CZ2002721A3 - Směsi oligosacharidů, způsob jejich syntézy a syntézy disacharidu meziproduktu a derivátů disacharidu, imunogen, vakcina, makromolekuly a pouľití disacharidů a makromolekul - Google Patents

Description

'FY2&V2 - ?<-’/ 'FY2&V2 - ?<-’/ ·*·· • · : .··..··; X * · * ······ · t · · · * ·· · · · · 1

Směsi oligosacharídů, způsob jejich syntézy a syntézy disacharidu meziproduktu a derivátů disachaňdu, imunogen, vakcina, makromolekuly a použití disacharidů a makromolekul.

Oblast techniky Předkládaný vynález se týká lékařského oboru, konkrétně chemické synté2y oligosacharido-vých směsí, odvozených od sloučeniny ribosa-ribitol-fosfát, které se používají jako aktivní základ pro prevenci infekcí, vyvolaných bakterií Haemophilus influenzae, typu b (Hib), jakož i vakcín, obsahujících zmíněné oligosacharidové směsi.

Dosavadní stav techniky

Haemophilus influenzae typ b, je vážným celosvětovým problémem lidského zdraví. Bakterie způsobuje, hlavně u dětí do 5 let, meningitidu, zápal plic, epiglotitidu a jiná onemocnění dýchacího ústrojí. U více než 30 % pacientů, kteří tuto nemoc přežili, byly v mnoha zemích pozorovány následky onemocnění, od sluchových problému až po vážnou mentální retardaci. Poslední odhady Světové zdravotnické organizace ukazují, že více než 550 000 dětí na světě zemře ročně na choroby, způsobené bakterií Haemophilus influenzae typu b. Přečištěný kapsulámí polysacharid bakterie Haemophilus influenzae je schopný vyvolat ochrannou imunitu u dospělých, avšak u dětí je taková imunitní odezva velmi slabá a prakticky není žádná u dětí do 2 let věku.

Kapsulámí polysacharid má následující; obecnou strukturu:

Bylo prokázáno, že hlavním problémem je povaha antigenu samotného, protože je to polysacharid, T-nezávislý antigen, neschopný stimulovat ještě nevyvinutý dětský imunitní systém. Prokázalo se, že řešení tohoto problému se může dosáhnout kovalentním spojováním (konju- • · 20váním) polvsacharidu na protein známý jako nosič. Takto získaný produkt, obecně známy jako konjugovaná vakcína, indukuje hladinu ochranných protilátek od dvou měsíců veku.

Chu et al.. (Inlection imm unity 1983, 40. 245*256) získal konjugát z přírodního kapsulárního polysadtaridu a toxoid tetanu po aktivaci bromkvanem.

Goidoii (L"S 4 496 538) aktivoval přírodní polysacharíd bromkvanem a pak ho konjugovaí na záškrtový toxoid dihidrazidem kyseliny adipové.

Hilman et.al. (US 4 459 286) konjugovaí porodní polysacharíd 6-aminokapronovou kyselinou na meningokokální protein s vnější membránou po jejich počáteční aktivaci.

Ve všech předcházejících konjugačnich procesech se kovalentní vazba nachází mezi několika skupinami kapsulárního polvsacharidu a proteinovým nosičem.

Schopnost indukovat ochrannou imunitu u dětí závisí na struktuře konjugátu. Když je konjugace provedena u přírodního polvsacharidu, skupiny účastnící se vazby jsou náhodně distribuovány na polvsacharidovém řetězci, vytvářející velmi komplexně charakter každé várky. Všechny tyto vakeíny se dají velmi těžko analyzovat íýzíkálně-chemickými metodami; proto je obecnou praxí hodnotit každou várku studiemi imunogenicity u experimentálních zvířat. Avšak chovám' konjugátu u dětí a u experimentálních zvířat je různé.

Podle kriterií stabilní kvality světové zdravotnické organizace (WHO) (M.R. Holliday, C.Jones, Biologicals, 1999, 27, 51-53) by měla být kontrola konjugovaných vakcín založena na fvzikálnč-chemických metodách , prokazujících podobnost jedné várky od druhé. K usnadnění tohoto úkolu by měly být konjugované vakeíny stále více definovány na molekulární úrovni. Jedním alternativním řešením tohoto problému je syntéza fragmentů kapsulárního polvsacharidu. Tento proces pro zkonstruování aníigenu Haemophilus ínfluenzae typu h syntézou, má dva hlavní kroky: syntézu disacharidu meziproduktu, a jeho oligomeraci. Bylo vyvinuto několik přístupů pro tuto syntézu.

Beuvery et al. (evropská patentová přihláška EPO 0 276 516: US 5 034 519: ietrahedron Lett. 28. 1553. 1987) a Hoogerhout et al. (J. Carbohvdr. Chem, 1, 1988. 399-416) získal syntézou fragment kapsulárního polvsacharidu. v nároku uvádí obsah. 3 až 20 opakujících se jednotek. K dosaženi tohoto cíle byl nejprve připraven disacharid meziprodukt 2 a pak syntézou ’’ pevné fázi nebo v roztoku oligomer, obsahující 6 opakujících se jednotek (Elie et al,. Rec. nav. Chim. Pays*Bas í()8, 1989, 219). Oligomerv byly konjugovány na proteiny nebo pepti-d\ vazebním členem. Tnmer konjugát byl imunogenní u myší jako komerčně dostupná v akci* na. připravená z kapsulárního polvsacharidu. v přednostním provedení, ilustrujícím syntetickou cestu , byla použita následující -strategie: 3 * · ♦ * • · 1- syntéza ribitolu, 2 - kopulace na ribosu, 3 - selektivní zavedení substituentů na jednotku ribosy a 4 - zavedení fosforové aktivující skupiny. Touto cestou byl získán klíčový derivát disacharidu 2 pouze v 15 reakčních krocích. 3 * · ♦ * • ·

P—o OBOM A H3C-CH HC—ch3

TBDMSiO OBn OBn —OBn —ODMTr CH3 ch3

Celkový výtěžek je 7 % (Hermes et al., Reci. Trav. Chim. Pays-Bas 1987, 106, 498-504). Kromě toho má tento proces dvě hlavní nevýhody: zahrnuje 11 chromatografických kroků a chránící skupiny klíčového meziproduktu nejsou pro oligomeraci ideální. Při oligomeraci, nebo při druhém kroku syntézy, tato metoda používá syntézu v roztoku při aktivaci fosfot-riesterem, umožňující výtěžky mezi! 70 až 90 %ha jeden cyklus, vztaženo na disachaxid. Hlavní nevýhodou takového postupu je nemožnost přípravy fragmentů, obsahujících více než 4 opakující se jednotky, protože výtěžky dramaticky klesají. Disacharid meziprodukt 2 má tři odlišné chránící skupiny a jejich odstranění z finálního produktu je velmi obtížné. Proto tento disacharid není pro oligomeraci v pevné fázi výhodný. Vzhledem k tomu byla publikována oznámena syntéza hexameru. Při imunologických zkouškách (Peters CCAM, et al.jlnfect. Immunity 1991, 59, 3504-10) byla pouze oznámena konjugace trimeru na toxoid tetanu a jeho imunogenicita na myších a opicích. G. Just, J. Upeslacis (evropská patentová přihláška EP 0 320 942, L. Chán; G. Just, Tetrahed-ron, 46, 1990, 151-162) syntetizovali také fragment kapsulámího polysacharidu přes disacharid meziprodukt syntézou v roztoku. Se záměrem připravit optimální meziprodukt pro syntézu antigenu, se zvolila jiná cesta: 1- syntéza ribitolu, 2 - syntézu ribosové jednotky s dostatečnými chránícími skupinami, 3 - spojení ribosy a ribitolu a 4 - zavedením aktivní fosforové funkce.

3 Tímto postupem byl připraven meziprodukt 3 jako fosforamidit. ukazující na lepší výběr chránících skupin pro oligomeraci. K dosažení tohoto cíle byl nutný větší počet kroku. Klíčeny deriv al byl získán v 19 krocích, za použití 8 chromatografických čistících kroků. Disacharid 3 byl podroben oligomeraci v roztoku, ta poskytla fragmenty kapsulámiho poiy-sacharidu, obsahujícího tři opakující se jednotky s 'výtěžky mezi 70 až 90 % na jeden cyklus, vztaženo na disacharid,

Kandil et al., (Syn,Letí,, 1992, 555-7), Chon et al. (PCI patentová přihláška WO 93 15 205 y US 5 679 352), syntetizovali fragment kapsulámiho póly sacharidu za použití stejného disacharidu meziproduktu 3. a postupu v pevné fázi. a za podpory monomethoxypolyethyiengly-kolu získali fragmenty, obsahující až šest opakujících se jednotek, přičemž výtěžek byl 95 % na jeden cyklus.

Krivan et al. (PC I patentová přihláška WO 94 00 149) a Nilsson et al. (J. Carbohydr. Chem, 10. 1991, 1-22) získali fragment s deseti opakujícími se jednotkami s podobným disacharidem meziproduktem a postupem v pevné fázi. Tento fragment byl konjugován vazebním členem na I lib adhesin. Meziprodukt fosfonát byl získán v 21 krocích, s celkovým výtěžkem 5 %. Bylo třeba také nejméně 7 chromatografických kroků. Proces oligomerace se uskutečnil za použití H - fosfonátů, postupem v pevné fázi a užitím Merrifieldovy aminované pryskyřice. Získal se antigen s inkorporací 97 až 99 °o na cyklus.

Chin Machado et al. (J. Carbohydr. Chem.. 13, 1994. 465-474) a kubánský patent 22 424 oznámili účinný postup syntézy' vhodného chránícího derivátu ribosv z glukosy7. Užitím tohoto derivátu připravili klíčový disacharid ve 20 reakcních krocích.

Jedním z aspektů, kteiý může znesnadnit aplikaci syntézy pro popravu Hib fragmentů a jejich užití ve vakcínách, je syntéza disacharidu meziproduktu. Všechny metody shora zmíněné odrážejí stav techniky moderní uhlovodíkové chemie, avšak mají dvě hlavní vázne technické nevýhody. Je to použiti několika chromatografických kroků během sy ntézy, což je při sy ntéze v průmyslovém měřítku nepraktické, a počet koků syntézy, kterých je obvykle velmi mnoho. Hlavním problémem syntézy disacharidu v méně reakcních krocích je zavedení beozvlové skupiny do ribosové jednotky.

Proces oligomerace disacharidu meziproduktu se provádí buď v roztoku, s tou nevýhodou, že maximálně dosažitelná velikost je omezena na 3 až 4 opakující se jednotky. Může se však také provádět v pevné fázi. Oligomerace v pevné fázi umožňuje přípravu oligosacharidu v rozmezí 6 až 10 opakujících se jednotek s vysokým výtěžkem na cyklus. Jsou s tím však spojeny dva vážné problémy, a to. že reálný výtěžek je pouze 10 až 15 °e, a k dosažení vysoké 5 • · · · inkoiporace disacharidu meziproduktu na cyklus, je obvykle požadován vysoký přebytek disacharidu, mezi 3 až 10 molámími ekvivalenty. Přebytek disacharidu se během procesu ztrácí. Jiným problémem je, že se obvykle požadují dva různé deriváty, jeden pro kuplování na pevný nosič a druhý pro prodloužení řetězce.

Syntéza jednotlivého čistého fragmentu oligosacharidu, postrádajícího jakýkoli rozdíl nejen ve struktuře, ale také v délce řetězce, je obecně vyskytuje ve všech předchozích zprávách o syntéze antigenů Hib, a současně je jedním z jejich hlavních cílů. Všechny tyto zprávy se zakládají na předpokladu, že antigen tvořený jednou molekulou, je nezbytný k dosažení proti Hib konjugovaných vakem se stabilnější kvalitou, která se snadněji kontroluje.

Byly vyvinuty nové metody pro přípravu fragmentů oligosacharidu fragmentací přírodních póly sacharidů a také metody aktivace oligosacharidové směsi jedné z jejich koncových poloh. V patentech US 4 808 700, US 4 761 283, jakož i v Glycoconjugate J., 1989, 6, 489-498 (R.C.Seid, et al.) se přírodní polysacharid oxiduje perjodnanem a získané fragmenty se čistí. U směsi fragmentů oligosacharidu se aktivují jejich dvě koncové polohy, jak ukazuje následující schéma. Tyto oligosacharidy byly konjugovány reduktivní animační reakcí na CRM 197. Jak je ze schématu patrné, obě konjugační polohy jsou různé. Po provedení konjugace vznikly nejméně dva druhy oligosacharidu s různými strukturami. Na druhé straně procento oligosacharidu neurčuje dobře výsledky z napojení stejného oligosacharidu na dvě různé polohy stejného proteinu nebo na dvě různé molekuly proteinu. Všechny tyto jevy způsobují heterogenitu a obtížně se kontrolují. Μη Λ n

Naproti tomu se v patentu US 5 153 312 a v časopise Vaccine 1999, 17, 1251-63 (P.Constantino et al.). uvádí hydrolýza přírodního polysacharidu kyselinou octovou a čištění výsledné směsi fragmentů oligosacharidu. Získaný produkt se aktivuje sledem reakcí, kterými se zavádí vazební člen reduktivní aminací ethylendiaminem při vysokém pH a teplotě, která ovlivňuje integritu oligosacharidové směsi. Na druhé straně je část antigenů pravděpodobně inaktivována následkem redukce jejich poloacetalové karbonylové skupiny, jak ukazuje ná- 6 Μ·· sledující schéma. Dále byl amin oligosacharidu selektivně substituován aktivním esterem kyseliny adipové, jednou z jejich koncových esterových funkcí. Druhá esterová funkce zůstává aktivní pro napojení na protein.

NH2CH2CH2NH2 Py/Boran pH 9-10

vedlejší produkt

Pro praktickou imunizaci velkého množství dětí byly použity dvě vakcíny, připravené z produktů fragmentace přírodního polysacharidu. Tak se prokázalo, že ve vyrobené konjugo-vané vakcíně proti Hib, je možné použít oligosacharid, ne v jedné velikosti, ale spíše v určitém rozpětí velikostí, a současně je možno jej použít k řízení přiměřeně reprodukovatelnosti a kvality výrobku. I když konjugát, získaný touto cestou, je lépe definován než konjugát získaný přímou aktivací polysacharidu, je prakticky nemožné provést fragmentaci přírodního polysacharidu s následným zavedením aktivní funkční skupiny, a získání takové úrovně molekulární definice a čistoty antigenu, jaká může být dosažena chemickou syntézou. Žádné zřejmé výhody v kontrole konjugováných vakcín s použitím buď oligosacharidu s definovanou velikostí, nebo směsi oligosacharidu podle velikostí, ale homogenní ve zbytku jejich struktury, neexistují. To prokázaly pokročilé analytické metody současného stavu techniky, která umožnila velmi snadné stanovení složení oligosacharidové směsi Hib (P.Constantino, et al., Vaccine 1999, 17, 1251-1263 a D. Prioeti, et al., European Carbohyd-rate Symposium, Galway, July 1999, PB014).

Naproti tomu, nejsou žádné rozdíly v imunologickém chovám vakcín, vytvořených jak směsí různých velikostí Hib oligosacharidu, tak jedinou velikostí oligosacharidu, když fragmenty jsou větší než 3 opakující se jednotky (S.Pillai, et al., Infeetion and Immunity, 1991, 59, 4371-6; A.A. Kandil, et al., Glycoconjugate X, 1997, 14, 13-7 and Peters CCAM, et al., Infect. Im-munity 1991, 59, 3504-10). Výběr jediné optimální velikosti ztěžují z různých hledisek další okolnosti. Oligosacharidy o 4 až 6 opakujících se jednotkách se syntetizují mnohem snadněji a jejich velikost je obvykle dostatečná k zavedeni přiměřené imunitní odezvy. Avšak množství nosného proteinu, nezbytného pro vakcínu. je velmi vysoké a stabilita oligosacharidu ve vakcíně je slabá, vlivem toho, že degradační proces, způsobený hydrolýzou fosfodiesteru, rychle podněcuje vznik velmi krátkého fragmentu, kuplovaného na protein s méně než 4 opakujícími se jednotkami a proto je inaktivován. Fragmenty, o velikosti mezi 8 až 20 opakujících se jednotek, jsou v principu stabilnější, protože po degradaci na polovinu jejich velikosti, zbývající fragment, napojený na nosný protein bude větší než 4 opakující se jednotky. Množství nosného proteinu, nutného pro dávky vakcíny, je pak také menší.

Avšak podle dosavadního stavu techniky v oblasti oligosacharidu Hib, syntéza fragmentů velikostí v rozsahu mezi 10 až 20 se nedá provádět metodami v roztoku, a vyžaduje metody, uskutečňované v pevné fázi. V předchozích zmíněných příkladech však oligosacharidy této velikosti zcela chybí. Jinou nevýhodou je T- závislost imunitní odezvy, což je velmi důležitý aspekt pro získání dobré imunitní odezvy u dětí. T~ závislost polvsacharidu klesá se vzrůstem velikosti (O.Femández. E. Sverremark. Cell Immunol 1994, 153, 67-78). Závěrem lze konstatovat, že kterýkoliv způsob syntézy Hib antigenů. aby mohl soutěžit s jiný mi způsoby, musí snižovat počet kroků ke klíčovému disacharidu. snižovat počet chro-matograíických kroků, a zvláště významně zvyšovat výtěžek oligomeračniho procesu. Olígosacharidové směsi, získané hydrolýzou přírodních polysacharidů, obsahují frakce obou velikostních intervalů, které přebírají výhody obou intervalů a snižují jejich nevýhody. Kdyby sc podobné směsi daly získat synteticky, měly by výhody obou velikostních intervalů. Směs připravená synteticky, bude lépe definovaná a čistší, a bude obsahovat vazební člen v přesné proporci a poloze.

Podstata vynálezu

Tento vynález se konkrétně týká chemické syntézy oligosacharidových směsí, odvozených od nbosa-ribitol-fosfátu, které jsou použity jako aktivní základ ve vakcínách pro prevencí infekcí. vyvolaných bakterií Haemophiius influenzae, typ b (Hib), jakož i vakcín, obsahujících zmíněné olígosacharidové směsi.

Olígosacharidové směsi, získané chemickou syntézou, dle tohoto vynálezu, které obsahují opakující so jednotky obecných vzorců říbsfát-ribitoJ-ribo$a)n nebo (ribosa-ribitol-fbsfáí)n , složené nejméně z 5 sloučenin struktury Λ nebo B, která reprezentuji opakující se jednotku 8 * · kapsulámího polysacharidu Haemophilus influenzae, typ b, a liší se od sebe pouze hodnotou n, která se pohybuje mezi 4 a 25(n > 4 y < 25), a kde Ri = vazební člen jestliže R2 = H, nebo R2 = vazební člen jestliže Rj = H. 8 * ·

o.

—OH —OH —OH σ OH B

ri

Vynález se také týká imunogenů , obsahujících takové oligosacharidové směsi, vakcín, obsahujících zmíněné imunogeny, a metod přípravy těchto oligosacharidů jako směsí. Kromě toho, vynález zahrnuje použití vakcín, samotných nebo kombinovaných s jinými vakcínami, pro prevenci infekcí, vyvolaných bakterií Haemophilus influenzae typ b.

Pomocí tohoto vynálezu je možné chemickou syntézou získat normální směs oligosacharidů dobře definované velikosti, a to efektivnější cestou. Taková směs má vyšší čistotu a získává se jednoduchým technickým procesem. Také se zjistilo, že konjugované vakcíny, připravené ze směsi podle vynálezu, jsou vzhledem k jejich výrobě kvalitnější a snáze se kontrolují.

Jiným předmětem tohoto vynálezu je syntetická metoda získám shora zmíněné oligosacharidové směsi, která je charakterizována jednostupňovým procesem. Ten se skládá zřízené po-lykondenzační reakce, probíhající mezi klíčovým disacharidovým meziproduktem, vazebním členem a promotorem. Reakce je charakterizována též faktem, že průměrná velikost antigenu se dá řídit podílem každé zúčastněné složky, pořadím jejich adice a dobou reakce.

Jiným předmětem tohoto vynálezu je použití shora zmíněných imunogenů, při přípravě vakcín proti nemocím, vyvolaných bakterií Haemophilus influenzae typ b, s použitím nebo bez použití pomocných látek a jiných aditiv.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je použití směsí, dříve popsaných při přípravě kombinovaných vakcín s jinými vakcínami, konjugovanými nebo nekonjugovanýmí, jako je např. vak-cína proti hepatitidě B, DPT, proti meningitidě A, B, C, proti zápalu plic 1, 5, 6B, 6A, 14, 19F, 19A, 23F, a vakeíně proti dětské obrně.

Jiný předmět tohoto vynálezu představuje optimalizaci procesu syntézy klíčového disachari-du, požadovaného pro syntézu Hib oligosacharidů. Tato optimalizace se zakládá na objevu nové selektivní benzylační reakce, která, aplikována na disacharid 4, umožňuje jeho transfor- mači na disacharid 5, se zaváděním benzylových chránících skupin do ribosové jednotky v jednom kroku, což dělá celý proces podstatně kratší a jednodušší.

—OBn —OBn —OBn —OAII 4R = H 5 R = Bn Předmětem tohoto vynálezu je také optimální postup syntézy meziproduktu 4, kteiý umožňuje jeho přípravu s vysokou čistotou, a to pouze vil reakčních krocích, a bez použití chromato-grafických postupů.

Jiným předmětem vynálezu je užití dříve popsaných oligosacharidů při detekci a kvantifikaci protilátek proti Hib, prostřednictvím jejich konjugátů s imunologicky inertními látkami, jako je polyakrylamid, polystyren a latex.

Novost tohoto vynálezu tkví ve složení získané oligosacharidové směsi, která odpovídá opakujícím se jednotkám bakterie Haemophilus influenzae typu b, kapsulámího polysacharidu s vazebním členem pro konjugaci pouze v jedné z jejich koncových poloh, a to v poloze předem určené syntézou. Odpovídá to stejné pravidelné a homogenní struktuře. Oligosacharidová směs obsahuje fragmenty dvou různých velikostních intervalů, hlavně mezi 4 až 8 a 8 až 20, získávající tak výhody od každého intervalu a omezující nevýhody, které by každá skupina měla samostatně.

Kromě toho, novost tohoto vynálezu tkví v procesu samotném, pro přípravu takové směsi chemickou syntézou, která umožňuje zhotovení produktu s vysokou reprodukovatelností a účinností. Tento vynález také prokazuje, že zavedení benzylových chránících skupin u ribosové jednotky v jednom kroku umožňuje pouze jediná reakce, čímž se zvyšuje účinnost přípravy klíčového disacharidu pro syntézu takových oligosacharidů.

Syntéza disacharidového meziproduktu začíná přípravou derivátu 5-0-allyl-2,3,4-tri-0--benzyl-D-ribitol 14, devíti chemickými reakcemi, jak ukazuje následující schéma. Vosk D--ribosy se transformuje na isopropylidenový derivát 6 postupem, dříve popsaném v literatuře (Leonart et al, J.HetChem., 1966, 3, 485). Poloha 5 se allyluje allylbromidem za podmínek fázové přeměny, a následuje hydrolýza isopropylidenové skupiny kyselinou sírovou v metha-nolu a získá se tak derivát 8, kteiý se podrobí benzylaci benzylchloridem a hydroxidem sodným v dimethylformamidu.

• · 10

Methylová skupina se hydrolyzuje směsí kyseliny octové a chlorovodíkové, a pak se redukuje borhydridem sodným. Derivát 5-0-allyl-2,3-di-0-benzyl-D-Ribitol 11 se absorbuje na silika-gel a selektivně extrahuje perkolačním procesem , nejprve eyklohexanem a pak chloroformem. Tento postup dovoluje čištění do vysokého stupně, bez použití chromatografických metod. Dále se derivát 11 trityluje v pyridinu, benzyluje benzylchloridem a hydridem sodným v dimethylformamidu a nakonec hydrolyzuje kyselinou octovou, čímž se získá derivát ribitol, kteiý se čistí destilací. Ribitol 14 se podrobuje ribosylaci peracetátem ribofuranosy 15, jak ukazuje následující schéma. Po deacetylaci, následované novou aplikací absorpčně-desorpčních metod, se získá triol 4 ve vysokém stupni, bez jakýchkoliv chromatografických kroků. ,

5 4

Pak se aplikuje objev dibenzylační reakce, dle tohoto vynálezu, a vznikne triol 4. Tato reakce umožňuje získání derivátu 5 po přečištění sloupcovou chromatografií. Allylová skupina meziproduktu 5 se isomerizuje na propenyl, a pak se zavede fosfonát do tří volných poloh ribosové jednotky. Odstranění propenylové skupiny poskytne klíčový meziprodukt 19. Podobným způsobem se připraví klíčový disacharid 23 acetylací hydroxylové funkční skupiny v poloze 3 u derivátu 17, poté následuje hydrolýza propenylu, zavedením fosfonátu do polohy 5 a deace-lylace produktu. Tento klíčový disacharid 23 má fosfonát v poloze 5 a volnou hydroxylovou funkční skupinu v poloze 3.

22 12 ···· • * • * ·

Struktura vytvořených produktů byla ve všech případech potvrzena nukleární magnetickou rezonancí *Η y 13C a H-H y H-X korelačními experimenty. Čistota byla kontrolována chro-matografií na tenké vrstvě nebo HPLC.

Z derivátů 18 nebo 22, se získají deriváty' 24 a 25, používané také jako akceptoiy v polykondenzační reakcí, jak bude dále ukázáno.

Oligomerační reakce byla studována za různých podmínek, vždy za přítomnosti pouze tří složek: klíčového disacharidu (19 nebo jeho analogu 23), promotoru reakce, kterým může být pivaloylchlorid, adamantan-l-karbonylchlorid nebo jiný stéricky bráněný chlorid kyseliny, a třetí složky, která reakci tlumí a současně zavádí vazební Člen. Tato složka obsahuje aktivní funkční skupinu nebo její prekurzor v koncové poloze, jako např. 24, 25 nebo 26.

Jako vazební člen, kterým v případech 24, 25 nebo 26 je 5-azido-3-oxapentanol, mohou být použity jiné sloučeniny obecného vzorce Ri-Y-OH, kde Y je řetězec vazebního členu, kterým může být řetězec alifatický. Alifatický řetězec může zahrnovat aromatický řetězec, do něj vložený, nebo řadu heteroatomů, oscilujících mezi 0 až 5. Ri je funkční skupina v koncové poloze vazebního členu, a může to být NH2, COOR, CHO, SH, nebo jakékoli jejich prekurzo- ry·

Pro polykondenzační proces byly, pro několik případů, vyvinuty optimální podmínky, např. s disacharidem 19, s vazebním členem 5-azido-3-oxapentanolem 26 a pivaloylchloridem v dichlormethanpyridinu. Frakce, která obsahovala oligomery 27, se může získat ve výtěžku 70 až 85 %, vztaženo na dísacharid po oxidaci, gelovou chromatografíí na Sephadexu LH-20 v methanolu. 13

Oligosacharidová směs 27 se hydrogenovala v systému methanol-ethylacetát- voda-kyselina octová za přítomnosti palladia na uhlíku, aby poskytla surovou oligosacharidovou směs 28. Jestliže je nutné skupinu vazebního členu aktivovat, je lepší tento proces provést v následujícím kroku. Například, ke směsi oligomerů 28 se přidá N-hydroxysukcinimidylester kyseliny β-maleimidopropionové v dimethylformamidu. Po ukončení reakce se výsledný roztok zředil vodou a diafíltroval pod tlakem dusíku přes membránu se separačním limitem 1000. Produkt 30, takto získaný, je aktivní oligosacharidová směs, připravená pro konjugaci.

Struktura vytvořeného produktu byla ve všech případech potvrzena nukleární magnetickou rezonancí Ή y 13C a korelačními zkouškami H-H y H-X.

Proteiny se derivatizovaly kyselinou thiopropionovou zavedením thiolu, maskovaného jako bisulfíd. Pro tuto derivatizaci se mohou použít reagencie jako SPDP nebo DSP, po které následuje reakce s dithiotreitolem v atmosféře dusíku. Přebytek reagencie se eliminuje pro Neis-seria meningitidis OMP, nebo pro toxoid tetanu, srážením vodným ethanolem (20 až 95 %) a následným odstředěním. Provedení procesu pro Neisseria meningitidis OMP je zobrazeno na následujícím schématu.

32

Thiolovaný protein se míchá v inertní atmosféře s aktivním oligosacharidem, předtím zfiltro-vaným přes filtr 0,2 Jim a lyofilizovaný. Reakce se utlumila srážením ethanolem, po němž následovalo odstředění nebo diafiltrace.

Alternativně se může přebytek aktivační reagencie odstranit z konjugátu diafiltrací. Oba sepa-rační procesy eliminují téměř všechen oligosacharid, nekonjugovaný na protein a vytváří tak velmi stabilní kvalitu finálního výrobku.

Směs oligosacharidů 30 se může konjugovat na jiný nosič, např. na lipidy. Například, reakce s 2,3-idioktadecyloxypropylsukcmimidylbutandioát33 v přítomnosti karbodiimidu umožňuje získat konjugát 34. fun Λ o-. MHsooccHptax^i. nhs''~x/°'

i—MtSOOťXI-feC^ty^NHCHgCHzOCHjCHy -O-P=0 ^isHseO I CieHaeO-* m ,, J-OC18H36 33

-OH -OH -OH -Θ- O—i 34

Konjugát syntetické oligosacharidové směsi a proteinů se může zředit nebo přestavět na adekvátní fyziologický tlumič a může se smíchat s aditivy nebo pomocnými látkami, ochrannými prostředky a jinými složkami, s cílem získat konečný vakcínový přípravek. Podobně se může vakcína smíchat, před a nebo během procesu formulace, s jinými vakcínami z typu běžně používaného v imunizačním programu dětí do stáří jednoho roku. Například, míchání s proteiny s vnější membránou typu Neisseria meningitidis typ B (OMP), může být vytvořena kombinovaná vakcína proti Hib a proti meningitidě typu B. Po smíchání s DTP se můře získat kombinovaná tetravalentítí vakcína proti Híb. proti záškrtu, proti černému kašli a proti tetanu.

Imunogenicita konjugátu vakcíny oligosacharidů 30 a meningokokálnich proteinů s vnější membránou, byla prokázána na několika zvířecích modelech. Přítomnost protilátek proti kap-sulámímu polysaoharidu Hib, zaváděných vakcínou, byla detekována za použití metody ELIS A (D.C. Phipps et al. j. Immunolog. Methods, 1990. 135. 121-8). Výsledky ukazují obr. 2 až 5. U králíků vyvolává vakcína, připravená bez aluminy, vyšší odezvu v pivních dávkách, avšak oba preparáty se stanou shodnými po druhých dávkách. V obou případech byl pozorován vysoký íitr protilátky.

Na příkladu Sprague-Dawleyových krys. ukázala vakcína, připravená ze dvou konjugátů, lišících se poměrem sacharid - protein, vysoké íitry I lib protilátky.

Vakcína. získaná z podobného konjugátu, indukovala u myši Balb/c vysoké litry anti-kapsulámí polysacharidové protilátky.

Oligosacharidová směs 30 se může být kopulovat s matricemi jako např. s polyakrylamidem. Tento produkt se může použít k detekci anti-Hib protilátek u imunizovaných lidí nebo u laboratorních zvířat. Směs se může také kopulovat s latexem a použít k detekci protilátek u nemocných nebo očkovaných lidí. Poiyakrvlamid, aktivovaný podle N.Bovina (Glycoconjugate .1.. 1998, 15. 431 až 446) reagoval se směsí oligosacharidů 30. Komparativní schopnost HbO-HSA, doporučované látky k detekci anti-Hib protilátek a polyakrvlamidový konjugát 30 jsou zobrazeny na obr, 6. Lepší poměr odezva - šum byl dosažen s produktem, obsahujícím syntetické oligosacharidy. PřeíUed obrázků na výkresech

Obr. 1. Typicky chromatogram oligomemích frakcí, získaných v přikladu 15 íontomeničovou chromatografíí na Mono Q HR 5 5 s lineárním gradientem NaCl 0 až 500 raM. kde A je penlamer; B je oligomer z příkladu 10.

Obr, 2. Odezva protilátky u králíků imunizovaných vakcínou z příkladu 16.

Obr. 3. Odezva protilátky u králíků, imunizovaných vakcínou z příkladu-15.

Obr. 4. Odezva protilátky u krys. imunizovaných vakcínou z příkladu 15.

Obr. 5. Odezva protilátky u myši Balb/c imunizované vakcínou z příkladu 15.

Obr. 6. Schopnost konjugátu 26-PAA k detekcí anti-Hib protilátek. • · Síjkjady provedení vynálezu Přiklad 1 : Syntéza 5-0-allyl-2,3-di-0-benzvl-D-ribitolu 11

Allylace. - 100 g meíhyl-2,3-Q-i$opropylidm-D-ribofuranosidu bylo během 12 hodin za míchání rozpouštěno v 70 ml ailvlbromídu za přítomnosti 75 ml vodného 50 % hydroxidu sodného a 2.6 g tetrabutylamonium-jodidu. Po této době bylo míchám přerušeno a táze rozděleny. Vodná fáze se extrahovala dichiormethanem (70 ml) a organická fáze se sušila a odpařila. Hydrolýza. - Výsledný sirup se rozpustil v 1.5 litru methanolu. K tomuto roztoku se přidalo 3,6 tni vodné kyseliny sírové (0.4 N) a směs se 3 hodiny refluxovala. Po ukončení reakce se neutralizovala hydrogenuhličitanem sodným, vzniklé soli se zfiltrovaly a roztok se odpařil. Zbytek se extrahoval ethylacetátem, sušil a odpařil. Produkt se sušil za vakua nejméně 2 hodiny.

Benzylaee ; Získaný produkt se rozpustil ve 450 ml dimethylformamidu. Výsledný roztok se ochladil na 0 °C a pomalu se přidávalo 50 g hydridu sodného. Směs se míchala 30 minut a pak se pfikapával benzylchlorid (150 ml). Po 2 hodinách míchání se do reakční směsi přika-pávaio 20 ml methanolu. Výsledná suspenze se za vakua odpařila, znovu rozpustila v dichlormethanu a promyla vodou. Organická fáze se sušila síranem sodným a odpařila.

Hydrolýza. - Výsledný sirup z předchozí reakce se rozpustil 1,5 litru dioxanu. Přidala se HC1 (2N. 1,5 litru) a systém se zahřál na 75 až 80 UC. Po 2 hodinách se reakce zastavila a fáze byly rozděleny. Vodná fáze se dvakrát extrahovala 200 ml dichlormethanu a spojená organická fáze se odpařila. Zkoncentrovaný produkt se rozpustil v dichlormethanu (1 litr) a postupně se promyl vodou (400 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (300 ml) a vodou (400 ml), a nakonec se sušil síranem sodným a odpařil.

Redukce.- Výsledný sirup se rozpustil v ethanolu (800 ml) a roztok se ochladil na 20 °C. Potom se přidalo 24 g NaBH*. Směs se míchala 1,5 hodiny za pokojové teploty a po ukončení reakce se přebytek borohydridu odstranit kyselinou octovou až do dosaženi pH 7 až 8. Roztok se zfilmoval a odpařil. Zbytek se rozpustil v 500 ml dichlormethanu, organický roztok se pro-my! vodou se síranem sodným a použil v následujícím příkladu. rnkiau -O-aih di-( t-henzvl-D-ribiíoi 11. K dichlomtethanovému roztoku surového 5-0-aUyl-2.3-di-0-benzyí~l)-ribitolu 111 předchozího příkladu se přidalo 300 g silikagelu a směs se ručně míchala, dokud se produkt neadsor-boval na pevnou fázi. Suspenze se za vakua odpařila, aby se odstranil dichlormethan. Produkt s obsahem silikagelu se umístil do perkolátoru. Nečistoty se odstranily extrahováním cvklo • · • · hexanem po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo z předchozí extrakce se změnilo na dichlonnethan pro extrakci produktu, a získal se chromatograficky čistý, světle žlutý sirup. Výtěžek byl 75 až 95 °o. NMR 13C δ 60.7 (C-l), 70.2 (C-4), 71,0, 71,7, 72.0. 73.6, (PhCH2C-5, OCH2CH-). 79,2 79,3 {(7-2.3). 117.3 (CH2=), 127.5 - 128,2 (Pii), 134,3 (CH = ), 138,0, 138.1 (Cipso). Příklad 3; Syntéza 5-0-allyl-2,3,4-tri-0-benzyl-D-ribitoIu 14.

Tritylace. - 100 g 5-0-allyl-2,3-di-0-benzyl-D-ribitolu 11 z předchozího příkladu byl sušen ve vakuu a rozpuštěn ve 600 ml pyridinu. K tomuto roztoku se přidalo 75 g ehlortrifenylmet-hanu a 0,5 g dimethylaminopyridinu, a směs se míchala 6 hodin při 50 °C. Po ukončení reakce se rozpouštědlo odpařilo a zbytek se rozpustil v 500 ml diehlormethanu, roztok se protnyl vodou (1 litr), sušil a odpařil. Zbytek se sušil 3 hodiny ve vakuu.

Benzylace. Sirup z předchozí reakce se rozpustil v 300 ml dimethylíormamidu a roztok se ochladil na 5 °C. Pomalu se přidával hydrid sodný (25 g) a pokračovalo se vmíchání 30 minut. Pak se pomalu přidal benzylchorid (40 ml) a směs se dále míchala po dobu 1 hodiny. Po skončení reakce se směs opět ochladila a pomalu se přidalo 10 ml methanolu. aby se odstranil přebytek reageneii Roztoky se odpařily a zbytek se rozpustil v 500 ml diehlormethanu a proutci 1 litrem vody. Organická fáze se sušila síranem sodným a odpařila.

Hydrolyza. - Zbytek se rozpustil v kyselině octové (1 litr) ave 110 ml vody, a reakční směs se míchala 1,5 hodiny při 80 °C. Rozpouštědlo se odstranilo odpařením a zbytek se rozpustil v 500 ml cyklohexanu. Organická fáze se ochladila na 0 až 5 °C během 4 hodin, a pak se zfil-trovala, promyla vodou, sušila síranem sodným a odpařila. Destilaci při 200 až 220 °C a 0,1 mm se získal čistý produkt. Výtěžek byl 80 až 90 g, vztaženo na 100 g ribosy. NMR 13C δ ,2 (C-l), 69,6, 71,8, 72,1, 72,3, 73,9 (PhCH2C-5, OCH2CH=), 78,0, 78,8. 78,9 (C-2,3,4). (Cipso). 116,8 (CH,-), 127,5 až 128,2 (Ph), 134,7 (CH-), 138,0, 138,1, 138. Přiklad 4: Syntéza 5-0-allyl-2.3,4-tri-0-benzyl-l-0-(P-D-ribofuraRosyl)-D-ríbitolu 4. Glykosylac-e. - Produkt z předchozího příkladu (370 g) se rozpustil v 2,7 litrech suchého dichlorethanu a převedl do reaktoru. Roztok se ochladil na 0 až 25 °C, přidalo se práškové molekulami síto 4 Λ (207 g) a po 15 minutách se pomalu přidával etherát fluoridu boritého (4o7 ml) rychlostí 15 mi min, výsledný peracetát D-ríbofuranosy 15 (370 g). rozpuštěný v suchem dichlorethanu (1 litr) se pomalu přidával během 20 mm. Reakční směs se míchala 3 hodiny a zkoušela metodou TLC svsrémem hexany eíhylaceiát (2 1). Destičky bvjv vyvíjeny

7\Ů 1£ kiíl) {V dhanoiu. Po skončení reakce se směs neutralizovala trieťhvla* !8 i

minem (222 ml) clo pH 7 a pak se přidal nasycený roztok hydrogenuhličítánu sodného (800 ml) a míchání pokračovalo ještě 30 minut. pH reakce je nutno udržovat v neutrální oblastí. Obsah reaktoru se zfiltroval za vakua. Pevný podíl se dvakrát promyl di chloremaněni (200 ml), aby se extrahoval veškerý zbývající produkt v pevném podílu. Pevná fáze se vyřadila a organická fáze se extrahovala dvakrát vodou 600 mi, sušila síranem sodným a odpařila ve vakuu.

Deacetylace. - K výslednému sirupu z předchozí reakce, rozpuštěnému v methanolu (2 litry), se přidal roztok methoxidu sodného (1 %) v methanolu až do dosažení pH 9. Reakce pokračovala téměř 2 hodiny. Po skončení reakce se směs neutralizovala pryskyřičnou kyselinou až do dosažení pH 6 až 7. Pryskyřice se odstranila filtrací ve vakuu. Sirup (427 g) obsahoval žádaný produkt spolu s 5-0-allyl-2,3,4-tri-O-benzyl-D-ribitolem, D-ribosou a jinými neurčenými sloučeninami. Příklad 5: Čištění 5-0-allyl-2,3,4-tri-0-benzyM -0-( P-D-ríboínranosyl)-D-ribitolu 4.

Sirup z předchozího příkladu se rozpustil v dichlormethanu (1 litr). K roztoku se přidal silika-gel (1 kg) a směs se ručně míchala, dokud se produkt neadsorboval na pevnou fázi. Suspenze se za vakua odpařila, aby se odstranil dichlormethan. Výsledná pevná látka se sušila ve vakuu 2 hodiny, k odstranění zbylých stop dichlormethanu. Produkt s obsahem silikagelu se umístil do perkoíátoru. Nečistoty se odstranily extrahováním cykiohexanem po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo k extrakci se změnilo na chloroform k další extrakci výrobku, která poskytla chro-maíograficky čistý, světle žlutý sirup. Výtěžek 238 g. NMR Ή δ 5,85 (m, 1H. CH-). 5.20 (m. 2H, CH;~), 4,85 (s. IR Η-1'), 13C δ 62.8 (C-5'). 77,7, 77,9, 78,2 (C-2.3,4), 84.0 (C-4'). 107.2(()-1/). Příklad ó: Syntéza 5-O-aUy 1-2,3.4-tri-O-benzyl-1 -0-(p-D-2', 5 '-di-O-benzyl-ribofuranosy 1 V· D-ribitolu 5/

Benzvlace. -- Výsledné sloučeniny (200 g) z předchozího příkladu se rozpustily v toluenu (2 litry). K tomuto roztoku se přidal BmSnO (80 g) a směs se refluxovala 4 hodiny. V malých dávkách se přidával 50 % Naíl (56 g) za pokojové teploty, a směs se míchala při 80 °C po dobu 30 minut. Přidal se tetrabutvdamonium-jodid (62 g) a směs se dále míchala 1 hodinu. Pak se přidal benzyiohlorid (148 ml) a pokračovalo se v mícháním pň 80 °C po několik dalších hodin. Tyto adice benzylchloridu se opakovaly v 30 minutových intervalech, dokud TLC (hexany/ethylacetát - 2:1) neukázala jako hlavní produkt dibenzvlovaný disacharid. Reakční směs se ochladila a neutralizovala methanolíckvm roztoke tm 1 O,' > HOL Pak se reakční směs zfiltrovala pres celit a odpařila za sníženého tlaku. Výsledný produkt, který obsahoval něco sob', se rozpustil v ethvlacetátu. zfiltroval za sníženého tlaku a zkoncentroval. Suro\ý sirup se čistil sloupcovou chromatcgraíií v systému toluen-aceton 60:1 Čistý' produkt 5 se získal jako sirup (100 g). KMR lH δ 5,96 (m, Iři, -CH-), 5.18 (m, 2H, CH2--), 5,02 (s, 1H, H-l) Příklad 7: Syntéza 2,3,4-tri-O-benzy 1-1 -0-(β-ϋ-2 ,5' -di-O-benzyl-3' -O-tríethylamonium -fosfonát-ribofuranosyl)-D-ribitolu 19.

Isomerizace allylové skupin}'. - 20 g výsledného sirupu z předchozího příkladu bylo sušeno za vysokého vakua 2 hodiny. Sirup se rozpustil v sušeném dimethylsulfoxidu (100 ml) a přidal se terc-butoxid draselný (6,4 g). Reakční směs se míchala 1 hodinu při 100 °C a pak se přidalo 250 ml ledové vody. Pak se po kapkách přidávala koncentrovaná kyselina chlorovodíková až do dosažení pH 7. Směs se dále třikrát extrahovala 80 ml diethvletheru. Organická fáze se spojila, sušila síranem sodný m a odpařila.

Fosfonylace. - Roztok imidazolu (1,5 g) v sušeném aceíonitrilu (34 ml), se ochladil na 0 °C. Přidal se chlorid fosfority (0,56 ml) a triethylamin (3,1 ml). Výsledný roztok se míchal 15 minut. K této směsi, rozpuštěné v suchém acetonitrilu (3 ml), se přidal disacharid z předchozí reakce. Výsledná směs se míchala 15 minut při pokojové teplotě a reakce se zastavila přidáním 1 M roztoku triethylamonium-bromidu. Míchání pokračovalo ještě 10 minut, načež se přidal dichlormethan a obě fáze se rozdělily. Organická fáze se promyla ochlazeným roztokem hvdrogenuhličitanu triethylamonného, sušila a odpařila.

Hvdrolýza propenvlové skupiny. - Produkt se rozpustil v 60 % kyselině octové a míchal 30 minut při 70 °C. Rozpouštědlo se odstranilo odpařením a produkt se rozpustil v dichlormethanu, promyl hydrogenuhličitanem triethylamonným. sušil a odpařil. Sloupcová chromatografic výsledného produktu poskytla čistou látku s výtěžkem mezi 70 až 85 °o. NMR Ή o 6.85 (d, H-P). 4,95 (s, H-l), 4.60 (m, H-3), 2,93 (q. NCH2CH3) 1.20 (t, NOH2CH?), ώΟ δ 105.9 (C-l). Příklad 8: Polykondenzačni reakce mezi 19 a 26 (poměr 10:1) K roztoku sloučeniny 19 (1 g) ve směsi pyridin triethylamin (10:1. 1 ml)· se přidal íríme-thylacetylchlorid (0.14 ml) a reakční směs se míchala 20 minut. Přidal se vazební člen 26 (29,2 mg) a nová dávka trimethyiacetyichioridu (0,9 ml) a směs se míchala 1 hodinu. Přidal se roztok L> (1.1 g) ve směsi pyridin-voda (/,3 mi; 20:1) a reakční směs se míchala 30 minut. Zředila se dichformethanem. promyla roztokem thiosíranu sodného (1 M) a studením roztokem triethylamonium-bromidu (0.5M). pak se sušila síranem sodným a odpařila. Vvsledný ; produkt se rozpustil v metbanolu a chromatografoval na sloupci Sephadexu LH-20 ve stejném rozpouštědle. Frakce obsahující oiigomery byly spojeny a odpařeny. Výtěžek 80 %. Přiklad 9; Poiykondeiizačm reakce mezi 19 a 26 (poměr 10:1} K roztoku sloučeniny 19 (1 g) a vazebního Členu 26 (14.6 mg) ve směsi pyridin-iriethylamin í 10:1. 1 ml) se přidal trimethylaeetylohlorid (0.23 ml) a reakční směs se míchala 2 hodiny. Přidal se roztok I; (1.1 g) ve směsi pyridin-voda (7.3 ml; 20:1) a produkt se zpracoval podobně jako upříkfadu 8. Příklad 10: Polvkotidenzační reakce mezi 19 a 26 (poměr 5:1) K roztoku sloučeniny 19 (1 g) a vazebního členu 26 (29.2 mg) ve směsi pyridin-triethylamin (10.1. 1 mi) se přidal trimethylacetylchlorid (0,23 ml) a reakční směs se míchala 2 hodiny. Přidal se roztok I2 (1.1 g) ve směsi pyridin-voda (7,3 ml; 20:1) a produkt se zpracoval podobně jako u přikladli 8. Příklad 11: Póly kondenzační reakce mezi 23 a 26 (poměr 5:1, rozpouštědlo pyridin) K roztoku sloučeniny 23 (1 g) a vazebního členu 26 (29,2 mg) v pyridinu ( 1 ml) se přidal trimethylacctyi-clúorid (0,23 ml) a reakční směs se míchala 2 hodiny. Přidat se roztok l: (1,1 g) λ e směsi pyridin-voda (7.3 ml: 20:1) a produkt se zpracoval podobně jako u příkladu 8. Příklad 12: Polvkondenzační reakce mezi 19 a 24 (poměr 5:1. rozpouštědlo pyridin) K roztoku sloučeniny 19 (1 g) a vazebního členu 24 (29,2 mg) v pyridinu (1 ml) se přidal tri-methylacetyíehlorid (0,23 ml) a reakční směs se míchala 2 hodiny. Přidal se roztok F (1,1 g) ve směsi pyridin-voda (7,3 mi; 20:1) a produkt se zpracoval podobně jako u příkladu 8. Příklad 13: Hydrogenačni reakce produktů z příkladů 8 až 12.

Surový produkt z příkladů 8 až 12 se hydrogenoval ve směsi ethylacetát-ethanol-voda-kyselina octová (1:2:2:0,1) s 10 % palladia na uhlíku. Nakonec se produkt čistil iontoměničo-vou chromatograílí na Sephadexu C-25 Na. Lyoíilizovanv produkt byl charakterizován metenou . 7’.ij,í j ia ukazala na opakuiici se jednotku nb-rio-fosfat a \a/.eoní wlen. Po diafiltiaci a ultraílitraci se získaly aktivní frakce, první přes membránu se sepaiačmm limitem 1000, a zádrž přes membránu se sepaiačmm limitem 10 000. Roztok, který prošel přes membránu 10 000 se spojil a lyofilizoval a poskytl konečný produkt 28 s celkovým výtěžkem, v závislosti na reakčníc-h podmínkách mezi 20 až 80 °o. vztaženo na odloučeny disachand. : : • · · · · · * « · » · « · · · NMK JH ό 5.12 ( Η-1). 4,60 (H-3), 3.29 (CH2NH2). nP 6 2,14 (spac-P-rib) 0,74 (ribitoí-P-ribí. Příklad 14: Syntéza derivátu íbsfáiu 30. •(3-maleimidopropionamido)-3 oxapentyl oligo libo sil ribitol K roztoku z předchozího příkladu (3,34 mg, 1,73 μηιοΙ ) v redestilované vodě (0,1 ml), se přidalo 0.7 mg (2,62 umol) N-hydroxysukcinimidyl β-maleimidopropionátii 27, rozpuštěného v N,N-dimethylformamidu (0,4 ml). Po 4 hodinách reakce se roztok ve vakuu odpařil, znovu suspendoval v destilované vodě (0,5 ml), a odstředil (10 minut, 3500 oťmin). Kapalina nad sedlinou se zředila vodou a ulírafiltrovala v zařízení Amicon membránou se separačním limitem 1000. Zádrž se lyofilizovala. Výtěžek se pohyboval mezi 85 až 95 %. NMR: ’ϋ. Ó 6.95 (s, 2H. CH-CH). 5,01 (s. H-l) 3,41 (t, 2H, CH2NH), 2,56 (t, 211 CH2a). Příklad 15: Analýza produktů, získaných v/ příkladu 13 iontoměničovou chromatografií. Hydrogenované produkty z příkladu 8 až 12 se jako sodné solí analyzovaly iontoměničovou chromatografií v HR5,'5mono Q sloupci s lineárním gradientem chloridu sodného (P.Constantmo, et ai.. Vaccine 1999, 17, 1251 až 1263). EluČní chromatografický profil z přikladu 8 je zobrazen na obr. 1B a ukazuje fragmenty různých velikosti. Jestliže se srovnávají s výsledky, publikovanými v literatuře s obr. 1A, zobrazující chromatogram pentameru. lze učinit závěr, že ve směsi jsou patrné fragmenty se 4 až 5 opakujícími se jednotkami, až do více než 20 jednotek.

Příklad 16: Konjugace s proteinem s vnější membránou Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis. proteinový komplex s vnější membránou (OMPC). 400 mg. se rozpustil v 80 ml PBS pufru, pH 8. předem propláchnuty N2 (g). Roztok se propláchoval N2 (g) po dobu 5 minut za míchání v lázni sledovou vodou. Přidalo se 1.6 ml roztoku DSP v dimethvlfonnamidu a směs se mírně míchala 2 hodiny při 4 °C. Pak se přidalo 1,6 ml roztoku DIT v PBS a míchání pokračovalo 1 hodinu při 4 °C. Výsledná suspenze se převedla clo odstředivkové banky, obsahující 20 až 400 ml studeného ethanolu. Baňka se odstřeďovala při i 800 Gfmm a 4 °C 30 minut a voda nad sedlinou vypustila. Přidala se nová davka ethanolu k pevnému podílu a odsííeďování se opakovalo po přidání 200 až 400 mi ethanolu. Sraženina se znovu suspendovala v 80 ml PBS pufru o pH - 7 až 9. Výsledný roztok se přidal k syntetickému oíigosacharidu 30 a míchání pokračovalo 1 až 48 hodin, Po ukončení procesu se ethanolická srážecí a odstřeďovací operace opakovaly, následovala diaííltraee za použití membrány se separačním limitem 30 000. Zádrž se rekonstituovala v PBS pufru na koncentraci Hib 40 až 80 pg ml. Příklad 17: Konjugace s toxoidem tetanu.

Roztok toxoidu tetanu o koncentraci 5 mg. ml v PBS pH 8, byl 5 minut probubláván N-> (s). Za neustálého míchání v lázni ledové vody se přidalo 1.6 ml roztoku DSP v dimethylformamidu a směs se dále mírně míchala 2 hodiny při 4 °C. Přidalo se 1.6 m! roztoku DTT v PBS a míchání pokračovalo ještě 1 hodinu pn 4 °C. Výsledný roztok se převedl do ultraílltračního zařízení s membránou se separačním limitem 10 000. Roztok se několikrát diafíltroval za přidání čerstvého pufru, předem probublaného X2 (g), dokud roztok, který prošel membránou byl negativní na Elmanňv test. K výslednému roztoku se přidal syntetický oligosacharid 30 a míchání pokračovalo po 1 až 48 hodin. Po ukončení procesu se roztok opět diafiltrovaL dokud roztok, který prošel membránou nebyl negativní na fenol-sírový test na cukry. Finální roztok byl rekonstituován v PBS pufru na koncentraci Hib 40 až 80 ttg ml. Pííkiad 18: Konjugace s dioktadecvlglycerolpolosukcinátem.

Produkt z příkladu 8 (10 mg) byl rozpuštěn v 1 ml dimethylformamidu a přidal se k roztoku dioktadecvlglycerolpolosukcinátu jako N-hydroxysukcinimidester 31. K roztoku se přidal eťhyldiaminopropylkarbodiimid (5 mg) a reakční směs se míchala 6 hodin. Přidala se nová dávka karbodiimidu a míchání pokračovalo dalších 6 hodin. Rozpouštědlo se odpařilo a směs se nasadila do sloupce silikagetu C 18 (1 g). Eluce vodou odstranila oligosacharid. Produkt se eluoval s koncentračním gradientem směsi methanol-voda. Výtěžek 85 °o. NMR 1H o 5.12 (H-l), 4,60 (íI-3), 3.40 (CH2NH), 1,30 (CH2), 0.90 (CII3). Příklad 19: Příprava vak cíny bez pomocné látky. hmmogen z příkladu 16 rozpuštěný ve fosfátovém pufru za koncentrace 40 pg/ml by! zředěn za asepíickýob podmínek při 4 až 8 °C redestilovanou v'odou. Suspenze se míchala 10 minut. Konečná koncentrace Hib antigenu byla určena stanovením ribosy a celkových proteinů a mohla se znovu upravit přidáním další dás kv roztoku pufru. dokud nebyla konečná koncentrace Hib antigenu 20 mg mi. Přidal se Tiomersal v konečné koncentraci 0.1 až 0.001 %. výsledná suspenze je koneční m objemem proti Hib konjugátu vakcíny bez pomocné latkv. Příklad 20: Příprava vakcíny proti Hib v aluminějako pomocné látky.

Imunogen z příkladu 16. rozpuštěný ve fosfátovém pufru v koncentraci 40 ugml, se smíchal za aseptických podmínek při 4 až 6 °C se stejným objemem aluminy 1 až 0.01 mgírJ v destilované vodě. Míchám se udržovalo 20 minut při teplotě 4 až 8 °C. Konečná koncentrace Hib se určila stanovením ribosy a celkových proteinů a mohla být znovu upravena dalším přidáním roztoku pufru, dokud nebyla konečná koncentrace Hib antigenu 20 mg/ml. Přidal se Tiomersal v konečné koncentraci 0.1 až 0.001 %. Výsledná suspenze je konečným objemem konjugátu vakcíny proti Hib λ/ aiumině. Příklad 21: Příprava kombinované vakcíny proti Hib a meningokoku B. imunogen z přikladu 16, rozpuštěný ve fosfátovém pufru a o koncentrací 80 ug ml. se smíchal za aseptických podmínek při 4 až 6 °C s objemovým roztokem komplexu proteinu s vnější membránou (OMPC) Neisseria meningitidis. typu B, běžně používané v V AMEMGOC BC o koncentraci v PBS 100 až 200 ms/mL Po 20 minutách homogenizace mímvm mícháním magnetickým míchadlem se obsah reakce smíchal se stejným objemem aluminy 1 až 0.01 mg/ml v destilované vodě. Míchání se udržovalo 20 minut při 4 až 6 °C. Konečná koncentrace antigenu Hib se určila stanovením ribosy a celkových proteinů pomocí Lowrv, a mohla se znovu upravit přidáním dalšího roztoku pufru, dokud nebyla konečná koncentrace Hib antigenu 20 mgml. Přidal se Tiomersal v konečné koncentraci 0,1 až 0,001 %. Výsledná suspenze je konečným objemem kombinované vakcíny proti Hib a proti meningokoku B v aiumině. Pííkiad 22: Příprava kombinované vakcíny proti Hib a DTP.

Imunogen z příkladu 16, rozpuštěný ve fosfátovém pufru a o koncentraci 80 dg ml, se smíchal za aseptických podmínek při 4 až 6 °C s objemovým roztokem DTP ve čtyřnásobné koncentraci. Po 20 minutách homogenizace mírným mícháním magnetickým míchadlem. se obsah reakce smíchal se stejným objemem aluminy 1 až 0,01 mg ml v redestilované vodě. Míchání se udržovalo 20 minut při 4 až 6 °C. Konečná koncentrace Hib se určila stanovením ribosy a celkových proteinu pomocí Lowrv, a mohla se znovu upravit přidáním dalšího množství roztoku pufru. dokud nebyla konečná koncentrace Hib antigenu 20 mg ml. Přidal se Tiomersal v konečné koncentraci 0,1 až 0.001 %. Výsledná suspenze je konečným objemem kombinované vakcíny proti Hib a DPI v aiumině. • «

2 I Přiklad 23: Imunologické zkoušky vakc-ía připravených ze syntetické oligosacharidové směsi a ()MP.

Zvířata, poi

Vakcína z příkladů 19 a 20 byl imunizována dávkou 1 u« nebe žitá v těchto experimentech, byly králíci, krysy nebo myši. Byly prováděny dvě imunizace v intervalu 4 týdnů s odběry po 0. 28 a 42 dnech. Krev byla shromážděna a odstřeďována při 3500 ot min po dobu 20 minut. Séra byla desetinásobně zředěna a uložena při -40 °C .

Odezva protilátky se změřila nepřímou metodou ELIS A za použití povlečeného antigenu Hib-HSA. \vsledkv ukazují obr. 2 až 5. Příklad 24: Konjugát mezi směsí syntetických oligosacharidů a p-nitrofenylakrylátu.

Směs oligosacharidů z příkladu 13 (1.0 mg) se rozpustila v dimethy Ifonnamidu a přidala k roztoku mtrofenylakryiátu (10 až 30 mg) v dimethylfórmamidu (1 ml). Přidalo se 0.1 až 0.5 ml triethv laminu a reakce se udržovala mícháním po dobu 16 hodin. Pak se přidal amoniak 0.1 až 0.5 ml a míchání pokračovalo 24 hodin. Roztok se nanesl na sloupec Sephadexu LH-20 v acetonitrilu. Eluce se prováděla směsí acetonitril-voda. Frakce pozitivní na orcinolovou zkoušku na ribo.su byly spojeny a lyofilizovány. Výtěžek je obvykle vyšší než 80 °o. Příklad 25: Schopnost detekce konjugátu syntetického oligosacharidů protilátek proti Hib. Roztok produktu z předchozího příkladu v uhlicitanovém-hydrogenuhličitanovém pufru se v koncentraci 1 až 100 pg ml aplikoval na polovinu destičky s 96 miskami. Na druhou polovinu této destičky se aplikoval antigen HbO-HSA v doporučené koncentraci. Zkouška El.ISA se provedla za použití séra imunizované myši vakcínou, obsahující přírodní kapsulámí poly-sacharid, kupí ováný na toxoid tetanu. Získané výsledky ukazuje obr. 6.

Claims (19)

1. jV2£CZ-?Ai

   • « · · • · · * • * ·· .'t«# • · · * • •I « · · « 25 PATENTOVÉ NÁROKY 1. Směsi oligosacharidů, které obsahují opakující se jednotky vzorce (fosfát-ribosa-ribitol)n nebo (ribosa-ribitol-fosfát)n, vyznačující se tím, že se získávají synteticky a obsahují nejméně 5 sloučenin obecné struktury A nebo B, kde n má hodnotu mezi 4 a 25. a kde Rj nebo R2 je vazební člen pro konjugaci na nosič s podmínkou že Ri = vazební člen, když R2 = H, nebo R2 = vazební člen, když Ri = H.
2. 2. Směs oligosacharidů podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněné sloučeniny vzorce (fosfát-ribosa-ribitol)n nebo (ribosa-ribitol-fosfát)n struktuiy A nebo B se od sebe liší pouze indexem n, nabývajícího hodnot mezi 4 a 25.
3. 3. Směs oligosacharidů podle nároku 2, vyznačující se tím, že vazební člen znamená jakýkoliv alifatický uhlovodíkový řetězec, obsahující počet heteroatomů od 0 do 5 a/nebo aromatický řetězec, kteiý má vždy na druhém konci funkční skupinu NH2, COOR, CHO, SH, nebo jejich prekurzor, schopný vytvořit chemickou vazbu s molekulou, působící jako nosič.
4. 4. Způsob! syntézy směsi oligosacharidů, které obsahují opakující se jednotky vzorce (fosfát-ribosa-ribitol)n nebo (ribosa-ribitol-fosfát)n, vyznačující se tím, že je prováděn polykon-denzační reakcí v jednom kroku, aplikovanou na derivát disacharidu 19 nebo 23 za přítomnosti promotoru, kteiým může být aktivní derivát stéricky bráněné kyseliny, v bazickém rozpouštědle a s vazebním členem, kteiý se zúčastňuje reakce jako akceptor, ukončující růst oligomemího řetězce.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že disacharid meziprodukt 19 nebo 23 a pro motor, jsou v molámím poměru 1 / 1 až 3. 6 Způsob podle nároků 4 a 5. vyznačující se tím. že promotor je aktivní derivát stéricky bráněné kyseliny.
6. 7. Způsob podle nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že promotor je s výhodou pivaloví chlorid, adainantoylchlorid nebo aktivní derivát kyseliny fosforečné.
7. 8. Způsob podle nároku 4, xyznačujici se tím, že disacharid meziprodukt 19 nebo 23 a vazební člen jsou v molámim poměru 5 až 10 i 1.
8. 9. Způsob podle nároků 4 až 8. xyznačujici se tím, že disacharid je 19 a vazební člen je 24. promotor je pivaloylchlorid a rozpouštědlo je pyridin.
9. 10. Způsob syntézy směsi oligosacharidů podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že sloučeniny získané podle Způsobu dle nároků 4 až 9 jsou dále podrobeny oxidaci fosfonátu na fosfát, následované hydrogenací, za účelem odstranění benzylových chránících skupin, sejmutí chránící skupiny nebo aktivace vazebního členu a eliminace frakcí menších než 4 nebo větších než 25 opakujících se jednotek, jedním nebo několika procesy s molekulovými síty.
10. 11. Imunogen obsahující oligosacharidové směsi podle nároků 1 až 3, xyznačujici se tím, že zmíněná oligosacharidová směs je spojena s molekulou nosiče, vybraného ze skupiny, obsahující proteiny, peptidy nebo lipidy.
11. 12. Vakcína obsahující imunogeny podle nároku 11, vyznačující se tím, že je sestavená s pomocnou látkou nebo jinými aditivy nebo bez nich. pro prevenci nemocí vyvolaných bakterií Haemophilus influenzae, typu b,
12. 13. Vakcína podle nároku 12, vyznačující- se tím, že se používá v kombinaci s jinými vakcí-nami. jako jsou vakcíny proti hepatitidě B. proti meningitidě A, B, a nebo C, DPI, proti dětské obrně, proti zápalu plic 1, 5, 6B. 6A, 14, 19F, 19a a nebo 23F, nebo v kombinaci s jejich příslušnými imunogeny.
13. 14. Způsob syntézy disacharidu meziproduktu 2.3,4-tri-0-benzyl-5-0-ailyl-(p-D--ribofuránosvl)-D-ribitolu 4 v čisté formě, xyznačujici se tím, ze se provádí ribosvlact 2.3 4-tn-0-benzy]-5-0-al!yl-E)-ribitolu 14 s peracetátem ríbofuranosy, následovanou dea- kterou získá sloučenina sc čistí na silikagelu technikou absorpce- tíesorpce.
14. 15. Způsob syntézy disacharidu meziproduktu 17. xyznačujici se tím, že se skládá z Uibenzylace disacharidu 4 dibutylcínoxidem, teírabutykmonium-jodidem, hydridem sodným a benzvlchloridem v poměru 1: 0,5 až 2 : 0.001 až 1. 0,5 až 10 : 1 až 5. v rozpouštědle jako toluen, benzen, tetrahydrofuran nebo xylen, poskytující sloučeniny vzorce 5, následované isotnerizaeí allylu na propeny!.
15. 36. Di sacharid 5-(>pinpenyl-2,3.4-tri-0-benzyl-l-0-í2\5'-di-0-benzy!-j3-D-ribofuranosv!)--D-ribitol 17 jako meziprodukt při syntéze derivátů 19 a 23. 7. Deriváty disacharidu 2,3,4-tri-O-benzyl-l -0(2 5 '-di-O-benzyl-P-D-ribofuranosyl)-D--ribitol-5-O-triethylamomum-fosfonát 23 a 23.4-íri-O-benzvl-l -0-(2\5 '-di-O-benzvl-8- D-ribofuranosyl)-D-ribitol-3 '-O-triethylamonium-fosfonát 19 jako klíčové meziprodukty oligomei ace podle nároků 5 až 7.
16. 18. Způsob přípravy disacharidu 19 nebo 23, vyznačující se tím. že vychází z disacharidu 17. a skládá se z fosfonvlaěního procesu s chloridem fosforitým-imidazolem. následovaném hydrolýzou propenylové skupiny a z řosfonylace chloridem fosforitým-imidazolem, a následnou deaceíyiací.
17. 19. Použití disacharidu 19 nebo 23 pro syntézu oligosacharidové směsi podle nároků 1 až 3.
18. 20. Makromolekuly vyznačující se tím, že obsahují oligosacharidovou směs podle nároků 1 až 3, jejichž oligosacharidová směs je spojena imunologicky inertním polymemím materiálem.
19. 21, Použití makromolekul podle nároku 20 pro detekci a kvantifikaci protilátek proti kapsu-íámímu poh sacharidu Haemophilus influenzae typu b, které při použití obsahují makromolekuly podle nároku 18.