ES2252045T3 - Oligosacaridos derivados de ribosa-ribitol-fosfato y vacunas que los contienen. - Google Patents
Oligosacaridos derivados de ribosa-ribitol-fosfato y vacunas que los contienen.Info
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Abstract
La presente invención se relaciona con el campo de la medicina, en particular con la síntesis química de mezclas de oligosacáridos derivados de ribosa-ribitol-fosfato, las cuales son empleadas como principio activo en vacunas para la prevención de infecciones causadas por Haemophilus influenzae tipo b (Hib), así comoçon las vacunas que comprenden dicha mezcla de oligosacáridos. Las mezclas de oligosacáridos obtenidas por síntesis química de la presente invención, comprenden unidades repetitivas de fórmula (fosfato-ribosa-ribitol)n o (ribosa-ribitol-fosfato)n de al menos 5 compuestos de estructura A ó B, las cuales representan la unidad repetitiva del polisacárido capsular del Haemophilus influenzae tipo b y difieren sólo por n, siendo n-4 y 25, y donde R1 ó R2 es un espaciador para la conjugación a un carrier, con la condición que R1 = espaciador si R2 = H, ó R2 = espaciador si R1 = H. La invención también se relaciona con los inmunógenos que contienen estas mezclas oligosacarídicas, con las vacunas que contienen esos inmunógenos y con los métodos para preparar estos oligosacáridos en forma de mezclas. Además, la invención contempla el uso de las vacunas ya sean solas o en combinación con otras vacunas para la prevención de las infecciones causadas por el Haemophilus influenzae tipo b.
Description
Oligosacáridos derivados de
ribosa-ribitol-fosfato y vacunas que
los contienen.
La presente invención se refiere al campo de la
medicina, en particular a la síntesis química de mezclas de
oligosacáridos derivados de
ribosa-ribitol-fosfato, que se usan
como principio activo en vacunas para prevenir infecciones causadas
por Haemophilus influenzae tipo b (Hib), así como a las
vacunas que contienen dichas mezclas de oligosacáridos.
La bacteria Haemophilus influenzae tipo b
es un problema sanitario mundial grave para el ser humano. La
bacteria produce, principalmente en niños menores de 5 años,
meningitis, neumonía, epiglotitis y otras enfermedades del tracto
respiratorio. Las secuelas observadas, que van desde problemas
auditivos hasta retraso mental grave, en muchos países alcanza el
30% de los supervivientes de la enfermedad. Los cálculos recientes
de la Organización Mundial de la Salud indican que mueren en el
mundo más de 550000 niños al año por enfermedades producidas por
Haemophilus influenzae tipo b.
El polisacárido capsular purificado de
Haemophilus influenzae puede inducir inmunidad protectora en
los adultos, sin embargo, la respuesta inmunitaria en los niños es
muy escasa y está prácticamente ausente en niños menores de 2 años
de edad.
El polisacárido capsular tiene la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado que el problema principal es la
propia naturaleza del antígeno, debido a que siendo un polisacárido
es un antígeno independiente de T que no puede estimular el sistema
inmunitario infantil, que todavía no es maduro. Se ha demostrado que
la solución a este problema se puede lograr uniendo de forma
covalente (conjugando) el polisacárido a una proteína conocida como
soporte. El producto así obtenido, conocido como vacuna conjugada,
induce un nivel protector de anticuerpos desde los dos meses de
edad.
Chu y col., (Infection immunity 1983, 40,
245-256) obtuvieron el conjugado a partir del
polisacárido capsular nativo y el toxoide del tétanos después de
activación con bromuro de cianógeno.
Gordon (Patente de EE.UU. nº 4.496.538) activó el
polisacárido natural con bromuro de cianógeno y después lo conjugó
con el toxoide de la difteria mediante dihidrazida del ácido
adípico.
Hilman y col. (Patente de EE.UU. nº 4.459.286)
conjugaron el polisacárido natural, mediante el ácido
6-aminocaproico, a la proteína de membrana externa
meningocócica después de su activación inicial.
En todos los procedimientos de conjugación
previos, la unión covalente se produce entre varios grupos del
polisacárido capsular y la proteína soporte.
La capacidad para inducir una inmunidad
protectora en niños depende de la estructura del conjugado. Cuando
la conjugación se realiza en el polisacárido nativo, los grupos que
participan en la unión están distribuidos aleatoriamente a lo largo
de la cadena de polisacárido, haciendo que la caracterización de
cada lote sea muy compleja.
Todas estas vacunas son muy difíciles de analizar
por procedimientos fisicoquímicos, por lo tanto la práctica habitual
es evaluar cada lote mediante estudios de inmunogenicidad en
animales experimentales. Sin embargo, el comportamiento del
conjugado es diferente en niños y en animales experimentales.
De acuerdo con los criterios de la Organización
Mundial de la Salud (OMS) de calidad estable (M. R. Holliday, C.
Jones, Biologicals, 1999, 27, 51-53) el
control de las vacunas conjugadas se debe basar en procedimientos
fisicoquímicos que demuestren la similitud entre los lotes.
Con el fin de facilitar esta tarea, las vacunas
conjugadas deben estar cada vez más definidas a nivel molecular. Una
solución alternativa a este problema es la síntesis de fragmentos de
polisacárido capsular. El procedimiento para construir el antígeno
de Haemophilus influenzae de tipo B por síntesis tiene dos
etapas principales, la síntesis del disacárido intermedio y su
oligomerización. Se han desarrollado varias estrategias para esta
síntesis.
Beuvery y col. (solicitud de patente europea EPO
0276516; patente de EE.UU. 5.034.519; Tetrahedron Lett. 28,1553,
1987) y Hoogerhout y col. (J. Carbohydr. Chem., 7, 1988,
399-416) obtuvieron mediante síntesis un fragmento
del polisacárido capsular que se reivindicaba que contenía entre 3 y
20 unidades repetitivas. Para lograr este objetivo, primero se
preparó el disacárido intermedio 2 y después, mediante química en
fase sólida o síntesis en solución, se preparó un oligómero que
contenía 6 unidades que se repetían (Elie y col., Rec. Trav.
Chim., Pays-Bas 108, 1989, 219). Los oligómeros
se conjugaron a proteínas o péptidos mediante un espaciador. El
trímero conjugado era tan inmunógeno en ratones como las vacunas
disponibles en el comercio preparadas a partir del polisacárido
capsular.
En una realización preferida que ilustraba la
ruta sintética seguida, se usó la siguiente estrategia: 1. síntesis
del ribitol, 2. acoplamiento a la ribosa, 3. introducción selectiva
de sustituyentes en la unidad de ribosa, y 4. introducción del grupo
activante de fósforo. Usando esta ruta se obtuvo el disacárido clave
2 en sólo 15 etapas de reacción.
El rendimiento global es 7% (Hermans y col.,
Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 1987, 106,
498-504). Además, este procedimiento tiene dos
inconvenientes importantes: el procedimiento incluye 11 etapas
cromatográficas y los grupos protectores del producto intermedio
clave no son los ideales para el procedimiento de
oligomerización.
En la oligomerización o segunda etapa de esta
síntesis, el procedimiento usado es la síntesis en solución
mediante la activación con fosfotriéster, que permite rendimientos
entre 70-90% por ciclo, basados en el disacárido.
El inconveniente principal de dicho procedimiento es la
imposibilidad de preparar fragmentos que contengan más de 4
unidades que se repiten, porque los rendimientos disminuyen
radicalmente. El disacárido intermedio 2 tiene tres grupos
protectores diferentes que hacen muy difícil la desprotección del
producto final. Por lo tanto, este disacárido no es el más
conveniente para la oligomerización mediante la química en fase
sólida, en la medida en que se describe la síntesis de un
hexámero.
En ensayos inmunológicos (Peters CCAM, y col,
Infect. Immunity 1991, 59, 3504-10) sólo se
describe la conjugación de un trímero al toxoide del tétanos y su
inmunogenicidad en ratones y monos.
G. Just, J. Upeslacis (solicitud de patente
europea EP 0320942, L. Chan; G. Just, Tetrahedron, 46, 1990,
151-162) también sintetizaron un fragmento del
polisacárido capsular mediante un disacárido intermedio y síntesis
de química en solución. Con el objetivo de preparar el producto
intermedio óptimo para la síntesis del antígeno, se seleccionó una
ruta diferente: 1. síntesis de ribitol, 2. síntesis de la unidad de
ribosa con grupos protectores adecuados, 3. acoplamiento de la
ribosa y el ribitol, y 4. introducción del grupo funcional activo de
fósforo.
Usando esta metodología se tiene un procedimiento
para el producto intermedio 3 como fosforamidita que presenta una
mejor selección de los grupos protectores para el procedimiento de
oligomerización. Con el fin de lograr este objetivo era necesario
un número mayor de etapas. El derivado clave se obtuvo en 19 etapas
y usando 8 procedimientos cromatográficos de purificación.
El disacárido 3 se oligomerizó en solución dando
fragmentos de polisacárido capsular que contenían 3 unidades que se
repetían, con rendimientos entre 70-90% por ciclo,
basados en el disacárido.
Kandil y col. (Syn. Lett., 1992,
555-7), Chon y col. (solicitud de patente PCT
WO93/15205 y patente de EE.UU. 5.679.352), sintetizaron un
fragmento del polisacárido capsular usando el mismo disacárido
intermedio 3 y mediante química en fase sólida, usando un soporte
de monometoxipolietilenglicol, obtuvieron fragmentos que contenían
hasta 6 unidades que se repetían, siendo el rendimiento por ciclo de
95%.
Krivan, y col. (solicitud de patente PCT
WO94/00149) y Nilsson, y col. (J. Carbohydr. Chem. 10, 1991,
1-22) obtuvieron un fragmento de 10 unidades que se
repetían con un disacárido intermedio similar y química en fase
sólida. Este fragmento se conjugó mediante un espaciador a la
adhesina de Hib. El fosfonato intermedio se obtuvo en 21 etapas con
un rendimiento global de 5%. También se necesitaron al menos 7
etapas cromatográficas. El procedimiento de oligomerización se
llevó a cabo usando H-fosfonatos y química en fase
sólida usando una resina aminada de Merrifield. El antígeno se
obtuvo por incorporación de 97-99% por ciclo.
Chiu Machado y col. (J. Carbohydr. Chem.,
13 1994, 465-474) y en la patente cubana 22424
describían un procedimiento eficaz para la síntesis de un derivado
de ribosa protegido de forma adecuada, a partir de glucosa. Usando
este derivado prepararon el disacárido clave en 20 etapas de
reacción.
Uno de los aspectos que hacen difícil la
aplicación de la síntesis a la preparación de fragmentos de Hib y su
uso en vacunas es la síntesis del disacárido intermedio.
Todos los procedimientos listados antes reflejan
el estado de la técnica de la química moderna de hidratos de
carbono, sin embargo, tienen dos inconvenientes técnicos graves
importantes. El uso de varias etapas cromatográficas a lo largo de
la síntesis que hacen que la síntesis no sea practicable a escala
industrial, y el número de etapas sintéticas que normalmente es muy
alto. El problema principal para la síntesis del disacárido en menos
etapas de reacción es la introducción de grupos bencilo en la
unidad de ribosa.
El procedimiento de oligomerización del
disacárido intermedio se podría llevar a cabo en solución, con el
grave inconveniente de que el tamaño máximo que se podría alcanzar
está limitado a 3-4 unidades que se repiten.
También se podría llevar a cabo mediante química en fase sólida. La
química en fase sólida permite preparar oligosacáridos que están en
el intervalo de 6 a 10 unidades que se repiten con rendimientos
altos por ciclo. Sin embargo, los dos problemas graves que
normalmente están presentes son que el rendimiento real es sólo de
10-15%, porque para lograr la alta incorporación de
un disacárido intermedio por ciclo normalmente se requiere un gran
exceso de disacárido, entre 3 y 10 moles equivalentes. El exceso de
disacárido se pierde durante el procedimiento. El otro problema es
que normalmente se necesitan dos derivados diferentes, uno para el
acoplamiento con el soporte sólido y el segundo para la elongación
de la cadena.
La síntesis de un fragmento de oligosacárido puro
solo que no tenga ninguna diferencia no sólo en su estructura sino
tampoco en la longitud de la cadena, es un aspecto común en todas
las publicaciones precedentes de la síntesis de antígenos de Hib, y
al mismo tiempo era uno de sus principales objetivos. Todo esto se
basaba en la suposición de que es necesario el antígeno compuesto
por una sola molécula para lograr las vacunas conjugadas
anti-Hib con más calidad estable, debido a un
control más fácil.
Se desarrollaron nuevos procedimientos para
preparar fragmentos de oligosacáridos por fragmentación de
polisacáridos naturales y también para la activación de la mezcla
de oligosacáridos por una de sus posiciones terminales.
En las patentes de EE.UU. 4.808.700; 4.761.283,
así como en Glycoconjugate J., 1989, 6,
489-498 (R. C. Seid, y col.) el polisacárido natural
se oxida con peryodato y se purifican los fragmentos obtenidos. La
mezcla de fragmentos de oligosacáridos es activada por las dos
posiciones terminales como se muestra en el siguiente esquema.
Estos oligosacáridos se conjugaron mediante una reacción de
aminación reductora a CRM 197. Como puede verse en el esquema,
ambos sitios de conjugación son diferentes. Una vez que se lleva a
cabo la conjugación, existirán al menos dos familias de
oligosacáridos conjugados con diferentes estructuras. Por otra
parte, resulta un porcentaje de oligosacáridos no bien determinado
de la unión del mismo oligosacárido a dos sitios diferentes de la
misma proteína o a dos moléculas diferentes de proteína. Todos estos
fenómenos generan heterogenicidad y hacen difícil el control.
Por otra parte, en la patente de EE.UU.
5.153.312, así como en Vaccine 1999, 17,
1251-63 (P. Constantino y col.) se describe la
hidrólisis del polisacárido natural con ácido acético y purificación
de la mezcla resultante de fragmentos de oligosacáridos. El
producto es activado por una secuencia de reacciones en las que se
introduce el espaciador por aminación reductora con etilendiamina a
pH y temperatura altos, que pueden afectar a la integridad de la
mezcla de oligosacáridos. Por otra parte, probablemente se inactiva
una parte del antígeno después de la reducción de su hemiacetal de
carbonilo como se muestra en el siguiente esquema. Además, el
derivado de amina del oligosacárido se sustituyó selectivamente con
el éster activo del ácido adípico por uno de sus grupos funcionales
terminales de éster. El otro grupo funcional éster permanece activo
para el acoplamiento a una proteína.
Las dos vacunas preparadas a partir de los
productos de fragmentación del polisacárido natural se han usado en
la práctica de la inmunización de gran cantidad de niños. Esto ha
demostrado que se puede usar el oligosacárido sin un solo tamaño, si
no más bien en un intervalo de tamaños, en la fabricación de la
vacuna conjugada frente a Hib, y al mismo tiempo, controlar
adecuadamente la reproducibilidad y calidad del producto. Incluso
aunque los conjugados obtenidos por esta ruta están más definidos
que los obtenidos por activación directa del polisacárido, es
prácticamente imposible realizar la fragmentación del polisacárido
natural seguido de la introducción de un grupo activo funcional y
lograr el mismo nivel de definición molecular y pureza en el
antígeno, que el que se puede obtener por síntesis química.
No hay ventajas evidentes en el control de las
vacunas conjugadas con el uso de un oligosacárido con un tamaño
definido o una mezcla de oligosacáridos en cuanto a tamaño pero
homogénea en cuanto al resto de la estructura. Esto se ha
demostrado con el avance experimentado por procedimientos analíticos
del estado de la técnica que hacen muy fácil determinar la
composición de la mezcla de oligosacáridos de Hib (P. Constantino, y
col., Vaccine 1999, 17, 1251-1263 y D.
Prioeti, y col., European Carbohydrate Symposium, Galway,
July 1999, PB014).
Por otra parte, no hay diferencias en el
comportamiento inmunológico entre una vacuna compuesta de una mezcla
por tamaños de oligosacáridos de Hib o de un oligosacárido de un
solo tamaño cuando el fragmento es mayor de 3 unidades que se
repiten (S. Pillai, y col., Infection and Immunity, 1991, 59,
4371-6; A. A Kandil, y col., Glycoconjugate
J., 1997, 14, 13-7 y Peters CCAM, y col.,
Infect. Immunity 1991, 59, 3504-10).
Circunstancias adicionales dificultan la
selección de un solo tamaño óptimo desde todos los puntos de vista.
Los oligosacáridos de 4-6 unidades que se repiten se
sintetizan más fácilmente y normalmente su tamaño es suficiente
para inducir una respuesta inmunitaria adecuada. Sin embargo, la
cantidad de proteína soporte necesaria para esta vacuna es muy alta
y la estabilidad del oligosacárido en la vacuna es peor debido a que
el proceso de degradación por la hidrólisis del fosfodiéster provoca
muy rápidamente un fragmento muy corto acoplado a una proteína con
menos de 4 unidades que se repiten, y por lo tanto inactivo. Los
fragmentos con un tamaño entre 8-20 unidades que se
repiten en principio son más estables porque después de degradarse a
la mitad del tamaño, el fragmento restante acoplado a la proteína
soporte será mayor de 4 unidades que se repiten. La cantidad de
proteína soporte necesaria para una dosis de vacuna también es
menor.
Sin embargo, de acuerdo con el estado de la
técnica para los oligosacáridos de Hib, es imposible la síntesis de
fragmentos de tamaño en el intervalo de 10-20 por
procedimientos en solución, y sigue siendo un reto para los
procedimientos en fase sólida. De hecho, en ejemplos previamente
descritos, los oligosacáridos de este tamaño están completamente
ausentes. Otra desventaja es la dependencia de T de la respuesta
inmunitaria, un aspecto muy importante para lograr una buena
respuesta inmunitaria en niños. La dependencia de T de un
polisacárido disminuye con el aumento de tamaño (C. Fernandez, E.
Sverremark, Cell Immunol. 1994, 153,
67-78).
En conclusión, cualquier ruta de síntesis de
antígenos de Hib que sea competitiva debe reducir el número de
etapas del disacárido clave, reducir el número de etapas
cromatográficas y especialmente aumentar significativamente los
rendimientos en los procedimientos de oligomerización.
Las mezclas de oligosacáridos obtenidas por
hidrólisis de los polisacáridos naturales contienen fracciones de
ambos intervalos de tamaños, aprovechan las ventajas de cada uno y
reducen las desventajas. Si se pudieran obtener mezclas similares
por síntesis, tendrían la ventaja de contener ambos intervalos de
tamaños. Diseñada por síntesis, esta mezcla estaría más definida y
sería más pura, y contendría el espaciador en una proporción y
posición precisas.
La presente invención se refiere en particular a
la síntesis química de mezclas de oligosacáridos obtenidos de
ribosa-ribitol-fosfato, que se usan
como principio activo en vacunas para prevenir las infecciones
producidas por Haemophilus influenzae tipo b (Hib), así como
a las vacunas que contienen dichas mezclas de oligosacáridos.
Las mezclas de oligosacáridos obtenidas por
síntesis química de la presente invención, comprenden unidades que
se repiten de fórmula
(fosfato-ribosa-ribitol)_{n}
o
(ribosa-ribitol-fosfato)_{n}
de al menos 5 compuestos de estructura A o B, que representan la
unidad que se repite del polisacárido capsular de Haemophilus
influenzae tipo b y sólo difieren en n, siendo n un valor
contenido entre 4 y 25 (n \geq 4 y \leq 25), y en los que
R_{1} o R_{2} son un espaciador para la conjugación con un
soporte, con la condición de que R_{1} = espaciador si R_{z} =
H, o R_{2} = espaciador si R_{1}= H.
Mediante la presente invención se puede obtener
por síntesis química una mezcla regular de oligosacáridos de un
tamaño bien definido y de una forma más eficaz. Esta mezcla tiene
una pureza mayor y se obtiene usando un procedimiento técnico más
sencillo. También se ha encontrado que las vacunas conjugadas
preparadas a partir de la mezcla de la invención son superiores
debido a su fabricación y control más sencillos.
Otro objetivo de la presente invención es el
procedimiento sintético para obtener la mezcla de oligosacáridos
antes mencionada, que se caracteriza por ser un procedimiento de una
etapa que consiste en una reacción de policondensación controlada
entre un disacárido intermedio clave, un espaciador y un promotor, y
que se caracteriza también por el hecho de que el tamaño medio de un
antígeno se puede controlar por la proporción de cada participante,
su orden de adición y el tiempo de reacción.
Otro objetivo de la presente invención es la
optimización del procedimiento sintético del disacárido clave
necesario para la síntesis de los oligosacáridos de Hib. La
optimización consiste en el descubrimiento de una nueva reacción de
bencilación selectiva, que aplicada al disacárido 4 permite su
transformación en el disacárido 5, con la introducción de grupos
protectores bencilo en la unidad de ribosa en una sola etapa,
haciendo que el procedimiento entero sea significativamente más
corto y más sencillo.
El objetivo de la presente invención también es
el procedimiento óptimo para la síntesis del producto intermedio 4,
que permite su preparación con alta pureza en sólo 11 etapas de
reacción y sin usar procedimientos cromatográficos.
Otro objetivo de la presente invención es el uso
de los oligosacáridos previamente descritos, en la detección y
cuantificación de anticuerpos anti-Hib mediante sus
conjugados con sustancias inmunológicamente inertes como
poliacrilamida, poliestireno, látex.
La novedad de la presente invención es la
composición de la mezcla de oligosacáridos obtenida, que responde a
la unidad que se repite del polisacárido capsular de Haemophilus
influenzae tipo b con un espaciador para la conjugación en sólo
una de sus posiciones terminales, en una posición previamente
diseñada en la síntesis. Responde a la misma estructura regular y
homogénea. La mezcla de oligosacáridos contiene fragmentos de dos
intervalos de tamaños diferentes, principalmente entre
4-8 y 8-20, consiguiendo las
ventajas de cada intervalo y reduciendo las desventajas que podría
tener cada grupo por separado.
Además, la novedad de la presente invención está
en el propio procedimiento de preparación de dicha mezcla por
síntesis química, permitiendo preparar el producto con una alta
reproducibilidad y eficacia. De la misma forma, mediante la presente
invención se demuestra que sólo una reacción permite la introducción
de los grupos protectores bencilo en la unidad de ribosa en una sola
etapa, aumentando la eficacia en la preparación de un derivado de
disacárido clave para la síntesis de dichos oligosacáridos.
La síntesis de un disacárido intermedio empieza
con la preparación de un derivado de
5-O-alil-2,3,4-tri-O-bencil-D-ribitol
14 mediante 9 reacciones químicas representadas en el siguiente
esquema. La D-ribosa se transformó en el derivado de
isopropilideno 6 siguiendo el procedimiento descrito en la técnica
(Leonart y col., J. Het. Chem., 1966, 3, 485). La posición 5
se aliló con bromuro de alilo en condiciones de transferencia de
fase, seguido de hidrólisis del grupo isopropilideno con ácido
sulfúrico en metanol para proporcionar el derivado 8, que se sometió
a bencilación con cloruro de bencilo e hidruro sódico en
dimetilformamida.
El grupo metilo se hidrolizó con una mezcla de
ácido acético y ácido clorhídrico seguido de reducción con
borohidruro sódico. El derivado
5-O-alil-2,3-di-O-bencil-D-ribitol
11 se adsorbió en gel de sílice y se extrajo selectivamente gracias
a un procedimiento de percolación, primero con ciclohexano y después
con cloroformo. Este procedimiento permite la purificación a gran
escala, sin apelar a métodos cromatográficos convencionales.
Además, el derivado 11 se tritiló en piridina, se
benciló con cloruro de bencilo e hidruro sódico en dimetilformamida
y finalmente se hidrolizó con ácido acético para dar el derivado de
ribitol final que se purificó por destilación. El derivado de
ribitol 14 se ribosiló con un peracetato de ribofuranosa 15 como se
muestra en el siguiente esquema. Después, la desacetilación seguida
de una nueva aplicación de un procedimiento de
absorción-desorción permite obtener el triol 4 a
gran escala, sin ninguna etapa cromatográfica convencional.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después, se aplica la reacción de dibencilación
descubierta en el marco de la presente invención al triol 4. Esta
reacción permite obtener el derivado 5 después de un procedimiento
de purificación por cromatografía en columna. El grupo alilo del
producto intermedio 5 se isomerizó a propenilo seguido de la
introducción de fosfonato en la posición 3 libre de la unidad de
ribosa. La eliminación del grupo propenilo dio el derivado
intermedio 19. De una forma similar, la acetilación de la función
hiroxi en la posición 3 en un derivado 17, seguido de hidrólisis
del propenilo, introducción del fosfonato en la posición 5 y
desacetilación del producto, conduce al disacárido clave 23 que
tiene un fosfonato en la posición 5 y un grupo funcional hidroxi
libre en la posición 3.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
La estructura de los productos formados se
confirmó en todos los casos por resonancia magnética nuclear de
^{1}H y ^{13}C y por experimentos de correlación
H-H y H-X. La pureza se controló por
cromatografía en capa fina o por HPLC.
Partiendo de los derivados 18 ó 22, se pueden
obtener los derivados 24 y 25 usados también como aceptores en la
reacción de policondensación como se mostrará.
Se estudió la reacción de oligomerización en
diferentes condiciones, siempre basándose en sólo tres componentes,
un disacárido clave (19 o su análogo 23), un promotor de la reacción
que puede ser cloruro de pivaloilo, cloruro de
adamantan-1-carbonilo u otro cloruro
de ácido con impedimento estérico, y un tercer componente que
inactiva la reacción y al mismo tiempo introduce el espaciador. Este
componente contiene el grupo funcional activo o su precursor en una
posición terminal, tal como por ejemplo en 24, 25 ó 26.
Como espaciador, que en el caso de 24, 25 ó 26 es
5-azido-3-oxapentanol,
se pueden usar cualesquiera otros compuestos con la fórmula global
R_{1}-Y-OH, donde Y es la cadena
espaciadora que puede ser una cadena alifática. La cadena alifática
puede incluir una cadena aromática insertada en ella o una serie de
heteroátomos que oscila entre 0-5. R_{1} es un
grupo funcional en la posición terminal del espaciador, y puede ser
NH_{2}, COOR, CHO, SH o cualquiera de sus precursores.
Se desarrollaron las condiciones óptimas para el
procedimiento de policondensación para varios casos, por ejemplo,
con el disacárido 19, el espaciador
5-azido-3-oxapentanol
26 y cloruro de pivaloilo en diclorometano-piridina
se obtiene un producto. Los oligómeros 27 contenidos en una fracción
se pueden obtener con un rendimiento de 70-85%
basado en el disacárido después de oxidación y cromatografía en gel
H-20 en LH-20 en metanol.
La mezcla de oligosacáridos 27 se hidrogenó en
metanol-acetato de etilo-agua-ácido
acético en presencia de paladio sobre carbón para dar la mezcla
bruta de oligosacáridos 28. Si es necesario activar el grupo
espaciador, el procedimiento se lleva a cabo mejor en la siguiente
etapa. Por ejemplo, a la mezcla de oligómeros 28 se añadió éster de
N-hidroxisuccinimidilo del ácido
\beta-maleimidopropiónico en dimetilformamida.
Cuando terminó la reacción, la solución resultante se diluyó con
agua destilada y se diafiltró con presión de nitrógeno a través de
una membrana con un valor de corte de 1000. El producto 30 así
obtenido es una mezcla activa de oligosacáridos lista para usar en
el procedimiento de conjugación.
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La estructura de los productos formados se
confirmó en todos los casos por resonancia magnética nuclear de
^{1}H y ^{13}C y por experimentos de correlación
H-H y H-X.
Las proteínas se derivatizaron con ácido
tiopropiónico mediante introducción de tiol enmascarado como
bisulfuro. Para esta derivatización, se pueden usar reactivos como
SPDP o DSP seguido de reacción con ditiotreitol en atmósfera de
nitrógeno. El exceso de reactivos para la OMP de Neisserica
meningitidis o para el toxoide del tétanos, se puede eliminar
por precipitación con etanol acuoso (20-95%) seguido
de centrifugación. Para la OMP de Neisserica meningitidis se
llevó a cabo el procedimiento ilustrado en el siguiente esquema.
La proteína tiolizada se mezcló en atmósfera
inerte con el oligosacárido activo, previamente filtrado a través de
0,2 micrómetros y liofilizado. La reacción se inactivó por
precipitación con etanol seguido de centrifugación o
diafiltración.
Alternativamente, el exceso de reactivos
activantes se puede eliminar del conjugado por diafiltración. Ambos
procedimientos de separación eliminan prácticamente todo el
oligosacárido no conjugado de la proteína, haciendo que la calidad
del producto final sea muy estable.
La mezcla de oligosacáridos 30 se puede conjugar
a otro soporte, por ejemplo lípidos. Así, por ejemplo, la reacción
con butanodioato de
2,3-di-octadeciloxipropilo y
succinimidilo 33 en presencia de carbodiimida permite obtener el
conjugado 34
El conjugado de la mezcla de oligosacáridos
sintéticos y proteínas se puede diluir o reconstituir en un tampón
fisiológico adecuado y se puede mezclar con aditivos como
adyuvantes, conservantes y otros con el objetivo de obtener la
formulación de vacuna final.
Igualmente, la vacuna se puede mezclar antes o
durante el procedimiento de formulación con otras vacunas del tipo
usado actualmente en el programa de inmunización de niños menores de
un año. Por ejemplo, mezclando con las proteínas de membrana
externa de Neisserica meningitidis tipo B (OMP) se puede
conformar una vacuna combinada anti-Hib y
antimeningitis tipo B. Después de mezclar con DTP, se puede obtener
una vacuna tetravalente combinada anti-Hib y
anti-difteria, tosferina y tétanos.
La inmunogenicidad de la vacuna conjugada de los
oligosacáridos 30 y proteínas de membrana externa meningocócicas se
demostró en varios modelos animales. La presencia de anticuerpos
contra el polisacárido capsular Hib inducidos por la vacuna se
detectó usando el procedimiento ELISA (D.C. Phipps y col., J.
Immunolog. Methods, 1990, 135, 121-8). Los
resultados se muestran en las Figuras 2-5.
En conejos, la vacuna formulada sin alúmina
induce una respuesta mayor en la primera dosis, sin embargo, ambas
preparaciones se hacen iguales después de la segunda dosis. En ambos
casos se observó un título de anticuerpos alto.
En el ejemplo de ratas
Sprague-Dawley, la vacuna preparada a partir de dos
conjugados que difieren en la proporción de hidratos de
carbonos-proteína, mostró también un título de
anticuerpos anti-Hib alto.
En ratones Balb c, la vacuna obtenida de un
conjugado similar indujo un título de anticuerpos de polisacárido
anticapsular alto.
La mezcla de oligosacáridos 30 se puede acoplar a
matrices, como por ejemplo, poliacrilamidas. El producto se puede
usar para detectar anticuerpos anti-Hib en seres
humanos inmunizados o en animales de laboratorio. La mezcla también
se puede acoplar a látex y usarse en la detección de anticuerpos en
gente enferma o vacunada. La poliacrilamida activada de acuerdo con
N. Bovin (Glycoconjugate J., 1998, 15,
431-446) se hizo reaccionar con una mezcla de
oligosacáridos 30. La capacidad comparativa de
HbO-HSA, la sustancia recomendada para la detección
de anticuerpos anti-Hib, y el conjugado de
poliacrilamida de 30 se muestran en la Figura 6. Se logró una
relación respuesta-ruido mejor con el producto que
contenía los oligosacáridos sintéticos.
Alilación. Se disolvieron 100 g de
metil-2,3-O-isopropiliden-D-ribofuranósido
en 70 ml de bromuro de alilo y se agitaron en presencia de 75 ml de
hidróxido sódico acuoso al 50% y 2,6 g de yoduro de tetrabutilamonio
durante 12 h. Después de este tiempo, se paró la agitación y se
separaron las fases. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (70
ml) y las fases orgánicas juntas se secaron y evaporaron.
Hidrólisis. El jarabe resultante se
disolvió en 1,5 litros de metanol. A esta solución se añadieron 3,6
ml de ácido sulfúrico acuoso (0,4 N) y la mezcla se calentó a
reflujo durante 3 horas. Cuando terminó la reacción, se neutralizó
con bicarbonato sódico, las sales resultantes se filtraron y se
evaporó la solución. El residuo se extrajo con acetato de etilo, se
secó y evaporó. El producto se secó a vacío durante al menos 2
horas.
Bencilación.El producto obtenido se
disolvió en 450 ml de dimetilformamida. La solución resultante se
enfrió a 0ºC y se añadieron lentamente 50 g de hidruro sódico. La
mezcla se agitó durante 30 min y después se añadió gota a gota
cloruro de bencilo (150 ml). Después de 2 horas de agitación, se
añadieron a la reacción gota a gota 20 ml de metanol. La suspensión
resultante se evaporó a vacío, se volvió a disolver en diclorometano
y se lavó con agua. La fase orgánica se secó son sulfato sódico y se
evaporó.
Hidrólisis. El jarabe resultante de la
reacción previa se disolvió en 1,5 litros de dioxano. Se añadió HCl
(2 N, 1,5 litros) y el sistema se calentó a 75-80ºC.
Después de 2 horas, la reacción se paró y se separaron las fases. La
fase acuosa se extrajo dos veces con 200 ml de diclorometano y las
fases orgánicas juntas se evaporaron. El producto concentrado se
disolvió en diclorometano (1 litro) y se lavó sucesivamente con
agua (400 ml), solución saturada de bicarbonato sódico (300 ml) y
agua (400 ml), y finalmente se secó con sulfato sódico y se
evaporó.
Reducción. El jarabe resultante se
disolvió en etanol (800 ml) y el sistema se enfrió a 20ºC. Después
se añadieron 24 g de NaBH_{4}. La mezcla se agitó durante 1,5
horas a temperatura ambiente y cuando se terminó la reacción el
exceso de borohidruro se destruyó con ácido acético hasta alcanzar
pH 7-8. La solución se filtró y evaporó. El residuo
se disolvió en 500 ml de diclorometano, la solución orgánica se lavó
con agua, se secó con sulfato sódico y se usó en el siguiente
ejemplo.
A la solución en diclorometano del
5-O-alil-2,3-di-O-bencil-D-ribitol
11 del ejemplo anterior, se añadieron 300 g de gel de sílice y la
mezcla se agitó manualmente hasta que el producto se adsorbió en la
fase sólida. La suspensión se evaporó a vacío para eliminar el
diclorometano. El gel de sílice que contenía el producto se puso en
un percolador. Se separaron las impurezas por extracción con
ciclohexano durante 48 horas. El disolvente de extracción se cambió
a diclorometano para la extracción del producto dando un jarabe
amarillo pálido puro por cromatografía. Rendimiento
75-95%. RMN ^{13}C \delta 60,7
(C-1), 70,2 (C-4), 71,0, 71,7, 72,0,
73,6 (PhCH_{2}C-5, OCH_{2}CH=), 79,2, 79,3
(C-2,3), 117,1 (CH_{2}=),
127,5-128,2 (Ph), 134,3 (CH=), 138,0, 138,1
(Cipso).
Tritilación.-Se secaron a vacío 100 g de
5-O-alil-2,3-di-O-bencil-D-ribitol
11 del ejemplo previo y se disolvieron en 600 ml de piridina. A esta
solución se añadieron 75 g de clorotrifenilmetano y 0,5 g de
dimetilaminopiridina y la mezcla se agitó a 50ºC durante 6 horas.
Una vez terminada la reacción, se evaporó el disolvente y el residuo
se disolvió en 500 ml de diclorometano, la solución se lavó con agua
(1 litro), se secó y se evaporó. El residuo se secó a vacío durante
3 horas.
Bencilación.- El jarabe de la reacción
previa se disolvió en 300 ml de dimetilformamida y la solución se
enfrió a 5ºC. Se añadió lentamente hidruro sódico (25 g) y se
continuó agitando durante 30 minutos. Después se añadió lentamente
cloruro de bencilo (40 ml) y se mantuvo la agitación durante 1 h.
Después de terminar la reacción, se volvió a enfriar y se añadieron
lentamente 10 ml de metanol con el fin de destruir el exceso de
reactivos. La fase orgánica se secó con sulfato sódico y se
evaporó.
Hidrólisis.- El residuo se disolvió en
ácido acético (1 litro) y 110 ml de agua, y la reacción se agitó a
80ºC durante 1,5 horas. Se eliminó el disolvente por evaporación y
el residuo se disolvió en 500 ml de ciclohexano. La fase orgánica se
enfrió a 0-5ºC durante 4 horas, y después se filtró,
se lavó con agua, se secó sobre sulfato sódico y se evaporó. El
producto se obtuvo puro por destilación a 200-220ºC
y 0,1 mm. Rendimiento 80-90 g basado en 100 g de
ribosa. RMN ^{13}C \delta 61,2 (C-1), 69,6,
71,8, 72,1, 72,3, 73,9 (PhCH_{2}C-5,
OCH_{2}CH=), 78,0, 78,8, 78,9 (C-2,3,4), 116,8
(CH_{2}=), 127,5-128,2 (Ph), 134,7 (CH=), 138,0,
138,1, 138,2 (Cipso).
Glicosilación.- El producto del ejemplo
previo (370 g) se disolvió en 2,7 litros de dicloroetano seco y se
transfirió a un reactor. La solución se enfrió a
0-25ºC, se añadieron tamices moleculares en polvo de
4 \ring{A} (207 g) y después de 15 minutos se añadió lentamente
eterato de trifluoruro de boro (407 ml) a 15 ml/min. Finalmente se
añadió lentamente peracetato de D-ribofuranosa 15
(370 g) disuelto en dicloroetano seco (1 litro) durante 20 min. La
reacción se agitó durante 3 horas y se vigiló por TLC con
hexanos/acetato de etilo (2/1). Las placas se revelaron con
H_{2}SO_{4}(ac) al 5% en etanol. Una vez terminada la
reacción, se neutralizó con trietilamina (222 ml) hasta pH 7 y
después con una solución saturada de bicarbonato sódico (800 ml) y
se continuó agitando durante 30 minutos. El pH de la reacción se
debe mantener neutro. El contenido del reactor se filtró a vacío. El
sólido se lavó dos veces con dicloroetano (200 ml) para extraer
cualquier producto que quedara en el sólido. La fase sólida se
descartó y la fase orgánica se extrajo dos veces con 600 ml de agua,
se secó con sulfato sódico y se evaporó a vacío.
Desacetilación.- Al jarabe resultante de
la reacción previa disuelto en metanol (2 litros), se añadió una
solución de metóxido sódico (1%) en metanol hasta alcanzar pH 9. La
reacción se continuó hasta casi 2 horas. Una vez acabada, la
reacción se neutralizó con resina ácida hasta alcanzar pH
6-7. La resina se eliminó por filtración a vacío. El
jarabe (427 g) contenía el producto deseado junto con
5-O-Alil-2,3,4-tri-O-bencil-D-ribitol,
D-Ribosa y otras impurezas no determinadas.
El jarabe del ejemplo previo se disolvió en
diclorometano (1 litro). Se añadió a la solución gel de sílice (1
kg) y la mezcla se agitó manualmente hasta que el producto se
adsorbió en la fase sólida. La suspensión se evaporó a vacío para
eliminar el diclorometano. El sólido resultante se secó a vacío
durante 2 horas para eliminar cualquier traza de diclorometano.
El gel de sílice que contenía el producto se puso
en un percolador. Las impurezas se separaron por extracción con
ciclohexano durante 48 h. El disolvente de extracción se cambió a
cloroformo para la extracción del producto, dando un jarabe amarillo
pálido. Rendimiento 238 g. RMN ^{1}H \delta 5,85 (m, 1H, CH=),
5,20 (m, 2H, CH_{2}=), 4,85 (s, 1H, H-1').
^{13}C d 62,8 (C-5'), 77,7, 77,9, 78,2
(C-2,3,4), 84,0 (C-4'), 107,2
(C-1').
Bencilación.- Los compuestos (200 g)
resultantes del ejemplo previo se disolvieron en tolueno (2 litros).
A esta solución se añadió Bu_{2}SnO (80 g) y la mezcla se calentó
a reflujo durante 4 horas. Se añadió NaH al 50% (56 g) en porciones
pequeñas a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó a 80ºC durante
30 minutos. Se añadió yoduro de tetrabutilamonio (62 g) y la mezcla
se agitó otra vez durante 1 hora. Después se añadió cloruro de
bencilo (148 ml) y la reacción se continuó agitando a 80ºC durante
varias horas. Se repitieron adiciones similares de cloruro de
bencilo a intervalos de 30 min hasta que la TLC (hexano/acetato de
etilo - 2/1) mostró un producto mayoritario que consistía en un
disacárido dibencilado. La reacción se enfrió y neutralizó con una
solución de HCl al 1% en metanol. Después se filtró la reacción a
través de celita y se evaporó a presión reducida. El producto
resultante que contenía algunas sales se disolvió en acetato de
etilo, se filtró a presión reducida y se concentró. El jarabe bruto
se purificó por cromatografía en columna en un sistema de disolvente
de tolueno-acetona 60/1. Se obtuvo el compuesto 5
puro en forma de un jarabe (100 g). RMN ^{1}H \delta 5,96 (m,
1H, -CH=), 5,18 (m, 2H, CH_{2}=), 5,02 (s, 1H,
H-1).
Isomerización del grupo alilo.- Se secaron
con alto vacío 20 g del jarabe resultante del ejemplo previo durante
2 horas. El jarabe se disolvió en dimetilsulfóxido seco (100 ml) y
se añadió t-butóxido potásico (6,4 g). La reacción
se agitó a 100ºC durante 1 hora y después se añadió a 250 ml de agua
helada. Se añadió gota a gota ácido clorhídrico concentrado para
alcanzar pH 7. La mezcla se extrajo 3 veces con 80 ml de éter
dietílico. Las fases orgánicas se mezclaron, se secaron sobre
sulfato sódico y se evaporaron.
Fosforilación.- Una solución de imidazol
(1,5 g) en acetonitrilo seco (34 ml) se enfrió a 0ºC. Se añadieron
tricloruro de fósforo (0,56 ml) y trietilamina (3,1 ml). La solución
resultante se agitó durante 15 minutos. Se añadió el disacárido de
la reacción previa a esta mezcla disuelto en acetonitrilo seco (3
ml). La mezcla resultante se agitó durante 15 minutos a temperatura
ambiente y se paró por adición de una solución 1 M de bromuro de
trietilamonio. Se continuó agitando durante 10 minutos, se añadió
diclorometano y se separaron las fases. La fase orgánica se lavó
con solución fría de bicarbonato de trietilamonio, se secó y
evaporó.
Hidrólisis del grupo propenilo.- El
producto se disolvió en ácido acético al 60% y se agitó a 70ºC
durante 30 minutos. El disolvente se separó por evaporación y el
producto se disolvió en diclorometano, se lavó con bicarbonato de
trietilamonio, se secó y evaporó. La cromatografía en columna del
producto resultante dio el compuesto puro con un rendimiento entre
70-85%. RMN ^{1}H \delta 6,85 (d,
H-P), 4,95 (s, H-1), 4,60 (m,
H-3), 2,93 (q, NCH_{2}CH_{3}) 1,20 (t,
NCH_{2}CH_{3}), ^{13}C \delta 105,9
(C-1).
A una solución del compuesto 19 (1 g) en
piridina-trietilamina (10-1, 1 ml)
se añadió cloruro de trimetilacetilo (0,14 ml) y la reacción se
agitó durante 20 minutos. Se añadió el espaciador 26 (29,2 mg) y
otra cantidad de cloruro trimetilacetilo (0,9 ml) y la reacción se
agitó durante 1 hora. Se añadió una solución de I_{2} (1,1 g) en
piridina-agua (7,3 ml; 20-1) y la
reacción se agitó durante 30 minutos. La mezcla se diluyó con
diclorometano, se lavó con soluciones de tiosulfato sódico (1 M) y
con una solución fría de bromuro de trietilamonio (0,5 M), después
se secó con sulfato sódico y se evaporó. El producto resultante se
disolvió en metanol y se cromatografió en una columna de Sephadex
LH-20 en el mismo disolvente. Las fracciones que
contenían los oligómeros se mezclaron y evaporaron. Rendimiento
80%.
A una solución del compuesto 19 (1 g) y el
espaciador 26 (14,6 mg) en piridina-trietilamina
(10-1, 1 ml) se añadió cloruro de trimetilacetilo
(0,23 ml) y la reacción se agitó durante 2 horas. Se añadió una
solución de I_{2} (1,1 g) en piridina-agua (7,3
ml; 20-1) y el producto se trató de una forma
similar al ejemplo 8.
A una solución del compuesto 19 (1 g) y el
espaciador 24 (29,2 mg) en piridina-trietilamina
(10-1, 1 ml) se añadió cloruro de trimetilacetilo
(0,23 ml) y la reacción se agitó durante 2 horas. Se añadió una
solución de I_{2} (1,1 g) en piridina-agua (7,3
ml; 20-1) y el producto se trató de una forma
similar al ejemplo 8.
A una solución del compuesto 23 (1 g) y el
espaciador 26 (29,2 mg) en piridina (1 ml) se añadió cloruro de
trimetilacetilo (0,23 ml) y la reacción se agitó durante 2 horas. Se
añadió una solución de I_{2} (1,1 g) en
piridina-agua (7,3 ml; 20-1) y el
producto se trató de una forma similar al ejemplo 8.
A una solución del compuesto 19 (1 g) y el
espaciador 24 (29,2 mg) en piridina (1 ml) se añadió cloruro de
trimetilacetilo (0,23 ml) y la reacción se agitó durante 2 horas. Se
añadió una solución de I_{2} (1,1 g) en
piridina-agua (7,3 ml; 20-1) y el
producto se trató de una forma similar al ejemplo 8.
El producto bruto de los ejemplos previos
8-12 se hidrogenó en una mezcla de acetato de
etilo-etanol-agua-ácido acético
(1-2-2-0,1) con
paladio sobre carbón al 10%. Finalmente el producto se purificó por
cromatografía de intercambio iónico en sephadex C-25
Na. El producto liofilizado se caracterizó por RMN y mostró la
unidad básica que se repetía de
Rib-Rib-fosfato y el espaciador. Se
obtuvieron las fracciones activas después de un procedimiento de
diafiltración y ultrafiltración, primero con una membrana de valor
de corte 1000 y el retenido con una membrana de valor de corte
10000. Las soluciones que pasaron por la membrana de 10000 se
juntaron y liofilizaron dando el producto final 28 con un
rendimiento global que dependiendo de las condiciones de reacción
estaba entre 20-80% basado en el disacárido de
partida. RMN ^{1}H \delta 5,12 (H-1), 4,60
(H-3), 3,29 (CH_{2}NH_{2}). ^{31}P \delta
2,14 (espac-P-Rib) 0,74
(Ribitol-P-Rib).
A una solución del ejemplo previo (3,34 mg, 1,73
\mumol) en agua bidestilada (0,1 ml), se añadieron 0,7 mg (2,62
\mumol) de \beta-maleimidopropionato de
N-hidroxisuccinimidilo 27 disuelto en
N,N-dimetilformamida (0,4 ml). Después de 4 horas de
reacción, la solución se evaporó a vacío, se volvió a suspender en
agua destilada (0,5 ml) y se centrifugó (10 minutos, 3500 rpm). El
líquido sobrenadante se diluyó con agua y se ultrafiltró en un
equipo Amicon con una membrana de valor de corte 1000. El retenido
se liofilizó. Los rendimientos están entre 85 y 95%. RMN: ^{1}H,
\delta 6,95 (s, 2H, CH=CH), 5,01 (s, H-1) 3,41 (t,
2H, CH_{2}NH), 2,56 (t, 2H, CH_{2}a).
Los productos de los ejemplos
8-12 se hidrogenaron y se analizaron en forma de
sales de sodio por cromatografía de intercambio iónico en una
columna mono Q HR5/5 con un gradiente lineal de cloruro sódico (P.
Constantino, y col., Vaccine 1999, 17,
1251-1263). El perfil de elución cromatográfico del
ejemplo 8 está representado en la Figura 1B y muestra fragmentos de
diferentes tamaños. Si se comparan con los resultados descritos en
la bibliografía y en la Figura 1A que representa un cromatograma de
un pentámero, se puede concluir que en la mezcla se encuentran
representados fragmentos de 4-5 unidades que se
repiten a más de 20.
Se disolvieron 400 mg del complejo de proteína de
membrana externa de Neisseria meningitidis(OMPC) en 80 ml de
tampón de PBS pH 8 previamente lavado por barrido con N_{2} (g).
La solución se lavó por barrido con N_{2} (g) durante 5 minutos
mientras se agitaba en un baño de agua helada. Se añadieron 1,6 ml
de solución de DSP en dimetilformamida y la mezcla se agitó
suavemente a 4ºC durante 2 h. Se añadieron 1,6 ml de solución de DTT
en PBS y se continuó agitando a 4ºC durante 1 hora. La suspensión
resultante se transfirió a un matraz de centrífuga que contenía
20-400 ml de etanol frío. El matraz se centrifugó a
1800 rpm y 4ºC durante 30 minutos y se descartó el líquido
sobrenadante. Se añadió otra porción de etanol al sólido y se volvió
a repetir el procedimiento de centrifugación después de añadir
200-400 ml de etanol. El precipitado se volvió a
suspender en 80 ml de tampón de PBS pH = 7-9. A la
solución resultante se añadió el oligosacárido sintético 30 y se
continuó agitando durante 1-48 horas. Una vez
terminado el procedimiento, se repitieron las operaciones de
precipitación con etanol-centrifugación seguido de
una diafiltración usando una membrana de valor de corte 30.000. El
retenido se reconstituyó en un tampón de PBS hasta una concentración
de Hib de 40-80 \mug por ml.
Una solución del toxoide del tétanos con una
concentración de 5 mg/ml en PBS pH 8 se burbujeó con N_{2} (g)
durante 5 minutos. Mientras se mantenía la agitación en un baño de
agua helada, se añadieron 1,6 ml de solución de DSP en
dimetilformamida y la mezcla se agitó suavemente a 4ºC durante 2
horas. Se añadieron 1,6 ml de solución de DTT en PBS y se continuó
agitando a 4ºC durante 1 hora. La solución resultante se transfirió
a un equipo de ultrafiltración con una membrana de valor de corte
10000. La solución se diafiltró varias veces añadiendo tampón
reciente previamente burbujeado con N_{2} (g) hasta que la
solución que pasaba por la membrana dio negativa la prueba de Elman.
A la solución resultante se añadió el oligosacárido sintético 30 y
se continuó agitando durante 1-48 horas. Una vez
terminado el procedimiento, la solución se volvió a diafiltrar hasta
que la solución que pasaba por la membrana dio negativa la prueba de
fenol-sulfúrico para azúcares. Finalmente la
solución se reconstituyó en tampón de PBS hasta una concentración de
Hib de 40-80 \mug por ml.
El producto del ejemplo 8 (10 mg) se disolvió en
1 ml de dimetilformamida y se añadió a una solución de hemisuccinato
de dioctadecil-glicerol en forma de éster de
N-hidroxisuccinimida 31. Se añadió a la solución
etil-diaminopropilcarbodiimida (5 mg) y la reacción
se agitó durante 6 horas. Se añadió una nueva porción de
carbodiimida y se continuó agitando durante 6 horas. Se evaporó el
disolvente y la mezcla se aplicó a una columna de gel de sílice C18
(1 g). La elución con agua separó el oligosacárido. El producto de
eluyó con una concentración con gradiente de
metanol-agua. Rendimiento 85%. RMN ^{1}H \delta
5,12 (H-1), 4,60 (H-3), 3,40
(CH_{2}NH), 1,30 (CH_{2}), 0,90 (CH_{3}).
El inmunógeno del ejemplo 16 disuelto en un
tampón de fosfato con una concentración de 40 \mug por ml, se
diluyó en condiciones asépticas a 4-8ºC con una
solución de agua bidestilada. La suspensión se agitó durante 10
minutos. La concentración final del antígeno de Hib se determinó
calculando la ribosa y las proteínas totales y se podía reajustar
añadiendo más solución tampón hasta una concentración final del
antígeno de 20 mg por ml. Se añadió tiomersal hasta una
concentración final de 0,1-0,001%. La suspensión
resultante es la suspensión a granel final de una vacuna de
conjugado anti-Hib sin adyuvante.
El inmunógeno del ejemplo 16 disuelto en un
tampón de fosfato con una concentración de 40 \mug por ml, se
mezcló en condiciones asépticas a 4-6ºC con un
volumen igual de alúmina 1-0,01 \mug por ml en
agua destilada. La agitación se mantuvo durante 20 min a
4-8ºC. La concentración final de Hib se determinó
calculando la ribosa y las proteínas totales y se podía reajustar
añadiendo más solución tampón hasta una concentración final de
antígeno de Hib de 20 mg por ml. Se añadió tiomersal hasta una
concentración final de 0,1-0,001%. La suspensión
resultante es la suspensión a granel final de una vacuna conjugada
anti-Hib en alúmina.
El inmunógeno del ejemplo 16 disuelto en un
tampón de fosfato con una concentración de 80 \mug por ml, se
mezcló en condiciones asépticas a 4-6ºC con una
solución a granel de complejo de proteína de membrana externa (OMPC)
de Neisseria meningiditis tipo B usada habitualmente en
VAMENGOC BC con una concentración en PBS de 100-200
mg por ml. Después de 20 minutos de homogeneización con agitación
magnética suave, el contenido de la reacción se mezcló con un
volumen igual de alúmina 1-0,01 mg por ml en agua
destilada. La agitación se mantuvo durante 20 min a
4-6ºC. La concentración final del antígeno de Hib se
determinó calculando la ribosa y las proteínas totales por el método
de Lowry, y se podía reajustar añadiendo más solución tampón hasta
una concentración final de antígeno de Hib de 20 mg por ml. Se
añadió tiomersal hasta una concentración final de
0,1-0,001%. La suspensión resultante es la
suspensión a granel final de un anti-Hib y
antimeningococo B combinados en alúmina.
El inmunógeno del ejemplo 16 disuelto en un
tampón de fosfato con una concentración de 80 mg por ml, se mezcló
en condiciones asépticas a 4-6ºC con una solución a
granel de de DTP con una concentración 4x. Después de 20 minutos de
homogeneización con agitación magnética suave, el contenido se
mezcló con un volumen igual de alúmina 1-0,01 mg por
ml en agua destilada. La agitación se mantuvo durante 20 min a
4-6ºC. La concentración final de Hib se determinó
calculando la ribosa y las proteínas totales por el método de Lowry,
y se podía reajustar añadiendo más solución tampón hasta una
concentración final de antígeno de Hib de 20 mg por ml. Se añadió
tiomersal hasta una concentración final de
0,1-0,001%. La suspensión resultante es la
suspensión a granel final de un anti-Hib y
anti-DTP combinados en alúmina.
La vacuna de los ejemplos 19 y 20 se inmunizaron
con una dosis de 1 \mug o 2 \mug de antígenos. Los animales
usados en estos experimentos eran conejos, ratas y ratones. Se
llevaron a cabo 2 inmunizaciones en intervalos de 4 semanas con
extracción de sangre a los 0,28 y 42 días. La sangre se recogió y
centrifugó a 3500 rpm durante 20 minutos. El suero se diluyó 10
veces y se almacenó a -40ºC.
La respuesta de los anticuerpos se midió por un
ensayo ELISA indirecto usando Hib-HSA como antígeno
de recubrimiento. Los resultados se muestran en las Figuras
2-5.
La mezcla de oligosacáridos del ejemplo 13 (10
mg) se disolvió en dimetilformamida y se añadió a una solución de
acrilato de nitrofenilo (10-30 mg) en
dimetilformamida (1 ml). Se añadieron 0,1-0,5 ml de
trietilamina y la reacción se mantuvo con agitación durante 16
horas. Se añadieron 0,1-0,5 ml de amoniaco y se
continuó agitando durante 24 horas. La solución se aplicó en una
columna de sephadex LH-20 en acetonitrilo. La
elución se llevó a cabo con acetonitrilo-agua. Se
juntaron las fracciones positivas en el ensayo de orcinol para la
ribosa y se liofilizaron. Normalmente el rendimiento es mayor de
80%.
Una solución del producto del ejemplo previo en
un tampón de carbonato-bicarbonato se aplicó con una
concentración de 1-100 \mug por ml en la mitad de
una placa de 96 pocillos. En la otra mitad de la placa se aplicó el
antígeno HbO-HSA a la concentración recomendada. Se
llevó a cabo un ensayo ELISA usando el suero de ratones inmunizados
con una vacuna que contenía el polisacárido capsular natural
acoplado con toxoide del tétanos. Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 6.
Figura 1. Cromatograma típico de las fracciones
oligómeras obtenidas en el Ejemplo 15 por cromatografía de
intercambio iónico en Mono Q HR 5/5 con un gradiente lineal de NaCl
0-500 mM, en el que A = pentámero; B = oligómero del
Ejemplo 10.
Figura 2. Respuesta de anticuerpos en conejos
inmunizados con la vacuna del Ejemplo 16.
Figura 3. Respuesta de anticuerpos en conejos
inmunizados con la vacuna del Ejemplo 15.
Figura 4. Respuesta de anticuerpos en ratas
inmunizados con la vacuna del Ejemplo 15.
Figura 5. Respuesta de anticuerpos en ratones
Balb C inmunizados con la vacuna del Ejemplo 15.
Figura 6. Capacidad del conjugado
26-PAA para detectar anticuerpos
anti-Hib.
Claims (13)
1. Procedimiento para sintetizar una mezcla de
oligosacáridos que comprende unidades que se repiten de fórmula
(fosfato-ribosa-ribitol)_{n}
o de fórmula
(ribosa-ribitol-fosfato)_{n},
en el que se lleva a cabo una reacción de policondensación en una
etapa aplicada al derivado de disacárido 19 ó 23.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en presencia de un promotor, en un
disolvente básico y con un espaciador que participa en la reacción
como un aceptor que inactiva el crecimiento de la cadena
oligómera.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el disacárido intermedio 19 ó 23 y el promotor se usan
con una relación molar de 1/1-3.
3. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2, en el que el promotor es un derivado
activado de un ácido con impedimento estérico.
4. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el promotor es cloruro de
pivaloilo, cloruro de adamantoilo o un derivado activado de un ácido
fosfórico.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el disacárido intermedio 19 ó 23 y el espaciador se
usan en una relación molar de 5-10/1.
6. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el disacárido es el producto 19,
el espaciador es el producto 24, el promotor es cloruro de pivaloilo
y el disolvente es piridina.
7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende una oxidación de
fosfonato a fosfato, seguido de hidrogenación para eliminar los
grupos bencilo protectores, desprotección o activación del
espaciador y eliminación de las fracciones que tienen menos de 4 o
más de 25 unidades que se repiten, mediante uno o varios
procedimientos de tamizado molecular, para obtener una mezcla de
oligosacáridos que comprende al menos 5 compuestos de estructura A o
B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en las que n tiene un valor de 4 a
25, R_{1} o R_{2} son un espaciador para conjugar con un
soporte, R_{1} es un espaciador cuando R_{2} = H y R_{2} es un
espaciador cuando R_{1} =
H.
\newpage
8. Procedimiento para sintetizar el disacárido
intermedio
2,3,4-tri-O-bencil-5-O-alil-(\beta-D-ribofuranosil)-D-ribitol
4 en forma pura
por ribosilación del
2,3,4-tri-O-bencil-5-O-alil-D-ribitol
con peracetato de ribofuranosa seguido de desacetilación para dar el
compuesto 4, que se puede someter a una
absorción-desorción en gel de sílice para la
purificación.
9. Procedimiento para sintetizar el disacárido
intermedio 17
que comprende la dibencilación del
disacárido 4 con óxido de dibutilestaño, yoduro de tetrabutilamonio,
hidruro sódico y cloruro de bencilo con una relación
1:0,5-2:0,001-1,
0,5-10:1-5, en un disolvente tal
como tolueno, benceno, tetrahidrofurano o xileno, para dar los
compuestos de fórmula
5,
seguido de isomerización del alilo
o
propenilo.
10. Disacárido
5-O-propenil-2,3,4-tri-O-bencil-1-O-(2',5'-di-O-bencil-\beta-D-ribofuranosil)-D-ribitol
17
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
11. Derivados de disacárido fosfonato de
2,3,4-tri-O-bencil-1-O-(2',5'-di-O-bencil-\beta-D-ribofuranosil)-D-ribitoI-5-O-trietilamonio
23 y fosfonato de
2,3,4-tri-O-bencil-1-O-(2',5'-di-O-bencil-\beta-D-ribofuranosil)-D-ribitol-3'-O-trietilamonio
19
12. Procedimiento para preparar los disacáridos
19 ó 23 partiendo del disacárido 17, que comprende fosfonilación
con tricloruro de fósforo-imidazol, seguido de
hidrólisis del grupo propenilo o acetilación, hidrólisis del grupo
propenilo, y fosfonilación con tricloruro de
fósforo-imidazol seguido de desacetilación.
13. Uso de los disacáridos 19 ó 23 para
sintetizar las mezclas de oligosacáridos que comprenden al menos 5
compuestos de estructura A o B
en las que n tiene un valor de 4 a
25, R_{1} o R_{2} es un espaciador para la conjugación con un
soporte, R_{1} es un espaciador cuando R_{2} = H y R_{2} es un
espaciador cuando R_{1}=
H.
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