CN104004085B - 一种结核杆菌lam寡糖缀合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用。结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：

Description

一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用，属于肺结核疫苗研制技术领域。
背景技术
肺结核是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，具有较高的致死率。结核病主要通过呼吸道传染，也可以通过消化道、皮肤和子宫传染。大部分感染者通常没有任何症状，只有部分机体免疫力较低或细胞介导的变态反应增高的感染者才会发病，如果不及时治疗，大约有一半的感染者会死亡。近几年这一疾病的发病率逐年上升。造成这一现象的原因主要有：(1)抗生素的滥用导致病菌耐药性的不断增强；(2)与艾滋病的交叉感染；(3)不发达国家较差的基础医疗设施和环境(J.Infect.Dis.,1999,179,S461；Drugs,1997,53:40；Pharmacotherapy,1998,18:738)。因此，研制新型、有效、安全的结核病药物成为国内外学者共同关注的一个重要课题。
结核病的治疗方法主要是抗生素和免疫治疗。抗生素治疗周期较长，不但给患者的免疫系统造成了非常大的伤害，而且使病菌的耐药性不断增强。免疫治疗是预防结核病的非常有效的措施，不存在细菌耐药性和削弱患者免疫力的问题。目前，预防结核病的主要疫苗是卡介苗(BCG)。但是，研究发现BCG对结核病的免疫保护力低于80％(Trends Microbiol.,2008,16:456)，对于有免疫缺陷的病人，BCG接种还有可能导致结核的全身播散。因此，人们迫切需要一种新的疫苗来替代BCG。为了达到这个目的，人们对结核杆菌的细胞结构进行了深入的研究。研究发现，其细胞壁的最外层含有结构非常复杂和特殊的糖聚合物，主要包括分枝酸-阿拉伯半乳糖复合物(mAG)和脂肪阿拉伯甘露聚糖(LAM)(Tuberculosis,2003,83:91)。其中，LAM在结核杆菌感染人体细胞的免疫学过程中扮演了非常重要的作用，它能够促进宿主巨噬细胞中有机体的存活，同时在结核杆菌细胞中LAM是高度保守的(FEMS Microbiol.Rev.,2011,35:1126)。因此，可以根据LAM的结构特征，设计合成LAM寡糖片段，并将其作为半抗原与蛋白质缀合，来制备复合糖缀合物疫苗。
目前，相关的研究工作主要集中在LAM寡糖片段的合成方法学上，只有少数人将寡糖片段与蛋白质连接。Peter H.Seeberger等(J.Am.Chem.Soc.,2008,130:16791)高效的合成了磷脂酰肌醇(PI)和含有1-6个甘露糖苷的磷脂酰肌醇(PIM1-PIM6)，在每一个PIM的还原端都有一个硫醇作为连接基团与血蓝蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)连接，但是，这些糖蛋白的免疫活性测试结果并不理想。David R.Bundle等(Bioconjugate Chem.,2014,25:685)将LAM非还原端阿拉伯分支六糖通过点击化学反应连接在一个共聚维酮上，这一聚合物是由乙酸乙烯酯和N-乙烯基-2吡咯烷酮通过共聚合反应得到的，然后脱去聚合物上的乙酰基，再通过引入氨基、叠氮以及炔基等功能基团作为坠与糖或肽连接在一起。结果表明，最终的络合物能够作为较好的非蛋白抗原，很容易在ELISA板上产生吸附作用，在分析抗体与半抗原的连接方面表现出较好的特性。
当前，结核杆菌糖缀合物疫苗的研究仍然停留在试验阶段，有许多问题函待解决。目前，以结核分枝杆菌LAM非还原端含有甘露糖片段的阿拉伯寡糖为半抗原，与载体连接制备结核杆菌复合寡糖缀合物疫苗，尚未见相关文献报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种结核杆菌LAM寡糖缀合物及其制备方法与应用，其中的寡糖是结核杆菌细胞表面夹膜多糖的寡聚衍生物。
本发明通过如下的技术方案来实现：
一种结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：
其中，寡糖是如下通式(Ⅰ)-(Ⅱ)中的任意一寡糖：
式(I)和式(Ⅱ)中，a是0到10中的任意一个整数，b是0到20中的任意一个整数，m是0到10中的任意一个整数，n是0到20中的任意一个整数，c是0或1，d是0或1，e是0或1；
X选自：-CH2-、-NH-、-O-、-C(O)-、-S-或之一；
连接体是寡糖与载体直接或间接连接后得到的结构部分；
t是与载体连接的寡糖的数量，t为1～30中的任意一整数；
载体选自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、白喉毒素无毒突变体(CRM197)、单磷酰化的脂质A(lipid A)、1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺之一。
根据本发明优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式为如下之一：
式中，j1是1到10中的任意一个整数，j2是1到10中的任意一个整数，k是33或35,t是1到30中的任意一个整数。
根据本发明优选的，所述的载体选自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)或白喉毒素无毒突变体(CRM197)之一。
根据本发明进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：
根据本发明进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：
根据本发明进一步优选的，所述结核杆菌LAM寡糖缀合物的结构通式如下：
上述结核杆菌LAM寡糖缀合物在制备肺结核疫苗中的应用。
有益效果
本发明所述的结核杆菌LAM寡糖缀合物中，寡糖的化学结构是明确且单一的，而非混合物，可通过化学方法合成，它能够解决卡介苗免疫保护力低的问题，对某些免疫力低下的人群同样会产生较好的免疫效果，同时能够避免抗生素的大量使用而带来的细菌耐药性的问题。
附图说明
图1 是化合物A11的1H NMR谱图；
图2是A11-KLH寡糖缀合物的特异性抗体滴度图；
图中kappa代表针对化合物产生的免疫球蛋白中轻链为Kappa的免疫球蛋白，IgM代表针对化合物产生的免疫球蛋白中重链为μ的免疫球蛋白，IgG1是针对化合物产生的免疫球蛋白中重链为γ的免疫球蛋白的一个亚型。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例作进一步详细描述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1：通用的合成方法
A：糖基化反应
取糖基供体(1.2个当量)、糖基受体(1个当量)和分子筛(与供体重量相等)溶于干燥无水的二氯甲烷中，在氮气气氛下将反应液降温至-30℃，搅拌30分钟，加入N-碘代丁二酰亚胺(NIS，1.2个当量)和催化量的三氟甲磺酸银(AgOTf)。反应液缓慢升至室温，待TLC检测到原料全部反应后用三乙胺中和，过滤除去不溶的固体，滤液旋干，粗品经硅胶柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有说明)。
B：去乙酰化反应
将原料溶于甲醇，搅拌条件下加入1mol/L的甲醇钠甲醇溶液调节pH值至10左右，将反应液置于室温下搅拌反应3小时，TLC检测至原料全部反应完毕，反应液用酸性树脂(amberlite IR120)中和，过滤除去酸性树脂，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有说明)。
C：脱二甲基叔丁基硅(TBS)保护的反应
将原料(1个当量)溶于四氢呋喃，在搅拌条件下加入四正丁基氟化铵(TBAF)的四氢呋喃溶液(1mmol/mL，1.2个当量)，室温搅拌反应2小时，减压蒸馏除去溶剂，粗品经硅胶柱分离得目标产物(所用洗脱液为石油醚(PE)/乙酸乙酯(EA)，除非另有说明)。
D：催化氢化反应
取原料溶于冰乙酸和水的混合溶液(冰乙酸:水＝10:1)，在氮气保护下加入催化量的钯碳(Pd/C，10％)，向反应瓶中通入氢气，置换出氮气，反应液在氢气气氛下搅拌36小时。将反应液过滤除去钯碳，减压蒸馏除去溶剂得目标产物。
E：寡糖缀合物的合成
寡糖的活化：将寡糖溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和磷酸盐缓冲溶液(PBS buffer，0.1M)的混合液(DMF:PBS＝4:1)，搅拌条件下向其中加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯，反应液室温搅拌4小时，减压蒸馏除去溶剂得白色粉末状固体，固体用EA洗涤，干燥，得活化的寡糖。
寡糖蛋白缀合物的合成：按照30:1的摩尔比取活化的寡糖和蛋白(寡糖:蛋白＝30:1)溶于PBS缓冲溶液，反应液搅拌过夜，用透析的方法除去小分子物质，透析完毕后将蛋白水溶液冻干得寡糖-蛋白缀合物。
实施例2：3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-α-D-阿拉伯糖-KLH缀合物的合成(A11-KLH)
(1)5-O-叔丁基二甲基硅基-D-阿拉伯糖(A1)的合成
取D-阿拉伯糖(5.00g，33mmol)溶于100mL吡啶，在0℃下加入叔丁基二甲基氯硅烷(6.00g，40mmol)和催化量的4-二甲基氨基吡啶，将反应液置于室温下搅拌6小时。用TLC(EA)跟踪反应，待原料全部反应完后，将溶剂蒸干得黄色粘稠液体，粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(6.34g，产率72％)。
(2)1,2,3-三-O-乙酰基-5-O-叔丁基二甲基硅基-α,β-D-阿拉伯糖(A2)的合成
取A1(5.00g，19mmol)溶于5mL乙酸酐和20mL吡啶的混合溶剂，将混合液降温至0℃，搅拌条件下加入催化量的4-二甲基氨基吡啶，反应液升至室温反应4小时，减压蒸馏除去溶剂得黄色粘稠液体，粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(6.65g，产率90％，α:β＝2:1)。
(3)对甲苯硫基2,3-二-O-乙酰基-5-O-叔丁基二甲基硅基-1-S-α-D-阿拉伯糖(A3)的合成
将A2(6.00g,15mmol)和对甲苯硫酚(2.29g,18mmol)溶于50mL干燥除水的二氯甲烷中,将混合液降温至0℃，在搅拌条件下加入催化量的四氯化锡。反应液升至室温搅拌30分钟，TLC跟踪反应至原料全部消失，反应液用三乙胺中和，旋蒸除去溶剂，粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(5.01g，产率72％)。
(4)对甲苯硫基2,3-二-O-苄基-5-O-叔丁基二甲基硅基-1-S-α-D-阿拉伯糖(A4)的合成
取A3(5.00g，11mmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基，用酸性树脂中和反应液，过滤除去固体，减压蒸馏除去溶剂得淡黄色油状液体。将此液体溶于30mL干燥除水的DMF，混合液降温至0℃，缓慢加入NaH(60％，1.76g，44mmol)，加完后保持0℃反应30分钟。取BnBr(5.64g，33mmol)缓慢加入到反应液中，反应液升至室温搅拌30分钟。此时将反应液倾入150mL冰水中，再用100mL乙酸乙酯萃取，有机相用水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干得淡黄色油状液体，粗品经硅胶柱分离得无色油状液体(4.50g，产率74％)。
(5)3-叠氮基丙基2-O-乙酰基-3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A5)的合成
以对甲苯硫基2-O-乙酰基-3,5-二-O-苄基-1-S-α-D-阿拉伯糖(2.30g,4.81mmol，参照文献Org.Lett.,2014,16,988的方法合成)为糖基供体，3-叠氮基-1-丙醇(583mg，5.77mmol)为受体，按照实施例1中通用合成方法A进行糖基化反应得目标产物(1.90g，产率87％)。
(6)3-叠氮基丙基3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A6)的合成
取A5(1.50g，3.30mmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基得目标产物(1.24g，产率91％)。
(7)3-叠氮基丙基2,3-二-O-苄基-5-O-叔丁基二甲基硅基-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A7)的合成
以A4(2.30g，4.18mmol)为糖基供体，A6(2.07g，5.02mmol)为糖基受体，按照实施例1中通用合成方法A进行糖基化反应得目标产物(β:α＝1.5:1，1.79g，产率51％)。
(8)3-叠氮基丙基2,3-二-O-苄基-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A8)的合成
取A7(1.00g，1.19mmol)按实施例1中通用合成方法C脱去TBS保护基得目标产物(794mg，产率92％)。
(9)3-叠氮基丙基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→5)-2,3-二-O-苄基-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A9)的合成
以对甲苯硫基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O-苄基-1-S-α-D-甘露糖(200mg，0.19mmol，参照文献J.Org.Chem.,2007,72,8976的方法合成)为糖基供体，A8(141mg，0.19mmol)为糖基受体，按照实施例1中通用合成方法A进行糖基化反应得目标产物，以正己烷(n-hexane)/乙酸乙酯为洗脱液(α:β＝1.8:1，168mg，产率53％)。
(10)3-叠氮基丙基3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→2)-3,4,6-三-O-苄基-α-D-甘露糖基-(1→5)-2,3-二-O-苄基-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-3,5-二-O-苄基-α-D-阿拉伯糖(A10)的合成
取A9(70mg，43μmmol)按实施例1中通用合成方法B脱去乙酰基得目标产物，以甲苯(toluene)/乙酸乙酯为洗脱液(62mg，产率91％)。
(11)3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-α-D-阿拉伯糖乙酸盐(A11)的合成
取A10(30mg，19μmmol)按实施例1中通用合成方法D脱去苄基得目标产物(13mg，产率96％)。1H NMR(600MHz,D2O)，见说明书附图1，δ:4.98(s,1H),4.95(s,2H),4.84(s,1H),4.01-3.40(m,24H),2.95(t,2H),1.80(m,2H),1.73(s,3H).质谱：MALDI-TOF MS(m/z):计算值：C25H45NO19Na[M+Na]+,686.2,实测值：685.4。
(11)A11-KLH糖缀合物的合成
取A11(1mg)，KLH(4mg)按实施例1中通用合成方法E合成A11-KLH缀合物(3.1mg)。以硫酸-苯酚法(参考医药导报，2008，27，12:1511的方法)测定寡糖缀合物的糖含量为5.7％。
实施例3：3-氨基丙基α-D-甘露糖基-(1→2)-α-D-甘露糖基-(1→5)-β-D-阿拉伯糖基-(1→2)-α-D-阿拉伯糖-BSA缀合物的合成(A11-BSA)
取A11(1mg)，BSA(3mg)按实施例1中通用合成方法E合成A11-BSA缀合物(2.7mg)。质谱：MALDI-TOF MS(m/z)：74354
实施例4：寡糖缀合物A11-KLH的免疫原性抗体滴度测定
实施例2中制备的寡糖缀合物A11-KLH在小鼠(C57/BL，7周大，每组6只)体内进行免疫试验。采用皮下注射的方式，以寡糖用量计算，2μg/只小鼠/次，分别在第1、14、21、28天进行免疫。
分别在免疫前1天和末次免疫2天后取血，制备抗血清研究其免疫原性，用相应寡糖的BSA缀合物作为固定抗原，以酶联免疫法(ELISA)检测多糖特异性抗体的滴度，结果如图2所示。
经过免疫后，小鼠血液中的抗体滴度明显增高，IgG1抗体的滴度在总抗中占有较大比例，说明化合物诱导产生的免疫响应主要是IgG1型，而IgG1型抗体属于T细胞参与的免疫响应，它能够使宿主细胞产生免疫记忆，促进抗体成熟，这一结果说明化合物A11-KLH是一种非常有前景的肺结核疫苗。

Claims (2)

1.一种结核杆菌LAM寡糖缀合物，结构通式如下：
载体选自：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉毒素无毒突变体、单磷酰化的脂质A、1,2-二硬酯酸-3-磷脂酰乙醇胺或1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺之一。
2.权利要求1所述结核杆菌LAM寡糖缀合物在制备肺结核疫苗中的应用。
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