KR20230089676A - 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세포 사멸 불활성화 배추 변이체 제조방법, 종자 및 배추 변이체를 사용하면 식물 기반의 차세대 바이오시밀러 (biosimilar) 생산 플랫폼 개발용 식물 소재로 활용할 수 있으며, 배양 시스템으로 전환시 단백질 생산 수율을 증대할 수 있다.

Description

세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체 {Method for Producing Genome-edited Brassica rapa Plant Having Immortalization and the Plant Thereof}
본 발명은 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 배추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.
식물은 의약품, 농약, 향신료, 색소, 식품 첨가물, 화장품 등으로 사용되는 폭넓은 이차대사산물을 생산할 수 있는 유용한 자원이다. 또한, 바이오 의약품 생산에 식물을 이용할 경우, 동물 세포 배양에서 문제가 되는 고가의 배지나 분리 정제 공정의 문제점을 극복할 수 있고, 환경 조절이 용이하여 대사를 인위적으로 조절해 생산량을 증가시키는 것이 가능하다.
그러나, 식물 세포는 미생물 배양 대비 성장 속도가 느리고 생산성이 낮아 상업화에 문제점이 존재한다. 예를 들어, 식물 세포를 통해 대사산물을 추출하는 경우, 그 함량이 낮고, 식물의 재배조건이나 부위 등에 따라 생산성에 큰 차이를 나타내어 안정된 공급을 제공하지 못한다. 따라서 세포 사멸이 억제되어 증식율 및 스트레스에 대한 저항성이 증가된 식물 개발이 바이오 의약품 및 다양한 산업적 측면에서 대사 산물의 안정된 공급을 위해 요구되고 있는 실정이다.
대한민국 등록공보 제10-2304761호(2021.09.15)
일 양상은 서열번호 1 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화 하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
다른 양상은 재조합 발현 벡터가 도입된 배추로부터 자가수정을 통해 동질접합체(homozygous)로 얻어진 배추 식물체를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 서열번호 1 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화 하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하는 단계; 상기 발현 벡터가 도입된 식물체의 하배축을 배양하여 형질전환 식물체 (E0)를 얻는 단계; 및 상기 형질전환 식물체 (E0)의 자가 수정을 통해 후대 유전자 교정 식물체 (E1)인 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 식물체를 얻는 단계;를 포함하는 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 식물체 제조 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 1 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화 하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
일 구체예에 따르면, 상기 서열번호 1 뉴클레오티드 서열은 배추 유래의 비접힘 단백질 반응 (unfolded protein response, UPR) 신호전달 유전자에 혼성화하는 가이드 RNA (gRNA)를 암호화 하는 것일 수 있다.
상기 가이드 RNA (guide RNA)는 상기 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 서열로 엔도뉴클레아제 (endonuclease) 단백질과 같은 핵산분해효소를 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제 1부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA (sgRNA) 형태를 의미할 수 있으나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 상기 가이드 RNA는 예를 들면 단일 가닥 가이드 RNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 핵산분해효소의 종류 또는 미생물에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것 또는 생체 외 (in vitro)에서 전사된 (transcribed) 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비접힘 단백질 반응 (unfolded protein response, UPR)은 소포체의 내강에 접히지 않았거나 잘못 접힌 단백질의 축적으로 인해 활성화되는 것일 수 있다. 이는 단백질의 번역을 멈추어 세포의 원기능은 회복시키고 단백질 접힘을 수행하는 샤페론 생산을 증가시키는 신호경로를 활성화 하거나, 상기 경로가 순조롭게 활성화되지 않으면 비접힘 단백질 반응은 세포사멸을 유도하는 것일 수 있다. 비접힘 단백질 반응 경로의 후속(downstream)에 작용하는 단백질은 전구세포사멸(proapatotic) 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 언제 정확히 "세포 사멸사 스위치"가 켜지는지는 알려지지 않았다. 상기 비접힘 단백질 반응의 화학적 유도인자로는 튜니카마이신 (tunicamycin), 디티오트레이톨 (dithiothreitol), 2-데오시포도당 (2-deoxyglucose) 등을 사용할 수 있다.
상기 신호전달 유전자는 비접힘 단백질 반응을 유도하는 유전자이거나, 반응의 후속 신호 경로에 포함되어 있는 유전자일 수 있다.
상기 유전자는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA로, 표적 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 종류가 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 (non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다.
상기 "Cas9 단백질"은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소로써, CRISRP RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성하여, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)로 작용할 수 있다.
상기 "작동가능한게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점 (replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열 (terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점 또는 BBV 복제원점 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레 오티드 단편일 수 있다. 프로모터는 세포, 예를 들어, 진핵 세포(예컨대, 식물 세 포, 또는 동물 세포(예를 들어, 인간, 마우스 등의 포유류 세포 등) 등)에서 전사 개시를 조절할 수 있으면, 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter(예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate- early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1- alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로 모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호 흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오 닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "재조합"은 한 DNA 분자의 일부가 다른 DNA 분자로 이동하는 과정을 의미하는 것일 수 있다.
상기 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터(예를 들어, mRNA 또는 기타 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 이후에 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리 뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된다면, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플 라이싱을 포함할 수 있다.
상기 "재조합 발현 벡터"는 형질전환을 유도하기 위하여 DNA를 운반하는 것일 수 있으며, 제한 효소 절단 부위, 선택표지자, 표적 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 선택표지자는 항생제 내성 유전자일 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자는 형질 전환된 균주를 구분하기 위하여 사용되는 것일 수 있다.
상기 형질전환은 특정 DNA 단편을 생명체의 유전체 내로 삽입하여 새로운 유전형질이 발현되도록 하는 방법을 의미하는 것일 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트 로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 및 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)을 이용할 수 있다.
다른 양상은 재조합 발현 벡터가 도입된 배추로부터 자가수정을 통해 동질접합체(homozygous)로 얻어진 배추 식물체를 제공하는 것이다.
상기 "재조합 발현 벡터가 도입"은 상기 기재된 형질을 전환하는 공지의 방법을 통해 도입될 수 있고, 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PE G)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에 따르면, 상기 배추 식물체는 서열번호 1이 서열번호 2 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 돌연변이 된 배추 식물체일 수 있다.
상기 서열번호 2 및 상기 서열번호 3는 서열번호 1에서 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등이 일어난 것일 수 있다.
상기 자가수정 방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 1 뉴클레오티드 서열; Cas9 단백질을 암호화 하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터를 식물체 하배축에 도입하는 단계; 상기 발현 벡터가 도입된 식물체의 하배축을 배양하여 형질전환 식물체 (E0)를 얻는 단계; 및 상기 형질전환 식물체 (E0)의 자가 수정을 통해 후대 유전자 교정 식물체 (E1)인 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 식물체를 얻는 단계;를 포함하는 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 식물체 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 서열번호 1 뉴클레오티드, Cas9 단백질, 작동가능하게 연결된, 프로모터, 재조합 발현 벡터, 하배축, 형질전환, 자가수정은 상기 기재된 내용과 동일하다.
상기 하배축에 도입하는 단계는 전술한 발현 벡터를 배추의 하배축 에 도입하는 단계로, 도입을 위한 방법을 전술한 바와 같다.
상기 하배축은 발아하고 있는 어린식물에서 뿌리와 떡잎 사이에 있는 부분을 의미하며, 하배축을 적절한 배양조건에서 배양할 경우 싹이 형성될 수 있다.
상기 배추 형질전환 식물체 (E0)을 얻는 단계는 상기 발현 벡터가 도입된 배추의 하배축을 배양하여 얻는 단계로서, 본 발명에서의 구체적인 방법으로, 발현 벡터를 포함하는 균주와 함께 배추의 하배축을 암배양한 뒤 명배양하여 배추 형질전환 식물체 (E0)를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 세포 사멸 불활성화 배추 변이체 제조방법, 종자 및 배추 변이체를 사용하면 식물 기반의 차세대 바이오시밀러 (biosimilar) 생산 플랫폼 개발용 식물 소재로 활용할 수 있으며, 배양 시스템으로 전환시 단백질 생산 수율을 증대할 수 있다.
도 1은 가이드 RNA 염기서열 및 유전체 편집 위치를 나타내는 모식도이다.
도 2는 형질전환한 식물체 내 유전자의 변이를 확인한 PCR 결과이다.
도 3은 형질전환한 식물체 내 유전자를 심층 분석하여 확인한 염기서열이다.
도 4A는 튜니카마이신 (Tunicamycin)의 농도별로 처리하여 형질전환을 하지 않은 일반 배추 식물체가 자라는 것을 확인한 데이터이며, 4B는 4A 식물체의 생체중 (fresh weight)를 확인한 데이터이다.
도 5A는 튜니카마이신 (Tunicamycin)의 150 ug/L 또는 200 ug/L 로 처리하여 형질전환을 하지 않은 일반 배추 식물체, 형질전환한 IM2(IM#2) 및 IM10(IM#10)가 자라는 것을 확인한 데이터이며, 5B는 5A 식물체의 생체중 (fresh weight)를 확인한 데이터이다.
도 6는 형질전환한 식물체를 자가수정하여 얻어낸 동질접합체 종자로부터 키워낸 식물체에 목표 유전자 삽입 여부를 확인한 PCR 결과이다.
도 7은 IM2, IM10 E1 식물체 내 유전자를 심층 분석하여 확인한 염기서열이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 유전자 가위의 표적 서열 디자인
유전자 가위 표적 유전자를 디자인하기 위하여, 비접힘 단백질 반응(unfolded protein response, UPR) 신호전달 유전자의 불멸화(immortalization, IM) 표적 유전자의 활성을 제거하기 위해 목표유전자에 표적화 자리를 가지도록 설정하여 sgRNA (single guide RNA)를 제작하였다. 도 1에서 보이는 바와 같이 목표유전자의 표적화 자리의 sgRNA 디자인하기 위해 애기장대(Arabidopsis thaliana, At) 염기서열과 Brassica oleracea (Bo)와 Brassica rapa (Br)의 염기서열 정렬을 통해서 sgRNA을 디자인 하였다. 하기 표 1의 서열번호 1은 sgRNA를 암호화하는 서열이다.
서열번호 서열명칭 염기서열 (5' > 3')
서열번호 1 sgRNA ACACAACAGGAAACAAGAGAGG (22bp)
실시예 2. 벡터제작
제한효소를 처리하여 pAGM4723 플라스미드에 하이그로마이신 (hygromycin) 내성 유전자와 sgRNA를 넣어 클로닝하므로 pAGM4723-Hyg_Cas9 IM vector를 재조합 하였다. 재조합된 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium) GV3101 균주에 형질전환 (transformation)하여 이후 배추 식물체 형질전환에 이용하였다.
실시예 3. 배추 형질 전환
배추 종자 약 3,000립(서울배추, 동원농산종묘)을 파종하여 10,000개 이상의 하배축을 확보하여 이를 아그로박테리움과 공동배양하여 형질전환을 진행하였다. 배추의 형질 전환을 위하여 사용된 배지 및 조성은 하기 표 2과 같다.
배지 종류 MS sucrose BA
(4mg/ml)		 NAA
(1mg/ml)		 AgNO3
(4mg/ml)		 Cefotaxime
(250mg/ml)		 Hygromycin
(50 mg/ml)		 Plant agar pH
기내파종 (1/2 MS) 2.2 g 20 g - - - - - 5 g 5.8
공동배양(CM) 4.4 g 20 g 1 ml 1 ml - - - 9 g 5.2
선발(SⅠ) 4.4 g 20 g 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 80 μL 9.5 g 5.2
발근(RIM) 4.4 g 20 g - - - - - 6 g 5.8
3-1. 종자 소독 및 파종
배추 종자를 70% EtOH 용액에 1분간 침지한 다음 멸균증류수로 3회 세척하였다. 세척한 종자를 25% 락스 용액에 20분간 쉐이킹 (shaking)하여 소독하고, 멸균증류수로 6회 다시 세척한 후, 멸균증류수에 1시간 동안 방치하였다. 그 후 종자를 1/2 MS 배지 (MS 2.2g, sucrose 20g/L, pH 5.8)에 파종하여, 25℃에서 3일간 암배양하였다.
3-2. 접종 절편체 채취 및 전배양
발아된 유식물체를 명배양으로 옮겨 3~4시간 빛을 받아 경화과정을 거치게 하였다. 배축의 엽록소가 안보이는 부위를 0.7~1cm 길이로 잘라서 전배양배지 (MS, sucrose 20g/L, BA 4.0mg/L, NAA 1.0mg/L, plant agar 9g, pH 5.2)에 가로로 치상하고 23℃에서 2일간 암배양하였다.
3-3. 균주배양 및 접종
접종 예정일 전날에 실시예 2에서 형질전환한 균주를 O.D값이 0.6~0.8이 될 때까지 배양하였다. 접종당일에 균주를 4,000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 균주를 MS배지 (MS 4.4g, glucose 36g/L, pH 5.2)에서 23℃, 1시간동안 쉐이킹하므로 희석하였다. 전배양한 하배축을 균주와 10분간 접종한 후 공동배양(CM) 배지(MS, sucrose 20g/L, BA 4.0mg/L, NAA 1.0mg/L, plant agar 9g, pH 5.2)에 접종하고 23℃에서 2일간 암배양하였다.
3-4. 배추 E 0 형질전환 식물체 획득 (선발)
상기 공동배양하므로 형질전환된 식물체를 선발 (SI) 배지(MS, sucrose 20g/L, BA 4.0mg/L, NAA 1.0mg/L, AgNO3 4.0mg/L, cefotaxime 250mg/L, hygromycin 4.0mg/L, plant agar 9.5g, pH 5.2)에서 명배양하였고, 2~3주간격으로 상태를 관찰하여 배지를 교체해주었다. 선발 (SI) 배지에서 완전한 형태의 싹이 형성되면 발근 (RIM) 배지 (MS, sucrose 20g/L, plant agar 6g, pH 5.8)로 이식하므로 배추 형질전환 식물체를 선발하였다.
3-5. 배추 E 0 형질전환 식물체에 목표 유전자 삽입 여부 확인
총 22개의 형질전환 식물체를 획득하였으며, 획득한 형질전환 식물체에 목표 유전자가 삽입되어 있는지를 확인하기 위하여 PCR 검정을 수행하였다. PCR 검정은 상기 표 3의 프라이머를 사용하여 수행하였으며, Takara exTaq (Takara Shuzo Co., Ltd., Shiga, Japan)을 이용하였다.
Primer name Primer sequence (5’- 3’) Size (bp)
Transgene
specific primer		 GTCGACATAGCGATTGTACGGCGAGTGCC 200
TCTAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
그 결과, 도 2에서 보이는 바와 같이, 획득한 배추 형질전환 식물체 22개체 중 18개체에서 목표 유전자가 삽입된 것을 확인하였다.
3-6. 배추 E 0 형질전환 식물체 목표 유전자 좌 내 변이 확인
유전자 삽입 유무를 확인한 형질전환 식물체를 목표 유전자 좌 내 변이를 확인하기 위하여 심층 서열분석 (deep-sequencing)을 수행하였다.
그 결과, 도 3에서 보이는 바와 같이, 유전자 좌 내 변이가 나타난 것을 확인하였으며, 유전자 내 큰 결실 (deletion)이 나타난 형질 전환된 식물체도 있는 것을 확인하였다.
실시예 4. 배추 형질전환 식물체의 세대진전
목표 유전자 좌 내 변이를 확인한 형질전환 식물체 (E0)를 자가수정하여 동질접합체 (homozygous)인 후대 종자 (E1)를 획득하였다.
실시예 5. 배추 E 1 형질전환 식물체 스트레스 내성 분석
획득한 종자 중 변이율 (InDel frequency)이 높았던 IM2와 IM10의 종자를 0.3%(v/v) 차아염소나트륨 (sodium hypochlorite)으로 10분동안 소독한 후, 멸균증류수로 5회 세척하여 4일동안 4℃에서 춘화처리하였고, 1x Murashige and Skoog (MS, Duchefa), pH 5.8, 3% sucrose, 0.25% gellan gum (phyto Technology Laboratory)이 포함된 배지에 기내 파종하였다. 파종한 종자는 22℃ 장일 조건(16/8시간 명암주기, 100-200umol/m2/s 광장 선속 밀도(photon flux density), 60-70% 상대습도)에서 배양하였다. 장시간 스트레스 실험을 위하여 N-glucosylation inhibitor인 튜니카마이신 (tunicamycin)을 농도별로 MS 배지에 첨가하여 5일 또는 7일 후의 식물 표현형을 관찰하였다. 결과 값은 던칸 다중비교법 (Duncan's multiple range test)을 사용하여 나타내었다.
튜니카마이신의 적정농도를 확인하기 위하여 형질전환이 되지 않은 대조군 (wild type, WT)를 이용하여 스트레스 내성 분석을 하였다. 튜니카마이신이 포함된 MS 배지에 대조군 종자를 파종한 후 식물체의 생체중 (fresh weight)를 확인한 결과, 하기 표 4 및 도 4에서 보이는 바와 같이, 100ug/L에서 200ug/L로 농도가 높아짐에 따라 생체중이 절반 이상 차이가 나는 것을 확인하였다.
TM (ug/l)
Sample 		0 50 100 200 300 400 500 600
1 67.0 58.6 64.3 32.7 21.8 12.0 13.0 10.9
2 74.4 69.7 42.0 25.7 24.3 13.1 12.1 11.4
3 52.1 54.5 36.2 25.8 13.5 13.7 11.3 6.8
4 70.7 61.6 49.2 27.5 12.5 13.1 8.0 8.2
5 69.4 40.4 60.6 12.0 10.5 10.8 12.5 5.3
Average
(단위: mg)		 66.7az 57.0ab 50.5b 24.7c 16.5cd 12.5cd 11.4cd 8.5d
상기 결과를 바탕으로, 튜니카마이신을 150ug/L와 200ug/L로 처리하여 IM2 및 IM10의 식물체 생체중을 측정하였다. 그 결과, 하기 표 5 및 도 5에서 보이는 바와 같이, 대조군(WT) 생체중 대비 IM2 및 IM10 생체중에서 현저한 차이를 나타내는 것을 확인하였다. 즉, 형질전환된 식물체가 스트레스에 내성을 보이는 것을 나타내는 확인하였다.
sample Mock (TM 0 ug/L) TM 150 ug/L TM 200 ug/L
WT IM2 IM10 WT IM2 IM10 WT IM2 IM10
1 192.3 226.5 227.8 49.3 79.8 83.1 38.1 64.7 53.6
2 201.8 79.2 194.2 52.6 66.1 103.2 43.8 61.8 63.5
3 181.2 213.0 189.2 54.9 88.0 98.0 39.3 63.2 65.3
4 168.0 189.5 198.6 40.1 100.6 81.2 36.6 45.9 51.0
Average 185.8az 202.1a 202.5a 49.2b 83.6a 91.4a 39.5b 58.9a 58.4a
실시예 6. 배추 E 1 형질전환 식물체 목표 유전자 삽입 여부 확인
스트레스 내성 분석에 사용한 IM2 및 IM10 E1 식물체를 본엽이 3-4매 전개되었을 때 신초를 이용하여 DNA를 추출, PCR 분석을 하였다.
도 6에서 보이는 바와 같이, IM2의 경우 15개체 중 3번, 4번, 9번 및 13번이 제외된 11개체에서, IM10의 경우 20개체 중 8번 및 16번이 제외된 18개체에서 목표 유전자가 삽입된 것을 확인하였다.
실시예 7. 배추 E 1 형질전환 식물체 목표 유전자좌 내 변이 확인
목표 유전자 삽입이 확인된 개체에 대해서 심층 서열 (deep sequencing) 분석을 실시하였다. 그 결과 도 7 및 하기 표 6에서 보이는 바와 같이, 모든 E1 형질전환 식물체에 대해서 목표 유전자좌 내 변이가 발생하였으며, 변이는 하기 서열번호 2 및 서열번호 3과 같이 발생하는 것을 확인하였다.
서열번호 서열명칭 염기서열 (5' > 3')
서열번호 2 DNA mutation sequence 1 ACACAACAGGAAACAAAGAGAGG (23bp)
서열번호 3 DNA mutation sequence 2 ACACAACAGGAAAGAGAGG (19bp)
<110> Republic of Korea(Management: Rural Development Administration) <120> Method for Producing Genome-edited Brassica rapa Plant Having Immortalization and the Plant Thereof <130> RDA-BPA210038 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 1 acacaacagg aaacaagaga gg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA mutation sequence 1 <400> 2 acacaacagg aaacaaagag agg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA mutation sequence 2 <400> 3 acacaacagg aaacaaagag agg 23

Claims (5)

  1. 서열번호 1 뉴클레오티드 서열;
    Cas9 단백질을 암호화 하는 뉴클레오티드 서열; 및
    상기 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 뉴클레오티드 서열은 배추 유래의 비접힘 단백질 반응 (unfolded protein response, UPR) 신호전달 유전자에 혼성화하는 gRNA를 암호화 하는 것인,
    재조합 발현 벡터.
  3. 제1항의 재조합 발현 벡터가 도입된 배추로부터 자가수정을 통해 동질접합체(homozygous)로 얻어진 배추 식물체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 배추 식물체는 서열번호 1이 서열번호 2 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 돌연변이 된 것인,
    배추 식물체.
  5. 제1항의 발현 벡터를 식물체 하배축에 도입하는 단계;
    상기 발현 벡터가 도입된 식물체의 하배축을 배양하여 형질전환 식물체 (E0)를 얻는 단계; 및
    상기 형질전환 식물체 (E0)의 자가 수정을 통해 후대 유전자 교정 식물체 (E1)인 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 식물체를 얻는 단계;
    를 포함하는 세포 불멸화 형질을 가지는 유전체 교정 식물체 제조 방법.

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