CN116601163A - 受保护的二糖、它们的制备方法、它们在合成两性离子寡糖中的用途及其缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供两性离子寡糖，特别是来自宋内志贺菌(Shigella sonnei)的表面多糖片段，以及包含它们的宋内志贺菌缀合物。本发明还提供受保护的二糖、它们的制备方法、它们在合成两性离子寡糖中的用途及其缀合物，宋内志贺菌的二糖重复单元为式(I)：

Description

受保护的二糖、它们的制备方法、它们在合成两性离子寡糖中 的用途及其缀合物
技术领域
本发明提供受保护的二糖、它们的制备方法、它们在合成两性离子寡糖中的用途及其缀合物。本发明还提供两性离子寡糖，特别是来自宋内志贺菌(Shigella sonnei)的表面多糖片段，以及包含它们的宋内志贺菌缀合物。
背景技术
腹泻病是全球主要的公共卫生负担，也是5岁以下儿童的第二大死因。最近的研究已经确定志贺菌属(Shigella)是在该人群中导致中度至重度腹泻的主要病原体之一。此外，志贺菌病的全球负担被认为被低估了，多重耐药菌株的出现不利于抗生素治疗，所述抗生素治疗为解决志贺菌属负担的唯一方法。WHO在几十年前就建议利用疫苗来对抗志贺菌病，疫苗接种仍被视为一种有价值的预防干预措施。然而，尽管在临床试验中测试了多种候选疫苗，但仍然没有获得广泛许可的志贺菌属疫苗。
宋内志贺菌作为单一血清型，估计占所有志贺菌病发作的25％。它是低收入和中等收入国家中第二大常见的致病志贺菌属物种，也是高收入和转型期国家中的主要物种。旅行者腹泻的高发病率和抗生素耐药性的增强也导致对这种革兰氏阴性肠侵袭性细菌的担忧。证据表明宋内志贺菌(S.sonnei)表面多糖是防止再感染的主要保护性抗原，在针对宋内志贺菌疫苗研究的众多策略中，多糖缀合物已成为一种有前途的途径。此外，探索使用合成碳水化合物半抗原作为宋内志贺菌天然多糖抗原的替代物的可行性被设想为一种有前途的替代方案。
来自宋内志贺菌O-Ag的重复单元是一种独特的两性离子多糖(zwitterionicpolysaccharide，ZPS)，具有下式[4)-α-L-AltpNAcA-(1→3)-β-D-FucpNAc4N-(1→]：
据发明人所知，宋内志贺菌也被荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)包围。正如最近公开的那样，两种宋内志贺菌表面多糖显示出相同的两性离子重复单元。
对于其他ZPS，来自宋内志贺菌的表面多糖的两性离子特征来源于相邻的单糖单元，其在重复单元内具有交替的电荷。但是据发明人所知，宋内志贺菌ZPS是迄今为止唯一以双糖重复单元为特征的物质。所述单元由两种不常见的氨基糖组成，2-乙酰胺基-2-脱氧-L-阿卓糖醛酸(2-acetamido-2-deoxy-L-altruronic acid，L-AltpNAcA，A)和2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-D-吡喃半乳糖(2-acetamido-4-amino-2,4,6-trideoxy-D-galactopyranose，D-FucpNAc4N，AAT，B)，彼此1,2-反式连接。
尽管是整个糖组中的一个不寻常的组分，但AAT已在其他几种细菌ZPS中被鉴定出来，最常见的是α-连接的残基，例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1(Sp1)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)(PS A1)的CPS。它较少以β-形式存在，所述β-形式存在于宋内志贺菌和类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)O17中，所述类志贺邻单胞菌O17表达与宋内志贺菌相同的O-Ag，它最近在来自产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)O22(另一种腹泻病原因)的LPS和口腔链球菌(Streptococcus oralis)Uo5的脂磷壁酸中被确定出来。由于其特有的免疫调节特性，ZPS(尤其是Sp1和PS A1)及其合成片段近年来引起了人们的广泛兴趣，无论是旨在开发疫苗半抗原还是用作疫苗载体。在这种情况下，AAT已成为一个有吸引力的合成目标。
相比之下，几乎没有遇到L-AltpNAcA，据发明人所知，其最初被报道为宋内志贺菌和类志贺邻单胞菌(P.shigelloides)O17 ZPS的关键组分。除了其特殊的两性离子性质外，宋内志贺菌O-Ag的一个显著特征是在二糖重复单元中出现三个氨基，其中两个以乙酰胺形式存在。
然而，尽管包含AB二糖的化合物引起了所有兴趣，但由于除了羧酸基团以外还存在不同形式的所述三个氨基，因此它们的合成特别困难。此外，这些基团使得位点选择性缀合特别难以实现，特别是在载体和/或固体支持物上以多重方式实现。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供通用的核心前体(versatile core precursor)，其能够以高效的发散方式产生大量寡糖。
本发明的另一个目的是提供核心前体和寡糖和多糖，其能够使所述寡糖和多糖上的位点选择性缀合(即，暗示所述寡糖和多糖上的单一官能团)至载体。因此，由于本发明的核心前体和寡糖和多糖，与目标寡糖和多糖(NH2、CO2、仲OH、邻位氨基醇、邻位二醇……)上天然存在的官能团正交的缀合方法是可能的。
本发明的另一个目的是在针对宋内志贺菌相关疾病的疫苗开发以及诊断工具开发的情况下，提供一种以寡糖、多糖及其缀合物形式获得多种选定靶标的方法。
本发明的另一个目的是提供带有微调(finely tuned)保护基团的核心前体和中间体化合物，其能够：
-通过提供可以容易地转化为供体或受体的前体，与[AB]n、B[AB]n、[AB]nA和B[AB]nA序列(甚至是长序列)进行有效同源化；
-在一个或两个步骤中高效地使所有保护基团脱保护；
-使与反应性残基或目标化合物的偶联方法变得简单。
因此，在第一目的中，本发明提供一种缀合物，其包含寡糖或多糖，所述寡糖或多糖选自：
(B)x-(A-B)n-(A)y，和
(A)x-(B-A)n-(B)y，
其中：
x为0或1，
y为0或1，
n为1至50，特别是1或2至10，更特别是1或2至4或3至8，n尤其为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，
A为4)-α-L-AltpNAcA-(1→，
B为3)-β-D-FucpNAc4N-(1→，
或其药学上可接受的盐，
所述寡糖或多糖与载体结合，特别是与载体共价结合。
4)-α-L-AltpNAcA-(1→特别地是指：
3)-β-D-FucpNAc4N-(1→特别地是指：
在一个特别的实施方案中，x+y＝1。
在另一个特别的实施方案中，x＝y＝0。
在一个特别的实施方案中，n为1或2至10，更特别是1或2至4或3至8，n尤其为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
术语“缀合物(conjugate)”特别地是指共价连接至载体的寡糖或多糖。
在一个特别的实施方案中，寡糖或多糖经由所述寡糖或多糖的还原端与载体结合。因此，这种缀合是位点选择性的，并且对应于缀合物，其中载体经由单个锚定点连接至寡糖或多糖。
在一个特别的实施方案中，寡糖或多糖经由所述寡糖或多糖的非还原端与载体结合。这种缀合也是位点选择性的，并且对应于缀合物，其中载体经由单个锚定点连接至寡糖或多糖。更特别地，寡糖或多糖经由所述寡糖或多糖的B残基(例如式(B)x-(A-B)n-(A)y，其中x为1)的非还原端结合至载体。
寡糖或多糖可以在有或没有连接分子或间隔子的情况下共价结合至载体。
连接分子或间隔子不含任何碳水化合物残基；因此，它既不是碳水化合物残基，也不是寡糖或多糖化合物。优选使用连接分子将寡糖或多糖缀合至载体。在本发明中使用的接头或交联剂优选为小分子，直链或非直链的，具有大约<500道尔顿的分子量并且在最终产品形式中是无热原且无毒的，特别是在体外使用的框架内，或者当最终产品是在疫苗接种中使用的免疫原性组合物时。
有利地，除了确保产品同质性和避免微生物污染以外，合成寡糖或多糖的使用与其在载体上的位点选择性连接完全相容，从而为可控且稳健的缀合方法开辟了道路。一方面，避免了对保护重要的表位的不受控掩蔽，另一方面，可以消除缀合过程中可能形成的新表位产生的副作用。
使用合成寡糖或多糖的另一个优点是它们可以比大的异质细菌多糖以更大的摩尔量接枝。人们还可以确定发挥期望作用(即，抗原或免疫原性(如果缀合))的最小和足够的结构。
合成寡糖和多糖与蛋白质的共价连接是本领域已知的，并且可以例如通过靶向赖氨酸的ε-胺、天冬氨酸/谷氨酸的羧基、半胱氨酸或酪氨酸的巯基(sulfhydryl)来实现。反应性基团(例如胺)也可以直接或经由接头在寡糖还原末端引入，最终用于插入双官能接头以与载体缀合。
例如，寡糖或多糖可以通过马来酰亚胺基或卤代乙酰基(特别是溴乙酰基，结合至寡糖或多糖，特别是经由接头)与巯基(thiol)或NH2基团(结合至载体，特别是经由接头)的反应缀合至载体；或者可以通过马来酰亚胺基或卤代乙酰基(特别是溴乙酰基，结合至载体，特别是经由接头)与巯基或NH2(结合至寡糖或多糖，特别是经由接头)的反应缀合至载体。
为了与接头或交联剂缀合，寡糖或多糖和载体之一或两者可以首先与一个或多个接头共价结合。接头或交联剂为同型双官能团或异型双官能团分子，例如己二酰肼、乙二胺、胱胺、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-乙酰基-DL-高半胱氨酸硫内酯、N’-琥珀酰亚胺基-[N-(2-碘乙酰基)-β-丙氨酰]丙酸酯(SIAP)、3,3’-二硫代二丙酸、方酸酯及其衍生物等。
根据寡糖或多糖与载体之间的连接类型，有可能制备缀合物，其中寡糖或多糖与载体的比例可以特别地为1:1至500:1，尤其是1:1至200:1。更特别地，该比例为1:1至30:1，优选5:1至25:1，更优选8:1至30:1，或者5:1至20:1，尤其是当载体为破伤风类毒素或其片段时。
载体可以为天然的、修饰的-天然的、合成的、半合成的或重组的材料，其含有一个或多个官能团，例如伯氨基和/或仲氨基、叠氮基、巯基、炔基、烯基或羧基。载体可以为水溶性的或水不溶性的。满足这些标准的载体是本领域普通技术人员所熟知的。
根据本发明的合适的载体尤其包括蛋白质、肽、脂肽、两性离子多糖、脂质聚集体(例如油滴或脂质体)、灭活的病毒颗粒、纳米颗粒特别是金纳米颗粒(例如参考BioorganicChemistry 99(2020)103815或Nanomedicine 2012,7:651-662)、病毒样颗粒例如噬菌体Qβ(VLPs Methods Enzymol 2017；597:359-376)和膜抗原的通用模块(Generalized Modulesfor Membrane Antigens，GMMA；例如参考Vaccines 2020,8,540；Vaccines(Basel).2020年4月3日；8(2):160)。
在一个特别的实施方案中，载体为蛋白质。
在这种情况下，术语“载体(carrier)”特别地是指寡糖或多糖偶联或连接或缀合的蛋白质，通常用于增强或促进免疫系统对抗原的检测。寡糖为T非依赖性抗原，免疫原性差，不会导致长期保护性免疫反应。寡糖抗原与蛋白质载体的缀合改变了免疫效应细胞对寡糖作出反应的环境。术语载体蛋白旨在涵盖小肽和大多肽(>10kDa)。在一个特别的实施方案中，载体为免疫载体。
免疫载体为载体，其被选择用于增加寡糖或多糖的免疫原性和/或产生医学上有益的针对载体的抗体。
根据本发明的合适的免疫载体尤其包括蛋白质、糖鞘脂、肽、脂肽、含有T辅助肽(至少一种)的脂质聚集体、灭活的病毒颗粒、纳米颗粒特别是金纳米颗粒(例如在NPJVaccines 2020,5(1),8中所描述)和膜抗原的通用模块(GMMA)。
在一个特别的实施方案中，本发明的缀合物共价结合至包含至少一个T辅助表位的蛋白质或肽。
根据一个有利的实施方案，本发明的糖缀合物(glycoconjugate)共价结合至包含至少一个T辅助表位的蛋白质或肽，用作针对宋内志贺菌感染和/或由以交叉反应性碳水化合物抗原为特征的病原体引起的感染(例如类志贺邻单胞菌感染，尤其是类志贺邻单胞菌O17感染)的疫苗。
已知具有有效T辅助表位的蛋白质载体包括但不限于细菌类毒素，如破伤风、白喉和霍乱类毒素，葡萄球菌属(Staphylococcus)外毒素或类毒素，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A及其重组产生的基因解毒变体，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白(OMP)和志贺菌属蛋白。描述了重组产生的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)无毒突变株外毒素A(rEPA)，并将其用于多糖-蛋白缀合疫苗(Infect Immun 1993,61,1023-1032)。CMR197载体是一种充分表征的无毒白喉毒素突变体，可用于人用糖缀合物疫苗制剂(a)Adv Exp Med Biol1989,251,175-180；b)Vaccine1992,10,691-698)。其他示例性蛋白质载体包括破伤风毒素的片段C(WO 2005/000346、WO2005/000346)。还公开了CRM9载体用于人类免疫(Pediatr Infect Dis J 2003,22,701-706)。
有用的载体蛋白包括细菌毒素或类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。也可以使用毒素或类毒素的片段，例如破伤风类毒素的片段C(市售可得)。白喉毒素的CRM 197突变体对本发明特别有用。其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白、合成肽、热休克蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、特别用于诊断方面的人血清白蛋白(优选重组的)、通用CD4+细胞表位、特别是包含来自各种病原体衍生抗原(如N19或破伤风类毒素)的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白质(Cancer Immunol Immunother.2016,65(3),315-25)、来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白D、肺炎球菌表面蛋白PspA、肺炎球菌溶血素、铁摄取蛋白、来自艰难梭菌(Clostridium difficile)的毒素A或B、重组铜绿假单胞菌胞外蛋白A(rEPA)、GBS蛋白等，例如Micoli等人所描述(Molecules2018,23(6),1451)。
特别合适的载体蛋白包括CRM 197、破伤风类毒素(TT)、破伤风类毒素片段C、蛋白D、破伤风毒素和白喉类毒素(DT)的无毒突变体。其他合适的载体蛋白包括来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的蛋白抗原GBS80、GBS67和GBS59以及融合蛋白，例如WO2011/121576中公开的GBS59(6xD3)和EP14179945.2中公开的GBS59(6xD3)-1523。将几种志贺菌属血清型如IpaD、IpaB、MxiH及其所有可能的组合所共有的蛋白质抗原用作其他合适的载体蛋白质也可能是有利的。另一种载体可以是基因修饰的OMV(GMMA)，例如制药业开发的那些。带有免疫显性T辅助细胞表位的合成肽也可以作为多糖和寡糖缀合物中的载体。肽载体包括多肽，所述多肽含有多个解决HLA分子的广泛多态性的T辅助表位(Pediatrics1993,92,827-832)和与人类使用相容的通用T辅助表位。示例性的T辅助表位包括但不限于以破伤风类毒素为特征的天然表位(J Immunol 1992,149,717-721)和非天然表位或工程表位，如泛HLA DR结合表位PADRE(Immunity1994,1,751-761；Vaccine 2004,22(19),2362-7)。
载体还包括脂肽，例如Pam(3)CAG(Vaccine 2009,27(39),5419-26)，作为佐剂。
载体还包括两性离子多糖，例如Chem Sci 2020,11(48),13052-13059中所描述。
在本发明的一个特别的实施方案中，免疫载体选自包含至少一个T辅助表位的蛋白质或肽，或其衍生物。
衍生物在这里特别地是指包含至少一个T辅助表位的肽，其因此比相应的T辅助表位长，例如出于溶解性原因。
在一个特别的方面，免疫载体为肽PADRE。
在本发明的一个特别的实施方案中，免疫载体为破伤风类毒素(TT)或其片段，特别是TT的片段Hc。
在本发明的另一个特别的实施方案中，免疫载体为CRM 197。
在本发明的另一个特别的实施方案中，免疫载体为白喉类毒素、蛋白D(特别是流感嗜血杆菌b蛋白D)、OMV(特别是脑膜炎奈瑟菌OMV)、PADRE、重组铜绿假单胞菌胞外蛋白A(rEPA)。
如本文使用的术语“类毒素”是指细菌毒素(通常是外毒素)，其毒性已通过化学(福尔马林)或热处理灭活或抑制，而其他特性(通常是T辅助特性和/或免疫原性)被保留。如本文所使用的突变类毒素为重组细菌毒素，其已通过修改野生型氨基酸序列而被修改为毒性较低或甚至无毒性。这种突变可以是一个或多个氨基酸的取代。这种突变的类毒素在其表面上呈现出官能团，所述官能团可以与相互连接的分子的官能团反应以提供修饰的类毒素。所述官能团是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于可在还原剂的存在下与活化酯、异氰酸酯基团或醛反应的赖氨酸残基的伯氨基官能团，可被碳二亚胺活化的谷氨酸或天冬氨酸残基的羧酸酯官能团，或半胱氨酸残基的巯基官能团。
活化的酯包括但不限于N-(y-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)、N-(y-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-GMBS)、琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、己二酸二琥珀酰亚胺酯(DSA)、2-吡啶基二硫代-四氧杂十四烷-N-羟基琥珀酰亚胺(PEG-4-SPDP)、双(4-硝基苯基)己二酸酯和双(4-硝基苯基)琥珀酸酯。优选的活化酯为例如N-(y-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)、N-(y-马来酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-GMBS)、琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、琥珀酰亚胺基-3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。
载体蛋白上的半胱氨酸残基可以转化为相应的脱氢丙氨酸，所述脱氢丙氨酸可以进一步与合适的互相连接的分子反应以提供修饰的载体蛋白，其表面上具有互相连接的分子的官能团。
例如，本文所述的本发明的糖与无毒突变白喉毒素CRM197缀合，所述无毒突变白喉毒素CRM197存在赖氨酸残基的伯胺官能团作为官能团。
CRM197样野生型白喉毒素为535个氨基酸的单条多肽链(58kD)，由通过二硫键连接的两个亚基组成，具有用谷氨酸取代甘氨酸的单个氨基酸取代。它在许多已获批准的用于疾病的缀合疫苗(如Prevnar)中用作载体蛋白。
尤其优选的是，本文所述的本发明的糖与破伤风类毒素(TT)或其片段缀合，所述破伤风类毒素(TT)或其片段存在赖氨酸残基的伯胺官能团作为官能团。
尤其优选的是，本文所述的本发明的糖与CRM197缀合，所述CRM197存在赖氨酸残基的伯胺官能团作为官能团。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，载体蛋白在其表面上存在赖氨酸残基的伯氨基官能团，其能够与互相连接的分子的官能团反应以提供修饰的载体蛋白，所述修饰的载体蛋白在其表面上具有互相连接的分子的所述官能团，其能够与本发明的寡糖和多糖的Z基团反应。
互相连接的分子的所述官能团例如包含或选自马来酰亚胺、α-碘乙酰基、α-溴乙酰基、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、醛、亚胺酯、羧酸、烷基磺酸酯、磺酰氯、环氧化物、酸酐、碳酸酯。
其他类型的载体包括但不限于生物素或脂质体。与生物素或标签缀合的寡糖或多糖专门用于诊断宋内志贺菌感染。关于使用脂质体作为载体，特别是那些不暗示共价连接的载体，可以参考国际申请WO 2010/136947。
在本发明的一个特别的实施方案中，载体为生物素(作为锚)或生物素/抗生物素蛋白复合物。
在本发明的一个特别的实施方案中，载体为多价支架(scaffold)，即，能够多次呈递本发明的寡糖或多糖的载体，特别是能够形成至少两个键的支架，每个键与本发明的寡糖或多糖形成。所述多价支架为例如直链聚合物、树枝状聚合物、单糖、环状肽或(聚)-赖氨酸支架，例如MAP(多抗原肽)。
组合物可以包含少量游离载体。当指定的载体蛋白以游离和缀合形式存在于本发明的组合物中时，未缀合形式优选不超过整个组合物中载体蛋白总量的5％，更优选为小于以重量计2％。
缀合后，可以分离游离和缀合的寡糖。有许多合适的方法，包括疏水色谱法、切向超滤、渗滤等。
在一个特别的实施方案中，缀合物选自：
其中：
n为1、2、3或4；
TT为破伤风类毒素或其片段。
在另一个目的中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含根据本发明的缀合物和生理学上可接受的媒介物(vehicle)。
与缀合物相关的所有实施方案也单独或组合地适用于此。
免疫原性(或疫苗)组合物包括一种或多种药学上可接受的赋形剂或媒介物，如水、盐水、甘油或乙醇。此外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等，可以存在于此类媒介物中。
本发明的糖缀合物诱导针对宋内志贺菌感染的保护性抗体，将本发明的糖缀合物以足以预防或减轻宋内志贺菌感染的严重程度和持续时间的量施用于哺乳动物受试者，优选人。
免疫原性组合物适合施用于动物(特别是人)患者，因此包括人和兽医用途。它们可以用于提高患者免疫应答的方法，其包括将组合物施用于患者的步骤。
可以在受试者暴露于宋内志贺菌之前和/或受试者暴露于宋内志贺菌之后施用本发明的免疫原性组合物。
可以将免疫原性组合物制备成单位剂量形式。在一些实施方案中，单位剂量可以具有0.1至1.0mL的体积，例如约0.5mL。
本发明还提供一种递送装置(例如注射器、雾化器、喷雾器、吸入器、皮肤贴剂等)，其包含本发明的免疫原性组合物，例如包含单位剂量。该装置可以用于将组合物施用于脊椎动物受试者。
本发明还提供一种包含本发明的免疫原性组合物(例如包含单位剂量)的无菌容器(例如小瓶)，或多剂量无菌容器。
本发明还提供本发明的免疫原性组合物的单位剂量。
本发明还提供一种包含本发明的免疫原性组合物的密封容器。合适的容器包括例如小瓶。
可以以多种形式制备本发明的免疫原性组合物。例如，可以将免疫原性组合物制备成可注射剂型，即液体溶液或混悬剂。也可以制备适合在注射前溶解或混悬在液体媒介物中的固体形式(例如冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合物)。组合物可以制备用于局部施用，例如软膏、霜剂或粉末。组合物可以制备用于口服施用，例如片剂或胶囊、喷雾或糖浆(任选地调味)。该组合物可以制备用于肺部施用，例如通过吸入器，使用细粉末或喷雾。组合物可以制备成栓剂。组合物可以制备用于鼻、耳或眼施用，例如喷雾或滴剂。用于肌肉内施用的可注射剂型是典型的。
药物组合物可以包含有效量的佐剂，即，当以单次剂量或作为系列的一部分施用给个体时，所述量有效增强对共同施用的宋内志贺菌2型抗原的免疫应答。该量可以根据待治疗的个体的健康和身体状况、年龄、待治疗的个体的分类组(例如非人类灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、期望的保护程度、免疫原性组合物的配制、主治医生对医疗状况的评估以及其他相关因素而变化。该量将落在一个相对广泛的范围内，可以通过常规试验确定。
用于配制和施用本发明的免疫原性组合物的技术可以在"Remington'sPharmaceutical Sciences"Mack Publishing Co.,Easton PA中找到。每个疫苗剂量包含治疗有效量的寡糖或多糖缀合物。
根据本发明的一个缀合物或一个通式(I)的糖的治疗有效剂量是指导致针对疾病的至少部分免疫的化合物的量。可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学、药理学和毒理学程序来确定此类化合物的毒性和治疗功效。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数。施用的组合物的实际量将取决于待治疗的受试者、受试者的体重、病痛的严重程度、施用方式和处方医师的判断。
这种量将根据受试者合成针对寡糖或多糖的抗体的能力、期望的保护程度、所选的特定寡糖或多糖缀合物及其施用方式等因素而变化。本领域技术人员可以容易地确定合适的有效量。治疗有效量可以在宽的范围内变化，所述范围可以通过常规试验确定。
更特别地，本发明的寡糖或多糖缀合物将以治疗有效量施用，所述治疗有效量包含0.1μg至100μg，尤其是0.5μg至50μg，优选1μg至10μg寡糖或多糖。可以通过本领域技术人员已知的方法确定特定疫苗的最佳量，特别是涉及测量受试者的抗宋内志贺菌抗体滴度(更准确地说是保护性抗体滴度)的标准研究。
施用本发明的免疫原性组合物的方法是本领域技术人员熟知的。简而言之，本发明的免疫原性组合物可以单剂量或多剂量施用。发明人已经发现，施用单剂量的本发明的免疫原性组合物可能是足够的。可替代地，先施用一个单位剂量再施用第二单位剂量可能是有效的。通常，第二(或第三、第四、第五等)单位剂量与第一单位剂量相同。第二单位剂量可以在第一单位剂量后的任何合适的时间施用，特别是在1、2或3个月后。特别地，在初次施用后，受试者可以间隔约4周接受一次或两次加强注射。对于小于12月龄的婴儿，可以间隔不少于两个月施用两剂量，第一剂量不得在2月龄之前施用。本发明的免疫原性组合物可以包含一种或多种佐剂。然而，也设想使用不含佐剂的组合物，例如，省略佐剂以降低潜在的毒性可能是有利的。因此，设想了不含任何佐剂或不含任何铝盐佐剂的免疫原性组合物。
通常与糖缀合物疫苗结合的佐剂能够增强抗体应答，从而增强B应答。佐剂可以直接加入到疫苗组合物中，或者可以单独施用，与疫苗同时施用或之后不久施用。
佐剂是本领域技术人员所熟知的。例如，参考Current Opinion inImmunology2020,65:97–101。经典公认的佐剂的示例包括：
-含矿物质的组合物，包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等，其中盐可以采取任何合适的形式(例如凝胶、结晶、无定形等)。优选吸附到这些盐上。还可以将含组合物的矿物质配制成金属盐颗粒。也可以使用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。本发明可以使用任何通常用作佐剂的“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称为“氢氧化铝”的佐剂通常为羟基氧化铝盐，其通常至少部分结晶。称为“磷酸铝”的佐剂通常为羟基磷酸铝，通常还含有少量硫酸盐(即，羟基磷酸铝硫酸盐)。它们可以通过沉淀获得，沉淀过程中的反应条件和浓度影响磷酸盐对盐中羟基的取代度。氢氧化铝和磷酸铝的混合物可用于本发明的制剂中；
-皂苷，其为甾醇糖苷和三萜糖苷的异源组，存在于众多植物物种的树皮、叶、茎、根甚至花中。来自皂树(Quillaja saponaria)、莫利纳(Molina)树的树皮的皂苷已被广泛研究作为佐剂。也可以从菝葜(Smilax ornata)(菝葜(sarsaprilla))、满天星(Gypsophilla paniculata)(满天星(brides veil))和肥皂草(Saponaria oficianalis)(皂根)中市售获得皂苷。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂，如QS21，以及脂质制剂，如ISCOM。皂苷组合物已使用HPLC和RP-HPLC纯化。已经确定了使用这些技术的特定纯化级分，包括QS7、QS 17、QS 18、QS2 1、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷制剂还可以包含甾醇，如胆固醇。皂苷和胆固醇的组合可以用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM通常包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷都可以用于ISCOM。优选地，ISCOM包括QuilA、QHA和QHC中的一种或多种；
-微颗粒(即，直径为100nm至150pm，更优选直径为200nm至30pm，或直径为500nm至10pm的颗粒)，其由可生物降解且无毒的材料形成。这些无毒且可生物降解的材料包括但不限于聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯；
-CD1d配体，如α-糖基神经酰胺、含植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-六十六酰胺基)-1,3,4-十八烷三醇]、CRONY-101、3"-磺基-半乳糖基-神经酰胺；
-免疫刺激性寡核苷酸，如含有CpG基序的免疫刺激性寡核苷酸(含有通过磷酸键与鸟苷残基结合的未甲基化胞嘧啶残基的二核苷酸序列)，或含有Cpl基序的免疫刺激性寡核苷酸(含有与肌苷结合的胞嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA，或含有回文序列的寡核苷酸，或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。免疫刺激性寡核苷酸可以包括核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，并且可以是双链的或(RNA除外)单链的；
-含有与含磷酸酯的无环主链相连的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564；
-细菌来源的ADP-核糖基化肠毒素，特别是粘膜疫苗佐剂LT(R192G/L211A)或dmLT(例如在Clements等人,mSphere 2018,3(4)中所描述)；
-油乳剂(例如弗氏佐剂)，特别是用于诊断用途。
特别地，这类佐剂可以选自铝盐(氢氧化铝、磷酸铝)、水包油乳剂(有或没有特定的刺激剂如TLR激动剂)、胞壁酰肽、皂苷佐剂、细胞因子、细菌毒素(如霍乱毒素、百日咳毒素或大肠埃希菌不耐热毒素)的脱毒突变体。
本发明的免疫原性组合物可以与其他免疫原或免疫调节剂一起施用，例如免疫球蛋白、细胞因子、淋巴因子和趋化因子。
在一个特别的方面，免疫原性组合物进一步包含免疫原，其提供针对另一种病原体的保护，例如其他志贺菌属物种的成员，如弗氏志贺菌(S.flexneri)，例如弗氏志贺菌血清型1b、2a、3a、6(SF6)或6a(SF6a)，和痢疾志贺菌(S.dysenteriae)1型，或导致人腹泻病的病原体。
在另一个特别的方面，免疫原性组合物不包含提供针对另一种病原体的保护的免疫原，例如其他志贺菌属物种的成员，如弗氏志贺菌，例如弗氏志贺菌血清型1b、2a、3a、6(SF6)或6a(SF6a)，和/或痢疾志贺菌1型，和/或导致人腹泻病的病原体。
免疫原性组合物优选为水性形式，特别是在施用时，但它们也可以以非水性液体形式或干燥形式存在，例如明胶胶囊或冻干物等。
免疫原性组合物可以包含一种或多种防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。不含汞的组合物是优选的，并且可以制备不含防腐剂的疫苗。
免疫原性组合物可以包含生理盐，如钠盐，例如以控制张力。氯化钠(NaCl)是典型的，含量可以为1至20mg/ml。可能存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二钠二水合物、氯化镁、氯化钙等。
免疫原性组合物可以具有200mOsm/kg至400mOsm/kg的渗透压。
免疫原性组合物可以包含在纯水(例如w.f.i.)中的化合物(含有或不含不溶性金属盐)，但通常包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液(特别是含有氢氧化铝佐剂)或柠檬酸盐缓冲液。缓冲盐通常为5至20mM。
免疫原性组合物通常具有5.0至9.5，例如6.0至8.0的pH。
免疫原性组合物优选为无菌且无麸质的。
通常，免疫原性组合物被制备成可注射剂型(如液体溶液或混悬剂)，或适合在注射前溶解或混悬在液体媒介物中的固体形式。制剂可以被乳化或封装在脂质体中以增强佐剂作用。在这方面，可以参考国际申请WO 2010/136947。
配制好后，免疫原性组合物可以通过皮下、肌内或皮内注射进行肠胃外施用。
通常，本发明的免疫原性组合物可以肌肉内施用，例如通过肌肉内施用至上臂或前臂。适用于其他施用模式的其他制剂包括口服和鼻内制剂。
在另一方面，本发明涉及如上面所定义的缀合物或免疫原性组合物，其用于疫苗接种的用途。
在另一方面，本发明涉及如上面所定义的缀合物或免疫原性组合物，其用于疫苗接种的用途。
在另一方面，本发明涉及如上面所定义的缀合物或免疫原性组合物，其用于针对宋内志贺菌感染和/或由以交叉反应性碳水化合物抗原为特征的病原体引起的感染(例如类志贺邻单胞菌感染，尤其是类志贺邻单胞菌O17感染)的疫苗接种的用途。
在另一方面，本发明涉及一种下式化合物：
Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OR (IIb)，
其中：
x为0或1，
y为0或1，
n为1至50，
Q为H或C1-C6烷基，
A为4)-α-L-AltpNAcA-(1→，
B为3)-β-D-FucpNAc4N-(1→，
R为H、C1-C6烷基(特别是丙基或甲基)或基团LZ，
L为：
-单键，
-二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，或
-被至少一个-OH基团取代的二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其特别地为下式-(CH2-CH2-C(OH))q-(CH2-CH2)i，其中i为0或1，并且q为1至10，
--N(Ra)-D-，其中Ra为H、C1-C4-烷基、C1-C4-烷氧基、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5或OCH2CH2C6H5，D为C1-C7-亚烷基、C1-C7-烷氧基、C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基、O-C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基或C1-C7-烷氧基-Rb，其中Rb为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基，并且其中p为0至6，优选地p为1、2或3，进一步优选地p为1；
Z为Z1或F1-L2-Z2，
Z1为末端(反应性)官能团或基团，任选地受保护，能够与载体和/或固体支持物形成共价键，或多价支架；锚；单糖、寡糖或多糖；或染料或荧光残基，
F1为能够将接头L结合至接头L2的任何基团，F1特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺(hydrazonamide)、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
L2为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
Z2为Z1或F2-L3-Z1，
F2为能够将接头L结合至接头L3的任何基团，F2特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
L3为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
或其药学上可接受的盐，
条件是所述化合物不是H-AB-OPr、H-BA-OPr、H-ABA-OPr、H-BAB-OPr、H-(AB)2-OPr或H-BA-OMe。
与缀合物或免疫组合物相关的所有实施方案也单独或组合地适用于此。
LZ基团可以为下式之一：
-L-Z1；
-L-F1-L2-Z1；或
-L-F1-L2-F2-L3-Z1。
在一个特别的实施方案中，Z1为末端(反应性)官能团或基团，任选地受保护，能够与载体和/或固体支持物形成共价键。
在一个特别的实施方案中，载体和/或固体支持物在其表面上存在能够与Z1反应的官能团，更特别是伯氨基官能团，尤其是赖氨酸残基。
在另一个特别的实施方案中，载体和/或固体支持物在其表面上存在连接至互相连接的分子的官能团，更特别是伯氨基官能团，尤其是赖氨酸残基，所述互相连接的分子能够与本发明的寡糖和多糖的Z1基团反应。
在一个特别的实施方案中，Z1为多价支架；锚；单糖、寡糖或多糖；或染料或荧光残基。
在一个特别的实施方案中，L2为单键，并且F1和Z2或Z1是一个且唯一的基团。
在一个特别的实施方案中，L3为单键，并且F2和Z1是一个且唯一的基团。
锚特别地是指能够与载体和/或固体支持物形成非共价型连接的残基。所述锚为例如生物素，其能够与结合至固体支持物的链霉亲和素形成非共价键。
多价支架特别地是指能够形成至少两个键的支架，每个键与一个本发明的式(II)化合物形成。所述多价支架为例如直链聚合物、树枝状聚合物、单糖、环肽或(聚)-赖氨酸支架。
在一个特别的实施方案中，Z1为末端(反应性)官能团或基团，任选地受保护，能够与载体和/或固体支持物形成共价键。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及一种下式化合物：
Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)
条件是：
-当n＝1时，LZ不是Pr；
-当n＝1，x＝0且y＝0时，LZ不是Me；
-当n＝2，x＝0且y＝0时，LZ不是Pr。
在一个特别的实施方案中，n为1至50，更特别地：
-为1或2至25；或
-为1或2至12；或
-为1或2至10；或
-为1或2至4；或
-为2或3至8。
在一个更特别的实施方案中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个特别的实施方案中，Q为H。
在另一个特别的实施方案中，Q为Me。
在一个特别的实施方案中，R为H。在这种情况下，本发明的化合物为半缩醛。
在一个特别的实施方案中，R为Pr。
在一个特别的实施方案中，R为LZ。
在一个特别的实施方案中，当n为1或2时，R不为Pr。
在一个特别的实施方案中，Q为H，并且R为H。
在一个特别的实施方案中，Q为H，并且R为Pr。
在一个特别的实施方案中，Q为H，并且R为LZ。在一个特别的实施方案中，LZ为：
-L-Z1；
-L-F1-L2-Z1；或
-L-F1-L2-F2-L3-Z1。
在一个特别的实施方案中，Z1为卤素(特别是Cl、Br、I，更特别是Br)、生物素、C2-C6烯基、C2-C6炔基、叠氮基、烷氧基、环氧化物、C(＝O)H、半缩醛、C(＝O)Rc、缩醛、SRa、NH2或NHC(＝O)CH2Hal，其中Hal为卤素，特别是Cl、Br、I，更特别是Br，
Ra为H、C(＝O)CH3或SRb，并且
Rb为C1-C6烷基、C6-C10芳基(任选被取代，特别是被一个或多个C1-C6烷基取代)、5至7元杂芳基(如吡啶基，任选被取代，特别是被一个或多个C1-C6烷基取代)、任何能够将SSRb转化为SH的基团或Q-(B)x-(A-B)n-(A)y-O-，
Rc为C1-C6烷基。
在一个特别的实施方案中，LZ为LZ1，其中L为二价C1-C12烷基，并且Z为C(＝O)H，或受保护的C(＝O)H(如半缩醛)或C(OH)-CH2-OH基团。
在一个更特别的实施方案中，LZ为CH2-C(＝O)H或CH2-C(OH)-CH2-OH基团。
在一个特别的实施方案中，LZ为LZ1，其中L为二价C1-C12烷基，并且Z为C(＝O)Ra，或受保护的C(＝O)Ra(如缩醛)。
在一个更特别的实施方案中，LZ为CH2-CH2-C(＝O)-CH3或相应的基团，其中酮受保护为缩醛。
在一个特别的实施方案中，LZ为LZ1，其中L为二价C1-C12烷基(特别是C3烷基)，并且Z为NH2或NH3 +。
在一个特别的实施方案中，L为二价C1-C12烷基(特别是-(CH2)3-)，并且Z为F1-L2-Z2，其中F1为酰胺，L2为二价C1-C12烷基(特别是-CH2-)，并且Z2为-SH或受保护的巯基(如-SAc)。
在一个特别的实施方案中，L为二价C1-C12烷基(特别是-(CH2)3-)，并且Z为F1-L2-Z2，其中F1为酰胺，L2为二价C1-C12烷基(特别是-(CH2)2-)，并且Z2为-SH或受保护的巯基(如-S-S-吡啶)。
在一个特别的实施方案中，L为二价C1-C12烷基(特别是-CH2-)，并且Z为F1-L2-Z2，其中F1为腙酰胺(特别是-C＝N-NH-C(＝O)-)，L2为二价C1-C12烷基(特别是-(CH2)2-)，并且Z2为-SH或受保护的巯基(如-S-S-吡啶)。
在一个特别的实施方案中，L为二价C1-C12烷基(特别是-CH2-)，并且Z为F1-L2-Z2，其中F1为腙(特别是-C＝N-NH-)，L2为单键，并且Z2为以下：
在一个特别的实施方案中，L为-N(Ra)-D-E-CH2-(CH2)q-S-，或LZ为-N(Ra)-D-E-CH2-(CH2)q-SH，其中Ra为H、C1-C4-烷基、C1-C4-烷氧基、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5或OCH2CH2C6H5；D为C1-C7-亚烷基、C1-C7-烷氧基、C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基、O-C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基或C1-C7-烷氧基-Rb，其中Rb为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基，并且其中p为0至6，优选地p为1、2或3，进一步优选地p为1；E为NHC(O)、S或CH2；q为0至6，优选地q为1、2、3或4，进一步优选地q为1或2。
在一个特别的实施方案中，本发明提供寡糖或多糖，其选自：
其中n＝1、2或3，
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其中n＝1、2、3、4或5，
其中n＝1、2、3或4，
其中n＝1、2、3或4，
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在另一个方面，本发明涉及一种用于体外诊断宋内志贺菌感染的试剂盒，其中所述试剂盒包含如本文所定义的寡糖或多糖，特别是式(IIa)或(IIb)化合物，所述寡糖或多糖任选地与标记物或固体支持物结合。
在一个特别的实施方案中，根据本发明的寡糖或多糖，特别是式(IIa)或(IIb)化合物在体外用作标准免疫测定中的宋内志贺菌特异性诊断试剂。
可替代地，根据本发明的寡糖或多糖，特别是式(IIa)或(IIb)化合物用于测试宋内志贺菌特异性抗体的存在。寡糖或多糖，特别是式(IIa)或(IIb)化合物可以用于流行病学研究，例如用于确定全球宋内志贺菌感染的地理分布和/或演变，以及用于评价由免疫原诱导的宋内志贺菌特异性抗体应答。
根据本领域技术人员已知的标准方案，可以有利地将根据本发明的寡糖或多糖，特别是式(IIa)或(IIb)化合物标记和/或固定到固相上。此类标记物包括但不限于酶(碱性磷酸酶、过氧化物酶)、发光或荧光分子。例如，可以将根据本发明的与生物素缀合的寡糖或多糖固定到固相上，以检测生物样品中宋内志贺菌特异性抗体的存在。
此类免疫测定包括但不限于凝集测定、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定、荧光测定、蛋白质印迹等。
此类测定可以是例如直接形式(其中标记的寡糖或多糖与待检测的抗体反应)、间接形式(其中标记的二抗与所述寡糖或多糖反应)或竞争形式(加入标记的寡糖或多糖)。
对于所有治疗、预防和诊断用途，单独的或与载体连接的本发明的寡糖或多糖(特别是式(IIa)或(IIb)化合物)以及抗体和其他必要的试剂和适当的装置和附件可以以试剂盒形式提供，从而便于获得和使用。
在另一个方面，本发明涉及如本文所定义的寡糖或多糖，特别是式(IIa)或(IIb)化合物在体外诊断中的用途。
在另一个方面，本发明涉及下式(I0)化合物的用途：
T-A’-B’-Y或T-B’-A’-Y(I0)，
其中：
T选自2-萘甲基(Nap)、对甲氧基苄基(PMB)、4-溴苄基(PBB)、苄氧基甲基缩醛(BOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、甲氧基丙基(MOP)、四氢吡喃基(THP)、烯丙基(All)、C1-C6烷基或甲硅烷基，T特别地为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二甲基己基甲硅烷基(TDS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)或三乙基甲硅烷基(TES)，
Y选自：
-OAll，当T不为All时；
-甲硅烷基醚，特别是叔丁基二甲基甲硅烷基醚(OTBS)、二甲基己基甲硅烷基醚(OTDS)、三乙基甲硅烷基醚(OTES)、三异丙基甲硅烷基醚(OTIPS)，当T为Nap或PMB时；
-OPMB、ONap，当OT为甲硅烷基醚或T为All或PBB醚时；
-对甲氧基苯基-O(OMP或OPMP)；和
-SR4，其中R4使得化合物为硫糖苷；
A’为特别是/>其中：
-P1选自TCA、TFA、DCA、ClCH2-C(＝O)-(CA)、Ac、苄氧基氨基甲酸酯(Cbz)、三氯乙氧羰基(Troc)和Fmoc，P1和P2中的至少一个选自TCA、DCA、Ac、Fmoc、Troc，当Y不为OAll、OAlloc时，
-P2为H，或选自Ac、Boc、TFA、苄氧基氨基甲酸酯(Cbz)和2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)，当P1不为Ac时P2为H，
-或P1和P2一起形成邻苯二甲酰亚胺或四氯邻苯二甲酰亚胺(Cl4Phth)基团，
-R2为CO2R1或CH2OR3，其中R3为Ac、苯甲酰基(Bz)，或R3与T形成亚苄基，
-R1选自C1-C6烷基，尤其是Me或叔丁基(tBu)、Bn和对甲氧基苄基(PMB)，R1特别地为Bn，
B’为特别是/>
用于制备下式(II)化合物：
Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OR (IIb)，
其中：
x为0或1，
y为0或1，
n为1至50，
Q为H或C1-C6烷基，
A为4)-α-L-AltpNAcA-(1→，
B为3)-β-D-FucpNAc4N-(1→，
R为H、C1-C6烷基(特别是丙基或甲基)或基团LZ，
L为：
-单键，
-二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，或
-被至少一个-OH基团取代的二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其特别地为下式-(CH2-CH2-C(OH))q-(CH2-CH2)i，其中i为0或1，并且q为1至10，
--N(Ra)-D-，其中Ra为H、C1-C4-烷基、C1-C4-烷氧基、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5或OCH2CH2C6H5，D为C1-C7-亚烷基、C1-C7-烷氧基、C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基、O-C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基或C1-C7-烷氧基-Rb，其中Rb为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基，并且其中p为0至6，优选地p为1、2或3，进一步优选地p为1；
Z为Z1或F1-L2-Z2，
Z1为末端(反应性)官能团或基团，任选地受保护，能够与载体和/或固体支持物形成共价键，
F1为能够将接头L结合至接头L2的任何基团，F1特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
L2为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
Z2为Z1或F2-L3-Z1，
F2为能够将接头L结合至接头L3的任何基团，F2特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
L3为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
特别地，条件是所述化合物不是H-AB-OPr、H-BA-OPr、H-ABA-OPr、H-BAB-OPr、H-(AB)2-OPr或H-BA-OMe。
TCA为Cl3C-C(＝O)-。
TFA为F3C-C(＝O)-。
DCA为Cl2CH-C(＝O)-。
CA为ClCH2-C(＝O)-。
在整个说明书中，特别是对于A’，Bn保护基可以被Nap保护基代替。
与缀合物、免疫原性组合物或式(IIa)或(IIb)化合物相关的所有实施方案也单独地或组合地适用于此。
单糖、寡糖或多糖为例如单葡糖胺、寡葡糖胺或聚葡糖胺，或β-葡聚糖。
所述化合物T-A’-B’-Y或T-B’-A’-Y(I0)可以用于制备如下面所定义的受体H-A’-B’-Y或H-B’-A’-Y，或供体T-A’-B’-X或T-B’-A’-X，或半缩醛中间体T-A’-B’-OH或T-B’-A’-OH。
在另一个方面，本发明涉及下式T-A’-B’-OH或T-B’-A’-OH化合物用于制备下式(II)Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OR(IIb)化合物的用途。
在另一个方面，本发明涉及下式T-A’-B’-X或T-B’-A’-X化合物用于制备下式(II)Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OR(IIb)化合物的用途。在整个说明书中，当化合物包含以下序列时：
其中X为本说明书中定义的亚氨酸酯，
所述化合物实际上可以分别对应于具有下式的化合物：
其中波浪键表示相应的取代基在直立(axial)和/或平伏(equatorial)位置。
因此，含有这种波浪键的化合物作为α和β端基异构体的混合物存在，或者仅作为α或β端基异构体存在。
除非另有说明，A’和/或B’，特别是A’可以为与式中所示的构象不同的另一种构象。更特别地，A’的吡喃糖环可以为与式中所示构象不同的另一种构象，例如选自椅式、船式和扭曲式(skewed)构象。
在一个特别的实施方案中，A’为
更特别是/>/>
在一个特别的实施方案中，T选自2-萘甲基(Nap)、对甲氧基苄基(PMB)、4-溴苄基(PBB)、苄氧基甲基缩醛(BOM)、烯丙基(All)、C1-C6烷基或甲硅烷基，T特别地为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二甲基己基甲硅烷基(TDS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)或三乙基甲硅烷基(TES)。
在一个特别的实施方案中，T为2-萘甲基(Nap)、对甲氧基苄基(PMB)或C1-C6烷基，特别是2-萘甲基(Nap)、甲氧基甲基醚(MEM)、甲基醚(Me)、四氢吡喃缩醛(THP)。
在一个特别的实施方案中，T选自2-萘甲基(Nap)、对甲氧基苄基(PMB)、4-溴苄基(PBB)、苄氧基甲基缩醛(BOM)，或者T使得OT为甲硅烷基醚，T特别地为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二甲基己基甲硅烷基(TDS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)或三乙基甲硅烷基(TES)。
在一个特别的实施方案中，T选自2-萘甲基(Nap)、4-溴苄基(PBB)、苄氧基甲基缩醛(BOM)、C1-C6烷基，或者T使得OT为甲硅烷基醚，T特别地为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二甲基己基甲硅烷基(TDS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)或三乙基甲硅烷基(TES)。
在一个特别的实施方案中，T选自2-萘甲基(Nap)、对甲氧基苄基(PMB)、C1-C6烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)，特别是2-萘甲基(Nap)。
在一个特别的实施方案中，A’为并且B’为/>/>
在一个特别的实施方案中，A’为 更特别是 并且B’为/>
在一个特别的实施方案中，Y为OAll。
在一个特别的实施方案中，Y为OAll，并且T为Nap、PMB、PBB、BOM、C1-C6烷基，或者T使得OT为甲硅烷基醚，T特别地为Nap、PMB、PBB、BOM，或者T使得OT为甲硅烷基醚，T更特别地为Nap或PMB，优选Nap。
在一个特别的实施方案中，Y为OAll，T为Nap、PMB、PBB、BOM、C1-C6烷基，或者T使得OT为甲硅烷基醚，T特别地为Nap、PMB、PBB、BOM，或者T使得OT为甲硅烷基醚，T更特别地为Nap或PMB，优选Nap，A’为特别是并且B’为/>特别是/>
在一个特别的实施方案中，Y为甲硅烷基醚，特别是叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二甲基己基甲硅烷基(TDS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)，并且T为Nap或PMB。
在一个特别的实施方案中，Y为OPMB，并且OT为甲硅烷基醚，特别是叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二甲基己基甲硅烷基(TDS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)。
在一个特别的实施方案中，Y为SR4。
硫苷是本领域技术人员所熟知的。例如可以参考Advances in CarbohydrateChemistry and Biochemistry,第52卷,1997年,179-205页。
在一个特别的实施方案中，R4选自：
-C1-C12-烷基，特别是Me或Et；
-C1-C12-烷基-Ar，其中Ar为芳基，所述芳基任选被取代，尤其是被一个或多个选自C1-C6烷基、O-C1-C6烷基、NO2的基团取代，特别是(CH2)3-Ph、CH2-(叔丁基-Ph)(MBP)；
-C1-C12-烷基-Het，其中Het为杂芳基，所述杂芳基任选被取代，尤其是被一个或多个选自C1-C6烷基、O-C1-C6烷基、NO2的基团取代；
-C1-C12-烯基，特别是Me或Et；
-C1-C12-烯基-Ar，其中Ar为芳基，所述芳基任选被取代，尤其是被一个或多个选自C1-C6烷基、O-C1-C6烷基、NO2的基团取代，特别是4-(对甲氧基苯基)-4-戊烯基(MPTG)；
-C1-C12-烯基-Het，其中Het为杂芳基，所述杂芳基任选被取代，尤其是被一个或多个选自C1-C6烷基、O-C1-C6烷基、NO2的基团取代；
-芳基，其任选被取代，尤其是被一个或多个选自C1-C6烷基、O-C1-C6烷基、NO2的基团取代，特别是苯基、甲苯基、-Ph-NO2；
-杂芳基，其任选被取代，尤其是被一个或多个选自C1-C6烷基、O-C1-C6烷基、NO2的基团取代，特别是吡啶基、吲哚基、苯并噁唑基(Box)；和
-糖基；
-或者其使得SR4为烷氧基硫代亚氨酸酯。
在一个特别的实施方案中，R2为CO2R1，其中R1特别地为Bn。
在一个特别的实施方案中，Z为卤素(特别是Cl、Br、I，更特别是Br)、生物素、C2-C6烯基、C2-C6炔基、叠氮基、烷氧基、环氧化物、缩醛、C(＝O)H、SRa、NH2或NHC(＝O)CH2Hal，其中Hal为卤素，特别是Cl、Br、I，更特别是Br，
Ra为H、C(＝O)CH3或SRb，并且
Rb为C1-C6烷基、C6-C10芳基(任选被取代，特别是被一个或多个C1-C6烷基取代)、5至7元杂芳基(如吡啶基，任选被取代，特别是被一个或多个C1-C6烷基取代)、任何能够将SSRb转化为SH的基团或Q-(B)x-(A-B)n-(A)y-O-。在后一种情况下，本发明的化合物为本发明的糖的二聚体形式。
因此，Z可以通过本领域技术人员熟知的化学反应建立非共价键(生物素)或共价键。
这些反应中的一些为本领域技术人员熟知的亲核取代，并且涉及例如卤素、烷氧基、环氧化物、SRa、NH2或NHC(＝O)CH2Hal，Hal更特别地为Br。
这些反应中的另一些称为“点击反应”，涉及例如C2-C6烯基、C2-C6炔基、叠氮基、C(＝O)H或SRa基团或酰肼/腙、肟介导的反应。这些反应的示例可以参见例如Chem.Soc.Rev.(2014)43,7013-7039。
例如，Z可以为叠氮基，其例如可以通过菌株促进的炔-叠氮化物环加成(strainpromoted alkyne-azide cycloaddition，SPAAC，也称为无Cu或非基于铜的点击反应)，或通过铜(I)催化的炔-叠氮化物环加成形成共价键(Glycoconj J.(2011)28(3-4):149-164)。
例如，Z可以为巯基基团，其可以参与巯基选择性生物缀合反应，特别是巯基-马来酰亚胺或巯基-溴乙酰胺反应。这些反应的示例可以参见例如Curr.Opin.Chem.Biol.(2020)58,28-36。
例如，Z可以为马来酰亚胺，其可以参与巯基选择性生物缀合反应，特别是巯基-马来酰亚胺反应。这些反应的示例可以参见例如Science 2004年7月23日；305(5683):522-5。
对于寡糖苷和多糖苷与载体的缀合，还可以参见Chem.Soc.Rev.,2018,47,9015和Chem.Soc.Rev.,2016,45,1691。
在另一个方面，本发明涉及一种制备下式(II)化合物的方法：
Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OR (IIb)，
其中：
x为0或1，
y为0或1，
n为1至50，
Q为H或C1-C6烷基，
A为4)-α-L-AltpNAcA-(1→，
B为3)-β-D-FucpNAc4N-(1→，
R为H、C1-C6烷基(特别是丙基或甲基)或基团LZ，
L为：
-单键，
-二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，或
-被至少一个-OH基团取代的二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其特别地为下式-(CH2-CH2-C(OH))q-(CH2-CH2)i，其中i为0或1，并且q为1至10，
--N(Ra)-D-，其中Ra为H、C1-C4-烷基、C1-C4-烷氧基、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5或OCH2CH2C6H5，D为C1-C7-亚烷基、C1-C7-烷氧基、C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基、O-C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基或C1-C7-烷氧基-Rb，其中Rb为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基，并且其中p为0至6，优选地p为1、2或3，进一步优选地p为1；
Z为Z1或F1-L2-Z2，
Z1为末端(反应性)官能团或基团，任选地受保护，能够与载体和/或固体支持物形成共价键，或多价支架；锚；单糖、寡糖或多糖；或染料或荧光残基，
F1为能够将接头L结合至接头L2的任何基团，F1特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
L2为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
Z2为Z1或F2-L3-Z1，
F2为能够将接头L结合至接头L3的任何基团，F2特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
L3为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
特别地条件是所述化合物不是H-AB-OPr、H-BA-OPr、H-ABA-OPr、H-BAB-OPr、H-(AB)2-OPr或H-BA-OMe，
所述方法包括以下步骤：
(i)通过中间形成半缩醛T-A’-B’-OH或T-B’-A’-OH将下式T-A’-B’-Y，特别是T-A’-B’-OAll或T-B’-A’-Y(I0)化合物转化为下式T-A’-B’-X或T-B’-A’-X(ID)供体化合物的步骤，其中X表示选自亚氨酸酯的离去基团，例如OPTFA或OTCA，PTFA表示N-苯基三氟乙酰亚胺基(N-phenyltrifluoroacetimidyl)，TCA表示三氯乙酰亚胺基，来自o-炔基苯甲酸酯，和来自二苯基氧代锍(diphenyl oxosulfonium)，特别是当Y为All时，通过金属催化的脱烯丙基化，例如Pd、Ir或Rh，更特别地在H2活化的Ir催化剂的存在下，然后在I2或NIS水溶液的存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，或者通过Pd催化的脱烯丙基化，特别是在PdCl2的存在下，然后在I2或NIS水溶液的存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，提供相应的半缩醛T-A’-B’-OH或T-B’-A’-OH，然后在PTFA-Cl或三氯乙腈的存在下，
和/或
(ii)将T不为C1-C6烷基的下式T-A’-B’-Y，特别是T-A’-B’-OAll或T-B’-A’-Y(I0)化合物转化为下式H-A’-B’-Y，特别是H-A’-B’-OAll或H-B’-A’-Y(IA)受体化合物的步骤，特别地当T为Nap或PMB时在2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)、CAN或酸的存在下，或者当T为甲硅烷基时在缓冲的TBAF，例如用AcOH缓冲的TBAF，或Et3N.3HF的存在下，或者当T为THP、MEM、MOP时在有机酸、无机酸或路易斯酸如AcOH、TsOH、HCl、ZnBr2的存在下，
和/或
(iii)由化合物(IA)和/或(ID)获得化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y，特别是Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y(IIOP)的步骤，其中m为1至n，当x为0时Q’为T，当x为1时Q’选自T、Bn和酰基，例如Lev、ClAc、Fmoc或Ac，特别是在路易斯酸的存在下，例如选自TMSOTf、TBSOTf、TfOH、Yb(OTf)3、Cu(OTf)2、AgOTf或三氟化硼醚合物，
(iv)当R为LZ并且L不为-N(Ra)-D-时，将化合物(IIOP)缀合至下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ(IICP)化合物，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OW化合物的步骤，其中W为L-F1’或L-F1’P，L如上面所定义，F1’为如上面所定义的F1的前体，F1’P为受保护的基团F1’，特别是受一个或多个苄基保护的基团F1’，
或者当R为LZ并且L为-N(Ra)-D-时，制备化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OH或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OH的步骤，
(iv’)任选地，当m不为n时，分别将化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ(IICP)，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OW化合物转化为化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)n-(B’)y-OLZ(IICP)，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)n-(B’)y-OW化合物的步骤，注意当Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ(IICP)或Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OW的Q’基团不为C1-C6烷基时，Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)n-(B’)y-OLZ(IICP)或Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)n-(B’)y-OW的Q’基团可以表示C1-C6烷基，
(v)将在步骤(iii)或(iv)中获得的化合物脱保护以获得下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OLZ或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OLZ(II)化合物，或下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-O-L-F1’或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-O-L-F1’化合物，或下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OH或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OH化合物的步骤，特别是在Pd(OH)2-C或Pd-C、H2，例如通过电解水产生高压氢气，和碱的存在下，特别是无机碱，例如选自NaHCO3、K2CO3、NH4HCO3、CaCO3、MgCO3，当R1为C1-C6烷基，尤其是Me时，然后在有机/无机碱例如乙二胺、三乙胺、二乙胺、羟胺、NH2OH或LiOH/H2O2的存在下任选地进行皂化，或者当T为甲硅烷基醚、THP、MEM、MOP和/或P1为Boc时，之前在TBAF或TFA、ZnBr2、TsOH的存在下，
(vi)当在步骤(v)中获得的化合物为式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-O-L-F1’或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-O-L-F1’化合物时，将所述化合物与以下化合物接触的步骤
-下式F1”-L2-Z1化合物，F1”为如上面所定义的F1的前体，L2和Z1如上面所定义，或者
-下式F1”-L2-F2’化合物，F1”为如上面所定义的F1的前体，F2’为如上面所定义的F2的前体，L2如上面所定义，然后将所得的化合物与下式F2”-L3-Z1化合物接触，其中F2”为如上面所定义的F2的前体，并且L3和Z1如上面所定义，
或者当在步骤(v)中获得的化合物为式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OH或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OH化合物时，将所述化合物与以下化合物接触的步骤：
-下式HN(Ra)-D-Z1化合物，Ra、D和Z1如上面所定义，或者
-下式HN(Ra)-D-F1’化合物，F1’为如上面所定义的F1的前体，然后将所得的化合物与下式F1”-L2-Z1化合物接触，其中F1”为如上面所定义的F1的前体，
以获得下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OLZ或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OLZ(II)化合物。
与如上面所定义的缀合物、免疫原性组合物或式(IIa)或(IIb)化合物或用途相关的所有实施方案也单独地或组合地适用于此。
在一个特别的实施方案中，本发明涉及一种制备下式(IIa)化合物的方法：
Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)，
所述方法包括以下步骤：
(i)通过中间形成半缩醛T-A’-B’-OH将下式T-A’-B’-Y，特别是T-A’-B’-OAll(I0)化合物转化为下式T-A’-B’-X(ID)供体化合物的步骤，其中X表示选自亚氨酸酯的离去基团，例如OPTFA或OTCA，PTFA表示N-苯基三氟乙酰亚胺基，TCA表示三氯乙酰亚胺基，来自o-炔基苯甲酸酯，和来自二苯基氧代锍，特别是当Y为All时，通过金属催化的脱烯丙基化，例如Pd、Ir或Rh，更特别地在H2活化的Ir催化剂的存在下，然后在I2或NIS水溶液的存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，或者通过Pd催化的脱烯丙基化，特别是在PdCl2的存在下，然后在I2或NIS水溶液的存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，提供相应的半缩醛T-A’-B’-OH，然后在PTFA-Cl或三氯乙腈的存在下，
和/或
(ii)将T不为C1-C6烷基的下式T-A’-B’-Y，特别是T-A’-B’-OAll(I0)化合物转化为下式H-A’-B’-Y，特别是H-A’-B’-OAll(IA)受体化合物的步骤，特别地当T为Nap或PMB时在2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)、CAN或酸的存在下，或者当T为甲硅烷基时在缓冲的TBAF，例如用AcOH缓冲的TBAF，或Et3N.3HF的存在下，或者当T为THP、MEM、MOP时在有机酸、无机酸或路易斯酸如AcOH、TsOH、HCl、ZnBr2的存在下，
和/或
(iii)由化合物(IA)和/或(ID)获得化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y，特别是Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll(IIOP)的步骤，其中m为1至n，当x为0时Q’为T，当x为1时Q’选自T、Bn和酰基，例如Lev、ClAc、Fmoc或Ac，特别是在路易斯酸的存在下，例如选自TMSOTf、TBSOTf、TfOH、Yb(OTf)3、Cu(OTf)2、AgOTf或三氟化硼醚合物，
(iv)当R为LZ时，将化合物(IIOP)缀合至下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ(IICP)化合物，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW化合物的步骤，其中W为L-F1’或L-F1’P，L如上面所定义，F1’为如上面所定义的F1的前体，F1’P为受保护的基团F1’，特别是受一个或多个苄基保护的基团F1’，
(iv’)任选地，当m不为n时，分别将化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ(IICP)，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW化合物转化为化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OLZ(IICP)，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OW化合物的步骤，注意当Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ(IICP)或Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW的Q’基团不为C1-C6烷基时，Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OLZ(IICP)或Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OW的Q’基团可以表示C1-C6烷基，
(v)将在步骤(iii)或(iv)中获得的化合物脱保护以获得下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OLZ或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OLZ(II)化合物，或下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-O-L-F1’或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-O-L-F1’化合物的步骤，特别是在Pd(OH)2-C或Pd-C、H2，例如通过电解水产生高压氢气，和碱的存在下，特别是无机碱，例如选自NaHCO3、K2CO3、NH4HCO3、CaCO3、MgCO3，当R1为C1-C6烷基，尤其是Me时，然后任选地在NH2OH或NH4OH的存在下，在所述氢化之后任选地进行皂化在有机或无机碱例如乙二胺、三乙胺、二乙胺、羟胺、NH2OH或LiOH/H2O2的存在下，或者当T为甲硅烷基醚、THP、MEM、MOP和/或P1为Boc时，之前在TBAF或TFA、ZnBr2、TsOH的存在下，
(vi)当在步骤(v)中获得的化合物为式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-O-L-F1’或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-O-L-F1’化合物时，将所述化合物与以下化合物接触的步骤
-下式F1”-L2-Z1化合物，F1”为如上面所定义的F1的前体，L2和Z1如上面所定义，或者
-下式F1”-L2-F2’化合物，F1”为如上面所定义的F1的前体，F2’为如上面所定义的F2的前体，L2如上面所定义，然后将所得的化合物与下式F2”-L3-Z1化合物接触，其中F2”为如上面所定义的F2的前体，并且L3和Z1如上面所定义，
以获得下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OLZ或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OLZ(II)化合物。
F1’和F1”为例如：
--C(＝O)-C(＝O)H和胺，形成-C(＝O)-C(＝O)-NH-基团，
--C(＝O)-C(＝O)H和胺，形成-C(＝O)-C(H)＝N-NH-基团，
-羧酸或活化酯和醇，形成酯，
-活化酯和胺，形成酰胺，
-胺和离去基团，形成胺，
-巯基和离去基团，形成硫醚，
-胺和醛，形成亚胺，
-胺和醛，形成胺，特别是通过还原胺化，
-巯基和马来酰亚胺，形成硫代琥珀酰亚胺，
-叠氮化物和炔烃，形成三唑，特别是通过点击化学，
-C(＝O)CH2-Hal，特别是Br，和胺，形成C(＝O)CH2-NH基团，
-NHC(＝O)CH2-Hal，特别是Br，和胺，形成NHC(＝O)CH2-NH基团，
-C(＝O)CH2-Hal，特别是Br，和巯基，形成C(＝O)CH2-SH基团，
-NHC(＝O)CH2-Hal，特别是Br，和巯基，形成NHC(＝O)CH2-SH基团，
-和胺或醇，形成/> />
F2’和F2”为例如：
--C(＝O)-C(＝O)H和胺，形成-C(＝O)-C(＝O)-NH-基团，
--C(＝O)-C(＝O)H和胺，形成-C(＝O)-C(H)＝N-NH-基团，
-羧酸或活化酯和醇，形成酯，
-活化酯和胺，形成酰胺，
-胺和离去基团，形成胺，
-巯基和离去基团，形成硫醚，
-胺和醛，形成亚胺，
-胺和醛，形成胺，特别是通过还原胺化，
-巯基和马来酰亚胺，形成硫代琥珀酰亚胺，
-叠氮化物和炔烃，形成三唑，特别是通过点击化学，
-C(＝O)CH2-Hal，特别是Br，和胺，形成C(＝O)CH2-NH基团，
-NHC(＝O)CH2-Hal，特别是Br，和胺，形成NHC(＝O)CH2-NH基团，
-C(＝O)CH2-Hal，特别是Br，和巯基，形成C(＝O)CH2-SH基团，
-NHC(＝O)CH2-Hal，特别是Br，和巯基，形成NHC(＝O)CH2-SH基团，
-和胺或醇，形成/>
对于乙醛基，还可以参考Bioconjugate Chem.2013,24,735-765。
在一个特别的实施方案中，F1”和F2’为正交的(即，特别地它们一起反应)。
步骤(i)可以分为两个子步骤进行。
当Y为OAll时，第一个子步骤特别地为本领域技术人员熟知的异头脱烯丙基化，更特别是金属催化的脱烯丙基化，所述金属为例如Pd、Ir或Rh，更特别地在H2活化的Ir催化剂的存在下，或钯催化的异头脱烯丙基化，尤其是在PdCl2的存在下，尤其是然后进行裂解，所述裂解可以是碘辅助的。
也可以如Carbohydrate Research 342(2007)2635-2640所描述进行脱烯丙基化，例如在DABCO和(Ph3P)3RhCl的存在下，然后进行汞辅助裂解。
当Y为OPMP时，可以通过本领域技术人员熟知的任何程序进行脱保护，例如使用CAN(例如参考Synthesis 2018,50,4270–4282)。
当Y为SR4时，可以通过本领域技术人员熟知的方法进行向供体的转化。例如参考Carbohydrate Research 403(2015)13-22。合适的促进剂为那些能够产生嗜硫物质的促进剂，特别地可以分为四种主要类型：(1)金属盐；(2)卤试剂；(3)有机硫试剂；(4)单电子转移(SET)试剂/方法。广泛使用的示例为NIS/HOTf或NIS/AgOTf。有机硫试剂构成另一组广泛使用的硫代糖苷的糖苷化促进剂，例如三氟甲磺酸二甲基(硫代甲基)锍(DMTST)。强大的促进剂还为亚磺酰基衍生物和Tf2O的组合。
第二个子步骤特别地为将所得的半缩醛活化为亚氨酸酯供体(异头OPTFA或OTCA取代)(J.Org.Chem.(2015)80,11237-57)，或活化为苯甲酸炔基供体(Acc.Chem.Res.2018,51,507-516)，或活化为二苯基氧代锍(J.Am.Chem.Soc.2000,122,4269-4279)。
Handbook of Chemical Glycosylation Advances in Stereoselectivity andTherapeutic Relevance(2008),Wiley,A.V.Demchenko提供了其他可能的糖基化方法。
步骤(ii)为T基团的裂解(脱保护)，其中T不是C1-C6烷基，特别是本领域技术人员熟知的Nap、PMB或甲硅烷基脱保护。
例如，可以在2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)、CAN或酸如TFA(Mulard等人,J.of Organic Chemistry,doi:10.1021/acs.joc.0c00777；Chem.Commun.,2014,50,3155)或HCl的六氟异丙醇(HFIP)溶液(J.Org.Chem.2015,80,8796-8806)的存在下去除Nap或PMB保护基。
甲硅烷基醚可以例如在缓冲的TBAF(例如用AcOH缓冲的)或Et3N.3HF的存在下裂解。本领域技术人员熟知的其他方法可以参见Nelson等人(Synthesis 1996；1996(9):1031-1069)。
步骤(iii)可以在路易斯酸或路易斯酸性金属盐的存在下进行，所述路易斯酸例如选自TMSOTf、TBSOTf、TfOH、三氟化硼醚合物(JACS(2015)137,12653)。
在Angew Chem(2009)48,1900-34中描述了大量其他糖基化促进剂。
Handbook of Chemical Glycosylation Advances in Stereoselectivity andTherapeutic Relevance(2008),Wiley,A.V.Demchenko提供了其他可能的糖基化促进剂。
步骤(iv)可以分为三个子步骤进行。
第一个子步骤特别地为本领域技术人员熟知的异头脱烯丙基化，更特别地为钯催化的异头脱烯丙基化或在H2活化的Ir催化剂的存在下的脱烯丙基化。
第二个子步骤特别地为将所得的半缩醛活化为亚氨酸酯供体(异头OPTFA或OTCA取代)(J.Org.Chem.(2015)80,11237-57)。
第三步为将上一步获得的活化化合物与化合物如HO-LZ或HO-W反应，其中W为L-F1’或L-F1’P。
步骤(v)包括通过氢化脱保护。这种氢化可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行，也可以通过使用电解水产生的氢气，尤其是高压氢气，例如通过H-Cube系统进行。
碱的存在量特别地为相对于起始材料1当量至进行步骤(v)的化合物中存在的每个氯1当量。
更特别地，碱的存在量特别地为进行步骤(v)的化合物中存在的每个氯1/3当量至进行步骤(v)的化合物中存在的每个氯1当量。
在一个优选的实施方案中，碱在脱保护反应开始时不存在，但在之后加入，优选在所有Bn、Bzl和Nap都被裂解时加入，和/或分批加入。
在另一个优选的实施方案中，碱在脱保护反应开始时以相对于起始材料的1/3当量存在，然后进一步加入，优选在所有Bn、Bzl和Nap都被裂解时加入，和/或分批加入。
在该氢化之前或之后可以进行另一个脱保护步骤，特别是当存在甲硅烷基醚(例如OTBS)、Ac和/或Boc基团时，如本领域技术人员所熟知的那样。
当R1为C1-C6烷基，尤其是Me时，在所述氢化之前可以进行皂化步骤，所述皂化步骤使用例如LiOH/H2O2或本领域技术人员熟知的其他更温和的方法。合适程序的示例可以参见Org.Biomol.Chem.,2013,42,3510。
当x为1并且Q’选自酰基，例如Lev、ClAc、Fmoc或Ac时，在所述氢化之前或之后可以进行通过酸甲醇解或用弱碱的裂解。
当P1为Alloc时，优选去除Alloc以提供脱保护的-NH2，然后在所述氢化步骤之前转化为-NHAC。
当R2为CH2OR3，其中R3为Ac时，优选在步骤(iv)、(iv’)或(v)之前将CH2OR3转化为CH2OH基团，例如在NaOMe的存在下，然后转化为CO2Bn基团，使用例如a)TBABr、NaHCO3、TEMPO、NaOCl；b)HCl、2-甲基丁-2-烯、NaClO2、NaH2PO4；c)CsF、BnBr。该程序的示例可以参见Chem Eur J(2010)16,3476。
当P1和P2一起形成四氯邻苯二甲酰亚胺基(Cl4Phth)基团时，可以在氢化步骤之前使用例如H2NCH2CH2NH2然后使用Ac2O进行脱保护。
当P1和P2一起形成邻苯二甲酰亚胺基时，脱保护可以在氢化步骤之前进行，特别是在R2为CH2OR3时将CH2OR3转化为CO2Bn之前，通过本领域技术人员熟知的方法进行。步骤(vi)是由F1’残基和F1”-L2-Z1化合物，或由残基F1’和下式F1”-L2-F2’化合物形成F1基团，然后将所得的化合物与下式F2”-L3-Z1化合物接触。
这可以通过本领域技术人员已知的任何方法来完成，例如通过生物缀合方法，特别是当Z1为生物分子时。尤其在Bioconjugate Techniques:第三版(2013),GregHermanson,Elsevier中描述了这类方法。
例如，它可以通过酰胺形成、还原胺化、肟形成、腙形成，或通过使用例如烯烃或乙烯基硫代膦酸酯的巯基-烯反应来完成。在Chem.Eur.J.2014,20,34-41和Chem.Rev.2017,117,10358-10376中描述了肟和肼方法的示例。描述了用于巯基-巯基生物缀合的化学诱导的乙烯基硫代膦酸盐亲电子试剂的示例(J.Am.Chem.Soc.2020,142,9544-9552)。
在一个特别的实施方案中，步骤(iii)为由化合物(IA)和化合物Q’-B’-X获得化合物Q’-B’-(A’-B’)m-Y，特别是Q’-B’-(A’-B’)m-OAll(IIOP)的步骤，其中Q’如前面所定义。
在一个特别的实施方案中，步骤(iii)为由化合物(ID)和化合物H-A’-Y特别是H-A’-OAll获得化合物T-(A’-B’)m-A’-Y，特别是T-(A’-B’)m-A’-OAll(IIOP)的步骤，其中T如前面所定义。
在一个特别的实施方案中，步骤(iii)为由化合物(IA)和(ID)获得化合物T-(A’-B’)2-Y，特别是T-(A’-B’)2-OAll的步骤，所述化合物T-(A’-B’)2-Y，特别是T-(A’-B’)2-OAll(IIOP)可以：
a)进一步转化为化合物T-(A’-B’)2-X，然后与化合物H-A’-B’-Y，特别是H-A’-B’-OAll(IA)反应，或者
b)进一步转化为化合物T-(A’-B’)2-X，然后与由T-(A’-B’)2-Y特别是T-(A’-B’)2-OAll获得的化合物H-(A’-B’)2-Y特别是H-(A’-B’)2-OAll反应，特别是当T为Nap或PMB时在2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)、CAN或酸的存在下，或当T为甲硅烷基时在Et3N.3HF或AcOH缓冲的TBAF的存在下，或者
c)当T不为C1-C6烷基时，进一步转化为化合物H-(A’-B’)2-Y，特别是H-(A’-B’)2-OAll，然后与化合物T-A’-B’-X(ID)反应，或者
d)当T不为C1-C6烷基时，进一步转化为化合物H-(A’-B’)2-Y，特别是H-(A’-B’)2-OAll，然后与化合物T-(A’-B’)2-X反应，
e)如有必要，用至少一种在前述步骤中获得的化合物重复步骤a)至d)中的至少一个；
以在当m为3或更大时获得式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y，特别是Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll(IIOP)化合物。
事实上，步骤(iii)可以在多个子步骤中进行，其在于将起始材料或在先前步骤中获得的化合物转化为受体或供体，然后分别与如上所述获得的供体或受体反应，直到获得期望长度的寡糖。
例如，可以通过中间地形成T-A’-B’-X、T-(A’-B’)2-X、T-(A’-B’)3-X或甚至T-(A’-B’)4-X供体，和/或H-A’-B’-Y、H-(A’-B’)2Y、H-(A’-B’)3-Y或甚至H-(A’-B’)4-Y受体来获得期望长度的寡糖(对应于具有目标n值的化合物)。
当Q’为C1-C6烷基时，例如经由供体化合物引入所述Q’，其中在步骤(iii)或(iv’)期间Q’或T为C1-C6烷基，注意所得的化合物不能转化为受体，而是再次转化为供体以与受体反应，并且任选地再次转化为供体直到达到期望的m或n值。
在一个特别的实施方案中，当R为LZ时，步骤(iv)包括以下子步骤：
a)将化合物(IIOP)脱保护以获得下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OH的半缩醛化合物的子步骤，
b)将下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OH的半缩醛化合物活化以获得下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-X’化合物的子步骤，其中X’表示亚氨酸酯，例如OPTFA或OTCA，PTFA表示N-苯基三氟乙酰亚胺基，TCA表示三氯乙酰亚胺基，
c)将下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-X’化合物与式HO-LZ化合物，例如式HO-C1-C12烷基的醇如甲醇，或与式HO-L-F1’或HO-L-F1’P化合物反应以获得化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW(IICP)的子步骤，其中W为如上面所定义的L-F1’或L-F1’P。
当Z1为受保护的时，可以将Z1脱保护，例如在脱保护的最后一步进行。
在一个特别的实施方案中，L为二价C1-C12烷基或烯基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，并且F1’P为N3、NHCbz或NBnCbz基团，L-F1’P尤其为具有N3的PEG链、NHCbz、NBnCbz或SBn基团(对于后者，参见例如Chem.Sci.2014,5,1992)。
在一个特别的实施方案中，F1’或F1’P基团与F1”-L2-Z1反应，所述F1”-L2-Z1为具有第一反应官能团的化合物，与F1’或F1’P残基反应形成F1官能团。在一个特别的实施方案中，F1’或F1’P基团与F1”-L2-F2’反应，所述F1”-L2-F2’进一步包含第二反应官能团F2’，其与第一反应官能团F1”正交。
在一个更特别的实施方案中，HO-L-Z1或HO-L-F1’P为HO-(CH2)p-N3或HO-(CH2)p-NHCbz、HO-(CH2)p-NBnCbz，L-Z1或L-F1’为-(CH2)p-NH3 +或-(CH2)p-NH2，其中p为1至10，特别是2至8，更特别是2、3、4、5或6，并且F1”-L2-Z1或F1”-L2-F2’为活化形式，特别是下式化合物的活化酯：
在另一个更特别的实施方案中，HO-L-Z1或HO-L-F1’P为HO-(CH2)p-CH2＝CH2，F1”-L2-Z1为硫醇，例如HS-Bn。特别地参见Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,3894-3898。
在另一个更特别的实施方案中，HO-L-Z1或HO-L-F1’P为HO-(CH2)p-SBn，L-Z1或L-F1’P为-(CH2)p-SBn或-(CH2)p-SO2H(对于后者，特别地参见Chem.Eur.J.2004,10,4265-4282)，脱保护的L-Z1或L-F1’为-(CH2)p-SH，其中p为1至10，特别是2至8，更特别是2、3、4、5或6。在一个特别的实施方案中，HO-L-Z1或HO-L-F1’P为HO-C1-C10-烷基，其中-CH2-被半缩醛或缩醛(特别是任选取代的环状缩醛)取代，例如2-甲基-1,3-二氧戊环-2-乙醇。
在一个特别的实施方案中，HO-L-Z1或HO-L-F1’P为HO-(CH2)p-OBn，并且脱保护的L-Z1或L-F1’为-(CH2)p-OH，其中p为1至10，特别是2至8，更特别是2、3、4、5或6。引入的伯醇可以例如在选择性氧化时转化为醛部分，然后与包含酰肼-、肟-或衍生物的F1”-L2-Z1或F1”-L2-F2’化合物反应。F1”-L2-Z1或F1”-L2-F2’任选地进一步包含第二反应官能团，其与第一反应官能团正交，其可以选自烯烃、炔烃和掩蔽的巯基基团。
在一个特别的实施方案中，当HO-L-Z1或HO-L-F1’P为HO-CH2-C(OBn)-CH2-OBn时，L-Z1或L-F1’为-CH2-C(OH)-CH2-OH，并且F1”-L2-Z1或F1”-L2-F2’为下式：
当T为C1-C6烷基时，C1-C6烷基也可以在T保护基的脱保护之后引入，例如通过使脱保护的化合物与C1-C6烷基离去基团化合物接触。合适的离去基团是本领域技术人员已知的。
在一个特别的实施方案中，T＝Nap的化合物T-A’-B’-OAll(I0)由以下化合物获得，特别是在TEMPO和BAIB的存在下，然后在BnBr和任选的碱，例如无机碱如K2CO3的存在下：
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
其中T＝Nap，
由以下化合物获得，特别是在TBAF的存在下：
/>
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
其中T＝Nap，
由以下化合物：
特别是在路易斯酸的存在下，所述路易斯酸例如选自TMSOTf、TBSOTf、TfOH和三氟化硼醚合物，和以下化合物获得：
例如，H.B.Pfister和L.A.Mulard(Org.Lett.2014,16,4892-4895)描述了详细的程序。
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
其中T＝Nap，由以下化合物获得：
特别是在PTFA-Cl和碱，例如无机碱如Cs2CO3的存在下。
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
其中T＝Nap，
由以下化合物获得：
特别是在H2活化的Ir催化剂的存在下或通过Pd催化的脱烯丙基化，特别是在PdCl2的存在下，然后在I2或NIS水溶液的存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，
所述化合物优选地由以下化合物获得：
特别是在PPh3或Zn和任选的AcOH的存在下，然后在三氯乙腈的存在下，任选地使用碱，特别是有机碱如Et3N，
所述化合物更优选地由以下化合物获得：
特别是在甲醇和CSA的存在下，然后在TBDPS-Cl的存在下，使用碱，特别是有机碱，例如咪唑，然后在2-(溴甲基)萘的存在下，使用强碱，特别是NaH。
在一个特别的实施方案中，T＝TBS的化合物T-A’-B’-OAll(I0)由以下化合物获得，特别是在TBSO-W(其中W为离去基团，特别地选自卤素和Tf)和碱的存在下，所述TBSO-W特别地为TBSOTf，所述碱特别地为有机碱，例如咪唑：
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
由以下化合物获得，例如H.B.Pfister和L.A.Mulard(Org.Lett.2014,16,4892-4895)所描述：
在一个特别的实施方案中，T＝C1-C6烷基的化合物T-A’-B’-OAll(I0)由以下化合物获得，特别是在TEMPO和BAIB的存在下，然后在BnBr和任选的碱，例如无机碱如K2CO3的存在下：
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
其中T＝C1-C6烷基，
由以下化合物获得，特别是在路易斯酸的存在下，所述路易斯酸例如选自TMSOTf、TBSOTf、TfOH和三氟化硼醚合物，然后在TBAF的存在下：
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
其中T＝C1-C6烷基，
由以下化合物，
特别是在路易斯酸的存在下，所述路易斯酸例如选自TMSOTf、TBSOTf、TfOH和三氟化硼醚合物，和以下化合物获得：
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
其中T＝C1-C6烷基，
由以下化合物获得，
特别是在PTFA-Cl和任选的碱，例如无机碱如Cs2CO3的存在下。
在一个特别的实施方案中，以下化合物：
其中T＝C1-C6烷基，
由以下化合物获得，
特别是在H2活化的Ir催化剂的存在下，然后在I2或NIS水溶液存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，或者通过Pd催化的脱烯丙基化，特别是在PdCl2的存在下，然后在I2或NIS水溶液存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，
所述化合物优选地由以下化合物获得：/>
特别是在Zn和任选的AcOH的存在下，然后在三氯乙腈存在下，任选地使用碱，特别是有机碱如Et3N，
所述化合物更优选地由以下化合物获得：
特别是在甲醇和CSA的存在下，然后在tBDMS-Cl的存在下，使用碱，特别是有机碱，例如咪唑，然后在T-I的存在下，使用强碱，如NaH。
在另一个方面，本发明涉及一种下式(III)之一的化合物：
Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y或Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ、Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-O-L-F1’、Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-O-L-F1’P、Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OH、H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y、Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ、Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-O-L-F1’、Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-O-L-F1’P、Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OH、H-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y，
其中Q’、A’、B’、Y、L、Z、F1’、F1’P、x和m如上面所定义，
条件是：
-当化合物为H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y，特别是H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll，并且x＝y＝0时，m为3至50，特别是4或5至50。
在另一个方面，本发明涉及一种下式(III)之一的化合物：
Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y或Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ、Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-O-L-F1’、Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-O-L-F1’P、Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OH、H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y、Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ、Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-O-L-F1’、Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-O-L-F1’P、Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OH、H-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y，
其中Q’、A’、B’、Y、L、Z、F1’、F1’P、x和m如上面所定义，
条件是：
-当化合物为H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y，特别是H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll，并且x＝y＝0时，m为3至50，特别是4或5至50；
-当化合物为Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y，特别是Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OAll，并且x+y＝1时，m为2至50，特别是3、4或5至50。
与如上面所定义的缀合物、免疫原性组合物、式(IIa)或(IIb)化合物、用途或方法相关的所有实施方案也单独地或组合地适用于此。
在一个特别的实施方案中，所述化合物不是A’为并且B’为的化合物。
在一个特别的实施方案中，当A’为并且B’为时，T不是甲硅烷基，特别是TBS。
在一个特别的实施方案中，当A’为并且B’为T为Nap。
在以下部分中
其中n＝1、2、3或4，其中n＝1、2、3或4，/>
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/>
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/>
在另一个方面，本发明涉及一种下式之一的化合物：
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保护和脱保护技术(即保护基引入和裂解)例如由P.G.M.Wuts和T.W.Greene描述(Greene's Protective Groups in Organic Synthesis,第四版；Wiley-Interscience,2006；或Greene's Protective Groups in Organic Synthesis,第五版；Wiley-Interscience,2014,by P.Wuts,DOI:10.1002/9781118905074)。还参考“Recent AdvancesToward Robust N-Protecting Groups for Glucosamine as Required forGlycosylation Strategies”,Mohamed Ramadan El Sayed Aly和El Sayed H.El Ashry,Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,第73卷,第117-224页(2016)。
定义
本文包含的以下术语和表述定义如下：
如本文所使用，术语“烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、1-乙基丙基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、己基等。含有烷基的基团如芳烷基或O-烷基的烷基部分具有与上述定义的烷基相同的含义。优选的低级烷基为如上所定义的含有1至4个碳的烷基。名称如“C1-C4烷基”是指含有1至4个碳原子的烷基。
如本文所使用，术语“芳基”是指具有6至10个环碳原子的取代或未取代的单环或双环烃芳香环系统。示例包括苯基和萘基。优选的芳基包括未取代或取代的苯基和萘基。“芳基”的定义中包括稠环系统，包括例如其中芳香环与环烷基环稠合的环系统。这种稠合环系统的示例包括例如茚满、茚和四氢萘。
如本文所使用，术语“杂芳基”是指含有5至10个环碳原子的芳族基团，其中一个或多个环碳原子被至少一个杂原子如-O-、-N-或-S-取代。杂芳基的示例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、异噁唑基、噁唑基、氧硫杂环戊烯基(oxathiolyl)、噁二唑基、三唑基、噁三唑基、呋喃基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、嘌呤基、喹唑啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、噻萘基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、肉桂基、酞嗪基、萘啶基和喹喔啉基。“杂芳基”的定义中包括稠环系统，包括例如芳环与杂环基环稠合的环系统。这种稠合环系统的示例包括例如邻苯二甲酰胺、邻苯二甲酸酐、二氢吲哚、异二氢吲哚、四氢异喹啉、色满、异色满、色烯和异色烯。
如本文所使用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合与人类和动物组织接触的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其没有与合理的收益/风险比不相称的过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题并发症。
在另一个方面，本发明涉及上述化合物的药学上可接受的盐。如本文所使用，“药学上可接受的盐”包括本发明化合物的盐，所述盐来源于此类化合物与无毒酸的组合。
酸加成盐包括无机酸，如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸和磷酸，以及有机酸，如乙酸、柠檬酸、丙酸、酒石酸、谷氨酸、水杨酸、草酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、琥珀酸和苯甲酸，以及相关的无机酸和有机酸。
除了药学上可接受的盐以外，其他盐也包括在本发明中。它们可以用作化合物纯化、其他盐的制备或化合物或中间体的鉴定和表征中的中间体。
本发明化合物的药学上可接受的盐还可以以各种溶剂化物的形式存在，如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、乙酸乙酯等的溶剂化物。也可以制备这些溶剂化物的混合物。这种溶剂化物的来源可以来自结晶溶剂，制备或结晶溶剂中固有的溶剂，或这种溶剂的外来物。这样的溶剂化物在本发明的范围内。
应认识到本发明的化合物可以以各种立体异构形式存在。因此，本发明的化合物包括非对映异构体和对映异构体。通常将这些化合物制备成外消旋体，并可以方便地直接使用，但如果需要，可以通过常规技术分离或合成单个对映异构体。这样的外消旋体和单独的对映异构体及其混合物构成本发明的一部分。
制备和分离此类光学活性形式是本领域众所周知的。可以使用对映异构体纯的或对映异构体富集的原料通过立体选择性合成来制备特定的立体异构体。起始材料或产物的特定立体异构体可以通过本领域已知的技术拆分和回收，如外消旋形式的拆分，正相、反相和手性色谱法，重结晶，酶促拆分，或由用于该目的的试剂形成的加成盐的分级重结晶。拆分和回收特定立体异构体的有用方法描述于Eliel,E.L.；Wilen,S.H.Stereochemistry ofOrganic Compounds；Wiley:New York,1994，和Jacques,J,等人Enantiomers,Racemates,and Resolutions；Wiley:New York,1981，每一个都通过引用整体并入本文。
特别地，n值不同的本发明化合物显示出构象拟态(conformational mimicry)。例如，1H NMR研究表明，n值为2、3、4、5和6的本发明化合物共享构象拟态。
如本文所使用，术语“寡糖”更特别地是指含有2至10个单糖(单个糖)的糖。
如本文所使用，术语“多糖”更特别地是指含有多于10个单糖(单个糖)的糖。
如本文所使用，“x-y”或“x至y”或“x到y”形式的一系列值包括整数x、y以及它们之间的整数。例如，短语“1-6”或“1至6”或“1到6”旨在包括整数1、2、3、4、5和6。优选的实施方案包括该范围内的每个单独的整数，以及整数的任何子组合。例如，“1-6”的优选整数可以包括1、2、3、4、5、6、1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、2-6等。
如本文所使用，术语“供体”更特别地是指在异头位置具有离去基团的单糖、寡糖或多糖。
如本文所使用，术语“受体”更特别地是指具有至少一个游离羟基的单糖、寡糖或多糖，通常不同于异头羟基，优选至少对应于生长链的伸长位点的游离羟基。
“二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链”特别地分别是指C1-C12烷烃二基、C2-C12烯烃二基或C2-C12炔烃二基链。
“经由所述寡糖或多糖的还原末端与载体结合”特别地是指例如如下箭头所示的末端：
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附图说明
图1显示在小鼠中诱导的抗宋内志贺菌LPS IgG滴度，所述小鼠接受了糖缀合物SonB至SonF的三次注射，所述糖缀合物含有每剂量2.5μg寡糖。在第3次注射后3周进行采血。X轴：糖缀合物。Y轴：抗宋内志贺菌LPS IgG滴度。在SonB、SonC和SonD之间没有观察到统计学上的显著差异。在SonE和SonF之间没有观察到统计学上的显著差异。这些糖缀合物诱导的Ab滴度明显高于SonB、SonC和SonD诱导的Ab滴度。指示了中值(粗线)。t检验MannWithney非参数：***p<0.0005。
图2显示在小鼠中诱导的抗宋内志贺菌LPS IgG滴度，所述小鼠接受了糖缀合物SonF至SonM的三次注射，所述糖缀合物含有每注射剂2μg寡糖。在第3次注射后1个月进行采血。X轴：糖缀合物。Y轴：抗宋内志贺菌LPS IgG滴度。指示了中值(粗线)。t检验MannWithney非参数：***p<0.0005；**p<0.005；*p<0.05。
图3显示在小鼠中诱导的抗宋内志贺菌LPS IgG滴度，所述小鼠接受了三剂量的糖缀合物Son H、Son K和Son M(每注射剂2μg寡糖)。在免疫1后30天(J30 imm1)、免疫2后30天(J30 imm2)和免疫3后7天和30天(分别为J7 imm3和J30 imm3)进行采血。X轴：糖缀合物和采血时间。Y轴：抗宋内志贺菌LPS IgG滴度。指示了中值(粗线)。t检验Mann Withney非参数：***p<0.0005；**p<0.005。图4显示在小鼠中诱导的抗宋内志贺菌LPS IgG滴度，所述小鼠接受了缀合物Son W至Son Z的三次注射，所述缀合物含有每注射剂2μg或0.5μg寡糖。在第3次免疫后3周进行采血。X轴：糖缀合物和寡糖的剂量(分别地，2对应于2μg，0.5对应于0.5μg)。Y轴：抗宋内志贺菌LPS IgG滴度。指示了中值(粗线)。
图5显示在小鼠中诱导的抗宋内志贺菌LPS IgG滴度，所述小鼠接受了缀合物SonN至Son V的三次注射，所述缀合物含有每注射剂2μg寡糖。在第3次免疫后3周进行采血。X轴：糖缀合物。Y轴：抗宋内志贺菌LPS IgG滴度。指示了中值(粗线)。t检验Mann Withney非参数：***p<0.0005。
图6显示在小鼠中诱导的抗宋内志贺菌LPS IgG滴度，所述小鼠接受了缀合物SonN、Son AA和Son BA的两次注射，所述缀合物含有每注射剂2μg寡糖。在第2次免疫后3周进行采血。X轴：具有alum(+AlH)或不具有alum的糖缀合物。Y轴：抗宋内志贺菌LPS IgG滴度。指示了中值(粗线)。t检验Mann Withney非参数：***p<0.0005；**p<0.005。
图7显示在小鼠中诱导的抗宋内志贺菌LPS IgG亚类，所述小鼠接受了缀合物SonY的三次注射。X轴：小鼠IgG亚类。Y轴：抗宋内志贺菌LPS IgG亚类滴度。指示了中值(粗线)。
图8显示在小鼠中诱导的抗宋内志贺菌LPS IgG滴度，所述小鼠接受了缀合物SonCA至Son GA的两次注射，所述缀合物含有每注射剂2μg或1μg寡糖。在第2次免疫后3周进行采血。X轴：糖缀合物和寡糖的剂量(分别地，2对应于2μg，1对应于1μg)。Y轴：抗宋内志贺菌LPS IgG滴度。指示了中值(粗线)。
具体实施方式
实施例
一般程序
Ref 1:[1]H.B.Pfister,L.A.Mulard,Org.Lett.2014,16,4892-4895.
Ref 2:[2]Westphal,O.,和J.Jann.1965.Bacterial lipopolysaccharidesextraction with phenol-water and further application of the procedures.Meth.Carbohydr.Chem.5:83–91。
无水溶剂包括Tol、DCM、DCE、THF、DMF、MeOH、ACN和Py在MS上处理并按原样使用。在Ar气氛下使用干燥的玻璃器皿进行需要无水条件的反应。在使用前通过在高真空下加热来激活MS。使用硅胶60F254，0.25mm预涂布TLC铝箔板进行分析TLC。使用UV254和/或10％的H2SO4水溶液中的苔黑素(1mg·mL-1)并炭化来使化合物可视化。使用硅胶(粒径为40至63μm)进行快速柱层析。使用Kromasil 5μm C18/>10×250mm半制备柱进行RP-HPLC纯化，用含有0.08％TFA水溶液的ACN洗脱，5mL.min-1，UV(λ＝215nm)检测。最终化合物(λ＝215nm或230nm，ESLD)的分析性RP-HPLC使用Kromasil 3.5μm C18/>3×150mm分析柱进行，使用在0.08％TFA水溶液中的ACN以0至20％的线性梯度洗脱20分钟，流速为0.4mL·min-1(条件A)或1.0mL·min-1(条件A’)，使用在10mM乙酸铵水溶液中的ACN以0至20％的线性梯度洗脱20分钟，流速为0.4mL·min-1(条件B)，或者使用Aeris Peptide 3.5μm C18/>2.1×150mm分析柱，使用在0.08％TFA水溶液中的ACN以0至20％的线性梯度洗脱20分钟，流速为0.3mL·min-1(条件C)，或者使用Kromasil 3.5μm C18/>3×150mm分析柱，使用在0.08％TFA水溶液中的ACN以0至40％的线性梯度洗脱20分钟，流速为0.4mL·min-1(条件D)，或者使用在0.08％TFA水溶液中的ACN以0至70％的线性梯度洗脱20分钟，流速为0.4mL·min-1(条件E)。除八糖4以外，NMR波谱均在配备BBO探头的Bruker Avance波谱仪上在303K下在400MHz(1H)和100MHz(13C)下记录。在CDCl3、DMSO-d6和D2O中记录波谱。在八糖4的情况下，NMR波谱在配备高灵敏度TCI低温探头的800MHz Bruker Avance NEO上记录。在CDCl3和DMSO-d6的情况下，化学位移以相对于残留溶剂峰的ppm(δ)为单位报告，在D2O的情况下，化学位移以相对于HOD和DSS(4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)的ppm(δ)为单位报告，1H和13C波谱分别为7.28/77.0、2.50/39.0和4.70/0.00ppm。耦合常数以赫兹(Hz)为单位报告。化学结构的阐明基于1H、COSY、DEPT-135、13C、HSQC、HMBC、HSQCND和NOESY波谱。信号报告为s(单峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、dd(双二重峰)、q(四重峰)、dt(双三重峰)、dq(双四重峰)、ddd(双双二重峰)、m(多重峰)。信号也可以描述为宽(前缀br)或部分重叠(后缀po)。在C-6位的两个磁性不等效的偕质子中，在较低场共振的一个表示为H-6a，在较高场共振的一个表示为H-6b。糖残基根据宋内志贺菌O-Ag重复单元的字母进行字母标注，并在信号归属列表中由下标(A、B)标识。对于由多个重复单元组成的化合物，残基以A/B、Ai/Bi的形式区分，其中A/B对应于还原末端的重复单元。在WATERS QTOF Micromass仪器上以正离子电喷雾电离(ESI+)模式记录HRMS图谱。使用含有0.1％甲酸的1:1ACN/H2O制备溶液。对于敏感化合物，使用1:1MeOH/H2O(向其中加入10mM乙酸铵)制备溶液。
异头脱烯丙基化的一般程序
将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(0.02当量)溶解在无水THF(20mM)中，在H2气氛下搅拌30至40分钟。将所得的黄色溶液用Ar脱气数次，倒入烯丙基糖苷(1.0当量)的无水THF(50-100mM)溶液中。在室温搅拌1至2小时后，加入NIS(1.1当量)和H2O，以达到1:5H2O/THF的比例。在室温搅拌1小时后，加入10％亚硫酸钠水溶液淬灭反应。浓缩反应混合物，用DCM萃取水相。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc)纯化获得期望的半缩醛，为α/β混合物。
PTFA糖基供体合成的一般程序
将半缩醛前体(1.0当量)溶解在丙酮(0.2M)中。加入PTFACl(1.3当量)，然后加入Cs2CO3(1.1当量)。在Ar气氛下在室温搅拌直至完成(估计约2小时)后，将反应混合物通过硅藻土塞过滤，用无水DCM彻底洗涤。减压浓缩滤液。将粗残余物原样用于糖基化反应。通过快速色谱法(含有1％Et3N的cHex/EtOAc)纯化提供分析样品。
氢化的一般程序，其能够伴随裂解苄基酯和苄基醚，将叠氮化物还原为胺和将烯丙基苷元还原为丙基苷元，以及将三氯乙酰胺加氢脱氯为乙酰胺。
方法1：将寡糖(50mg)溶解在2-MeTHF/异丙醇/水(1:15:3，v/v/v)中。加入20％Pd(OH)2/C(100mg，寡糖质量的两倍)，将反应混合物脱气数次并在氢气氛下剧烈搅拌24小时。每1小时后，检查溶液的pH，通过加入1M NaHCO3水溶液来中和溶液(在前6至12小时内加入每NHTCA组3当量)。通过LC-MS和HRMS监测反应进程。平均而言，在12至24小时内完成。通过0.2μm过滤器过滤混悬液，用水反复洗涤固体。在真空下去除挥发物，加入水并将溶液冻干。通过制备型RP-HPLC纯化粗产物。收集所关注的级分并冻干以获得完全脱保护的寡糖，如通过HRMS和NMR分析所确认。
方法2(H-cube，全氢气模式，压力0巴，色谱柱加热器：25℃，流速：0.8至1.2mL.min-1，20％Pd(OH)2-C柱)：将50mg寡糖溶解在2-MeTHF/异丙醇/水(1:15:3，v/v/v)中。将该溶液进行氢化。在每个循环后，通过加入1M NaHCO3水溶液来淬灭释放的HCl(在前3至6个循环内加入每NHTCA组3当量)。通过LC-MS和HRMS分析监测反应进程。平均而言，在6至12个循环后完成。通过0.2μm过滤器过滤混悬液，用水反复洗涤固体。在真空下去除挥发物，加入水并将溶液冻干。通过制备型RP-HPLC纯化粗产物。收集所关注的级分并冻干以获得完全脱保护的寡糖，如通过HRMS和NMR分析所确认。
方法3(10％Pd-C)：将50mg受保护的寡糖溶解在1.0mL 2-MeTHF中，加入2-MeTHF/异丙醇/水(1:10:1，v/v/v)以达到0.2至0.25mM/重复单元。将反应混合物脱气数次，加入10％Pd/C(起始寡糖质量的两倍)，将混悬液在氢气氛(气球)下剧烈搅拌，直到RP-HPLC和HRMS监测表明反应完成。如果需要，随时间加入更多的10％Pd/C(至多为起始寡糖质量的两倍)。定时检查溶液的pH，通过加入1M NaHCO3水溶液(至多每NHTCA组3当量)将其调节到5至6。将混悬液通过硅藻土垫过滤，将固体用水反复洗涤。在真空下去除挥发物，加入水并将溶液冻干。通过制备型RP-HPLC纯化粗产物。收集所关注的级分并冻干以获得完全脱保护的寡糖，如通过HRMS和NMR分析所证实。
-有用的中间体
方案1.通过二醇S2对阿卓糖苷(altroside)12进行保护基操作。i.80％AcOH水溶液,80℃,2小时；ii.CSA,MeOH/DCM(4:1),室温,2小时；iii)Ac2O,Py,室温,3小时,由12计算为88％；iv.TBDPSCl,咪唑,DMF,室温,过夜。
烯丙基2-叠氮基-3-O-苄基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖苷(S2)。将叠氮化物12(4.0g，9.4mmol，1.0当量)溶解在AcOH(40mL)中并加入水(10mL)。将溶液在80℃加热2小时。TLC追踪(Tol/EtOAc 1:1)显示不存在起始材料(Rf 0.9)并且存在新点(Rf 0.1)。达到室温后，将反应混合物真空浓缩。将残余物与甲苯(10mL)共蒸发两次并真空干燥以获得粗的二醇S2。后者具有Rf 0.45(Tol/EtOAc 1:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.38-7.34(m,5H,HAr),5.99-5.90(m,1H,CHAll),5.36-5.31(m,1H,CH2All),5.25-5.22(m,1H,CH2All),4.83(dpo,1H,J＝11.2Hz,CH2Bn),4.80(dpo,1H,J1,2＝2.4Hz,H-1),4.61(d,1H,CH2Bn),4.29-4.23(m,1H,CH2All),4.07-4.01(m,1H,CH2All),3.99(ddd,1H,J4,5＝8.4Hz,H-5),3.92-3.88(m,1H,H-4)3.89(ddpo,1H,J2,3＝3.5Hz,H-2),3.86(ddpo,1H,J5,6b＝3.6Hz,H-6a),3.79(ddpo,1H,J5,6a＝5.2Hz,J6a,6b＝12.3Hz,H-6b),3.78-3.75(mo,1H,H-3)。13C NMR(CDCl3)δ137.0(Cq,Ar),133.6(CHAll),129.0,128.6,128.2,128.2,128.0(CAr),117.4(CH2All),97.9(C-1,1JC,H＝170Hz),76.2(C-3),72.5(CH2Bn),70.8(C-5),68.7(CH2All),64.7(C-4),62.9(C-6),59.6(C-2)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C16H25N4O5计算353.1825；实测353.1827。
烯丙基4,6-二-O-乙酰基-2-叠氮基-3-O-苄基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖苷(22)。将粗的二醇S2(9.4mmol理论值，1.0当量)溶解在吡啶(40mL)中，在室温加入乙酸酐(2.2mL，23.6mmol，2.5当量)。搅拌3小时后，TLC分析表明反应完成。蒸发挥发物，与甲苯(10mL)共蒸发两次，用DCM(150mL)稀释。将有机相用1N HCl水溶液(150mL)、50％NaHCO3水溶液(150mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗品通过快速色谱法纯化，用Tol/EtOAc(4:1→3:1)洗脱，获得二乙酸酯22(3.5g,8.3mmol,88％)，为白色固体。叠氮化物22具有Rf 0.4(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.39-7.31(m,5H,HAr),5.98-5.89(m,1H,CHAll),5.37-5.31(m,1H,CH2All),5.26-5.22(m,2H,H-4,CH2All),4.72(d,1H,J1,2＝4.4Hz,H-1),4.67(ddpo,1H,J＝11.6Hz,CH2Bn),4.29(ddpo,1H,J5,6a＝6.0Hz,H-6a),4.29-4.24(m,2H,H-5,CH2All),4.18-4.15(mpo,1H,H-6b),4.09-4.04(m,1H,CH2All),3.81(dd,1H,J2,3＝8.3Hz,H-2),3.81(dd,1H,J3,4＝3.8Hz,H-3),2.10(s,3H,CH3Ac),2.08(s,3H,CH3Ac)。13C NMR(CDCl3)δ170.4,170.0(COAc),137.1(Cq,Ar),133.4(CHAll),128.4,128.0(CAr),117.3(CH2All),98.7(C-1,1JC,H＝169Hz),74.6(C-3),72.4(CH2Bn),69.6(C-5),69.2(CH2All),66.3(C-4),62.7(C-6),61.5(C-2),20.8(CH3Ac),20.6(CH3Ac)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C20H25N3O7Na计算442.1590；实测442.1597。
烯丙基2-叠氮基-3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖苷(S3)。
将CSA(4.1g，17.7mmol，0.5当量)加入到在MeOH/DCM(4:1，170mL)中的缩醛12(15.0g，35.4mmol，1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 4:1)表明反应完成。加入5％NaHCO3水溶液(300mL)，然后加入EtOAc(500mL)。将有机相分离，用盐水(500mL)洗涤，经Na2SO4干燥并减压浓缩。将材料在高真空下干燥，获得粗的二醇S2，为黄色油状物。后者直接用于下一步。
在0℃，将叔丁基二苯基氯硅烷(10.1mL，38.9mmol，1.1当量)和咪唑(3.1g，46.0mmol，1.3当量)加入到在无水DMF(180mL)中的二醇S2中。使反应混合物缓慢达到室温并在该温度搅拌过夜。加入MeOH(10.0mL)，30分钟后，减压蒸发挥发物。将粗物质溶解在EtOAc(500mL)中，将有机层用90％盐水(500mL)洗涤，分离，经Na2SO4干燥，浓缩以获得粗的甲硅烷基醚S3。后者具有Rf 0.65(Tol/EtOAc 9:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.71-7.68(m,4H,HAr),7.40-7.34(m,11H,HAr),6.00-5.90(m,1H,CHAll),5.35-5.29(m,1H,CH2All),5.23-5.19(m,1H,CH2All),4.84(d,1H,J1,2＝4.2Hz,H-1),4.80(d,1H,J＝11.4Hz,CH2Bn),4.62(d,1H,CH2Bn),4.34-4.29(m,1H,CH2All),4.09-4.04(m,1H,CH2All),4.01(ddd,1H,H-5),3.95(ddd,1H,J4,5＝6.7Hz,H-4),3.91(dd,1H,J5,6b＝3.3Hz,J6a,6b＝11.2Hz,H-6a),3.85-3.80(m,2H,J5,6b＝5.2Hz,H-6b,H-2),3.77(dd,1H,J2,3＝7.3Hz,J3,4＝3.9Hz,H-3),3.77(dd,1H,J4,OH＝5.2Hz,OH-4)。13C NMR(CDCl3)δ137.2,135.7,135.6(Cq,Ar),133.8(CHAll),133.2,133.1,129.7(2C),128.6,128.1,128.0,127.7(CAr),117.3(CH2All),98.2(C-1,1JC,H＝169Hz),76.9(C-3),73.4(C-5),72.6(CH2Bn),68.6(CH2All),65.2(C-4),64.5(C-6),60.8(C-2),26.8(CH3,TBDPS),19.2(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C32H43N4O5Si计算591.3003；实测591.2971。
实施例1：策略2A-NHAc,2B-NTCA,4A-Nap
方案2.通过使用以2A-NHAc为特征的结构单元(building block)逆合成(AB)n低聚物。
-二糖结构单元
·AB受体：来自4A,6A-O-亚苄基A供体
方案3.使用4,6-O-亚苄基A供体的[A+B]糖基化。(i)Zn,AcOH,THF,(ii)a.TCPO,Et3N,DCE,50℃,b.Ac2O,py,90℃,2步83％,(iii)PPh3,H2O,THF,60℃,(iv)FmocCl,NaHCO3,DMAP,DCM,0℃,2步88％,(v)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.I2,NaHCO3,THF/H2O,对于14为43％,和NIS,THF/H2O,对于15为90％,(vi)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,对于16为80％,对于19为90％,(vii)TMSOTf,MSDCE,-30℃,80％,(viii)CCl3CN,K2CO3,Acet,定量,(ix)TMSOTf,MS/>DCE,-15℃,62％(由粗供体20计算)。Acet:丙酮,Ir-cat:[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6。OPTFA:(N-苯基)三氟乙酰亚胺基。
烯丙基3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α-L-阿卓吡喃糖苷(10)。将已知的叠氮化物12[1](10.0g，23.6mmol，1.0当量)溶解在无水THF(95mL)中。在室温加入锌粉(12.3g，189mmol，8.0当量)和AcOH(10.8mL，189mmol，8.0当量)。将反应混合物剧烈搅拌1小时。TLC追踪(Tol/EtOAc1:1)显示高极性产物的形成和起始物12(Rf 0.9)的完全消耗。将混悬液通过硅藻土垫过滤，用DCM(100mL)洗涤两次。将滤液用饱和NaHCO3水溶液洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将对应于已知的胺13[1]的残余物在高真空下干燥2小时。将粗物质(9.6g)用于下一步。
将四氯邻苯二甲酸酐(4.05g，14.1mmol，0.6当量)加入至在室温和Ar气氛下在无水DCM(100mL)中搅拌的粗的13(9.38g，23.6mmol理论值)中。30分钟后，加入Et3N(3.2mL，23.6mmol，1.0当量)，然后加入更多的TCPO(4.05g，14.1mmol，0.6当量)。将反应混合物在室温再搅拌30分钟，此时TLC追踪(EtOAc)显示存在极性产物(Rf 0.0)并且不存在13(Rf0.15)。在减压下除去挥发物，将残余物在高真空下干燥1小时。将粗品溶解在无水Py(90mL)中，在室温加入Ac2O(11.1mL,118mmol,5.0当量)。将混合物加热至80℃持续10分钟，此时TLC追踪显示完成。在减压下除去挥发物，与甲苯(40mL)共蒸发两次。将粗品用DCM(200mL)稀释，用1N HCl水溶液(300mL)、饱和NaHCO3水溶液(300mL)和盐水(250mL)洗涤。将DCM层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗品通过快速色谱法(cHex/EtOAc，98:2至90:10)纯化，获得完全保护的10(13.0g，18.8mmol，83％)，为稠的淡黄色油状物。烯丙基糖苷10具有Rf 0.65(Tol/EtOAc10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.53-7.05(m,10H,HAr),5.88-5.80(m,1H,CHAll),5.65(s,1H,HBzl),5.28-5.23(m,1H,CH2All),5.16-5.12(mpo,1H,CH2All),5.14(dpo,1H,J1,2＝4.0Hz,H-1),4.85(d,1H,J＝12.5Hz,CH2Bn),3.92(t,1H,J2,3＝4.0Hz,H-2),4.71(d,1H,CH2Bn),4.52-4.42(m,2H,H-5,H-6a),4.34(ddpo,1H,J3,4＝4.4Hz,J4,5＝9.6Hz,H-4),4.27-4.22(m,1H,CH2All),4.10(t,1H,H-3),4.03-3.97(m,1H,CH2All),3.88(t,1H,J5,6b＝J6a,6b＝10.0Hz,H-6b)。13C NMR(CDCl3),δ162.3(CONTCP),140.3,138.1,137.6,137.6(Cq,Ar),133.6(CHAll),129.8,129.0,128.2,128.0(2C),127.2,126.9,126.4(CAr),117.3(CH2All),101.8(CBzl),95.4(C-1,1JC,H＝171Hz),76.4(C-4),73.1(C-3),72.8(CH2Bn),69.7(C-6),68.4(CH2All),59.8(C-5),55.5(C-2)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C31H25Cl4NO7Na计算686.0283；实测686.0284。
烯丙基3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-(9-芴基甲氧基羰基)-α-L-阿卓吡喃糖苷(11)。向叠氮化物12(2.4g,5.6mmol,1.0当量)的THF(30mL)溶液中加入三苯基膦(1.63g,6.2mmol,1.1当量)和H2O(3.0mL,169mmol,30当量)。将反应混合物在60℃搅拌过夜，冷却至室温，减压浓缩，与甲苯(10mL)共蒸发两次。将在无水DCM(28mL)中的粗胺13在Ar气氛下在室温经新活化的MS 搅拌30分钟。冷却至0℃后，加入NaHCO3(953mg，11.3mmol，2.0当量)、DMAP(69mg，567μmol，0.1当量)和FmocCl(1.7g，6.8mmol，1.2当量)。在此温度搅拌1小时后，TLC分析(cHex/EtOAc 9:1)显示中间体13(Rf 0.45)转化为极性较小的产物(Rf0.7)。将反应混合物过滤，将固体用DCM(20mL)洗涤两次。真空浓缩滤液，将残余物通过快速色谱法使用cHex/EtOAc(20:1→15:1)纯化，获得Fmoc衍生物11(3.1g,5.0mmol,88％)，为白色固体。完全保护的11具有1H NMR(CDCl3)δ7.81-7.78(m,2H,HAr),7.65-7.60(m,2H,HAr),7.51-7.26(m,15H,HAr),5.98-5.89(m,1H,CHAll),5.57(s,1H,HBzl),5.37-5.31(m,1H,CH2All),5.22-5.20(m,1H,CH2All),4.96(d,J2,NH＝8.8Hz,NH),4.88(d,1H,J＝12.6Hz,CH2Bn),4.83(d,1H,CH2Bn),4.73(s,1H,H-1),4.59-4.48(m,3H,H-5,CH2Fmoc),4.32(dd,1H,J5,6a＝5.6Hz,J6a,6b＝10.4Hz,H-6a),4.29-4.21(m,3H,CHFmoc,H-2,CH2All),4.04-3.99(m,1H,CH2All),3.90(brs,1H,H-3),3.73(tpo,1H,J5,6b＝10.4Hz,H-6b),3.70(brdpo,1H,J4,5＝8.8Hz,H-4)。13C NMR(CDCl3)δ155.2(CONHFmoc),144.3 143.6,141.5,141.4,138.7,137.6(Cq,Ar),133.6(CHAll),129.0,128.2,128.0,127.8,127.5,127.3,127.1,127.0,126.2,124.7,120.0(CAr),117.2(CH2All),102.3(CBzl),98.9(C-1,1JC,H＝170Hz),77.0(C-4),74.2(C-3),72.1(CH2Bn),69.2(C-6),68.4,(CH2All),66.6(CH2Fmoc),58.7(C-5),52.1(C-2),47.3(CHFmoc)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C38H37NO7Na计算642.2468；实测642.2464。
3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α/β-L-阿卓吡喃糖(14)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(38mg,45μmol,0.02当量)溶解在无水THF(5.0mL)中，将红色溶液在H2气氛下搅拌30分钟。将所得浅黄色溶液用Ar脱气数次，倒入烯丙基糖苷10(1.5g，2.26mmol，1.0当量)的无水THF(25mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，TLC追踪(cHex/EtOAc；15:1)显示不存在起始物10(Rf 0.3)并且存在弱极性点(Rf 0.35)。加入碘(1.14g，6.1mmol，1.05当量)，然后立即加入NaHCO3(571mg，6.78mmol，3.0当量)的水(5mL)溶液。在室温搅拌1小时后，通过加入10％Na2SO3水溶液淬灭反应。蒸发挥发物，用DCM(100mL)萃取水层两次。使用cHex/EtOAc(10:1→8:1)通过快速色谱法纯化获得期望的半缩醛14(610mg，0.98mmol，43％)，为白色松软固体，主要对应于单一端基异构体。后者具有Rf 0.15(Tol/EtOAc；10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.55-7.52(m,2H,HAr),7.44-7.38(m,3H,HAr),7.11-7.09(m,2H,HAr),6.94(t,2H,J＝7.6Hz,HAr),6.78-6.74(m,1H,HAr),6.35(dd,1H,J1,OH＝8.8Hz,J1,2＝4.8Hz,H-1),5.61(s,1H,HBzl),4.84(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.46(dd,1H,J5,6a＝5.2Hz,J6a,6b＝10.4Hz,H-6a),4.39(d,1H,CH2Bn),4.30-4.24(m,2H,H-3,H-5),4.02(dd,1H,J2,3＝3.2Hz,H-2),3.87-3.81(m,3H,H-6b,H-4,OH)。13C NMR(CDCl3),δ162.9(CONTCP),139.6,137.7,137.3(Cq,Ar),129.4,129.1,128.9,128.3,127.9,127.0(2C),126.1(CAr),102.0(CBzl),91.1(C-1,1JC,H＝176Hz),79.3(C-4),74.0(CH2Bn),73.9(C-3),69.0(C-6),64.4(C-5),58.4(C-2)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C28H21Cl4NO7Na计算645.9970；实测645.9964。
3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-(9-芴基甲氧基羰基)-α/β-L-阿卓吡喃糖(15)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(71mg,84μmol,0.02当量)的无水THF(5.0mL)溶液在H2气氛下在室温搅拌1小时。将所得的黄色溶液用Ar脱气数次，使用套管转移到烯丙基糖苷11(2.6g，4.1mmol，1.0当量)的无水THF(40mL)溶液中。在室温搅拌1小时后，加入NIS(1.03g,4.6mmol,1.1当量)和H2O(8mL)，将反应混合物再搅拌1小时。完成时，通过加入10％Na2SO3水溶液淬灭反应，去除挥发物。用DCM(40mL)萃取水相两次。将合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。使用Tol/EtOAc(5:1→4:1)通过快速色谱法纯化残余物，获得期望的15(2.2g,3.7mmol,90％)，为白色固体。半缩醛15被分离为7:3α/β混合物，具有Rf 0.2(Tol/EtOAc,4:1)。1H NMR(部分归属,CDCl3)δ7.79-7.77(m,2.7H,HAr),7.76-7.62(m,2.6H,NH,HAr),7.54-7.51(m,2.7H,HAr),7.43-7.28(m,19.5H,HAr),7.22-7.18(m,5.0H,HAr),5.60(s,0.4H,HBzl,β),5.57(s,1H,HBzl,α),5.35-5.30(m,1H,H-1α),5.01-4.90(m,1.9H,H-1β,CH2Bnα,CH2Bnβ),4.78-4.75(m,1.4H,CH2Bnα,CH2Bnβ),4.58-4.55(m,2.6H,CH2Fmoc,αβ),4.34-4.30(m,1H,H-6aα),4.26-4.13(m,5H,H-2α,H-2β,H-3α,H-3β,H-5α,H-5β,CHFmoc,α,CHFmoc,β),3.83-3.69(m,2.9H,H-4α,H-4β,H-6bβ),3.62(brs,0.9H,OHαβ)。13C NMR(CDCl3),δ156.4(COFmoc),143.6,143.5,141.4,141.3,138.3,137.8,137.4,137.0(Cq,Ar),129.2,129.1,129.0,128.5,128.3(2C),128.2,128.0,127.8,127.6,127.1,126.1(2C),125.3,124.9,124.8,124.7,120.0(CAr),102.6(CBzl),102.3(CBzl),94.7(C-1β,1JC,H＝175.6Hz),92.0(C-1α,1JC,H＝170.6Hz),77.3(C-4α,C-4β),75.3(C-3α),75.3(C-3β),74.5(CH2Bn,β),73.5(CH2Bn,α),69.3(C-6α),68.9(C-6β),66.8(CH2Fmoc,β),66.8(CH2Fmoc,α),64.5(C-5α,C-5β),54.6(C-2α),52.7(C-2β),47.3(CHFmoc,α,CHFmoc,β)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C35H33NO7Na计算602.2155；实测602.2153。
3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α/β-L-阿卓吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(16)。将半缩醛14(2.85g,4.2mmol,1.0当量)溶解在丙酮(40mL)中，加入PTFACl(855μL,5.5mmol,1.3当量)，然后加入Cs2CO3(1.68g,5.1mmol,1.1当量)。在室温搅拌2小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 10:1)显示存在极性较小的点(Rf 0.7)并且仅存在痕量的半缩醛14。将反应混合物经硅藻土垫过滤，用丙酮(10mL)洗涤两次。减压浓缩滤液，将残余物通过快速色谱法纯化(cHex/EtOAc 95:5→93:7，含有1％Et3N)，获得供体16，为白色固体(2.75g，3.46mmol，80％)。后者为两种端基异构体的10:3混合物，具有Rf0.3(cHex/EtOAc10:1)。1H NMR(部分归属,CDCl3)δ7.76(brs,0.8H,HAr),7.59(d,0.8H,J＝7.6Hz,HAr),7.52-7.08(m,18.4H,HAr),6.98(d,0.4H,J＝7.2Hz,HAr),6.82(d,1.6H,J＝7.2Hz,HAr),5.50(s,0.8H,CHBzl),5.24(s,0.2H,CHBzl),5.01-4.96(m,1.8H),4.76-4.66(m,1.3H),4.35(dd,0.8H,J＝5.2Hz,J＝10.8Hz),4.25(dd,0.4H),3.94(t,0.8H,J＝8.0Hz,J＝8.4Hz),3.87-3.81(m,0.8H),3.79-3.71(m,0.4H),3.64-3.51(m,0.8H),3.46-3.43(m,0.8H)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C36H25Cl4F3N2O7Na计算817.0266；实测817.0242。
烯丙基3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-β-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(17)、烯丙基3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(18)和3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-L-altral(S1)。将受体8(600mg，1.61mmol，1.0当量)和PTFA供体16(1.4g，1.77mmol，1.1当量)在无水DCE(20mL)中的混合物与新活化的MS(1.0g)在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。将反应混合物冷却至-20℃，缓慢加入TMSOTf(19μL，10μmol，0.06当量)。在-20℃搅拌30分钟后，此时TLC追踪显示供体消耗，加入Et3N，过滤混悬液，真空浓缩滤液。使用cHex/EtOAc(15:1→10:1)进行快速色谱法，获得不需要的白色固体状的β-异构体17(960mg，0.98mmol，61％)与需要的α-异构体18(150mg，0.15μmol，10％)，以及消除产物S1(220mg，0.36mmol，20％就16而论)。β-异构体17具有Rf 0.35(cHex/EtOAc 10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.53-7.39(m,5H,HAr),7.09(dd,2H,J＝1.0,8.0Hz,HAr),6.95(t,2H,J＝7.6Hz,HAr),6.79-6.73(m,2H,HAr,NH),6.20(d,1H,J1,2＝8.5Hz,H-1A),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.58(s,1H,HBzl),5.28-5.23(m,1H,CH2All),5.18-5.14(m,1H,CH2All),4.82(d,1H,J＝12.5Hz,CH2Bn),4.77(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.45(dd,1H,J5,6a＝5.1Hz,J6a,6b＝10.2Hz,H-6aA),4.41(ddpo,1H,J3,4＝3.4Hz,J2,3＝10.9Hz,H-3B),4.40(dpo,1H,CH2Bn),4.35-4.30(m,1H,CH2All),4.28(brt,H-3A),4.24(ddd,1H,J4,5＝9.6Hz,J5,6＝4.8Hz,H-5A),4.22(dd,1H,J2,3＝3.1Hz,H-2A),4.07-4.02(m,1H,CH2All),3.97(brd,1H,H-4B),3.86(t,1H,J5,6b＝10.4Hz,H-6bA),3.80(dd,1H,J4,5＝9.6Hz,J3,4＝2.3Hz,H-4A),3.72-3.64(m,2H,H-2B,H-5B),1.36(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ163.8(CONHTCA),162.7,161.6(2C,CONTCP),139.9,139.5,137.3,137.1(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.6,129.3,129.2,128.9,128.3,128.0,127.7,127.1,126.2,126.1(CAr),117.7(CH2All),102.0(CBzl),98.8(C-1B,1JC,H＝161Hz),96.0(C-1A,1JC,H＝173Hz),92.8(CCl3),79.2(C-4A),76.9(C-3B),74.6(CH2Bn),73.9(C-3A),69.9(CH2All),69.3(C-5B),69.2(C-6A),64.5(C-5A),63.5(C-4B),57.1(C-2A),53.7(C-2B),17.4(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C39H34Cl7N5O10Na计算1000.0023；实测1000.0015。
α-异构体18具有Rf 0.3(cHex/EtOAc 10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.54-7.51(m,2H,HAr),7.48-7.37(m,3H,HAr),7.28(d,2H,J＝6.8Hz,HAr),7.12(tpo,3H,J＝8.0Hz,HAr),6.97(tpo,1H,J＝7.2Hz,HAr),6.79(d,1H,J2,NH＝6.4Hz,NHB),5.86-5.76(m,1H,CHAll),5.63(s,1H,HBzl),5.35(d,1H,J1,2＝5.6Hz,H-1A),5.24-5.18(m,1H,CH2All),5.16-5.12(m,1H,CH2All),4.82(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.81(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B),4.74(dd,1H,J2,3＝4.8,Hz,H-2A),4.64(dd,1H,J3,4＝3.6Hz,J2,3＝10.8Hz,H-3B),4.58-4.46(m,2H,H-5A,CH2Bn),4.50(dd,1H,J5,6a＝5.2Hz,J6a,6b＝10.4Hz,H-6aA),4.32-4.27(m,1H,CH2All),4.21(dd,1H,J3,4＝4.8Hz,J4,5＝8.8Hz,H-4A),4.12(brt,1H,H-3A),4.02-3.97(m,1H,CH2All),3.89(brd,1H,J3,4＝2.8Hz,H-4B),3.85(t,1H,J5,6b＝10.1Hz,H-6bA),3.71(dqpo,1H,H-5B),3.53-3.46(m,1H,H-2B),1.39(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ162.5(CONHTCA),161.7(CONTCP),140.3,137.9,137.3(Cq,Ar),133.4(CHAll),129.9,129.1,128.4,128.2,127.9,127.1,126.9,126.2(CAr),118.0(CH2All),101.7(CBzl),97.7(C-1A,1JC,H＝173Hz),97.3(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.1(CCl3,),76.3(C-4A),76.1(C-3B),73.0(CH2Bn),72.0(C-3A),70.2(CH2All),69.6(C-6A),69.1(C-5B),65.8(C-4B),60.8(C-5A),55.7(C-2A),55.7(C-2B),17.5(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C39H38Cl7N6O10计算995.0469；实测995.0437。
Altral S1具有Rf 0.65(cHex/EtOAc 10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.58-7.56(m,2H,HAr),7.45-7.40(m,3H,HAr),7.15(dpo,2H,J＝7.2Hz,HAr),6.96-6.92(mpo,2H,HAr),6.79-6.75(m,1H,HAr),6.61(s,1H,H-1),5.67(s,1H,HBzl),4.83(d,1H,J＝12.6Hz,CH2Bn),4.60(dd,1H,J5,6a＝5.3Hz,J6a,6b＝10.4Hz,H-6a),4.50(dt,1H,J5,6b＝10.3Hz,J4,5＝5.3Hz,H-5),4.39(d,1H,J3,4＝5.3Hz,H-3),4.38(d,1H,CH2Bn),4.21(dd,1H,H-4),3.96(t,1H,H-6b)。13CNMR(CDCl3)δ162.5(CONTCP),147.3(C-1),139.9,138.6,137.2(Cq,Ar),129.7,129.2,128.7,128.3,127.9,127.1,126.9,126.2(CAr),108.4(C-2),101.7(CBzl),77.9(C-4),74.0(CH2Bn),68.3(C-6),67.6(C-3),65.1(C-5)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C28H23Cl4N2O6计算623.0310；实测623.0295。
3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-(9-芴基甲氧基羰基)-α/β-L-阿卓吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(19)。将半缩醛15(170mg，293μmol，1.1当量)溶解在丙酮(6mL)中。加入PTFACl(60μL，382μmol，1.3当量)，然后加入Cs2CO3(105mg，323μmol，1.1当量)。在室温搅拌1小时后，TLC分析表明反应完成。将反应混合物经硅藻土垫过滤，将固体用DCM(5mL)洗涤两次。减压蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法用cHex/EtOAc(98:2→90:10)洗脱来纯化，获得期望的19(200mg,273μmol,90％)，为灰白色固体。受约束的PTFA供体具有Rf 0.8(Tol/EtOAc 9:1)。1H NMR(α端基异构体,CDCl3)δ7.68-7.50(m,18H,HAr),5.67(d,1H,J＝3.6Hz,H-1),5.50(s,1H,HBzl),4.67(brs,1H,CH2Fmoc),4.54(brs,1H,CH2Bn),4.50(ddpo,1H,CH2Fmoc),437-4.33(m,1H,H-6a),4.27-4.10(m,3H,H-5,H-3,CHFmoc),3.70-3.58(m,2H,H-6b,H-2)3.60(ddpo,1H,J3,4<1.0Hz,J4,5＝8.8Hz,H-4)。13C NMR(CDCl3)δ153.4(CONFmoc),141.3,139.7,137.8,137.4(Cq,Ar),129.4,129.1,128.5,128.3,128.2(2C),127.8,127.7,127.6,127.5,127.3,127.2,127.0,126.3,126.1,124.6,124.3,122.5,120.4,120.3,120.2(CAr),102.6(CBzl),95.8(C-1,1JC,H＝182Hz),75.7(C-4α),73.7(CH2Bn),71.6(C-3),69.0(C-6),67.2(CH2Fmoc),63.7(C-5α),61.2(C-2α),47.0(CHFmoc)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C43H38F3N2O7计算751.2631；实测751.2665。
烯丙基3-O-苄基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-2-N-(9-芴基甲氧基羰基)-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(21)。将半缩醛15(343mg，59μmol，1.1当量)溶解在丙酮(10mL)中并冷却至0℃。加入三氯乙腈(855μL,2.36mmol,4.0当量)，然后加入K2CO3(163mg,1.18mmol,2.0当量)。在0℃搅拌4小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，用DCM(5mL)洗涤两次。减压浓缩滤液，获得粗的三氯乙酰亚氨酯20。
将粗的20(1.1当量理论值)与受体8(200mg,538μmol,1.0当量)混合，与甲苯反复共蒸发，并在高真空下干燥2小时。将混合物溶解在无水DCM(10mL)中，在Ar气氛下与新活化的MS(500mg)一起搅拌45分钟，然后将温度设定为-15℃。缓慢加入TMSOTf(7μL，30μmol，0.05当量)。在此温度搅拌30分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc 3:1)显示存在一个新点(Rf0.4)，该点接近受体8的点(Rf 0.35)和半缩醛15的点(Rf 0.32)。加入Et3N(约10μL)，将混悬液通过合适的漏斗过滤。减压浓缩滤液，将残余物通过快速色谱法用Tol/EtOAc(5:1→4:1)洗脱来纯化，获得期望的二糖21(200mg,214μmol,62％)。偶联产物具有1H NMR(CDCl3)δ7.80-7.77(m,2H,HAr),7.59-7.57(dpo,2H,HAr),7.52-7.29(m,15H,HAr),6.90(d,J2,NH＝6.2Hz,NHB),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.56(s,1H,CHBzl),5.29-5.24(m,1H,CH2All),5.20-5.17(m,1H,CH2All),4.99(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B),4.87(dpo,1H,J＝11.8Hz,CH2Bn),4.84(dpo,1H,J＝7.2Hz,NHA),4.80(dpo,1H,CH2Bn),4.77(spo,1H,H-1A),4.64-4.58(m,2H,H-3B,H-5A),4.52(brd,2H,J＝5.8Hz,CH2,NHFmoc),4.36-4.31(m,2H,H-6aA,CH2All),4.24(brd,1H,J2,NH＝7.2Hz,H-2A),4.20(t,1H,J＝6.0Hz,CHNHFmoc),4.09-4.04(m,1H,CH2All),3.87(brs,1H,H-3A),3.78(brq,1H,H-5B),3.72(t,1H,J5,6b＝J6a,6b＝10.5Hz,H-6bA),3.69(brdpo,1H,J3,4＝3.0Hz,H-4B),3.67(brdpo,1H,J4,5＝8.0Hz,H-4A),3.49-3.43(m,1H,H-2B),1.42(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ162.2(CONTCA),154.9(CONFmoc),143.5,141.4,141.3,138.9,137.3(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.1,128.2,128.0,127.8,127.4,127.2,127.1,126.2,124.8,124.7,120.0(CAr),117.9(CH2All),102.3(CBzl),101.6(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.2(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.0(CCl3,),76.7(C-4A),75.6(C-3B),74.0(C-3A),72.3(CH2Bn),70.2(CH2All),69.7(C-5B),69.1(C-6A),66.6(CH2Fmoc),65.9(C-4B),59.7(C-5A),56.1(C-2B),52.4(C-2A),47.3(CHNHFmoc),17.4(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C46H50Cl3N6O7计算951.2654；实测951.2694。
-A供体的使用，其中保护基团如4A-OH和6A-OH是相同的
方案4.使用模型4,6-二-O-乙酰基供体25进行[A+B]糖基化。(i)80％水溶液80℃,(ii)Ac2O,py,2步88％,(iii)Zn,AcOH,THF,(iv)a.TCPO,py,DCE,50℃,b.Ac2O,py,90℃,2步85％,(v)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,86％,(vi)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,2步86％,(vii)8,TMSOTf,DCM,-20℃,88％,(viii)NaOMe,MeOH,(ix)a.H2NCH2CH2NH2,MeOH,50℃,b.Ac2O,MeOH,2步68％,(x)TEMPO,BAIB,DCM/H2O,(xi)BnBr,K2CO3,DMF,2步36％.BAIB:[双(乙酰氧基)碘]苯,TEMPO:2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基。
烯丙基4,6-二-O-乙酰基-3-O-苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α-L-阿卓吡喃糖苷(23)。在室温，将锌粉(5.6g,85.8mmol,8.0当量)和AcOH(4.9mL,85.8mmol,8.0当量)加入到叠氮化物22(4.5g,10.7mmol,1.0当量)的THF(70mL)溶液中。将反应混合物搅拌2小时，此时TLC追踪(Tol/EtOAc 1:1)表明不存在任何剩余的22(Rf 0.8)并且存在极性更强的产物。将混合物经硅藻土垫过滤，将固体用DCM(100mL)洗涤两次。将合并的有机相用饱和NaHCO3水溶液(200mL)和盐水(200mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物在高真空下干燥3小时并原样进行下一步。粗的胺中间体具有HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C20H28NO7计算394.1866；实测394.1856。
将四氯邻苯二甲酸酐(3.68g，12.8mmol，1.2当量)加入到粗中间体的DCM(40mL)溶液中，将溶液在室温搅拌30分钟。加入Et3N(1.79mL，12.8mmol，1.2当量)，将反应混合物再搅拌30分钟。在减压下去除挥发物，将残余物在高真空下干燥1小时。将粗物质溶解于吡啶(50mL)，在0℃加入Ac2O(5.0mL,53.6mmol,5.0当量)。将混合物加热至80℃持续10分钟。TLC追踪(Tol/EtOAc 9:1)显示生成的产物(Rf 0.7)的极性略高于叠氮化物22(0.75)。达到室温后，将反应混合物浓缩，与甲苯(15mL)共蒸发两次。将残余物用DCM(100mL)稀释，用1NHCl水溶液(200mL)、饱和NaHCO3水溶液(200mL)和盐水(200mL)洗涤。将DCM层经Na2SO4干燥，过滤，浓缩，将残余物通过快速色谱法用cHex/EtOAc(12:1→9:1)洗脱来纯化，获得二乙酸酯23(6.0g,9.1mmol,85％)，为淡黄色泡沫。化合物23具有Rf 0.35(Tol/EtOAc 10:1)。1HNMR(CDCl3)δ7.29-7.17(m,2H,HAr),7.06-7.00(m,3H,HAr),5.81-5.72(m,1H,CHAll),5.50(ddpo,1H,H-4),5.37(d,1H,J＝7.3Hz,H-1),5.22-5.17(m,1H,CH2All),5.13-5.09(m,1H,CH2All),4.61(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.53(dd,1H,Hz,J2,3＝11.2Hz,H-2),4.44(dd,1H,J3,4＝4.3Hz,H-3),4.39(dd,1H,J5,6a＝6.6Hz,J6a,6b＝11.7Hz,H-6a),4.37(dd,1H,J5,6b＝5.7Hz,H-6b),4.30(dtpo,1H,J4,5＝3.1Hz,H-5),4.23-4.18(m,1H,CH2All),4.20(dpo,1H,CH2Bn),4.01-3.96(m,1H,CH2All),2.21(s,3H,CH3Ac),2.17(s,3H,CH3Ac)。13C NMR(CDCl3)δ170.0(COAc),162.9(CONTCP),139.9,137.4,129.6,127.0,125.2(Cq,Ar),133.4(CHAll),129.0,128.2,128.1,127.6(CAr),117.7(CH2All),95.4(C-1,1JC,H＝169Hz),72.7(C-5),72.1(CH2Bn),71.1(C-3),69.3(CH2All),68.8(C-4),62.9(C-6),53.2(C-2)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C28H29Cl4N2O9计算677.0627；实测677.0622。
4,6-二-O-乙酰基-3-O-苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α/β-L-阿卓吡喃糖(24)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(59mg,0.07mmol,0.02当量)在无水THF(5.0mL)中在H2气氛下在室温搅拌30分钟。将所得的黄色溶液用Ar脱气数次，使用套管转移到烯丙基糖苷23(2.3g，3.4mmol，1.0当量)的无水THF(25mL)溶液中。在室温搅拌1小时后，加入NIS(864mg,3.8mmol,1.05当量)和H2O(5mL)。2小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示存在比烯丙基糖苷23(Rf 0.65)极性更大的化合物(Rf 0.35)。加入10％Na2SO3水溶液，将反应混合物浓缩以去除THF，将水相用DCM(50mL)萃取三次。将合并的DCM相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。使用Tol/EtOAc(8:1→6:1)通过快速色谱法纯化残余物，获得预期的24(2.0g，3.2mmol，92％)，为白色松软固体(α/β～5:1)。半缩醛24(α端基异构体)具有1H NMR(萃取的,CDCl3)δ7.28-7.01(m,5H,HAr),5.61(t,1H,J1,2＝J1,OH＝7.6Hz,H-1),5.60(dd,1H,H-4),4.60(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.53(dd,1H,J3,4＝3.8Hz,J2,3＝11.1Hz,H-3),4.43-4.35(m,3H,H-2,H-6a,H-6b),4.32(ddd,1H,J4,5＝2.1Hz,J5,6＝5.1Hz,J5,6＝7.1Hz,H-5),4.22(d,1H,CH2Bn),3.49(d,1H,OH)。13C NMR(CDCl3)δ170.6,170.4(COAc),163.1(CONTCP),140.0,137.8,137.4(Cq,Ar),129.7,129.0,128.1(2C),127.7(CAr),128.3,128.2,127.8,125.3,90.4(C-1α,1JC,H＝170Hz),73.8(C-3),71.9(CH2Bn),70.8(C-5),66.9(C-4),62.6(C-6),55.0(C-2),21.0,20.8(2C,CH3Ac)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C25H25Cl4N2O9计算637.0314；实测637.0336。
半缩醛24(β端基异构体)具有1H NMR(萃取的,CDCl3)δ7.28-7.01(m,5H,HAr),5.64(dd,1H,J3,4＝2.0Hz,J4,5＝2.8Hz,H-4),5.43(t,1H,J1,2＝J1,OH＝4.0Hz,H-1),5.21(dd,1H,J5,6a＝3.2Hz,J5,6b＝11.2Hz,H-5),4.75(dd,1H,J1,2＝3.2Hz,J2,3＝10.4Hz,H-2),4.69(d,1H,J＝10.8Hz,CH2Bn),4.60(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.54-4.49(mo,2H,H-6a,H-6b),4.43-4.35(mo,1H,CH2Bn,β),4.21-4.17(mpo,1H,H-3),4.11(d,1H,OH)。13C NMR(CDCl3),δ170.9,170.3(COAc),163.8(CONTCP),140.2,137.8(Cq,Ar),128.3,128.2,127.8,125.2(CAr),93.1(C-1α,1JC,H＝175Hz),75.2(C-3),71.5(CH2Bn),67.6(C-5),67.5(C-4),64.5(C-6),53.0(C-2),21.4,21.0(2C,CH3Ac)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C25H25Cl4N2O9计算637.0314；实测637.0336。
4,6-二-O-乙酰基-3-O-苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α/β-L-阿卓吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(25)。将半缩醛24(1.5g,2.4mmol,1.0当量)溶解在丙酮(20mL)中。加入PTFACl(580μL,3.6mmol,1.5当量)，然后加入碳酸铯(947mg,2.9mmol,1.2当量)。将反应混合物在室温搅拌。2小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 6:1)显示存在新化合物(Rf0.65)并且不存在半缩醛24(Rf 0.2)。将反应混合物经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮(10mL)洗涤两次。浓缩滤液，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 9:1)纯化，获得PTFA25(1.8g，2.2mmol，94％)，为白色固体。供体25(α/β3:2)具有Rf 0.65(cHex/EtOAc 9:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.29-6.99,6.72,6.54(m,14H,HAr),6.54,(bso,0.6H,H-1α),6.43(brs,0.4H,H-1β),5.71(d,0.4H,J4,5＝2.4Hz,H-4β),5.54(dd,0.6H,J3,4＝3.2Hz,J4,5＝3.6Hz,H-4α),5.45(dd,0.4H,J3,4＝2.8Hz,J2,3＝9.6Hz,H-3β),4.97(dd,0.4H,J1,2＝3.6Hz,H-2β),4.71(d,0.4H,J＝10.4Hz,CH2Bnβ),4.7(dd,0.6H,J1,2＝4.8Hz,J2,3＝10.8Hz,H-2α),4.65(d,0.6H,J＝12.4Hz,CH2Bnα),4.60(ddpo,0.4H,J6a,6b＝8.0Hz,J5,6b＝4.4Hz,H-6aβ),4.65(d,0.6H,CH2Bnα),4.51-4.35(m,2.2H,H-5α,H-5β,H-6aα,H-6bβ,H-3α),4.33(dd,0.6H,J6a,6b＝12.4Hz,J5,6b＝4.8Hz,H-6bα),4.23(d,0.6H,CH2Bnα),2.23,2.16(2s,1.8H,CH3Acα),2.21,2.17(2s,1.2H,CH3Acβ)。13C NMR(CDCl3)δ170.4(2C,COAc,β),170.3,169.9(2C,COAc,α),163.2(COTCP,β),162.6(COTCP,α),142.9,142.5,140.3,137.8,129.8,126.9,124.5(CAr,β,q),140.1,137.2,129.7,126.9,124.5(CAr,α,q),129.0,128.6(2C),128.3,128.2,128.1,127.9,127.7,125.2,124.5(2C),119.4,119.1(CAr,β,CAr,α),95.2(C-1α,1JC,H＝182Hz,C-1β,1JC,H＝177Hz),76.3(C-5β),74.2(C-5α),72.3(CH2Bnα),71.8(CH2Bnβ),70.8(C-3β),67.5(C-4α,C-4β),66.7(C-3α),63.3(C-6β),63.2(C-6α),52.3(C-2α),51.5(C-2β),21.4,20.9(CH3Acα),20.8,20.6(CH3Acβ)。
烯丙基4,6-二-O-乙酰基-3-O-苄基-2-脱氧-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(26)。将受体8(2.03g,5.45mmol,1.0当量)和PTFA25(5.4g,6.54mmol,1.2当量)的混合物与无水甲苯(20mL)共蒸发，在高真空下干燥1小时，然后溶解于无水DCE(130mL)中。加入新活化的MS(1.0g)，在Ar气氛下在室温搅拌45分钟后，将反应混合物冷却至0℃，加入TMSOTf(59μL，327μmmol，0.05当量)。在0℃下20分钟后，TLC追踪(Tol/EtOAc 3:1)显示一个新点(Rf 0.4)并且没有剩余的受体8(Rf 0.35)。加入Et3N，将混悬液通过合适的漏斗过滤。将固体用DCM(30mL)洗涤两次，在减压下浓缩滤液。使用Tol/EtOAc(8:1→6:1)通过快速色谱法获得期望的二糖26(4.7g，4.83mmol，88％)，为白色固体。二乙酸酯26具有1H NMR(CDCl3)δ7.28-7.16(m,2H,HAr),7.00(brs,3H,HAr),6.67(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB),5.83-5.74(m,1H,CHAll),5.56(d,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A),5.46(dd,1H,J4,5＝2.8Hz,H-4A),5.22-5.16(m,1H,CH2All),5.17-5.10(m,1H,CH2All),4.75(d,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1B),4.58(ddpo,1H,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3B),4.57(do,1H,CH2Bn),4.57(ddpo,1H,J2,3＝11.2Hz,H-2A),4.41(ddpo,1H,J3,4＝3.9Hz,H-3A),4.40-4.35(m,3H,H-5A,H-6aA,H-6bA),4.29-4.24(m,1H,CH2All),4.16(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.00-3.95(m,1H,H-4B,CH2All),3.68(dq,J4,5＝1.0Hz,H-5B),3.55(ddd,1H,J2,3＝11.0Hz,H-2B),2.18(s,3H,CH3Ac),2.17(s,3H,CH3Ac),1.37(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ170.5,170.3(COAc),162.9(CONHTCA),161.5(CONTCP),139.9,137.8,137.2(Cq,Ar),133.4(CHAll),129.0,128.2,128.1,128.0,127.6,125.2(CAr),118.0(CH2All),97.9(C-1A,1JC,H＝171Hz),97.5(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.2(CCl3),76.6(C-3B),73.2(C-3A),72.1(CH2Bn),70.6(C-5A),70.1(CH2All),69.0(C-5B),66.5(C-4A),65.4(C-4B),62.8(C-6A),55.3(C-2B),53.1(C-2A),20.8(2C,CH3Ac),17.5(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C36H38Cl7N6O12计算991.0367；实测991.0355。
烯丙基(2-乙酰胺基-4,6-二-O-乙酰基-3-O-苄基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖基)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(27)。将乙二胺(41μL，617μmol，4.0当量)加入二糖24(150mg，154μmol，1.0当量)的正丁醇(8mL)溶液中，将溶液在70℃加热72小时。TLC追踪(Tol/EtOAc 4:1)表明不存在邻苯二甲酰亚胺24，在反应混合物达到室温后，去除挥发物，将残余物与甲苯(5mL)共蒸发两次。将乙酸酐(0.15mL，1.5mmol，10当量)加入到在吡啶(4mL)中的残余物中，将系统在室温搅拌。在4小时后没有进一步演变的情况下(TLC：Tol/EtOAc 4:1)，蒸发挥发物，将残余物通过柱色谱法用Tol/EtOAc(80:20→70:30)洗脱来纯化，获得27(76mg,101μmol,65％)，为白色固体。期望的27具有Rf 0.45(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.41-7.30(m,5H,HAr),6.67(d,1H,J2,NH＝8.3Hz,NHB),5.83-5.74(m,1H,CHAll),5.56(d,1H,J1,2＝7.6Hz,NHA),5.29-5.24(m,1H,CH2All),5.20-5.17(m,1H,CH2All),5.02(dd,1H,J3,4＝3.4Hz,J4,5＝8.2Hz,H-4A),4.90(d,1H,J1,2＝2.2Hz,H-1A),4.87(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.67(d,1H,J＝12.3Hz,CH2Bn),4.64(d,1H,CH2Bn),4.59(dddpo,1H,J5,6a＝5.6Hz,H-5A),4.55(ddpo,1H,J3,4＝3.5Hz,H-3B),4.37-4.31(mpo,1H,CH2All),4.44-4.34(m,2H,H-2A,H-6aA),4.18(dd,1H,J5,6b＝2.9Hz,J6a,6b＝12.0Hz,H-6bA),4.09-4.04(m,1H,CH2All),3.91(dd,1H,J2,3＝5.3Hz,H-3A),3.84(brd,1H,J3,4＝3.4Hz,H-4B),3.77(brq,J4,5＝1.0Hz,H-5B),3.58(ddd,1H,J2,3＝10.8Hz,H-2B),2.18,(s,3H,CH3Ac),2.17(s,3H,CH3Ac),1.37(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ170.5,170.3(2C,COAc),162.9(CONHTCA),161.5(CONTCP),139.9,137.8,137.2,(Cq,Ar),133.4(CHAll),129.0,128.2,128.1,128.0,127.6,125.2(CAr),118.0(CH2All),97.9(C-1A,1JC,H＝171Hz),97.5(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.2(CCl3),76.6(C-3B),73.2(C-3A),72.1(CH2Bn),70.6(C-5A),70.1(CH2All),69.0(C-5B),66.5(C-4A),65.4(C-4B),62.8(C-6A),55.3(C-2B),53.1(C-2A),20.8(2C,CH3Ac),17.5(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C30H39Cl3N5O11计算750.1711；实测750.1746。
烯丙基2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(28)。将NaOMe(26μL，25％NaOMe的MeOH溶液，0.2当量)加入到在无水甲醇(15mL)中的二糖26(500mg，514μmol，1.0当量)中。在室温搅拌1小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 1:2)表明反应完成，逐滴加入Dowex树脂(H+)以达到pH 7。混悬液通过合适的漏斗过滤，将滤液浓缩并在高真空下干燥。所得的二醇具有(HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C32H34Cl7N6O10计算907.0156；实测907.0156)。
充分干燥后，将中间体二醇溶解在THF/MeOH(1:4,15mL)中。加入乙二胺(137μL，2.0mmol，4.0当量)，将混合物在70℃加热48小时。在反应完成时(TLC：EtOAc)，将反应混合物冷却，减压浓缩，并与甲苯(5mL)共蒸发两次。将Et3N(500μL)和乙酸酐(485μL，5.1mmol，10当量)加入到在甲醇(10mL)中的残余物中。在室温搅拌2小时后，TLC追踪(EtOAc/MeOH 9:1)表明反应完成。蒸发挥发物，将残留物通过柱色谱法(DCM/MeOH 95:5)纯化，获得期望的28(235mg,353μmol,69％)，为白色固体。二醇28具有Rf 0.2(EtOAc)。1H NMR(DMSO-d6)δ8.85(d,1H,J＝9.0Hz,NHB),7.93(dpo,1H,J＝8.7Hz,NHA),7.44-7.22(m,5H,HAr),5.86-5.76(m,1H,CHAll),5.26-5.21(m,1H,CH2All),5.12-5.09(m,1H,CH2All),4.79(d,1H,J1,2＝1.7Hz,H-1A),4.65(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.61-4.56(m,2H,OH),4.51(dpo,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1B),4.50(dpo,1H,CH2Bn),4.27(ddd,1H,J2,3＝3.9Hz,H-2A),4.22-4.17(m,1H,CH2All),4.11-4.07(mpo,1H,J3,4＝3.6Hz,H-3B),4.09(brso,1H,H-4B),4.04(ddd,1H,J4,5＝9.2Hz,J5,6a＝2.1Hz,J5,6b＝7.1Hz,H-5A),3.99-3.96(m,1H,CH2All),3.90-3.84(m,1H,H-2B),3.76-3.70(m,2H,H-5B,H-6aA),3.64(m,1H,H-4A),3.54-3.48(mpo,1H,H-6bA),3.47(pt,1H,J3,4＝4.1Hz,H-3A),1.79(s,3H,CH3Ac),1.27(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13CNMR(DMSO-d6)δ169.0(CONHTCA),162.2(CONHAc),139.4(Cq,Ar),134.8(CHAll),128.2,127.9,127.4(CAr),116.8(CH2All),102.0(C-1A,1JC,H＝170Hz),100.3(C-1B,1JC,H＝163Hz),93.5(CCl3),77.4(C-3B),76.9(C-3A),71.6(C-5A),71.0(CH2Bn),69.7(C-5B),69.3(CH2All),65.3(C-4B),64.9(C-4A),62.0(C-6A),53.4(C-2B),49.4(C-2A),22.9(CH3Ac),17.7(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C26H35Cl3N5O9计算666.1486；实测666.1500。
烯丙基(2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(29)。将TEMPO(89mg，0.057mmol，0.2当量)和BAIB(242mg，0.75mmol，2.5当量)加入到在DCM/H2O(2:1,15mL)中的二醇28(200mg，301μmol，1.0当量)中。将反应在室温搅拌4小时。当TLC(EtOAc/MeOH 9:1)指示完成时，加入10％Na2SO3水溶液，用DCM(20mL)稀释双相混合物。将水相分离并用DCM(10mL)萃取两次。将水相用稀HCl水溶液酸化以达到pH 1，用DCM(10mL)洗涤三次。将合并的有机相用盐水洗涤，通过分相过滤器干燥并减压浓缩。将苄基溴(142μL，1.2mmol，4.0当量)和K2CO3(83mg，0.60mmol，2.0当量)加入到在无水DMF(2mL)中的残余物中。在室温搅拌1小时后，将反应混合物用H2O(50mL)稀释，将水层用DCM(20mL)萃取三次。将有机相合并，用盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。用Tol/EtOAc(3:1→2:1)洗脱通过快速色谱法获得苄基酯29(85mg,110μmol,36％)，为白色固体。二糖29具有Rf 0.3(Tol/EtOAc 1:1)。1HNMR(CDCl3)δ7.43-7.31(m,10H,HAr),6.81(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.89-5.79(m,1H,CHAll),7.93(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NHA),5.28(d,1H,J2,NH＝12.1Hz,CH2Bn-6,CH2All),5.29-5.23(mpo,1H,CH2All),5.22(dpo,1H,CH2Bn-6),5.20-5.16(m,1H,CH2All),4.93(d,1H,J1,2＝3.2Hz,H-1A),4.78(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.73(d,1H,J＝11.8Hz,CH2Bn),4.69(dpo,1H,J4,5＝7.8Hz,H-5A),4.66(d,1H,CH2Bn),4.51(dd,1H,J3,4＝3.7Hz,J2,3＝10.7Hz,H-3B),4.34-4.39(m,2H,H-2A,CH2All),4.12(ddd,1H,J4,5＝7.8Hz,H-4A),4.07-4.01(m,1H,CH2All),3.85(dd,1H,J2,3＝5.0Hz,J3,4＝3.5Hz,H-3A),3.80(d,1H,J3,4＝3.2Hz,H-4B),3.61(dq,1H,J4,5＝0.9Hz,H-5B),3.55(ddd,J2,3＝10.8Hz,1H,H-2B),2.76(d,1H,J4,OH＝8.2Hz,OH),1.95(s,3H,CH3Ac),1.27(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ169.5(CONHTCA),169.4(C-6),162.1(CONHAc),137.6,135.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),128.7,128.6(2C),128.4(2C),128.2,128.0(CAr),117.9(CH2All),100.6(C-1A,1JC,H＝170Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.2(CCl3),76.7(C-3B),75.2(C-3A),72.0(CH2Bn),71.0(C-5A),70.0(CH2All),69.6(C-5B),67.4(CH2Bn-6),65.6(C-4A),65.4(C-4B),55.3(C-2B),49.5(C-2A),23.2(CH3Ac),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C33H38Cl3N5O10Na计算792.1582；实测792.1584。
-来自A供体的AB结构单元，其中4A-OH 6A-OH处的保护基团彼此正交
方案5.使用正交保护的A供体33通过[A+B]糖基化合成AB叠氮丙基糖苷41。(i)CSA,MeOH/DCM(4:1,v/v),(ii)TBDPSCl,咪唑,DMF,(iii)NapBr,NaH,DMF,0℃,3步85％,(iv)Zn,AcOH,THF,(v)a.TCPO,Et3N,DCM,b.Ac2O,Py,80℃,2步82％,(vi)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,对于32为82％,对于38为92％,(vii)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,对于33为定量,对于39/40(～2:1)为89％,(viii)8,TMSOTf,DCM,-15℃,96％,(ix)a.H2NCH2CH2NH2,MeOH/THF(1:1,v/v),50℃,b.Ac2O,MeOH,94％,(x)TBAF,THF,86％,(xi)TEMPO,BAIB,DCM/H2O,(xii)BnBr,K2CO3,DMF,2步85％,(xiii)DDQ,DCM/磷酸盐缓冲液pH 7(6:1,v/v),0℃至室温,87％,(xiv)叠氮丙醇,Yb(OTf)3,DCM,0℃,78％。
烯丙基2-叠氮基-3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖苷(30)。将CSA(4.1g，17.7mmol，0.5当量)加入到在MeOH/DCM(4:1，170mL)中的缩醛12(15.0g，35.4mmol，1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 4:1)表明反应完成，其显示不存在起始物12(Rf 0.65)且存在非迁移点。加入5％NaHCO3水溶液(300mL)，然后加入EtOAc(500mL)。将有机相分离，用盐水(500mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，减压浓缩。将粗产物在高真空下干燥。在0℃，将叔丁基二苯基氯硅烷(10.1mL，38.9mmol，1.1当量)和咪唑(3.1g，46.0mmol，1.3当量)加入到在无水DMF(180mL)中的粗的二醇中。使反应混合物缓慢达到室温并在该温度搅拌过夜。加入甲醇(10mL)，30分钟后，减压蒸发挥发物。将残余物溶解在EtOAc(500mL)中，将有机层用90％盐水(500mL)洗涤，分离，经Na2SO4干燥，浓缩。将2-(溴甲基)萘(10.9g,49.6mmol,1.4当量)加入到在DMF(230mL)中的粗的中间体中。将溶液冷却至0℃，分批加入NaH(60％在矿物油中，1.7g，70.8mmol，2.0当量)。在浴温缓慢达到室温的同时剧烈搅拌2小时后，TLC追踪显示反应完成。将反应混合物用DCM(1L)稀释，加入5％NH4Cl水溶液(500mL)。将有机层用水(1.5L)和盐水(1L)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将粗产物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 12:1→10:1)纯化，获得完全保护的30(21.6g,30.2mmol,85％)，为淡黄色油状物。烯丙基糖苷30具有Rf0.8(Tol/EtOAc 10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.30(m,22H,HAr),5.98-5.88(m,1H,CHAll),5.34-5.28(m,1H,CH2All),5.21-5.17(m,1H,CH2All),4.79(d,1H,J＝12.2Hz,CH2Nap),4.79(d,1H,CH2Nap),4.73(d,1H,J1,2＝4.7Hz,H-1),4.67(d,1H,J＝11.9Hz,CH2Bn),4.61(d,1H,CH2Bn),4.31-4.25(m,1H,CH2All),4.19(pq,1H,H-5),4.07-4.01(m,1H,CH2All),3.98-3.943.97(ddpo,1H,H-2),3.95(ddpo,1H,J4,5＝5.3Hz,H-4),3.77(brd,2H,J5,6a＝4.5Hz,J5,6b＝4.5Hz,H-6a,H-6b),3.74(ddpo,1H,J3,4＝3.5Hz,J2,3＝8.0Hz,H-3),1.00(s,9H,CH3,TBDPS)。13CNMR(CDCl3),δ137.8,135.5,133.2,133.0(Cq,Ar),133.8(CHAll),135.6,135.6,129.7,128.3,128.1,127.9,127.7(2C),126.6(2C),126.0,125.9,125.8(CAr),117.2(CH2All),98.7(C-1,1JC,H＝170Hz),76.2(C-3),72.9(C-5),72.3(CH2Nap,CH2Bn),72.1(C-4),68.7(CH2All),63.7(C-6),61.8(C-2),26.9,26.7(3C,CH3,TBDPS),19.1(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C34H47N3O5SiNa计算736.3783；实测736.3177。
烯丙基3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α-L-阿卓吡喃糖苷(31)。将锌粉(8.2g,126mmol,10.0当量)和AcOH(7.2mL,126mmol,10.0当量)加入到在无水THF(85mL)中的叠氮化物30(9.0g,12.6mmol,1.0当量)中。搅拌1小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 10:1)显示不存在叠氮化物30(Rf 0.8)并且存在更强极性的点(Rf 0.0)。将混悬液通过硅藻土垫过滤，用DCM洗涤。将DCM层用饱和NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，减压浓缩，并在高真空下干燥。将粗胺溶解在DCM中，加入四氯邻苯二甲酸酐(2.2g，7.5mmol，0.6当量)。将混合物在室温搅拌30分钟。加入Et3N(2.1mL,15.1mmol,1.2当量)，随后加入更多的四氯邻苯二甲酸酐(2.2g,7.5mmol,0.6当量)。将反应在室温再搅拌30分钟，此时TLC追踪(EtOAc)指示反应完成。蒸发挥发物，在高真空下干燥。将粗品溶解于吡啶(60mL)，加入Ac2O(5.9mL,63.0mmol,5.0当量)。加热至80℃持续10分钟后，TLC分析(cHex/EtOAc9:1)显示中间体已完全消耗，并且存在极性较小的点。完成时，将混合物减压浓缩，与甲苯(30mL)共蒸发两次。将粗品吸收在DCM(300mL)中，将DCM层用水(300mL)和盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 93:7→88:12)纯化，获得完全保护的31(9.54g,10.4mmol,82％)，为稠的淡黄色油状物。烯丙基糖苷31具有Rf 0.7(cHex/EtOAc,10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.83-7.35(m,18H,HAr),7.04(brs,4H,HAr),5.83-5.73(m,1H,CHAll),5.27(d,1H,J1,2＝7.0Hz,H-1),5.19-5.14(m,1H,CH2All),5.08-5.05(m,1H,CH2All),4.94(d,1H,J＝12.7Hz,CH2Nap),4.85(dpo,1H,CH2Nap),4.85(ddpo,1H,J2,3＝11.2Hz,H-2),4.60(d,1H,J＝12.3Hz,CH2Bn),4.3.6(dd,1H,J3,4＝3.6Hz,H-3),4.30(dddpo,1H,J4,5＝3.3Hz,H-5),4.25-4.19(m,1H,CH2All),4.16(pt,1H,H-4),4.10(d,1H,CH2Bn),3.98-3.93(m,1H,CH2All),3.83(brd,2H,J5,6a＝6.1Hz,J5,6b＝6.1Hz,H-6a,H-6b),1.04(s,9H,CH3,TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ163.2(CONTCP),157.4,142.4,139.7,138.0,135.9,133.2,133.1,133.0(2C),129.5,127.7,127.2(Cq,Ar),133.9(CHAll),135.6(2C),129.8,128.0,127.9,127.8,127.6,127.5,127.3,126.5,126.0(2C),125.8(CAr),117.1(CH2All),96.1(C-1,1JC,H＝169Hz),75.6(C-5),74.3(C-3),72.7(CH2Nap),72.1(CH2Bn),71.8(C-4),68.6(CH2All),63.1(C-6),53.4(C-2),26.9,26.7(3C,CH3,TBDPS),19.2(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C51H51Cl4N2O7Si计算971.2220；实测971.2213。
3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α/β-L-阿卓吡喃糖(32)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(115mg,0.13mmol,0.02当量)溶解在无水THF(8.0mL)中，在H2气氛下搅拌30分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，使用套管转移到烯丙基糖苷31(6.5g,6.8mmol,1.0当量)的无水THF(60mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌1小时，此时加入NIS(1.68g,7.5mmol,1.1当量)的H2O(15mL)溶液。在室温搅拌1小时后，TLC分析(cHex/EtOAc 8:1)显示异构化产物(Rf 0.65)的完全消耗，并且存在更强极性的点(Rf 0.1)。加入10％Na2SO3水溶液，蒸发挥发物。用DCM(200mL)萃取水相两次。将有机层合并，用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 10:1→8:1)纯化残余物，获得预期的半缩醛32(5.2g，5.6mmol，82％)，为白色松软固体。半缩醛32(α/β5:1)具有Rf 0.6(cHex/EtOAc 9:1)。α端基异构体具有1H NMR(CDCl3)δ7.84-6.99(m,22H,HAr),5.25(dd,1H,J1,OH＝9.4Hz,J1,2＝6.8Hz,H-1),4.81(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Nap),4.76(d,1H,CH2Nap),4.67(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,H-2),4.53(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.43-4.33(dd,1H,J3,4＝3.0Hz,H-3),4.30(ddd,J4,5＝1.8Hz,1H,H-5),4.19(dd,1H,H-4),4.03(d,1H,CH2Bn),3.91(dd,1H,J5,6a＝5.6Hz,J6a,6b＝10.6Hz,H-6a),3.86(dd,1H,J6a,6b＝8.2Hz,H-6b),3.06(d,1H,OH),1.03(s,9H,CH3TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ163.2(CONTCP),139.8,137.8,137.9,137.8,135.6,135.5,135.4,133.2,133.1,133.0,132.8(Cq,Ar),135.6,135.5,129.9(2C),129.0,128.2(2C),128.1(2C),127.9,127.8(2C),127.7,127.4,126.8,126.6,126.0(2C),125.9,125.2(Cq,Ar),91.5(C-1,1JC,H＝171Hz),76.1(C-3),73.3(C-5),72.7(CH2Nap),71.7(CH2Bn),71.7(C-4),62.2(C-6),56.1(C-2),26.8(CH3TBDPS),21.4(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C48H47Cl4N2O7Si计算931.1907；实测931.1880。
β端基异构体具有1H NMR(CDCl3)δ7.84-6.99(m,22H,HAr),5.37(dd,1H,J1,2＝4.1Hz,J1,OH＝5.6Hz,H-1),4.95(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,H-2),4.95(ddpo,1H,J3,4＝2.7Hz,H-3),4.90(dpo,1H,CH2Nap),4.85(d,1H,J＝12.6Hz,CH2Nap),4.41(d,1H,J＝11.6Hz,CH2Bn),4.28(bso,1H,H-4),4.28-4.25(m,1H,H-5),4.21(dpo,1H,CH2Bn),3.99(dpo,1H,H-6a),3.93-3.84(mo,1H,H-6b),3.48(brs,1H,OH),1.08(s,9H,CH3TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ163.9(CONTCP),139.8-125.3(CAr),92.6(C-1,1JC,H＝175Hz),77.4(C-3),72.2(CH2Nap),72.4(C-4),71.4(CH2Bn),64.6(C-6),53.6(C-2),26.8(CH3TBDPS),21.4(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C48H47Cl4N2O7Si计算931.1907；实测931.1880。
烯丙基3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(34)。将PTFACl(1.47mL,7.1mmol,1.3当量)和Cs2CO3(1.9g,6.0mmol,1.1当量)加入到在丙酮(40mL)中的半缩醛32(5.0g,5.4mmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。将滤液减压浓缩并真空干燥，获得粗的供体33(6.0g,5.4mmol,定量)，将其原样用于下一步。PTFA供体33具有Rf 0.85(Tol/EtOAc 10:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C56H47Cl4F3N2O7SiNa计算1107.1757；实测1107.1755。
将粗的PTFA供体33(6.0g，5.4mmol，1.1当量理论值)和受体8(1.83g，4.9mmol，1.0当量)的混合物与无水甲苯(30mL)共蒸发，然后真空干燥。将新活化的MS (4.0g)加入到在无水DCM(90mL)中的起始材料中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌1小时。冷却至-15℃后，缓慢加入TMSOTf(49μL，0.05当量)并继续搅拌40分钟，在此期间浴温保持在-15℃。TLC分析(Tol/EtOAc 10:1)显示不存在供体33，并且除了少量半缩醛32(Rf 0.4)之外还存在新点(Rf 0.5)。完成后，加入Et3N(80μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 10:1→8:1)纯化，获得二糖34，为白色固体(6.0g,4.7mmol,96％)。偶联产物34具有1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.81(m,4H,HAr),7.67-7.63(m,3H,HAr),7.53-7.16(m,10H,HAr),7.04-6.98(m,5H,HAr),6.67(m,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB),5.85-5.75(m,1H,CHAll),5.43(d,1H,J1,2＝7.2Hz,H-1A),5.23-5.17(m,1H,CH2All),5.14-5.11(m,1H,CH2All),4.94(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Nap),4.87(ddpo,1H,J2,3＝11.1Hz,H-2A),4.81(d,1H,CH2Nap),4.73(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.61(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.50(dd,2H,J3,4＝3.5Hz,J2,3＝10.7Hz,H-3B),4.39(dddpo,1H,J4,5＝3.3Hz,H-5A),4.33(ddpo,1H,J3,4＝3.5Hz,H-3A),4.29-4.24(m,1H,CH2All),4.11(ptpo,1H,H-4A),4.09(dpo,1H,CH2Bn),4.00-3.94(m,1H,CH2All),3.86(dpo,1H,J3,4＝3.8Hz,H-4B),3.85(dpo,1H,J5,6a＝6.4Hz,H-6aA),3.79(dd,1H,J5,6b＝5.8Hz,J6a,6b＝11.0Hz,H-6bA),3.51(dd,1H,H-2B,),3.47(dq,J4,5＝1.3Hz,H-5B),1.82(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B),1.05(s,9H,CH3TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ163.1(CONHTCA),161.5(CONTCP),139.8,137.8,137.7,135.7,133.2,133.0(2C),132.9,129.6,127.5(Cq,Ar),133.5(CHAll),135.6,135.2,129.9,129.0,128.2,128.1,128.0,127.9,127.8,127.7,127.6,127.4,126.5,126.0,125.9,125.2(CAr),117.8(CH2All),98.5(C-1A,1JC,H＝171Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝163Hz),92.2(CCl3),75.9(C-5A),75.5(C-3B),73.7(C-3A),72.6(CH2Nap),72.1(CH2Bn),71.4(C-4A),70.0(CH2All),69.2(C-5B),65.4(C-4B),63.1(C-6A),53.3(C-2B),53.1(C-2A),26.9(CH3TBDPS),19.3(CTBDPS),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C59H60Cl7N6O10Si计算1285.1960；实测1285.1948。
烯丙基2-乙酰胺基-3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(35)。在室温，将乙二胺(1.3mL,19.3mmol,4.0当量)加入到在THF/MeOH(1:1,100mL)中的二糖34(6.2g,4.8mmol,1.0当量)中，将反应混合物在Ar气氛下于50℃搅拌72小时。TLC分析(Tol/EtOAc 7:3)显示不存在起始物34(Rf 1.0)并且存在新点(Rf 0.55)。使混合物达到室温，加入Et3N(2.0mL)，随后加入乙酸酐(4.6mL，48.9mmol，10.0当量)。在室温搅拌3小时后，TLC分析(Tol/EtOAc7:3)显示存在新点(Rf 0.65)，而中间体胺已完全消耗。将混悬液通过硅藻土垫过滤，用DCM(15mL)洗涤三次并将滤液减压浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(cHex/EtOAc 10:1→7:1)。获得乙酰胺35(4.8g,4.6mmol,94％)，为白色固体。二糖35具有1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.81(m,1H,HAr),7.75-7.62(m,7H,HAr),7.50-7.26(m,15H,HAr),6.67(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.28-5.23(mpo,1H,CH2All),5.23(dpo,1H,J2,NH＝8.8Hz,NHA),5.19-5.16(m,1H,CH2All),4.89(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B),4.78(d,1H,J＝12.7Hz,CH2Nap),4.74(d,1H,CH2Nap),4.71(dpo,1H,CH2Bn),4.69(brspo,1H,J1,2＝1.8Hz,H-1A),4.52(d,1H,J＝12.1Hz,CH2Bn),4.48(ddpo,1H,J3,4＝3.7Hz,J2,3＝10.9Hz,H-3B),4.47-4.43(mo,2H,H-5A),4.41(ddd,J2,3＝4.3Hz,H-2A),4.34-4.29(m,1H,CH2All),4.06-4.01(mpo,1H,CH2All),4.00(ddpo,1H,J5,6a＝2.6Hz,J6a,6b＝11.2Hz,H-6aA),3.95(ddpo,1H,J5,6a＝2.6Hz,J6a,6b＝11.1Hz,H-6bA),3.93(ptpo,1H,H-3A),3.63(dd,1H,J3,4＝3.0Hz,J4,5＝8.9Hz,H-4A),3.57(brd,1H,H-4B),3.53(brq,1H,H-5B),3.41(ddd,1H,H-2B),1.74(s,3H,CH3NHAc),1.17(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6B),1.08(s,9H,CH3TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ168.8(CONHTA),162.1(CONHAc),138.6,135.1,133.5,133.0(2C,Cq,Ar),133.6(CHAll),135.7,135.6,129.7(2C),128.2(2C),127.8,127.7,127.6,127.5,126.8,126.1,125.9(2C,CAr),117.7(CH2All),101.5(C-1A,1JC,H＝168Hz),97.5(C-1B,1JC,H＝163Hz),92.2(CCl3),76.0(C-3B),72.5(C-3A),71.5(CH2Nap),70.5(CH2Bn),70.4(C-4A),70.1(CH2All),69.7(C-5A),69.7(C-5B),65.2(C-4B),63.7(C-6A),55.8(C-2B),49.6(C-2A),27.0(CH3TBDPS),23.0(CH3NHAc),19.4(CTBDPS),17.1(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C53H61Cl3N5O9Si计算1044.3304；实测1044.3325。
烯丙基2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(36)。将TBAF(1.8g,5.8mmol,1.2当量)加入到在THF(98mL)中的二糖35(4.8g,4.8mmol,1.0当量)中，将反应混合物在室温搅拌4小时。TLC分析(Tol/EtOAc 7:3)显示完全保护的35(Rf 0.65)的消耗和极性点的存在。加入乙酸(0.34mL，5.8mmol，1.2当量)，在搅拌10分钟后蒸发挥发物。将残余物通过快速色谱法(EtOAc/MeOH 100:0→95:5)纯化，获得醇33(3.2g，3.9mmol，86％)，为白色固体。二糖36具有Rf 0.15(EtOAc)。1H NMR(DMSO-d6)δ8.87(d,1H,J2,NH＝9.2Hz,NHB),7.93-7.82(m,4H,NHA,HAr),7.75(brs,1H,HAr),7.53-7.47(m,2H,HAr),7.43-7.39(m,3H,HAr),7.32-7.24(m,3H,HAr),5.85-5.76(m,1H,CHAll),5.26-5.20(m,1H,CH2All),5.12-5.09(m,1H,CH2All),4.81(d,1H,J1,2＝1.6Hz,H-1A),4.69(dpo,3H,J＝11.6Hz,CH2Nap),4.67-4.62(m,2H,J＝11.8Hz,OH,CH2Bn),4.53(dpo,1H,CH2Bn),4.51(dpo,1H,J1,2＝8.9Hz,H-1B),4.49(dpo,1H,CH2Nap),4.32(ddd,1H,J2,NH＝8.4Hz,J2,3＝4.5Hz,H-2A),4.24-4.16(m,2H,H-5A,CH2All),4.12(ddpo,1H,J3,4＝3.6Hz,J2,3＝10.8Hz,H-3B),4.05(brd,1H,H-4B),4.00-3.95(m,1H,CH2All),3.90(dddpo,1H,H-2B),3.79(ddpo,1H,H-3A),3.78-3.74(mo,1H,H-6aA),3.72(bq,1H,H-5B),3.68(dd,1H,J3,4＝3.1Hz,J4,5＝8.9Hz,H-4A),3.53(ddd,1H,H-6bB),1.74(s,3H,CH3NHAc),1.24(s,9H,CH3TBDPS)。13C NMR(DMSO-d6)δ169.1(CONHTCA),162.0(CONHAc),139.3,136.4,133.1,132.9(Cq,Ar),134.8(CHAll),128.3,128.1(2C),128.0,127.6,126.5,126.4,126.3(CAr),116.8(CH2All),101.9(C-1A,1JC,H＝171Hz),100.2(C-1B,1JC,H＝162Hz),93.5(CCl3),77.5(C-3B),73.8(C-3A),72.5(C-4A),70.9(CH2Nap),70.4(CH2Bn),70.2(C-5B),69.6(C-5A),69.3(CH2All),65.3(C-4B),61.6(C-6A),53.4(C-2B),49.4(C-2A),22.9(CH3NHAc),17.6(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C37H43Cl3N5O9计算806.2126；实测806.2117。
烯丙基(2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(37)。向醇36(3.0g，3.7mmol，1.0当量)在DCM/H2O(2:1，120mL)中的混悬液中加入TEMPO(116mg,0.74mmol,0.2当量)，随后加入BAIB(3.0g,9.3mmol,2.5当量)。将双相混合物在室温剧烈搅拌2小时，此时TLC分析(EtOAc)显示不存在醇36(Rf0.15)并且存在极性产物(Rf 0.0)。加入10％Na2SO3水溶液，然后加入DCM(80mL)。分离DCM层，将水相用DCM(100mL)萃取两次。将合并的有机相通过分相过滤器干燥并浓缩至干。将残余物溶解在无水DMF(40mL)中。加入苄基溴(1.3mL,11.1mmol,3.0当量)和K2CO3(670mg,4.8mmol,1.3当量)，将混悬液在室温搅拌2小时。完成时，加入饱和NH4Cl水溶液，将水层用DCM(100mL)洗涤三次。将有机相合并，用盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 7:3→6:4)纯化残余物，获得期望的苄基酯37(2.8g，3.0mmol，85％)，为棕白色固体。酯37具有Rf 0.3(Tol/EtOAc,4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.26(m,17H,HAr),6.94(d,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.73(d,J2,NH＝6.8Hz,NHA),5.33(d,1H,J1,2＝5.6Hz,H-1A),5.24-5.20(mpo,1H,CH2All),5.22(dpo,1H,CH2Bn-6),5.19-5.15(mpo,1H,CH2All),5.17(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn-6),4.80(d,1H,J4,5＝4.6Hz,H-5A),4.77(d,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1B),4.73(d,1H,J＝12.7Hz,CH2Nap),4.71(d,1H,CH2Nap),4.52(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.48(ddpo,1H,J3,4＝3.8Hz,H-3B),4.48(d,1H,CH2Bn),4.33-4.28(m,1H,CH2All),4.10(ddpo,J3,4＝2.7Hz,H-4A),4.07-3.98(m,3H,H-3A,H-2A,CH2All),3.93(brd,1H,J3,4＝3.2Hz,H-4B),3.57(dt,1H,J2,3＝10.5Hz,H-2B),3.47(brq,1H,H-5B),1.86(s,3H,CH3Ac),1.23(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6B)。13CNMR(CDCl3)δ170.4(CONTCA),169.3(C-6A),161.9(CONAc),137.9,134.9,134.8,133.1,133.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),128.7(2C),128.6,128.3,128.1,127.9,127.8,127.6,126.9,126.1,126.0,125.9(CAr),117.9(CH2All),99.5(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.4(CCl3),76.6(C-3B),73.4(C-3A),72.9(C-4A),71.9(C-5A),71.8(2C,CH2Bn,CH2Nap),70.1(CH2All),69.3(C-5B),67.5(CH2Bn-6),65.1(C-4B),55.0(C-2B),52.1(C-2A),23.4(CH3Ac),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C44H47Cl3N5O10计算910.2388；实测910.2380。
烯丙基(2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(29)。将苄酯37(见下文，340mg，374μmol，1.0当量)溶解在DCM(6.0mL)中，加入磷酸盐缓冲液pH 7(1.0mL)。将双相混合物冷却至0℃，加入DDQ(144mg，636μmol，1.7当量)。继续搅拌2小时，同时让浴槽达到室温。将混合物用DCM(10mL)稀释，将DCM层用饱和NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤，然后用Na2SO4干燥，减压浓缩。将残留物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 65:35→55:45)纯化，获得醇29(290mg,325μmol,87％)，为白色固体。二糖29具有Rf 0.3(Tol/EtOAc 1:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.43-7.31(m,10H,HAr),6.81(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.89-5.79(m,1H,CHAll),7.93(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NHA),5.28(d,1H,J2,NH＝12.1Hz,CH2Bn-6,CH2All),5.29-5.23(mpo,1H,CH2All),5.22(dpo,1H,CH2Bn-6),5.20-5.16(m,1H,CH2All),4.93(d,1H,J1,2＝3.2Hz,H-1A),4.78(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.73(d,1H,J＝11.8Hz,CH2Bn),4.69(dpo,1H,J4,5＝7.8Hz,H-5A),4.66(d,1H,CH2Bn),4.51(dd,1H,J3,4＝3.7Hz,J2,3＝10.7Hz,H-3B),4.34-4.39(m,2H,H-2A,CH2All),4.12(ddd,1H,J4,5＝7.8Hz,H-4A),4.07-4.01(m,1H,CH2All),3.85(dd,1H,J2,3＝5.0Hz,J3,4＝3.5Hz,H-3A),3.80(d,1H,J3,4＝3.2Hz,H-4B),3.61(dq,1H,J4,5＝0.9Hz,H-5B),3.55(ddd,J2,3＝10.8Hz,1H,H-2B),2.76(d,1H,J4,OH＝8.2Hz,OH),1.95(s,3H,CH3Ac),1.27(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ169.5(CONHTCA),169.4(C-6),162.1(CONHAc),137.6,135.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),128.7,128.6(2C),128.4(2C),128.2,128.0(CAr),117.9(CH2All),100.6(C-1A,1JC,H＝170Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.2(CCl3),76.7(C-3B),75.2(C-3A),72.0(CH2Bn),71.0(C-5A),70.0(CH2All),69.6(C-5B),67.4(CH2Bn-6),65.6(C-4A),65.4(C-4B),55.3(C-2B),49.5(C-2A),23.2(CH3Ac),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C33H38Cl3N5O10Na计算792.1582；实测792.1584。
(2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-α/β-D-半乳吡喃糖(38)。将在无水THF(4.0mL)中的[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(13mg,15μmol,0.02当量)反复脱气，在氢气氛下搅拌30分钟。将所得的黄色溶液用Ar脱气数次，使用套管转移到烯丙基糖苷37(700mg,770μmol,1.0当量)的无水THF(10mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，加入NIS(191mg,847μmol,1.1当量)和H2O(12mL)。再搅拌一小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 7:3)显示二糖37(Rf 0.45)完全消耗并且存在极性点(Rf 0.2)。加入10％Na2SO3水溶液。在减压下去除挥发物，将水相用DCM(20mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc 5:1→4:1)纯化残余物，获得预期的半缩醛38(620mg，713μmol，92％)，为白色固体。分离的作为10:7α/β混合物的半缩醛38具有Rf 0.15(Tol/EtOAc 1:1)。主要端基异构体具有1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.26(m,17H,HAr),6.94(d,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.73(d,J2,NH＝6.8Hz,NHA),5.33(d,1H,J1,2＝5.6Hz,H-1A),5.27-5.22(m,1H,CH2All),5.20-5.14(mpo,3H,CH2All,CH2Bn-6),4.80(d,1H,J4,5＝4.4Hz,H-5A),4.77(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.70(brs,2H,CH2Nap),4.53-4.46(m,3H,H-3B,CH2Bn),4.33-4.28(m,1H,CH2All),4.10(ddpo,J3,4＝2.8Hz,H-4A),4.07-4.00(m,3H,H-3A,H-2A,CH2All),3.93(brd,1H,J3,4＝3.2Hz,H-4B),3.57(dddpo,1H,J2,3＝9.2Hz,H-2B),3.47(brq,1H,H-5B),1.86(s,3H,CH3NAc),1.23(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ170.4(CONTCA),169.3(C-6A),161.9(CONAc),137.9,134.9,134.8,133.1,133.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),128.7(2C),128.6,128.3,128.1,127.9,127.8,127.6,126.9,126.1,126.0,125.9(CAr),117.9(CH2All),99.5(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.4(CCl3),76.6(C-3B),73.4(C-3A),72.9(C-4A),71.9(C-5A),71.8(2C,CH2Bn,CH2Nap),70.1(CH2All),69.3(C-5B),67.5(CH2Bn-6),65.1(C-4B),55.0(C-2B),52.1(C-2A),23.4(CH3Ac),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C41H43Cl3N5O10计算870.2076；实测870.2070。
(2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-α/β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(39)和2-三氯甲基-[(2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-1,2,4,6-四脱氧-α-D-半乳吡喃糖并]-[2,1,d]-噁唑啉(40)。将半缩醛38(630mg,725μmol,1.0当量)溶解在丙酮(10mL)中。加入PTFACl(149μl,942μmol,1.3当量)，然后加入Cs2CO3(260mg,797μmol,1.1当量)。将反应混合物在室温在Ar气氛下搅拌2小时。TLC追踪(Tol/EtOAc5:1)表明起始物38已经演变成两个极性较小的点(Rf0.3和0.35)。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，用丙酮(10mL)洗涤两次，将滤液减压浓缩。将残余物通过闪式快速色谱法(cHex/EtOAc 4:1→2:1,1％Et3N)纯化，获得期望的供体，为39和40的3:2混合物(670mg,644μmol,89％)，分离为松软的白色固体。分离的供体39和40的混合物具有1H NMR(CDCl3)δ7.87-6.80(m,22HAr,PTFA,NHB,PTFA,17H-Ar,oxa),6.56(bs,0.6H,H-1B,PTFA),6.18(d,0.4H,J1,2＝7.0Hz,H-1B,oxa),5.86(d,0.4H,J2,NH＝7.2Hz,NHA,oxa),5.48(d,0.4H,J1,2＝5.6Hz,H-1A,oxa),5.41(dpo,0.6H,J1,2＝7.6Hz,H-1A,PTFA),5.39(dpo,J1,2＝8.0Hz,NHA,PTFA),5.23(d,0.4H,J＝12Hz,CH2Bn-6),5.16(spo,1.2H,CH2Bn-6),5.14(dpo,0.4H,CH2Bn-6),4.87(d,0.6H,J＝12.5Hz,CH2Nap),4.81(d,0.6H,CH2Nap),4.78(dpo,0.6H,J3,4＝3.0Hz,H-5A),4.76(dpo,0.6H,J3,4＝4.9Hz,H-5A),4.69(d,0.4H,J＝12.4Hz,CH2Nap),4.64(d,0.4H,CH2Nap),4.59(d,0.4H,J＝12.1Hz,CH2Bn),4.54(d,0.4H,CH2Bn),4.48(dd,0.6H,J3,4＝3.1Hz,J3,4＝11.0Hz,H-3B),4.42(do,0.6H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.42-4.37(mo,0.6H,H-2B),4.30(ddd,0.6H,H-2A),4.26(bs,0.6H,H-4B),4.20-4.23(m,2.2H,CH2Bn,H-3A,H-4A,H-2B),4.10(ddpo,0.6H,H-4A),4.08-4.03(mpo,0.4H,H-2A),4.05-4.99(m,0.6H,H-5B),3.86(m,0.4H,H-4B),3.75(dd,0.4H,H-5B),3.57(dd,0.4H,J3,4＝3.7Hz,J2,3＝8.1Hz,H-3B),3.54(dd,0.6H,J2,3＝10.1Hz,J3,4＝2.8Hz,H-3A),1.94(s,1.8H,CH3Ac),1.93(s,1.2H,CH3Ac),1.28(dpo,0.6H,J5,6＝6.3Hz,H-6B),1.27(dpo,0.4H,J5,6＝6.3Hz,H-6B)。13C NMR(部分,CDCl3)δ173.2,170.7,170.5(CONTCA),169.3,168.9(C-6A),162.9,162.1(CONAc),143.0,137.9,137.3,135.0,134.9,134.7,134.6,133.1,133.0(Cq,Ar),129.1,128.8(2C),128.6,128.5,128.4,128.3(2C),128.2,128.0(2C),127.9(2C),127.8,127.6,127.2,126.9,126.8,126.2,126.1(2C),126.0(2C),125.9,124.4,119.4,118.3(CAr),107.6(C-1B,oxa,1JC,H＝183Hz),99.0(C-1A,1JC,H＝169Hz),98.8(C-1A,1JC,H＝171Hz),93.7(bs,C-1B-PTFA),92.4(CCl3),86.9(CCl3),81.1(C-3A),74.5(C-3B),73.6(C-5A),73.1(C-4A),73.0(C-4A),72.5(C-3B),72.1(CH2Nap),71.8(2C,CH2Nap,CH2Bn),71.5(C-5A),71.4(2C,C-3A,CH2Bn),69.0(C-5B),68.0(C-5B),67.4(2C,CH2Bn-6),64.2(C-4B),63.5(C-2B),61.3(C-4B),52.3(C-2A),51.0(C-2A),50.3(C-2B),23.7,23.4(CH3Ac),17.5,17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C49H47Cl3F3N6O10计算1041.2372；实测1041.2378。
3-叠氮丙基(2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(31)。将新活化的MS (50mg)加入到含有3-叠氮基丙醇(22μL，240μmol，5.0当量)的在无水DCM(3.0mL)中的供体39/40(2:1,50mg,48μmol,1.0当量)中。将反应混合物在室温和Ar气氛中搅拌45分钟，冷却至0℃。加入Yb(OTf)3(3.0mg,5.0μmol,0.1当量)，在0℃搅拌30分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc 7:3)证实不存在供体39/40(Rf 0.45,0.55)并且存在主要化合物(Rf0.2)。加入Et3N(2.0μL)，将混悬液通过合适的漏斗过滤，并用DCM彻底洗涤。将滤液减压浓缩，将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 60:40→50:50)纯化，获得缩合产物41(36mg，37μmol，78％)，为白色固体。叠氮丙基糖苷41具有Rf 0.2(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.71(m,4H,HAr),7.51-7.47(m,2H,HAr),7.42-7.25(m,11H,HAr),6.83(d,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.55(d,J2,NH＝7.2Hz,NHA),5.28(d,1H,J1,2＝5.9Hz,H-1A),5.22(d,H,J＝12.0Hz,CH2Bn-6),5.19(d,H,CH2Bn-6),4.82(d,1H,J4,5＝4.8Hz,H-5A),4.75(d,H,J＝12.5Hz,CH2Nap),5.22(d,H,CH2Nap),4.65(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.53(d,1H,J＝11.9Hz,CH2Bn),4.45(d,1H,CH2Bn),4.39(dd,1H,J3,4＝3.5Hz,J2,3＝10.8Hz,H-3B),4.11(dd,J3,4＝2.8Hz,H-4A),4.07(pdt,1H,H-2A),3.97(ddpo,1H,J2,3＝8.2Hz,H-3A),3.93-3.88(m,2H,H-4B,OCH2),3.62(ddd,1H,H-2B),3.56-3.51(m,1H,OCH2),3.49(brq,1H,H-5B),3.38(t,2H,J＝6.8Hz,NCH2),1.89-1.78(m,2H,CH2),1.87(s,3H,CH3NHAc),1.23(d,3H,J5,6＝6.2Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ170.3(CONHTCA),169.3(C-6A),161.8(CONHAc),137.8,134.9,134.8,133.1,133.0(Cq,Ar),128.7,128.6,128.3,128.2,128.1,127.8(2C),127.7,126.8,126.1,126.0,125.9(CAr),99.5(C-1A,1JC,H＝171Hz),97.2(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.5(CCl3),76.5(C-3B),73.6(C-3A),72.7(C-4A),71.9(C-5A),71.8(2C,CH2Bn,CH2Nap),69.4(C-5B),67.4(CH2Bn-6),66.3(OCH2),64.9(C-4B),54.7(C-2B),52.0(C-2A),48.1(CH2N3),29.0(CH2),23.5(CH3Ac),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C44H48Cl3N8O10计算953.2559；实测953.2542。
实施例2：策略2A-NAcBoc,2B-NTCA,4A-Nap系列
使用2A-NHAc的酸敏感乙酰胺掩饰(camouflage)
方案6.通过使用2A-NAcBoc,2B-NTCA结构单元逆合成(AB)n低聚物
方案7.2A-N-AcBoc/2B-N-TCA二糖57的合成、完全脱保护和低聚化尝试。(i)Boc2O,DMAP,THF,73％,(ii)DDQ,DCM/磷酸盐缓冲液pH 7(10:1,v/v),79％,(iii)TFA,DCM,(iv)H2,Pd(OH)2,tBuOH/DCM/H2O,对于1由57开始两步71％，对于2由61开始两步37％,(v)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,87％,(vi)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,86％,(vii)粗的60,TfOH,DCM,0℃,41％。Boc:叔丁氧羰基。
烯丙基(2-(N-叔丁氧羰基)乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(57)。将碳酸二叔丁酯(1.22g,5.6mmol,8.0当量)然后将DMAP(34mg,282μmol,0.4当量)加入到在无水THF(20mL)中的二糖37(640mg,704μmol,1.0当量)中。在50℃加热2小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 4:1)显示存在极性较小的点(Rf 0.75)并且不存在起始物37(Rf 0.1)。使反应混合物达到室温并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 10:1→7:1)纯化，获得期望的57，为白色固体(520mg,515μmol,73％)。二糖57具有1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.74(m,4H,HAr),7.49-7.46(m,3H,HAr),7.39-7.36(m,5H,HAr),7.29-7.18(m,5H,HAr),6.75(d,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.92-5.82(m,1H,CHAll),5.72(d,1H,J1,2＝8.2Hz,H-1A),5.29-5.23(m,1H,CH2All),5.22(dpo,1H,CH2Bn-6),5.19(dpo,1H,J＝12.1Hz,CH2Bn-6),5.20-5.16(mpo,1H,CH2All),5.00-4.89(br,1H,H-2A),4.85(dpo,1H,J＝12.3Hz,CH2Bn),4.81(dpo,1H,CH2Bn),4.75(dpo,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1B),4.72(d,J4,5＝2.6Hz,H-5A),4.42(dpo,1H,J＝11.8Hz,CH2Nap),4.38(ddpo,2H,J2,3＝10.5Hz,J3,4＝2.3Hz,H-3B),4.37(pto,1H,J3,4＝2.8Hz,H-4A),4.34-4.29(m,2H,CH2Nap,CH2All),4.24(brd,1H,J2,3＝10.4Hz,H-3A),4.05(bd,1H,H-4B),4.05-4.00(m,1H,CH2All),3.61-3.54(pdt,1H,H-2B),3.44(dq,1H,J4,5＝1.0Hz,H-5B),2.34(s,3H,CH3NAc),1.48(s,9H,CH3NBoc),1.26(d,3H,J5,6＝6.2Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ174.4(br,CONAc),169.1(C-6A),161.7(CONTCA),153.9(br,CONBoc),137.8,135.5,135.0,133.2,132.9(Cq,Ar),133.6(CHAll),129.0,128.8,128.7(2C),128.2(2C),127.8,127.6,126.2,126.0,125.8,125.7,125.2(10C,CAr),117.9(CH2All),98.9(C-1A,1JC,H＝174Hz),97.9(C-1B,1JC,H＝163Hz),92.4(CCl3),83.7(CBoc),76.9(br,C-3B),74.1(2C,C-4A,C-5A),73.7(br,C-3A),72.5(CH2Nap),71.7(CH2Bn),70.1(CH2All),68.8(C-5B),67.4(CH2Bn-6),65.3(C-4B),55.0(C-2B),27.8(CH3Boc),27.1(CH3Ac),17.4(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C49H58Cl3N6O12计算1027.3179；实测1027.3176。
烯丙基(2-(N-叔丁氧羰基)乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(58)。将DDQ(256mg,1.1mmol,3.0当量)加入到在DCM/磷酸盐缓冲液pH 7(10:1,10mL)中的完全保护的二糖57(380mg,377μmol,1.0当量)中。在室温剧烈搅拌2小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示起始物57(Rf 0.75)已演变为极性更强的产物(Rf0.35)。加入5％NaHCO3水溶液(10mL)和DCM(10mL)。将DCM层分离，用盐水(25mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc5:1→4:1)纯化，获得醇58，为白色固体(260mg,257μmol,79％)。二糖58具有1H NMR(CDCl3)δ7.44-7.40(m,5H,HAr),7.32-7.22(m,5H,HAr),6.65(d,J2,NH＝7.6Hz,NHB),5.91-5.81(m,1H,CHAll),5.61(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A),5.28-5.22(mpo,1H,CH2All),5.25(s,2H,CH2Bn-6),5.19-5.15(m,1H,CH2All),4.71(dpo,1H,J4,5＝2.6Hz,H-5A),4.70-4.62(br,1H,H-2A),4.65(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.55-4.53(mpo,1H,H-4A),4.54(dpo,1H,CH2Bn),4.42(d,1H,J＝11.6Hz,CH2Bn),4.35(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝3.7Hz,H-3B),4.33-4.27(m,2H,H-3A,CH2All),4.04-3.99(m,2H,H-4B,CH2All),3.61(pt,1H,H-2B),3.39(dq,1H,J4,5＝1.0Hz,H-5B),2.59(d,1H,J4,OH＝2.2Hz,OH),2.31(s,3H,CH3Ac),1.50(s,9H,CH3Boc),1.25(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ174.1(br,CONAc),168.8(C-6A),161.7(CONTCA),153.6(br,CONBoc),137.2,135.0(Cq,Ar),133.6(CHAll),128.8(2C),128.5,128.1,127.8,(10C,CAr),117.9(CH2All),98.5(C-1A,1JC,H＝174Hz),98.1(C-1B,1JC,H＝161Hz),92.4(CCl3),83.9(OCBoc),76.8(C-3B),75.2(C-5A),73.3(br,C-3A),72.0(CH2Bn),70.1(CH2All),68.7(C-5B),67.6(CH2Bn-6),66.8(C-4A),65.3(C-4B),54.9(C-2B),27.8(CH3Boc),27.1(CH3Ac),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C38H50Cl3N6O12计算887.2552；实测887.2558。
(2-(N-叔丁氧羰基)乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-α/β-D-半乳吡喃糖(59)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(12mg,13μmol,0.03当量)的无水THF(3.0mL)溶液脱气，在H2气氛下搅拌20分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，倒入烯丙基糖苷57(430mg,473μmol,1.0当量)的无水THF(16mL)溶液中。在室温搅拌1小时后，加入NIS(117mg,520μmol,1.1当量)和H2O(4.0mL)。在室温再搅拌一小时后，TLC追踪(CHex/EtOAc 6:1)显示不存在烯丙基糖苷57(Rf 0.6)和附近的产物。加入10％Na2SO3水溶液，蒸发挥发物。将水相用DCM(10mL)萃取两次。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(Chex/EtOAc 70:30→65:35)纯化残余物，获得预期的半缩醛59(360mg，356μmol，87％)，为白色固体。半缩醛59具有Rf 0.15,0.25(Tol/EtOAc,3:1)。1H NMR(主要异构体,CDCl3)δ7.84-7.17(m,17H,HAr),6.65(d,1H,J2,NH＝7.6Hz,NHB),5.85(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A),5.40(brs,1H,H-1B),5.24(d,1H,CH2Bn-6),5.16(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn-6),5.05(brs,1H,H-2A),4.90(d,1H,CH2Nap),4.82(d,1H,J＝12.3Hz,CH2Nap),4.72(d,1H,J4,5＝2.4Hz,H-5A),4.41(d,1H,J＝11.6Hz,CH2Bn),4.36(dpo,1H,H-4A),4.35-4.26(m,2H,H-3B,H-2B),4.20(dd,1H,J2,3＝10.5Hz,J3,4＝2.1Hz,H-3A),4.13(brspo,1H,H-4B),4.11(bqpo,1H,H-5B),3.15(brs,1H,OH),2.36(s,3H,CH3NAc),1.47(spo,9H,CH3Boc),1.22(d,3H,J5,6＝6.2Hz,H-6B)。13C NMR(主要异构体,CDCl3)δ174.7(br,CONAcBoc),168.9(C-6A),162.0(CONTCA),153.4(br,COBoc),137.7,137.5,135.4,135.1,134.8,133.2,133.0(Cq,Ar),128.9,128.8,128.7(2C),128.5,128.3(2C),128.1,127.8,127.7,126.3,126.2,126.0,125.9,125.7(CAr),98.0(br,C-1A,1JC,H＝174Hz),92.4(CCl3),90.8(C-1B,1JC,H＝174Hz),84.1(CBoc),74.2(C-5A),74.0,73.9(2br,3C,C-3B,C-4A,C-3A),72.7(CH2Nap),71.6(CH2Bn),67.4(CH2Bn-6),65.6(C-4B),64.6(C-5B),55.4(br,C-2A),51.1(C-2B),27.8(CH3NBoc),27.4(CH3Ac),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C46H58Cl3N7O12计算987.2860；实测987.2862。
(2-(N-叔丁氧羰基)乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-α/β-D-半乳吡喃糖基)N-(苯基)三氟乙酰胺(60)。将PTFACl(23μL,148μmol,1.3当量)和Cs2CO3(197mg,604μmol,1.1当量)加入到在丙酮(4.0mL)中的半缩醛59(110mg,113μmol,1.0当量)中。在Ar气氛下在室温搅拌2小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 6:1)表明半缩醛59(Rf 0.1)已转化为极性较小的化合物(Rf 0.85)。将混悬液经硅藻土垫过滤，将固体用DCM(4mL)洗涤两次，蒸发挥发物。通过快速色谱法(Chex/EtOAc 90:10→98:12,1％Et3N)纯化粗残余物，获得供体60(110mg,96μmol,86％)，为白色固体。供体具有1H NMR(主要异构体,CDCl3)δ7.85-7.10(m,21H,HAr),6.79(d,2.2H,J＝7.6Hz),6.53(brs,0.9H),5.94(d,1H,J＝8.4Hz),5.24(d,1H,CH2Bn-6),5.16(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn-6),4.90(brs,2H,CH2Nap),4.74(d,1H,J＝2.0Hz,H-5A),4.37(dpo,2H,H-2A,CH2Bn),4.36-4.33(m,3H,H-3A,H-4A,H-4B),4.23(dpo,1H,J＝11.9Hz,CH2Bn),4.22-4.17(m,2H,H-2B,H-3B),3.97-3.91(dq,1H,H-5B),2.37(s,3H,CH3Ac),1.47(s,9H,CH3Boc),1.25(d,3H,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.6,162.1,143.0,138.0,137.5,135.0,134.7,133.2,133.0(Cq,Ar),129.4,129.0,128.8,128.7,128.6(2C),128.5,128.3,128.2(2C),128.0,127.9,127.8(2C),127.6,126.8,126.3,126.1,126.0,125.9,125.7,125.2,124.4,120.4,119.3(CAr),107.3,97.0,93.4,92.1,84.4(CBoc),77.2,74.5(C-5A),74.2(2C),72.5(CH2Nap),71.6(CH2Bn),67.7(C-5B),67.5(CH2Bn-6),64.5(C-2A),50.3(C-2B),27.9,27.8,27.3,26.9,17.6,17.3。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C54H58Cl3F3N7O12计算1158.3156；实测1158.3137。
烯丙基(2-(N-叔丁氧羰基)乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃基)-(1→4)-(2-(N-叔丁氧羰基)乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(61)。将PTFA供体60(58mg，51μmol，1.1当量)和受体58(40mg，46μmol，1.0当量)的混合物与无水甲苯共蒸发，在真空下彻底干燥，然后放入含有活化的MS (100mg)的无水DCE(2.0mL)中。将反应混合物在室温和Ar气氛中搅拌30分钟，冷却至0℃。加入溶解于10μL ACN中的TfOH(0.2μL，0.05当量)。在此温度再搅拌30分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在供体60且存在新点。加入Et3N，滤出固体。蒸发挥发物，将粗产物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 85:15→80:20)纯化，获得期望的61(35mg，19μmol，41％)，为白色固体。四糖61具有Rf 0.35(Tol/EtOAc4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.83-7.75(m,5H,HAr),7.48-7.17(m,24H,HAr),6.85(brs,1H,NHB*),6.85(brs,1H,NHB1*),5.89-5.83(m,1H,CHAll),5.73(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A*),5.53(brd,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A1*),5.28-5.15(m,6H,2CH2Bn-6,CH2All),5.03-4.88(brs,2H,H-2A*,H-1B1),4.82(brs,3H,H-5A*,CH2Nap),4.71-4.68(m,2H,H-5A1*,H-1B),4.56-4.53(m,2H,H-2A1*,H-3B*),4.44-4.21(m,9H,H-3B1*,H-3A*,H-3A1*,H-4A*,H-4A1*,2CH2Bn),4.07-4.00(m,3H,H-4B,CH2All),3.64-3.38(m,1H,H-2B,H-5B),2.38-2.22(s,6H,CH3Ac),1.52-1.43(m,18H,CH3Boc),1.29(brd,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B*),1.19(brd,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B1*)。13C NMR(CDCl3)δ174.4(CONAcBoc),169.2,168.7(2C,C-6A,C-6A1),161.9,161.6(2C,CONTCA),153.8(2C,CONAcBoc),137.9,137.8,135.5,135.1,15.0,133.2,132.9(Cq,Ar),133.7(CHAll),129.0,128.9,128.8,128.7,128.6(2C),128.3,128.2(2C),127.9,127.8,127.7,127.6(2C),126.2,126.0,125.8,125.7,125.2(10C,CAr),117.6(CH2All),99.4(C-1B*,1JC,H＝169Hz),98.9(C-1A*,1JC,H＝175Hz),98.5(2C,C-1B1*,1JC,H＝164Hz,C-1A1*,1JC,H＝177Hz),92.4(CCl3),92.1(CCl3),83.8(CBoc),83.6(CBoc),77.6,77.2(2C,C-3B,C-3B1),76.0,74.1(2C,C-5A,C-5A1),73.6(2C,C-3A,C-3A1),72.5(CH2Nap),71.7,71.6(2C,CH2Bn),70.0(CH2All),68.8(2C,C-5B,C-5B1),67.4,67.3(2C,CH2Bn-6),66.8(2C,C-4A,C-4A1),65.2(2C,C-4B,C-4B1),55.4(2C,C-2A,C-2A1),54.7(2C,C-2B,C-2B1),27.9,27.8(2C,CH3NBoc),27.4,27.2(2C,CH3Ac),17.4,17.2(2C,C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C84H98Cl6N11O23计算1838.4963；实测1838.4982。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(1)。[1]路线1。在室温，将TFA(15μL，197μmol，4当量)加入到二糖57(46mg，49μmol，1.0当量)的DCM(2mL)溶液中。3至4小时后，使用Tol/EtOAc(4:1)的TLC追踪显示存在极性更强的单个点。加入稀的NaHCO3水溶液(5mL)，然后加入DCM(5mL)。将DCM层分离，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将20％Pd(OH)2/C(68mg)加入到粗中间体在tBuOH/DCM/H2O(16mL,7:3:1)中的溶液中，在大幅脱气后，气氛被氢气饱和。在氢气下搅拌48小时后，将混悬液通过0.2μm过滤器并用甲醇彻底洗涤。蒸发挥发物，将粗中间体溶解在水(5mL)中并冻干。通过半制备型RP-HPLC纯化，获得已知的丙基糖苷1，为白色固体(16mg，35μmol，71％)。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(2)。将四糖61(15mg，8.2μmol，1.0当量)溶解在DCM(1.0mL)中，所述四糖61被15至20％二糖伴侣(disaccharidepartner)污染，加入TFA(15μL，197μmol，24当量)。在室温搅拌3小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc2:1)表明反应完成。加入10％NaHCO3水溶液(5mL)和DCM(5mL)。将有机层分离，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将粗品溶解于tBuOH/DCM/H2O(11mL,7:3:1)，加入20％Pd(OH)2/C(50mg)。在氢气下搅拌48小时后，将混悬液通过注射器过滤器(0.2μm)并用甲醇彻底洗涤。蒸发滤液，将粗品溶解在水(5mL)中并冻干。通过半制备型RP-HPLC纯化残余物，获得丙基糖苷2，为白色泡沫(2.6mg,3.0μmol,37％(低估))。四糖2具有RP-HPLC(215nm)Rt＝12.3min(条件A),Rt＝13.6min(条件B),1H NMR(D2O)δ4.87(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A),4.77(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A1),4.74(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B1),4.66(brs,1H,H-5A),4.44(dpo,2H,J＝8.4Hz,H-1B1,H-4A),4.36(brs,1H,H-4A1),4.15-4.08(m,2H,H-3B,H-3B1),4.03-3.99(mpo,2H,H-5B,H-5B1),3.96-3.90(m,2H,H-2A,H-4B),3.80-3.66(m,7H,H-3A,H-3A1,H-2A1,H-2B,H-2B1,H-4B1,OCH2Pr),3.51-3.49(mpo,1H,OCH2Pr),1.99,1.94(2s,12H,CH3Ac),1.51-1.48(m,2H,CH2Pr),1.29(dpo,6H,H-6B),0.82(t,3H,J＝7.2Hz,CH3Pr)。13C NMR(D2O)δ174.6,174.5(2C),174.0(CONHAc),102.9(C-1B1,1JC,H＝168Hz),101.6(C-1B,1JC,H＝166Hz),101.1(2C,C-1A,C-1A1,1JC,H＝170Hz,1JC,H＝168Hz),79.7(C-4A),76.5,76.3(C-5A,C-5A1),76.0(2C,C-3B,C-3B1),72.7(OCH2Pr),68.5(C-4A1),68.5(C-3A1),67.8(C-3A),67.6(C-4A),67.4,67.3(C-5B,C-5B1),54.8(C-4B),54.7(C-4B1),51.5(C-2A1),51.3(C-2A),51.0,50.8(C-2B,C-2B1),23.3,22.2(4C,CH3Ac),21.2(CH2Pr),15.6,15.5(C-6B,C-6B1),9.5(CH3Pr)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C35H58N6O19Na计算889.3649；实测889.3636。
实施例3：策略2A-NAc2,2B-NTCA,4A-Nap系列
-对弱碱敏感的保护基作为2A-乙酰胺的掩饰
方案8.从2A-乙酰胺基AB中间体到可用于低聚化的2A-(N,N-二乙酰基)氨基AB结构单元。[AB]n低聚物的2A-(N,N-二乙酰基)氨基AB路线。
方案9.通过关键的2A-N-Ac2/2B-N-TCA二糖47合成AB低聚物。(i)AcCl,iPr2NEt,DCM,90％,(ii)DDQ,DCM/磷酸盐缓冲液pH 7(10:1,v/v),93％,(iii)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,90％,(iv)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,80％,(v)粗的50/51,TfOH,DCM,0℃,对于52由48开始为62％(校正85％),对于54为71％(校正98％),对于56为33％(校正54％),(vi)DDQ,DCM/磷酸盐缓冲液pH 7(8:1,v/v),0-10℃,对于53为72％,对于55为64％。TfOH:三氟甲磺酸。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(47)。在0℃，将DIPEA(9.5mL,54.9mmol,20.0当量)和乙酰氯(3.9mL,21.9mmol,20当量)依次加入到二糖37(2.5g,2.75mmol,1.0当量)的无水DCM(90mL)溶液中。使混合物缓慢达到室温并搅拌过夜。TLC追踪(Tol/EtOAc 4:1)显示乙酰胺基37(Rf 0.25)完全转化为极性较小的产物(Rf 0.8)。加入10％NaHCO3水溶液(50mL)，将双相混合物用DCM(20mL)稀释。将有机层分离，经Na2SO4干燥并减压浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 90:20→88:12)纯化残余物，获得完全保护的47(2.36g，2.48mmol，90％)，为灰白色固体。N-乙酰基乙酰胺基衍生物47具有Rf 0.65(Tol/EtOAc 7:3)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.83(m,3H,HAr),7.52-7.45(m,3H,HAr),7.42-7.36(m,4H,HAr),7.30-7.26(m,4H,HAr),7.21-7.12(m,3H,HAr),6.75(d,J2,NH＝7.6Hz,NHB),5.92-5.82(m,1H,CHAll),5.80(d,1H,J1,2＝7.8Hz,H-1A),5.29-5.23(m,1H,CH2All),5.26(d,H,J＝11.9Hz,CH2Bn-6),5.21(d,H,CH2Bn-6),5.20-5.17(m,1H,CH2All),4.85(d,1H,J＝12.9Hz,CH2Nap),4.81(d,1H,CH2Nap),4.76(d,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1B),4.73(d,1H,J4,5＝2.2Hz,H-5A),4.48(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝3.8Hz,H-3B),4.39-4.34(mpo,3H,H-4A,CH2Bn),4.35-4.30(mpo,1H,CH2All),4.27(ddpo,1H,J2,3＝10.5Hz,J3,4＝2.9Hz,H-3A),4.26(dpo,1H,J＝11.6Hz,CH2Bn),4.06-4.00(mpo,1H,CH2All),4.05(bdo,1H,H-4B),3.59(ddd,1H,H-2B),3.45(dq,1H,J5,6＝1.0Hz,H-5B),2.38(s,6H,CH3NAc),1.27(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6B)。13CNMR(CDCl3)δ175.1(2C,CONAc),168.7(C-6A),161.9(CONTCA),137.8,137.4,135.2,134.9,133.2,133.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),128.7-125.2(CAr),117.9(CH2All),98.8(C-1A,1JC,H＝176Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.3(CCl3),77.4(C-3B),73.9(C-5A),73.7(C-3A),73.0(C-4A),72.5(CH2Nap),71.9(CH2Bn),70.2(CH2All),68.7(C-5B),62.6(CH2Bn-6),65.2(C-4B),59.1(C-2A),55.2(C-2B),21.4(CH3Ac),17.4(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C46H52Cl3N6O11计算969.2759；实测969.2751。
烯丙基(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-β-D-半乳吡喃糖苷(48)。将二糖47(1.0g，1.0mmol，1.0当量)溶解在DCM(10mL)中，加入磷酸盐缓冲液pH 7(1.0mL)。将双相混合物冷却至0℃，加入DDQ(477mg,2.1mmol,2.0当量)。使反应缓慢达到室温并在该温度搅拌3小时。完成后，加入5％NaHCO3水溶液(30mL)，将双相混合物用DCM(50mL)稀释。将DCM层分离，用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 5:1→4:1)纯化残余物，获得醇48(800mg，0.93mmol，93％)，为白色固体。二糖48具有Rf 0.45(Tol/EtOAc,7:3)。1H NMR(CDCl3)δ7.45-7.39(m,5H,HAr),7.35-7.25(m,3H,HAr),7.20-7.17(m,2H,HAr),6.69(d,J2,NH＝7.4Hz,NHB),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.68(d,1H,J1,2＝7.9Hz,H-1A),5.27(s,2H,CH2Bn-6),5.28-5.22(m,1H,CH2All),5.19-5.15(m,1H,CH2All),4.73(d,1H,J4,5＝2.3Hz,H-5A),4.67(d,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1B),4.53-4.52(mpo,1H,H-4A),4.50(dpo,1H,CH2Bn),4.45(ddpo,1H,J2,3＝10.7Hz,J3,4＝3.8Hz,H-3B),4.24(dpo,J＝11.6Hz,CH2Bn),4.36(dd,1H,J2,3＝10.3Hz,J3,4＝3.4Hz,H-3A),4.33-4.28(m,1H,CHAll),4.07-3.99(m,3H,H-2A,H-4B,CH2All),3.60(pdt,1H,H-2B),3.39(dqpo,1H,J4,5＝1.1Hz,H-5B),2.57(d,1H,J4,OH＝2.0Hz,OH),2.37,2.34(2s,6H,CH3NAc),1.24(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ174.9(2C,CONAc),168.3(C-6A),161.9(CONTCA),136.8,134.9(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.0,128.9,128.8,128.6,128.3,128.2,128.0(CAr),118.2(CH2All),98.3(C-1A,1JC,H＝174Hz),97.7(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.3(CCl3),72.2(C-3B),75.2(C-5A),72.7(C-3A),72.3(CH2Bn),70.1(CH2All),68.7(C-5B),67.8(CH2Bn-6),66.6(C-4A),65.2(C-4B),58.9(C-2A),55.0(C-2B),21.4(CH3Ac),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C35H44Cl3N6O11计算829.2134；实测829.2128。
(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-4-O-(2-萘甲基)-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-α/β-D-半乳吡喃糖(49)。将在无水THF(3.0mL)中的[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(18mg,0.02mmol,0.02当量)脱气，在H2气氛下搅拌20分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，倒入烯丙基糖苷47(1.0g,1.05mmol,1.0当量)的无水THF(20mL)溶液中。在室温搅拌1小时后，TCL追踪(cHex/EtOAc 10:1，进行2遍)显示起始物47(Rf 0.6)已经转化为紧密迁移的产物(Rf 0.65)。加入NIS(260mg,1.1mmol,1.1当量)和H2O(12mL)，在室温再搅拌1小时后，加入10％Na2SO3水溶液。将反应混合物浓缩，将水相用DCM(30mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。通过快速色谱法使用cHex/EtOAc(80:20→75:25)纯化残余物，获得预期的半缩醛49(870mg,0.95mmol,90％)，为白色固体。α/β半缩醛49具有Rf 0.4,0.45(Tol/EtOAc,4:1)。α异构体具有1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.75(m,4H,HAr),7.52-7.46(m,3H,HAr),7.39-7.26(m,8H,HAr),7.21-7.10(m,2H,HAr),6.70(d,J2,NH＝9.2Hz,NHB),5.80(d,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A),5.24(t,1H,J1,2＝3.6Hz,H-1B),5.19(brs,2H,CH2Bn-6),4.83(brs,2H,CH2Nap),4.74(d,1H,J4,5＝2.0Hz,H-5A),4.42-4.33(m,3H,H-2A,H-4A,H-2B),4.34(dpo,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.25(dpo,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.23(ddpo,J3,4＝3.2Hz,J2,3＝10.4Hz,H-3A),4.15(ddpo,J3,4＝2.4Hz,H-4B),4.09-4.03(m,2H,H-3B,H-5B),3.15(d,1H,J1,OH＝3.6Hz,OH),2.39(s,3H,CH3Ac),2.38(s,3H,CH3Ac),1.21(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3),δ175.1(2C,CONAc),168.8(C-6A),161.9(CONTCA),135.1,134.8,133.2,133.0(Cq,Ar),129.0,128.8,128.5,128.4,128.2,127.9,127.7(2C),126.4,126.1,125.6,125.3(CAr),98.8(C-1A,1JC,H＝175Hz),92.4(CCl3),91.2(C-1B,1JC,H＝176Hz),76.9(C-3B),73.9(C-5A),73.6(C-4A),73.0(C-3A),72.6(CH2Nap),71.8(CH2Bn),67.5(CH2Bn-6),65.5(C-4B),64.7(C-5B),59.1(C-2A),50.6(C-2B),21.4(CH3Ac),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C35H44Cl3N6O11计算1615.3589；实测1615.3596。
(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-4-O-(2-萘甲基)-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-α/β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(50)和2-三氯甲基-[(3-O-苄基-4-O-(2-萘甲基)-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-1,2,4,6-四脱氧-α-D-半乳吡喃糖并]-[2,1,d]-噁唑啉(51)。将半缩醛49溶解在丙酮(12mL)中，加入PTFACl(113μL,713μmol,1.3当量)，然后加入Cs2CO3(197mg,604μmol,1.1当量)。在室温搅拌2小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 4:1)显示半缩醛(Rf 0.4)完全转化为极性较小的化合物(Rf 0.9)。将混悬液通过硅藻土垫过滤，用丙酮(5mL)洗涤两次，将滤液浓缩。通过柱层析法(cHex/EtOAc 90:10→85:15,+1％Et3N)纯化残余物，获得预期的PTFA供体50和噁唑啉51的4:1混合物(480mg,281μmol,80％)，为白色固体。分离的50和51的混合物具有Rf 0.9(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(主要化合物,CDCl3)δ7.85-6.70(m,21H,HAr),6.59(d,1H,J＝8.4Hz,NH),5.94(bs,1H,H-1B),6.37(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A),5.21(bs,2H,CH2Bn-6),6.37(d,1H,CH2Nap),6.37(d,1H,J＝12.1Hz,CH2Nap),4.88-4.81(mpo,2.5H),4.75(d,1H,J＝2.0Hz,H-5A),4.55(ddd,1H,H-2B),4.41(ddpo,1H,J2,3＝10.5Hz,H-2A),4.39-4.33(m,2H,H-4A,CH2Bn),4.25(d,1H,J＝11.8Hz,CH2Bn),4.21(ddpo,1H,J2,3＝2.8Hz,H-3A),4.19(do,1H,H-4B),4.13(d,1H,J2,3＝11.0Hz,J3,4＝3.2Hz,H-3B),3.90(brq,1H,H-5B),2.38(s,6H,CH3Ac),1.25(d,3H,J5,6＝6.2Hz,H-6B)。13CNMR(主要异构体,CDCl3)δ175.0(CONAc),168.8,168.7(C-6A),162.0(CONTCA),142.9,137.2,135.0,134.7,133.2,133.0(Cq,Ar),128.9,128.8,128.7(2C),128.6,128.4(2C),128.2(2C),128.0,127.8,127.7(2C),126.5,126.4,126.3,126.2,126.1,126.0(2C),125.7,124.9,120.4,119.2(CAr),98.5(C-1A),93.7(br,C-1B),92.0(CCl3),76.3(C-3B),74.1(C-5A),,73.5(C-4A),73.0(C-3A),72.6(CH2Nap),71.8(CH2Bn),67.6(CH2Bn-6),67.5(C-5B),64.6(C-4B),59.0(C-2A),49.9(C-2B),29.6(CH3Ac),,17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C51H48Cl3F3N6O11计算1100.2737；实测1100.2729。
烯丙基(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→3)-(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(52)。将PTFACl(102μL,642μmol,1.3当量)和Cs2CO3(117mg,543μmol,1.1当量)加入到半缩醛49(230mg,252μmol,1.0当量)的丙酮(8.0mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，将混悬液经硅藻土垫过滤，用丙酮(5mL)洗涤三次。将滤液减压浓缩，将粗产物用于下一步。
糖基供体50和51(252μmol理论值，1.1当量)和受体48(184mg，227μmol，1.0当量)的粗混合物与无水甲苯(5mL)共蒸发，然后在高真空下干燥1小时。将干燥的混合物溶解在无水DCM(8.0mL)中，在Ar气氛下与新活化的MS(500mg)一起搅拌1小时。将反应混合物冷却至0℃，加入TfOH(1.1μL,13μmol,0.05当量)。在此温度搅拌30分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc，4:1)显示没有进一步的变化，供体50/51(Rf 0.9)已经反应并且可以看到极性更强的点(Rf 0.35)。加入Et3N(2.0μL)，将混悬液通过合适的漏斗过滤。将固体用DCM(5mL)洗涤两次，在减压下浓缩滤液。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 80:20→60:40)纯化残余物，首先得到白色固体状的缩合产物52(240mg，141μmol，62％；校正产率85％)，然后得到一些未反应的48(50mg,7％)。四糖52具有1H NMR(CDCl3)δ7.82-7.74(m,4H,HAr),7.51-7.10(m,23H,HAr),6.99(d,J2,NH＝6.8Hz,NHB1),6.74(d,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.90(m,1H,CHAll),5.78(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A1),5.65(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A),5.29-5.15(m,6H,CH2All,CH2Bn-6),5.00(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B1),4.85-4.79(m,3H,CH2Nap,H-5A1),4.76(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B),4.72(d,1H,J4,5＝2.4Hz,H-5A),4.64(dd,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.8Hz,H-3B),4.45-4.22(m,11H,H-2A1,H-3B1,H-4A,H-4A1,H-3A,H-3A1,CH2All,CH2Bn),4.07-3.99(m,4H,CH2All,H-2A,H-4B1,H-4B),3.54-3.41(m,4H,H-2B,H-2B1,H-5B,H-5B1),2.38(brs,12H,CH3Ac),2.23(brs,3H,CH3Ac),1.28(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B),1.19(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B1)。13C NMR(CDCl3)δ175.3-174.8(br,4C,CONAc),168.7,168.3(C-6A,C-6A1),161.9,161.8(2CONTCA),137.4,135.2,135.1,135.0,133.2,133.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.0,128.9,128.8,128.7,128.6,128.5,128.4,128.2,128.1,128.0,127.9,127.8,127.7,127.6,126.3,126.1,125.9,125.6,125.2(CAr),117.9(CH2All),98.9(C-1A1 *,1JC,H＝175Hz),98.8(C-1B1,1JC,H＝167Hz),98.3(C-1A *,1JC,H＝175Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝163Hz),92.2,91.8(CCl3),76.7(C-3B1),76.2(C-5A1),75.9(C-3B),73.4(C-5A),73.6(C-4A),72.8,72.6(C-3A,C-3A1),72.5(CH2Nap),72.0,71.8(CH2Bn),71.4(C-4A1),70.1(CH2All),68.7,68.6(C-5B,C-5B1),67.5(2C,CH2Bn-6),65.3(C-4B),65.2(C-4B1),59.3(C-2A),59.1(C-2A1),58.8(C-2B1),55.3(C-2B),27.7,25.3,21.4(4C,CH3Ac),17.4,17.2(C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C78H86Cl6N6O21计算1722.4131；实测1722.4110。
烯丙基(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→3)-(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(53)。将DDQ(108mg,475μmol,3.0当量)加入到冷却至0℃的在DCM/磷酸盐缓冲液pH 7(8:1,18mL)中的四糖52(270mg,158μmol,1.0当量)中。将双相混合物剧烈搅拌4小时，同时让浴槽缓慢升温至室温。完成后，加入10％NaHCO3水溶液(10mL)，然后加入DCM(20mL)。将DCM层分离，用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将粗品通过快速色谱法用Tol/EtOAc(75:25→70:30)纯化。所得的醇53(180mg,115μmol,73％)为白色固体，具有Rf 0.3(Tol/EtOAc,6:4)。1H NMR(CDCl3)δ7.44-7.13(m,20H,HAr),6.97(d,J2,NH＝6.8Hz,NHB1),6.80(d,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.88(m,1H,CHAll),5.68(d,1H,J1,2＝7.8Hz,H-1A1),5.64(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A),5.34-5.15(m,6H,CH2All,CH2Bn-6),4.95(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B1),4.79(d,1H,J4,5＝2.0Hz,H-5A1),4.76(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.72(d,1H,J4,5＝2.4Hz,H-5A),4.64(dd,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.4Hz,H-3B),4.50-4.37(m,7H,H-3B1,H-4A,H-4A1,H-3A,H-3A1,CH2Bn),4.32-4.24(m,3H,CH2Bn,CH2All),4.13-3.99(m,4H,CH2All,H-2A1,H-2A,H-4B1,H-4B),3.54-3.41(m,4H,H-2B,H-2B1,H-5B,H-5B1),2.61(d,1H,J4,OH＝2.0Hz,OH),2.38-2.32(brs,9H,CH3Ac),2.22(brs,3H,CH3Ac),1.28(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B),1.19(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B1)。13C NMR(CDCl3)δ175.3,174.7(CONAc),168.3,168.2(C-6A),161.9,161.8(CONTCA),137.4,136.9,135.0(2C)(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.0,128.9,128.7(2C),128.6(2C),128.5,128.4,128.3,128.2,128.0(2C),125.2(CAr),117.9(CH2All),98.9(C-1B1,1JC,H＝168Hz),98.4(C-1A,1JC,H＝176Hz),98.4(C-1A1,1JC,H＝177Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.2,91.9(2C,CCl3),76.7(C-3B1),76.2(C-5A1),75.7(C-3B),75.2(C-5A),72.6(C-4A),72.5,71.4(C-3A,C-3A1),72.3,72.0(2C,CH2Bn),70.1(CH2All),68.7,68.6(C-5B,C-5B1),67.5,67.5(2C,CH2Bn-6),66.5(C-4A1),65.3(2C,C-4B,C-4B1),59.3(C-2A),59.1(C-2A1),55.7(C-2B1),55.2(C-2B),27.7,25.3,21.4(4C,CH3Ac),17.4,17.2(C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C67H78Cl6N11O21计算1582.3505；实测1582.3503。
烯丙基(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→3)-(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→3)-(3-O-苄基-2-(N,N-二乙酰基)氨基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(54)。将半缩醛49(131mg,144μmol,1.0当量)溶解在丙酮(7.0mL)中。加入PTFACl(30μL,187μmol,1.3当量)和Cs2CO3(52mg,158μmol,1.1当量)，将混合物在室温搅拌2小时。将固体通过硅藻土垫过滤，用丙酮(5mL)洗涤两次。在减压下浓缩滤液，将分离为PTFA50和噁唑啉51的4:1混合物的粗供体不进行进一步纯化用于下一步。
将供体50/51(144μmol理论值，1.25当量)和受体53(180mg,115μmol,1.0当量)的粗混合物与无水甲苯(5mL)共蒸发两次，然后在高真空下彻底干燥。将混合物溶解在无水DCM(6.0mL)中，在Ar气氛下在室温与新活化的MS(200mg)一起搅拌30分钟，然后冷却至0℃。加入TfOH(1.0μL，0.05当量)，在此温度搅拌30分钟后，TLC分析表明供体被消耗，存在主要的新产物以及一些未反应的受体。加入Et3N(2.0μL)，10分钟后，滤出固体并用DCM(5mL)洗涤两次。蒸发挥发物，通过快速色谱法(Tol/EA75:25→60:40)纯化残余物，首先获得白色固体状的缩合产物54(200mg，81μmol，71％；校正产率98％)，然后获得一些未反应的53(50mg,28％)。六糖54具有Rf 0.25(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.11(m,37H,HAr),6.94(d,J2,NH＝6.8Hz,NHB2*),6.90(d,J2,NH＝6.8Hz,NHB1*),6.74(d,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.91-5.81(m,1H,CHAll),5.78(d,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A2),5.65(d,1H,J1,2＝7.8Hz,H-1A1*),5.64(d,1H,J1,2＝7.8Hz,H-1A*),5.31-5.16(m,8H,CH2All,3CH2Bn-6),5.03(d,1H,J1,2＝8.1Hz,H-1B2*),4.99(d,1H,J1,2＝8.1Hz,H-1B1*),4.82-4.80(m,2H,CH2Nap),4.80(dpo,1H,J4,5＝2.2Hz,H-5A*)4.78(dpo,1H,J4,5＝2.4Hz,H-5A1*),4.76(dpo,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1B),4.72(d,1H,J4,5＝2.3Hz,H-5A2*),4.68(dd,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.7Hz,H-3B2*),4.59(dd,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.6Hz,H-3B1*),4.44(dd,1H,J3,4＝3.8Hz,J2,3＝10.7Hz,H-3B),4.41-4.22(m,15H,H-2A2,H-3B,H-4A,H-4A1,H-4A2,H-3A,H-3A1,H-3A2,CH2All,3CH2Bn),4.09(bdpo,1H,H-4B1*),4.07(bdpo,1H,H-4B),4.05-3.99(m,4H,CH2All,H-2A,H-2A1,H-4B2*),3.52(dt,1H,H-2B),3.50-3.43(m,3H,H-5B,H-5B1,H-5B2),3.42-3.36(m,2H,H-2B1,H-2B2),2.41(brs,12H,4CH3Ac),2.23(brs,6H,2CH3Ac),1.30(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B*),1.23(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B1*)1.12(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B2*)。13C NMR(CDCl3)δ175.6,175.3,175.0,174.7(br,6C,CONAc),168.9,168.8,168.7(3C,C-6A),162.3,161.8,161.7(3C,CONTCA),137.5,137.4,135.2,135.1,135.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),133.2,133.0(Cq,Ar),129.0,128.9,128.8,128.7,128.6,128.5,128.4,128.2,128.1,128.0,127.8,127.7,126.4,126.1,125.9,125.6,125.2(27C,CAr),117.9(CH2All),98.9(C-1B2*,1JC,H＝167Hz),98.8(C-1A2,1JC,H＝175Hz),98.7(C-1B1*,1JC,H＝167Hz),98.4(C-1A1*,1JC,H＝177Hz),98.3(C-1A*,1JC,H＝177Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝163Hz),76.7,75.7,75.1(C-3B,C-3B1,C-3B2),76.2,74.0(3C,C-5A,C-5A1,C-5A2),73.7,71.3(3C,C-4A,C-4A1,C-4A2),72.8,72.4,70.9(C-3A,C-3A1,C-3A2),72.5(CH2Nap),72.0,71.9(3C,CH2Bn),70.1(CH2All),68.6,68.5(C-5B,C-5B1,C-5B2),67.5(3C,CH2Bn-6),65.3,65.2(C-4B,C-4B1,C-4B2),59.5,59.4,59.1(C-2A,C-2A1,C-2A2),55.9,55.2(C-2B,C-2B1,C-2B2),27.7,25.4(3C,CH3Ac),17.4,17.3(C-6B,C-6B1,C-6B2)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C110H124Cl9N17O31计算1246.7922；实测1246.7922。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→3)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→3)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(55)。将DDQ(55mg,244μmol,3.0当量)加入到在DCM(8.0mL)和磷酸盐缓冲液pH 7(1.0mL)中的六糖54(200mg,81μmol,1.0当量)中。将双相混合物冷却至0℃并搅拌2小时。加入额外的DDQ(200mg,81μmol,1.0当量)并继续搅拌4小时，同时浴温达到室温。TLC分析(Tol/EtOAC 3:1)显示不存在完全保护的54(Rf 0.6)并且存在更极性的点(Rf0.4)。加入10％NaHCO3水溶液(5mL)，然后加入DCM(15mL)。将DCM层分离，用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 4:1→3:1)纯化，获得醇55(120mg,51μmol,64％)，为白色固体。六糖55具有1H NMR(CDCl3)δ7.36-7.13(m,30H,HAr),6.89(dpo,J2,NH＝6.8Hz,NHB*),6.87(d,J2,NH＝6.8Hz,NHB1*),6.72(d,J2,NH＝7.6Hz,NHB2*),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.68(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A*),5.65(dpo,1H,J1,2＝7.8Hz,H-1A1*),5.65(dpo,1H,J1,2＝7.8Hz,H-1A2*),5.35-5.15(m,8H,CH2All,3CH2Bn-6),5.01(dpo,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B*),4.94(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B1*),4.79-4.75(m,6H,CH2Nap,H-5A*,H-5A1*,H-3B*,H-1B2*),4.72(d,1H,J4,5＝2.4Hz,H-5A2*),4.69(dd,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.8Hz,H-3B1*),4.58(dd,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.4Hz,H-3B2*),4.45-4.23(m,15H,H-3B,H-4A,H-4A1,H-4A2,H-3A,H-3A1,H-3A2,CH2All,3CH2Bn),4.08-3.99(m,7H,H-2A,H-2A1,H-2A2,H-4B,H-4B1,H-4B2,CH2All),3.54-3.35(m,6H,H-2B,H-2B1,H-2B2,H-5B,H-5B1,H-5B2),2.52(d,1H,J4,OH＝2.4Hz,OH),2.40-2.17(brm,18H,CH3Ac),1.29-1.12(m,12H,H-6B,H-6B1,H-6B2)。13C NMR(CDCl3)δ175.3(6C,CONAc),168.3(2C),168.1(3C,C-6A),161.8(2C),161.7(3C,CONTCA),133.5,133.5(CHAll),137.4,136.8,135.0(2C),127.8,127.0(Cq,Ar),129.0,129.4,128.8(2C),128.7(2C),128.6(2C),128.5(2C),128.4(2C),128.3,128.2,128.0(2C),125.2(30C,CAr),117.9(CH2All),98.9(C-1B*,1JC,H＝166Hz),98.7(C-1B1*,1JC,H＝167Hz),98.4(C-1A,1JC,H＝175Hz),98.3(2C,C-1A1*,C-1A2*,1JC,H＝175Hz),97.6(C-1B2*,1JC,H＝164Hz),92.6,91.8(3C,CCl3),76.6,75.5,75.1(C-3B,C-3B1,C-3B2),76.2(2C),75.2(C-5A,C-5A1,C-5A2),72.8,72.6,72.4(C-3A,C-3A1,C-3A2),72.3,72.0(3C,3CH2Bn),71.3,71.0(2C,C-4A,C-4A1),70.1(CH2All),68.6(2C),68.5(C-5B,C-5B1,C-5B2),67.7,67.5(3C,CH2Bn-6),66.5(C-4A2),65.4,65.3,65.2(C-4B,C-4B1,C-4B2),59.5,59.3,59.0(C-2A,C-2A1,C-2A2),55.8(2C),55.3(C-2B,C-2B1,C-2B2),27.7(6C,CH3Ac),17.4,17.3,17.2(3C,C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C99H112Cl9N16O31计算2335.4876；实测2335.4871。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→3)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→3)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→3)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-(N,N-二乙酰基)氨基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(56)。将供体50/51(92mg,85μmol,1.5当量)和受体55(132mg,57μmol,1.0当量)的4:1混合物与甲苯(3mL)共蒸发两次，然后在高真空下彻底干燥。将混合物溶解在无水DCM(4.0mL)中，在室温与新活化的MS一起搅拌45分钟，并冷却至0℃。加入TfOH(3.8μL,0.05当量)，将反应混合物在此温度搅拌。完成时，如TLC分析(Tol/EtOAc 7:3)所示，加入Et3N(5.0μL)，10分钟后，通过合适的漏斗过滤固体。将滤液浓缩至干，通过快速色谱法(Tol/EtOAc 80:20→70:30)纯化残余物，首先获得糖基化产物56(60mg,19μmol,33％,校正产率54％就受体而论(wrt acceptor))，为白色固体，然后是剩余的未反应受体55(50mg,38％)。八糖56具有Rf 0.35(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.74(m,5H,HAr),7.52-7.11(m,42H,HAr),6.90-6.86(m,3H,NHB1,NHB3,NHB3),6.71(d,1H,J2,NH＝7.3Hz,NHB),5.90-5.75(m,1H,CHAll),5.78(d,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A3),5.66-5.62(m,3H,H-1A,H-1A1,H-1A2),5.29-5.16(m,10H,CH2All,4CH2Bn-6),5.03-5.01(m,2H,H-1B1,H-1B2),4.96(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B3),4.83-4.80(m,3H,CH2Nap,H-5A),4.78-4.76(m,3H,H-1B,H-5A1*,H-5A2*),4.72-4.55(m,4H,H-3B,H-3B1,H-3B2,H-5A3*),4.45-4.22(m,17H,H-2A*,H-3B3*,H-3A,H-3A1,H-3A2,H-3A3,H-4A,H-4A1,H-4A2,H-4A3,CH2All,3CH2Bn),4.09-3.98(m,8H,CH2All,H-2A1,H-2A2,H-2A3,4H-4B),3.55-3.32(m,8H,4H-2B,4H-5B),2.40-2.19(mpo,24H,8CH3NAc),1.30-1.18(d,12H,J5,6＝6.4Hz,H-6B,H-6B1,H-6B2,H-6B3)。13C NMR(部分,CDCl3)δ175.5,175.0,174.6(CONAc),168.7(2C),168.3,168.2(C-6A),162.3,161.8,161.7(4C,CONTCA),137.4(2C)137.3,135.2(2C),135.1,135.0(2C),133.2,133.0,126.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.0,128.9,128.8,128.7(2C),128.6,128.5(2C),128.4(2C),128.2,128.1,128.0,127.8,127.7,126.4,126.1,125.9,125.6,125.2(CAr),117.9(CH2All),98.9(C-1A3*,1JC,H＝178Hz),98.8(C-1B3*,1JC,H＝166Hz),98.7(C-1B1,C-1B2,1JC,H＝168Hz),98.4(C-1A1*,C-1A2*,1JC,H＝178Hz),98.3(C-1A*,1JC,H＝178Hz),97.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.2,91.8(4C,CCl3),76.6,75.8,75.1,74.9(4C,C-3B,C-3B1,C-3B2,C-3B3),76.2,73.7(4C,C-5A,C-5A1,C-5A2,C-5A3),74.0,72.9,72.8(4C,C-4A,C-4A1,C-4A2,C-4A3),72.5(CH2Nap),71.8,70.9(3C,C-3A,C-3A1,C-3A2),72.0,71.9(4C,CH2Bn),70.1(CH2All),68.6,68.5(4C,C-5B,C-5B1,C-5B2,C-5B3),67.5(4C,CH2Bn-6),65.4(4C,C-4B,C-4B1,C-4B2,C-4B3),59.5,59.4,59.1(4C,C-2A,C-2A1,C-2A2,C-2A3),),55.8,55.3(4C,C-2B,C-2B1,C-2B2,C-2B3),),27.6,25.2,12.4(8C,CH3Ac),17.4,17.3,17.2(4C,C-6B,C-4B1,C-4B2,C-4B3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C142H154Cl12N21O41计算3229.6899；实测3230.7006。
-完全脱保护
方案10.宋内志贺菌两性离子二糖至八糖1至4的合成。(i)Pd(OH)2/C,H2,tBuOH/DCM/H2O,(ii)NH2OH,MeOH,在两步中对于1为57％,对于2为39％,对于3为31％,对于4为16％。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(1)。[1]将20％Pd(OH)2/C(100mg)加入到47(50mg,53μmol,1.0当量)在tBuOH/DCM/H2O(17mL,20:5:2,v/v/v)中的溶液中。在氢气氛中搅拌48小时后，将混悬液通过0.2μm过滤器并用甲醇彻底洗涤。将滤液浓缩，将粗产物真空干燥。将所得的白色粉末溶解在甲醇(5mL)中，加入羟胺(3.7mg，μmol，1.0当量)。LCMS监测表明4小时后单乙酸酯产物已完全消耗，并且存在期望的产物(LCMS:[M+H]+m/z 867.2)。加入磷酸盐缓冲液pH 7并频繁监测pH以达到pH 7。将混合物用水(10mL)稀释并冻干。在冷冻干燥后，通过半制备型RP-HPLC纯化粗物质，获得丙基糖苷1(14mg,30μmol,57％)，为白色固体。二糖1具有RP-HPLC(215nm)Rt＝13.9min(条件B),Rt＝12.2min(条件C)。HRMS(ESI+):m/zC19H35N3O9Na计算[M+Na]+m/z 486.2064；实测486.2067。NMR数据与发表的一样。[1]
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(2)。将四糖54(30mg,18μmol,1.0当量)溶解于tBuOH/DCM/H2O(10mL,20:5:2,v/v/v)，加入20％Pd(OH)2/C(100mg)。将反应混合物脱气数次，在氢气氛下搅拌48小时。HRMS追踪显示存在主要产物，对应于2A-NAc2,2B-NAc产物(HRMS:C39H62N6O21Na[M+Na]+m/z 973.4270)。将混悬液通过注射器过滤器(0.2μm)并用甲醇彻底洗涤。将滤液浓缩，将粗产物真空干燥。将所得的白色粉末溶解在甲醇(3.0mL)中，加入羟胺(2.2mg,36μmol,2.0当量)。LCMS监测显示，4小时后，没有中间体残留，并且大量存在期望的产物(LCMS:[M+H]+m/z 867.3)。将反应混合物用磷酸盐缓冲液中和并频繁监测pH以达到pH 7，然后用水(6.0mL)稀释并冻干。通过半制备型RP-HPLC纯化粗物质，获得丙基糖苷2(5.9mg,6.8μmol,39％)，为白色固体。四糖2具有RP-HPLC(215nm)Rt＝12.3min(条件A),Rt＝13.6min(条件B),1H NMR(D2O)δ4.87(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A),4.77(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A1),4.74(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B1),4.66(brs,1H,H-5A),4.60(brs,1H,H-5A1),4.44(dpo,2H,J＝8.4Hz,H-1B,H-4A),4.36(brs,1H,H-4A1),4.15-4.08(m,2H,H-3B,H-3B1),4.03-3.99(mpo,2H,H-5B,H-5B1),3.96-3.90(m,2H,H-2A,H-4B),3.80-3.66(m,7H,H-3A,H-3A1,H-2A1,H-2B,H-2B1,H-4B1,OCH2Pr),3.51-3.49(mpo,1H,OCH2Pr),1.99,1.94(2s,12H,CH3Ac),1.51-1.48(m,2H,CH2Pr),1.29(dpo,6H,H-6B,H-6B1),0.82(t,3H,J＝7.2Hz,CH3Pr)。13C NMR(D2O)δ174.6,174.5(2C),174.0(4C,CONHAc),172.7,172.5(2C,C-6A,C-6A1),102.9(C-1B1,1JC,H＝168Hz),101.6(C-1B,1JC,H＝166Hz),101.1(2C,C-1A,C-1A1,1JC,H＝170Hz,1JC,H＝168Hz),76.7(C-4A),76.5,76.3,76.0(4C,C-5A,C-5A1,C-3B,C-3B1),72.7(OCH2Pr),68.5(C-4A1),67.8,67.6(2C,C-3A,C-3A1),67.4,67.3(2C,C-5B,C-5B1),54.8,54.7(2C,C-4B,C-4B1),51.5(C-2A1),51.3(C-2A),51.0,50.8(2C,C-2B,C-2B1),23.3,22.2(4C,CH3Ac),21.2(CH2Pr),15.6,15.5(2C,C-6B,C-6B1),9.5(CH3Pr)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C35H58N6O19Na计算889.3649；实测889.3636。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(3)。将六糖54(70mg,31μmol,1.0当量)溶解于tBuOH/DCM/H2O(19mL,20:5:2,v/v/v)。加入20％Pd(OH)2/C(120mg)，将混悬液反复脱气。在氢气氛下搅拌48小时后，通过LCMS分析监测显示存在目标中间体(LCMS:[M+H]+m/z1396.4)。将混悬液通过0.2μm过滤器并用甲醇彻底洗涤。将滤液浓缩，将粗物质真空干燥2小时。将所得的白色粉末溶解在甲醇(3.0mL)中，加入羟胺(6.1mg,85μmol,3.0当量)。搅拌3小时后，LCMS分析显示三乙酸酯中间体完全消失并且存在期望的产物(LCMS:[M+H]2+m/z 635.2)。加入水(6.0mL)，将反应混合物冻干。通过半制备型RP-HPLC纯化粗物质，获得六糖3(12mg，9.4μmol，31％)，为白色固体。丙基糖苷3具有RP-HPLC(215nm)Rt＝11.3min(条件A),Rt＝13.3min(条件B)。1H NMR(D2O)δ4.88(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A2),4.78(dpo,2H,J1,2＝8.4Hz,H-1A,H-1A1),4.75(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B1,H-1B2),4.70(brspo,2H,H-5A,H-5A1),4.61(brs,1H,H-5A2),4.62(mpo,2H,H-1B,H-4A),4.36(brs,1H,H-4A1),4.16-4.09(m,3H,H-3B,H-3B1,H-3B2),4.06-3.90(m,7H,H-5B,H-5B1,H-5B2,H-2A,H-2A1,H-4A,H-4B),3.86-3.72(m,10H,H-3A,H-3A1,H-3A2,H-4B1,H-4B2,H-2A2,H-2B,H-2B1,H-2B2,OCH2Pr),3.51-3.49(mpo,1H,OCH2Pr),1.99,1.98,1.96,1.95(4s,18H,CH3Ac),1.54-1.45(m,2H,CH2Pr),1.30-1.29(dpo,9H,H-6B),0.82(t,3H,J＝7.2Hz,CH3Pr)。13C NMR(D2O)δ174.7,174.5(2C),174.4(2C),174.0(6C,CONAcA,B),172.6,172.2(2C)(3C,C-6A,C-6A1,C-6A2),102.9(2C,C-1B1,C-1B2,1JC,H＝174.2Hz,1JC,H＝170.2Hz),101.6(C-1B,1JC,H＝162.0Hz),101.2,101.1(3C,C-1A,C-1A1,C-1A2),76.6(2C,C-4A,C-4A1),76.3,76.1(3C,C-5A,C-5A1,C-5A2),75.7(3C,C-3B,C-3B1,C-3B2),72.7(OCH2Pr),68.4(C-4A2),68.2,67.8(3C,C-3A,C-3A1,C-3A2),67.6,67.3(3C,C-5B,C-5B1,C-5B2),54.8,54.7(3C,C-4B,C-4B1,C-4B2),51.5,51.3(3C,C-2A,C-2A1,C-2A2),50.9,50.8(3C,C-2B,C-2B1,C-2B2),23.3,22.2(6C,CH3Ac),21.2(CH2Pr),15.6(3C,C-6B,C-6B1,C-6B2),9.5(CH3Pr)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C51H85N9O28计算635.7747；实测635.7736。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(4)。将八糖56(20mg,12μmol,1.0当量)溶解于tBuOH/DCM/H2O(16.5mL,20:5:2,v/v/v)。加入20％Pd(OH)2/C(50mg)，将混悬液反复脱气。在氢气氛下搅拌48小时后，将混悬液通过0.2μm过滤器并用甲醇彻底洗涤。将滤液浓缩，将粗物质真空干燥2小时。粗物质的HRMS分析表明存在四-2-N-乙酰基乙酰胺基产物([M+2H]2+C75H118N12O41计算921.3758,实测921.3753)。将所得的白色粉末溶解在甲醇(3.0mL)中，加入羟胺(3.0mg,49μmol,4.0当量)。在搅拌6小时后，LCMS分析显示存在期望质量的产物(LCMS:[M+H]2+m/z 837.2)。加入水(6.0mL)，将反应混合物冻干。通过半制备型RP-HPLC纯化粗品，获得八糖4(1.7mg,1.01μmol,16％)，为白色固体。丙基糖苷4具有RP-HPLC(215nm)Rt＝11.3min(条件A’)。1H NMR(D2O,800MHz)δ4.81-4.79(2dpo,3H,H-1A),4.67-4.65(mpo,4H,H-1A,3H-1B),4.54(brdpo,2H,H-4A),4.42-4.37(brs,4H,3H-5A,H-1B),4.31-4.30(mpo,3H,H-5A,2H-4A),4.11-4.05(m,4H,H-3B),4.01-3.99(q,4H,H-5B),3.92-3.87(m,3H,H-2B,2H-4B),3.82-3.68(m,9H,4H-2A,3H-2B,2H-4B),3.67-3.65(mpo,3H,2H-3A,OCH2Pr),3.59-3.55(mpo,3H,2H-3A,OCH2Pr),1.96-1.89(mpo,24H,CH3Ac),1.47-1.44(m,2H,CH2Pr),1.26(mpo,12H,H-6B),0.78(t,3H,J＝7.2Hz,CH3Pr)。13C NMR(D2O,800MHz)δ174.8,174.6,174.4,173.9(8C,CONAc),173.9(4C,C-6A),103.0(2C,C-1A),101.6(2C,C-1A,C-1B),101.1(2C,C-1B),100.9(2C,C-1B,C-1A),77.9,77.4,77.3(3C,C-4A,C-4A1,C-4A2),76.0,75.8,75.7,75.5(4C,C-3B),72.6(OCH2Pr),72.0(C-4A3),69.1,68.1,67.7(4C,C-3A),67.4,67.2(4C,C-5B),54.9,54.7(4C,C-4B),51.4(4C,C-2A),50.9,50.8(4C,C-2B),22.3,22.1(8C,CH3Ac),21.2(CH2Pr),15.5(4C,C-6B),9.4(CH3Pr)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C61H110N12O37计算837.3547；实测837.3542。
实施例4：策略2A-NR1R2,2B-NDCA,4A-Nap系列
方案11.以2B-NDAC部分为特征的AB低聚物的逆合成分析。
方案12.使用正交保护的A供体33和受体9通过[A+B]糖基化合成AB结构单元65。(i)LiOH.H2O,Acet/H2O(2:1,v/v),50℃,(ii)DCA-Cl,Et3N,ACN,两步68％,(iii)粗的33,TMSOTf,ACN,-15℃,67％,(iv)a.H2NCH2CH2NH2,MeOH/THF(1:1,v/v),50℃,b.Ac2O,MeOH,87％,(v)TBAF,THF,80％,(vi)TEMPO,BAIB,DCM/H2O,(vii)BnBr,K2CO3,DMF,两步61％。ACN:乙腈。
烯丙基4-叠氮基-2-二氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(9)。将LiOH.H2O(304mg,7.2mmol,3.0当量)加入到在丙酮/水(3:1,24mL)中的完全保护的8(1.0g,2.4mmol,1.0当量)中。在50℃搅拌2小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 1:2)表明起始材料(Rf0.8)被完全消耗并且存在极性更强的产物(Rf 0.0)。将反应混合物减压浓缩。使粗品通过短硅胶柱，用95:5DCM/MeOH洗脱，在高真空下充分干燥后获得中间体氨基醇。后者具有HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C9H16N4O3计算229.1301；实测229.1302。
将Et3N(0.5mL，3.6mmol，1.5当量)加入到粗氨基醇的无水ACN(10mL)溶液中，然后冷却至0℃。缓慢加入二氯乙酰氯(391μL，2.6mmol，1.1当量)，在此温度搅拌30分钟后，TLC追踪(Tol/EtOAc 7:3)表明氨基醇被完全消耗并且存在极性较低的产物(Rf 0.2)。加入EtOAc(30mL)和水(20mL)，分离有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 7:3→6:4)纯化粗残余物，获得期望的二氯乙酰胺9(560mg,1.65mmol,68％)，为白色固体。受体9具有1H NMR(DMSO-d6)δ8.40(d,1H,JNH,2＝9.2Hz,NH),6.38(s,1H,CHCl2),5.81-5.76(m,1H,CHAll),5.63(d,1H,J＝4.8Hz,OH),5.24-5.20(m,1H,CH2All),5.10-5.07(m,1H,CH2All),4.36(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1),4.18-4.13(m,1H,CH2All),3.96-3.88(m,2H,H-3,CH2All),3.76(dd,1H,J3,4＝4.4Hz,J4,5<1.0Hz,H-4),3.67-3.62(mpo,1H,H-5,H-2),1.20(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6)。13C NMR(DMSO-d6)δ164.1(CONHDCA),134.9(CH2All),116.7(CH2All),100.5(C-1,1JC,H＝161Hz),70.8(C-3),69.2(CH2All),68.7(C-5),67.6(CHCl2),66.2(C-4),53.3(C-2),17.7(C-6)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C11H16Cl2N4O4Na计算361.0446；实测361.0442。
烯丙基3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-四氯邻苯二甲酰亚胺基-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2-二氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(62)。将粗的PTFA供体33(737mg，680μmol，1.15当量)和受体5(200mg，592μmol，1.0当量)混合，并与甲苯(5mL)共蒸发两次。将混合物在高真空下彻底干燥1小时，溶解在无水ACN(15mL)中，在Ar气氛下与新活化的MS(1.0g)一起搅拌30分钟。在冷却至-15℃后，缓慢加入TMSOTf(8μL,34μL,0.05当量)。在此温度搅拌1小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 9:1)显示供体被消耗并且存在新的主要点(Rf 0.7)。加入Et3N(15μL)，滤出固体。浓缩滤液，通过快速色谱法(cHex/EtOAc 90:10→85:15)纯化残余物。获得二糖62(490mg,397μmol,67％)，为白色固体。偶联产物62具有1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.77(m,4H,HAr),7.66-7.62(m,4H,HAr),7.53-7.37(m,9H,HAr),7.04-6.97(m,5H,HAr),6.45(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.85-5.76(m,1H,CHAll),5.67(s,1H,CHCl2),5.40(d,1H,J1,2＝7.2Hz,H-1A),5.23-5.17(m,1H,CH2All),5.15-5.11(m,1H,CH2All),4.96(d,1H,J＝12.6Hz,CH2Nap),4.82(dpo,1H,CH2Nap),4.82(ddpo,1H,J2,3＝11.1Hz,H-2A),4.62(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.59(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.48(dd,1H,J3,4＝3.6Hz,J2,3＝10.8Hz,H-3B),4.34(pdt,1H,J4,5＝3.2Hz,H-5A),4.29(ddpo,1H,J3,4＝3.5Hz,H-3A),4.27-4.22(m,1H,CH2All),4.12(pt,H-4A),4.08(d,1H,CH2Bn),3.99-3.94(m,1H,CH2All),3.84(dd,1H,J6a,6b＝10.9Hz,J5,6a＝6.3Hz,H-6aA),3.80(brdpo,1H,H-4B),3.78(ddpo,1H,J5,6b＝6.2Hz,H-6bA),3.50(dddpo,1H,H-2B),4.47(dqpo,1H,J4,5＝1.1Hz,H-5B),1.20(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6B),1.03(s,9H,CH3TBDPS)。13CNMR(CDCl3)δ163.9(CONTCA),163.3(CONTCP),139.8,137.7,135.7,133.2,133.0,132.9,129.5,127.2(Cq,Ar),133.6(CHAll),135.6,135.5,129.9,128.1,128.0,127.9(2C),127.8,127.6,127.5,127.4,126.5,126.0,125.9,125.8(CAr),117.7(CH2All),98.0(C-1B,1JC,H＝163Hz),97.8(C-1A,1JC,H＝170Hz),76.1(C-5A),75.6(C-3B),73.9(C-3A),72.7(CH2Nap),72.1(CH2Bn),71.5(C-4A),69.9(CH2All),69.1(C-5B),66.3(CCl3),65.1(C-4B),62.9(C-6A),54.6(C-2B),54.3(C-2A),26.8(CH3TBDPS),19.2(CTBDPS),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C59H61Cl6N6O10Si计算1251.2350；实测m/z 1251.2330。
烯丙基2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2-二氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(63)。将乙二胺(75μL，1.13mmol，4.0当量)加入到在THF/MeOH(1:1，14mL)中的二糖62(350mg，284μmol，1.0当量)中。将反应混合物在50℃加热60小时，此时，TLC分析(Tol/EtOAc 7:3)显示起始物62(Rf 0.95)被消耗并且存在新点(Rf 0.1)。冷却至室温后，加入Et3N(0.5mL)，然后加入Ac2O(268μL,2.8mmol,10.0当量)。TLC分析(Tol/EtOAc 6:4)显示存在新点(Rf 0.4)。滤出固体并用DCM(5mL)洗涤两次。浓缩滤液，通过柱层析法(cHex/EtOAc3:1→2:1)纯化粗产物。所得的二糖63为白色固体(250mg,247μmol,87％)，具有1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.63(m,8H,HAr),7.51-7.18(m,15H,HAr),6.68(m,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.94(s,1H,CHCl2),5.91-5.82(m,1H,CHAll),5.29(do,1H,J2,NH＝7.7Hz,NHA),5.28-5.24(mpo,1H,CH2All),5.20-5.16(m,1H,CH2All),4.88(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.77(d,1H,J2,NH＝12.2Hz,CH2Nap),7.73(do,1H,J1,2＝3.8Hz,H-1A,),4.72(dpo,1H,CH2Nap),4.71(do,1H,CH2Bn),4.55(d,1H,J＝12.2Hz,CH2Bn),4.47-4.39(m,3H,H-2A,H-3B,H-5A),4.34-4.29(m,1H,CH2All),4.07-4.02(m,1H,CH2All),3.99(ddpo,1H,J5,6a＝2.7Hz,J6a,6b＝11.1Hz,H-6aA,),3.95(ddpo,1H,J5,6b＝4.8Hz,H-6bA),3.91(dd,1H,J2,3＝3.6Hz,H-3A),3.65(dd,1H,J3,4＝3.6Hz,J4,5＝8.8Hz,H-4A),3.57(brd,1H,J3,4＝3.4Hz,H-4B),3.53(dq,1H,J4,5＝1.1Hz,H-5B),3.43(ddd,1H,J2,3＝10.8Hz,H-2B),1.78(s,3H,CH3Ac),1.18(d,3H,J5,6＝6.3Hz,H-6B),1.08(s,9H,CH3TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ169.3(CONDCA),164.7(CONAc),138.8,135.2,133.5(2C),133.1,133.0(Cq,Ar),133.7(CHAll),135.7,135.6,12.7,129.0,128.2(2C),127.8,127.7,127.6(2C),126.7,126.1,125.9,125.9(CAr),117.67(CH2All),101.5(C-1A,1JC,H＝170Hz),97.8(C-1B,1JC,H＝163Hz),76.5(C-3B),72.5(C-3A),70.6(C-4A),71.4(CH2Nap),70.6(CH2Bn),70.0(CH2All),69.8(C-5A),69.6(C-5B),66.5(CHCl2),65.6(C-4B),63.7(C-6A),55.3(C-2B),49.8(C-2A),27.0(CH3TBDPS),23.1(CH3Ac),19.4(CTBDPS),17.1(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C53H62Cl2N5O9Si计算1010.3694；实测1010.3669。
烯丙基2-乙酰胺基-3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2-二氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(64)。在室温，将TBAF(83mg，266μmol，1.2当量)加入到在无水THF(10mL)中的二糖63(220mg，221μmol，1.0当量)中。在2小时后，TLC监测(EtOAc)显示反应完成并且存在更多的点(Rf 0.1)。加入乙酸(27μL，266μmol，1.2当量)。在减压下去除挥发物。通过快速色谱法(EtOAc/MeOH 100:0→85:15)纯化残余物，获得醇64(135mg,175μmol,80％)，为白色固体。二糖64具有1H NMR(DMSO-d6)δ8.57(d,1H,J2,NH＝9.2Hz,NHB),7.94-7.82(m,4H,HAr,NHA),7.76(brs,1H,HAr),7.51-7.49(m,2H,HAr),7.42-7.39(m,3H,HAr),7.32-7.25(m,3H,HAr),6.44(s,1H,CHCl2),5.84-5.76(m,1H,CHAll),5.26-5.21(m,2H,CH2All),5.12-5.09(m,1H,CH2All),4.76(brs,1H,H-1A),4.71(d,1H,J＝11.6Hz,CH2Nap),4.66-4.61(m,2H,CH2Bn,OH),4.55(d,1H,J＝11.6Hz,CH2Bn),4.50(dpo,1H,CH2Nap),4.48(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B),4.28-4.15(m,3H,H-2A,H-5A,CH2All),4.03-3.94(m,3H,H-3B,H-4B,CH2All),3.82-3.69(m,5H,H-2B,H-5B,H-3A,H-4A,H-6aA),3.56-3.50(m,1H,H-6bA),1.78(s,3H,CH3Ac),1.23(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(DMSO-d6)δ169.3(CONDCA),164.2(CONAc),139.3,136.5,133.2,132.9(Cq,Ar),134.9(CHAll),128.3,128.2,128.1,128.0,127.5,126.5,126.4,126.3(2C)(CAr),116.8(CH2All),101.8(C-1A,1JC,H＝169Hz),100.1(C-1B,1JC,H＝161Hz),77.7(C-3B),73.6(C-3A),72.6(C-4A),70.9(CH2Nap),70.3(CH2Bn),69.8(C-5A),69.5(C-5B),69.2(CH2All),67.6(CHCl2),65.4(C-4B),61.5(C-6A),52.4(C-2B),49.5(C-2A),22.9(CH3Ac),17.6(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z772.2502(计算C37H43Cl2N5O9H[M+H]+m/z 772.2516)。
烯丙基(2-乙酰胺基-3-O-苄基-6-O-苄基-4-O-(2-萘甲基)-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-二氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(65)。在室温，将TEMPO(4mg,26μmol,0.2当量)，然后将BAIB(104mg,324μmol,2.5当量)加入到醇64(100mg，130μmol，1.0当量)在DCM/水(2:1,6.0mL)中的混悬液中。在室温剧烈搅拌2小时后，TLC监测(EtOAc/MeOH 20:1)显示存在主要极性点并且不存在起始物64(Rf 0.2)。加入50％Na2SO3水溶液(5mL)，分离DCM层，将水相用氯仿/异丙醇(3:1,10mL)萃取两次。将水相用稀HCl水溶液酸化以达到pH～1，再次用氯仿/异丙醇(3:1,10mL)萃取两次。将合并的有机相用盐水洗涤(50mL)，通过分相过滤器干燥并减压浓缩。在室温，将由此获得的粗品溶解在DMF(2.0mL)中，加入苄基溴(44μL，259μmol，2.0当量)，然后加入K2CO3(27mg，194μmol，1.5当量)。在室温搅拌4小时后，加入水(20mL)。将水层用DCM(5.0mL)洗涤三次。将合并的DCM部分用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并减压浓缩。将粗品通过快速色谱法(Tol/EtOAc 70:30→65:35)纯化。所得的苄酯65为灰白色固体(70mg，79μmol，61％)，具有Rf 0.2(Tol/EtOAc 7:3)。1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.68(m,5H,HAr),7.51-7.25(m,12H,HAr),6.78(d,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.04(s,1H,CHCl2),5.91-5.81(m,2H,NHA,CHAll),5.37(d,1H,J1,2＝6.0Hz,H-1A),5.28-5.13(mpo,4H,CH2All,CH2Bn-6),4.75(d,1H,J4,5＝4.0Hz,H-5A),4.73(dpo,1H,J1,2＝8.8Hz,H-1B,),4.73(dpo,1H,CH2Nap),4.68(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Nap),4.51(dpo,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.48(dpo,1H,CH2Bn),4.47(ddpo,J3,4＝3.8Hz,J2,3＝10.9Hz,H-3B),4.33-4.28(m,1H,CH2All),4.11-4.01(m,2H,H-3A,H-4A,CH2All),3.95-3.90(m,2H,H-2A,H-4B),3.52(pdt,1H,H-2B),3.43(q,1H,H-5B),1.88(s,3H,CH3Ac),1.24(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13CNMR(CDCl3),δ170.6(C-6A),169.3(CONDCA),164.3(CONAc),137.9,134.9,134.8,133.1,133.0(Cq,Ar),133.6(CHAll),133.1,133.0(Cq,Ar),128.7(2C),128.6,128.3,128.2,128.1,127.9,127.8,127.6,126.8,126.1,126.0,125.9(17C,CAr),117.9(CH2All),99.3(C-1A,1JC,H＝170.Hz),97.9(C-1B,1JC,H＝162Hz),77.0(C-3B),73.4(C-3A),73.1(C-4A),72.1(C-5A),72.0(2C,CH2Bn,Nap),70.1(CH2All),69.2(C-5B),67.5(CH2Bn-6),66.7(CHCl2),65.2(C-4B),54.3(C-2B),52.5(C-2A),23.4(CH3Ac),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C44H48Cl2N5O10计算876.2778；实测876.2773。
实施例5：策略2A-NTCA,2B-NTCA,TBS系列
-用于低聚化的AB结构单元：4A-TBS
方案13.通过已知的AB受体7由已知的4A,6A-O-亚苄基AB二糖5a[1]合成AB结构单元6a和供体9a/10a。[1](i)TBSOTf,咪唑,DMAP,THF,90％,(ii)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.I2,NaHCO3,THF/H2O,95％,(iii)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,91％,或由6a为95％。
烯丙基(3-O-苄基-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(6a)。将咪唑(1.0g,14.7mmol,5.0当量)和DMAP(50mg,290nmol,0.1当量)加入到醇7a(2.57g,2.94mmol,1.0当量)的无水THF(11.8mL)溶液中。将反应混合物冷却至0℃，缓慢加入叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(1.69mL，7.35mmol，2.5当量)。在室温搅拌2小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 8:2)显示起始物7a转化为极性较小的产物，表明反应完成。加入MeOH(1.5mL)。在室温搅拌15分钟后，蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc90:10→80:20)纯化，获得完全保护的6a(2.62g,2.65mmol,90％)。二糖6a具有Rf 0.3(Tol/EtOAc 8:2)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C39H49Cl6N5O10SiNa计算1008.1277；实测1008.1379。
(3-O-苄基-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖(8a)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(27mg,30nmol,0.02当量)溶解在无水THF(3.2mL)中，在H2气氛下搅拌20分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，使用套管转移到烯丙基糖苷6a(1.58g,1.6mmol,1.0当量)的无水THF(8.0mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌2小时，此时加入I2(811mg,3.2mmol,2.0当量)的THF/H2O(4:1,7.8mL)溶液。在室温搅拌45分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc 95:5)显示异构化产物(Rf0.4)的完全消耗，并且存在两个更强极性的点(Rf0.25,0.1)。加入10％Na2SO3水溶液(50mL,20当量)，蒸发挥发物。用DCM(200mL)萃取水相两次。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc 80:20→40:60)纯化残余物，获得预期的半缩醛8a(1.42g，1.5mmol，95％)，为白色松软固体。半缩醛8a(α/β5:1)具有Rf 0.3,0.25(cHex/EtOAc7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C36H45Cl6N5O10SiNa计算968.0964；实测968.0972。
(3-O-苄基-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(9a)和2-三氯甲基[(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-1,2,4,6-四脱氧-α-D-半乳吡喃糖并]-[2,1,d]-噁唑啉(10a)。将PTFACl(970μL,6.1mmol,2.0当量)和Cs2CO3(1.19g,3.67mmol,1.2当量)加入到在丙酮(34mL)中的半缩醛8a(2.9g,3.06mmol,1.0当量)中。在室温搅拌1小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。将滤液减压浓缩，将残余物通过快速色谱法纯化(cHex/Et3N 99:1用于柱平衡，然后用cHex/EtOAc 100:0→90:10)，获得预期的供体，为PTFA9a和噁唑啉10a的6:4混合物(3.09g，91％)。PTFA供体9a具有Rf 0.4(cHex/EtOAc 85:15)。
噁唑啉10a具有Rf 0.45(cHex/EtOAc 85:15)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C36H44Cl6N5O9Si计算928.1039；实测928.1004。
-从结构单元6a(4A-TBS)低聚化
方案14.通过关键的2A-N-TCA/2B-N-TCA二糖6a合成AB低聚物。(i)TMSOTf,DCE,-30℃,对于11a由7开始为77％,(ii)Et3N.3HF对于15a为96％,对于17a为89％,对于19a为89％,(iii)9a/10a(1:1),TMSOTf,DCE,0℃,77％,(iv)9a/10a(1:1),TMSOTf,DCE,-10℃,40％(corr 67％),(v)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.I2,NaHCO3,THF/H2O,94％,(vi)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,两步84％,(vii)13a/14a(1:1),TMSOTf,DCE,-10℃,对于18a为81％,对于20a为81％,(viii)13a/14a(1:1),TMSOTf,DCE,0℃,50％,(ix)13a/14a(1:1),TfOH,DCE,-10℃,56％。DCE:1,2-二氯乙烷,TfOH:三氟甲磺酸。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(11a)。将新活化的MS (2.63g)加入到在无水DCE(52mL)中的供体9a和10a的混合物(3.08g,2.75mmol,1.1当量理论值)和二糖受体7a(2.19g,2.51mmol,1.0当量)中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。在冷却至-30℃后，缓慢加入TMSOTf(45μL，250μmol，0.1当量)并在此温度继续搅拌40分钟。TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示少量剩余的受体7a和新点(Rf 0.5)的存在。加入Et3N(10μL,1.0当量)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 95:5→90:10)纯化，获得四糖11a，为白色固体(3.48g,1.93mmol,77％)。偶联产物11a具有Rf 0.35(Tol/EtOAc 9:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C69H78Cl12N10O19SiNa计算1821.1375；实测1821.1779。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖(12a)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(9.4mg,11nmol,0.02当量)溶解在无水THF(1.1mL)中，在H2气氛下搅拌20分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，使用套管转移到烯丙基糖苷11a(1.0g,554nmol,1.0当量)的无水THF(2.8mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌2小时，此时加入I2(281mg,1.11mmol,2.0当量)的THF/H2O(4:1,3.3mL)溶液。在室温搅拌1小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示异构化产物(Rf0.5)的完全消耗，并且存在两个更强极性的点(Rf 0.3,0.1)。加入10％Na2SO3水溶液(50mL,20当量)，蒸发挥发物。将水相用DCM(60mL)萃取三次。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc 80:20→60:40)纯化残余物，获得预期的半缩醛12a(916mg，94％)，为白色松软固体。半缩醛12a(α/β5:1)具有Rf 0.3,0,1(Tol/EtOAc 8:2)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C66H74Cl12N10O19SiNa计算1781.1061；实测1781.1320。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(13a)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(32mg,38nmol,0.04当量)溶解在无水THF(3.9mL)中，在H2气氛下搅拌20分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，使用套管转移到烯丙基糖苷11a(1.72g,953nmol,1.0当量)的无水THF(4.5mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌2小时，此时加入I2(484mg,1.9mmol,2.0当量)的THF/H2O(4:1,5.7mL)溶液。在室温搅拌1.5小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示异构化产物(Rf 0.5)的完全消耗，并且存在两个更强极性的点(Rf0.3,0.1)。加入10％Na2SO3水溶液(50mL,20当量)，蒸发挥发物。将水相用DCM(200mL)萃取两次。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc 80:20→40:60)纯化残余物，获得预期的半缩醛12a(1.66g,99％)，为白色松软固体。
将PTFACl(287μL,1.81mmol,2.0当量)和Cs2CO3(355mg,1.09mmol,1.2当量)加入到在丙酮(10mL)中的半缩醛12a(1.6g,910μmol,1.0当量)中。在室温搅拌1.5小时后，TLC(cHex/EtOAc 7:3)检测显示转化完成。将反应混合物经硅藻土垫过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。减压浓缩滤液，通过快速色谱法(cHex/EtOAc100:0→70:30)纯化残余物，获得预期的供体，为PTFA 13a和噁唑啉14a的混合物(1.43g，两步84％)。PTFA供体13a具有Rf 0.55(cHex/EtOAc 7:3)。
噁唑啉14a具有Rf 0.65(cHex/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C66H76Cl12N11O18Si计算1758.1401；实测1758.1414。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(15a)。将Et3N.3HF(1.25mL,7.67mmol,8.0当量)加入到完全保护的四糖11a(1.73g,958μmol,1.0当量)的无水THF(3.45mL)溶液中，将溶液在室温搅拌48小时，此时TLC追踪(Tol/EtOAc8:2)显示反应完成。加入MeOH(1.0mL)，真空去除挥发物。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 80:20→75:25，然后Tol/Acet 50:50→20:80)纯化残余物，获得期望的醇15a(1.55g，96％)。四糖受体15a具有Rf 0.45(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+H+K]2+C63H63Cl12N10O19K计算862.0164；实测862.0118。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(16a)。将新活化的MS (332mg)加入到在无水DCE(6.7mL)中的供体9a和10a的混合物(414mg,370μmol,1.25当量理论值)和四糖受体15a(500mg,296μmol,1.0当量)中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。在冷却至0℃并搅拌10分钟后，加入TMSOTf(6.6μL，30μmol，0.1当量，20μL来自TMSOTf/DCE溶液(1:2.7v/v))，并在0℃继续搅拌45分钟。TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示一些剩余的少量受体15a(Rf 0.15)和新点(Rf0.35)的存在。再搅拌15分钟后，加入Et3N(50μL的Et3N/DCE溶液(1:2v/v))。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc90:10→70:30)纯化，获得六糖16a(599mg,223μmol,77％)，为白色固体。HRMS(MALDI):m/z[M+Na]+C99H107Cl18N15O28SiNa计算2635.1499；实测2635.0943。HRMS(MALDI):m/z[M+K]+C99H107Cl18N15O28SiK计算2652.1191；实测2652.0420。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(17a)。将Et3N.3HF(103μL,635μmol,8.0当量)加入到完全保护的六糖16a(208mg,79μmol,1.0当量)的无水THF(290μL)溶液中，将溶液在室温搅拌48小时，此时TLC追踪(Tol/EtOAc8:2)显示反应完成。加入MeOH(1.0mL)，真空去除挥发物。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 80:20→50:50)纯化残余物，获得期望的醇17a(176mg,89％)。六糖受体17a具有Rf 0.35(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C93H97Cl18N16O28计算2517.1033；实测2516.7451。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C93H97Cl18N16O28计算1267.5687；实测1267.5885。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(18a)。[2+6糖基化]将新活化的MS (13mg)加入到在无水DCE(2.5mL)中的供体9a和10a的混合物(17mg,15μmol,1.25当量)和六糖受体17a(30mg,12μmol,1.0当量)中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。在冷却至0℃并搅拌15分钟后，加入TMSOTf(0.2μL,1.2μmol,0.1当量,10μL的TMSOTf/DCE溶液(1:49v/v))，并在-10℃继续搅拌40分钟。加入更多的TMSOTf(0.1当量)。在-10℃搅拌20分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示一些剩余受体17a和一个新点(Rf 0.35)，尽管没有进一步演变。加入Et3N(0.1当量,10μL的Et3N/DCE溶液(1:49v/v))。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(20mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 90:10→70:30)纯化，获得白色固体状的的八糖18a(16.5mg,47μmol,40％)和一些剩余的六糖受体17a(12mg,40％)。
[4+4糖基化]将新活化的MS (124mg)加入到在无水DCE(2.5mL)中的供体13a和14a的混合物(126mg,65μmol,1.1当量)和四糖受体15a(100mg,59μmol,1.0当量)中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌45分钟。在冷却至-10℃并搅拌15分钟后，加入TMSOTf(0.3μL,2μmol,0.03当量,15μL的TMSOTf/DCE溶液(1:49v/v))，并在-10℃继续搅拌20分钟。TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示存在少量受体15a和一个新点(Rf 0.35)。再搅拌15分钟后，加入Et3N(20μL的Et3N/DCE溶液(1:36.5v/v))。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 95:5→70:30)纯化，获得八糖18a，为白色固体(163mg,47μmol,81％)。偶联产物18a具有Rf 0.5(Tol/EtOAc 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C129H142Cl24N22O37Si计算1732.6169；实测1732.6240。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(19a)。将Et3N.3HF(75μL,455μmol,5.0当量)加入到完全保护的八糖18a(312mg,91μmol,1.0当量)的无水THF(455μL)溶液中，将溶液在室温搅拌52小时，此时TLC追踪(Tol/EtOAc 8:2)显示只有微量的起始物18a和主要的极性更大的产物的存在。加入MeOH(300μL)，在室温10分钟后，真空去除挥发物。将残余物溶解在DCM(100mL)中，将有机相用饱和NaHCO3水溶液(30mL)和盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤。在真空浓缩后，将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc80:20→50:50)纯化，获得期望的醇19a(269mg,81μmol,89％)。八糖受体19a具有Rf 0.3(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C123H128Cl24N22O37Si计算1675.5724；实测1676.5715。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(20a)。将新活化的MS(227mg)加入到在无水DCE(4.5mL)中的供体13a和14a的混合物(139mg,72μmol,1.2当量)和六糖受体17a(150mg,60μmol,1.0当量)中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌1小时。在冷却至-10℃并搅拌15分钟后，加入TMSOTf(0.3μL,2μmol,0.03当量,15μL的TfOH/DCE溶液(1:49v/v))，并在-10℃继续搅拌20分钟。TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示存在新点(Rf 0.35)，在-10℃继续再搅拌20分钟。加入Et3N(30μL的Et3N/DCE溶液(1:42v/v))。过滤固体并用DCM(20mL)洗涤两次。蒸发挥发物，通过快速色谱法(Tol/EtOAc95:5→70:30)纯化残余物，除了污染级分之外还获得白色固体状的十糖20a(206mg,48μmol,81％)。完全保护的十糖20a具有Rf 0.5(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C159H171Cl30N27O46Si计算1675.5724；实测1676.5715。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(21a)。路线1.将新活化的MS(137mg)加入到在无水DCE(2.7mL)中的供体13a和14a的混合物(50mg,26μmol,1.3当量)和八糖受体19a(66mg,20μmol,1.0当量)中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。在冷却至0℃并搅拌10分钟后，加入TMSOTf(0.14μL,1μmol,0.03当量,10μL的TfOH/DCE溶液(1:70v/v))，并在0℃继续搅拌1小时。TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示存在新点(Rf 0.35)。加入Et3N(80μL的DCE溶液(1:35v/v))。过滤固体并用DCM(20mL)洗涤两次。蒸发挥发物，通过快速色谱法(Tol/EtOAc 90:10→70:30)纯化残余物，除了污染级分和对应于甲硅烷基化受体的极性较小的化合物(9mg，2.6μmol，13％)之外，还获得白色固体状的十二糖21a(51mg,10μmol,50％)。甲硅烷基化的副产物具有Rf 0.65(Tol/EtOAc 75:25)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C126H138Cl24N22O37Si计算1712.0916；实测1712.0918。
路线2.将新活化的MS(310mg)加入到在无水DCE(3.1mL)中的供体13a和14a的混合物(57mg,29μmol,1.3当量)和八糖受体19a(75mg,23μmol,1.0当量)中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌1小时。在冷却至-10℃并搅拌5分钟后，加入TfOH(0.1μL,1μmol,0.03当量,10μL的TfOH/DCE溶液(1:125v/v))，并在-10℃继续搅拌25分钟。TLC分析(Tol/EtOAc 8:2)显示存在微量受体19a和新点(Rf0.35)。在-10℃再搅拌35分钟后，加入Et3N(40μL的Et3N/DCE溶液(1:50v/v))。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。蒸发挥发物，通过快速色谱法(Tol/EtOAc 90:10→70:30)纯化残余物，除了污染级分之外，还获得白色固体状的十二糖21a(66mg,13μmol,56％)。偶联产物21a具有Rf 0.3(Tol/EtOAc75:25)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C189H200Cl36N32O55Si计算2550.1213；实测2550.0933。
实施例6：策略2A-NTCA,2B-NTCA,4A-Nap
-可用于低聚化的4A-Nap AB结构单元
方案15.通过使用在4和6位正交保护的A供体3b进行[A+B]糖基化。(i)PPh3,H2O,THF,60℃,73％,(ii)Zn,AcOH,THF,(iii)TCA-Cl,Et3N,DCM,0℃,两步80％,(iv)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,对于2b为82％,对于9a为95％,(v)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,对于3b为定量,91％作为9b/10b混合物,(vi)8(参见以上),TMSOTf,DCM,-20℃,99％,(vii)TBAF.3H2O,THF,89％,(viii)a.TEMPO,BAIB,DCM/H2O,b.BnBr,K2CO3,DMF,82％,(ix)DDQ,10:1DCM/磷酸盐缓冲液pH 7,90％。TCA-Cl:三氯乙酰氯
烯丙基2-氨基-3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-α-L-阿卓吡喃糖苷(1a)。将叠氮基前体30(1.0g,1.4mmol)的THF(7.0mL)溶液用PPh3(0.4g,1.5mmol,1.1当量)和H2O(0.5mL,28mmol,20.0当量)处理。将反应混合物加热至60℃并搅拌过夜。TLC追踪(Tol/EtOAc 9:1)表明起始材料(Rf 0.7)被完全转化并且存在极性更强的产物(Rf 0.1)。将反应混合物浓缩，在减压下与甲苯反复共蒸发。通过快速色谱法(Tol/EtOAc/NH3OH 85:15:2)纯化粗物质，获得胺1a(0.73g，73％)，为无色油状物。1H NMR(CDCl3)δ7.88-7.17(m,22H,HAr),6.02-5.91(m,1H,CH＝CH2),5.31(dq,1H,CH＝CH2),5.19(dq,1H,CH＝CH2),4.79(d,2H,CH2Nap),4.58(d,1H,J1,2＝5.1Hz,H-1),4.54(dd,2H,CH2Bn),4.34(dd,1H,J5,6＝5.5Hz,J5,4＝10.4Hz,H-5),4.33(ddt,1H,CH2All),4.05(ddt,1H,CH2All),4.04-4.01(m,1H,H-4),3.89(dd,1H,J6b,5＝4.9Hz,J6b,6a＝10.6Hz,H-6b),3.84(dd,1H,J6a,5＝5.0Hz,J6a,6b＝10.6Hz,H-6a),3.66(dd,1H,J3,4＝3.3Hz,J3,2＝8.2Hz,H-3),3.45(dd,1H,J2,1＝5.2Hz,J2,3＝8.0Hz,H-2),1.08(s,9H,H-tBuTBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ135.9(Cq,Nap),135.7(CqPh,TBDPS),135.6(CqPh,TBDPS),134.9(CqBn),134.4(CH＝CH2),133.9(Cq,Nap),133.7(Cq,Nap),129.8-125.3(CAr,Bn,Ph,Nap),117.1(CH＝CH2),101.4(C-1,1JC,H＝163.7Hz),78.0(C-3),73.0(C-5),71.7(CH2Nap),71.6(CH2Bn),71.0(C-4),68.9(CH2All),63.3(C-6),51.9(C-2),26.8(CH3tBu,TBDPS),19.3(CqtBu,TBDPS)。
烯丙基3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖苷(1b)。将Zn(24.7g,378mmol,8.0当量)和AcOH(21.6mL,378mmol,10当量)加入到在无水THF(470mL)中的叠氮基前体30中。搅拌1小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 10:1)显示不存在叠氮化物1(Rf 0.85)并且存在更强极性的点。将混悬液通过硅藻土垫过滤，用DCM洗涤。将DCM层用饱和NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，减压浓缩，并在高真空下干燥。
将粗胺1a溶解在DCM(100mL)中并冷却至0℃。加入Et3N(9.8mL,70.8mmol,1.5当量)，然后滴加三氯乙酰氯(6.85mL,61.4mmol,1.3当量)，同时将温度保持在0℃。在搅拌1小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc)表明反应完成。通过加入甲醇(2.0mL)来淬灭反应。在用DCM(200mL)稀释，用50％盐水洗涤后，分离DCM层，干燥并浓缩。将粗品通过快速色谱法(cHex/EtOAc 54:6)纯化，获得三氯乙酰胺1b，为无色油状物(31.6g,38.0mmol,80％)。烯丙基糖苷1b具有Rf 0.2(Tol/EtOAc 7:3)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.83(m,1H,HAr),7.77-7.72(m,6H,HAr),7.63(brs,1H,HAr),7.52-7.28(m,14H,HAr),6.75(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NH),5.97-5.89(m,1H,CHAll),5.37-5.32(m,1H,CH2All),5.24-5.20(m,1H,CH2All),4.92(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Nap),4.88(dpo,1H,J1,2＝4.8Hz,H-1),4.73(d,2H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.72(dpo,1H,CH2Nap),4.61(d,1H,CH2Bn),4.51-4.48(m,1H,CH2All),4.51(ddd,1H,J2,3＝1.0Hz,H-2),4.37(dt,J5,6b＝2.8Hz,H-5),4.29-4.24(m,1H,CH2All),4.14(dd,1H,J5,6a＝3.2Hz,J6a,6b＝11.2Hz,H-6a),4.06-3.97(m,3H,H-3,H-6b,CH2All),3.93(dd,J3,4＝3.2Hz,J4,5＝9.2Hz,H-4),1.00(s,9H,CH3,TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ161.2(CONHTCA),137.9,133.2(2C),133.0,129.0,125.3(Cq,Ar),133.6(CHAll),135.8,135.5,129.7,128.3,128.2,127.9,127.7(2C),127.6,126.7,126.1,125.9,125.8(22C,CAr),117.3(CH2All),97.3(C-1,1JC,H＝169Hz),92.1(CCl3),72.0(C-3),71.5(CH2Nap),70.9(CH2Bn),70.5(C-4),68.6(C-5),68.3(CH2All),62.8(C-6),50.8(C-2),26.9(CH3,TBDPS),19.4(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C45H52Cl3N2O6Si计算849.2655；实测849.2657。
3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α/β-L-阿卓吡喃糖(2b)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(965mg,1.14mmol,0.03当量)溶解在无水THF(100mL)中，在H2气氛下搅拌30分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，使用套管转移到烯丙基糖苷1b(31.6g,38.0mmol,1.0当量)的无水THF(200mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌4小时，此时加入NIS(11.2g,49.4mmol,1.3当量)的H2O(60mL)溶液。在室温搅拌1小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 9:1)显示异构化产物(Rf 0.7)被完全消耗，并且存在更强极性的点(Rf 0.4)。加入10％Na2SO3水溶液，蒸发挥发物。用DCM(200mL)萃取水相两次。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc 90:10→88:12)纯化残余物，获得预期的半缩醛2b(24.6g,31.0mmol,82％)，为白色松软固体。半缩醛2b(α/β5:1)具有Rf 0.5(cHex/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.64(m,10.4H,HAr),7.52-7.28(m,18.6H,HAr),7.04(d,1H,J2,NH＝5.6Hz,NHα),6.80(d,0.24H,J2,NH＝5.6Hz,NHβ),5.64(d,0.25H,J1,OH＝11.2Hz,OHβ),5.41(ddpo,1H,J1,2＝3.6Hz,H-1α),5.10(d,0.25H,J1,2＝1.0Hz,H-1β),4.90(d,0.29H,J＝11.2Hz,CH2Nap,β),4.82-4.74(m,2.35H,CH2Nap,α,CH2Nap,β),4.69(dpo,1.5H,CH2Bn,α,CH2Bn,β),4.61(d,1H,J＝11.6Hz,CH2Bn,α),4.39(ddd,0.29H,J2,3＝3.6Hz,H-2β),4.30-4.24(brm,2.56H,H-2α,H-3β,H-5α,H-5β),4.20(dd,0.27H,J5,6b＝2.0hz,J6a,6b＝11.2Hz,H-6aβ),4.11-3.90(m,4.71H,H-3α,H-4α,H-4β,H-6aα,H-H-6bα,H-6bβ),2.98(d,1H,J1,OH＝4.0Hz,OHα),1.12(s,2.22H,CH3,TBDPS),1.09(s,9H,CH3,TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ162.1(CONHTCA,α),161.4(CONHTCA,β),137.8,136.5,134.9,134.8,133.7,133.4,133.1(2C),133.0,132.9(Cq,Ar),135.8,135.7,135.5(2C),129.7(3C),128.7,128.4,128.3,128.2,128.0,127.9(2C),127.7(3C),127.6(2C),126.6,126.2,126.1,125.9,125.7,125.6(CAr),93.4(C-1β,1JC,H＝175Hz),91.3(C-1α,1JC,H＝169Hz),92.2,91.8(CCl3),74.3(CH2Nap,β),74.2(C-3α,C-3β),73.9(C-5β),72.9(CH2Nap,α),72.1(CH2Bn,β),72.1(C-5α),71.7(CH2Bn,α),71.3(C-4α),70.8(C-4β),67.7(C-5β),63.0(C-6α),62.5(C-6β),53.1(C-2α),51.3(C-2β),27.0,26.9(CTBDPS),19.4(CH3,TBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C44H46Cl3N2O6Si计算809.2342；实测809.2346。
3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-三氯乙酰胺基-α/β-L-阿卓吡喃糖基N-(苯基)三氟乙酰亚氨酯(3b)。将PTFACl(7.74mL,37.3mmol,1.2当量)和Cs2CO3(11.1g,34.2mmol,1.1当量)加入到在丙酮(300mL)中的半缩醛2b(24.6g,31.0mmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。将滤液减压浓缩并真空干燥，获得粗的供体3b(～30.0g，31.0mmol，定量)，其原样用于下一步。PTFA供体3b具有Rf 0.92(Tol/EtOAc 9:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C50H48Cl3F3N2O6SiNa计算985.2197；实测985.2191。
烯丙基(3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖基)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(4b)。将粗的PTFA供体3b(～30.0g,31.0mmol,1.0当量理论值)和受体8(10.8g,32.0mmol,1.03当量)的混合物与无水甲苯(50mL)共蒸发，然后在高真空下干燥。将新活化的MS(15.0g)加入到起始材料的无水DCM(520mL)溶液中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌1小时。冷却至-15℃后，缓慢加入TMSOTf(281μL，0.05当量)并继续搅拌40分钟，在此期间浴温保持在-15℃。TLC分析(Tol/EtOAc 9:1)显示不存在供体3b，并且除了少量受体8(Rf0.05)之外还存在新点(Rf 0.6)。完成后，加入Et3N(300μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(100mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc90:10→85:15)纯化，获得二糖4b，为白色固体(35.6g,31.0mmol,99％)。偶联产物4b具有1H NMR(CDCl3)δ7.82-7.80(m,1H,HAr),7.74-7.68(m,6H,HAr),7.61(brs,1H,HAr),7.54-7.28(m,14H,HAr),6.75(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB),6.49(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NHA),5.91-5.81(m,1H,CHAll),5.30-5.25(m,1H,CH2All),5.21-5.18(m,1H,CH2All),4.92(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.83-4.75(m,3H,H-1A,CH2Nap),4.73(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.60(d,1H,CH2Bn),4.55-4.48(mpo,2H,H-3B,H-5A),4.37-4.31(m,2H,H-2A,CH2All),4.09-3.97(m,3H,H-6abA,CH2All),3.92(t,1H,J2,3＝J3,4＝3.2Hz,H-3A),3.78(dd,1H,J4,5＝9.6Hz,H-4A),3.58-3.54(m,2H,H-5B,H-4B),3.45(dddpo,1H,H-2B),1.21(d,3H,6.4Hz,H-6B),1.10(s,9H,CH3,TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ162.2,161.0(CONHTCA),138.3,134.8,133.5,133.3,133.1(Cq,Ar),133.5(CHAll),135.8,135.5,129.8,128.8,128.3(2C),127.8,127.7(2C),127.6,126.9,126.2,126.0,125.8(22C,CAr),117.8(CH2All),100.5(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.3(C-1B,1JC,H＝163Hz),92.1,91.8(2C,CCl3),76.2(C-3B),72.6(C-3A),72.1(CH2Nap),70.8(CH2Bn),70.1(CH2All),70.1(C-4A),69.7(C-5B),69.4(C-5A),65.5(C-4B),63.2(C-6A),55.9(C-2B),51.2(C-2A),27.0(CH3,TBDPS),19.5(CTBDPS),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C53H61Cl6N6O9Si计算1163.2395；实测1163.2402。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖基)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(5b)。将TBAF.3H2O(10.7g,34.1mmol,1.1当量)加入到在THF(300mL)中的二糖4b(35.6g,31.0mmol,1.0当量)中，将反应混合物在室温搅拌4小时。TLC分析(Tol/EtOAc1:4)显示完全保护的4b(Rf 1.0)的消耗和极性点的存在。加入乙酸(2.1mL，3.73mmol，1.2当量)，在搅拌10分钟后蒸发挥发物。将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 40:60→0:100)纯化，获得醇5b(25.2g,27.7mmol,89％)，为白色固体。二糖5b具有Rf 0.25(Tol/EtOAc 1:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.83-7.73(m,3H,HAr),7.60(brs,1H,HAr),7.53-7.46(m,4H,HAr),7.42-7.32(m,4H,HAr),6.87(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB),6.64(d,1H,J2,NH＝8.0Hz,NHA),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.29-5.23(m,1H,CH2All),5.20-5.17(m,1H,CH2All),4.93(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.88(brs,1H,H-1A),4.83(dd,2H,J＝12.4Hz,J＝7.6Hz,CH2Nap),4.72(dd,1H,J＝3.6Hz,J＝10.2Hz,H-3B),4.67(d,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.50-4.44(mpo,2H,H-5A,CH2Bn),4.39-4.31(m,2H,H-2A,CH2All),4.08-4.03(m,1H,CH2All),3.93-3.89(m,2H,H-3A,H-6aA),3.82-3.75(m,3H,H-4B,H-5B,H-6bA),3.53-3.44(m,2H,H-2B,H-4A),1.40(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ162.3,161.1(CONHTCA),138.1,134.4,133.4,133.1,133.0(Cq,Ar),133.4(CHAll),128.5,128.4,128.3,127.8,127.7,127.2,126.3,126.2,125.7(12C,CAr),118.0(CH2All),100.1(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.2(C-1B,1JC,H＝164Hz),92.3,91.8(2C,CCl3),75.3(C-3B),72.6(C-3A),71.9(CH2Nap),70.5(CH2Bn),70.4(C-4A),70.2(CH2All),69.7(C-5B),69.0(C-5A),65.6(C-4B),62.2(C-6A),56.2(C-2B),51.4(C-2A),17.4(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C37H41Cl6N6O9计算925.1217；实测925.1223。
烯丙基(3-O-苄基-4-O-(2-萘甲基)-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(6b)。向醇5b(25.0g,3.7mmol,1.0当量)在DCM/H2O(2:1,690mL)中的双相溶液中加入TEMPO(1.29g,8.26mmol,0.3当量)，随后加入BAIB(18.6g,57.8mmol,2.5当量)。将双相混合物在室温剧烈搅拌6小时，此时TLC分析(Tol/EtOAc 1:4)显示不存在醇5b(Rf 0.65)并且存在极性产物。将NaHCO3(9.7g,115mmol,4.2当量)加入到100mL水中。分离DCM层，将水相用DCM(100mL)萃取两次。将合并的有机相通过分相过滤器干燥并浓缩至干。将残余物溶解在无水DMF(250mL)中。加入苄基溴(4.25mL,35.8mmol,1.3当量)和K2CO3(4.95g,35.8mmol,1.3当量)，将混悬液在室温搅拌2小时。完成时，加入饱和NH4Cl水溶液，将水层用DCM(400mL)洗涤三次。将有机相合并，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc 77:23→70:30)纯化残余物，获得期望的苄基酯6b(23.0g,25.3mmol,82％)，为白棕色固体。糖醛酸酯6b具有Rf 0.7(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.75(m,3H,HAr),7.69(brs,1H,HAr),7.51-7.47(m,2H,HAr),7.41-7.76(m,1H,HAr),6.77(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.64(d,1H,J2,NH＝7.6Hz,NHA),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.29-5.17(m,5H,H-1A,CH2Bn-6,CH2All),4.85(d,1H,J4,5＝5.2Hz,H-5A),4.82(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.73(brs,2H,CH2Nap),4.62(dd,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.2Hz,H-3B),4.56(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.48(d,1H,CH2Bn),4.35-4.30(m,1H,CH2All),4.23-4.18(m,1H,H-2A),4.09-4.02(m,2H,H-4A,CH2All),3.87-3.84(m,2H,H-4B,H-3A),3.61-3.54(m,2H,H-2B,H-5B)1.28(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.9(C-6A),162.0,161.6(CONHTCA),137.4,135.0,134.6,133.1(2C)(Cq,Ar),133.5(CHAll),128.7,128.6,128.4,128.3,128.1,127.9(2C),127.7,127.0,126.2,126.1,125.8(12C,CAr),117.9(CH2All),98.9(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.7(C-1B,1JC,H＝162Hz),),92.3,92.1(2C,CCl3),75.9(C-3B),73.4(C-3A),72.1(C-4A),72.0(CH2Nap),71.9(CH2Bn),71.6(C-5A),70.1(CH2All),69.4(C-5B),67.5(CH2Bn-6),65.2(C-4B),55.5(C-2B),53.1(C-2A),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C44H47Cl6N6O10计算1029.1491；实测1029.1479。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(7)。[1]将二糖6b(11.0g,10.8mmol,1.0当量)溶解在DCM(200mL)中，加入磷酸盐缓冲液pH 7(20mL)。将双相混合物冷却至0℃，加入DDQ(7.4g,2.1mmol,3.0当量)。使反应缓慢达到室温并在该温度搅拌6小时。在完成时，加入10％NaHCO3水溶液(200mL)，用DCM(200mL)稀释双相混合物。将DCM层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 70:30→60:40)纯化，获得醇7(8.6g,8.50mmol,90％)，为白色固体。二糖7具有Rf 0.45(Tol/EtOAc,7:3)。1H NMR(CDCl3)δ7.42-7.25(m,10H,HAr),6.75(dpo,1H,J2,NH＝8.8Hz,NHA),6.73(dpo,1H,J2,NH＝7.6Hz,NHB),5.89-5.80(m,1H,CHAll),5.31-5.24(m,3H,CH2Bn-6,CH2All),5.20-5.17(m,1H,CH2All),4.98(d,1H,J1,2＝3.2Hz,H-1A),4.83(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.72(m,3H,H-5A,CH2Bn),4.64(dd,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.6Hz,H-3B),4.35-4.27(m,1H,H-2A,CH2All),4.15(dt,1H,J4,5＝7.6Hz,,H-4A),4.07-4.02(m,2H,CH2All),3.88(dd,1H,J2,3＝5.6Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3A),3.79(d,1H,H-4B),3.64(qpo,1H,H-5B),3.52-3.46(m,1H,H-2B),2.78(d,1H,J4,OH＝7.6Hz,OH),1.26(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.8(C-6A),162.1,161.6(CONHTCA),137.2,135.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),128.7(2C),128.6,128.4,128.2,125.2(10C,CAr),118.0(CH2All),99.5(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.4(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.1,91.9(2C,CCl3),76.3(C-3B),74.8(C-3A),72.4(CH2Bn),71.1(C-5A),70.1(CH2All),69.5(C-5B),67.5(CH2Bn-6),65.5(C-4A),65.5(C-4B),55.7(C-2B),51.4(C-2A),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C33H39Cl6N6O10计算889.0853；实测889.0860。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖(9a)。将在无水THF(20mL)中的[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(286mg,0.338mmol,0.03当量)脱气，在H2气氛下搅拌20分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，倒入烯丙基糖苷6b(11.4g,11.2mmol,1.0当量)的无水THF(200mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，TCL追踪(Tol/EtOAc 4:1)显示起始物6b(Rf 0.6)已经转化为紧密迁移的产物(Rf0.65)。加入NIS(3.0g,13.5mmol,1.2当量)和H2O(20mL)，在室温再搅拌1小时后，加入10％Na2SO3水溶液。将反应混合物浓缩，将水相用DCM(200mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。通过快速色谱法使用cHex/EtOAc(70:30→60:40)纯化残余物，获得预期的半缩醛9a(10.4mg,10.7mmol,95％)，为白色固体。α/β半缩醛9a具有Rf 0.3,0.6(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C41H43Cl6N6O10计算989.1166；实测989.1177。α异构体具有1H NMR(CDCl3)δ7.87-7.76(m,3H,HAr),7.71(brs,1H,HAr),7.53-7.17(m,13H,HAr),7.06(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NHB),6.86(d,1H,J2,NH＝7.4Hz,NHA),5.40(d,1H,J1,2＝6.4Hz,H-1A),5.28(t,1H,J1,2＝3.5Hz,H-1B),5.19(ddpo,2H,J＝12.4Hz,CH2Bn-6),4.82(d,1H,J4,5＝4.0Hz,H-5A),4.75(brs,2H,CH2Nap),4.44-4.38(mpo,3H,H-2B,CH2Bn),4.26(dd,1H,J3,4＝3.2Hz,J2,3＝10.6Hz,H-3B),4.22-4.09(mpo,3H,H-2A,H-4A,H-5B,),3.95(d,1H,H-4B),3.89(dd,1H,J2,3＝2.8Hz,J3,4＝2.8Hz,H-3A),3.44(brd,1H,J4,OH＝2.4Hz,OH),1.22(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.9(C-6A),162.0,161.9(CONHTCA),137.8,137.0,134.7,134.5,133.1(2C)(Cq,Ar),129.0,128.8(2C),128.7,128.6,128.5,128.4(2C),128.3,128.2,128.1,127.9,127.7,127.1,126.2,126.1,126.0,125.3(10C,CAr),97.9(C-1A,1JC,H＝167Hz),92.4,92.1(2C,CCl3),91.1(C-1B,1JC,H＝175Hz),75.2(C-3B),73.0(C-3A),72.4(C-5A),72.0(C-4A),72.0(CH2Nap),71.7(CH2Bn),67.6(CH2Bn-6),,65.3(C-5B),65.2(C-4B),53.3(C-2A),51.0(C-2B),17.3(C-6B)。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-α/β-D-半乳吡喃糖基N-苯基三氟乙酰亚氨酯(9a)和2-三氯甲基[(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-1,2,4,6-四脱氧-α-D-半乳吡喃糖并]-[2,1]-噁唑啉(10a)。将PTFACl(721μL,4.55mmol,1.3当量)和Cs2CO3(1.25g,3.85mmol,1.1当量)加入到半缩醛9a(3.4g,3.50mmol,1.0当量)的丙酮(70mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，将混悬液经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮(30mL)洗涤两次。减压浓缩滤液，将残余物通过快速色谱法用cHex/EtOAc(90:1→80:20)纯化，获得预期的PTFA供体9b和噁唑啉10b的混合物(3.6g，3.15mmol，就PTFA供体而论计算为91％)，为白色固体。供体9b具有HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C49H47Cl6F3N7O10计算1160.1462；实测1160.1445。噁唑啉10b具有HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C41H38Cl6N5O9计算954.0795；实测954.0776。
-低聚化2ANTCA,2BNTCA(4A-Nap)
方案16.通过关键的2A-N-TCA/2B-N-TCA二糖6b合成AB低聚物。(i)a.9a,PTFA-Cl,Cs2O3,Acet,b.TMSOTf,DCE,-30℃,71％,(ii)DDQ,10:1DCM/磷酸盐缓冲液pH 7,对于15b为86％,对于17b为86％,对于19b为91％,(iii)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.I2,NaHCO3,THF/H2O,97％,(iv)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,91％,(v)9b/10b,TMSOTf,DCE,0℃,73％,(vi)13b/14b,TMSOTf,DCE,0℃,对于18b为70％,对于20b为64％,对于21b为70％。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(11b)。将PTFACl(1.52mL,9.63mmol,1.3当量)和Cs2CO3(2.65g,8.15mmol,1.1当量)加入到在丙酮(150mL)中的半缩醛9a(7.2g,7.41mmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。将滤液减压浓缩并在高真空下干燥，获得粗的供体9b/10b(8.4g，7.41mmol，定量)，为PTFA供体9b和噁唑啉10b的混合物。将粗物质原样用于下一步。供体9b/10b具有Rf0.95(Tol/EtOAc4:1)。
将粗的供体9b/10b(8.4g,7.41mmol,1.06当量理论值)和二糖受体7(6.0g,69.7mmol,1.0当量)的混合物与无水甲苯(50mL)共蒸发，然后真空干燥。将新活化的MS(10g)加入到在无水DCM(150mL)中的起始材料中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌1小时。冷却至-15℃后，缓慢加入TMSOTf(107μL,593μmol,0.08当量)并继续搅拌45分钟，在此期间浴温保持在-15℃。TLC分析(Tol/EtOAc4:1)显示不存在供体，并且除了少量弱极性副产物之外还存在新点。完成后，加入Et3N(120μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(50mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 92:8→90:10)纯化，获得四糖11b，为白色固体(9.1g,49.8mmol,71％)。偶联产物11b具有Rf 0.45(Tol/EtOAc 4:1)。1HNMR(CDCl3)δ7.85-7.75(m,3H,HAr),7.69(brs,1H,HAr),7.43-7.20(m,26H,HAr),6.97(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB),6.77(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.57(d,1H,J2,NH＝7.6Hz,NHA),6.49(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.90-5.80(m,1H,CHAll),5.31-5.14(m,7H,H-1A,CH2Bn-6,CH2All),5.05(d,1H,J1,2＝5.2Hz,H-1A),4.85(dpo,1H,J1,2＝8.8Hz,H-1B),4.83(d,1H,J4,5＝5.2Hz,H-5A),4.80(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.74-4.66(m,5H,H-3B,H-3B,H-5A,CH2Bn),4.59(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.48(brd,3H,CH2Bn,CH2Nap),4.34-4.24(m,3H,H-2A,H-4A,CH2All),4.08-4.01(m,2H,H-4A,CH2All),3.93-3.88(m,3H,H-2A,H-3A,H-4B),3.80-3.77(m,2H,H-3A,H-4B),3.62-3.54(m,2H,H-2B,H-5B),1.31(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B),1.20(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.8,168.2(C-6A),162.0,161.9,161.6,161.5(CONHTCA),137.4,137.0,135.1,135.0,133.4,133.1(2C)(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.1,129.0,128.7(2C),128.6,128.5,128.4,128.3(2C),128.2,128.0,127.9,127.7,126.9,126.2,125.8,125.2(CAr),99.2(C-1A,1JC,H＝170Hz),98.8(C-1B,1JC,H＝166Hz),98.1(C-1A,1JC,H＝170Hz),97.7(C-1B,1JC,H＝166Hz),92.4,92.3,92.1(4C,CCl3),75.1(C-3B),74.7(C-3B),73.4(C-3A),73.0(C-3A),72.5(CH2Nap),72.0(2C,C-4A),71.9(2C,CH2Bn),71.5(2C,C-5A),70.0(CH2All),69.3(C-5B),68.8(C-5B),67.6(CH2Bn-6),67.4(CH2Bn-6),65.5(C-4B),65.1(C-4B),55.6(C-2B),55.5(C-2B),54.1(C-2A),52.7(C-2A),17.3(C-6B).17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C74H76Cl12N11O19计算1842.1576；实测1842.1593。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(15b)。将四糖11b(4.0g,2.19mmol,1.0当量)溶解在DCM(40mL)中，加入磷酸盐缓冲液pH 7(4.0mL)。将双相混合物冷却至0℃，加入DDQ(996mg,4.38mmol,2.0当量)。将反应搅拌6小时，保持温度在0至10℃。完成后，加入10％NaHCO3水溶液(100mL)，将双相混合物用DCM(500mL)稀释。将DCM层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 75:25→70:30)纯化，获得醇15b(3.2g,1.90mmol,86％)，为白色固体。四糖受体15b具有Rf 0.45(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C63H68Cl12N11O19计算1702.0950；实测1702.0950。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-α/β-D-半乳吡喃糖(12b)。将在无水THF(9.0mL)中的[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(185mg,219μmol,0.05当量)脱气，在H2气氛下搅拌30分钟。将所得的深黄色溶液用Ar反复脱气，倒入到烯丙基糖苷11b(8.0g,4.38mmol,1.0当量)的无水THF(80mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，TCL追踪(Tol/EtOAc 4:1，进行2遍)显示起始物11b(Rf 0.15)已经转化为紧密迁移的产物(Rf 0.2)。加入NIS(1.18g,5.26mmol,1.2当量)和H2O(18mL)，在室温再搅拌1小时后，加入10％Na2SO3水溶液。将反应混合物浓缩，将水相用DCM(90mL)萃取三次。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 80:20→75:25)纯化，获得期望的半缩醛12b(7.6g,7.51mmol,97％)，为白色固体。α/β半缩醛12b具有Rf 0.1,0.15(Tol/EtOAc 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C71H72Cl12N11O19计算1802.1263；实测1802.1242。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-α/β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(13b)和2-三氯甲基[(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-1,2,4,6-四脱氧-α-D-半乳吡喃糖并]-[2,1]-噁唑啉(14b)。将PTFACl(878μL,5.53mmol,1.3当量)和Cs2CO3(1.52g,4.68mmol,1.1当量)加入到半缩醛12b(7.6g,4.26μmol,1.0当量)的丙酮(85mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，将混悬液经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮(20mL)洗涤两次。减压浓缩滤液，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 85:15→80:20)纯化，获得预期的PTFA四糖13b和相应的噁唑啉14b的混合物(7.5g，7.51mmol，就PTFA供体而论计算为91％)，为白色固体。亚氨酸酯13b具有HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C79H76Cl12N12O19计算1973.1559；实测1973.1556。噁唑啉14b具有HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C71H70Cl12N11O18计算1784.1157；实测1784.1094。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(16b)。[4+2]-糖基化：将供体9b/10b(678mg,594μmol,1.0当量)和受体15b(1.0g,594μmol,1.0当量)的混合物与无水甲苯共蒸发，然后在真空下干燥1小时。将新活化的MS(1.0g)加入到在无水DCE(15mL)中的起始材料中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌45分钟。在冷却至0℃后，缓慢加入TMSOTf(8.6μL,48μmol,0.08当量)并继续搅拌45分钟，在此期间浴温保持在0℃。TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在供体且存在新点。完成后，加入Et3N(10μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(20mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 92:8→86:14)纯化，获得六糖16b(1.15g,436μmol,73％)，为白色固体。偶联产物16b具有Rf 0.2(Tol/EtOAc 4:1)HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C104H105Cl18N16O28计算2665.1580；实测2665.1580。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(17b)。将DDQ(155mg,683μmol,3.0当量)加入到在DCM(20mL)和磷酸盐缓冲液pH 7(2.0mL)中的六糖16b(600mg,228μmol,1.0当量)中。将双相混合物冷却至0℃并搅拌6小时，同时保持温度在0至10℃。TLC分析(Tol/EtOAC 3:1)显示不存在完全保护的16b(Rf 0.6)并且存在更极性的点(Rf 0.4)。加入10％NaHCO3水溶液(10mL)，然后加入DCM(20mL)。将DCM层分离，用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残留物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 80:20→70:30)纯化，获得醇17b(490mg,196μmol,86％)，为白色固体。六糖受体17b具有Rf 0.2(Tol/EtOAc 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C93H97Cl18N16O28计算2525.0942；实测2525.0949。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(18b)。[4+4]-糖基化：将供体13b/14b(1.21g,621μmol,1.0当量)和受体15b(1.04g,621μmol,1.0当量)与无水甲苯共蒸发，然后在真空下干燥1小时。将新活化的MS(2.0g)加入到在无水DCE(15mL)中的起始材料中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌45分钟。在冷却至0℃后，缓慢加入TMSOTf(10μL,565μmol,0.09当量)并继续搅拌45分钟，在此期间浴温保持在0℃。TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在供体13b/14b且存在新点。完成后，加入Et3N(15μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(20mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 88:12→84:16)纯化，获得八糖18b，为白色固体(1.5g,434μmol,70％)。偶联产物18b具有Rf 0.55(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C134H138Cl24N22O37计算1749.0997；实测1749.0984。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(19b)。将DDQ(223mg,983μmol,3.0当量)加入到在DCM(30mL)和磷酸盐缓冲液pH 7(3.0mL)中的八糖18b(600mg,328μmol,1.0当量)中。将双相混合物冷却至0℃并搅拌6小时，同时保持温度在0至10℃。TLC分析(Tol/EtOAC 7:3)显示不存在完全保护的18b(Rf 0.6)并且存在更极性的点。加入10％NaHCO3水溶液(30mL)，然后加入DCM(30mL)。将DCM层分离，用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残留物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 80:20→70:30)纯化，获得醇19b(990mg,299μmol,91％)，为白色固体。八糖受体19b具有Rf 0.35(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C123H129Cl24N22O37计算1679.0681；实测1679.0663。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(20b)。[4+6]-糖基化：将四糖供体13b/14b(235mg,120μmol,1.0当量)和受体17b(300mg,120μmol,1.0当量)与无水甲苯共蒸发，然后在真空下干燥。将新活化的MS(500mg)加入到在无水DCE(10mL)中的起始材料中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌45分钟。在冷却至0℃后，缓慢加入TMSOTf(2μL,11μmol,0.09当量)并继续搅拌45分钟，在此期间浴温保持在0℃。TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在供体13b/14b且存在新点。完成后，加入Et3N(2μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(20mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 84:16→82:18)纯化，获得十糖20b，为白色固体(330mg,77.4μmol,64％)。偶联产物20b具有Rf 0.5(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C164H175Cl30N27O46计算2157.6027；实测2157.6028。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(21b)。[4+8]-糖基化：将四糖供体13b/14b(490mg,251μmol,1.0当量)和八糖受体17b(830mg,251μmol,1.0当量)与无水甲苯共蒸发，然后在真空下干燥。将新活化的MS(1.0g)加入到在无水DCE(15mL)中的起始材料中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌1小时。在冷却至0℃后，缓慢加入TMSOTf(4.1μL,23μmol,0.09当量)并继续搅拌45分钟，在此期间浴温保持在0℃。TLC分析(Tol/EtOAc 7:3)显示不存在供体13b/14b且存在新点。完成后，加入Et3N(5μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(15mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 82:18→78:22)纯化，获得十二糖21b，为白色固体(900mg,177μmol,70％)。偶联产物21b具有Rf 0.45(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C194H196Cl36N32O55计算2566.1056；实测2566.1059。
-对以4A-Nap为特征的完全保护的前体进行完全脱保护
方案17.宋内志贺菌两性离子二糖至十二糖1至4和22b、23b的合成。(i)方法1:Pd(OH)2/C,H2,NaHCO3,2-MeTHF/iPrOH/H2O,对于1为78％,对于2为49％,对于3为39％,(ii)方法2:Pd(OH)2/C柱,H2(H-cube),NaHCO3,2-MeTHF/异丙醇/水,对于4为49％,对于22b为33％,对于23b为6％。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(1)。对二糖6b(140mg,182μmol)进行脱保护(方法1)。获得已知的丙基糖苷1(66mg,130μmol,78％)，为白色冻干粉末。目标丙基糖苷1具有RP-HPLC(215nm):Rt＝12.3min(条件A),Rt＝13.9min(条件B),Rt＝12.2min(条件C)。分析数据如上。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(2)。对四糖11b(110mg,65μmol)进行氢化(方法1)。获得期望的丙基糖苷，为白色冻干粉末(28mg，32μmol，49％)。四糖2具有RP-HPLC(215nm):Rt＝12.3min(条件A’),Rt＝13.6min(条件B)。分析数据如上。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(3)。对完全保护的六糖16b(100mg,38μmol)进行氢化(方法1)。获得期望的丙基糖苷3，为白色冻干固体(19mg,15μmol,39％)。游离六糖3具有RP-HPLC(215nm):Rt＝11.3min(条件A’),Rt＝13.4min(条件B)。分析数据如上。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(4)。对完全保护的八糖18b(20mg,6μmol)进行脱保护(方法2)。在全H2模式下，将起始材料的iPrOH/MeTHF/H2O(10:1:1)溶液以0.8mL/min的流速通过20％Pd(OH)2-C柱。在第一次运行结束后，加入0.12mM NaHCO3水溶液(50μL,6μmol,1当量)。在接下来的五次运行中重复相同的操作，以达到总共5当量的NaHCO3。获得产物(4.9mg,2.9μmol,50％)，为白色固体。游离八糖4具有RP-HPLC(215nm):Rt＝13.3min(条件A)。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(22b)。对完全保护的十糖20b(30mg,7.0μmol)进行氢化(方法2)。获得产物(4.9mg,2.4μmol,33％)，为白色冻干泡沫。游离十糖22b具有RP-HPLC(215nm):Rt＝13.5min(条件A)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C83H135N15O46计算1038.9337；实测1038.9330。
丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(23b)。对完全保护的十二糖21b(50mg,10.7μmol)进行一步氢化介导的最终脱保护(方法2)。分离游离的丙基糖苷(1.5mg,0.61μmol,6％)，为白色冻干物。游离十二糖23b具有RP-HPLC(215nm):Rt＝14.1min(条件A)。HRMS(ESI+):m/z[M+3H]3+C99H161N18O55计算827.6790；实测827.6793。
实施例7：策略2A-NTCA,2B-NTCA，以4A-Me端链二糖为特征
-链终止剂4A-Me AB二糖结构单元
方案18.通过使用4-O-甲基化端链A供体34b进行[A+B]糖基化。(i)a.CSA,MeOH/DCM,b.tBDPS-Cl,咪唑,DMF,c.MeI,NaH,DMF,0℃至室温,99％,(ii)a.Zn,AcOH,THF,b.TCA-Cl,Et3N py,DCM,83％,(iii)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.I2,NaHCO3,THF/H2O,对于33b为89％,对于38b为92％,(iv)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,对于34b为定量,对于39b/40b为83％,(v)8,TMSOTf,DCE,-15℃,92％,(vii)TBAF.3H2O,THF,82％,(vi)a.TEMPO,BAIB,DCM/H2O,b.BnBr,K2CO3,DMF,87％。
烯丙基2-叠氮基-3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-甲基-α-L-阿卓吡喃糖苷(31b)。将CSA(1.3g,5.90mmol,0.5当量)加入到在MeOH/DCM(4:1,50mL)中的亚苄基缩醛12(5.0g,11.8mmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 4:1)表明反应完成，其显示不存在起始物(Rf 0.65)且存在极性点。加入10％NaHCO3水溶液(100mL)，然后加入EtOAc(100mL)。将有机相分离并用盐水(100mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，减压浓缩。将粗产物在高真空下干燥。在0℃，将叔丁基二苯基氯硅烷(3.37mL,12.9mmol,1.1当量)和咪唑(1.6g,23.6mmol,2.0当量)加入到在无水DMF(60mL)中的粗的二醇中间体中。使反应混合物缓慢达到室温并在该温度搅拌过夜。加入甲醇(5.0mL)，30分钟后，减压蒸发挥发物。将残余物溶解在EtOAc中，将有机层用90％盐水洗涤，分离，经Na2SO4干燥，浓缩，获得粗的6-O-甲硅烷基化中间体。将MeI(1.47g,23.6mmol,2.0当量)加入到在DMF(230mL)中的粗中间体中。将溶液冷却至0℃，分批加入NaH(60％在矿物油中，567mg,23.6mmol,2.0当量)。在浴温缓慢达到室温的同时剧烈搅拌2小时后，TLC追踪显示反应完成。将反应混合物用DCM(1L)稀释，加入5％NH4Cl水溶液(100mL)。将有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将粗产物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 92:8→88:12)纯化，获得完全保护的31b(6.9g,11.7mmol,99％)，为淡黄色油状物。烯丙基糖苷31b具有Rf0.65(Tol/EtOAc 10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.71-7.68(m,4H,HAr),7.47-7.31(m,11H,HAr),5.95-5.90(m,1H,CHAll),5.34-5.29(m,1H,CH2All),5.21-5.18(m,1H,CH2All),4.76-4.67(m,3H,H-1,CH2Bn),4.30-4.25(m,1H,CH2All),4.12(q,1H,J5,6b＝4.8Hz,H-5),4.07-4.02(m,1H,CH2All),3.90(dd,1H,J1,2＝4.8Hz,J2,3＝8.0Hz,H-2),3.81(brd,2H,J5,6＝4.4Hz,H-6a,H-6b),3.77(dd,1H,J3,4＝3.6Hz,H-3),3.66(dd,1H,J4,5＝5.2Hz,H-4),3.39(s,3H,OCH3),1.09(s,9H,CH3,TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ137.8,133.2,133.0(Cq,Ar),133.8(CHAll),135.7,135.5,129.8,128.4,127.8,127.7(2C),127.5(CAr),117.3(CH2All),98.7(C-1,1JC,H＝169Hz),75.8(C-3),74.9(C-4),72.5(C-5),72.3(CH2Bn),68.7(CH2All),63.9(C-6),61.7(C-2),58.2(OCH3),26.8(CH3,TBDPS),19.2(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C33H45N4O5Si计算605.3154；实测605.3153。
烯丙基3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖苷(32b)。将锌粉(7.6g,117mmol,10.0当量)和AcOH(6.7mL,117mmol,10.0当量)加入到在无水THF(120mL)中的叠氮化物31b(6.9g,11.7mmol,1.0当量)中。在室温搅拌1小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 10:1)显示不存在叠氮化物31b(Rf 0.8)并且存在更强极性的点。将混悬液通过硅藻土垫过滤，用THF洗涤。将滤液浓缩，然后用DCM稀释。将DCM层用饱和NaHCO3水溶液、水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，减压浓缩，并在高真空下干燥。将三氯乙酰氯(1.97mL，17.6mmol，1.5当量)和三乙胺(3.25mL，23.4mmol，2.0当量)加入粗胺的DCM(120mL)溶液中。在室温搅拌1小时后，TLC追踪(Tol/EtOAc 10:1)表明反应完成。加入甲醇(2mL)，将反应混合物再搅拌10分钟。蒸发挥发物，在高真空下干燥。将粗品溶解在DCM(300mL)中，将DCM层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 94:6→90:10)纯化，获得完全保护的32b(6.95g,118mmol,83％)，为稠的淡黄色油状物。烯丙基糖苷32b具有Rf 0.7(Tol/EtOAc 10:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.75-7.71(m,4H,HAr),7.47-7.29(m,11H,HAr),6.84(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NH),5.95-5.86(m,1H,CHAll),5.34-5.29(m,1H,CH2All),5.20-5.17(m,1H,CH2All),4.88(dpo,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.87(d,1H,J1,2＝4.8Hz,H-1),4.70(d,1H,CH2Bn),4.48(ddd,1H,J2,3＝3.6Hz,H-2),4.27(m,2H,H-5,CH2All),4.06-3.98(mpo,2H,H-6a,CH2All),3.90(dd,1H,J5,6b＝2.4Hz,J6a,6b＝11.2Hz,H-6b),3.67(dd,1H,J4,5＝9.2Hz,H-4),3.27(s,3H,OCH3),1.09(s,9H,CH3,TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ161.2(CONHTCA),137.9,133.5,133.3(Cq,Ar),133.5(CHAll),135.7,133.5,129.6,128.2,128.1,127.6(15C,CAr),117.3(CH2All),97.3(C-1,1JC,H＝169Hz),73.0(C-4),71.5(CH2Bn),71.2(C-3),68.5(C-5),68.3(CH2All),62.8(C-6),56.4(OCH3),50.8(C-2),26.8(CH3,TBDPS),19.4(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C35H46Cl3N2O6Si计算723.2185；实测723.2184。
3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖(33b)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(248mg,294μmol,0.03当量)溶解在无水THF(10mL)中，在H2气氛下搅拌30分钟。将所得黄色溶液脱气数次，在Ar下倒入烯丙基糖苷32b(6.9g,9.78mmol,1.0当量)的无水THF(90mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，加入NaHCO3(2.4g,29.3mmol,3.0当量)的H2O(10mL)溶液，然后加入碘(4.96g,19.5mmol,2.0当量)的THF(10mL)溶液。在室温搅拌1小时后，用10％Na2SO3水溶液淬灭反应。将反应混合物浓缩，将水相用DCM(3×100mL)萃取。将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc 90:10→88:12)纯化，获得半缩醛33b(α/β～4:1,5.8g,8.71mmol,89％)，为白色泡沫。α/β-端基异构体33b具有Rf 0.55,0.5(Tol/EtOAc 4:1)；1H NMR(CDCl3)δ7.75-7.69(m,5.2H,HAr),7.47-7.26(m,14.4H,HAr),7.21-7.18(m,0.56H,HAr),7.09(d,1H,J2,NH＝6.4Hz,NHα),6.84(d,0.24H,J2,NH＝7.6Hz,NHβ),5.61(d,0.24H,J1,OH＝11.2Hz,OHβ),5.37(dd,1H,H-1α),5.10(ddpo,0.24H,H1β),4.90-4.75(m,2.54H,CH2Bn,α,CH2Bn,β),4.39-4.36(m,0.51H,H-2β,H-5β),4.31-4.25(m,2H,H-2α,H-5α),4.13-4.07(m,0.54H,H-6aβ,H-4β),3.98-3.88(m,3.3H,H-4α,H-6abα,β,H-6bβ),3.80(dd,0.28H,J2,3＝2.4Hz,J3,4＝9.6Hz,H-3β),3.65(dd,1H,J2,3＝3.2Hz,J3,4＝9.2Hz,H-3α),3.32(s,0.76H,OCH3,β),3.29(s,3H,OCH3,α),3.06(d,1H,J1,OH＝4.0Hz,OHα),1.09,1.08(2s,11.6H,CH3,TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ162.2,161.4(CONHTCA),137.8,136.5,135.6,135.5(2C),133.6,133.3,133.2,133.1(Cq,Ar),135.7,135.6,135.5(2C),129.7(2C),129.0,128.7,128.5,128.4,128.3,128.0,127.9,127.7,127.6,125.3(CAr),93.4(C-1β,1JC,H＝174Hz),91.3(C-1α,1JC,H＝169Hz),74.3(CH2Bn,β),74.1(C-4α),73.5(C-3α),73.0(CH2Bn,β),72.8(C-3β),72.7(C-5β),71.3(C-5α),67.6(C-4β),62.9(C-6α),62.9(C-6β),57.1(OCH3),53.1(C-2α),51.3(C-2β),26.9,26.8(CH3,TBDPS),19.4(CTBDPS)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C32H42Cl3N2O6Si计算683.1872；实测683.1876。
烯丙基3-O-苄基-6-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(35b)。将半缩醛33b(5.8g,8.72mmol,1.0当量)溶解在丙酮(80mL)中。加入PTFACl(1.79mL,11.3mmol,1.3当量)，然后加入Cs2CO3(3.4mg,10.4mmol,1.2当量)。在室温搅拌2小时后，将反应混合物过滤，将滤液减压浓缩。PTFA供体34b具有Rf 0.8(Tol/EtOAc 4:1)。
将粗的PTFA供体34b(7.29g,8.72mmol,1.0当量理论值)和受体8(3.2g,8.72mmol,1.0当量)与无水甲苯(40mL)共蒸发，然后真空干燥。将干燥的物质溶解在无水DCE(120mL)中，加入新活化的MS(5.0g)，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。将反应混合物冷却至-15℃，加入TMSOTf(79μL,436μmol,0.05当量)。在-15℃持续40分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在供体且存在新点。将混合物用Et3N淬灭，过滤并浓缩。通过快速色谱法(cHex/EtOAc90:10→88:12)获得偶联产物35b(8.2g,8.04mmol,92％)，为白色泡沫。期望的二糖35b具有Rf 0.5(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.73-7.70(m,4H,HAr),7.52-7.28(m,11H,HAr),6.73(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.67(d,1H,J2,NH＝8.0Hz,NHA),5.90-5.81(m,1H,CHAll),5.29-5.24(m,1H,CH2All),5.21-5.17(m,1H,CH2All),4.92(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.85(dpo,1H,J1,2＝4.4Hz,H-1A),4.84(dpo,1H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.77(d,1H,CH2Bn),4.59(dd,1H J2,3＝10.8Hz,J3,4＝4.0Hz,H-3B),4.41-4.30(m,3H,H-2A,H-5A,CH2All),4.08-4.01(m,3H,,H-4A,H-6aA,CH2All),3.95(dd,J5,6b＝2.0Hz,J6a,6b＝11.2Hz,H-6bA),3.63(dpo,1H,J4,5＝3.6Hz,H-4B),3.60(dqpo,1H,J4,5＝1.0Hz,H-5B),3.53(dd,1H,J2,3＝9.2Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3A),3.43-3.36(m,1H,H-2B),3.29(s,3H,OCH3),1.23(d,3H,6.4Hz,H-6B),1.09(s,9H,CH3,TBDPS)。13C NMR(CDCl3)δ162.2,161.1(CONHTCA),138.4,133.4,133.3(Cq,Ar),133.5(CHAll),135.7,135.5,129.8,128.8,128.2,128.7(CAr),117.8(CH2All),100.6(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.3(C-1B,1JC,H＝163Hz),92.1,92.0(2C,CCl3),76.2(C-3B),73.3(C-3A),72.3(CH2Bn),72.0(C-4A),70.1(CH2All),69.7(C-5B),69.4(C-5A),65.6(C-4B),63.2(C-6A),56.7(OCH3),56.0(C-2B),51.4(C-2A),26.9(CH3,TBDPS),19.4(CTBDPS),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C43H55Cl6N6O9Si计算1037.1925；实测1037.1914。
烯丙基3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖基-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(36b)。将TBAF.3H2O(2.91g,9.25mmol,1.15当量)加入到在THF(80mL)中的二糖35b(8.2g,8.0mmol,1.0当量)中，将反应混合物在室温搅拌2小时。TLC分析(EtOAc)显示保护的二糖35b(Rf 1.0)的消耗和极性点的存在。缓慢加入乙酸(0.53mL,9.25mmol,1.15当量)，在搅拌10分钟后蒸发挥发物。将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc30:70→0:100)纯化，获得醇36b(5.8g,7.42mmol,92％)，为白色固体。二糖36b具有Rf 0.35(EtOAc)。1H NMR(DMSO-d6)δ8.92(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NHA),8.82(d,1H,J2,NH＝9.2Hz,NHB),7.37-7.24(m,5H,HAr),5.85-5.75(m,1H,CHAll),5.25-5.19(m,1H,CH2All),5.11-5.08(m,1H,CH2All),5.00(d,1H,J1,2＝4.0Hz,H-1A),4.82(t,1H,J6,OH＝5.6Hz,OH),4.61(d,1H,J＝11.6Hz,CH2Bn),4.55(d,1H,CH2Bn),4.48(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.22-4.14(m,3H,H-3B,H-2A,CH2All),4.08-4.02(m,2H,H-4B,H-5A),3.98-3.93(m,1H,CH2All),3.86-3.79(m,2H,H-4A,H-2B),3.69-3.60(mpo,2H,H-5B,H-6aA),3.58-3.54(mpo,2H,H-3A,H-6bA),3.24(s,3H,OCH3),1.23(d,3H,6.4Hz,H-6B)。13C NMR(DMSO-d6)δ162.0,161.8(CONHTCA),138.8(Cq,Ar),134.8(CHAll),128.4,128.0,127.7(CAr),116.9(CH2All),100.8(C-1A,1JC,H＝172Hz),100.4(C-1B,1JC,H＝161Hz),93.6,93.2(2C,CCl3),76.3(C-3B),74.5(C-3A),74.0(C-4A),72.7(C-5A),71.4(CH2Bn),69.5(CH2All),69.3(C-5B),65.4(C-4B),61.7(C-6A),57.6(OCH3),53.4(C-2B),52.7(C-2A),17.7(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C27H37Cl6N6O9计算799.0748；实测799.0748。
烯丙基(3-O-苄基-4-O-甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(37b)。将TEMPO(234mg,1.49mmol,0.2当量)和BAIB(6.0g,18.7mmol,2.5当量)加入到二糖36b(5.85g,7.49mmol,1.0当量)在双相DCM/H2O(1:10,150mL)中的溶液中。在室温搅拌2小时后，用10％Na2SO3水溶液淬灭反应，用DCM(150mL)稀释双相混合物。将水相分离，用DCM(150mL)萃取两次。将合并的有机相用盐水洗涤，通过分相过滤器干燥并减压浓缩。向粗物质的无水DMF(40mL)溶液中加入苄基溴(2.66mL,22.4mmol,3.0当量)和K2CO3(1.3g,9.73mmol,1.3当量)。在室温搅拌1小时后，将反应混合物用10％NH4Cl水溶液(100mL)稀释，用DCM(200mL)萃取两次。将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。使用Tol/EtOAc(4:1)通过快速色谱法获得苄酯37b(5.8g,6.55mmol,87％)，为白色固体。糖醛酸酯37b具有Rf0.6(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.44-7.28(m,10H,HAr),6.78(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.73(d,1H,J2,NH＝7.6Hz,NHA),5.88-5.80(m,1H,CHAll),5.30-5.23(mpo,3H,CH2Bn-6,CH2All),5.22(dpo,1H,J1,2＝6.0Hz,H-1A),5.19-5.16(m,1H,CHAll),4.82(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.78(d,1H,J4,5＝5.2Hz,H-5A),4.65-4.53(m,3H,H-3B,CH2Bn),4.34-4.29(m,1H,CH2All),4.14-4.08(m,1H,H-2A),4.06-4.01(m,1H,CH2All),3.97(dd,1H,J2,3＝8.4Hz,J3,4＝2.8Hz,H-3A),3.85-3.83(m,2H,H-4B,H-4A),3.60-3.52(m,2H,H-2B,H-5B),3.38(s,3H,OCH3),1.27(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.9(COCO2Bn),161.9,161.7(CONHTCA),137.4,135.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),128.7(3C),128.4,128.1,128.0(CAr),117.9(CH2All),98.7(C-1A,1JC,H＝170Hz),97.7(C-1B,1JC,H＝164Hz),92.3,92.2(2C,CCl3),75.8(C-3B),75.1(C-4A),73.2(C-3A),72.1(CH2Bn),71.4(C-5A),70.1(CH2All),69.3(C-5B),67.5(CH2Bn-6),65.2(C-4B),58.2(OCH3),55.5(C-2B),53.3(C-2A),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C34H41Cl6N6O10计算903.1010；实测903.1014。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖(38b)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(149mg,0.176mmol,0.03当量)溶解在无水THF(10mL)中，在H2气氛下搅拌30分钟。将所得黄色溶液脱气数次，倒入烯丙基糖苷31b(5.2mg,5.87mmol,1.0当量)的无水THF(80mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，加入碘(2.9g,11.7mmol,2.0当量)溶液和NaHCO3(1.48g,17.6mmol,3.0当量)。在室温搅拌2小时后，用10％亚硫酸钠水溶液淬灭反应。将反应混合物浓缩，将水相用DCM(3×150mL)萃取。将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 75:25→70:30)纯化，获得半缩醛38b(α/β3.5:1,4.6g,5.44mmol,92％)，为白色泡沫。α/β-端基异构体具有Rf 0.2,0.5(Tol/EtOAc 7:3)。1HNMR(CDCl3)δ7.45-7.18(m,15H,HAr,NHB-β),7.04(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NHB-α),6.87(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHA-α),6.83(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHA-β),5.43(d,1H,J1,2＝6.8Hz,H-1A-α),5.39(d,0.3H,J1,2＝6.8Hz,H-1A-β),5.29(tpo,1.1H,J1,2＝3.6Hz,H-1B-α),5.6-5.21(mpo,2.6H,CH2Bn-6),4.81(d,0.3H,J4,5＝3.6Hz,H-5A-β),4.79(d,1H,J4,5＝3.2Hz,H-5A-α),4.67(t,0.3H,J1,2＝8.8Hz,H-1B-β),4.61-4.37(m,2.7H,CH2Bn),4.43-4.37(m,1H,H-2B-α),4.26(dd,1H,J2,3＝8.4Hz,J3,4＝3.2Hz,H-3B-α),4.17(dd,1H,J2,3＝8.4Hz,J3,4＝3.2Hz,H-3B-β),4.13-4.03(m,2.7H,H-5B-α,H-2A-α,H-2A-β),3.96-3.86(m,4H,H-4B-α,H-4A-α,H-3A-α,H-2A-β,H-3A-β,H-4B-β),3.82(dd,0.3H,J3,4＝2.8Hz,J4,5＝9.6Hz,H-4A-β),3.62-3.59(m,0.3H,H-5B-β),3.54(s,1H,OCH3-β),3.41(s,1H,OCH3-α),3.07(d,1H,J1,OH＝3.6Hz,OH),1.32(d,1H,J5,6＝6.4Hz,H-6B-β)1.27(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B-α)。13C NMR(CDCl3)δ168.9,168.7(COCO2Bn),162.2,162.0,161.8(CONHTCA),137.0,136.8,134.8(CAr),129.0,128.9,128.8(2C),128.7,128.6,128.5,128.3,128.2,128.1(CAr),98.4(C-1A-β,1JC,H＝168Hz),97.5(C-1A-α,1JC,H＝169Hz),96.1(C-1B-β,1JC,H＝163Hz),96.1(C-1B-α,1JC,H＝176Hz),92.5,92.2(2C,CCl3),76.5(C-3B-α),75.2(C-3B-α),75.1(C-4A-α),75.1(C-4A-β),73.8(C-3A-β),73.1(C-3A-α),72.8(C-5A-β),72.2(C-5A-α),71.9(CH2Bn-β),71.8(CH2Bn-β),69.7(C-5B-β),67.8(CH2Bn-6β),67.7(CH2Bn-6α),65.4(C-5B-α),65.0(C-4B-α),64.5(C-4B-β),58.4(OCH3-β),58.0(OCH3-α),55.7(C-2A-β),53.6(C-2A-α),53.5(C-2B-β),50.9(C-2B-α),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C31H37Cl6N6O10计算863.0697；实测863.0700。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(39b)和2-三氯甲基[(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-1,2,4,6-四脱氧-α-D-半乳吡喃糖并]-[2,1,d]-噁唑啉(40b)。将半缩醛38b(3.0g,3.55mmol,1.0当量)溶解在丙酮(40mL)中。加入PTFACl(731μL,4.61mmol,1.3当量)，然后加入Cs2CO3(1.27g,3.90mmol,1.1当量)。在室温搅拌2小时后，将反应混合物过滤，用丙酮(2*20mL)洗涤，将滤液减压浓缩。对粗物质进行快速色谱法，用cHex/EtOAc/Et3N(20:1:0.2)洗脱，获得(N-苯基)三氟乙酰亚氨酸酯供体39b和少量噁唑啉40b的混合物(3.0g,2.95mmol,基于39b为83％)，为白色固体。二糖供体39b具有Rf 0.7(Tol/EtOAc 4:1)；HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C39H41Cl6F3N7O10计算1034.0970；实测1034.0993。噁唑啉40b具有Rf 0.5(Tol/EtOAc 4:1)；HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C31H32Cl6N5O9计算828.0326；实测828.0305。
-带有4A-端链甲基的低聚糖：链延长
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方案19.利用二糖38b合成端链4A-O-甲基化AB低聚物。(i)PTFA-Cl,Cs2O3,Acet,(ii)TfOH,DCM,-10℃,80％,(iii)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,对于42b为86％,对于44b为78％,对于46b为81％,(iv)39b/40b,TMSOTf,DCM,0℃,对于43b为78％,对于45b为76％。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(41b)。将PTFACl(110μL,692μmol,1.3当量)和Cs2CO3(191mg,586μmol,1.1当量)加入到在丙酮(10mL)中的半缩醛38b(450mg,533μmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮洗涤。将滤液浓缩并在真空下干燥，获得粗的供体39b/40b混合物(540mg,定量)。
将粗的供体39b/40b混合物(540mg,533μmol,1.0当量理论值)和受体7(464mg,533μmol,1.0当量)与无水甲苯(10mL)共蒸发，然后真空干燥1小时。将MS(1g)加入到后者的无水DCM(20mL)溶液中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌45分钟。在冷却至-10℃后，加入TfOH(2.4μL,27μmol,0.05当量)并继续搅拌30分钟，同时浴温保持在0℃。TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在供体39b/40b且存在新点。完成后，加入Et3N(5μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，将固体用DCM(10mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc85:15→75:25)纯化，获得四糖41b，为白色固体(730mg,0.429mmol,80％)。偶联产物41b具有Rf 0.55(Tol/EtOAc 7:3)。1H NMR(CDCl3)δ7.45-7.17(m,20H,HAr),6.98(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB),6.77(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.64(d,1H,J2,NH＝8.0Hz,NHA),6.49(d,1H,J2,NH＝6.4Hz,NHA),5.89-5.80(m,1H,CHAll),5.33-5.14(mpo,6H,CH2Bn-6,CH2All),5.16(dpo,1H,J1,2＝5.6Hz,H-1A),5.07(dpo,1H,J1,2＝5.6Hz,H-1A),4.83(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.79(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.77(dpo,1H,J4,5＝5.2Hz,H-5A),4.71-4.64(m,4H,H-3B,H-3B1,H-4A,H-5A)4.54(d,1H,CH2Bn),4.45(brs,2H,CH2Bn),4.33-4.28(m,1H,CH2All),4.23(brs,1H,H-4A1)4.21-4.16(m,1H,H-2A),4.06-4.01(m,1H,CH2All),3.92(d,1H,J3,4＝3.2Hz,H-4B),3.90-3.84(m,4H,H-2A1,H-3A,H-3A1,H-4A1),3.78(d,1H,J3,4＝3.2Hz,H-4B1),3.62-3.57(m,2H,H-2B,H-5B),3.50-3.43(m,2H,H-2B,H-5B),3.39(s,3H,OCH3),1.30(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B),1.19(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.8,168.2(COCO2Bn),162.0,161.9,161.6(CONHTCA),137.4,137.1,135.1,135.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.1,129.0,128.9,128.7(2C),128.6,128.5,128.4,128.3,128.2,128.0,125.2(CAr),117.9(CH2All),99.0(C-1A1,1JC,H＝170.8Hz),98.9(C-1B1,1JC,H＝165.7Hz),98.1(C-1A,1JC,H＝170.4Hz),97.8(C-1B,1JC,H＝162.3Hz),92.4,92.3(2C),92.2(CCl3),75.0(3C),74.7(C-5A,C-4A,C-3B,C-3B1),73.2,73.0,(C-3A,C-3A1),72.5(CH2Bn),72.0(CH2Bn),71.9(C-4A1),71.5(C-5A1),70.0(CH2All),69.3,68.8(C-5B,C-5B1),67.6,67.4(CH2Bn-6),65.5,65.1(C-4B,C-4B1),58.1(OCH3),55.6,55.5(C-2B,C-2B1),54.1,52.9(C-2A,C-2A1),17.3,17.2(C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C34H70Cl12N11O19计算1716.1106,实测1716.1147。
(3-O-苄基-4-O-甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖(42b)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(16mg,19μmol,0.05当量)溶解在无水THF(3.0mL)中，在H2气氛下搅拌30分钟。将所得的黄色溶液反复脱气，转移至烯丙基糖苷41b(650mg,0.383mmol,1.0当量)的无水THF(12mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，加入NIS(103mg,0.459mmol,1.2当量)。在室温再搅拌2小时后，用10％亚硫酸钠水溶液淬灭反应。蒸发挥发物，将水相用DCM(3×15mL)萃取。将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 70:30→65:35)纯化，获得半缩醛42b(α/β5:1,550mg,331μmol,86％)，为白色泡沫。α/β-端基异构体具有Rf 0.35,0.55(Tol/EtOAc7:3)。α-端基异构体具有1H NMR(CDCl3)δ7.45-7.17(m,20H,HAr),7.01(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB),6.77(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.64(d,1H,J2,NH＝8.0Hz,NHA),6.49(d,1H,J2,NH＝6.4Hz,NHA),5.33-5.18(m,4H,CH2Bn-6),5.08(d,1H,J1,2＝7.2Hz,H-1A),5.04(d,1H,J1,2＝5.6Hz,H-1A1),4.87(dpo,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B1),4.85(ddpo,1H,H-1B),4.76(dpo,1H,J4,5＝5.0Hz,H-5A),4.71(ddpo,1H,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3B),4.68-4.63(mpo,3H,CH2Bn),4.56(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.48(dd,2H,J＝12.4Hz,CH2Bn),4.23-4.17(m,2H,H-2A,H-4A),3.92-3.81(m,5H,H-2A,H-3A,H-3A1,H-4B),3.78(brd,1H,J3,4＝3.6Hz,H-4B1),3.35-3.42(m,4H,H-2B,H-2B1,H-5B,H-5B1),3.39(s,3H,OCH3),1.22,1.18(2d,6H,J5,6＝6.0Hz,H-6B1,H-6B1)。13C NMR(CDCl3)δ168.9,168.2(2C,C-6A,C-6A1),162.3,162.0,161.6(2C)(CONHTCA),137.4,137.0,135.1,135.0(Cq,Ar),129.1,129.0,128.7(2C),128.6,128.4(2C),128.3,128.2,128.0,125.2(CAr),99.1,98.8,98.2,96.7,92.4,92.3,(C-1),92.2(2C,CCl3),77.3(CH2Bn),77.2,75.0(3C,C-5A,C-4A,C-3B),74.4(C-3B1),73.1,72.9(2C,C-3A,C-3A1),72.0(CH2Bn),71.9(C-4A1),71.4(C-5A1),69.2,68.9(2C,C-5B,C-5B1),67.5,67.4(CH2Bn-6),65.1(2C,C-4B,C-4B1),58.1(OCH3),55.5,55.1(2C,C-2B,C-2B1),53.9,52.8(2C,C-2A,C-2A1),17.4,17.2(2C,C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C61H66Cl12N11O19计算1676.0793,实测1676.0797。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(43b)。[2+4]-糖基化：将PTFACl(73μL,462μmol,1.3当量)和Cs2CO3(127mg,391μmol,1.1当量)加入到在丙酮(10mL)中的半缩醛38b(300mg,355μmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，用丙酮(5mL)洗涤两次。将滤液减压浓缩，获得粗的供体39b/40b(～360mg,0.355mmol,定量)，在高真空下充分干燥后直接用于下一步。
将供体39b/40b混合物(355μmol,1.0当量理论值)和受体15b(598mg,355μmol,1.0当量)与无水甲苯(10mL)共蒸发两次，然后在高真空下充分干燥。将混合物在Ar气氛下在室温与在无水DCM(12mL)中的新活化的MS(1.0g)一起搅拌45分钟。在冷却至0℃后，加入TMSOTf(3.2μL,18μmol,0.05当量)并继续搅拌50分钟，同时浴温保持在0℃。TLC分析(Tol/EtOAc 6:4)显示不存在供体39b/40b且存在新点。完成后，加入Et3N(3μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，将固体用DCM(5mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 82:18→85:15)纯化，获得六糖43b，为白色固体(700mg,278μmol,78％)。偶联产物43b具有Rf 0.4(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C94H103Cl18N17O28计算1273.5770；实测1273.5784。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖(44b)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(12mg,14μmol,0.05当量)溶解在无水THF(4mL)中，将溶液在H2气氛下搅拌20分钟。将所得的黄色溶液反复脱气，倒入烯丙基糖苷43b(700mg,278μmol,1.0当量)的无水THF(6mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，加入NIS(94mg,418μmol,1.5当量)。在室温再搅拌2小时后，用10％亚硫酸钠水溶液淬灭反应。将挥发物真空去除，将水相用DCM(10mL)反复萃取。将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 75:25→65:35)纯化，获得半缩醛44b(α/β混合物,540mg,219μmol,78％)，为白色泡沫，Rf 0.25,0.4(Tol/EtOAc 7:3)。
烯丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(45b)。[2+6]-糖基化：将PTFA供体39b/40b混合物(200mg,0.197mmol,1.4当量)和受体17b(344mg,0.138mmol,1.0当量)与在无水DCM(6mL)中的新活化的MS(600mg)在Ar气氛下在室温一起搅拌30分钟。在冷却至-10℃后，加入TMSOTf(1.8μL,10μmol,0.05当量)并继续搅拌1小时，同时浴温保持在-10℃。完成后，加入Et3N(3μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(6mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 85:15→82:18)纯化，获得八糖45b，为白色固体(350mg,0.105mmol,76％)。偶联产物45b具有Rf 0.35(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C124H128Cl24N21O37计算3356.1160；实测3356.1186。
(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖(46b)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(4.0mg,5μmol,0.05当量)溶解在无水THF(2.0mL)中，在H2气氛下搅拌40分钟。将所得的黄色溶液用Ar气流脱气，倒入八糖45b(700mg,0.105mmol,1.0当量)的无水THF(3.0mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，加入NIS(31mg,317μmol,1.3当量)。在室温继续搅拌2小时后，加入10％亚硫酸钠水溶液淬灭反应。将反应混合物浓缩，将水相用DCM(5mL)萃取三次。将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 70:30→60:40)纯化，获得相应的半缩醛46b(α/β混合物,280mg,85μmol,81％)，为白色泡沫。半缩醛46b具有Rf 0.15,0.25(Tol/EtOAc 6:4)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C121H128Cl24N22O37计算1662.0643；实测1662.0621。
实施例8.以端链A残基上的4A-Me为特征的具有接头的寡糖：接头＝(S)-(-)-2,3- 二苄氧基-1-丙醇
-接头连接
方案20.具有接头的端链4A-O-甲基化AB低聚物的合成。(i)a.PTFA-Cl,Cs2O3,Acet,b.(S)-(-)-2,3-二苄氧基-1-丙醇,TfOH,DCM,-10℃,对于47b为87％,(ii)a.PTFA-Cl,Cs2O3,Acet,b.(S)-(-)-2,3-二苄氧基-1-丙醇,TfOH,DCM,0℃,对于49b为66％,(iii)a.PTFA-Cl,Cs2O3,Acet,b.(S)-(-)-2,3-二苄氧基-1-丙醇,TMSOTf,DCM,-10℃,对于51b为64％,对于52b为51％,(iv)DDQ,10:1DCM/磷酸盐缓冲液pH 7,66％,(v)a.38b,PTFA-Cl,Cs2O3,Acet,b.TfOH,DCM,-10℃,90％。
(S)-2,3-二苄氧基-1-丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(47b)。将PTFACl(212μL,1.33mmol,1.3当量)和Cs2CO3(369mg,1.13mmol,1.1当量)加入到在丙酮(20mL)中的半缩醛9a(1.0g,1.03mmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮(10mL)洗涤两次。将滤液浓缩，真空干燥，获得粗的PTFA/噁唑啉供体9b/10b(600mg,0.592mmol,定量)，在真空下充分干燥后直接用于下一步。
将粗的供体9b/10b(1.17g,1.03mmol,1.0当量理论值)和(S)-(-)-2,3-二苄氧基-1-丙醇(519μL,2.06mmol,2.0当量)的混合物与在无水DCM(20mL)中的新活化的MS(1g)在Ar气氛下在室温一起搅拌1小时。在冷却至-10℃后，加入TfOH(4.5μL,51μmol,0.05当量)并继续搅拌30分钟，在此期间浴温保持在-10℃。TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在供体9b/10b且存在新点。完成后，加入Et3N(10μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(20mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 80:20→76:24)纯化，获得二糖47b，为白色固体(1.1g,0.897mmol,87％)。偶联产物47b具有Rf 0.6(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.74(m,3H,HAr),7.70(brs,1H,HAr),7.45-7.48(m,2H,HAr),7.45-7.48(m,21H,HAr),6.71(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHA),6.65(d,1H,J2,NH＝7.8Hz,NHB),5.23(brs,2H,CH2Bn),5.18(d,1H,J1,2＝5.2Hz,H-1A),4.86(d,1H,J4,5＝5.2Hz,H-5A),4.73(brs,2H,CH2Bn),4.73(dpo,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B),4.66(brs,2H,CH2Bn),4.58-4.54(m,3H,CH2Bn),4.49-4.45(mpo,3H,CH2Bn,H-3B),4.22(dddpo,1H,H-2A),4.08(dd,1H,J3,4＝2.8Hz,H-4A),3.96(dd,1H,J＝4.4Hz,10.4Hz,H2-接头),3.85-3.82(m,2H,H-3A,H-4B),3.78-3.73(m,1H,H1-接头),3.67-3.52(m,5H,H1-接头,H3-接头,H-2B,H-5B),1.27(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.9(C-6A),161.9,161.6(CONHTCA),138.5,138.3,137.4,135.0,133.1(2C)(Cq,Ar),128.7,128.6,128.4,128.3(2C),128.2,127.9(2C),127.7(2C),127.6,127.5(2C),127.0,126.2,126.1,125.9(CAr),99.4(C-1B,1JC,H＝163.4Hz),98.9(C-1A,1JC,H＝171.0Hz),92.3,92.1(2C,CCl3),77.0(CH),76.3(C-3B),73.4(C-3A),73.3(CH2Bn),72.1(CH2Nap),72.0(2C,C-4A,CH2Bn),71.9(CH2Bn),71.6(C-5A),70.1(CH2Bn),69.4(C-5B),68.8(CH2Bn),67.5(CH2Bn-6),65.1(C-4B),55.2(C-2B),53.0(C-2A),17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C58H61Cl6N6O12计算1243.2473；实测1243.2493。
(S)-2,3-二苄氧基-1-丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(48b)。将DDQ(482mg,2.12mmol,2.6当量)加入到在DCM(20.0mL)和磷酸盐缓冲液pH7(2.0mL)的混合物中的二糖47b(1.0g,816μmol,1.0当量)中。将双相混合物冷却至0℃并剧烈搅拌2小时。TLC分析(Tol/EtOAC 4:1)显示不存在完全保护的47b并且存在更极性的点。加入10％NaHCO3水溶液(20mL)，然后加入DCM(20mL)。将DCM层分离，用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(Tol/EtOAc 80:20→75:25)纯化，获得醇48b(585mg,539μmol,66％)，为白色固体。二糖48b具有Rf 0.5(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.43-7.26(m,20H,HAr),6.80(d,1H,J2,NH＝8.2Hz,NHA),6.73(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),5.26(ddpo,2H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.96(d,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A),4.76(dpo,1H,J1,2＝8.2Hz,H-1B),4.75-4.68(mpo,3H,H-5A,CH2Bn),4.65(ddpo,2H,CH2Bn),4.53(ddpo,2H,CH2Bn),4.47(dd,1H,J2,3＝10.6Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3B),4.34-4.29(mpo,1H,H-2A),4.08(dt,1H,J4,5＝7.6Hz,J3,4＝3.6Hz,H-4A),3.98(dd,1H,J＝3.6,5.6Hz,H3-接头),3.84(dd,1H,J＝3.6,5.6Hz,H-3A),3.77-3.72(m,2H,H-4B,H2-接头),2.82(d,1H,J4,OH＝8.0Hz,OH),3.68-3.55(m,5H,H1-接头,H3-接头,H-2B,H-5B),1.27(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.8(C-6A),162.1,161.6(CONHTCA),138.4,138.2,137.1,134.9(Cq,Ar),128.7,128.5,128.4(2C),128.3(2C),128.2,127.6(2C)(CAr),99.5(C-1A,1JC,H＝171.2Hz),99.3(C-1B,1JC,H＝163.4Hz),92.2,91.9(2C,CCl3),77.0(CH),76.7(C-3B),74.7(C-3A),73.3(CH2Bn),72.2(CH2Bn),72.1(CH2Bn),71.2(C-5A),70.0(CH2Bn),69.6(C-5B),68.8(CH2Bn),67.5(CH2Bn-6),65.5(C-4A),65.3(C-4B),55.4(C-2B),51.3(C-2A),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C47H53Cl6N6O12计算1103.1858；实测1103.1847。
(S)-2,3-二苄氧基-1-丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-甲基-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(49b)。将PTFACl(122μL,770μmol,1.3当量)和Cs2CO3(212mg,651μmol,1.1当量)加入到在丙酮(15mL)中的半缩醛38b(500mg,592μmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮洗涤。蒸发挥发物，获得粗的供体39b/40b混合物(600mg,定量)，在真空下充分干燥后直接用于下一步。
将粗的供体39b/40b混合物(600mg,592μmol,1.0当量理论值)和(S)-(-)-2,3-二苄氧基-1-丙醇(298μL,1.18mmol,2.0当量)与在无水DCM(20mL)中的新活化的MS(500mg)在Ar气氛下在室温一起搅拌1小时。在冷却至0℃后，加入TfOH(2.6μL,30μmol,0.05当量)，在此温度继续搅拌40分钟。TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在供体39b/40b且存在新点。完成后，加入Et3N(5μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，将固体用DCM(10mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 80:20→76:24)纯化，获得二糖49b，为白色固体(430mg,423μmol,66％)。偶联产物49b具有Rf 0.8(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.42-7.26(m,20H,HAr),6.74(ddpo,2H,J2,NH＝7.6Hz,NHA,NHB),5.26(brd,2H,CH2Bn-6),5.20(d,1H,J1,2＝5.6Hz,H-1A),4.79(d,1H,J4,5＝4.8Hz,H-5A),4.73(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.66-4.63(m,3H,CH2Bn),4.57-4.53(m,3H,CH2Bn),4.49(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3B),4.15-4.10(m,1H,H-2A),3.97-3.92(m,2H,H-3A,OCH2),3.86-3.82(m,2H,H-4B,H-4A),3.76-3.72(m,1H,CH),3.67-3.54(m,5H,H-2B,H-5B,3OCH2),3.39(s,3H,OCH3),1.26(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.9(C-6A),161.9,161.7(CONHTCA),138.5,138.3,137.4,135.0(Cq,Ar),128.8,128.7(2C),128.4,128.3(2C),128.2,128.0,127.6,127.5(3C)(CAr),99.4(C-1B,1JC,H＝163Hz),98.6(C-1A,1JC,H＝169Hz),92.3,92.2(2C,CCl3),77.0(CH),76.2(C-3B),75.1(C-4A),73.3(CH2Bn),73.1(C-3A),72.1(CH2Bn),72.0(CH2Bn),71.4(C-5A),70.1(OCH2),69.4(C-5B),68.8(OCH2),67.5(CH2Bn-6),65.1(C-4B),58.0(OCH3),55.2(C-2B),53.2(C-2A),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C48H55Cl6N6O12计算1117.2004；实测1117.1999。
(S)-2,3-二苄氧基-1-丙基(3-O-苄基-4-O-甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(50b)。将PTFA-Cl(73μL,0.460mmol,1.3当量)和Cs2CO3(127mg,385μmol,1.1当量)加入到在丙酮(10mL)中的半缩醛38b(300mg,353μmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，用丙酮(5mL)洗涤两次。将滤液减压浓缩，获得粗的PTFA供体(360mg,定量)，在高真空下充分干燥后直接用于下一步。
将粗的PTFA供体(360mg,0.355mmol,1.25当量理论值)和受体48b(308mg,284μmol,1.0当量)的混合物与无水甲苯(5mL)共蒸发两次，然后在高真空下充分干燥。将新活化的MS(600mg)加入到在无水DCM(9.0mL)中的混合物中，将混悬液在Ar气氛下在室温搅拌1小时。在冷却至-10℃后，加入TfOH(1.6μL,18μmol,0.06当量)并继续搅拌30分钟，同时浴温保持在0℃。TLC分析(Tol/EtOAc14:6)显示不存在供体且存在新点。完成后，加入Et3N(3μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，将固体用DCM(5mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(cHex/EtOAc 82:18→77:23)纯化，获得四糖50b，为白色固体(490mg,256μmol,90％)。偶联产物50b具有Rf 0.7(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C78H84Cl12N11O21计算1930.2100；实测1930.2138。
(S)-2,3-二苄氧基-1-丙基(3-O-苄基-4-O-甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-4-O-甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(51b)。将半缩醛44b(540mg,219μmol)溶解在丙酮(6mL)中。加入PTFA-Cl(57μL,357μmol,1.6当量)和Cs2CO3(102mg,0.313mmol,1.4当量)。在室温搅拌2小时后，将混悬液经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮(5mL)洗涤两次。蒸发挥发物，获得粗的PTFA供体(577mg,定量)，在真空下充分干燥后直接用于下一步。
将粗的供体(577mg,219μmol,1.0当量理论值)和含有新活化的MS(1.2g)的(S)-(-)-2,3-二苄氧基-1-丙醇(169μL,670μmol,3.0当量)在无水DCM(12mL)中的混合物在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。在冷却至-10℃后，加入TMSOTf(2.0μL,11μmol,0.05当量)并继续搅拌40分钟，同时浴温保持在-10℃。完成后，加入Et3N(4μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(6mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 82:18→85:15)纯化，获得六糖51b，为白色固体(380mg,139μmol,64％)。偶联产物51b具有Rf 0.45(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C108H118Cl18N15O30计算2243.2255；实测2746.2190。
(S)-2,3-二苄氧基-1-丙基(3-O-苄基-4-O-甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-4-O-甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-4-O-甲基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(52b)。将PTFACl(18μL,111μmol,1.3当量)和Cs2CO3(31mg,94μmol,1.1当量)加入到半缩醛46b(280mg,85μmol,1.0当量)的丙酮(5.0mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮(3mL)洗涤两次。将滤液减压浓缩，获得粗的供体(300mg,定量)，在真空下充分干燥后直接用于下一步。
将粗的PTFA供体(300mg,85μmol,1.0当量理论值)和含有新活化的MS(300mg)的(S)-(-)-2,3-二苄氧基-1-丙醇(85μL,341μmol,4.0当量)在无水DCM(6.0mL)中的混合物在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。在冷却至-10℃后，加入TMSOTf(1.0μL,4μmol,0.05当量)并继续搅拌45分钟，同时浴温保持在-10℃。完成后，加入Et3N(2μL)。在此温度继续搅拌10分钟后，将混悬液通过合适的漏斗过滤，将固体用DCM(4mL)洗涤两次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 84:16→78:22)纯化，获得八糖52b，为白色固体(155mg,44mmol,51％)。缩合产物52b具有Rf 0.6(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C138H146Cl24N22O39计算1793.1260；实测1793.1251。
-完全脱保护
方案21.具有丙三醇的宋内志贺菌两性离子二糖至六糖53b、54b、55b的合成。(i)方法1:Pd(OH)2/C,H2,NaHCO3,2-MeTHF/iPrOH/H2O,对于53b为86％,对于54b为35％,对于55b为24％。
(S)-2,3-二羟基-1-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(53b)。对完全保护的二糖49b(120mg,109μmol)进行氢化介导的脱保护(方法1)。获得二糖53b，为白色固体(48mg,94μmol,86％)。二糖53b具有RP-HPLC(215nm)Rt＝12.3min(条件A),Rt＝6.3min(条件B)。1H NMR(D2O)δ4.88(d,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1A),4.78(brs,1H,H-5A),4.48(d,1H,J1,2＝8.6Hz,H-1B),4.13(dd,1H,J3,4＝4.4Hz,J2,3＝10.8Hz,H-3B),4.02(qpo,1H,H-5B),3.98brt,1H,H-4A),3.90(ddpo,1H,H-2A),3.85(brd,1H,H-4B),3.84-3.74(mpo,3H,H-2B,H1-接头),3.70(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝2.0Hz,H-3A),3.62-3.55(m,2H,H1-接头),3.49-3.45(mpo,1H,H2-接头),3.48(brs,3H,OCH3),2.00,1.96(2s,6H,CH3Ac),1.29(d,3H,J5,6＝6.6Hz,H-6B)。13C NMR(D2O)δ174.5,174.2(NHCOA,B),172.7(C-6A),101.7(C-1B,1JC,H＝163.0Hz),100.8(C-1A,1JC,H＝169.0Hz),78.6(C-4A),76.1(C-3B),72.8(C-5A),70.8(OCH2),70.2(OCH接头),67.6(C-3A),67.3(C-5B),62.3(OCH2),58.1(OCH3),54.7(C-4B),51.7(C-2A),50.8(C-2B),22.2(2C,CH3Ac),15.5(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C20H36N3O12计算510.2293；实测510.2292。
(S)-2,3-二羟基-1-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(54b)。对完全保护的四糖50b(78mg,41μmol)进行氢化介导的脱保护(方法1)。获得四糖54b，为白色固体(13mg,14μmol,35％)。四糖54b具有RP-HPLC(215nm)Rt＝7.9min(条件A)。1H NMR(D2O,部分)δ4.87(d,1H,J1,2＝8.1Hz,H-1A),4.80-4.74(mpo,4H,H-5A,H-5B1,H-1A,H-1B1),4.48-4.45(m,2H,H-4A,H-1B),4.16-4.10(m,2H,H-3B,H-3B1),4.02-3.98(m,3H,H-5B,H-5B1),3.93-3.89(mpo,1H,H-2A),3.86-3.66(m,9H),3.59-3.55(m,2H,H1-接头),3.49-3.47(mpo,1H,H2-接头),3.48(brs,3H,OCH3),1.99,1.97,1.94(2s,12H,CH3Ac),1.29(dpo,6H,J5,6＝6.0Hz,H-6B,H-6B1)。13C NMR(D2O,部分)δ174.6,174.5(5C,4NHCO,C-6A),174.1(C-6A),102.8(C-1B1,1JC,H＝166.0Hz),101.8(C-1B,1JC,H＝162.4Hz),101.1(C-1A,1JC,H＝166.4Hz),100.9(C-1A,1JC,H＝167.0Hz),78.5(C-4A),76.5(C-3B1),76.0(3C,C-3B,C-4A1,C-5A1),72.7(C-5A),70.8(OCH2),70.2(OCH接头),67.6(C-3A),67.3(2C,C-5B,C-5B1),62.3,58.2(OCH2),58.2(OCH3),54.8,54.7(2C,C-4B1,C-4B),51.7,51.5(2C,C-2A,C-2A1),51.0,50.9(2C,C-2B,C-2B1),22.4,22.2(2C,CH3Ac),15.6,15.5(2C,C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C36H61N6O21计算913.3884；实测913.3864。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C36H60N6O21Na计算935.3704；实测935.3680。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C36H61N6O21计算457.1979；实测457.1972。
(S)-2,3-二羟基-1-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(55b)。对完全保护的六糖51b(75mg,28μmol)进行氢化介导的脱保护(方法1)。获得六糖55b，为白色固体(8.5mg,9.3μmol,24％)。1H NMR(D2O,部分)δ4.90(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A),4.81-4.70(mpo,5H,H-5A,2H-1A,2H-1B),4.70-4.65(mpo,2H,2H-5A),4.49-4.48(m,3H,2H-4A,H-1B),4.17-4.11(m,3H,H-3B),4.02-3.93(m,4H,H-4A,3H-5B),3.94-3.67(m,14H),3.60-3.55(m,2H,H1-接头),3.49(brs,3H,OCH3),3.47-3.45(m,1H,H1-接头),3.01-1.95(mpo,18H,CH3Ac),1.30(dpo,9H,J5,6＝6.0Hz,H-6B)。13C NMR(D2O,部分)δ174.6,174.5,174.4,174.1(5C,4NHCOA,B,C-6A2),172.9,172.4(2C,C-6A,C-6A1),102.9(2C,C-1B1,C-1B2,1JC,H＝166.0Hz),101.8(C-1B,1JC,H＝163.0Hz),101.1(2C,C-1A,C-1A1,1JC,H＝167.0Hz),100.9(C-1A2,1JC,H＝169.0Hz),78.6,76.7(C-4A,C-4A1),76.3,76.0(C-5A,C-5A1),75.9,75.7(C-3B),72.9,70.8(2C,OCH2),70.2(OCH接头),67.6(3C,C-3A,C-3A1,C-3A2),67.3(3C,C-5B,C-5B1,C-5B2),62.3(OCH2),58.1(OCH3),54.8(3C,C-4B1,C-4B,C-4B2),51.7(3C,C-2A,C-2A1,C-2A2),51.0,50.9(3C,C-2B,C-2B1,C-2B2),22.3,22.2(6C,CH3Ac),15.6,15.5(3C,C-6B,C-6B1,C-6B2)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C52H87N9O30计算658.7774；实测658.7754。
实施例9：以4A-端链羟基为特征的具有接头的寡糖
-作为接头前体的叠氮丙基糖苷配基
方案22.具有叠氮丙基的AB低聚物的合成。(i)3-叠氮丙醇,TMSOTf,DCE,-15℃,对于56为89％,对于58b为93％,(ii)DDQ,10:1DCM/磷酸盐缓冲液pH 7,86％,(iii)9b/10b,TMSOTf,DCE,-15℃,66％,(iv)13b/14b,TMSOTf,DCE,-5℃,55％。
3-叠氮丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(56b)和2-叠氮丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-α-D-半乳吡喃糖苷(57b)。将供体9b/10b(1.0g,876μmol,1.0当量)和3-叠氮丙醇(161μL,1.75mmol,2.0当量)的无水DCE(14mL)溶液与新活化的MS(1.0g)在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。将反应混合物冷却至-15℃，加入TMSOTf(11μL,61μmol,0.07当量)。在-15℃持续40分钟后，将混合物用Et3N(12μL,0.1当量)淬灭，过滤并浓缩。快速色谱法(Tol/EtOAc 4:1)按洗脱顺序获得白色固体状的α-异构体57b(40mg，38μmol，4％)和白色固体状的期望的二糖56b(830mg，787μmol，89％)。二糖56b具有Rf 0.6(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.85-7.74(m,3H,HAr),7.70(brs,1H,HAr),7.52-7.48(m,2H,HAr),7.42-7.27(m,11H,HAr),6.80(d,1H,J2,NH＝7.4Hz,NHB),6.72(d,1H,J2,NH＝7.9Hz,NHA),5.26-5.19(ddpo,3H,H-1A,CH2Bn-6),4.85(d,1H,J4,5＝4.6Hz,H-5A),4.74(brs,2H,CH2Nap),4.71(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.53(dpo,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.50(ddpo,1H,J3,4＝4.0Hz,J2,3＝10.2Hz,H-3B),4.45(dpo,1H,CH2Bn),4.24-4.19(m,1H,H-2A),4.10(dd,1H,J3,4＝2.8Hz,H-4A),3.95-3.89(m,1H,OCH2),3.86(brd,1H,H-4B),3.84(dd,1H,J2,3＝8.1Hz,H-3A),3.67-3.51(mpo,H-2B,H-5B,OCH2),3.37(t,2H,J＝6.6Hz,CH2N3),1.89-1.77(m,2H,CH2),1.28(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.9(C-6A),162.0,161.7(CONHTCA),137.4,134.9,134.5,133.1(2C)(Cq,Ar),128.7,128.6,128.4,128.3,128.2,128.0,127.9,127.7,127.0,126.2,126.1,125.9(CAr),99.1(C-1B,1JC,H＝163Hz),98.8(C-1A,1JC,H＝170Hz),92.4,92.1(2C,CCl3),76.1(C-3B),73.4(C-3A),72.0(C-4A,CH2Nap),71.9(CH2Bn),71.8(C-5A),69.4(C-5B),67.5(CH2Bn-6),66.3(OCH2),65.1(C-4B),55.1(C-2B),53.1(C-2A),48.1(CH2N3),29.0,17.3(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C44H48Cl6N9O10计算1072.1650,实测1072.1645。
副产物57b具有Rf 0.65(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.86-7.75(m,3H,HAr),7.71(brs,1H,HAr),7.53-7.48(m,2H,HAr),7.45-7.16(m,11H,HAr),7.05(d,1H,J2,NH＝7.4Hz,NHB),6.81(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHA),5.41(d,1H,J1,2＝6.2Hz,H-1A),5.19(ddpo,2H,J＝12.2Hz,CH2Bn-6),4.90(d,1H,J1,2＝3.8Hz,H-1B),4.81(d,1H,J4,5＝3.8Hz,H-5A),4.76(brs,2H,CH2Nap),4.46-4.38(mpo,3H,H-2B,CH2Bn),4.24-4.15(mpo,3H,H-2A,H-4A,H-3B),3.94(ddpo,1H,H-4B),3.90-3.85(mpo,2H,H-3A,H-5B),3.76-3.70(m,1H,OCH2),3.50-3.44(m,1H,OCH2),3.35(t,2H,J＝6.4Hz,CH2N3),1.85-1.78(m,2H,CH2),1.24(d,3H,J5,6＝6.2Hz,H-6B)。13CNMR(CDCl3)δ168.9(C-6A),162.0,161.7(CONHTCA),136.9,134.8,134.5,133.1(2C)(Cq,Ar),129.0,128.9,128.8,128.7,128.6,128.5,128.4,128.3,128.2(2C),128.0,127.9,127.7,127.1,126.2,126.1,126.0,125.2(CAr),97.9(C-1A,1JC,H＝169Hz),96.8(C-1B,1JC,H＝175Hz),92.5,92.1(2C,CCl3),75.4(C-3B),73.1(C-3A),72.7(C-5A),72.0(CH2Nap),71.9(C-4A),71.6(CH2Bn),67.5(CH2Bn-6),65.6(C-5B),65.1(OCH2),64.9(C-4B),53.6(C-2A),50.8(C-2B),48.2(CH2N3),28.7(CH2,接头),17.2(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C44H48Cl6N9O10计算1072.1650,实测1072.1646。
3-叠氮丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(58b)。将供体13b/14b(3.8g,1.94mmol,1.0当量)和3-叠氮丙醇(358μL,3.88mmol,2.0当量)的无水DCE(50mL)溶液与新活化的MS(3.0g)在Ar气氛下在室温搅拌45分钟。将反应混合物冷却至-15℃，加入TMSOTf(25μL,136μmol,0.07当量)。在-15℃搅拌1小时后，加入Et3N(20μL,0.1当量)。将混悬液经硅藻土垫过滤，将固体用DCM洗涤，蒸发挥发物。对残余物进行快速色谱法(Tol/ACN90:10)，获得期望的四糖58b(3.4g,1.82mmol,93％)，为白色固体。四糖58b具有Rf 0.55(Tol/ACN 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.74(m,3H,HAr),7.69(brs,1H,HAr),7.51-7.20(m,18H,HAr),7.08(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB1),6.82(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.67(d,1H,J2,NH＝8.0Hz,NHA),6.54(d,1H,J2,NH＝7.6Hz,NHA1),5.30-5.18(ddpo,4H,CH2Bn-6),5.17(dpo,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A),5.07(d,1H,J1,2＝5.0Hz,H-1A1),4.83(dpo,1H,J4,5＝5.2Hz,H-5A1),4.81(dpo,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B1),4.77-4.67(mpo,4H,CH2Nap,H-5A,H-1B),4.65(ddpo,1H,J3,4＝3.6Hz,J2,3＝10.6Hz,H-3B1),4.59-4.55(m,2H,H-3B,CH2Bn),4.55(dpo,1H,J＝12.6Hz,CH2Bn),4.52(brs,2H,CH2Bn),4.31-4.25(m,2H,H-4A,H-2B1),4.08(dd,1H,J3,4＝3.0Hz,H-4A1),3.94-3.88(mpo,3H,H-2A,H-4B,OCH2),3.84-3.73(mpo,H-3A,H-3A1,H-4A1),3.68-3.60(m,2H,H-2B,H-5B),3.56-3.51(m,2H,H-2B1,OCH2)3.49-3.43(m,1H,H-5B1),3.36(t,2H,J＝6.6Hz,CH2N3),1.86-1.76(m,2H,CH2),1.31(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B),1.31(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B1)。13CNMR(CDCl3)δ168.9,168.2(2C,C-6A,C-6A1),162.1,161.9,161.7,161.6(4C,CONHTCA),137.3,137.0,135.0,134.9,134.6,133.1(2C)(Cq,Ar),129.1,129.0,128.8(2C),128.7(2C),128.5,128.4(2C),128.3,128.2,128.0,127.9,126.9,126.2,126.1,125.8(CAr),99.2(C-1B,1JC,H＝162Hz,C-1B1,1JC,H＝166Hz),97.9(C-1A,1JC,H＝170.0Hz),92.4,92.3,92.1(4C,CCl3),75.2(2C,C-5A,C-3B1)74.8(C-3B),73.3,73.1(C-3A,C-3A1),72.5(CH2Nap),72.0(C-4A),71.9(CH2Bn),71.8(CH2Bn),71.6(C-4A1),69.4(C-5B),68.9(C-5B1),67.6(CH2Bn-6),67.4(CH2Bn-6),66.2(OCH2),65.4,65.1(2C,C-4B,C-4B1),55.4,55.2(2C,C-2B,C-2B1),53.9,52.7(2C,C-2A,C-2A1),48.1(CH2N3),29.0(CH2,接头),17.3,17.2(2C,C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C74H77Cl12N14O19计算1885.1746,实测1885.1760。
3-叠氮丙基(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(59b)。将四糖58b(2.5g,1.33mmol,1.0当量)溶解在DCM(25mL)中，加入磷酸盐缓冲液pH 7(3mL)。将双相混合物冷却至0℃，加入DDQ(608mg,2.67mmol,2.0当量)，搅拌双相混合物，同时浴温保持在0-10℃。完成后，加入5％NaHCO3水溶液(50mL)，将双相混合物用DCM(50mL)稀释。将DCM层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 85:15→86:14)纯化，获得醇59b(2.0g,1.15mmol,86％)，为白色固体。四糖59b具有Rf 0.35(Tol/ACN 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.84-7.74(m,20H,HAr),6.98(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB1),6.79(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.75(d,1H,J2,NH＝8.0Hz,NHA),6.52(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHA1),5.31-5.20(ddpo,4H,CH2Bn-6),5.13(d,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A),4.90(d,1H,J1,2＝4.0Hz,H-1A1),4.82(dpo,1H,J4,5＝8.4Hz,H-1B),4.72-4.69(mpo,5H,CH2Bn,H-5A,H-5A1,H-1B1),4.46-4.57(mpo,2H,H-3B1,H-3B),4.49-4.41(m,2H,CH2Bn),4.34-4.30(m,1H,H-2A),4.27(t,1H,J4,5＝J3,4＝2.4Hz,H-4A),4.15(mpo,1H,H-4A1),3.95-3.88(mpo,3H,H-2A,H-4B,OCH2),3.85(d,1H,J3,4＝2.4Hz,H-4A1),3.82-3.78(ddpo,1H,H-3A1),3.73(d,1H,J3,4＝3.0Hz,H-4A),3.65-3.42(mpo,5H,H-2B,H-5B,H-2B1,OCH2,H-5B1),3.35(t,2H,J＝6.6Hz,CH2N3),2.83(brs,1H,OH),1.88-1.76(m,2H,CH2),1.30(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6B),1.17(d,3H,J5,6＝6.2Hz,H-6B1)。13C NMR(CDCl3)δ168.8,168.2(COCOOBn),162.2,161.9,161.7,161.6(CONHTCA),137.8,137.0,136.9,135.0,134.9(2C)(Cq,Ar),129.1,129.0,128.8,128.7(2C),128.6,128.5,128.4(2C),128.2,125.2(CAr),99.5(C-1A1,1JC,H＝168Hz),99.0(C-1B,1JC,H＝162Hz),99.0(C-1B1,1JC,H＝165Hz),97.9(C-1A,1JC,H＝170Hz),92.4,92.3,92.0(4C,CCl3),75.8(C-3B),75.0(C-5A),74.7(C-3A,C-3B1),72.9(C-4A1),72.4,72.3(CH2Bn),72.1(C-3A1),71.4(C-4A1),69.5(C-5B1),68.8(C-5B),67.6(CH2Bn-6),67.5(CH2Bn-6),66.3(OCH2),65.4,65.1(2C,C-4B,C-4B1),55.4(2C,C-2B,C-2B1),53.9,51.3(2C,C-2A,C-2A1),48.1(CH2N3),29.0(CH2,接头),17.3,17.1(2C,C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C63H69Cl12N14O19计算1745.1120,实测1745.1117。
3-叠氮丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(60b)。将二糖供体9b/10b(694mg,608μmol,1.05当量)和叠氮丙基四糖59b(1.0g,579μmol,1.0当量)的无水DCE(15mL)溶液与新活化的MS(1.2g)在Ar气氛下在室温搅拌1小时。将反应混合物冷却至-15℃，加入TMSOTf(8μL,43μmol,0.07当量)。在-15℃持续40分钟后，加入Et3N(12μL,0.1当量)。在搅拌10分钟后，将混悬液通过硅藻土垫过滤，将固体用DCM洗涤，将滤液真空浓缩。快速色谱法(Tol/ACN 84:14→85:15)获得六糖60b(850mg,317μmol,55％)，为白色固体。叠氮丙基糖苷60b具有Rf 0.3(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C104H106Cl18N19O28计算2700.1824,实测2700.1892。
3-叠氮丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(61b)。将四糖供体13b/14b(1.07g,547μmol,1.05当量)和叠氮丙基四糖59b(900mg,521μmol,1.0当量)的无水DCE(22mL)溶液与新活化的MS(1.5g)在Ar气氛下在室温搅拌1小时。将反应混合物冷却至-5℃，加入TMSOTf(7μL,38μmol,0.07当量)。在-5℃搅拌40分钟后，加入Et3N(8μL,0.1当量)。在搅拌10分钟后，过滤固体并用DCM洗涤。真空浓缩滤液。对残余物进行快速色谱法(Tol/ACN 84:14→84:16)，获得叠氮丙基八糖61b(850mg,317μmol,55％)，为白色固体。偶联产物61b具有Rf 0.25(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C134H139Cl24N25O37计算1770.6082,实测1770.6075。
-具有接头的糖苷的其他途径
οCbz掩蔽的氨丙基接头
ο缩醛掩蔽的含酮接头
方案23.另类的具有接头的宋内志贺菌AB二糖的合成。(i)2-甲基-1,3-二氧戊环-2-乙醇,TMSOTf,DCE,-15℃,78％,(ii)3-(苄氧基羰基氨基)-1-丙醇,TMSOTf,DCE,-15℃,91％。
2-甲基-1,3-二氧戊环-2-乙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(62b)。将供体9b/10b(550mg,482μmol,1.0当量)和2-甲基-1,3-二氧戊环-2-乙醇(127mg,963μmol,2.0当量)的无水DCE(8mL)溶液与新活化的MS(800mg)在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。将反应混合物冷却至-15℃，加入TMSOTf(6.0μL,34μmol,0.07当量)。在-15℃搅拌1小时后，将混合物用Et3N(6μL,0.1当量)淬灭，过滤并浓缩。使用Tol/EtOAc(80:20)通过快速色谱法获得期望的二糖62b(410mg,405μmol,78％)，为白色固体。二糖62b具有Rf 0.4(Tol/EtOAc4:1)，HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C47H53Cl6N6O12计算1103.1821；实测1103.1847。
3-(苄氧基羰基氨基)-1-丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(63b)。将供体9b/10b(600mg,525μmol,1.0当量)和3-(苄氧基羰基氨基)-1-丙醇(220mg,1.05mmol,2.0当量)的无水DCE(9mL)溶液与新活化的MS(800mg)在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。将反应混合物冷却至-15℃，加入TMSOTf(7.0μL,61μmol,0.07当量)。在-15℃搅拌40分钟后，将Et3N(7μL,0.1当量)加入至反应混合物，在室温搅拌10分钟。将混悬液过滤并浓缩。快速色谱法(Tol/EtOAc 7:3)获得期望的二糖63b(560mg,481μmol,91％)，为白色固体。二糖63b具有Rf 0.35(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C52H56Cl6N7O12计算1180.2113；实测1180.2091。
实施例10.以B-端链残基为特征的具有接头的寡糖
-作为接头前体的叠氮丙基糖苷配基
方案24.B-端链宋内志贺菌受保护的三糖和五糖18c和19c的合成。(i)BnBr,NaH,DMF,0℃,55％(75％brsm),(ii)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,对于10c为93％,对于13c为92％,对于16c为92％,(iii)PTFA-Cl,Cs2O3,Acet,对于11c为92.5％,由12c开始对于14c为86％,对于17c为85％,(iv)3-叠氮丙醇,TMSOTf,DCM,-30℃,对于12c为52％,由7开始对于15c为84％,(iv)TMSOTf,DCM,-30℃,52％,(v)TMSOTf,DCE,-10℃,由7开始为84％,(vi)3-叠氮丙醇,DCE,-15℃,对于18c为85％,对于19c为88％。
烯丙基4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(9c)。在Ar气氛下，将醇8(6.0g,16.1mmol,1.0当量)的无水DMF(40mL)溶液冷却至0℃。加入苄基溴(2.3mL,19.3mmol,1.2当量)，然后分批加入NaH(60％在矿物油中，1.16g,48.3μmol,3.0当量)。在0℃搅拌24小时后，加入稀NH4Cl水溶液(200mL)，将水层用DCM(200mL)洗涤两次。将合并的有机部分经Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩滤液。对粗残余物进行快速色谱法(Tol/EtOAc 90:10→84:16)，获得期望的苄醚9c(4.1mg,8.87mmol,55％)，为白色固体。进一步的洗脱(Tol/EtOAc 90:10→60:40)获得未反应的起始物8(1.6g,26％)，对应于75％的校正产率。苄醚9c具有Rf 0.6(Tol/EtOAc 7:3)。1H NMR(CDCl3)δ7.36-7.28(m,5H,HAr),7.08(d,1H,JNH,2＝7.0Hz,NH),5.91-5.81(m,1H,CHAll),5.28-5.24(mpo,1H,CH2All),5.19-5.16(mpo,1H,CH2All),4.93(d,1H,J1,2＝8.6Hz,H-1),4.70(d,1H,J＝10.8Hz,CH2Bn),4.62(d,1H,CH2Bn),4.50(dd,1H,J2,3＝10.6Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3),4.35-4.30(mpo,1H,CH2All),4.09-4.04(mpo,1H,CH2All),3.75(brd,1H,H-4),3.69-3.59(mpo,2H,H-2,H-5),1.35(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6)。13C NMR(CDCl3)δ162.0(CONHTCA),137.0(Cq,Ar),133.6(CHAll),128.6,128.3(CAr),117.9(CH2All),97.7(C-1,1JC,H＝163Hz),92.4(CCl3),76.1(C-3),72.6(CH2Bn),70.2(CH2All),69.0(C-5),63.0(C-4),56.0(C-2),17.6(C-6)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C18H25Cl3N5O4计算480.0967；实测480.0967。
4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-α/β-D-半乳吡喃糖(10c)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]PF6(200mg,237μmol,0.03当量)溶解在无水THF(10mL)中，在H2气氛下搅拌30分钟。将所得的黄色溶液用Ar反复脱气，使用套管转移到烯丙基糖苷9c(3.65g,7.89mmol,1.0当量)的无水THF(70mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，TLC分析(Tol/EtOAc85:15)显示起始物完全消失，并且存在极性稍小的点。加入在THF/H2O(1:1,20mL)中的NIS(2.1g,9.47mmol,1.2当量)。在室温搅拌1小时后，TLC分析(Tol/EtOAc 7:3)显示异构化中间体被完全消耗，并且存在更大极性的点。加入10％Na2SO3水溶液，蒸发挥发物。将水相用DCM(100mL)萃取三次。将合并的有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 80:20→70:30)纯化残余物，获得预期的α/β-半缩醛10c(3.1g,7.34mmol,93％)，为白色松软固体。半缩醛10c具有Rf 0.5,0.2(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C15H21Cl3N5O4计算440.0654；实测440.0652。
4-叠氮基-3-O-苄基-2,4,6-三脱氧-2-三氯乙酰胺基-α/β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(11c)。将半缩醛10c(3.0g,7.10mmol,1.0当量)溶解在丙酮(35mL)中。加入PTFA-Cl(1.46mL,9.24mmol,1.3当量)，然后加入Cs2CO3(2.7g,8.53mmol,1.2当量)。在室温搅拌2小时后，将反应混合物过滤，用丙酮洗涤，将滤液减压浓缩。将粗的供体通过短硅胶柱(cHex/EtOAc 90:10)纯化，获得PTFA供体11c，为α/β-异构体的混合物(3.9g,6.57mmol,92.5％)。α-异构体具有Rf 0.7(Tol/EtOAc9:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.44-7.35(m,5H,HAr),7.32-7.24(m,2H,HAr),7.14-7.11(ttpo,1H,HAr),6.79(d,2H,J＝7.6Hz,HAr),6.46(d,1H,J2,NH＝7.7Hz,NH),6.39(brs,1H,H-1),4.82(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.62(dpo,1H,CH2Bn),4.59-4.53(mpo,1H,H-2),4.07-4.05(mpo,1H,H-5),3.99-3.96(mpo,2H,H-3,H-4),1.36(d,1H,J5,6＝6.0Hz,H-6)。13C NMR(CDCl3)δ161.8(CONHTCA),142.9,135.5(Cq,Ar),129.3,128.9,128.8,128.5,128.1,126.3,124.6,120.5,119.2(CAr),119.2(CF3),94.1(C-1,1JC,H＝191Hz),92.1(CCl3),75.0(C-3),71.6(CH2Bn),67.7(C-5),61.9(C-4),50.2(C-2),17.4(C-6)。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C23H21Cl3F3N5O4Na计算616.0503；实测616.0496。
烯丙基4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(12c)。将PTFA供体11c(3.4g,5.73mmol,1.0当量)和受体7(4.99g,5.73mmol,1.0当量)混合，真空干燥。将干燥的物质溶解在无水DCM(100mL)中，与新活化的MS(6.0g)在Ar气氛下在室温搅拌30分钟。将反应混合物冷却至-30℃，加入TMSOTf(51μL,287μmol,0.05当量)。在-30℃持续40分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc 4:1)显示不存在PTFA供体且存在新点。加入Et3N，15分钟后，过滤混悬液，蒸发挥发物。快速色谱法(Tol/ACN 90:10→88:12)获得期望的三糖12c(3.8g,3.1mmol,52％)，为白色固体。以及不期望的α-异构体(2.6g,3.64mmol,35％)。期望的产物12c具有Rf 0.4(Tol/ACN 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.43-7.15(m,15H,HAr),7.05(d,1H,J2,NH＝7.1Hz,NHB1),6.76(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.51(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHA),5.89-5.80(m,1H,CHAll),5.31-5.18(mpo,4H,CH2All,CH2Bn-6),5.17(dpo,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A),4.90(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B1),4.78(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.73(d,1H,J4,5＝2.7Hz,H-5A),4.68-4.62(mpo,3H,CH2Bn,H-3B),4.54(ddpo,1H,J2,3＝10.6Hz,J4,5＝3.4Hz,H-3B1),4.47(ddpo,2H,J＝12.6Hz,CH2Bn),4.33-4.29(mpo,2H,H-4A,CH2All),4.05-4.01(mpo,1H,CH2All),3.95-3.86(mpo,3H,H-2A,H-3A,H-4B),3.66(d,1H,J3,4＝3.4Hz,H-4B1),3.61-3.46(mpo,4H,H-2B,H-2B1,H-5B,H-5B1),1.30(d,3H,J5,6＝6.2Hz,H-6B1),1.27(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.2(C-6A),162.0,161.9,161.6(CONHTCA),137.1,137.0,135.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.0(2C),128.8,128.7,128.6,128.3(3C),125.3(CAr),117.9(CH2All),99.0(C-1B1,1JC,H＝165Hz),98.2(C-1A,1JC,H＝169Hz),97.8(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.5,92.3(3C,CCl3),75.5(C-3B1),75.2(C-5A),74.8(C-3B),73.0(C-3A),72.7(CH2Bn),72.4(CH2Bn),71.8(C-4A),70.0(CH2All),69.0(C-5B),68.8(C-5B1),67.5(CH2Bn-6),65.4(C-4B),63.0(C-4B1),55.8,55.6(2C,C-2B,C-2B1),54.1(C-2A),17.5,17.3(2C,C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C48H54Cl9N10O13计算1293.1063；实测1293.1068。
4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖(13c)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(123mg,145μmol,0.05当量)溶解在无水THF(8mL)中，在H2气氛下搅拌20分钟。将所得的黄色溶液用连续的Ar气流脱气，倒入烯丙基糖苷12c(3.7g,2.90mmol,1.0当量)的无水THF(50mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，加入在THF/H2O中的NIS(783mg,3.48mmol,1.2当量)。在室温再搅拌1小时后，加入10％亚硫酸钠水溶液直至完全脱色。蒸发挥发物，将水相用DCM(50mL)萃取三次。将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc75:25→60:40)纯化，获得α/β半缩醛13c(3.3g,2.67mmol,92％)，为白色固体。α/β-端基异构体具有Rf 0.5,0.25(Tol/EtOAc 75:25→60:40)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C45H50Cl9N10O13计算1257.0713；实测1253.0750。
4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(14c)。将PTFACl(550μL,3.47mmol,1.3当量)和Cs2CO3(1.04g,3.20mmol,1.2当量)加入到溶解于丙酮(27mL)中的半缩醛13c(3.3g,2.67mmol,1.0当量)中。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，用丙酮(5mL)洗涤两次。减压浓缩滤液，将粗的PTFA供体通过短硅胶块纯化(cHex/EtOAc 75:25→65:35)。分离α/β-PTFA供体14c，为固体(3.25g,2.31mmol,两步86％)。PTFA供体具有Rf 0.75,0.8(Tol/EtOAc 7:3)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C53H54Cl9F3N11O13计算1424.1046；实测1424.1029。
烯丙基4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(15c)。将PTFA三糖14c(1.0g,711μmol,1.0当量)和二糖受体7(619mg,711mmol,1.0当量)与在无水DCE(17mL)中新活化的MS(1.0g)在Ar气氛下在室温搅拌1小时。在冷却至-10℃后，加入TMSOTf(7.7μL,43μmol,0.06当量)并继续搅拌45分钟，同时反应浴温保持在-10℃。完成后，加入Et3N(～10μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(6mL)洗涤三次。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 90:10→86:14)纯化，获得五糖15c，为白色固体(1.2g,574μmol,84％)。偶联产物15c具有Rf 0.55(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C78H83Cl15Cl4N15O22计算2114.1070；实测2114.1078。
1H NMR(CDCl3)δ7.41-7.17(m,25H,HAr),7.11(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB2),7.02(d,1H,J2,NH＝6.7Hz,NHB1),6.76(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.49(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHA1),6.44(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHA),5.89-5.80(m,1H,CHAll),5.36(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn-6),5.28-5.22(mpo,3H,CH2All,CH2Bn-6),5.20-5.15(mpo,3H,CH2All,CH2Bn-6,H-1A),5.02(d,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A1),4.94(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B2),4.88(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1B1),4.81(ddpo,J2,3＝10.6Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3B1),4.78(dpo,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.72(dpo,1H,J4,5＝2.7Hz,H-5A),4.68(dpo,1H,J4,5＝2.6Hz,H-5A1),4.67-4.63(mpo,3H,H-3B,CH2Bn),4.58(ddpo,1H,J2,3＝10.6Hz,J3,4＝3.4Hz,H-3B2),4.51(d,1H,J＝12.2Hz,CH2Bn),4.45-4.40(mpo,3H,CH2Bn),4.34-4.28(mpo,2H,CH2All,H-4A1),4.21(tpo,1H,H-4A),4.06-4.00(mpo,1H,CH2All),3.98-3.94(mpo,1H,H-2A1),3.91(brd,1H,J3,4＝3.4Hz,H-4B),3.87-3.85(mpo,3H,H-2A,H-3A,H-4B1),3.81(dd,1H,J2,3＝10.5Hz,J3,4＝2.5Hz,H-3A1),3.66(brd,1H,J3,4＝3.0Hz,H-4B2),3.62-3.39(mpo,6H,H-2B1,H-2B2,H-2B3,H-5B1,H-5B2,H-5B3),1.30(d,1H,J5,6＝6.2Hz,H-6B),1.27(d,1H,J5,6＝6.4Hz,H-6B),1.22(d,1H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.2,168.1(C-6A),162.1,161.9,161.5(5C,CONHTCA),137.1,137.0,135.1,135.0(Cq,Ar),133.5(CHAll),129.1(2C),129.0,128.9,128.2,(2C)(CAr),117.9(CH2All),99.0(C-1B2,1JC,H＝166Hz),98.6(C-1B1,1JC,H＝166Hz),98.4(C-1A1,1JC,H＝16Hz),98.0(C-1A,1JC,H＝168Hz),97.8(C-1B,1JC,H＝162Hz),92.5,92.4,92.3(5C,CCl3),75.4(C-5A,C-5A1,C-3B2),74.6(C-3B),73.6(C-3B1),72.8(2C,C-3A,C-3A1),72.4(2C,CH2Bn),72.1(CH2Bn),71.9(C-4A1),71.7(C-4A),70.0(CH2All),69.3,68.7(C-5B,C-5B1,C-5B2),67.5,67.5(2C,CH2Bn-6),65.5(C-4B),65.3(C-4B1),63.1(C-4B2),55.9,55.8,55.6(C-2B,C-2B1,C-2B2),54.2,53.8(C-2A,C-2A1),17.5,17.3,17.2(C-6B,C-6B1,C-6B2)。
4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖(16c)。将[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(22mg,26μmol,0.05当量)溶解在无水THF(6mL)中，在H2气氛下搅拌40分钟。将所得的黄色溶液用连续的Ar气流脱气10分钟，倒入烯丙基糖苷15c(1.1g,527μmol,1.0当量)的无水THF(5.0mL)溶液中。在室温搅拌2小时后，加入NIS(142mg,632μmol,1.2当量)。在室温继续搅拌1小时后，用10％亚硫酸钠水溶液淬灭反应。将挥发物真空去除，将水相用DCM(3×20mL)萃取。将有机相合并，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。通过快速色谱法(Tol/EtOAc 70:30→60:40)纯化，获得预期的α/β-半缩醛16c(1.0g,488μmol,92％)，为白色固体。α/β-端基异构体具有Rf 0.55,0.7(Tol/EtOAc1:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C75H79Cl15N15O22计算2066.0847；实测2066.0888。
4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(17c)。将半缩醛16c(1.0g,488μmol,1.0当量)溶解在丙酮(6.0mL)中。加入PTFACl(100μL,635μmol,1.3当量)和Cs2CO3(191mg,586μmol,1.2当量)。在室温搅拌2小时后，将反应混合物经硅藻土垫过滤，将固体用丙酮(6mL)洗涤两次。减压浓缩滤液，将粗的PTFA供体通过短硅胶块用cHex/EtOAc(70:30→50:50)洗脱来纯化。合并对应于产物的级分，获得预期的PTFA供体17c，为α/β-异构体的混合物(920mg,415μmol,85％)。HRMS(ESI+):C83H83Cl15F3N16O22计算2239.1121；实测2239.11185。
3-叠氮丙基4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(18c)。将PTFA供体14c(1.1g,782μmol,1.0当量)和3-叠氮基-1-丙醇(144μL,1.56mmol,2.0当量)与在无水DCE(15.6mL)中的新活化的MS(1.0g)在Ar气氛下在室温搅拌1小时。在冷却至-15℃后，加入TMSOTf(10μL,55μmol,0.07当量)并继续搅拌45分钟，同时反应浴温保持在-15℃。完成后，加入Et3N(～12μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(10mL)洗涤两次。对残余物进行快速色谱法(Tol/ACN 90:10→88:12)，获得叠氮丙基三糖18c，为白色固体(875mg,663μmol,85％)。偶联产物18c具有Rf 0.45(Tol/ACN 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.43-7.17(m,15H,HAr),7.01(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NH),6.74(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NH),6.51(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NH),5.30-5.19(mpo,3H,CH2Bn-6,H-1A),4.86(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B1),4.73(dpo,1H,J4,5＝2.5Hz,H-5A),4.70(dpo,1H,J1,2＝8.1Hz,H-1B),4.64(ddpo,2H,J＝11.2Hz,CH2Bn),4.56(dd,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝3.6Hz,H-3B),4.50-4.43(mpo,3H,H-3B1,CH2Bn),4.29(t,1H,J＝2.2Hz,H-4A),3.94-3.85(mpo,4H,OCH2,H-2A,H-3A,H-4B),3.66(d,1H,J3,4＝2.8Hz,H-4B1),3.64-3.50(mpo,4H,OCH2,H-2B,H-2B1,H-5B),3.47(dqpo,1H,H-5B1),3.35(t,2H,J＝6.6Hz,NCH2),1.88-1.76(m,2H,CH2),1.29(d,6H,J5,6＝6.4Hz,H-6B,H-6B1)。13C NMR(CDCl3)δ168.2(C-6A),161.9(3C,CONHTCA),137.1,137.0,135.0(Cq,Ar),129.0,128.8(2C),128.7,128.6,128.3(2C),128.2(CAr),99.1(2C,C-1B1,C-1B,1JC,H＝168Hz,1JC,H＝162Hz),98.0(C-1A,1JC,H＝168Hz),75.6(C-3B1),75.3(C-5A),74.9(C-3B),73.0(C-3A),72.7(CH2Bn),72.5(CH2Bn),71.9(C-4A),69.0,68.9(2C,C-5B,C-5B1),67.6(OCH2),66.3(CH2Bn-6),65.3(C-4B),62.9(C-4B1),55.7,55.3(2C,C-2B,C-2B1),54.1(C-2A),48.1(NCH2),29.0(CH2),17.5,17.3(2C,C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C48H55Cl9N13O13计算1336.1234；实测1336.1229。
3-叠氮丙基4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(19c)。将PTFA供体17c(920mg,415μmol,1.0当量)和3-叠氮基-1-丙醇(76μL,829μmol,2.0当量)与在无水DCE(10mL)中的新活化的MS(600mg)在Ar气氛下在室温搅拌1小时。在冷却至-15℃后，加入TMSOTf(5.0μL,29μmol,0.07当量)并继续搅拌45分钟，同时反应浴温保持在-15℃。完成后，加入Et3N(～10μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM洗涤。蒸发挥发物，将残余物通过快速色谱法(Tol/ACN 90:10→88:12)纯化，获得叠氮丙基五糖19c，为白色固体(785mg,359μmol,88％)。偶联产物19c具有Rf 0.4(Tol/ACN 4:1)。
1H NMR(CDCl3)δ7.34-7.15(m,25H,HAr),7.07(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHB2),7.01(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB1),6.76(d,1H,J2,NH＝7.2Hz,NHB),6.50(d,1H,J2,NH＝6.8Hz,NHA1),6.44(d,1H,J2,NH＝8.0Hz,NHA),5.35(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn-6),5.28-5.17(mpo,4H,H-1A,CH2Bn-6),5.05(d,1H,J1,2＝7.6Hz,H-1A1),4.91(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B2),4.84(d,1H,J1,2＝8.2Hz,H-1B1),4.78(ddpo,J2,3＝10.6Hz,J3,4＝4.0Hz,H-3B1),4.72(dpo,1H,J4,5＝2.6Hz,H-5A1),4.70(dpo,J1,2＝8.0Hz,H-1B),4.69(dpo,1H,J4,5＝2.8Hz,H-5A),4.65(ddpo,2H,CH2Bn),4.58-4.52(mpo,2H,H-3B2,H-3B),4.49-4.40(mpo,4H,CH2Bn),4.31(tpo,1H,J4,5＝J3,4＝2.6Hz,H-4A1),4.21(tpo,1H,H-4A),4.00-3.86(mpo,6H,H-2A,H-2A1,H-3A,H-3A,H-4B,H-4B1,OCH2),3.66(brd,1H,J3,4＝2.8Hz,H-4B2),3.65-3.51(mpo,7H,OCH2,H-2B1,H-2B2,H-2B3,H-5B1,H-5B2,H-5B3),3.36(t,2H,J＝6.6Hz,NCH2),1.88-1.76(mpo,2H,CH2),1.30(d,1H,J5,6＝6.2Hz,H-6B),1.28(d,1H,J5,6＝6.4Hz,H-6B),1.22(d,1H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(CDCl3)δ168.2,168.1(C-6A),162.1,161.9,161.6(5C,CONHTCA),137.1,137.0,135.1,134.9(Cq,Ar),129.1(2C),129.0,128.9,128.8,128.7,128.6(2C),128.5,128.3(2C)(CAr),99.2(C-1B,1JC,H＝161Hz,C-1B2,1JC,H＝163Hz),98.8(C-1B1,1JC,H＝167Hz),98.3(C-1A1,1JC,H＝168Hz),97.8(C-1A,1JC,H＝169Hz),92.5,92.4,92.3(5C,CCl3),75.4(C-5A,C-5A1),74.6(C-3B1),74.6(C-3B,C-3B2),72.9(C-3A,C-3A1),72.7(CH2Bn),72.5(CH2Bn),72.1(CH2Bn),71.9(C-4A1),71.7(C-4A),69.0,68.8,68.8(C-5B,C-5B1,C-5B2),67.5(2C,CH2Bn-6),66.2(OCH2),65.4(C-4B),65.3(C-4B1),63.0(C-4B2),55.8,55.7,55.6(C-2B,C-2B1,C-2B2),54.1,53.8(C-2A,C-2A1),48.1(NCH2),29.0(CH2),17.5,17.3,17.2(C-6B,C-6B1,C-6B2)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C78H84 35Cl11 37Cl4N18O22计算2157.1242实测2157.1284。
实施例11. 4A-末端寡糖的完全脱保护，提供相应的具有氨基丙基接头的寡糖
方案25.具有氨基丙基的宋内志贺菌两性离子二糖至八糖64b至67b的合成。(i)20％Pd(OH)2/C,H2,NaHCO3,2-MeTHF/iPrOH/H2O,对于64b为56％(方法1),(ii)10％Pd/C,H2,NaHCO3,2-MeTHF/iPrOH/H2O,对于66b为41％,对于67b为17％(方法3)。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(64b)。对二糖63b进行氢化介导的完全脱保护(方法1)。因此，将20％Pd(OH)2-C(180mg,3当量)加入到在2-MeTHF/异丙醇/水(1:15:3,v/v/v,39mL)中的完全受保护的二糖63b(100mg,86μmol)中。将混悬液在氢气氛下剧烈搅拌1小时，加入0.6mM NaHCO3水溶液(440μL,3当量)。在氢气氛下再搅拌1小时后，加入更多的NaHCO3(150μL,1当量)(两次)，将反应再进行3小时，此时LC-MS显示反应完成。再加入1当量的NaHCO3(150μL,1当量)，以达到总共6当量。通过0.2μm过滤器过滤混悬液。蒸发挥发物，将残余物通过C-18色谱法用水/ACN 100:0至90:10洗脱来纯化。获得期望的氨基丙基二糖64b，为白色冻干粉末(23mg,48μmol,56％)。游离二糖64b具有RP-HPLC(215nm/ESLD):Rt＝4.1/4.3min(条件A)。1H NMR(D2O)δ4.85(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A),4.41(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.34-4.31(m,2H,H-4A,H-3B),3.98-3.85(m,5H,H-5A,H-2A,H-5B H-2B,OCH2Pr),3.71-3.66(mpo,2H,H-3A,OCH2Pr),3.42(brs,1H,H-4B),3.06(t,2H,J＝6.8Hz,NCH2),2.04,1.99(2s,6H,CH3Ac),1.93(t,J＝6.0Hz,CH2),1.28(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(D2O)δ175.2,174.3(NHCOA,B),174.2(C-6A),101.8(C-1B,1JC,H＝161.2Hz),100.5(C-1A,1JC,H＝165.2Hz),78.3(C-5A),77.2(C-3B),69.7(C-5B),69.0(C-4A),68.3(C-3A),68.0(OCH2Pr),53.6(C-4B),51.7(C-2A),50.7(C-2B),37.6(NCH2),26.8(CH2Pr),22.2(2C,CH3Ac),15.8(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C19H35N4O10计算479.2348；实测479.2346。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(65b)。对叠氮丙基四糖58b进行完全氢化介导的脱保护(方法1)。游离四糖65b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝5.0/5.2min(条件A)。1H NMR(D2O)δ4.90(d,1H,J1,2＝8.0Hz,H-1A),4.81-4.74(mpo,2H,H-1A1,H-1B),4.52-4.46(mpo,3H,H-5A,H-5A1,H-1B1),4.40-4.36(mpo,2H,H-4A,H-4A1),4.18-4.16(m,2H,H-3B,H-3B1),4.10-4.05(m,2H,H-5B,H-5B1),4.01-3.99(mpo,3H,H-4B,H-2A,OCH2Pr),3.90-3.80(m,4H,H-2A,H-4B,H-2B,H-2B1),3.76-3.65(mpo,4H,H-2B,H-3A,H-3A1,OCH2Pr),3.11-3.07(mpo,2H,NCH2),2.06,2.03,2.02,1.98(2s,6H,CH3Ac),1.98-1.91(mpo,2H,CH2),1.33(dpo,6H,J5,6＝6.4Hz,H-6B,H-6B1)。13C NMR(D2O)δ174.9,174.7,174.5,174.4(4C,NHCOA,B),174.1,174.2(2C,C-6A,C-6A1),103.0(C-1B1,1JC,H＝166.0Hz),101.7(C-1B,1JC,H＝162.5Hz),101.1(C-1A,1JC,H＝165.0Hz),100.9(C-1A,1JC,H＝165.5Hz),78.0,77.6(2C,C-5A,C-5A1),77.5(C-4A),76.0,75.7(2C,C-3B,C-3B1),69.3(C-4A),67.5,67.3(2C,C-5B,C-5B1),68.2(OCH2Pr),68.2,67.9(2C,C-3A,C-3A1),54.9,54.8(2C,C-4B,C-4B1),51.6,51.5(2C,C-2A,C-2A1),51.0,50.9(2C,C-2B,C-2B1),37.6(NCH2),26.7(CH2Pr),22.5,22.4(4C,CH3Ac),15.7,15.6(2C,C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C35H60N7O19计算882.3938,实测882.3929。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(66b)。方法3：将六糖60b(111mg,4.1μmol)溶解在2-MeTHF(2.0mL)中，在2-MeTHF/iPrOH/H2O(1:10:1v/v/v,50mL)中稀释至0.26mM每重复单元。将溶液脱气，加入10％Pd/C(220mg)。将混悬液在氢气氛下剧烈搅拌4小时，此时加入10％Pd/C(220mg)和1MNaHCO3水溶液(25μL,30μmol,7当量)。在40小时后，加入10％Pd/C(220mg)，将混悬液在氢气氛下搅拌3天，此时RP-HPLC和HRMS对照表明存在期望的化合物，并且不存在任何主要的氯化中间体。将混悬液通过硅藻土垫过滤，将固体用水彻底洗涤。蒸发挥发物，将水相冻干，将残余物溶解于水(2.0mL)中。通过加入1M NaHCO3水溶液将pH调节到6，通过0.2μm过滤器过滤，将滤液冻干。对粗物质进行RP-HPLC纯化(在0.08％TFA中的ACN 0→18％)，获得期望的氨基丙基六糖66b(22mg,17μmol,41％)，为白色冻干粉末。游离的六糖66b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝6.6/6.7min(条件A),Rt＝6.0/6.1min(条件E)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C51H85N10O28计算1285.5529；实测1285.5510,m/z[M+2H]2+C51H86N10O28计算643.2801；实测643.2792。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(67b)。方法3：将八糖61b(77mg,2.2μmol)溶解在2-MeTHF(1.5mL)中，在2-MeTHF/iPrOH/H2O(1:10:1v/v/v,27mL)中稀释至0.19mM每重复单元。将溶液脱气，加入10％Pd/C(164mg,7当量)。将混悬液在氢气氛下剧烈搅拌4小时，此时加入10％Pd/C(164mg,7当量)和1M NaHCO3水溶液(18μL,18μmol,8当量)。在40小时后，加入10％Pd/C(164mg,7当量)，将混悬液在氢气氛下搅拌3天，此时RP-HPLC和HRMS对照表明存在期望的化合物和少量的单氯化中间体。将混悬液通过硅藻土垫过滤，将固体用水彻底洗涤。蒸发挥发物，将水相冻干。将残余物溶解于水(2.0mL)中，通过0.2μm过滤器过滤，将滤液冻干。对在水(2.5mL,pH 5)中的粗物质(53mg)进行RP-HPLC纯化(在0.08％TFA中的ACN 0→18％)，获得期望的氨基丙基八糖67b(6.5mg,3.8μmol,17％)，为白色冻干粉末。游离的八糖67b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝7.6/7.8min(条件A),Rt＝6.2/6.4min(条件D)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C67H111N13O37计算844.8596；实测844.8588,m/z[M+3H]3+C67H112N13O37计算563.5755；实测563.5750。
实施例12.氨基丙基接头修饰成可缀合的寡糖
-使用SAMA或SPDP的接头修饰：掩蔽的巯基的化学选择性引入
方案26.可缀合的宋内志贺菌两性离子二糖至八糖68b至72b的合成。(i)S-乙酰硫代乙醇酸五氟苯酯,ACN/磷酸盐缓冲液pH 6.2(1:13),对于68b为39％,(ii)3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯,DMSO/磷酸盐缓冲液pH 6.2(1:10),对于69b为52％,对于70b为35％,对于71b为46％(校正64％),对于72b为24％。
3-(2-甲硫基乙酰基)乙基氨基)-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(68b)。将氨基丙基寡糖64b(3.1mg,6.5μmol,1.0当量)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(800μL)中。将在ACN(60μL)中的S-乙酰硫代乙醇酸五氟苯酯(1.94mg,6.5μmol,1.0当量)在2小时中分批加入到在室温搅拌的反应混合物中。通过RP-HPLC和LCMS分析监测进程。由于一些起始材料在2.5小时后仍然可见，因此将反应在室温过夜。通过RP-HPLC纯化(在20分钟内0至20％梯度，在230nm处进行UV检测)并重复冻干所收集的相关级分，获得二糖68b(1.5mg,39％)，为冻干粉末。期望的具有接头的产物二糖68b具有RP-HPLC(215nm/ESLD):Rt＝8.84/8.98min(条件D)。1HNMR(D2O)δ4.87(d,1H,J1,2＝8.7Hz,H-1A),4.50(brs,1H,H-5A),4.44(d,1H,J1,2＝8.6Hz,H-1B),4.36(brs,1H,H-4A),4.12(dd,1H,J2,3＝10.4Hz,J3,4＝4.0Hz,H-3B),4.04(qpo,1H,J5,6＝6.4Hz,H-5B),3.98-3.92(mpo,1H,H-2A),3.93(brd,1H,H-4B),3.89-3.83(mpo,1H,OCH2Pr),3.81-3.76(tpo,1H,H-2B),3.66(ddpo,1H,H-3A),3.61(brs,2H,CH2,SAc),3.61-3.56(mpo,2H,OCH2Pr),3.27-3.12(m,2H,NCH2),2.39(SCH3),2.01,1.98(2s,6H,CH3Ac),1.72(tpo,J＝6.4Hz,CH2Pr),1.28(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C23H39N4O12S计算595.2280；实测595.2270。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C23H38N4O12SNa计算617.2099；实测617.2087。
引入-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺部分的一般程序：将氨基丙基寡糖(1-10mg,1.0当量)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(1.0mg/100-300μL)中。加入在DMSO(～1mg在10μL中)中的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(1.0当量)。将反应混合物在室温搅拌6至16小时。通过RP-HPLC和LCMS分析监测进程。完成时，将期望的产物通过RP-HPLC使用在0.08％TFA水溶液中的ACH的梯度作为洗脱液纯化。基于NMR和HRMS分析确认产物。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(69b)。对溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(3.1mL)中的二糖64b(15mg,31μmol,1.0当量)进行区域选择性酰胺化。加入SPDP(990μg，31μmol，1.0当量)，将反应混合物搅拌6小时。对粗物质进行RP-HPLC，获得酰胺69b(5.1mg,24％)，为白色冻干固体。具有接头的二糖69b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝11.9/12.1min(条件D)。1H NMR(D2O)δ8.55(d,1H,J＝5.2Hz,HAr),8.20(t,1H,J＝4.0Hz,HAr),8.07(d,1H,J＝8.4Hz,HAr),7.62(t,1H,J＝6.4Hz,HAr),4.87(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A),4.54(brs,1H,H-5A),4.45(d,1H,J1,2＝8.6Hz,H-1B),4.36(brs,1H,H-4A),4.13(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝4.0Hz,H-3B),4.02(qpo,1H,J5,6＝6.4Hz,H-5B),3.96(tpo,1H,J＝8.6Hz,H-2A),3.91(brd,1H,H-4B),3.87-3.83(mpo,1H,OCH2),3.77(t,1H,H-2B),3.67(ddpo,1H,H-3A),3.60-3.54(m,1H,OCH2),3.21-3.09(m,2H,NCH2),3.11(t,2H,J＝6.8Hz,COCH2),2.65(t,2H,SCH2),2.00,1.97(2s,6H,CH3Ac),1.71(t,2H,J＝6.8Hz,CH2),1.28(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6B)。13C NMR(D2O)δ174.6,174.0(NHCOA,B),173.4(NHCO),173.1(C-6A),156.7(CAr,q),144.7,143.4,124.4,12.4(CAr),101.5(C-1B,1JC,H＝161.4Hz),101.0(C-1A,1JC,H＝165.2Hz),76.7(C-5A),76.2(C-3B),68.6(C-4A),68.0(OCH2Pr),67.9(C-3A),67.3(C-5B),54.7(C-4B),51.4(C-2A),50.8(C-2B),36.2(NCH2),34.5(SCH2),34.2(COCH2),28.3(CH2Pr),22.2(2C,CH3Ac),15.5(C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C27H42N5O11S2计算676.2317；实测676.2292。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(70b)。将粗的四糖65b(20μmol，来自58b的理论值)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH6.2(4.5mL)中，并在室温剧烈搅拌。经2小时分批加入SPDP(4.7mg,15μmol,0.75当量)的DMSO(50μL)溶液。搅拌过夜后，加入更多的在DMSO(50μL)中的SPDP(4.7mg,15μmol,0.75当量)，将反应混合物再搅拌6小时。将总体积的四分之一通过RP-HPLC纯化。获得酰胺70b(5.1mg,来自58b为24％)，为白色冻干固体。具有接头的四糖70b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝10.7/10.8min(条件E)。1H NMR(D2O)δ8.56(d,1H,J＝5.2Hz,HAr),8.23(t,1H,J＝8.0Hz,HAr),8.09(d,1H,J＝8.8Hz,HAr),7.65(t,1H,J＝6.4Hz,HAr),4.87(d,1H,J1,2＝8.2Hz,H-1A),4.78-4.75(mpo,2H,H-1A1,H-1B),4.63(brs,1H,),4.57(brs,1H,H-5A1),4.44-4.42(mpo,2H,H-5A,H-1B1),4.37(dpo,1H,H-4A),4.16-4.10(m,2H,H-3B),4.04-4.00(m,2H,H-5B,H-5B1),3.97-3.95(mpo,1H,H-2A),3.91(brs,1H,H-4B),3.88-3.66(mpo,7H,H-2A,H-2B,H-2B1,H-3A,H-3A1,H-4B,OCH2Pr),3.58-3.56(mpo,1H,OCH2Pr),3.19-3.10(mpo,4H,NCH2,COCH2-接头),2.64(t,J＝6.4Hz,SCH2),2.06,1.99,1.95(3s,12H,CH3Ac),1.71-1.68(mpo,2H,CH2),1.29(dpo,6H,J5,6＝6.2Hz,H-6B)。13C NMR(D2O)δ174.6,174.4,173.9(4C,NHCOA,B),173.3(NHCO接头),172.9,172.7(C-6A),162.7(CAr,q),156.5,144.3,143.8,124.5,123.5(CAr),102.9(C-1B1,1JC,H＝166.4Hz),101.6(C-1B,1JC,H＝162.8Hz),101.0(2C,C-1A,C-1A1,1JC,H＝166.0Hz,167.0Hz),76.8,76.6(3C,C-4A,C-5A,C-5A1),76.0,75.9(2C,C-3B,C-1B1),68.5(C-4A),68.0(OCH2Pr),67.8,67.6(2C,C-5B)C-1B1),67.4,67.3(2C,C-3A,C-3A1),54.8,54.7(2C,C-4B,C-4B1),51.5,51.3(2C,C-2A,C-1A1),50.9,50.8(2C,C-2B,C-1B1),36.2(NCH2),34.4(SCH2),34.2(COCH2),28.3(CH2Pr),22.3,22.2(4C,CH3Ac),15.6,15.5(2C,C-6B,C-1B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C43H67N8O20S2计算1079.3908,实测1079.3873。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(71b)。将六糖66b(5.1mg,3.97μmol,1.0当量)的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(1.0mL)溶液在室温剧烈搅拌，将琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP,1.25mg,3.97μmol,1.0当量)的DMSO(30μL)溶液分批加入到其中(10μL每30分钟)。在室温搅拌2小时以后，加入更多的在DMSO(10μL)中的SPDP(0.4mg,0.3当量)，将反应混合物在室温再搅拌1.5小时，然后在4℃过夜。将反应混合物通过RP-HPLC纯化(0→40％在0.08％TFA水溶液中的ACN，经20分钟)然后冻干，获得具有接头的六糖71b(2.7mg,1.82μmol,46％)和一些剩余的氨基丙基糖苷66b(1.45mg,1.13μmol)，达到64％的校正产率。期望的71b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝11.3/11.4min(条件D)。1H NMR(D2O,800MHz)δ8.56(dd,1H,J＝5.8,<1.0Hz,HAr),8.23(dt,1H,J＝8.0,1.6Hz,HAr),8.07(d,1H,J＝8.2Hz,HAr),7.64(mpo,1H,J＝6.4Hz,HAr),4.83(d,1H,J1,2＝8.3Hz,H-1A2),4.73-4.66(峰与HOD重叠,4H,H-1A1,H-1A,H-1B2,H-1B1),4.62-4.60(mpo,2H,H-5A1,H-5A),4.54(d,1H,J4,5＝2.2Hz,H-5A2),4.41(tpo,1H,J3,4＝J4,5＝2.5Hz,H-4A1),4.40(tpo,1H,J3,4＝J4,5＝2.6Hz,H-4A),4.38(dpo,1H,J1,2＝8.5Hz,H-1B),4.33(tpo,1H,J3,4＝J4,5＝2.7Hz,H-4A2),4.11-4.06(mpo,3H,H-3B2,H-3B1,H-3B),4.00-3.96(m,3H,H-5B2,H-5B1,H-5B),3.93(dd,1H,J2,3＝10.6Hz,J1,2＝8.4Hz,H-2A2),3.87(d,1H,J3,4＝4.4Hz,H-4B),3.83-3.75(mpo,7H,H-2A1,H-2A,H-2B2,H-2B1,H-4B2,H-4B1,OCH2Pr),3.72(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,J1,2＝8.8Hz,H-2B),3.70-3.68(mpo,2H,H-3A1,H-3A),3.62(dd,1H,J2,3＝10.8Hz,J3,4＝3.1Hz,H-3A2),3.53-3.50(mpo,1H,OCH2Pr),3.14-3.11(m,1H,NCH2),3.08-3.05(mpo,1H,NCH2),3.07(tpo,2H,J＝6.6Hz,COCH2-接头),2.60(t,2H,J＝6.6Hz,SCH2-接头),1.96,1.95,1.94,1.91,1.90(6s,18H,CH3Ac),1.68-1.63(m,2H,CH2Pr),1.26-1.24(mpo,9H,H-6B2,H-6B1,H-6B)。13C NMR(D2O,800MHz)δ174.6,174.4,174.4,173.9,173.3(NHCOA,B),173.3(NHCO接头),172.7,172.5,172.4(C-6A),162.8(CAr,q),156.5,144.1,143.8,124.6,123.6(CAr),102.9(C-1B2,1JC,H＝165Hz),102.9(C-1B1,1JC,H＝166Hz),101.5(C-1B,1JC,H＝163Hz),101.1(C-1A2,1JC,H＝166Hz),101.0(C-1A,1JC,H＝166Hz),101.0(C-1A1,1JC,H＝168Hz),76.7,76.6(2C,C-4A,C-4A1),76.5,76.4(3C,C-5A2,C-5A1,C-5A),76.0,75.8(3C,C-3B2,C-3B1,C-3B),68.4(C-4A2),67.9(OCH2Pr),67.8,67.5(3C,C-3A2,C-3A1,C-3A),67.3,67.2(3C,C-5B2,C-5B1,C-5B),54.8(3C,C-4B2,C-4B1,C-4B),51.4,51.2(3C,C-2A2,C-2A1,C-2A),50.9,50.8(3C,C-2B2,C-2B1,C-2B),36.1(NCH2),34.4(SCH2),34.2(COCH2),28.2(CH2Pr),22.2,22.1(6C,CH3Ac),15.5(3C,C-6B2,C-6B1,C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C59H93N11O29S2计算741.7786；实测741.7782。HRMS(ESI+):m/z[M+3H]3+C59H94N11O29S2计算494.8548；实测494.8546。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(72b)。将八糖67b(5.1mg,3.0μmol,1.0当量)的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.4(1.0mL)溶液在室温剧烈搅拌，将琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP,950μg,3.0μmol,1.0当量)的DMSO(30μL)溶液分批加入到其中(10μL每30分钟)。在室温搅拌3小时以后，加入更多的在DMSO(5.0μL)中的SPDP(90μg,0.3当量)，将反应混合物在室温再搅拌30分钟。RP-HPLC纯化(0→40％在0.08％TFA水溶液中的ACN，经20分钟)然后冻干，获得具有接头的八糖72b(2.3mg,1.82μmol,41％)和一些剩余的氨基丙基糖苷67b(2.0mg,1.16μmol)，达到67％的校正产率。期望的72b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝11.0/11.2min(条件D)。1H NMR(D2O,800MHz)δ8.56(d,1H,J＝5.8Hz,HAr),8.15(ttpo,1H,J＝8.0Hz,HAr),8.01(d,1H,J＝8.4Hz,HAr),7.56(ttpo,1H,J＝6.0Hz,HAr),4.83(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1A3),4.74-4.66(峰重叠,6H,H-1A2,H-1A1,H-1A,H-1B3,H-1B2,H-1B1),4.56-4.55(mpo,3H,H-5A2,H-5A1,H-5A),4.54(brs,1H,H-5A3),4.40-4.38(mpo,4H,H-4A2,H-4A1,H-4A,H-1B),4.33(t,1H,J3,4＝J4,5＝2.5Hz,H-4A3),4.11-4.06(mpo,4H,H-3B3,H-3B2,H-3B1,H-3B),4.00-3.96(mpo,4H,H-5B3,H-5B2,H-5B1,H-5B),3.93(dd,1H,J2,3＝10.7Hz,J1,2＝8.5Hz,H-2A3),3.87(d,1H,J3,4＝4.4Hz,H-4B),3.83-3.74(mpo,10H,H-2A2,H-2A1,H-2A,H-2B3,H-2B2,H-2B1,H-4B3,H-4B2,H-4B1,OCH2Pr),3.72(dd,1H,J2,3＝11.0Hz,J1,2＝8.9Hz,H-2B),3.69-3.67(mpo,3H,H-3A2,H-3A1,H-3A),3.62(dd,1H,J2,3＝10.6Hz,J3,4＝2.9Hz,H-3A3),3.54-3.51(mpo,1H,OCH2Pr),3.14-3.11(m,1H,NCH2),3.08-3.04(mpo,1H,NCH2),3.06(tpo,2H,J＝6.3Hz,COCH2-接头),2.60(t,2H,J＝6.4Hz,SCH2-接头),1.96,1.95,1.94,1.92,1.91,1.90(8s,24H,CH3Ac),1.67-1.63(m,2H,CH2),1.26-1.24(mpo,12H,H-6B3,H-6B2,H-6B1,H-6B)。13C NMR(D2O,800MHz)δ174.6,174.4,174.4,174.1(8C,NHCOA,B),173.3(NHCO接头),173.2,172.9,172.4(4C,C-6A),162.8(CAr,q),156.8,144.8,143.1,124.0,123.3(CAr),103.0(C-1B3,1JC,H＝165Hz),102.9(C-1B2,C-1B1,1JC,H＝165Hz,166Hz),101.6(C-1B,1JC,H＝163Hz),101.1(C-1A3,1JC,H＝165Hz),101.0(3C,C-1A2,C-1A1,C-1A,1JC,H＝166Hz,168Hz),76.9(3C,C-4A2,C-4A1,C-4A),76.8,76.7(4C,C-5A3,C-5A2,C-5A1,C-5A),76.0,75.7,75.6(4C,C-3B3,C-3B2,C-3B1,C-3B),68.6(C-4A3),68.2(OCH2Pr),67.9,67.8,67.6(4C,C-3A3,C-3A2,C-3A1,C-3A),67.3,67.2(4C,C-5B3,C-5B2,C-5B1,C-5B),54.8,54.3(4C,C-4B3,C-4B2,C-4B1,C-4B),51.4,51.3(4C,C-2A3,C-2A2,C-2A1,C-2A),50.9,50.8(4C,C-2B3,C-2B1,C-2B1,C-2B),36.1(NCH2),34.4(SCH2),34.0(COCH2),28.2(CH2Pr),22.2,22.1(8C,CH3Ac),15.5(4C,C-6B3,C-6B2,C-6B1,C-6B)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C75H118N14O38S2计算943.3581；实测943.3567。HRMS(ESI+):m/z[M+3H]3+C75H119N14O38S2计算629.2412；实测629.2402。
实施例13.丙三醇糖苷配基修饰成可缀合的寡糖
-使用PDPH的接头修饰：通过醛中间体化学选择性引入掩蔽的巯基
方案27.通过醛-酰肼偶联合成可缀合的宋内志贺菌两性离子二糖至六糖53e、54e、55e和53f。(i)NaIO4,H2O,室温,黑暗,对于53d为77％,对于54d为89％,(ii)PDPH,水/0.1M磷酸盐缓冲液pH 5.5,对于53e为69％,对于54e为58％,(iii)(+)-生物素酰肼,乙酸盐缓冲液pH 5,10％。
2-氧代乙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-4-O-甲基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(53d)。将二醇53(10.8mg,21.2μmol,1.0当量)溶解在水(2.6mL)中，加入NaIO4水溶液(87mM,246μL,4.58mg,21.2μmol,1.0当量)。将反应混合物在黑暗中在室温搅拌，通过RP-HPLC监测反应进程。2小时后，加入更多的NaIO4水溶液(50μL,930μg,4.3μmol,0.2当量)，因为一些剩余的起始物53仍然可见(RP-HPLC(215nm):Rt＝7.1min(条件A))，在室温继续搅拌30分钟。将粗物质通过RP-HPLC(0→70％在水中的ACN)纯化，获得期望的醛53d(7.9mg,16.5μmol,77％)。二糖53d具有RP-HPLC(215nm):Rt＝6.8min(条件A),Rt＝5.9min(条件E)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C19H39N3O11计算478.2031；实测478.2012。
2-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰亚肼基)乙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-4-O-甲基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(53e)。将醛53d(5.1mg,10.7μmol,1.0当量)溶解在水/0.1M磷酸盐缓冲液pH 5.5(5:1,1.2mL)中，将在DMSO(20μL)中的3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼(PDPH,4.9mg,21.4μmol,2当量)在室温剧烈搅拌3小时，通过RP-HPLC和LCMS监测反应进程。将粗物质通过RP-HPLC(0→70％在水中的ACN)纯化，获得期望的腙53e(5.1mg,7.4μmol,69％)，所述粗物质显示MS(ESI+)为C27H40N6O11S2Na m/z[M+H]+711.2。具有接头的二糖53e具有RP-HPLC(215nm):Rt＝10.0min(条件E)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C27H41N6O11S2计算689.2275,实测689.2270。
2-(生物素-酰肼)-乙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-4-O-甲基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(53f)。将二醇53(2.0mg,3.9μmol,1.0当量)溶解在乙酸盐缓冲液pH 5(1.3mL)中，加入NaIO4水溶液(20mM,195μL,830μg,3.9μmol,1.0当量)。将反应混合物在黑暗中在室温搅拌2小时。加入KCl水溶液(1M,1.5mg,20μL,20μmol,5.1当量)，将反应混合物再搅拌20分钟。加入(+)-生物素酰肼(2.0mg,8.2μmol,2.0当量)，将混合物在室温搅拌48小时。将粗混合物冻干，将残余物通过RP-HPLC纯化。期望的生物素化二糖53f(0.3mg,0.4μmol,10％)具有HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C29H48N7O12S计算718.3076；实测718.3073。
2-氧代乙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(54d)。将二醇54(9.2mg,10.1μmol,1.0当量)溶解在水(1.5mL)中，加入NaIO4水溶液(87mM,139μL,2.58mg,12.1μmol,1.2当量)。将反应混合物在黑暗中在室温搅拌，通过RP-HPLC(条件A)监测反应进程。在2小时后，起始物54(Rt＝8.9min)不存在，观察到新的产物(Rt＝8.4min,MS(ESI+)C35H57N6O20计算:m/z[M+H]+881.3)。将粗物质通过RP-HPLC(0→20％在水中的ACN)纯化，获得期望的醛54d(7.9mg,9.0μmol,89％)。四糖54d具有RP-HPLC(215nm):Rt＝9.8min(条件A)。
2-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰亚肼基)乙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(54e)。将醛54d(4.3mg,4.9μmol,1.0当量)溶解在水/0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.5(4:1,1.0mL)中，将在DMSO(10μL)中的PDPH(2.2mg,21.4μmol,2当量)在室温剧烈搅拌3小时，通过RP-HPLC和LCMS监测反应进程，显示起始物在Rt＝8.0min(条件A)洗脱和产物在Rt＝17.1min(条件A),Rt＝9.9min(条件E)洗脱，MS(ESI+)为C43H66N9O20S2:m/z[M+H]+1092.2,m/z[M+2H]2+546.7。将粗物质通过RP-HPLC(0→70％在水中的ACN)纯化，获得期望的腙54e(3.1mg,2.8μmol,5％)。具有接头的四糖54e具有RP-HPLC(215nm):Rt＝20.3min(条件A),Rt＝12.2/13.2min(条件E，水/乙酸铵缓冲液pH 6.6中的样品)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C43H66N9O20S2计算1092.3860；实测1092.3860,m/z[M+2H]2+C43H67N9O20S2计算546.6966；实测546.6968。
实施例14.以作为载体的破伤风类毒素为例的寡糖-蛋白质缀合物，和通过使用SPDP策略从在其还原末端具有接头的(AB)n寡糖开始的巯基-马来酰亚胺缀合化学
方案28.通过巯基-马来酰亚胺缀合化学从可缀合的二糖至八糖69b至72b开始合成寡糖-蛋白质缀合物。(i)TCEP·HCl,0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1/DMSO 6:1,(ii)GMBS,0.1M HEPES pH 7.5/DMSO 29:1,(iii)a.来自步骤(i)和(ii)的粗物质,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,b.半胱胺·HCl,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,c.在PBS 1X pH 7.2中的缓冲液交换。
缀合步骤的一般方法
尺寸排阻色谱法(SEC)。色谱系统(GE Healthcare Life Sciences)配备高分辨率制备型凝胶Hiload 16/600Superdex 200pg柱，用0.2μm无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水(PBS)x1，pH 7.2，1.0mL/min洗脱用于制备色谱，或者配备Superdex 200Increase3.2/300，用PBS x1，0.05mL/min洗脱用于分析色谱。
缓冲液交换和浓缩。使用具有30kDa MWCO(15分钟，5,000xg，室温)的旋转过滤器(Millipore，Amicon ultra 4和15)进行缓冲液交换和浓缩。对于每次缓冲液交换，进行至少四个连续循环，交换比例为至少15次每个循环。
通过UV检测(λ＝280nm)以缓冲液作为对照估算破伤风类毒素缀合物(ε(TT)＝ε＝189,460M-1.cm-1,mw(TT):150,551D)和CRM 197缀合物((ε(CRM)＝ε＝54,570M-1.cm-1,mw(CRM):58,413D)的蛋白质浓度。
MALDI分析的程序。将蛋白质溶液(20μL)通过ZipTip C4，在MTP 384研磨钢靶板(MTP 384ground steel target plate，Bruker-Daltonics，德国)上洗脱，使用2μL 20mg/mL在含有0.1％TFA水溶液的50％ACN水溶液中的芥子酸作为基质溶液。样品空气干燥15分钟。使用Flexcontrol软件(Bruker-Daltonics，德国)在Bruker UltrafleXtrem仪器上采集数据。在30-210kDa的m/z范围内以正离子线性模式记录10,000次射击。
来自具有巯基的二糖73b的二糖-TT缀合物(78b)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT，150kD，来自Bio Farma(万隆，印度尼西亚)，15.3mg/mL，228μL，3.49mg)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换。将GMBS(1.04mg，3.71μmol，160当量)的DMSO(15μL)溶液加入到所得的TT(23nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩以达到16.8mg/mL的中间体77b的终浓度。
将二糖69b(1.65mg，2.4μmol)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(100μL)中。加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(10μL，672μg，2.34μmol，0.96当量)中的11.4μM溶液，在室温搅拌溶液。通过RP-HPLC(条件D)和HRMS进行监测，显示不存在起始物69b(Rt＝10.0min)，并且存在对应于预期的硫醇73b的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝8.3min(条件E)。观察到硫醇73b在储存时会二聚化，具有HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C44H75N8O22S2计算1131.4437；实测1131.4430。
中间体77b和73b的储备溶液的两个单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH7.2进行缓冲液交换，最后收集。将收集体积调整为1.0mL的体积。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物78b1：来自修饰的TT(77b,89μL,1.5mg,10nmol)和粗硫醇73b(27μL,404μg,185nmol,60当量)的储备溶液。
缀合物78b2：来自修饰的TT(77b,89μL,1.5mg,10nmol)和粗硫醇73b(18μL,269μg,530nmol,40当量)的储备溶液。
缀合物78b3：来自修饰的TT(77b,89μL,1.5mg,10nmol)和粗硫醇73b(18μL,269μg,530nmol,30当量)的储备溶液。
来自具有巯基的四糖74b的四糖-TT缀合物(79b)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT，150kD，1.9mL，6.17mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至860μL(TT的最终浓度:13.2mg/mL)。将GMBS(3.4mg,12.1μmol,160当量)的DMSO(30μL)溶液加入到所得的TT(88μM,76nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩至810μL以达到13.78mg/mL的中间体77b的终浓度。
将四糖70b(3.68mg,3.41μmol)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(300μL)中。加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)在DMSO(53μL,980μg,3.41μmol,1.0当量)中的64mM溶液，在室温搅拌溶液。通过RP-HPLC(条件D/E)和HRMS进行监测，显示不存在起始物70b(Rt＝11.2/10.7min)，并且存在对应于预期的硫醇74b的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm):Rt＝8.6min(条件D),Rt＝8.3min(条件E)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C38H63N7O20S计算970.3921；实测970.3917。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C38H62N7O20SNa计算992.3741；实测992.3735。
中间体77b和74b的储备溶液的两个单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH7.2进行缓冲液交换，最后收集。将收集体积调整为1.0mL的体积。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物79b1：来自修饰的TT(77b,145μL,2.0mg,13.3nmol)和粗硫醇74b(29.5μL,287nmol,21.6当量)的储备溶液。
缀合物79b2：来自修饰的TT(77b,72.6μL,1.0mg,6.6nmol)和粗硫醇74b(27.1μL,264nmol,40当量)的储备溶液。
缀合物79b3：来自修饰的TT(77b,72.6μL,1.0mg,6.6nmol)和粗硫醇74b(40.1μL,396nmol,60当量)的储备溶液。
作为达到14.94mg/mL的中间体77b的最终浓度的另一个实验的一部分，获得缀合物79b4和79b5。
缀合物79b4：来自修饰的TT(77b,89μL,1.3mg,8.7nmol)和粗硫醇74b(31μL,261nmol,30当量)的储备溶液。
缀合物79b5：来自修饰的TT(77b,89μL,1.3mg,8.7nmol)和粗硫醇74b(剩余储备)的储备溶液。
来自具有巯基的六糖75b的六糖-TT缀合物(80b)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT，150kD，1.9mL，6.17mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至860μL(TT的最终浓度:13.2mg/mL)。将GMBS(3.4mg,12.1μmol,160当量)的DMSO(30μL)溶液加入到所得的TT(88μM,76nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩至810μL以达到13.78mg/mL的中间体77b的终浓度。
将六糖71b(2.8mg,1.89μmol)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(189μL)中。加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)在DMSO(30μL,540μg,1.89μmol,1.0当量)中的64mM溶液，在室温搅拌溶液。在1小时后，通过RP-HPLC(条件D)和HRMS进行监测，显示不存在起始物71b(Rt＝11.3min)，并且存在对应于预期的硫醇75b的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm):Rt＝8.6min(条件D)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C54H90N10O29S计算687.2792；实测687.2792。HRMS(ESI+):m/z[M+H+Na]2+C54H89N10O29SNa计算698.2702；实测698.2699。
中间体77b和75b的储备溶液的三个单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH7.2进行缓冲液交换，最后收集。将收集体积调整为1.0mL的体积。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物80b1：来自修饰的TT(77b,72.6μL,1.0mg,6.6nmol)和粗硫醇75b(19.2μL,166nmol,25当量)的储备溶液。
缀合物80b2：来自修饰的TT(77b,65.3μL,0.9mg,6.0nmol)和粗硫醇75b(27.7μL,239nmol,40当量)的储备溶液。
缀合物80b3：来自修饰的TT(77b,65.3μL,1.0mg,6.0nmol)和粗硫醇75b(46.2μL,398nmol,60当量)的储备溶液。
来自具有巯基的八糖76b的八糖-TT缀合物(81b)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT，150kD，1.9mL，6.17mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至860μL(TT的最终浓度:13.2mg/mL)。将GMBS(3.4mg,12.1μmol,160当量)的DMSO(30μL)溶液加入到所得的TT(88μM,76nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩至810μL以达到13.78mg/mL的中间体77b的终浓度。
将八糖72b(1.0mg,530μmol)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(100μL)中。加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)在DMSO(8.5μL,152μg,530nmol,1.0当量)中的64mM溶液，以达到4.9nM的寡糖浓度，在室温搅拌溶液。在1小时后，通过RP-HPLC(条件D)和HRMS进行监测，显示不存在起始物72b(Rt＝11.1min)，并且存在对应于预期的硫醇76b的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm):Rt＝8.5min(条件D)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C70H115N13O38计算888.8588；实测888.8589。HRMS(ESI+):m/z[M+H+Na]2+C70H114N13O38SNa计算899.8498；实测899.8496。HRMS(ESI+):m/z[M+2Na]2+C70H113N13O38SNa2计算910.8407；实测910.8409。
中间体77b和76b的各种储备溶液的不同单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1XpH 7.2进行缓冲液交换，最后收集。将收集体积调整为1.0mL的体积。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物81b1：来自修饰的TT(77b,65.3μL,0.9mg,6.0nmol)和粗硫醇76b(24.4μL,119nmol,20当量)的储备溶液。
缀合物81b2：来自修饰的TT(77b,65.3μL,0.9mg,6.0nmol)和粗硫醇76b(48.9μL,239nmol,40当量)的储备溶液。
作为达到13.85mg/mL的中间体77b的最终浓度的另一个实验的一部分，获得缀合物81b3至83b6。
缀合物81b3：来自修饰的TT(77b,75μL,1.0mg,6.6nmol)和粗硫醇76b(24μL,104nmol,15当量)的储备溶液。
缀合物81b4：来自修饰的TT(77b,319μL,4.4mg,29.3nmol)和粗硫醇76b(160μL,705nmol,24当量)的储备溶液。
缀合物81b5：来自修饰的TT(77b,255μL,3.5mg,23.5nmol)和粗硫醇76b(170μL,750nmol,32当量)的储备溶液。
缀合物81b6：来自修饰的TT(77b,28μL,392μg,2.6nmol)和粗硫醇76b(23.6μL,104nmol,32当量)的储备溶液。
作为达到12.8mg/mL的中间体77b的最终浓度的另一个实验的一部分，获得缀合物81b7。
缀合物81b7：来自修饰的TT(77b,936μL,12.0mg,797nmol)和粗硫醇76b的储备溶液，所述粗硫醇76b由以掩蔽的巯基部分为特征的前体72b(6.0mg,3.18μmol,40当量)获得。
实施例15.以作为载体的破伤风类毒素为例的寡糖-蛋白质缀合物，和通过使用PDPH策略的巯基-马来酰亚胺缀合化学
方案29.通过巯基-马来酰亚胺缀合化学由可缀合的二糖53e开始合成寡糖-蛋白质缀合物。(i)TCEP·HCl,0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.3/DMSO,(ii)GMBS,0.1M HEPES pH 7.5/DMSO,(iii)a.来自步骤(i)和(ii)的粗物质,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,b.半胱胺·HCl,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,c.在PBS 1X pH 7.2中的缓冲液交换。
来自具有巯基的二糖53e的二糖-TT缀合物(53h)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT,150kD,6.12mg/mL,900μL,5.5mg)的PBS 1X溶液在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1MHEPES pH 7.5进行缓冲液交换，以达到10.9mg/mL(550μL)的浓度。将GMBS(1.5mg,5.35μmol,145当量)的DMSO(15μL)溶液加入到所得的TT(32.7nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.3进行缓冲液交换四遍，最后浓缩以达到14.2mg/mL(380μL)的中间体77b的终浓度。
将二糖53e(4.6mg,6.67μmol)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(165μL)中。加入TCEP·HCl在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.3中的20mM溶液(335μL,1.91mg,6.66μmol,1.0当量)，在室温搅拌溶液1.5小时。通过RP-HPLC(条件E)和LCMS进行监测，显示不存在起始物53e(Rt＝10.0min)，并且存在对应于预期的硫醇53g的主要产物(Rt＝6.0min)，显示C22H37N5O11S的MS(ESI+):m/z[M+H]+580.2,m/z[M+Na]+602.2。对应于在500μL中总共6.7μmol的储备溶液在使用前保持在0℃。
中间体77b和53g的储备溶液的四个单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3.5小时。将半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH7.2进行缓冲液交换，最后收集。将收集体积调整为1.0mL的体积。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物53h1：来自修饰的TT(77b,70μL,1.0mg,nmol)和粗硫醇53g(15μL,115μg,199nmol,30当量)的储备溶液。
缀合物53h2：来自修饰的TT(77b,70μL,1.0mg,nmol)和粗硫醇53g(30μL,230μg,530nmol,60当量)的储备溶液。
缀合物53h3：来自修饰的TT(77b,70μL,1.0mg,nmol)和粗硫醇53g(两份15μL,230μg,530nmol,60当量)的储备溶液。
缀合物53h4：来自修饰的TT(77b,89μL,1.0mg,nmol)和粗硫醇53g(三份15μL,345μg,597nmol,90当量)的储备溶液。
表1.通过巯基-马来酰亚胺化学获得的宋内志贺菌(AB)n寡糖-TT缀合物。
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实施例16：在小鼠中的研究
小鼠免疫
对于每种有佐剂的(adjuvanted)缀合物，将七周大的Balb/c雌性小鼠(JanvierLabs，法国)用相当于每剂量2.5、2.0、1.0或0.5μg等价寡糖的量的缀合物(取决于实验)进行肌内(i.m.)免疫，所述缀合物有佐剂氢氧化铝(alum,AlH,Alhydrogel,Brenntag,丹麦)，除非另有说明。在Tris pH 7.2 20mM中以1.4mg/mL的浓度使用alum，并与缀合物进行v/v混合，得到143μg每只小鼠每注射剂的剂量。在室温孵育5分钟后，在两个位点注射200μL有佐剂的糖缀合物(每个位点100μL)。以3周的间隔进行3次免疫。除非另有说明，在第三次注射后一周回收血液样品。对于一些实验，使用每次注射后3周回收的血液样品进行动力学。每组使用七只小鼠。
抗宋内志贺菌IgG应答的测量
如前所述，使用从宋内志贺菌参考菌株(CIP 106 347)纯化的纯化宋内志贺菌LPS，通过ELISA测量对宋内志贺菌LPS特异性的糖缀合物诱导的抗LPS IgG应答。[2]简而言之，将2.5μg纯化的宋内志贺菌LPS涂布至PBS中的每个ELISA板孔，并在4℃孵育过夜。用PBS-Tween 20 0.01％清洗孔后，通过将板与PBS-BSA 1％在37℃孵育30分钟来进行饱和。然后，在PBS-BSA1％中连续稀释小鼠血清，在37℃孵育1小时。在用PBS-Tween 20 0.01％洗涤后，将抗小鼠IgG过氧化物酶标记的缀合物(Sigma-Aldrich)以1/5,000的稀释度用作二抗。将IgG滴度定义为血清的最后稀释度，产生的OD值是使用类似稀释的免疫前血清获得的OD值的两倍。为了测量抗宋内志贺菌LPS IgG亚类，进行类似的ELISA，除了抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3过氧化物酶标记的缀合物(Sigma-Aldrich)以1/5,000的稀释度用作二抗。
除了以(AB)n半抗原(n＝1-4)为特征的原始TT-缀合物，注意到通过使用相同的程序成功获得以(AB)n半抗原(n＝4,5)为特征的其他TT-缀合物。
实施例17：本发明的其他(AB)n寡糖TT-缀合物的合成-以4A-端链羟基为特征的具有接头的寡糖
-作为接头前体的叠氮丙基糖苷配基-链延长后(post-chain elongation)接头引入
方案30.由相应的烯丙基糖苷合成具有叠氮丙基的八糖61b和十糖87b。(i)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,对于83b为93％,对于84b为93％,(ii)PTFA-Cl,Cs2CO3,丙酮,对于86b为94％(两步),(iii)3-叠氮丙醇,TMSOTf,DCE/ACN,室温,对于61b为79％(两步),对于87b为81％。
3-叠氮丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(61b)。步骤1：将在无水THF(4mL)中的[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(29mg,35μmol,0.05当量)在H2气氛下搅拌45分钟。溶液的粉红色变成黄色。将溶液反复脱气，倒入烯丙基糖苷18b(2.39g,693μmol,1.0当量)的无水THF(20mL)溶液中。将反应在室温搅拌8小时。加入NIS(187mg,831μmol,1.2当量)和H2O(5mL)，将反应再搅拌4小时。在TLC分析后，加入50％Na2S2O3水溶液(10mL)。将反应混合物减压浓缩，将水相用DCM(50mL)和水(50mL)稀释。将DCM层用50％NaHCO3水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，减压浓缩。将粗品通过快速色谱法(Tol/ACN,80:20→75:25)纯化，获得半缩醛83b，为白色固体(2.2g,645μmol,93％)。半缩醛83b具有Rf 0.3,0.4(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C131H134Cl24N22O37计算1729.0814；实测1729.0814。
步骤2：将PTFACl(153μL,968μmol,1.5当量)和Cs2CO3(252mg,774μmol,1.2当量)加入到半缩醛83b(2.2g,645μmol,1.0当量)的丙酮(13mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌2小时。在TLC分析后，将混合物经垫过滤，用丙酮(2×5mL)洗涤。将合并的滤液减压浓缩。对粗品进行快速色谱法(Tol/ACN,80:20)，获得所需的PTFA供体85b和相应的噁唑啉的混合物，为白色固体。供体85b具有Rf 0.55(Tol/EtOAc 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C139H138Cl24F3N23O37计算1810.6028；实测1810.6024。噁唑啉具有HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C131H132Cl24N22O36计算1720.0787；实测1720.0765。
步骤3：向PTFA供体85b(2.0g,558μmol,1.0当量)的无水DCE(10mL)溶液中加入3-叠氮基丙醇(85μL,838μmol,1.5当量)。将溶液与新活化的MS(～1.0g)在氩气氛下搅拌1小时。经1小时加入TMSOTf(7μL,39μmol,0.07当量，在无水ACN(1mL)中)，同时在室温搅拌混合物。在室温30分钟接着TLC分析(Tol/ACN 4:1)后，加入Et3N(1当量，相比于TMSOTf)。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(3×5mL)洗涤。将合并的滤液浓缩，将黄色残余物通过自动快速色谱法(SiOH 25μm,Tol/ACN,86:14)纯化。获得叠氮丙基糖苷61b，为白色固体(1.55g,443μmol,79％)，具有Rf 0.5(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C134H139Cl24N25O37计算1770.6082；实测1770.6086。
3-叠氮丙基(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-4-O-(2-萘甲基)-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-(4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(87b)。步骤1：将在无水THF(3mL)中的[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(23mg,27μmol,0.05当量)在H2气氛下搅拌30分钟。溶液的粉红色变成黄色。通过加入氩气将混合物反复脱气。将溶液转移至烯丙基糖苷20b(2.3g,540μmol,1.0当量)的无水THF(25mL)溶液中。将反应在室温搅拌。在16小时后，加入NIS(146mg,647μmol,1.2当量)和水(6mL)。在室温再搅拌2小时后，加入50％Na2S2O3水溶液(10mL)。在减压下去除挥发物。将残余物用DCM(40mL)和水(40mL)稀释。将有机层分离，用50％NaHCO3水溶液和盐水洗涤。收集有机相，经Na2SO4干燥，减压浓缩。对粗品进行快速色谱法(Tol/EtOAc 70:30→60:40)，获得半缩醛84b，为白色固体(2.0g,474μmol,87％)。半缩醛84b具有Rf 0.5,0.6(Tol/ACN 6:4)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C161H163Cl30N27O46计算2133.0925；实测2133.0909。
步骤2：将PTFACl(112μL,710μmol,1.5当量)和Cs2CO3(185mg,568μmol,1.2当量)加入到半缩醛84b(2.0g,474μmol,1.0当量)的丙酮(10mL)溶液中。在室温搅拌4小时后，将混悬液经垫过滤，用丙酮(2×10mL)洗涤。将合并的滤液浓缩。对粗品进行快速色谱法(cHex/EtOAc 60:40)，获得PTFA供体86b，为白色固体(2.0g,455μmol,94％)。供体86b具有Rf 0.5,0.6(Tol/ACN 6:4)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C169H167Cl30F3N28O46计算2219.1060；实测2219.1055。
步骤3：将PTFA供体76B(2.0g,455μmol,1.0当量)和3-叠氮丙醇(126μL,1.36mmol,3.0当量)的无水DCE(22mL)溶液与新活化的MS(1.0g)在氩气氛下在室温搅拌1小时。在室温，将在无水ACN(1mL)中的TMSOTf(6μL,32μmol,0.07当量)经30分钟加入至反应混合物。在室温再经过1小时后，TLC分析(Tol/ACN 4:1)显示反应完成。加入Et3N(1.0当量，相对于TMSOTf)。将混悬液经/>垫过滤，用DCM(2×10mL)洗涤。将合并的滤液减压浓缩。快速色谱法(SiOH 25μm,Tol/ACN 82:18)获得十糖87b，为白色固体(1.6g,372μmol,81％)。叠氮丙基糖苷87b具有Rf 0.5(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C164H168Cl30N30O46计算2174.1162；实测2174.1153。
-完全脱保护和使用SPDP的接头修饰：掩蔽的巯基的化学选择性引入
方案31.可缀合的宋内志贺菌两性离子十糖89b的合成。(i)20％Pd(OH)2/C,H2,柠檬酸钠,2-MeTHF/iPrOH/H2O,室温,对于67b为17％,对于88b为9％(方法4),(ii)3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯,DMSO/0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(1:10),52％。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(67b)。方法4.将异丙醇(60mL)和水(30mL)加入到八糖61b(100mg,29μmol,1.0当量)的2-MeTHF(4mL)溶液中。加入在水(2mL)中的柠檬酸二氢钠(147mg,687μmol,24当量)，然后加入20％Pd(OH)2/C(320mg,458μmol,16当量)。将混悬液在氢气下搅拌18小时。加入NaHCO3(57mg,687μmol,24当量)。将混悬液经垫过滤，用甲醇(2×10mL)和水(2×10mL)洗涤。在减压下去除挥发物。将所得的溶液(～50mL)通过0.2μm注射器过滤器。在冻干后，将粗品通过Sephadex G-10凝胶过滤(100％Milli-Q水)纯化。将对应于期望产物的级分冻干。最后，将残余物通过半制备型RP-HPLC纯化，得到期望的八糖67b(8.6mg,5.1μmol,17％)，为冻干白色粉末。分析数据如上。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(88b)。方法4.将异丙醇(120mL)和水(40mL)加入到在2-MeTHF(8mL)中的十糖87b(200mg,46μmol,1.0当量)中，然后加入柠檬酸二氢钠(298mg,1.39mmol,30当量)和20％Pd(OH)2/C(650mg,929μmol,20当量)。将混悬液在氢气下在室温搅拌24小时。加入NaHCO3(117mg,1.39mmol,30.0当量)，将混悬液经垫过滤，用甲醇(2×15mL)洗涤，然后用水(2×15mL)洗涤。将合并的滤液减压浓缩(～60mL)。将溶液通过0.2μm注射器过滤器并冻干。将残余物通过SephadexG-10凝胶过滤(条件)纯化，将对应于期望产物的级分冻干。半制备型RP-HPLC获得十糖88b，为白色固体(8.6mg,4.1μmol,9％)。氨基丙基糖苷88b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝8.3/8.4min(条件A)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C83H136N16O46计算1046.4392；实测1046.4382。HRMS(ESI+):m/z[M+3H]3+C83H137N16O46计算697.9619；实测697.9611。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(89b)。将磷酸盐缓冲液(0.4mL,0.2M,pH 6.6)加入到游离十糖88b(3.0mg,1.4μmol,1.0当量)的Milli-Q水(0.3mL)溶液中。将溶液冷却至5℃。将SPDP(1.8mg,5.7μmol,4.0当量)的DMSO(15μL)溶液分三份(每份占总体积的1/3)加入。将第一部分加入至冷却的溶液后，继续搅拌2小时，同时使反应混合物达到室温。加入第二部分SDDP溶液(5.0μL)。在室温再搅拌5小时后，加入剩余的SPDP溶液，将反应在室温放置过夜。通过0.2μm离心过滤器过滤反应混合物，将滤液进行半制备型RP-HPLC。分离目标十糖89b(1.2mg,525nmol,36％)，为白色固体。具有接头的十糖89b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝11.1/11.2min(条件D)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C91H143N17O47S2计算1144.9376；实测1144.9365。HRMS(ESI+):m/z[M+3H]3+C91H144N17O47S2计算763.6275；实测763.6263。HRMS(ESI+):m/z[M+H+Na]2+C91H142N17O47S2Na计算1155.9268；实测1155.9278。
-将十糖89b转化为(AB)5-TT缀合物。
方案32.通过巯基-马来酰亚胺缀合化学从可缀合的十糖89b开始合成十糖-TT缀合物82b。(i)TCEPHCl,含有5mM EDTA/DMSO 30:1的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,(ii)GMBS,0.1M HEPES pH 7.5/DMSO 30:1,(iii)a.来自步骤(i)和(ii)的粗物质,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.3,b.半胱胺·HCl,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,c.在PBS 1X pH 7.2中的缓冲液交换。
来自具有巯基的十糖90b的十糖-TT缀合物(82b)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT,150kD,389μL,6.17mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至230μL(TT的最终浓度:8.77mg/mL)。将GMBS(599μg,2.13μmol,160当量)的DMSO(30μL)溶液加入到所得的TT(58μM,13nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.3进行缓冲液交换，最后浓缩至280μL以达到7.04mg/mL的中间体77b的终浓度。
将十糖89b(900μg,393nmol)溶解在含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(150μL)中。加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP·HCl)在DMSO(5.4μL,118μg,410nmol,1.04当量)中的77mM溶液，以达到2.6mM的寡糖浓度，在室温搅拌溶液。在1小时后，通过RP-HPLC(条件D)和HRMS进行监测，显示不存在起始物89b(Rt＝11.2min)，并且存在对应于预期的硫醇90b的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm):Rt＝9.4min(条件D)。
将所得的中间体77b(TT,280μL,1.97mg,13.1nmol)的溶液和粗的90b(来自十糖89b,393nmol)混合，并在室温轻轻搅拌4小时。加入半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH 7.2进行缓冲液交换，调节体积至800μL。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析所得的缀合物82b的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
除了上述以(AB)n半抗原(n＝1至5，n为每条链中AB重复的个数)为特征的TT-缀合物，注意到通过使用相同的程序成功合成以B(AB)n半抗原为特征的TT-缀合物({B[AB]n}m-TT,表2,m为每个TT上的寡糖链的个数)。为此，获得在其还原末端具有掩蔽的巯基的可缀合寡糖。然后将它们如上所述类似地缀合。
表2.通过在其非还原末端({B[AB]n}m-TT)或在其非还原末端(TT-{B[AB]n}m)连接获得的宋内志贺菌B(AB)n寡糖-TT缀合物。
实施例18：叠氮丙基糖苷形式的本发明的B(AB)n寡糖的合成-链延长后接头引入
方案33.B末端链宋内志贺菌受保护的寡糖的合成。(A)单糖B(21c)和(B)七糖B(AB)3(25c).(i)3-叠氮丙醇,TMSOTf,DCM,-25℃,对于20c为82％,对于21c为3％,(ii)TMSOTf,DCM,0℃,70％,(iii)a.H2活化的Ir-cat,THF,b.NIS,THF/H2O,87％,(iv)PTFA-Cl,Cs2CO3,Acet,93％,(v)3-叠氮丙醇,TMSOTf,DCE,-15℃,70％。
3-叠氮丙基4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(20c)。将含有新活化的MS(1.0g)的PTFA供体11c(2.0g,3.37mmol,1.0当量)的DCM(33mL)混悬液在氩气氛下在室温搅拌1小时。在冷却至-25℃持续10分钟后，缓慢加入TMSOTf(61μL,337μmol,0.1当量)。在该温度搅拌1小时后，TLC分析(Tol/EtOAc,4:1)显示反应完成。加入Et3N(1.0当量，相对于TMSOTf)，将异质混合物过滤。将固体用DCM(2×10mL)洗涤。将合并的滤液浓缩，将粗品通过快速色谱法(Tol/EtOAc 85:15→80:20)纯化，按洗脱顺序获得α-异构体21c(58mg,99μmol,3％)和期望的β-异构体20c(1.6g,3.16mmol,82％)，二者均为白色固体。β-异构体20c具有Rf 0.45(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(CDCl3)δ7.40-7.31(m,5H,HAr),6.95(d,1H,J2,NH＝6.0Hz,NH),4.91(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1),4.71(d,1H,J＝11.2Hz,CH2Bn),4.62(d,1H,CH2Bn),4.45(dd,1H,J2,3＝10.9Hz,J3,4＝3.2Hz,H-3),3.96-3.91(mpo,1H,OCH2),3.76(d,1H,H-4),3.67(dqpo,1H,H-5),3.62-3.55(mpo,2H,OCH2,H-2),3.38(t,2H,J＝6.8Hz,NCH2),1.90-1.78(mpo,2H,CH2),1.36(d,3H,J5,6＝6.0Hz,H-6)。13C NMR(CDCl3)δ162.0(CONHTCA),136.8(Cq,Ar),128.7,128.4,128.3(CAr),98.7(C-1,1JC,H＝162Hz),92.4(CCl3),76.0(C-3),72.6(CH2Bn),69.1(C-5),66.4(OCH2),62.9(C-4),55.9(C-2),48.1(NCH2),29.0(CH2),17.5(C-6)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C18H26Cl3N8O4计算523.1137；实测523.1136。
α-异构体21c具有Rf 0.5(Tol/EtOAc 4:1)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39-7.31(m,5H,HAr),6.69(d,1H,J2,NH＝8.4Hz,NH),4.91(d,1H,J1,2＝3.6Hz,H-1),4.76(d,1H,J＝12.0Hz,CH2Bn),4.60(d,1H,CH2Bn),4.45(dddpo,1H,H-2),3.95(dqpo,1H,H-5),3.86(ddpo,1H,J3,4＝3.6Hz,H-3),3.83(dpo,1H,H-4),3.80-3.74(mpo,1H,OCH2),3.54-3.84(mpo,2H,OCH2),3.35(t,2H,J＝5.6Hz,NCH2),1.88-1.84(mpo,2H,CH2),1.32(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6)。13CNMR(CDCl3)δ161.6(CONHTCA),137.8(Cq,Ar),128.6,128.2,127.9(CAr),96.9(C-1,1JC,H＝172Hz),92.6(CCl3),76.0(C-3),71.7(CH2Bn),65.3(OCH2),65.1(C-5),62.6(C-4),50.0(C-2),48.4(NCH2),28.5(CH2),17.4(C-6)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C18H26Cl3N8O4计算523.1137；实测523.1136。
烯丙基4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(22c)。将三糖供体14c(1.0g,711μmol,1.0当量)和四糖受体15b(1.19g,711μmmol,1.0当量)与无水甲苯(20mL)共蒸发，然后在高真空下干燥1小时。将干燥的混合物溶解在无水DCM(18mL)中，在氩气氛下在室温与新活化的MS(～1.0g)搅拌1小时。将反应混合物冷却至0℃，缓慢加入TMSOTf(7.7μl,43μmol,0.06当量)。在0℃搅拌1小时后，TLC(Tol/ACN 4:1)追踪显示反应完成。加入Et3N(1.0当量，相对于TMSOTf)，使反应混合物达到室温。将混悬液通过合适的漏斗过滤，用DCM(3×10mL)洗涤。将滤液真空浓缩，将粗品通过快速色谱法(SiOH25μm,Tol/ACN 85:15)纯化，获得七糖22c，为白色固体(1.46g,503μmol,70％)。期望的22c具有Rf 0.35(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C108H116Cl21N21O31计算1470.0799；实测1470.0819。
4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-α/β-D-半乳吡喃糖(23c)。将在无水THF(3mL)中的[Ir(COD)(PMePh2)2]+PF6 -(19mg,22μmol,0.05当量)在H2气氛下搅拌40分钟。溶液的深红色缓慢变成黄色。将混合物脱气，转移到七糖22c(1.3g,448mmol,1.0当量)的无水THF(9mL)溶液中。在室温搅拌过夜后，加入NIS(121mg,538mmol,1.2当量)和水(4mL)。在室温再经过2小时后，加入50％Na2S2O3水溶液(5mL)。将挥发物真空去除。将所得的溶液用DCM(20mL)和水(20mL)稀释。将有机层分离，将水层用DCM(2×10)洗涤。将有机部分合并，用20％NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥，浓缩。快速色谱法(Tol/EtOAc 70:30→60:40)获得半缩醛23c，为白色固体(1.12g,391μmol,87％)。半缩醛23c具有Rf 0.5(Tol/EtOAc 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C105H112Cl21N21O31计算1450.5620；实测1450.5630。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C105H112Cl21N21O31计算1450.5620；实测1450.5630。
4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-α/β-D-半乳吡喃糖基(N-苯基)三氟乙酰亚氨酯(24c)。向半缩醛23c(1.12g,391μmol,1.0当量)的丙酮(15mL)溶液中依次加入PTFA-Cl(79μL,500μmol,1.3当量)和Cs2CO3(150mg,461μmol,1.2当量)。在室温搅拌2小时后，将混悬液经硅藻土垫过滤，用丙酮(2×5mL)洗涤。将滤液浓缩。快速色谱法(cHex/EtOAc 60:40→50:50)获得PTFA供体24c(1.09g,359μmol,93％)，为白色固体。所得的24c具有Rf 0.55(Tol/EtOAc4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C113H112Cl21F3N21O31计算3053.1244；实测3053.1379。
3-叠氮丙基4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-3-O-苄基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基-(1→4)-(3-O-苄基-2-脱氧-2-三氯乙酰胺基-α-L-阿卓吡喃糖醛酸苄酯)-(1→3)-4-叠氮基-2-三氯乙酰胺基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(25c)。向PTFA供体24c(1.09g,359μmol,1.0当量)的无水DCE(18mL)溶液中加入3-叠氮基丙醇(66μL,719μmol,2.0当量)。将溶液与新活化的MS(800mg)在氩气氛下搅拌1小时，然后冷却至-15℃。缓慢加入TMSOTf(7.0μL,36μmol,0.1当量,在无水ACN(500μL)中)。在-15℃搅拌45分钟后，TLC分析(Tol/EtOAc,7:3)显示反应完成。加入Et3N(10μL)。将混悬液通过合适的漏斗过滤。将固体用DCM(2×5mL)洗涤，将滤液浓缩。快速色谱法(SiOH 25μm,Tol/ACN 85:15)获得叠氮丙基糖苷25c，为白色固体(750mg,254μmol,70％)。七糖25c具有Rf0.3(Tol/ACN 4:1)。HRMS(ESI+):m/z[M+2NH4]2+C108H117Cl21N24O31计算1492.5872；实测1492.5849。HRMS(ESI+):m/z[M+NH4]+C108H117 35Cl17 37Cl4N24O31计算2971.1342；实测2971.1380。
实施例19：氨基丙基糖苷形式的以B末端链残基为特征的本发明的寡糖的合成，和相应的可缀合的寡糖的合成
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方案34.以B末端链残基为特征的可缀合的单糖至七糖30c至33c的合成。(i)20％Pd(OH)2/C,H2,NaHCO3,2-MeTHF/iPrOH/H2O,对于26c为40％,对于27c为44％,对于28c为26％,对于29c为29％(方法1),(ii)3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯,DMSO/磷酸盐缓冲液pH 6.2,对于30c为24％(两步),对于31c为30％(校正为51％),对于32c为25％(校正为32％),对于33c为26％。
3-氨基丙基2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(26c)。将异丙醇(30mL)和水(15mL)加入到AAT衍生物20c(50mg,99μmol,1.0当量)的2-MeTHF(2mL)溶液中。将在水(1mL)中的NaHCO3(25mg,1.18mmol,3.0当量)加入到溶液中，然后加入20％Pd(OH)2/C(280mg,396μmol,4.0当量)。将混悬液在氢气氛下在室温搅拌8小时，经垫过滤，用甲醇(10mL)和水(10mL)洗涤。将滤液浓缩，将粗产物通过半制备型RP-HPLC纯化。获得游离单糖26c，为白色冻干固体(10.5mg,40μmol,40％)。二胺26c具有RP-HPLC(215nm/ELSD)Rt＝3.1/3.2min(条件A)。1H NMR(D2O)δ4.48(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1),4.09-3.97(mpo,3H,H-3,H-5,OCH2),3.77-3.67(mpo,2H,H-2,OCH2),3.60(brd,1H,J3,4＝4.4hz,H-4),3.06(t,2H,J＝7.2Hz,NCH2),2.04(s,3H,CH3Ac),1.96-1.90(m,2H,CH2),1.26(d,3H,J5,6＝6.8Hz,CH3)。13C NMR(D2O)175.1(COAc),101.6(C-1,1JC,H＝163Hz),68.1(OCH2),67.6(C-3),67.5(C-5),54.8(C-4),52.1(C-2),37.6(NCH2),26.7(CH2),22.2(CH3Ac),15.7(C-6)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C11H24N3O4计算262.1761；实测262.1763。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(27c)。将异丙醇(60mL)和Milli-Q水(12mL)加入到受保护的三糖18c(200mg,152μmol,1.0当量)的2-MeTHF(2mL)溶液中。加入20％Pd(OH)2/C(320mg,455μmol,3.0当量)，将混合物在氢气下在室温搅拌20小时。在这段时间内，利用自动注射泵缓慢加入在Milli-Q水(3.0mL)中的NaHCO3(115mg,1.36mmol,9.0当量)。将混悬液经垫过滤，用异丙醇/水(1:1,v/v,20mL)洗涤。在减压下去除挥发物，将水相冻干。对残余物进行半制备型RP-HPLC，获得具有氨基丙基的三糖27c，为白色冻干固体(45mg,68μmol,44％)。游离三糖27c具有RP-HPLC(215nm/ELSD)Rt＝6.2/7.3min(条件A)。1H NMR(D2O)δ4.76-4.74(po,1H,H-1A),4.70(po,1H,H-1B1),4.43(brs,1H,H-5A),4.39(d,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B),4.09-4.06(ddpo,1H,H-3B),4.04-3.90((mpo,5H,H-3B1,H-5B,H-5B1,H-4A,OCH2),3.85-3.72(mpo,5H,H-2B,H-2B1,H-4B,H-2A,H-3A),3.64-3.59(mpo,1H,OCH2)3.52(br,1H,H-4B1),2.98(t,2H,J＝6.4Hz,NCH2),1.97(s,3H,CH3Ac),1.95(s,3H,CH3Ac),1.91(s,3H,CH3Ac),1.89-1.85(mpo,2H,CH2),1.26(br,6H,CH3)。13C NMR(400MHz,D2O)175.4,174.4,174.2(CONHAc),171.6(C-6A),103.0(C-1B1,1JC,H＝163Hz),101.6(C-1B,1JC,H＝163Hz),101.2(C-1A,1JC,H＝166Hz),76.6(C-4A),76.1(C-5A),75.8(C-3B),68.2(OCH2),67.6(C-3A,C-3B1),67.6(C-5B),67.4(C-5B1),54.8(C-4B),54.7(C-4B1),52.4(C-2B),51.5(C-2A),50.8(C-2A1),37.6(NCH2),26.7(CH2),22.3(CH3Ac),22.2(CH3,Ac),15.7(C-6B),15.6(C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C27H49N6O13计算665.3352；实测665.3336。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C27H48N6O13Na计算687.3172；实测687.3152。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(28c)。向五糖19c(120mg,56μmol,1.0当量)的2-MeTHF/异丙醇/水(1:15:3,v/v/v,76mL)溶液中加入20％Pd(OH)2/C(160mg,225μmol,4.0当量)和NaHCO3水溶液(400μL,来自NaHCO3(71mg,845μmol,15当量)在Milli-Q水(1.5mL)中的储备液)。将混悬液在氢气氛下搅拌42小时，同时缓慢加入剩余的NaHCO3储备水溶液(200μL/2h)。完成时，将混悬液经垫过滤，用异丙醇(2×10mL)和水(2×10mL)洗涤。将滤液减压浓缩并冻干。对残余物进行半制备型RP-HPLC纯化，获得氨基丙基糖苷28c，为白色固体(12.2mg,11.4μmol,20％)。五糖28c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝8.0/8.9min(条件A)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C43H74N9O22计算1068.4943；实测1068.4946。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C43H75N9O22计算534.7508；实测534.7512。
3-氨基丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(29c)。向七糖25c(120mg,41μmol,1.0当量)的2-MeTHF/异丙醇/水(1:10:2,v/v/v)溶液中加入20％Pd(OH)2/C(170mg,245μmol,6.0当量)和NaHCO3水溶液(600μL,来自NaHCO3(72mg,856μmol,21.0当量，在水(2.1mL)中)的储备液)。将反应混合物在氢气氛下搅拌54小时，同时缓慢加入剩余的NaHCO3储备水溶液(200μL/2h)。将混悬液经硅藻土垫过滤，用异丙醇(2×10mL)和水(2×10mL)洗涤。将滤液减压浓缩并冻干。通过半制备型RP-HPLC纯化，获得氨基丙基糖苷29c，为白色固体(17.8mg,12μmol,29％)。七糖29c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝7.4/7.5min(条件A)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C59H100N12O31计算736.3303；实测736.3286。HRMS(ESI+):m/z[M+H+Na]2+C59H99N12O31Na计算747.3213；实测747.3197。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(30c)。步骤1：将异丙醇(45mL)和水(22mL)加入到叠氮丙基AAT 20c(132mg,297μmol,1.0当量)的2-MeTHF(4.0mL)溶液中。加入20％Pd(OH)2/C(835mg,1.18mmol,4.0当量)，然后加入在水(1.0mL)中的NaHCO3(75mg,891μmol,3.0当量)。将反应混合物在氢气氛下在室温搅拌8小时。完成后，将混悬液过滤，用甲醇(2×15mL)洗涤并浓缩。将粗品26c不进行进一步纯化用于下一步骤。
步骤2：将SPDP接头(40mg,130μmol,0.5当量，在DMSO(50μL)中)加入到粗胺26c(291μmol理论值,1.0当量)的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(3.3mL,0.1M)溶液中。将所得的混悬液在室温搅拌48小时，在此期间沉淀物缓慢消失。在基于RP-HPLC监测完成时，将反应混合物通过0.2μm离心过滤器。将滤液通过半制备型RP-HPLC纯化，获得期望的30c，为白色冻干固体(29mg,63μmol,24％)。具有接头的AAT 30c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝11.0/11.0min(条件E)。1H NMR(D2O,400MHz)δ8.51(d,1H,J＝4.4Hz,HAr),8.12(dtpo,1H,J＝6.4Hz,HAr),8.01(d,1H,J＝8.4Hz,HAr),7.55(dtpo,1H,J＝5.6Hz,HAr),4.45(dpo,1H,J1,2＝8.Hz,H-1),4.05-3.96(mpo,2H,H-3,H-5),3.90-3.84(mpo,1H,OCH2),3.74-3.69(mpo,1H,OCH2),3.61-3.55(mpo,2H,H-2,H-4),3.23-3.13(mpo,2H,NCH2),3.09(t,2H,J＝6.0Hz,CH2),2.64(t,2H,J＝6.8Hz,SCH2-接头),2.01(s,3H,CH3Ac),1.74-1.68(m,2H,COCH2-接头),1.30(d,3H,J5,6＝6.4Hz,H-6)。13C NMR(D2O,400MHz)δ174.9(CONHAc),,173.4(CO接头),157.1(Cq,Ar),145.6,142.4,123.6,123.1(CAr),101.6(C-1),68.0(OCH2),67.7(C-3),67.5(C-5),54.8(C-4),52.1(C-2),36.2(NCH2),34.5(SCH2),34.1(COCH2),28.3(CH2Pr),22.2(CH3Ac),15.6(C-6)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C9H31N4O5S2计算459.1730；实测459.1723。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C9H30N4O5S2Na计算481.1550；实测481.1543。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(31c)。将氨基丙基三糖27c(10mg,15μmol,1.0当量)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(1.2mL)中。缓慢加入SPDP(4.7mg,15μmol,1.0当量)的DMSO(20μL)溶液。将反应混合物在室温搅拌48小时。在基于RP-HPLC监测完成时，将粗反应物通过0.2μm离心过滤器。将滤液通过半制备型RP-HPLC纯化，首先获得未反应的27c(4.1mg)，然后获得期望的31c(3.9mg,4.5μmol,30％,校正产率51％)，均为白色冻干固体。胺31c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝16.2/17.0min(条件D)。1H NMR(D2O,400MHz)δ8.53(d,1H,J＝5.6Hz,HAr),8.21(dtpo,1H,J＝7.6Hz,HAr),8.07(d,1H,J＝8.4Hz,HAr),7.62(dtpo,1H,J＝6.0Hz,HAr),4.74(dpo,1H,J1,2＝8.8Hz,H-1A),4.72(具有HOD的po,1H,H-1B1),4.61(brs,1H,H-5A),4.423(dpo,1H,H-4A),4.40(d,1H,J1,2＝8.6Hz,H-1B),4.19(dd,1H,J2,3＝11.0Hz,J3,4＝4.0Hz,H-3B1),4.05-3.97(mpo,3H,H-3B,H-5B,H-5B1),3.86-3.78(mpo,3H,H-2A,H-2B1,OCH2),3.77-3.69(mpo,3H,H-2B,H-3A,H-4B1),3.57-3.51(mpo,2H,H-4B,OCH2),3.16-3.07(mpo,2H,NCH2),3.06(tpo,2H,J＝6.4Hz,COCH2-接头),2.61(t,2H,J＝6.4Hz,SCH2-接头),1.98,1.97,1.92(3s,9H,CH3Ac),1.70-1.63(m,2H,CH2),1.29(dpo,3H,J5,6＝6.8Hz,H-6B1*),1.26(dpo,3H,J5,6＝6.8Hz,H-6B*)。13C NMR(D2O,400MHz)δ175.4,174.5,174.0(CONHAc),173.4(CO接头),172.7(C-6A),156.7(Cq,Ar),144.5,143.7,124.5,123.6(CAr),103.0(C-1B1,1JC,H＝165Hz),101.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),101.1(C-1A,1JC,H＝165Hz),77.0(C-4A),76.6(C-5A),76.0(C-3B1),68.1(OCH2),67.8(C-3B),67.6(C-5B),67.6(C-5B1),67.4(C-3A),54.6(C-4B,C-4B1),52.4(C-2B),51.6(C-2A),50.9(C-2B1),36.3(NCH2),34.5(SCH2),34.3(COCH2),28.4(CH2Pr),22.3,22.3(2C,CH3Ac),,15.7,15.6(C-6B,C-6B1)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C35H55N7O14S2计算862.3321；实测862.3300。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C35H55N7O14S2Na计算884.3141；实测884.3118。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(32c)。将氨基丙基五糖28c(7.1mg,6.7μmol,1.0当量)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(1.6mL)中。缓慢加入SPDP(2.0mg,6.7μmol,1.0当量)的DMSO(50μL)溶液，同时将反应混合物在室温搅拌。在8小时后，加入更多的在DMSO(25μL)中的SPDP(311μg,0.15当量)。将反应再进行16小时，将混悬液通过0.2μm离心过滤器。将滤液通过半制备型RP-HPLC纯化，首先获得未反应的28c(1.6mg)，然后获得期望的32c(2.1mg,1.6μmol,25％,校正产率32％)，均为白色固体。可缀合的五糖32c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝11.4/11.5min(条件D)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C51H82N10O23S2计算633.2492；实测633.2480。
3-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(33c)。将氨基丙基七糖29c(6.0mg,4.1μmol,1.0当量)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2(1.0mL)中。加入在DMSO(30μL)中的SPDP(1.3mg,4.1μmol,1.0当量)。在室温20小时后，LCMS分析表明存在期望的产物。通过0.2μm离心过滤器过滤混悬液。将滤液通过半制备型RP-HPLC纯化，获得33c(1.8mg,1.42μmol,26％)，为白色冻干固体。可缀合的七糖33c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝15.5/16.4min(条件D)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C67H107N13O32S2计算834.8266；实测834.8288。HRMS(ESI+):m/z[M+H+Na]2+C67H106N13O32S2Na计算845.8197；实测845.8171。
实施例20：由寡糖前体合成本发明的寡糖-TT缀合物，所述寡糖前体在其还原末端包含B末端链残基和掩蔽的巯基接头。
方案35.通过巯基-马来酰亚胺缀合化学从可缀合的三糖至七糖31c至33c开始合成寡糖-蛋白质缀合物。(i)TCEP·HCl,0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1/DMSO 6:1,(ii)GMBS,0.1M HEPES pH 7.5/DMSO 29:1,(iii)a.来自步骤(i)和(ii)的粗物质,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,b.半胱胺·HCl,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,c.在PBS 1X pH 7.2中的缓冲液交换。
来自具有巯基的三糖34c的三糖-TT缀合物(37c)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT,150kD,1.0mL,6.16mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至400μL(TT的最终浓度:15.6mg/mL)。将GMBS(1.85mg,6.6μmol,160当量)的DMSO(20μL)溶液分两份加入到所得的TT(104μM,41nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩至410μL以达到15.1mg/mL的中间体77b的终浓度。
将三糖31c(300μg,348nmol)溶解在含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(150μL)中。加入TCEP·HCl在DMSO中的67mM溶液(5.2μL,100μg,349nmol,1.0当量)，在室温搅拌溶液1小时。通过RP-HPLC(条件D)和HRMS进行监测，显示不存在起始物31c(Rt＝15.7min)，并且存在对应于预期的硫醇34c的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝11.6/12.4min(条件D)。硫醇34c具有LC-MS(ESI+):m/z[M]+C30H52N6O14S计算753.3；实测753.2。
将一部分所得的粗34c的溶液(138μL,318μmol理论值,24当量)与一部分修饰的TT的储备溶液(77b,132μL,2.0mg,13.3nmol)混合，在室温轻轻搅拌3小时。加入半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH7.2进行缓冲液交换，最后收集。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物37c1的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
在另一个实验中，将三糖31c(1.96mg,2.27μmol)溶解在含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(200μL)中。加入TCEP·HCl在DMSO中的67μM溶液(34μL,653μg,2.28μmol,1.0当量)，在室温搅拌溶液1小时。如上通过RP-HPLC(条件D)进行监测，获得预期的硫醇34c。
中间体77b和所得的34c的各种储备溶液的不同单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH 7.2进行缓冲液交换，最后收集。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物37c2：来自修饰的TT(77b,132μL,2.0mg,13.3nmol)和粗硫醇34c(60μL,580nmol,44当量)的储备溶液。
缀合物37c3：来自修饰的TT(77b,132μL,2.0mg,13.3nmol)和粗硫醇34c(95μL,930nmol,70当量)的储备溶液。
来自具有巯基的五糖35c的五糖-TT缀合物(38c)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT,150kD,1.95mL,5.76mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至760μL(TT的最终浓度:14.7mg/mL)。将GMBS(3.3mg,11.8μmol,160当量)的DMSO(20μL)溶液分两份加入到所得的TT(97μM,74nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩至650μL以达到17.15mg/mL的中间体的终浓度。
将五糖32c(1.8mg,1.4μmol)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(150μL)中。加入TCEP·HCl在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1中的63mM溶液(23μL,410μg,1.4μmol,1.0当量)，在室温搅拌溶液1小时。通过RP-HPLC(条件D)和HRMS进行监测，显示不存在起始物32c(Rt＝11.2/11.4min)，并且存在对应于预期的硫醇35c的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm):Rt＝8.8/8.9min(条件D)。硫醇35c具有HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C46H79N9O23S计算m/z578.7499；实测578.7491。
中间体77b和35c的各种储备溶液的不同单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl(0.4mg，3.0μmol,20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH 7.2进行缓冲液交换，最后收集。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物38c1：来自修饰的TT(77b,115μL,2.0mg,13.3nmol)和粗硫醇35c(38.7μL,319nmol,24当量)的储备溶液。
缀合物38c2：来自修饰的TT(77b,105μL,1.8mg,12.0nmol)和粗硫醇35c(64μL,526nmol,44当量)的储备溶液。
缀合物38c3：来自修饰的TT(77b,69μL,1.2mg,8.0nmol)和粗硫醇35c(67μL,550nmol,70当量)的储备溶液。
来自具有巯基的七糖36c的七糖-TT缀合物(39c)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT，150kD，730μL,6.15mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至310μL(TT的最终浓度:14.4mg/mL)。将GMBS(1.3mg,4.7μmol,160当量)的DMSO(10μL)溶液加入到所得的TT(96μM,30nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩至310μL以达到14.3mg/mL的中间体77b的终浓度。
将七糖33c(1.0mg,600nmol)溶解在含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(150μL)中。加入TCEP·HCl在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1中的58mM溶液(10.3μL,172μg,600nmol,1.0当量)，在室温搅拌溶液1小时。通过RP-HPLC(条件D)和HRMS进行监测，显示不存在起始物33c(Rt＝15.5/16.5min)，并且存在对应于预期的硫醇36c的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝11.8/12.6min(条件D)。硫醇36c具有LC-MS(ESI+):m/z[M+2H]2+C62H105N12O32S计算780.8；实测780.5。
中间体77b和36c的各种储备溶液的不同单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1XpH 7.2进行缓冲液交换，最后收集。
缀合物39c1：来自修饰的TT(77b,112μL,1.6mg,10.6nmol)和粗硫醇36c(68μL,255nmol,24当量)的储备溶液。
缀合物39c2：来自修饰的TT(77b,77μL,1.1mg,7.3nmol)和粗硫醇36c(86μL,322nmol,44当量)的储备溶液。
将两种制剂合并，通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
在另一个实验中，将SEC纯化的破伤风类毒素(TT,150kD,1.0mL,6.17mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至420μL(TT的最终浓度:14.7mg/mL)。将GMBS(1.8mg,6.5μmol,160当量)的DMSO(20μL)溶液分两份加入到所得的TT(98μM,76nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩至450μL以达到14.6mg/mL的中间体77b的终浓度。
将七糖33c(1.7mg,1.0μmol)溶解在含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(150μL)中。加入TCEP·HCl在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1中的81mM溶液(12.5μL,292μg,1.0μmol,1.0当量)，在室温搅拌溶液1小时。通过RP-HPLC(条件D)进行监测。分析数据如上。
中间体77b和36c的各种储备溶液的不同单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1XpH 7.2进行缓冲液交换，最后收集。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物39c3：来自修饰的TT(77b,46μL,675μg,4.5nmol)和粗硫醇36c(69.9μL,440nmol,98当量)的储备溶液。
缀合物39c4：来自修饰的TT(77b,31μL,453μg,3.0nmol)和粗硫醇36c(25.4μL,160nmol,53当量)的储备溶液。
缀合物39c5：来自修饰的TT(77b,31μL,453μg,3.0nmol)和粗硫醇36c(74.1μL,467nmol,155当量)的储备溶液。
令人感兴趣的是，使用类似的程序，还成功地实现寡糖在其非还原末端的单位点缀合以产生本发明的其他缀合物，例如TT-B(AB)2五糖缀合物，尽管由在其非还原末端包含B末端链残基和掩蔽的巯基接头的寡糖前体开始。
实施例21：丙基糖苷形式的B(AB)n寡糖的合成，并转化为以在其非还原末端的掩蔽的巯基接头为特征的可缀合寡糖。
方案36.B(AB)n三糖至七糖丙基糖苷41c至43c的合成，和以非还原B残基的接头为特征的可缀合的B(AB)2五糖44c的合成。(i)20％Pd(OH)2/C,H2,NaHCO3,2-MeTHF/iPrOH/H2O,对于41c为53％,对于42c为53％,对于43c为63％(方法1),(ii)3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯,DMSO/磷酸盐缓冲液pH 6.2,对于44c为15％(校正41％)。
丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(41c)。[1]将异丙醇(90mL)和水(30mL)加入到受保护的三糖12c(150mg,118μmol,1.0当量)的2-MeTHF(4mL)溶液中。加入NaHCO3(89mg,1.05mmol,9.0当量)的水(1.0mL)溶液，然后加入Pd(OH)2/C(495mg,706μmol,6.0当量)。将反应混合物在氢气氛下在室温搅拌5小时，此时LCMS追踪表明存在期望的产物。将混悬液经垫过滤。将固体用异丙醇(2×10mL)和水(2×10mL)洗涤。将滤液减压浓缩，将残留体积冻干。对粗残余物进行半制备型RP-HPLC，获得丙基糖苷41c，为白色冻干固体(41mg,63μmol,53％)。三糖41c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝13.3/13.4min(条件A)。1H NMR(D2O)δ4.78(dpo,1H,J1,2＝8.8Hz,H-1A),4.74(dpo,1H,J1,2＝8.4Hz,H-1B1),4.73(bspo,1H,H-5A),4.47(brs,1H,H-4A),4.46(dpo,1H,J1,2＝8.8Hz,H-1B),4.11(ddpo,1H,J2,3＝11.2Hz,J3,4＝4.0Hz,H-3B1),4.06(ddpo,1H,J2,3＝11.2Hz,J3,4＝4.8Hz,H-3B),4.05-3.98(mpo,1H,H-5B,H-5B1),3.88-3.74(mpo,6H,H-2A,H-3A,H-2B,H-2B1,H-4B,OCH2Pr),3.56(d,1H,H-4B1),3.54-3.48(mpo,1H,OCH2Pr),2.00,1.96(2s,9H,CH3Ac),1.53-1.46(mpo,2H,CH2Pr),1.31(dpo,3H,J5,6＝6.8Hz,H-6B),1.30(dpo,3H,J5,6＝6.9Hz,H-6B1),0.82(t,3H,J＝7.2Hz,CH3Pr)。13C NMR(D2O)δ175.4,174.5,174.0(CONHAc,C-6A),103.0(C-1B1,1JC,H＝165Hz),101.6(C-1B,1JC,H＝162Hz),101.1(C-1A,1JC,H＝167Hz),76.7(C-4A),76.1(3C,C-3B,C-3B1,C-5A),72.7(OCH2Pr),67.7,67.5(C-5B,C-5B1),67.4(C-3A),54.8(2C,C-4B,C-4B1),52.3(C-2B1),51.5(C-2A),50.9(C-2B),22.3,22.2(3C,CH3Ac),22.1(CH2Pr),15.6,15.5(C-6B,C-6B1),9.5(CH3Pr)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C27H48N5O13计算m/z650.3243；实测650.3238。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C27H47N5O13Na计算m/z672.3063；实测672.3057。
丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(42c)。将异丙醇(75mL)和水(25mL)加入到受保护的五糖15c(100mg,48μmol,1.0当量)的2-MeTHF(4mL)溶液中。加入NaHCO3(56mg,718μmol,14.0当量)的水(1.4mL)溶液，然后加入20％Pd(OH)2/C(505mg,670μmol,15.0当量)。将反应混合物在氢气下搅拌24小时，此时加入固体NaHCO3(4.0mg,1.0当量)。将混悬液经硅藻土垫过滤，将固体用异丙醇(2×10mL)和水(2×10mL)洗涤。在减压下除去挥发物，将剩余溶液通过0.2μm注射器过滤器过滤。将滤液冻干，将残余物通过半制备型RP-HPLC纯化，获得丙基糖苷42c，为白色冻干固体(27mg,26μmol,53％)。五糖42c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝13.4/13.5min(条件A)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C43H74N8O22计算m/z527.2453；实测527.2440。HRMS(ESI+):m/z[M+Na]+C43H72N8O22Na计算m/z1075.4653；实测1075.4628。
丙基(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(43c)。将异丙醇(90mL)和水(30mL)加入到完全保护的七糖22c(120mg,41μmol,1.0当量)的2-MeTHF(4mL)溶液中。加入固体NaHCO3(73mg,869μmol,21.0当量)，然后加入20％Pd(OH)2/C(610mg,869μmol,21.0当量)。将反应混合物在氢气氛下在室温搅拌24小时。此时，LCMS分析显示期望的化合物为主要产物。将混悬液经垫过滤。将残余物用异丙醇(20mL)和水(20mL)洗涤。将合并的滤液浓缩(50mL)，将剩余的水溶液用0.2μm注射器过滤器过滤。将滤液冻干，将粗品通过半制备型RP-HPLC纯化，获得丙基糖苷43c，为白色冻干固体(39mg,27μmol,64％)。七糖43c具有RP-HPLC(215nm):Rt＝14.0min(条件A)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C59H97N11O31计算m/z 728.8249；实测728.8234。HRMS(ESI+):m/z[M+H+Na]2+C59H98N11O31Na计算m/z739.8158；实测739.8142。
丙基(2-乙酰胺基-4-(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-(2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-(2-乙酰胺基-2-脱氧-α-L-阿卓吡喃糖醛酸)-(1→3)-2-乙酰胺基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(44c)。将在DMSO(40μL)中的SPDP(14.2mg,46μmol,4.0当量)加入到五糖42c(12.0mg,11.4μmol,1.0当量)的0.2M磷酸盐缓冲液pH 6.6(1.2mL)溶液中。加入0.2M磷酸盐缓冲液pH 6.6(0.5mL)。再经过16小时后，混悬液变成澄清溶液。在36小时后，加入更多的在DMSO(20μL)中的SPDP(7.1mg,23μmol,2.0当量)。在24小时后，使用0.2μm离心管过滤反应混合物。将滤液通过半制备型RP-HPLC纯化，首先获得未反应的44c(8.0mg)，然后获得期望的五糖44c(2.1mg,1.66μmol,15％,校正44％)，均为白色冻干固体。具有接头的37c具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝12.0/12.1min(条件D)。HRMS(ESI+):m/z[M+2H]2+C51H81N9O23S2计算m/z 625.7438；实测625.7428。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C51H80N9O23S2计算m/z 1250.4803；实测1250.4785。
实施例22：由寡糖前体合成本发明的寡糖-TT缀合物，所述寡糖前体在其非还原末端包含B末端链残基和掩蔽的巯基接头。
方案37.通过巯基-马来酰亚胺缀合化学由可缀合的五糖44c开始合成五糖-TT缀合物40c。(i)TCEP·HCl,0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1/DMSO,(ii)GMBS,0.1M HEPES pH 7.5/DMSO 29:1,(iii)a.来自步骤(i)和(ii)的粗物质,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH6.1,b.半胱胺·HCl,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,c.在PBS 1X pH 7.2中的缓冲液交换。
来自具有巯基的五糖44c的五糖-TT缀合物(40c)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT,150kD,270μL,12.27mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至210μL(TT的最终浓度:12.3mg/mL)。将GMBS(744μg,2.65μmol,155当量)的DMSO(10μL)溶液分两份加入到所得的TT(82μM,17.2nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体77b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1进行缓冲液交换，最后浓缩至630μL以达到10.9mg/mL的中间体的终浓度。
将五糖44c(1.2mg,962nmol)溶解在含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1(150μL)中。加入TCEP·HCl在0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1中的209mM溶液(4.5μL,275μg,960nmol,1.0当量)，在室温搅拌溶液1小时。通过RP-HPLC(条件D)和HRMS进行监测，显示不存在起始物44c(Rt＝11.2min)，并且存在对应于预期的硫醇45c的主要产物。后者具有RP-HPLC(215nm):Rt＝10.1min(条件D)。硫醇45c具有HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C46H77N9O23S计算m/z 1141.4817；实测1141.4815；m/z[M+Na]+C46H76N9O23SNa计算m/z 1163.4636；实测1163.4633。由于存在不需要的二聚体，将所得的粗品额外用TCEP处理，获得总体积为300μL的粗品45c。
中间体77b和45c的各种储备溶液的不同单独部分分别用于获得具有不同碳水化合物：蛋白质比例的缀合物。将预期量的两种溶液中的每一种混合，并在室温轻轻搅拌3小时。将半胱胺·HCl(0.4mg，3.0μmol,20mg/mL，在去离子水(20μL)中)加入到所有反应混合物中，使得与中间体77b相比摩尔过量160。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH 7.2进行缓冲液交换，最后收集。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
缀合物40c1：来自修饰的TT(77b,115μL,1.8mg,12.0nmol)和粗硫醇45c(150μL,480nmol,40当量)的储备溶液。
缀合物40c2：来自修饰的TT(77b,105μL,1.5mg,10.0nmol)和粗硫醇45c(130μL,416nmol,42当量)的储备溶液。
此外，使用类似的程序，将TT改为CRM 197，成功地提供了CRM 197-缀合物，例如四糖(AB)2-CRM缀合物和八糖(AB)4-CRM缀合物。
表3.通过巯基-马来酰亚胺缀合化学获得的宋内志贺菌(AB)n寡糖(OS)-CRM 197缀合物。
实施例23：将可缀合的(AB)n寡糖转化为(AB)n-CRM缀合物。
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方案38.通过巯基-马来酰亚胺缀合化学分别从可缀合的四糖和八糖70b和72b开始合成寡糖-CRM 197缀合物。(i)TCEP·HCl,0.1M磷酸盐缓冲液pH6.1/DMSO,(ii)GMBS,0.1M HEPES pH 7.5/DMSO 29:1,(iii)a.来自步骤(i)和(ii)的粗物质,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,b.半胱胺·HCl,含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.1,c.在PBS 1X pH 7.2中的缓冲液交换。
来自具有巯基的四糖74b的四糖-CRM缀合物(92b)。将重组CRM197(CRM,58,443D,Provepharm Life Solutions(马赛,法国),1.0mL,5.0mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至300μL(CRM的最终浓度:16.1mg/mL)。将GMBS(2.9mg,10.2μmol,120当量)的DMSO(15μL)溶液加入到所得的CRM(275μM,83nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体91b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2进行缓冲液交换，最后浓缩至300μL以达到14.25mg/mL的中间体91b的终浓度。
如上所述由70b(700μg,649nmol)获得四糖74b。
将一部分修饰的CRM的储备溶液(91b,132μL,1.89mg,32nmol)和总体积的粗四糖74b(649nmol理论值,20当量)在含有5mM EDTA的磷酸盐缓冲液pH 6.2中的溶液混合，并在室温轻轻搅拌20小时。加入半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)，使得与中间体91b相比摩尔过量120。在室温搅拌30分钟后，将全部体积的缀合物通过SEC纯化，在Akta Superdex 200Increase 10 300GL柱上用PBS以0.5mL/min洗脱，获得三个级分，分别为92b1、92b2和92b3。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
来自具有巯基的八糖76b的八糖-CRM缀合物(93b)。将重组CRM197(CRM,58,443D,300μL,5.0mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.5进行缓冲液交换，最后浓缩至300μL(CRM的最终浓度:4.8mg/mL)。将GMBS(863μg mg,3.1μmol,120当量)的DMSO(5.2μL)溶液加入到所得的CRM(82μM,25nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体91b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 6.2进行缓冲液交换，最后浓缩至260μL以达到5.1mg/mL的中间体91b的终浓度。
如上所述由72b(1.5mg,796nmol)获得八糖76b。
将一部分修饰的CRM的储备溶液(91b,196μL,1.0mg,17nmol)和总体积的粗八糖74b(780nmol理论值,46当量)在含有5mM EDTA的磷酸盐缓冲液pH 6.2中的溶液混合，并在室温轻轻搅拌3小时45分钟。加入半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)，使得与中间体91b相比摩尔过量120。在室温搅拌30分钟后，将全部体积的缀合物通过SEC纯化，在Akta Superdex 200Increase10 300GL柱上用PBS以0.5mL/min洗脱，获得三个级分，分别为93b1、93b2和93b3。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
还注意到巯基马来酰亚胺化学可以成功地被巯基-溴乙酰基化学替代，以产生本发明的其他缀合物。事实上，用马来酰亚胺部分修饰的破伤风类毒素(77b)已成功替换为用溴乙酰基修饰的破伤风类毒素(94b)，用马来酰亚胺部分修饰的CRM 197(91b)已成功替换为用溴乙酰基部分修饰的CRM 197(95b)。
表4.通过巯基-溴乙酰基化学获得的宋内志贺菌(AB)n寡糖-TT和(AB)n寡糖-TT缀合物。
a通过使用BCA测定法测量蛋白质浓度。
实施例24：通过巯基-溴乙酰基缀合化学将寡糖半抗原缀合至载体
方案39.通过巯基-溴乙酰基缀合化学由具有接头的二糖和四糖69b和70b起始合成寡糖-CRM 197缀合物和寡糖-TT缀合物。(i)TCEP·HCl,0.1M磷酸盐缓冲液pH 8.0/DMSO,(ii)SBAP,0.1M HEPES pH 7.4/DMSO,(iii)a.来自步骤(i)和(ii)的粗物质,含有1mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 8.0,b.半胱胺·HCl,H2O,c.SEC纯化。
来自具有巯基的四糖74b的四糖-TT缀合物(96b)。将SEC纯化的破伤风类毒素(TT,150kD,500μL,7.97mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与0.1M HEPES pH 7.4进行缓冲液交换，最后浓缩至500μL(TT的最终浓度:7.66mg/mL)。将SBAP(1.5mg,4.9μmol,190当量)的DMSO(25μL)溶液加入到所得的TT(51μM,25nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体94b与含有5mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 8.0进行缓冲液交换，最后浓缩至450μL以达到7.93mg/mL的中间体94b的终浓度。
将四糖70b(2.5mg,2.31μmol)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 8.0(200μL)中。加入TCEP·HCl在DMSO中的145mM溶液(16μL,662μg,2.31μmol,1.0当量)，在室温搅拌溶液1小时30分钟。如上通过RP-HPLC进行监测。
将一部分粗的四糖74b的溶液(74μL,798nmol,60当量理论值)加入到粗的94b的溶液(252μL,2.0mg,13nmol)中，将溶液在室温轻轻搅拌20小时。加入半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)，使得与中间体94b相比摩尔过量190。在室温搅拌30分钟后，将整个体积的缀合物与PBS 1X pH 7.2进行缓冲液交换，最后收集。通过UV(λ＝280nm)、BCA和MALDI-MS分析最终缀合物(96b1)的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
来自具有巯基的二糖73b的二糖-CRM缀合物(97b)。将重组CRM197(CRM,58,443D,500μL,5.0mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与含有1mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH7.8进行缓冲液交换，最后浓缩至450μL(CRM的最终浓度:5.0mg/mL)。将SBAP(525μg,1.7μmol,50当量)的DMSO(8.7μL)溶液加入到一部分所得的CRM(86μM,400μL,34nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体91b与含有1mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.8进行缓冲液交换，最后浓缩至300μL以达到5.9mg/mL的中间体95b的终浓度。
由69b(800μg,1.2μmol)起始如上获得二糖73b，除了使用磷酸盐缓冲液pH7.8(200μL)。
将修饰的CRM197(95b,175μL,1.03mg,18nmol)加入至粗硫醇73b(1.2μmol理论值，60当量理论值)的溶液中，将溶液在室温轻轻搅拌20小时。加入半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)，使得与中间体95b相比摩尔过量60。在室温搅拌30分钟后，将全部体积的缀合物通过SEC纯化，在Akta Superdex200Increase 10 300GL柱上用PBS X1以0.5mL/min洗脱，获得缀合物97b1。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
来自具有巯基的四糖74b的四糖-CRM缀合物(98b)。将重组CRM197(CRM,58,443D,800μL,5.0mg/mL)在30kD离心过滤器上通过四遍来与含有1mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4进行缓冲液交换，最后浓缩至450μL(CRM的最终浓度:8.8mg/mL)。将SBAP(2.0mg,6.5μmol,95当量)的DMSO(8.7μL)溶液加入到所得的CRM(150μM,450μL,6.8nmol)溶液中。在环境温度进行修饰持续1小时。在这段时间之后，将整个体积的中间体91b与含有1mM EDTA的0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.8进行缓冲液交换，最后浓缩至300μL以达到5.9mg/mL的中间体95b的终浓度。
由70b(800μg,1.2μmol)起始如上获得四糖74b，除了使用磷酸盐缓冲液pH7.8(200μL)。
将所得的修饰的CRM197(95b,175μL,1.03mg,18nmol)的150μM溶液加入至粗硫醇74b(1.2μmol理论值，60当量理论值)的溶液中，将溶液在室温轻轻搅拌20小时。加入半胱胺·HCl溶液(0.4mg，20mg/mL，在去离子水(20μL)中)，使得与中间体95b相比摩尔过量60。在室温搅拌30分钟后，将全部体积的缀合物通过SEC纯化，在Akta Superdex 200Increase10 300GL柱上用PBS X1以0.5mL/min洗脱，获得缀合物98b1。通过UV(λ＝280nm)和MALDI-MS分析最终缀合物的缀合产率和碳水化合物：蛋白质比例。
此外，氨基丙基糖苷可以成功地转化为在其还原末端具有以单个炔丙基部分为特征的接头的寡糖，以产生可缀合的半抗原，所述可缀合的半抗原与不涉及硫醇前体的缀合化学相容，如四糖100b所例示。
可替代地，氨基丙基糖苷可以成功地转化为在其还原末端具有以单个叠氮基部分为特征的接头的寡糖，以产生可缀合的半抗原，所述可缀合的半抗原与不涉及硫醇前体的缀合化学相容，如四糖100b所例示。
实施例25.氨基丙基接头修饰成可缀合的寡糖
-炔丙基部分或叠氮基部分的化学选择性引入
方案40.分别合成具有单个炔丙基部分的可缀合的宋内志贺菌两性离子四糖(99b)或具有单个叠氮基部分的可缀合的宋内志贺菌两性离子四糖(100b)。(i)炔丙基-N-羟基琥珀酰亚胺酯,DMSO/磷酸盐缓冲液pH 7.8(1:6),73％,(ii)叠氮基-PEG2-N-羟基琥珀酰亚胺酯,DMSO/磷酸盐缓冲液pH 7.8(1:6)。
可缀合的(AB)2四糖(99b)。将四糖65b(1.1mg,1.25μmol,1.0当量)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.8(300μL)中，并在室温剧烈搅拌。加入炔丙基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(393μg,15μmol,1.4当量)的DMSO(50μL)溶液。在室温搅拌30分钟后，RP-HPLC监测显示完全消耗。将总体积通过RP-HPLC纯化。获得酰胺99b(0.9mg,73％)，为白色冻干固体。具有接头的四糖99b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝9.0/9.1min(条件D)。HRMS(ESI+):m/z[M+H]+C41H66N7O21S计算992.4306,实测992.4307。
可缀合的(AB)2四糖(100b)。将四糖65b(1.4mg,1.6μmol,1.0当量)溶解在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.8(300μL)中，并在室温剧烈搅拌。加入叠氮基-PEG2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(741μg,2.6μmol,1.6当量)的DMSO(50μL)溶液。在室温搅拌3小时后，RP-HPLC和LC-MS监测显示存在新产物。具有接头的四糖100b具有RP-HPLC(215nm/ELSD):Rt＝9.0/9.1min(条件D)。LC-MS(ESI+):m/z[M+2H]2+C41H70N10O22计算527.23,实测527.2；[M+H]+C41H69N10O22计算1053.45,实测1053.3。

Claims (14)

1.一种缀合物，其包含寡糖或多糖，所述寡糖或多糖选自：
(B)x-(A-B)n-(A)y，和
(A)x-(B-A)n-(B)y，
其中：
x为0或1，
y为0或1，
n为1至50，特别是1或2至10，更特别是1或2至4或3至8，n尤其为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，
A为4)-α-L-AltpNAcA-(1→，
B为3)-β-D-FucpNAc4N-(1→，
或其药学上可接受的盐，
所述寡糖或多糖与载体结合，特别是与载体共价结合。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述载体选自包含至少一个T辅助表位的蛋白质或肽，或其衍生物。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述寡糖或多糖经由不含任何碳水化合物残基的间隔子与载体结合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的缀合物，其特征在于寡糖或多糖与载体的比例为1:1至500:1，特别地1:1至200:1，更特别地1:1至30:1，优选地5:1至25:1，更优选地8:1至30:1、40:1或50:1，或5:1至20:1。
5.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物和生理学上可接受的媒介物。
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其特征在于将其配制成用于肠胃外、口服、鼻内或皮内施用。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物或根据权利要求5或6所述的免疫原性组合物，其用于疫苗接种，特别是针对宋内志贺菌(S.sonnei)感染和/或由以交叉反应性碳水化合物抗原为特征的病原体引起的感染，例如类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)感染，尤其是类志贺邻单胞菌O17感染的疫苗接种的用途。
8.一种下式化合物：
Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OR (IIb)，
其中：
x为0或1，
y为0或1，
n为1至50，
Q为H或C1-C6烷基，
A为4)-α-L-AltpNAcA-(1→，
B为3)-β-D-FucpNAc4N-(1→，
R为H、C1-C6烷基，特别是丙基或甲基，或基团LZ，
L为：
-单键，
-二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，或
-被至少一个-OH基团取代的二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其特别地为下式-(CH2-CH2-C(OH))q-(CH2-CH2)i，其中i为0或1，并且q为1至10，
--N(Ra)-D-，其中Ra为H、C1-C4-烷基、C1-C4-烷氧基、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5或OCH2CH2C6H5，D为C1-C7-亚烷基、C1-C7-烷氧基、C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基、O-C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基或C1-C7-烷氧基-Rb，其中Rb为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基，并且其中p为0至6，优选地p为1、2或3，进一步优选地p为1；
Z为Z1或F1-L2-Z2，
Z1为末端官能团或基团，任选地受保护，能够与载体和/或固体支持物形成共价键，或多价支架；锚；单糖、寡糖或多糖；或染料或荧光残基，
F1为能够将接头L结合至接头L2的任何基团，F1特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
F1更特别地选自硫代琥珀酰亚胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-和三唑官能团或基团，
L2为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
Z2为Z1或F2-L3-Z1，
F2为能够将接头L结合至接头L3的任何基团，F2特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
F2更特别地选自硫代琥珀酰亚胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-和三唑官能团或基团，
L3为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
条件是所述化合物不是H-AB-OPr、H-BA-OPr、H-ABA-OPr、H-BAB-OPr、H-(AB)2-OPr或H-BA-OMe，
或其药学上可接受的盐。
9.根据权利要求7所述的化合物，其选自：
其中特别地n＝1、2或3,
其中特别地n＝1、2、3或4,
其中特别地n＝1、2、3、4或5,
其中特别地n＝1、2、3或4,
其中特别地n＝1、2、3或4,
其中特别地n＝1、2或3,
10.一种用于体外诊断宋内志贺菌感染的试剂盒，其中所述试剂盒包含根据权利要求8或9所述的化合物，所述化合物任选地与标记物或固体支持物结合。
11.下式(I0)化合物的用途：
T-A’-B’-Y或T-B’-A’-Y (I0)，
其中：
T选自2-萘甲基(Nap)、对甲氧基苄基(PMB)、4-溴苄基(PBB)、苄氧基甲基缩醛(BOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、甲氧基丙基(MOP)、四氢吡喃基(THP)、烯丙基(All)、C1-C6烷基或甲硅烷基，T特别地为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二甲基己基甲硅烷基(TDS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)或三乙基甲硅烷基(TES)，
Y选自：
-OAll，当T不为All时；
-甲硅烷基醚，特别是叔丁基二甲基甲硅烷基醚(OTBS)、二甲基己基甲硅烷基醚(OTDS)、三乙基甲硅烷基醚(OTES)、三异丙基甲硅烷基醚(OTIPS)，当T为Nap或PMB时；
-OPMB、ONap，当OT为甲硅烷基醚或T为All或PBB醚时；
-对甲氧基苯基-O(OMP或OPMP)；和
-SR4，其中R4使得化合物为硫糖苷；
A’为特别是/>其中：
-P1选自TCA、TFA、DCA、CA、Ac、苄氧基氨基甲酸酯(Cbz)、三氯乙氧羰基(Troc)和Fmoc，P1和P2中的至少一个选自TCA、DCA、Ac、Fmoc、Troc，当Y不为OAll、OAlloc时，
-P2为H，或选自Ac、Boc、TFA、苄氧基氨基甲酸酯(Cbz)和2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)，当P1不为Ac时P2为H，
-或P1和P2一起形成邻苯二甲酰亚胺或四氯邻苯二甲酰亚胺(Cl4Phth)基团，
-R2为CO2R1或CH2OR3，其中R3为Ac、苯甲酰基(Bz)，或R3与基团T形成亚苄基，
-R1选自C1-C6烷基，尤其是Me或叔丁基(tBu)、Bn和对甲氧基苄基(PMB)，R1特别地为Bn，
B’为特别是/>
用于制备根据权利要求8或9所述的下式(II)化合物Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OR(IIb)。
12.一种用于制备根据权利要求8或9所述的下式(II)化合物的方法：
Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OR(IIa)或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OR(IIb),
所述方法包括以下步骤：
(i)通过中间形成半缩醛T-A’-B’-OH或T-B’-A’-OH将根据权利要求11所述的下式T-A’-B’-Y，特别是T-A’-B’-OAll或T-B’-A’-Y(I0)化合物转化为下式T-A’-B’-X或T-B’-A’-X(ID)供体化合物的步骤，其中X表示选自亚氨酸酯的离去基团，例如OPTFA或OTCA，PTFA表示N-苯基三氟乙酰亚胺基，TCA表示三氯乙酰亚胺基，来自o-炔基苯甲酸酯，和来自二苯基氧代锍，特别是当Y为All时，通过金属催化的脱烯丙基化，例如Pd、Ir或Rh，更特别地在H2活化的Ir催化剂的存在下，然后在I2或NIS水溶液的存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，或者通过Pd催化的脱烯丙基化，特别是在PdCl2的存在下，然后在I2或NIS水溶液的存在下，任选地使用碱，特别是无机碱，例如NaHCO3，提供相应的半缩醛T-A’-B’-OH或T-B’-A’-OH，然后在PTFA-Cl或三氯乙腈的存在下，
和/或
(ii)将T不为C1-C6烷基的下式T-A’-B’-Y，特别是T-A’-B’-OAll或T-B’-A’-Y(I0)化合物转化为下式H-A’-B’-Y化合物，特别是H-A’-B’-OAll或H-B’-A’-Y(IA)受体化合物的步骤，特别地当T为Nap或PMB时在2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)、CAN或酸的存在下，或者当T为甲硅烷基时在缓冲的TBAF，例如用AcOH缓冲的TBAF，或Et3N.3HF的存在下，或者当T为THP、MEM、MOP时在有机酸、无机酸或路易斯酸如AcOH、TsOH、HCl、ZnBr2的存在下，
和/或
(iii)由化合物(IA)和/或(ID)获得化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y，特别是Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y(IIOP)的步骤，其中m为1至n，当x为0时Q’为T，当x为1时Q’选自T、Bn和酰基，例如Lev、ClAc、Fmoc或Ac，特别是在路易斯酸的存在下，例如选自TMSOTf、TBSOTf、TfOH、Yb(OTf)3、Cu(OTf)2、AgOTf或三氟化硼醚合物，
(iv)当R为LZ并且L不为-N(Ra)-D-时，将化合物(IIOP)缀合至下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ(IICP)化合物，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OW化合物的步骤，其中W为L-F1’或L-F1’P，L如上面所定义，F1’为如上面所定义的F1的前体，F1’P为受保护的基团F1’，特别是受一个或多个苄基保护的基团F1’，
或者当R为LZ并且L为-N(Ra)-D-时，制备化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OH或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OH的步骤，
(iv’)任选地，当m不为n时，分别将化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ(IICP)，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OW化合物转化为化合物Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)n-(B’)y-OLZ(IICP)，或下式Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)n-(B’)y-OW化合物的步骤，注意当Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ(IICP)或Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OW的Q’基团不为C1-C6烷基时，Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OLZ或Q’-(A’)x-(B’-A’)n-(B’)y-OLZ(IICP)或Q’-(B’)x-(A’-B’)n-(A’)y-OW或Q’-(A’)x-(B’-A’)n-(B’)y-OW的Q’基团可以表示C1-C6烷基，
(v)将在步骤(iii)或(iv)中获得的化合物脱保护以获得下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OLZ或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OLZ(II)化合物，或下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-O-L-F1’或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-O-L-F1’化合物，或下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OH或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OH化合物的步骤，特别是在Pd(OH)2-C或Pd-C、H2，例如通过电解水产生高压氢气，和碱的存在下，特别是无机碱，例如选自NaHCO3、K2CO3、NH4HCO3、CaCO3、MgCO3，当R1为C1-C6烷基，尤其是Me时，然后在有机/无机碱例如乙二胺、三乙胺、二乙胺、羟胺、NH2OH或LiOH/H2O2的存在下任选地进行皂化，或者当T为甲硅烷基醚、THP、MEM、MOP和/或P1为Boc时，之前在TBAF或TFA、ZnBr2、TsOH的存在下，
(vi)当在步骤(v)中获得的化合物为式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-O-L-F1’或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-O-L-F1’化合物时，将所述化合物与以下化合物接触的步骤
-下式F1”-L2-Z1化合物，F1”为如上面所定义的F1的前体，L2和Z1如上面所定义，或者
-下式F1”-L2-F2’化合物，F1”为如上面所定义的F1的前体，F2’为如上面所定义的F2的前体，L2如上面所定义，然后将所得的化合物与下式F2”-L3-Z1化合物接触，其中F2”为如上面所定义的F2的前体，并且L3和Z1如上面所定义，
或者当在步骤(v)中获得的化合物为式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OH或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OH化合物时，将所述化合物与以下化合物接触的步骤：
-下式HN(Ra)-D-Z1化合物，Ra、D和Z1如上面所定义，或者
-下式HN(Ra)-D-F1’化合物，F1’为如上面所定义的F1的前体，然后将所得的化合物与下式F1”-L2-Z1化合物接触，其中F1”为如上面所定义的F1的前体，
以获得下式Q-(B)x-(AB)n-(A)y-OLZ或Q-(A)x-(BA)n-(B)y-OLZ(II)化合物。
13.一种下式(III)之一的化合物：
Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y或Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OLZ,Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-O-L-F1’,Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-O-L-F1’P,Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OH,H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y,Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OLZ,Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-O-L-F1’,Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-O-L-F1’P,Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OH,H-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y,
其中：
x为0或1，
当x为0时Q’为T，当x为1时Q’选自T、Bn和酰基，例如Lev、ClAc、Fmoc或Ac，
T选自2-萘甲基(Nap)、对甲氧基苄基(PMB)、4-溴苄基(PBB)、苄氧基甲基缩醛(BOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、甲氧基丙基(MOP)、四氢吡喃基(THP)、烯丙基(All)、C1-C6烷基或甲硅烷基，T特别地为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS)、二甲基己基甲硅烷基(TDS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)或三乙基甲硅烷基(TES)，
A’为特别是/>其中：
-P1选自TCA、TFA、DCA、CA、Ac、苄氧基氨基甲酸酯(Cbz)、三氯乙氧羰基(Troc)和Fmoc，P1和P2中的至少一个选自TCA、DCA、Ac、Fmoc、Troc，当Y不为OAll、OAlloc时，
-P2为H，或选自Ac、Boc、TFA、苄氧基氨基甲酸酯(Cbz)和2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)，当P1不为Ac时P2为H，
-或P1和P2一起形成邻苯二甲酰亚胺或四氯邻苯二甲酰亚胺(Cl4Phth)基团，
-R2为CO2R1或CH2OR3，其中R3为Ac、苯甲酰基(Bz)，或R3与基团T形成亚苄基，
-R1选自C1-C6烷基，尤其是Me或叔丁基(tBu)、Bn和对甲氧基苄基(PMB)，R1特别地为Bn，
B’为特别是/>
Y选自：
-OAll，当T不为All时；
-甲硅烷基醚，特别是叔丁基二甲基甲硅烷基醚(OTBS)、二甲基己基甲硅烷基醚(OTDS)、三乙基甲硅烷基醚(OTES)、三异丙基甲硅烷基醚(OTIPS)，当T为Nap或PMB时；
-OPMB、ONap，当OT为甲硅烷基醚或T为All或PBB醚时；
-对甲氧基苯基-O(OMP或OPMP)；和
-SR4，其中R4使得化合物为硫糖苷；
L为：
-单键，
-二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，或
-被至少一个-OH基团取代的二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，其特别地为下式-(CH2-CH2-C(OH))q-(CH2-CH2)i，其中i为0或1，并且q为1至10，
--N(Ra)-D-，其中Ra为H、C1-C4-烷基、C1-C4-烷氧基、CH2C6H5、CH2CH2C6H5、OCH2C6H5或OCH2CH2C6H5，D为C1-C7-亚烷基、C1-C7-烷氧基、C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基、O-C1-C4-烷基-(OCH2CH2)pO-C1-C4-烷基或C1-C7-烷氧基-Rb，其中Rb为任选取代的芳基或任选取代的杂芳基，并且其中p为0至6，优选地p为1、2或3，进一步优选地p为1；
Z为Z1或F1-L2-Z2，
Z1为末端官能团或基团，任选地受保护，能够与载体和/或固体支持物形成共价键，或多价支架；锚；单糖、寡糖或多糖；或染料或荧光残基，
F1为能够将接头L结合至接头L2的任何基团，F1特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
F1更特别地选自硫代琥珀酰亚胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-和三唑官能团或基团，
L2为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
Z2为Z1或F2-L3-Z1，
F2为能够将接头L结合至接头L3的任何基团，F2特别地选自-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-、-C(＝O)-C(＝O)-NH-、-NHC(＝O)-C(＝O)-、-NHC(＝O)-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、-NH-C(＝O)-C(H)＝N-NH-、酯、酰胺、胺、-CH2-、醚、硫醚、亚胺、硫代琥珀酰亚胺、肟、腙、腙酰胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-、三唑官能团或基团和以下：
F2更特别地选自硫代琥珀酰亚胺、-C(＝O)CH2-NH-、-NH-CH2-C(＝O)-和三唑官能团或基团，
L3为单键，二价C1-C12烷基、C2-C12烯基或C2-C12炔基链，所述链任选地被一个或多个杂原子中断，所述杂原子尤其选自氧原子、硫原子或氮原子，所述氮和硫原子任选地被氧化，所述氮原子任选地包含在乙酰胺键中，
F1’为如上面所定义的F1的前体，
F1’P为受保护的基团F1’，特别是受一个或多个苄基保护的基团F1’，
m为1至n，
n为1至50，特别是1或2至10，更特别是1或2至4或3至8，n尤其为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，
条件是：
当化合物为H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y，特别是H-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll，并且x＝y＝0时，m为3至50，特别是4至12；
当化合物为Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-Y或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-Y，特别是Q’-(B’)x-(A’-B’)m-(A’)y-OAll或Q’-(A’)x-(B’-A’)m-(B’)y-OAll，并且x+y＝1时，m为2至50，特别是3、4或5至12或50。
14.一种下式之一的化合物：
CN202180083929.3A 2020-11-20 2021-11-22 受保护的二糖、它们的制备方法、它们在合成两性离子寡糖中的用途及其缀合物 Pending CN116601163A (zh)

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