CN1149835A - 甲型链球菌多糖免疫原性组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的对抗由甲型链球菌引起的感染和疾病的免疫原性组合物和疫苗、生产它们的方法以及免疫方法。该组合物包括与蛋白质或脂质体共价相连而形成免疫原性缀合物的甲型链球菌多糖。本发明的免疫方法包括给予个体致免疫量的甲型多糖。甲型多糖可以作为基于其本身、与蛋白质缀合或与脂质体缀合的疫苗来给药。另外，甲型多糖可以与佐剂结合。本发明特别适用于为那些最有危险患甲型链球菌感染和疾病的人群即成年人、孕妇并且特别是婴儿和儿童提供主动的和被动的免疫原性保护。

Description

甲型链球菌多糖免疫原性组合物及方法
发明领域
本发明涉及新的免疫原性组合物领域，生产它们的方法，以及使温血动物，包括人，对甲型链球菌引起的感染和疫病免疫的方法。发明背景
如依年龄组的感染率所示，甲型链球菌疾病是一种儿童期疾病(1-3)。与此类的其它疾病如脑膜炎球菌(4)和嗜血杆菌脑膜炎(5)、白喉(6)等(7，8)一样，大部分病例发生在幼年，并且感染率随年龄而降低。因此，到18岁，甲型链球菌感染发生率相对较低(1-3)。我们可以假设，与发现的其它儿童期感染一样，对此类生物体的某些类型的自然免疫可能是随时间发生的。
在连续几十年的实验中，Lancefield和同事们(9-11)证实了大部分感染人体的溶血性链球菌是甲型的。此特性是基于与甲型链球菌碳水化合物的血清学反应。之后的研究报道了免疫显性决定簇是N-乙酰氨基葡糖(12，13)。用鼠保护试验和沉淀素测定，根据存在于生物体表面的抗原性不同的M蛋白质的存在，将这些甲型链球菌进一步分为血清型。在一鼠感染模型中明显表明，针对特异性M血清型的抗体有保护作用(14)。在人体中，早型链球菌感染的痊愈常常与对感染性生物体为类型特异性的长期持久性免疫有关(11)。但在这两种情况下，该保护都是对M血清型特异的，并且不延及对其它血清型的保护。另外，许多研究中已表明，人体血清极少含有多种M蛋白血清型特异的抗体(11，15)。这些对人体和实验动物的经典实验证实了M蛋白在甲型链球菌毒力方面的重要作用，并且构成了许多研制链球菌疫苗的不成功偿试的基础，这些疫苗应该能诱发针对其中保留血清型特异性的M蛋白的氨基末端部分或更新近地针对分子的普通C-重复区域的保护性抗体(16)。
但是，考虑列表现出对这类细菌的自然免疫性升高的甲型感染与年龄相关的性质，问题在于这是否表示针对M蛋白上较普通区域的抗体的缓慢增加，或者是否其它不太被注意的表面抗原可能在这种自然获得的非血清型特异性保护中起着作用。例如，透明质酸夹膜在豚鼠(17)丙型感染的毒力方面起着重要的作用，并且在动物(18，34)和人体(19)中检测到了抗透明质酸盐抗体。已有报道，有用形式化的、有夹膜的甲型链球菌免疫后或与脂质体结合后，来自甲型链球菌的透明质酸对家兔有致免疫作用(18)。对脂质体在疫苗中的应用也有过报道(31)。注射链球菌细胞壁粘肽组分导致了实验动物体内短暂的保护(20)，但还不知道其在人体中的作用。
类型特异性碳水化合物由多聚-鼠李糖骨架组成，在甲型的情况下，N-乙酰氨基葡糖存在于骨架的非还原末端位置(图1a)。已对甲型变种链球菌进行了描述并鉴定了其特征(12，13)。在这些链球菌中，存在多聚-鼠李糖骨架，但其未被N-乙酰氨基葡糖修饰(图1b)。在早期实验中，给家兔注射缺少M蛋白的整个甲型链球菌，发现达诱发了针对甲型碳水化合物的沉淀的抗体。但是，在被动鼠保护研究中这些抗体对M蛋白阳性的甲型链球菌的攻击不起被动保护作用(14)。此外，几种用来说明类似的人体中的沉淀的抗体的早期尝试是不成功的，这表明了沉淀的碳水化合物抗体在对链球菌感染的保护中不起显著作用。
但是，由于许多早期检测抗体升高的方法是依赖于这些抗体能与加入的抗原沉淀的性质，许多虽然在分析中与特异抗原反应但并不沉淀的抗体则不被检测。能与甲型链球菌透明质酸荚膜反应的抗体就是一个很好的例子。在集中解决这一问题的研究中，始于1965年的一系列报道(21，22)使用了直接和间接凝集技术来检测抗体。直接凝集作用检测沉淀的抗体，而间接凝集作用则可以检测沉淀性与非沉淀性抗体。令人感兴趣的是Karakawa等人的报道(22)，在这些人血清中的直接凝集抗体，即沉淀的抗体，主要是针对甲型变种碳水化合物，多聚-鼠李糖骨架，而针对非沉淀性抗体的间接凝集技术检测了针对N-乙酰氨基葡糖决定簇的高滴度抗体。
Zimmerman等人随后的研究(23)使用了来自各种链球菌感染的人血清，其表明这些非沉淀性抗体的发生率从低至人数的30％(仔细追踪并治疗链球菌感染)到高达最近受甲型链球菌感染的人数的84％之间变化。他们还注意到甲型碳水化合物的抗体滴度在17岁时达到峰值，并且在有或没有心脏病的风湿病患者中这种碳水化合物的抗体滴度没有差别。这些结果与Dudding和Ayoub报道的结果不同，在Dudding和Ayoub的报道中，风湿性心脏病患者体内的抗-甲型碳水化合物抗体与没有瓣膜损伤患者体内的抗体相比是持续升高的(24)。
是否这些抗体在保护中起作用这一问题尚难以确定。Lancefield的经典调理素细胞吞噬分析使用了所选择的人全血(15，25，26)，向其中加入带已知M蛋白血清型特异性抗体的高度免疫兔血清。人全血的选择是基于两个因素；(1)其不含有与M蛋白反应的抗体和/或(2)在缺少血清型特异的兔抗血清时其不会促进链球菌的吞噬作用。是否正常人血清本身能促进吞噬作用这一问题从未真正地加以论述。发明概述
本发明提供了一种保护哺乳动物不受甲型链球菌感染的免疫原性组合物。该免疫原性组合物含有致免疫量的具有下列结构的甲型链球菌多糖(GASP)以及载体：其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n是一个足够大的数字来确定一个平均分子量足够大的多糖，从而提供对与鼠李糖的3位配糖相连的β-D-GlcpNAc残基的免疫原应答。GASP的这一区域确定了诱导杀菌抗体形成的表位。
存在于免疫原性组合物中的GASP可以是游离多糖的形式或作为缀合物的一个组分，在缀合物中GASP与能形成脂质体或蛋白质的磷脂共价相连。天然或重组细菌蛋白如破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉素毒素、或CRM197都是可用作缀合物的适宜蛋白质的实例。在另一实施方案中，免疫原性蛋白质结合到了含有与磷脂共价相连的GASP的脂质体中。
该免疫原性组合物还可用作疫苗，并可进一步含有佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂A、QS21或硬脂酰酷氨酸。本发明的免疫原性组合物能诱发对甲型链球菌感染的主动和被动保护。对于被动保护，免疫原性抗体是通过用本发明的免疫原性组合物制成的疫苗来免疫哺乳动物，然后从哺乳动物回收免疫原性抗体来生产的。
本发明还提供了通过给予致免疫量的本发明的组合物来免疫哺乳动物抵抗甲型链球菌感染的方法。
在另一实施方案中，本发明提供了一种制备免疫原性组合物的方法，该方法包括使GASP与脂质体共价相连；将脂质体溶于能溶解疏水性蛋白质的缓冲液中；将溶解的脂质体与溶于缓冲液中的蛋白质合并，从而形成脂质体与蛋白质的配合物。然后从缓冲液中分离蛋白质/脂质体配合物。
本发明的一个目的是提供可用于增加具有预防和诊断目的用途的抗体的免疫原性组合物。本发明的另一个目的是提供一种通过给予致免疫量的GASP使哺乳动物对甲型链球菌免疫的方法。再一个目的是提供使GASP与蛋白质共价连接而形成免疫原缀合物的方法。在优选的实施例中，缀合物具有下式：
其中R′是末端还原糖的还原和氧化产物。本发明的又一个目的是免疫原性组合物的用途，在那些最有危险患甲型链球菌感染和疾病的人群，即成人、孕妇和，特别是，婴儿和儿童中，提供对甲型链球菌感染的保护。附图简要说明
图1用示意图表示了甲型碳水化合物(图1A)和甲型变种碳水化合物(图1B)的结构图。对甲型碳水化合物三维结构的描绘清楚地支持了观察结果，即：碳水化合物的血清学特异性是针对碳水化合物的N-乙酰氨基葡糖部分的。
图2用图解法表明了对来自特立尼达及纽约的5岁和10岁正常儿童体内甲型链球菌碳水化合物抗体的ELISA滴度测定。读数是于405nm的终点测定结果为1.0 OD。
图3用图解法表明了用已知含有对甲型一脂质体有反应性的抗体的人血清的抑制ELISA研究。将血清大约稀释到在405nm给出1.0 OD单位的值，并与各种浓度的不同抗原于37℃混合1小时，于10,000转/分离心5分钟。用上清液在实施例3所述的ELISA分析中测定反应性。数据表示所测血清的平均值。
图4用图解法表明了用洗涤后的人血进行的间接杀菌分析，如实施例1中简要说明的向含RPMI和补体的试管中加入各种血清。初始9个CFU的是甲型6型链球菌。A图显示了含正常兔血清的旋转试管中生物体的生长。B图显示了具有与甲型碳水化合物反应的高ELISA滴度的人血清的静态试管中的生长。C图显示了用如B图中一样的人血清但在旋转试管中的生长抑制。
图5用图解法表示了如图4中所述的间接杀菌分析。生物体是血清型3(菌株D58/11/3)、血清型6(菌株S43)、血清型14(菌株S23/101/5)、和血清型28(菌株T28/isoA/5)。左轴描绘了旋转试量对静态试管的菌落形成单位的数目。右轴表示旋转试管对静态试管的生物体杀伤百分率。
图6用图解法表示了肝素对间接杀菌分析的作用。按所述方法进行间接杀伤分析，但平行作两份。向一组静态和旋转的试管中加入肝素(5单位/ml)，而另一组试管作为正常杀菌分析对照。用于Lancefield所述的杀菌分析的肝素标准量通常是10单位/ml(33-35)。可以看出，肝素，在通常所述浓度的一半时，显著降低了抗一甲型碳水化合物抗体依赖性杀伤的数量。
图7用图解法表示了如ELISA分析中所测定的抗-甲型分析碳水化合物滴度的杀菌分析。在使用血清型6生物体的两种分析中测定了17个人的血清。注意到所有表现出CHO滴度大于200,000的血清(13/13)在杀菌分析中均表现出了大于80％的杀伤率。相反，滴度低于200,000的4个血清中只有一个促进了生物体的调理吞噬，并且吞噬程度比用高滴度血清观察到的低得多。
图8用图解法表示了实施例1中所述的调理吞噬杀菌分析。用与静态对照相比生物体的杀伤百分率描述生物体的吞噬。条块表示用N-乙酰氨基葡糖亲合柱吸附前、用亲合柱吸附后的百分杀伤率，以及从柱中洗脱出的抗体的百分杀伤率。注意到用N-乙酰氨基葡糖亲合柱吸附后所有血清的杀伤率全部消失，从亲合柱洗脱抗体后调理吞噬的杀菌活性部分恢复。除完全没有杀伤力的吸附后的血清以外，示出了各种情况下的标准误差。
图9用图解法表示了已知在用甲型链球菌碳水化合物免疫后含有高滴度抗-甲型碳水化合物抗体的兔血清的调理吞噬指数。用与静态对照相比生物体的杀伤百分率描述生物体的吞噬，注意到滴度＜50,000的生物体缺乏吞噬作用，滴度为75,000时杀伤率逐渐增加，而滴度大于100,000时吞噬作用完全。用于这些研究的生物体是甲型6类菌株，接种物是4个菌落形成单位。对发明的详细描述
由于已知测定人血清中碳水化合物抗体的血清学数据伴随着与年龄相关的由其它碳水化合物抗原，即肺炎球菌(27)、脑膜炎双球菌(4)、和嗜血杆菌多糖(5)，引起的保护的诱导，我们决定再检测一下各种人体血清，即正常人群和受链球菌感染的人群血清中碳水化合物抗体的存在。这些研究还包括了链球菌感后遗症的病人。将纯化为甲型碳水化合物与合成的磷脂酰乙醇胺共价相连，结合到脂质体中，并用在基于ELISA的分析中。本发明表明在人体血清中易于检测针对甲型碳水化合物抗原的抗体。另外，根据地区性人口和对链球菌疾病的接触，这些抗体的量具有与年龄相关的依赖性。在已知链球菌感染之后，还观察到了对甲型碳水化合物抗体滴度的升高。为了论述是否这些能与甲型碳水化合物反应的抗体或这些抗体的一部分能促进调理吞噬这一问题，我们使用了改进的Lancefield杀菌分析法。所得数据表明这些抗体是有调理作用，的并且这些调理性甲型碳水化合物抗体所针对的表位是非还原性末端N-乙酰氨基葡糖残基。
本发明提供了一种免疫原性组合物以及保护哺乳动物，特别是人，抵抗甲型链球菌感染的免疫方法。本发明的免疫原性缀合物是通过将甲型链球菌多糖(GASP)与适宜的蛋白质或脂质体共价连接形成磷脂而构成的。
按照McCarty(28)和Dubois等人(31)所述的方法完成甲型链球菌的分离和生长以及甲型多糖的制备，这两篇文献作为参考文献并入本发明。分离的GASP具有下列化学结构：其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，n是重复单位的数目，其应足够大，从而确定具有足够平均分子量的多糖来致免疫。优选n是从约1至约50。更优选地，n是从约3至约30，最佳数目是约为20。此处所用的多糖一词是指包括任何糖类多聚物，包括二糖、寡糖等。产生上述多糖结构的甲型变种链球菌的培养物被保藏在马里兰州Rockville的美国典型培养物保藏中心。GASP应具有足够大小以诱导个体的免疫原应答。更优选的平均分子量是约为10,000千道尔顿。单一重复量的GASP分子量约为500千道尔顿。
在本发明优选的实施方案中，GASP与蛋白质共价相连形成缀合物。这样的缀合物优选将T-细胞依赖性的对多糖的免疫原应答转化为T-细胞依赖性的免疫原应答。因而，个体可接受的、并能诱导T-细胞依赖性应答的任何蛋白质或其片段都适宜与GASP缀合。基本上任何蛋白质都能作为缀合蛋白。特别是所选择的蛋白质必须具有至少一个自由氨基，用于与甲型多糖的缀合。优选蛋白质是任何天然或重组细菌蛋白，并且其本身是诱导年轻和成年哺乳动物中T-细胞依赖性应答的免疫原。这样的蛋白质的例子包括，但不限制于，破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素和CRM197。其它缀合蛋白的候选物包括假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素。
在优选的实施方案中，本发明的缀合物分子含有一个蛋白质核心，GASP通过末端还原糖的修饰形式与之相连。因此这样的缀合分子就会含有单官能化的GASP结合蛋白。优选多个GASP，特别是约1至12个GASP与每个蛋白相连。更优选至少约5个GASP与每个蛋白相连。
在另一个实施方案中，GASP通过每个GASP上的两个或多个位点与蛋白质相连。由于杀菌表位可能是出现在GASP重复单位的支链上，因此GASP的官能化以及与蛋白质的连接应该是以保持致免疫量的杀菌表位的方式来实现。
GASP与之缀合的蛋白质可以是天然毒素或去毒后的毒素(即类毒素)。另外，还可以使用蛋白毒素的非毒性突变形式。优选这样的突变保留了天然毒素的表位。这些突变后的毒素被称作“交叉反应物质”或CRMs。CRM17比活性白喉毒素有一个氨基酸不同并且与之在免疫学上不可区分，CRM17是流感嗜血杆菌缀合疫苗的一个组分，该疫苗已广泛应用于婴儿。
产生CRM197蛋白的白喉杆菌菌株C7培养物(β197)被保存在马里兰州Rockville的美国典型培养物保藏中心(保藏号ATCC53281)。
还可以用蛋白质片段与GASP缀合，其条件是这些片段应足够长，即优选至少10个氨基酸以确定T-细胞表位。
可用许多缀合方法产生本发明的甲型多糖-蛋白质缀合物。所用的优选方法应当能保持与鼠李糖的3位配糖相连的β-D-GlcpNAc支链上存在的杀菌表位的免疫原性。当单个GASP连接两个或多个蛋白分子时，所得缀合物对蛋白质来说是交叉连接的。可以通过缀合反应中所用条件的常规变化来调节交叉连接的程度和缀合物分子的整个大小，这对于本领域普通技术人员来说是已知的。这些变化包括，例如，缀合反应的速率以及反应混合物中存在的蛋白质与GASP的比值。
将多糖与蛋白质缀合的各种化学方法是已知的并在文献中有所描述。例如，作为参考文献引入本发明的美国专利4,644,059描述了用己二酸二酰肼(ADH)作为同双功能连接物制备的缀合物。也作为参考文献引入本发明的美国专利4,695,624描述了制备多糖以及用属间间隔基制备缀合物的方法。在Dick、William E.和Michel Beurret的Contrib.Mrcrobil.Immunol.(1989)，Vol.10，pp.48-114中讨论了对各种用于设计缀合物的制备方法和因素的概括性研究，其也作为参考文献引入本发明。优选的缀合本发明GASP-蛋白质缀合物的方法是美国专利4,356,170所述的还原性氨基化法，其也作为参考文献引入本发明。简单地说，在优选的实施方案中，GASP的末端还原糖通过使用温和的还原剂如硼氢化钠或其等同物被还原成开环。
下面，用偏高碘酸钠或其等同物的选择性氧化反应来氧化先前还原糖部分的末端邻位羟基而形成末端醛基。这形成了活化的GASP，其现在能与选择的蛋白质载体共价相连。在本发明的另一个实施方案中该活化的GASP还可与磷脂，如脂质体形式的磷脂酰乙醇胺共价相连。活化的GASP的化学结构如下：其中R′是除形成醛基(CHO)的末端还原糖部分以外的末端还原糖的还原和氧化产物。在室温，用约1ml约20mM的偏高碘酸钠溶液适宜地氧化约10mg的多糖约10-15分钟。反应时间可随其它数量的高碘酸盐而变化以得到同等的氧化。末端还原糖的还原和开环使得还原糖的邻位羟基比存在于配糖连接的β-D-GlcpNAc支链上的羟基更活泼。但是，通过某些配糖连接的β-D-GlcpNAc残基的氧化可以同样产生其它连接位点。然后在氰基硼氢化物离子或另一种还原剂的存在下，通过将载体蛋白的氨基与GASP的末端醛基偶联使活化的GASP与所选择的缀合蛋白缀合。从而甲型多糖与蛋白质通过-CH2-NH-蛋白连接键相连，如式II：
Figure A9519341300172
得自还原性氨基化过程的GASP-蛋白缀合物优选有极少的交联，并优选能溶于水溶液。这使本发明的GASP-蛋白缀合物成为用作疫苗的优选候选物。
在本发明的另一个实施方案中，GASP被埋入脂质体，形成了免疫原性组合物。由于脂质体能诱导对B-淋巴细胞的“加帽”作用，因此它们经常用于缀合物中。没有被理论束缚，我们认为GASP-脂质体缀合物通过加帽来提高抗体滴度，从而活化B-淋巴细胞。加帽现象是细胞生物学领域中已知的。简单地说，由于脂质体结构上的特征，脂质体中能埋入抗原，从而形成多价免疫原结构。由于脂质体细胞膜中的受体分子是游动的，所以这些受体许多能通过二价试剂交联从而形成片型沉淀区或“斑片”。这些斑片将在B-淋巴细胞的极性端凝聚或集结，在淋巴细胞的细胞膜中形成帽子。如果在T-辅助效应细胞存在下出现了抗原在B-淋巴细胞上的加帽作用，则这种作用将通过B-淋巴细胞活化抗体的产生。
已知各种使多糖与脂质体缀合的方法，并描述于文献中。例如，作为参考文献引入本发明的美国专利5,283,185描述了通过制备阳离子脂质与共脂质的混合脂质分散体、然后将核酸引入分散体而将核酸转入到细胞中形成配合物的方法。然后用这种配合物处理细胞。在本发明优选的实施方案中，通过用细针注射或优选用声处理的方法将脂质分散于水溶液中来制备脂质体，如Fillet，H.M.Milan Blake、ChristaMacDonald和Maclyn NcCarty(1988)，Immunogenicity ofLiposome-bond hyaluronate in mice，J.Exp.Med.168：971-982中所述，其作为参考文献引入本发明。
为了制备含与GASP成份共价相连的磷脂的脂质体，按已知方法形成脂质体。例如，在本发明的一个实施方案中将磷脂酰乙醇胺溶于如氯仿的溶剂中并加到容器里。除去氯仿溶剂从而使容器覆盖上磷脂酰乙醇胺。向容器中加入含水缓冲液如水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，将混合物用声处理形成脂质体。向脂质体中加入等摩尔量的已活化的GASP，优选用还原法随后用氧化法活化GASP，在任何适宜的缓冲液，如盐水、林格溶液或最优选的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)存在下，使两种成份混合过夜。然后向混合物中加入氰基硼氢化钠，在磷脂酰乙醇胺与GASP多糖之间形成稳定的共价键。可以用离心、分子筛色谱法或透析使式III所示的最终产物从氰基硼氢化钠中分离出来。
Figure A9519341300191
式III中的R′和n如前面所述，R2为磷脂酰乙醇胺。
在优选的实施方案中GASP一脂质体与蛋白质结合从而将疏水性蛋白掺入脂质体。按照一种方法，将GASP一脂质体溶于β-辛基葡糖苷的5％溶液中。将待加入脂质体中的蛋白质也溶于5％β-辛基葡糖苷中，合并蛋白质和脂质体。经混合将蛋白质掺入到脂质体之后，透析除去β-辛基葡糖苷。所得GASP一脂质体一蛋白质配合物从而可用作免疫原或疫苗。
还可以用其它不太优选的技术使GASP与磷脂连接，例如使用苯醌，如Fillit，H.M.、M.Mc Carty、和M.S.Blake(1986)，the inductionof antibodies to hyalurouic acid by immunization of rabbits withencapsulated streptococci.J.Exp.Med.164：762-776中所述，其作为参考文献引入本发明。但是，如果组合物要用作疫苗，那么使用这些试剂可能不太理想。
本发明的免疫原性组合物可用作增加用于预防和诊断目的的抗体的手段。诊断尤其适用于监视和检测各种由甲型链球菌引起的感染和疾病。本发明的另一个实施方案用免疫原性组合物作为免疫原，用于对有危险患甲型链球菌感染或疾病的个体进行主动的和被动的免疫原性保护。用于被动保护的免疫原性抗体是这样产生的：用本发明的任意免疫原性组合物免疫哺乳动物，然后从哺乳动物回收γ-球蛋白部分中的杀菌抗体，或者作为血清或作为特异性抗体。此处所用的本发明的疫苗能诱导用于提供对甲型链球菌感染的保护的抗体。
另外，甲型多糖本身可以用作免疫剂，优选与佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂A、QS21或硬脂酰酪氨酸缔合。本发明进一步的实施方案是用免疫原性组合物作为对抗甲型链球菌感染的免疫原性保护。具体地说，本发明将对那些最有危险患甲型链球菌感染或疾病的人群，即成人、孕妇和、特别是婴儿和儿童，提供保护。
本发明的免疫原性组合物和疫苗可通过将GASP或缀合物分散到适宜的药物上可接受的载体，例如生理盐水、磷酸盐缓冲的盐水或其它可注射的液体中而典型地形成。疫苗可胃肠外给药，例如皮下、腹膜内、或肌内给药。也可以存在疫苗中常用的添加剂，例如稳定剂如乳糖或山梨糖醇和佐剂如磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝、单磷酰基脂A、QS21或硬脂酰酪氨酸。
免疫原性组合物的剂量应是能达到致免疫作用效果的剂量。剂量通常在每千克体重约0.01μg至约10μg之间的范围。可以给出一系列最佳免疫剂量。单位剂型的疫苗可含有与约0.01μg至约10μg相当量的GASP或缀合物。
用下列非限制性实施例来说明来发明。实施例1
使甲型链球菌生长、制备和测定甲型链球菌碳水化合物抗体的方法以及它们作为新的用于成人和儿童的疫苗的应用列举如下：甲型链球菌的生长
将-70℃的甲型链球菌种子贮存物涂布在含3克/升Todd Hewitt肉汤和3克/升酵母萃(GAS培养基)的培养基平板上。将平板在37℃温育48小时，然后，将菌落(8-9)转移到200ml的GAS培养基摇瓶中，于37℃和120转/分钟生长18小时。将种子培养物(150ml)转移到15L发酵罐(New Brunswick，BioHo4)的Todd Hewitt肉汤中。使培养物在pH7.0和37℃生长7-8小时。当培养物达到静止期(在600nm的光密度为1.5左右)时加入3g/L的葡萄糖。使培养物再生长8小时并收集培养物。最后的光密度在600nm处约为2.7。甲型链球菌多糖的制备
将于600ml水中的60克甲型链球菌细胞与75ml 4N亚硝酸钠和75ml冰乙酸合并。使溶液混合15分钟并在SS34转子中于11,000转/分钟离心10分钟。分出上清液，对水透析并冷冻干燥。用PBS作洗脱剂通过Sphadex G-50柱(Pharmacia)凝胶过滤从粗品冷冻干燥提取物纯化甲型多糖。用Dubois的苯酚硫酸酯测定法(31)监测从柱中洗脱出的各部分中碳水化合物的存在。合并碳水化合物阳性的各部分，在4℃对水透析并冷冻干燥。多糖制品(240mg)含有少于1％(重量/重量)的蛋白质和核酸。用AM-500 BRUKER分光计在500Hz通过1H-NMR进一步确认其纯度。脂质体的制备：用McCarty先前所述的方法(28)分离甲型链球菌碳水化合物。将冷冻干燥物重新悬浮，调节到10mg/ml，用苯醌作为链球菌透明质酸盐连接剂的Fillit等人先前所述的方法(18)与脂质体共价连接，该文献作为参考文献引入本发明。简单地说，GASP与苯醌反应形成被活化的中间体。然后该中间体进一步与脂质体形式的磷脂酰乙醇胺反应，形成免疫原性GASP一脂质体缀合物。ELISA分析：基本上按照Fillit等人所述的ELISA法(18)，作了以下改进。使用人血清的预备试验表明用在PBS中的0.5μgCHO/ml、pH7.2的脂质体制品来敏化微量滴定板给出了最好的结果，脂质体对照品的背景读数最低。因此，将100μl制品放置于微量滴定板(Dynatech板，美国)的每个孔中，于37℃保温过夜。然后将平板在ELISA洗涤缓冲液(10mM醋酸钠、100mM NaCl、0.1％Brij35，pH8.0)中洗涤3次。将人血清稀释到同样的ELISA缓冲液中，并将得到的血清稀释液100μl放入平板中，于37℃保温1小时。所有血清都一式二份操作。适当洗涤后，用1∶1,000的山羊F(ab′)  2抗-人IgG(γ链特异性)或IgM(Mu链特异性)、碱性磷酸酯酶缀合物(Tago，Inc，美国)稀释液作为次生抗体，再于37℃保温1小时。再于ELISA缓冲液中洗涤3次后，向孔中加入于0.1M二乙醇胺(pH9.6)中的磷酸酯酶底物(Sigma104)，将平板于37℃保温1小时，在ElidaV(Physica Co.)仪器上于405nm读数。用给出读数为1.0的稀释度记作滴度。杀菌测定：按下列步骤进行Lancefield所述的间接杀菌测定(15，25，26)：使各种菌株的生物体在Todd Hewitt肉汤中于37℃生长18小时。先将过夜培养物的样品以1∶2稀释到新鲜Todd Hewitt肉汤中，再于37℃生长2小时。将悬浮液稀释至1∶100，然后进行连续二倍法稀释，使5-15个菌落分配在50μlTodd Hewitt肉汤中。用加肝素的血液作为人吞噬细胞的来源。为了避免吞噬细胞悬浮液中存在自体血浆，将血液在2000转/分钟离心10分钟，除去血浆，将沉淀团块在PBS(pH7.2)中洗涤3次，最后再悬浮于RPMI(Gibco-BRL，Co.，Rockville，MD)中至与初始血样相同的体积。使用新从已知含少量抗碳水化合物抗体的正常献血者分离的血清(其已用甲型链球菌在0℃被反复吸附，以等分试样保存于-70℃)(29)向测定体系供应补体。使用之前，分析该补体来源的补体活性和甲型碳水化合物抗体的缺乏。在密封的试管中一式两份进行杀菌测定。反应混合物如下：悬浮于RPMI中的人吞噬细胞300μl，人补体100μl，待测血清200μl，稀释的链球菌培养物50μl。同Lancefield测定一样，两个试管中的一个于37℃立式旋转3小时，另一个作为对照的试管在同样温度下保持静态。3小时后，从每个试管中取100μl涂布在血琼脂培养倾注平板上，  并于37℃保温过夜。然后计数每个平板上的菌落数。按下式计算调理吞噬活性，以特定血清的链球菌杀伤百分数表示：(1-旋转血清试验中的cfu/静态试管中的cfu)×100。来自人血清的N-乙酰氨基葡糖抗体的吸附：将与琼脂糖珠粒(SigmaChemical Co.)偶联的N-乙酰氨基葡糖于PBS中的50％悬浮液600μl放置于无菌eppendorf试管中并在4℃于14000转/分钟离心10分钟。除去上清液并向珠粒中加入300μl血清。将悬浮液于37℃立式旋转1小时。在同样条件下再次离心后，分出吸收过的血清并用于前面所述的杀菌测定中。半含有被吸附抗体的珠粒装入1ml结核菌素注射器中，使于0.15MNaCl中的0.58％(v/v)的冰乙酸溶液(pH2.2)流过，从而从亲合柱中分出N-乙酰氨基葡糖抗体。通过测定280nm的吸收度来监测洗脱液，收集峰值部分，对pH7.2的PBS透析，并用Amicon centriprep 30浓缩仪(Amicon，Bererly，MA)将其浓缩到初始的血清体积。人血清：本研究中的受试者来自特立尼达、纽约、和大湖海军培养基地。它们的年龄范围是5-20岁。用静脉穿刺术获得血液，并用标准无菌技术收集血清。所有血清的年龄、来源和健康状况示于表1。
                     表1
                  人数分布
    患者     年龄(岁)     患者数量
正常儿童-特立尼达     5     36
正常儿童-特立尼达     10     16
正常儿童-纽约     5     32
正常儿童-纽约     10     22
风湿热-特立尼达     7     19
肾炎-特立尼达     4     18
无并发症的猩红热     18-20     6
有并发症的猩红热(ARF)     18-20     5
杀菌测定：我们已经证实了人血清确实含有甲型碳水化合物抗体，并且这些抗体的滴度在个体中的确有所变化，下面论述的问题是是否这些抗体在体外测定体系中也能促进调理吞噬。基本上按照Dr.Lancefield(15，25，26)使用的杀菌测定法测定人血清，进行了上面简述的改进。图4说明了吞噬测定的结果。使用了甲型链球菌菌株血清型6的9个菌落形成单位的接种物，在正常兔血清存在下在旋转的试管中菌落数目明显增多(图A)。图B显示了使用人血清的静态试管中有略微增多。明显相反，含人血清的旋转试管(图C)完全消除了生物体的生长(比较图B和C)。
为了确定观察到的甲型链球菌调理吞噬作用并不限于一种血清型，用另外三种不同M蛋白血清型的甲型菌株重复这些实验。从图5可见，与观察6型菌株的情况类似，在人血清存在下，另外三种菌株都被吞噬了。比较旋转为与静态的试管，杀伤百分率变化为80-100％。血清型3、14、28菌株与Dr.Lance field在其细胞吞噬测定(15，25，26)中所用的菌株一致。抗-CHO滴度与人血清调理吞噬之间的关系：吞噬测定清楚地表明了各种人血清促进甲型链球菌吞噬的能力有所不同。通常所给血清的吞噬特性与抗甲型碳水化合物抗体的滴度相关。从图6可见，显示出大于200,000滴度的所有血清都显示出了大于80％的杀伤率，而4种滴度小于200,000的血清中的3种未显示出杀伤率。一种CHO滴度为40,000的血清也促进了吞噬作用，但杀伤程度比用高滴度抗-CHO血清观察到的杀伤程度低得多。在加肝素的血中与无肝素的测定中人血清吞噬作用的研究：由于已知肝素能结合并钝化多种补体成份并能使我们的吞噬测定与先前用过的那些测定相关，所以在存在和不存在肝素的情况下在吞噬测定中测试了上述正常人血清调理吞噬的能力。用静脉穿刺法抽取肝素化的人血，如上所述在PBS中充分洗涤并分成两等份。一份加RPMI再悬浮至初始体积，如上所述进行调理测定。同样处理第二等份，但加入每ml5单位的肝素，然后同另一份一样用同样方法进行测定。
结果描绘于图6，其表明不存在肝素时被人血清吞噬的甲型链球菌平均为94％。但是，存在肝素时，同样的血清只能达到平均12％的同样接种物的吞噬。
吸附实验：为了确定链球菌碳水化合物组成成分中哪一部分导致杀菌活性，如方法学部分所述用N-乙酰氨基葡糖偶联的琼脂糖珠粒吸附人血清。然后将吸附的和未吸附的血清用于标准杀菌测定。图7示出了这些实验的结果。未吸附的血清明显促进了链球菌的吞噬作用。相反，用N-乙酰氨基葡糖偶联的珠粒吸附过的血清去除了调理性抗体。作为存活对照，正常兔血清没有促进吞噬作用。这些实验表明，在我们的杀菌测定中，针对甲型碳水化合物上非还原性末端N-乙酰氨基葡糖残基的抗体对甲型链球菌的调理吞噬作用非常重要。为了证实这些结果，洗脱来自选择血清的抗体，这些血清已被吸附在N-乙酰氨基葡糖亲合柱上，然后将这些抗体用于杀菌测定。也如图9所示，这些实验表明，从亲合柱洗脱出的N-乙酰氨基葡糖特异性抗体能部分恢复血清的调理吞噬杀菌活性。
使用所设计的用来测定与甲型链球菌碳水化合物起反应的沉淀性和非沉淀性抗体的方法，使该碳水化合物与磷脂酰乙醇胺共价连接并将其掺入能与微量滴定板结合的脂质体中。该方法清楚地表明，大部分人血清含有对抗甲型链球菌多糖的抗体。
令人惊奇的是我们发现来自不同地理区域的儿童表现出他们对抗甲型碳水化合物的滴度明显不同。虽然在特立尼达接触链球菌(脓疱和咽炎)的量比纽约高。但链球菌感染在纽约也很普遍。关于这一点，Zimmerman等人(23)确实注意到被细心监测并治疗甲型链球菌感染的病人与不被监测组相比甲型碳水化合物抗体滴度较低。另外，通常碳水化合物抗原是T细胞非依赖性的，因此可以想到需要反复接触抗原来诱导抗体应答。
使用从猩红热急性期和恢复期病人获得的血清进行的研究表明，在疾病发作时已经存在对抗甲型链球菌碳水化合物的抗全滴度，但在恢复期抗体滴度确实升高2倍。与无并发症的猩红热血清相比，当出现猩红热发作时测定急性链球菌感染的ARF血清，针对甲型碳水化合物的滴度较低，但当ARF出现时滴度升高4倍，这表明，与无并发症的猩红热患者相比，其对抗原的免疫应答可能较强。针对甲型碳水化合物的抗体滴度明显低于在未产生ARF的猩红热患者中看到的抗体滴度。对甲型和甲型变种碳水化合物的抑制研究清楚地表明，这些抗体大部分是针对甲型碳水化合物上的特异性非还原性末端N-乙酰氨基葡糖残基，而不是针对鼠李糖骨架。
是否这些碳水化合物抗体促进甲型链球菌的调理吞噬这一问题已经得到了肯定的答案，并且调理程度与抗一碳水化合物抗体的水平完全相关。通常小于100,000的ELISA滴度没有作用，而大部分滴度大于200,000的血清促进了吞噬作用。一项重要的发现是该调理吞噬作用并非仅限于甲型链球菌的一种血清型，因为至少三种不同血清型的其它菌株也被吞噬了。可与N-乙酰氨基葡糖反应的抗体在调理中的重要作用通过事实得以证明：从人血清中吸附这些抗体完全消除了血清的杀菌活性，而当洗脱这些抗体并加回到杀菌测定中时，又恢复了杀菌力。
几个有关人血清杀菌测定动力学的观察结果值得一提。首先，在杀菌测定中只有少量链球菌接种物是有效的，而大量接种物经常压倒人血清调理生物体的能力。第二，杀菌活性主要以未稀释的血清起作用，其方式与Dr.Lancefield在其对人血清和类型特异性抗体的研究(15，25，26)中观察到的方式类似。相反，用所给类型特异性蛋白质免疫的动物血清，即使在稀释度为1∶20或更多时仍有作用。实施例2
比较正常儿童中与甲型碳水化合物起反应的抗体的滴度：我们首先致力于测定是否正常儿童产生了针对甲型链球菌碳水化合物的抗体，以及是否这些抗体的滴度随个体的年龄和个体生活的地理区域而改变。因此，我们用材料与方法部分中所述的ELISA测定法对从特立尼达(高键球菌接触区)5岁和10岁正常儿童获得的血清进行了与甲型碳水化合物起反应的抗体的滴度的测定，并与纽约(低链球菌接触区)年龄相当的儿童进行比较，图2表明对于5岁儿童，来自特立尼达的儿童的94％表现出小于1∶10,000的抗体滴度，平均抗体滴度为1∶158,472。这些抗体滴度与所测定的10岁儿童血清的滴度设有明显区别。相反，在纽约的5岁儿童表现出了明显较低的滴度，平均为1∶6,100，10岁儿童的平均滴度增长到1∶25,500。69％的纽约儿童的滴度大于1∶10,000，这一事实表明两个年龄组中纽约地区儿童的滴度明显低于特立尼龙地区儿童的相应滴度。
为了确定对甲型碳水化合物的免疫应答是IgG类还是IgM类，进行了下列实验。适当稀释对甲型碳水化合物表现出高滴度的选择血清，使每种血清在ELISA测定中于405nm给出的读数为1.0。然后用亲合纯化的人抗-IgG或抗-IgM碱性磷酸酯酶缀合物次生抗体测定每种血清。如表II中所见，针对链球菌碳水化合物检测的抗体中大部分是IgG类的，而只有少数反应见于IgM类中。
                  表II针对链球菌CHO-脂质体配合物的IgG和IgM抗体滴度的ELISA测定
    患者          免疫球蛋白类
    IgG     IgM
    1     1,200,000     6000
    2     640,000     2000
    3     480,000     2000
    4     360,000     2000
    5     320,000     1000
每种血清被大约稀释到在ELIDA V显示器中于405nm的读数为1.0光密度。实施例3早型反应性抗体的部分结构确定：Zimmerman等人(23)先前已经阐明某些人血清含有与从甲型变种链球菌分离的碳水化合物起反应的抗体，因此其是针对甲型多糖分子的聚-鼠李糖骨架部分的。为了确定跟与末端N-乙酰氨基葡糖甲型决定簇起反应的抗体相比这些鼠李糖骨架反应性抗体的量，用甲型和甲型变种纯化碳水化合物进行了正常血清的抑制研究。同前面一样，用甲型碳水化合物脂质体配合物敏化微量滴定板。将100μl的适宜血清与不同浓度的碳水化合物混合，并在37℃水浴中保温1小时。然后将混合物于10,000转/分钟离心5分钟，上清液在ELISA测定中起反应。对照物包括与盐水混合的血清。如图3中所示，正常血清中大部分抗甲型碳水化合物反应性抗体是针对甲型碳水化合物部分，即N-乙酰氨基葡糖决定簇的。对于甲型变种碳水化合物观察到了某些抑制作用，但达到同样抑制程度需要的量比甲型碳水化合物高1,000-5,000倍。由于甲型变种碳水化合物掺杂了约4％N-乙酰氨基葡糖(与甲型碳水化合物的36％相比)，所以某些检测到的抑制作用可能是与残余的N-乙酰氨基葡糖的反应。这表明大部分的血清免疫反应活性是针对N-乙酰氨基葡糖部分的，这可以通过在ELISA测定中加入纯化的N-乙酰氨基葡糖(Sigma)则甲型抗体活性丧失来看出。这可以直接与加入密切相关的单糖N-乙酰氨基葡糖而缺乏任何抑制作用相比较。实施例4ARF与APSGN病人的抗一甲型碳水化合物抗体滴度的比较：为了确定是否抗甲型碳水化合物抗体的滴度在充分证实患有链球菌感染后的后遗症病人中不同，将得自急性风湿热病人(ARF)的血清样品与得自急性链球菌感染后的肾小球性肾炎患者(APSGN)的血清相比较。所有血清均得自在特立尼达住院的充分确证的ARF和AGN患者，并且在疾病急性期治疗之前取血。表III总结了结果，可以看出，与疾病发作时的ARF病人相比，在APSGN患者血清中与甲型碳水化合物的反应性有所增加。当与特立尼达的正常儿童比较时，这些病人的滴度与特立尼达正常儿童的滴度也明显不同(见图2)。
                             表III患APSGN、ARF和无并发症的猩红热病人的血清中抗-碳水化合物抗体的平均滴度
                                    大湖系列
    患者     数目   发作时的平均滴度   4周后的平均滴度
    猩红热     6     8,838     18,050
    ARF     5     2,045     7.950
                                 特立尼达系列
    患者     数目     平均滴度
    ARF     19     202,300
    APSGN     18     299,900
实施例5无并发症的链球菌感染病人与ARF病人中抗-甲型碳水化合物抗体滴度的确定：我们收集的大湖地区的血清均得自在大湖海军培养基地于1946年感染了猩红热的病人。这些病从中一部分进一步发展为典型的ARF。因而，从这些患者中如下选择血清：1)猩红热急性发作期间，2)猩红热恢复阶段(4周之后)，或3)急性链球菌感染后(3-4周)ARF发作期。表III表明，在少量的病例中，与发作期相比(按出现猩红热的时间来划分)，对甲型碳水化合物的反应性在疾病恢复阶段有所增加。在无并发症的猩红热组以及在猩红热发作4周后发展为ARF的那些病人中均见到了对甲型碳水化合物的抗体滴度的升高。虽然研究的病例数量很少，但令人感兴趣的是，与无并发症的猩红热病例相比，在猩红热发作以及4周后风湿病发作的ARF病人中，对甲型碳水化合物的滴度较低。实施例6甲型多糖-蛋白质缀合物A.甲型多糖还原性末端的NaBH4还原
将纯化的甲型多糖(GASP)(100mg)溶于10ml水中，并用0.5NNaOH调节溶液pH至10。向溶液中加入固体NaBH4(100mg)，然后将反应混合物在室温保温2小时，用1M AcOH破坏过剩的硼氢化物。在冷处将溶液对水透析并冷冻干燥，得到91mg还原的GASP。B.用受控制的过碘酸盐氧化反应将末端醛基引入甲型多糖
将还原的GASP(90mg)溶于4.5ml水中，然后与4.5ml的50mMNaIO4合并。在室温下30分钟后，加入1ml乙二醇破坏过剩的过碘酸盐，并在冷处将溶液对水透析并冷冻干燥，得到73mg氧化的GASP。C.GASP-TT和GASP-HSA缀合物
通过NaBH3CN的还原性氨基化反应使氧化的GASP与单体破伤风类毒素(TT)(SSI，Copenhagen，丹麦)或人血清白蛋白(HSA)(Sigma)相连。
将氧化的GASP(40mg)与单体TT(20mg)或HSA(20mg)溶于0.2M pH7.4的磷酸盐缓冲液中(0.7ml)。加入NaBH3CN(20mg)后，将反应混合物于37℃保温4天。通过对小量反应混合物在Superose-12(Pharmacia)上的HPLC分析监测缀合过程。用PBS作洗脱剂在SuperdexG-200(Pharmacia)柱上层析来纯化缀合物。用WatersR403示差折光仪和紫外光谱学在280nm监测从柱中洗脱出的各部分。合并含有甲型多糖一缀合物的部分，透析并冷冻干燥。用Bradford的方法(Bradford，M.M.，1976，Anal.Bio chem.72：248-254)用人血清白蛋白作标准品估算缀合物的蛋白质含量。用Dubois等人的方法(31)用纯化的GASP作标准品测定碳水化合物含量。TT缀合物含有39％(w/w)碳水化合物和61％(w/w)蛋白质。假设多糖平均分子量为10,000千道尔顿(通过用葡聚糖作为分子量标记物在Superose-12上进行HPLC，并用激光散射法测定分子量标记物而测得)，单体TT的分子量为150,000千道尔，GASP-TT缀合物的多糖与TT的摩尔比分别为9-10∶1。实施例7免疫与免疫测定A.免疫步骤
用10mcg未偶联的天然甲型多糖或-TT缀合物，总体积为0.5ml，在背部两个部位皮下接种一组五只新西兰白色雌性家兔(7-8周龄)(接种三次，间隔三周)。所给予的疫苗可以9被或者不被氢氧化铝(Alhydrogel；Superfos，丹麦)或硬脂酰酪氨酸(ST)吸附，在明矾或ST/ml盐水中的浓度均为1.0mg。在疫苗中加入乙基汞硫代水杨酸钠至最终浓度为1/10,000。一组五只兔子接受了用乳化于完全弗洛因德佐剂(Sigma Laboratories)中的缀合疫苗进行的第一次注射，并接受了用乳化于不完全弗洛因德佐剂中的缀合疫苗进行的后续加强剂量注射。在0、21、42和52天从每只动物收集血清。B.ELISA
使微量滴定板(Nunc Polysorb ELISA板)覆盖上在PBS中稀释至1.0mcg/ml的100ng GASP-HSA的缀合物，并将平板于37℃保温1小时。覆盖之后，用含0.05％吐温20的PBS(PBS-T)洗涤平板，并用于PBS中的0.5％BSA在室温封闭1小时。然后向孔中注满100μl连续2-倍稀释于PBS-T中的兔抗血清，并将平板于室温保温1小时。用PBS-T洗涤后，将平板与100μl过氧化物酶标记的山羊抗-兔IgG(H&L)(Kirkegaard & Perry Laboratories)在室温保温30分钟，然后用PBS-T洗涤5次。最后，向每个孔中加入50μlTMB过氧化物酶底物(Kirkegaard & Perry Laboratories)，然后在室温使平板保温10分钟，加入50μl 1M H3PO4停止反应。用Molecular Devices Emax微板读数器在450nm对平板读数，用650nm作为能比波长(见表IV)。
虽然我们在此已描述了本发明的一些实施方案，但显而易见，可以改变这些基本结构而提供使用本发明方法的其它实施方案。因此，应当理解，本发明的范围应被后面所附的权利要求书限定而不是被以实施例方式在此之前给出的特定实施方案所限制。
                                 表IV
用各种制剂形式的GAS多糖或GAS多糖一破伤风毒素缀合物免疫的家免的GAS多糖一特异性抗体的滴度
疫苗                              各天ELISA中的抗体滴度*
                 0                21                42                52GASP  (盐水)      100               100               100               100
GASP-TT         100               100               4,130             7,600
(盐水)                                         (900-12,000)      (2,600-13,500)
GASP-TT         100               10,600            81,800            141,800
(Al(OH)3)                   (4,800-21,000)    (51,000-129,000)  (76,700-287,500)
GASP-TT         100               6,200             21,100            59,600
(ST)                         (2,300-12,700)    (8,300-31,000)    (21,300-95,500)
GASP-TT         100               188,000           1,664,000         1,760,000
(CFA，IFA)                   (2,200-428,500)(1,000,000-2,299,000)(1,100,000-2,370,000)
*几何平均滴度(范围)值为100的表示抗体滴度≤100。数值是两份测定的平均值。在第0、21和42天给家兔(5个NZW一组)皮下注射100mcg多糖(天然的或缀合的)。参考文献
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Claims (60)

1.一种免疫原性组合物，其含有致免疫量的下列式I的甲型多糖以及载体：
Figure A9519341300021
其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc；其中n为一个足够大的数字使得免疫原性组合物足够大且具有足够的平均分子量以致免疫，其中所述组合物为哺乳动物提供对抗甲型链球菌感染的保护。
2.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中n为从约1至约50。
3.根据权利要求2的免疫原性组合物，其中甲型多糖的分子量为约10,000Kd。
4.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中将所述免疫原性组合物给予个体的剂量约为每千克体重0.01μg至约10μg。
5.根据权利要求1的免疫原性组合物，其中的载体选自包括盐水、林格氏溶液、和磷酸盐缓冲盐水的一组物质。
6.根据权利要求5的免疫原性组合物，其中免疫原性组合物进一步含有估剂。
7.根据权利要求6的免疫原性组合物，其中的佐剂选自包括氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂A、QS21和硬脂酰酪氨酸的一组物质。
8.一种免疫原性多糖一蛋白质缀合物分子，其含有式(I)的甲型多糖
Figure A9519341300022
其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n为一个足够大的数字，从而提供对与式(I)中所示的鼠李糖的3位配糖相连的β-D-GlcpNAc残基的免疫原性反应，该残基确定了诱导杀菌抗体形成的表位，并且其中多糖与蛋白质共价相连。
9.根据权利要求8的免疫原性多糖-蛋白质缀合物，其中多糖通过仲胺键与蛋白质相连，而形成式(II)的缀合物其中R′  为末端还原糖的还原和氧化产物，该还原糖未出现在式II的-CH2-NH-蛋白质仲胺键中。
10.根据权利要求9的免疫原性多糖-蛋白质缀合物，其中蛋白质是任何天然的或重组的细菌蛋白。
11.根据权利要求10的免疫原性多糖蛋白质缀合物，其中的蛋白质选自由破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素或CRM197组成的一组物质。
12.根据权利要求11的免疫原性多糖-蛋白质缀合物，其中的蛋白质是破伤风类毒素。
13.根据权利要求12的免疫原性多糖-蛋白质缀合物，其中n为约1至约50。
14.根据权利要求13的免疫原性多糖-蛋白质缀合物，其中n为约3至约30。
15.根据权利要求14的免疫原性多糖-蛋白质缀合物，其中多糖的分子量为约10,000Kd。
16.根据权利要求8的蛋白质-多糖缀合物，其中缀合物的蛋白质含有T-细胞表位，并且长度至少约为10个氨基酸。
17.一种提供对抗甲型链球菌感染的保护的疫苗，其含有致免疫量的式(I)的甲型多糖以及载体其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n为一个足够大的数字，从而提供对与式(I)中所示的鼠李糖的3位配糖相连的β-D-GlcpNAc残基的免疫原应答，该残基确定了诱导杀菌抗体形成的表位，并且其中所述组合物为哺乳动物提供对抗甲型链球菌感染的保护。
18.根据权利要求17的疫苗，其中的免疫原性组合物含有式(I)的甲型多糖
Figure A9519341300041
其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n为1至50的数字，并且其中多糖与蛋白质共价相连。
19.根据权利要求18的疫苗，其中多糖通过仲胺键与蛋白质相连从而形成缀合物式(II)
Figure A9519341300042
其中R′为末端还原糖的还原和氧化产物，该还原糖未出现在式II的-CH2-NH-蛋白质仲胺键中。
20.根据权利要求19的疫苗，其中的蛋白质是任何天然的或重组的细菌蛋白。
21.根据权利要求20的疫苗，其中的蛋白质选自由破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素、和CRM197组成的一组物质。
22.根据权利要求12的疫苗，其中多糖-蛋白质缀合物中的蛋白质是破伤风类毒素。
23.根据权利要求22的疫苗，其中多糖-蛋白质缀合物中的n是从约3至约30。
24.根据权利要求23的疫苗，其中疫苗轭合物中的多糖分子量为约10,000Kd。
25.根据权利要求24的疫苗，其中将疫苗给予个体的剂量约为每千克体重0.01μg至约10μg。
26.一种免疫哺乳动物对抗甲型链球菌感染的方法，该方法包括给予个体致免疫量的式(I)多糖
Figure A9519341300051
其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc；n为一个足够大的数字而使甲型多糖足够大并且其平均分子量能致免疫。
27.根据权利要求26的方法，其中n为从约1至约50。
28.根据权利要求27的方法，其中n为从约3至约30。
29.根据权利要求28的免疫方法，其中甲型多糖的分子量为约10,000Kd。
30.根据权利要求29的免疫方法，其中给予甲型多糖的剂量为每千克体重约0.10μg至约10μg。
31.根据权利要求30的免疫方法，其中多糖与载体一起给药；载体选自包括盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水的一组物质。
32.根据权利要求31的免疫方法，其中多糖进一步含有佐剂。
33.根据权利要求32的免疫方法，其中佐剂选自包括氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂A、QS21和硬脂酰酪氨酸的一组物质。
34.根据权利要求26的免疫方法，其中哺乳动物是人。
35.根据权利要求34的免疫方法，其中的人是儿童。
36.一种免疫原性缀合物分子，其含有式(I)的甲型多糖其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n为一个足够大的数字，从而提供对与式(I)中所示的鼠李糖的3位配糖相连的β-D-GlcpNAc残基的免疫原应答，该残基确定了诱导杀菌抗体形成的表位，该多糖与脂质体共价相连形成缀合分子。
37.根据权利要求36的多糖-脂质体缀合物，其中的脂质体是由阳离子脂质构成的。
38.根据权利要求37的多糖-脂质体缀合物，其中的脂质体是由磷脂酰乙醇胺构成的。
39.根据权利要求38的多糖-脂质体缀合物，其中甲型多糖的分子量为约10,000Kd。
40.根据权利要求39的多糖-脂质体缀合物，其中免疫原性配合物所给予个体的剂量为每千克体重约0.01μg至约10μg。
41.根据权利要求36的缀合物，其中多糖-脂质体缀合物进一步含有埋入所述脂质体中的蛋白质。
42.一种通过给予致免疫量的根据权利要求37的组合物来对抗甲型链球菌感染的免疫方法。
43.根据权利要求42的免疫方法，其中的脂质体是由磷脂酰乙醇胺构成的并且多糖通过仲胺键与磷脂酰乙醇胺相连，从而形成式III的缀合物
Figure A9519341300061
式中R′为除与式III中仲胺键NH基团相连的末端还原糖部分之外的末端还原糖的还原和氧化产物，并且R2为磷脂酰乙醇胺。
44.根据权利要求43的免疫方法，其中n约从1至约50。
45.根据权利要求44的免疫方法，其中多糖的分子量约为10,000Kd。
46.根据权利要求45的免疫方法，其中多糖-脂质体缀合物所给予个体的剂量为每千克体重约0.01μg至约10μg。
47.根据权利要求46的免疫方法，其中多糖-脂质体缀合物与载体一起给药，载体选自包括盐水、林格氏溶液和磷酸盐缓冲盐水的一组物质。
48.根据权利要求46的免疫方法，其中多糖一脂质体组合物进一步含有佐剂。
49.根据权利要求48的免疫方法，其中佐剂选自包括氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂A、QS21和硬脂酰酪氨酸的一组物质。
50.根据权利要求49的免疫方法，其中佐剂选自包括氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂A、QS21和硬脂酰酪氨酸的一组物质。
51.根据权利要求18的疫苗，其中免疫原性组合物含有式(I)的甲型多糖
Figure A9519341300071
其中R为末端还还性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n为一个足够大的数字，以提供对与式(I)中所示的鼠李糖的3位配糖相连的β-D-GlcpNAc残基的免疫原应答，该残基确定了诱导杀菌抗体形成的表位，其中的多糖与脂质体共价相连。
52.根据权利要求51的疫苗，进一步含有包埋于脂质体中的天然的或重组的细菌蛋白。
53.根据权利要求52的疫苗，其中的细菌蛋白是破伤风类毒素；
54.根据权利要求53的疫苗，其中多糖-脂质体缀合物中的n为约1和50之间。
55.根据权利要求54的疫苗，其中疫苗的多糖-脂质体组合物分子量约为10,000Kd。
56.根据权利要求55的疫苗，其中疫苗给予个体的剂量为每千克体重约0.01μg至约10μg。
57.一种导致被动免疫的免疫组合物，包括来自甲型链球菌的杀菌抗体，其中所述抗体是通过用权利要求1、8、37和42任何一项中的任何一种免疫原性组合物来免疫个体而生成的。
58.根据权利要求57的免疫组合物，其中杀菌抗体存在于血清、γ球蛋白部分或纯化的抗体制剂中。
59.一种导致被动免疫的方法，包括给予个体致免疫量的根据权利要求57的免疫组合物。
60.共价连接式(I)的甲型多糖与包含磷脂酰乙醇胺的脂质体的方法其中R为末端还原性L-鼠李糖或D-GlcpNAc，而n为重复单位的数目，其足够大，从而确定平均分子量足够大的多糖以致免疫，该方法包括：
a)形成磷脂酰乙醇胺脂质体；
b)通过还原末端糖并氧化还原的糖而形成末端醛来活化甲型多糖；
c)合并活化的甲型多糖和脂质体，使甲型多糖通过还原性氨基化与脂质体共价相连，从而形成甲型多糖-脂质体缀合物；和
d)回收甲型多糖-脂质体缀合物。
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