FI118514B - A-ryhmän streptokokin polysakkaridi, immunogeeniset koostumukset ja menetelmät - Google Patents

Description

118514 A-ryhmän streptokokin polysakkaridi, immunogeeniset koostumukset ja menetelmät - Polysackarid av grupp A streptokock, immunogeniska sämmänsättningar och metoder 5 Keksinnön alue Tämä keksintö koskee uusien immonogeenisten koostumuksien aluetta, menetelmiä niiden tuottamiseksi ja niiden käyttöä lääkkeen valmistamiseksi, joka suojaa lämminverisiä eläimiä A-ryhmän streptokokkien aiheuttamilta infektioilta ja 10 taudeilta.

Keksinnön tausta A-ryhmän streptokokkitauti on lapsuuden sairaus, kuten ikäryhmän infektiomäärä osoittaa (1 - 3) . Kuten tähän ryhmään kuuluvissa muissakin taudeissa, esimerkiksi meningokokin (4) 15 ja hemofilusbakteerin aiheuttamassa aivokalvontulehduksessa (5), kurkkumädässä (6) ja muissa sairauksissa (7, 8), suurin osa tapauksista esiintyy nuorilla lapsilla ja infektioiden määrä kasvaa iän mukana. Kuitenkin 18 vuoden iässä A-ryhmän streptokokki-infektioiden esiintymistiheys on suhteellisen al-20 hainen (1 - 3). Tämä viittaisi siihen, että jonkinlainen luonnollinen immuniteetti organismin tätä ryhmää vastaan voi ilmaantua ajan kuluessa aivan kuin on todettu muiden lapsuuden infektiotautien yhteydessä.

• · « · 25 Useiden vuosikymmenien aikana tehdyissä kokeissa Lancefield ja . .·. hänen kollegansa (9 - 11) osoittivat, että valtaosa hemo- • · · .···. lyyttisistä streptokokki-infektioista ihmisillä oli A-ryhmän • · * streptokkien aiheuttamia. Tämä erotus perustui serologisiin ;·β reaktioihin A-ryhmän streptokokin hiilihydraattia kohtaan.

• ·· 3 0 Myöhemmät tutkimukset osoittivat, että immunodominant ti deter- • · • m ’!* minantti oli N-asetyyliglukosamiini {12, 13). Käyttämällä hiiren suojaustestejä ja presipitiinimäärityksiä nämä A-ryhmän • · · *...· streptokokit jaettiin serologisesti edelleen alatyyppeihin, ··· jotka perustuivat antigeenisesti erilaisten M-proteiinien ···· 35 läsnäoloon organismin pinnalla. On selvästi osoitettu, että ··· spesifistä M-serotyyppiä vastaan suunnatut vasta-aineet suojaavat hiiren infektiomallissa (14). Ihmisillä A-ryhmän 2 118514 streptokokki-infektiosta toipumiseen liittyy usein kauan kestävä immuniteetti, joka on tyypiltään spesifinen infek-toivaa organismia vastaan (11). Mutta kummassakin tapauksessa suoja on M-serotyypiItään spesifinen, eikä suojaa muilta 5 serotyypeiltä. Lisäksi useissa tutkimuksissa on osoitettu, että ihmisen seerumi sisältää tavattoman monia M-proteiini-serotyypiItään spesifisiä vasta-aineita (11, 15). Nämä klassiset kokeet, jotka on molemmat suoritettu ihmisillä ja koe-eläimillä, osoittivat M-proteiinin suuren merkityksen A-ryh-10 män streptokokkien taudinaiheuttamiskyvyssä, ja ne ovat muodostaneet perustan useille epäonnistuneille yrityksille kehittää streptokokkirokotteita, mikä käynnistäisi suojäävien vasta-aineiden tuotannon joko M-proteiinin aminopäätteistä osaa vastaan, josta serotyyppinen spesifisyys on peräisin 15 tai vielä viimeaikoina molekyylin yleisiä c-toistoalueita vastaan (16).

Kuitenkin ottaen huomioon A-ryhmän infektioiden luonteen, ikään suhteutettuna, mikä osoittaa luonnollisen immuniteetin 20 kasvun tätä bakteeriryhmää vastaan, on paikallaan esittää kysymys siitä, edustaako tämä hidasta kasvua vasta-aineissa, jotka suuntautuivat yleisempiin alueisiin M-proteiinissa vai saattaisiko muilla, vähemmän huomiota saaneilla pinta-anti- . : : geeneillä olla merkittävä rooli tässä luonnollisesti hanki- :V: 25 tussa non-serotyyppisessä spesifisessä puolustuksessa. Esi- « · ····· merkiksi hyaluronihappokapselilla on suuri merkitys C-ryhmän infektioiden taudinaiheuttamiskyvyssä marsuilla (17) ja »··· . ,·, anti-hyaluronaatti-vasta-aineita on havaittu eläimillä (18, • · · IV. t 34) ja ihmisillä (19). A-ryhmän streptokokin hyaluronihapon • · · * 30 sanottiin olevan immunogeeninen kaniineilla, sen jälkeen kun oli immunisoitu formaliinia sisältävillä, kapselillisilla A- • · · *·!·* ryhmän streptokokeilla tai sen jälkeen, kun oli liitetty li- posomeihin (18). Liposomien käytöstä rokotteissa on myös :*·.· kerrottu (31). streptokokkien soluseinän mukopeptidi-frakti- 35 oiden injektoiminen saa aikaan lyhytikäisen suojan koe-eläi-millä (20), mutta sen merkitys ihmisillä jää tuntemattomak- • · · • · · • · si.

• · · · · • *

Ryhmäspesifinen hiilihydraatti koostuu polyramnoosin sisem- 3 118514 mästä ydinosasta, jossa, A-ryhmän tapauksessa, N-asetyyli-glukosamiini on läsnä ei-pelkistävässä terminaalisessa asemassa (kuvio la). A-ryhmän streptokokki-variantteja on kuvattu ja karakterisoitu (12, 13). Näissä streptokokeissa 5 polyramnoosin sisempi ydinosa on läsnä, mutta muistuttaa N-asetyyliglukosamiinista (kuvio Ib). Aikaisemmissa kokeissa kaniineille annettiin injektiona kokonaisia A-ryhmän streptokokkeja M-proteiinin puuttuessa ja tämä näytti herättävän sakkautuvat vasta-aineet A-ryhmän hiilihydraattia vastaan. 10 Kuitenkaan nämä vasta-aineet eivät suojanneet passiivisesti M-proteiini-positiivista A-ryhmän streptokokin tunnistusta vastaan passiivisissa hiiren suojaustutkimuksissa (14). Edelleen useat aikaisemmat yritykset vastaavasti sakkautuvi-en vasta-aineiden osoittamiseksi ihmisillä, olivat epäonnis-15 tuneet, osoittaen, että saostuvilla hiilihydraatti-vasta-aineilla ei ollut suurta merkitystä streptokokki-infektioita vastaan kohdistuvassa puolustusmekanismissa.

Kuitenkin koska useimmat aikaisemmat menetelmät, joiden tar-20 koituksena oli havaita vasta-ainetuotannon kasvu, mikä riippui näiden vasta-aineiden kyvystä sakkautua antigeeniä lisättäessä, monet vasta-aineet, jotka kaikesta huolimatta reagoivat spesifisen antigeenin kanssa, mutta eivät sakkau- • · \: : tuneet tällaisissa analyyseissä, jäivät havaitsematta.

• · V.: 25 Vasta-aineet, jotka ovat reaktiivisia A-ryhmän streptokokki- ·:**: en hyaluronihappokapselia vastaan, ovat tästä hyvänä esi- ··· merkkinä. Pyrittäessä keskitetysti poistamaan tämä ongelma, • * · · . useat vuodelta 1965 alkavat selostukset (21, 22) käyttivät • · · sekä suoria että epäsuoria agglutinaatiotekniikoita vasta- I · t 30 aineiden havaitsemiseen. Suora agglutinaatio havaitsi sak-. kautuvat vasta-aineet, kun taas epäsuora agglutinaatio mit- »tl taisi sekä sakkautuvat että sakkautumattomat vasta-aineet.

• * *** ‘ Mielenkiintoinen oli julkaisussa: Karakawa et ai (22) kuvat- tu havainnollinen esitys siitä, että suoraan agglutinoituvat :··· 35 vasta-aineet, toisin sanoen sakkautuvat vasta-aineet, joissa humaani-seerumit suunnattiin ensisijaisesti A-ryhmän hiili- • * * * *. hydraatti-varianttia, polyramnoosin sisempää ydinosaa vas- MM» taan, kun taas epäsuorat agglutinaatiotekniikat, jotka oli suunnattu ei-sakkautuviin vasta-aineisiin, havaitsivat 4 118514 korkean vasta-ainetitterin N-asetyyliglukosamiini-determi-nanttia vastaan.

Julkaisun: Zimmerman et ai (23) myöhemmät tutkimukset käyttäen 5 eri streptokokki-infektioista saatuja humaani-seerumeita osoittivat, että näiden sakkautumattomien vasta-aineiden esiintymistiheys vaihteli alhaisesta 30 prosentista populaatiossa, jota oli seurattu tarkkaan ja hoidettu streptokokki-infektioiden vuoksi, kulloinkin aina 84 prosentin korkeuteen 10 populaatiossa, joka oli äskettäin sairastunut A-ryhmän streptokokki-infektioon. He huomasivat myös, että A-ryhmän hiilihydraattiin kohdistuvan vasta-ainetitterin huippu oli 17 vuoden iässä ja että vasta-ainetittereissä tätä hiilihydraattia vastaan ei ollut mitään eroa reumapotilailla, joilla 15 oli sydänsairaus tai joilla ei ollut sydänsairautta. Nämä -tulokset erosivat Duddingin ja Ayoubin esittämistä tutkimustuloksista, joissa anti-A-ryhmän hiilihydraatti-vasta-aineet kohosivat pysyvästi reumaattisilla sydäntautia sairastavilla potilailla verrattuna niihin potilaisiin, joilla ei esiintynyt 20 läppävikaa (24).

On ollut vaikea vastata kysymykseen, onko näillä vasta-ainei- « · · V * 11a merkitystä puolustuksessa vai eikö. Lancefieldin klassinen • · :,V opsonointifagosytoosimääritys käytti valikoitua ihmisen koko- *:**: 25 verta (15, 25, 26), johon oli lisätty hyperimmuunia kaniinin seerumia, jossa oli tunnetun M-proteiini-serotyypin spesifisiä : : : vasta-aineita. Ihmisen kokoveren valikointi perustui kahteen tosiasiaan; (1) Se sisälsi ei-M-proteiinille reaktiivisia vasta-aineita ja/tai (2) se ei tehostaisi streptokokkien ·*·.. 3 0 fagosytoosia serotyypiltään spesifisen kaniinin antiseerumin .***. poissa ollessa. Kysymystä, voisiko normaali-humaani-seerumi • · · *. itsessään tehostaa fagosytoosia, ei koskaan todella esitetty.

• · · • * · • · * ··« • · *”·* KEKSINNÖN TIIVISTELMÄ 35 Tämä keksintö koskee immunogeenista koostumusta, joka suojaa nisäkkäitä A-ryhmän streptokokkibakteerien aiheuttamilta infektioilta. Immunogeeninen koostumus käsittää immunogeenisen määrän A-ryhmän streptokokkien polysakkaridia (GASP), 5 118514 jolla on seuraava rakenne: [—>2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—»]n---R; 3 5 T (I)

β-D-GlcpNAC

jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc 10 ja n on suuri lukuarvo noin 3- noin 50, ja kantajaa. Tämä GASP:n alue määrittelee epitoopin, joka saa aikaan bakteereja tappavien vasta-aineiden muodostuksen.

GASP, joka on läsnä immunogeenisissä koostumuksissa, voi olla 15 vapaana polysakkaridina tai konjugaatin komponenttina, jossa GASP on liittynyt kovalenttisesti fosfolipidiin, joka on kykenevä muodostamaan liposomin tai proteiinin. Natiivi tai rekombinantti bakteriaalinen proteiini, kuten tetanustoksoidi, koleratoksiini, dif teriatoksoidi tai CRM^, ovat esimerkkejä 20 sopivista proteiineista, joita voidaan käyttää konjugaatteina.

Toisessa suoritusmuodossa immunogeeninen proteiini liitetään liposomeja sisältävään GASP:iin, joka on sitoutunut kovalent- ··» V · tisesti fosfolipidiin.

• · • * · • · · • · *:·*: 25 Immunogeeninen koostumus on myös käyttökelpoinen rokotteena ja ^•j* voi edelleen sisältää adjuvanttia, kuten alumiinihydroksidia, : alumiinifosfaattia, monofosforyylilipidi A:ta, QS21:tä tai

• M

stearyylityrosiiniä. Tämän keksinnön mukainen immunogeeninen koostumus kykenee käynnistämään aktiivisen ja passiivisen 30 puolustusmekanismin A-ryhmän streptokokkien aiheuttamaa infek- ·**. tiota vastaan. Passiivista suojausta varten immunogeenisia • · · *, vasta-aineita tuotetaan immunisoimalla nisäkäs, joka ei ole • · · • · « "* ihminen, rokotteella, joka on tehty keksinnön mukaisesta • · *;·’ immunogeenisesta koostumuksesta ja sitten immunogeeniset 35 vasta-aineet otetaan talteen nisäkkäästä.

• i· • « • · ··· 118514 Tämä keksintö koskee myös keksinnönmukaisten koostumusten käyttöä nisäkkäitä A-ryhmän streptokokkibakteerien aiheuttamia infektiota suojaavan lääkkeen valmistamiseksi antamalla immunogeeninen määrä keksinnönmukaisia koostumuksia.

5

Toisessa suoritusmuodossa tämä keksintö koskee menetelmää im-munogeenisen koostumuksen tuottamiseksi, joka sisältää kova-lenttisesti liposomeihin liittyneen GASPin; liposomit liuotetaan sopivaan puskuriin hydrofobisiin proteiineihin liuotta-10 mistä varten; liuenneet liposomit yhdistetään proteiiniin, joka on liuotettu puskuriin, jolloin muodostuu liposomien ja proteiinin kompleksi. Proteiini/liposomikompleksi erotetaan sitten puskurista.

15 Tämän keksinnön kohteena ovat immunogeeniset koostumukset jotka ovat käyttökelpoisia vasta-ainemuodostuksen lisäämiseksi, jolloin vasta-aineita voidaan käyttää profylaktisiin ja diagnostisiin tarkoituksiin. Edelleen tämän keksinnön kohteena on immunogeenisen koostumuksen käyttö sellaisen lääkkeen 20 valmistamiseksi, joka suojaa A-ryhmän streptokokkibakteerien aiheuttamalta infektiolta. Edelleen keksinnön kohteena ovat menetelmät GASP:in liittämiseksi kovalenttisesti proteiiniin immunogeenisen konjugaatin muodostamiseksi. Edullisena pide-tyssä suoritusmuodossa konjugaatilla on kaava 25 • · ....: [->2) -α-L-Rhap- (l-»3) -α-L-Rhap- (l-»]n---R1 -CH2-NH-proteiini 3 *

*·*· A

t (I) • · · • · » ... i ® · · x • · · 30 S-D-GlcpNAc • · • ·

• M

.•••# jossa R’ on terminaalisen pelkistävän sokerin pelkistys- ja • · *·’ hapetustuote. Edelleen tämän keksinnön kohteena on immunogee- • · · **:·* nisten koostumuksien käyttö, jonka tarkoituksena on suojata A- • · · ·...* 3 5 ryhmän sptreptokokkien aiheuttamilta infektioilta niissä popu- ··· laatioissa, joilla on suurin riski sairastua A-ryhmän strepto- ··· kokkien aiheuttamiin infektioihin ja tauteihin, nimittäin aikuisilla, raskaana olevilla naisilla ja erityisesti pikkulapsilla ja lapsilla.

• i* 7 118514

ROVIOIDEN LYHYT KUVAUS

Kuvio 1 esittää kaaviomaisesti rakennekuvan A-ryhmän hiilihydraatista (kuvio IA) ja A-ryhmän hiilihydraatti-variantista (kuvio IB). A-ryhmän hiilihydraatin kolmiulotteisen 5 rakenteen kuva tukee selvästi sitä havaintoa, että hiilihydraatin serologinen spesifisyys suuntautuu hiilihydraatin N-asetyyliglukosamiini-puolikasta vastaan.

Kuvio 2 kuvaa graafisesti A-ryhmän streptokokkien hiilihyd-10 raatti-vasta-aineiden ELISA-titterimäärityksiä normaalilap- silla, jotka ovat iältään 5 ja 10 vuotta ja asuvat Trinidadissa ja New Yorkissa. Lukemat olivat päätepistemäärityksis-sä 1,0 OD aallonpituudella 405 nm.

15 Kuvio 3 kuvaa graafisesti ELlSA-inhibitiomäärityksiä ihmi sen seerumeilla, joissa on tunnetusti vasta-aineita, jotka ovat reaktiivisia A-ryhmän liposome ja vastaan. Seerumit laimennettiin keskimäärin, jotta saataisiin arvo 1,0 OD yksikköä aallonpituudella 405 nm ja sekoitettiin vaihtelevien 20 konsentraatioiden eri antigeenejä kanssa 1 tunnin ajan 37 eC:ssa, sentrifugoitiin 5 minuuttia kierrosnopudella 10.000 rpm. Supernatantit testattiin reaktiivisuuden suhteen ELISA-analyysiä käyttäen esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

* Arvo kuvaa testattujen seerumien keskiarvoa.

• « * · * ~ — *.·.* 25 *i'” Kuvio 4 kuvaa graafisesti epäsuoraa bakterisidista määritys- *:* tä käyttäen pestyä ihmisen verta, johon oli lisätty eri *·»· 1 ·*; seerumeita koeputkissa, jotka sisälsivät RPMI:tä ja esimer- *·· kissä 1 kuvattua komplementtia. Alkuperäisenä inokulaattina 30 eli siirrosteena oli A-ryhmän tyyppiä 6 olevien streptokok-kien yhdeksän CFU:ta. Paneeli A osoittaa organismin kasvun ϊ ϊ ! pyöritellyissä putkissa, jotka sisältävät normaalia kaniinin J * · *, seerumia. Paneeli B osoittaa kasvun paikallaan olevissa put- * ♦ V*: kissa, joissa oli humaani-seerumia, jonka ELISA-titteri oli ·:*·: 35 korkea ja joka oli reaktiivinen A-ryhmän hiilihydraattia vastaan. Paneeli C osoittaa kasvun estymisen samalla humaa- • · « * *. niseerumilla kuin paneelissa B, mutta pyöritellyssä putkes- • · sa.

8 118514

Kuvio 5 kuvaa graafisesti epäsuoraa bakterisidista määritystä, kuten on kuvattu kuviossa 4. Organismit olivat serotyyp-piä 3 (kanta D58/11/3), serotyyppiä 6 (kanta S43), sero-tyyppiä 14 (kanta S23/101/5), ja serotyyppiä 28 (kanta T28/-5 isoA/5). Vasen akseli kuvaa kasvupesäkkeitä muodostavien yksiköiden lukumäärän pyöritellyissä putkissa versus paikallaan olevat putket. Oikea akseli osoittaa organismien tappo-prosentin pyöritellyissä putkissa versus paikallaan olevat putket.

10

Kuvio 6 kuvaa graafisesti hepariinin vaikutuksen epäsuorissa bakterisidisissa määrityksissä. Epäsuora bakterisidinen määritys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, mutta kahtena. Hepariini (5 yksikköä/ml) lisättiin toiseen ryhmään paikal-15 laan olevia ja pyöriteltyjä putkia, kun taas toista ryhmää putkia käytettiin normaaleihin bakterisidisen määrityksen kontrolleihin. Käytetyn hepariinin standardimäärä bakterisidisissa määrityksissä, kuten Lancefield on kuvannut, on 10 yksikköä/ml (33 - 35). Kuten voidaan nähdä hepariini, puolet 20 tavallisesti kuvatusta konsentraatiosta, vähentää nopeasti anti-A-ryhmän hiilihydraatti-vasta-ainemäärän tappoasteesta riippuen.

/:*: Kuvio 7 kuvaa graafisesti anti-A-ryhmän hiilihydraatti- .*/. 25 tittereiden bakterisidisia määrityksiä, kuten ELISA-mene- ♦ · „,.j telmällä mitattiin. 17 yksilöllistä humaani-seerumia testat- e · tiin molemmissa analyyseissä käyttäen serotyypin 6 organis-**" mia. Huomioi, että kaikilla seerumeilla (13/13) havaittiin j { · ;;** CHO-titteri suuremmaksi kuin 200.000, osoittaen yli 80 % J * · ** ' 30 tappoasteen bakteerimäärityksessä. Päinvastoin ainoastaan yksi neljästä seerumista, jonka titteri oli alle 200.00, te-hosti organismin opsonointifagosytoosia ja fagosytoosiaste «»· ’ oli alle sen, mikä havaittiin korkeatitterisillä seerumeil- i

• I 1 A

» · · ia · * M k · 35 • · . Kuvio 8 kuvaa graafisesti opsonointifagosyyttisiä bakteri- • · sidisia määrityksiä, kuten esimerkissä l on kuvattu. Orga-*!**ί nismien fagosytoosi ilmaistaan organismin tappoprosentteina verrattuna stationäärisiin kontrolleihin. Pylväät osoittavat 9 118514 tappoprosentin ennen N-asetyyliglukosamiini-affiniteettipyl-väällä tapahtuvaa adsorptiota, affiniteettipylväällä tapahtuneen absorption jälkeen ja pylväästä eluoitujen vasta-aineiden tappoprosentin. Huomioi tappamisen täydellinen 5 puuttuminen kaikista seerumeista N-asetyyliglukosamiini- affiniteettipylväällä tapahtuneen absorption jälkeen ja opsonointifagosyyttisen bakterisidisen aktiviteetin osittainen talteenotto sen jälkeen, kun vasta-aineet on eluoitu af f initeettipylväästä. standardi virhe osoitetaan jokaisessa 10 tapauksessa lukuunottamatta absorboituneita seerumeita, joista tappaminen puuttui kokonaan.

Kuvio 9 kuvaa graafisesti kaniinin seerumin opsonointifago-syyttistä indeksiä, jolloin kaniinin seerumilla on tunnetus-15 ti korkeat anti-A-ryhmän hiilihydraatti-vasta-ainetitterit sen jälkeen, kun on immunisoitu A-ryhmän strepokokin hiilihydraatilla. Organismien fagosytoosi kuvataan organismin tappoprosenttina verrattuna stationäärisiin kontrolleihin. Huomioi organismin fagosytoosin puuttuminen tittereillä 20 < 50.000, tappamisen asteittainen kasvu tittereillä: 75.000 ja täydellinen fagosytoosi tittereillä: >100.000. Näihin tutkimuksiin käytetty organismi oli A-ryhmän 6-tyyppiä oleva kanta ja siirrosteena olivat 4 kasvupesäkettä muodostavat • t V : yksiköt.

*V: 25

'··'! KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

*»· Ottaen huomioon tunnetut serologiset tiedot, jotka saadaan i»»· » ·*. osoittamalla hiilihydraattivasta-aineet humaani-seerumeis-

Ml j*:·. sa, yhdistettynä ikään suhteutettuun puolustuksen aikaansaa- 30 miseen muilla hiilihydraatti-antigeeneilla, nimittäin pneu mokokkien (27), meningokokkien (4) ja Haemophilus-bakteerien : « : polysakkarideilla (5), päätimme tutkia uudelleen eri humaa- • m · * ni-seerume ja hiilihydraatti-vasta-aineiden läsnäolon suhteen molemmissa normaalipopulaatioissa ja niissä populaatioissa, ·;··· 35 joissa esiintyi streptokokki-infektioita. Nämä tutkimukset käsittivät myös potilaat, joilla oli streptokokki-infektion ti# * *, jälkitauti. Puhdistettu A-ryhmän hiilihydraatti liitettiin #·*·· kovalenttisesti synteettiseen fosfatidyylietanoliamiiniin, joka oli liitetty liposomeihin, ja käytettiin ELISA-menetel- 10 118514 mään perustuvaa määritystä. Tämä keksintö osoittaa, että vasta-aineet A-ryhmän hiilihydraatti-antigeenia vastaan, havaitaan jo humaani-seerumeissa. Edelleen riippuen maantieteellisestä populaatiosta ja altistumisesta streptokkien 5 aiheuttamalle sairaudelle, näiden vasta-aineiden määrän riippuvuus on ikään suhteutettu. Vasta-ainetitterin kasvu A-ryhmän hiilihydraattia vastaan osoitettiin myös seuraten tunnettua streptokokki-infektiota. Saadaksemme vastauksen kysymykseen, voisivatko nämä vasta-aineet tai osa näitä vasta-10 aineita, jotka olivat reaktiivisia A-ryhmän hiilihydraattia vastaan, tehostaa opsonointifagosytoosia vai ei, käytimme Lancefieldin modifioitua bakterisidista määritystä. Tulokseksi saatavat tiedot osoittavat, että nämä vasta-aineet ovat opso-nisoivia ja epitoopit, joita vastaan opsonisoivat A-ryhmän 15 hiilihydraattivasta-aineet suunnataan, ovat ei-redusoivia terminaalisia N-asetyyliglukosamiini-jäänteitä.

Keksintö koskee sekä immunogeenista koostumusta ja sen käyttöä nisäkkäitä A-ryhmän streptokokkibakteerien aiheuttamalta 20 infektiolta suojaavan lääkkeen valmistamiseksi. Tämän keksinnön mukaiset immunogeeniset konjugaatit muodostetaan liittämällä A-ryhmän streptokokin polysakkaridi (GASP) kova- * * · ϊ#ϊ : lenttisesti sopivaan proteiiniin tai liposomeja muodostavaan :e:*: fosfolipidiin.

·:··: 25 ·;* A-ryhmän streptokokin eristäminen ja kasvatus ja A-ryhmän »t·· : polysakkaridin valmistus suoritetaan julkaisussa: McCarty (28) • · · ·*:*· ja Dubois et ai. (31) kuvattujen menetelmien mukaisesti, jotka on liitetty tähän referenssinä. Eristetyllä GASP:illa on 30 seuraava kemiallinen rakenne: • · ··· • · * · *, [->2) -α-L-Rhap- (l-»3) -α-L-Rhap- (l-»]n---R; • * · * · · ·*· 3 y t dj . *:* 3 5 1 *··· S*": β-D-GlcpNAc jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc 11 118514 ja n on toistuvien yksiköiden lukumäärä, joka on noin 1 -noin 50. Vielä edullisemmin n on noin 3 - noin 30, jolloin optimaalinen määrä on noin 20. Kuten tässä on käytetty, termillä polysakkaridi tarkoitetaan mitä tahansa sakkaridien 5 polymeeriä ja se käsittää disakkaridit, oligosakkaridit jne. A-ryhmän streptokokki-variantti-viljelmät, jotka tuottavat edellä olevan polysakkaridirakenteen, ovat talletettuina kokoelmassa: American Type Culture Collection, Rocville md. GASP:in tulisi olla riittävän kokoinen immunogeenisen vas-10 teen herättämiseksi yksilöissä. Edullisin keskimääräinen molekyylipaino on suunnilleen 10 kilodaltonia. GASP:in yksinkertaisen toistuvan määrän molekyylipaino on suunnilleen 500 daltöniä.

Keksijän edullisena pidetyssä suoritusmuodossa GASP on liit-15 tynyt proteiiniin kovalenttisesti muodostaakseen konjugaa- tin. Tällaiset konjugaatit muuttavat edullisesti immunogeenisen vasteen polysakkaridia vastaan, esimerkiksi vaste, joka on T-solusta riippumaton tulee T-solusta riippuvaiseksi. Tämän mukaisesti mikä tahansa niiden proteiini tai frag-20 mentti, jota yksilö sietää ja joka on kykenevä herättämään T-solusta riippuvaisen vasteen, soveltuu liitettäväksi • · · V ! GASP:iin. Olennaista on, että mikä tahansa proteiini voisi toimia konjugaatti-proteiinina. Spesifisesti valikoidulla • · ··♦·· proteiinilla täytyy olla vähintään yksi vapaa aminoryhmä 25 käytettäväksi konjugaationa A-ryhmän polysakkaridin kanssa.

»Ml . Proteiini on edullisesti mikä tahansa natiivi tai rekombi- • · · nantti bakteriaalinen proteiini ja se on itse immunogeeninen « l « herättävä T-solu, joka on riippuvainen vasteista sekä nuo-rissa että aikuisissa nisäkkäissä. Esimerkkinä tällaisista • · • ’* 30 proteiineista ovat tetanustoksoidi, koleratoksiini, difte- riatoksoidi ja CRM197, vaikka keksintö ei olekaan rajoittunut * • ;*· niihin. Muut konjugaatti-proteiiniehdokkaat käsittävät seu- • · .*··. raavi en bakteerien: pseudomonas, staphylococcus, streptococ- ** cus, pertussis ja enterotoksigeeniset bakteerit, mukaan lu- ··· *··ί 35 kien Escherichia coli, erittämät toksiinit ja toksoidit.

··· • * • * *** 12 118514

Edullisena pidetyssä suoritusmuodossa tämän keksinnön mukaiset konjugaattimolekyylit käsittävät proteiini-ydinosan, johon GASP:it ovat liittyneet terminaalisen pelkistävän sokerin modifioidun muodon kautta. Tällaiset konjugaattimo-5 lekyylit käsittäisivät tämän vuoksi monofunktionalisoidun GASP:iin liittyneen proteiinin. Edullisesti useampi GASP, spesifisesti noin 1-12 GASP:ia on liittynyt jokaiseen proteiiniin. Edullisimmin vähintään noin viisi GASP:ia on liittynyt jokaiseen proteiiniin.

10

Toisessa suoritusmuodossa GASP:it ovat liittyneet proteiiniin jokaisen GASP:in kahden tai useamman kohdan kautta. Siitä lähtien, kun bakterisidinen epitooppi ilmestyy ollakseen läsnä GASP:ia toistavien yksiköiden haarassa, pitäisi 15 tapahtua GASP:in funktionalisointi ja liittyminen proteiiniin tavalla, joka säilyttää immunogeenisen määrän bakteri-sidista epitooppia.

Proteiini, johon GASP konjugoidaan, voi olla natiivi tok-20 siini tai toksiini, josta myrkky on poistettu (s.o. toksoi-di). Voidaan myös käyttää proteiinitoksiinin ei-toksisia mutaatio-muotoja. Tällaiset mutaatiot pitävät sisällään edullisesti natiivin toksiinin epitoopit. Tällaisia mutatoi-tuja toksiineja on nimitetty "ristiin reagoiviksi materiaa- • · * . 25 leiksi" tai CRM:ksi. CRM197, jolla on yksinkertainen amino- • » t '*’·] happoketju ja joka on peräisin aktiivisesta difteriatoksii- • * nista ja on immunologisesti mahdoton erottaa siitä, on ..I:* Haemophilus inf luenzae-konj ugaatti rokotteen komponentti, M.5 jota on käytetty paljon lapsilla.

·«· : : : 30

Corynebacterium diphtheria kannan C7 (B197) viljelmä, joka • ;*· tuottaa CRM197-proteiinia, on talletettuna kokoelmaan: Ameri- ··· can Type Culture Collection, Rockville, Md. (saantinumero / . ATCC 53281).

• » · *· ·: 35 ** * Proteiinien fragmentteja voidaan myös käyttää GASP:iin ·*;*: konjugointia varten, edellyttäen, että ne ovat riittävän • · pitkiä, toisin sanoen edullisesti vähintään 10 aminohapon pituisia kyetäkseen määrittelemään T-solu-epitoopin.

» 118514

Useita kon jugointimenetelmiä voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten A-ryhmän polysakkaridi-proteiinikonjugaattien kehittämiseksi. Käytetty menetelmä olisi edullisesti menetelmä, joka säilyttää bakterisidisen epitoopin immunogeenisuu-5 den, jolloin epitooppi on läsnä β-D-GlcpNAc-haaroissa, jotka ovat liittyneet glykosidisesti ramnoosin 3-asemaan. Jos yksinkertainen GASP sitoo kaksi tai useamman proteiinimole-kyylin, niin tuloksena oleva konjugaatti liitetään ristiin proteiiniin nähden. Ristiin liittymisastetta ja konjugaatti-10 molekyylin kokoa voidaan säädellä rutiinimuuntelulla konju- gointireaktion aikana käytetyissä olosuhteissa, jotka ovat hyvin tunnettuja. Tällaiset muuntelut käsittävät esimerkiksi konjugointireaktion asteen ja reaktioseoksessa olevien proteiinien ja GASP:in määrän.

15

Tunnetaan useita erilaisia kemiallisia menetelmiä polysakkaridien konjugoimiseksi proteiiniin ja niitä on kuvattu esimerkiksi US patentissa 4,644,059, joka on liitetty oheen referenssinä ja kuvaa konjugaattia, joka on tehty käyttäen 20 adipiinihappodihydratsidia (ADH) homodifunktionaalisena linkkerinä. US patentti 4,695, 624, joka on myös liitetty oheen referenssinä, kuvaa polysakkaridien ja konjugaattien valmistusmenetelmiä käyttäen kaksineuvoisia välitilamolekyy-lejä. Yleiskatsaus eri valmistusmenetelmistä ja faktoreis- • · *·’ * 25 ta, joita on käytetty suunnitelluissa konjugaateissa, on « · V.: esitetty julkaisussa: Dick, William E. ja Michel Beurret,

Contrib. Microbiol. Inmunol. (1989), Voi. 10 pp. 48 - 114, t>*j* joka on myös liitetty oheen referenssinä. Edullisena pidetty : konjugointimenetelmä tämän keksinnön mukaisille GASP-prote- ··· 30 Unikonjugaateille on pelkistävä aminointi, kuten US paten- tissa 4,356,170 on kuvattu ja joka on liitetty oheen refe- . ,·, renssinä. Lyhyesti edullisena pidetyssä suoritusmuodossa, • · · ’•Y.' GASP:in terminaalinen pelkistävä sokeri pelkistetään avoi- « « « *. meksi renkaaksi käyttäen heikkoa pelkistintä, esim. natrium- • · *·.*': 35 boorihydridiä tai sen ekvivalenttia.

• *

Seuraavaksi natriummetaperjodaatilla tai sen ekvivalentilla • · · tapahtuvaa selektiivistä hapetusta käytetään hapettamaan • · aikaisemmin pelkistetyn sokerin puolikkaan terminaaliset 14 118514 vierekkäiset hydroksyyliryhmät, jolloin muodostuu terminaalinen aldehydiryhmä. Tämä muodostaa aktivoidun GASP:in, joka kykenee nyt sitoutumaan kovalenttisesti valittuun proteiini-kantajaan. Toisessa tämän keksinnön mukaisessa suoritusmuo-5 dossa tämä aktivoitu GASP voi myös olla kovalenttisesti sitoutunut fosfolipidiin, kuten fosfatidyylietanoliamiiniin, jotka ovat liposomien muodossa. Aktivoidun GASP:in kemiallinen rakenne on seuraavanlainen:

10 [-2) -o-L-Rhap- (1-3) -α-L-Rhap- (1- ] „---R'CHO

3 t B-D-GlcpNAc 15 jossa R' on terminaalisen pelkistävän sokerin pelkistys- ja hapetustuote, poikkeuksena terminaalisen pelkistävän sokerin osa, joka muodostaa aldehydijäänteen (OHO). Keskimäärin 10 mg polysakkaridia hapetetaan sopivasti noin 1 ml:11a keski-20 määrin 20 mM natriummetaperjodaattiliuosta suunnilleen 10 -15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Reaktioaikaa voidaan vaihdella muiden perjodaattimäärien mukaisesti vastaavien hapetusten saavuttamiseksi. Pelkistys ja terminaalisen pel-kistävän sokerin avaus saa aikaan vierekkäiset hydroksyyli- • 1 » .1 . 25 ryhmät pelkistävässä sokerissa ollakseen paljon reaktiivi- • · · * # · * 1, sempia kuin ne, jotka ovat läsnä glykosidisesti liittyneissä β-D-GlcpNAc-haaroissa. Kuitenkin lisäliitoskohdat voivat il- • · ···! maantua yhtä hyvin joidenkin glykosidisesti liittyneiden β- :.i,! D-GlcpNAc-jäänteiden hapettumisen seurauksena. Aktivoitu • ·1 J.: : 30 GASP ja valikoitu konjugoiva proteiini konjugoidaan sitten syanoboorihydraatti-ionien tai jonkin muun pelkistävän : aineen läsnä ollessa, kytkemällä kantajaproteiinin aminoryh- ··· .·1:1: mät GASP:in terminaalisiin aldehydiryhmiin. A-ryhmän poly- .1 . sakkaridi ja proteiini liitetään sen vuoksi -CH2-NH-proteii- * · · *· 1: 35 niliitokseen, kuten kaavassa II.

* r • •Ml • · · • · · • 1 · • · * (MM • 1 „ 118514 [-»2) -α-L-Rhap- (1-+3) -α-L-Rhap- (l-> ]n R ' -CH2-NH-protei ini 3 t (I) 5 B-D-GlcpNAc

Tulokseksi saatavilla GASP-proteiini-konjugaateilla, jotka on saatu pelkistävästä aminointiprosessista, on edullisesti rajoittunut ristiin-sitoutuminen ja ne liukenevat edullisesti vesipitoisiin liuoksiin. Tämä tekee keksinnön mukaisen 10 GASP-proteiini-konjugaatin edullisena pidetyksi ehdokkaaksi käytettäväksi rokotteena.

Toisessa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa GASP:it on liitetty liposomeihin, jolloin ne muodostavat immunogeenisen 15 koostumuksen. Liposomeja käytetään usein konjugaateissa, koska ne kykenevät aikaansaamaan "sieppausvaikutuksen" B-lymfosyyteissä. Olematta teoriassa sidos, GASP-liposomi-konjugaattien uskotaan nostavan vasta-ainetittereitä sieppaamalla siten aktivoituvat B-lymfosyytit. Sieppausilmiö on 20 hyvin tunnettu solubiologiassa. Lyhyesti liposomaalisten rakenteellisten tunnusmerkkien johdosta liposomit kykenevät olemaan antigeeniin liitettyinä ja sillä tavalla luomaan multivalentteja immunogeenisia rakenteita. Koska reseptori- . molekyylit ovat liposomien solumembraanissa liikkuvia, monet • » · ‘ . 25 näistä reseptoreista voivat olla sitoutuneet ristiin kaksi- • · · ***'[ arvoisilla reagensseilla muodostaakseen kaksidimensionaali- * * sen presipitaation alueet tai ’’täplät”. Nämä täplät liitty- vät yhteen tai ryhmittyvät B-lymfosyyttien vastakkaisiin *.·/ päihin muodostaen vaipan lymfosyytin solumembraaniin. Tämä ij*: 30 antigeenin vaihe, jossa solukalvon vasta-ainemolekyylit ryh mittyvät antigeeniin sitoutumisen jälkeen solun pinnan tie- . .*. tylle alueelle (capping) B-lymfosyyteiksi, jos se tapahtuu · effektori-auttaja-T-solujen läsnä ollessa, aktivoi vasta- / 4 ainetuotannon B-lymfosyyttien avulla.

· · *· *: 35 * * Tunnetaan useita menetelmiä polysakkaridien konjugoimiseksi liposomeihin ja niitä on kuvattu esimerkiksi US patentissa * · 5,283,185, joka on liitettynä oheen referenssinä ja kuvaa nukleiinihappojen siirtoa soluihin valmistamalla kationisen 16 118514 lipidin seos-lipididispersio kolipidin kanssa ja sitten johtamalla nukleiinihapot dispersioon, jolloin muodostuu kompleksi. Soluja käsitellään sitten tällä kompleksilla. Tämän keksinnön edullisena pidetyssä suoritusmuodossa liposomeja 5 tuotetaan dispergoimalla lipidi vesipitoiseen liuokseen joko ruiskuttamalla ohuen injektioneulan lävitse tai edullisesti sonikoimalla, kuten on kuvattu julkaisussa: Fillit, H. M. Miian Blake, Christa MacDonald ja Maclyn McCarty (1988), "Immunogenicity of liposome-bound hyaluronate in mice, J. 10 Exp. Med. 168 : 971 - 982", joka on liitetty oheen referenssinä.

Valmistettaessa liposomeja, jotka sisältävät fosfolipidin kovalenttisesti liittyneenä GASP-komponenttiin, liposomit 15 muodostetaan tunnettu jen menetelmien mukaisesti. Esimerkiksi tämän keksinnön eräässä suoritusmuodossa fosfatidyylietano-liamiini liuotetaan liuottimeen, kuten kloroformiin ja lisätään astiaan. Kloroformi liuotin poistetaan sitten pinnoittamalla astia fosfatidyylietanoliamiinilla. Sitten astiaan li-20 sätään vesipitoista puskuria, kuten vettä tai fosfaattipus-kuroitua suolaliuosta (PBS) ja seos sonikoidaan liposomien muodostamiseksi. GASP, joka on edullisesti aktivoitu pelkistämällä ja sen jälkeen hapettamalla, lisätään sitten li- . . posomeihin yhtä suurena molaarisena määränä ja kahta kompo- • · *;*,* 25 nenttia sekoitetaan yön ajan minkä tahansa sopivan puskurin, • * * '·*] kuten suolaliuoksen, Ringerin liuoksen tai edullisimmin fos- * * faattipuskuroidun suolaliuoksen (PBS) läsnä ollessa. Sitten seokseen lisätään natriumsyanoboorihydridiä stabiilin kova-ϊ.ί.ϊ lenttisen sidoksen muodostamiseksi fosfatidyylietanoliamii- ΓΓ: 30 nin ja GASP-polysakkaridin välille. Kaavassa III osoitettu lopputuote voidaan erottaa natriumsyanoboorihydridistä sent- . rifugoimalla, molekyyliseulakromatografiällä tai dialyysil- * · · lä.

( i t * · **.*·: 35 [ -*·2) -α-L-Rhap- (1^3) -α-L-Rhap- (1- ] n---R'-CH2-NH-R2 t (III) • · · ' ' • * ....: i • · B-D-GlcpNAc 17 118514 R' ja n merkitsevät kaavassa III samaa kuin on kuvattu aikaisemmin ja R2 on fosfatidyylietanoliamiini.

Edullisena pidetyssä suoritusmuodossa GASP-liposomit yhdiste-5 tään proteiiniin hydrofobisen proteiinin liittämiseksi liposo-meihin. Yhden menetelmän mukaisesti GASP-liposomit liuotetaan 5-prosenttiseen β-oktyyliglukosidi-liuokseen. Liposomeihin lisättävä proteiini liuotetaan myös 5-prosenttiseen β-oktyyli-glukosidiin ja proteiini ja liposomit yhdistetään. Sekoitta-10 misen jälkeen proteiinin liittämiseksi liposomiin, β-oktyyli-glukosidi poistetaan dialyysillä. Tulokseksi saatavaa GASP-liposomi-proteiini-kompleksia voidaan sitten käyttää immuno-geenina tai rokotteena.

15 GASP voidaan myös liittää fosfolipideihin käyttäen muita vähemmän edullisena pidettyjä tekniikoita, kuten käyttäen bentsokinonia, kuten on kuvattu julkaisussa: Fillit, H. M. M. McCarty ja M. S. Blake (1986), "The induction of antibodies to hyaluronic acid by immunization of rabbits with encapsulated 20 streptococci J. Exp. Med. 164 : 762 - 776", joka on liitetty tähän referenssinä. Tällaisten reagenssien käyttö ei voi kuitenkaan olla toivottavaa, jos koostumusta on tarkoitus käyttää rokotteena.

··♦ • · · ♦ · · ♦ V.· 25 Keksinnönmukaisia immunogeenisia koostumuksia voidaan käyttää *ϊ**ί keinona lisätä vasta-ainetuotantoa, jolloin vasta-aineita käy- >p*j* tetään profylaktisiin ja diagnostisiin tarkoituksiin. Diagnosoi*: tiikkaa voidaan käyttää erityisesti eri A-ryhmän streptokok- :*·’: kien aiheuttamien infektioiden ja tautien seurantaan ja ha- 30 vaitsemiseen. Toinen keksinnön suoritusmuoto käyttää immuno- •\# geenisiä koostumuksia immunogeenina, joka on tarkoitettu käy- .*·*. tettäväksi sekä aktiivisessa että passiivisessa immunogeeni- ··· ·. sessa puolustuksessa niillä yksilöillä, joilla on riski · · "** sairastua A-ryhmän streptokokkien aiheuttamiin infektioihin · *”·* 35 tai tauteihin. Passiiviseen puolustukseen käytettyjä immuno- geeni-sia vasta-aineita tuotetaan immunisoimalla nisäkäs, joka ei ole ihminen, millä tahansa keksinnönmukaisella immunogeeni-sella koostumuksella ja sitten ottamalla bakterisidiset vasta-aineet talteen nisäkkäistä gammaglobuliinifraktiona tai seerumina X o 118514 tai spesifisinä vasta-aineina. Esimerkiksi tämän keksinnön mukaiset rokotteet kykenevät aikaansaamaan vasta-aineita, jotka ovat hyödyllisiä ja suojaavat A-ryhmän streptokokki-bakteerien aiheuttamilta infektioilta.

5

Lisäksi itse A-ryhmän polysakkarideja voidaan käyttää immunisoivana aineena edullisesti yhdessä adjuvantin, kuten alumiinihydroksidin, alumiinifosfaatin, monofosforyylilipidi A:n, QS21:n tai stearyylityrosiinin kanssa. Keksinnön toinen 10 suoritusmuoto on käyttää immunogeenisia koostumuksia immuno-geenisena suojana A-ryhmän streptokokkien aiheuttamaa infektiota vastaan. Ertyisesti tämä keksintö tarjoaisi suojausta niille populaatioille, joilla on suurin riski saada A-ryhmän streptokokkien aiheuttamia infektioita tai sairauksia, ni-15 mittäin aikuisille, raskaana oleville naisille ja erityisesti pikkulapsille ja lapsille.

Keksinnön mukaiset immunogeeniset koostumukset ja rokotteet muodostetaan tyypillisesti dispergoimalla GASP tai konju-20 gaatti sopivaan farmaseutisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen, kuten fysiologiseen suolaliuokseen, fosfaattipus-kuroituun suolaliuokseen tai muihin injisoitaviin nesteisiin. Rokote annetaan parenteraalisesti, esimerkiksi ruis- ..' keena ihonalaiseen kudokseen, intraperitoneaalisesti tai • · » ;. 25 ruiskeena lihakseen. Rokotteessa voi myös olla tavanomaisia • 1 · ***·[ lisäaineita, esimerkiksi stabilisaattoreita, kuten laktoosia e · · • 1 tai sorbitolia ja adjuvantteja, kuten alumiinifosfaattia, alumiinihydroksidia, alumiinisulfaattia, monofosforyylilipi- *,·.1 di A:ta, QS21:tä tai stearyylityrosiinia.

·«· : : : 30

Immunogeenisten koostumusten annos on sellainen, joka ai- . .1. kaansaa immunogeenisesti tehokkaita tuloksia. Annokset ovat ··· .·;·, normaalisti alueella: noin 0,01 ng - noin 10 μg/painokilo.

t Voidaan myös antaa useamman annoksen sarja optimaalisen im- « » · *·'· 35 muniteetin saavuttamiseksi. Rokotteen annosyksikkömuodot voidaan antaa GASP:in tai konjugaatin määrien kanssa ekviva-lenttisina alkaen noin 0,01 μg:sta noin 10 μg:aan.

» · • ·

Keksintöä selvennetään seuraavilla ei-rajoittavilla esimer- 19 118514 keillä.

Esimerkki 1

Menetelmät A-ryhmän streptokokkien hiilihydraatti-vasta-5 aineiden kasvattamiseksi, valmistamiseksi ja määrittämiseksi ja niiden käyttö uutena rokotteena aikuisilla ja lapsilla, on lueteltu seuraavasti.

A-rvhmän streptokokin kasvu 10 -70 °C:sta uuden kannan A-ryhmän streptokokkia siveltiin elatusainelevylle, joka sisältää 3 g/1 Todd Hewitt-bakteeri-en kasvatusliuosta ja 3 g/1 hiivauutetta (GAS-elatusaine). Levyä inkuboitiin 37 °C:ssa 48 tunnin ajan, jona aikana kasvupesäkkeet (8-9) siirrettiin 200 ml GAS-elatusainetta 15 sisältävään ravistuspulloon ja kasvatettiin 18 tunnin ajan 37 eC:ssa kierrosnopeuden ollessa 120 rpm. Kantaviljelmä (150 ml) siirrettiin 15 litran fermentoriin (New Brunswick, BioFlo 4) Todd Hewitt-bakteerien kasvatus liuoksessa. Viljelmää kasvatettiin 7-8 tunnin ajan 37 ‘C:ssa pH:n ollessa 20 7,0. Glukoosia lisättiin 3 g/1, kun viljelmä oli saavuttanut stationäärifaasin (optinen tiheys aallonpituudella 600 nm noin 1,5). Viljelmän annettiin kasvaa vielä 8 tunnin ajan ja otettiin talteen. Lopullinen optinen tiheys on keskimäärin , , 2,7 aallonpituudella 600 nm.

• SS

:. 25 • » · v\ A-rvhmän streptokokin polysakkaridin valmistus * * 60 g A-ryhmän streptokokkisoluja 600 ml:ssa vettä yhdistet- tiin 75 ml:aan 4 N natriumnitriittiä ja 75 ml:aan jääetik-*.·/ kaa. Liuosta sekoitettiin 15 minuuttia ja sentrifugoitiin 10 iT: 30 minuuttia kierrosnopeudella 11.000 rpm SS34-roottorissa. Su- pernatantti poistettiin, dialysoitiin vettä vasten ja lyo-. .*. filisoitiin. A-ryhmän polysakkaridi puhdistettiin käsitte- /:·. lemättömästä lyofilisoidusta uutteesta geelisuodatuksella « · 4 /t Sephadex G-50-pylvään läpi (Pharmacia) käyttäen eluenttina '· *i 35 PBS:ää. Pylväästä eluoituja fraktioita tarkkailtiin hiili-hydraatin esiintymisen suhteen käyttäen Dubois'n (31) feno- * lirikkihappomääritystä. Hiilihydraatti-positiiviset fraktiot M Φ yhdistettiin, dialysoitiin 4 °C:ssa vettä vasten ja lyofili-soitiin. Polysakkaridivalmiste (240 mg) sisälsi alle 1 % 20 1 1 851 4 (w/w) proteiineja ja nukleiinihappoja. Sen puhtaus vahvistettiin edelleen ^-NMRrllä 500 MHz:ssa käyttäen AM-500 BRUKER-spektrometria.

5 Ljposomien valmistus: A-ryhmän streptokokin hiilihydraatti eristettiin käyttäen edellä julkaisussa: McCarty (28) kuvattuja menetelmiä. Lyo-filisoitu materiaali suspendoitiin uudelleen, saatettiin tilavuuteen 10 mg/ml ja liitettiin kovalenttisesti lipo-10 someihin edellä julkaisussa: Fillit et ai (18) kuvattujen menetelmien mukaisesti käyttäen bentsokinonia liittävänä aineena, joka on esitetty referenssinä koskien streptokokkien hyaluronaattia. Lyhyesti GÄSP:in annetaan reagoida bentsokinonin kanssa aktivoidun väliaineen muodostamiseksi. 15 Tämän väliaineen annetaan sitten reagoida fosfatidyylietano- liamiinin kanssa liposomin muodossa immunogeenisen GASP-li-posomi-konjugaatin muodostamiseksi.

ELISA-vasta-ainemääritvkset: ELISA-menetelmää kuvattiin 20 oleellisesti julkaisussa: Fillit et ai (18) seuraavin modifikaatioin. Alkutestaus humaani-seerumeilla osoitti, että 0,5 μς liposomaalisen valmisteen CHO:ta/ml PBS:ssä, pH:n ollessa 7,2, mikrotitterilevyjen herkistämiseksi antaa par- , . haimmat tulokset liposomaalisia kontrolli valmisteita vastaan • · *·* * 25 taustalukemien ollessa minimaaliset. Tämän mukaisesti 100 μΐ * * « *·'.* valmistetta asetetaan kaivoa kohti mikrotitterilevyille (Dy- **** natech plates USA) ja inkuboidaan 37 DC:ssa yön ajan. Levyt ,,*** pestään sitten 3 x ELISA-pesupuskurissa (10 mM Na-asetaat- i t*: tia, 100 mM NaClrää, 0,1 % Brij 35itä, pH 8,0). Humaani-see- » * · 30 rumit laimennettiin samassa ELISA-puskurissa ja 100 μΐ t ilmoitettua seerumilaimennosta pantiin levyihin ja inkuboi-, ti in 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Kaikkia seerumeita käytettiin • « p '*··( kaksinkertaisina. Sopivan pesun jälkeen, 1 : 1.000 laimen- • e * nosta Goat F(ab') 2 anti-humaani IgG:tä (gammaket julle spesi- ψ ♦ V*: 35 finen) tai IgM:ää (Muketjulle spesifinen), alkalista fosfa-*·*** taasi-konjugaattia (Tago, Inc., USA) käytettiin toisena vas- • * ta-aineena ja inkuboitiin lisäksi 1 tunnin ajan 37 *C:ssa.

i < l

Sen jälkeen, kun oli pesty uudelleen kolme kertaa ELISA- m # puskurissa, fosfataasi-substraatti (Sigma 104) 0,1 M dieta- 21 118514 noliamiinissa, pH 9,6 lisättiin kaivoihin, levyjä inkuboi-tiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan ja luettiin Elida V (Physica Co.) laitteella aallonpituudella 405. Titteri ilmoitettiin sinä laimennoksena, joka antoi lukeman 1,0.

5

Bakterisidiset määritykset: Lancefieldin (15, 25, 26) kuvaama epäsuora bakterisidinen määritys suoritettiin seuraavasti: Eri kantojen organismeja kasvatetaan 18 tunnin ajan 37 °C:ssa Todd Hewitt-bakteerien kasvatusliuoksessa. Näyte 10 yön yli pidetystä viljelmästä laimennettiin ensiksi 1 : 2 tuoreessa Todd Hewitt-bakteerien kasvatusliuoksessa ja sitten kasvatettiin edelleen 2 tunnin ajan 37 ”C:ssa. Suspensio laimennettiin 1 : 100 seuraten järjestyksessä kahta laimennossarjaa tarkoituksena taata 5 -15 kasvupesäkettä 50 15 μΐ :ssa Todd Hewitt-bakteerien kasva tus liuos ta. Humaanifago- syyttien lähteenä käytettiin heparinisoitua verta. Tarkoituksena välttää autologisen eli yksilön omista kudoksista peräisin olevan plasman läsnäolo fagosyyttisessä suspensiossa, verta sentrifugoitiin 10 minuuttia kierrosnopeuden ol-20 lessa 2.000 rpm, plasma poistettiin, pelletti pestään 3 x PBS:ssä (pH 7,2) ja lopuksi suspendoidaan uudelleen RPMI:n kanssa (Gibco-BRL, Co., Rockville, MD) samaan tilavuuteen v kuin alkuperäinen verinäyte. Komplementti lisättiin määri- Y. tyssysteemiin käyttäen juuri eristettyä seerumia, joka oli • · · *·1·] 25 peräisin normaaliluovuttajalta ja sisälsi tunnetusti alhai- * 1 set määrät anti-hiilihydraatti-vasta-ainetta ja joka oli toistuvasti absorboitu o "C:ssa A-ryhmän streptokokkien kanssa ja jota säilytettiin tasaosina -70 °C:ssa (29). Ennen :T: käyttöä tämä komplementtilähde analysoitiin molempien komp- 30 lementtien aktiviteetin ja A-ryhmän hiilihydraatti-vasta- . aineiden poissaolon suhteen. Bakterisidinen määritys suori- • · ♦ tettiin kaksi kertaa suljetuissa putkissa. Reaktioseos oli * · · # seuraavanlainen: 300 μΐ humaanifagosyyttejä, jotka oli sus- • » 1 22 118514 jokaisesta putkesta päällystettiin veriagarilla levyille pantavaksi ja inkuboitiin yön yli 37 eC:ssa. Sitten laskettiin jokaisen levyn kasvupesäkkeiden lukumäärä. Opsonointi-fagosyyttinen aktiviteetti laskettiin määrätyn seerumin 5 streptokokkien tappoprosenttina seuraavan yhtälön mukaisesti: (1-cfu pyöritellyssä testiseerumissa/cfu paikallaan olevassa putkessa) x 100.

N-asetvvliqlukosamiini-vasta-aineiden_absorptio humaani- 10 seerumista : 600 μΐ 50-prosenttisesta N-asetyyliglukosamii-nisuspensiota, joka oli kytketty Sepharose-helmiin (Sigma Chemical Co.) PBSissä pantiin steriiliin Eppendorf-putkeen ja sentrifugoitiin 4 ‘C:ssa 10 minuuttia kierrosnopeudella 14.000 rpm. Supernatantti poistettiin ja helmiin lisättiin 15 300 μΐ seerumia. Suspensiota pyöriteltiin kallellaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sentrifugoitiin uudelleen samoissa olosuhteissa ja absorboitunut seerumi poistettiin ja sitä käytettiin bakterisidiseen määritykseen edellä kuvatulla tavalla. N-asetyyliglukosamiini-vasta-aineiden poistamiseksi 20 affiniteettipylväästä, absorboituneita vasta-aineita sisältävät helmet pakattiin l ml:n tuberkuliiniruiskuun, jonka läpi annetaan kulkea liuoksen, jossa oli 0,58 % (v/v) jää-v# etikkaa 0,15 M NaClissä, pH 2,2. Eluenttia tarkkaillaan ab- l . sorboimalla aallonpituudella 280 nm ja piikkifraktiot ote- • · · ***** 25 taan talteen, dialysoidaan PBS:ää vasten, pH 7,2 ja konsent- * * roidaan takaisin seerumin alkuperäiseen tilavuuteen käyttäen *

Amicon centriprep 30 rikastuslaitetta (Amicon, Beverly, MA).

* · · I · * « · · :’*:*: Humaani-seerumit: Tähän tutkimukseen kuuluvat yksilöt olivat 30 Trinidadista, New Yorkin kaupungista ja suurten järvien Na- . valin harjoitusasemalta. Heidän ikänsä oli 5-20 vuotta.

··· .*:*. Verinäytteet saatiin laskimopunktoinnilla ja seerumi otet- / t tiin talteen käyttäen steriilejä standardi-tekniikoita.

* * · *· *: Kaikki seerumit olivat, iän, alkuperän ja terveydentilan *:**: 35 suhteen vastaavia kuin taulukossa I on osoitettu.

• · • * · « « f • · * S * 23 118514

TAULUKKO

Väestön jakautuminen

Potilaat Ikä Potilaan nro 5 (vuosina)

Normaalilapset Trinidad 5 36

Normaalilapset Trinidad 10 16

Normaalilapset New York 5 32 10 Normaalilapset New York 10 22

Reumakuume - Trinidad 7 19

Munuaistulehdus -Trinidad 4 18

Tulirokko ilman 18-20 6 komplikaatioita 15 Tulirokko, jossa esiin- 18-20 5 tyy komplikaatioita (ARF)

Bakterisidiset määritykset: Näyttäen toteen, että humaani-seerumit sisältävät A-ryhmän hiilihydraattivasta-aineita ja 20 että näiden vasta-aineiden titterit vaihtelevat eri yksilöillä, asetamme kysymyksen, tehostaisivatko nämä vasta-aineet myös opsonointifagosytoosia in vitro-raäärityssys-teemissä. Bakterisidinen määritys oli oleellisesti sama, ** . jota tri Lancefield (15, 25, 26) käytti humaani-seerumien • · · *·*·* 25 testauksessa käyttäen edellä kuvattuja modifikaatioita.

Kuvio 4 kuvaa fagosyyttimääritysten tuloksia. Käyttäen inokulaattia eli siirrostetta, joka on peräisin A-ryhmän streptokokkikannan serotyypin 6 yhdeksän kasvupesäkettä muodostavista yksiköistä, havaittiin kasvupesäkkeiden määrän 30 merkittävä kasvu pyöritellyissä putkissa normaalin kaniinin • seerumin läsnä ollessa (Paneeli A). Paneeli B osoittaa vä-*·· häisen kasvun paikallaan olevassa putkessa, jossa oli humaa- #* . ni-seerumia. Selvänä vastakohtana tälle, pyöritelty putki, • · · ***j joka sisältää humaani-seerumia (paneeli C), lakkauttaa täy- 35 dellisesti organismien kasvun (vertaa paneeli B ja C).

* • · * · * • · · • ·

Jotta voidaan varmistua siitä, että havaittu A-ryhmän streptokokkien opsonointifagosytoosi ei ollut rajoittunut yhteen ainoaan serotyyppiin, nämä kokeet toistettiin käyttäen 24 118514 kolmea muuta eri M-proteiinin serotyypin A-ryhmän kantaa. Kuten kuviossa 5 on osoitettu# kaikissa muissa kolmessa kannassa esiintyi fagosytoosia humaani-seerumien läsnä ollessa vastaavasti# kuten oli havaittu tyypin 6 kannassa. 5 Tappokyvyn prosenttimäärä vaihteli 80 - 100 prosentin välillä# kun yhdistettiin pyöritellyt/paikallaan olevat putket. Serotyyppien 3# 14 ja 28 kannat ovat identtisiä kantoja# joita tri Lancefield on käyttänyt hyväksi omissa fagosyytti-määrityksissään (15# 25# 26).

10

Anti-CHO-titterien ia opsonointifagosytoosin välinen suhde humaani-seerumeissa; Fagosyytti-määritystä käyttäen on selvää# että humaani-seerumit erosivat sen mukaan# millainen oli niiden kyky tehostaa A-ryhmän streptokokkien fagosytoo-15 siä. Yleisesti annetun seerumin fagosytoivat ominaisuudet korreloivat anti-ryhmä-A-hiilihydraatti-vasta-ainetitte-reiden kanssa. Kuten kuviossa 6 on osoitettu# kaikilla seerumeilla, joiden titterit osoittavat yli 200.000, havaittiin yli 80 prosentin suuruinen tappoaste, kun taas kolmella see-20 rumilla neljästä, joiden titterit olivat alle 200.000, ei tätä tappokykyä ollut. Yksi seerumi, jonka CHO-titteri oli 40.000# tehosti fagosytoosia# mutta tappoaste oli pienempi# ·.·, kuin mitä oli havaittu anti-CHO-seerumeilla, joilla oli • · · • korkeammat titterit.

« « · • · · 25

Humaani-seerumin faqpsytoosi-tutkimukset^ heparinisoidussa • · · *"· veressä verrattuna analyyseihin, noissa ei ollut käytetty i * · ·’··' hepariinia: Sen vuoksi# että hepaninilla on tunnetusti kyky • »· *.·: sitoa ja inaktivoida useita komplementin komponentteja ja 30 korreloidaksemme fagosyytti-määritystämme aikaisemmin käy-: tettyihin määrityksiin, edellä kuvattujen normaali-humaani- :*·*: seerumien opsonointifagosytoivat kyvyt testattiin fagosyyt- .* . tianalyyseissä hepariinin läsnä ollessa ja hepariinin poissa ollessa. Heparisisoitu verinäyte otettiin ihmiseltä laskimo-35 punktoinnilla, pestiin hyvin PBS:ssä edellä kuvatulla taval-la ja jaettiin kahteen tasa-osaan. Toinen tasaosa suspendoi-·;··: tiin uudelleen alkuperäiseen tilavuuteen RPMI:n kanssa ja opsoniini-määritys suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Toista tasaosaa käsiteltiin samalla tavalla, mutta lisäämäl 25 118514 lä 5 yksikköä/ml hepariinia ja sen jälkeen analyysi suoritettiin samalla tavalla kuin toisen tasaosan kohdalla.

Kuviossa 6 kuvatut tulokset osoittavat, että hepariinin 5 poissa ollessa ihmisen seerumissa havaittiin A-ryhmän streptokokkien keskimäärin 94-prosenttinen fagosytoosi. Kuitenkin hepariinin läsnä ollessa, sama seerumi kykeni saavuttamaan ainoastaan saman siirrosteen keskimäärin 12-prosenttisen fagosytoosin.

10

Absorptio-kokeet: Yrityksessä määrittää, mikä osa streptokokin hiilihydraatin puolikkaasta oli vastuussa bakteereja tappavasta ominaisuudesta, humaani-seerumit absorboitiin N-asetyyliglukosamiinin avulla, joka oli kytketty sefaroosi-15 helmiin, kuten edellä kuvatuissa menetelmissä. Absorboituja ja absorboimattomia seerumeita käytettin sitten bakterisidi-sissa standardimäärityksissä. Kuvio 7 osoittaa näiden kokeiden tulokset. Absorboitumaton seerumi tehosti streptokokkien fagosytoosia. sitä vastoin, seerumi, joka oli absorboitu N-20 asetyyliglukosamiinin avulla, joka oli kytketty helmiin, poisti opsonisoivat vasta-aineet. Toteuttamiskelpoisena kontrollina normaali kaniinin seerumi ei tehostanut fagosy- ·,·. toosia. Nämä kokeet osoittavat, että vasta-aineet, jotka on • · · suunnattu ei-pelkistävää terminaalista N-asetyyliglukosamii- • « · * 25 ni-jäännettä vastaan A-ryhmän hiilihydraatin pinnalla oli vat meidän bakterisidisissa määrityksissämme erittäin tär- ·· · ···[ keitä A-ryhmän streptokokkien opsonointifagosytoosissa.

*.!.* Näiden tulosten vahvistamiseksi eluoitiin vasta-aineet, • 1« * jotka olivat peräisin valikoiduista seerumeista ja jotka oli 30 absorboitu N-asetyyliglukosamiini-affiniteettipylvääseen ja ί Γ: niitä käytettiin bakterisidiseen määritykseen. Kuten kuvios- •‘i*: sa 9 on myös esitetty, nämä kokeet osoittivat, että N-ase- e . tyyliglukosamiinia kohtaan spesifiset vasta-aineet, jotka i i · **'· oli eluoitu affiniteettipylväästä, kykenivät palauttamaan 35 osittain seerumin opsonointifagosyyttisen bakterisidisen aktiviteetin.

• · • · Käyttäen kuvattuja menetelmiä mitattaessa sekä sakkautuvia että sakkautumattomia vasta-aineita, jotka olivat reaktii- 26 118514 visia A-ryhmän streptokokin hiilihydraattia vastaan, tämä hiilihydraatti oli kovalenttisesti sitoutunut fosfatidyyli-etanoliamiiniin ja liittynyt liposomiin, joka kykeni sitoutumaan mikrotitterilevyihin. Tämä menetelmä osoittaa selväs-5 ti, että pääosa humaani-seerumeista sisältää vasta-aineita A-ryhmän streptokokkien polysakkaridia vastaan.

Yllättäen havaitsimme, että maantieteellisesti eri paikkakunnilla asuvilla lapsilla oli merkittäviä eroja mitä tulee 10 heidän A-ryhmän hiilihydraatti-tittereihinsä. Koska strepto-kokkialtistuksen määrä (sekä impetigo eli märkärupi ja fa-ryngiitti eli nielutulehdus) on suurempi Trinidadissa New Yorkiin verrattuna, streptokokki-infektiot ovat myös yleisiä New Yorkissa. Tässä yhteydessä Zimmerman et ai. (23) havait-15 si matalammat A-ryhmän hiilihydraatti-vasta-ainetitterit potilailla, joita oli seurattu huolellisesti ja joita oli hoidettu A-ryhmän streptokokki-infektioiden vuoksi verrattuna ei-seurantaryhmiin. Tämän lisäksi hiilihydraatti-antigeenit ovat yleisesti T-soluista riippumattomia ja sen vuoksi 20 on mahdollista, että vasta-ainevasteen käynnistämiseksi tarvitaan toistuvaa altistusta antigeenille.

V, Tutkimukset seerumeilla, jotka on saatu potilailta tulirokon * · · akuutin ja toipilasvaiheen aikana osoittavat, että vasta- • · · ' *. 25 ainetitterit A-ryhmän streptokokin hiilihydraattia vastaan olivat olemassa jo taudin puhjetessa, mutta kasvoivat kak- ··· • sinkertaisiksi toipumisen aikana. Kun ARF-seerumeita tutkit- tiin akuutin streptokokki-infektion jälkeen, titterit ryhmän * ·· *.· · A-hiilihydraattia vastaan olivat matalammat tulirokon puhke- 30 amisvaiheen aikana verrattuna seerumeihin, jotka oli saatu : :*#i tulirokkopotilailta, joilla ei esiintynyt komplikaatioita, ·*·*: mutta kasvoivat nelinkertaiksi ARF:n esiintymisen aikaan, .* . osoittaen ehkä voimakkaamman immuunivasteen antigeeniä • » · * * vastaan verrattuna tulirokkopotilaisiin, joilla ei esiinty- 35 nyt komplikaatioita. Vasta-ainetitterit A-ryhmän hiilihyd- :Y: raattia vastaan olivat merkitsevästi matalammat kuin oli ha- • · ·;· vaittu tul irokkopoti lailla, joille ei ollut kehittynyt ARF:ää. Inhibitiotutkimukset A-ryhmän hiilihydraatilla ja A-ryhmän hiilihydraatti-variantilla osoittavat selvästi, että 27 118514 pääosa näistä vasta-aineista on suunnattu A-ryhmän spesifistä ei-pelkistävää terminaalista N-asetyyliglukosamiini-jäännettä vastaan hii1ihydraattiryhmässä, eikä ramnoosin sisempää ydinosaa vastaan.

5

Kysymykseen, tehostavatko nämä hiilihydraatti vasta-aineet A-ryhroän streptokokkien opsonointifagosytoosia, on vastattu myöntävästi ja opsonointiaste korreloi hyvin anti-hiilihyd-raattivasta-ainetason kanssa. ELISA-titterit, jotka olivat 10 alle 100.000 olivat yleisesti tehottomia, kun taas pääosa seerumeista, joiden titterit olivat yli 200.000, tehostivat fagosytoosia. Tärkeä havainto oli se tosiasia, että tämä opsonointifagosytoosi ei rajoittunut yhteen A-ryhmän streptokokkien serotyyppiin, koska vähintään kolmessa muussa eri 15 serotyyppien kannassa tapahtui myös fagosytoosia. N-asetyy-liglukosamiinia vastaan reaktiivisten vasta-aineiden roolin merkitys opsonoinnissa osoitettiin todeksi sen tosiasian vuoksi, että näiden vasta-aineiden absorboiminen humaani-seerumeista lakkautti kokonaan seerumien bakteereja tappavan 20 aktiviteetin ja siksi että, jos nämä vasta-aineet eluoitiin ja lisättiin takaisin bakterisidisiin määrityksiin, tappo-kyky palautui.

• ♦ • ♦ • · · • \ Useat havainnot, jotka koskevat humaani-seerumeilla suorite- • · · * \· 25 tun bakteereja tappavan määrityksen kinetiikkaa, ovat kom- • · !t mentin arvoisia. Ensiksikin pienet streptokokki-siirrosteet *··| bakteereja tappavassa määrityksessä olivat tehokkaita, koska •j·* suuremmat siirrosteet peittivät usein humaani-seerumien V * kyvyn opsonisoida organismeja. Toiseksi bakteereja tappava 30 aktiviteetti toimi ensi sijaisesti laimentamattoman seerumin kyseessä ollessa vastaavalla tavalla kuin mitä havaittiin tri Lancefieldillä hänen tutkiessaan humaani-seerumeita ja · tyyppi-spesifisiä vasta-aineita (15, 25, 26). Päinvastoin, • · · eläinten seerumit, jotka oli immunisoitu kuvatun tyyppisellä . 35 spesifisellä proteiinilla, olivat tehokkaita vieläpä laimen- • · V.! noksilla, jotka olivat 1 : 20 tai enemmän.

• « ·· · • ·

Esimerkki 2 A-rvhmän hiilihydraattia vastaan reaktiivisten vasta-aine- 28 1 1 85 1 4 titterien vertailu normaalilapsillai Ensimmäisenä yritykse-nämme oli määrittää, kehittivätkö normaalilapset vasta-aineita A-ryhmän streptokokin hiilihydraattia vastaan vai eivät ja vaihteliko näiden vasta-aineiden titteri yksilöiden 5 iän ja maantieteellisen sijainnin mukaan. Tämän mukaisesti A-ryhmän hiilihydraattia vastaan reaktiivisten vasta-aineiden titterit mitattiin seerumeista, jotka oli saatu normaaleilta 5 ja 10 vuotiailta Trinidadissa asuvilta lapsilta (korkea streptokokkialtistus) ja niitä verrattiin vastaavan 10 ikäisiltä lapsilta New Yorkissa saatuihin seerumeihin (matala streptokokkialtistus) käyttäen edellä kuvattua ELISA-määritystä. Kuvio 2 esittää, että 5 vuoden iässä, 94 prosentilla Trinidadin lapsista vasta-ainetitterit olivat alle 10.000 keskimääräisen vasta-aineitterin ollessa l : 158.472. 15 Nämä vasta-ainetitterit eivät eronneet merkitsevästi lasten seerumeista, jotka oli testattu 10 vuoden iässä. Päinvastoin 5 vuoden ikäsillä lapsilla New Yorkissa oli merkitsevästi matalammat titterit, keskimääräisen titterin ollessa 1 : 6.100, joka kasvoi 10 vuoden iässä titteriksi: 1 : 25.000. 20 New Yorkin alueella asuvien lasten titterit kummassakin ikäryhmässä olivat selvästi matalampia kuin Trinidadissa asuvien lasten vastaavat titterit, minkä osoittaa se tosi-,t.r asia, että 69 prosentilla New Yorkin lapsista titterit \. olivat yli 1 : 10.000.

• : : * *. 25 ·♦···

Tarkoituksena määrittää, oliko immuunivaste A-ryhmän hiili- * hydraattia vastaan joko igG- vai IgM-luokkaa, suoritettiin i *.j.J seuraava koe. Valikoidut seerumit, joilla oli korkeat titteli ί rit A-ryhmän hiilihydraattia vastaan, laimennettiin tarkoi- 30 tuksenmukaisesti siten, että jokainen seerumi antoi lukeman * ·*: 1,0 aallonpituudella 405 nm ELISA-analyysissä. Jokainen ··· .‘J·. seerumi testattiin sitten joko affiniteetti-kromatografises- 4* t ti puhdistetulla humaani-anti-IgG- tai anti-IgM-alkalifosfa- * * · *·*| taasi-konjugaatti-sekundaarisella vasta-aineella. Kuten *l * 35 taulukossa II on osoitettu, pääosa havaituista vasta-aineis- ft ta streptokokkien hiilihydraattia vastaan oli igG-luokkaa ja * p ainoastaan minaaliset reaktiot nähtiin IgM-luokassa.

29 1 1 851 4

TAULUKKO IX

ELISA-analyysilla on määritetty IgG- ja IgM-vasta-ainetitte-rit streptokokkien CHO-liposomi-kompleksia vastaan 5 Potilas Immunoglobuliiniluokka

IgG IgM

1 1.200.000 6000 2 640.000 2000 10 3 480.000 2000 4 360.000 2000 5 320.000 1000 15 Jokainen seerumi liuotettiin tarkoituksenmukaisesti, jotta saataisiin lukema: optinen tiheys 1,0 aallonpituudella 405 nm ELIDA V lukijalla.

Esimerkki 3 20 A-rvhmää vastaan reaktiivisten vasta-aineiden osittainen rakennemääritvs: Zimmermann et ai (23) oli aikaisemmin osoittanut, että jotkut humaani-seerumit sisälsivät vasta- V. aineita, jotka reagoivat hiilihydraattiryhmän kanssa, joka * « · ; . oli eristetty A-ryhmän streptokokki-varianteista ja täten ί ί ί ' 25 suunnattu A-ryhmän polysakkaridimolekyylin polyramnoosm 11*1» / sisemmän ydinosan alueelle. Näiden ramnoosin sisempää ydin- e» f *··! osaa vastaan reaktiivisten vasta-aineiden määrän määrittämi- ψ M.* seksi verrattuna vasta-aineisiin, jotka olivat reaktiivisia *·* : terminaalista N-asetyyliglukosamiini-A-ryhmän determinanttia 30 vastaan yksilöllisessä seerumissa, suoritettiin normaalisee-t *.’: rumin estotutkimukset käyttäen sekä ryhmän A hiilihydraatte- c‘j'· ja että ryhmän A puhdistettuja hiilihydraatti-variantteja.

,* . Kuten aikaisemmin A-ryhmän hiilihydraatti-liposomi-komplek- *·’* siä käytettiin mikrotitterilevyjen herkistämiseksi. 100 μΐ M %·· 35 sopivaa seerumia sekoitettiin eri hiilihydraatti-konsentraa- ?Y: tioiden kanssa ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa vesi- * * »$··· hauteessa. Seosta sentrifugoitiin sitten 5 minuuttia kier- rosnopeudella 10.000 rpm ja supernatantin annettiin reagoida ELISA-analyysissä. Kontrollit käsittivät seerumin, johon oli 30 118514 sekoitettu suolaliuosta. Kuten kuviossa 3 on osoitettu, pääosa anti-A-ryhmä-hiilihydraattia vastaan reaktiivista vasta-ainetta normaaliseerumissa suunnattiin A-ryhiaän hiilihydraatin puolikasta, toisin sanoen N-asetyyliglukosamiini-deter-5 rainanttia vastaan. A-hiilihydraatti-variantilla havaittiin vähän estymistä, mutta määrä, joka tarvittiin saman estoas-teen saavuttamiseen, oli 1.000 - 5.000 kertaa suurempi kuin A-ryhmän hiilihydraatilla. Koska A-ryhmän hiilihydraatti-varianttiin on kontaminoitunut keskimäärin 4 % N-asetyyli-10 glukosamiinia (verrattuna 36 prosenttiin A-ryhmän hiilihydraattia), jokin havaitusta estymisestä voisi reagoida jäljellejäävän N-asetyyliglukosamiinin kanssa. Tämä osoitti, että pääosa seerumin immunoreaktiviteetista suunnattiin N-asetyyliglukosamiini-puolikkaaseen, mikä voitiin havaita A-15 ryhmän vasta-aine-reaktiviteetin häviämisenä ELISA-analyy-sissä lisäämällä puhdistettua N-asetyyliglukosamiinia (Sigma) . Tätä voidaan suoraan verrata minkä tahansa estymisen puutteeseen lisäämällä läheisesti sukua olevaa monosakkari-di-N-asetyyligalaktosamiinia.

20

Esimerkki 4

Anti-A-ryhmgfi hiilihvdraatti-vasta-ainetitterien vertailu ART— versus APSNG-potilailla: Sen määrittämiseksi, erosi-vatko anti-A-ryhmän hiilihydraatti-vasta-ainetitterit poti-25 lailla, joilla oli hyvin dokumentoitu streptokokki-infektion • · aiheuttama jälkitauti, seeruminäytteitä, jotka oli saatu akuuttia reumakuumetta sairastavilta potilailta (ARF) ver-rattiin seeruminäytteisiin, jotka oli saatu akuuttia strep-tokokki-infektion jälkeistä munuaiskeräsen tulehdusta sai- • φ · *·’ * 30 rastavilta potilailta (APS6N). Kaikki seerumit saatiin hyvin dokumentoiduilta ARF ja AGN-potilailta, jotka olivat olleet :.i.: sairaalahoidossa Trinidadissa ja joita oli hoidettu ensi si- • · · : jaisesti taudin akuutin vaiheen aikana. Taulukossa III ovat .·. : yhteenkoottuina tulokset ja voidaan nähdä, että lisääntynyt 35 reaktiviteetti A-ryhmän hiilihydraattia vastaan havaittiin • ♦ . APSGN-potilaiden seerumeissa (< 50 %), joita verrattiin ARF- • · *.v potilaiden seerumeihin taudin puhkeamisvaiheessa. Kun ver- *:"· rattiin Trinidadissa asuviin normaalilapsiin, havaittiin myös merkitsevä ero tittereissä, jotka oli saatu näiltä 31 118514 potilailta ja tittereissä, jotka oli saatu Trinidadissa asuvilta normaalilapsilta (katso kuvio 2).

TAULUKKO III

5 Anti-hiilihydraatti-vasta-aineiden keskimääräiset titterit seerumeissa, jotka oli saatu potilailta, jotka sairastivat APSGN:ää, ARF:ää ja tulirokkoa, jossa ei esiintynyt komplikaatioita 10 Suurten järvien sarjat

Potilaat Numero Keskimääräiset Keskimääräiset titterit sairau- titterit 4 viik-den puhkeamis- koa myöhemmin 15 vaiheessa

Tulirokko 6 8.838 18.050 ARF 5 2.045 7.950 20 _

Trinidadin sarjat

Potilaat Numero Keskimääräiset titterit • · • · • · « * I ..... Il — n ..........

:Y: 25 ARF 19 202.300 • · • · ----------- ------------------------ . . — APSGN 18 299.900 ··** • · ........ .......- - . · - - . - - • · · • · * * · · * · · • · · * 30 Esimerkki 5 . Anti-A-ryhmän hiilihvdraatti-vasta-ainetitterien määritys • · · *·:·* potilailla, joilla on streptokokki-infektio ilman komplikaa- • * · V : tioita versus ARF: Suurten järvien seerumikokoelma saatiin potilailta, jotka olivat kaikki sairastaneet tulirokon Nava- m · ....: 35 Iin suurten järvien harjoitusasemalla 1946. Pieni osa näistä potilaista jatkoi kehittämällä klassisen ARF:n. Tämän mukai- • « · *** sesti seerumit valikoitiin näiltä potilailta seuraavasti: 1) tulirokon akuutin puhkeamisvaiheen ajalta 2) tulirokon toi-pumisvaiheen ajalta (4 viikkoa myöhemmin), tai 3) ARF:n puh- 32 1 1 851 4 keamisen ajalta (3-4 viikkoa) akuutin streptokokki-infektion jälkeen. Taulukko III osoittaa, että pienessä määrässä tapauksia, reaktiviteetti A-ryhmän hiilihydraattia vastaan kasvoi taudin toipumisvaiheen aikana puhkeamisvaiheeseen 5 verrattuna (määritetty aikana, jolloin tulirokko alkaa). Tämä A-ryhmän hiilihydraattiin kohdistuvien vasta-ainetitte-rien kasvu nähtiin molemmissa ryhmissä sekä tulirokkoryhmäs-sä, jossa ei esiintynyt komplikaatioita samoin kuin niillä potilailla, joille kehityi ARF 4 viikon kuluttua tulirokon 10 puhkeamisesta. Koska tutkittujen tapausten määrä oli pieni, on mielenkiintoista, että titterit A-ryhmän hiilihydraattia vastaan olivat matalampia ARF-potilailla molemmat tulirokon puhkeamisvaiheessa ja reumakuumeen puhkeamisvaiheessa 4 viikkoa myöhemmin, kun verrattiin tulirokkotapauksiin, 15 joissa ei esiintynyt komplikaatioita.

Esimerkki 6 A-ryhmän polysakkaridi - proteiini-koniuaaatit A. A-ryhmän polysakkaridien pelkistävien päätteiden NaBH*-20 pelkistys

Puhdistettu A-ryhmän polysakkaridi (GASP) (100 mg) liuotettiin 10 ml:aan vettä ja liuoksen pH saatettiin 0,5 N NaOH:lla arvoon 10. Kiinteä NaBH4 (100 mg) lisättiin liuoksi : seen ja sitten reaktioseosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa :V: 25 2 tunnin ajan, ylimäärä boorihydridiä hävitettiin 1 M AcOH:- ··*·· lla. Liuos dialysoitiin vettä vasten kylmässä ja lyofilisoi- tiin, jolloin saatiin 91 mg pelkistettyä GASP:ia.

• · · · « * · Φ * · a*j!' B. Terminaalisen aldehydin käyttöönotto A-ryhmän polysak- • · · ’ 30 karidissa hapettamalla perjodaatti kontrolloidusti

Pelkistetty GASP (90 mg) liuotettiin 4,5 ml:aan vettä ja • · · *·!·’ sitten yhdistettiin 4,5 ml:n kanssa 50 mM NaI0.:ää. Sen • · * * ’ jälkeen kun oli pidetty 30 minuutin ajan huoneenlämpötilas- ·*·,· sa, ylimäärä perjodaattia hävitettiin lisäämällä 1 ml ety- * · ....: 35 leeniglykolia ja liuos dialysoitiin vettä vasten kylmässä ja lyofilisoitlin, jolloin saatiin 73 mg hapetettua GASP:ia.

t · · • · ♦ • · **’" C. GASP-TT ja GASP-HSA-konjugaatit

Hapetettu GASP liitettiin joko monomeeriseen tetanustoksoi- 33 118514 di in (TT) (SSI, Copenhagen, Denmark) tai humaani-seerumin albumiiniin (HSA) (Sigma) aminoimalla pelkistäen NaBH3CN: 1 lä.

Hapetettu GASP (40 mg) ja joko monomeerinen tetanustoksoidi (20 mg) tai hiomaani-seerumin albumiini (20 mg) liuotettiin 5 0,2 mooliin fosfaattipuskuria pH:n ollessa 7,4 (0,7 ml).

Sitten lisättiin NaBH3CN:ää (20 mg) , reaktioseosta inkuboi-tiin 37 °C:ssa 4 päivää. Konjugoitumisen edistymistä tarkkailtiin HPLC:llä käyttäen reaktioseoksen pieniä tasa-osia, jotka oli analysoitu Superose-12:11a (Pharmacia). Konjugaatit 10 puhdistettiin kromatografioimalla Superdex G-200-pylväällä (Pharmacia) käyttäen eluenttina PBS:ää. Pylväästä eluoituja fraktioita tarkkailtiin Waters R403 differentiaali-refraktometrillä ja UV-spektroskopialla aallonpituudella 280 nm. Fraktiot, jotka sisälsivät A-ryhmän polysakkaridi-15 konjugaatteja, yhdistettiin, dialysoitiin ja lyofilisoitiin.

Konjugaattien proteiinipitoisuus arvioitiin Bradfordin menetelmän mukaisesti (Bradford, M.M., 1976, Anal. Biochem.

72 : 248 - 254) käyttäen standardina humaani-seerumin albumiinia. Hiilihydraattipitoisuus mitattiin julkaisussa: 20 Dubois et ai (31) kuvatun menetelmän mukaisesti käyttäen standardina puhdistettua GASP:ia. TT-konjugaatit sisälsivät

• M

V · 39 % (w/w) hiilihydraattia ja 61 % (w/w) proteiinia. Oletta- :V: en, että polysakkaridin keskimääräinen molekyylipaino on 10 ·:··· kilodaltonia (määritetty HLPC:llä Superose 12:11a käyttäen 25 dekstraaneja molekyylipainomarkkereina ja mitattu laser- **•1 . .·. sironnalla molekyylipainomarkkereina) ja monomeerisen TT:n • · · ,···, molekyylipaino on 150 kilodaltonia, GASP-TT-konjugaattien • · · molaarinen suhde: polysakkaridi : TT oli 9 - 10 : 1 tässä „ järjestyksessä.

• · • ·· * :***: 30 Esimerkki 7

• M

t *·**· Immunisointi ia iimnunoanalvvsit ··· • • » M» • A. Immunisointimenetelmät ··« • · · • · ·

Ryhmä, joka käsittää viisi, valkoista Uudesta Seelannista • · peräisin olevaa naaraskaniinia (7-8 viikon vanhoja) roko-35 tettiin subkutaanisesti kahteen kohtaan selkää (kolme kertaa kolmen viikoin välein) 10 mcg:lla jompaa kumpaa ei-kytkettyä 34 118514 natiivia A-ryhmän polysakkaridia tai -TT-konjugaattina kokonaistilavuuden ollessa 0,5 ml. Rokotteet annettiin joko ad-sorboimattomina tai adsorboituina alumiinioksihydroksidiin (Alhydrogeeli; Superfos, Denmark) tai stearyylityrosiiniin 5 (ST), molempien konsentraatiot 1,0 mg alumiinia tai ST:tä/ml suolaliuos. Tiomersaalia lisättiin rokotteisiin, kunnes lopullinen konsentraatio oli 1 /10.000. Viiden kaniinin ryhmä sai konjugaatti-rokotteen emulgoituna komplettiin Freundin adjuvanttiin (Sigma Laboratories) ensimmäistä injektiota 10 varten ja inkomplettiin Freundin adjuvanttiin seuraavia tehosteinjektioita varten. Seerumi otettiin talteen jokaiselta eläimeltä päivinä 0, 21, 42 ja 52.

B. ELISA

15 Mikrotitterilevyt (Nunc Polysorb ELISA-levyt) pinnoitettiin 100 ngrlla GASP-HSA-konjugaattia, joka oli laimennettu 1,0 mcg:aan/ml PBSrssä ja levyjä inkuboitiin 37 "Crssa 1 tunnin ajan. Pinnoittamisen jälkeen ne pestiin PBSrää sisältävällä 0,05-prosenttisella Tween 20:llä (PBS-T) ja suojattiin 0,5 20 prosentilla BSArta PBSrssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten kaivot täytettiin 100 ulrlla kaniinin antiseerumin kaksinkertaista sarjalaimennosta PBS-Trssä ja levyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen, .V: kun oli pesty PBS-Trllä, levyjä inkuboitiin 30 minuutin ajan ;Y: 25 huoneenlämpötilassa 100 μ1:η kanssa peroksidaasilla leimat- · ....: tua vuohen anti-kaniini-IgG:tä (H&L) (Kirkegaard & Perry

Laboratories) ja sitten pestiin viisi kertaa PBS-T rllä. Lopuksi jokaiseen kaivoon lisättiin 50 μΐ TBM-peroksidaasi- * · · ;;; substraattia (Kirkegaard & Perry Laboratories) ja sitten * · · 30 levyjä inkuboitiin 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, reaktio pysäytettiin lisäämällä 50 μΐ 1 M H3PO«rää. Levyt luettiin aallonpituudella 450 nm käyttäen Molecular Devices • * * V : E^-mikrolevyn lukijaa aallonpituudella 650 nm sen toimiessa * referenssiaallonpituutena (katso taulukko IV).

• · ....: 35 • · • Koska olemme tähän mennessä kuvanneet aikaisemmin useita tä- * * *.V män keksinnön suoritusmuotoja, on ilmeistä, että perusraken- *"*· teet voivat muuttua, jolloin saadaan toisenlaisia suoritus muotoja, jotka hyödyntävät tämän keksinnön mukaisia menetel- 35 118514 raiä. Kuitenkin on ymmärrettävä, että tämän keksinnön kohde on määritelty tähän liitetyissä patenttivaatimuksissa pikemminkin kuin spesifisissä suoritusmuodoissa, jotka on esitetty aikaisemmin esimerkkejä apuna käyttäen.

5

TAULUKKO IV

GAS-polysakkaridi - GAS-polysakkaridilla tai GAS-polysakka-ridi-tetanustoksoidikonjugaatilla eri formulaatioina rokotettujen kaniinien spesifiset vasta-ainetitterit 10

Rokotteet Vasta-ainetitteri ELISA AT päivä1 0 21 42 52

15 GASP

(Suolaliuos) 100 100 100 100 GASP-TT 20 (Suolaliuos) 100 100 4130 7600 (900-12000) (2600-13500)

GASP-TT

.V: (A1(0H)3) 100 10600 81800 141800 25 (4800-21000) (51000-129000) (76700-287500) • · • ·

.·. GASP-TT

(ST) 100 6200 21200 59600 (2300-12700) (8300-31000) (21300-95500) • · · # · 1 • 30

GASP-TT

:.J.: (CFA, 100 188000 1664000 176000 V ; IFA) (2200- (1000000-2299000) (1100000- .1. : 428500) 2370000) I 1« ' 1 * · 35 · ‘Geometrinen keskiarvotitteri (vaihteluväli) arvolla 100, • · 1 joka osoittaa vasta-ainetitterin <100. Arvot ovat kaksinker-täisten määritysten keskiarvoja. Kaniineille (viiden uusiseelantilaisen ryhmät) ruiskutettiin injektiona ihon alle 36 1 1 851 4 100 mcg polysakkaridia (natiivia tai konjugoitua) päivinä 0, 21 ja 42.

LÄHDEKIRJALLISUUS

5 1. Powers, G.F. ja P.L. Boisvert. (1944). Age as a factor in streptococcosis. J. Pediat. 25:481.

2. Paul, J.R. (1958). The Epidemiology of Rheumatic Fever. 10 Anonyymi julkaisija. American Heart Association, New York, N.Y.. 19-21.

3. Zingher, A. (1924). The Dick test in normal persons and in acute and convalescent cases of scarlet fever. J. Amer.

15 Med. Ass. 83:432.

4. Goldschneider, I. E.C. Gotschlich, ja M.S. Artenstein, (1969). Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. J. Exp. Med. 129:1307-1326.

20 5. Fothergill, L.D. ja J. Wright, (1933). Influenzal meningitis: The relation of age incidence to the bactericidal power of blood against the causal organism. J. Immunol.

.V: 24:273.

.V. 25 • · ♦ • · ....: 6. Schick, B. (1942). Brennenmenn's Practice of Pediatrics, .·, anonyymi julkaisija. W.F. Prior Co. Inc., Hagarstown, MD.

»··· * . .

7. Aycock, W.L. 3a S.D. Kramer, (1930). Immunity to poliomy- • * * 30 elitis in normal individuals in urban and rural communities as indicated by neutralization test. J. Prew. Med. 4:189.

• · • · · ··· V · 8. Stokes, J., Jr. (1959). Mumps. In Textbook of Pediatrics.

.*. : W.E. Nelson, julkaisija W.B. Saunders Co., Philadelphia, 35 PA* 505· * · • * *.V 9. Dochez, A.R., O.T. Avery ja R.C. Lancefield, (1919).

* *·*" Studies on the biology of Streptococcus. I. Antigenic rela tionship between strains of streptococcus hemolyticus. J.

37 1 1 851 4

Exp. Med. 30: 179-213.

10. Lancefield, R.c. (1933). A serological differentiation of human and other groups of haemolytic streptococci. J.

5 Exp. Med. 57:571-595.

11. Lancefield, R.C. (1962). Current knowledge of type sepcific M antigens of group A Streptococci. J. Immunol. 89:307-313.

10 12. McCarty, M. (1956). Variation in the group spesific carbohydrate of group A streptococci. II. Studies on the chemical basis for serological spesificity of the carbohydrate. J. Exp. Med. 104:629-643.

15 13. McCarty, M. (1971). The sreptococcal cell wall. In the Harvey Lectures, H. Harris, D.E. Koshland, M. McCarty, A.B. Pardee, G. Popjak, R.R. Porter, J.E. Seegmiller, ja E.R. Stadtman, julkaisijat Academic Press, Mew York. 73-96.

20 14. Lancefield, R.C. ja E.W. Todd, (1928). Antigenic differences between matt hemolytic streptococci and their glossy variants. J. Exp. Med. 48:769-790.

• · • · • · · •V. 25 15. Lancefield, (1959). Persistence of type specific antibo- • · dies in man following infection with group A Streptococci, .j. J. Exp. Med. 110:271-292.

t «··· ♦ : : : III 16. Fischetti, V.A., (1989). streptococcal M Protein: Mole- « · · *·* * 30 cular design and biological behavior. Clin. Microbiol. Rev.

2:285-314.

• · · • · · ··· • tt V : 17. Seastone, c.v. (1939). The virulence of group C strepto- .*.J cocci of animal origin. J. Exp. Med. 70:361-378.

• ♦ • 35 ·«·« • · 4· 18. Fillit, H.M. M. McCarty, ja M.S. Blake, (1986). ftie

Indikrtion of antibodies to hyaluronic acid by id^iunizfetion of rabbits with encapsulated streptococci. \J. ΪΛφ. Med. 164:762-776.

38 118514 19. Faarber, P., P.J.A. Capel, G.P.M. Rigke, G. Vierminden, L.B.A. Van de Putte, ja RA.P. Koene (1984). Cross reactivity of acute DNA antibodies with proteoglycans. Clin. Exp.

5 Immunol. 55:502-508.

20. Rotta, J. ja B. Bednar, (1969). Biological properties of cell wall mucopeptides of hemolytic streptococci. J. Exp. Med. 130:31-47.

10 21. Schmidt, W.C. ja D.J. Moore, (1965). The determination of antibody to group A Streptococcal polysaccharide in human sera by agglutination. J. Exp. Med. 121:793-806.

15 22 Karakawa, W.W., C.K. Osterland, ja R.M. Krause. (1965).

Detection of group specific antibodies in human sera. J. Exp. Med. 122:195-210.

23. Zimmerman, R.A., A.H. Auernheimer, ja A. Taranta (1971). 20 Precipitating antibodies to group A polysaccharide in humans. J. Immunol. 107:832-841.

24. Dudding, B.A. ja E.M. Ayoub. (1968). Persistence of .V: group A antibody in patients with rheumatic valvular dise- ·*;’· 25 ase. J. Exp. Med. 128:1081-1092.

* · * 5 «

,:, 25. Lancefield, R.C. (1957). Differentiation of group A

* *'”t Streptococci with a common R antigen into three serological • · · "I types, with special reference to the bactericidal test. J.

• * * V ' 30 Exp. Med. 106:525-544.

*.:.* 26. Lancefield, R.C. (1958). Occurrence of R antigen speci- • · · V ! fic for group A type 3 streptococci. J. Exp. Med. 108:329- » .*. i 341.

• ·· « · .,.,: 35 • · 27. Gotschlich, E.C., R. Austrian, B. Cvjetanovic, ja J.B. Robbins, (1978). Prospects for the prevention of bacterial ***** meningitis with polysaccharide vaccines. Bull. Wld Hlth.

Org. 56:509-518.

39 1 1 851 4 28. McCarty, M. (1958). Further studies on the chemical basis for serological spesificity of gropup A streptococcal carbohydrate. J. Exp. Med. 108:311-328.

5 29. Joiner, K.A., K.A. Warren, E.J. Brown, J.L. Swanson, ja M.M. Frank, (1983). Studies of the mechamism of bacterial resistance to complement mediated killing: IV C5b-9 forms high molecular wight complexes with bacterial outer membrane 10 constituents on serum-resistant, but not on serum-sensitive Neisseria gonorrhoea. J. Immunol. 131:1443-1451.

30. Dubois, M., K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers ja F. Smith, (1956), Colorimetric Method For the Determination 15 of Sugars and Relates Substances, Anal. Chem. 28:350-356.

31. Fillit, Howard M., Milan Blake, Christa McDonald ja Maclyn McCarty, (1988). Immunogenicity of Liposome Boud Hyaluronate in Mice, J. Exp. Med. 168:971-982.

20 • · • · • · · • · # · · • « · • · • · a • v · • ·«·« ♦ * · it· ··· * ·· :: : * 4 • 4 4 • ♦ ♦ 44* *4« • 4 · • · * 4 ♦ • 4 4*4 • *4 • 4 4 4444# • 4 % • · • 4 4 4 4 4 • 4 * • 4 4 4 4 4 4

Claims (35)

1. 40 118514
2. 1. Immunogeeninen koostumus, joka suojaa nisäkkäät A-ryhmän streptokokkibakteerien aiheuttamalta infektiolta, tunnettu siitä, että se sisältää immunogeenisen määrän A- 5 ryhmän polysakkaridia, jolla on kaava (I) [->2) -a-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—»]n R 3 t (I) 10 1 β-D-GlcpNAc jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc; ja jossa n on lukuarvo noin 3 - noin 50, ja kantajaa. 15
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen immunogeeninen koostumus, tunnettu siitä, että A-ryhmän polysakkaridin molekyyli-paino on noin 10 kilodaltonia.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen immunogeeninen koostumus, ·«· V* tunnettu siitä, että kantaja on valikoitu ryhmästä, joka • m ·.·.· käsittää suolaliuoksen, Ringerin liuoksen ja fosfaatti- m *·"· puskuroidun suolaliuoksen. »·· ···· « ϊ.-.ϊ 25 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen immunogeeninen koostumus, • · · ίφϊ i tunnettu siitä, että immunogeeninen koostumus sisältää edelleen adjuvantin. ·· • · • ·♦
5. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen immunogeeninen koostumus, • · · φ *·# 30 tunnettu siitä, että adjuvantti on valikoitu ryhmästä, • · · V.’,m joka käsittää alumiinihydroksidin, alumiinifosfaatin, mono- • · "* fosforyylilipidin A, QS21:n ja stearyylityrosiinin. • · · m ···· • · ·
6. 6. Immunogeeninen polysakkaridi -proteiini-konjugaatti-mole- 41 118514 kyyli, joka saa aikaan opsonisten vasta-aineiden muodostumisen nisäkkäissä, jotka ovat komplementin ja fagosyyttien läsnäollessa bakteereita tappavia, tunnettu siitä, että mainittu konjugaattimolekyyli sisältää A-ryhmän polysakkaridin, 5 jolla on kaava (I) [->2) -οί-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] n---R 3 T (I) 10 1 β-D-GlcpNAc jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc ja n on lukuarvo noin 3 - noin 50, jolloin polysakkaridi on 15 liittynyt kovalenttisesti proteiiniin.
7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen immunogeeninen polysakka-ridi-proteiini-konjugaatti, tunnettu siitä, että polysakkaridi on liittynyt proteiiniin sekundaariamiinisidoksella 20 kaavan (li) mukaisen konjugaatin muodostamiseksi t · · • t * * · · • · :.V [—>2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—»]n R' -CH2-NH-proteiini 3 τ (id l.O 25 1 V ; β-D-GlcpNAc • a j *.· jossa R' on terminaalisen pelkistävän sokerin pelkistys- ja hapetustuote, joka ei ole edustettuna kaavan (II) mukaisessa . 30 CH2-NH-proteiini-sekundaariamiinisidoksessa. • * · • · • · *·* 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen immunogeeninen polysakka- ·*· ridi-proteiini-konjugaatti, tunnettu siitä, että prote- • · · • · *·..* iini on mikä tahansa natiivi tai rekombinantti bakteriaalinen 42 118514 proteiini .
8. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen immunogeeninen polysakkaridi -proteiini-konjugaatti, tunnettu siitä, että prote- 5 iini on valikoitu ryhmästä, joka käsittää tetanustoksoidin, koleratoksiinin, difteriatoksoidin tai CRM197:n.
9. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen immunogeeninen polysak karidi -proteiini-konjugaatti, tunnettu siitä, että prot- 10 eiini on tetanustoksoidi.
10. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen immunogeeninen polysakkaridi -proteiini-konjugaatti, tunnettu siitä, että polysakkaridin molekyylipaino on suunnilleen 10 kilodaltonia. 15
11. 12. Patenttivaatimuksen 6 mukainen proteiini-polysakkaridi-konjugaatti, tunnettu siitä, että konjugaatin proteiini sisältää τ-solu-epitoopin ja on vähintään noin 10 aminohapon pituinen. 20 *·· ·.* * 13. Rokote, jota käytetään suojaamaan nisäkkäät A-ryhmän * · :.V streptokokkibakteerien aiheuttamalta infektiolta tunnet - ♦ *:**J t u siitä, että se sisältää immunogeenisen määrän A-ryhmän ..*·* polysakkaridia, jolla on kaava (I) *· ·*· 25 • · * ^ ;T: [->2) -οί-L-Rhap- (l-»3) -α-L-Rhap- (l-»]n---R 3 ···.. t (I) » ··· -i • · · # 30 β-D-GlcpNAc • · · jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc • · *!* ja n on lukuarvo noin 3 - noin 50, ja kantajaa. ··· • • t·· φ · ·
12. 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen rokote, tunnettu 43 118514 siitä, että polysakkaridi on kovalenttisesti liittynyt proteiiniin.
13. 15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen rokote, tunnettu 5 siitä, että polysakkaridi on liittynyt proteiiniin sekundaarisella amiinisidoksella kaavan (II) mukaisen kon-jugaatin muodostamiseksi [->2) -a-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (l->]n R' -CH2-NH-proteiini 10 3 t (II) β-D-GlcpNAC jossa R1 on terminaalisen pelkistävän sokerin pelkistys- ja 15 hapetustuote, joka ei ole edustettuna kaavan (II) mukaisessa CH2-NH-proteiini-sekundaariamiinisidoksessa.
14. 16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen rokote, tunnettu siitä, että proteiini on mikä tahansa natiivi tai rekom- 20 binantti bakteriaalinen proteiini. a · · a * · *·* * 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen rokote, tunnettu • a *.V siitä, että proteiini on valikoitu ryhmästä, joka käsittää tetanustoksoidin, koleratoksiinin, difteriatoksoidin tai ·:* 25 CRM19 -n. aa·· ·*-* · a a a a a a a aaa **:*. 18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen rokote, tunnettu aaa a siitä, että polysakkaridi-proteiini-konjugaatin proteiini on ;·# tetanus toksoidi. • aa 30 a a
15. 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen rokote, tunnettu a Σ,ί.ϊ siitä, että polysakkaridin molekyylipaino on konjugaatti- :***: rokotteessa suunnilleen 10 kilodaltonia. aaa a a a · · a
16. 20. Patenttivaatimuksen 13 mukainen rokote, tunnettu a a ’···* siitä, että polysakkaridi on kovalenttisesti liitetty 44 118514 liposomeihin.
17. 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen rokote, joka käsittää edelleen natiivin tai rekombinantin bakteerialisen proteiinin, 5 joka on liitetty liposomeihin.
18. 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen rokote, tunnettu siitä, että bakteriaalinen proteiini on tetanustoksoidi
19. 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen rokote, tunnettu siitä, että rokotteen polysakkaridi-liposomi-koostumuksen molekyylipaino on suunnilleen 10 kilodaltonia.
20. 24. Immunogeeninen polysakkaridi-liposomi-konjugaatti-mole-15 kyyli, joka sisältää A-ryhmän polysakkaridin, jolla on kaava (I) [~>2) -a-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (l-»]„---R 3 20 t (I) β-D-GlcpNAc ··* • · · *·* * 25 jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc V.* ja n on lukuarvo noin 3 - noin 50, ja jossa polysakkaridi on ♦ *·'*· liittynyt kovalenttisesti liposomeihin konjugaattimolekyylien "* muodostamiseksi. ··»· • » · • · · ··· :*·*: 30 25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen polysakkaridi-liposomi- konjugaatti, tunnettu siitä, että liposomit ovat raken- ··. tuneet kationisista lipideistä. • ·· M· * » ·” 26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen polysakkaridi-liposomi- :.J.: 35 konjugaatti, tunnettu siitä, että liposomit muodostuvat fosfatidyylietanoliamiinista. ·· **" 27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen polysakkaridi-liposomi- * · *···* konjugaatti, tunnettu siitä, että A-ryhmän polysak- 45 118514 karidin molekyylipaino on noin 10 kilodaltonia.
21. 28. Patenttivaatimuksen 24 mukainen konjugaatti, tunnettu siitä, että polysakkaridi-liposomi-konjugaatti 5 käsittää edelleen proteiinin, joka on liitetty mainittuun liposomiin.
22. 29. Immunogeeninen koostumus passiivisen immuniteetin kehittämiseksi A-ryhmän streptokokkibakteereita vastaan, 10 tunnettu siitä, että se sisältää opsonisia vasta-aineita, jotka komplementin ja fagosyyttien läsnäollessa tappavat A-ryhmän streptokokkibakteereita, ja mainitut vasta-aineet on a) otettu nisäkkäistä ja b) ne sitoutuvat A-ryhmän streptokokkibakteerien polysakkaridiin, jolla on kaava (I) 15 [—>2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] n R 3 T (I) 20 1 β-D-GlcpNAc ··· • t · *t* * jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc • · · ja n on lukuarvo noin 3-noin 50. • · . 25 • # * •••j 30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen immunogeeninen koostumus, • · · *·!·* tunnettu siitä, että bakteriaalisia vasta-aineita on «·· *.* * läsnä seerumissa, gammaglobuliini-fraktiossa tai puhdistetussa vasta-aineessa. Γ·.. 30
23. 31. Patenttivaatimuksen 29 mukainen immunogeeninen koostumus, #·· *, tunnettu siitä, että mainitut vasta-aineet tuotetaan • · * immunisoimalla yksilö, joka ei ole ihminen, jollakin vaati- • · *···* muksen 1, 6, 13 tai 24 mukaisella immunogeenisellä koostu- *:* 35 muksella, ·«·· ·»· • · * · «· ·
24. 32. Patenttivaatimuksen 29 mukainen immunogeeninen koostumus, 46 118514 tunnettu siitä, että vasta-aineet on saatu seerumista tai yksilöstä, joka ei ole ihminen.
25. 33. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se 5 sisältää patenttivaatimuksen 29 mukaisen immunogeenisen koostumuksen ja farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan.
26. 34. Menetelmä sellaisen A-ryhmän polysakkaridin, jolla on kaava I 10 [->2) -α-L-Rhap- (1—»3) -α-L-Rhap- (l->] n---R 3 t (I) 15 β-D-GlcpNAc jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc ja n on toistuvien yksiköiden lukumäärä noin 1 - noin 50, liittämiseksi kovalenttisesti fosfatidyylietanoliamiinin si-20 sältävään liposomiin, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet: a) muodostetaan liposomi fosfatidyylietanoliamiinista; * ·* * b) aktivoidaan A-ryhmän polysakkaridi pelkistämällä termi- • · · * \ naalinen sokeri ja hapettamalla pelkistetty sokeri terminaa- • · . 25 lisen aldehydin muodostamiseksi; ·*· •••j c) yhdistetään aktivoitu A-ryhmän polysakkaridi ja liposomit ♦ * · *·ϊ·* ja A-ryhmän polysakkaridi liitetään kovalenttisesti liposo- ··· V : meihin pelkistävällä aminoinnilla A-ryhmän polysakkaridi-li- posomi-konjugaatin muodostamiseksi; ja ! *.. 30 d) otetaan talteen A-ryhmän polysakkaridi-liposomi-konjugaat- ··♦ . * • · tl • · » "* 35. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukaisen immunogeenisen • · '···* koostumuksen käyttö nisäkkäitä A-ryhmän streptokokkibakteerien ··· 35 aiheuttamalta infektiolta suojaavan lääkkeen valmistamiseksi. ·*φ· • · · i · * I « · ·
27. 36. Patenttivaatimuksen 35 mukaisen immunogeenisen koostu- 47 118514 muksen käyttö, jolloin immunogeeninen koostumus annetaan yksilölle annosmäärän ollessa noin 0,01 - noin 10 μg painokiloa kohti.
28. 37. Jonkin patenttivaatimuksen 6-12 mukaisen immunogeenisen polysakkaridi-proteiini-konjugaatti-molekyylin käyttö sellaisen lääkkeen valmistamiseksi, joka saa aikaan opsonisten vasta-aineiden muodostumisen nisäkkäissä, jotka vasta-aineet ovat komplementin ja fagosyyttien läsnäollessa bakteereita 10 tappavia.
29. 38. Patenttivaatimuksen 37 mukaisen immunogeenisen polysakkaridi-proteiini-konjugaatti-molekyylin käyttö, jolloin mainittu immunogeeninen polysakkaridi-proteiini-konjugaatti 15 annetaan yksilölle annosmäärän ollessa noin 0,01-noin 10 μ9 painokiloa kohti.
30. 39. Jonkin patenttivaatimuksen 13-19 mukaisen rokotteen käyttö sellaisen lääkkeen valmistamiseksi, joka suojaa A- 20 ryhmän streptokokkibakteerien aiheuttamalta infektiolta. ·*·*; 40. Patenttivaatimuksen 39 mukaisen rokotteen käyttö, jolloin mainittu rokote annetaan yksilölle annosmäärän ollessa noin • · · 0,01-noin 10 μg painokiloa kohti. . 25 ··· ***t 41. Jonkin patenttivaatimuksen 24-28 mukaisen immunogeenisen • · · *”** polysakkaridi-liposomi-konjugaatti-molekyylin käyttö sellaisen • · · lääkkeen valmistamiseksi, joka suojaa A-ryhmän streptokokki-bakteerien aiheuttamalta infektiolta. f*·· 30
31. 42. Patenttivaatimuksen 41 mukaisen immunogeenisen poly- .···. Sakkaridi-liposomi-konjugaatti-molekyylin käyttö, jolloin mai- • · nittu immunogeeninen polysakkaridi-liposomi-konjugaatti- • · . molekyyli annetaan yksilölle annosmäärän ollessa noin 0,01- • ♦ i#*.i 35 noin 10 μg painokiloa kohti. • M • ♦ • · ·«·
32. 43. Jonkin patenttivaatimuksen 20-23 mukaisen rokotteen 48 118514 käyttö sellaisen lääkkeen valmistamiseksi, joka suojaa A-ryhmän streptokokkibakteerien aiheuttamalta infektiolta.
33. 44. Patenttivaatimuksen 43 mukaisen rokotteen käyttö, jolloin 5 mainittu rokote annetaan yksilölle annosmäärän ollessa noin 0,01-noin 10 μ5 painokiloa kohti.
34. 45. Sellaisten vasta-aineiden käyttö, jotka vasta-aineet komplementin ja fagosyyttien läsnäollessa edistävät bakteerien 10 tappamista ja jotka on saatu nisäkkäästä ja jotka sitoutuvat A-ryhmän streptokokkibakteerien kaavan (I) mukaiseen polysakkaridiin, [—>2) -α-L-Rhap- (l-»3) -α-L-Rhap- (1—>] n R 15 3 t (I) S-D-GlCpNAc 20 jossa R on terminaalinen pelkistävä L-ramnoosi tai D-GlcpNAc; ja jossa n on lukuarvo noin 3 - noin 50, A-ryhmän strepto- ***** V * kokkibakteerien aiheuttamalta infektiolta suojaavan lääkkeen • · ·.·.· valmistamiseksi. • · ..*·* 25 46. Patenttivaatimuksen 45 mukaisten vasta-aineiden käyttö, ϊ,ϊ.ί jolloin vasta-aineet ovat peräisin yksilöstä, joka ei ole : : : ihminen.
35. 47. Patenttivaatimuksen 46 mukaisten vasta-aineiden käyttö, 30 jolloin farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseen käytetyt • · · # vasta-aineet ovat läsnä seerumissa, gamma-globuliini-frakti- • · · ossa tai puhdistetussa vasta-aineessa. • * * · ·*· ··· *♦·· ··* • » • « *·* 49 118514