KR20120014238A - 신규한 당지질 애주번트를 갖는 ｇｌｏｂｏ ｈ 및 관련 항암 백신 - Google Patents

신규한 당지질 애주번트를 갖는 ｇｌｏｂｏ ｈ 및 관련 항암 백신 Download PDF

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Abstract

면역원성 조성물, 암 백신 및 암의 치료 방법이 제공된다. (a) 파라-나이트로페닐과 같은 링커에 의해 캐리어 단백질과 컨쥬게이트되는, Globo H 또는 이의 면역원성 단편과 같은 글리칸; 및 (b) 수지상 세포 상의 CD1d와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트, 이를 테면 α-갈락토실-세라미드 유도체를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기에서 면역원성 조성물은 IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도한다. 캐리어 단백질 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197) 및 애주번트 C34를 포함하는 면역원성 조성물이 제공된다. 본 명세서에 개시된 면역원성 조성물에 의해 생성되는 항체는 또한 항원 Globo H, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시킨다. DT-CRM 197와 컨쥬게이트된 Globo H, SSEA-3 또는 SSEA-4를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하는 유방암 줄기 세포에 대한 치료제가 제공된다.

Description

신규한 당지질 애주번트를 갖는 ＧＬＯＢＯ Ｈ 및 관련 항암 백신{GLOBO H AND RELATED ANTI-CANCER VACCINES WITH NOVEL GLYCOLIPID ADJUVANTS}
관련 출원의 상호 참조
본 특허 출원은 미국 가특허 출원 제61/061,968호(출원일: 2008년 6월 16일)에 대한 우선권을 주장하는, 공동 계류 중인 미국 특허 출원 제12/485,546호(출원일: 2009년 6월 16일, 발명의 명칭: "Compositions for inducing immune responses specific to Globo H and SSEA-3 and uses thereof in cancer treatment")의 일부 계속 출원이다. 이들 특허 출원의 내용은 본 명세서에 이들 전체가 참고로 포함된다.
발명의 기술분야
본 발명은 암 백신 분야에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 면역원성 캐리어(immunogenic carrier) DT-CRM 197에 컨쥬게이트된(conjugated), B 세포 에피토프(epitope)인 Globo H를 함유하는 탄수화물 기반의 백신에 관한 것이다. 더욱 자세히, 본 발명은 신규한 당지질 애주번트, 예를 들어 C34와 함께 투여되는 항암 Globo H-DT 백신에 관한 것이다.
암에 대한 치료법을 설계하기 위하여, 정상 세포에 없는 암 또는 암 줄기 세포의 분자 표적을 구하는 것이 바람직하다. 이상 당화(aberrant glycosylation)는 종종 종양 진행과 관련되며, 암 글리칸이 건강한 세포와 다르다는 설명과 함께 Meezan 등에 의해 처음으로 1969년도에 기재되었다(Meezan E, et al. (1969) Biochemistry 8:2518-2524). 이상 당화는 특정 구조의 소실 또는 과발현, 절단된 구조의 지속 및 신규 구조의 발생을 포함한다. 구조적 차이는 이후에 건강한 조직과 악성 조직을 비교하는 렉틴-염색을 사용하여 많은 조직학적 증거에 의해 입증되었다(Turner GA (1992) Clin Chim Acta 208:149-171; Gabius HJ (2000) Naturwissenschaften 87:108-121).
보다 최근에, 종양 관련 탄수화물 항원이 모노클로널 항체와 질량 분석법에 의해 동정되었다(Shriver Z, et al. (2004) Nat Rev Drug Disc 3:863-873; Pacino G, et al. (1991) Br J Cancer 63:390-398). 현재까지, 당지질 또는 당단백질의 형태로 암 세포 상에서 발현되는 수많은 종양 관련 항원이 특징지어졌으며, 특정 암 유형과 관련지어졌다(Bertozzi CR, Dube DH (2005) Nat Rev Drug Discovery 4:477-488). 악성 세포에서 활동하는 표면 탄수화물의 역할에 관해서는 상대적으로 거의 알려져 있지 않지만, 수동적으로 투여되거나 백신으로 유도된, 이들 항원에 대한 항체가 예후의 개선과 관련이 있었다.
보고된 종양 관련 글리칸 중에, 당지질 항원 Globo H(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc)가 1984년도에 Hakomori 등에 의해 유방암 MCF-7 세포로부터 처음 단리되고 동정되었다(Bremer EG, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773-14777). 항-Globo H 모노클로널 항체를 사용하는 추가의 연구로, Globo H가 전립선암, 위암, 췌장암, 폐암, 난소암 및 결장암을 비롯한 많은 다른 암에 존재하며, 면역계에 용이하게 접근가능하지 않은 정상 분비 조직의 관강면(luminal surface) 상에서는 아주 적은 발현만이 있는 것으로 나타났다(Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128). 또한, 유방암 환자의 혈청에 높은 수준의 항-Globo H 항체가 함유되어 있으며(Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20; Wang C-C, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661-11666), Globo H-양성 종양을 갖는 환자가 Globo H-음성 종양을 갖는 환자에 비해 더 짧은 생존을 보이는 것으로 규명되었다(Chang, Y-J, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299-10304). 이들 발견은 6당류 에피토프인 Globo H가 암 백신 개발에 매력적인 종양 마커이며 적합한 표적이게 한다.
Globo H는 다양한 상피암에서 과발현되는 암 항원이다. 이 항원이 암 면역요법에서 표적으로 도움이 될 수 있음이 제안되었다. Globo H에 대한 항체 반응을 이끌어 내기 위한 백신이 개발되었으나, Globo H의 낮은 항원성 때문에, 이들의 항암 효능은 만족스럽지 못하다. Globo H를 표적으로 하는 면역 반응을 높은 수준으로 이끌어 낼 수 있는 새로운 백신이 필요하다.
줄기 세포는 자가-재생능 및 상이한 유형의 세포와 조직으로의 분화능을 가지는 세포의 무리로 정의된다(Reya T et al., (2001) Nature 414:105-111). 악성 종양 및 정상 조직 둘 모두가 이질적 세포 집단을 함유하기 때문에, 암 줄기 세포는 종양 성장 및 종양 이질성을 유지하는 데 중요할 역할을 수행할 수 있다. 암 줄기 세포는 뇌암, 유방암, 결장암 및 전립선암과 같은 다양한 고형 종양으로부터 동정되었다. 유방암 줄기 세포(BCSC)는 Al-Hajj 등에 의해, NOD/SCID 마우스로의 이종기관이식(xenotransplantation)에서 표현형 다양성을 가지는 종양을 생성하는 이들의 능력에 기초하여, 유방암의 CD24-CD44+ 부분집단에 속하는 것으로 처음 나타났다(Al-Hajj M, et al., (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:3983-3988). 유방암 환자의 골수에서 대부분의 초기 파종(disseminated) 암 세포가 CD24-CD44+의 표현형을 나타내었으며(Balic M et al., (2006) Clin Cancer Res 12:5615-5621), 이는 BCSC가 전이할 수 있음을 시사한다. BCSC는 이들의 성장, 분화 및 전이 능력 및 이들의 방사능에 대한 저항성에 입각하여, 유방암의 치료법에 대한 주요 표적이다(Tang C. et al., (2007) FASEB J. 21:1-9).
Globo H 발현은 유방암에서 도관형(ductal), 소엽상(lobular) 및 관상(tubular) 암종 중 60% 초과에서 관찰되나, 비상피 유방 종양에서는 그렇지 않았다(Mariani-Constantini R et al., (1984) Am . J. Pathol . 115:47-56). Globo H는 면역계에 접근할 수 없는 것으로 보이는 부위인 루멘 가장자리의 첨단 상피 세포(apical epithelial cell)에서의 약한 발현을 제외하고는 정상 조직에서 발현되지 않는다(Id .; Zhang S. et al., (1997) Int . J. Cancer 73:42-49).
Globo H는 또한 유방암 줄기 세포(BCSC)에서 발현된다. 유세포 측정기로, Globo H가 41개 중 25개 유방암 검사물(61.0%)에서 발현되는 것으로 드러났다. 25개 중 25개로부터의 비(non)-BCSC 및 40개 중 8개로부터의 BCSC(20%)가 Globo H를 발현한다. Globo H의 5당류 전구체인 단계-특이적 배아 항원 3(SSEA-3)이 40개 중 31개(77.5%) 종양에서 발현된다. 31개 중 29개로부터의 비-BCSC 및 40개 중 25개로부터의 BCSC(62.5%)는 SSEA-3을 발현한다(Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11667-11672).
Danishefsky 및 Livingston은 이전에 다양한 암에 대한 Globo H-KLH 백신(Gilewski T el al . (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128; Kudryashov V, et al. (1998) Glycoconj J. 15:243-249; Slovin SF et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715) 및 7가 백신(KLH에 각각 따로 컨쥬게이트된 GM2, Globo H, Lewis Y, Tn, STn, TF 및 Tn-MUC1 함유; 문헌 [Sabbatini PJ et al (2007) Clin Cancer Res 13:4170-4177])의 제조를 보고하였다. 그러나, 7가 백신으로 면역화된 환자에서는 GM2 및 Lewis Y 항체를 제외한 7개 중 오직 5개 항원에 대한 항체 반응이 유도되었다. GM2와 같이 도처에 발현되는 항원보다는, 정상 분비 조직에서는 아주 적은 수준으로만 발현되고 종양 세포에서 특별히 발현되는 Globo H가 이것이 백신 개발에 바람직한 표적이게 한다. 이들 연구에서, Globo H 아글리콘(aglycone)의 오존분해에 이어서, KLH 캐리어 단백질을 사용하는 환원성 아민화로, 단백질 당 약 150개의 탄수화물 유닛을 생성하였다(Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem lnt Ed 36: 125-128). 추가의 개선은 MMCCH 링커를 사용함으로써 탄수화물 컨쥬게이션 비를 약 720:1로 증가시켰다(Wang S-K, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:3690-3695). 그러나, 글리코컨쥬게이트(glycoconjugate)를 정밀하게 특징짓는 것이 어렵다. 또한, 면역학적 애주번트 QS-21과 병용한 합성 백신은 전립선 및 전이 유방암 환자 둘 모두에서 주로 IgM을 유도하고, 보다 적은 양의 IgG 항체를 유도하는 것으로 보인다. 또한, 백신은 I상 임상 시험에서 백신접종(vaccination) 부위에서 일시적인 국소 피부 반응을 가지는 최소 독성을 나타내었다(Gilewski T el al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem lnt Ed 36:125-128; Slovin SF et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715). 일부 환자에서 관찰되는 약한 독감-유사 징후는 아마도 QS-21의 부작용과 연관될 것이다. 말레이미드-변형된 캐리어 단백질 KLH에 컨쥬게이트된 5개 전립선 및 유방암 관련 탄수화물 항원-- Globo-H, GM2, STn, TF 및 Tn --을 함유하는 5가 백신이 ELISA 분석법에서 IgM보다 더 높은 역가의 IgG를 가지는 항-Globo H 혈청을 생성하는 것으로 보고되었다(Zhu J. et al. (2009) J. Am . Chem . Soc. 131(26):9298-9303).
따라서, 특히 높은 역가의 IgG와 함께, Globo H에 대한 항체 반응을 증가시키기 위한 대안적인 캐리어 및 애주번트를 동정하고, 최소한의 부작용과 함께 백신 효능을 향상시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 p-나이트로페닐 링커를 통하여 면역원성 캐리어 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)(Th 에피토프)에 화학적으로 컨쥬게이트된 Globo H(B 세포 에피토프)를 함유하는 탄수화물 기반의 백신에 관한 것이다. 당지질 애주번트와 병용하는 합성 백신은 유방암 모델에서 IgG, IgG1 및 IgM 항체를 유도하며, 이종이식 연구에서 지연된 종양형성을 나타내는 예외적인 면역원성을 제공한다. Globo H-DT 및 당지질 C34에 의해 유도된 항원의 글리칸 어레이 분석으로, 항체가 모두 암 세포 및 암 줄기 세포 모두에 대해 특이적인, Globo H 뿐만 아니라, SSEA-3(Gb5) 및 SSEA-4(시알릴 Gb5) 글리칸을 인식하는 것으로 나타났다.
본 발명은 (a) Globo H 또는 이의 면역원성 단편으로 주로 구성되며, 링커를 통해서 캐리어 단백질과 컨쥬게이트되는 글리칸; 및 (b) 수지상 세포(dendritic cell) 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기에서 면역원성 조성물은 IgM 아이소타입(isotype) 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도한다.
몇몇 측면에서, 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이다. 몇몇 측면에서, 링커는 p-나이트로페닐 링커이다.
몇몇 측면에서, 애주번트는 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)의 합성 유사체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 애주번트는 하기의 구조를 포함하는 C34이다:
Figure pct00001
몇몇 측면에서, 면역 반응은 바람직하게는 IgG 아이소타입 항체의 생산을 지향한다. 몇몇 측면에서, 면역원성 조성물은 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 애주번트를 포함한다.
몇몇 측면에서, 면역 반응에 의해 생성된 항체는 암 세포 또는 암 줄기 세포 상에 발현된 항원을 중화시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서, 면역 반응에 의해 생성된 항체는 항원 Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항원 Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 항체는 IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 포함한다.
본 발명은 대상체에서 항암 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 조성물을 포함하는 암 백신에 관한 것이다. 몇몇 측면에서, 암 백신은 유방암, 폐암, 간암, 볼암(buccal cancer), 위암, 결장암, 비인두암, 피부암(dermal cancer), 신장암, 뇌종양, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 장암(intestinal cancer) 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암을 치료하는 데 적합하다.
몇몇 측면에서, 암 조직은 세포의 표면 상에 Globo H 항원을 발현한다. 몇몇 측면에서, Globo H 항원은 유방 종양의 상피 세포 상에서 발현된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 암 백신은 항원 Globo H, Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 항체를 생성한다. 몇몇 측면에서, 항원은 유방암 줄기 세포 상에서 발현된다.
본 발명은 (a) Globo H 또는 이의 면역원성 단편으로 주로 구성되며 링커를 통해서 캐리어 단백질과 컨쥬게이트되는 글리칸, 및 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및 (b) IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 많은 양의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법에 관한 것이다.
본 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 링커는 p-나이트로페놀이며, 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이고, 애주번트는 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)의 합성 유사체이다. 일 실시형태에 있어서, 애주번트는 C34이다.
본 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 면역원성 조성물은 암 백신을 추가로 포함하며, 또한 여기에서 유효량의 암 백신으로의 1회 이상의 치료가 종양 성장을 억제한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 암 백신의 투여는 종양 크기를 감소시킨다.
본 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 면역 반응은 바람직하게 항원 Globo H, Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 IgG 아이소타입 항체의 생산을 지향한다. 몇몇 측면에서, 항원 Globo H, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나는 유방암 줄기 세포 상에서 발현된다. 몇몇 측면에서, Globo H 항원은 유방 종양의 상피 세포 상에서 발현된다.
본 발명은 (a) Globo H 또는 이의 면역원성 단편으로 주로 구성되며 링커를 통해서 캐리어 단백질과 컨쥬게이트되는 글리칸, 및 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하며, IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 암 백신에 관한 것이다.
몇몇 측면에서, 암 백신은 링커가 p-나이트로페놀이고, 캐리어 단백질이 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이며, 애주번트가 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)의 합성 유사체인 면역원성 조성물을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 애주번트는 C34이다.
몇몇 측면에서, 암 백신은 암을 치료하기 위해 사용되며, 여기에서 유효량의 암 백신으로의 1회 이상의 치료는 종양 성장을 억제한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 암 백신의 투여는 종양의 크기를 감소시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서, 암은 유방암, 폐암, 간암, 볼암, 위암, 결장암, 비인두암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 장암 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 (a) Globo H-관련 글리칸 또는 이의 면역원성 단편으로 주로 구성되며 링커를 통해서 캐리어 단백질과 컨쥬게이트되는 글리칸; 및 (b) 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기에서 Globo H-관련 글리칸은 SSEA-3 및 SSEA-4로 구성된 군으로부터 선택되며, 면역원성 조성물은 IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도한다.
면역원성 조성물의 몇몇 측면에서, 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이며, 애주번트는 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)의 합성 유사체이고, 링커는 p-나이트로페닐 링커이다. 일 실시형태에 있어서, 애주번트는 C34이다.
본 발명은 p-나이트로페닐 링커를 통해서 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197) 캐리어 단백질과 컨쥬게이트된 Globo H; 및 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하는 유방암 줄기 세포에 대한 치료제에 관한 것이다. 치료제의 몇몇 실시형태에 있어서, 애주번트는 C34이다.
본 발명은 p-나이트로페닐 링커를 통해서 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197) 캐리어 단백질과 컨쥬게이트된 SSEA-3; 및 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질 C34를 포함하는 애주번트를 포함하는 유방암 줄기 세포에 대한 치료제에 관한 것이다.
본 발명은 p-나이트로페닐 링커를 통해서 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197) 캐리어 단백질과 컨쥬게이트된 SSEA-4를 포함하는 유방암 줄기 세포에 대한 치료제에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치료제는 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 추가로 포함한다.
본 발명의 치료제의 대상체에의 투여는 유방암 줄기 세포(BCSC) 상에서 발현되는 항원을 인식하는 항체의 생성을 유도하며, 여기에서 항원은 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명은 본 발명의 치료제를 투여하는 것을 포함하는 유방암의 치료방법에 관한 것이다.
하기의 도면은 본 발명의 상세한 설명의 일부를 형성하며, 본 개시 내용의 특정 면을 추가로 나타내기 위해 포함되며, 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 실시형태의 상세한 설명과 함께, 하나 이상의 이들 도면을 참조로 하여 더 이해될 수 있다. 특허 또는 출원 파일은 유색으로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 유색 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 복사본은 요청서와 필요한 수수료 납입 시 관련 특허청에서 제공될 것이다.
도 1은 Globo H 및 절단된 유도체의 구조를 나타낸 도면;
도 2A 내지 2C는 각각 모노클로널 항체 VK9 및 Mbr1(Globo H에 대한) 및 항-SSEA-3의 결합 특이성을 나타낸 도면;
도 3A 및 3B는 다양한 Globo H 컨쥬게이트 및 α-GalCer로 백신접종된(vaccinated) 마우스의 혈청학적 반응을 나타낸 도면으로, 3마리의 C57BL/6 마우스 그룹에 피하로, 2 ㎍의 당지질과 함께 또는 이것 없이 1 ㎍의 합성 글리코컨쥬게이트로 백신접종시켰다. 마우스 혈청을 IgM(도 3A) 및 IgG(도 3B) 항체 분석을 위해 각각 1:60 및 1:240으로 희석하였다. Cy3-항-마우스 IgG 또는 IgM 2차 항체를 532 nm, PMT 500 하의 형광 검출을 위해 사용하였다. 데이터는 3마리의 마우스의 평균 형광 강도 ± SEM으로 나타내었다;
도 4는 α-GalCer와 유사체의 구조를 나타낸 도면;
도 5는 Globo H 컨쥬게이트와 α- GalCer 유도체로 백신접종된 마우스의 IgM 수준을 나타낸 도면으로, 해당 도면에 나타낸 바와 같이, 2차 및 3차 백신접종 후에 마우스 혈청을 수집하고 분석하였다. Cy3 2차 항-마우스 IgM을 532 nm, PMT 400 하의 검출을 위해 사용하였다. 결과는 3마리의 마우스의 평균 형광 강도 ± SEM으로 나타내었다;
도 6은 백신접종 후에, 마우스 폴리클로널 항체(항-Globo H, 항-Gb5, 항-SSEA-4 및 항-Gb4)의 정교한 특이성을 나타낸 도면으로, 마우스 혈청을 2 ㎍의 애주번트와 함께 또는 이것 없이 1.6 ㎍의 GH-DT의 3차 백신접종 2주 후에 수득하였다(암컷, Balb/c, 근육내). 글리칸 마이크로어레이(microarray)에 의해 IgG 역가를 분석하고, PMT 400 하에 1000(백그라운드(background)에 대해 10배)을 초과하는 MFI를 산출하는 가장 높은 희석도로 정의하였다. 각 점은 개별 마우스 역가를 나타낸다;
도 7은 상이한 애주번트를 가지는 Globo H-DT의 IgM 대 IgG 항체 역가를 나타낸 도면;
도 8은 GH-KLH 백신과의 애주번트 활성의 평가를 나타낸 도면; 암컷 Balb/c 마우스를 근육내로 1.6 ㎍의 GH-KLH 및 2 ㎍의 지정된 애주번트로 백신접종하고, 백신접종 이후 매 2주 마다 채혈하였다. 혈청을 희석하고, 마이크로어레이 분석에 도입하였다;
도 9는 면역화 이후의 항체 아이소타입 프로필을 나타낸 도면으로, 마우스를 기재된 바와 같이 백신접종하였다. 혈청(1:60 희석)을 항체 하위분류 분석을 위해 마이크로어레이에 도입하였다(532㎚, PMT 300). 데이터는 3마리의 마우스의 평균 형광 ± SEM으로 나타내었다;
도 10은 상이한 종류의 당지질 애주번트와 함께 SSEA-3-DT 또는 SSEA-4-DT에 의해 유도된 IgM 대 IgG의 항체 역가를 나타낸 도면;
도 11은 세포 표면 상의 24가지 글리칸의 구조를 나타낸 도면;
도 12a 내지 12c는 상이한 백신에 의해 유도된 IgG의 교차 반응성 연구를 나타낸 도면으로, 도 12a: C1 애주번트와 함께 Globo H-DT에 의해 유도된 항-Globo H IgG; 도 12b: C1 애주번트와 함께 Gb5-DT에 의해 유도된 항-Gb5 IgG; 도 12c: C1 애주번트와 함께 SSEA-4-DT에 의해 유도된 항-SSEA-4 IgG;
도 13은 마우스 이종이식 모델을 나타낸 도면으로, 2×105 4T1 마우스 전이성 유방 종양 세포를 멸균한 PBS 중에 준비하고, 백신접종된 Balb/c 마우스에 피하로 주사하였다. 마우스 종양 크기를 버니어 캘리퍼(Vernier caliper)로 측정하고, (길이×높이×너비)/2(㎣)로 정의하였다;
도 14는 Globo H 하프 에스터(half ester)와 글리코컨쥬게이트의 합성을 도식적으로 나타낸 도면;
도 15는 원발성 유방암 줄기 세포에서 SSEA-4 발현의 유세포 분석을 나타낸 도면으로, BCSC 및 비-BCSC의 표면상에서의 SSEA-4의 발현을 4-색 면역형광 염색에 이어서 유세포 분석으로 평가하였다. BCSC는 왼쪽 패널에 나타낸 바와 같이, CD45-/CD24-/CD44+ 세포로 정의되며, 비-BCSC는 CD45- 세포의 다른 모집단으로 정의된다. BCSC 및 비-BCSC 상에서의 관심 항원의 발현은 가운데 및 오른쪽 패널에 각각 나타내었다. 점선은 아이소타입 대조군을 나타내며, 숫자는 양성 세포의 퍼센트를 나타낸다;
도 16은 정상 조직에서의 SSEA-4의 제한된 발현을 나타낸 도면으로, 정상 조직 어레이의 면역조직화학적 염색을 사용하여 유방, 소장 및 직장에서의 SSEA-4의 발현을 시험하였다. SSEA-4에 대한 양성의 염색은 상피 세포의 첨단면에 제한되었다.
본 발명은 DT-CRM 197이 수십 년간 디프테리아에 대한 인간 백신접종에 널리 사용되어온 이유뿐 아니라, 이의 높은 면역원성 때문에 Globo H 및 SSEA-4를 위한 유망한 캐리어 단백질이라는 놀라운 발견에 관한 것이다. 무엇보다, 이는 다양한 글리코컨쥬게이트 백신을 위해 FDA에 의해 승인되었다. 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)은 천연 분자의 면역학적 특성을 공유하고, 종종 암에서 과발현되는 DT에 대한 특정 세포-막 수용체인, 헤파린-결합 상피 성장 인자(HB-EGF)에 대한 이의 결합능을 공유하는 DT의 비독성 돌연변이(G52E)이다(Buzzi S. et al., Cancer Immunology, Immunotherapy (2004), 53(11):1041-1048).
C34를 애주번트로 사용함으로써, GH-DT 및 SSEA-4-DT 둘 모두가 종양 항원에 대하여 IgM 항체보다 IgG를 더 유도하기 위한 가장 효과적인 면역 반응을 나타냈다. C34와 병용한 GH-DT는 Globo H뿐만 아니라, SSEA-3(Gb5) 및 SSEA-4(모두 유방암 세포 및 암 줄기 세포에 대하여 특이적임)도 중화시키는 항체를 유도하였다.
또한, 개시된 글리칸 마이크로어레이는 항체 특이성 시험에 대한 강력한 발판을 제공하며, 백신 시험과 면역화 이후 이들의 면역 반응의 모니터링을 위한 환자의 동정에 유용하다.
다음의 설명에서, 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부한 도면을 참고하며, 여기에서 실시될 수 있는 특정 실시형태를 예시의 방법으로 나타내었다. 이들 실시형태는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 상세히 기재되며, 다른 실시형태들도 이용될 수 있고 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 한 구조적, 논리적 및 전기적 변화를 가할 수 있음을 알아야 한다. 따라서, 하기의 예시적인 실시형태의 상세한 설명은 제한적인 의미가 아니며, 본 발명의 범주는 첨부한 특허청구범위에 의해서 정의된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 업계의 숙련자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료가 여기에 기재된다. 본 명세서에 특별히 언급된 모든 공개문헌 및 특허는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 공개문헌에 보고된 화학물질, 세포주, 벡터, 동물, 기기, 통계 분석 및 방법을 기재 및 개시하는 것을 비롯한 모든 목적을 위해 참조로 포함된다. 본 상세한 설명에 게시된 모든 참고문헌은 해당 업계의 기술 수준을 시사하는 것으로 취해야 한다. 본 명세서에서, 본 발명은 이러한 개시 내용이 선행 발명보다 선행하도록 할 수 없게 하는 승인으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 재료 및 방법을 기재하기 전에, 본 발명이 기재된 특정 방법, 프로토콜, 재료 및 시약에 제한되지 않고, 이들이 변할 수 있음을 이해한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어가 특정 실시형태만을 기재하기 위한 목적이며, 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니고, 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것임이 이해되어야 한다.
정의
단수형의 "부정관사"("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 분명하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 또한, 용어 "하나"("a" 또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "포함하는"("comprising"), "함유하는"("including") 및 "갖는"("having")이 상호호환적으로 사용될 수 있음을 알아야 한다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 해당 분야의 기술 내에 있는 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 기술을 사용할 것이다. 이들 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 이하의 문헌들[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; 및 Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)]을 참고할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "지질"은 세포 시그널링 경로에 참여하는 임의의 지용성 (지방 친화성) 분자를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "당지질"은 세포 인식을 위한 마커로서 소용되는 탄수화물-부착형 지질을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알파-갈락토실 세라미드" 및 "α-GalCer"는 자연 살해 T 세포가 T 헬퍼(TH)1 및 TH2 사이토카인 둘 모두를 생산하도록 자극하는 당지질을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 당지질 유도체 C34는 이하의 구조를 갖는다:
Figure pct00002
본 개시 내용의 α-GalCer 유사체는 세균 기원의 α-GalCer 유사체(그룹 I: C2, C3 및 C14), 술폰화로 변형된 α-GalCer 유사체(그룹 II: C4, C5 및 C9), 페닐-알킬 사슬 α-GalCer 유사체(그룹 III: C6-C8, C1O-C11, C15-C16, C18-C34, C8-5 및 C8-6) 및 피토스핑고신 절단된 α-GalCer 유사체(그룹 IV: C12, C13 및 C 17)를 포함한다. C34 및 다른 알파-갈락토실 세라미드 유사체의 구조 및 이들의 애주번트로서의 용도는 PCT 특허 출원 제PCT/US2008/060275호(출원일: 2008년 4월 14일)에 상세히 개시되어 있다.
C34를 비롯한 합성 α-GalCer 유사체는 CD1d 분자와 복합체를 형성할 수 있다. 합성 α-GalCer 유사체는 NKT T-세포 수용체에 의해 인식될 수 있다. 합성 α-GalCer 유사체는 TH1-형, TH2-형, 또는 TH1-형 및 TH2-형 반응을 이끌어 낼 수 있다. α-GalCer 유사체는 시험관 내에서 NKT를 활성화시킬 수 있다. α-GalCer 유사체는 생체 내에서 NKT를 활성화시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "글리칸"은 다당류 또는 올리고당류를 말한다. 또한, 글리칸은 당단백질, 당지질, 당펩티드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 지질다당류 또는 프로테오글리칸과 같은 글리코컨쥬게이트의 탄수화물 부분을 언급하기 위하여 본 명세서에서 사용된다. 글리칸은 통상 단당류 사이의 O-글리코시드 결합으로만 구성된다. 예를 들어, 셀룰로스는 β-1,4-결합된 D-글루코오스로 구성된 글리칸(또는 더욱 자세히는 글루칸)이며, 키틴은 β-1,4-결합된 N-아세틸-D-글루코사민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 단당류 잔기의 호모 또는 헤테로폴리머일 수 있으며, 선형 또는 분지형일 수 있다. 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 부착된 글리칸이 관찰될 수 있다. 이들은 일반적으로 세포의 외표면 상에서 관찰된다. O- 및 N-결합된 글리칸은 진핵생물에서는 매우 일반적이나, 일반적이지 않지만, 원핵생물에서도 관찰될 수 있다. 세쿠온(sequon)에서 아스파라긴의 R-그룹 질소(N)에 부착된 N-결합된 글리칸이 관찰된다. 세쿠온은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "당단백질"은 글리칸(들)으로 공유적으로 변형된 단백질을 말한다. 4가지 유형의 당단백질이 있다: 1) N-결합된 당단백질, 2) O-결합된 당단백질(뮤신), 3) 글루코사미노글리칸(glucosaminoglycan)(GAG, 프로테오글리칸으로도 칭함), 4) GPI-고정형(anchored). 대부분의 당단백질은 구조적 미소-이질성(micro-heterogeneity)(동일한 당화 부위 내에 부착된 다중의 상이한 글리칸 구조) 및 구조적 거대-이질성(macro-heterogeneity)(다수의 글리칸 부착 부위 및 유형)을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원"은 면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 임의의 물질로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원"은 항원, 또는 DNA 백신과 같은 항원의 생성을 유도할 수 있는 물질을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성"은 면역원, 항원 또는 백신의 면역 반응 자극 능력을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역요법"은 예방 및/또는 치료 목적을 달성하기 위하여 면역계를 조절하는 개념에 기초한 다수의 치료 전략을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CD1d"는 다양한 인간 항원-제시 세포의 표면 상에 발현된 당단백질의 CD1(분화 클러스터 1) 패밀리의 구성원을 말한다. 지질 항원을 제시하는 CD1d는 자연 살해 T 세포를 활성화시킨다. CD1d는 당지질 항원이 결합하는 깊은 항원-결합 그루브(groove)를 갖는다. 수지상 세포 상에 발현된CD1d 분자는 α-GalCer 유사체, 이를 테면 C34를 비롯한 당지질과 결합할 수 있으며, 이를 제시할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "적응성 면역계"(adaptive immune system)는 병원성 시험감염(challenge)을 제거하는 고도의 특수화된 전신 세포 및 과정을 말한다. 적응성 면역계의 세포는 림프구로 불리는 백혈구의 한 유형이다. B 세포 및 T 세포는 림프구의 주요 유형이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "T 세포" 및 "Ts"는 세포-매개의 면역에서 중추적인 역할을 수행하는 림프구로 알려진 백혈구 그룹을 말한다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)라 불리우는, 이들의 세포 표면 상의 특별한 수용체의 존재에 의하여 B 세포 및 NK와 같은 다른 림프구 유형과 구별될 수 있다. 각각 독특한 기능을 가지는 몇몇 상이한 T 세포의 서브세트가 기술되었다. 헬퍼 T(TH) 세포는 적응성 면역계의 "중개자"이다. 활성화되면, 이들은 신속하게 분리되고, 면역 반응을 조절하거나 "돕는" 사이토카인으로 불리우는 작은 단백질을 분비한다. 수용된 사이토카인 신호에 의존적으로, 이들 세포는 TH1, TH2, TH17, 또는 다른 서브세트 중 하나로 분화되며, 이들은 상이한 사이토카인을 분비한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원-제시 세포"(APC)는 이의 표면상에 주조직 적합성 복합체(MHC)와 복합체를 형성하는 외래 항원을 나타내는 세포를 말한다. T-세포는 이들의 TCR을 사용하여 이 복합체를 인식할 수 있다. APC는 전문적 및 비-전문적의 2가지 카테고리로 나뉜다. 수지상 세포(DC)는 전문적 카테고리에 해당하며, CD1과 관련하여 항원을 T 세포에 제시할 수 있다. 예시적인 실시에서, 본 개시 내용의 방법에서 사용되는 DC는 한 실시에서는 림프구, 또는 다른 실시에서는 골수성 골수 전구세포로부터 분화되는 몇몇 DC 서브세트 중 임의의 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "나이브 세포(naive cell)"는 아직 특정 병원체를 인식하도록 특수화되지 않은 미분화 면역계 세포, 예컨대 CD4 T-세포를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자연 살해 세포" 및 "NK"는 바이러스 및 기타 세포내 병원체에 대한 선천적 숙주 방어를 담당하는 인터페론에 의하여 활성화되는 림프 세포의 분류를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자연 살해 T 세포"(NKT)는 통상적인 T 및 NK 둘 모두와 특징/수용체를 공유하는 T 세포의 서브세트를 말한다. 많은 이들 세포는 자가- 및 외래 지질 및 당지질과 결합하는 항원 제시 분자인 비-다형성 CD1d 분자를 인식한다. NKT의 TCR은 CD1d 분자에 의해 제시된 (샤페론형(chaperoned)) 당지질 항원을 인식할 수 있다. NKT의 주요 반응은 자극 후의 IL-4, IFN-γ 및 IL-10을 비롯한 사이토카인의 신속한 분비이며, 이에 따라 다양한 면역 반응 및 발병 과정에 영향을 미친다. NKT는 균질적인 모집단 또는 이질적인 모집단일 수 있다. 하나의 예시적인 실시에 있어서, 모집단은 예를 들어, 다양한 TCR을 발현하며, 또한 다량의 IL-4 및 IFN-γ를 생산할 수 있는 CD1d-반응성 비-불변 T 세포의, 인간 및 마우스 골수 및 인간 간 T 세포 모집단을 포함할 수 있는 "비-불변 NKT"일 수 있다. 가장 잘 알려진 CD1d-의존성 NKT의 서브세트는 불변 TCR-알파(TCR-α) 사슬을 발현한다. 이들은 I형 또는 불변 NKT(iNKT)로 언급된다. 이들 세포는 인간(Vα24i NKT)과 마우스(Vα14i NKT) 사이에 보존되며, 많은 면역학적 과정에 연루된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "사이토카인"은 통상 전구체 세포가 별개의 특수화된 세포형으로 되게 하는 유전자 발현에서의 변화를 포함하여, 면역 세포 분화 과정에 영향을 미침으로써 면역 반응의 강도와 기간을 조절하는 임의의 수많은 작은 분비된 단백질을 말한다. 사이토카인은 이들의 추정 기능, 분비 세포 또는 활동 표적에 기초하여, 림포카인, 인터류킨 및 케모카인으로 다양하게 명명되었다. 예를 들어, 몇몇 일반적인 인터류킨에는 IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21 및 TGF-β가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "케모카인"은 림프구의 활성화 및 가동화를 위한 수단을 제공하는, 감염 부위에 방출되는 임의의 다양한 작은 화학주성 사이토카인을 말한다. 케모카인은 백혈구를 감염 부위로 유인한다. 케모카인은 이들을 4가지 그룹으로 지정되게 하는 보존된 시스테인 잔기를 갖는다. 대표적인 케모카인과 함께 그 그룹은 C-C 케모카인(RANTES, MCP-1, MIP-1α 및 MIP-1β), C-X-C 케모카인(IL-8), C 케모카인(림포택틴(Lymphotactin)) 및 CXXXC 케모카인(프랙탈린(Fractalkine))이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TH2-형 반응"은 사이토카인, 인터페론, 케모카인의 특정 유형이 생성되도록 하는 사이토카인 발현 패턴을 말한다. 전형적인 TH2 사이토카인에는 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TH1-형 반응"은 사이토카인, 인터페론, 케모카인의 특정 유형이 생성되도록 하는 사이토카인 발현 패턴을 말한다. 전형적인 TH1 사이토카인에는 IL-2, IFN-γ, GMCSF 및 TNF-β가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TH1 편재(biased)"는 TH1 사이토카인 및/또는 케모카인의 생성이 TH2 사이토카인 및/또는 케모카인의 생성보다 더 큰 범위로 증가되는 면역 반응을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자의 부분으로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "백신"은 전체 질환-유발 유기체(이하의 구조되거나 약화된) 또는 이들 유기체의 성분, 이를 테면 단백질, 펩티드 또는 다당류로 구성된 항원을 함유하며, 유기체가 유발하는 질환에 대한 면역성을 부여하기 위해 사용되는 제제를 말한다. 백신 제제는 천연이거나, 합성이거나, 재조합 DNA 기술에 의해 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역학적 애주번트"는 면역원과 컨쥬게이트되어 사용되며, 면역원에 대한 면역 반응을 증진시키거나 변경하는 물질을 말한다. 본 개시 내용의 α-GalCer 유사체는 백신이 투여된 환자의 면역계를 백신에 대하여 더 격렬하게 반응하도록 자극함으로써, 백신의 효과를 변경하거나 증가시키는 면역학적 애주번트로 사용된다. 예시적인 실시에 있어서, 유사체 C34는 애주번트로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알룸(alum) 애주번트"는 면역 애주번트 활성을 가지는 알루미늄 염을 말한다. 이 제제는 용액 중의 단백질 항원을 흡수하고 침전시키며; 생성된 침전물은 접종 부위에 형성된 백신 데포(depot)로부터의 항원의 느린 방출을 촉진시킴으로써 백신 면역원성을 향상시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항-종양 면역요법 활성제"는 종양을 억제, 감소 및/또는 제거하는 본 개시 내용의 백신에 의해 생성된 항체를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원 특이적"은 특정 항원, 또는 항원의 단편의 공급이 특정 세포 증식을 야기하도록 하는 세포 모집단의 특성을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유세포 분석" 또는 "FACS"는 광학 및 전자 검출 장치를 통하여, 유체의 스트림 중에 현탁화된 입자 또는 세포의 물리적 및 화학적 특성을 시험하는 기술을 의미한다.
펩티드 내의 아미노산 잔기는 하기에서 다음과 같은 축약될 것이다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F; 류신은 Leu 또는 L; 아이소류신은 Ile 또는 I; 메티오닌은 Met 또는 M; 발린은 Val 또는 V; 세린은 Ser 또는 S; 프롤린은 Pro 또는 P; 트레오닌은 Thr 또는 T; 알라닌은 Ala 또는 A; 티로신은 Tyr 또는 Y; 히스티딘은 His 또는 H; 글루타민은 Gln 또는 Q; 아스파라긴은 Asn 또는 N; 라이신은 Lys 또는 K; 아스파르트산은 Asp 또는 D; 글루탐산은 Glu 또는 E; 시스테인은 Cys 또는 C; 트립토판은 Trp 또는 W; 아르기닌은 Arg 또는 R; 글리신은 Gly 또는 G. 아미노산의 추가의 설명에 대해서는 문헌 [Proteins: Structure and Molecular Properties by Creighton, T. E., W. H. Freeman & Co., New York 1983]을 참고한다.
본 명세서에 개시된 조성물은 본 개시 내용을 읽는다면 당업자에게 의해 확인될 수 있는 부가적 활성제, 담체(혹은 캐리어), 비히클(vehicle), 부형제, 또는 보조제와 함께 약제학적 또는 기능식품 조성물에 포함될 수 있다.
약제학적 또는 기능식품 조성물은 바람직하게는 적어도 1개의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 약제학적 조성물에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 "활성제"로도 지칭되는 "활성 화합물"을 형성한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여와 호환성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보조적 활성 화합물도 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적 조성물은 목적하는 투여 경로와 호환성이 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구적, 예컨대 정맥내, 피부내, 피하, 경구(예컨대 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구적, 피부내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함할 수 있다: 주사를 위한 물과 같은 멸균 희석제, 염수 용액, 고정된 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질알코올 또는 메틸파라벤; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산 나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충액, 예컨대 아세테이트, 사이트레이트, 또는 포스페이트 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성을 조절하기 위한 제제를 포함한다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기를 사용하여 조절할 수 있다. 비경구적 제제는 앰풀, 1회용 바늘, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다회용 바이얼에 포장될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 대상체는 인간 및 비인간 영장류(예컨대 고릴라, 마카크, 마모셋), 가축(예컨대 양, 암소, 말, 당나귀, 및 돼지), 반려 동물(예컨대 개, 고양이), 실험실 시험 동물(예컨대 마우스, 토끼, 랫트, 기니아 피그, 햄스터), 잡힌 야생 동물(예컨대 여우, 사슴) 및 본 발명의 개시 내용의 제제로부터 유익할 수 있는 임의의 기타 유기체를 포함한다. 본 명세서에 개시된 제제로부터 유익할 수 있는 동물 유형에 대해서는 제한이 없다. 인간인식 또는 비-인간 유기체인식 여부에 관계없이 대상체는 환자, 개체, 동물, 숙주 또는 수여자로 지칭될 수 있다.
주사 용도로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위하여, 적합한 담체는 생리적 염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor EL™(미국 뉴져지주 파시패니 소재의 바스프(BASF)사 제품), 또는 인산 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균이어야 하고 또 용이하게 주사기에 존재하도록 유체이어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산 매질 및 이의 적합한 혼합물일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 이용하는 것에 의해, 분산액의 경우 소망하는 입자 크기를 유지하는 것에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에서, 등장제, 예컨대, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 흡수 연장은 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예컨대 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴을 포함하는 것에 의해 야기될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요에 따라 상기 열거된 성분 중의 하나 또는 그 조합물과 함께 적절한 용매 중에 소망하는 양의 활성 화합물을 혼입한 다음 멸균 여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본적 분산 매질 및 상기 열거한 것으로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입하여 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에서, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조를 포함하며, 그로 인하여 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말 및 소망하는 임의의 부가적 성분을 얻는다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료적 투여 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되어 정제, 구내정(troch), 또는 캡슐, 예컨대 젤라틴 캡슐 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세정제로서 사용하기 위하여 유체 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 약제학적 혼화성 결합제, 또는 애주번트 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 구내정 등은 이하의 성분 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 미세결정성 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 녹말 또는 락토오스와 같은 부형제; 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 녹말과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘 또는 스테로트(sterotes)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 광택제; 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살라실레이트 또는 오렌지 향과 같은 향미제.
흡입에 의해 투여하기 위하여, 화합물은 적합한 추진제, 예컨대 이산화탄소와 같은 가스, 또는 네뷸라이저(nebulizer)를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서(dispenser)로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과되는 배리어(barrier)에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 경점막 투여의 경우, 세제, 담즙 염, 및 후시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 경비 스프레이 또는 좌약의 사용을 통하여 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 샐브(salves), 젤, 또는 크림으로 제형화된다. 화합물들은 또한 좌약형태(예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기제를 사용) 또는 직장 전달을 위해 정체 관장 형태로 제조될 수 있다.
실시에 따르면, 활성 화합물은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달계를 비롯하여 방출 조절형 제형과 같이 몸으로부터 신속한 제거로부터 화합물을 보호할 것인 담체와 함께 제조한다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하기 위한 방법은 당업자들이 숙지하고 있을 것이다. 재료는 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티컬스 인코포레이티드(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 구입할 수 있다. 또한, 리포좀 현탁액(세포-특이적 항원에 대한 모노클로널 항체를 갖는 감염된 세포를 표적화하는 리포좀 포함)은 제약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라서, 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
투여의 용이성 및 투여의 균일성을 위하여 투여 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 처리될 대상체에 대하여 균일 투여량으로 적합한 물리적으로 분할되는 단위를 지칭하며; 각 단위는 소망하는 약제학적 담체와 조합되어 소망하는 치료 효과를 내기 위하여 산출된 활성 화합물의 미리결정된 양을 함유한다.
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 LD50(모집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(모집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위하여 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 과정에 의하여 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며 또 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있지만, 비감염 세포에 대한 있을 수 있는 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위하여, 감염 부위 위치에 이러한 화합물을 표적으로 하는 전달계를 고안하도록 주의해야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 용량 범위를 결정하는데 이용될 수 있다. 이러한 화합물의 용량은 바람직하게는 독성이 적거나 거의 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 존재한다. 용량은 이용된 투여 형태 및 이용된 투여 경로에 따라서 상기 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 화합물의 경우, 치료적으로 효과적인 용량은 처음에 세포 배양 분석으로부터 추산될 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 측정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 최대 억제의 1/2을 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하는 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장 중의 수준은 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, 활성 화합물의 치료적 유효량(즉, 효과적인 투여량)은 체중 1㎏당 약 0.001 내지 100 g/kg 범위, 또는 과도한 실험없이 당업자들에게 명백하고 이해할 수 있는 다른 범위일 수 있다. 당업자는 비제한적으로 질병 또는 증상의 심각도, 이전의 치료, 대상체의 일반적인 건강 또는 연령 및 존재하는 기타 질병을 비롯한 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하기 위하여 필요한 용량과 시기에 영향을 줄 수 있음을 인식할 것이다.
다른 측면에 따르면, 하나 이상의 부분들의 키트(kit)는 당업자에 의해 구상될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 방법 중의 적어도 하나를 실시하는 부분들의 키트, 둘 이상의 조성물을 포함하는 부분들의 키트, 상술한 방법 중 적어도 하나에 따른 본 명세서에 개시된 조성물의 유효량을 단독 또는 조합물로 포함하는 조성물이 개시된다.
또한, 키트는 아마도, 활성제, 생물학적 사건의 식별자 또는 본 개시 내용을 읽는다면 당업자에게 의해 확인될 수 있는 다른 화합물을 포함한다. 키트는 또한 본 명세서에 개시된 조성물의 유효량을 포함하는 적어도 하나의 조성물 또는 세포주를 포함할 수 있다. 부분들의 키트의 조성물 및 세포주는 당업자에 의해 식별가능한 과정에 따라 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 방법을 실시하기 위하여 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 아미노산 잔기의 임의의 멀티머 또는 폴리머를 말한다. 폴리펩티드는 둘 이상의 폴리펩티드 사슬로 구성될 수 있다. 폴리펩티드는 단백질, 펩티드 및 올리고펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있다. 폴리펩티드는 변형된 아미노산 잔기, 아미노산 유사체 또는 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 비-아미노산 잔기에 의해 개재될 수 있다. 천연적인 것이든 또는 개입, 예컨대 이황화 결합의 형성, 당화, 지질화(lipidation), 메틸화, 아세틸화, 인산화에 의한 것이든 또는 조작, 이를 테면 표지 성분(labeling component)과의 컨쥬게이션에 의한 것이든, 변형된 아미노산 폴리머가 정의 내에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은 결합 쌍(예컨대 항체와 항원) 간의 상호작용을 말한다. 다양한 예에서, 특이적인 결합은 약 10-6 몰/리터(㏖/ℓ), 약 10-7 몰/리터, 또는 약 10-8 몰/리터 미만의 친화도 상수에 의해 구현될 수 있다.
본 발명의 암 백신
본 발명의 일 실시형태는 Globo H 또는 이의 단편(예컨대 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3, Gb5로도 알려짐), 또는 SSEA-4) 중 하나 및 애주번트를 함유하는 면역 조성물의 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법이다. 표적 암 유형에는 유방암(1-4기 포함), 폐암(예컨대 소세포폐암), 간암(예컨대 간세포 암종), 구강암(oral cancer), 위암(T1-T4 포함), 결장암, 비인두암, 이하의 구조암, 신장암, 뇌종양(예컨대 성상세포종, 다형성교모세포종 및 뇌수막종), 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암 및 자궁내막, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종 및 위장관 기질 종양이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
부위로 분류된 암에는 구강 및 인두의 암(입술, 혀, 침샘, 입바닥, 잇몸 및 다른 입안, 비인두, 편도, 이하의 구조, 하인두, 다른 경구/인두); 소화계의 암(식도; 위; 소장; 결장 및 직장; 항문, 항문관 및 항문직장; 간; 간내 담관; 담낭; 다른 담도; 췌장; 후복막; 복막, 그물막 및 장간막; 다른 소화계); 호흡계의 암(비강, 중이 및 부비강; 후두; 폐 및 기관지; 흉막; 기도, 종격 및 다른 호흡계); 중피종의 암; 뼈 및 관절; 및 심장을 비롯한 연조직; 흑색종 및 다른 비-상피 피부암을 비롯한 피부암; 카포시 육종 및 유방암; 여성 생식계의 암(자궁경; 자궁체; 특정되지 않은 다른 자궁; 난소; 질; 음문; 및 다른 여성 생식기); 남성 생식계의 암(전립샘; 정소; 음경; 및 다른 남성 생식기); 비뇨계의 암(방광; 신장 및 신우; 요관; 및 다른 비뇨계); 눈 및 안와의 암; 뇌 및 신경계의 암(뇌; 및 다른 신경계); 내분비계의 암(갑상샘 및 가슴샘을 비롯한 다른 내분비); 림프종(호지킨병 및 비-호지킨성 림프종), 다발성 골수종 및 백혈병(림프구성 백혈병; 골수성 백혈병; 단구성 백혈병; 및 다른 백혈병)이 포함된다.
본 발명에 따른 암 백신에 대한 적합한 표적일 수 있는, 조직학적 유형에 의해 분류되는 다른 암에는 악성 신생물; 특정되지 않은 다른 암종; 특정되지 않은 다른 미분화 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 특정되지 않은 다른 소세포 암종; 특정되지 않은 다른 유두암종; 특정되지 않은 다른 편평 세포 암종; 림프표피 암종; 특정되지 않은 다른 기저 세포 암종; 모발기질 암종; 특정되지 않은 다른 이행 세포 암종; 유두 이행 세포 암종; 특정되지 않은 다른 샘암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 특정되지 않은 다른 간세포 암종; 복합성 간세포 암종 및 담관암종; 육주의 샘암종; 샘낭암종; 샘종폴립증에서의 샘암종; 샘암종, 가족성 폴립증; 특정되지 않은 다른 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 기관지폐포암종; 특정되지 않은 다른 유두모양샘암종; 혐색소성 암종; 호산구 암종; 호산성 샘암종(Oxyphilic adenocarcinoma); 호염기구 암종; 특정되지 않은 다른 투명 세포 샘암종; 과립 세포 암종; 특정되지 않은 다른 여포상 샘암종; 유두상 및 여포상 샘암종; 비캡슐화 경화 암종(Nonencapsulating sclerosing carcinoma); 부신 피질 암종; 자궁내막유사 암종(Endometroid carcinoma); 피부 부속기 암종; 아포크린 샘암종; 피지샘암종; 귀지 샘암종; 점액표피양 암종; 특정되지 않은 다른 낭샘암종; 특정되지 않은 다른 유두상 낭샘암종; 유두상 장액 낭샘암종; 특정되지 않은 다른 점액낭샘암종; 점액샘암종; 반지세포암종; 침윤성 관상 암종; 특정되지 않은 다른 속질암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파제트병; 샘꽈리 세포 암종; 선평편암종(Adenosquamous carcinoma); 편평상피화생이 있는 샘암종; 악성 흉선종; 악성 난소 간질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립층 세포 종양; 악성 남성모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 레이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관육종(Glomangiosarcoma); 특정되지 않은 다른 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 얕은 확산 흑색종; 거대 색소 모반에서의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색모반; 특정되지 않은 다른 육종; 특정되지 않은 다른 섬유육종; 악성 섬유 조직구종; 점액육종; 특정되지 않은 다른 지방육종; 특정되지 않은 다른 평활근육종; 특정되지 않은 다른 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 특정되지 않은 다른 간질 육종; 특정되지 않은 다른 악성 혼합 종양; 뮐러리안 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 특정되지 않은 다른 암육종; 악성 간엽종; 악성 브렌너 종양; 악성 엽상 종양; 특정되지 않은 다른 윤활막 육종; 악성 중피종; 미분화세포종; 특정되지 않은 다른 배아 암종; 특정되지 않은 다른 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 특정되지 않은 다른 골육종; 측피질(Juxtacortical) 골육종; 특정되지 않은 다른 연골육종; 악성 연골모세포종; 중갑엽연골육종; 뼈의 거대 세포 종양; 유윙육종; 악성 치원성 종양; 사기질모세포 치아육종(Ameloblastic odontosarcoma); 악성 사기질모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경아교종; 특정되지 않은 다른 뇌실막세포종; 특정되지 않은 다른 성상세포종; 원형질성 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 별모세포종; 특정되지 않은 다른 아교모세포종; 특정되지 않은 다른 희소돌기아교세포종; 희소돌기아교모세포종; 원치신경외배엽종양; 특정되지 않은 다른 소뇌 육종; 신경절모세포종; 특정되지 않은 다른 신경모세포종; 특정되지 않은 다른 망막모세포종; 후신경원성 종양; 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립 세포 종양; 특정되지 않은 다른 악성 림프종; 특정되지 않은 다른 호지킨병; 호지킨병; 특정되지 않은 다른 부육아종; 악성 소림프구 림프종; 대세포성 악성 림프종; 특정되지 않은 다른 악성 소포 림프종; 균상식육종; 다른 특정된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 특정되지 않은 다른 백혈병; 특정되지 않은 다른 림프구성 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 특정되지 않은 다른 골수성 백혈병; 호염기구 백혈병; 호산구 백혈병; 특정되지 않은 다른 단핵구 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발상 세포 백혈병이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는"은 암, 암의 징후 또는 암에 대한 소인이 있는 대상체에게, 암, 암의 징후 또는 암에 대한 소인을 구제, 치유, 경감, 완화, 변경, 치료, 개량, 개선, 또는 영향을 줄 목적으로, 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 병용하여, 대상체에 대한 치료적 효과를 부여하는 데 필요한 각 활성제의 양을 말한다. 유효량은 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 투여 경로, 부형제 사용 및 다른 활성제와의 공동-사용에 따라 달라진다.
상술된 방법에 사용되는 면역 조성물은 Globo H 또는 이의 단편인 글리칸(즉, 당 부분(moiety)을 함유하는 분자) 및 애주번트를 함유할 수 있다. Globo H는 6당류 에피토프(Fucα1→2 Galβ1→3 GalNAcβ1→3 Galα1→4 Galβ1→4 Glc) 및 임의로, 비-당 부분을 함유하는 글리칸이다. 이의 단편은 6당류 에피토프의 단편 및 적용가능하다면 비-당 부분을 함유하는 글리칸이다. 이들 올리고당류는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다(문헌 [Huang et al., Proc . Natl . Acad . Scl . USA 103:15-20 (2006)] 참고). 필요에 따라, 이들은 비-당 부분에 결합될 수 있다.
모 출원인 미국 특허 출원 제12/485,546호는 (1) Globo H의 바로 앞단계 전구체(immediate precursor)인 SSEA-3이 유방암 줄기 세포에서 높은 수준으로 발현되어, 유방암 치료에 적합한 표적으로 삼을 수 있고, (2) α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)가 항-Globo H 및 항-SSEA-3 항체의 생성을 증진시키는 효과적인 애주번트라는 예기치 않은 발견을 기초로 한 것이다.
미국 특허 출원 제12/485,546호는 Globo H 또는 이의 단편(예를 들어, SSEA-3) 및 애주번트(예를 들어, α-GalCer)를 함유하는 면역 조성물을 특징으로 한다. Globo H 또는 이의 단편은 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH)과 컨쥬게이트될 수 있다. 대상체(예를 들어, 인간)에 투여되는 경우, 면역 조성물은 Globo H 또는 이의 단편을 표적으로 하는 면역 반응(예를 들어, 항체 생성)을 이끌어내어, 암(예를 들어, 유방암, 전립선암, 난소암 및 폐암)을 치료하는 데 효과적이다.
미국 특허 출원 제12/485,546호는 비-인간 포유류(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양 또는 말)에 상술된 면역 조성물을 투여하고, Globo H 또는 이의 단편과 결합하는 포유동물 항체로부터 분리하는 것에 의한, Globo H 또는 이의 단편에 특이적인 항체의 생성 방법에 관한 것이다.
본 개시 내용에 기재된 Globo H 또는 다른 글리칸은 단백질 캐리어, 이를 테면 DT-CRM 197에 컨쥬게이트된다. 그 다음, 이들은 통상의 방법을 통해, C34와 같은 애주번트 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 인산 완충 염수 또는 중탄산염 용액)와 혼합되어, 면역 조성물(예를 들어, 백신)을 형성할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,601,903호; 제4,599,231호; 제4,599,230호; 및 제4,596,792호를 참고한다. 조성물은 주사 가능 물질, 액제, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있으며, 담체는 투여 방식 및 경로뿐 아니라 표준 약제학적 관례에 준하여 선택된다. 적합한 약제학적 담체와 희석제, 및 이들의 이용을 위한 약제학적 필요물질은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기재되어 있다. 면역 조성물은 바람직하게는 α-GalCer를 애주번트로서 함유한다. 애주번트의 다른 예에는 콜레라독소, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 엔테로톡신(heat-labile enterotoxin)(LT), 리포좀, 면역 자극 복합체(ISCOM) 또는 면역자극성 서열 올리고데옥시뉴클레오티드(immunostimulatory sequences oligodeoxynucleotide)(ISS-ODN)가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 조성물은 또한 생체 내 운반을 용이하게 하는 폴리머를 함유할 수 있다. 문헌 [Audran R. et al. Vaccine 21:1250-5, 2003]; 및 문헌 [Denis-Mize et al. Cell Immunol., 225:12-20, 2003]을 참고한다. 필요에 따라, Globo H 또는 이의 단편의 당 부분에 대한 면역 반응을 이끌어 내는 조성물의 능력을 증진시키기 위하여 소량의 보조 물질, 이를 테면 습윤화제(wetting agent) 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충화제를 추가로 함유할 수 있다. 본 명세서에 기재된 면역 조성물은 비경구로(예를 들어, 정맥내 주사, 피하 주사 또는 근육내 주사) 투여될 수 있다. 대안적으로, 좌약 및 경구 제제를 비롯한 기타 투여 방식이 바람직할 수 있다. 좌약을 위해, 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트라이글리세라이드를 포함할 수 있다. 경구 제제는 예를 들어, 약제학적 등급의 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 인시피언트(incipient)를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제제 또는 분제의 형태를 취하며, 본 명세서에 기재된 면역 조성물을 10-95%로 함유한다.
본 명세서에 기재된 면역 조성물은 비경구로(예를 들어, 정맥내 주사, 피하 주사 또는 근육내 주사) 투여될 수 있다. 대안적으로, 좌약 및 경구 제제를 비롯한 기타 투여 방식이 바람직할 수 있다. 좌약을 위해, 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트라이글리세라이드를 포함할 수 있다. 경구 제제는 예를 들어, 약제학적 등급의 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 인시피언트를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제제 또는 분제의 형태를 취하며, 본 명세서에 기재된 면역 조성물을 10-95%로 함유한다.
면역 조성물은 투여 제제와 호환성인 방식으로, 치료적으로 유효하고, 보호적이며, 면역원성인 양으로 투여된다. 투여되는 양은 예를 들어, 개체 면역계의 항체 합성 능력 및 필요에 따라 세포-매개의 면역 반응을 생성할 능력을 비롯한 치료 대상체에 따라 달라진다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 달라진다. 그러나, 적합한 용량 범위가 당업자에 의해 즉시 결정될 수 있다. 초기 투여 및 부스터(booster) 용량에 적합한 요법도 또한 가변적이나, 초기 투여에 이어서 이후의 투여를 포함할 수 있다. 백신의 용량도 또한 투여 경로에 따라 달라질 수 있으며, 숙주의 크기에 따라 바뀐다.
본 발명의 면역 조성물은 또한 암 치료 및 진단 둘 모두에서 사용될 수 있는 항체의 생산을 위한 동물에서 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양 또는 말)에서의 모노클로널 및 폴리클로널 항체 및 이의 단편의 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참고한다. 용어 "항체"는 원래대로의 이뮤노글로불린 분자뿐 아니라 이의 단편, 이를 테면 Fab, F(ab')2, Fv, scFv(단일 사슬 항체) 및 dAb(도메인 항체; 문헌 [Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544])를 포함한다.
Globo H- DT -CRM 197 및 관련 백신
Globo H(1) 및 이의 단편(2-10)을 본 명세서에 기재된 방법으로 합성하였다. 단백질 컨쥬게이션을 위하여, 정제된 Globo H 하프 에스터(12)를 도 14에 나타낸 바와 같은 개별 캐리어 단백질과 함께 인큐베이션시켰다.
Globo H-단백질 컨쥬게이트를 MALDI-TOF 분석으로 특징지어, 각 캐리어 단백질 상의 Globo H 분자의 수를 결정하였다. Globo H 평균 혼입수를 표 1에 열거하였다.
Globo H 혼입의 MALDI - TOF 분석
참조 단백질 분자량 당화 이후a 평균 혼입(n) 탄수화물 퍼센트
GH-BSA 66431 66449 76029 8 14.4%
GH-DT 58472 58326 62138 2～4 6.8%
GH-TT 150682 155609 162902 6 4.5%
GH-KLH* 8.6×106 ～700 14.7%
GH-Bamboo 25kD×1600
N.D.
a MALDI-TOF에서의 피크 m/z; N.D.: 결정되지 않음; *GH-KLH는 옵티머 인코포레이티드(Optimer Inc.)로부터 제공받았다.
GH-KLH 컨쥬게이트는 가장 큰 Globo H 혼입수를 나타내었으며, 이는 대부분 KLH의 더 큰 크기와 더 많은 Lys 잔기 때문이다. 또한, p-나이트로페닐 링커를 사용한 동일한 커플링 과정을 바이러스 외피(coat) 상에 100,000개가 넘는 라이신 잔기를 함유하는 밤부 모자이크 바이러스(bamboo mosaic virus)에 적용하였다. 그러나, 4℃에서 인산나트륨 완충액(pH = 7.2) 중에서 반응하는 동안의 바이러스의 불안정성은 추가의 개발에 가장 우려되는 점이다. 또한, GH-BaMV(16)는 이의 거대한 크기 때문에 이의 MALDI-TOF 분석에 의한 검출이 제한된다.
합성 Globo H 및 절단된 단편(도 1)은 환원 말단에서 펜틸아민 링커에 부착되며, NHS-코팅된 유리 슬라이드 상에 공유적으로 고정된다. 11개 올리고당류 중 9개를 마이크로어레이 상에 프린팅하기 위해 선택하였다. 각 마이크로어레이 슬라이드에 9개의 Globo H 유사체(SSEA-4, GH, Gb5, Gb4, Gb3, Gb2, BB4, BB3 및 BB2) 각각의 50 μM을 12벌로 스폿팅하였다.
마이크로어레이 상에서 탄수화물을 입증하기 위하여, 마우스 모노클로널 항체(Globo H를 위한 VK9 및 Mbr1, 및 항-SSEA-3)를 사용하고, 각 2차 항체(염소 항-마우스 IgG 및 IgM)를 사용하여 결합 특이성을 시험하고, 결과를 도 2A-2C에 나타내었다. 데이터는 MBr1이 BB3도 약간 인식하지만 VK9 및 Mbr1 둘 모두가 Globo H 및 외부 4당류 BB4를 인식하는 것을 시사한다. 또한, 항-SSEA-3 항체는 어떤 교차 반응성 없이, SSEA-3 항원(Gb5)을 특이적으로 인식하였다. 결과는 Globo H 마이크로어레이가 면역화된 마우스로부터 폴리클로널 항체의 특이성 및 효능을 프로파일링(profiling)하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
상술된 바와 같이, 완전한 합성 Globo H 백신 및 QS-21가 공동-투여된 마우스의 면역화는 인간 유방암 세포에 대한 항체의 생성을 야기하나; 심지어 수회의 부스팅 백신접종 이후에도 마우스 항체는 주로 IgM이었다(Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128).
한 그룹의 마우스를 당지질 애주번트인 α-GalCer(C1)와 함께, 또는 이것 없이 1 ㎍의 합성 Globo H-컨쥬게이트로 피하로 면역화시켰다. 도 3A에 요약된 바와 같이, GH-KLH, GH-DT 및 GH-BV가 IgM 유도를 위한 가장 효과적인 면역원이며, 그 다음으로는 GH-TT 및 GH-BSA이고, α-GalCer는 높은 수준의 IgM 항체를 유도하기 위한 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한, 유사한 경향이 마우스 IgG 항체(도 3B)에서도 관찰되었으며, IgG의 상대적 수준이 IgM 수준보다 더 높았다. 요약하면, 합성 글리코컨쥬게이트의 더 낮은 탄수화물 밀도에도 불구하고, GH-DT는 GH-KLH와 유사한 면역원성을 보유하였으며, 애주번트 α-GalCer는 면역 반응을 증진시키는 것으로 보인다.
α-GalCer가 GH-DT에 대한 효과적인 애주번트인 것으로 보여지기 때문에, C1보다 더 나은 애주번트 활성을 가지는 다른 당지질을 도 4에 나타낸 바와 같이 시험하였다. 마우스 그룹을 당지질과 함께 또는 이것 없이, GH-DT 및 GH-BV로 면역화시켰다. 혈청을 수득하고, 글리칸 마이크로어레이 분석에 도입하였다. 일반적으로, 마우스 항-Globo H IgG 역가는 면역화가 진행됨에 따라 증가하였으나, IgM 수준은 백신접종 횟수에 거의 영향을 받지 않았다(도 5). GH-BV 백신접종 그룹 중에, 당지질-백신 처리과 단독의 백신 사이에는 IgM 수준에 유의한 차이가 없었다. 결과는 당지질과 병용한 GH-BV가 효과적인 면역화 요법이 아님을 시사하지만, 낮은 면역원성은 BaMV의 불안정한 특성으로부터 기인할 수 있다. 그럼에도 불구하고, α-GalCer 유사체, 특히 7DW8-5는 GH-DT와 잘 협력하여, 마우스 면역 반응을 유도하였다.
흥미롭게도, GH-DT 및 다양한 당지질 애주번트에 의해 생성된 마우스 폴리클로널 IgG 항체는 Globo H를 중화시킬 뿐만 아니라, Gb5, SSEA-4 및 Gb4와 교차-반응하며, C34가 가장 효과적인 당지질 애주번트인 것으로 보인다(도 6). IgM보다 훨씬 더 높은 역가의 IgG를 유도할 수 있는 새로운 백신 조성물을 찾기 위하여, Globo H-DT 컨쥬게이트 및 당지질 C1 또는 C34 또는 상업적으로 입수할 수 있는 애주번트 AlPO4(인산알루미늄) 또는 MF59를 시험하였다.
놀랍게도, Globo H-DT는 당지질 C34와 함께 3차 백신접종 후에 거의 배타적으로 IgG 항체를 유도하였다(도 7). 요약하면, GH-DT 컨쥬게이트와 병용한 신규한 당지질 애주번트 7DW8-5는 항-Globo H IgG 및 IgM 항체 둘 모두를 증진시킬 수 있었으며, GH-DT와 병용한 당지질 애주번트 C34는 IgM보다 훨씬 더 높은 항체 역가의 IgG를 유도할 수 있었다. 이들은 또한 둘 모두 유방암 줄기 세포의 표면상에 특이적으로 발현되는 SSEA-3(Gb5) 및 SSEA-4 항원에 대한 다양한 결합 친화도를 보유하였다.
Globo H 백신에서 상이한 당지질 애주번트의 효과를 추가로 비교하기 위하여, 본 발명자들은 7개 군의 마우스를 GH-KLH로 면역화시켰다. 결과는 당지질로 백신접종한 마우스가 더 높은 수준의 항-Globo H 항체를 유도하는 것을 시사하였다(도 8). MF59가 강력한 애주번트이지만, Globo H에 대한 항체를 유도하기 위하여 GH-KLH와 협력하지는 못했다. AlPO4(인산알루미늄)도 또한 항체의 유도에서 명백한 효과를 나타내지 못했다. 반면, C34와 함께 GH-KLH는 1차 및 2차 백신접종 이후에 뛰어난 면역원성을 나타내었으나, 3차 백신접종 이후에는 C1과 유의한 차이를 나타내지 않았다. 결국, 이들 관찰은 신규한 당지질 유도체의 탄수화물 기반 백신을 위한 애주번트로서의 효능을 제시한다.
세포성 및 체액성 면역 반응의 성질은 항원 및 애주번트 조합에 의해서뿐 아니라, 담체 및 면역화 경로에 의해서도 영향을 받는다. 세사르딕 등이 기술한 바와 같이, 독성 활성이 없는 돌연변이 독소, DT-CRM 197은 항원-특이적 T 세포 증식을 유도하며, 비장세포의 IL-2, IFN-γ 및 IL-6 생성을 증가시켰으며, 이는 Th1 구동 경로에서의 이의 역할을 시사한다(Miyaji EN et al. (2001) Infect Immun 69:869-874; Godefroy S, et al. (2005) Infect Immun 73:4803-4809; Stickings P, et al. (2008) Infect Immun 76:1766-1773). 사이토카인 프로필이 우세하게 Th1이었단 사실에도 불구하고, 항-CRM 197 항체의 하위분류가 IgG1이었으며, 검출가능한 IgG2a가 없었고, 이는 혼합형 Th1/Th2 반응을 시사한다. 이들 결과는 Globo H 백신의 항체 아이소타입 프로필의 평가를 상기시키며, 본 연구는 당지질 애주번트와 병용한 GH-DT 또는 GH-KLH가 미량의 IgG2a와 함께 주로 IgG1 항체를 유도하는 것을 나타낸다(도 9).
당지질 애주번트가 정맥내로(i.v.) 단독으로 투여되는 경우에 Th1 편향된 사이토카인 분비를 증진시킨다는 사실에도 불구하고, 항체 클래스 전환(antibody class switch)(IgG2a)이 관찰되지 않았다. 종합적으로, 당지질은 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 모두를 증진시키는 데 중추적인 역할을 수행한다.
Globo H, SSEA -3 및 SSEA -4 암 백신
DT와 컨쥬게이트된 SSEA-3(Gb5) 및 SSEA-4를 합성하고 시험하였다. 3차 백신접종 후에, IgM과 IgG의 항체 역가를 비교하였으며, SSEA-3-DT 및 SSEA-4-DT도 또한 IgM보다 훨씬 높은 역가의 IgG를 유도하는 것이 관찰되었다(도 10).
GH-DT 및 C34가 Globo H, Gb5 및 SSEA-4를 인식하는 항체를 유도하기 때문에, 애주번트의 존재 하에서의 SSEA-3-DT 및 SSEA-4-DT 백신의 특이성을 일련의 24개 글리칸을 사용하여, IgG의 연구에 초점을 맞추어 시험하였다(도 11).
도 12에 나타낸 바와 같이, Globo H-DT 및 C34 애주번트로 면역화된 마우스는 높은 선택성을 가지고 Globo H, SSEA-3(Gb5) 및 SSEA-4를 인식할 수 있는 항체를 유도하였고, 애주번트 MF59와 함께 백신 SSEA-3-DT는 낮은 선택성을 가지고 높은 면역 반응을 유도하였다. 반면, 애주번트 C34와 병용한 SSEA-3-DT는 오직 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 항체를 유도하였다.
흥미롭게도, 애주번트의 존재 하의 또는 부재 하의 SSEA-4-DT(시알릴-Gb5)는 SSEA-4 및 이의 절단된 구조(헤드(head) 락토오스 결실을 갖는 SSEA-4)를 특이적으로 인식하는 IgG 및 IgM 항체를 유도하였다. 이론에 의한 제약 없이, 시알산이 고도로 면역원성이며, 고도로 특이적인 면역 반응을 유도하는 것으로 추정된다.
마우스의 SSEA-3-DT-C34로의 면역화는 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4와 반응성인 항체를 유도하였으며, 이는 Globo H 기반의 백신이 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4를 발현하는 종양 세포 및 유방암 줄기 세포를 표적으로 할 수 있는 것을 시사한다.
마우스의 Globo H-DT-C34로의 면역화는 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4와 반응성인 항체를 유도하였으며, 이는 Globo H 기반의 백신이 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4를 발현하는 종양 세포 및 유방암 줄기 세포를 표적으로 할 수 있는 것을 시사한다.
마우스의 SSEA-4-DT로의 면역화는 SSEA-4와 반응성인 항체를 유도하였으며, 이는 SSEA-4-DT 기반의 백신이 SSEA-4를 발현하는 종양 세포 및 유방암 줄기 세포를 표적으로 할 수 있는 것을 시사한다.
암 백신에 의한 종양 크기 감소
합성 글리코컨쥬게이트 백신의 효능을 직접 평가하기 위하여, 도 13에 나타낸 바와 같이 종양 크기를 주마다 3회 측정하였다. 일반적으로, 종양은 Globo H를 갖는 유방암 세포주인 4T1의 주사 후 2주 성장시켰다. 모든 당지질 애주번트와 함께 백신접종된 그룹은 24일에, 여전히 단독의 GH-DT 및 PBS 대조군에 비해 상대적으로 더 적은 종양 진행을 나타냈다. 이 데이터는 GH-DT 및 당지질 애주번트로의 백신접종이 생체 내에서 종양 진행을 어느 정도 지연시키는 것을 시사한다.
유방암 및 BCSC 에서의 SSEA -3 및 SSEA -4의 발현
비-BCSC보다 더 낮은 빈도이나, BCSC에서의 Globo H의 발현과, 유방암 및 BCSC에서의 Globo H 발현보다 더 높은 빈도의 SSEA-3 발현이 기술되었다(본 명세서에 그 전체가 참고로 포함된 문헌 [Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11667-11672]).
SSEA-3 또는 SSEA-4 발현 범위를 측정한 35명의 유방암 환자의 임상적 특징을 표 2에 약술하였다. 중간 연령은 48세 (31세 내지 82세)였다. 이들은 0기 1명, I기 10명, II기 19명 및 III기 5명으로 구성되어 있다. 대부분의 종양 검사물이 침윤성 관암종의 병상을 가졌으며 (80.0%), 51.4%가 ER에 대해 양성이고, 65.7%가 림프절 침범에 대해 양성이었다. 표 2에서, SSEA-3 또는 SSEA-4 발현 범위는 총 암세포 내의 양성 세포의 퍼센트로 나타내었다. HER-2에 상대적인 SSEA-3 또는 SSEA-4 발현 또는 림프절 침범 상태의 통계적 분석을 위해 t 검정을 사용하였다. HER-2 발현을 면역조직화학에 의해 결정하였다. 종양에서 SSEA-3 또는 SSEA-4의 발현 수준과 다양한 임상병리적 인자, 이를 테면 단계 (SSEA-4: P = 0.3498; SSEA-3: P=0.9311) 또는 HER-2(SSEA-4: P = 0.0142; SSEA-3:, P=0.O128) 사이에는 유의한 상관관계가 없었다(표 2).
유방암 환자의 임상적 특징
특징 인원수 % SSEA4
발현 중간을 가지는 세포 퍼센트(범위)		 P 값 SSEA3
발현 중간을 가지는 세포 퍼센트(범위)		 P 값
참여 환자
연령
중간
범위		 35

48
31-82		 100











종양 유형
침윤성 도관암종
침윤성 소엽암종
동소에서 도관암종
속질 암종
비전형 속질 암종
화생 암종
염증성 암종
28
1
1
1
1
2
1
80.0
2.8
2.8
2.8
2.8
6.0
2.8
























단계
0
I
II
III
1
10
19
5
2.9
28.6
54.3
14.2
33.1(33.1)
41.4(0.5-69.1)
39.3(0.0-77.1)
49.8(7.7-70.7)		 0.7880
1.4(1.4)
36.4(0.0-55.9)
30.9(0.0-66.4)
32.3(0.0-36.1)		 0.9311
림프절 침범
음성
양성
23
12
65.7
34.3
37.8(0.0-69.1)
49.1(17.4-77.1)		 0.0322
30.9(0.0-66.4)
35.8(0.0-60.7)		 0.4925
ER
음성
양성
18
17
51.4
48.6
36.2(0.5-60.3)
48.5(0.0-77.1)		 0.0142
29.7(0.0-38.6)
40.0(0.0-66.4)		 0.0128
효소적 분해에 의해 참여한 환자로부터 분리한 원발성 종양 세포를 CD45, CD24, CD44에 대한 특정 항체로 염색하고, CD45+ 세포를 먼저 빼내어, 백혈구를 제거하였다. BCSC와 비-BCSC 사이의 SSEA-3 또는 SSEA-4 발현을 비교하기 위하여, CD45- 종양 세포를 추가로 이들의 표면 마커의 발현에 기초하여 BCSC 및 비-BCSC로 분리하였다. BCSC는 CD45-/CD24-/CD44+ 세포로 동정었으며; CD45- 모집단의 나머지는 비-BCSC로 간주하였다.
이 접근법을 사용하여, BCSC와 비-BCSC에서의 SSEA-3 또는 SSEA-4의 발현을 35개의 종양 검사물에서 평가하였다. 종합적으로, SSEA-4가 35개 종양 중 34개(97.1%)에서 검출되었으며, SSEA-3이 35개 종양 중 27개(77.1%)에서 검출되었다(표 3). SSEA4 또는 SSEA3 발현을 유세포 측정기로 결정하였다. BCSC를 CD45-CD24-CD44+ 세포로 정의하였으며, 비-BCSC를 CD45- 세포의 나머지 모집단으로 정의하였다. 범위를 총 세포 중의 양성 세포의 퍼센트로 계산하였다.
표 3에 약술된 바와 같이, SSEA-3을 발현하는 35개 중 27개(77.1%) 샘플 중에, 양성 세포의 퍼센트는 1.4% 내지 66.4% 범위였다. 35개 중 25개 종양으로부터 분리되는 비-BCSC가 SSEA-3를 발현하였으며, 양성 세포의 퍼센트는 24.3% 내지 70.4% 범위였다. 비교하면, 35개 중 23개(65.7%) 종양으로부터의 BCSC가 SSEA-3에 대해 양성 염색을 나타내었으며, 양성 세포의 퍼센트는 5.0% 내지 58.4% 범위였다.
SSEA-4를 발현하는 35개 중 34개(97.1%) 샘플 중에, 양성 세포의 퍼센트는 0.5% 내지 77.1% 범위였다. 35개 중 32개 종양으로부터 분리되는 비-BCSC가 SSEA-3를 발현하였으며, 양성 세포의 퍼센트는 24.0% 내지 78.1% 범위였다. 비교하면, 35개 중 31개(88.6%) 종양으로부터의 BCSC가 SSEA-4에 대해 양성 염색을 나타내었으며, 양성 세포의 퍼센트는 5.6% 내지 83.6% 범위였다.
BCSC 와 비- BCSC 에서의 SSEA4 및 SSEA3 발현의 비교
글리칸 모집단 환자 수 양성
수 중간 발현을 가지는 세포 퍼센트(범위) 전체의 %
SSEA-4
전체 35 34 41.4(0.5-77.1) 97.1
비-BCSC 35 32 43.7(4.0-78.1) 91.4
BCSC 35 31 37.1(5.6-83.6) 88.6
SSEA-3
전체 35 27 36.4(1.4-66.4) 77.1
비-BCSC 35 25 40.5(24.3-70.4) 71.4
BCSC 35 23 24.3(5.0-58.4) 65.7
BCSC 에서의 SSEA -4의 발현
BCSC와 비-BCSC 사이의 SSEA-4 발현을 비교하기 위하여, CD45- 종양 세포를 추가로 이들의 표면 마커의 발현에 기초하여 BCSC 및 비-BCSC로 분리하였다. BCSC는 CD45-/CD24-/CD44+ 세포로 동정되었으며; CD45- 모집단의 나머지는 비-BCSC로 간주하였다. 이들 두 게이티드(gated) 모집단 각각에서의 SSEA-4의 발현은 도 15에 나타낸 바와 같이 종양 샘플에서 다양하다. 예를 들어, 전체 분리된 종양 세포의 5.7%를 차지하는 환자 BC0264의 BCSC가 SSEA-4에 대하여 음성이었으나, 비-BCSC 중 60.3%가 SSEA-4를 발현하였다. 환자 BC0266에 대하여, SSEA-4 발현이 비-BCSC의 59.4% 및 BCSC의 55.7%에서 검출되었다. 환자 BCO313에 대하여, SSEA-4 발현이 비-BCSC의 32.4% 및 BCSC의 83.6%에서 검출되었다. 전체적으로, SSEA-4는 시험된 샘플의 35개 중 34개(97.1%)에서 검출되었으며, 양성 세포의 퍼센트는 0.5% 내지 77.1% 범위였다(표 3).
정상 조직에서의 SSEA -3 및 SSEA -4의 발현
조직 마이크로어레이를 사용하여, 표 4에 나타낸 바와 같이 SSEA-4 발현을 면역조직화학 염색에 의해 20개의 상이한 기관에서 분석하였다(E, 상피; C, 연결 조직).
정상 조직에서의 SSEA -4의 발현
정상 조직
 항원
SSEA4
뇌 0/5
뼈 0/5
림프절 0/5
E C
유방 1/5 0/5
결장* 2/4 0/4
식도 0/5 0/5
장 5/5 0/5
신장 2/5 0/5
간 0/5 0/5
폐 1/5 0/5
난소 1/5 0/5
췌장 1/5 0/5
전립선 0/5 0/5
직장 5/5 0/5
피부 0/5 0/5
비장 0/5 0/5
위 4/5 0/5
정소 4/5 0/5
가슴샘 1/5 0/5
자궁경부 1/5 0/5
SSEA-4는 유방, 결장, 위장관, 신장, 폐, 난소, 췌장, 직장, 위, 정소, 가슴샘 및 자궁경부와 같은 몇몇 샘조직의 상피 세포에서 발현된다(표 4). 또한, Globo H 및 SSEA-3와 유사한 방식으로(Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11667-11672), SSEA-4 발현은 주로 도 16에 나타낸 바와 같이 면역계에 본질적으로 접근할 수 없는 세포질 또는 상피 세포의 첨단 표면에 한정된다.
비교해 보면, Globo H는 유방, 위장관, 췌장, 전립선 및 자궁경부와 같은 몇몇 샘조직의 상피 세포상에 발현된다. SSEA3의 분포는 정상 유방 조직에서의 이의 부재와, Globo H에 대해서는 음성인 신장, 직장, 정소 및 가슴샘에서의 존재를 제외하고는 Globo H의 분포와 유사하다(Chang W-W. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11667-11672).
실시예
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내기 위하여 포함된다. 하기의 실시예에 개시된 기술은 본 발명자가 발견한 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 기술을 나타내며, 이에 따라 이의 실시를 위한 바람직한 방식을 이루는 것으로 여겨질 수 있음이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시 내용의 견지에서, 개시된 특정 실시형태에서 많은 변형이 이루어질 수 있고, 여전히 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
일반 방법, 재료 및 기기
재료
통상의 용매 및 시약을 추가의 정제 없이 받은 대로 사용하였으며, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 애크로스(Acros), 머크(Merck), 에코 케미컬(Echo chemical) 및 센 케미컬(Senn Chemical)로부터 구입하였다. 모노클로널 항체 Mbr1을 알렉시스 바이오케미컬즈(ALEXIS biochemicals)로부터 구입하고, Cy3-컨쥬게이트형 항-마우스 IgG(IgG, IgG1 및 IgG2a) 및 IgM 항체를 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research)로부터 구입하였다. DT-CRM 197 단백질 및 파상풍 톡소이드를 각각 머크와 애드이뮨(Adimmune)으로부터 구입하였다. 인산알루미늄 겔 애주번트(AlPO4)를 브렌태그 바이오섹터(Brenntag Biosector)로부터 구입하였다. 밤부 바이러스 및 VK9 모노클로널 항체를 각각 린(Lin) 박사 및 유(Yu) 박사의 실험실로부터 준비하였다. 당지질 유도체를 합성하고, 왕(Wong) 박사 실험실에 의해 제공받았다.
일반적인 방법
당화에 사용된 분자체(MS, AW-300)를 사용 전에 평평하게 하고(crushed), 활성화시켰다. 반응을 분석 TLC 플레이트(PLC 실리카 겔-60, F254, 2 mm, 머크)로 모니터링하고, UV(254㎚) 하에 가시화시키거나, p-아니스알데히드로 염색함으로써 가시화시켰다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 실리카 겔(40-63 ㎛) 또는 LiChroprep RP18(40-63 ㎛) 상에서 수행하였다. 투석막(셀룰로스 에스터, MCCO = 10,000)을 사용 전에 ddH2O로 세정하였다.
기기
양성자 핵 자기 공명(1H NMR) 스펙트럼, 탄소 핵 자기 공명(13C NMR) 스펙트럼을 브루커 어드밴스(Bruker Advance) 600(600 ㎒ / 150 ㎒) NMR 분광계로 기록하였다. 양성자에 대한 화학적 이동을 ppm(δ 스케일)으로 기록하고, 테트라메틸실란(δ = 0)을 참고하였다. 탄소에 대한 화학적 이동은 또한 백만부당 부(ppm, δ 스케일)로 기록하였다. 다중도의 결정을 위하여 DEPT 135(분극 편광에 의한 왜곡 보상(distortion-less) 증진)를 사용하였다. 데이터를 다음과 같이 나타내었다: 화학적 이동, 다중도(s = 단일, d = 2중, t = 3중, q = 4중, m = 다중, br = 브로드), 통합 및 ㎐ 단위의 커플링 상수(J). 고해상도의 질량 스펙트럼을 BioTOF III로 얻고, Ultraflex II TOF/TOF200에 의해 MALDI-TOF MS를 사용하였다.
실시예 1: 상이한 캐리어 단백질과 컨쥬게이트된 Globo H의 합성
Globo H(1; 도 11 참고) 및 이의 단편(2-10)을 프로그래밍 될 수 있는 원-포트(one-pot) 전략을 사용하여 합성하였다(Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20). 1의 반응을 실온에서 무수 DMF 용액 중에 유효한 동종이작용성(homobifunctional) 링커와 함께 수행하였다(Wu X, et al. (2004) Org Lett 6:4407-4410; Wu X, Bundle DR (2005) J Org Chem 70:7381-7388). 반응을 TLC에 의해 용이하게 모니터링하였다. 더 큰 R f 생성물과 함께 유리 아민의 소실이 발생하면, 반응 혼합물을 증발시켜 DMF를 제거하고, 다이클로로메탄과 물로 세정하여, 과량의 링커를 제거하였다. 마지막으로, 생성물을 역상(C18) 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 서서히 1% 아세트산을 함유하는 물 내지 수 중의 40% 메탄올로 용출시켰다. 그 다음, 용액을 동결건조시켜, 밝은 황색 생성물(12)을 얻었다. 마지막으로, 단백질 컨쥬게이트을 위해, 정제된 Globo H 하프 에스터(12)(30-40 당량)를 인산 완충액(10 mM, pH 7.2) 중의 개별 캐리어 단백질과 함께 24 시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다(도 14). 중요한 것은, 단백질 농도를 ~5 ㎎/㎖로 조정하여, 라이신 잔기와 Globo H 하프 에스터의 커플링을 최대화시켜야 한다는 것이다. 그 다음, 24시간 후에, 글리코컨쥬게이트를 희석하고, 탈이온수에 대해 투석하여, 남아있는 p-나이트로페닐기를 제거하였다. 그 다음, 용액을 백색 분말로 동결건조시켜, 글리코컨쥬게이트(13, 14 및 15)를 제공하였다.
Globo H-단백질 컨쥬게이트를 MALDI-TOF 분석으로 특징지어, 각 캐리어 단백질 상의 Globo H 분자의 수를 결정하였다. 평균 Globo H 혼입수를 상기 나타낸 표 1에 열거하였다.
글리코컨쥬게이트(13, 14, 15)를 약 1 pmol/㎕의 최종 농도가 수득되도록, ddH2O 중에 용해시켰다. 시나핀산을 매트릭스로 선택하고, 아세토니트릴 및 탈이온수(1 : 1 v/v)와 혼합하여 새로이 제조하고, 0.1% TFA를 함유하는 10 mg/mL의 최종 매트릭스 농도를 만들었다. 각 샘플을 선형 포지티브 모드 하에서 검출하여, m/z 스펙트럼을 얻었다. 각 글리코컨쥬게이트의 분자량을 m/z에 의해 결정하였다. 글리코컨쥬게이트(14)는 이질성을 나타내었으며, 이는 2~4의 평균 혼입을 지시한다. GH-KLH 컨쥬게이트는 가장 큰 수의 Globo H 혼입을 나타내었으며, 이는 주로 KLH의 더 큰 크기와 더 많은 Lys 잔기 때문이다. 또한, p-나이트로페닐 링커를 사용하는 동일한 커플링 과정을 바이러스 외피상에 100,000개 초과의 라이신 잔기를 함유하는 밤부 모자이크 바이러스에도 적용하였다. 그러나, 4℃에서 인산나트륨 완충액(pH = 7.2) 중에서 반응하는 동안의 바이러스의 불안정성은 추가의 개발에 가장 우려되는 점이다. 또한, GH-BaMV(16)는 이의 거대한 크기 때문에 이의 MALDI-TOF 분석에 의한 검출이 제한된다. 마지막으로, 동결건조된 글리코컨쥬게이트를 -30℃에서 보관하고, 면역화 이전에 멸균수로 재구성하였다.
실시예 2: 글리칸 마이크로어레이 제작 및 검증:
합성 Globo H 및 절단된 단편(도 1)을 환원 말단에서 펜틸아민 링커에 부착시키고, NHS-코팅된 유리 슬라이드 상에 공유적으로 고정시켰다. 11개 올리고당류 중 9개를 마이크로어레이 상에 프린팅하기 위해 선택하였다. 올리고당류 연속 농도(1, 5, 10, 20, 40, 50, 80, 1OOμM)를 결합 친화도 및 형광 강도를 최적화하기 위하여 시험하였다. 각 마이크로어레이 슬라이드에 9개의 Globo H 유사체(SSEA-4, GH, Gb5, Gb4, Gb3, Gb2, BB4, BB3 및 BB2) 각각의 50 μM을 12벌로 스폿팅하였다. 80% 습도 분위기에서의 반응 후에, 슬라이드를 사용하기 전에 데시케이터(desiccator) 중에서 실온에 보관하였다.
마이크로어레이 상에서 탄수화물을 입증하기 위하여, 마우스 모노클로널 항체(Globo H를 위한 VK9 및 Mbr1, 및 항-SSEA-3)를 사용하고, 각 2차 항체(염소 항-마우스 IgG 및 IgM)를 사용하여 결합 특이성을 시험하고, 결과를 도 2A-2C에 나타내었다. 데이터는 MBr1이 BB3도 약간 인식하지만 VK9 및 Mbr1 둘 모두가 Globo H 및 외부 4당류 BB4를 인식하는 것을 시사한다(Gilewski T el al . (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20). 또한, 항-SSEA-3 항체는 임의의 교차 반응성 없이, SSEA-3 항원(Gb5)을 특이적으로 인식하였다. 결과는 Globo H 마이크로어레이가 면역화된 마우스로부터 폴리클로널 항체의 특이성 및 효능을 프로파일링하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 마우스 면역화
본 연구에서, 한 그룹의 마우스를 당지질 애주번트인 α-GalCer(C1)와 함께, 또는 이것 없이 1 ㎍의 합성 Globo H(GH)-컨쥬게이트로 피하로 면역화시켰다. 격주로 3회의 백신접종 10일 후에, 마우스 혈청을 수집하고, 이어서 글리칸 마이크로어레이 분석에 도입하여, 항체 수준을 평가하였다. 도 3A에 요약된 바와 같이, GH-KLH, GH-DT 및 GH-BV가 IgM 유도를 위한 가장 효과적인 면역원이며, 그 다음으로는 GH-TT 및 GH-BSA이고, α-GalCer가 높은 수준의 IgM 항체를 유도하기 위한 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한, 유사한 경향이 마우스 IgG 항체(도 3B)에서도 관찰되었으며, IgG의 상대적 수준이 IgM 수준보다 더 높았다. 요약하면, 합성 글리코컨쥬게이트의 더 낮은 탄수화물 밀도에도 불구하고, GH-DT는 GH-KLH와 유사한 면역원성을 보유하였으며, 애주번트 α-GalCer는 면역 반응을 증진시키는 것으로 관찰되었다.
C1이 GH-DT에 대한 효과적인 애주번트인 것으로 보여지기 때문에, 도 4에 나타낸 바와 같은 C1보다 더 나은 애주번트 활성을 가지는 다른 당지질을 시험하였다(Fujio M, et al. (2006) J Am chem soc 128:9022-9023).
마우스 그룹을 2 ㎍의 당지질과 함께 또는 이것 없이, 1.6 ㎍의 GH-DT 및 GH-BV로 근육내로 주 2회 면역화시켰다. 3차 백신접종 2주 후에 혈청을 수득하고, 글리칸 마이크로어레이 분석에 도입하였다. 일반적으로, 마우스 항-Globo H IgG 역가는 면역화가 진행됨에 따라 증가하였으나, IgM 수준은 백신접종 횟수에 거의 영향을 받지 않았다(도 5). GH-BV 백신접종 그룹 중에, 당지질-백신 처리와 단독의 백신 사이에 IgM 수준의 유의한 차이가 없었다. 결과는 당지질과 병용한 GH-BV가 효과적인 면역 요법이 아님을 시사하지만, 낮은 면역원성은 BaMV의 불안정한 특성으로부터 기인할 수 있다. 그럼에도 불구하고, α-GalCer 유사체, 특히 7DW8-5는 GH-DT와 잘 협력하여, 마우스 면역 반응을 유도하였다.
흥미롭게도, GH-DT 및 다양한 당지질 애주번트에 의해 생성된 마우스 폴리클로널 IgG 항체는 Globo H를 중화시킬 뿐만 아니라, Gb5, SSEA-4 및 Gb4와 교차-반응하며, C34가 가장 효과적인 것으로 보인다(도 6). IgM보다 훨씬 더 높은 역가의 IgG를 유도할 수 있는 새로운 백신 조성물을 찾기 위하여, Globo H-DT 컨쥬게이트 및 당지질 C1 또는 C34 및 상업적으로 입수할 수 있는 애주번트 AlPO4(인산알루미늄) 또는 MF59를 시험하였다. 놀랍게도, Globo H-DT는 당지질 C34와 함께 3차 백신접종 후에 거의 IgG 항체를 유도할 수 있었다(도 7). 요약하면, GH-DT 컨쥬게이트와 병용한 신규한 당지질 애주번트 7DW8-5는 항-Globo H IgG 및 IgM 항체 둘 모두를 증진시킬 수 있었으며, GH-DT와 병용한 당지질 애주번트 C34는 IgM보다 훨씬 더 높은 항체 역가의 IgG를 유도할 수 있었다. 이들은 또한 둘 모두 유방암 줄기 세포의 표면상에 특이적으로 발현되는 Gb5 및 SSEA-4 항원에 대한 다양한 결합 친화도를 보유하였다.
Globo H 백신에서 상이한 당지질 애주번트의 효과를 추가로 비교하기 위하여, 7개 군의 마우스를 GH-KLH로 면역화시켰다. 결과는 당지질로 백신접종한 마우스가 더 높은 수준의 항-Globo H 항체를 유도하는 것을 시사한다(도 8). MF59가 강력한 애주번트이지만, Globo H에 대한 항체를 유도하기 위하여 GH-KLH와 협력하지는 못했다. AlPO4(인산알루미늄)도 또한 항체의 유도에서 명백한 효과를 나타내지 못했다. 반면, C34와 함께 GH-KLH는 1차 및 2차 백신접종 이후에 뛰어난 면역원성을 나타내었으나, 3차 백신접종 이후에는 C1과 유의한 차이를 나타내지 않았다.
독성 활성이 없는 돌연변이 독소, DT-CRM 197은 항원-특이적 T 세포 증식을 유도하며, 비장세포의 IL-2, IFN-γ 및 IL-6 생산을 증가시키며, 이는 Th1 구동 경로에서의 이의 역할을 시사한다(Miyaji EN et al. (2001) Infect Immun 69:869-874; Godefroy S, et al. (2005) Infect Immun 73:4803-4809; Stickings P, et al. (2008) Infect Immun 76:1766-1773). 사이토카인 프로필이 우세하게 Th1이었단 사실에도 불구하고, 항-CRM 197 항체의 하위분류가 IgG1이었으며, 검출가능한 IgG2a가 없었고, 이는 혼합형 Th1/Th2 반응을 시사한다. 이들 결과는 Globo H 백신의 항체 아이소타입 프로필의 평가를 상기시키며, 본 연구는 당지질 애주번트와 병용한 GH-DT 또는 GH-KLH가 주로 IgG1 항체와, 미량의 IgG2a를 유도하는 것을 보여준다(도 9).
당지질 애주번트가 정맥내로(i.v.) 단독으로 투여되는 경우에 Th1 편향된 사이토카인 분비를 증진시킨다는 사실에도 불구하고, 항체 클래스 전환(IgG2a)이 관찰되지 않았다. 종합하면, 당지질은 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 모두를 증진시키는 데 중추적인 역할을 수행한다.
또한, DT와 컨쥬게이트된 Gb5 및 SSEA-4를 동일한 전략으로 합성하였다. 3차 백신접종 후에, IgM과 IgG의 항체 역가를 비교하였으며, Gb5-DT 및 SSEA-4-DT도 또한 IgM보다 훨씬 높은 역가의 IgG를 유도하는 것이 관찰되었다(도 10).
실시예 4: 상이한 백신 조성물에 의해 유도된 항체의 특이성 연구
GH-DT 및 C34가 Globo H, Gb5(SSEA-3) 및 SSEA-4를 인식하는 항체를 유도하기 때문에, 애주번트의 존재 하에서의 SSEA-3-DT 및 SSEA-4-DT 백신의 특이성을 일련의 24개 글리칸을 사용하여, IgG의 연구에 초점을 맞추어 다음으로 시험하였다(도 11).
도 12에 나타낸 바와 같이, Globo H-DT 및 C34 애주번트로 면역화된 마우스는 높은 선택성을 가지고 Globo H, SSEA-3(Gb5) 및 SSEA-4를 인식할 수 있는 항체를 유도하였고, 애주번트 MF59와 함께 백신 SSEA-3-DT는 낮은 선택성을 가지고 높은 면역 반응을 유도하였다. 반면, 애주번트 C34와 병용한 SSEA-3-DT는 오직 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 항체를 유도하였다.
흥미롭게도, 애주번트의 존재 또는 부재 하의 SSEA-4-DT는 SSEA-4 및 이의 절단된 구조(헤드 락토오스 결실을 갖는 SSEA-4)를 특이적으로 인식하는 IgG 및 IgM 항체를 유도하였다. 그러나 선택성의 기원이 명확하지 않다.
합성 글리코컨쥬게이트 백신의 효능을 직접 평가하기 위하여, 도 13에 나타낸 바와 같이 종양 크기를 매주 3회 측정하였다. 일반적으로, 종양은 Globo H를 갖는 유방암 세포주인 4T1의 주사 후 2주 성장시켰다. 당지질 애주번트와 함께 백신접종된 모든 그룹은 24일에, 여전히 단독의 GH-DT 및 PBS 대조군에 비해 상대적으로 더 적은 종양 진행을 나타냈다. 예비 데이터는 GH-DT 및 당지질 애주번트로의 백신접종이 생체 내에서 종양 진행을 어느 정도 지연시키는 것을 시사한다.
실시예 5: Globo H 하프 에스터의 제조
GloboH 하프 에스터를 다음과 같이 제조하였다:
Figure pct00003
Globo H 아민(1)(5 mg, 4.54 μmol)을 무수 DMF 용액 중에 용해시켰다. 그 다음, p-나이트로페닐 에스터 링커(8.8 mg, 22.7 μmol)를 가하고, 실온에서 1~3 시간 동안 교반하였다. 반응을 TLC(메탄올 중의 1% AcOH) 및 닌하이드린(Ninhydrin) 시험으로 모니터링하였다. 더 큰 R f 생성물과 함께 유리 아민의 소실은 반응의 완료를 지시한다. 반응 혼합물을 가열 없이 감압 하에 증발시켜 DMF를 제거한 다음, CH2Cl2 및 1% 아세트산을 함유하는 물로 2회 추출하였다. 수용액을 농축시키고, 역상(C18) 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 서서히 1% 아세트산을 함유하는 H2O 내지 MeOH : H2O = 4 : 6으로 용출시켰다. 그 다음, 용액을 동결건조시켜, 밝은 황색 고체 생성물(12)을 얻었다(5.4 mg, 수율 88%) 1H NMR(600 ㎒, D2O) δ 8.25 (d, 2H, J= 9.0 ㎐), 7.28 (d, 2H, J= 9.0 ㎐), 5.12 (d, 1H, J= 3.9 ㎐), 4.79 (d, 1H, J= 3.7 ㎐), 4.51 (d, 1H, J= 7.7 ㎐), 4.44 (d, 1H, J= 7.7 ㎐), 4.39 (d, 1H, J= 7.7 ㎐), 4.31-4.28 (t, 2H, J= 7.7 ㎐), 4.15-4.11 (m, 2H), 3.99 (d, 1H, J= 2.0 ㎐), 3.92 (d, 1H, J= 2.8 ㎐), 3.89-3.44 (m, 33H), 3.16 (t, 1H, J= 8.6 ㎐), 3.10 (t, 2H, J= 6.7 ㎐), 2.62 (t, 2H, J= 6.9 ㎐), 2.20 (t, 2H, J= 6.6 ㎐), 1.93 (s, 3H), 1.62-1.49 (m, 4H) 1.54-1.48 (m, 2H), 1.45-1.40 (m, 2H), 1.30-1.24 (m, 2H), 1.11 (d, 3H, J= 6.5 ㎐) 13C NMR (150 ㎒, D2O) δ178.0, 176.1, 176.0, 156.9, 147.1, 127.3, 124.5, 105.7, 105.0, 103.7, 103.6, 102.2, 101.0, 80.5, 80.0, 78.9, 78.0, 77.8, 77.1, 76.7, 76.4, 76.3, 76.2, 75.2, 74.6, 73.8, 73.5, 72.5, 72.1, 71.8, 71.2, 70.9, 70.8, 70.1, 69.7, 69.5, 68.5, 62.6, 62.6, 62.0, 62.0, 61.7, 53.3, 40.8, 37.1, 35.0, 30.0, 29.7, 26.4, 25.0, 24.1, 23.9, 17.0 HRMS: C55H87N3O35Na [M+Na]+ 계산치: 1372.5018; 실측치: 1372.5016.
실시예 6: 글리코컨쥬게이트 생성을 위한 일반적 과정
글리코컨쥬게이트를 다음과 같이 제작하였다:
Figure pct00004
BSA, DT-CRM 197 및 파상풍 톡소이드(대만 소재의 애드이뮨)를 100 mM 인산 완충액 pH 7.2(~5 mg/ml) 중에 용해시키고, 30 내지 40 당량의 Globo H 하프 에스터(35)를 용액에 가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 약하게 교반하였다. 그 다음, 혼합물을 탈이온수로 희석하고, 5회 교환한 탈이온수에 대해 투석하였다. 그 다음, 용액을 백색 분말로 동결건조시켰다. 수득된 Globo H-단백질 컨쥬게이트를 MALDI-TOF 분석으로 특징지어, 탄수화물 혼입비를 결정할 수 있다. 41(GH-BSA) MALDI-TOF 실측치: 76029, 42(GH-DT-CRM 197) 실측치: 62138, 43(GH-TT) 실측치: 162902, 44(GH-BaMV)는 결정되지 않았다.
실시예 7: 글리코컨쥬게이트 에 대한 MALDI - TOF MS 분석
글리코컨쥬게이트(41, 42, 43) 및 주요 캐리어 단백질을 ddH2O로 재구성하였다(~1 ㎍/㎕). 매트릭스인 시나핀산을 아세토니트릴 및 탈이온수(1 : 1 v/v)로 새로이 제조하여, 0.1% TFA를 함유하는 10 mg/mL의 최종 매트릭스 농도를 만들었다. 조심히 로딩하고 매트릭스 용액 및 글리코컨쥬게이트를 혼합한 다음, 플레이트를 공기 건조시켰다. 측정 전에 소 혈청 알부민을 사용하여 반드시 보정해야 한다. 글리코컨쥬게이트 및 주요 단백질 샘플 각각을 선형 포지티브 모드 하에서 검출하였따. 평균 분자량은 캐리어 단백질상에 혼입된 평균 탄수화물 수의 계산을 가능하게 한다.
실시예 8: 글리칸 마이크로어레이 제작
마이크로어레이를 96 웰로부터 NHS-코팅된 유리 슬라이드로의, 프린팅 완충액(300 mM 인산 완충액, pH 8.5, 0.005% Tween-20 함유)중의 다양한 농도의 아민-함유 글리칸 ~0.7 nL의 로봇식의 핀(pin)(SMP3, 미국 소재의 텔레켐 인터내셔널 인코포레이티드(TeleChem International Inc.)) 침착에 의해 프린팅하였다(바이오도트(BioDot), 미국 소재의 카테시안 테크놀로지즈(Cartesian Technologies)). 각 마이크로어레이 슬라이드를 9개 Globo H 유사체(SSEA-4, GH, Gb5, Gb4, Gb3, Gb2, BB4, BB3 및 BB2) 각각의 50 μM로 12벌로 스폿팅하였다. 프린팅된 슬라이드를 1시간 동안 80% 습도 분위기에서 반응되도록 하고, 이어서 밤새 건조되도록 하였다. 이들 슬라이드를 사용 전에 실온에서 데시케이터에 보관하였다.
실시예 9: 혈청학적 분석( 글리칸 마이크로어레이 )
마우스 혈청을 예비 스크리닝으로서 3% BSA/PBS 완충액(pH 7.4) 중의 0.05% Tween 20을 사용하여 1 : 60으로 희석하였다. 글리칸 마이크로어레이를 50 mM 에탄올아민으로 1시간 블로킹(blocked)하고, 사용 전에 ddH2O 및 PBS 완충액으로 2회 세정하였다. 그 다음, 혈청 희석액을 Globo H 마이크로어레이에 도입하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 마이크로어레이 슬라이드를 추가로 PBST(PBS 완충액 중의 0.05% Tween-20) 및 PBS 완충액으로 각각 3회 세정하였다. 다음으로, Cy3-affiniPure 염소 항-마우스 IgG(H + L), IgGl, IgG2a 또는 항-마우스 IgM을 마이크로어레이 슬라이드에 가한 다음, 밀봉하여 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 마지막으로, 슬라이드를 차례로 PBST, PBS 및 ddH2O로 3회 세정하였다. 마이크로어레이 슬라이드를 건조시킨 후 마이크로어레이 형광 칩 판독기(제네픽스(Genepix) 4000B)로 532 nm에서 스캐닝하였다. 데이터를 소프트웨어 제네픽스 프로 6.0(미국 캘리포니아주 유니언시티 소재의 악손 인스트루먼츠(Axon Instruments))으로 분석하였다. 정확한 측정을 얻기 위하여, PMT 이득값(gain)을 400으로 조정하여, 형광 포화를 막았다. 각 글리칸 스폿에서, 신호로부터 국소의 백그라운드를 감하였다. 명백한 결함이 있는 스폿 또는 검출가능하지 않은 신호가 있는 스폿을 생략하였다. 최종의 형광 강도는 반복 스폿으로부터의 "F532㎚ - B532㎚ 중간"의 평균으로 정의하였다.
실시예 10: 혈청학적 분석(효소-결합 면역흡착 분석법)
100 ㎕ 카보네이트 바이카보네이트 완충액(pH 10) 중의 0.2 ㎍의 Globo-H 세라미드를 96-웰 플레이트(NUNC)에 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBS로 세정하고, 실온에서 30분 동안 3% 소 혈청 알부민으로 블로킹하였다. 마우스 혈청의 연속 희석물을 각 웰에 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서 DPBST(둘베코 인산 완충 염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline), 0.05% Tween20)로 세정하였다. 염소 항-마우스 IgG-AP(1 : 200, 미국 소재의 서던 바이오테크(Southern Biotech.))를 가하고, 실온에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBST로 5회 세정한 다음, 37℃에서 알칼리 포스파타아제 기질인 p-나이트로페닐 포스페이트(시그마)와 8분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 3 M NaOH 용액을 가함으로써 반응을 중지시키고, 플레이트를 ELISA 판독기(스펙트라맥스(SpectraMax), 몰레큘러 디바이스즈(Molecular Devices))상에서 405㎚에서 판독하였다. 역가는 0.1 초과의 광학 밀도를 생성하는 가장 높은 희석으로서 정의된다.
실시예 11: 용량 및 면역화
(1) 3마리의 마우스 그룹(6주령 암컷 C57BL/6 마우스, 대만 소재의 바이오라스코(BioLASCO))에 격주로 3회 동안 당지질 애주번트 C1 또는 7DW8-5와 함께 또는 이것 없이 각각 GH-KLH(옵티머 인코포레이티드), GH-BSA, GH-TT, GH-CRM 197 및 GH-BaMV를 복부 부분에 피하로 투여하였다. 각 백신접종에는 2 ㎍ 당지질 애주번트와 함께 또는 이것 없이 1 ㎍의 Globo H가 함유되어 있었다. 대조군 마우스에 인산 완충 염수(PBS)만을 주사하였다. 첫번째 면역화 전(면역-전) 그리고 3차 면역화 10일 후에 마우스에서 채혈하였다. (2) 3마리의 마우스 그룹(8주령 암컷 Balb/c 마우스, 대만 소재의 바이오라스코)에 근육 내로 각각 C1, C23 또는 7DW8-5와 함께 또는 이것 없이 GH-BaMV 또는 GH-CRM 197로, 2주 간격으로 3회 면역화시켰다. 각 백신접종에는 2 ㎍ 애주번트와 함께 또는 이것 없이 1.6 ㎍의 Globo H가 함유되어 있었다. 대조군 마우스에 인산 완충 염수(PBS)를 주사하였다. 면역화 전 그리고 각 백신접종 2주 후에 마우스에서 채혈하였다. (3) 3마리의 마우스 그룹(8주령 암컷 Balb/c 마우스, 대만 소재의 바이오라스코)에 기재된 (2)와 같이, 애주번트 C1, C17, 7DW8-5, C30, AlPO4, MF59(1:1 혼합물)와 함께 또는 이것 없이, GH-CRM 197 또는 GH-KLH로 면역화시켰다. 모든 혈청을 4000 g 하에서의 10분 동안의 원심분리에 의해 수득하였다. 혈청학적 반응을 글리칸 마이크로어레이에 의해 분석하거나 통상의 ELISA 분석법으로 비교하였다.
실시예 12: 이종이식 모델
(1) 면역화된 암컷 Balb/c 마우스의 5개의 그룹(PBS, GH-CRM 197 단독 또는 각각 C1, C23 및 7DW8-5와 함께)에 2×105 전이성 마우스 유방 종양 세포주인 4T1(멸균 PBS 중의)을 최종 백신접종 8주 후에 피하로 주사하였다. (2) 면역화된 암컷 Balb/c 마우스의 7개의 그룹(GH-KLH 단독 또는 각각 C1, C17, 8-5, C30, AlPO4 및 MF59와 함께)에 2×105 전이성 마우스 유방 종양 세포주인 4T1(멸균 PBS 중의)을 최종 백신접종 6주 후에 피하로 주사하였다. 마우스 항-Globo H 혈청을 종양 이종이식 이전과 이후에 모니터링하였다. 마우스 종양 크기를 버니어 캘리퍼로 주마다 3회 측정하고, (길이×높이×너비)/2 (㎣)로 정의하였다.
실시예 13: 인간 유방암 검사물로부터의 원발성 종양 세포의 분리
인간 종양 암 검사물을 대만 타이베이 소재의 삼군총의원(Tri-Service General Hospital)에서 초기 수술을 받은 환자로부터 수득하였다. 샘플을 환자 비밀을 보호하기 위해 완전히 암호화하고, 대만 타이베이 소재의 아카데미아 시니카(Academia Sinica)의 인간 대상 연구 윤리 위원회의 임상시험심사위원회(Institutional Review Board of Human Subjects Research Ethics Committee)에 의해 승인된 프로토콜 하에 사용하였다. 종양 검사물을 1 ㎟ 정사각형 조각으로 슬라이싱하고, 37℃에서 2 시간 동안 콜라게나아제(1,000 U/㎖), 히알루로니다아제(300 U/㎖) 및 DNase I(100 ㎍/㎖)을 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 인큐베이션시킴으로써 효소적으로 분해시켰다. 원발성 유방 종양 세포를 100-㎛ 세포 스트레이너(strainer)(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences))를 통해 여과한 후에 수집하고, 5% FBS가 보충된 RPMI1640 배지 중에 재현탁시켰다.
실시예 14: 유세포 분석
원발성 유방암 세포를 2% FBS 및 0.1% NaN3를 함유하는 50 ㎕의 PBS 중에 1×105 세포로 준비하였다. 세포를 항-CD24-PE, 항-CD44-APC 및 항-CD45-PerCP-Cy5.5 항체 혼합물(각각 1 ㎕)로 표지하였다. Globo H 발현을 Alexa488과 컨쥬게이트된 모노클로널 항-Globo H 항체(VK-9)로의 염색에 의해 검출하였다. FACSCanto 유세포 측정기(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 상에서 분석을 수행하였다. BCSC를 CD45-/CD24-/CD44+ 세포로 정의하였으며, 비-BCSC를 CD45- 세포의 나머지 모집단으로 정의하였다. Globo H 발현을 게이티드 영역에서 추가로 분석하였다.
실시예 15: 세포 분류
마우스에 이식된 인간 유방 종양으로부터 수집한 세포를 항-CD24-PE, 항-CD44-APC 및 항-H2Kd-FITC 항체 혼합물(비디 바이오사이언스즈)로 염색하였다. 항체-표지된 세포의 형광 활성화된 분류를 FACSAria 세포 분류기(Becton Dickinson) 상에서 수행하였다. H2Kd-/CD24-/CD44+ 세포를 BCSC로 분류하고, H2Kd- 세포의 나머지 모집단을 비-BCSC로 분류하였다. BCSC 및 비-BCSC의 전형적인 순도는 각각 >85% 및 >90%였다.
실시예 16: 면역조직화학
정상 조직에서의 SSEA-4 발현을 위해, 20개의 상이한 기관을 함유하며, 각 기관이 5 개체로부터 유래된 조직 마이크로어레이 슬라이드(바이오맥스(Biomax))를 사용하였다. 표준 병리조직학적 과정에 따라, 슬라이드를 56℃에서 밤새 건조시키고, 자일렌 중에서 탈왁싱(dewaxed)시키고, 재수화시키고, 이어서 AR-10 용액 pH 9.0(바이오제넥스 래보러터리즈(BioGenex Laboratories))을 사용하여 항원 복구(antigen retrieval)를 하였다. 항-SSEA-4 항체(이바이오사이언스(eBioscience))의 사용과 함께 SSEA-4 발현을 결정하였다. SSEA-4에 대한 염색을 2차 항체로서 항-랫트 IgM을 사용하여 검출하고, DAB 기질로 현상하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 원발성 유방 종양 BCO145 및 NOD/SCID 마우스로부터의 종양 이종이식편을 10% 인산-완충 포르말린 중에서 고정시키고, 파라핀에 임베딩(embedded)하였다. 파라핀 섹션을 2㎛의 두께로 절단하고, 슈퍼프로스트 플러스 현미경 슬라이드(SuperFrost Plus microscopy slides)(멘젤-글래져(Menzel-Glaser)) 상에 마운팅하고, 55℃에서 밤새 건조시켰다. 섹션을 표준 병리조직학적 과정에 따라 자일렌 중에서 탈왁싱시키고, 재수화시키고, 이어서 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 면역염색 이전에, 슬라이드를 먼저 10 mmol/ℓ 시트르산염 완충액(pH 6.0)의 용액 중에 두고, 15분 동안 마이크로파 처리하였다. 그 다음, 슬라이드를 밤새 항-ER 또는 항-PR 항체와 함께 인큐베이션하였다. 슈퍼 센서티브 폴리머-HRP IHC 검출 시스템(Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection System)(바이오제넥스)을 사용하여 면역검출을 수행하였다.
본 명세서에 기재된 모든 공개문헌 및 특허 출원은 각각의 개별 공개문헌 또는 특허 출원이 참조 인용되는 것으로 특정적이고 개별적으로 명시되는 것처럼 본 명세서에서 참조로 인용된다.
전술한 발명이 이해를 명확히 하기 위해 예시 및 실시예의 방법으로 어느 정도 자세하게 기술되었지만, 본 발명의 교시를 고려하여 당업자라면 임의의 변경 및 변형이 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위를 벗어남 없이 본 명세서에서 이행될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다.
요약서는 독자가 기술적 개시 내용의 특성과 요지를 신속히 확인할 수 있도록 37 C.F.R. §1.72(b)에 부합하게 제공된다. 요약서는 이것이 청구범위의 범위나 의미를 해석하거나 한정하는데 이용되지 않을 것이라는 이해와 함께 제출되는 것이다.

Claims (57)

  1. (a) Globo H 또는 해당 Globo H의 면역원성 단편으로 주로 구성되며, 링커를 통해서 캐리어 단백질(carrier protein)과 컨쥬게이트되는(conjugated) 글리칸; 및
    (b) 수지상 세포(dendritic cell) 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트(adjuvant)를 포함하되,
    IgM 아이소타입(isotype) 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도하는 것인 면역원성 조성물(immunogenic composition).
  2. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)인 것인 면역원성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 애주번트는 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)의 합성 유사체인 것인 면역원성 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 애주번트는 이하의 구조를 포함하는 C34인 것인 면역원성 조성물:
    Figure pct00005
  5. 제1항에 있어서, 상기 링커는 p-나이트로페닐 링커인 것인 면역원성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 링커는 p-나이트로페닐이고, 상기 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이며, 상기 애주번트는 C34인 것인 면역원성 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역 반응이 바람직하게는 IgG 아이소타입 항체의 생성을 지향하는 것인 면역원성 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이고, 상기 애주번트는 C34인 것인 면역원성 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 적어도 하나의 애주번트를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 면역 반응에 의해 생성되는 항체가 암 세포 또는 암 줄기 세포 상에 발현된 항원을 중화시키는 것인 면역원성 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역 반응에 의해 생성되는 항체가 항원 Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 것인 면역원성 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항원 Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 항체가 IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 포함하는 것인 면역원성 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이며, 상기 애주번트는 C34인 것인 면역원성 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 대상체에서 항암 면역 반응을 유도할 수 있는 암 백신 조성물을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  15. 유방암, 폐암, 간암, 볼암(buccal cancer), 위암, 결장암, 비인두암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 장암(intestinal cancer) 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된 암을 치료하는 데 적합한 제14항의 암 백신.
  16. 제15항에 있어서, 암 조직이 세포의 표면상에 Globo H 항원을 발현하는 것인 암 백신.
  17. 제15항에 있어서, Globo H 항원이 유방 종양의 상피 세포 상에 발현되는 것인 암 백신.
  18. 면역 반응에 의해 생성된 항체가 항원 Globo H, Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 제14항의 암 백신.
  19. 항원 Globo H, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나가 유방암 줄기 세포 상에 발현되는 제14항의 암 백신.
  20. (a) Globo H 또는 해당 Globo H의 면역원성 단편으로 주로 구성되며, 링커를 통해서 캐리어 단백질과 컨쥬게이트되는 글리칸, 및 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계; 및
    (b) IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 양의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 면역원성 조성물에서 링커는 p-나이트로페놀이며, 상기 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이고, 상기 애주번트는 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)의 합성 유사체인 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 애주번트는 C34인 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 암 백신을 추가로 포함하며, 또한 유효량의 암 백신으로의 1회 이상의 치료가 종양 성장을 억제하는 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암 백신의 투여가 종양의 크기를 감소시키는 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  25. 제23항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 간암, 볼암, 위암, 결장암, 비인두암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 장암 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 면역 반응이 바람직하게는 IgG 아이소타입 항체의 생성을 지향하는 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  27. 제20항에 있어서, 상기 면역 반응에 의해 생성되는 항체가 항원 Globo H, Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항원 Globo H, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나가 유방암 줄기 세포 상에 발현되는 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 Globo H 항원이 유방 종양의 상피 세포 상에 발현되는 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 항원 Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 항체가 IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 포함하는 것인, 종양 성장의 억제를 포함하는 치료방법.
  31. (a) Globo H 또는 해당 Globo H의 면역원성 단편으로 주로 구성되며 링커를 통해서 캐리어 단백질과 컨쥬게이트되는 글리칸, 및 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하며, IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 암 백신.
  32. 제31항에 있어서, 상기 면역원성 조성물에서 링커는 p-나이트로페놀이며, 상기 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이고, 상기 애주번트는 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)의 합성 유사체인 것인 암 백신.
  33. 제32항에 있어서, 상기 애주번트는 C34인 것인 암 백신.
  34. 제32항에 있어서, 상기 암은 유방암이며, Globo H 항원이 유방암의 상피 세포 상에 발현되는 것인 암 백신.
  35. 제32항에 있어서, 상기 면역 반응에 의해 생성되는 항체가 항원 Globo H, Gb4, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나를 중화시키는 것인 암 백신.
  36. 제32항에 있어서, 상기 암은 유방암이며, 항원 Globo H, 단계-특이적 배아 항원-3(SSEA-3) 및 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4) 중 적어도 하나가 유방암 줄기 세포 상에 발현되는 것인 암 백신.
  37. (a) Globo H-관련 글리칸 또는 해당 글리칸의 면역원성 단편으로 주로 구성되며, 링커를 통해서 캐리어 단백질과 컨쥬게이트되는 글리칸; 및
    (b) 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하되,
    상기 Globo H-관련 글리칸이 SSEA-3 및 SSEA-4로 구성된 군으로부터 선택되고, 면역원성 조성물이 IgM 아이소타입 항체에 비해 상대적으로 더 높은 수준의 IgG 아이소타입 항체를 유도하는 면역 반응을 유도하는 것인 면역원성 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)인 것인 면역원성 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 상기 애주번트는 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)의 합성 유사체인 것인 면역원성 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 애주번트는 하기의 구조를 포함하는 C34인 것인 면역원성 조성물:
    Figure pct00006
  41. 제37항에 있어서, 상기 링커는 p-나이트로페닐 링커인 것인 면역원성 조성물.
  42. 제37항에 있어서, 상기 링커는 p-나이트로페닐이며, 상기 캐리어 단백질은 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197)이고, 상기 애주번트는 C34인 것인 면역원성 조성물.
  43. 유방암 줄기 세포에 대한 치료제로서,
    p-나이트로페닐 링커를 통해서 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197) 캐리어 단백질과 컨쥬게이트된 Globo H; 및
    수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 포함하는 치료제.
  44. 제43항에 있어서, 상기 애주번트는 C34인 것인 치료제.
  45. 제43항에 있어서, 상기 치료제의 대상체에의 투여가 유방암 줄기 세포(BCSC) 상에 발현되는 항원을 인식하는 항체의 생성을 유도하는 것인 치료제.
  46. 제44항에 있어서, 적어도 하나의 항원은 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 치료제.
  47. 유방암 줄기 세포에 대한 치료제로서,
    p-나이트로페닐 링커를 통해서 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197) 캐리어 단백질과 컨쥬게이트된 SSEA-3; 및
    수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질 C34를 포함하는 애주번트를 포함하는 치료제.
  48. 제47항에 있어서, 상기 치료제의 대상체에의 투여가 유방암 줄기 세포(BCSC) 상에 발현되는 항원을 인식하는 항체의 생성을 유도하는 것인 치료제.
  49. 제48항에 있어서, 적어도 하나의 항원은 Globo H, SSEA-3 및 SSEA-4로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 치료제.
  50. 유방암 줄기 세포에 대한 치료제로서,
    p-나이트로페닐 링커를 통해서 디프테리아 독소 교차 반응 물질 197(DT-CRM 197) 캐리어 단백질과 컨쥬게이트된 SSEA-4를 포함하는 치료제.
  51. 제50항에 있어서, 수지상 세포 상의 CD1d 분자와 결합할 수 있는 당지질을 포함하는 애주번트를 추가로 포함하는 치료제.
  52. 제51항에 있어서, 상기 애주번트는 C34인 것인 치료제.
  53. 제50항에 있어서, 상기 치료제의 대상체에의 투여가 유방암 줄기 세포(BCSC) 상에 발현되는 SSEA-4 또는 해당 SSEA-4의 절단된 구조를 인식하는 항체의 생성을 유도하는 것인 치료제.
  54. 제43항에 기재된 치료제 조성물을 유방암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유방암의 치료방법.
  55. 제47항에 기재된 치료제 조성물을 유방암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유방암의 치료방법.
  56. 제50항에 기재된 치료제 조성물을 유방암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유방암의 치료방법.
  57. 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 기재된 치료적 조성물을 유방암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유방암의 치료방법.
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