CN108864277B - 卡他莫拉菌los核心寡糖缀合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卡他莫拉菌脂寡糖LOS核心寡糖缀合物，所述寡糖缀合物的结构通式如式(I)所示，各个基团的定义详见说明书。此外，还公开了该缀合物的制备方法与应用。本发明所述的寡糖缀合物，其寡糖的化学结构是明确且单一的，而非混合物，可以通过化学方法大量合成。将寡糖与载体蛋白偶联得到糖蛋白缀合物，并作为抗卡他莫拉菌疫苗免疫小鼠，结果表明能诱导机体产生较强的免疫应答，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于抗菌疫苗研制技术领域，涉及糖蛋白缀合物，具体地说， 是一种卡他莫拉菌LOS核心寡糖缀合物及其制备方法与应用。
背景技术
卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis，Mcat)，又称卡他奈瑟菌或卡他布 兰汉菌，首次发现于1896年，是一种革兰氏阴性需氧双球菌，通常定植 于人类黏膜细胞表面。过去，卡他莫拉菌一直被认为是对人体无致病性的 上呼吸道正常寄居菌。但近20多年的研究发现，该菌不仅与一些上下呼 吸道疾病如支气管炎、鼻窦炎、咽喉炎有关，而且还是成人慢性阻塞性肺 炎的第二大诱因(10％的病源，不定型流感嗜血杆菌NTHi第一)，以及儿 童急性中耳炎的第三大致病因素(15％～10％的病源，仅次于NTHi和肺炎 链球菌Spi)，在世界范围内造成了显著的医疗经济负担[Verhaegh S.J.C.et al.Moraxellacatarrhalis.Mol.Med.Microbiol.(2nd Ed.),2015,3: 1565-1586]。在2015年Pichichero等的报道中，卡他莫拉菌更是超过NTHi 和Spi，成为了AOM最主要的致病菌，给新生儿的疾病预防与治疗带来了 严重的威胁[Casey J.R.et al.Otopathogens causing acuteotitis mediain the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine era.In:18thinternationalsymposium on recent advances in otitis media,2015]。据此，开展 抗卡他莫拉菌感染研究显得尤为重要。
抗生素一直以来都是预防和治疗细菌感染的主要工具。但对于卡他莫 拉菌而言，其耐药现状却并不容乐观。自1977年首次报道发现β-内酰胺 酶阳性Mcat菌株以来，卡他莫拉菌的耐药性尤其是对β-内酰胺类抗生素 的耐药率逐年升高[Riley T.V.Antimicrobialresistance in Branhamella catarrhalis.J.Antimicrob.Chemother.,1988,21:147-150]，截至目前，其临 床产酶菌株分离率已基本维持在90％以上，在部分地区如日本等，β-内酰 胺酶阳性率更是高达97％[Yamada K.et al.Antimicrobial susceptibility tobeta-lactam antibiotics and production of BRO beta-lactamase in clinicalisolates of Moraxella catarrhalis from a Japanese hospital.J.Microbiol.Immunol.Infect,2016,1-4]。在临床用药上，常用广谱青霉素如阿莫西林、 氨苄西林等治疗效果已明显减弱，难以再作为首选药物来继续使用。而其 他抗生素药物如含β-内酰胺酶抑制剂的青霉素类、第二、第三代头孢菌素、 大环内酯类及氟喹诺酮类，尽管尚无明显的耐药性产生，但仍有个别的上 升趋势，形势依旧令人担忧。基于此，如何发展其它的预防或治疗手段(如 疫苗等)是现阶段抗卡他莫拉菌感染研究的重中之重[Cripps A.W.et al.Bacterial otitis media:a vaccine preventable disease？.Vaccine,2005,23: 2304-2310]。
多价Spi及Hib多糖结合疫苗的成功为抗Mcat疫苗的研究奠定了研究 基础。截至目前，尽管并没有抗Mcat疫苗成功上市，但经过多年的努力， 已筛选出多个有希望的疫苗抗原[Tan T.-T.et al.Current progress of adhesins as vaccine candidates forMoraxella catarrhalis.Expert Rev.Vaccines,2007,6: 949-956；Su Y.-C.etal.Moraxella catarrhalis:from interactions with the host immune system tovaccine development.Future Microbiol.,2012,7: 1073-1100]。脂寡糖LOS是Mcat外膜表面的独特糖配体，在与宿主细胞 的相互作用中，LOS可选择性作用于Toll样受体TLR2，刺激NF-κB通路 释放IL-8因子，进而激活炎症反应相关基因的转录，最终诱发免疫逃逸[Slevogt H.et al.Moraxella catarrhalis is internalized in respiratoryepithelial cells by a trigger-like mechanism and initiates a TLR2-and partlyNOD1-dependent inflammatory immune response.Cell.Microbiol.，2007,9: 694-707]。由于LOS抗体反应是人体处于卡他莫拉菌感染期时的主要免疫 反应，并没有特殊的血清型[Rahman M.et al.Lack of serotype-specific antibody response tolipopolysaccharide antigens of Moraxella catarrhalis during lower respiratorytract infection.Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis., 1995,14:297-304]，而LOS的结构在不同细菌之间又具有高度的结构保守 性，因此被认为是发展特异性疫苗的优质抗原。
已有研究表明，利用天然提取的卡他莫拉菌脂寡糖构建的蛋白偶联物 在动物实验中免疫反应效果良好，具有发展为特异性抗Mcat疫苗的良好 潜力[Gu X.-X,etal.Enhancement of clearance of bacteria from murine lungs by immunizationwith detoxified lipooligosaccharide from Moraxella catarrhalis conjugated toproteins.Infect.Immun.,2000,68:4980-4985；Cox A. D.et al.Investigating thepotential of conserved inner core oligosaccharide regions of Moraxellacatarrhalis lipopolysaccharide as vaccine antigens: accessibility andfunctional activity of monoclonal antibodies and glycoconjugate derivedsera.Glycoconj.J.,2011,28:165-182]。但是，由于卡 他莫拉菌分为三种血清亚型，且脂寡糖结构复杂、稳定性不足，导致从致 病菌中直接分离纯化较为困难，严重制约了相关疫苗研究的进一步深入， 为此，采用化学方法合成脂寡糖中的寡糖分子对于在分子水平研究其功能 具有非常重要的意义。与此同时，卡他莫拉菌的LOS由外层核心寡糖和内 层核心寡糖两各部分，研究显示，外层核心寡糖与人的血型抗原结构相似， 具有pK antigen表位(Galα-4Galβ-4Glcβ-)，直接利用完整的LOS作为疫 苗抗原，有诱发自身免疫反应的风险[Ren D.et al.Mutant lipooligosaccharide-based conjugate vaccine demonstratesa broad-spectrum effectiveness against Moraxella catarrhalis.Vaccine,2011,29:4210-4217.]。这 提示，在实际的抗Mcat糖疫苗研究中，保守的内层核心寡糖才是更为优选的研究对象。因此，可根据卡他莫拉菌LOS的结构特征，利用化学合成 方法获取更为保守的内层核心寡糖片段，并将其作为抗原与载体蛋白偶 联，制备糖缀合物疫苗。
由于卡他莫拉菌LOS的核心寡糖具有自然界少见的以1,3,4,6-四取代 葡萄糖为核心的高分支结构，且同时含有多个1,2-trans苷键和1,2-cis苷键， 分子高度拥挤，合成难度较大，导致目前相关合成研究仅有两篇报道 [Ekeloef K.et al.Synthesis ofoligosaccharide structures from the lipopolysaccharide of Moraxellacatarrhalis.J.Org.Chem.,1996,61: 7711-7718；Pearson A.G.,et al.Synthesis of anovel pentasaccharide core component from the lipooligosaccharide ofMoraxella catarrhalis.Carbohydr. Res.,2011,346:2805-2811]。而以结构单一的卡他莫拉菌LOS内层核心寡 糖片段作为抗原，与载体偶联制备寡糖缀合物疫苗，尚未见相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种卡他莫拉菌LOS核心寡糖缀 合物及其制备方法与应用，其中的寡糖是卡他莫拉菌外膜表面脂寡糖结构 中的内层核心寡糖片段。
本发明的第一个目的是提供一种卡他莫拉菌LOS核心寡糖缀合物。
本发明的第二个目的是提供上述卡他莫拉菌LOS核心寡糖缀合物的 制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述卡他莫拉菌LOS核心寡糖缀合物在 制备抗卡他莫拉菌药物及疫苗中的应用及包含其的组合物。
本发明通过如下的技术方案来实现：
第一方面，在本发明的实施方案中，本发明提供了一种卡他莫拉菌 LOS核心寡糖缀合物，其结构通式如下式(I)所示：
其中，X选自：-NH-、-C(O)-、-S-、或
L是Y-X与V相连接的连接子；
n为1到30中的任意一整数；
V是载体，选自：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、血 蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒 突变体(CRM197)、霍乱类毒素(CT)、或单磷酰化的脂质A(lipid A)；
Y选自下列结构：
在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种卡他莫拉菌LOS核心 寡糖缀合物，其中，-X-L-选自：
式中，j1是1到10中的任一个整数，j2是1到10中的任一个整数，j3是1到10中的任一个整数，j4是1到10中的任一个整数，j5是1到10中 的任一个整数，j6是1到10中的任一个整数。
在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种卡他莫拉菌LOS核心 寡糖缀合物，其中，-X-L-为：
Y、n和V定义如上。
在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种卡他莫拉菌LOS核心 寡糖缀合物，其中，-X-L-为：
Y、n和V定义如上。
在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种卡他莫拉菌LOS核心 寡糖缀合物，其中，-X-L-为：
Y、n和V定义如上。
在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种卡他莫拉菌LOS核心 寡糖缀合物，其中，-X-L-为：
Y、n和V定义如上。
在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种卡他莫拉菌LOS核心 寡糖缀合物，其中，-X-L-为：
Y定义如上，n为1，V为单磷酰化的脂质A。
在本发明的特别优选实施方案中，本发明提供的一种卡他莫拉菌LOS 核心寡糖缀合物选自：
第二方面，本发明提供了上述卡他莫拉菌LOS核心寡糖缀合物的制备 方法，所述方法包括：
Y-X+L+V得到式(I)化合物。
这里，Y、X、L以及V的定义同上。
在本发明的一种实施方案中，本发明提供的上述卡他莫拉菌LOS核心 寡糖缀合物的制备方法，可以参考下面的具体技术路线：
(1)化合物1与化合物2在NIS/AgOTf的作用下在无水DCM中发 生糖基化反应，生成二糖化合物3；
(2)化合物3在NaCH3CN/TFA的条件下在DMF中反应选择性开环， 生成化合物4；
(3)化合物4与化合物5在NIS/AgOTf的作用下在无水DCM中发 生糖基化反应，生成三糖化合物6；
(4)化合物6在酸性条件下脱除PMB保护基，生成化合物7；
(5)化合物7与化合物8在NIS/AgOTf的作用下在无水DCM中发 生糖基化反应，生成四糖化合物9；
(6)化合物9在m-CPBA的作用下氧化成亚砜，之后与Bn、Cbz双 保护的5-氨基-1戊醇在Tf2O/DTBMP/1,3,5-三甲氧基苯的条件下在无水 DCM中发生糖基化反应，生成四糖化合物10；
(7)化合物10在TFA的条件脱除侧链R1，在Ac2O/Py体系下乙酰 化，之后在硫脲/lutidine的条件下脱除CA保护基，得到化合物11；
(8)化合物11与化合物12在MeOTf的作用下在无水乙醚中发生糖 基化反应，生成五糖化合物13；
(9)化合物13依次在NaOMe/MeOH体系中脱除酰基保护基，在 MeOH/H2O/THF/AcOH混合溶剂中用Pd(OH)2/C催化氢化脱除Bn和Cbz 保护基，生成寡糖14；
(10)根据载体V的性质，选择连接体L，将寡糖与连接体L进行偶 联，完成寡糖的活化，最后，将活化的寡糖连接到载体V上，分离纯化后 得到LOS核心寡糖缀合物；
其中，所述化合物1-14和寡糖缀合物的结构及合成路线如下：
上述制备方法，只表示制备本发明的式(Ⅰ)化合物的方法之一的例 子。本发明化合物的制备方法并不仅限于这些方法，在本说明书的实施例 中，由于更具体地说明了本发明化合物的制备方法，因此，本领域的人员， 根据上述说明和具体实施例中的说明，根据需要，对此加以适当修改，即 可制备出卡他莫拉菌LOS内层核心寡糖缀合物。
第三方面，本发明提供了所述卡他莫拉菌LOS核心寡糖缀合物在制备 抗卡他莫拉菌药物或疫苗中的应用。此外，本发明还提供了包含上述寡糖 缀合物和药学上可接受的辅料或佐剂的药物组合物。所述的药物组合物或 者疫苗可用来预防或治疗卡他莫拉菌感染的哺乳动物(包括人)，给药方 法方法包括全身或局部例如粘膜途径给药，给药的途径可以是肌内注射、 腹腔内注射、皮内注射或静脉内注射、或经粘膜例如口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道给药。给药的剂量可以是每剂含有0.01-1000mg所述卡他莫拉 菌LOS核心寡糖缀合物。
相比于现有技术：
1.本发明所述的卡他莫拉菌LOS内层核心寡糖缀合物中，寡糖的化 学结构是明确且单一的，而非混合物，可以通过化学方法进行合成，通过 设计连接体与载体偶联，制备缀合物抗原。
2.本发明所述寡糖缀合物作为抗卡他莫拉菌疫苗免疫小鼠，结果表明 可以诱导机体产生较强的免疫应答，因此，本发明具有较强的应用价值。
3.本发明所述寡糖缀合物合成路线简洁，操作简单，通用性强，糖基 化反应立体选择性好，产物收率高。
附图说明
图1是化合物14-CRM197免疫小鼠后检测血清中的总抗体滴度。
图2是化合物16-CRM197免疫小鼠后检测血清中的总抗体滴度。
图3是化合物16-CRM197免疫小鼠后检测血清中的总抗体滴度。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例作进一步详细描 述，但并非对本发明保护范围的限制。
检测仪器信息：
核磁波谱NMR：Bruker AV-400型核磁共振仪，测定温度恒定25℃。 核磁化学位移根据所用氘代溶剂定标：CDCl3(1H NMRδ0.00，13C NMRδ 77.16)；D2O(1H NMRδ4.79)；CD3OD(1HNMRδ3.31，13C NMRδ49.00)；
高分辨质谱(ESI-HRMS)：Bruker APEX IV傅立叶变换离子回旋共振 质谱仪；
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)：AB SCIEX 5800spectrometer纳升级高效液相-串联飞行时间质谱联用仪
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：Bio rad小型垂直电泳仪
吸光度：TEACN sunrise酶标仪
缩写词：
NIS：N-碘代丁二酰亚胺
AgOTf:三氟甲磺酸银
TLC:薄层色谱分析
m-CPBA:间氯过氧苯甲酸
DTBMP:2,6-二叔丁基-4-甲基吡啶
TMB:1,3,5-三甲氧基苯
Tf2O:三氟甲磺酸酐
TFA:三氟乙酸
HRMS:高分辨质谱
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
PE:石油醚
EtOAc:乙酸乙酯
Bn:苄基
Cbz:苄氧羰酰基
DMAP：4-二甲氨基吡啶
THF：四氢呋喃
AcOH：乙酸
PMB:对甲氧基苄基
CRM197:白喉毒素无毒变异体
BSA:牛血清白蛋白
MALDI-TOF-MS:基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
实施例1：通用的合成方法
A：硫苷法糖基化反应
将硫苷供体(1.2～1.5eq.)、受体(1eq.)、NIS(1.6～2eq.)与活化的4
分子筛(100mg/1mL)混合置于预先无水处理的圆底反应瓶中，抽真空换 氩气保护。加入无水CH2Cl2(1mL/0.1mmol供体)进行溶解，室温下搅拌 30min。随后降温至-20℃，预冷5min后加入AgOTf(0.2eq.)，继续搅拌 反应，TLC监测反应的进程。反应结束，加入三乙胺中和至中性，滤除分 子筛，CH2Cl2洗涤滤饼数次，滤液合并浓缩，直接柱层析分离，得糖基化 产物。
B：亚砜糖供体的制备
将底物溶于CH2Cl2(25mL/1mmol)中，氩气保护下降温至-78℃。经 注射器滴加m-CPBA(85％，1.1eq.)的CH2Cl2(25mL/1mmol)溶液，之后 于-78℃下反应0.5h，加饱和Na2S2O3溶液淬灭。反应液移至室温，用CH2Cl2稀释，有机相依次经饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，柱层析分离，得R/S混合异构体亚砜，直接用于糖基化反应。
C：亚砜糖作供体进行糖基化反应
将亚砜供体(1eq.)、DTBMP(2eq.)、均三甲氧基苯TMB(1.5eq.)与 活化的4
分子筛(100mg/1mL)混合置于预先处理的圆底反应瓶中，抽 真空换氩气保护。加入无水CH2Cl2(1mL/0.15mmol供体)进行溶解，室温 下搅拌30min。随后降温至-10℃，经微量进样器加入Tf2O(1.1eq.)，搅拌 活化。30min后，将反应液移至-40℃，经注射器加入受体(0.8～2eq.)的 CH2Cl2溶液(调节反应液供体终浓度为0.1M)，继续反应。1h后，移至室 温，TLC监测反应的进程。待反应完成后，加入三乙胺中和至中性，滤除 分子筛，CH2Cl2洗涤滤饼数次，滤液合并浓缩，直接柱层析分离，得糖基 化产物。
D：侧链(2-手性辅基)的脱除
将底物溶于CH2Cl2中，冰浴条件下滴加TFA(调节终浓度为 TFA:CH2Cl2＝1:10)进行反应,TLC监测反应的进程。反应结束，反应液用 CH2Cl2稀释，有机相用饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，柱层析分离，得脱侧链产物。
E：寡糖缀合物的合成
寡糖的活化：将寡糖溶于乙醇水(1:1,v/v)中，加入方酸二乙酯(5 eq.)，室温下进行搅拌。向反应液中逐次加入饱和Na2CO3溶液(每5min 一次，每次2μl)，直至TLC显示原料完全消失。反应结束，将反应液浓 缩，残余物经Sephadex LH-20(水洗脱)纯化，冻干得活化的寡糖。
寡糖蛋白缀合物的合成：将载体蛋白(1eq.)溶于硼酸缓冲液 (Na2B4O7 0.07M,KHCO3 0.35M,pH 9.0)中,加入活化的寡糖(20eq.)并 混合均匀，于室温下静置反应3d。反应结束，将反应液用无菌去离子水 稀释，过滤除菌，之后采用超滤的方法除去小分子物质。超滤完成后将最 终浓缩的离心液冻干，得到寡糖蛋白—蛋白缀合物。
实施例2：5-氨基戊基α-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[β-D- 葡萄糖基-(1→3)]-[β-D-葡萄糖基-(1→4)]-α-D-葡萄糖(化合物14的合成)
(1)2-(S)-苯基-(2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基 -(1→3)-4,6-O-对甲氧基苯亚甲基-1,2-二去氧-β-D-葡萄糖)[1,2-e]-1,4-氧硫 杂环己烷(化合物3的合成)
取化合物2(143mg,239μmol)，化合物1(83mg,199μmol)按照实施 例1中所述通用合成方法A进行糖基化反应，得无色糖浆化合物3(170mg, 96％)。HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C51H55O12S[M+H]+891.3409,实测 值：891.3385.
(2)2-(S)-苯基-(2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基-(1→3)-6-O- 对甲氧基苄基-1,2-二去氧基-β-D-葡萄糖)[1,2-e]-1,4-氧硫杂环己烷(化合物 4的合成)
将化合物3(8g,8.98mmol)、NaBH3CN(2.82g,44.9mmol)与4
分子 筛(5g)混合置于圆底反应瓶中，加入无水DMF(66mL),室温下搅拌1h， 随后移至0℃下加入TFA(6.66mL.89.8mmol)，待瓶中白雾消失(0.5h左 右)后，转移至室温反应过夜，TLC显示反应完全。停止反应，滤除分子 筛，滤饼用EtOAc洗涤数次，合并滤液，有机相用饱和NaHCO3溶液、水 和饱和食盐水洗涤数次，无水Na2SO4干燥，浓缩，柱层析分离(PE-EtOAc, 3:1)，得无色糖浆化合物4(6.64g,82％)。HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值 C51H56NaO12S[M+Na]+915.3385,实测值：915.3359。
(3)2-(S)-苯基-(2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基 -(1→3)-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→4)]-6-O-对甲 氧基苄基-1,2-二去氧-β-D-葡萄糖)[1,2-e]-1,4-氧硫杂环己烷(化合物6的合 成)
取化合物5(5.16g,7.88mmol)，化合物4(5.20g,5.82mmol)按照实 施例1所述通用合成方法A进行糖基化反应，得黄色糖浆化合物6(6.83g, 82％)。HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C67H90N15O19S[M+NH4]+1440.6253, 实测值：1440.6224.
(4)2-(S)-苯基-(2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基 -(1→3)-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→4)]-1,2-二去 氧-β-D-葡萄糖)[1,2-e]-1,4-氧硫杂环己烷(化合物7的合成)
将化合物6(6.56g,4.61mmol)溶于CH2Cl2(50mL)中，冰浴条件下 滴加TFA(4mL)，搅拌反应40min后，TLC显示反应完全。停止反应， 反应液用CH2Cl2稀释，有机相经饱和NaHCO3溶液洗至无气泡产生后，无 水Na2SO4干燥，浓缩，柱层析分离(PE-EtOAc,3:2)，得无色糖浆化合物7 (5.18g,86％)。HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C75H86NO18S[M+NH4]+ 1320.5560,实测值：1320.5570.
(5)2-(S)-苯基-(2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基 -(1→3)-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→4)]-[3,4,6-三 -O-苄基-2-O-氯乙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→6)]-1,2-二去氧-β-D-葡萄 糖)[1,2-e]-1,4-氧硫杂环己烷(化合物9的合成)
取化合物8(162mg,307μmol)，化合物7(200mg,153μmol)按照实施 例1中所述通用合成方法A进行糖基化反应，得无色糖浆化合物9(266mg, 96％)。HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C104H115ClNO24S[M+NH4]+ 1828.7213,found 1828.7182.
(6)N-(苄基)-苄氧羰酰基-5-氨基戊基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基-(1→3)-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-葡萄糖基 -(1→4)]-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-氯乙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→6)]-2-O-[(1S)- 苯基-2-(2,4,6-三甲氧基苯硫基)-乙基]-α-D-葡萄糖(化合物10的合成)
取化合物9(642mg,465μmol)按照实施例1中所述通用合成方法B 反应，得无色糖浆亚砜(614mg,94％)。
取亚砜(210mg,115μmol)，Bn、Cbz双保护的5-氨基-1-戊醇(50mg, 153μmol)按照实施例1中所述通用合成方法C进行糖基化反应，得无色 糖浆化合物10(212mg,80％)。HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值 C133H150ClN2O30S[M+NH4]+2321.9677,实测值：2321.9745.
(7)N-(苄基)-苄氧羰酰基-5-氨基戊基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D- 葡萄糖基-(1→3)-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基β-D-葡萄糖基 -(1→4)]-[3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基-(1→6)]-2-O-乙酰基-α-D-葡萄糖基 (化合物11的合成)
取化合物10(212mg,91.9μmol)按照实施例1中所述通用合成方法D 脱除侧链，之后溶于吡啶(5mL)中，加入乙酸酐(0.5mL)和催化量 DMAP，室温反应10min，TLC显示反应完全。反应结束，加适量MeOH 淬灭，反应液减压浓缩，残余物溶于CH2Cl2，有机相依次用1N HCl水溶 液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩蒸干。将所得糖浆加入MeOH (10mL)中，加入硫脲(140mg,1.84mmol)和2,6-lutidine(214μL,1.84 mmol)，70℃下回流反应12h，TLC显示反应完全。停止反应，反应液浓 缩蒸干，残余物溶于CH2Cl2/H2O，分液，有机相用1N HCl水溶液洗涤， 无水Na2SO4干燥，浓缩，柱层析分离(PE-Acetone,3:1)，得无色糖浆化合 物11(149mg,三步82％)。HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C116H133N2O27[M +NH4]+1985.9090,实测值：1985.9116.
(8)N-(苄基)-苄氧羰酰基-5-氨基戊基2,3,4,6-四-O-苄-α-D-葡萄糖基 -(1→2)-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基 -β-D-葡萄糖基-(1→3)]-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-葡萄糖基 -(1→4)]-2-O-乙酰基-α-D-葡萄糖(化合物13的合成)
将化合物12(1.2g,1.86mmol)、化合物11(600mg,305μmol)和4
分子筛(2.4g)混合置于圆底反应瓶中，抽真空换氩气保护，之后加入无 水乙醚(45mL),0℃下搅拌10min后，经注射器加入MeOTf(1.2mL,10.6 mmol),继续搅拌反应12h，TLC显示反应完全。停止反应，加入三乙胺 中和至中性，滤除不溶物，CH2Cl2洗涤滤饼数次，滤液合并浓缩，直接柱 层析分离(PE-Acetone,7:2)，得无色糖浆(737mg,97％)。再次分离 (PE-EtOAc,4:1)，得到无色糖浆化合物13和13β(5:1)。化合物13：HRMS (ESI-FT-ICR)m/z理论值C150H167N2O32[M+NH4]+2508.1496,实测值： 2508.1551；化合物13β:HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C150H167N2O32[M+NH4]+2508.1496,实测值：2508.1510.
(9)5-氨基戊基α-D-葡萄糖基-(1→2)-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[β-D-葡萄 糖基-(1→3)]-[β-D-葡萄糖基-(1→4)]-α-D-葡萄糖(化合物14的合成)
将化合物13(50mg,20.1μmol)溶于CH2Cl2/MeOH混合溶剂(1:1,v/v, 5mL)中，加入甲醇钠调节溶液pH至9～10，室温下搅拌反应12h，TLC 显示反应完全。停止反应，向反应液中加入阳离子树脂中和至pH＝7。过 滤，滤液浓缩，蒸干。将残余物溶于THF/MeOH/H2O/AcOH混合溶剂 (25:50:25:1,v/v,5mL)中，加入Pd(OH)2/C(10％钯负载于碳,20mg)，4atm H2环境下搅拌反应2d，TLC显示反应完全，停止反应，过滤，滤液合并， 浓缩蒸干，残余物经Sephadex LH-20纯化(水洗脱)，冻干得化合物14(16.5 mg,90％):Rf＝0.1(EtOAc-EtOH-H2O,1:1:1)；
1H NMR(400MHz,D2O)δ5.38(d,J＝3.9Hz,1H),4.93(d,J＝7.9 Hz,1H),4.87(d,J＝3.8Hz,1H),4.65(d,J＝7.8Hz,1H),4.60(d,J＝7.8Hz, 1H),4.35(d,J＝11.2Hz,1H),4.20(t,J＝9.4Hz,1H),4.05–3.95(m,2H),3.93–3.80(m,6H),3.78–3.65(m,7H),3.59–3.30(m,15H),2.99(dt,J＝ 12.8,7.6Hz,2H),1.74–1.59(m,4H),1.51–1.35(m,2H)；13C NMR(100 MHz,D2O)δ102.92,101.37,100.30,97.77,97.37,76.85,76.08,75.97,75.83, 75.75,75.64,75.53,74.33,74.05,73.30,73.08,72.71,71.83,71.83,71.62, 71.42,69.84,69.73,69.51,69.34,69.28,68.80,67.96,60.70,60.34,48.83, 39.39,28.03,26.91,22.43；HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C35H64NO26[M+ H]+914.3711,实测值：914.3718.
实施例3:5-氨基戊基β-D-葡萄糖基-(1→3)-[β-D-葡萄糖基-(1→4)]-α-D-葡 萄糖(化合物16的合成)
(1)5-叠氮基戊基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基 -(1→3)-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→4)]-6-O-对甲 氧基苄基-2-O-[(1S)-苯基-2-(2,4,6-三甲氧基苯硫基)-乙基]-α-D-葡萄糖(16b 的合成)
取化合物6(3g,2.11mmol)按照实施例1中所述通用合成方法B反 应，得无色糖浆亚砜16a(2.73g,90％)。
取亚砜(82mg,57.0μmol)，5-叠氮基-1-戊醇(6mg,45.6μmol)按照 实施例1中所述通用合成方法C进行糖基化反应，得无色糖浆糖基化产物 16b(63mg,80％)。HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C97H115N4O23S[M+ NH4]+1735.7667,实测值：1735.7669.
(2)5-叠氮基戊基2-O-乙酰基-3,4,6-三-O-苄基-β-D-葡萄糖基 -(1→3)-[3,4,6-三-O-苄基-2-O-乙酰丙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→4)]-α-D-葡萄 糖(化合物16c的合成)
取化合物16b(1.8g,1.05mmol)按照实施例1中所述通用合成方法D 脱除侧链，同时PMB在酸性条件下同时发生脱除，得无色糖浆化合物16c (0.92g,68％):HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C72H89N4O19[M+NH4]+ 1313.6116,实测值：1313.6112.
(3)5-氨基戊基β-D-葡萄糖基-(1→3)-[β-D-葡萄糖基-(1→4)]-α-D-葡萄 糖(化合物16的合成)
将化合物16c(300mg,231μmol)溶于CH2Cl2/MeOH混合溶剂(1:1, v/v,30mL)中，加入甲醇钠调节溶液pH至9～10，室温下搅拌反应12h， TLC显示反应完全。停止反应，向反应液中加入阳离子树脂中和至pH＝7。 过滤，滤液浓缩，蒸干。将残余物溶于THF/MeOH/H2O/AcOH混合溶剂 (25:50:25:1,v/v,30mL)中，加入Pd(OH)2/C(10％钯负载于碳,120mg)，4atm H2环境下搅拌反应2d，TLC显示反应完全，停止反应，过滤，滤液 合并，浓缩蒸干，残余物经Sephadex LH-20纯化(水洗脱)，冻干得化合物 16(130mg,95％):Rf＝0.1(EtOAc-EtOH-H2O,1:1:1)；
1H NMR(400MHz,D2O)δ4.89(d,J＝8.3Hz,1H),4.84(d,1H, covered by H2O signal),4.61(d,J＝7.9Hz,1H),4.11(t,J＝9.3Hz,1H),3.94 –3.61(m,10H),3.54–3.22(m,9H),2.96(t,J＝7.6Hz,2H),1.76–1.52(m,4H),1.51–1.31(m,2H)；13C NMR(100MHz,D2O)δ101.48,100.74,97.76, 76.69,76.12,75.87,75.59,75.41,73.22,72.80,72.66,71.84,70.93,69.49, 69.23,67.76,60.71,60.57,60.06,39.30,28.02,26.48,22.38；HRMS (ESI-FT-ICR)m/z理论值C23H44NO16[M+H]+590.2655,实测值：590.2653.
实施例4:5-氨基戊基β-D-葡萄糖基-(1→3)-[β-D-葡萄糖基-(1→4)]-[β-D- 葡萄糖基-(1→6)]-α-D-葡萄糖(化合物17的合成)
将化合物11(70mg,35.5μmol)溶于CH2Cl2/MeOH混合溶剂(1:1,v/v, 5mL)中，加入甲醇钠调节溶液pH至9～10，室温下搅拌反应12h，TLC 显示反应完全。停止反应，向反应液中加入阳离子树脂中和至pH＝7。过 滤，滤液浓缩，蒸干。将残余物溶于THF/MeOH/H2O/AcOH混合溶剂 (25:50:25:1,v/v,5mL)中，加入Pd(OH)2/C(10％钯负载于碳,30mg)，4atm H2环境下搅拌反应2d，TLC显示反应完全，停止反应，过滤，滤液合并， 浓缩蒸干，残余物经Sephadex LH-20纯化(水洗脱)，冻干得化合物17(23.0 mg,85％):Rf＝0.1(EtOAc-EtOH-H2O,1:1:1)；
1H NMR(400MHz,D2O)δ4.97–4.87(m,2H),4.67(d,J＝8.0Hz,1H),4.50 (d,J＝8.0Hz,1H),4.25(d,J＝11.1Hz,1H),4.20–4.11(m,1H),4.05–3.99 (m,1H),3.98–3.86(m,5H),3.80(dd,J＝9.6,3.7Hz,1H),3.76–3.68(m,4H),3.58–3.41(m,8H),3.39–3.25(m,5H),3.06–2.94(m,2H),1.78–1.58 (m,4H),1.53–1.37(m,2H)；13C NMR(100MHz,D2O)δ102.24,101.36, 101.06,97.81,76.53,76.08,75.86,75.82,75.71,75.67,75.61,73.66,73.15, 73.09,73.01,71.64,69.73,69.65,69.43,67.99,67.35,60.76,60.72,60.67, 39.34,28.00,26.51,22.38；HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论值C29H54NO21[M+ H]+752.3183,实测值：752.3171.
实施例5：14-CRM197糖缀合物的合成
取化合物14(20mg,22.0μmol)按照实施例1中所述通用方法E进行 寡糖的活化得化合物14B(21mg,93％)。14B:HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理论 值C29H48NO19[M+H]+1038.3871,实测值：1038.3853。
取CRM197蛋白(28.1mg,0.481μmol)溶于硼酸缓冲液(Na2B4O7 0.07 M,KHCO30.35M,pH 9.0,1.4mL)中,加入活化寡糖14B(9.5mg,9.15 μmol)并混合均匀，于室温下静置反应3d。反应结束，将反应液用无菌去 离子水稀释，过滤除菌，之后采用超滤离心管在4℃下12000g离心15min。 加入无菌去离子水再次稀释，重复离心3次。将最终浓缩的离心液冻干， 得白色泡沫状固体14-CRM197(25.2mg)。质谱：MALDI-TOF-MS(m/z) 66197.9.
实施例6：14-BSA糖缀合物的合成
14-BSA糖缀合物采用与14-CRM197相似的方法进行合成：合成中活化 寡糖14B用量为20eq.。质谱：MALDI-TOF-MS(m/z)71449.3.
实施例7：16-CRM197糖缀合物的合成
取化合物16(13mg,22.0μmol)按照实施例1中所述通用方法E进行 寡糖的活化得化合物14B(14.5mg,92％)。16B:HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理 论值C29H48NO19[M+H]+714.2815,实测值：714.2820；
16-CRM197的合成按照实施例1中所述通用方法E进行合成，质谱： MALDI-TOF-MS(m/z)65925.5.
实施例8：16-BSA糖缀合物的合成
16-BSA糖缀合物采用与16-CRM197相似的方法进行合成：合成中活化 寡糖16B用量为20eq.。质谱：MALDI-TOF-MS(m/z)74025.0.
实施例9：17-CRM197糖缀合物的合成
取化合物17(16mg,22.0μmol)按照实施例1中所述通用方法E进行 寡糖的活化得化合物14B(14.5mg,92％)。17B:HRMS(ESI-FT-ICR)m/z理 论值C35H58NO24[M+H]+876.3343,实测值：876.3351；
17-CRM197的合成按照实施例1中所述通用方法E进行合成，质谱： MALDI-TOF-MS(m/z)65903.5.
实施例10：17-BSA糖缀合物的合成
14-BSA糖缀合物采用与14-CRM197相似的方法进行合成：合成中活化寡糖 14B用量为20eq.。质谱：MALDI-TOF-MS(m/z)76152.2.
实施例11：寡糖缀合物14-CRM197、16-CRM197、17-CRM197的免疫原性 抗体滴度测定
实施例5、7、9中制备的寡糖缀合物14-CRM197、16-CRM197、17-CRM197在小鼠(NIH小鼠，雌性，SPF级)体内进行免疫试验。采用腹部皮下注 射的方式，以寡糖用量计算，分为三个剂量组：0.5μg，1.5μg,4.0μg，分 别在第1、14、28天进行免疫，本实验设十组，每组10只，具体如表1 所示。
表1免疫以及取血方案
第一次与第二次免疫两周后眼眶取血，分别保存为一免与二免血清。 第三次免疫两周后采集全血，保存为三免血清。以14-BSA、16-BSA、17-BSA 糖缀合物作为固定包被抗原，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测对应的 CRM197免疫后各血清中多糖特异性抗体的滴度，结果如图1、2、3所示。
经过免疫后，小鼠血清中IgG抗体滴度水平显著提高，免疫应答强烈。 所有剂量组一免、二免及三免血清中均能有效检测出抗体，其抗体滴度分 别在102、104与105左右的水平。对比不同时间点的血清抗体滴度可知， 随着免疫次数的增加，小鼠体内的抗体浓度逐渐增高，第三次免疫之后可 以达到一个较高的水平(104以上)。这说明，通过加强免疫次数可以有效 提高糖偶联物的免疫原性，增强其在小鼠体内的免疫效果。将不同剂量组 的血清学结果进行对比，可以发现，各组的抗体滴度虽稍有不同，但却并 没有统计学上的显著性差异(P>0.05)。这提示，在本实验中，所设置的最 小免疫剂量即已达到免疫饱和值，增加给药量并不能在小鼠体内诱导产生 更高的抗体滴度。同时，这也间接说明，我们所设计的糖偶联物免疫原性 较强，在较低的剂量下，即可以诱发高滴度的抗体应答。缀合物产生的免 疫响应主要是IgG型，属于T细胞依赖性免疫应答，此应答能够使宿主细 胞产生免疫记忆，活性结果说明缀合物14-CRM197、16-CRM197、17-CRM197是一种非常有潜力的抗卡他莫拉菌疫苗。
Claims (2)
1.一种卡他莫拉菌LOS核心寡糖缀合物，所述寡糖缀合物为：
其中，n为1到30中的任意一整数；
BSA为牛血清白蛋白，CRM197为白喉毒素无毒突变体。
2.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的寡糖缀合物和药学上可接受的辅料。
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| 基于合成脂多糖的抗卡他莫拉菌疫苗研究;魏雄等;《中国化学会第十一届全国天然有及化学学术会议论文集第五册》;20160930;总第394页第2段以及附图 * |
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