PL181037B1 - Kompozycja immunogenna i szczepionka do ochrony ssaków przed zakażeniem bakteriami Streptococcus grupy A, immunogenne koniugaty, kompozycje odpornościowe do nadawania ssakom odporności biernej, kompozycja farmaceutyczna, sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej i sposób wytwarzania koniugatu polisacharydu z liposomem - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna i szczepionka do ochrony ssaków przed zakażeniem bateriami Streptococcus grupy A, immunogenne koniugaty, kompozycje odpornościowe do nadawania ssakom odporności biernej, kompozycja farmaceutyczna, sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej i sposób wytwarzania koniugatu polisacharydu z liposomem.

Choroby wywoływane przez streptokoki grupy A, jak to pokazują statystyki zachorowalności według wieku, sąchorobami dziecięcymi (1-3). Podobnie jak inne choroby wtej kategorii, takie jak np. wywołane przez meningokoki (4), Haemophilus meningitis (5), błonica (6) i inne (7,8), większość przypadków występuje u małych dzieci zaś zachorowalność zmniejsza się z wiekiem. Tak więc, w wieku osiemnastu lat częstość zakażeń streptokokami grupy A jest względnie niska (1-3). Sugerowałoby to, że z czasem może się wykształcać pewien rodzaj naturalnej odporności na tę grupę mikroorganizmów, podobnie jak to stwierdzono w przypadku innych zakażeń dziecięcych.

W doświadczeniach trwających kilka dziesięcioleci, Lancefield i wsp. (9-11) stwierdzili, że znaczna większość streptokokówhemolizujących zakażających ludzi należy do grupy A. Rozróżnienie to oparte było na reakcjach serologicznych z węglowodanami streptokoków grupy A. W ostatnich badaniach donoszono, że dominującą determinantą odporności była N-acetyloglukozamina (12, 13). Przy użyciu testów ochronnych na myszach i testów precypitacyjnych, grupa A streptokoków została dalej podzielona na serotypy, w oparciu o obecność różnych antygenowe białek M, znajdujących się na powierzchni mikroorganizmu. Jasno wykazano, że przeciwciała skierowane przeciwko swoistemu serotypowi M, są ochronne w mysim modelu zakażenia (14). U ludzi, zdrowienie z zakażenia streptokokami grupy A jest często związane z

181 037 długotrwałą odpornością swoistą dla zakażającego drobnoustroju (11). Ale w obu powyższych przypadkach, ochrona jest swoista dla serotypu M i nie rozciąga się na inne serotypy. Dodatkowo, wykazano w licznych badaniach, że surowice ludzkie rzadko zawierają przeciwciała swoiste dla licznych serotypów białka Μ (11,15). Te klasyczne doświadczenia, zarówno na ludziach jak i na zwierzętach doświadczalnych, określiły ważną rolę białka M w zjadliwości streptokoków grupy A i stworzyły podstawę dla licznych, nieskutecznych prób opracowania szczepionek streptokokowych, zdolnych do wywołania ochronnych przeciwciał przeciwko końcowi aminowemu białka M, gdzie jest zlokalizowana swoistość serotypowa albo wspólnych C-końcowych regionów powtórzeń cząsteczki (16).

Jednakże, w świetle związanej z wiekiem natury zakażeń grupą A, która wskazuje na powstawanie odporności naturalnej na tę grupę bakterii, pozostaje pytanie czy odzwierciedla ona powolne powstawanie przeciwciał skierowanych przeciwko bardziej rozpowszechnionym regionom białka M czy inne antygeny powierzchniowe, na które zwracano mniejszą uwagę, mogą odgrywać rolę w tej nabytej naturalnie, nie swoistej serotypowo ochronie. Przykładowo, osłonka z kwasu hialuronowego odgrywa ważną rolę w zjadliwości zakażeń grupąC u świnek morskich (17) i stwierdzano przeciwciała przeciwko hialuronianowi u zwierząt (18,34) i ludzi (19). Kwas hialuronowy streptokoków grupy A jest, jak donoszono, immunogenny dla królików po immunizacji utrwalonymi formaliną otoczkowymi streptokokami grupy A albo związanymi z liposomami (18). Opisywano również zastosowanie liposomów w szczepionkach (31). Wstrzyknięcie frakcji mukopeptydowej ściany komórkowej streptokoków wywoływało krótkotrwałą ochronę u zwierząt doświadczalnych (20) ale jej rola u ludzi pozostaje nieznana.

Węglowodany grupowo swoiste zbudowane są ze szkieletu poliramnozy, do którego przyłączona jest w końcowej pozycji nie redukującej, w przypadku grupy A, N-acetyloglukozamina (figura la). Opisano i scharakteryzowano odmianę grupy A streptokoków (12, 13). U tych streptokoków, szkielet poliramnozy jest obecny, ale pozbawiony N-acetyloglukozaminy (figura Ib). We wstępnych doświadczeniach, królikom wstrzykiwano całe streptokoki grupy A, pozbawione białka M i powodowano wywołanie przeciwciał precypitujących węglowodan grupy A. Jednakże, przeciwciała te, w badaniach nad bierną ochroną myszy (14), nie chroniły biernie przed ekspozycją na streptokoki grupy A pozytywne pod względem białka M. Ponadto, kilka wcześniejszych prób wykazania podobnych przeciwciał precypitujących u ludzi zakończyło się niepowodzeniem, co wskazuje, że przeciwciała precypitujące węglowodany nie odgry wająistotnej roli w ochronie przed zakażeniami streptokokami.

Jednakże, ponieważ większość wczesnych sposobów wykrywania wzbudzonych przeciwciał zależała od zdolności tych przeciwciał do precypitacji pod wpływem dodanego antygenu, wiele przeciwciał, które mimo tego reagowały ze swoistym antygenem, ale nie precypitowały w tym teście, pozostało niewykrytych. Przeciwciała aktywne w stosunku do otoczki kwasu hialuronowego streptokoków grupy A stanowią dobry przykład. Według wielu doniesień począwszy od roku 1965 (21,22) w badaniach dotyczących eliminacji tego problemu, wykorzystywano zarówno bezpośrednie jak i pośrednie techniki aglutynacji w celu wykrycia przeciwciał. Aglutynacja bezpośrednia wykrywa przeciwciała precypitujące, podczas gdy aglutynacja pośrednia wykrywa przeciwciała precypitujące i nie precypitujące. Duże zainteresowanie wywołało wykazanie przez Karakawę i in. (22), że przeciwciała aglutynujące bezpośrednio, tzn. przeciwciała precypitujące, w surowicach ludzkich były skierowane głównie przeciwko węglowodanom odmiany grupy A, szkieletowi poliramnozy, podczas gdy techniki aglutynacji pośredniej, skierowane na przeciwciała nie precypitujące, wykrywały wysokie miano przeciwciał w stosunku do determinanty N-acetyloglukozaminowej.

Następne badania Zimmermanna i in. (23), z wykorzystaniem surowic ludzkich z różnych zakażeń streptokokami wykazały, że występowanie tych przeciwciał nie precypitujących wahało się od 30% w populacji skrupulatnie badanej i leczonej z powodu zakażeń streptokokami, do 85% w populacji ostatnio zakażonej streptokokami grupy A. Zauważono również, że miana przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A miały szczyt w wieku lat 17 i, że nie było różnicy w mianach przeciwciał w stosunku do tego węglowodanu u chorych na reumatyzm, z oraz bez choroby

181 037 serca. Wyniki te różniły się od opisanych przez Dudding i Ayoub, w których przeciwciała przeciwko węglowodanom grupy A były stale podwyższone u pacjentów z reumatoidalną chorobą serca, w porównaniu z pacjentami bez uszkodzenia zastawek (24).

Odpowiedź na pytanie, czy przeciwciała te odgrywająrolę w ochronie, jest trudna do określenia. Klasyczny test opsonofagocytozy Lancefielda, stosuje określoną krew pełną(l 5,25,26), do której dodawana jest hiperodpoma surowica królicza z przeciwciałami swoistymi przeciwko znanym serotypom białka M. Wybór ludzkiej krwi pełnej opiera się na dwóch faktach: (1) nie zawiera przeciwciał swoistych dla białka M i/lub (2) nie promuje fagocytozy streptokoków, pod nieobecność króliczej surowicy odpornościowej swoistej dlaserotypu. Pytanie, czy normalna surowica ludzka sama przez się wzmaga fagocytozę, nie zostało nigdy zadane.

Z publikacji Carbohydrate res. 232: 131-142 znane sąkoniugaty polisacharydu streptokoków grupy A związanego z białkiem jako nośnikiem, przeznaczone do wytwarzania środków diagnostycznych. Największy oligosacharyd według tej publikacji jest pentasacharydem i obejmuje pięć jednostek cukrowych. Publikacja nie zawiera żadnych informacji, że takie koniugaty wywołująpowstawanie przeciwciał ochronnych, które sąbakteriobójcze wobec bakterii Streptococcus grupy A.

Celem wynalazkujest dostarczenie kompozycji immunogennej, użytecznej do wywoływania przeciwciał, znajdujących zastosowanie profilaktyczne i diagnostyczne.

Kompozycja immunogenna według wynalazku służy do ochrony ssaków przeciwko zakażeniom bakteriami Streptococcus grupy A. Kompozycję immunogenną według wynalazku stosuje się do zapewnienia ochrony przeciwko zakażeniom streptokokami grupy A, w populacjach narażonych na ryzyko nabycia zakażenia streptokokami grupy A i ryzyko choroby, a konkretnie dorosłych, ciężarnych kobiet i, w szczególności, niemowląt i dzieci.

Kompozycja może też służyć do pozyskania przeciwciał, które wykorzystuje się do nadawania odporności biernej.

Kompozycja immunogenna zawiera immunogennąilość polisacharydu streptokoków grupy A.(GASP), o strukturze:

[—>2) — α-L-Rhap- (1—>3) cc-L—Rhap— (1—> ] _n R;

T β-D-GlcpNAc w której R oznacza końcową, redukuj ącąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, a n oznacza liczbę 3 do 30, oraz nośnik.

Korzystnie kompozycja może jeszcze zawiera adiuwant, takie jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu, monofosforylolipid A, QS21 i stearylotyrozyna. Jako nośnik kompozycja zawiera korzystnie nośnik wybrany z grupy składającej się z roztworu soli, roztworu Ringer i roztworu soli buforowanego fosforanem. Kompozycję immunogenną według wynalazku można stosować do wywołania czynnej i biernej ochrony przed zakażeniem streptokokami grupy A. Do ochrony biernej, przeciwciała immunogenne wytwarza się przez immunizację ssaka szczepionką wykonaną z kompozycji immunogennej według wynalazku, a następnie przez uzyskiwanie przeciwciał immunogennych od zwierzęcia.

W zakres wynalazku wchodzą też immunogenne koniugaty, w których GASP jest połączony kowalencyjnie z fosfolipidem zdolnym do tworzenia liposomu albo z białkiem. Naty wne albo rekombinowane białka bakteryjne, jak toksoid tężca, toksyna cholery, toksoid błoniczy albo CRM₁₉₇ są przykładami odpowiednich białek użytecznych do stosowania w koniugacie. W in

181 037 nym wykonaniu, białko immunogenne włączone jest do liposomu zawierającego GASP połączony kowalencyjnie z fosfolipidem.

Koniugat polisacharydu z białkiem wywołuje u ssaków tworzenie przeciwciał opsoninowych, które są bakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów.

Korzystnie polisacharyd jest połączony z białkiem przez drugorzędowe wiązanie aminowe tworząc koniugat o wzorze (II)

[->2) -α-L-Rhap- (l->3) -α-L-Rhap- (l-»]_n---R' -CH₂-NH-białko β-D-GlcpNAc w którym R' oznacza produkt redukcji i utleniania końcowego cukru redukującego.

Korzystnym białkiem jest toksoid tężcowy, a połączony z nim polisacharyd korzystnie ma ciężar cząsteczkowy około 10 000.

Korzystnie jako białko w koniugacie stosuje się też epitop limfocyta T, który ma długość przynajmniej 10 aminokwasów.

Koniugat polisacharydu z liposomami korzystnie zawiera liposomy, które są skonstruowane z lipidów kationowych.

Korzystnie liposomy obejmują fosfatydyloetanolaminę, a polisacharyd wówczas ma ciężar cząsteczkowy około 10 000.

W zakres wynalazku wchodzi też szczepionka do zapewnienia ochrony ssaków przed zakażeniem bakteriami Streptococcus grupy A, która zawiera immunogenną ilość polisacharydu grupy A o wzorze (I)

[—>2) -α-L-Rhap- (l->3) -α-L-Rhap- (1—>] _n---R;

r β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową redukująca L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, ewentualnie związany kowalencyjnie z białkiem lub liposomem.

Wynalazek obejmuje też kompozycję odpornościową do nadawania ssakom odporności biernej, która zawiera przeciwciała opsoninowe, które są bakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów, przy czym przeciwciała te są wytwarzane przez immunizację osobnika kompozycją immunogenną obejmującą immunogenną ilość polisacharydu grupy A o wzorze (I)

[->2) -α-L-Rhap- (l->3)-α-L-Rhap- (1—>] _n---R ΐ (I) β-D-GlcpNAc

181 037 w którym R oznacza końcową, redukuj ącąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od około 3 do 30, oraz nośnik.

Przeciwciała wchodzące w skład kompozycji odpornościowej do nadawania ssakom odporności biernej mogąbyć też wytwarzane przez immunizację osobnika immunogennym koniugatem polisacharydu grupy A o wzorze (I), połączonego kowalencyjnie z białkiem, bądź immunogennym koniugatem polisacharyd-liposom, w którym, polisacharyd grupy A o wzorze (I) połączony jest kowalencyjnie z liposomem.

Do immunizacji w celu pozyskania przeciwciał można też stosować immunogenną szczepionkę, która zawiera immunogenną ilość polisacharydu grupy A o wzorze (I).

Kompozycja odpornościowa do nadawania ssakom odporności biernej przeciwko bakteriom Streptococcus z grupy A według wynalazku zawiera przeciwciała opsoninowe przeciwko bakteriom Streptococcus z grupy A, które są bakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów i które a) są pozyskiwane od ssaków i b) wiążąsię z polisacharydem bakterii Streptococcus grupy A o wzorze (I):

[->2) -α-L-Rhap- (1-+3) -a-L-Rhap- (1—>]_n---R ^T (I) β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową redukującą L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30.

Przeciwciała te pozyskuje się od ssaków przez immunizację osobnika kompozycjąimmunogenną według wynalazku, bądź immunogennym koniugatem polisacharydu grupy A o wzorze (I) połączonego kowalencyjnie z białkiem albo immunogennym koniugatem polisacharydu grupy A o wzorze (I) połączonego kowalencyjnie z liposomem.

Przeciwciała opsoninowe można też wyizolować z surowicy osobników, którzy zawierają takie przeciwciała naturalnie, korzystnie których miano w surowicy wynosi powyżej około 40 000, a zwłaszcza powyżej około 200 000.

W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja farmaceutyczna do ochrony ssaków, która zawiera kompozycję odpornościową według wynalazku zawierającą przeciwciała opsoninowe przeciwko bakteriom Streptococcus z grupy A, które sąbakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów i które a) są pozyskane od ssaków i b) wiążąsię z polisacharydem bakterii Streptococcus grupy A o wzorze (I):

[->2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] _n---R

T i ω β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową redukującąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

181 037

W zakres wynalazku wchodzi też sposób wytwarzania koniugatu polisacharydu grupy A o wzorze I, połączonego kowalencyjnie z liposomem zawierającym fosfatydyloetanolaminę, który obejmuje:

a) wytwarzanie liposomu z fosfatydyloetanolaminy;

b) akty wacj ę polisacharydu grupy A przez redukcj ę końcowego cukru i utlenianie zredukowanego cukru do końcowej grupy aldehydowej;

c) łączenie aktywowanego polisacharydu grupy A i liposomów i kowalencyjne wiązanie polisacharydu grupy A z liposomem przez redukujące aminowanie z wytworzeniem koniugatu polisacharydu grupy A i liposomu; i

d) odzyskiwanie koniugatu polisacharydu grupy A z liposomami.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia schematycznie wzór strukturalny węglowodanu grupy A (fig. 1A) oraz węglowodanu odmiany grupy A (fig. IB). Rysunek trójwymiarowej struktury węglowodanu grupy A, wspiera obserwację, że swoistość serologiczna węglowodanu jest skierowana przeciwko reszcie N-acetyloglukozaminy w węglowodanie.

Figura 2 przedstawia graficznie oznaczenia mian ELIS A przeciwciał przeciwko węglowodanom streptokoków grupy A u dzieci normalnych w wieku od 5 do 10 lat z Trinidadu i z Nowego Yorku. Odczyty były oznaczeniami 1,0 O.D. przy długości fali 405 nm.

Figura 3 przedstawia graficznie badania zahamowania ELISA ludzkimi surowicami znanymi z posiadania przeciwciał aktywnych w stosunku do grupy A/liposomów. Surowice rozcieńczano odpowiednio uzyskując 1,0 O.D. przy 405 nm, i mieszano z różnymi stężeniami różnych antygenów przez 1 godzinę w 37°C, odwirowano przez 5 minut przy 10000 obr./min. Nadsącze badano na reaktywność w teście ELISAjakto opisano w przykładzie 3. Dane oznaczają średnią z badanych surowic.

Figura 4 przedstawia graficznie pośredni test bakteriobójczy, z zastosowaniem płukanej ludzkiej krwi, do której dodawano różnych surowic w probówce zawierającej RPMI i dopełniacz, jak to opisano w przykładzie 1. Początkowe inokulum wynosiło 9 CFU streptokoków grupy A typ 6. Panel A pokazuje wzrost mikroorganizmów w probówkach obrotowych zawierających normalną surowicę króliczą. Panel B pokazuje wzrost w probówkach stacjonarnych z ludzką surowicą zawierającą wysokie miana, mierzone ELISA, reaktywne w stosunku do węglowodanów grupy A. Panel C pokazuje zahamowanie wzrostu z tą samą surowicą ludzką, jak w panelu B ale w probówkach obrotowych.

Figura 5 przedstawia graficznie pośredni test bakteriobójczy jak to opisano w przykładzie 4. Bakterie należały do serotypu 3 (szczep D58/11/3), serotypu 6 (szczep S43), serotypu 14 (szczep S23/101/5) i serotypu 28 (szczep T28/isoA/5). Oś lewa przedstawia liczbę jednostek tworzących kolonie w probówkach obrotowych w stosunku do probówek stacjonarnych. Oś prawa oznacza odsetek zabijania mikroorganizmów w probówkach obrotowych w stosunku do probówek stacjonarnych.

Figura 6 przedstawia graficznie wpływ heparyny na pośredni test bakteriobójczy. Pośredni test bakteriobójczy wykonywano jak to opisano ale w powtórzeniu. Do jednego zestawu probówek obrotowych i jednego stacjonarnego dodano heparynę (5 jednostek/ml), podczas gdy drugi zestaw służył jako kontrola. Standardowa ilość heparyny stosowana w teście bakteriobójczym, w oparciu o sposób Lancefielda, wynosi 10 jednostek/ml (33-35). Jak widać, heparyna, w ilości o połowę mniejszej od opisywanych, dramatycznie zmniejsza niszczenie zależne od przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A.

Figura 7 przedstawia graficznie test bakteriobójczy mian przeciwko węglowodanom grupy A, mierzonych testem ELISA. 17 indywidualnych surowic ludzkich mierzono w obu testach stosując bakterie serotypu 6. Należy zauważyć, że wszystkie surowice (13/13) wykazujące miana CHO wyższe niż 200000, wykazywały powyżej 80% niszczenia w teście bakteriobójczym. W przeciwieństwie, tylko jedna spośród 4 surowic o mianie poniżej 200000 ułatwiała opsonofa

181 037 gocytozę mikroorganizmów, zaś stopień fagocytozy był znacznie niższy od obserwowanego w przypadku surowic o wysokich mianach.

Figura 8 przedstawia graficznie opsonofagocytamy test bakteriobójczy jak to opisano w przykładzie 1. Fagocytoza mikroorganizmów przedstawiona jest w procentach niszczenia bakterii w porównaniu z niszczeniem kontroli stacjonarnych. Słupki pokazują procent niszczenia przed adsorpcją na kolumnie powinowactwa z N-acetyloglukozaminąpo absorpcji na kolumnie powinowactwa i procent niszczenia przy użyciu przeciwciał eluowanych z kolumny. Należy zauważyć całkowity brak niszczenia we wszystkich surowicach po absorpcji na kolumnie powinowactwa z N-acetyloglukozaminą oraz częściowe odzyskiwanie bakteriobójczej aktywności opsonofagocytamej po elucji przeciwciał z kolumny powinowactwa. Błąd standardowy pokazano w każdym przypadku, z wyjątkiem surowic absorbowanych, gdzie nie występowało niszczenie.

Figura 9 przedstawia graficznie wskaźnik opsonofagocytamy surowic króliczych, znanych z posiadania wysokich mian przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A, po immunizacji węglowodanami streptokoków grupy A. Fagocytozę drobnoustrojów zaznaczono jako procent niszczenia drobnoustroju w porównaniu z kontrolą stacjonarną. Należy zauważyć brak fagocytozy mikroorganizmów w mianach<50000, stopniowe zwiększanie niszczenia w mianach rzędu 75000 i całkowitą fagocytozę w mianach powyżej 100000. Stosowano drobnoustroje szczepu grupy A typu 6 zaś inokulum wynosiło 4 jednostki tworzące kolonie.

W świetle znanych danych serologicznych wykrywających przeciwciała przeciwko węglowodanom w surowicach ludzkich, w połączeniu z zależną od wieku indukcją ochrony przez inne antygeny węglowodanowe, konkretnie polisacharydy pneumokoków (27), meningokoków (4) i Haemophilus (5), zadecydowano ponownie zbadać różne surowice ludzkie na obecność przeciwciał przeciwko węglowodanom w populacji normalnej i zakażonej streptokokiem. Do badania byli włączeni pacjenci po przebytym zakażeniu streptokokiem. Oczyszczone węglowodany streptokoków grupy A połączono kowalencyjnie z syntetyczną fosfatydyloetanolaminą, wbudowano do liposomów i zastosowano do badania opartego na ELIS A. Wynalazek ten pokazuje, że przeciwciała przeciwko antygenowi węglowodanowemu grupy A są łatwo wykrywalne w surowicach ludzkich. Ponadto, zależnie odpopulacji geograficznej i ekspozycji na streptokoki, ilość przeciwciał wykazuje zależność od wieku. Wzrost miana przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A wykazano również po zakażeniu streptokokiem. W celu odpowiedzi na pytanie czy przeciwciała te albo ich część, aktywna w stosunku do węglowodanów grupy A, może ułatwiać opsonofagocytozę, zastosowano modyfikację testu bakteriobójczego Lancefielda. Uzyskane dane pokazują, że przeciwciała te są opsonizujące zaś końcowe nie redukujące reszty N-acetyloglukozaminy stanowią epitop, przeciwko któremu są skierowane.

Koniugaty immunogenne według wynalazku tworzone są przez przyłączanie kowalencyjne polisacharydu streptokoka grupy A (GASP) do odpowiedniego białka albo fosfolipidu tworzącego liposomy.

Izolację i wzrost streptokoków grupy A, oraz wytwarzanie polisacharydów grupy A prowadzono według procedury opisanej przez McCarthy (28) i Dubois i in. (31). Izolowany GASP miał następującą strukturę chemiczną:

[—>2) -α,-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] _n---R' -CH₂-NH-białko β-D-GlcpNAc w której R oznacza końcową, nie redukującąL-ramnozę albo D-GlcpNAc zaś n oznacza liczbę powtórzeń podjednostek, odpowiednio dużą do budowy polisacharydu o odpowiednim cię

181 037 żarze cząsteczkowym, by był immunogenny. Wartość n zawiera się w zakresie od 3 do 30, optymalnie około 20. W znaczeniu tu użytym, określenie „polisacharyd” obejmuje każdy polimer sacharydowy i obejmuje disacharydy, oligosacharydy itp. Hodowle odmiany streptokoka grupy A, wytwarzającego powyższą strukturę polisacharydu, zdeponowano w American Type Culture Collection, Rockville, MD. GASP powinien posiadać odpowiednio dużą wielkość aby wywoływać odpowiedź odpornościową u osobników. Najkorzystniej, średni ciężar cząsteczkowy wynosi około 10 000. Pojedyncze powtórzenie GASP posiada ciężar cząsteczkowy rzędu 500.

Koniugaty GASP z białkiem korzystnie przekształcają odpowiedź odpornościową niezależną od limfocytów T w kierunku odpowiedzi zależnej od limfocytów T. Każde białko albo jego fragment, tolerowane przez osobnika i zdolne do wywołania odpowiedzi odpornościowej zależnej od limfocytów T, jest odpowiednie do zastosowania w koniugacie z GASP. Zasadniczo, każde białko może służyć jako białko koniugatu. Konkretnie, wybrane białko musi posiadać przynajmniej jedną wolną grupę aminową do zastosowania w koniugacji z polisacharydami grupy A. Korzystnie, białko jest dowolnym białkiem natywnym lub rekombinowanym bakteryjnym, i samo w sobie jest immunogenem wywołującym odpowiedź odpornościową zależną od limfocytów T u młodych i dorosłych ssaków. Przykłady takich białek obejmują, ale nie wyłącznie toksoid tężca, toksyny cholery, toksoid błonicy i CRM₁₉₇. Inne potencjalne białka koniugatu obejmują toksyny albo toksoidy pseudomonas, stafylokoków, streptokoków, krztuśca i bakterii enterotoksycznych włącznie z E. coli.

W korzystnym wykonaniu, cząsteczki koniugatu według wynalazku, obejmują rdzeń białkowy do którego przyłączony jest GASP, przez zmodyfikowaną postać końcowego, redukującego cukru. Taka cząsteczka koniugatubędzie więc zawierać jednofunkcyjne białko wiążące GASP. Korzystnie, do każdego białka przyłączonych jest wiele GASP, w szczególności od około 1 do około 12. Bardziej korzystnie, przynajmniej około 5 GASP związanych jest z każdym białkiem.

W innym wykonaniu GASP związany jest z białkiem przez dwa lub więcej miejsc na każdym GASP. Ponieważ bakteriobójczy epitop wydaje się być obecny na rozgałęzieniach powtórzeń GASP, funkcjonalizacja GASP i wiązanie z białkiem należy przeprowadzić w sposób zachowujący immunogenną ilość epitopu bakteriobójczego.

Białka, z którymi może być koniugowany GASP, mogąbyć toksynami natywnymi albo toksynami inaktywowanymi (tzn. toksoidami). Również, może być zastosowana zmutowana, nietoksyczna postać toksyny. Korzystnie, mutacje takie zachowują epitopy natywnej toksyny. Taka zmutowana toksyna nosi nazwę „substancji reagującej krzyżowo” albo CRM. CRM₁₉₇, która posiada pojedynczą zmianę aminokwasową, w stosunku do aktywnej toksyny błoniczej i jest immunologicznie nieodróżnialna od niej, jest składnikiem koniugatu szczepionki Haemophilus influenzae szeroko stosowanej u dzieci.

Kultura szczepu C7 Corynebacterium diphteriae (βΐ 97), wytwarzającego to białko CRM₁₉₇, zdeponowana jest w American Type Culture Collection, Rockville, MD (Nr ATCC 53281).

Fragmenty białka mogąbyć również zastosowane do koniugowania GASP, o ile są odpowiedniej długości, tzn. korzystnie przynajmniej 10 aminokwasów jest koniecznych by stanowiły epitop limfocyta T.

Aby wytworzyć koniugat polisacharydu grupy A z białkiem, mogąbyć zastosowane liczne sposoby koniugacji. Korzystnie, zastosowany sposób powinien zachowywać immunogenność epitopu bakteriobójczego obecnego na rozgałęzieniach β-D-GlcpNAc, połączonych wiązaniem glikozydowym z pozycją 3 ramnozy. Gdy pojedynczy GASP wiąże dwie lub więcej cząsteczek białka, powstały koniugat jest usieciowany w odniesieniu do białka. Stopień usieciowania i całkowita wielkość cząsteczki koniugatu może być regulowana rutynowymi zmianami warunków zastosowanych podczas reakcji koniugacji, dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Odmiany takie obejmują, przykładowo, szybkość reakcji koniugacji i stosunek białek i GASP obecnych w mieszaninie reakcyjnej.

Wiele chemicznych metod koniugowania polisacharydów z białkami jest znanych i opisanych w stanie techniki. Przykładowo, opis patentowy USA 4 644 059 ujawnia koniugat wytwo

181 037 rzony przy zastosowaniu dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH) jako łącznika homodifunkcjonalnego. Opis patentowy USA 4 695 624 ujawnia sposób wytworzenia polisacharydów i koniugatów przy zastosowaniu „bigeneric spacers” Przegląd różnych sposobów wytwarzania i czynników stosowanych w projektowaniu koniugatów przedyskutowano w Dick, W.E. i Beurret, M., Contrib. Microbiol. Immunol. (1989), vol. 10, 48-114. Korzystnym sposobem koniugacji do zastosowania w koniugatach GASP-białko, według wynalazku, jest redukujące aminowanie jak to ujawniono w opisie patentowym USA 4 356 170. W korzystnym wykonaniu, końcowy cukier redukuj ący GASP j est redukowany tak by otworzyć pierścień, przez zastosowanie łagodnego czynnika redukującego, np. borowodorku sodu albo jego równoważnika.

Następnie, stosuje się selektywne utlenianie metanadjodanem sodu albo jego równoważnikiem, w celu utlenienia sąsiadujących końcowych grup hydroksylowych uprzednio zredukowanej cząsteczki cukru, tworząc końcową grupę aldehydową. Powstaje aktywowany GASP, który jest zdolny do kowalencyjnego przyłączania do wybranego białka nośnikowego. W innym wykonaniu wynalazku, aktywowany w ten sposób GASP może być również kowalencyjnie wiązany z fosfolipidem, takim jak fosfatydyloetanolamina, będąca w postaci liposomów. Budowa chemiczna aktywowanego GASP wygląda następująco:

[->2) -α-L-Rhap- (l->3) -α-L-Rhap- (l->] _n---R' CHO

T i

β-D-GlcpNAc przy czym R' oznacza produkt redukcji i utleniania końcowego cukru redukującego, z wyjątkiem części końcowego cukru redukującego tworzącego resztę aldehydową(CHO). Około 10 mg polisacharydu jest odpowiednio utleniane przy zastosowaniu około 1 ml około 20 mM roztworu metanadjodanu sodu przez około 10-15 minut w temperaturze pokojowej. Czas reakcji można zmieniać dostosowując go do innych ilości nadjodanu aby uzyskać równoważny stopień utlenienia. Redukcja i otwarcie końcowych cukrów redukujących powoduje, że sąsiadujące grupy hydroksylowe cukru redukującego stają się bardziej aktywne w porównaniu z grupami obecnymi na związanych wiązaniem glikozydowym odgałęzieniach β-D-GlcpNAc. Jednakże, mogą wystąpić dodatkowe miejsca wiązania, również przez utlenienie niektórych związanych wiązaniem glikozydowym reszt β-D-GlcpNAc. Aktywowany GASP i wybrane koniugujące białko poddaje się reakcji w obecności jonów cyjanoborowodorowych albo innego czynnika redukującego, przez sprzęganie grup aminowych białka nośnikowego z końcowymi grupami aldehydowymi GASP. Polisacharydy grupy A i białko są związane przez wiązanie -CH₂-NH- jak we wzorze Π:

[->2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] _n---R' -Cłty-NH-biaiko (Π) β-D-GlcpNAc

181 037

Powstałe w wyniku procesu aminowania redukcyjnego koniugaty GASP-białko, korzystnie, posiadają ograniczone usieciowanie i korzystnie, są rozpuszczalne w roztworach wodnych. Powoduje to, że koniugat GASP-białko, według wynalazku, jest korzystnym kandydatem do zastosowania w szczepionce.

W innym wykonaniu wynalazku, GASP są wbudowane do liposomów, tworząc kompozycję immunogenną. Liposomy są często stosowane w koniugatach, z powodu ich zdolności do wywoływania efektu „capping” limfocytów B. Bez wnikania w teorię, koniugaty GASP-liposom, jak się uważa, zwiększają miana przeciwciał przez redystrybucję receptora i aktywację limfocytów B. Zjawisko to jest dobrze znane w dziedzinie biologii komórkowej. Pokrótce, dzięki strukturalnym właściwościom liposomy mogąbyć opłaszczane przez antygen, tworząc poliwalentne struktury immunogenne. Ponieważ cząsteczki receptora w błonie komórkowej limfocytów mają zdolność ruchu, wiele spośród nich może być usieciowanych przez reagenty dwuwartościowe, tworząc obszary precypitacji dwuwymiarowej albo „łatki”. Te z kolei grupują się na polarnych końcach limfocytów B tworząc czapeczkę w błonie komórkowej limfocyta. Akt tworzenia czapeczki antygenowej na limfocycie B, w obecności limfocytów T pomocniczych, aktywuje produkcję przeciwciał przez limfocyty B.

Różne sposoby koniugowania polisacharydów z liposomami są znane i opisane w technice. Przykładowo, opis patentowy USA 5 283 185, ujawnia przeniesienie kwasów nukleinowych do komórki, przez przygotowanie dyspersji mieszaniny lipidu kationowego z innym lipidem a następnie wprowadzenie kwasów nukleinowych do dyspersji z wytworzeniem kompleksów. Następnie kompleksem tym traktuje się komórki. W korzystnym wykonaniu wynalazku, liposomy są wytwarzane przez dyspergowanie lipidu w roztworze wodnym przez wstrzyknięcie przez cienką igłę, albo, korzystnie, przez sonikację, jak to opisano w Fillit, Η. M. Milan Blake, Christa McDonald i Maclyn McCarthy (198), Immunogenicity of liposome-bound hyaluronate in mice, J. Exp. Med., 168: 971-982.

W celu wytworzenia liposomów zawierających fosfolipid kowalencyjnie związany z GASP, wytwarza się liposomy znanymi sposobami. Przykładowo, w jednym wykonaniu wynalazku, fosfatydyloetanolaminę rozpuszcza się w rozpuszczalniku jak np. chloroform i umieszcza się w naczyniu. Rozpuszczalnik chloroformowy usuwa się opłaszczając naczynie fosfatydyloetanolaminą. Do naczynia dodawany jest bufor wodny taki jak woda albo roztwór soli buforowany fosforanem (PBS), po czym mieszanina poddawana jest sonikacji i tworzą się liposomy. GASP, który został zaktywowany, korzystnie, przez redukcję a następnie utlenianie, jest dodawany do liposomów w równej molamie ilości, po czym oba składniki miesza się przez noc w obecności dowolnego odpowiedniego buforu jak roztwór soli, roztwór Ringera albo najkorzystniej, roztwór soli buforowany fosforanem (PBS). Następnie do mieszaniny dodaje się cyjanoborowodorku sodu i tworzy się stabilne kowalencyjne połączenia pomiędzy fosfatydyloetanolaminą i polisacharydem GASP. Produkt końcowy, jak przedstawiony wzorem ΙΠ, może być oddzielony od cyjanoborowodorku sodu przez odwirowanie, chromatografię na sicie molekularnym albo dializę:

o

[-+2) -α-L-Rhap- (l->3) -a-L-Rhap- (l->] _n R' -CH₂-NH-R

T (in) β-D-GlcpNAc

R' i n we wzorze III są opisane uprzednio zaś R² oznacza fosfatydyloetanolaminę.

181 037

W korzystnym wykonaniu GASP-liposomy są łączone z białkiem w celu włączenia białka hydrofobowego do łiposomów. Nawiązując do jednego ze sposobów, GASP-liposomy rozpuszcza się w 5% roztworze β-oktyloglukozydu. Białko, które ma być dodawane do łiposomów również rozpuszcza się w 5% β-oktyloglukozydzie i łączy się białko i liposomy. Po zmieszaniu w celu włączenia białka do łiposomów, β-oksyloglukozyd usuwa się przez dializę. Powstałe kompleksy GASP-liposom-białko mogąbyć stosowane jako immunogen albo szczepionka.

GASP mogąbyć również wiązane z fosfolipidami przez zastosowanie innych mniej korzystnych technik takich jak stosowanie benzochinonu, jak to opisano w Fillit, H.M., M. McCarthy i M. S. Blake (1986), The induction of antibodies to hyaluronic acid by immunization of rabbits with encapsulated streptococci, J. Exp. Med., 164: 762-776. Jednakże, zastosowanie takich odczynników może nie być pożądane, jeżeli kompozycja ma zostać użyta jako szczepionka.

Kompozycje immunogenne według wynalazku mogą być zastosowane jako środek do wywołania przeciwciał użytecznych do celów profilaktycznych i diagnostycznych. Środki diagnostyczne są szczególnie użyteczne w śledzeniu i wykrywaniu różnych zakażeń i chorób powodowanych przez streptokoki grupy A. W innym wykonaniu wynalazku stosuje się kompozycje immunogenne jako immunogen do zastosowania w czynnej i biernej ochronie osobników poddanych ryzyku kontaktu z zakażeniami albo chorobami wywołanymi przez streptokoki grupy A. Przeciwciała immunogenne zastosowane do biernej ochrony wytwarza się przez immunizację ssaka kompozycją immunogenną według wynalazku, koniugatem polisacharydu z białkiem lub liposomem, lub szczepionką według wynalazku oraz pozyskaniu przeciwciał bakteriobójczych z frakcji gammaglobulin albo jako surowicę, albo jako przeciwciała swoiste. W znaczeniu tu użytym, szczepionki według wynalazku zdolne są do wywołania przeciwciał użytecznych dla zapewnienia ochrony przed zakażeniami bakteriami streptococcus grupy A.

Dodatkowo, polisacharyd grupy A może być zastosowany sam jako czynnik immunizujący, korzystnie w połączeniu z adiuwantem takim jak np. wodorotlenek glinu, fosforan glinu, monofosforylolipid A, QS21 albo stearylotyrozyna. Dalsze wykonanie wynalazku stanowi zastosowanie kompozycji immunogennych jako ochrony immunogennej przed zakażeniami streptokokami grupy A. W szczególności, wynalazek powinien zapewnić ochronę populacjom najbardziej narażonym na zakażenie i choroby spowodowane streptokokami grupy A, zwłaszcza dorosłym, kobietom ciężarnym a w szczególności niemowlętom i dzieciom.

Kompozycję immunogenną i szczepionki według wynalazku zwykle wytwarza się przez dyspergowanie GASP albo koniugatu w odpowiednim, dopuszczalnym farmaceutycznie nośniku, takim jak roztwór fizjologiczny soli, roztwór soli buforowany fosforanem albo inny płyn do wstrzyknięć. Szczepionka jest podawana pozajelitowo, przykładowo podskórnie, dootrzewnowe albo domięśniowo. Mogą być również obecne dodatki zwykle dodawane do szczepionek, przykładowo stabilizatory takie jak laktoza czy sorbit oraz adiuwanty takie jak wodorotlenek glinu, fosforan glinu, monofosforylolipid A, QS21 albo stearylotyrozyna.

Dawka kompozycj i immunogennej powinna być wystarczaj ąca do wywołania wyniku efektywnego immunologicznie. Dawkowanie zwykle powinno się zawierać w granicach od około 0,01 pg do około 10 pg na kilogram ciężaru ciała. Dla optymalnej odporności powinno się podawać szereg dawek. Może być dostarczona postać użytkowa szczepionki o ilości GASP albo koniugatu, równej od około 0,01 pg do około 10 pg.

Wynalazek jest ilustrowany poniższymi nie ograniczającymi przykładami.

Przykład 1

Poniżej opisane zostały sposoby hodowli, przygotowania i testów na przeciwciała przeciwko węglowodanom streptokoków grupy A i ich zastosowanie jako nowych szczepionek u dorosłych i dzieci:

Hodowla streptokoków grupy A

Przechowywaną w -70°C kulturę streptococcus grupy A wysiano na płytkę zwierającą3 g/1 bulionu Todd Hewitt i 3 g/1 ekstraktu drożdżowego (pożywka GAS). Płytkę inkubowano w 37°C przez 48 godzin, po czym kolonie (8-9) przeniesiono do butelki z 200 ml pożywki GAS i hodowano przez 18 godzin w 37°C wytrząsając przy 120obr./min. Hodowlę (150 ml) przeniesiono do 15

181 037 litrowego fermentora (New Brunswick, BioFlo 4) w bulionie Todd Hewitt. Hodowlę hodowano przez 7-8 godzin w pH 7,0 i 37°C. Gdy hodowla osiągnęła fazę stacjonarną (gęstość optyczna przy 600 nm równa około 1,5) dodano glukozy 3 g/1. Hodowlę podtrzymywano przez kolejne 8 godzin po czym zbierano. Końcowa gęstość optyczna wynosiła około 2,7 przy 600 nm.

Przygotowanie polisacharydów streptokoków grupy A

Sześćdziesiąt gramów komórek streptokoka grupy A w 600 ml wody połączono z 7 5 ml 4 N azotynu sodu i 75 ml lodowatego kwasu octowego. Roztwór mieszano przez 15 minut i odwirowano przez 10 minut przy 11000 obr./min. w rotorze SS34. Nadsącz pobrano, dializowano wobec wody i liofilizowano. Polisacharyd grupy A oczyszczano z surowego liofilizowanego ekstraktu przez filtrację żelową na kolumnie Sephadex G-50 (Pharmacia) przy użyciu PBS jako eluentu. Frakcje wypłukiwane z kolumny śledzono na obecność węglowodanów stosując test z kwasem fenolosiarkowym Dubois (31). Frakcje pozytywne pulowano, dializowano w 4°C wobec wody i liofilizowano. Preparat polisacharydowy (240 mg) zawierał mniej niż 1% (wag./wag.) białka i kwasów nukleinowych. Jego czystość została dalej potwierdzona przez ’Η-NMR przy 500 MHz, z użyciem spektrometru BRUKER AM-500.

Przygotowanie liposomów

Węglowodany streptokoków grupy A izolowano sposobem opisanym uprzednio przez McCarthy (28). Liofilizowany materiał zawieszono, ustalono stężenie na 10 mg/ml i wiązano kowalencyjnie z liposomami sposobem opisanym uprzednio przez Fillit i in., (18), stosując benzochinon jako czynnik łączący. Pokrótce, GASP poddano reakcji z benzochinonem tworząc aktywowany związek przejściowy. Poddawano go dalszej reakcji z fosfatydyloetanolaminą w postaci liposomów tworząc immunogenny koniugat GASP-liposomy.

Testy ELISA

Metoda ELISA była, zasadniczo, analogiczna do opisanej przez Fillit i in., (18) z następującymi modyfikacjami. Wstępne badanie z surowicami ludzkimi wskazywało, że 0,5 CHO/ml w PBS, pH 7,2, preparatu liposomów do uczulania płytek do mikromiareczkowania daje najlepsze wyniki z minimalnym odczytem tła w stosunku do kontrolnych preparatów liposomowych. 100 μΐ preparatu umieszczano w każdej studzience płytki (Dynatech, U SA) i inkubowano w 37°C przez noc. Płytki płukano trzykrotnie w buforze ELISA do płukania (10 mM octan sodu, 100 mM NaCl, 0,1% Brij 35, pH 8,0). Surowice ludzkie rozcieńczano w tym samym buforze ELISA i 100 μΐ danego rozcieńczenia surowicy umieszczano na płytkach i inkubowano przez godzinę w 37°C. Wszystkie surowice badano w powtórzeniach. Po odpowiednim płukaniu, jako przeciwciało wtórne zastosowano rozcieńczenie 1:1000 koziego F(ab')₂ przeciwko ludzkim IgG (swoiste dla łańcucha γ) albo IgM (swoiste dla łańcucha μ) skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną (Tago, Inc., USA), po czym inkubowano przez dodatkową godzinę w 37°C. Po trzech dodatkowych płukaniach w buforze ELISA, do studzienek dodano substratu fosfataza(Sigma 104) w 0,1M dietanoloaminie, pH 9,6, płytki inkubowano w 37°C przez godzinę i odczytywano w urządzeniu Elida V (Physica Co.) przy 405 nm. Za miano uznawano rozcieńczenie dające odczyt gęstości optycznej równy 1,0.

Test bakteriobójczy

Pośredni test bakteriobójczy, opisany przez Lancefielda (15, 25, 26) wykonano jak niżej. Drobnoustroje różnych szczepów hodowano przez 18 godzin w 37°C w bulionie Todd Hewitt. Próbki całonocnych hodowli rozcieńczono 1:2 świeżym bulionem Todd Hewitt i hodowano przez dodatkowe dwie godziny w 37°C. Zawiesinę rozcieńczono 1:100 kolejnymi dwukrotnymi rozcieńczeniami w celu otrzymania 5-15 kolonii w 50 μΐ bulionu Todd Hewitt. Jako źródło fagocytów ludzkich zastosowano heparynizowaną krew. W celu uniknięcia obecności osocza autologicznego w zawiesinie fagocytamej, osad płukano trzykrotnie w PBS (pH 7,2) i na koniec zawieszono w RPMI (Gibco-BRL, Co., Rockville, MD) do tej samej objętości co początkowa próbka krwi. Dopełniacz dostarczono do układu przez zastosowanie świeżo izolowanej surowicy od normalnego dawcy, znanego z posiadania małych ilości przeciwciał przeciwko węglowodanom i którego surowicę absorbowano kilkakrotnie w 0°C ze streptokokami grupy A a jej porcje przechowywano w -70°C (29). Przed zastosowaniem, źródło dopełniacza badano zarówno na

181 037 aktywność dopełniacz jak i na nieobecność przeciwciał przeciwko węglowodanom. Test bakteriobójczy przeprowadzono w powtórzeniach w zamkniętych probówkach. Mieszanina reakcyjna zawierała: 300 pl ludzkich fagocytów zawieszonych w RPMI, 100 pl dopełniacz, 200 pl badanej surowicy i 50 pl rozcieńczonej hodowli streptokoków. Podobnie jak w teście Lancefielda, jedną z probówek obracano wzdłuż osi długiej przez trzy godziny w 37°C zaś drugą probówkę, służącą jako kontrola, pozostawiono w bezruchu w tej samej temperaturze. Po 3 godzinach, 100 pl z każdej probówki wysiano na agar krwawy i inkubowano przez noc w 37°C. Następnie liczono liczbę kolonii na każdej z płytek. Aktywność opsonofagocytamą wyliczono jako procenty niszczenia streptokoków przez poszczególne surowice stosując następujące równanie: (1-cfu w surowicy obracanej/cfo w probówce stacjonamej)xl00.

Absorpcja przeciwciał przeciwko N-acetyloglukozaminie z ludzkich surowic.

600 μΐ 50% zawiesiny N-acetyloglukozaminy sprzęgniętej z perełkami Sepharose (Sigma Chemical Co.) w PBS, umieszczono w sterylnych probówkach eppendorf i odwirowano w 4°C przy 14000 obr./min. przez 10 minut. Nadsącz usunięto, po czym do perełek dodano 300 pl surowicy. Zawiesinę obracano wokół osi długiej probówki przez godzinę w 37°C. Po drugim odwirowaniu w tych samych warunkach, absorbowaną surowicę pobierano i stosowano w teście bakteriobójczym, jak to opisano uprzednio. W celu usunięcia przeciwciał przeciwko N-acetyloglukozaminie z kolumny powinowactwa, perełki opłaszczone adsorbowanymi przeciwciałami umieszczono w 1 ml strzykawce tuberkulinowej, przez którą przepuszczono roztwór 0,58% (vol./vol.) kwasu octowego w 0,15 MNaCl, pH 2,2. Eluent śledzono przez absorbcję przy 280 nm, zbierano frakcje szczytowe i dializowano wobec PBS, pH 7,2 po czym zatężano do objętości pierwotnej surowicy stosując koncentrator Amicon centriprep 30 (Amicon, Beverly, MA).

Surowice ludzkie

Osobnicy włączeni do badania pochodzili z Trinidadu, miasta Nowy York i Great Lakes Naval Training Station. Wiek ich wahał się od 5 do 20 lat. Krew uzyskiwano przez pobranie z żyły, a surowicę uzyskiwano standardową techniką. Wszystkie surowice dobierano pod względem wieku, pochodzenia i stanu zdrowia, jak to pokazano w tabeli I.

Tabela I

Rozkład populacji

Pacjenci	Wiek (lata)	Liczba pacjentów
Dzieci normalne - Trinidad	5	36
Dzieci normalne - Trinidad	10	16
Dzieci normalne - Nowy York	5	32
Dzieci normalne - Nowy York	10	22
Gorączka reumatyczna - Trinidad	7	19
Zapalenie nerek - Trinidad	4	18
Niepowikłana płonica	18-20	6
Powikłana płonica (ARF)	18-20	5

Test bakteriobójczy

Ustaliwszy, że surowice ludzkie zawierająprzeciwciała przeciwko węglowodanom grupy A oraz, że miana tych przeciwciał różnią się pomiędzy osobnikami, postawiono pytanie czy przeciwciała te również wspomagają opsonofagocytozę w teście in vitro. Test bakteriobójczy wyglądał zasadniczo jak przeprowadzony przez Dr Lancefielda (15, 25, 26) do badania surowic ludzkich z modyfikacjami opisanymi poniżej. Figura 4 pokazuje wyniki testów fagocytamych. Przy użyciu inokulum 9 jednostek tworzących kolonie serotypu 6 szczepu streptokoka grupy A, wykazano znaczne zwiększenie liczby kolonii w probówkach obracanych w obecności normal

181 037 nej surowicy króliczej (Panel A). Panel B pokazuje nieznaczny wzrost w probówkach stacjonarnych, w których znajdowała się surowica ludzka. W przeciwieństwie, obrotowe probówki zawierające surowicę ludzką (Panel C) całkowicie hamowały wzrost mikroorganizmów (w porównaniu z Panelem B i C).

Aby upewnić się, że obserwowana opsonofagocytoza streptokoków grupy A nie było ograniczona do jednego serotypu, doświadczenie to powtórzono stosując trzy inne szczepy grupy A o różnych serotypach białka M. Jak to widać na fig. 5, wszystkie trzy szczepy ulegały fagocytozie w obecności ludzkich surowic w sposób podobny do obserwowanego w przypadku serotypu 6. Procent niszczenia różnił się o 80-100%, gdy porównywano probówki obrotowe w stosunku do stacjonarnych. Szczepy serotypów 3,14 i 28 były identyczne ze stosowanymi przez dr Lancefielda w teście fagocytamym (15, 25, 26).

Zależność pomiędzy mianami anty-CHO i opsonofagocytoząprzez surowice ludzkie

Korzystając z testu fagocytamego, jest jasne, że surowice ludzkie różnią się zdolnością do ułatwiania fagocytozy streptokoków grupy A. Ogólnie, właściwości fagocytame danej surowicy korelują z mianem przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A. Jak to widać na figurze 6, wszystkie surowice posiadające miana większe niż 200 000 wykazywały niszczenie powyżej 80%, podczas gdy trzy spośród czterech surowic o mianach poniżej 200 000 nie wykazywały tego efektu. Jedna z surowic o mianie CHO 40000 ułatwiała fagocytozę, ale stopień niszczenia był daleko mniejszy od obserwowanego w przypadku surowic o wysokich mianach anty-CHO.

Badanie fagocytozy przez surowice ludzkie w teście z użyciem krwi heparynizowanej w porównaniu z nieheparynizowaną

Z powodu znanej zdolności heparyny do wiązania i inaktywacji wielu składników dopełniacz oraz w celu skorelowania testu fagocytamego z wykonywanymi uprzednio, właściwości opsonofagocytame normalnych surowic ludzkich opisanych wyżej, badano w teście fagocytamym w obecności i pod nieobecność heparyny. Heparynizowaną ludzką krew pobierano z żyły, płukano intensywnie w PBS jak to opisano powyżej i dzielono na dwie części. Jedną część zawieszano w początkowej objętości RPMI i wykonywano test opsonizacji jakto opisano wyżej. Dragą porcję traktowano w ten sam sposób, ale z dodatkiem 5 jednostek heparyny na mililitr, po czym wykonywano ten sam test w sposób opisany dla drugiej porcji.

Wyniki przedstawione na figurze 6 ujawniły, że pod nieobecność heparyny surowica ludzka powodowała średnio 94% fagocytozy streptokoków grapy A. Jednakże, w obecności heparyny, ta sama surowica powodowała jedynie 12% fagocytozy tego samego inokulum.

Doświadczenie absorpcji

W celu określenia, który z fragmentów cząsteczki węglowodanu streptokoków jest odpowiedzialny za aktywność bakteriobójczą, surowice ludzkie absorbowano na perełkach Sepharose sprzęgniętych z N-acetyloglukozaminą jak to opisano w rozdziale metod. Absorbowane i nieabsorbowane surowice zastosowano następnie w standardowym teście bakteriobójczym. Figura 7 przedstawia wyniki tych doświadczeń. Nieabsorbowane surowice wyraźnie zwiększały fagocytozę streptokoków. W przeciwieństwie, surowica absorbowana na perełkach sprzęgniętych z N-acetyloglukozaminą, pozbawiona była przeciwciał opsonizujących. Jako kontrola żywotności, normalna surowica królicza nie zwiększała fagocytozy. Doświadczenia te wskazują że przeciwciała skierowane przeciwko nie redukującej, końcowej reszcie N-acetyloglukozaminy węglowodanu grapy A były niezwykle istotne w opsonofagocytozie streptokoków grapy A w zastosowanym teście bakteriobójczym. W celu potwierdzenia tych wyników, przeciwciała z wybranych surowic, absorbowanych na kolumnie powinowactwa z N-acetyloglukozaminą eluowano i zastosowano w teście bakteriobójczym. Jak również pokazano na figurze 9, doświadczenia te pokazały, że przeciwciała swoiste dla N-acetyloglukozaminy, eluowane z kolumny powinowactwa, były zdolne do częściowego przywrócenia opsobofagocytamej aktywności bakteriobójczej surowicy.

Stosując sposoby mające na celu pomiar przeciwciał precypitujących jak i nie precypitujących, aktywnych w stosunku do węglowodanów streptokoków grapy A, węglowodan ten został sprzęgnięty kowalencyjnie z fosfatydyloetanolaminą i wbudowany do liposomów zdolnych

181 037 do wiązania się z płytką do mikromiareczkowania. Sposób ten jasno pokazuje, że większość ludzkich surowic zawiera przeciwciała w stosunku do polisacharydów streptokoków grupy A.

Nieoczekiwanie, odkryto, że dzieci z różnych położeń geograficznych wykazywały znaczące różnice w mianach przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A. Podczas gdy ilość ekspozycji na streptokoki (zarówno lisżajców jak i zapaleń krtani) jest większa na Trinidadzie niż w Nowym Yorku, zakażenia streptokokami są również częste w Nowym Yorku. W tym kontekście, Zimmerman i in., (23) zauważyli niższe miana przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A u pacjentów skrupulatnie badanych i leczonych z powodu zakażeń streptokokami grupy A, w porównaniu z grupąnie monitorowaną. Ponadto, antygeny węglowodanowe są ogólnie, grasiczo niezależne, a więc jest możliwe, że aby wywołać odpowiedź przeciwciał, konieczna jest częsta ekspozycja na antygen.

Badania surowic uzyskanych od pacjentów podczas okresu ostrego i w trakcie zdrowienia z płonicy wskazują że miana przeciwciał przeciwko węglowodanom streptokoków grupy A były obecne na początku choroby, ale zwiększyły się dwukrotnie podczas fazy zdrowienia. Gdy badano surowice ARF po ostrym zakażeniu streptokokiem grupy A, miana przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A były niższe podczas rozpoczęcia gorączki płoniczej w porównaniu z surowicami od niepowikłanej płonicy, ale zwiększały się czterokrotnie w czasie ARF, wskazując, prawdopodobnie, na silną odpowiedź odpornościową na antygen w porównaniu z pacjentami z niepowikłaną gorączką płoniczą. Miana przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A były znacznie niższe w porównaniu z pacjentami z gorączkąpłoniczą którzy nie rozwinęli ARF. Badania zahamowania przy zastosowaniu węglowodanów grupy A i odmiany grupy A jasno pokazały, że większość tych przeciwciał jest skierowana przeciwko swoistym dla grupy A nie redukującym końcowym resztom N-acetyloglukozaminy na węglowodanie grupy a nie przeciwko szkieletowi ramnozowemu.

Na pytanie, czy te przeciwciała przeciwko węglowodanom ułatwiają opsonofagocytozę streptokoków grupy A uzyskano odpowiedź twierdzącą zaś stopień opsonizacji dobrze korelował z poziomem przeciwciał przeciwko węglowodanom. Miana ELIS A niższe niż 100000 były, ogólnie, nieefektywne podczas gdy większość surowic o mianach powyżej 200000 ułatwiała fagocytozę. Ważną obserwacjąbył fakt, że opsonofagocytoza nie była ograniczona do jednego serotypu streptokoków grupy A, ponieważ przynajmniej trzy inne szczepy o różnych serotypach ulegały fagocytozie. Rola przeciwciał aktywnych wobec N-acetyloglukozaminy w opsonizacji, została potwierdzona przez fakt, że adsorbcj a tych przeciwciał z surowicy ludzkiej całkowicie likwidowała aktywność bakteriobójczą surowic, oraz, że gdy eluowano te przeciwciała i zastosowano w teście bakteriobójczym, niszczenie było przywrócone.

Kilka obserwacji dotyczących kinetyki testu bakteriobójczego z surowicami ludzkimi, warte jest skomentowania. Po pierwsze, wyłącznie małe inokula streptokoków w teście bakteriobójczym były efektywne, podczas gdy większe inokula przewyższały zdolność ludzkiej surowicy do opsonizacji drobnoustrojów. Po drugie, aktywność bakteriobójcza działała przede wszystkim w surowicach nie rozcieńczonych w sposób podobny do obserwowanego przez Dr Lancefield w doświadczeniach na surowicach ludzkich i przeciwciałach swoistych dla rodzaju (15,25,26). W przeciwieństwie, surowice zwierząt, immunizowane danym białkiem swoistym dla rodzaju, były efektywne nawet w rozcieńczeniach 1:20 i więcej.

Przykład 2. Porównanie mian przeciwciał aktywnych wobec węglowodanów grupy A u normalnych dzieci

Pierwsze wysiłki były skierowane na określenie czy normalne dzieci wykształcają przeciwciała przeciwko węglowodanom streptokoków grupy A, oraz czy te miana zmieniają się z wiekiem osobnika oraz położeniem geograficznym, w którym żyje dany osobnik. Miana przeciwciał aktywnych wobec węglowodanów grupy A mierzono w surowicach uzyskanych od 5 i 10 letnich dzieci z Trinidadu (wysoka ekspozycja na streptokoki) i porównywano z dobranymi wiekowo dziećmi z Nowego Yorku (niska ekspozycja na streptokoki), stosując test ELISA opisany w rozdziale o materiałach i metodach. Figura 2 pokazuje, że w wieku 5 lat 94% dzieci z Trinidadu wykazuje miana przeciwciał niższe niż 1:10000 ze średńim mianem 1:158472. Te miana prze

181 037 ciwciał nie były istotnie różne w surowicach dzieci badanych w wieku 10 lat. W przeciwieństwie do tego, 5-letnie dzieci z Nowego Yorku wykazywały znacznie niższe miana o średniej 1:6100, które zwiększały się do 1:25500 w wieku 10 lat. Miana dzieci w rejonie Nowego Yorku, w obu grupach wiekowych były znacznie niższe niż odpowiadające im miana dzieci w Trynidadzie, jak wykazano stwierdzeniem, że 69% dzieci w Nowym Yorku posiada miana wyższe niż 1:10000.

W celu określenia czy odpowiedź odpornościowa na węglowodany grupy A występowała w klasie IgG czy IgM, wykonano następujące doświadczenie. Wybrane surowice, wykazujące wysokie miana przeciwciał w stosunku do węglowodanów grupy A, były odpowiednio rozcieńczane, tak, że każda surowica dawała odczyt gęstości optycznej równej 1,0 przy 405 nm w teście ELISA. Każdą surowicę badano następnie przy użyciu oczyszczonego przez powinowactwo koniugatu fosfatazy alkalicznej z wtórnym przeciwciałem przeciwko IgG albo IgM. Jak to widać w tabeli Π, większość wykrytych przeciwciał przeciwko węglowodanom streptokoków występowała w klasie IgG, a tylko nieznaczną część zaobserwowano w klasie IgM.

Tabela II

Oznaczenie metodą ELISA mian przeciwciał IgG i IgM wobec kompleksu CHO streptokoków z liposomami

Pacjent	Klasa immunoglobulin
IgG	IgM
1	1200000	6000
2	640000	2000
3	480000	2000
4	360000	2000
5	320000	1000

Każdą z surowic rozcieńczono odpowiednio tak, aby dawała odczyt gęstości optycznej równy 1,0 przy 405 nm w czytniku ELIDA V.

Przykład3. Częściowe określenie strukturalne przeciwciał aktywnych wobec grupy A

Zimmerman i in (23) wykazali uprzednio, że niektóre surowice ludzkie zawierająprzeciwciała aktywne wobec grupy węglowodanów izolowanych z odmiany streptokoków grupy A, a więc skierowanych przeciwko szkieletowi ramnozy w cząsteczce polisacharydu grupy A. W celu określenia ilości tych przeciwciał w porównaniu z przeciwciałami aktywnymi wobec końcowej determinanty grupowej N-acetyloglukozaminy, wykonano badania hamowania z użyciem surowic normalnych i oczyszczonych węglowodanów grupy A i odmiany grupy A. Podobnie jak poprzednio, kompleks węglowodanów grupy A z liposomami zastosowano w celu uczulenia płytki do mikromiareczkowania. 100 pl odpowiedniej surowicy zmieszano z węglowodanami w różnych stężeniach i inkubowano przez godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Mieszaninę zatężono przy 10000 obr./min. przez 5 minut i nadsącz poddano badaniu ELISA. Kontrola obejmowała surowicę zmieszanąz roztworem soli. Jak pokazano na figurze 3, większość przeciwciał aktywnych wobec węglowodanu grupy A w surowicach normalnych skierowana była przeciwko cząstce węglowodanu grupy A, tzn. determinancie N-acetyloglukozaminowej. Pewne zahamowanie obserwowano z odmianą węglowodanu A, ale ilość potrzebna do uzyskania tego samego stopnia zahamowania była 1000-5000 razy wyższa niż dla węglowodanu grupy A. Ponieważ odmiana węglowodanu grupy A jest zanieczyszczona w około 4% N-acetyloglukozaminą (w porównaniu z 36% w węglowodanie grupy A), zahamowanie można przypisać częściowo reakcji z pozostałąN-acetyloglukozaminą. Pokazuje to, że większość aktywności immunologicznej surowic była skierowana przeciwko reszcie N-acetyloglukozaminy, co obserwowano przez utratę aktywności przeciwciał przeciwko grupie A w teście ELISA po dodaniu oczyszczonej N-acetyloglukozaminy (Sigma). Może to być bezpośrednio porównane z brakiem zahamowania po dodaniu blisko spokrewnionego monocukru - N-acetylogalaktozaminy.

181 037

Przykład4. Porównanie mian przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A u pacjentów ARF wobec pacjentów z APSGN.

W celu określenia czy miana przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A różnią się u pacjentów z dobrze udokumentowanymi zmianami po zakażeniu streptokokami, próbki surowicy uzyskane od pacjentów z ostrą gorączką reumatyczną (ARF) porównano z surowicami uzyskanymi od pacjentów po przebytym ostrym streptokokowym kłębuszkowym zapaleniu nerek (APSGN). Wszystkie surowice uzyskano od dobrze udokumentowanych przypadków ARF i AGN, hospitalizowanych w Trinidadzie i pobrano je przed wdrożeniem leczenia w trakcie ostrej fazy choroby. Tabela III podsumowuje wyniki i jak widać, występowała większa aktywność w stosunku do węglowodanów grupy A w surowicach pacjentów z APSGN (<50%) w porównaniu z pacjentami z ARF na początku choroby. W porównaniu z normalnymi dziećmi w Trinidadzie, występowała istotna różnica w mianach pomiędzy tymi pacjentami i normalnymi dziećmi (patrz, fig· 2).

Tabela III

Średnie miana przeciwciał przeciwko węglowodanom w surowicach pacjentów z APSGN, ARF i niepowikłaną gorączką płoniczą

Grupa Great Lakę
Pacjenci	Liczba	Średnie miano na początku	Średnie miano po 4 tygodniach
Płonica	6	8838	18050
ARF	5	2045	7950
Grupa Trinidad
Pacjenci	Liczba	Średnie miano
ARF	19	202300
APSGN	18	299900

Przykład 5. Oznaczenie mian przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A u pacjentów z niepowikłanym zakażeniem streptokokiem w porównaniu z ARF

Kolekcję surowic z Great Lakę uzyskano od pacjentów, którzy przebyli gorączkę płoniczą w Great Lakes Naval Training Station w 1946 roku. Część z tych pacjentów rozwinęła klasyczną ARF. Wybrano surowice od tych pacjentów w poniższy sposób: 1) podczas ostrego rzutu gorączki płoniczej, 2) podczas zdrowienia z płonicy (4 tygodnie później) albo 3) podczas rozpoczynającej się ARF (3-4 tygodnie) po ostrym zakażeniu streptokokiem. Tabela III pokazuje, że w małej liczbie przypadków, aktywność wobec węglowodanów grupy A podwyższała się w trakcie zdrowienia, w porównaniu z początkiem choroby (określonym pojawieniem się gorączki płoniczej). To podwyższenie mian przeciwciał obserwowano zarówno w grupie niepowikłanej płonicy, jak i u pacjentów, którzy rozwinęli ARF w cztery tygodnie po gorączce płoniczej. Mimo iż liczba badanych przypadków była mała, interesujące jest, że miana przeciwciał przeciwko węglowodanom grupy A były niższe u pacjentów z ARF zarówno na początku płonicy jak i na początku gorączki reumatycznej w 4 tygodnie później, w porównaniu z niepowikłaną płonicą.

Przykład 6. Koniugaty polisacharydu grupy A z białkiem

A. Redukcja grup końcowych polisacharydu A przez NaBH₄.

Oczyszczony polisacharyd grupy A (GASP) (100 mg) rozpuszczono w 10 ml wody i ustalono pH roztworu na 10 przy użyciu 0,5 M NaOH. 100 mg stałego NaBH₄ dodano do roztworu i inkubowano mieszaninę reakcyjnąw temperaturze pokojowej przez dwie godziny, po czym zniszczono nadmiar borowodoru przez dodanie 1 M AcOH. Roztwór dializowano wobec wody i liofilizowano uzyskując 91 mg zredukowanego GASP.

181 037

Β. Wprowadzenie końcowej grupy aldehydowej do węglowodanu grupy A przez kontrolowane utlenianie nadjodanem

Zredukowany GASP (90 mg) rozpuszczono w 4,5 ml wody i połączono z 4,5 ml 50 mM NaIO₄. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej nadmiar nadjodanu zniszczono przez dodanie 1 ml glikolu etylenowego i dializowano roztwór wobec wody na zimno, po czym liofilizowano uzyskując 73 mg utlenionego GASP.

C. Koniugaty GASP-TT i GASP-HSA

Utleniony GASP związano z monomerycznym toksoidem tężcowym (TT) (SSI, Kopenhaga, Dania) albo albuminą surowicy ludzkiej (HSA) (Sigma), przez redukcyjne deaminowanie NaBH₃CN.

Utleniony GASP (40 mg) i monomeryczny TT (20 mg) albo HSA (20 mg) rozpuszczono w 0,2 M buforze fosforanowym pH 7,4 (0,7 ml). Po dodaniu NaBH₃CN (20 mg), mieszaninę inkubowano w 37°C przez cztery dni. Postęp koniugacji badano metodąHPLC małych próbek mieszaniny reakcyjnej na Superose-12 (Pharmacia). Koniugaty oczyszczano przez chromatografię na kolumnie Superdex G-200 (Pharmacia) stosując PBS jako eluent. Frakcje wypłukiwane z kolumny badano w refraktometrze różnicowym Waters R403 oraz spektroskopiąUV przy 280 nm. Frakcje zawierające koniugaty polisacharydu grupy A pulowano, dializowano i liofilizowano. Zawartość białka w koniugacie oznaczano metodąBradforda (Bradford M.M., 1976, Anal. Blochem. 72:248-254) stosując albuminę surowicy ludzkiej jako standard. Zawartość węglowodanu mierzono sposobem Dubois i in., (31) stosując oczyszczony GASP jako standard. Koniugat TT zawierał 39% (wag./wag.) węglowodanu i 61% (wag./wag.) białka. Przyjmując średni ciężar cząsteczkowy polisacharydu 10 kDa (jak określono przez HPLC na Superose-12 stosując dekstran jako standard ciężaru cząsteczkowego oraz przez pomiar rozproszenia lasera) i ciężar cząsteczkowy monomerycznego TT 150 kDa, stosunek molowy polisacharydu do TT w koniugacie GASP-TT równy był 9-10:1.

Przykład 7. Immunizację i testy immunologiczne

A. Procedury immunizacyjne

Grupę pięciu samic białego królika nowozelandzkiego (7-8 tygodni) szczepiono podskórnie w dwa miejsca na grzbiecie (trzykrotnie w trzytygodniowych odstępach) stosując 10 pg niesprzęgniętego polisacharydu grupy A albo koniugat z TT w objętości 0,5 ml. Szczepionki podawano nieadsorbowane albo adsorbowane na wodorotlenku glinu (Alhydrogel; Superfos, Dania) albo stearylotyrozynie (ST), w stężeniu 1,0 mg w wodorotlenku glinu albo ST/ml roztworu soli. Do szczepionek dodano Thimerosal w stężeniu końcowym 1/10000. Grupa pięciu królików otrzymała szczepionkę z koniugatu emulgowanego w kompletnym adiuwancie Freunda (Sigma Laboratories) podczas pierwszego wstrzyknięcia i w niekompletnym adiuwancie Freunda podczas kolejnych wstrzyknięć przypominających. Surowice pobierano od każdego zwierzęcia w dniu 0, 21, 42 i 52.

B. ELISA

Płytki do mikromiareczkowania (NUNC Polysorb ELISA plates) opłaszczano 100 ng koniugatu GASP-HSA rozpuszczonego w stężeniu 1 pg/ml w PBS i inkubowano w 37°C przez godzinę. Po opłaszczaniu, przepłukiwano je PBS zawierającym 0,05% Tween 20 (PBS-T) i blokowano 0,5% BSA w PBS przez godzinę w temperaturze pokojowej. Studzienki napełniano 100 μΐ kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń surowicy przeciwkróliczej w PBS-T i inkubowano płytki przez godzinę w temperaturze pokoj owej. Po płukaniu PBS-T, płytki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej z 100 μ1 kozich przeciwciał przeciwko króliczym IgG, znakowanych peroksydazą (H&L) (Kirkegaard & Perry Laboratories) i płukano pięciokrotnie PBS-T. Na koniec, do każdej ze studzienek dodawano 50 μ1 substratu peroksydazy TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) i inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym przerwano reakcję przez dodanie 50 μΐ 1 M H₃PO₄. Płytki odczytywano przy 405 nm w czytniku płytek Molecular Devices E_max, stosując 650 nm jako długość fali odniesienia (patrz tabela IV).

Aczkolwiek opisano tu wiele wykonań wynalazku, jest oczywiste, że schemat ten może być zmieniony dostarczając innych wykonań stosujących sposoby według wynalazku. Zatem,

181 037 zakres wynalazku jest określony przez dołączone zastrzeżenia patentowe, nie zaś przez konkretne wykonania przedstawione tu jak przykłady.

Tabela IV

Miana przeciwciał swoistych wobec polisacharydu GAS królików szczepionych polisacharydem GAS albo koniugatem polisacharydu GAS z toksoidem tężcowym w różnych postaciach recepturowych

Szczepionka	Miano przeciwciał mierzone ELISA w dniu:
	0	21	42	52
GASP (roztwór soli)	100	100	100	100
GASP-TT (roztwór soli)	100	100	4130 (900-12000)	7600 (2600-13500)
GASP-TT (Al (OH) 3)	100	10600 (4800-21000)	81800 (51000-129000)	141800 (76700-287500)
GASP-TT (ST)	100	6200 (2300-12700)	21100 (8300-31000)	59600 (21300-95500)
GASP-TT (CFA, IFA)	100	188000 (2200-428500)	1664000 (1000000-2299000)	1760000 (1100000-2370000)

* Średnia geometryczna miana (zakres) z wartością 100 oznaczającą miano < 100.

Wartości sąśrednimi powtórzonych oznaczeń. Króliki (grupy po 5 NZW) nastrzyknięto s.c. 100 ug polisacharydu (natywnego albo koniugowanego) w dniu 0, 21 i 42.

181 037

CYTOWANA LITERATURA

1. Powers, G.F. and P.L. Boisvert. (1944). Age as a factor in streptococcosis. J. Pediat. 25:481.

2. Paul, J.R. (1957). The Epidemiology of Pheumatic Fever. Anonymous, editor. American Heart Association, New York, N.Y. 19-21.

3. Zingher, A. (1924). The Dick test in normal persons and in acute and convalescent cases of scarlet fever. J. Amer Med. Ass. 83:432.

4. Goldschneider, L, E.C. Gotschlich, and M.S. Artenstein, (1969). Humań immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. J. Exp. Med. 129:1307-1326.

5. Fothergill, L.D. and J. Wright, (1933). Influenzal meningitis: The relation of age incidence to the bactericidal power of blood against the causal organism. J. Immunol. 24:273.

6. Schick, B. (1942). Brennenmerm's Practice of Pediatrics, Anonymous, editor, W.F. Prior Co. Inc., Hagarstown, MD.

7. Aycock, W.L. and S.D. Kramer, (1930). Immunity to poliomyelitis in normal individuals in urban and rural communities as indicated by neutralization test. J. Prev. Med. 4:189.

8. Stokes, J., Jr. (1959). Mumps. In Textbook of Pediatrics. W.E. Nelson, editor. W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA. 505.

9. Dochez, A.R., O.T. Avery, and R.C. Lancefield, (1919). Studies on thebiology of Streptococcus. I. Antigenic relationship between strains of streptococcus hemolyticus. J. Exp. Med. 30: 179-213.

10. Lancefield, R.C. (1933). A serological differentiation of human and other groups of haemolytic streptococci. J. Exp. Med. 57: 571-595.

11. Lancefield, R.C. (1962). Current knowledge of type specific M antigens of group A Streptococci. J. Immunol.Z9'. 307-313.

12. McCarty, M. (1956). Variation in the group specific carbohydrate of group A Streptococci. Π. Studies on the Chemical basis for serological specificity of the carbohydrate. J. Exp. Med. 104: 629-643.

12. McCarty, M. (1971). The streptococcal celi wali. In The Harvey Lectures, H. Harris, D.E. Koshland, M. McCarty, A.B. Pardee, G. Popjak, R.R. Porter, J.E. Seegmiller, andE.R. Stadtman, editors. Academic Press, New York. 73-96.

14. Lancefield, R.C. andE.W. Todd, (1928). Antigenic differences between matthemolytic streptococci and their glossy variants. J. Exp. Med. 48: 769-790.

15. Lancefield, R.C. (1959). Persistence of type specific antibodies in man following infection with group A Streptococci. J. Exp. Med. 110: 271-292.

16. Fischetti, V.A., (1989). Streptococcal M Protein: Molecular design andbiologicalbehavior. Clin. Microbiol. Rev. 2: 285-314.

17. Seastone, C.V. (1939). The virulence of group C streptococci of animal origin. J. Exp. Med. 70: 361-378.

181 037

18. Fillit, Η.Μ.,Μ. McCarty, andM.S. Blake. (1986). The induction of antibodies tohyaluronicacidby immunizationofrabbitswithencapsulatedstreptococci. J. Exp. med. 164: 762-776.

19. Faarber, P., P.J.A. Capel, G.P.M. Rigke, G. Vierminden, L.B.A. Van de Putte, and RA.P. Koene. (1984). Cross reactivity of acute DNA antibodies with proteoglycans. Clin. Exp. Immunol. 55: 502-508.

20. Rotta, J. and B. Bednar, (1969). Biological properties of celi wali mucopeptides of hemolytic streptococci. J. Exp. Med. 130: 31-47.

21. Schmidt, W.C. and D.J. Moore, (1965). The determinantion of antibody to group A Streptococcal polysaccharide in human sera by agglutination. J. Exp. Med. 121: 793-806.

22. Karakawa, W.W., C.K. Osterland, and R.M. Krause. (1965). Detection of group specific antibodies in human sera. J. Exp. Med. 122: 195-210.

23. Zimmerman, R.A., A.H. Auemheimer, and A. Taranta, (1971). Precipitating antibodies to group A polysaccharide in humans. J. Immunol. 107: 832-841.

24. Dudding, B.A.and E.M. Ayoub. (1968). Persistence of group A antibody in patients with rheumatic valvular disease. J. Exp. Med. 128: 1081-1092.

25. Lancefield, R.C.(1957). Differentation of group A Streptococci with a common R antigen into three serological types, with special reference to the bactericidal test. J. Exp. Med. 106: 525-544.

26. Lancefield, R.C. (1958). Occurrence of R antigen specific for group A type 3 Streptococci. J. Exp. Med. 108: 329-341.

27. Gotschlich, E.C., R. Austrian, B. Cvjetanovic, and J.B. Robbins, (1978). Prospects for the prevention of bacterial meningitis with polysaccharide vaccines. Buli. Wid Hlth. Org. 56: 509-518.

28. McCarty, M. (1958). Further studies on the Chemical basis for serological specificity of group A Streptococcal carbohydrate. J. Exp. Med. 108: 311-328.

29. Joiner, Κ.Α.,Κ.Α. Warren, E.J. Brown, J.L. Swanson, andM.M. Frank, (1983). Studies on the mechanism of bacterial resistance to complement mediated killing: IV C5b-9 forms high molecular wight complexes with bacterial outer membranę constituents on serum-resistant, but not on serum-sensitive Neisseria gonorrhoea. J. Immunol. 131: 1443-1451.

30. Dubois, Μ.,K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. RebersandF. Smith, (1956). Colorimetric Method For the Determination of Sugars and Related Substances, Anal. Chem. 28: 350-356.

31. Fillit, Howard M., Milan Blake, Christa MacDonald and Maclyn McCarty, (1988). Immunogenicity of Liposome Bound Hyaluronate in Mice, J. Exp. Med. 168: 971-982.

Claims (48)

1. Z a s t r,z e ż e n i a patentowe

   1. Kompozycja immunogenna, znamienna tym, że zawiera immunogenną ilość polisacharydu grupy A o wzorze (I) [->2) -a-L-Rhap- (1—>3) -a-L-Rhap- (l->] _n---R β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową, redukującą L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, oraz nośnik, przy czym kompozycja zapewnia ochronę ssaków przed zakażeniem bakteriami Streptococcus grupy A.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera polisacharyd grupy A, który ma ciężar cząsteczkowy około 10 000.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera nośnik wybrany z grupy składającej się z roztworu soli, roztworu Ringera i roztworu soli buforowanego fosforanem.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że dodatkowo zawiera adiuwant.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że adiuwant wybrany jest z grupy składającej się z wodorotlenku ghnu, fosforanu glinu, monofosforylolipidu A, QS21 i stearylotyrozyny.
6. 6. Immunogenny koniugat polisacharydu z białkiem, obejmujący polisacharyd grupy A o wzorze (I) [—>2) -α-L-Rhap- (l->3) -α-L-Rhap- (l->] _n---R t (I) β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową, redukującąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, a n oznacza liczbę od 3 do 30, połączony kowalencyjnie z białkiem, przy czym koniugat wywołuje u ssaków tworzenie przeciwciał opsoninowych, które sąbakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów.

   181 037
7. 7. Koniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że polisacharyd jest połączony z białkiem przez drugorzędowe wiązanie aminowe tworząc koniugat o wzorze (II) [—>2)-α-L-Rhap-(1—>3) -α-L-Rhap- (1^] „---R' -CH₂-NH-białko

   1 β-D-GlcpNAc (Π) w którym R' oznacza produkt redukcji i utleniania końcowego cukru redukującego, który nie jest przedstawiony w drugorzędowym wiązaniu aminowym -CH₂-NH-białko we wzorze Π.
8. 8. Koniugat według zastrz. 7, znamienny tym, że białko jest dowolnym natywnym lub rekombinowanym białkiem bakteryjnym.
9. 9. Koniugat według zastrz. 8, znamienny tym, że białko jest wybrane z grupy składającej się z toksoidu tężcowego, toksyny cholery, toksoidu błoniczego albo CRM,₉₇.
10. 10. Koniugat według zastrz. 9, znamienny tym, że białkiem jest toksoid tężcowy.
11. 11. Koniugat według zastrz. 10, znamienny tym, że polisacharyd ma ciężar cząsteczkowy około 10 000.
12. 12. Koniugat według zastrz. 6, znamienny tym, że białko koniugatu stanowi epitop limfocyta T i ma długość przynajmniej 10 aminokwasów.
13. 13. Immunogenny koniugat polisacharydu z liposomem, obejmujący polisacharyd grupy A o wzorze (I) [—>2) -α-L-Rhap- (l->3) -α-L-Rhap- (l->] _n R t

    β-D-GlcpNAc (O w którym R oznacza końcową, redukującą L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, połączony kowalencyjnie z liposomem.
14. 14. Koniugat według zastrz. 13, znamienny tym, że liposomy są skonstruowane z lipidów kationowych.
15. 15. Koniugat według zastrz. 14, znamienny tym, że liposomy obejmują fosfatydyloetanolaminę.
16. 16. Koniugat według zastrz. 15, znamienny tym, że polisacharyd ma ciężar cząsteczkowy około 10 000.
17. 17. Koniugat według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera jeszcze białko zamknięte w łiposomie.

    181 037
18. 18. Szczepionka do zapewnienia ochrony ssaków przed zakażeniem bakteriami Streptococcus grupy A, znamienna tym, że zawiera immunogennąilość polisacharydu grupy A o wzorze (I) [->2) -α-L-Rhap- (l->3) -α-L-Rhap- (l->] _n---R;

    β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową, redukuj ącąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, oraz nośnik.
19. 19. Szczepionka według zastrz. 18, znamienna tym, że składnik polisacharydowy szczepionki jest związany kowalencyjnie z białkiem.
20. 20. Szczepionka według zastrz. 19, znamienna tym, że polisacharyd jest związany z białkiem przez drugorzędowe wiązanie aminowe tworząc koniugat o wzorze (II) [—>2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] _n---R' -CH₂-NH-białko ¹ (Π) β-D-GlcpNAc w którym R' oznacza produkt redukcji i utleniania końcowego cukru redukującego, który nie jest przedstawiony w drugorzędowym wiązaniu aminowym -CH₂-NH-białko we wzorze II.
21. 21. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że białko jest dowolnym natywnym lub rekombinowanym białkiem bakteryjnym.
22. 22. Szczepionka według zastrz. 21, znamienna tym, że białko jest wybrane z grupy składającej się z toksoidu tężcowego, toksyny cholery, toksoidu błoniczego albo CRM₁₉₇.
23. 23. Szczepionka według zastrz. 22, znamienna tym, że białkiem jest toksoid tężcowy.
24. 24. Szczepionka według zastrz. 20, znamienna tym, że polisacharyd w koniugacie ma ciężar cząsteczkowy około 10 000.
25. 25. Szczepionka według zastrz. 18, znamienna tym, że polisacharyd jest związany kowalencyjnie z liposomami.
26. 26. Szczepionka według zastrz. 25, znamienna tym, że zawiera jeszcze natywne albo rekombinowane białko bakteryjne zamknięte w liposomach.
27. 27. Szczepionka według zastrz. 26, znamienna tym, że białko bakteryjne jest toksoidem tężcowym.
28. 28. Szczepionka według zastrz. 25, znamienna tym, że kompozycja polisacharyd-liposom ma ciężar cząsteczkowy około 10 000.
29. 29. Kompozycja odpornościowa do nadawania ssakom odporności biernej, znamienna tym, że zawiera przeciwciała opsoninowe, które są bakteriobójcze w obecności dopełniacza i fa

    181 037 gocytów, przy czym przeciwciała te są wytwarzane przez immunizację osobnika kompozycją immunogenną obejmującą immunogenną ilość polisacharydu grupy A o wzorze (I) [->2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] _n---R ΐ (I) β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową, redukuj ącą L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, oraz nośnik.
30. 30. Kompozycja według zastrz. 29, znamienna tym, że przeciwciała znajdują się w surowicy, frakcji gammaglobulin albo preparacie oczyszczonych przeciwciał.
31. 31. Kompozycja odpornościowa do nadawania ssakom odporności biernej, znamienna tym, że zawiera przeciwciała opsoninowe, które sąbakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów, przy czym przeciwciała te są wytwarzane przez immunizację osobnika immunogennym koniugatem polisacharydu grupy A o wzorze (I) [—>2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>]_n---R (I) β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową, redukuj ącą L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od około 3 do około 30, połączonego kowalencyjnie z białkiem.
32. 32. Kompozycja odpornościowa do nadawania ssakom odporności biernej, znamienna tym, że zawiera przeciwciała opsoninowe, które sąbakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów, przy czym przeciwciała te są wytwarzane przez immunizację osobnika immunogenną szczepionką, która zawiera immunogenną ilość polisacharydu grupy A o wzorze (I) [—>2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] _n---R;

    ^T (I) β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową, redukującą L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, oraz nośnik.

    181 037
33. 33. Kompozycja odpornościowa do nadawania ssakom odporności biernej, znamienna tym, że zawiera przeciwciała opsoninowe, które sąbakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów, przy czym przeciwciała te są wytwarzane przez immunizację osobnika immunogennym koniugatem polisacharyd-liposom, w którym polisacharyd grupy A o wzorze (I) [—>2) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (1—>] _n R;

    1 β-D-GlcpNAc (I) w którym R oznacza końcową, redukuj ącąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, połączony jest kowalencyjnie z liposomem.
34. 34. Kompozycja odpornościowa do nadawania ssakom odporności biernej przeciwko bakteriom Streptococcus z grupy A, znamienna tym, że zawiera przeciwciała opsoninowe przeciwko bakteriom Streptococcus z grupy A, które sąbakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów i które a) są pozyskiwane od ssaków i b) wiążą się z polisacharydem bakterii Streptococcus grupy A o wzorze (I):

    [->2) -α-L-Rhap- (l-»3) -a-L-Rhap- (l->] _n---R ^f (I) β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową, redukującąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30.
35. 35. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że przeciwciała są wytwarzane przez immunizację osobnika kompozycjąimmunogennąobejmującąimmunogennąilość polisacharydu grupy A o wzorze (I) określonym w zastrz. 34, oraz nośnik.
36. 36. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że zawiera przeciwciała wytwarzane przez immunizację osobnika immunogennym koniugatem polisacharydu grupy A o wzorze (I) określonego w zastrz. 34 połączonego kowalencyjnie z białkiem.
37. 37. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że zawiera przeciwciała wytwarzane przez immunizację osobnika immunogennym koniugatem polisacharydu grupy A o wzorze (I) określonego w zastrz. 34 połączonego kowalencyjnie z liposomem.
38. 38. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że przeciwciała uzyskuje się z surowicy osobnika.
39. 39. Kompozycja według zastrz. 38, znamienna tym, że przeciwciała izoluje się z surowicy ludzkiej o mianie powyżej około 40 000.
40. 40. Kompozycja według zastrz. 39, znamienna tym, że przeciwciała izoluje się z surowicy ludzkiej o mianie powyżej około 200 000.

    181 037
41. 41. Kompozycja farmaceutyczna do ochrony ssaków, znamienna tym, że zawiera kompozycję odpornościową, która zawiera przeciwciała opsoninowe przeciwko bakteriom Streptococcus z grupy A, które sąbakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów i które a) sąpozyskane od ssaków i b) wiążą się z polisacharydem bakterii Streptococcus grupy A o wzorze (I):

    [->2 ) -α-L-Rhap- (1—>3) -a-L-Rhap- (1—>] _n---R t

    β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową redukującą L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30, i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
42. 42. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia i zapobiegania zakażeniu bakteriami Streptococcus grupy A, znamienny tym, że uzyskuje się od ssaków przeciwciała, które wywołują odpowiedź opsoninowąi sąbakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów i wiążąpolisacharyd bakterii Streptococcus grupy A o wzorze (I):

    [->2 ) -α-L-Rhap- (1—>3) -α-L-Rhap- (l->] _n---R _t (I) β-D-GlcpNAc w którym R oznacza końcową, redukującą L-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę od 3 do 30 i miesza się je z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
43. 43. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że przeciwciała uzyskuje się od immunizowanego osobnika.
44. 44. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że stosuje się przeciwciała, które znajdują się w surowicy, frakcji gammaglobulin albo preparacie oczyszczonych przeciwciał.
45. 45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciała z surowicy ludzkiej o mianie powyżej około 40 000.
46. 46. Sposób według zastrz. 45, znamienny tym, że uzyskuje się przeciwciała z surowicy ludzkiej o mianie powyżej około 200 000.
47. 47. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakażenia bakteriami Streptococcus grupy A, znamienny tym, że osobnika poddaje się immunizacji polisacharydem grupy A, o wzorze (I) [->2) -α-L-Rhap- (l->3) -α-L-Rhap- (1—>] _n---R ^T (I) β-D-GlcpNAc

    181 037 w którym R oznacza końcową redukuj ącąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, a n oznacza liczbę od 3 do 30, połączonym kowalencyjnie z białkiem, uzyskuje się od tego osobnika przeciwciała, które wiążąstreptokokowy polisacharyd grupy A o wzorze przedstawionym powyżej, sąopsoninowe i bakteriobójcze w obecności dopełniacza i fagocytów i miesza się te przeciwciała z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
48. 48. Sposób wytwarzania koniugatu polisacharydu grupy A o wzorze I [->2) -α-L-Rhap- (1—>3) -a-L-Rhap- (1—>] _n---R;

    T β-D-GlcpNAc (I) w którym R oznacza końcową redukującąL-ramnozę albo D-GlcpNAc, n oznacza liczbę 3 do 30, połączonego kowalencyjnie z liposomem zawierającym fosfatydyloetanolaminę, znamienny tym, że obejmuje:

    a) wytwarzanie liposomu z fosfatydyloetanolaminy;

    b) aktywację polisacharydu grupy A przez redukcję końcowego cukru i utlenianie zredukowanego cukru do końcowej grupy aldehydowej;

    c) łączenie aktywowanego polisacharydu grupy A i liposomów i kowalencyjne wiązanie polisacharydu grupy A z liposomem przez redukujące aminowanie z wytworzeniem koniugatu polisacharydu grupy A i liposomu; i

    d) odzyskiwanie koniugatu polisacharydu grupy A z liposomami.