RS50444B - Inhibitori 2-indolinon protein kinaze supstituisani pirolom - Google Patents

Inhibitori 2-indolinon protein kinaze supstituisani pirolom

Info

Publication number
RS50444B
RS50444B YUP-614/02A YUP61402A RS50444B RS 50444 B RS50444 B RS 50444B YU P61402 A YUP61402 A YU P61402A RS 50444 B RS50444 B RS 50444B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
pyrrole
alkyl
hydrogen
dimethyl
Prior art date
Application number
YUP-614/02A
Other languages
English (en)
Inventor
Peng Cho Tang
Tod Miller
Xiaoyuan Li
Li Sun
Chung Chen Wei
Shahrzad Shirazian
Congxin Liang
Tomas Vojkovsky
Asaad S. Nematalla
Original Assignee
Sugen Inc.
Pharmacia & Upjohn Company Llc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27391578&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS50444(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sugen Inc., Pharmacia & Upjohn Company Llc. filed Critical Sugen Inc.
Publication of YU61402A publication Critical patent/YU61402A/sh
Publication of RS50444B publication Critical patent/RS50444B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/32—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/33—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/02—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings
    • C07D231/10—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D231/12—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Polyurethanes Or Polyureas (AREA)

Description

Opis pronalaska
Ova prijava štiti prioritet, pod 35 U.S.C. 119 (e), za U.S. Provisional Applications Serial Nos. 60/182,710, podnete 15. februara 2000, 60/216,422 podnete 6. jula 2000 i Serial No. 60/243,532 pođete 27 februara 2000, čiji opisi su ovde u celini priključeni kroz citat.
Ovaj pronalazak se odnosi na neka jedinjenja 2-indolininona supstituisana sa 3-pirolom koja modulišu aktivnost protein kinaza ("PK"). Prema tome, jedinjenja iz ovog pronalaska su korisna pri tretiranju poremećaja povezanih sa abnormalnom aktivnošću PK. Opisani su takođe farmaceutski preparati koji sadrže ova jedinjenja, postupci za tretiranje bolesti u kojima se koriste farmaceutski preparati koji sadrže ova jedinjenja i postupci za njihovo dobijanje.
Ono što sledi daje se samo kao osnovna informacija i ne treba je uzimati kao prethodno stanje tehnike u vezi sa ovim pronalskom.
PK-e su enzimi koji katalizuju fosforilovanje hidroksi grupa na tirozinskim, serinskim i treoninskim ostacima proteina. Posledice ove naizgled jednostavne aktivnosti su neverovatne; rast diferencijacija i proliferacija ćelije, tj. virtuelno svi aspekti života ćelije na ovaj ili onaj način zavise od aktivnosti PK. Pored toga, abnormalna aktivnost PK je povezana sa mnoštvom poremećaja, koji se kreću od bolesti koje relativno ne ugrožavaju život, kao što je psorijaza, do krajnje virulentnih bolesti, kao što je glioblastom (kancer mozga).
Pogodno je da se PK podele u dve klase, protein tirozin kinaze (PTK) i serin-treonin kinaze (STK).
Jedan od primarnih aspekata aktivnosti PTK je njihovo učešće u receptorima faktora rasta. Receptori faktora rasta su proteini površine ćelije. Kada se vežu sa ligandom faktora rasta, receptori faktora rasta se konvertuju u aktivni oblik koji stupa u interakciju sa proteinima sa unutrašnje površine membrane ćelije. Ovo dovodi do fosforilovanja tirozinskih ostataka receptora i drugih proteina i do stvaranja kompleksa unutar ćelije sa raznim citoplazmičnim signalnim molekulima koji, za uzvrat, utiču na brojne ćelijske odgovore, kao što su deljenje ćelije (proliferacija), diferencijacija ćelijskog rasta, izlučivanje metaboličkih efekata u vanćelijsko mikrookruženje itd. Za potpuniju diskusiju videti Schlessinger i Ullrich,Neuron,1992, 9, 303-391. ovde priključen kroz citat, kako je tamo u potpunosti opisano, uključujući crteže.
Receptori faktora rasta sa aktivnošću PTK su poznati kao receptori tirozin kinaza ("RTK"). Oni čine veliku familiju transmembranskih receptora sa raznom biološkom aktivnošću. Do sada je identifikovano najmanje deventnaest različitih subfamilija RTK. Primer ovih je subfamilija koja se označava kao "HER" RTK, koja obuhvata EGFR (receptor epitelnog faktora rasta), HER2, HER3 i HER4. Ove RTK predstavljaju vanćelijski glikozilovani domen koji vezuje ligand, transmembranski domen i unutarćelijski citoplazmički katalitički domen, koji mogu da fosforiluju tirozinske ostatke na proteinima.
Sledeća subfamilija RTK sadrži receptor insulina (IR), receptor faktora rasta I nalik insulinu (IGF1R) i receptor srodan receptom insulina (IRR). IR i IGF1R stupaju u interakciju sa insulinom, tako da IGF-I i IGF-II formiraju heterotetramer iz dve potpuno vanćelijske glikozilovane a subjedinice i dve (3 subjedinice, koje ukrštavaju ćelijsku membranu i koje sadrže domen tirozin kinaze.
Treća subfamilija RTK se navodi kao grupa receptora faktora rasta izvedena iz trombocita (PDGFR), koja sadrži PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, c-kit i c-fms. Ovi receptori se sastoje od glikozilovanih vanćelijskih domena, sačinjenih od promenljivog broja petlji nalik imunoglobulinu, i unutarćelijskog domena, pri čemu je domen tirozin kinaze prekinut sa nesrodnim sekvencijama aminokiselina. Sledeća grupa, zbog njene sličnosti subfamiliji PDGFR, ponekad podvedena u poslednju grupu, je subfamilija receptora jetrene kinaze fetusa ("ftk"). Smatra se da je ova grupa sačinjena od umetnutog domena receptora kinaze jetrene kinaze-1 fetusa (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-1R, flk-4 i tirozin kinaze 1 nalik fms (flt-1).
Sledeći član familije receptora faktora rasta tirozin kinaze je subgrupa receptora faktora rasta fibroplasta ("FGF"). Ova grupa se sastoji od četiri receptora, FGFR1-4 i sedam liganada, FGF1-7. lako još uvek nije dobro definisana, čini se da se ovi receptori sastoje od glikozilovanih vanćelijskih domena koji sadrže promenljiv broj petlji nalik imunoglobulinu, i unutarćelijski domen u kome je sekvencija tirozin kinaze prekinuta sa regionima nesrodnih sekvencija aminokiselina.
Sledeći član familije receptora faktora rasta tirozin kinaze je podgrupa receptora faktora rasta vaskularnog endotelijuma (VEGF"). VEGF je dimerni glikoprotein sličan PDGF, ali ima različite biološke funkcije i specifičnost targetirane ćelije,in vivo.Za sada, misli se da VEGF igra bitnu ulogu u vaskulogenezi i angiogenezi. Potpunija lista poznatih subfamilija RTK opisana je u Plowman et al.,DN P,1994, 7(6), 334-339, ovde priključenom kroz citat, uključujući crteže kako je tamo dato.
Pored RTK, postoji takođe familija kompletno unutarćelijskih PTK, zvanih "ne-receptorske tirozin kinaze" ili "ćelijske tirozin kinaze". Ova poslednja naznaka, skraćeno "CTK", koristiće se ovde. CTK ne sadrže vanćelijske i transmembranske domene. Do sada su identifikovane preko 24 CTK, u 11 subfamilija (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak i Ack). Do sada se subfamilija Src smatra najvećom grupom CTK i sadrži Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Bik, Hck, Fgr i Yrk. Za detaljniju diskusiju CTK, videti Bolen,Oncogene,1993, 8, 2025-2031, priključenu ovde kroz citat, uključujući crteže kako je tamo dato. Serin/treonin kinaze, STK, kao i CTK, su prvenstveno unutarćelijske, mada postoji nekoliko receptora kinaza tipa STK. STK su najčešće od citosoličnih kinaza, tj. kinaza koje njihovu funkciju obavljaju u onom delu citoplazme koji se razlikuje od citoplazmičkih organela i citoskeleta. Citosol je region unutar ćelije gde se odigrava većina ćelijskih intermedijarnih metaboličkih i biosintetskih aktivnosti, npr. u citosolu se proteini sintetizuju na ribozomima.
Sve RTK, CTK i STK učestvuju u mnogobrojnim patogenim stanjima, uključujući značajno, kancer. Drugi patogeni uslovi koji su povezani sa PTK su, bez ograničavanja, psorijaza, ciroza jetre, dijabetes, angiogeneza, restenoza, očne bolesti, reumatoidni artritis i druga inflamatorna oboljenja, imunološki poremećaji, kao što su autoimune bolesti, kardiovaskularne bolesti, kao što je ateroskleroza i razni bubrežni poremećaji.
U pogedu kancera, postavljene su dve glavne hipoteze da se objasni povećana ćelijska proliferacija, koja dovodi do razvoja tumora, povezanog sa funkcijama za koje se zna da su regulisane sa PK. Tako je predloženo da maligni rast ćelije proizilazi iz raspada mehanizma koji kontroliše deljenje i/ili diferencijaciju ćelije. Pokazano je da proteinski proizvodi brojnih proto-onkogena učestvuju u putevima transdukcije signala koji regulišu rast i diferencijaciju ćelije. Ovi proteinski proizvodi proto-onkogena su vanćelijski faktori rasta, receptori transmembranskog faktora rasta PTK (RTK), citoplazmički PTK (CTK) i citostolni STK, kao što je diskutovano gore.
U pogledu jasne veze između ćelijskih aktivnosti povezanih sa PK i velikog broja humanih poremećaja, ne uznenađuje da je veliki napor utrošen u pokušaju identifikacije načina za modulisanje aktivnosti PK. Deo ovog napora je u biomimetičkim pristupima, koji koriste velike molekule nalik onima koji učestvuju u stvarnim ćelijskim procesima (npr. mutanti liganada (U.S. App. No. 4,966,849); rastvorni receptori i antitela (App. No. WO 94/10202, Kendall i Thomas,Proc.Nat' l Acad. Sci.1994, 90, 10705-09, Kim et al.,Nature,1993, 362, 841-84, ligandi RNA (Jelinek et al.,Biochemistry,33, 10450-56; Takano et al.,Mol. Bio. Cell 1993,4, 358A; Kinsella et al.,Exp. Cell Res.1992, 199, 56-62; VVright et al.,J. Celluiar Phys.152, 448-57) i inhibitori tirozin kinaze (WO 94/03427; VVO 92/21660; WO 91/15495; VVO 94/14808; U.S. Pat. No. 5,330,992; Mariani et al.Proc. Am. Assoc. Cancer Res1994, 35, 2268).
Pored gore rečenog, učinjeni su pokušaji da se identifikuju mali molekuli koji deluju kao inhibitori PK. Na primer, bis-monociklična, biciklična i heterociklična aril jedinjenja (PCT VVO 92/20642), derivati vinilenazaindola (PCT VVO 94/14808) i 1-ciklopropil-4-pridilhinoloni (U.S. Pat. No. 5,330,992) opisani su kao inhibitori tirozin kinaze. Stiril jedinjenja (U.S. Pat. No. 5,217,999), stiril-supstituisana piridil jedinjenja (U.S: Pat. No. 5,302,606), derivati hinazolina (EP App. No. 0 566 266 A1), selenindoli i selenidi (PCT VVO 94/03427), triciklična polihidroksilna jedinjenja (PCT VVO 92/21660) i jedinjenja benzilfosfonske kiseline (PCT VVO 91/15495), sva su opisana kao inhibitori PTK, korisni u tretmanu kancera.
Ovaj pronalazak je usmeren na neka jedinjenja 2-indolinona supstituisana sa 3-pirolom, koja pokazuju sposobnost moduliranja PK, pa su stoga korisna u tretiranju poremećaja povezanih sa abnormalnom aktivnošću PK.
U skladu sa tim, u jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na 2-indolinone supstituisane sa 3-pirolom Formule (I):
gde:
R<1>je odabran od vodonika, (C1-C4)alkila, -(CH2)R16i-C(0)NR<8>R<9>;
R<2>je odabran od vodonika, aril i -S(0)2NR<13>R<14>i
R<3>je odabran od vodonika, (Ci-C4)alkila, (CrC4)alkoksi, arila, heteroarila i C(0)R<15>;
R<4>je vodonik;
R<5>je odabran od d-C4)alkila, i (CrC4)alkila,
R<6>-C(0)R<10>;
R<7>je odabran od vodonika, (CrC4)alkila i arila;
R<8>i R<9>, nezavisno se biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil i aril;
R<10>je -N(R<11>)(CH2)nR<12>, gde n je 1, 2 ili 3; R11 je vodonik i R12 je odabran od hidroksi, (d-C^alkoksi, -C(0)R15, heteroaril i-NR13R14;
R<13>i R<14>ne<z>avisno, se biraju iz grupe koju čine vodonik, (CrC4)alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; ili
R<13>i R<14>se mogu kombinovati formirajući heterocikličnu grupu;
R<15>se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, (Ci-C4)alkil i ariloksi;
R16 se bira iz grupe koju čine hidroksi, -C(0)R15 i
r je 2 ili 3
ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
Derivati indolina i njihova upotreba navedeni su u sledećim publikacijama: US patent 5,886,020; međunarodna patentna prijava Wo98/50356, VV099/61422 i VVO00/38519 (objavljeno 6 jula 2000); J. Med. Cehm. 1998, 41. 2588-2603. Derivati oksinsola i njihova upotreba navedeni su u sledećim publikacijama: VVoOO/35908 (objavljeno 22 juna 2000). Formulacije za farmceutske agense jonizovane kao slobodne kiseline ili slobodne baze navedene su u sledećim publikacijama: VVO01/37820 (objavljeno 31 maja 2001).
U drugom aspektu ovaj pronalazak je usmeren na farmaceutski preparat koji sadrži jedno ili više jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, i farmaceutski prihvatljiv dodatak.
U trećem aspektu ovaj pronalazak je usmeren upotrebu jedinjenja formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za proizvodnju leka za lečenje poremećaja povezanih sa protein kinazom. Ovi poremećaji su, samo kao primer a bez ograničavanja, kancer, dijabetes, ciroza jetre, kardiovaskularne bolesti, kao što je ateroskleroza, angiogeneza, imunološke bolesti, kao što su autoimune bolesti i bubrežne bolesti.
Detaljan opis pronalaska
Definicije
Ukoliko se drugačije ne navede, sledeći nazivi, koji se koriste u ovoj prijavi i patentnim zahtevima, imaju značenja koja se razmatraju niže.
"Alkil" se odnosi na zasićeni, alifatični ugljovodonični radikal, uključujući grupe ravnog lanca i račvastog lanca, sa 1 do 20 atoma ugljenika . Primeri alkil grupa su metil, etil, propil, 2-propil, n-butil,/zo-butil, rerc-butil i slično. Alkil grupa je nesupstituisana.
"Cikloalkil" se odnosi na 3- do 8-č!ani potpuno ugljenični monociklični prsten, na potpuno ugljenični 5-člani/6-člani ili 6-člani/6-člani spojeni biciklični prsten, ili na grupu višecikličnih spojenih prstenova ("spojeni" prsten označava da svaki prsten u sistemu deli susedni par atoma ugljenika jedan prsten sa drugim u sistemu) u kojoj jedan ili više prstenova može da sadrži jednu ili više dvogubih veza, ali ni jedan od prstenova nema kompletno konjugovani sistem pi-elektrona.
Primeri, bez ograničavanja, cikloalkil grupa su ciklopropan, ciklobutan, ciklopentan, ciklopenten, cikloheksan, cikloheksandien, adamantan, cikloheptan, cikloheptatrien i slično. Cikloalkil grupa je nesupstituisana.
"Aril" se odnosi na grupe potpuno ugljeničnih monocikličnih ili policikličnih spojenih prstenova (tj. prstenovi koji dele susedni par atoma ugljenika), sa 6 do 12 atoma ugljenika, koji imaju potpuno konjugovani sistem pi-elektrona. Primer, bez ograničavanja, aril grupa su fenil, naftalinil i antracenil. Aril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana. Ako je supstituisana, aril grupa je supstuituisana sa jednim ili dva supstituenta koji se nezavisno biraju između halo, alkil, trihaloalkil, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono- ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.
"Heteroaril" se odnosi na grupu monocikličnog ili spojenih prstenova (tj prstenova koji dele susedni par atoma ugljenika), sa 5 do 12 atoma u prstenu, koji sadrže jedan, dva ili tri heteroatoma, koji se biraju između N, O ili S, a preostali atomi u prstenu su C, a pored toga imaju potpuno konjugovan sistem pi-elektrona. Primeri, bez ograničavanja, nesupstituisanih heteroaril grupa su pirol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, pirazol, piridin, pirimidin, hinolin, izohinolin, purin i karbazol. Heteroaril grupa može biti supstituisana ili nesupstituisana. Kada je supstituisana, heteroaril grupa je supstituisana sa jedan ili dva supstituenta koji se nezavisno biraju između halo, alkil, trihaloalkil, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono- ili dialkilamino, karboksi ili N-sulfonamido.
"Heterocikl" označava zasićeni ciklični radikal sa 3 do 8 atoma u prstenu u kome su jedan ili dva atoma u prstenu heteroatomi, kojise biraju između N, O ili S(0)n(gde je n ceo broj od 0 do 2), a preostali atomi u prstenu su C, gde jedan ili dva atoma ugljenika mogu opciono biti zamenjeni sa karbonil grupom. Specifičnije, naziv heterociklil obuhvata, ali nije njima ograničen, tetrahidropiranil, 2,2-dimetil-1,3-dioksolan, piperidino, N-metilpiperidin-3-il, piperazino, N-metilpirolidin-3-il, 3-pirolidino, morfolino, tiomorfolino, tiomorfolino-1 -oksid, tiomorfolino-1,1 -dioksid, 4-etiloksikarbonilpiperazino, 3-oksipiperazino, 2-imidazolidon, 2-pirolidinon, 2-oksohomopiperazino, tetrahidropirimidi-2-on i njihove derivate. Heterociklična grupa opciono supstituisana sa jednim ili dva supstituenta koji se nezavisno biraju između halo, alkil, alkil supstituisan sa karboksi, ili estar, hidroksi, mono- ili dialkilamino.
"Hidroksi" se odnosi na -OH grupu.
"Alkoksi" se odnosi na grupu -0-(nesupstituisani alkil) i na grupu -0-(nesupstituisani cikloalkil). Reprezentativni primeri su, ali ne i ograničeni njima, npr. metoksi, etoksi, propoksi, butoksi, ciklopropiloksi, ciklobutiloksi, ciklopentiloksi, cikloheksiloksi i slično.
"Ariloksi" se odnosi na grupu i -O-aril i na -O-heteroaril, kako su ovde definisane. Reprezentativni primeri su, aili ne i ograničeni njima, fenoksi, piridiniloksi, furaniloksi, tieniloksi, pirimidiniloksi, piraziniloksi i slično, i njihovi derivati.
"Merkapto" se odnosi na -SH grupu.
"Estar" se odnosi na grupi -C(0)0-R", gde se R" bira iz grupe koju čine alkil, trihalometil, cikloalkil po ivboru supstituisan aril, po izboru supstituisan heteroaril
(vezan preko atoma ugljenika u prstenu)
"Halo" grupa se odnosi na fluor, hlor, brom ili jod, poželjno fluor ili hlor. "Trihalometil" grupa se odnosi na grupu -0X3, gde je X halo grupa definisana gore.
"Cijano" se odnosi na grupu -C=N.
"N-sulfonamido" se odnosi na grupu -NR<18>S(0)2R<19>, gde su R18iR19definisani ranije.
"N-amido" se odnosi na grupu R<18>C(0)NR<19>, gde suR18i R<19>definisani ranije.
R<18>i R<19>su nezavisno odabrani od vodonika i alkila.
Nazivi "2-indolinon", "indolin-2-on" i "2-oksiindol" ovde se koriste naizmenično da označe molekul koji ima hemijsku strukturu:
Naziv "pirol" se odnosi na molekul koji ima hemijsku strukturu:
Naziv "2-indolinon supstituisan pirolom" i "3-pirolidenil-2-indolinon" ovde se koriste naizmenično, a odnose se na hemijsko jedinjenje koje ima opštu strukturu koja je pokazana Formulom (I).
Jedinjenja koja imaju istu molekulsku formulu, ali se razlikuju po prirodi ili redosledu vezivanja njihovih atoma, ili rasporedu njihovih atoma u prostoru, nazivaju se "izomerima". Izomeri koji se razlikuju po rasporedu njihovih atoma u prostoru nazivaju se "stereoizomeri". Stereoizomeri koji jedan prema drugom se ne odnose kao predmet i lik u ogledalu, nazivaju se "dijastereomeri", a oni koji su predmet i lik u ogledalu, a ne mogu se preklopiti, nazivaju se "enantiomeri". Ukoliko jedinjenje ima centar asimetrije, na primer, ima vezane četiri različite grupe, moguć je par enantiomera. Enantiomer se može karakterisati apsolutnom konfiguracijom njegovih centara asimetrije, i opisuje se pravilima R- i S-sekvencioniranja Cahn-a i Prelog-a, ili na način kojim molekul rotira ravan polarizovane svetlosti, i označava se kao desnorotacioni ili levorotacioni (tj. kao (+) ili (-)-izomeri, respetkivno). Hiralno jedinjenje može da postoji ili kao individualni enantiomer ili kao njihova smeša. Smeša koja sadrži jednake odnose enantiomera se naziva "racemska smeša".
Jedinjenja iz ovog pronalaska mogu da poseduju jedan ili više centara asimetrije; takva jedinjenja mogu stoga da se dobiju kao individualni (R)- ili (S)-stereoizomeri ili kao njihova smeša. Ukoliko se drugačije ne ukaže, opisom ili nazivom pojedinog jedinjenja u ovoj prijavi i u patentnim zahtevima, namera je da se obuhavete oba pojedinačna enatiomera i njegove smeše, racemska ili druge. Postupci određivanja stereohemije i razdvajanje stereoizomera su dobro poznati u stanju tehnike (videti diskusiju u 4. glavi "Advanced Organic Chemistrv" 4. izdanje, J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).
Jedinjenja Formule (I) mogu da ispolje fenomen tautomerije ili strukturne izomerije. Na primer, ovde opisano jedinjenje može da bude E ili Z konfiguracije, u odnosu na dvogubu vezu koja povezuje 2-indolinonski ostatak sa pirolskim ostatkom, ili može biti smeša E i Z. Ovaj pronalazak obuhvata bilo koji tautomerni ili strukturni izomerni oblik i njihove smeše, ako poseduju sposobnost da modulišu aktivnost RTK, CTK i/ili STK, a nije ograničena na bilo koji tautomerni ili strukturni izomerni oblik.
"Farmaceutski preparat" se odnosi na smešu jednog ili više ovde opisanih jedinjenja, ili njihovih fiziološki/farmaceutski prihvatljivih soli ili prolekova, sa drugim hemijskim komponentama, kao što su fiziološki/farmaceutski prihvatljivi nosači i dodaci. Svrha farmaceutskog preparata je da se olakša aministracija jedinjenja organizmu.
Jedinjenje Formule (I) može takođe da deluje kao prolek. "Prolek" se odnosi na agens koji se konvertuje u polazni lekin vivo.Prolekovi su često korisni, zato što u nekim situacijama oni mogu lakše da se ordiniraju nego polazni lek. Na primer, oni mogu biti bioupotrebljivi oralnom administracijom, dok polazni lek to nije. Prolek može takođe da ima poboljšanu rastvorljivost u farmaceutskim preparatima, u odnosu na polazni lek. Primer, bez ograničavanja, proleka moglo bi biti jedinjenje iz ovog pronalaska koje se ordinira kao estar ("prolek") da se olakša prolazak kroz ćelijsku membranu, gde je rastvorljivost u vodi štetna za mobilnost, ali tada se metabolički hidrolizuje u karboksilnu kiselinu, aktivni entitet, za koji je, kada je unutar ćelije, rastvprljivost u vodi korisna.
Sledeći primer proleka može biti kratki polipeptid, na primer, ali bez ograničavanja, polipeptid sa 2-10 aminokiselina, vezan preko krajnje amino grupe za karboksi grupu jedinjenja iz ovog pronalska, pri čemu se polipeptid hidrolizuje ili se metabolišein vivoslobađajući aktivni molekul. Prlekovi jedinjenja Formule (I) su unutar obima ovog pronalaska.
Pored toga, podrazumeva se da će se jedinjenje Formule (I) metabolisati enzmima u telu organizma, kao što je humano biće, generišući metabolit koji može da moduliše aktivnost protein kinaza. Ovi metaboliti su unutar obima ovog pronalska.
"Fiziološki/farmaceutski prihvatljiv nosač" ovde označava nosač ili razblaživač koji ne izaziva značajnu iritaciju organizma i ne poništava biološku aktivnost i svojstva ordiniranog jedinjenja.
"Farmaceutski prihvatljiv dodatak" se odnosi na supstancu koja se dodaje u farmaceutski preparat da se dodatno olakša aministraciju jedinjenja. Primeri, bez ograničavanja, dodataka su kalcijum-karbonat, kalcijum-fosfat, razni šećeri i vrste škroba, derivati celuloze, želatin, biljna ulja i polietilenglikoli.
Naziv "farmaceutski prihvatljiva so" ovde se odnosi na one soli koje zadržavaju biološku efikasnost i svojstva polaznog jedinjenja. Te soli su: (1) kisela adiciona so koja se dobija reakcijom slobodne baze polaznog jedinjenja sa neorganskim kiselinama, kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina i perhlorna kiselina i slično, ili sa organskim kiselinama, kao štio su sirćetna kiselina, oksalna kiselina, (D) ili (L) jabučna kiselina, maleinska kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, ćilibarna kiselina ili malonska kiselina i slično, poželjno hlorovodonična kiselina ili (L)jabučna kiselina, kao što je L-malatna so 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina(2-dietilaminoetil)amid; ili (2) soli formirane kada se kiselinski proton prisutan u polaznom jedinjenju ili zameni jonom metala, npr. jonom alkalnog metala, jonom zemnoalkalnog metala ili jonom aluminijuma; ili koordinira sa organskom bazom, kao što je etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin, N-metilglukamin i slično.
"PK" se odnosi na receptorsku protein tirozin kinazu (RTK), ne-receptorsku ili "ćelijsku" tirozin kinazu (CTK) i serin-treonin kinazu (STK).
"Postupak" se odnosi na načine, sredstva, tehnike i procedure za obavljanje datog zadatka, uključujući, ali bez ograničavanja, one načine, sredstva, tehnike i procedure koji su ili poznati ili se jednostavno mogu razviti iz već poznatih načina, sredstava, tehnika i procedura, od strane stručnjaka u hemijskom, farmaceutskom, biološkom, biohemijskom i medicinskom stanju tehnike.
"Modulacija" ili "modulisanje" se odnosi na promenu katalitičke aktivnosti svih RTK, CTK i STK. Modulacija se naročito odnosi na aktiviranje katalitičke aktivnosti svih RTK, CTK i STK, poželjno aktiviranjem ili inhibicijom katalitičke aktivnosti svih RTK, CTK ili STK, zavisno od koncentracije jedinjenja ili soli kojima su RTK, CTK ili STK izložene, ili poželjnije, inhibicije katalitičke aktivnosti svih RTK, CTK ili STK.
"Katalitička aktivnost" se odnosi na brzinu fosforilovanja tirozina pod uticajem, direktnim ili indirektnim, svih RTK i/ili CTK, ili fosforilovanja serina i treonina pod uticajem, direktnim ili indirektnim, svih STK.
"Dovođenje u kontakt" odnosi se na zajedničko premošćavanje jedinjenja iz ovog pronalska i targeta PK, na takav način da ovo jedinjenje može da utiče na katralitičku aktivnost PK, bilo direktno, npr. interakcijom sa samom kinazom, ili indirektno, npr. interakcijom sa drugim molekulom, od koga katalitička aktivnost kinaze zavisi. Ovo "dovođenje u kontakt" se može obaviti" in vitro",tj. u epruveti, petrijevoj šolji ili slično. U epruveti, dovođenje u kontakt može da obuhvati samo jedinjenje i interesantnu PK, ili može da obhvati čitave ćelije. Ćelije se mogu takođe održavati ili gajiti u šoljama za kultivisanje ćelija i dovesti u kontakt sa jedinjenjem u toj sredini. U ovom kontekstu, sposobnost pojedinog jedinjenja da utiče na poremećaj izazvan sa PK, tj. IC50jedinjenja, koje se definiše niže, može se odrediti pre upotrebe jedinjenja, pokušajemin vivosa složenijim živim organizmima. Za ćelije izvan organizma, postoje brojni postupci, koji su dobro poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike, da se PK dovede u kontakt sa ovim jedinjenjem, uključujući, ali bez ograničavanja, mikroinjektiranje direktno u ćeliju i brojne tehnike transmembranskih nosača.
" In vitro"se odnosi na procedure obavljene u veštačkoj sredini, kao što je npr. , ali bez ograničavanja, u epruveti ili medijumu za kultivisanje.
" In vivo"se odnosi na procedure obavljene unutar živog organizma, kao što je, ali bez ograničavanja, miš ili zec.
"Poremećaj povezan sa PK", "Poremećaj izazvan sa PK" i "abnormalna aktivnost PK", svi se odnose na stanje koje karakteriše neodgovarajuća, npr. smanjena ili češće povišena katalitička aktivnost PK, gde posmatrana PK može biti RTK, CTK ili STK. Neodgovarajuća katalitička aktivnost može da se pojavi kao rezultat: (1) izlučivanja PK u ćelijama koje normalno ne izlučuju PK, (2) povećanog izlučivanja PK koje dovodi do neželjene proliferacije, diferencijacije i/ili rasta ćelija, ili (3) smanjenje izlučivanja PK dovodi do neželjenog smanjenja proliferacije, diferencijacije i/ili rasta ćelija. Hiperaktivnost PK se odnosi ili na pojačavanje genetskog kodiranja određene PK ili stvaranju nivoa aktivnosti PK
koji može da koreliše sa proliferacijom diferencijacijom i/ili rastom ćelija i/ili poremećajem rasta (tj. kako nivo PK raste, oštrina jednog ili više simptoma ćelijskog poremećaja raste). Hipoaktivnost je, naravno, suprotna, pri čemu oštrina jednog ili više simptoma ćelijskog poremećaja raste kako nivo aktivnosti PK opada.
"Tretirati", "tretiranje" i "tretman" se odnose na postupak ublažavanja ili poništavanja ćelijskog poremećaja posredovanog sa PK i/ili njegovih pratećih simptoma. U odnosu posebno na kancer, ovi nazivi jednostavno znače da očekivanja u pogledu dužine života pojedinca napadnutog kancerom rastu ili da će jedan ili više simptoma bolesti biti smanjen.
"Organizam" se odnosi na bilo koji živi entitet koji se sastoji od najmanje jedne ćelije. Živi organizam može biti jednostavan kao što je na primer, pojedinačna eukaritoska ćelija, ili toliko složen kao što je sisar, uključujući humano biće.
"Terapeutski efikasna količina" se odnosi na onu količinu jedinjenja koje se ordinira koja će u izvesnoj meri ublažiti jedan ili više simptoma poremećaja koji se tretira. Uzimajući tretman kancera, terapeutski efikasna doza se odnosi na onu količinu koja ima efekat:
(1) smanjenja veličine tumora; (2) inhibiranje (tj. usporavanje do izvesne mere, poželjno zaustavljanje) metastaze tumora; (3) inhibiranje do izvesne mere (tj. usporavanje do izvesne mere, poželjno zaustavljanje) rasta tumora, i/ili (4) ublažavanje do izvesne mere (ili poželjno eliminisanje) jednog ili više simptoma povezanih sa kancerom.
"Praćenje" označava opažanje i detekciju efekta dovođenja u kontakt jedinjenja sa ćelijom koja izlučuje određenu PK. Opaženi ili detektovan efekat može biti promena u fenotipu ćelije, u katalitičkoj aktivnosti PK ili promena u interakciji PK
sa prirodnim partnerom za vezivanje. Tehnike opažanja ili detekcije tih efekata su dobro poznate u stanju tehnike.
Gore navedeni efekat je izabran iz promene ili odsustva promene fenotipa ćelije, promene ili odsustva promene u katalitičkoj aktivnosti pomenute protein kinaze, ili promene ili odsustva promene u interakciji pomenute protein kinaze sa prirodnim partnerom za vezivanje u finalnom aspektu ovog pronalska.
"Fenotip ćelije" se odnosi na spoljašnji izgled ćelije ili tkiva ili biološke funkcije ćelije ili tkiva. Primer, ali bez ograničavanja, fenotipa ćelije su veličina ćelije, rast ćelije, proliferacija ćelije, diferencijacija ćelije, preživljavanje ćelije, apoptoza i utrošak i korišćenje hrane. Ove fenotipske karakteristike se mere tehnikama koje su dobro poznate u stanju tehnike.
"Prirodni partner vezivanja" odnosi se na polipeptid koji se vezuje za određenu PK u ćeliji. Prirodni partneri vezivanja mogu igrati ulogu u propagaciji signala u procesima transdukcije signala posredovanim sa PK. Promena u interakciji prirodnog partnera vezivanja sa PK može da se manifestuje kao povećanje ili smanjenje koncentracije kompleksa PK/prirodni partner vezivanja, i kao rezultat toga, u promeni koja se može opaziti i sposobnosti PK da posreduje u signalu.
Reprezentativna jedinjenja iz ovog pronalaska su pokazana u Tabeli 1 u nastavku.
Brojevi jedinjenja odgovaraju brojevima Primera u delu sa Primerima. To znači, sinteza Jedinjenja 1 u Tabeli 1 je opisana u Primeru 1. Jedinjenja prikazana u Tabeli 1 su samo primeri i ne treba ih shvatiti kao ograničenje obima ovog pronalska u bilo kom smislu.
Poželjne realizacije
lako je najšira definicija data gore, neka jedinjenja Formule (I) koja će se pomenuti niže, su poželjna.
(1) Poželjna grupa jedinjenja Formule (I) su ona u kojima R<1>, R<3>iR<4>predstavljaju vodonik. (2) Sledeća poželjna grupa jedinjenja Formule (I) su ona u kojimaR<1>, R<2>iR<4>predstavljaju vodonik. (3) Sledeća poželjna grupa jedinjenja Formule (I) su ona u kojima R<1>, R<2>iR<3>predstavljaju vodonik. (4) Sledeća poželjna grupa jedinjenja Formule (I) su ona u kojimaR<2>, R<3>iR<4>predstavljaju vodonik. (5) Sledeća poželjna grupa jedinjenja Formule (I) su ona u kojimaR<1>,R<2>,R3 i
R<4>predstavljaju vodonik.
(6) Naredna poželjnija grupa jedinjenja Formule (I) je ona u kojoj su:
R<1>je vodonik, alkil, -C(0)NR<8>R<9>, poželjno vodonik ili metil, naročito vodonik;
R<2>je vodonik, hloro, bromo, fluoro, fenil, dimetilaminosulfonil, 3-hlorofenilaminosulfonil, aminosulfonil, metil-aminosulfonil, fenilaminosulfonil, piridin-3-il-aminosulfonil, dimetil-aminosulfonil, izopropilaminosulfonil, a bolje vodonik, fluoro ili bromo;
R<3>je vodonik, metoksi, karboksi, fenil, piridin-3-il, 3,4-dihlorofenil, 4-n-butilfenil, 3-izopropilfenil, poželjnije vodonik ili fenil; i R<4>je vodonik.
Unutar gornje poželjne grupe (6), poželjnija grupa jedinjenja je ona gde: R<5>je vodonik, metil, etil, izopropil, ter-butil, izo-butil ili n-butil, poželjnije vodonik ili metil; i
R<7>je vodonik, metil, etil, izopropil, n-, izo- ili terc-butil, fenil, poželjno
metil, vodonik ili fenil.
(7) Sledeća poželjna realizacija ovog pronalaska je jedinjenje koje ima prethodno opisanu strukturu gde se R13iR14nezavisno biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil, heteroaril i kombinovano, -(CH2)4-,
-(CH2)5-, -(CH2)20-(CH2)2- ili -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.
Upotreba
Sve PK čija je katalitička aktivnost modulisana jedinjenjima iz ovog pronalska su protein tirozin kinaze, od kojih postoje dve vrste, receptorske tirozin kinaze (RTK) i ćelijske tirozin kinaze (CTK), i serin-treonin kinaze (STK). Signal transdukcije posredovan sa RTK inicira vanćelijska interakcija sa specifičnim faktorom rasta (ligand), nakon čega sledi dimerizacija receptora, prolazna stimulacija aktivnosti unutrašnje protein tirozin kinaze i fosforilovanje. Time se kreiraju mesta vezivanja za unutarćelijske molekule za transdukciju signala, što vodi stvaranju kompleksa sa čitavim spektrom molekula za citoplazmičku signalizaciju, što olakšava odgovarajući ćelijski odgovor (npr. deljenje ćelije, metaboličke efekte na vanćelijsku okolinu itd.(videti Schlessinger i Ullrich,Neuron,1992, 9, 303-391. Pokazano je da mesta za fosforilovanje tirozinom na receptorima faktora rasta funkcionišu kao mesta sa jakim afinitetom vezivanja SH2 (src homologija) domenima molekula za signalizaciju. Fantl et al.,Cell,1992, 69, 413-423; Songvang et al.,Mol. Cell. Biol.1994, 14. 2777-2785; Songvang et al.,Cell 1993,72, 767-778, i Koch et al.Science1991, 252, 668-678. Identifikovano je nekoliko unutarćelijskih proteinskih substrata koji su povezani sa RTK.Oni se mogu podeliti u dve glavne grupe: (1) substrate koji imaju katalitički domen, i (2) substrate kojima nedostaje taj domen, ali koji služe kao adapteri i pomažu katalitičkoj aktivnosti molekula. Songvang et al.,Cell1993, 72, 767-778. Specifičnost interakcija između receptora i SH2 domena njihovih substrata se određuje preko ostataka aminokiselina koje neposredno okružuju fosforilovani ostatak tirozina. Razlike u afinitetima vezivanja između SH2 domena i sekvencija aminokiselina koje okružuju ostatke fosfotirozina na određenom receptom su saglasne sa opaženim razlikama u njihovim profilima fosforilovanja substrata. Songvang et al.,Cell1993, 72, 767-778. Ova opažanja ukazuju da je funkcija svake RTK određena ne samo njenom shemom izlučivanja i svojstvima liganda, nego takođe mnoštvom puteva silaznog signala transdukcije, koji se aktiviraju određenim receptorom. Dakle, fosforilovanje pruža značajan korak u regulaciji izazvan specifičnim receptorima faktora rasta, kao i receptorima faktora diferencijacije.
STK, koje su primarno citosoličke, utiču na unutrašnju biohemiju ćelije, često kao nizlazni odgovor na PTK izazov. STK su uključene u proces signalizacije koji inicira sintezu DNA i naknadnu mitozu koja dovodi do proliferacije ćelije.
Dakle, transudkcija signala pomoću PK dovodi, između ostalih odgovora, do proliferacije, diferencijacije, rasta i metabolizma ćelije. Abnormalna proliferacija ćelije može dovesti do raznovrsnih poremećaja i bolesti, uključujući razvoj neoplazije, kao što su karcinom, sarkom, glioblastom i hemangiom, do poremećaja kao što su leukemija, psorijaza, arterioskleroza, artritis i dijabetska retinopatija i drugih poremećaja koji su povezani sa nekontrolisanom angiogenezom i/ili vaskulogenezom.
Precizno razumevanje mehanizma po kome jedinjenja iz ovog pronalska inhibiraju PK nije potreban da bi se primenjivao ovaj pronalazak. Međutim, iako se ovde ne vezuje ni za jedan određeni mehanizam ili teoriju, veruje se da ova jedinjenja stupaju u interakciju sa aminokiselinama u katalitičkom regionu PK. PK tipično poseduju strukturu duplog režnja, gde izgelda da se ATP vezuje u procepu između dva režnja, u oblasti gde su aminokiseline očuvane između PK. Smatra se da se inhibitori PK vezuju ne-kovalentnim interakcijama, kao što su vodonična veza, van der Waals-ove sile i jonske interakcije u istoj opštoj oblasti, gde se pomenuti ATP vezuje za PK. Određenije, misli se da se 2-indolinonska komponenta jedinjenja iz ovog pronalska vezuje na mesto koje je obično zauzeto sa adeninskim prstenom ATP. Specifičnost određenog molekula za određenu PK može da nastane kao rezultat dodatnih interakcija između raznih supstituenata na jezgru 2-indolinona i domena aminokiselina specifičnih za određenu PK. Dakle, različiti indolinonski supstituenti mogu da doprinose preferencijalnom vezivanju za određenu PK. Sposobnost da se izaberu jedinjenja aktivna na različitim mestima vezivanja ATP (ili drugom nukleotidu) čini jedinjenja iz ovog pronalska korisnim za targetiranje bilokog proteina sa takvim mestom. Stoga jedinjenja koja se ovde opisuju imaju upotrebu u testovimain vitroza te proteine, kao što pokazuju terapeutski efekatin vivopreko interakcije sa takvim proteinima.
Pored toga, jedinjenja iz ovog pronalska pružaju terapeutski pristup tretiranju mnogih vrsta čvrstih tumora, uključujući, ali bez ograničavanja, karcinome, sarkome, uključujući Karposi-jev sarkom, eritroblastom, glioblastom, meningiom, astrocitom, melanom i mioblastom. Tretman ili prevencija tumora kancera koji nisu čvrsti, kao što je leukemija, takođe su obuhvaćeni ovim pronalskom. Indikacije mogu biti, ali nisu ograničene na njih, kanceri mozga, kanceri bešike, kanceri jajnika, kanceri želuca, kanceri pankreasa, kanceri debelog creva, kanceri krvi, kanceri pluća i kanceri kosti.
Drugi primeri, bez ograničavanja, tipova poremećaja povezanih sa neodgovarajućom aktivnošću PK, za koje ovde opisana jedinjenja mogu biti korisna u prevenciji, tretiranju i izučavanju, su poremećaji proliferacije ćelije, fibrotički poremećaji i metabolički poremećaji.
Poremećaji proliferacije ćelije, koji se mogu sprečiti, tretirati ili dalje izučavati pomoću ovog pronalska su kancer, proliferativni poremećaji krvnih sudova i proliferativni poremećaji mezangijalnih ćelija.
Proliferativni poremećaji krvnih sudova se odnose na poremećaje povezane sa abnormalnom vaskulogenezom (stvaranjem krvnih sudova) i angiogenezom (širenjem krvnih sudova), lako vaskulogeneza i angiogeneza igraju značajne uloge u raznih normalnim fiziološkim procesima, kao što su embrionalni razvoj, stvaranje corpus luteum-a, zarastanje rana i regeneracija organa, oni takođe igraju glavnu ulogu u razvoju kancera, gde dovode do formiranja novih kapilara neophodnih za održavanje tumora u životu. Drugi primeri proliferacije krvnih sudova su artritis, gde novi kapilarni krvni sudovi okupiraju zglob i uništavaju hrskavicu, i očne bolesti, kao što je dijabetska retinopatija, gde novi kapilari u mrežnjači okupiraju staklasto telo, krvare i izazivaju slepilo.
Identifikovane su strukturno srodne RTK koje vezuju VEGF sa jakim afinitetom: receptor nalik fms tirozinu 1 (fit-1) (Shibuva et al.,Oncogene1990, 5, 519-524; De Vries et al.,Science1992, 255, 989-991) i receptor KDR/FLK-1, poznat takođe kao VEGF-R2. Faktor vaskularnog rasta endotelijuma (VEGF) objavljeno je da je specifični mitogen ćelije endotelijuma, za promociju aktivnosti rasta ćelija endotelijumain vitro.Ferrara i Hanzel,Biochem. Biophys. Res. Comm.1989, 161, 851-858; Vaisman et al.,J. Biol. Chem.1990, 265, 19461-19566. Informacije koje su date u U.S. Application Ser. No. 08/193,829, 08/038,596 i 07/975,750, snažno ukazuju da nije samo VEGF odgovoran za proliferaciju ćelija endotelijuma, već takođei primarni regulator normalne i patološke angiogeneze. Videti, Klagsbur i Soker,Current Biology,1993, 3(10), 699-702; Houck eta\., J. Biol. Chem,1992, 267, 26031-26037.
Normalna vaskulogeneza i angiogeneza igraju značajne uloge u raznim fiziološkim procesima, kao što su embrionalni razvoj, zarastanje rana, regeneracija organa i reproduktivni procesi žene, kao što je razvoj folikule u corpus luteum-u tokom ovulacije i rast placente u trudnoći. Folkman i Shing,J. Biol. Chem.1992, 267(16), 10931-34. Nekontrolisana vaskulogeneza i/ili angiogeneza su povezane sa oblastima kao što su dijabetes, kao i sa malignim čvrstim tumorima, koji se pri rastu zasnivaju na vaskularizaciji. Klagsburn i Soker,Current Biology 1993,3(10), 699-702; Folkham,J. Natl. Cancerlnst.1991, 82, 4-6; VVeidner et al.,New Engl. J. Med.1991, 324, 1-5.
Pred postavljena uloga VEGF u proliferaciji endotelijuma ćelije i migraciji tokom angiogeneze i vaskulogeneze ukazuje na značajnu ulogu receptora KDR/FLK-1 u ovim procesima. Bolesti, kao što je dijabetes mellitus (Folkman, uXlth Congress of Thrombosis and Haemostasis(uredn. Verstraeta et al.), str. 583-596, Leuven Universitv Press, Leuven), kao i maligni rast tumora mogu da dovedu do angiogeneze. Videti npr. Folkman,N. Engl. J. Med.1971, 285, 1182-1186. Receptori za koje se VEGF specifično veže su značajne i snažne terapeutske mete za regulaciju i modulaciju vaskulogeneze i/ili angiogeneze i raznih ozbiljnih bolesti u kojima učestvuje abnormanlni rast ćelija izazvan tim procesima. Plovvman et al.,DNP,1994, 7(6), 334-339. Određenije, visoko specifična uloga receptora KDR/FLK-1 u neovaskularizaciji čini ga odabranim ciljem za terapeutske pristupe u tretmanu kancera i drugih bolesti koje uključuju nekontrolisano stvaranje krvnih sudova.
Dakle, ovaj pronalazak daje jedinjenja koja su u stanju da regulišu i/ili modulišu signal transdukcije tirozin kinaze, uključujući signal transdukcije receptora
KDR/FLK-1, kako bi se inhibirala ili promovisala angiogeneza i/ili vaskulogeneza, tj. jedinjenja koja inhibiraju, sprečavaju ili interferiraju sa signalom koji prenosi KDR/FLK-1, kada se aktivira Ugandom, kao što je VEGF. Mada se smatra da jedinjenja iz ovog pronalska deluju na receptor ili druge komponente duž puta transdukcije signala tirozin kinaze, ona mogu takođe da deluju direktno na ćelije tumora koje proizilaze iz nekontrolisane angiogeneze.
Mada je nomenklatura humanih i glodarskih (miševi) kopija generičkog receptora "flk-1" različita, oni se u mnogim aspektima mogu zameniti. Receptor glodara, Flk-1 i njegova humana kopija KDR, dele homologiju sekvencije sa 93,4% u unutarćelijskom domenu. Slično, FLK-1 glodara vezuje humani VEGF sa istim afinitetom kao i mišji VEGF, pa prema tome, on se aktivira ligandom koji se izvodi iz obe vrste. Millauer et al.,Cell 1993,72, 835-846; Quinn eta\., Proc. Natl. Acad. Sci. USA1993, 90, 7533-7537. FLK-1 je takođe povezan sa naknadnim tirozinskim fosforilatima humanih RTK substrata (npr. PLC-y ili p85) kada se izlučuje istovremeno u ćelijama 293 (fibroplasti bubrega humanog embriona).
Modeli koji se zasnivaju na receptom FLK-1 direktno su primenljivi za razumevanje receptora KDR. Naprimer, upotreba glodarskog receptora FLK-1 u postupcima koji identifikuju jedinjenja koja regulišu putanju transdukcije signala glodara, direktno su primenljivi za identifikaciju jedinjenja koja se mogu koristiti za regulaciju humanih puteva transdukcije signala, tj. koji regulišu aktivnost povezanu sa receptorom KDR. Dakle, hemijska jedinjenja koja se identifikuju kao inhibitori KDR/FLK-1in vitro,mogu se potvrditi u podesnim modelimain vivo.Modeli na miševima i pacovimain vivosu se pokazali izuzetno vrednim za ispitivanje kliničkog potencijala agenasa koji deluju na put transdukcije signala izazvan sa KDR/FLK-1.
Dakle, ovaj pronalazak daje jedinjenja koja regulišu, modulišu i/ili inhibiraju vaskulogenezu i/ili angiogenezu, utičući na enzimatsku aktivnost receptora KDR/FLK-1 i interferirajući sa signalom transdukovanim sa KDR/FLK-1. Dakle, ovaj pronalazak daje terapeutski prilaz tratmanu mnogih vrsta čvrstih tumora, uključujući, ali bez ograničavanja, glioblastom, melanom, i Kaposi-jev sarkom, i karcinome jajnika, pluća, dojke, prostate, pankreasa, debelog creva i epiderma. Pored toga, podaci ukazuju da aministraciju jedinjenja iz ovog pronalaska inhibira put transdukcije signala posredovan sa KDR/FLK-1, što se takođe može upotrebiti pri tretmanu hemangioma, restenoze i dijabetske retinopatije.
Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na inhibiciju vaskulogeneze i angiogeneze putevima koji su posredovani drugim receptorom, uključujući put koji uključuje receptor flt-1.
Transdukcija signala posredovana receptorom tirozin kinaze inicira se vanćelijskom interakcijom sa specifičnim faktorom rasta (ligand), nakon čega sledi dimerizacija receptora, prolazna stimulacija aktivnosti unutrašnje protein tirozin kinaze i autofosforilovanje. Time se kreiraju mesta za vezivanje za molekule u unutarćelijskoj transdukciji signala, što dovodi do stvaranja kompleksa sa čitavim spektrom citoplazmičkih molekula za signalizaciju, što olakšava odgovarajući ćelijski odgovor, npr. deljenje ćelije i metabolički efekti na izvanćelijsku sredinu. Videti, Schlessinger i Ullrich,Neuron1992, 9, 1-20.
Bliska homologija unutarćelijskih regiona KDR/FLK-1 sa onima iz receptora PDGF-B (50,3% homologije) i/ili srodnim receptorom flt-1, ukazuje indukcija preklapanja puteva transdukcije signala. Na primer, za receptor PDGF-p, članovi familije src. (Twamley et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA1993, 90, 7696-7700), fosfatidilinozitol-3'-kinaza (Hu et al.,Mol. Cell. Biol.1992, 12, 981-990), fosfolipaza cy (Kashishian i Cooper,Mol. Cell. Biol.1993, 4, 49-51), protein koji aktivira ras-GTP-azu Kashishian et al.,EMBO J.1992, jj., 1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al.,Proc. Natl. Acas. Sci. USA1993, 90, 6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al.,Mol. Cell. Biol 1994,14,, 6715-6726) i adapterski molekuli Shc i Nck (Nashimura et al.,Mol. Cell. Biol.1993, 13, 6889-6896), pokazano je da se vezuju za regione koji učestvuju na raznim mestima za autofosforilovanje. Videti, Claesson-VVelsh,Prog. Grovvth Factor Res.1994, 5, 37-54. Dakle, verovatno je da putevi transdukcije signala, aktivirani sa KDR/FLK-1 obuhvataju i ras put (Rozakis et al.,Nature1992, 360, 689-692), PI-3' kinazu, puteve posredovane sa src i plcy. Svaki od ovih puteva može da igra kritičnu ulogu u angiogenom i/ili vaskulogenom efektu KDR/FLK-1 u ćelijama endotelijuma. Prema tome, još jedan aspekt ovog pronalska je povezan sa upotrebom organskih jedinjenja opisanih ovde u modulisanju angiogeneze i vaskulogeneze, pošto su ti procesi kontrolisani tim putevima.
Obrnuto, poremećaji povezani sa širenjem, kontrakcijom ili zatvaranjem krvnih sudova, kao što je restenoza, takođe su implicirani i mogu se tretirati ili sprečiti postupcima iz ovog pronalska.
Fibrotički poremećaji se odnose na abnormalno stvaranje vanćelijskih matrica. Primeri fibrotičkih poremećaja su ciroza jetre i proliferativni poremećaji mezangijalnih ćelija. Cirozu jetre karakteriše porast vanćeliskih konstituenata matrice, što dovodi do stvaranja jetrenog ožiljka. Porast vanćelijske matrice koji dovodi do jetrenog ožiljka može takođe biti prouzrokovan virusnom infekcijom, kao što je hepatitis. Izgleda da lipociti igraju glavnu ulogu u cirozi jetre. Drugi fibrotički poremećaji obuhvataju aterosklerozu.
Proliferativni poremećaji mezangijalnih ćelija se odnose na poremećaje koji dovode do abnormalne proliferacije mezangijalnih ćelija. Mezangijalni proliferativni poremećaji su razne humane bubrežne bolesti, kao što je glomerulonefritis, dijabetska nefropatija i maligna nefroskleroza, kao i poremećaji kao što su sindromi trombotičke mikroangipatije, odbijanje transplantata i glomerulopatije. RTK PDGFR saučestvuje u održavanju proliferacije mezangijalnih ćelija. Floege et al.,Kidney International 1993,43, 47S-54S.
Mnogi kanceri su poremećaji proliferacije ćelije i, kao što je ranije pomenuto, PK su povezane sa proliferativnim poremećajima ćelije. Dakle, ne čudi da PK, kao što su na primer, članovi familije RTK, povezane sa razvojem kancera. Neki od ovih receptora, kao što je EGFR (Tuzi et al.,Br. J. Cancer1991, 63, 227-233; Torp et al.,APMIS1992, 100, 713-719), HER2/neu (Slamon et al.,Science,1989, 244, 707-712) i PDGF-R (Kumabe et al.,Oncogene1992, 7, 627-633) se hiper-izlučuju kod mnogih tumora i/ili su neprestao aktivirani preko petlje samostimulacije. Ustvari, kod najčešćih i ozbiljnih kancera pokazana su hiper-izlučivanja ovih receptora (Akbasak i Suner-Akbasak et al.,J. Neurol. Sci.1992, 111, 119-133; Dickson et al.,Cancer Tretament Res.1992, 61 249-273; Kore et al.,J. Clin. Invest.1992, 90, 1352-1360) i samostilišuće petlje (Lee i Donoghue,J. Cell. Biol.1992, 118, 1057-1070; Kore et al., vidi gore; Akbasak i Suner.Akbasak et al., vidi gore). Na primer EGFR je povezan sa skvamoznim ćelijama karcinoma, strocitoma, glioblastoma, kancera glave i vrata, kancera pluća i kancera bešike. HER2 je povezan sa kancerom dojke, jajnika, želuca, pluća, pankreasa i bešike. PDGFR je povezan sa glioblastomom i melanomom, kao i sa kancerom pluća, jajnika i prostate. RTK c-met je povezan takođe sa stvaranjem malignih tumora. Na primer, c-met je povezan sa, između ostalih kancera, sa karcinomoma kolorektalnim, tiroide, pankreasa, želuca i hepatocelularnim karcinomima i sa limfomima. Pored toga, c-met je povezan sa leukemijom. Hiper-izlučivanje c-met gena utvrđeno je takođe kod pacijenata sa Hodgkins-ovom bolešću i Burkitts-ovom bolešću.
Pored toga što je IGF-IR upleten u potporu varenja i tip-ll dijabetesa, povezan je takođe sa nekoliko vrsta kancera. Na primer, IGF-I je upleten kod samostimulišućeg rasta stimulatora za nekoliko tipova tumora, npr. ćelija karcionoma humanog raka dojke (Artega et al.,J. Clin. Ivest.1989, 84, 1418-1423) i tumora malih ćelija pluća (Macaulev et ai.,Cancer Res.1990, 50, 2511-2517). Pored toga, IGF-I, iako integralno učestvuje u normalnom rastu i diferencijaciji nervnog sistema, čini se da je takođe samostimulišući stimulator humanih glioma. Sandberg-Nordquist et al.,Cancer Res.1993, 53, 2475-2478. Značaj IGF-IR i njegovih liganada u proliferaciji ćelija potvrđuje još i činjenica da mnogi tipovi ćelija u kulturi (fibroplasti, ćelije endotelijuma, ćelihje glatkih mišića, T-limfociti, mieloidne ćelije, hodrociti i osteoblasti (stem ćelije u koštanoj srži)) bivaju stimulisane rastom IGF-I. Goldring i Goldring,Eukkaryotic Gene Expression1991, 1, 301-326. Baserga i Copola predlažu da IGF-IR igra centralnu ulogu u mehanizmu transformacije i kao takve mogu biti preferirani cilj za terapeutske intervencije u širokom spektru humanih maligniteta. Baserga,VancerRes.1995, 55, 249-252; Baserga,Cell 1994,79, 927-939; Coppola et al.,Mol. Cell. Biol.1994, 14, 4588-4595.
STK učestvuju u mnogim tipovima kancera, uključujući kancer dojke (Cance et al.,Int. J. Cancer1993, 54, 571-77.
Veza između normalne aktivnosti PK i bolesti ne ograničava se samo na kancer. Na primer, RTK su povezane sa bolestima kao što su psorijaza, dijabetes meliitus, endometrioza, angiogeneza, razvoj ateromatoznog plaka, Alzheimer-ova bolest, restenoza, von Hippel-Lindau-ova bolest, epidermalna hiperproliferacija, neurodegenerativne bolesti, makularna degeneracija povezana sa starenjem i hemangiomi. Na primer, EGFR je indiciran u zarašćivanju rana rožnjače i kože. Smanjenja Insulina-R i IGF-1R su indicirana kod tipa II dijabetes melitusa. Potpunija korelacija između specifičnih RTK i njihovih terapeutskih indikacija izneta je u radu Plovvman et al,DN& P1994, 7, 334-339.
Kao što je ranije pomenuto, ne samo razne RTK, već i CTK, uključujući, ali bez ograničavanja, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, bik, hek, fgr i yrk (pregled u Bolen et al.,FASEB J.1992, 6, 3403-3409) učestvuju u putanji transdukcije proliferativnog i metaboličkog signala, pa se tako može očekivati, a i pokazano je, da učestvuju u mnogim poremećajima posredovanim sa PTK, na koje je usmeren ovaj pronalazak. Na primer, pokazano je na pilićima da je mutirani src (v-src) onkoprotein (pp60<vsrc>). Pored toga, njegov ćelijski homolog, proto-onkogen pp60<c>"src, prenosi onkogene signale mnogih receptora. Hiper-izlučivanje EGFR ili HER/2neu u tumorima vodi konstitutivnom aktiviranju pp60c"scr,štoj<e>karakteristika malignih ćelija, ali je odsutno kod normalnih ćelija. S druge strane, miševi koji su deficitarni u izlučivanju c-src pokazuju osteoprotički fenotip i moguće učešće u srodnim bolestima.
Slično, Zap70 je upleten u signalizaciju T-ćelija, što se može povezati sa autoimunim poremećajima.
STK su povezane sa zapaljenjem, autoimunom bolešću, imuno odgovorima i hiperproliferacionim poremećajima, kao što su restenoza, fibroza, psorijaza, osteoartritis i reumatoidni artritis.
PK takođe učestvuju u implantaciji embriona. Tako, jedinjenja iz ovog pronalska mogu pružiti efikasan metod za prevenciju implantacije embriona i tako da budu korisna kao agensi za kontrolu rađanja. Drugi poemećaji koji se mogu tretirati ili sprečiti korišćenjem jedinjenja iz ovog pronalska su imunološki poemećaji, kao što su autoimune bolesti; AIDS i kardiovaskularni poremećaji, kao što je ateroskleroza.
Konačno, danas se smatra da i RTK i CTK učestvuju u autoimunim poremećajima.
Primeri efekta niza jedinjenja uzetih za primer iz ovog pronalska na nekoliko PTK su pokazani u Tabeli 2 niže. Jedinjenja i podatke koji su dati ne treba shvatiti ograničavanjem obima ovog pronalska na bilo koji način.
Administracija i farmaceutski preparati
Jedinjenje iz ovog pronalska ili njegova farmaceutski prihvatljiva so može se ordinirati humanom pacijentu kao takvo, ili se može ordinirati u farmaceutskim preparatima, u kojima su prethodni materijali pomešani sa pogodnim nosačima ili dodacima. Tehnike formulacije i administracije lekova se mogu naći u poslednjem izdanju knjige "Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA.
"Administrirati" ili "aministracija " se ovde koristi da označi oslobađanje jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, ili farmaceutskog preparata koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so iz ovog pronalaska u organizam, u svrhu prevencije ili tretmana poremećaja povezanog sa PK.
Pogodni putevi administracije su, bez ograničavanja, oralno, rektalno, transmukozalno ili intratestinalno aministracija ili intramuskularno, subkutano, intramedularno, intratekalno, direktno intraventrikularno, intravenozno, intavitrealno, inraperitonealno, intranazalno ili intraokularno injektiranje. Poželjni putevi aministracije su oralno i parenteralno.
Alternativno, jedinjenje se može ordinirati lokalnim, radije nego sistemskim načinom, na primer, injekcijom jedinjenja direktno u čvrsti tumor, često kao depo sa formulacijom za uzdržano oslobađanje.
Dalje, lek se može ordinirati u targetiranom sistemu oslobađanja leka, na primer, obložen lipozomom sa antitelom specifičnim za tumor. Lipozom je targetiran na i tumor ga selektivno prima.
Farmaceutski preparati iz ovog pronalska mogu se proizvoditi postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike, npr. konvencionalnim mešanjem, rastvaranjem, granulacijom, pravljenjem dražeja, mlevenjem, emulgovanjem, kapsuliranjem, zatvaranjem, liofilizacijom.
Farmaceutski preparati za upotrebu u skladu sa ovim pronalskom mogu se formulisati na konvencionalan način, koristeći jedan ili više fiziološki prihvatljivih nosača, koji se sastoje od dodataka i pomoćnih agenasa koji olakšavaju procesiranje aktivnog jedinjenja u preparate koji se mogu koristiti farmaceutski. Ispravna formulacija zavisi od odabranog puta aministracije.
Za injekcije, jedinjenja iz ovog pronalaska se mogu formulisati u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što su Hank-ov rastvor, Ringer-ov rastvor ili fiziološki slani pufer. Za transmukozalnu administraciju, u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri kroz koju treba da penetriraju. Ti penetranti su obično poznati u stanju tehnike.
Za oralnu administraciju, jedinjenja se mogu formulisati kombinovanjem aktivnih jedinjenja sa farmaceutski prihvatljvim nosačima, dobro poznatim u stanju tehnike. Ti nosači omogućavaju da se jedinjenja iz ovog pronalska formulišu kao tablete, pilule, hostije, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, guste suspenzije, suspenzije i slično, koje pacijent oralno guta. Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu se mogu napraviti korišćenjem čvrstih dodataka, opciono mlevenjem dobijene smeše, pa procesiranjem ove smeše u granule, a posle dodavanja drugih pogodnih pomoćnih agenasa, ukoliko se želi, da se dobiju tablete ili jezgra dražeja. Korisni dodaci su, naročito, punioci, kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol, preparate celuloze, kao što su naprimer, kukuruzni škrob, pšenični škrob, pirinčani škrob i škrob iz krompira, i druge materijale, kao što su želatin, tragant guma, metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza, natrijum-karboksimetilceluloza i/ili polivinilpirolidon (PVP). Ukoliko se želi, mogu se dodati agensi za dezintegraciju, kao što su umreženi polivinilpirolidon, agar ili alginska kiselina. Može se takođe koristiti so, kao što je natrijum-alginat.
Jezgra dražeja se daju sa pogodnim oblogama. Za tu svrhu se mogu koristiti koncentrovani rastvori šećera, koji opciono mogu da sadrže gumiarabiku, talk, polivinilpirolidon, gel karbopola, polietilenglikol i/ili titanijum-dioksid, rastvore za lakiranje i pogodne organske rastvarače i smeše rastvarača. Mogu se dodavati bojene supstance i pigmenti u obloge za tablete ili dražeje, radi identifikacije ili da se karakterišu različite kombinacije doza aktivnog jedinjenja.
Farmaceutski preparati koji se mogu koristiti oralno su kapsule koje se prave od želatina, kao i meke, zatopljene kapsule koje se prave od želatina i plastifikatora, kao što je glicerin ili sorbitol. Kapsule mogu da sadrže aktivne sastojke pomešane sa puniocem, kao što je laktoza, vezivom, kao što je škrob i/ili lubrikantom, kao što je talk ili magnezijum-stearat, i opciono, stabilizatorima. U mekim kapsulama, aktivna jedinjenja se mogu rastvoriti ili suspendovati u pogodnim tečnostima, kao što su ulja, tečni parafin ili tečni polietilenglikoli. Ovim formulacijama se takođe mogu dodati stabilizatori.
Farmaceutski preparati koji se takođe mogu koristiti, su tvrde želatinske kapsule. Kao primer kojim se ništa ne ograničava, aktivno jedinjenje u kapsuli oralne formulacije leka se može dati sa jačinama doze 50 i 200 mg (šifre formulacije J-011248-AA-00 i J-011248-AA-01, respektivno). Ove dve jačine doza se prave od istih granula, punjenjem u tvrde želatinske kapsule različitog formata, format 3 za kapsulu od 50 mg, a format 0 za kapsulu od 200 mg. Sastav formulacije može biti, na primer, kao što je pokazan u Tabeli 2.
Kapsule se mogu pakovati u boce od mrkog stakla ili plastične boce da bi se aktivno jedinjenje zaštitilo od svetlosti. Kontejneri u kojima se drže formulacije kapsula aktivnog jedinjenja moraju se skladištiti u sobi sa kontrolisanom temperaturom (15-3Q°C).
Za aministraciju inhalacijom, jedinjenja koja se koriste u skladu sa ovim pronalskom konvencionalno se oslobađaju u obliku spreja aerosola, koji koristi pakovanje pod pritiskom, ili nebulizator i pogodan propelant, npr. bez ograničavanja, dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan ili ugljen.dioksid. U slučaju aerosola pod pritiskom, jedinična doza se može kontrolisati obezbeđivanjem ventila koji oslobađa odmerenu količinu. Na primer, kapsule i kartridži od želatina, za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru, mogu se formulisati tako da sadrže mešavinu praha jedinjenja i pogodne praskaste osnove, kao što je laktoza ili škrob.
Ova jedinjenja se mogu takođe formulisati za parenteralnu aministraciju , npr. bolus injekcijama ili kontinualnim infuzijama. Formulacije za injekcije se mogu dati u obliku jedinične doze, npr. u ampulama, ili u kontejnerima sa više doza, uz dodatak prezervativa. Ovi preparati mogu biti u oblicima, kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanom ili vodenom tečnom nosaču, a mogu da sadrže materijale za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje.
Farmaceutski preparati za parenteralnu aministraciju su vodeni rastvori za oblik koji je rastvoran u vodi, kao što je, bez ograničavanja, so aktivnog jedinjenja. Pored toga, suspenzije aktivnog jedinjenja se mogu pripremiti u liofilnom tečnom nosaču. Podesni liofilni tečni nosači su masna ulja, kao što je susamovo ulje, sintetski estri masnih kiselina, kao što je etiloleat, i trigliceridi, ili materijali kao što su lipozomi. Suspenzije za injekcije u vodi mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što je natrijum-karboksimetilceluloza, sorbitol ili dekstran. Opciono, suspenzija može takođe da sadrži pogodne stabilizatore i/ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja, kako bi se omogućilo dobijanje visoko koncentrovanih rastvora.
Alternativno, aktivni sastojak može da bude u obliku praha, za konstituisanje pred upotrebu sa podesnim tečnim nosačem, npr. sterilnom apirogenom vodom.
Ova jedinjenja se mogu takođe formulisati u rektalne preparate, kao što su supozitorije ili retencione klizme, korišćenjem npr. konvencionalnih osnova za supozitorije, kao što su kakaobuter ili drugi gliceridi.
Pored formulacija koje su gore opisane, jedinjenja se mogu takođe formulisati kao depo preparati. Ove dugotrajne formulacije se mogu ordinirati implantacijm (na primer, subkutano ili intramuskularno) ili kao intramuskularne injekcije. Jedinjenje iz ovog pronalska se može formulisati za ovaj način aministracije sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, u emulziji sa farmakološki prihvatljivim uljem), sa jonoizmenjivačkim smolama, ili kao teško rastvorni derivat, kaošto je bez ograničavanja, teško rastvoma so.
Primer farmaceutskog nosača, bez ograničavanja, za hidrofobna jedinjenja iz ovog pronalska je sistem ko-rastvarača, koji se sastoji od benzilalkohola, nepolarnog surfaktanta,organskog polimera mešljivog sa vodom i vodene faze, kao što je sistem ko-rastvarača VPD. VPD je rastvor 3 % (m/V) benzilalkohola, 8%(m/V)nepolarnog surfaktanta Polvsorbate 80, i 65%( mA/)polietilenglikola 300, koji se do pune zapremine dopuni apsolutnim etanolom. Sistem ko-rastvarača VPD (VPD:D5W) se sastoji od VPD razblaženog u odnosu 1:1 sa 5% rastvorom dekstroze u vodi. Ovaj sistem ko-rastvarača dobro rastvara hidrofobna jedinjenja, a sam ima nisku toksičnost pri sistemskom ordiniranju. Prirodno, proporcije u takvom sistemu ko-rastvarača se mogu značajno menjati, bez ponoštavanja njegove rastvorljivosti i karakteristika toksičnosti. Pored toga, identitet komponenata ko-rastvarača se može menjati: na primer, mogu se koristiti drugi surfaktanti niske toksičnosti umesto Polvsorbate 80, frakcija polietilenglikola se može varirati, drugi biokopmatibilni polimeri mogu da zamene polietilenglikol, npr. polivinilpirolidon, a i drugi šećeri ili polisaharidi mogu da zamene dekstrozu.
Alternativno, može se koristiti drugi sistem za oslobađanje hidrofobnih farmaceutskih jedinjenja. Lipozomi i emulzije su dobro poznati primeri oslobađanja tečnog nosača za hidrofobne lekove. Pored toga, mogu se koristiti i neki organski rastvarači, kao što je dimetilsulfoksid, mada često po cenu veće toksičnosti.
Pored toga, ova jedinjenja se mogu oslobađati korišćenjem sistema za uzdržano oslobađanje, kao što su polupropustljive matrice od čvrstog hidrofobnog polimera, koje sadrže terapeutski agens. Razni materijali za uzdržano oslobađanje su pronađeni i dobro su poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike. Kapsule sa uzdržanim oslobađanjem mogu, zavisno od njihove hemijske prirode, da oslobađaju jedinjenja od nekoliko nedelja, pa do preko 100 dana. Zavisno od hemijske prirode i biološke stabilnosti terapeutskog reagensa, mogu se koristiti i druge strategije za stabilizovanje proteina.
Farmaceutski preparati mogu takođe da sadrže pogodne nosače ili dodatke u čvrstoj fazi ili u obliku gela. Primeri takvih nosača ili dodataka su, ali nisu njima ograničeni, kalcijum-karbonat, kalcijum-fosfat, razni šećeri, škrobovi, derivati celuloze, želatin i polimeri, kao što su polietilenglikoli.
Ivinoga od jedinjenja iz ovog pronalska za moduliranje PK mogu se dati kao fiziološki prihvatljive soli, pri čemu pomenuto jedinjenje može biti negativno ili pozitivno naelektrisana vrsta. Primeri soli u kojima jedinjenje formira pozitivno naelektrisan ostatak su, bez ograničavanja, kvaternerne amonijumove soli (definisane ovde), soli kao što su hidrohlorid, sulfat, karbonat, laktat, tartarat, malat, maleat, sukcinat, pri čemu je atom azota kvaternerne amonijumove grupe azot u izabranom jedinjenju iz ovog pronalska, koji reaguje sa odgovarjućom kiselinom. Soli u kojima jedinjenje iz ovog pronalska predstavlja negativno naelektrisanu vrstu su, bez ograničavanja, soli natrijuma, kalijuma, kalcijuma i magnezijuma, formirane reakcijom karboksilne kisele frupe u jedinjenjeu sa odgovarajućom bazom (npr. natrijum-hidroksidom (NaOH), kalijum-hidroksidom (KOH), kalcijum-hidroksidom (Ca(OH)2) itd.).
Farmaceutski preparati pogodni za upotrebu u ovom pronalsku su preparati u kojima su aktivni sastojci sadržani u količini dovoljnoj da se postigne nameravana svrha, npr. modulisanje aktivnosti PK ili tretman ili prevencija poremećaja povezanog sa PK.
Određenije, terapeutski efikasna količina označava količinu jedinjenja koja efikasno sprečava, ublažava ili olakšava simptome bolesti ili produžava preživljavanje subjekta koji se tretira.
Određivanje terapeutski efikasne količine je uglavnom u domenu onih koji su verzirani u stanje tehnike, naročito u svetlu detaljnog opisa koji se ovde daje.
Za bilo koje jedinjenje u postupku ovog pronalaska terapeutski efikasna količina ili doza se može odrediti primarno iz testova sa ćelijskom kulturom. Zatim se doza formuliše za upotrebu na modelima životinja, tako da se postigne cirkulaciona koncentracija u opsegu koji obuhvata IC50, određenom u ćelijskoj kulturi (tj. koncentracija testiranog jedinjenja koja postiže polovinu od maksimuma inhibicije aktivnosti PK). Ove informacije se zatim mogu koristiti za tačnije određivanje korisnih doza za humana bića.
Toksičnost i terapeutska efikasnost jedinjenja opisanih ovde mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama na ćelijskim kulturama ili na eksperimentalim životinjama, npr. određivanjem IC50i LD50(obe se ovde diskutuju i na drugom mestu) za posmatrano jedinjenje. Podaci koji se dobiju iz ovih testova sa ćelijskim kulturama i izučavanjima na životinjama mogu se korstiti za formulaciju opsega doziranja za upotrebu na humanim bićima. Doza može da varira zavisno od oblika za doziranje koji se koristi i puta aministracije koji se upotrebljava. Tačna formulacija, put aministracije i dozu može odabrati pojedini lekar uzumajući u obzir stanje pacijenta. (Videti npr. Fingl et al., u "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 1. glava, 1. strana).
Količina i interval doziranja se mogu individualno podešavati da obezbede sadržaje aktivnih vrsta u plazmi koji su dovoljni za održavanje efekata modulisanja kinaze. Ovi sadržaji u plazmi navode se kao minimalne efikasne koncentracije (MEC). Za svako jedinjenje MEC će varirati, ali se može proceniti iz podatakain vitro,npr. iz potrebne koncentracije da se postigne 50-90% inhibicije kinaze, što se potvrđuje iz upotrebe testova koji su ovde opisani.
Doze neophodne da se postigne MEC će zavisiti od karakteristika pojedinca i puta aministracije. HPLC testovi ili bio-testovi se mogu koristiti za određivanje koncentracija u plazmi.
Intervali doziranja mogu se takođe odrediti korišćenjem vrednosti MEC. Jedinjenja treba da se ordiniraju koristeći režim koji održava sadržaje u plazmi koji su iznad MEC tokom 10-90% vremena, poželjno između 30-90%, a najpoželjnije između 50-90%.
Za sada, terapeutski efikasne količine jedinjenja Formule (I) mogu da se kreću od približno 25 mg/m<2>do 1500 mg/m<2>nadan; poželjno oko 3 mg/m<2>/dan. Još poželjnije je 50 mg/m<2>/dan do 400 mg/m<2>/dan.
U slučajevima lokalne aministracije ili selektivne apsorpcije, efektivna lokalna koncentracija leka ne mora biti povezana sa koncentracijom u plazmi, a druge procedure poznate u stanju tehnike mogu da se upotrebe za korektnu količinu i interval doziranja.
Količina ordiniranog preparata će, naravno, zavisiti od osobe koja se tretira, ozbiljnosti patnje, načina aministracije, procene ordinirajućeg lekara itd. Preparati mogu, ukoliko se želi, da se daju u pakovanju ili uređaju za uzimanje leka, kao što je komplet koji preporučuje FDA, koji može da sadrži jedan ili više oblika za doziranje koji sadrže aktivni sastojak. Pakovanje se može, na primer, sastojati od metalne ili plastične folije, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili uređaj za uzimanje leka mogu biti opremljeni uputstvima za aministraciju . Uz pakovanje ili uređaj može takođe ići uputstvo priloženo uz kutiju, u obliku koji propisuje vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili promet farmaceutskih proizvoda, uputstvo u kome se vidi dozvola agencije za oblik preparata, ili za humano ili veterinarska administracija. Takvo uputstvo može, na primer, biti nalepnica koju izdaje U.S. Food and Drug Administration za prepisivanje lekova ili dozvoljeni proizvod. Preparati koji sadrže jedinjenje iz ovog pronalaska pripremljeni formulisanjem u kompatibilnom farmaceutskom nosaču, mogu se staviti u odgovarajući kontejner sa naiepnicom za tretman naznačenog stanja. Pogodna stanja naznačena na nalepnici mogu da obuhvate tretman tumora, inhibiciju angiogeneze, tretman fibroze, dijabetesa i slično.
Aspekt ovog pronalaska je takođe da jedinjenje koje se ovde opisuje, njegova so ili prolek, mogu da se kominuju sa drugim hemoterapeutskim agensima za tretiranje bolesti i poremećaja koji su ovde diskutovani. Na primer, jedinjenje, so ili prolek iz ovog pronalaska može da se kombinuje sa agensima za alkilovanje, kao što je fluorouracil (5-FU), samim ili u dodatnoj kombinaciji sa leukovorinom; ili drugim agensima za alkilovanje, kao što su, bez ograničavanja, drugi pirimidinski analozi, kao što je UFT, capecitabine, demcitabine i cvtarabine, alkil sulfonatima, npr. bisulfan (koristi se pri tretiranju hronične granulocitne leukemije), improsulfan i piposulfan; aziridinima, npr. benzodepa, carboquone, meturedepa i uredepa; etilendiaminima i metilmelaminima, npr. atretamine, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; i azotnim senfovima, npr. chlorambucil (koristi se za tretiranje hronične limfocitne leukemije, primarne mikroglobulinemije i ne-Hodgkin-ovog limfoma), ciklofosfamid (koji se koristi za tretiranje Hodgkin-ove bolesti, multiplog mieloma, neuroblastoma, kancera dojke, kancera jajnika, kancera pluća, vVilm-ovog tumora i rabdomizosarkoma), estramustine, ifostamide, novembrichin, prednimustine i uracilni senf (koji se koristi za tretiranje primarne trombocitoze, ne-Hodgkin-ovog limfoma, Hodgkin-ove bolesti i kancera jajnika); i triazini, npr. dacarbazine (koristi se za tretiranje sarkoma mekog tkiva).
Jedinjenje, so ili prolek iz ovog pronalaska može se takođe koristiti u kombinaciji sa drugim antimetaboličkim hemoterapeutskim agensima, kao što su, bez ograničavanja, analozi folne kiseline, npr. methotrexate (koristi se za tretiranje akutne limfoctne leukemije, horiokarcinoma, mikozne fungiode kancera dojke, kancera glave i vrata i osteogenog sarkoma) i pteropterin; i analozi purina, kao što je merkaptopurin i tioguanin, koji nalaze upotrebu u tretiranju akutne granulocitne, akutne limfocitne i hronične granulocitne leukemije.
Podrazumeva se da jedinjenje, so ili prolek iz ovog pronalaska može takođe da se koristi u kombinaciji sa hemoterapeuticima zasnovanim na prirodnim proizvodima, kao što su, bez ograničavanja, alkaloidi vinca-e, npr. vinblastin (koristi se za tretiranje kancera dojke i testisa), vincristine i vindesine; epipodofilotoksini, npr. etoposide i teniposide, oba su korisna za tretiranje kancera testisa i Kaposi-evog sarkoma; antibiotski hemoterapeutski agensi, npr. daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomvcin (koristi se za tretiranje kancera stomaka, cerviksa, debelog creva, dojke, bešike i pankreasa), dactinomvcin, temozolomide, plicamvcin, bleomvcin (koristi se za tretiranje kancera kože, jednjaka i genitourinarnog trakta); i enzimatska hemoterapeutska sredstva, kao što je L-asparaginaza.
Pored gornjih, jedinjenje, so ili prolek iz ovog pronalaska se mode takođe koristiti u kombinaciji sa koordinacionim kompleksima platine (cisplatin itd.); supstituisanim ureama, kao što je hidroksiurea; derivatima metilhidrazina, npr. procarbazine; adrenokrtikalnim supresantima, npr. mitotane, aminoglutetimid; i hormonima i antagonistima hormona, kao što su adrenokortikosteroidi (npr. prednisone), progestinima (npr. hidroprogesteronkaproat); estrogenima (npr. dietilstilbestrol); antiestrogenima, kao što je tamofixen; androgenima, npr. testosteronpropionat; i inhibitorima aromataze, kao što je anastrozole.
Konačno, podrazumeva se takođe da će kombinacija jedinjenja iz ovog pronalska biti efikasna u kombinaciji sa mitoxyntrone-om ili paclitaxel-om prilikom tretiranja čvsrtih tumora ili leukemije, kao što je, bez ograničavanja, mielogena (ne-limfocitna) leukemija.
Opšta procedura sinteze
Sledeća opšta metodologija se može upotrebiti za dobijanje jedinjenja iz ovog pronalaska.
Odgovarajuće supstituisani 2-oksiindol (1 ekviv.), odgovarajuće supstituisani aldehid (1,2 ekviv.) i baza (0,1 ekviv.) pomešaju se u rastvaraču (1-2 mL/mmol 2-oksiindola), pa se zatim ta smeša zagreva od oko 2 do oko 12 h. Posle hlađenja, nastali talog se filtrira, opere hladnim etanolom ili etrom i suši pod vakuumom, djući čvrst proizvod. Ukoliko se ne stvori talog, reakciona smeša se koncentriše, a ostatak triturira sa dihlorometan/etrom, pa se nastala čvrsta supstanca sakupi filtriranjem i zatim suši. Opciono, proizvod se može još pečistiti hromatografijom.
Baza može biti organska ili neorganska baza. Ukoliko se koristi organska baza, poželjno je da je to azotna baza. Primeri organskih azotnih baza su, ali bez ograničavanja, diizopropilamin, trimetilamin, trietilamin, anilin, piridin, 1,8-diazabiciklo[5.4.1]undec-7-en, pirolidin i piperidin.
Primeri neorganskih baza su, bez ograničavanja, amonijak, hidroksidi alkalnih ili zemnoalkalnih metala, fosfati, karbonati, bikarbonati, bisulfati i amidi. Alkalni metali su litijum natrijum i kalijum, dok su zemnoalkalni metali kalcijum, magnezijum i barijum.
U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, ukoliko je rastvarač protonski rastvarač, kao što su voda ili alkohol, baza je neorganska baza alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala, poželjno hidroksid alkalnog metala ili zemnoalkalnog metala.
Onima koji su verzirani u stanje tehnike je jasno, na osnovu opštih principa organske sinteze i opisima datim ovde, koja baza je najpogodnija za obavljanje reakcije.
Rastvarač u kome se reakcija obavlja može biti protonski ili aprotonski rastvarač, poželjno protonski rastvarač. "Protonski rastvarač" je rastvarač koji ima atom(e) vodonika kovalentno vezane za atome kiseonika ili azota, koji čine atome vodonika znatno kiselim, pa su tako u stanju da budu "podeljeni" sa rastvorenom supstancom preko vodonične veze. Primeri protonskih rastvarača su, bez ograničavanja, voda i alkoholi.
"Aprotonski rastvarač" može biti polaran i nepolaran, ali u oba slučaja ne sadrži kisele vodonike, pa stoga nije u stanju da stvara vodoničnu vezu sa rastvorenim supstancama. Primeri, bez ograničavanja, nepolarnih aprotonskih rastvarača su pentan, heksan, benzen, toluen, metilenhlorid i ugljetetrahlorid. Primeri polarnih aprotonskih rastvarača su hloroform, tetrahidrofuran, dimetilsulfoksid i dimetilformamid.
U poželjnoj realizaciji ovog pronalska rastvarač je protonski rastvarač, poželjno voda ili alkohol, kao što je etanol.
Reakcija se obavlja na temperaturi iznad sobne temperature. Obično, temperatura je od oko 30°C do oko 150°C, poželjno od oko 80°C do oko 100°C, najpoželjnije od oko 75°C do oko 85°C, što je oko temperature ključanja etanola. Pod "oko" se podrazumeva da je opseg temperature poželjno unutar 10°C oko naznačene temperature, poželjnije 5°C oko naznačene temperature, a najpoželjnije unutar 2°C oko na značene temperature. Dakle, na primer, "oko 75°C" znači 75±10°C, poželjno 75±5°C i najpoželjnije 75±2°C.
Korišćenjem tehnika dobro poznatih u stanju tehnike hernije, 2-oksiindoli i aldehidi se mogu jednostavno sintetizovati. Oni koji su verzirani u stanju tehnike podrazumevaju, da su dostupni i drugi putevi sinteze za stvaranje jedinjenja iz ovog pronalaska, a da su oni koji slede ponuđeni kao primer, a ne ograničenje.
Primeri
Sledeći preparati i primeri su dati da onima koji su verzirani u stanje tehnike olakšaju jasnije razumevanje i praktikovanje ovog pronalaska. Oni ne treba da se smatraju ograničenjem obima ovog pronalaska, nego samo kao njegova ilustracija i predstavljanje.
Primeri sinteze
Postupak A: Formilovanje pirola
U kapima se dodaje POCI3(1,1 ekviv.) u dimetilformamid (3 ekviv.), na temperaturi .10°C, nakon čega sledi dodavanje odgovarajućeg pirola rastvorenog u dimetilformamidu. Posle 2 h mešanja reakciona smeša se razblaži vodom i učini baznom, na pH 11, sa 10M KOH. Talog koji nastane se sakupi filtriranjem, opere vodom i suši u vakuum sušnici, dajući željeni aldehid.
Postupak B: Saponifikacija estara pirolkarboksilne kiseline
Smeša estra pirolkarboksilne kiseline i KOH (2-4 ekviv.) u EtOH se refluksuje do završetka reakcije, na šta ukazuje tankoslojna hromatografija (TLC). Ohlađena reakciona smeša se zakiseli na pH 3 sa 1M HCI. Nastali talog se sakupi filtriranjem, opere vodom i suši u vakuum sušnici, dajući željenu pirolkarboksilnu kiselinu.
Postupak C: Amidovanje
U mešani rastvor pirolkarboksilne kiseline u dimetilformamidu (0,3 M) dodaju se 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)karbodiimid (1,2 ekviv.), 1-hidroksibenzotriazol (1,2 ekviv.) i trietilamin (2 ekviv.). Doda se odgovarajući amin (1 ekviv.), pa se reakcija meša dok se ne završi, na šta ukazuje TLC. Zatim se reakcionoj smeši doda etilacetat, pa se rastvor opere zasićenim NaHCC>3 i zasićenim rastvorom soli (druge soli), osuši iznad bezvodnog MgS04i koncentriše, dajući željeni amid.
Postupak D: Kondenzovanje aldehida i oksiindola
koji sadrži supstituente karboksilne kiseline
Smeša oksiindola (1 ekviv.), 1 ekvivalenta aldehida i 1-3 ekvivalenta piperidina (ili pirolidina) u etanolu (0,4 M), meša se na 90-100°C sve dok se reakcija ne završi, na šta ukazuje TLC. Smeša se zatim koncentriše, a ostatak zakiseli sa 2M HCI. Talog koji nastane se opere vodom i EtOH, a zatim suši u vakuum sušniici, dajući proizvod.
Postupak E: Kondenzovanje aldehida i oksiindola
koji ne sadrže supstituente karboksilne kiseline
Smeša oksiindola (1 ekviv.), 1 ekvivalenta aldehida i 1-3 ekvivalenta piperidina (ili pirolidina) u etanolu (0,4 M), meša se na 90-100°C sve dok se reakcija ne završi, na šta ukazuje TLC. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, a nastali talog se sakupi filtriranjem, opere etanolom i osuši, dajući proizvod. Ukoliko se talog ne stvori nakon hlađenja reakcione smeše, ova smeša se koncentriše i prečisti hromatografijom na koloni.
C. Primeri sinteza oksiindola
Sledeće primere sinteza reprezentativnih oksiindola ne treba tumačiti ograničenjem ovog pronalaska na bilo koji način. Alternativni putevi do pokazanih oksiindola, kao i drugih oksiindola, koji se mogu koristiti za dobijanje jedinjenja iz ovog pronalaska, biće jasni onima koji su verzirani u stanje tehnike, na osnovu opisa koji slede. Te sinteze i oksiindoli su unutar obima i duha ovog pronalaska.
5- amino- 2- oksiindol
Hidrogenuje se 5-nitro-2-oksiindol (6,3 g) u metanolu, pomoću 10% paladijuma na uglju, dajući 3,0 g (60% prinos) naslovljenog jedinjenja, kao belu čvrstu supstancu.
5- bromo- 2- oksiindol
Ohladi se 2-oksiindol (1,3 g) u 20 mL acetonitrila na -10°C, pa se lagano, uz mešanje, dodaje N-bromosukcinimid. Reakcija se 1 h meša na -10°C i 2 h na 0°C. Talog se sakupi, opere vodom i suši, dajući 1,9 g (90% prinos) naslovljenog jedinjenja.
4- metil- 2- oksiindol
Uz mešanje, dodaje se dietiloksalat (30 mL) u 20 mL suvog etra, i 19 g kalijum-etoksida suspendovanog u 50 mL suvog etra. Smeša se ohladi u kupatilu sa ledom, pa se lagano dodaje 20 mL 3-nitro-o-ksilena u 20 mL suvog etra. Gusta, tamnocrvena smeša se zagreva pod refluksom 0,5 h, koncentriše do tamno crvenog rastvora, pa tretira sa 10% NaOH, dok se skoro sva čvrsta supstanca ne rastvori. Tamnocrvena smeša se tretira sa 30% vodonik-peroksidom, dok se crvena boja ne promeni u žutu. Ova smeša se tretira alternativno sa 10% NaOH i 30% vodonik-peroksidom, sve dok više nije prisutan tamnocrveni rastvor. Talog se odvoji filtriranjem, a filtrat zakiseli sa 6M HCI. Dobijeni talog se sakupi filtriranjem opere vodom i suši pod vakuumom, dajući 9,8 (45% prinos) 2-metil-6-nitrofenlsirćetnu kiselinu, kao beličastu čvrstu supstancu. Talog se hidrogenuje u metanolu, pomoću 10% paladijuma na uglju, dajući 9,04 g naslovljenog jedinjenja kao belu čvrstu supstancu.
7- bromo- 5- hloro-2-oksiindol
Suspenduju se 5-hloro-2-oksiindol (16,8 g) i 19,6 g N-bromosukcinimida u 140 mL acetonitrila, pa se refluksuju 3 h. Tankoslojna hromatografija (silicijum-dioksid, etilacetat) posle 2 h refluksovanja pokazuje prisustvo 5-hloro-2-oksiindola ili N-bromosukcinimida (Rf=0,8), proizvoda (Rf=0,85) i drugog proizvoda (Rf=0,9), čiji odnos se nije promenio nakon sledećeg sata refluksovanja. Ova smeša se ohladi na 10°C, talog sakupi filtriranjem pod vakuumom, opere sa 25 mL etanola i suši usisavanjem pod vakuumom 20 min na nuču, dajući 14,1 g vlažnog proizvoda (56% prinos). Ova supstanca se suspenduje u 200 mL denaturisanog etanola, a gusta suspenzija se pere , uz mešanje i refluksovanje 10 min. Smeša se ohladi u kupatilu sa ledom na 10°C. Čvrst proizvod se sakupi filtriranjem pod vakuumom, opere sa 25 mL etanola i suši pod vakuumom na 40°C, dajući 12,7 g (51% prinos) 7-bromo-5-hloro-2-oksiindola.
5- fluoro- 2- oksiindol
Rastvori se 5-fluoroizatin (8,2 g) u 50 mL hidrazin hidrata, pa se 1 h refluksuje. Reakciona smeša se zatim prespe u ledenu vodu. Talog se zatim filtrira, opere vodom i suši u vakuum sušnici, dajući naslovljeno jedinjenje.
5- nitro- 2- oksiindol
Rastvori se 2-oksiindol (6,5 g) u 25 mL koncentrovane sumporne kiseline, pa se smeša drži na -10° do -15°C, dok se u kapima dodaje 2,1 mL pušljive azotne kiseline. Po dodatku azotne kiseline reakciona smeša se 0,5 h meša na 0°C i prespe u smešu vode i leda. Talog se sakupi fitriranjem, opere vodom i kristališe iz 50% sirćetne kiseline. Kristalni proizvod se zatim filtrira, opere vodom i suši pod vakuumom, dajući 6,3 g (70%) 5-nitro-2-oksiindola.
5- aminosulfonil- 2- oksiindol
U balon od 100 mL, napunjen sa 27 mL hlorosulfonske kiseline, lagano se dodaje 13,3 g 2-oksiindola. Temperatura reakcije se održava ispod 30°C, tokom ovog dodavanja. Posle dodavanja reakciona smeša se 1,5 h meša na sobnoj temperaturi, 1 h zagreva na 68°C, ohladi i prespe u vodu. Talog se opere vodom i suši u vakuum sušnici, dajući 11,0 g 5-hlorosulfonil-2-oksiindola (50% prinos), koji se koristi bez daljeg prečišćavanja.
Doda se 5-hlorosulfonil-2-oksiindol (2,1 g) u 10 mL amonijum-hidroksida u 10 mL etanola, pa se preko noći meša na sobnoj temperaturi. Smeša se koncentriše, a talog sakupi filtriranjem, dajući 0,4 g (20% prinos) naslovljenog jedinjenja, kao beličastu čvrstu supstancu.
5- izopropilaminosulfonil- 2- oksiindol
U balon od 100 mL, napunjen sa 27 mL hlorosulfonske kiseline, lagano se dodaje 13,3 g 2-oksiindola. Temperatura reakcije se održava ispod 30°C, tokom ovog dodavanja. Posle dodavanja reakciona smeša se 1,5 h meša na sobnoj temperaturi, 1 h zagreva na 68°C, ohladi i prespe u vodu. Nastali talog se filtrira, opere vodom i suši u vakuum sušnici, dajući 11,0 g (50%) 5-hlorosulfonil-2-oksiindola, koji se koristi bez daljeg prečišćavanja.
Suspenzija 3 g 5-hlorosulfonil-2-oksihlorida, 1,15 g izopropilamina i 1,2 mL piridina u 50 mL dihlorometana meša se 4 h na sobnoj temperaturi, za koje vreme nastane beli talog. Ovaj talog se sakupi vakuum filtriranjem, gusta suspenzija se opere vrućim etanolom, ohladi, sakupi vakuum filtriranjem i preko noći suši pod vakuumom na 40°C, dajući 1,5 g (45%) 5-izopropilaminosulfonil-2-oksiindol.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) S 10,69 (s, br, 1H,NH),7,63 (dd,J=2i 8Hz, 1H), 7,59 (d,J=2Hz,1H), 7,32 (d, J=7Hz, 1H, NH-S02-), 6,93 (d, J=8Hz, 1H), 3,57 (s, 2H), 3,14-3,23 (m, 1H;CH-( CH3) 2),0,94 (d, J=7Hz, 6H, 2xCH3).
5- fenilaminosulfonil- 2- oksiindol
Suspenzija 5-hlorosulfonil-2-oksiindola (1,62 g, 7 mmol), anilina (0,782 g, 8,4 mmol) i piridina (1 mL) u dihlorometanu (20 mL), meša se 4 h na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša se razblaži etilacetatom (300 mL), pa zakiseli sa 1M HCI (16 mL). Organski sloj se opere natrijum-bikarbonatom i zasićenim rastvorom soli, suši i koncentriše. Ostatak se opere etanolom 3 mL), a zatim hromatografira na silikagelu, uz eluiranje sa metanol/dihlorometanom 1:9, dajući 5-fenilaminosulfonil-2-oksiindol.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 10,71 (s, br, 1H,NH),10,10 (s, br, 1H,NH),7,57-7,61 (m, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,06-7,09 (m, 2H), 6,97-7,0 (m, 1H), 6,88 (d, J=8,4Hz, 1H), 3,52 (s, 2H).
2- okso- 2, 3- dihidro- 1 H- indol- 5- sulfonska kiselina piridin- 3- ilamid
Rastvor 5-hlorosulfonil-2-oksiindola (3 g) i 3-aminopiridina (1,46 g) u piridinu (15 mL) meša se preko noći na sobnoj temperaturi, za koje vreme se pojavi mrk talog. Ovaj talog se filtrira, opere etanolom i suši pod vakuumom, dajući 1,4 g (38%) 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina piridin-3-il-amida.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 10,74 (s, 1H,NH),10,39 (s, 1H,S02NH),8,27-8,28 (d, 1H), 8,21-8,23 (m, 1H), 7,59-7,62 (m, 2H), 7,44-7,68 (m, 1H), 7,24-7,28 (m, 1H), 6,69-6,71 (d, 1H), 3,54 (s, 2H).
MSm/ z(APCI+) 290,2.
5- feniloksiindol
Rastvori se 5-bromo-2-oksiindol (5, g, 23,5 mmol) u 110 mL toluena i 110 mL etanola, uz mešanje i slabo zagrevanje. Doda se tetrakis(trifenilfosfin) paladijum(O) (1,9 g, 1,6 mmol), a zatim 40 mL (80 mmol) 2M vodenog natrijum-karbonata. Ovoj smeši se doda benzenboronska kiselina (3,7 g, 30,6 mmol), pa se smeša 12 h zagreva na 100°C u uljanom kuptilu. Reakcija se ohladi, razblaži etilacetatom (500 mL), opere zasićenim natirjum-bikarbonatom (200 mL), vodom (200 mL), 1M HCI (200 mL) i zasićenim rastvorom soli (200 mL).Organski sloj se osuši iznad magnezijum-sulfata i koncentruiše, dajući mrki ostatak. Trituriranje sa dihlorometanom daje 3,8 g (77%) 5-fenil-2-oksiindola, kao tamnu čvrstu supstancu.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 6 10,4 (br s, 1H,NH),7,57 (dd, J=1,8 i 7,2Hz, 1H), 7,5-7,35 (m, 5H), 7,29 (m, 1H), 6,89 (d, J=8,2Hz, 1H), 3,51 (s, 2H,CH2CO).
MS m/ z 209 [M+].
Na sličan način dobijeni su sledeći oksiindoli:
6-( 3, 5- dihlorofenil)- 1. 3- dihidroindol- 2- on
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 10,46 (br, 1H,NH),7,64 (d, J=1,8Hz, 2H), 7,57 (m, 1H),7,27(m, 2H), 7,05 (d, J=1,1Hz, 1H) 3,5 (s, 2H).
MS-EIm/ z 277/279[M<+>].
6- f4- butilfenin- 1, 3- dihidroindol- 2- on
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 10,39 (s, 1H,NH),7,49 (d, J=8,0Hz, 2H), 7,25 (d, J=8Hz, 3H), 7,17 (dd,J=1, 5i 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J=1,5Hz, 1H), 3,48 (s, 2H,CH2CO),2,60 (t, J=7,5Hz, 2H, CH2CH3), 1,57 (m, 2H, CH2), 1,32 (m,2H, CH2), 0,9 (t,J=7,5Hz,3H,CH3).
6-( 5- izopropil- 2- metoksifenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 10,29 ( br s, 1H,NH),7,16-7,21 (m, 2H), 7,08 (d, J=2,4Hz, 1H), 6,97-7,01 (m, 2H), 6,89 (d, J=0,8Hz, 1H), 3,71 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH20), 2,86 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,19 (d, J=6,8Hz, 6H, CH(Ctt3)2). MS-EIm/ z281 [M<+>].
6-( 4- etilfenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,39 (br s, 1H,NH),7,50 (d, J=8,2Hz, 2H), 7,28 (d, J=8,2Hz, 2H), 7,25 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,17 (dd, J=1,6 i 7,5Hz, 1H), 6,99 (d, J=1,6Hz, 1H), 3,48 (s, 2H, CH2CO), 2,63 (q, J=7,6Hz, 2H, CW2CH3), 1,20 (t, J=7,6Hz, 3H, CH2Ctf3).
MS-EI m/ z 237[M<+>].
6-( 3- izopropilfenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 10,37 (br s, 1H,NH),7,43 (m, 1H), 7,35-7,39 (m, 1H), 7,17-7,27 (m, 3H), 7,01 (d, J=1,8Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH2CO), 2,95 (m, 1H, CW(CH3)2), 1,24 (d, J=6,8Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/z 251[M<+>].
6- 2, 4- dimetoksifenil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 10,28 (br s, 1H,NH),7,17 (m, 2H), 6,93 (dd, J=1,6 i 7,6Hz, 1H), 6,86 (d, J=1,6Hz, 1H), 6,63 (d, J=2,4Hz, 1H), 6,58 (dd,J=2,4i 8,5Hz, 1H), 3,79 (s, 3H, OCH3), 3,74 (s, H, OCH3), 3,45 (s, 2H, CH20).
MS-EIm/ z269 [M<+>].
6- piridin- 3- il- 1, 3- dihidroindol- 2- on
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 10,51 (s, 1H,NH),8,81 (d, J=2,5Hz, 1H), 8,55 (dd, J=1,8 i 5,7Hz, 1H), 8 (m, 1H)t7,45 (dd, J=5,7 i 9,3Hz, 1H), 7,3 (m, 2H), 7,05 (s, 1H), 3,51 (s, 2H, CH2CO).
MS m/ z 210[M<+>],
2- okso- 2, 3- dihidro- 1 H- indol- 4- karboksilna kiselina ( 3- hloro- 4- etoksifenil)- amid
U rastvor 4-karboksi-2-oksiindola (200 mg, 1,13 mmol) i 3-hloro-4-metoksifenilamina (178 mg, 1,13 mmol) u dimetilformamidu (15 mL), na sobnoj temperaturi, doda se benzotriazol-1-iloksitris(dimetilamino)fosfonijum-heksafluorofosfat BOP reagens, 997 mg, 2,26 mmol), pa 4-dimetilaminopiridin (206 mg, 1,69 mmol). Ova smeša se 72 h meša na sobnoj temperaturi. Reakcija se zatim razblaži etilacetatom (300 mL), opere zasićenim natrijum-bikarbonatom (100 mL), vodom, 2M HCI (100 mL), vodom (3*200 mL) i zasićenim rastvorom soli. Zatim se suši iznad magnezijum-sulfata i koncentriše. Ostatak se triturira etilacetatom, dajući 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-4-kaboksilna kiselina (3-hloro-4-metoksifenil)-amid, kao ružičastu čvrstu supstancu.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 10,50 (s, br, 1H,NH),10,12 (s, br, 1H,NH), 7,9(s, J=2,5Hz, 1H), 7,62 (dd, J=2,5 i 9Hz, 1H), 7,38 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,32 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,13 (d, J=9Hz, 1H), 6,98 (d, J=7,6Hz, 1H), 3,83 (s, 3H, OCH3), 3,69 (s, 2H,CH2).
MS-EI m/ z316 [M+].
4- karboksi- 2- oksiindol
Rastvor trimetilsilildiazometana u heksanu (2M) u kapima se dodaje u rastvor 2,01 g 2-hloro-3-karboksi-nitrobenzena u 20 mL metanola, na sobnoj temperaturi, sve dok ne prestane izdvajanje gasa. Zatim se doda sirćetna kiselina da se neutrališe višak trimetilsilildiazometana. Reakciona smeša se ispari pod vakuumom, a ostatak se preko noći suši u sušnici. Dobije se 2-hloro-3-metoksikarbonilnitrobenzen, koji je dovoljno čist za sledeću reakciju.
Doda se dimetilmalonat (6,0 g) u ledom ohlađenu suspenziju 2,1 g natrijum-hidrida u 15 mL DMSO. Reakciona smeša se 1 h meša na 100°C, a zatim ohladi na sobnu temperaturu. Doda se 2-hloro-3-metoksikarbonilnitrobenzen (2,15 g), u jednoj porciji, pa se smeša 1,5 h zagreva na 100°C. Reakciona smeša se zatim ohladi na sobnu temperaturu, prespe u ledenu vodu, zakiseli do pH 5, pa ekstrahuje etilacetatom. Organski sloj se opere zasićenim rastvorom soli, osuši iznad bezvodnog natrijum-sulfata i koncentriše, dajući 3,0 g dimetil 2-metoksikarbonil-6-nitrofenil-malonata.
Refluksuje se preko noći dimetil 2-metoksikarbonil-6-nitrofenilmalonat (3,0 g) u 50 mL 6M HCI. Smeša se koncentriše do suva, dodaju se 20 mL etanola i 1,1 g kalaj(li)hlorida, pa se smeša 2 h refluksuje. Smeša se filtrira kroz Celite, koncentriše i hromatografira na silikagelu, koristeći kao eluent etilacetat:heksan:sirćetnu kiselinu, dajući 0,65 g (37%) 4-karboksi-2-okiindola kao belu čvrstu supstancu.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 12,96 (s, br, 1H, COOH), 10,74 (s, br, 1H,NH),7,53 (d, J=8Hz, 1H), 7,39 (t, J=8Hz, 1H), 7,12 (d, J=8Hz, 1H), 3,67 (s, 2H).
D. Sinteza 2- indolininona supstituisanih pirolom
Primer 1
( 3- dietilaminopropil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2-
izopropil- 4- fenil- 1 fY- pirol- 3- karboksilne kiseline
Smeša 2-aminoacetofenon hidrohlorida (1 ekviv.), etilizobutiirilacetata (1,2 ekviv.) i natrijum-acetata (2,4 ekviv.) u vodi, meša se 18 h na 100°C, a zatim ohladi na sobnu temperaturu. Vodeni sloj se dekantira, a ulje rastvori u etilacetatu. To se zatim opere vodom i zasićenim rastvrom soli, pa osuši, dajući (93%) 2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar kao crveno-mrko ulje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 11,21 (s, br, 1H,NH),7,14-7,27 (m, 5H), 6,70 (d, J=2,7Hz, 1H), 4,02 (q, J=7,1Hz, 2H, OCH2CH3), 3,65 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,22 (d, J=7,5Hz, 6H, CH(CH3)2), 1,04 (t, J=7,1Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EIm/ z257 [M<+>].
Gornji pirol se formuliše po postupku A, dajući (41%) 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestra, kao crvenkastu čvrstu supstancu. 1H NMR (30 MHz, DMSO-d6) 5 12,35 (s, br, 1H,NH), 9,14 (s,1H, CHO), 7,36 (s, 5H), 3,96 (q, J=7,1Hz, 2H, OCH2CH3), 3,74 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,29 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,90 t, J=7,1Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI m/ z 285[M<+>].
Estar ove pirolkarboksilne kiseline se hidrolizuje po postupku B, dajućii (57%) 5-formil-1-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu kao čvrstu supstancu bež boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 12,28 (s, br, 1H,NH),12,02 (s, br, 1H,NH),9,10 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H), 3,81 (m, 1H, CH(CH3)2), 1,28 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EIm/ z257 [M<+>].
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (120 mg g, 0,31 mmol) sa 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (dobijen postupkom C), dajući 120 mg (71%) naslovljenog jedinjenja.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 14,23 (s, br, 1H,NH),11,08 (s, br, 1H,NH),7,38-7,55 (m, 7H, Ar-H i CONHCH2), 7,30 s, 1H, H-vinil), 7,26 (dd, J=1,8 i 7,8Hz, 1H), 6,85 (d, J=8,7Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,07 (m, 2H,CH2),2,34 (q, J=7,1Hz, 4H, N(CH2CH3)2), 2,22 (t, J=6,9Hz, 2H,CH2),1,40 (m, 2H,CH2),1,31 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH3)2), 0,86 (t, J=7,1Hz, 6H, N(CH2cH3)2).
MS-EIm/ z565,1 [M<+>+1].
Primer 2
( 3- pirolidin- 1- ilpropil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)-2. izopropil- 4- fenil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2-izopropil-4-fenil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (127 mg, 0,28 mmol) sa 3-pirolidin-1-il-propilaminom (43 mg, 0,336 mmol), dajući 140 mg (66%) naslovljenog jedinjenja.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 14,40 (s, br, 1H,NH),7,38-7,47 (m, 7H), 7,23-7,27 (m, 2H), 6,84 (d, J=8,1Hz, 1H), 3,36 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,08 (m, 2H,CH2),2,30 (m, 4H, 2xCH2), 2,20 (t, J=7,0Hz, 2H,CH2),1,62 (m, 4H, 2xCH2), 1,42 (t, J=7,0Hz, 2H,CH2),1,31 (d, J=7,2Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EIm/ z560 i 562 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 3
( 3- dietilaminoetil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2-
izopropil- 4- fenil- 1 /-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (57 mg, 0,27 mmol) sa 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (120 mg), dajući 78 mg (53%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,23 (s, br, 1H,NH),11,09 (s, br, 1H,NH),7,38-7,51 (m, 6H), 7,25-7,28 (m, 2H), 7,19 (t, 1H, CONHCH2), 6,85 (d, J=7,8Hz, 1H), 3,43 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,11 (m, 2H, CH2), 2,82-2,39 (m, 6H, N(CH2CH3)2iCH2),1,31 (d, J=6,9Hz, CH(CH3)2), 0,85 (t, J=7,0Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/ z 548 i 550[M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 4
[ 3-( 4- metilpiperazin- 1- il) propillamid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 2- izopropil- 4- fenil- 1/-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (53 mg, 0,25 mmol) sa 5-formil-2-izopropil-4-fenil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina [3-(4-metilpiperazin-1-il)propil]amidom (300 mg), dajući 65 mg naslovljenog jedinjenja.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 14,22 (s, br, 1H,NH),11,08 (s, br, 1H,NH),7,23-7,50 (m, 9H), 6,85 (d, J=8,7Hz, 1H), 3,37 (m, 1H, CH(CH3)2), 3,05 (m, 2H, CH2),2,24 (m, 8H, 4*CH2), 2,11 (m, 5H, CH2i CH3), 1,42 (m, 2H,CH2),1,31 (d, J=7,2Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EIm/ z589 i 591 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 5
( 2- pirolidin- 1- iletil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2- metil-4- fenil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (44 mg, 0,21 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidi-1-iletil)amidom (70 mg, dobijenim na isti način i kao izopropil analog, gore), dajući 0,03 g (27%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,87 (s, br, 1H,NH),1,11 (s, br, 1H,NH),7,36-7,51 (m, 6H), 7,26 (dd, J=1,8 i 8,1Hz, 1H), 7,2 (s, 1H, H-vinil), 7,09 (m, 1H, CONHCH2), 6,83 (d, J=8,1Hz, 1H), 3,17 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m, CH3), 2,29-2,35 (m, 6H, 3xNCH2), 1,59 (m, 4H,2* CH2).
MS-EIm/ z518 i 520 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 6
( 2- dimetilaminoetil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2-
metil- 4- fenil- 1 /-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (46 mg, 0,22 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (65 mg), dajući 60 mg (55%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,86 (s, br, 1H,NH),11,09 (s, br, 1H, NH), 7,47-7,49 (m, 2H), 7,38-7,412 (m, 4H), 7,26 (dd, J=2,2 i 8,3Hz, 1H), 7,21 (s, 1H, H-vinil), 7,04 (m, 1H, CONHCH2), 6,77 (d, J=8,3Hz, 1H), 3,15 (m, 2H, NCH2), 2,48 (m,2H3),2,16 (t, J=6,8Hz, 2H, 3xNCH2), 2,02 (s, 6H, 2*NCH3).
MS-EIm/ z493 i 494,8 [M<+>] i [M<+>+2J.
Prime 7
( 3- dietilaminopropil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2-
metil- 4- fenil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,47 g, 2,2 mmol) sa 5-formil-2-metil-4-fenil-1/-/-pirol-2-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (0,75 g), dajući 0,11 g (42%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,86 (s, br, 1H, NH), 7,42-7,46 (m, 3H), 7,37-7,50 (m, 7H), 7,24-7,28 (m, 2H), 6,83 )d, J=8,1Hz, 1H), 3,09 (m, 2H, NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,38 (q, J=7,1Hz, 4H, 2xNCH2CH3), 2,26 (t, J=6,9Hz, 2H,NCH2),1,42 (m, 2H, NCH2), 0,87 (t, J=7,1Hz, 6H, 2xNCH2CH3).
MS-EIm/ z535,0 i 537 [M<+>] i [M<+>+2].
Primer 8
( 2- dimetilaminoetil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 /-/- pirol- 3- karboksilna kiselina
Smeša rerc-butil 3-oksobutirata i natrijum-nitrita (1 ekviv.) u sirćetnoj kiselini meša se na sobnoj temperaturi dajući ferc-butil-2-hidroksimino-3-oksibutirat. Mešaju se 1 h na 60°C etil-3-oksobutirat (1 ekviv.), cink u prahu (3,8 ekviv.) i sirovi ferc-butil-2-hidroksimino-3-oksobutirat u sirćetnoj kiselini. Reakciona smeša se prespe u vodu, a filtrat se sakupi, dajući (65%) 2-ferc-butiloksikarbonil-3,5-dimetil-4-etoksikarboni!pirola.
Smeša 2-terc-butiloksikarbonil-3,5-dimetil-4-etoksikarbonilpirola i trietilorto-formijata (1,5 ekviv.) u trifluorosirćetnoj kiselini meša se 1 h na 15°C. Reakcija se koncentriše, a ostatak prečisti dajući (64%) 2,4-dimetil-3-etoksikarbonil-5-formilpirola, u obliku žutih iglica.
Hidrolizuje se po postupku B 2,4-dimetil-3-etoksikarbonil-5-formilpirol, dajući (90%) 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 12 (br s, 2H, NH i C02H), 9,58 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3).
MS-EIm/ z267 [M<+>].
Kondenzuje se po postupku C 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (0,2 g), dajući 0,3 g (83%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H, NH), 8,07 (d, J=1,8Hz, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinil), 7,44 (t, J=5,2Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J=1,8 i 8,4Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J=8,4Hz, 1H, H-7), 3,26-3,33 (m, 2H), NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J=6,7Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).
MS-EIm/ z 430i 432 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 9
( 2- dimetilaminoetil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 6- fenil- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom (0,2 g), dajući 0,13 g (36%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-oranž boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) § 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7,85 (d, J=7,92Hz, 1H, H-4), 7,63-7,65 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,32-7,36 (m, 1H, Ar-H), 7,30 (dd, J=1,5 i 7,9Hz, 1H, H-5), 7,11 (d, J=1,6Hz, 1H, H-7), 3,28-3,34 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J=6,8Hz, 2H, NCH2), 2,18 (s, 6H, N(CH3)2).
MS-EI m/ z 428[M<+>j.
Primer 10
( 2- dimetilaminoetil) amid 5-( 5- hloro- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 5-hloro-1,3-dihidroindol-2-on (100 mg, 0,6 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina ()2-dimetilaminoetilamidom (0,15 g), dajući 0,22 g (90%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H,NH),10,98 (s, br, 1H, NH), 7,96 (d, J=2,0Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinil), 7,50 (t, J=5,5Hz, 1H, CONHCH2), 7,12 (dd, J=2,0 i 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,86 (d, J=8,3Hz, 1H, H-7), 3,26-3.31 (m, 2H, NCH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H,CH3),2,36 (t, J=6,6Hz, 2H, NCH2), 2,17 (s, 6H,N(CH3)2).
MS-EIm/ z386 [M<+>].
Primer 11
( 2- dietilaminoetil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,17 g, 0,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (0,2 g), dajući 90 mg (26%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,7Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,42 (t, J=5,5Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, 7=1,7 i 8,0Hz, 1H, H-6), 6,82 (d, J=8,0Hz, 1H, H-7), 3,23-3.32 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H,CH3),0,96 (t, J=7,2Hz, 6H, 3xNCH2CH3).
MS-EIm/ z458 i 460 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 12
( 2- pirolidin- 1 - il- etil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (90 mg, 0,4 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (0,1 g), dajući 0,14 g (81%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,98 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,9Hz, 1H, H-4), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,53 (t, J=5,5Hz, 1H, CONHCH2), 7,24 (dd, J=1,9 i8,5Hz, 1H, H-6), 6,81 (d, J=8,5Hz, 1H, H-7), 3,29-3,35 (m, 2H,NCH2),2,54 (t, J=6,9Hz, 2H, NCH2), 2,57 (m, pod DMSO), 2,42 (s, 3H,CH3),2,40 (s, 3H, CH3), 1,66-1,69 (m, 4Hm 2xCH2).
MS-EIm/ z 456i 458 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 13
( 3- imidazol- 1- ilpropil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1/-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (90 mg, 0,4 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-ilpropil)amidom (0,1 g), dajući 0,1 g (59%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,63 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J=2,2Hz, 1H, H-4), 7,77 (d, 1H, H-vinil), 7,71 (t, J=5,7Hz, 1H, CONHCH2), 7,65 (s, 1H, Ar-H), 6,89 (s, 1H, Ar-H), 6,81 (d, J=8,4Hz, 1H, H-7), 4,02 (t, J=6,7Hz, 2H, NCH2), 3,18 (q, J=6,7Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (m, 2H,CH2).
MS-EIm/ z467 i 469 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 14
2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 5- fenil- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 1H- pirol-3- karboksilna kiselina ( 2- dietilaminoetil) amid
Kondenzuje po postupku B se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (0,1
g), dajući 79 mg (46%) naslovljenog jedinjenja.
<1>H NMR (30 MHz, DMSO-d6) 5 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,95 (s, br, 1H, NH), 8,15
(d, J=1,2Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,40-7,47 (m, 4H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J=8,1Hz, 1H), 3,2-3,31 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3*NCH3), 0,96 (t, J=7,4Hz, 6H, 2xNCH2CH3).
MS-EIm/ z456 [M<+>].
Primer 15
( 2- pirolidin- 1 - iletiOamid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 5- fenil- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (40 mg, 0,2 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (40 mg), dajući naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-oranž boje.
<1>H NMR (30 MHz, DMSO-d6) 5 13,65 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,15 (d, J=1,0Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J=7,2Hz, 2H), 7,49 (t, J=6,3Hz, 1H, CONHCH2), 7,41-7,46 (m, 3H), 7,31 (m, 1H), 6,95 (d, J=7,8Hz, 1H), 4,08 (m, 4H, 2xNCH2), 3,32 (m, 2H, NCH3), 2,55 (t, J=7,1Hz, 2H, NCH2), 2,47 (m, ispod DMSO), 2,43 (s, 6H, 2xCH3), 1,66 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EI m/ z 454[M<+>].
Primer 16
( 3- imidazol- 1- ilpropil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 5- fenil- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-imidazol-1-ilpropil)amidom (10 mg), dajući 10 mg (59%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,67 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8,16 (d, J=1,2Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinil), 7,65-7,72 (m, 4H), 7,44 (m, 3H), 7,31 (m, 1H, CONHCH2), 7,21 (s, 1H, Ar-H), 4,02 (t, J=6,5Hz, 2H, NCH2), 3,19 (q,J=6, 5Hz,2H, CONHCH2), 2,44 (s, 6H, 2xCH3), 1,93 (m, 2H, CH2CH2CH2).
MS-EI m/ z 465[M<+>].
Primer 17
( 2- dietilaminoetil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 6- fenil- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)-1H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (80 mg, 0,4 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (100 mg), dajući 65 mg (38%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) S 13,61 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,62-7,66 (m, 3H), 7,40-7,47 (m, 3H), 7,28-7,36 (m, 2H),
7,10 (d, J=1,2Hz, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,46-2,55 (m, 6H, 3*NCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H,CH3),0,97 (t, J=7,2Hz, 6H, 2xNCH2CH3).
MS-EIm/ z456 [M<+>].
Primer 18
( 2- pirolidin- 1 - iletiDamid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 6- fenil- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetiQ- 1H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (30 mg, 0,15 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (40 mg), dajući 5,9 mg (8,5%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,60 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H, NH), 7,86 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,63-7,66 (m, 3H), 7,51 (m, 1H, CONHCH2), 7,45 (m, 2H), 7,28-7,36 (m, 2H), 7,10 (d, J=1,5HZ, 1H), 3,31 (m, 6H, 3*NCH2), 2,55 (t, J=6,6Hz, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H,2*CH2).
MS-EIm/ z454 [M<+>].
Primer 19
( 3- imidazol- 1- ilpropil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 6- fenil- 1, 2- dihidroindol-3-
ilidenmetil)- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (8 mg, 0,04 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina 3-imidazol-1-ilpropil)amidom (10 mg), dajući 7,3 mg (43%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,62 (s, br, 1H,NH),10,99 (s, br, 1H,NH),7,86 (d, J=8,2Hz, 1H), 7,62-7,70 (m, 5H), 7,45 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,30 (dd, J=1,4 i 8,2Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,10 (d, J=1,4Hz, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,02 (t, J=6,9Hz, 2H, CH2), 3,19 (m, 2H, NCH2CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,93 (t, J=6,9Hz, 2H, NCH2).
MS-EI m/ z 465[M<+>].
Primer 20
( 2- dietilaminometil) amid 5- f6-( 3, 5- dihlorofenil)- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 2, 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 6-(3,5-dihlorofenil)-1,3-dihidroindol-2-on (64 mg, 0,23 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (60 mg), dajući 53 mg (44%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu svetio mrke boje.
<1>H NMR (30 MHz, DMSO-d6) 5 13,62 (s, br, 1H, NH), 10,99 (s, br, 1H,NH),7,89 (d, J=7,9Hz, 1H, H-4), 7,69-7,71 (m, 3H), 7,55 (m, 1H, CONHCH2), 7,37 (m, 2H), 7,14 (d, J=1,4Hz, 1H, H-7), 3,27 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,58 (m, 6H, 3*NCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,42 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=6,8Hz, 6H, 3*NCH2CH3).
MS-EI m/ z 526,9[M<+>+1].
Primer 21
( 2- dietilaminoetil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 6- piridin- 3- il- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (40 mg, 0,19 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (50 mg), dajući 29 mg (33%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu svetlo-oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,62 (s, br, 1H,NH),11,05 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,53 (d,v/=5,8Hz, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,91 (d, J=8,1Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinil), 7,40-7,48 (m, 2H), 7,35 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 3,26 (m, 2H, NCH2), 2,48-2,55 (m, 3*NCH2), 2,42 (s, 3H,CH3),2,38 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, v/=6,9Hz, 6H, 2xNCH2CH3).
MS-EI m/ z 457[M<+>].
Primer 22
( 2- pirolidin- 1- iletil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 6- piridin- 3- il- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (60 mg, 0,28 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (75 mg), dajući 90 mg (71%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu svetio oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,05 (s, br, 1H,NH),8,86 (d, J=1,5Hz, 1H), 8,54 (dd, J=1,5 i 4,8Hz, 1H), 8,05 (m, 1H), 7,91 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,70 (s, 1H, H-vinil), 7,44-7,53 (m, 2H), 7,36 (dd, J=1,5 i 8,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J=1,2Hz, 1H), 3,33 (m, 2H,NCH2),2,47-2,57 (m, 6H, 3xNCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H,2* CH2).
MS-EI m/ z 455[M<+>].
Primer 23
( 3- dimetilaminopropil) amid 2. 4- di metil- 5-( 2- okso- 6- piridin- 3- il- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1 /-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 6-piridin-3-il-1,3-dihidroindol-2-on (42 mg, 0,2 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amidom (50 mg), dajući 67 mg (75%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-mrke boje.<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,61 (s, br, 1H, NH), 11,00 (s, br, 1H, NH), 8,86 (s, br, 1H), 8,54 (s, br, 1H), 8,04 (m, 1H), 7,90 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinil), 7,63 (m, 1H), 7,45-7,48 (m, 1H), 7,35 (dd,J=1,7 i 8,0Hz, 1H), 7,15 d, J=1,7Hz, 1H), 3,21-3,27 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 2,28 (m, 2H, NCH2), 2,14 (s, 6H, 2*NCH3), 1,64 (m, 2H,CH2).
MS-EI m/ z 443[M<+>].
Primer 24
O- dimetilaminopropiHamid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 5- fenil1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (67 mg, 0,32 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amidom (81 mg), dajući 40 mg (28%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,66 (s, br, 1H, NH), 10,92 (s, br, 1H, NH), 8,14 (s, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,71 (m, 2H), 7,62 (m, 1H), 7,44 (m, 3H), 7,32 (m, 1H), 6,95 (m, 1H), 3,33 (m, 2H, NCH2), 2,43 (s, 6H, 2xH3), 2,27 (m, 2H, NCH2), 2,13 (s, 6H, 2xNCH3), 1,63 (m, 2H, CH2).
MS-EI m/ z 442[M<+>].
Primer 25
( 3- dietilaminopropil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 5- fenil- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 5-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (2 g), dajući 1,3 g (40%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-oranž boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,64 (s, br, 1H,NH),10,91 (s, br, 1H,NH),8,14 (d, J=1,4Hz, 1H, ArH), 7,8 (s, 1H, ArH), 7,7 (dd, J=1,2 i 8,5Hz, 2H, ArH), 7,6 (t, J=5,3Hz, 1H, CONHCH2), 7,4 (m, 3H, ArH), 7,3 (t, J=7,4Hz, 1H, ArH), 6,9 (d, J=8,0Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3xNCH2 i 2xCH3), 1,61 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J=6,7Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EIm/ z470 [M<+>].
Primer 26
( 3- dietilaminopropil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 6- fenil- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 6-fenil-1,3-dihidroindol-2-on (1,5 g, 7,16 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom) (2 g), dajući 1,9 g (57%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,58 (s, br, 1H, NH), 10,94 (s, br, 1H,NH),7,8 (d, J=7,9Hz, 1H, ArH), 7,6 (m, 4H, ArH), 7,4 (t, J=7,5Hz, 2H, ArH), 7,3 (m, 2H), 7,1 (d, J=1,4Hz, 1H, ArH), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,5 (m, 12H, 3xCH2i 2xCH3), 1,61 m, 2H, CH2CH2CH2), 0,93 (t, J=6,7Hz, 6H, NCH2CH3).
MS-EIm/ z470 [M<+>].
Primer 27
( 3- dietilaminopropiOamid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (0,5 g, 2,36 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dimetilaminopropil)amidom (0,51 g), dajući 0,84 g naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu crveno-oranž boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,61 (s, br, 1H,NH),10,99 (s, br, 1H, NH), 8,09 (d, J=1,8Hz, 1H, ArH), 7,7 (m, 4H), 7,2 (dd, J=1,8 i 8,3Hz, 2H, ArH), 6,8 (d, J=7,8Hz, 1H, ArH), 3,3 (br s, 4H, 2*NCH2), 3,2 (m, 2H, CONHCH2), 2,6 (br s, 2H, NCH2i 2xCH3), 2,4 (s, 6H, 2*CH3), 1,66 (m, 2H, CH2CH2CH2), 0,98 (t, J=7,1Hz, 6H, NCH2CH3j.
MS-EIm/ z472 i 474 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 28
( 2- dietilaminoetil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
diizopropil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (100 mg, 0,47 mmol) sa 5-formil-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (150 mg), dajući 0,15 g (62%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,97 (s, br, 1H, NH), 10,95 (s, br, 1H,NH),8,09 d, J=1,3Hz, 1H, ArH), 7,84 (m, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (dd, J=1,3 i 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,8 (d, J=8,1 Hz, 1H, ArH), 3,5 (d, 1H, CH), 3,3 (m, 3H, CH i HCH2), 2,5 (br m, 6H, 3xNCH2), 1,28 (d, J=6,9Hz, 6H, 2xCH3), 1,23 (d, J=6,6Hz, 6H, 2xCH3), 0,96 (m, 6H, 3xCH2CH3).
MS-EIm/ z514 i 516 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 29
( 3- dietilaminopropil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetin- 2, 4-
diizopropil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (90 mg, 0,42 mmol) sa 5-formil-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-dietilaminopropil)amidom (140 mg), dajući 54 mg (25%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu crveno-mrke boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,98 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 8.09 (d, J=1,7Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,23 (dd, J=1,7 i 8,1 Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J=8,1Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 1H, CH), 3,25 (m, 2H, NCH2CH2), 1,28 (d, J=6,9Hz, 6H, 2xCH3), 1,24 (d, J=5,9Hz, 6H, 2*CH3), 1,06 (m, 6H, 2xCH2CH3).
MS-EIm/ z 528i 530 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 30
( 3- pirolidin- 1- ilpropil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
diizopropil-
1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (130 mg, 0,6 mmol) sa 5-formil-2,4-diizopropil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (3-pirolidin-1-ilpropil)amidom (150 mg, 0,45 mmol), dajući 36 mg (15%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu tamno-oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,98 (s, br, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 8.10 (d, J=1,6Hz, 2H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,23 (dd, J=1,6 i 7,6Hz, 1H, ArH), 6,82 (d, J=7,6Hz, 1H, ArH), 3,5 (m, 2H, CH), 3,25 (m, 2H, NHCH2), 3,15 (m, 1H, CH), 2,7 (br s, 6H, 3*NCH2), 1,7 (br m, 6H, 3*NCH2CH2), 1,28 (d, J=5,6Hz, 6H, 2xCH3), 1,24 (d, J=5,7Hz, 6H, 2*CH3).
MS-EIm/ z526 i 528 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 31
( piridin- 4- ilmetil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2. 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 5-bromo-1,3-dihidroindol-2-on (170 mg, 0,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (piridin-4-ilmetil)amidom (200 mg), dajući 14 mg (4%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,67 (s, br, 1H, NH), 11,01 (s, br, 1H, NH), 8,51 (dd, J=1,6 i 4,3Hz, 1H), 8,23 (t, J=6,0Hz, 1H, CONHCH2), 8,11 (d, J=1,9Hz, 1H), 7,78 (s, 1H, H-vinil), 7,31 (d, J=6,0Hz, 2H), 7,25 (dd, J=1,9 i 8,1 Hz, 1H), 6,82 (d, J=8,1Hz, 1H), 4,45 (d, J=6,0Hz, 2H, NCH2), 2,46 (s, 6H, 2*CH3).
MS-EIm/ z450 i 452 [M<+->1] i [M<+>+1].
Primer 32
( 2- pirolidin- 3- iletinamid 5- f6-( 4- butilfenil- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetin- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 5-[6-(4-butilfenil)]-1,3-dihidroindol-2-on 50( mg, 0,19 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (50 mg), dajući 74 mg (76%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) § 13,58 (s, br, 1H, NH), 10,93 (s, br, 1H, NH), 7.82 (d, J=7,9Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinil), 7,54 (d, J=7,9Hz, 2H), 7,46 (m, 1H, CONH), 7,26 (m, 3H), 7,09 (s, 1H), 3,30 (m, 2H, CH2), 2,52-2,63 (m, 4H, 2*2H2), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,43 (s, 3H, cH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2), 1,58 (m, 2H,CH2),1,34 (m, 2H, CH2), 0,91 (t, J=7,2Hz, 3H, CH2CH3).
MS-EI m/ z 510[M<+>].
Primer 33
( 2- pirolidin- 1- iletil) amid 5-[ 6-( 4- etilfenil)- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetin- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 6-(4-etilfenil)-1,3-dihidroindol-2-on (45 mg, 0,19 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (50 mg), dajući 60 mg (65%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,59 (s, br, 1H, NH), 10,96 (s, br, 1H, NH), 7.83 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinil), 7,51-7,56 (m, 3H), 7,25-7,30 (m, 3H), 7,08 (d, J=1Hz, 1H), 3,31 (m, 2H,CH2),2,63 (m, 2H, CH2CH2), 2,55 (m, 2H,
CH2), 2,49 (m, 4H, 2*CH2), 2,42 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2xCH2), 1,20 (t, J=7,5Hz, 3H, CH2CH3).
MS-EIm/ z482 [M<+>].
Primer 34
( 2- pirolidin- 1- iletil) amid 5- f6-( 3- izopropilfenil)- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 2, 4- dimetil-
1H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 6-(3-izopropilfenil)-1,3-dihidroindol-2-on (48 mg, 0,19 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (50 mg), dajući 59 mg (63%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 5 13,63 (s, 1H, NH), 10,97 (s, br, 1H, NH), 7,87 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,68 (s, 1H, H-vinil), 7,24-7,55 (m, 6H), 7,13 (s, 1H), 3,34 (m, 2H, CH2), 3,30 (m, 1H, CH(CH3)2), 2,60 (m, 2H, CH2), 2,50 (m, 4H, 2*CH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H,CH3),1,70 (m, 4H,2*CH2),1,27 (d, J=6,9Hz, 6H, CH(CH3)2).
MS-EI m/ z 496[M<+>].
Primer 35
( 2- dietilaminoetil) amid 5-( 5- fluoro- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 5-fluoro-1,3-dihidroindol-2-on (0,54 g, 3,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom, dajući 0,83 g (55%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-zelene boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,66 (s, 1H, NH), 10,83 (s, br, 1H, NH), 7,73 (dd,J=2,5i 9,4H, 1H), 7,69 (s, 1H, H-vinil), 7,37 (t, 1H, CONHCH2CH2), 6,91 (m, 1H), 6,81-6,85 (m, 1H), 3,27 (m, 2H,CH2),2,51 (m, 6H, 3*CH2), 2,43 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,96 (t, J=6,9Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/ z 398[M<+>].
Primer 35 ( alternativna sinteza)
( 2- dietilaminoetil) amid 5-( 5- fluoro- 2- okso- 1, 2- dihidroindol-( 3Z)- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Zagreju se na 100°C hidrazin hidrat (55%, 3000 mL) i 5-fluoroizatin (300 g). Tokom 120 min, uz mešanje, dodaje se u porcijama (100 g) još 5-fluoroizatina (500 g). Smeša se zagreje na 110°C i meša 4 h. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, pa se talog sakupi vakuum filtriranjem, dajući sirovi (2-amino-5-fluoro-fenil)sirćetna kiselina hidrazid (748 g). Ovaj hidrazid se suspenduje u vodi (700 mL), pa se pH smeše podesi na <3, sa 12 M HCI. Ova smeša se 12 h meša na sobnoj temperaturi. Talog se sakupi vakuum filtriranjem i dva puta opere vodom. Proizvod se suši pod vakuumom, dajući 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on (600 g, 73% prinos), kao mrki prah.<1>H NMR (DMSO-d6) 8 3,46 (s, 2H, CH2), 6,75, 6,95, 7,05 (3xm, 3H, aromatičan), 10,35 (s, 1H, NH). MS-EIm/z152 [M<+>].
3,5-diemtil-1H-pirol-2,4-dikarboksilna kiselina 2-terc-butilestar 4-etilestar (2600 g) i etanol (7800 mL) mešaju se snažno, dok se lagano dodaje 10 M HCI (3650 mL). Poveća se temperatura sa 25°C na 35°C, pa počne izdvajanje gasa. Smeša se zagreje na 54°C, pa se meša uz dodatni 1 h zagrevanja, kada temperatura dostigne 67°C. Smeša se ohladi na 5°C, pa se uz mešanje lagano dodaje 32 L ledene vode. Talog se sakupi vakuum filtriranjem i tri puta opere vodom. Talog se suši na vazduhu do konstantne mase, dajući 2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar (1418 g, 87% prinos) kao ružičastu čvrstu supstancu. 1H NMR (DMSO-d6) 8 2,10, 2,35, (2xs, 2x3H, 2xCH3), 4,13 (q, 2H, CH2), 6,37 (s, 1H, CH), 10,85 (s, 1H, NH). MS-EIm/z167 [M<+>+1].
Ohlade se na 4°C dimetilformamid (322 g) i dihlorometan (3700 mL), u kupatilu sa ledom, pa se uz mešanje dodaje fosfor-oksihlorid (684 g). Čvrst 2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar (670 g) dodaje se lagano u alkivotima tokom 15 min. Maksimalna temperatura koja se dostigne je 18°C. Smeša se zagreva pod refluksom 1 h, ohladi na 10°C u kupatilu sa ledom, pa se uz snažno mešanje brzo doda 1,6 L ledene vode. Temperatura poraste na 15°C. Uz snažno mešanje se doda 10 M HCI (1,6 L). Temperatura poraste na 22°C. Smeša se ostavi da stoji 30 min da se razdvoje slojevi. Temperatura dostigne maksimalno 40°C. Podesi se pH vodenom sloju na 12-13, dodavanjem 10 M KOH (3,8 L) takvom brzinom da se dozvoli da temperatura dostigne i zadrži se na 55°C, tokom ovog dodavanja. Po završetku dodavanja, smeša se ohladi na 10°C, pa meša 1 h. Talog se sakupi vakuum filtriranjem i četiri puta opere vodom, dajući 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar (778 g, 100% prinos), kao žutu čvrstu supstancu.<1>H NMR (DMSO-d6) 8 1,25 (t, 3H, CH3), 2,44, 2,48 (2*s, 3H, 2*CH3), 4,16 (q, 2H, CH2), 9,59 (s, 1H, CHO), 12,15 (br s, 1H, NH).MS-EI 195 m/ z[M<+>+1].
Smeša 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestra (806 g), kalijum-hidroksida (548 g), vode (2400 mL) i metanola (300 mL) refluksuje se 2 h, uz mešanje, pa se ohladi na 8°C. Smeša se ekstrahuje dva puta sa dihlorometanom. Podesi se pH vodenom sloju na 4, sa 1000 mL 10 M HCI, držeći temperaturu ispod 15°C. Doda se voda da se olakša mešanje. Talog se sakupi vakuum filtriranjem, tri puta opere vodom i suši pod vakuumom na 50°C, dajući 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu (645 g, 93,5% prinos), kao žutu čvrstu supstancu. NMR (DMSO-d6) 8 2,40, 2,43 (2*2s, 3H, 2xCH3), 9,57 (s, 1H, CHO), 12,07 (brs, 2H, NH+COOH).MS-EI m/ z 168[M<+>+1].
Mešaju se, na sobnoj temperaturi, 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (1204 g) i 6020 mL dimetilformamida, dok se dodaju 1-(3-dimetilaminopropil-3-etilkarbodiimid hidrohlorid (2071 g), hidroksibenzotriazol (1460 g), trietilamin (2016 mL) i dietiletilendiamin (1215 mL). Smeša se 20 h meša na sobnoj temperaturi. Smeša se razblaži sa 3000 mL vode, 2000 mL zasićenog rastvora soli i 3000 mL zasićenog rastvra natrijum-bikarbonata, pa se podesi pH na više od 10 sa 10 M NaOH. Smeša se dva puta ekstrahuje, svaki put sa 5000 mL 10% metanola u dihlorometanu, pa se ekstrakti kombinuju, osuše iznad bazvodnog magnezijum-sulfata i upare do suva na rotacionom uparivaču. Smeša se razblaži sa 1950 mL toluena, pa ponovo upari na rotacionom uparivaču. Ostatak se triturira sa 3:1 heksan:dietiletrom (4000 mL). Talog se sakupi vakuum filtriranjem, dva puta opere sa 400 mL etilacetata i suši pd vakuumom 21 h na 34°C, dajući 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil) amid (819 g, 43% prinos), kao svetlo-mrku čvrstu supstancu.<1>H NMR (DMSO-d6) 8 0,96 (t, 6H, 2xCH3), 2,31, 2,38 (2xS, 2xCH3), 2,51 (m, 6H, 3<x>CH2), 7,34 (m, 1H, amidni NH), 9,56 (s, 1H, CHO), 11,86 (s, 1H, pirolski NH). MS-EIm/ z266 [M<+>+1].
Smeša 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amida (809 g), 5-fluro-1,3-dihidro-indol-2-ona (438 g), etanola (8000 mL) i pirolidina (13 mL), zagreva se 3 h na 78°C. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, a talog sakupi vakuum filtriranjem i opere etanolom. Ova čvsrta supstanca se 30 min meša sa etanolom (5900 mL) na 72°C. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu. Talog se sakupi vakuum filtriranejm, opere etanolom i 130 h suši pod vakuumomna 54°C, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amid (1013 g, 88% prinos), kao čvrstu supstancu oranž boje.<1>H NMR (DMSO-d6) 8 0,98 (t, 6H, 2xCH3), 2,43, 2,44 (2xS, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 6H, 3xCH2), 3,28 (1, 2H, CH2), 6,84, 6,92, 7,42, 7,71, 7,50 (5*m, 5H, aromatični, vinil, CONH), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, pirolski NH). MS-EIm/ z397 [M<+->1].
Primer 36
3- F4-( 2- dietilaminoetilkarbamoil)- 3, 5- dimetil- 1H- pirol- 2- ilmetilen1- 2- okso- 2, 3-
dihidro- 1 H- indot- 6- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-6-karboksilna kiselina (80 mg, 0,45 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-2-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom, dajući 210 mg (92%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žuto-oranž boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s, 1H,NH),7,76 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,66 (s, 1H, H-vinil), 7,57 (dd, J=1,5 i 8,0Hz, 1H), 7,40-7,42 (m, 2H), 3,28 (m, 2H,
CH2),2,88 (m, H-piperidin), 2,54 (m, 6H, 3*CH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,56 (m, H-piperidin), 0,97 (t, J=6,98Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/ z 424 [M<+>].
Primer 37
( 2- pirolidin- 1- iletil) amid 5-( 5- dimetilsulfamoil- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 2, 4- dimetil- 1/-/- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina dimetilamid (90 mg, 0,38 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (100 mg), dajući 100 mg (54%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) § 13,65 (s,1H, NH), 11,30 (s, br, 1H, NH), 8,25 (d, 1H), 7,92 (s, 1H, H-vinil), 7,48-7,53 (m, 2H), 7,07 (d, J=8,2Hz, 1H), 3,33 (m, 2H, CH2), 2,61 (s, 6H, N(CH3)2), 2,56 (t, 2H,CH2),2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 1,67 (m, 4H, 2*CH2).
MS-EIm/ z485 [M<+>].
Primer 38
5- r5-( 3- hlorofenilsulfamoil)- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetin- 2, 4- dimetil- 1H-pirol- 3- karboksilna kiselina ( 2- pirolidin- 1- iletil) amid
Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina (3-hlorofenil) amid (120 mg, 0,38 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (100 mg), dajući 150 mg (69%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,55 (s, 1H, NH), 11,26 (s, br, 1H, NH), 10,30 (br s, 1H, NH), 8,26 (d, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinil), 7,51-7,57 (m, 2H), 7,22 (t,J=8,1Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 7,07 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,44 (m, 2H, CH2), 2,57 (t, J=7,0Hz, 2H, CH3), 2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 1,68 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EI m/ z 568[M<+>].
Primer 39
( 2- pirolidin- 1- iletil) amid 2, 4- dimetil- 5- f2- okso- 5-( piridin- 3- ilsulfamoin- 1. 2-
dihidroindol- 3- ilidenmetil1- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina piridin-3-ilamid (110 mg, 0,38 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-piroI-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom (100 mg), dajući 150 mg (74%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,58 (s,1H, NH), 8,21 (d, J=2,0Hz, 2H), 8,04 (m, 1H), 7,76 (s, 1H, H-vinil), 7,49-7,54 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 6,94 (d, J=8,5Hz, 1H), 3,33 (m, 2H,CH2),2,56 (t, J=7,06Hz, 2H;CH2),2,49 (m, 4H, 2xCH2), 2,43 (s, 6H,2xCH3),1,68 (m, 4H, 2xCH2).
MS-EIm/ z535 [M<4>].
Primer 40
3- f3, 5- dimetil- 4-( 4- metilpiperazin- 1- karbonil)- 1H- pirol- 2- ilmetilen1- 4-( 2-
hidroksietil)- 1, 3- dihidroindol- 2- on
Kondenzuje se 4-(2-hidroksietil)-1,3-dihidroindol-2-on (71 mg, 0,4 mmol) sa 3,5-dimetil-4-(4-metil-piperazin-1-karbonil)-1H-pirol-2-karbaldehidom, dajući 90 mg (55%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu oranž boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 14,25 (s,1H, NH), 10,88 (s,1H, NH), 7,57 (s, 1H, H-vinil), 7,03 (m, 1H), 6,75-6,82 (m, 2H), 4,86 (m, 1H,OH),3,70 (m, 2H,CH2),3,04 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 4H, 2xCH2), 2,28 (br s, 7H), 2,19 (s, 3H, CH3), 2,18 (s, 3H,CH3).
MS m/ z (pozitivan)4.09.3 [M<+>].
Primer 41
3- f3, 5- dimetil- 4-( 4- metilpiperazin- 1- karbonil)- 1H- pirol- 2- ilmetilen1-2- okso- 2, 3- dihidro- 1 H- indol- 5- sulfonska kiselina
Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina fenilamid (110 mg, 0,4 mmol) sa 3,5-dimetil-4-(4-metilpiperazin-1-karbonil)-1H-pirol-2-karbaldehidom (100 mg), dajući 50 mg (24%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,52 (s, 1H,NH),11,26(s, 1H,NH),10,08 (s, 1H,NH),8,21 (d, J=1,6Hz, 1H), 7,75 (s, 1H, H-vinil), 7,50 (dd, J=1,6 i 8,3Hz, 1H), 7,19 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 6,97 (m, 2H), 2,49 (m, 4H, 2*CH2), 2,28 (m, 1=H, 2xCH3i 2xCH2), 21,8 (s, 3H, CH3).
MS-EI m/ z 519[M<+>].
Primer 42
( 2- dietilaminoetil) amid 5-( 5- dimetilsulfamoil- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetiQ-2, 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina dimetilamid (90 mg, 0,38 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (100 mg), dajući 80 mg (43%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,61 (s,1H, NH), 8,27 (d, J=1,7Hz, 1H), 7,94 (s, 1H, H-vinil), 7,49 )dd, J=1,7 i 8,0Hz, 1H), 7,44 (m, 1H, CONHCH2CH2). 7,07 (d, H=8,0Hz, 1H), 3,26 (m, 2H,CH2),2,60 (s, N(CH3)2), 2,53 (m, 2H, CH2), 2,45-2,50 (m, 1=H, 2xCH3i N(CH2CH3)2), 0,96 (t, J=7,2Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EIm/ z487 [M<+>].
Primer 43
( 2- dietilaminoetil) amid 5f5-( 3- hlorofenilsulfamoil)- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetil)- 2, 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonska kiselina (3-hlorofenil)amid (120 mg, 3,8 mmol) sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amidom (100 mg), dajući 80 mg (37%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu žute boje.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 13,55 (s,1H,NH),11,24 (s, 1H,NH),10,29 (s, 1H, NH), 8,25 (d, J=1,87Hz, 1H), 7,79 (s, 1H, H-vinil), 7,52 (dd, J=1,87 i 8,3Hz, 1H), 7,42 (m, 1H, CONHCH2CH2), 7,22 (t, J=8,02Hz, 1H), 7,15 (t, J=2Hz, 1H),
7,08 (m, 1H), 7,0 (m, 2H), 3,27 (m, 2H,CH2),2,48-2,57 (m, 6H, 3*CH2), 2,45 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,0Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS-EI m/ z570,1 [M<+>].
Primer 44
etilestar ( f4- metil- 5-( 4- metil- 5- metilsulfamoil- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3-
ilidenmetiO- 1 H- pirol- 3- karbonil1- amino}- sirćetne kiseline
Formiluje se po postupku A 4-metil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina etilestar (literatura. D.O. Cheng, T.L. Bowman i E. LeGoff,J. Heterociclic Chem.1976, 13, 1145-1147), pa hidrolizuje po postupku B, posle čega sledi amidovanje po postupku C, dajući [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)-amino]-sirćetna kiselia etilestar.
Kondenzuje se 4-metil-5-metilaminosulfonil-2-oksiindol (50 mg, 0,21 mmol) sa [(5-formil-4-metil-1/-/-pirol-3-karbonil)-amino]-sirćetna kiselina etilestrom (100 mg, 0,42 mmol) i piperidinom (0,1 mL) u etanolu (2 mL), dajući 50 mg (52%) naslovljenog jedinjenja.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,59 (s, 1H, NH), 11,29 (v. br s, 1H, NH-CO), 8,33 (7, J=5,8Hz, 1H, CONHCH2), 7,83 (d, J=3,11Hz, 1H), 7,80 (s, 1H, H-vinil), 7,71 (d, J=8,5Hz, 1H), 7,34 (br m, 1H, NHCH3), 6,89 (d, J=8,5Hz, 1H), 4,11 (q, .7=7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J=5,8Hz, 2H, Gli-CH2), 2,86 (s, 3H, CH3), 2,48 (s, 3H, CH3), 2,42 (d, J=4,71Hz, 3H, HNCH3), 1,20 (t, J=7,1Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EIm/ z460 [ M*].
Primer 45
etilestar {[ 4- metil- 5-( 5- metilsulfamoil- 2- okso- 1, 2- dihidro- indol- 3- ilidenmetil)- 1H-pirol- 3- karbonil]- amino}- sirćetne kiseline
Smeša 5-metilaminosulfonil-2-oksiindola (0,06 g, 0,22 mmol), [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)-amino]-sirćetna kiselina etilestra (0,075 g, 0,27 mmol) i piperidina (2 kapi) u etanolu (5 mL) zagreva se 12 h u zatvorenoj cevi, na 90°C. Posle hlađenja, talog se sakupi vakuum filtriranjem, opere etanolom, triturira dihlorometan/etrom, suši, dajući 0,035 g (36%) naslovljenog jedinjenja kao žućkasto mrku čvrstu supstancu.
<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 5 13,6 (s, 1H, NH), 11 v. br s, 1H, NH-CO), 8,30 (t, J=5,7Hz, 1H, CONHCH2), 8,25 (d, J=1,2Hz, 1H), 7,88 (s, 1H, H-vinil), 7,84 (d, J=3,3Hz, 1H), 7,57 (dd, J=1,9 i 8,5Hz, 1H), 7,14 (br m, 1H, NHCH3), 7,04 (d, J=8,5Hz, 1H), 4,11 (q, J=6,7Hz, 2H, OCH2CH3), 3,92 (d, J=5,7Hz, 2H, Gli-CH2), 2,55 (s, CH3), 2,41 (m, 3H, NCH3), 1,20 (t, J=6,7Hz, 3H, OCH2CH3).
MS-EI m/ z 446 [M<+>].
Primer 46
ir4- metil- 5-( 5- metilsulfamoil- 2- okso- 1, 2- dihidro- indol- 3- ilidenmetil)- 1H- pirol- 3-
karbonill- aminoV- sirćetna kiselina
Smeša [(5-formil-4-metil-1H-pirol-3-karbonil)-amino]-sirćetna kiselina etilestra (0,142 g, 0,59 mmol) i 1M NaOH (1,2 mL) u metanolu (10 mL) meša se 1 h na sobnoj temperaturi. Reakcija se koncentriše, a ostatak se kondenzuje sa 5-metilaminosulfonil-2-oksiindolom (0,13 g, 0,48 mmol) i piperidinom (0,12 mL) u etanolu (12 mL), dajući 0,11 g (52%) naslovljenog jedinjenja.
<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 13,98 (s, br, 1H, NH), 8,17 (s, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,75 (d, J=3,1Hz, 1H), 7,51 (dd,J=2i 8,2Hz, 1H), 7,21 (m na br s, 2H), 6,97 (d, J=8,1Hz, 1H), 3,41 (d, J=4,2Hz, 2H, CH2NH), 2,54 (s, 3H, pirol-CH3), 2,39 (s, 3H, ArCH3).
MS-EI m/ z 417 [M<+->1].
Primer 48
( 2- dietilamino- etil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 1, 2- dihidro- indol- 3- ilidenmetin- 1H-pirol- 3- karboksilne kiseline
Smeša 1,3-dihiro-indol-2-ona (266 mg, 2 mmol), 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amida (530 g, 2 mmol) i piperidina (1 kap) u etanolu, zagreva se 2 h na 90°C. Reakcija se ohladi na sobnu temperaturu, a nastali talog sakupi vakuum filtriranjem, opere etanolom i osuši, dajući 422 mg (55%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu supstancu svetložute boje.
<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 13,7 (s, 1H, NH), 10,9 (s, 1H, NH), 7,88 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,64 (s, 1H, H-vinil), 7,41 (t, J=5,4Hz, 1H, NH), 7,13 (dt, J=1,2 i 7,6Hz, 1H), 6,99 (dt, J=1,2 i 7,6Hz, 1H), 6,88 (d, J=7,6Hz, 1H), 3,28 (m, 2H), 2,48-2,55 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,41 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,2Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS(+)APCI381 [M<+>+1].
Primer 49
( 2- dietilaminoetil) amid 5-( 5- hloro- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Smeša 5-hloro-1,3-dihidro-indol-2-ona (335 mg, 2 mmol), 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilaminoetil)amida (530 mg, 2 mmol) i piperidina (1 kap) u etanolu zagreva se 2 h na 90°C. Reakcija se ohladi na sobnu temperaturu, nastali talog sakupi vakuum filtriranjem, opere etanolom i suši, dajući 565 mg (68%) naslovljenog jedinjenja kao čvrstu susptancu oranž boje.
<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 13,65 (s, 1H, NH), 11,0 (s, 1H, NH), 7,98 (d, J=2,1Hz, 1H), 7,77 (s, 1H, H-vinil), 7,44 (t, NH), 7,13 (dd, J=2,1 i 8,4Hz, 1H), 6,87 (d, J=8,4Hz, 1H), 3,28 (g, 2H), 2,48-2,53 (m, 6H), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,43 (s, 3H, CH3), 0,97 (t, J=7,0Hz, 6H, N(CH2CH3)2).
MS(+)APCI415 [M<+>].
Primer 50
( 2- pirolidin- 1- iletil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)-
1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 1,3-dihidroindol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom, dajući naslovljeno jedinjenje. MS(+)APCI379 [M<+>].
Primer 51
( 2- pirolidin- 1- il- etil) amid 5-( 5- fluoro- 2- okso- 1. 2- dihidro- indol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kondenzuje se 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-iletil)amidom dajući naslovljeno jedinjenje. MS (+) APCI 397 [M<+>].
Scale - upprocedura
Refluksuju se 4,5 h 5-formil-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (61 g), 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-on (79 g), etanol (300 mL) i pirolidin (32 mL). U smešu se doda sirćetna kiselina (24 mL), pa se refluksovanje nastavi još 30 min. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, talog sakupi vakuum filtriranjem i dva puta opere etanolom. Talog se 130 min meša u 40% acetonu u vodi, koji sadrži 12 M HCI (6,5 mL). Talog se sakupi vakuum filtriranjem i dva puta opere 40% acetonom u vodi. Talog se suši pod vakuumom, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-đihidro-indo-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1/-/-pirol3-karboksilnu kiselinu (86 g, 79% prinos), kao čvrstu supstancu oranž boje.<1>H NMR (DMSO-d6) 5 2,48, 2,50 (2><s, 6H, 2xCH3), 6,80, 6,88, 7,68, 7,72 (4xm, 4H, aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 12,12 (s, 1H, COOH), 13,82 (s, 1H; pirolski NH). MS-EIm/z299 [M<+->1].
Mešaju se5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksiln akiselina (100 g) i dimetilfromamid (500 mL), pa se dodaju benzotriazol-1-ilioksitri(dimetilamino)fosfonijum heksafluorofosfat (221 g), 1-(2-aminoetil)pirolidin (45,6 g) i trietilamin (93 mL). Smeša se 2 h meša na temperaturi okoline. Talog se sakupi vakuum filtriranjem i opere etanolom. Talog se gusto suspenduje u etanolu (500 mL) i meša 1 h na 64°C, pa ohladi na sobnu temperaturu. Talog se sakupi vakuum filtriranjem, opere etanolom i osuši pod vakuumom, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amid (101,5 g, 77% prinos).<1>H NMR (MHz, DMSO-d6) 5 1,60 (m, 4H, 2xCH2), 2,40, 2,44 (2*s, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 4H, 2xCH2), 2,57, 3,35 (2xm, 4H, 2xCH2), 7,53, 7,70, 7,73, 7,76 (4xm, 4H, aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 1,367 (s, 1H, pirol NH).MS-EI m/z 396[M<+>+1].
Primer 52
( 2- piroHdin- 1- il- etil) amid 5-( 5- hloro- 2- okso- 1, 2- dihidro- indol- 3- ilidenmetil)- 2, 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 5-hloro-1,3-dihidroindol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-pirolidin-1-il-etil)amidom dajući naslovljeno jedinjenje. MS (+) APCI 413 [M<+>].
Primer 53
( 2- dimetilaminoetil) amid 2, 4- dimetil- 5-( 2- okso- 1. 2- dihidro- indol- 3- ilidenmetil)-1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Kondenzuje se 1,3-dihidroindol-2-on sa 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dimetilaminoetil)amidom dajući naslovljeno jedinjenje.
<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 13,63 (s, 1H, NH), 10,90 (s, 1H, NH), 7,78 (d, J=7,8Hz, 1H), 7,63 (s, 1H, H-vinil), 7,48 (t, 1H, NH), 7,13 (dt, 1H), 6,98 (dt, 1H), 6,88 (d, J=7,7Hz, 1H), 3,31 (q, J=6,6Hz, 2H), 2,43 (s, 3H, CH), 2,40 (s, 3H, CH3), 2,38 (t, J=6,6Hz, 2H), 2,19 (s, 6H), N(CH2CH3)2).
MS (+) APCI 353 [M<+>+1].
Primer 98
( 2- etilamino- etil) amid 5-( 5- fluoro- 2- okso- 1, 2- dihidro- indol-( 3Z)- ilidenmetil)-2, 4dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Smeša 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-etilaminoetil)amida (99 g), etanola (400 mL), 5-fluoro-2-oksiindola (32 g) i pirolidina (1,5 g) refluksuje se 3 h, uz mešanje. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, a talog sakupi vakuum filtriranjem. Proizvod se osuši pd vakuumom, dajući 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-etilaminoetil)amid (75 g, 95% prinos).<1>H NMR (DMSO-d6) 8 1,03 (t, 3H, CH3), 2,42, 2,44 (2xS, 6H, 2*CH3), 2,56 (q, 2H, CH2), 2,70, 3,30 (2xt, 4H, 2xCH2), 6,85, 6,92, 7,58, 7,72, 7,76 (5xm, 5H, aromatični, vinil i CONH), 10,90 (br s, 1H, CONH), 13,65 (br s, 1H, pirol NH).
MS-EIm/ z369 [M<+->1].
Primer 95
f2-( piridin- 1- il)- etinamid 5-( 5- fluoro- 2- okso- 1, 2- dihidroindol-( 3Z)- ilidenmetin- 2. 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Mućka se 2-3 dana 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iiidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (120 mg, 0,4 mmol) sa EDC HCI (96 mg, 0,5 mmol), anhidrovanim 1-hidroksi-benzotriazolom (68 mg, 0,5 mmol) i 2-(2-aminoetil-piridinom, nabavljenim iz firme Aldrich kao anhidrovani DMF (3 mL), na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša se razblaži sa 1M NaHCO"3 (1,5 mL), a zatim sa 8 mL vode.Talog sirovog proizvoda se sakupi filtriranjem, opere vodom, osuši i prečisti kristalizacijom ili hromatografijom, dajući 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)-etil]amid.
Primer 94
f2-( piridin- 1- il) etinamid 5-( 5- hloro- 2- okso- 1, 2- dihidro- indol-( 3Z)- ilidenmetil)- 2. 4-
dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilna kiselina
Postupajući kao što je opisano u prethonom Primeru, ali zamenjujući 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu sa5-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (127 mg), dobije se 5-(5-hloro-2-okso-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetiI)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]amid.
Primer 97
F2-( piridin- 1- il) etil1amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1. 2- dihidro- indol-( 3Z)- ilidenmetin- 2. 4-
dimetil- 1 /-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Postupajući kao što je opisano u Primeru 95, ali zamenjujući 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnu kiselinu sa 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilnom kiselinom (145 mg), dobije se 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-
(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1 -il)-etil]amid.
Primer 96
r2-( piridin- 1- iDetinamid 5-( 2- okso- 1, 2- dihidro- indol-( 3Z)- ilidenmetil)- 2, 4- dimetil-1/-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Postupajući kao što je opisano u Primeru 95, ali zamenjujući 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilnu kiselinu sa 5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilnom kiselinom {113 mg), dobije se 5-(2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(piridin-1-il)etil]amid.
Primeri 91. 92. 93 i 101
Postupajući kao što je opisano u Primerima 95, 94, 96 i 97, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(2-aminoetil)pirolidinom, nabavljenim iz firme Aldrich Chemical Companv, Inc., dobijaju se željena jedinjenja.
Primeri 62- 65
Postupajući kao što je opisano u Primerima 95, 94, 96 i 97, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(2-aminoetil)imidazolidi-2onom (dobijenim zagrevanjem dimetilkarbonata sa bis(2-aminoetil)aminom (2 ekvivalenta) u zatvorenom balonu, 30 min, na 150°C, a sledeći proceduru koja je opisana u U.S. Patent 2,613,212 (1950, Rohm & Haas Co.). Sirovi proizvod se prečisti na silicijum-dioksidu, koristeći kao eluent smešu hloroform-metanol-amonijak u vodi 80:25:2), dobiju se željena jedinjenja.
Primeri 66- 68 i 89
Postupajući kao što je opisano u Primerima 95, 94, 96 i 97, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 4-(2-aminotil)piperazin-1-sirćetna kiselina etilestrom (dobijenim kao što sledi: tretira se piperazin-1-sirćetna kiselina etilestar (11,22 g) sa jodoacetonitrilom (5,0 mL), u prisustvu kalijum-karbonata (6,9 g) u etilacetatu (260 mL), na 0°C. Po završetku dodavanja jodoacetonitrila (45 min), reakciona smeša se zatim 11 h meša na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša se filtrira, a filtrat ispari. Ostatak se 2 dana hidrogenuje u prisustvu kobalt-borida (dobija se iz CoCI2i natrjum-borohidrida) na sobnoj temperaturi, na 3,4 bar, u etanolu. Filtriranje, isparavanje i hromatografsko prečišćavanje, koristeći kao eluent smešu hloroform-metanol-amonijak u vodi 80:25:2, daje željeni amin (3,306 g) kao svetložuto ulje), dajući željena jedinjenja.
Primeri 69- 72
Postupajući kao što je opisano u Primerima 95, 94, 96 i 97, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(3-aminopropil)-azepin-2-onom (dobijenim u skladu sa procedurom Knaft A.,J. Chem. Soc. Perkin Trans.1999,1(6), 705-14, izuzev što se hidroliza DBU obavlja na 145°C u prisustvu litijum-hidroksida (1 h, 5ml_ DBU, 2 mL vode, 420 mg litijum-hidroksid hidrata). Prečišćavanje sirovog proizvoda je na silicijum-dioksidu, koristeći kao eluent smešu hloroform-metanol-amonijak u vodi 80:40:4, dajući 1-(3-aminopropil)-azepin-2-on (4,973 g, 87% prinos)), dobiju se željena jedinjenja.
Primeri 54- 56 i 73
Postupajući kao što je opisano u Primerima 95, 94, 96 i 97, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa N-acetil etilendiaminom (dobija se zagrevanjem smeše etilacetata i etilendiamina (1,5 ekviv.), 1,5 na 160°C u zatvorenom sudu. Vakuum destilacija daje željeni proizvod sa prinosom od 56%. N-acetiletilendiamin je takođe dostupan iz firme Aldrich), dobiju se željena jedinjenja.
Primeri 57- 60
Postupajući kao što je opisano u Primerima 95, 94, 96 i 97, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(3-aminopropil)-tetrahidro-pirimidin-2-onom (dobija se na isti način kao 1-(3-aminopropil)-azepin-2-on, po proceduri koju je dao Kraft Al, uJ. Chem. Soc. Perkin Trans.,1999,1(6), 705-14; ukratko, 1,3,4,6,7,8-heksahidro-2H-pirimido[1,2-a]pirimidin (4,939 g), litijum-hidroksid hidrat (918 mg) i 2 mL vode se zagrevaju bez rastvarača u zatvorenom sudu na 145°C, 1 h. Sirovi proizvod se prečišćava na koloni sa silicijum-dioksidom, uz hlorofom-metanol-vodeni amonijak, 80:40:4, dajući čist amin (5,265 g, 94% prinos).
Primeri 61. 74- 75 i 90
Postupajući kao što je opisano u Primerima 95, 94, 96 i 97, ali zamenjujući 2-(2-aminoetil)piridin sa 1-(2-aminoetil)-piperazin-2-onom (dobija se kao što sledi: čist terc-butildifenilsililhlorid (25 mL, 97,7 mmol) se dodaje u kapima u rastvor DBU (19,5 mL, 130 mmol) i bis(2-aminoetil)amina (4,32 mL, 40 mmol) u anhidrovanom dimetilamidu (80 mL), na sobnoj temperaturi, posle 5 min hlađenja u vodenom kupatilu. Ova smeša se 5 h meša. Doda se etilestar bromosirćetne kiseline (6,70 mL, 60 mmol), nakon hlađenja na sobnu temperaturu. Reakcija se 25 min meša, zatim ispari pod visokim vakuumom. Ostatak se rastvori u metanolu (200 mL), dodaju se KHC03(10 g) i KF (12 g, 200 mmol), pa se smeša 5 h meša na 60°C. Doda se 10 g Na2C03, meša se 10 min, ohladi i filtrira. Filtrat se ispari. Ostatak se ekstrahuje heksanima (2><250 mL). Materijal nerastvoran u heksanima se rastvori u etanolu (60 mL), filtrira i ispari. Ostatak se prečisti na koloni sa silicijum-dioksidom, uz hloroform-metanol-amonijak u vodi, 80:40:4, dajući čisti amin (4,245 g, 74% prinos)), dobiju se željena jedinjenja.
Primer 77
r2-( 4- metilpiperazin- 1- il)- etiHamid 5-( 5- fluoro- 2- okso- 1, 2- dihiro- indol- 3-
ilidenmetil)- 2, 4- dimetil- 1 /-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
U mešanu žutu, mutnu smešu 5-[5-fluoro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (90 mg), DMF (0,8 mL) i TEA (0,084 mL), u reakcionom sudu od 20 mL, doda se reagens BOP (199 mg). Smeša postane bistra za 5 min. U bistru smešu se doda 2-(4-metilpiperazin-1-il)etilamin<1>(51 mg). Nastali rastvor se preko noći meša na sobnoj temperaturi. Iz reakcionog sistema se istalože žuti proizvodi. Tankoslojna hromatografija (10% metanol u metilenhloridu) pokazuje da su se svi polazni materijali konvertovali u proizvod. Talog se izdvoji vakuum filtriranjem i 1* opere etanolom (1 mL). Ovaj talog se 20 min sonikuje u dietiletru (2 mL), pa se sakupi vakuum filtriranjem. Posle sušenja pod vakuumom, dobije se 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(4-metilpiperazin-1-il)-etiljamid (79 mg, 62% prinos).
<1>H NMR (DMSO-d6) 8 2,13 (s, 3H, CH3), 2,40, 2,42 (2><s, 6H, 2xCH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,47 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,82 (dd, J=4,5 i 8,7Hz, 1H),6,91(td,<2>J=2,4i<3>J=8,8Hz, 1H), 7,43 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J=2,8 i 9,6Hz, 1H) (aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,67 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 424,4 (M-1).
Primer 78
( 4- metilpiperazin- 1- il- etil) amid 5-( 5- hloro- 2- okso- 1, 2- dihiro- indol- 3- ilidenmetil)-2, 4- dimetil- 1 f7- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kada se sledi procedura iz Primera 77, ali se zameni 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina sa 5-(5-hloro-2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilnom kiselinom (95 mg, 0,3 mmol), dobije se 5-(5-hloro-2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin-1-il-etil)-amid (76 mg, 58%).
<1>H NMR (DMSO-de) 8 2,13 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2xS, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,84 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,0 i 8,0Hz, 1H), 7,44 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J=2,0Hz, 1 H)(aromatični i vinil), 10,98 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 440,2 (M-1).
Primer 79
( 4- metilpiperazin- 1 - il- etil) amid 5-( 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihiro- indol- 3- ilidenmetiP-2. 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kada se sledi procedura iz Primera 77, ali se zameni 5-(5-hloro-2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina sa 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilnom kiselinom, dobije se 5-(5-bromo-2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin-1-il-etil)-amid (39 mg, 54%), iz SU011670 (54 mg, 0,15 mmol)..
<1>H NMR (DMSO-de) 5 2,14 (s, 3H, CH3), 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,31 (m, 2H, CH2), 6,80 (d, J=8,0Hz, 1H), 7,23 (dd,J=2, 0i 8,0Hz, 1H), 7,44 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J=2,0Hz, 1H) (aromatični i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 486,6 (M).
Primer 81
( 4- metilpiperazin- 1 - il- etil) amid 5-( 2- okso- 1, 2- dihiro- indol- 3- ilidenmetil)- 2. 4- dimetil-1/-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kada se sledi procedura iz Primera 77, ali se zameni 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina, SU014900, sa 5-(2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1W-pirol-3-karboksilnom kiselinom, dobije se 5-(2-okso-1,2-dihiro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (4-metilpiperazin-1-il-etil)-amid, SU014903 (136 mg, 84%), iz SU012120 (112,8 mg, 0,4 mmol).
<1>H NMR (DMSO-de) 8 2,13 (s, 3H, CH3), 2,39, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,42 (m, 2H, CH2), 2,48 (m, 8H, 4xCH2), 3,30 (t, 2H, CH2), 6,86 (d, J=8,0Hz, 1H), 6,96 8t, J=7,4Hz, 1H), 7,1 (t, J=7,8Hz, 1H), 7,41 (t, J=5,4Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,76 (d, J=7,6Hz, 1H) (aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,61 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 406,6 (M-1).
Primer 80
[ 2-( 3, 5- dimetilpiperazin- 1- il- etil) amid 5- f2- okso- 1, 2- dihidro- indol-( 3Z)- ilidenmetill-2, 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
U mešanu žutu, mutnu smešu 5-[2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z9-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline (112,8 mg, 0,4 mmol), DMF (0,5 mL) i trietiamina (0,111 mL), u reakcionom sudu od 20 mL, doda se reagens BOP (265 mg). Ova smeša postane bistra za 5 min. U bistru smešu se doda 2-(2,6-dimetilpiperazin-1-il)etilamin (68,6 mg) (videti, Tapia, L. Alonso-Cires, P. Lopez-Tudanca, R. Mosquera, L. Labeaga, A. Inneraritv, A. Orjales,J. Med. Chem.1999, 42, 2870-2880). Dobijeni rastvor se preko noći meša na sobnoj temperaturi. Tankoslojna hromatografija (10% metanol u metilenhloridu) pokazuje da je sav polazni materijal konvertovan u proizvod. Reakciona smeša se ispari do suva, a zatim prečisti fleš hromatografijom (CH2CI2/CH3OH = 20/1 - 15/1), pa rekristalizacijom, dajući 5-[2-okso-1,2-dihiro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina [2-(3,5-dimetilpiperazin-1-il-etil)amid (83 mg, 50% prinos).
<1>H NMR (DMSO-de) 5 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J=11,6Hz, 2H, CH2), 2,41, 2,47 (2xS, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=10Hz, 2H), 6,97 (t, J=7,2Hz, 1H), 7,11 (t, J=7,8Hz, 1H), 7,48 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,75 (d, J=7,6Hz, 1,H) (aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 422,2 (M+1).
Primer 82
\ 2 -( 3, 5- dimetilpiperazin- 1 - il- etillamid 5- f5- fluoro- 2- okso- 1, 2- dihiro- indol-( 3Z)-ilidenmetil]- 2, 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kada se sledi procedura opisana u Primeru 77, dobije se željeno jedinjenje (60 mg, 0,2 mmol).
<1>H NMR (DMSO-de) 5 0,891, 0,907 (2xS, 6H, 2xCH3), 1,49 (t, J=10,4Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xS, 6H, 2xCH3), 2,41 (m, 2H, CH2), 2,74 (m, 4H), 3,03 (m, 2H), 6,62 (dd, J=4,5 i 8,7Hz, 1H), 6,90 (td,<2>J=2,4i<3>J=8,4Hz, 1H), 7,42 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J=4,6 i 8,4Hz, 1,H) (aromatični i vinil), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 438,4 (M-1).
Primer 83
r2-( 3, 5- dimetilpiperazin- 1- il- etillamid 5- r5- hloro- 2- okso- 1, 2- dihiro- indol-( 3Z)-ilidenmetin- 2, 4- dimetil- 1 /-/- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kada se sledi procedura Primera 80, željeno jedinjenje (31,2 mg, 34%) se dobija iz 5-[5-hloro-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilne kiseline (63 mg, 0,2 mmol).
1H NMR (DMSO-de) 6 1,15, 1,16 (2xS, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J=11,6Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=11,2Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,85 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,0 i 8,0Hz, 1H), 7,52 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,97 (d, J=2,0Hz, 1,H) (aromatični i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,63 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 456,2 (M+1).
Primer 84
f2-( 3, 5- dimetilpiperazin- 1- il- etillamid 5-[ 5- bromo- 2- okso- 1, 2- dihidro- indol-( 3Z)-ilidenmetill- 2, 4- dimetil- 1 H- pirol- 3- karboksilne kiseline
Kada se sledi procedura Primera 80, željeno jedinjenje (40 mg, 40%) se dobija iz 5-[5-bromo-2-okso-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilne kiseline (74 mg, 0,2 mmol).
<1>H NMR (DMSO-d6) 5 1,15, 1,16 (2xs, 6H, 2xCH3), 1,95 (t, J=11,6Hz, 2H, CH2), 2,40, 2,42 (2xS, 6H, 2xCH3), 2,50 (m, 2H, CH2), 3,03 (d, J=10,4Hz, 2H), 3,19 (m, 2H), 3,30 (m, 2H, CH2), 6,81 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,24 (dd,J=2,0i 8,4Hz, 1H), 7,51 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,10 (d, J=2,0Hz, 1,H) (aromatični i vinil), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 498,4 (M-1).
Biološki primeri
Sledeći testovi su upotrebljeni da se nađu ona jedinjenja koja pokazuju optimalan stepen željene aktivnosti.
A. Procedure testova
Mogu se upotrebiti sledeći testovi za odreživanje nivoa aktivnosti i efekta raznih jedinjenja iz ovog pronalska na jednu ili više PK. Slični testovi se mogu planirati za bilo koju PK, korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike. Nekoliko ovde opisanih testova se obavljaju u formatu ELISA (skraćeno od Enzvme-Linked Immunosorbent Sandvvich Assay) (videti, Voller et al., "Enzvme-Linked Immunosorbent Assay", Manual of Clinical lmmunology, 2. izdanje, Rose and Friedman, Am. Soc. of Microbilogy, VVashington, D.C., 1980, str. 359-371). Opšta procedura je sledeća: unese se jedinjenje u ćelije koji izlučuju testiranu kinazu, bilo prirodne ili rekombinantne, i posle odabranog perioda vremena, ako je test kinaza receptor, dodaje se ligand za koga se zna da aktivira dodati receptor. Ćelije se lizuju, a lizat se prebaci u bazenčiće ploče ELISA, koji su prethodno obloženi sa specifičnim antitelom koje prepoznaje substrat enzimske reakcije fosforilovanja. Komponente ne-substrata iz lizata ćelija se isperu, a količina fosforilovanja substrata se detektuje sa antitelom koje specifično prepoznaje fosfotirozin, u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje nisu dovedene u kontakt sa testiranim jedinjenjem
Ovde poželjni protokoli za obavljanje eksperimenata ELISA za specifične PK dati su niže. Međutim, prilagođavanje ovih protokola za određivanje aktivnosti jedinjenja prema drugim RTK, kao i CTK i STK, je uglavnom u okviru znanja onih koji su verzirani u stanje tehnike. Drugi ovde opisani testovi mere količinu DNA nastale kao odgovor na aktiviranje test kinaze, što je opšta mera proliferativnog odgovora. Opšta procedura za ovaj test je sledeća: jedinjenje se unese u ćelije koje izlučuju test kinazu, bilo prirodne ili rekombinantne, a posle odabranog perioda vremena, ukoliko je test kinaza receptor, dodaje se ligand za koga se zna da aktivira receptor. Posle inkubacije, najmanje preko noći, doda se agens za obeležavanje DNA, kao što je 5-bromodeoksiuridin (BrdU) ili H<3->timidin. Količina obeležene DNA se određuje ili sa anti-BrdU antitelima ili merenjem radiokativnosti, pa se poredi sa kontrolnim ćelijama koje nisu bile u kontaktu sa test jedinjenjem.
BIOTEST GST-FLK-1
Ovaj test analizira aktivnost tirozin kinaze GST-Flk-1 na poli(glu, tir)peptide.
Materijali i reagensi
1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning (Corning katalog br. 5805-96).
2. liofilizat poli(glu.tir) 4:1 (Sigma katalog br. P0275).
3. Dobijanje test-ploča obloženih sa poli(glu,tir) (pEY): obloži se 2 pg/bazenčić poli(glu,tir) (pEY) u 100 pL PBS, drži 2 h na sobnoj temperaturi, ili na 4°C preko noći. Bazenčići ploče se pokriju da se spreči isparavanje. 4. PBS pufer: za 1 L se pomeša 0,2 g KH2P04, 1,15 g Na2HP04, 0,2 g KCI i 8 g NaCI u pribl. 900 mL dH20. Kada se svi reagensi rastvore, podesi se pH na 7,2, pomoću HCI. Ukupna zapremina se dovede do 1L sa dH20.
5. PBST pufer: u 1L PBS pufera doda se 1,0 mL Tween-20.
6. TBB - pufer za blokiranje: za 1 L pomešati 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCI, 1 mL TVVEEN-20 u približno 900 mL dH20. Pomoću HCI podesi se pH na 7,2. Doda se 10 g BSA, i meša dok se ne rastvori. Ukupna zapremina se dovede na 1 L sa dH20. Filtrira se da se ukloni zrnasti materijal. 7. 1% BSA u PBS: da bi se pripremio 1x radnog rastvora, doda se 10 g BSA u približno 990 mL PBS pufera i meša dok se ne rastvori. Ukupna zapremina se podesi na 1L sa PBS puferom, pa filtrira da se ukloni zrnasti materijal.
8. 50 mM Hepes, sa pH 7,5.
9. GST-FIkcd prečišćen iz transformacije rekombinantnog bakulovirusa sf9 (SUGEN, Inc.).
10. 4% DMSO udH20.
11. 10 mM ATPudH20.
12. 40 mM MnCI2.
13. Pufer za razblaživanje kinaze (KDB): pomeša se 10 mL Hepes (pH 7,5), 1 mL 5M NaCI, 40 pL 100 mM natrijum-ortovanadata i 0,4 mL 5% BSA u dH20, sa 88,56 mL dH20. 14. NUNC, polipropilenske ploče sa 96 bazenčića i dnom oblika V, Applied Scientific, katalog br. AS-72092. 15. EDTA: pomeša se 14,12 g etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA) sa pribl. 70 mL dH20. Dodaje se 10 M NaOH dok se EDTA ne rastvori. Podesi se pH na 8,0. Podesi se ukupna zapremina na 100 mL sa dH20. 16. 1° pufer za razblaživanje antitela: pomeša se 10 mL 5% BSA u PBS puferu sa 89,5 mL TBST. 17. Anti-fosfotirozin konjugovano monoklonalno antitelo na peroksidazu rena (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech.). 18. 2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina (ABTS, Moss, katalog br. ABST) 19. 10% SDS
Procedura:
1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning se oblože sa 2 pg poliEY peptida u sterilnom PBS, kao što je opisano pod 3. u Materijalima i reagensima. 2. Ukloni se nevezana tečnost iz bazenčića obrtanjem ploče. Opere se jedanput sa TBST. Tapka se ploča na papirnoj salveti da se ukloni višak tečnosti. 3. Doda se 100 pL 1% BSA u PBS u svaki bazenčić. Inkubira se, uz mućkanje, 1 h na sobnoj temperaturi.
4. Ponovi se korak 2.
5. Natope se bazenčići sa 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 pL/bazenčić). 6. Razblaži se testirano jedinjenje sa dH20/4% DMSO na 4 puta željenu finalnu koncentraciju, u polipropileskim pločama sa 96 bazenčića. 7. Doda se 25 pL razblaženog testiranog jedinjenja u ploču ELISA. U kontrolne bazenčiće se stavi 25pL dH20/4% DMSO.
8. Doda se u svaki bazenčić 25 pL 40 mM MnCI2sa 4*ATP (2 pM).
9. Doda se 25 pL 0,5M EDTA u negativne kotrolne bazenčiće.
10. Razblaži se GST-Flk1 do 0,005 pg(5 ngVbazenčić, sa KDB.
11. Doda se 50 pL razblaženog enzima u svaki bazenčić.
12. Uz mućkanje, inkubira se 15 min, na sonoj temperaturi.
13. Zaustavi se reakcija dodavanjem 50 uL 250 mM EDTA (pH 8,0).
14. Pere se 3* sa TBST, pa se ploča tapka po papirnoj saveti da se ukloni višak tečnosti. 15. Doda se 100 pL po bazenčiću konjugata anti-fosfotirozin HRP, razblaženje 1:5000 puferom za razblaživanje antitela. Uz mućkanje, inkubira se 90 min, na sobnoj temperaturi.
16. Pranje, kao u 14. koraku.
17. U svaki bazenčić se doda 100 pL rastvora ABTS, na sobnoj temperaturi. 18. Uz mućkanje, inkubira se 10 do 15 min. Uklone se mehurići, ako ih ima. 19. Zaustavi se reakcija dodavanjem 20 pL 10% SDS u svaki bazenčić. 20. Očitavaju se rezultati na ELISA čitaču Dvnatech MR7000, sa test filterom na 410 nm i referentnim filterom na 630 nm
BIOTEST PYK2
Ovaj test se koristi za merenje aktivnosti kinazein vitro,na pyk2 čitave dužine obeležen epitopom HA (FL.pyk2-HA), u testu ELISA.
Materijali i reagensi
1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning.
2. 12CA5 monoklonalno anti-HA antitelo (SUGEN, Inc.).
3. PBS Dulbecco-ov slani pufeorvani fosfat (Gibco, katalog br. 450-1300EB). 4. TBST pufer: za 1 L se pomešaju 8,766 g NaCI, 6,057 g TRIS i 1 mL 0,1% Triton X-100, u pribl. 900 mL dH20. Podesi se pH na 7,2, a zapremina dvede na 1 L. 5. Pufer za blokiranje: za 1 L se pomešaju 100 g 10% BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g 1M NaCI i 10 mL 1% TVVEEN-20.
6. FL-pyk2-HA iz lizata ćelija sf9 (SUGEN, Inc.).
7. 4% DMSO u MilliO H20.
8. 10 mM ATP u dH20.
9. 1MMnCI2.
10. 1MMgCI2.
11. 1M ditiotreitol (DTT).
12. 10X pufer za fosforilovanjekinaze: pomešaju se 5,0 mL 1M Hepes (pH 7,5), 0,2 mL 1M MnCI2, 1,0 mL 1M MgCI2, 1,0 mL 10% Triton X-100 u 2,8 mL dH20. Neposredno pred upotrebu doda se 0,1 mL 1M DTT. 13. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića NUNC, sa dnom oblika V.
14. 500 mM EDTA u dH20.
15. Pufer za razblaženje antitela: za 100 mL, 1 mL 5% PSA/PBS i 1 mL 10% Tween-20 u 88 mL TBS. 16. HRP-konjugovani anti-Ptyr PY99, Santa Cruz Biotech. katalog br. SC-7020.
17. ABTS, Moss katalog br. ABST-2000.
18. 10%SDS.
Procedura
1. Oblože se ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning sa 0,5 pg po bazenčiću sa 12CA5 anti-HA antitelom u 100 pL PBS. Čuvaju se preko noći na 4°C. 2. Ukloni se nevezano HA antitelo iz bazenčića obrtanjem ploče. Opere se ploča sa dH20. Tapka se ploča po papirnoj salveti da se ukloni višak tečnosti. 3. U svaki bazenčić se doda 150 pL pufera za blokiranje. Inkubiranje, uz mućkanje, traje 30 min, na sobnoj temperaturi.
4. Ploča se opere sa TBS-T.
5. Lizat se razblaži u PBS (1,5 pg lizata/100 pL PBS).
6. Doda se 100 pL razblaženog lizata u svaki bazenčić. Mućka se 1 h na sobnoj temperaturi.
7. Opere se kao u koraku 4.
8. Doda se 50 pL pufera 2X kinaze na ELISA ploču, koja sadrži zahvaćeni pyk2-HA. 9. U svaki bazenčić se doda 25 pL 400 pM testiranog jedinjenja u 4%
DMSO. Za kontrolne bazenčiće se koristi samo 4% DMSO.
10. Doda se 25 pL 0,5M EDTA u bazenčiće sa negativnom kontrolom. 11. Doda se 25 pL 20 pM ATP u sve bazenčiće. Inkubira se, uz mućkanje
10 min.
12. Reakcija se zaustavi dodavanjem 25 pL 500 mM EDTA (pH 8,0), u sve bazenčiće.
13. Opere se kao u koraku 4.
14. U svaki bazenčić doda se 100 pL anti-Ptyr konjugovanog sa HRP, razblaženog 1:6.000 u puferu za razblaživanje antitela. Inkubira se, uz mućkanje, 1 h na sobnoj temperaturi.
15. Ploča se 3* opere sa TBST i 1 x sa PBS.
16. U svaki bazenčić se doda 100 pL rastvora ABST.
17. Ukoliko je potrebno, zaustavi se razvijanje reakcije dodavanjem 20 pL 10% SDS, svakom bazenčiću. 18. Očitava se ploča na ELISA čitaču, sa test filterom na 410 nm i referentnim filterom na 530 nm.
BIOTEST FGFR1
Ovaj test se koristi za merenjein vitroaktivnosti kinaze FGF1-R u ELISA testu.
Materijali i reagensi
1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Costar (Corning, katalog br. 3369).
2. Poli(glu-tir) (Sigma, katalog br. P0275).
3. PBS (Gibco, katalog br. 450-1300EB)
4. 50 mM puferski rastvor Hepes.
5. Pufer za blokiranje (5% BSA/PBS).
6. Prečišćeni GST/FGFR1 (SUGEN, Inc.).
7. Pufer za razblaživanje kinaze. Pomeša se 500 uL 1M Hepes (GIBCCO), 20 pL 5% BSA/PBS, 10 pL 100 mM natrijum-ortovanadata i
50 pL 5M NaCI.
8. 10 mM ATP.
9. ATP/MnCb, smeša za fosforilovanje: pomešaju se 20 pL ATP, 400 pL 1M MnCI2 i 9,56 mL dH20. 10. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića NUNC, sa dnom oblika V (Applied Scientific, katalog br. AS-72092).
11. 0,5 M EDTA.
12. 0,05% TBST. Doda se 500 pL TVVEEN u 1 L TBS.
13. Zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski serum (SUGEN, Inc.).
14. Kozji anti-zečji konjugat peroksidaze IgG (Biosource, katalog br.
ALI0404).
15. Rastvor ABTS.
16. Rastvor ABTS/H202.
Procedura
1. Oblože se Elisa ploče sa 96 bazenčića Costar sa 1 pg po bazenčiću
Poli(glu,tir) u 100 pL PBS. Čuvaju se preko noći na 4°C.
2. Ploče se jedanput operu sa PBS.
3. U svaki bazenčić se doda 150 pL 5% pufera za blokiranje BSA/PBS .
Inkubira se, uz mešanje, 1 h na sobnoj temperaturi.
4. Ploča se opere 2* sa PBS, zatim 1x sa 50 mM Hepes. Tapkaju se ploče po papirnoj salveti da se ukloni višak tečnosti i mehurići. 5. Na ploču se doda 25 pL 0,4 mM test jedinjenje u 4% DMSO ili sam 4%
DMSO (kontrole).
6. Razblaži se prečišćena GST-FGFR1 u puferu za razblaživanje kinaze (5 ng kinaze/50 pL KDB/bazenčić).
7. U svaki bazenčić se doda 50 pL razblažene kinaze.
8. Reakcija kinaze počinje sa dodavanjem 25 pL/bazenčić sveže pripremljenog ATP/Mn<++>(0,4 mL 1M MnCI2, 40 pL 10 mM ATP, 9,56 mL dH20, sveže pripemljen). 9. Ova reakcija kinaze je brza i mora se zaustaviti sa 25 pL 0,5M EDTA, na sličan način dodavanju ATP.
10. Ploča se 4* opere svežim TBST.
11. Pripremi se pufer za razblaživanje antitela: za 50 mL: pomešaju se 5 mL 5% BSA, 250 pL 5% mleka i 50 pL 100 mM natrijum-vanadata, pa se dovedu do finalne zapremine sa 0,05% TBST. 12. Doda se 100 pL po bazenčiću anti-fosfotirozina (1:10.000 razblažen u
ADB). Inkubira se, uz mućkanje, 1 h, na sobnoj temperaturi.
13. Opere se kao u koraku 10.
14. Doda se 100 pL po bazenčiću kozjeg anti-zečjeg konjugata peroksidaze IgF iz firme Biosource (1:6.000 razblažen sa ADB). Inkubira se, uz mućkanje, 1 h na sobnoj temperaturi. 15. Opere se kao u koraku 10, a zatim sa PBS, da se uklone mehurići i višak TVVEEN.
16. U svaki bazenčić doda se 100 pL rastvora ABTS/H202
17. Inkubira se, uz mućkanje, 10 do 20 min. Uklone se mehurići, ako ih ima. 18. Očitava se test na čitaču ELISA Dvnatch MR7000: test filter na 410 nm, a referentni filter na 630 nm.
BIOTEST EGFR
Ovaj test se koristi za određivanje aktivnosti kinaze FGF1-Rin vitro uELISA testu.
Materijali i reagensi
1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning.
2. SUM01 monoklonalno anti-EGFR antitelo (SUGEN, Ine).
3. PBS
4. Pufer TBST
5. Pufer za blokiranje: za 100 mL se pomeša 5,0 g mleka Carnation
Instant Non-fat milk<®>sa 100 mL PBS.
6. Lizat ćelija A431 (SUGEN, Inc.).
7. TBS pufer
8. TBS + 10% DMSO: za 1 L se pomešaju 1,514 g TRIS, 2,192 g NaCI i
25 mL DMSO; dovede se do ukupne zapremine 1L sa dH20.
9. ATP (adenozin-5'-trifosfat, iz konjskog mišića, Sigma, katalog br.
A.5394), 1,0 mM rastvor u dH20. Ovaj reragens treba da se priprema neposredno pred upotrebu i da se drži na ledu.
10. 1,0mMMnCI2.
11. ATP/MnCI2smeša za fosforilovanje: da se pripremi 10 mL, pomešaju se 300 pL 1 mM ATP, 500 pL MnCI2i 9,2 mL dH20. Priprema se neposredno pred upotrebu i drži se na ledu. 12. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića NUNC i sa dnom oblika V.
13. EDTA
14. Zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski serum (SUGEN, Inc.).
15. Kozji anti-zečji konjugat peroksidaze IgG (Biosource, katalog br.
ALI0404).
16. ABTS
17. 30% vodonik peroksid
18. ABTS/H202.
19. 0.2MHCI.
Postupak
1. Oblože se ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning sa 0,5 pg SUM01 u 100 mL PBS, po bazenčiću, pa se preko noći čuvaju na 4°C. 2. Ukloni se nevezani SUMOI iz bazenčića okretanjem ploče da se ukloni tečnost. Opere se 1x sa dH20. Tapka se po papirnoj salveti sa se ukloni višak tečnosti. 3. U svaki bazenčić se doda 150 pL pufera za blokiranje. Inkubira se, uz mućkanje, 30 min na sobnoj temperaturi. 4. Ploča se 3* opere dejonizovanom vodom, pa 1 * sa TBST. Tapka se ploča po papirnoj salveti da se ukloni tečnost i mehurići.
5. Razblaži se lizat u svakom bazenčiću. (7 pg lizata/100 pL PBS).
6. Doda se u svaki bazenčić 100 pL razbaženog lizata. Mućka se 1 h na sobnoj temperaturi.
7. Operu se ploče, kao pod 4. gore.
8. Doda se 120 pL TBS ELISA ploči, koja sadrža zahvaćenu EGFR.
9. Razblaži se testirano jedinjenje 1:10 u TBS, za stavljanje u bazenčić. 10. Doda se 13,5 pL razblaženog jedinjenja za testiranje na ploču ELISA.
U kontrolne bazenčiće se dodaje 13,5 pL TBS u 10% DMSO.
11. Inkubira se, uz mućkanje, 30 min na sobnoj temperaturi.
12. Doda se 15 pL mešavine za fosforilovanje u sve bazenčiće, izuzev bazenčića za negativnu kontrolu. Finalna zapremina u bazenčiću treba da je približno 150 pL, sa finalnom koncentracijom 3 pM ATP/5mM
MnCI2u svakom bazenčiću. Inkubira se, uz mućkanje, 5 min.
13. Reakcija se zaustavi dodavanjem 16,5 pL rastvora EDTA, uz mućkanje. Mućka se još 1 min.
14. Opere se 4* dejonizovanom vodom, 2* sa TBST.
15. Doda se 100 pL anti-fosfotirozina (razblažen 1:3.000 u TBST) po bazenčiću. Inkubira se, uz mućkanje, 30-45 min, na sobnoj
temperaturi.
16. Opere se kao pode 4. gore.
17. Doda se u svaki bazenčić 100 pL kozjeg anti-zečjeg konjugata peroksidaze IgG iz firme Biosource (razblaženog 1:2.000 u TBST).
Inkubira se, uz mućkanje, 30 min, na sobnoj temperaturi.
18. Opere se kao pod 4. gore.
19. Doda se 100 pL rastvora ABTS/H202u svaki bazenčić.
20. Inkubira se 5 do 10 min, uz mućkanje. Uklone se mehurići.
21. Ukoliko je potrebno, zaustavi se reakcija dodavanjem 100 pL 0,2 M HCI po bazenčiću. 22. Očitava se test na ELISA čitaču Dvnatech MR7000: test filter na 410 nm, a referentni filter na 630 nm.
BIOTEST PDGFR
Ovaj test se koristi za određivanje aktivnosti kinaze FGF1-Rin vitrou testu
ELISA.
Materijali i reagensi
1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning
2. 28D4C10, monoklonalno anti-PDGFR antitelo (SUGEN Inc.).
3. PBS.
4. Pufer TBST.
5. Pufer za blokiranje (isti kao za biotest EGFR).
6. Lizat ćelija 3T3 koje izlučuju PDGGFR-p (SUGEN Inc.)
7. Pufer TBS.
8. TBS+ 10% DMSO
9. ATP
10. MnCI2
11. Smeša pufera za fosforilovanje kinaze: za 10 mL pomešati 250 pL 1M TRIS, 200 pL 5M NaCI, 100 pL 1M MnCI2i 50 pL 100 mM Triton X-100 u dovoljnoj količini dH20, da se napravi 120 mL.
12. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića NUNC.
13. EDTA
14. Zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski serum (SUGEN Inc.)
15. Kozji anti-zečji konjugat peroksidaze IgG (Biosource, katalog br.
ALI0404).
16. ABTS
17. Vodonik-peroksid, 30% rastvor.
18. ABTS/H202
19. 0,2 M HCI
Procedura
1. Oblože se ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning, sa 0,5 pg 28D4C10 u 100 pL PBS po bazenčiću, pa se drže preko noći na 4°C. 2. Ukloni se nevezani 28D4C10 iz bazenčića okretanjem ploče da se ukloni tečnost. Opere se 1* sa dFbO. Tapka se ploča na papirnoj salveti da se ukloni višak tečnosti. 3. Doda se u svaki bazenčić 150 pL pufera za blokiranje. Inkubira se, uz mućkanje, 30 min, na sobnoj temperaturi. 4. Opere se ploča 3* sa dejonizovanom vodom, pa 1* sa TBST. Tapka se ploča na papirnoj salveti da se ukloni višak vode i mehurići.
5. Razblaži se lizat u HNTG (10 pg lizata/100 pL HNTG).
6. Doda se 100 pL razblaženog lizata u svaki bazenčić. Mućka se 60 min na sobnoj temperaturi.
7. Opere se ploča kao što je opisano u koraku 4.
8. Doda se 80 pL radnog pufera kinaze i pomeša sa ULISA pločom koja sadrži zahvaćeni PDGFR. 9. Razblaži se testirano jedinjenje 1:10 u TBS, na polipropilenskim pločama sa 96 bazenčića. 10. Doda se 10 pL razblaženog jedinjenja koje se testira na ELISA ploču.
U kontrolne bazenčiće doda se 10 pL TBS + 10% DMSO. Inkubira se, uz mućkanje, 30 min na sobnoj temperaturi. 11. Doda se 10 pL ATP direktno u svaki bazenčić, izuzev bazenčića za negativnu kontrolu (finalna zapremina u bazenčiću treba da je približno 100 pL sa 20 pM ATP u svakom bazenčiću). Inkubira se, uz mućkanje, 30 min. 12. Zaustavi se reakcija dodavanjem 10 pL rastvora EDTA u svaki bazenčić.
13. Opere se 4* sa dejonizovanom vodom, 2* sa TBST.
14. Doda se 100 pL anti-fosfotirozina (razblaženje 1:3.000 u TBST) po bazenčiću. Inkubira se, uz mućkanje, 30-45 min, na sobnoj temperaturi.
15. Oprati kao u koraku 4.
16. Doda se 100 pL kozjeg anti-zečjeg konjugata peroksidaze IgG iz firme Biosource (razblažen 1:2.000 u TBST), u svaki bazenčić. Inkubira se, uz mućkanje, 30 min na sobnoj temperaturi.
17. Oprati, kao u koraku 4.
18. Doda se 100 pL rastvora ABTS/H202u svaki bazenčić.
19. Inkubira se, uz mućkanje, 10 do 30 min. Uklone se mehurići.
20. Ukoliko je potrebno reakcija se zaustavi dodavanjem 100 pL 0,2 M HCI po bazenčiću. 21. Očitava se test na ELISA čitaču Dvnatech MR7000, sa test filterom na 410 nm i referentim filterom na 630 nm.
TEST ĆELIJSKE HER-2 KINAZE
Ovaj test se koristi za merenje aktivnosti kinaze HER-2, u celim ćelijama, u formatu ELISA.
Materijali i reagensi
1. DMEM (GIBCO, katalog br. 11965-092).
2. Serum goveđeg fetusa (FBS, GIBCO, katalog br. 16000-044), aktiviran
30 min toplotom u vodenom kupatilu, na 56°C.
3. Tripsin (GIBCO, katalog br. 25200-056).
4. L-glutamin (GIBCO, katalog br. 25030-081).
5. HEPES (GIBCO katalog br. 15630-080).
6. Medijum za gajenje: pomeša se 500 mL DMEM, 55 mL toplotom inaktiviranog FBS, 10 mL HEPES i 5,5 mL L-glutamina. 7. Medijum za izgladnjivanje: pomeša se 500 mL DMEM, 2,5 mL toplotom inaktiviranog FBS, 10 mL HEPES i 5,5 mL L-glutamina.
8. PBS
9. Ploče za mikro titraciju kulture tkiva sa 96 bazenčića, ravnog dna (Corning, katalog br. 25860). 10. Šolje za kultivisanje tkiva, prečnika15 cm (Corning, katalog br. 08757148).
11. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning
12. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića NUNC, sa dnom oblika V.
13. Costar Transfer Cartridges, za prenošenje 96 (Costar, katalog 7610).
14. SUMO 1: monoklonalno anti-EGFR antitelo (SUGEN Inc.).
15. Pufer TBST.
16. Pufer za blokiranje: 5% mleko Carnation Instant Milk<®>u PBS
17. EGF ligand: EGF-201, Shinko American, Japan. Suspendovani prah u 100 pL 10 mM HCI. Doda se 100 pL 10 mM NaOH. Doda se 800 pL PBS, pa se prebaci u Eppendorfovu epruvetu, čuva se na -20°C do
upotrebe.
18. Pufer za lizu HNTG. Za matični 5* HNTG pomešati 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCI, 500 mL glicerina i 100 mL Triton X-100, i dovoljno dH20 da se napravi 1 L rastvora. Za 1x HNTG<*>, pomešati 2 mL HNTG, 100
pL 0,1 M Na3V04, 250 pL 0,2 M Na2P207i 100 pL EDTA.
19. EDTA
20. Na3V04. Za pravljenje matičnog rastvora, pomeša se 1,84 g Na3V04sa 90 mL dH20. Podesi se pH na 10. Ključa se u mikrotalasnoj pećnici 1 min (rastvor postane bistar). Ohladi se na sobnu temperaturu. Podesi
se pH na 10. Ponavlja se ciklus zagrevanje/hlađenje sve dok pH ne
ostane na 10.
21. 200 mM Na4P207. 22. Zečji poliklonalni serum specifičan za fosfotirozin (anti-Ptyr antitelo,
SUGEN Inc.).
23. Antiserum prečišćen afinitetom, kozje anti-zečje antitelo konjugat IgG, peroksidaze (Biosource, katalog br. ALI0404).
24. Rastvor ABTS.
25. 30% rastvor vodonik-peroksida.
26. ABTS/H202.
27. 0,2 M HCI
Postupak
1. Oblože se ELISa ploče sa 96 bazenčića Corning, sa SUM01, sa 1,0 pg po bazenčiću, u PBS, 100 pL finalne zapremine po bazenčiću. Drži se preko noći na 4°C. 2. Da dan upotrebe, ukloni se pufer za oblaganje i ploča opere 3* sa dH20 i 1* sa puferom TBST. Sva ispiranja u ovom testu treba da se rade na isti način, ukoliko se drugačije ne naglasi. 3. Dodati 100 pL pufera za blokiranje u svaki bazenčić. Ploča se inkubira, uz mućkanje, 30 min na sobnoj temperaturi. Neposredno pred upotrebu oprati ploču.
4. Za ovaj test koristiti soj ćelija EGFr/HER-2 himera/3T3-C7.
5. Odabrati petrijeve šolje sa 80-90% slivanja. Sakupiti ćelije tripsinizacijom, pa 5 min centrifugirati sa 1000 o/min, na sobnoj temperaturi. 6. Resuspenduju se ćelije u medijumu za izgladnjivanje, pa se broje sa trvpan-plavim. Zahteva se preživljavanje iznad 90%. Ćelije se zasejavaju u medijum za izgladnjivanje sa gustinom 2.500 ćelija po bazenčiću, 90 pL po bazenčiću, na mikrotitarsoj ploči sa 96 bazenčića. Zasejane ćelije se inkubiraju preko noći na 37°C, u 5% C02.
7. Dva dana posle zasejavanja počinje test.
8. Rastvore se testirana jedinjenja u 4% DMSO. Uzorci se zatim dalje razblažuju, direktno na pločama, sa DMEM-medijumom za izgladnjivanje. Tipično, ovo razblaženje je 1:10 ili veće. Svi bazenčići se zatim prebace na ploču za ćelije, uz dalje razblaživanje 1:10 (10 pL uzorka i medijuma u 90 pL medijuma za izgladnjivanje). Finalna koncentracija DMSO treba da je 1% ili manja. Mogu se takođe koristiti standardna serijska razblaživanja.
9. Inkubira se u 5% C02, 2 h, na 37°C.
10. Pripremi se EGF ligand, razblaživanjem matičnog EGF (16,5 pM) u toplom DMEM na 150 nM. 11. Pripremi se svež HNTG<*>, dovoljno za po 100 pL po bazenčiću; stavi se na led. 12. Posle 2 h inkubacije sa test jedinjenjem, doda se ćelijama pripremljeni EGF ligand, 50 pL po bazenčiću, tako da je finalna koncentracija 50 nM. Bazenčići sa pozitivnom kontrolom dobiju istu količinu EGF.
Negativne kontrole ne dobijaju EGF. Inkubira se 10 min na 37°C.
13. Ukloni se testirano jedinjenje, EGF i DMEM. Ćelije se operu 1x sa
PBS.
14. Prenese se HNTG<*>u ćelije, 100 pL po bazenčiću. Stave se na led 5 min. U međuvremenu, ukloni se pufer za blokiranje sa ELISA ploča i
operu se.
15. Pomoću mikropipetora se sastružu ćelije sa ploče, a ćelijski materijal se homogenizuje ponavljanjem aspiracije i ispuštanja u pufer za lizu HNTG<*>. Lizat se prenese u obloženu, blokiranu, opranu ELISA ploču.
Ili se koristi Costar transfer cartridge za prebacivanje lizata na ploču.
16. Inkubira se, uz mućkanje, 1 h na sobnoj temperaturi.
17. Ukloni se lizat, opere. Prebaci se sveže razblaženo anti-Ptyr antitelo (1:3.000 u TBST) na ELISA ploču, 100 pL po bazenčiću.
18. Inkubira se, uz mućkanje, 30 min na sobnoj temperaturi.
19. Ukloni se anti-Ptvr antitelo, opere se. Prebaci se sveže razblaženo antitelo iz firme BIOSOURCE na ELISA ploču (1:8.000 u TBST; 100 pL
po bazenčiću).
20. Inkubira se, uz mućkanje, 30 min na sobnoj temperaturi.
21. Ukloni se antitelo iz firme BIOSOURCE, opere se. Prebaci se sveže pripremljen rastvor ABTS/H2O2 na ELISA ploču, 100 pL po bazenčiću. 22. Inkubira se, uz mućkanje, 5-10 min na sobnoj temperaturi. Uklone se mehurići ako ih ima.
23. Zaustavi se reakcija dodavanjem 200 pL 0,2 M HCI po bazenčiću.
24. Očitava se test na ELISA čitaču Dvnatech MR7000, sa test filterom na 410 nm i referentim filterom na 630 nm.
TEST CDK/CIKLIN A
Ovaj test se koristi za merenjein vitroaktivnosti kinaze serin/treonin humane cdk2/ciklin A, u Testu bliske scintilacije (SPA)
Materijali i reagensi
1. Polietilen-tereftalatne (savitljive) ploče sa 96 bazenčića VVallac (VVallac, katalog br. 1450-401).
2. Amersham redivue [y<33>0] ATP (Amersham, katalog br. AH 9968).
3. Amersham-ova poliviniltoulenska SPA zrnca obložena sa streptavidinom (Amersham, katalog br. RPNO0007). Zrnca treaba da se rekonstituišu u PBS bez magnezijuma ili kalcijuma, sa 20 mg/mL 4. Aktivirani enzimski kompleks cdk/ciklin A, prečišćen od Sf9 ćelija (SUGEN Inc.). 5. Biotinilovani peptidni substrat (Debtide). Rastvori se peptin biotin-X-PKTPKKAKKL u dH20, sa koncentracijom 5 mg(mL. 6. Smeša peptid/ATP: za 10 mL se pomeša 9,979 mL dH20, 0,00125 mL "hladnog" ATP, 0,010 mL Debtide i 0,010 mL y<33>P ATP. Konačna koncentracija po bazenčiću je 0,5 pM "hladnog" ATP, 0,1 pg Debtide i 0,2 pCi y<33>P ATP. 7. Pufer kinaze: za 10 mL se pomeša 8,85 mL dH20, 0,625 mL TRIS (pH 7,4), 0,25 mL 1M MgCI2, 0,25 mL 10% NP40 i 0,025 mL 1M DTT, dodaje se svež, pred upotrebu.
8. 10 mM ATP u dH20.
9. 1M Tris, pH podešeno na 7,4 sa HCI.
10. 1M MgCI2.
11. M DTT.
12. PBS (Gibco, katalog br. 14190-144).
13. 0,5 M EDTA.
14. Rastvor za zaustavljanje: za 10 mL se pomeša 9,25 mL PBS, 0,005 mL 100 mM ATP, 0,1 mL 0,5 M EDTA, 0,1 mL 10% Triton X-100 i 1,25 mL 20 mg/mL SPA zrnaca.
Procedura
1. Pripreme se rastvori testiranih jedinjenja u 5% DMSO, u 5* od željene finalne koncentracije Doda se 10 pL u svaki bazenčić. Za negativne kontrole koristi se 10 pL samo 5% DMSO u bazenčiće.
2. Razblaži se rastvor cdk2/ciklin A sa 2,1 mL 2* pufera kinaze.
3. Doda se u svaki bazenčić po 20 pL enzima.
4. U bazenčiće sa negativnom kontrolom doda se 10 pL 0,5 M EDTA.
5. Da počne reakcija kinaze, doda se u svaki bazenčić 20 pL smeše peptid/ATP. Inkubira se 1 h bez mućkanja.
6. Doda se u svaki bazenčić po 200 pL rastvora za zaustavljanje.
7. Drži se najmanje 10 min.
8. Vrti se ploča sa približno 2300 o/min, tokom 3-5 min.
9. Broji se ploča, korišćenjem aparata Trilux ili sličnog čitača.
TEST TRANSFOSFORILOVANJA MET
Ovaj test se koristi za merenje nivoa fosfotirozina na supstratu poli(glutamiska kiselina-tirozin (4:1)), kao načinu za identifikaciju agonista/antagonista met transfosforilovanja substrata.
Materijali i reagensi
1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning (Corning, katalog broj 25805-96).
2. Poli(glu,tir) 4:1, (Sigma, katalog br. P 0275).
3. PBS (Gibco, katalog br. 450-1300EB).
4. 50 mM HEPES
5. Pufer za blokiranje: rastvori se 25 g albumina goveđeg seruma (Sigma, katalog br. A-7888) u 500 mL PBS i filtrira kroz filter od 4 pm. 6. Prečišćeni GST fuzioni protein koji sadrži domen Met kinaze (Sugen
Inc.).
7. TBST pufer.
8. 10%DMSOuvodi(MilliQH2O).
9. 10 mM adenozin-5'-trifosfat u vodi (dH20) (Sigma, katalog br. A-5394). 10. 2x pufer za razblaživanje kinaze: za 100 mL pomešati 10 mL 1 M HEPES (pH 7,5) sa 0,4 mL 5% BSA/PBS, 0,2 mL 0,1 M natrijum-ortovanadata i 1 mL 5M NaCI u 88,4 mL dH20. 11. Reakciona smeša ATP, 4*: za 10 mL se pomeša 0,4 mL 1 M mangan-hlorida i 0,02 mL 0,1 M ATP u 9,56 mL vode. 12. Smeša za negativne kontrole, 4*: za 10 mL pomešati 0,4 mL 1M mangan-hlordia u 9,6 mL dH20. 13. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića NUNC, sa dnom oblika V,
Applied Scientic, katalog br. S-72092.
14. 500 mM EDTA.
15. Pufer za razblaživanje antitela: za 100 mL pomešati 10 mL 5% BSA/PBS, 0,5 mL mleka Carnation Instant Milk<®>u PBS i 0,1 mL 0,1 M natrijum-ortovanadata, u 88,4 mL TBST.
16. Zečje poliklonalno antifosfotirozinsko antitelo (SUGEN Inc.).
17. Kozje anti-zečje antitelo konjugovane peroksidaze rena, (Biosources,
Inc.).
18. Rastvor ABTS: Za 1 L pomešati 19,21 g limunske kiseline, 35,49 g
Na2HP04i 500 mg ABTS sa dovoljno vode da se napravi 1 L.
19. ANTS/H202: pomešati 15 mL rastvora ABTS sa 2 pL H202, pet minuta pre upotrebe.
20. 0,2 M HCI.
Prcedura
1. Oblože se ELISA ploče sa 2 pg Poli(glu-tir) u 100 pL PBS, pa se preko noći drže na 4°C.
2. Blokira se 60 min ploča sa 150 uL 5% BSA/PBS.
3. Opere se ploča 2x sa PBS, 1 x sa 50 mM Hepes puferom sa pH 7,4. 4. Doda se u sve bazenčiće 50 pL razblažene kinaze. (Prečišćena kinaza razblažena sa puferom za razblaživanje kinaze. Finalna koncentracija treba da je 10 ng/bazenčić). 5. Doda se 25 pL testiranog jedinjenja (u 4% DMSO) ili sam DMSO (4% u dH20) u kontrolne ploče.
6. Inkubira se smeša kinaza/jedinjenje 15 min.
7. Doda se 25 pL 40 mM MnCI2u bazenčiće sa negativnom kontrolom.
8. Doda se u sve druge bazenčiće 25 pL smeše ATP/MnC^ (izuzimaju se negativne kontrole). Inkubira se 5 min.
9. Doda se 25 uL 500 mM EDTA da se zaustavi reakcija.
10. Ploča se 3* opere sa TBST.
11. U svaki bazenčić se doda 100 pL zečjeg poliklonalnog anti-Ptyr, razblaženg 1:10.000 sa puferom za razblaživanje antitela. Inkubira se, uz mućkanje, 1 h, na sobnoj temperaturi.
12. Ploča se 3* opere sa TBST.
13. Razblaži se anti-zečje antitelo konjugovano sa HRP iz firme Biosource, 1:6.000 u puferu za razblaživanje antitela. Doda se 100 pL po bazenčiću, pa se nkubira se, uz mućkanje, 1 h, na sobnoj temperaturi 14. Ploča se 1 x opere sa PBS.
15. Doda se 100 pL rastvora ABTS/H2O2u svaki bazenčić.
16. Ukoliko je potrebno, zaustavi se reakcija razvijanja dodavanjem 100 pL 0,2 M HCI po bazenčiću. 17. Očitava se test na ELISA čitaču Dvnatech MR7000, sa test filterom na 410 nm i referentim filterom na 630 nm.
TEST TRANSFOSFORILOVANJA IGF-1
Ovaj test se koristi za merenje nivoa fosforilovanja u poli(glutaminska kiselina-tirozin) (4:1), za identifikaciju agonista/antagonista transfosforilovanja gst-IGF-1 substrata.
Materijali i reagensi
1. ELISA ploče sa 96 bazenčića Corning
2. Poli(glu-tir) (4:1), Sigma, katalog. Broj P 0275.
3. PBS, Gibco, katalog br. 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES
5. Pufer za blokiranje TBB: za 1L se pomešaju 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g NaCI i 10 mL 1% TVVEEN-20. 6. Prečišćen fuzioni GST protein koji sadrži domen IGF-1 kinaze (Sugen
Inc.).
7. Pufer TBST: za 1 L se pomešaju 6,057 g Tris, 8,766 g NaCI i 0,5 mL
TVVEEN-20, sa dovoljno vode do 1 L.
8. 4% DMSO u Milii-Q H20.
9. 10 mM ATP u dH20.
10. Pufer za razblaživanje kinaze, 2*: za 100 mL se pomešaju 10 mL 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 mL 5% BSA u dH20, 0,2 mL 0,1 M natrijum-ortovanadata i 1 mL 5 M NaCI, sa dovoljno vode da se napravi 100 mL. 11. Reakciona smeša ATP, 4*: za 10 mL se pomešaju 0,4 mL 1 M MnCI2i 0,008 mL 0,01 M ATP i 9,56 mL dH20. 12. Smeša za negativne kontrole, 4 *: pomeša se 0,4 mL 1 M mangan-hlorida sa 9,60 mL dH20. 13. Polipropilenske ploče sa 96 bazenčića NUNC, sa dnom oblika V.
14.500 mM EDTA u dH20.
15. Pufer za razblaživanje antitela: za 100 mL se pomešaju 10 mL 5% BSA u PBS, 0,5 mL 5% mleka Carnation Instant Non-fat Milk<®>u PBS i 0,1 mL 0,1 M natrijum-ortovanadata, u 88,4 mL TBST.
16. Zečje poliklonalno antifosfotirozinsko antitelo, Sugen, Inc.
17. Kozje anti-zečje antitelo konjugovano sa HRP, Biosource.
18. Rastvor ABTS.
19. ABTS/H202: pomešati 15 mL ABTS sa 2 pL H202, 5 min pre upotrebe. 20.0,2 M HCI u dH20.
Procedura
1. Oblože se ELISA ploče sa 2,0 pg/bazenčić sa Poli(glu-tir) 4:1 (Sigma
Po275) u 100 pL PBS. Drže se preko noći na 4°C.
2. Ploča se 1 * opere sa PBS.
3. U svaki bazenčić se doda 100 pL pufera za blokiranje TBB. Inkubira se ploča, uz mućkanje, 1 h, na sobnoj temperaturi 4. Ploča se opere 1* sa PBS, zatim 2* sa 50 mM Hepes puferom, pH 7,5. 5. Dodaje se 25 pL jedinjenja koje se testira u 4% DMSO (dobija se razblaživanjem matičnog 10 mM rastvora jedinjenja koje se testira u
100% DMSO, sa dH20) u ploču.
6. Doda se u sve bazenčiće 10,0 ng gst-IGF-1 kinaze u 50 pL pufera za razblaživanje kinaze. 7. Reakcija kinaze počinje sa dodavanjem 25 pL 4* reakcione smeše ATP u sve bazenčiće koji se testiraju i u bazenčiće sa pozitivnom kontrolom. Doda se 25 pL 4* smeše za negativne kontrole u bazenčiće sa negativnom kontrolom. Inkubira se, uz mućkanje, 10 min,
na sobnoj temperaturi.
8. Doda se 25 pL 0,5M EDTA (pH 8,0) u sve bazenčiće.
9. Ploča se 4x opere sa puferom TBST.
10. Doda se zečji poliklonalni anti-fosfotirozinski antiserum, sa razblaženjem 1:10.000 u 100 pL pufera za razblaživanje antitela, u sve
bazenčiće. Inkubira se, uz mućkanje, 1 h, na sobnoj temperaturi.
11. Ploča se opere kao u koraku 9.
12. Doda se 100 pL anti-zečjeg HRP iz firme Biosource, sa razblaženjem 1:10.000 u puferu za razblaživanje antitela, u sve bazenčiće. Inkubira
se, uz mućkanje, 1 h, na sobnoj temperaturi.
13. Ploča se opere kao u koraku 9. posle čega sledi jedno ispiranje sa
PBS, da se smanje mehurići i višak TVVEEN-20.
14. Razvijanje, dodavanjem u svaki baznečić 100 pL/bazenčić ABTS/H202. 15. Posle oko 5 min, očitava se test na ELISA čitaču, sa test filterom na 410 nm i referentim filterom na 630 nm.
TESTOVI UGRADNJE BrdU
Sledeći testovi koriste ćelije skrojene za izlučivanje odabranog receptora, pa se zatim vrednuje efekat jedinjenja na aktivnost sinteze DNA indukovane ligandom, preko određivanja ugradnje BrdU u DNA.
Sledeći materijali, reagensi i procedure su opšti za svaki od sledećih testova ugradnje BrdU. Naznačene su varijacije u specifičnim testovima.
Materijali i reagensi
1. Odgovarajući ligand.
2. Odgovarajuće skrojene ćelije.
3. Reagens za obeležavanje BrdU : 10 mM, u PBS (pH 7,4) (Boehringer
Mannheim, Nemačka).
4. FixDenat: fiksiranje rastvora (spreman za upotrebu) (Boehringer
Mannheim, Nemačka).
5. Anti-BrdU-POD: mišje monoklonalno antitelo konjugovano sa peroksidazom (Boehringer Mannheim, Nemačka). 6. Rastvor substrata TMB: tetrametibenzidin (TMB, Boehringer
Mannheim, Nemačka).
7. Rastvor za ispiranje PBS: 1 x PBS, pH 7,4.
8. Albumin, goveđi (BSA), Frakcija V prah (Sigma Chemical Co., Inc.
USA).
Opšta procedura
1. Ćelije se zasejavaju sa 8.000 ćelija/bazenčić u 10% CS, 2 mM Gln u DMEM, ploči sa 96 bazenčića. Ćelije se preko noči inkubiraju na 37°C, u 5% C02. 2. Posle 24 h ćelije se operu sa PBS, a zatim se izgladnjuju u medijumu bez seruma (0% CS DMEM sa 0,1% BSA) tokom 24 h. 3. Trećeg dana u ćelije se istovremeno dodaju odgovarajući ligand i jedinjenje koje se testira. Bazenčići sa negativnom kontrolom dobijaju ligand, ali bez jedinjenja koje se testira. Jedinjenja koja se testiraju pripremaju se u DMEM bez seruma, sa ligandom, na ploči sa 96 bazenčića, pa serijski razblažuju na 4 testirane koncentracije. 4. Polse 18 h aktivacije ligandom, doda se razblaženi reagens za obeležavanje BrdU (1:100 u DMEM, 0,1% BSA), pa se ćelije 1,5 h inkubiraju sa BrdU (finalna koncentracija je 10 pM). 5. Posle inkubacije sa reagensom za obeležavanje, dekantovanjem se ukloni medijum, a okrenute ploče se tapkaju po papirnoj salveti. Doda se rastvor FixDenat (50 pL/bazenčić), pa se ploče 45 min inkubiraju na sobnoj temperaturi u mućkalici za ploče. 6. Rastvor FixDenat se potpuno ukloni dekantovanjem i tapkanjem okrenute ploče po papirnoj salveti. Doda se mleko (5%dehidratisano mleko u PBS, 200 pL/bazenčić) kao rastvor za blokiranje, pa se ploča 30 min inkubira na sobnoj temperaturi na mućkalici za ploče. 7. Ukloni se rastvor za blokiranje dekantovanjem, pa se bazenčići 1* operu sa PBS. Doda se anti-BrdU-POD rastvor (razblaženje 1:200 u PBS, 1%BSA) (50 pL/bazenčić), pa se ploča 30 min inkubira na sobnoj temperaturi na mućkalici za ploče. 8. Konjugat antitela se potpuno ukloni dekantovanjem i ispiranjem 5* sa
PBS, pa se ploča suši okretanjem ii tapkanjem po papirnoj salveti. 9. Doda se rastvor substrata TBM (100 pL/bazenčić), pa se 20 min inkubira na sobnoj temperaturi na mućkalici za ploče, dok se boja dovoljno ne razvije za fotometrijsku detekciju. 10. Meri se absorbancija uzoraka na 410 nm (načinom "dvojne talasne dužine" sa očitavanjem na filter od 490 nm, kao referentnoj talasnoj dužini), na čitaču ELISA Dvnatech.
TEST UGRADNJE BrdU INDUKOVAN SA EGF
Materijali i reagensi
1. Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan)
2. 3T3/EGFRC7.
TEST UGRADNJE BrdU INDUKOVAN SA EGF I POKRENUT SA Her-2
Materijali i reagensi
1. Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan)
2. 3T3/EGFr(Her2/EGFr (EGFr sa domenom Her-2 kinaze).
TEST UGRADNJE BrdU INDUKOVAN SA EGF I POKRENUT SA Her-4
Materijali i reagensi
1. Mišji EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan)
2. 3T3/EGFr(Her4/EGFr (EGFr sa domenom Her-4 kinaze).
TEST UGRADNJE BrdU INDUKOVAN SA PDGF
Materijali i reagensi
1. Humani PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Nemačka)
2. 3T3/EGFRc7.
TEST UGRADNJE BrdU INDUKOVAN SA FGF
Materijali i reagensi
1. Humani FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA)
2. 3T3c7/EGFr.
TEST UGRADNJE BrdU INDUKOVAN SA IGF1
Materijali i reagensi
1. Humani rekombinantni (G511, Promega Corp. USA)
2. 3T3/IGF1r.
TEST UGRADNJE BrdU INDUKOVAN SA INSULINOM
Materijali i reagensi
1. Insulin, kristalni, goveđi, cink (13007, Gibco BRL, USA)
2. 3T3/H25.
TEST UGRADNJE BrdU INDUKOVAN SA HGF
Materijali i reagensi
1. Rekombinantni humani HGF (Katl. Br. 249-HG, R&D Svstems Inc. USA)
2. BxPC-3 ćelije (ATCC CRL-1687).
Procedura
1. Ćelije se zasejavaju sa 9.000 ćelija/bazenčić u RPMI 10% FBS na ploči sa 96 bazenčića. Ćelije se preko noći inkubiraju na 37°C, u 5% C02. 2. Polse 24 h, ćelije se operu sa PBS, pa se izgladnjuju u 100 pL medijuma bez seruma (RPMI sa 0,1% BSA) tokom 24 h. 3. Trećeg dana se ćelijama doda 25 pL rastvora koji sadrži ligand (priprema se kao 1 pg/mL u RPMI, sa 0,1% BSA; finalna koncentracija HGF je 200 ng/mL) i testirano jedinjenje. Bazenčići sa negativnom kontrolom dobiju 25 pL RPMI bez seruma, samo sa 0,1% BSA; ćelije za pozitivnu kontrolu dobijaju ligand (HGF), ali ne jedinjenje koje se testira. Testirana jedinjenja se dobijaju u koncentraciji 5* većoj od njihove finalne koncentracije u RPMI bez seruma, sa ligandom, na pločama sa 96 bazenčića, pa se serijski razblažuju dajući 7 koncentracija za testiranje. Tipično, najveća konačna koncentracija jedinjenja koje se testira je 100 pM, a koriste se razblaženja sa korakom 1:3 (tj. finalni opseg koncentracija jedinjenja koje se testira je 0,137-100 pM). 4. Posle 18 h aktiviranja liganda u svaki bazenčić se doda 12,5 pL razblaženog reagensa za obeležavanje BrdU, pa se ćelije inkubiraju 1 h sa BrdU (finalna koncentarcija 10 pM).
5. Isto kao u opštoj proceduri.
6. Isto kao u opštoj proceduri.
7. Rastvor za blokiranje se ukloni dekantovanjem, a bazenčići se operu 1* sa PBS. Doda se rastvor anti-BrdU-POD (razblaženje 1:100 u PBS, 1% BSA) (100 pL/bazenčić), pa se ploča inkubira 90 min na sobnoj temperaturi, na mućkalici za ploče.
8. Isto kao u opštoj proceduri.
9. Isto kao u opštoj proceduri.
10. Isto kao u opštoj proceduri.
TEST HUV-EC-C
Ovaj test se koristi za merenje aktivnosti jedinjenja protiv PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF ili Flk-1/KDR, a sve ih prirodno izlučuju ćelije HUV-EC.
Nulti dan
1. Ćelije HUV-EC-C se operu i tripsinizuju (humane ćelije endotelijuma pupčane vene (American Type Culture Collection, Catalogue No. 1730 CRL). Operu se 2* sa Dulbecco-vim slanim fosfatnim puferom (D-PBS, dobijen iz Gibco BRL, katalog br. 14190-029), za oko 1 mL/10 cm<2>kulture tkiva u balonu. Tripsinizuje se 0,05% tripsin-EDTA u rastvoru za disocijaciju ćelije bez enzima (Sigma Chemical Company, katalog br. C-1544). Rastvor 0,05% tripsina se pravi razblaživanjem 0,25% tripsin/1mM EDTA (Gibco, katalog br. 25200-049) u rastvoru za disocijaciju ćelija. Tripsinizuje se sa oko 1 mL/25-30 cm<2>kulture tkiva u balonu, tokom 5 min, na 37°C. Kada se ćelije odvoje od balona, doda se jednaka zapremina test medijuma, pa se prenese u sterilne epruvete za centrifugiranje od 50 mL (Fisher Scientific,katalog br. 05-539-6). 2. Ćelije se operu sa oko 35 mL test medijuma u sterilnoj epruveti za centrifugiranje od 50 mL, dodavanjem test medijuma, centrifugiranjem 10 min sa približno 200*g, aspiriranjem bistrog sloja i
resuspendovanjem sa 35 mL D-PBS. Pranje se ponovi još dva puta sa D-PBS, resuspenduju se ćelije u oko 1 mL test medijuma/15cm<2>
kulture tkova u balonu. Test medijum se sastoji od medijuma F12K (Gibco BRL, katalog br. 21127-014) i 0,5% toplotom inaktiviranog sreuma goveđeg fetusa. Ćelije se broje sa aparatom Coulter Counter<®>
(Coulter Electronics, Inc.) pa se dodaje test medijum ćelijama da se dobije koncentracija (0,8-1,0)*10<5>ćelija/mL.
3. Ćelije se dodaju na ploču sa 96 bazenčića sa ravnim dnom, po 100 pL/bazenčić ili (0,8-1,0)*10<4>ćelija/bazenčić, pa se inkubiraju -24 h, na
37°C, u 5% C02.
Prvi dan
1. Pravi se dvostruka test titracija jedinjenja u odvojenim pločama sa 96 bazenčića, obično od 50 pM pa naniže, do 0 pM. Koristi se isti test medijum, kao što je pomenuto u 0. danu, korak 2, gore. Titracije se obavljaju dodavanjem 90 pL/bazenčić testiranog jedinjenja sa 200 pM (4* finalna koncentracija) u gornji bazenčić određene kolone na ploči. Pošto je matično testirano jedinjenje obično 20 mM, 200 pM koncentracija leka sadrži 2% DMSO.
U test medijumu razblaživač čini do 2% DMSO (12K + 0,5% serum goveđeg fetusa) i koristi se za razblaživanje testiranog jedinjenja u titracijama, kako bi se u testiranom jedinjenju održala konstantna koncentracija DMSO. U preostale bazenčiće u koloni doda se ovaj razblaživač, 60 pL/bazenčić. Uzme se 60 pL iz 120 pL 200 pM razblaženja testiranog jedinjenja u gornji bazenčić kolone, pa se pomeša sa 60 pL u drugom bazenčiću kolone. Uzme se 60 pL iz ovog bazenčića i pomeša sa 60 pL u trećem bazenčiću te kolone i tako dalje, dok se dvostruke titracije ne kompletiraju. Kada se pomeša predposlednji bazenčić, uzme se 60 pL od 120 pL u tom bazenčiću i odbaci se. Poslednji bazenčić se ostavi sa 60 pL DMSO/razblaživača medijuma, kao kontrola koja ne sadrži jedinjenje koje se testira. Načini se 9 kolona titrisanog testiranog jedinjenja, dovoljno za triplikat svakog bazenčića: (1) VEGF (dobijen iz Pepro Tech Inc., katalog br. 100-200, (2) faktor rasta ćelije endotelijuma (ECGF) (poznat takođe kao faktor rasta kiselog fibroplasta, ili aFGF) (dobijen iz Boehringer Mannheim Biochemica, katalog br. 1439 600), ili (3) humani PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Nemačka) i kao kontrola test medijum. ECGF dolazi kao preparat sa natrijum-heparinom. 2. Prebaci se 50 pL/bazenčić razblaženja test jedinjenja na test ploče sa 96 bazenčića, koje sadrže (0,8-1,0)*10<4>ćelija/100 pL/bazenčić ćelija HUV-EC-C iz 0. dana, pa se inkuibiraju -2 h na 37°C, pri 5% CO2. 3. U triplikatu, doda se 50 pL/bazančić 80 pg(ml_ VEGF, 20 ng/mL ECGF, ili kontrolni medijum u svako stanje testiranog jedinjenja. Kod testiranih jedinjenja koncentracije faktora rasta su 4* od željenih finalnih koncentracija. Koristi se test medijum iz 0. dana, korak 2., da se doteraju koncentracije faktora rasta. Inkubira se približno 24 h na 37°C, u 5% C02. Svaki bazenčić će imati 50 pL razblaženja testiranog jedinjenja, 50 pL faktora rasta ili medijuma i 100 pL ćelija, što ukupno čini 200 pL/bazenčić. Dakle, 4* koncetracije test jedinjenja i faktora rasta postaju 1 x, kada se sve doda u bazenčić.
Drugi dan
1. Doda se<3>H-timidin (Amersham, katalog br. TRK-686), sa 1 pCi/bazenčić
(10 pL/bazenčić rastvora od 100 pCi/mL, napravljenog u RPMI medijumu + 10% toplotom inaktiviranog seruma goveđeg fetusa), pa se inkubira -24 h na 37°C, u 5% C02. RPMI se dobija iz firme Gibco BRL, katalog br. 11875-051.
Treći dan
1. Ploče se preko noći drže u frizeru na -20°C.
Četvrti dan
Otkrave se ploče i ćelije sakupe sa skupljačem za ploče sa 96 bazenčića (Tomtec Harvester 96<®>) na filter papir (VVallac, katalog br. 1205-401), pa se impulsi broje na tečnom scintilacionom brojaču VVallac Betaplate™.
Tabela 3 pokazuje rezultate biološkog testiranja nekih reprezentativnih jedinjenja iz ovog pronalaska. Rezultati se daju kao vrednosti IC50u mikromolarnim (pM) koncentracijama jedinjenja koje se testira, koje izazivaju 50% promenu aktivnosti targetirane PKT, u poređenju sa aktivnošću PKT u kontroli kojoj je testirano jedinjenje dodato. Specifično, pokazani rezultati ukazuju na koncentraciju testiranog jedinjenja potrebnu da izazove 50% smanjenja aktivnosti targetirane PTK. Biotestovi koji se ili se mogu koristiti za vrednovanje jedinjenja, detaljno su opisani u nastavku.
MODELIIN VIVONA ŽIVOTINJAMA
Modeli ksenografta na životinjama
Svojstvo humanih tumora da rastu kao ksenografti u atimičnim miševima (npr. Nalb/c, nu/nu), pruža koristanin vivomodel za izučavanje biološkog odgovora na terapije humanih tumora. Od prve uspešne ksenotransplantacije humanih tumora na atimične miševe (Rvgaard i Povišen,Acta Pathol. Microbiol. Scand.1969, 77, 758-760), transplantirani su i uspešno rasli na golim miševima mnogi različiti sojevi ćelija tumora (npr. dojke, pluća, genitourinarni, gastro-intestinalni, glave i vrata, glioblastom, kosti i maligni melanomi). Sledeći testovi se mogu koristiti za određivanje nivoa aktivnosti, specifičnosti i efekta različitih jedinjenja iz ovog pronalska. Za vrednovanje jedinjenja korisna su tri opšta tipa testova: ćelijsko/katalitički, ćelijsko/biološki iin vivo.Predmet ćelijsko/katalitičkih testova je određivanje efekta jedinjenja na sposobnost TK da fosforiluju tirozine na poznatom substratu u ćeliji. Predmet ćelijsko/bioloških testova je određivanje efekta jedinjenja na biološki odgovor stimulisan sa TK u ćeliji. Predmetin vivotestova je određivanje efekta jedinjenja određenog poremećaja, kao što je kancer, na modelu životinje.
Pogodni sojevi ćelija za eksperimente sa subkutanim ksenograftom su C6 ćelije (gliom, ATCC # CCI 107), A375 ćelije (melanom, ATCC # 1619), A431 ćelije (epidermoidni karcinom, ATCC # CRL 1555), Calu 6 ćelije (pluća, ATCC # HTB 56), PC3 ćelije (prostata, ATCC # CRL 1435), SKOV3TP5 ćelije i NIH 3T3 fibroplasti dobijene genetskim inžinjeringom da hiperizlučuju EGFR, PDGFR, IGF-1R ili bilo koju drugu testiranu kinazu. U obavljanju eksperimenata sa ksenograftima može se koristiti sledeći protokol: Iz Simonsen Laboratories (Gilrov, CA) dobijene su ženke miševa (BALB/c, nu/nu). Sve životinje se čuvaju u uslovima čiste-sobe, u kavezima Micro-isolator, obloženih sa Alpha-dri bedding. Dobijaju hranu za glodare i vodu bez ograničenja.
Sojevi ćelija se gaje u odgovarajjućem medijumu (na primer, MEM, DMEM, Ham-ov F10 ili Ham-ov F12 sa 5-10% seruma goveđeg fetusa (FBS) i 2 mM glutamina (GLN)). Svi medijumi za ćelijske kulture, glutamin i serum goveđeg fetusa su poručivani iz firme Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), ukoliko se drugačije ne naglasi. Sve ćelije se gaje u vlažnoj atmosferi sa 90-95% vazduha i 5-10% C02, na 37°C. Svi sojevi ćelija se rutinski subkultivišu dva puta nedeljno i negativni su na mikoplazmu, što se određuje postukom Mvcotest (Gibco).
Ćelije se sakupljaju pri skoro potpunom slivanju sa 0,05% tripsin-EDTA, a peletiraju se sa 400*g, tokom 10 min. Pelete se resuspenduju u sterilnom PBS ili
medijumima (bez FBS) u određenoj koncentraciji, pa se ćelije implantiraju u zadnji deo slabine miševa (8-10 miševa u grupi, (2-10)*10<6>ćelija/životinja). Rast tumora se meri tokom 3- 6 nedelja, korišćenjem kalibrisanog šestara. Zapremine tumora se izračunavaju kao proizvod dužinaxvisinaxširina, ukoliko nije drugačije naznačeno. Vrednosti P se izračunavaju korišćenjem Student-ovog t-testa. Testirana jedinjenja u 50-100 pL tečnog nosača (DMSO ili VPD:D5W), daju se IP injekcijom, sa različitim koncentracijama, obično sa početkom dan posle implantacije.
Model invazije tumora
Razvijen je sledeći model invazije tumora koji se može koristiti za vrednovanje terapeutske vrednosti i efikasnosti jedinjenja koja su identifkovana da selektivno inhibiraju KDR/FLK-1 receptor.
Procedura
Goli miševi (ženke), stari 8 nedelja (Simonsen Inc.) se koriste kao eksperimentalne životinje. Implantacija ćelija tumora se može obaviti u vratnom delu laminarnim protokom. Za anesteziju ordinira se intraperitonealno koktel Ksilazin/Ketamin (100 mg/kg ketamina i 5 mg/kg ksilazina). Obavlja se rez po sredini da se priđe abdominalnoj šupljini (približno 1,5 cm dužine), da bi se injektiralo 10<7>ćelija tumora u zapremini od 100 pL medijuma. Ćelije se injektiraju ili u duodenalni režanj pankreasa ili pod serozu debelog creva. Peritoneum i mišići se zatvore koncem 6-0 kontinualnim ušivanjem rane, a koža se zatvori pomoću kopči za rane. Životinje se svakodnevno osmatraju.
Analiza
Posle 2-6 nedelja, zavisno od opažanja debljine životinja, miševi se žrtvuju, a lokalne metastaze tumora na razne organe (pluća, jetra, mozak, stomak, slezina, srce, mišići) se izvade i analiziraju (merenja veličine tumora, stepena invazije, imunohemije, određivanja hibridizacijein situ,itd.)
Ovaj test se koristi za detekciju stepena fosforilovanja c-kit tirozina.
Ćelije M07E (humana akutna mieloidna leukemija) se serumski izgladnjuju preko noći, u 0,1% serumu. Ćelije se prethodno tretiraju sa jedinjenjem (paralelno sa serumskim izgladnjivanjem), pre stimulacije ligandom. Ćelije se stimulišu 15 min sa 250 ng/mL rh-SCF. Nakon stimulacije, ćelije se lizuju i imunotalože sa anti-c-kit antitelom. Sadržaji fosfotirozina i proteina se određuju metodom VVestern blotting.
TEST PROLIFERACIJE MTT
Ćelije M07E se serumski izgladnjuju i prethodno tretiraju sa jedinjenjem, kao što je opisano u eksperimentima fosforilovanja. Ćelije se zaseju sa oko 4*10<5>ćelija/bazenčič, u šolji sa 96 bazenčića, u 100 pL RPMI + 10% seruma. Doda se rh-SCF (100 ng/mL) pa se ploča inkubira 48 h. Posle 48 h doda se 10 pL rastvora 5 mg/mL MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid]. Doda se kiseli izopropanol (100 pL 0,04 M HCI u izopropanolu), pa se meri optička gustina na talasnoj dužini 550 nm.
TEST APOPTOZE
Ćelije M07E se inkubiraju ±SCF i ±jedinjenje, u 10% FBS, sa rh-GM-CSF (10 ng/mL) i rh-IL-3 (10 ng/mL). Uzorci se testiraju posle 24 i 48 h. Da bi se merio aktivirani caspase-3, uzorci se operu sa PBS i permeabilizuju sa 79% etanolom ohlađenim u ledu. Ćelije se zatim boje sa PE-konjugovanim poliklonalnim zečjim anti-aktivnim caspase-3, pa analiziraju pomoću FACS. Da bi se merila otcepljena PARP, uzorci se lizuju i analiziraju metodom VVestern blotting, sa anti-PARP antitelom.
Dodatni testovi
Mogu se koristiti i dodatni testovi za vrednovanje jedinjenja iz ovog pronalaska, bez ograničavanja, test bio-flk-1, test himernog receptora na celim ćelijama za EGF receptor-HER2, test bio-src, test bio-lck i test koji meri funkciju fosforilovanja raf. Protokoli za svaki od ovih testova se mogu naći u U.S: Application Ser. NO. 09/099,842, koja je ovde priključena, zajedno sa crtežima, kroz citat.
Merenia toksičnosti ćelije
Terapeutska jedinjenja treba da su snažnija u inhibiranju receptora aktivnosti tirozin kinaze, nego u ispoljavanju toksičnih efekata. Mera efikasnosti i toksičnosti ćelija jednog jedinjenja se može dobiti određivanjem terapeutskog indeksa, tj. IC50/LD50, gde IC50predstavlja dozu potrebnu sa se postigne 50% inhibicije, koja se može meriti upotrebom standardnih tehnika, kao što su one koje su ovde opisane, a LD50je doza koja dovodi do 50% toksičnosti, koja se takođe može meriti standardnim tehnikama (Mossman,J. Immunol. Methods,1983, 65, 55-63), zatim merenjem oslobođene količine LDH (Korzeniewski i Callewaert, J.Immunol. Methods1983, 64, 313; Decker i Lohmann-Matthes,J. Immunol. Methods1988, 115, 61) ili merenjem letalne dioze na modelima životinja. Poželjna su jedinjenja sa velikim terapeutskim indeksom. Terapeutski indeks treba daje veći od 2, poželjno bar 10, a poželjnije bar 50.
B. Primer rezultata ćelijskog testa korišćenjem ( 2- dietil- amino- etil) amida 5-( 5-fluoro- 2- okso- 1, 2- dihidroindol- 3- ilidenmetil)- 2, 4- dimetil- 1/-/- pirol- 3- karboksilne
kiseline
Da bi se potvrdila moć 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 35), detektovana u biohemijskim testovima (v. gore), svojstvo pomenutog jedinjenja da inhibira RTK fosforilovanje zavisno od liganda, vrednovana je u testovimana bazi ćelija, korišćenjem NIH-3T3 mišjih ćelija skrojenih inžinjeringom da hiperizlučuju Flk-1 ili humani PDGFR-p. Pokazalo se da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) inhibira VEGF-zavisno fosforilovanje Flk-1 tirozina sa vednošću IC50od približno 0,03 pM. Ova vrednost je slična vrednosti 0,009 pM, koja je određena za inhibiranje Flk-1 sa 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amidm (Jedinjenje 35), određenom u biohemijskim testovima. Ovo pokazuje da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/- pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) lako prodire u ćelije. Saglasno sa biohemijskim podacima (v. gore), pokazuje se da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) ima uporednu aktivnost protiv Flk-1 i PDGFR-p, jer je takođe pronađeno da inhibira fosforilovanje zavisno od PDGFR receptora u ćelijama, sa vrednošću IC50približno 0,03 pM. Svojstvo 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 35) da inhibira c-kit, blisko srodnu RTK koja vezuje faktor stem ćelija (SCF), određena je korišćenjem ćelija M07E, koje izlučuju taj receptor. U ovim ćelijama 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira fosforilovanje c-kit, zavisno od SCF, sa vrednošću IC50od 0,01-0,1 pM. Ovo jedinjenje inhibira takođe fosforilovanje c-kits stimulisano sa SCF kod blasta akutne mieloidne leukemije (AML), izolovanih iz periferne krvi pacijenata.
Pored toga, testiranje svojstva 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 35) da inhibira fosforilovanje receptora u ćelijama zavisno od liganda, njegov efekat na proliferativne odgovore ćelija zavisne od liganda, ispitivan je takođein vitro(videti Tabelu 4). U ovim studijama, ćelije koje su preko noći mirovale serumskim izgladnjivanjem, izazvane su da učestvuju u sintezi DNA, nakon dodavanja odgovarajućeg mitogenog liganda. Kao što pokazuje Tabela 4, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) inhibira proliferaciju indukovanu sa PDGF ćelija NIH-3T3, koje hiperizlučuju PDGFRp ili PDGFRa, sa vrednostima IC500,031 i 0,069 pM, respektivno, a proliferaciju indukovanu sa SCF ćelija M07E, sa vrednošću IC50od 0,07 pM.
Kao što je pokazano u Tabeli 4, postoji opšta saglasnost biohemijskih i ćelijskih aktivnosti 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 35), u prilog zaključku da ovo jedinjenje prolazi kroz ćelijsku membranu. Dalje, može se zaključiti da su ćelijski odgovori na rezultat aktivnosti Jedinjenja 35 protiv naznačenog cilja. Nasuprot, kada se testira u prisustvu kompletnog medijuma za uzgajanjein vitro,potrebne su znatno više koncentracije 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 /-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 35) (>10 pM) za inhibiranje rasta ćelija raznih humanih tumora (videti Tabelu 5). Ovo ukazuje da jedinjenje ne inhibira direktno rast ovih ćelija sa koncentracijama potrebnim za inhibiranje fosforilovanja receptora zavisnog od liganda i proliferaciju ćelija.
Ukratko, rezultati prikazani u Tabeli 5 su dobijeni inkubiranjem ćelija 48 h u kompletnom medijumu za uzgajanje, u prisustvu serijskih razblaženja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 f/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida. Na kraju perioda rasta određivan je relativni broj ćelija. Vrednosti JC50su izračunavane kao koncentracija jedinjenja koja inhibira rast ćelija za 50%, relativno prema netretiranim ćelijama. Vrednosti LD50su izračunavane kao koncentracija koja izaziva 50% smanjenje u broju ćelija, relativno prema onima na početku eksperimenta.
Relevantniji test na bazi ćelija, u kome se vrednuje anti-angiogeni potencijal 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna
kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 35), je test mitogenezein vitrokoji koristi ćelije endotelijuma vene humanog pupka (HUVEC) kao model sistem proliferacije ćelija endotelijuma presudan za proces angiogeneze. U ovom testu, mitogeni odgovor, meren kao porast sinteze DNA, je indukovan u serumski izgladnelim ćelijama HUVEC, nakon dodavanja VEGF ili FGF. U ovim ćelijama, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) inhibira mitogene odgovore indukovane sa VEGF ili FGF na način koji zavisi od doze, sa vrednostima IC50od 0,004 pM i 0,7 pM, respektivno, kada je jedinjenje bilo prisutno tokom čitavog 48 satnog eksperimenta.
Ukratko, gore pomenuti rezultati su dobijeni korišćenjem serumski izgladnjivanih HUVEC, koje su bile inkubirane sa mitogenim koncentracijama VEGF (100 ng/mL) ili FGF (30 ng/mL), uz prisustvo serijskih razblaženja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietflamino-etil)amida (Jedinjenje 35), tokom 24 h. Mitogeni odgovor tokom sledećih 24 h, u prisustvu liganda i inhibitora, kvantitativno je određen merenjem sinteze DNA, zasnovane na ugrađivanju bromodeoksiuridina u ćelijsku DNA.
U odvojenim eksperimentima, jedinjenje 35 inhibira fosforilovanje ERK<1>/4 (p42744MAP kinaza) zavisno od VEGF, početni nizlazni cilj Flk-1/KDR, na način zavisan od doze. Pokazano je takođe, da je inhibitorska aktivnost jedinjenja 35 dugotrajna u ovom sistemu; Inhibiranje fosforilovanja ERKVzzavisno od VEGF, tokom čitavih 48 h nakon uklanjanja 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1AY-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 35) iz medijuma, koje sledi kratkotrajno (2h) izlaganje mikromolarnim koncentracijama ovog jedinjenja.
Opaženo je da je VEGF značajan faktor za preživljavanje ćelija endotelijuma. Pošto 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) inhibira mitogeni odgovor HUVEC koji zavisi od VEGF, ispitan je efekat ovog jedinjenja na preživljavanje HUVEC. U tim eksperimentima, korišćeno je cepanje substrata caspase-3 poli-ADP-ribozil polimeraze (PARP), za očitavanje apoptoze. Kultivisane HUVEC pod uslovima bez seruma, tokom 24 h, pokazale su znatne nivoe cepanja fragmenta PARP. Ovo je uglavnom sprečeno dodavanjem VEGF u ćelijski medijum, što ukazuje sa VEGF deluje kao faktor preživljavanja u ovom testu. Pokazano je da 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1/-V-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) inhibira signalizaciju LDR. U skladu sa tim, 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-i!idenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 80) inhibira preživljavanje HUVEC koje je posredovano sa VEGF, na način koji zavisi od doze. Dakle, ovi podaci ukazuju da jedinjenje 35 indukuje apoptozu ćelija endotelijuma u kulturi, u prisustvu VEGF.
C. Izučavanja efikasnostiin vivo
i. Efikasnost protiv utvrđenog ksenografta tumora
Efikasnost 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 /-/-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amida (Jedinjenje 35)in vivo,izučavana je na modelima subkutanog (SC) ksenografta korišćenjem humanih ćelija tumora implantiranih u region slabine atimičkih miševa. Nakon implantacije, sačekano je da tumori dostignu domenzije od 100-150 mm<3>, pre početka oralnog tretmana sa ovim jedinjenjem.
Dnevno oralnu aministraciju jedinjenja 35 izaziva inhibiciju zavisnu od doze rasta tumora A431, a tretman je počet pošto je tumor narastao do veličine od 400 mm<3>. Statistički signifikantna (P<0,05) inhibicija rasta tumora opažena je sa dozama od 40 mg/kg/dan (74% inhibicija) i 80 mg/kg/dan (84% inhibicija) (videti Tabelu 6). U preliminarnim eksperimentima, veća doza (160 mg/kg/dan) ovog jedinjenja nije bila efikasnija protiv utvrđenih tumora A431, nego doza od 80 mg/kg/dan. Pored toga, miševi tretirani sa dozom ovog jedinjenja od 160 mg/kg/dan su gubili telesnu težinu, što ukazuje da se viša doza ne podnosi dobro. Slični rezultati su dobijeni u eksperimentu u kome je tumorima A431 dopušteno da dostignu veličinu 100 mm<3>(Videti Tabelu 5). U ovom drugom eksperimentu, do potpunog povlačenja tumora došlo je kod šest od osam životinja, tretiranih 21 dan sa 80 mg/kg/dan. Kod ovih šest životinja tumori nisu ponovo počeli da rastu tokom 110-to dnevnog perioda opažanja, posle završetka tretmana. Kod dve životinje, kod kojih su tumori ponovo počeli da rastu do velikih dimenzija (2000-3000 mm<3>), došlo je do povlačenja tumora kao odgovor na drugu rundu tretmana sa jedinjenjem 80. Značajno je da je u svim eksperimentima efikasnosti 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) sa dozom od 80 mg/kg/dan dobro podnošen, čak i kada je doziranje bilo kontinualno tokom više od 100 dana.
Ukratko, rezultati pokazani u Tabeli 6 su dobijeni korišćenjem ćelija A431 (0,5^10<6>ćelija/miš), implantiranih SC u zadnji deo slabine atimičkih miševa. Dnevno je oralno ordiniran 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35), u tečnom nosaču na bazi Cremophore-a ili samo tečni nosač za kontrolne, počev od kada su tumori dostigli naznačenu prosečnu zapreminu. Tumori su mereni kalibracionim šestarima, a zapremina tumora izračunavana kao proizvod dužina*širinaxvisina. P-vrednosti su izračunavane poređenjem veličine tumora životinja tretiranih sa jedinjenjem 35 (n=8), prema onim životinjama koje su tretirane sa tečnim nosačem (n=16), poslednjeg dana eksperimenta, korišćenjem dvostrukog t-testa Student-a.
Efikasnost jedinjenja35 protiv utvrđenih ksenografta humanih tumora različitog porekla je određena korišćenjem Colo205 (karcinom debelog creva), SF763T (gliom) i NCI-H460 (karcinom pluća) (videti Tabelu 7). Ovi eksperimenti su obavljeni korišećnjem jedinjenja 5-{5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1W-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35), ordiniranog oralno sa dozom od 80 mg/kg/dan; dozom koja je bila efikasna i dobro se podnosila.
U gore pomenutim eksperimentima jedinjenje 35 se ordinira oralno jedanput na dan sa 80 mg/kg u tečnom nosaču na bazi Cremophor-a, tek kada tumor dostigne naznačenu veličinu. Procenat inhibicije je poređen sa kontrolnom grupom koja je tretirana sa tečnim nosačem, i izračunavan je po završetku eksperimenata. P-vrednosti su izračunavane poređenjem veličine tumora životinja tretiranih sa jedinjenjem, prema veličinama tumora onih životinja koje su tretirane sa tečnim nosačem, korišćenjem dvostrukog t-testa Student-a.
Mada 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amid (Jedinjenje 35) inhibira rast svih tipova tumora pokazanih u Tabeli 7, postoji razlika u odgovoru na razne modele ksenografta. Specifično, rast NCI-H460 i SF763T tumora je bio zaustavljen ili veoma usporen, dok su se tumori Colo205, kao i tumori A431, povukli, kada su tretirani sa 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroinđol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirol-3-karboksilna kiselina (2-dietilamino-etil)amidom.
Da bi se odredila molekulska osnova razlike u odgovoru između modela ksenografta, izučavani su tumori SF763T. Stoga, tumori SF763T, koji su imali slabiji odgovor na tretman sa 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirol-3-karboksiina kiselina (2-dietilamino-etil)amidom , vrednovani su na molekulskom nivou, korišćenjem imunohistolških tehnika određivanja efekta tretmana sa ovim jedinjenjem. Ova izučavanja su početno obavljena na ovom tipu tumora, zato što su tumori SF673T visoko vaskularizovani sa mikro-krvnim sudovima koji snažno izlučuju ćelijski marker endotelijuma CD31, pa su stoga vrlo pogodni za izučavanje gustine mikro-krvnih sudova tumora (MVD). Imunohistološko vrednovanje tumora SF763T je pokazalo da tumori u tretiranim životinjama imaju smanjenu MVD u poređenju sa kontrolnim, tretiranim sa tečnim nosačem, što je saglasno sa anti-angiogenim mehanizmom delovanja jedinjenja 35; MVD je bila 24,2±4,1 kod životinja tretiranih sa jedinjenjem 35, u poređenju sa 39,3±5,7 kod onih koje su tretirane samo sa nosačem. Kao što se predviđa, iz sa tim povezanim zaustavljanjem rasta tumora, izrazita inhibicija proliferacije ćelija tumora je očigledna kod tumora koji su tretirani sa jedinjenjem 35.T1 tumori su imali prepolovljen mitotički indeks u odnosu na one tumore koji su tretirani tečnim nosačem (podaci nisu prikazani). Efekat jedinjenja 35 na MVD i proliferaciju ćelija tumora pokazuje da ovo jedinjenje ima snažan anti-angiogeni i anti-tumorski efekat, čak i pod uslovima pod kojima se tumor ne povlači.
Svojstvo jedinjenja 35 da inhibira fosforilovanje PDGFR i naknadnu signalizacijuin vivovrednovano je takođe za tumore SF763T, koji izlučuju visoke sadržaje PDGFEp. Tretman tumora SF763T se jedinjenjem 35 snažno inhibira fosforilovanje PDGFRp tirozina u utvrđenim tumorima SF763T. Jedinjenje 35 takođe smanjuje sadržaje fosforilovanih (aktiviranih) fosfolipaza C gama (PLC-y), trenutni silazni indikator aktiviranja PDGFR. Ovi podaci pokazuju da oralno ordiniamje jedinjenja 35 dugotrajno inhibira signalizaciju zavisnu od VEGF u HUVECin vitro(v. gore), a efiksanost jedinjenja je vrednovana kada je jedinjenje neredovno ordinirano na modelu tumora Colo205. Kao što pokazuje Tabela 8, doze 80 mg/kg (91% inhibicija) i 40 mg/kg (84% inhibicija) bile su efikasne kada se oralno ordiniraju, ali ne ako se ordiniraju dva puta nedeljno. Nasuprot, viša doza jedinjenja 35 (160 mg/kg) inhibira (52% inhibicija) rast utvrđenih tumora Colo205 ako se ordinira dva puta nedeljno, što ukazuje da ovo jedinjenje može da pokaže efikasnst kada se neredovno ordinira većom dozom. Treba primetiti da režimi doziranja mogu biti određeni od strane onih koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike, bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Ukratko, rezultati prikazani u Tabeli 8 su dobijeni korišćenjem ćelija Colo205 (0,5x10<6>ćelija/miš), koje su implantirane u slabinski deo atimičkih miševa. Oralnu aministraciju jedinjenja 35, u skladu sa naznačenom shemom, počelo je tek kada su tumori dostigli veličinu od 400 mm<3>. Tumori su mereni kalibracionim šestarom, a zapremina tumora je izračunavana kao proizvod dužinaxširinaxvisina. P-vrednosti su izračunavane poređenjem veličine tumora životinja tretiranih sa jedinjenjem 35, prema onim životinjama koje su tretirane sa tečnim nosačem, poslednjeg dana eksperimenta, korišćenjem dvostrukog t-testa Student-a.
ii. Efikasnost Jedinjenja 35 na modelu bolesti rasejavania
Pored potvrde zadržanog rasta čvrstih primarnih tumora, angiogeneza je takođe bitna komponenta podrške razvoja bolesti rasejavanja, usled metastaze primarnog tumora. Efekat jedinjenja 35 na razvoj bolesti rasejavanja je ispitan na modelu kolonizacije melanoma pluća miševa B16F1. U ovom modelu, ćelije B16-F1 se intravenozno inokuliraju kroz repnu venu atimičkih miševa da kolonizuju pluća i formiraju tumore. Kao što pokazuje Tabela 8, oralnu aministraciju jedinjenja 35, sa 80 mg/kg/dan, efikasno smanjuje masu ćelija B16-F1 u plućima, što se vrednuje merenjem ukupne mase pluća. Ovi podaci ukazuju da jedinjenje 35 možein vivoda inhibira bolest rasejavanja.
Ukratko, rezultati prikazani u Tabeli 9 su dobijeni korišćenjem atimičkih miševa, inokuliranih sa B16-F1 ćelijama tumora (5x10<5>ćelija/miš) kroz repnu venu. Miševi su tretirani svakodnevno sa jedinjenjem 35, dozom od 80 mg/kg/dan (n=10) ili sa tečnim nosačem (n=18), tokom 24 dana nakon inokulacije ćelijama tumora. Na kraju perioda tretmana miševi su žrtvovani, a njihova pluća su izvađena i merena im masa. P-vrednosti su izračunavane poređenjem veličine tumora životinja tretiranih sa jedinjenjem 35, prema onim životinjama koje su tretirane sa tečnim nosačem. P-vrednosti su određene korišćenjem dvostrukog t-testa Student-a.
D. Primeri biološke aktivnosti
Primeri snage jedinjenja iz ovog pronalskain vitro,prikazani su u Tabeli 2.
ZAKLJUČAK
U studijama koje su ispitivale farmakokinetičke karakteristike jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalaska, pokazano je da oralnu aministraciju pojedinačne doze pomenutih jedinjenja ima za rezultat visoku oralnu bioupotrebljivost kod miševa. Dobra oralna bioupotrebljivost i linearna farmakokinetika ukazuju da jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalaska imaju povoljne farmakokinetičke karakteristike.
Pored toga, jedinjenja poželjnih realizacija iz ovog pronalaska su potencijalni inhibitori aktivnosti tirozin kinaze domena podeljene kinaze RTK Flk-1/KDR i
PDGFR, koji učestvuju u angiogenezi, i receptora RTK c-kit za faktr stem ćelija (SCF) koji učestvuje u nekim hematološkim kancerima. Pri višim koncentracijama, jedinjenja poželjnih realizacija iz ovog pronalaska takođe inhibiraju aktivnost tirozin kinaze FGFR-1, treće RTK koja učestvuje u angiogenezi. Saglasno sa njihovom biohemijskom aktivnošću, jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalaska inhibiraju fosforilovanje ciljnih RTK zavisnih od liganda, iin vitromitogeni odgovor humanih ćelija endotelijuma pupčane vene (HUVEC), stimulisan sa VEGF ili FGF, ćelija NIH-2T3 koje izlučuju PDGFR stimulisanih sa PDGF, i ćelija akutne mieloidne leukemije M07E, stimulisanih sa SCF. Nasuprot, jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalaska ne ihibiraju direktno proliferaciju ćelija tumora u kompletnom medijumu rasta, pri koncentracijama za 2 do 3 reda veličine višim od onih koje su potrebne za inhibiranje mitogenih odgovora zavisnih od liganda. U izučavanjima ksenografta na miševima, jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalska inhibiraju rast utvrđenih humanih tumora raznog porekla na način zavisan od doze i sa koncentracijama koje se dobro podnose, čak i pri produženom doziranju (>100 dana). Sa 80 mg/kg/dan, jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalaska izazivaju povlačenje velikih utvrđenih tumora A431 i Colo205, a izazivaju značajnu inhibiciju rasta ili staze tumora SF763T i NCI-H460. Kod miševa sa tumorima SF763T, jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalaska izazivaju zapažena smanjenja u gustini mikro-krvinih sudova, fosfori lova nj u PDGFR u tumorima i mitotički indeks u ćelijama tumora. Pri ovoj dozi, jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalaska takođe inhibiraju kolonizaciju pluća sa ćelijama tumora B16-F1, na modelu metastaza tumora. Izučavanja režima pokazuju da su jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalska najefikasnija kada se ordiniraju svakodnevno. Direktan dokaz anti-angiogene aktivnosti jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalska je utvrđen na tumorima SF763T, kod kojih se smanjila gustina mikro krvnih sudova. Direktan dokaz da jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalska inhibiraju fosforilovanje i signalizacijuin vivoje takođe dobijen na tumorima SF763T.
Uzevši zajedno, ovi podaci potvrđuju saznanje da su oralno ordinirana jedinjenja poželjnih realizacija ovog pronalska anti-angiogeni agensi za tretman kancera, uključujući čvrste tumore i hematološke malignitete, kod kojih su angiogeneza i/ili signalizacija kroz c-kit značajni u patologiji bolesti.
Smatra se da su jedinjenja, postupci i farmaceutski preparati iz ovog pronalska efikasni za modulisanje aktivnosti PK, pa stoga se očekuje da su efikasni kao terapeutski agensi protiv poremećaja koji su povezani sa RTK, CTK i STK.
Svi patenti i publikacije koji su pomenuti u ovoj prijavi su indikacija nivoa za one koji su verzirani u stanje tehnike na koje se ovaj pronalazak odnosi. Svi patenti i publikacije koji su ovde priključeni kroz citate, u istoj meri kao da je svaka pojedina publikacija specifično i individualno naznačena i ugrađena kroz citat.
Ovaj pronalazak ovde ilustrativno opisan, može se pogodno sprovesti u odsustvu bilo kojeg elementa ili elemenata ograničenja ili ograničavanja, koji nisu specifično opisani. Tako, na primer, u svakom slučaju ovde, svaki od naziva "sadrži", "sastoji se u suštini od" i "sastoji se od" može se zameniti jedan sa drugim. Nazivi i izrazi koji se koriste upotrebljavaju se kao nazivi opisa, a ne ograničavanja, i nije namera da se pri upotrebi tih naziva i izraza, isključuju bilo koji ekivalenti pokazanih i opisanih karakteristika ili njihovih delova, već se podrazumeva da su moguće razne modifikacije unutar obima pronalaska koji se štiti. Dakle, podrazumeva se da, iako je ovaj pronalazak opisan kroz poželjne realizacije i opcione karakteristike, da se modifikacija i variranje koncepata koji su ovde opisani mogu izvesti od strane onih koji su verzirani u stanje tehnike, i da se te modifikacije i varijacije smatra da su unutar obima ovog pronalska, kako je definisan priključenim patentnim zahtevima.
Pored toga, ukoliko su karakteristike ili aspekti ovog pronalska opisani pomoću Markush-ovih grupa, oni koji su verzirani u stanje tehnike shvataju da je ovaj pronalazak time opisan i preko bilo kog individualnog broja ili subgrupe članova Markush-ove grupe. Na primer, sko se X opisuje tako da se bira iz grupe koju čine brom, hlor i jod, zahtevi da je X brom i zahtevi da je X brom i hlor su potpuno opisani.
Ostale realizacije su unutar obima patentnih zahteva koji slede.

Claims (17)

1. Jedinjenje Formule (I): gde . R<1>je odabran od vodonika, (C1-C4)alkila, -(CH2)rR<16>i -C(0)NR<8>R<9>; R<2>je odabran od vodonika, halogena, aril i -S(0)2NR13R1<4>i R<3>je odabran od vodonika, (d-C4)alkila, (d-C4)alkoksi, arila, heteroarila i C(0)R<15>; R<4>je vodonik; R<3>je odabran od hidrogena i (Ci-C4)alkila; R<6>je -C(0)R<10>; R<7>je odabran od vodonika, (CrC4)alkila i arila; R<s>i R<9>, nezavisno se biraju iz grupe koju čine vodonik, alkil i aril; R<10>je -N(R<11>)(CH2)nR<12>, gde n je 1, 2 ili 3; R<11>je vodonik i R<12>je odabran od hidroksi, (C,-C4)alkoksi, -C(0)R15, heteroaril i -NR13R<14>; R13i R<14>nezavisno, se biraju iz grupe koju čine vodonik, (Ci-C4)alkil, cikloalkil, aril i heteroaril; ili R13i R14 se mogu kombinovati formirajući heterocikličnu grupu; R<15>se bira iz grupe koju čine vodonik, hidroksi, (C^C^alkoksi i ariloksi; R16se bira iz grupe koju čine hidroksi i -C(0)R15i r je 2 ili 3 i gde alkoksi se odnosi na O-alkil ili O-cikloalkil; ariloksi se odnosi na O-aril ili O-heteroaril; heteroaril se odnosi na monociklični ili kondenzovani prsten sa 5 do 12 atoma u prstenu, a koji sadrži jedan dva ili tri heteroatoma u prstenu, odabraniih od N, O ili S, preostali atomi u prstenu su atomi C; heterociklična grupa se odnosi na zasićeni ciklični radikal od 3 do 8 atoma u prstenu u kojem su jedan ili dva atoma u prstenu heteroatomi odabrani od N, O ili S(0)ngde n je broj od 0 do 2, preostali atomi su atomi C, gde su jedan ili dva C atoma po izboru zamenjeni karbonil grupom; alkil, alkoksi i cikloalkil grupe su nesupstituisane; aril i heteroaril grupe su po izboru supstituisane sa jedan ili dva supstituenta nezavisno odabrana od halo, (Ci-C4)alkil, trihalo(Ci-C4)alkil, hidroksi, merkapto, cijano, N-amido, mono- ili di(Ci-C4)alkilamino, karboksi i N-sulfonamido; heterociklična grupa je po izboru supstituisana jednim ili dva supstituenta nezavisno odabran od halo, -(Ci-C4)alkil, -(CrC4)alkil-karboksi, -(Ci-C4)alkil-ester, hidroksil i mono- ili di(Ci-C4)alkilamino.
2. Jedinjenje iz zahteva 1. naznačeno time, štoR13i R<14>su nezavisno odabrani od vodonika , (C1-C4)alkil, heteroaril i kombinovanih, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)2-0-(CH2)2- and -(CH2)2N(CH3)(CH2)2-.
3. Jedinjenje iz zahteva 1, naznačeno time, što n je 2 ili 3 i R<12>je - NR<13>R14gde su R<13>i R<14>ne<z>avisno (d-C4)alkil.
4. Jedinjenje iz zahteva 1, naznačen time, što n je 2 ili 3 i R<12>je -NR<13>R14gde R<13>i R<14>zajedno formiraju grupu odaranu od -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)2-0-(CH2)2- ili - (CH2)2N(CH3)(CH2)2-.
5. Jedinjenje iz zahteva 1, naznačeno time, što R1 je -C(0)NR<8>R<9>, gdeR<8>jevodonik i R9 je aril.
6. Jedinjenje iz zahteva 1, formule ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
7. Jedinjenje iz zahteva 1, naznačeno time, što je L-malatna so (2-dietilaminoetil)amida 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenemetil)-2,4-dimeti!-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline.
8. Jedinjenje iz zahteva 1, formule ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
9. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje iz zahteva 1 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili eksipijens.
10. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje iz zahteva 6 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili eksipijens.
11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10, naznačena time, što sadrži L-malatnu so (2-dietilaminoetil)amida 5-(5-fluoro-2-okso-1,2-dihidroindol-3-ilidenemetil)-2,4-dimeti!-1 H-pirol-3-karboksilne kiseline.
12. Upotreba jedinjenja iz zahteva 1 ili 6 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za proizvodnju leka za lečenje poremećaja u organzimu povezanih sa protein kinazom.
13. Upotreba jedinjenja iz zahteva 12, gde je poremećaj povezan sa protein kinazom odabran od poremećaja povezanih sa receptorom tirozin kinaze, poremećaja povezanih sa nespecifičnim -receptorom tirozin kinaze i poremećaja povezanih sa serin -treonin kinazom.
14. Upotreba jedinjenja iz zahteva 12, gde je poremećaj povezan sa protein kinazom odabran od poremećaja povezanih sa EGFR, poremećaja povezanih sa PDGFR, poremećaja povezanih sa IGFR i poremećaja povezanih sa flk.
15. Upotreba jedinjenja iz zahteva 12, gde je poremećaj povezan sa protein kinazom kancer odabran od karcinoma skvamoznih ćelija, astrocitoma, Kaposi-jevog sarkoma, glioblastoma, kancera pluća, kancera bešike, kancera glave i vrata, melanoma, karcinoma jajnika, kancera prostate, raka dojke, kancera malih ćelija pluća, glioma, kolorektalnog kancera, genitourinarnog kancera i gastrointestinalnog kancera.
16. Upotreba jedinjenja iz zahteva 12, gde je poremećaj povezan sa protein kinazom odabran od dijabetesa, autoimunog poremećaja, hiperproliferativnih poremećaja, restenoze, fibroze, psorijaze, Heppel-Lindau bolesti, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, angiogeneze, inflamatornih poremećaja, imunoloških poremećaja i kardiovaskularnih poremećaja.
17. Upotreba jedinjenja iz zahteva 12, gde je dati oraganizam, humani. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
YUP-614/02A 2000-02-15 2001-02-15 Inhibitori 2-indolinon protein kinaze supstituisani pirolom RS50444B (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18271000P 2000-02-15 2000-02-15
US21642200P 2000-07-06 2000-07-06
US24353200P 2000-10-27 2000-10-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU61402A YU61402A (sh) 2005-07-19
RS50444B true RS50444B (sr) 2010-03-02

Family

ID=27391578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-614/02A RS50444B (sr) 2000-02-15 2001-02-15 Inhibitori 2-indolinon protein kinaze supstituisani pirolom

Country Status (42)

Country Link
US (4) US6573293B2 (sr)
EP (1) EP1255752B1 (sr)
JP (1) JP3663382B2 (sr)
KR (1) KR100713960B1 (sr)
CN (1) CN1329390C (sr)
AR (1) AR034118A1 (sr)
AT (1) ATE369359T1 (sr)
AU (2) AU2001239770B2 (sr)
BE (1) BE2010C009I2 (sr)
BG (1) BG65764B1 (sr)
BR (2) BRPI0117360B8 (sr)
CA (1) CA2399358C (sr)
CO (1) CO5280092A1 (sr)
CR (2) CR20120009A (sr)
CY (3) CY1108032T1 (sr)
CZ (1) CZ303705B6 (sr)
DE (3) DE122008000002I1 (sr)
DK (1) DK1255752T3 (sr)
EA (1) EA005996B1 (sr)
ES (1) ES2290117T3 (sr)
FR (2) FR08C0002I2 (sr)
HR (1) HRP20020751B1 (sr)
HU (1) HU228979B1 (sr)
IL (1) IL151127A0 (sr)
IS (1) IS2491B (sr)
LT (1) LTC1255752I2 (sr)
LU (2) LU91407I2 (sr)
ME (1) ME00415B (sr)
MX (1) MXPA02008021A (sr)
MY (1) MY130363A (sr)
NL (2) NL300332I2 (sr)
NO (4) NO325532B1 (sr)
NZ (1) NZ520640A (sr)
PE (1) PE20011083A1 (sr)
PL (1) PL211834B1 (sr)
PT (1) PT1255752E (sr)
RS (1) RS50444B (sr)
SI (1) SI1255752T1 (sr)
SK (1) SK287142B6 (sr)
TW (1) TWI306860B (sr)
UA (1) UA73976C2 (sr)
WO (1) WO2001060814A2 (sr)

Families Citing this family (343)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569868B2 (en) 1998-04-16 2003-05-27 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
US20040226056A1 (en) * 1998-12-22 2004-11-11 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
DE60045474D1 (de) 1999-01-13 2011-02-17 Univ New York State Res Found Neues verfahren zum erschaffen von proteinkinase-inhibitoren
RS50444B (sr) 2000-02-15 2010-03-02 Sugen Inc. Inhibitori 2-indolinon protein kinaze supstituisani pirolom
US7030219B2 (en) 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
MY128449A (en) 2000-05-24 2007-02-28 Sugen Inc Prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
AU2001268154A1 (en) 2000-06-02 2001-12-17 Sugen, Inc. Indolinone derivatives as protein kinase/phosphatase inhibitors
US6635640B2 (en) 2000-06-30 2003-10-21 Sugen, Inc. 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
PT1415987E (pt) 2000-10-20 2007-05-31 Eisai R&D Man Co Ltd Compostos contendo aneis aromáticos azotados utilizados como agentes anti-cancerígenos.
JP2004518669A (ja) * 2000-12-20 2004-06-24 スージェン・インコーポレーテッド ４−アリール置換インドリノン
AR042586A1 (es) * 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
WO2002070478A1 (en) 2001-03-06 2002-09-12 Astrazeneca Ab Indolone derivatives having vascular-damaging activity
EP1247809A3 (en) * 2001-03-30 2003-12-17 Pfizer Products Inc. Triazine compounds useful as sorbitol dehydrogenase inhibitors
AU2002303892A1 (en) 2001-05-30 2002-12-09 Jingrong Cui 5-aralkylsulfonyl-3- (pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
WO2003002109A2 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for treating autoimmune diseases
JP4159988B2 (ja) 2001-08-15 2008-10-01 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−５−［（５−フルオロ−１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１ｈ−ピロール−３−カルボキシアミドのリンゴ酸塩を含む結晶、その製法およびその組成物
AR038957A1 (es) * 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer
MXPA04002242A (es) 2001-09-10 2005-03-07 Sugen Inc Derivados de 3-(4,5,6,7,-tetrahidroindol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de cinasa.
WO2003031438A1 (en) * 2001-10-10 2003-04-17 Sugen, Inc. 3-[4-(substituted heterocyclyl)-pyrrol-2-ylmethylidene]-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
MXPA04003758A (es) * 2001-10-22 2005-06-20 Univ New York State Res Found Inhibidores de proteina - cinasas y proteina-fosfatasas, metodos para disenarlos y metodos para usarlos.
US7005445B2 (en) 2001-10-22 2006-02-28 The Research Foundation Of State University Of New York Protein kinase and phosphatase inhibitors and methods for designing them
TWI259081B (en) * 2001-10-26 2006-08-01 Sugen Inc Treatment of acute myeloid leukemia with indolinone compounds
US20030080191A1 (en) * 2001-10-26 2003-05-01 Allen Lubow Method and apparatus for applying bar code information to products during production
US20030187026A1 (en) 2001-12-13 2003-10-02 Qun Li Kinase inhibitors
US6797825B2 (en) 2001-12-13 2004-09-28 Abbott Laboratories Protein kinase inhibitors
US7156308B2 (en) * 2001-12-17 2007-01-02 International Barcode Corporation Double-sided bar code doubling as a single bar code
US20050131733A1 (en) * 2001-12-17 2005-06-16 Allen Lubow Sealable individual bar coded packets
DK1458713T3 (da) * 2001-12-27 2005-10-31 Theravance Inc Indolinonderivater anvendelige som proteinkinaseinhibitorer
KR100657110B1 (ko) * 2002-02-15 2006-12-12 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨 인돌리논 유도체의 제조방법
US20040018528A1 (en) * 2002-05-17 2004-01-29 Sugen, Inc. Novel biomarkers of tyrosine kinase inhibitor exposure and activity in mammals
ITMI20021620A1 (it) * 2002-07-23 2004-01-23 Novuspharma Spa Composto ad ativita' antitumorale
WO2004016211A2 (en) * 2002-08-08 2004-02-26 Vanderbilt University Pi3k antagonists as radiosensitizers
US7195876B2 (en) * 2002-08-09 2007-03-27 Theravance, Inc. Oncokinase fusion polypeptides associated with hyperproliferative and related disorders, nucleic acids encoding the same and methods for detecting and identifying the same
US20040121407A1 (en) * 2002-09-06 2004-06-24 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Regulation of the growth hormone/IGF-1 axis
TW200418836A (en) * 2002-09-10 2004-10-01 Pharmacia Italia Spa Formulations comprising an indolinone compound
US7626031B2 (en) * 2002-11-15 2009-12-01 Symphony Evolution, Inc. Substituted 3-(diarylmethylene)indolin-2-ones and methods of their use
AR042042A1 (es) * 2002-11-15 2005-06-08 Sugen Inc Administracion combinada de una indolinona con un agente quimioterapeutico para trastornos de proliferacion celular
US20040209937A1 (en) * 2003-02-24 2004-10-21 Sugen, Inc. Treatment of excessive osteolysis with indolinone compounds
US7452913B2 (en) * 2003-02-24 2008-11-18 Pharmacia & Upjohn Company Polymorphs of pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
KR101106905B1 (ko) 2003-02-26 2012-01-25 수젠, 인크. 단백질 키나아제 억제제로서의 아미노헤테로아릴 화합물
US7157577B2 (en) * 2003-03-07 2007-01-02 Sugen Inc. 5-sulfonamido-substituted indolinone compounds as protein kinase inhibitors
US20040266843A1 (en) * 2003-03-07 2004-12-30 Sugen, Inc. Sulfonamide substituted indolinones as inhibitors of DNA dependent protein kinase (DNA-PK)
JPWO2004080462A1 (ja) * 2003-03-10 2006-06-08 エーザイ株式会社 ｃ−Ｋｉｔキナーゼ阻害剤
US20050043233A1 (en) 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis
DE10334582A1 (de) * 2003-07-28 2005-02-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Maleinsäureanhydrid
WO2005023765A1 (en) * 2003-09-11 2005-03-17 Pharmacia & Upjohn Company Llc Method for catalyzing amidation reactions by the presence of co2
ATE473223T1 (de) * 2003-10-02 2010-07-15 Pharmacia & Upjohn Co Llc Salze und polymorphe formen einer pyrrolsubstituierten indolinonverbindung
SI1680140T1 (sl) * 2003-10-16 2011-08-31 Imclone Llc Inhibitorji receptorja-1 za fibroblastni rastni faktor in metode za zdravljenje z le-temi
CN102225926A (zh) 2003-11-07 2011-10-26 诺华疫苗和诊断公司 具有改进药物特性的喹啉酮类化合物的药学上可接受的盐
CN101337930B (zh) 2003-11-11 2010-09-08 卫材R&D管理有限公司 脲衍生物的制备方法
WO2005053686A1 (en) * 2003-11-26 2005-06-16 The Scripps Research Institute Indolinone based protein kinase inhibitors
US20050171182A1 (en) * 2003-12-11 2005-08-04 Roger Briesewitz Methods and compositions for use in the treatment of mutant receptor tyrosine kinase driven cellular proliferative diseases
US20050152943A1 (en) * 2003-12-23 2005-07-14 Medtronic Vascular, Inc. Medical devices to treat or inhibit restenosis
WO2005118543A1 (ja) * 2004-06-03 2005-12-15 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. キナーゼ阻害薬およびその用途
EP1765313A2 (en) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
SE0401790D0 (sv) * 2004-07-07 2004-07-07 Forskarpatent I Syd Ab Tamoxifen response in pre- and postmenopausal breast cancer patients
US20060009510A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-12 Pharmacia & Upjohn Company Llc Method of synthesizing indolinone compounds
ME01788B (me) * 2004-08-26 2011-02-28 Pfizer Enantiomerno čista aminoheteroaril jedinjenja kao inhibitori protein kinaza
EP1797881B1 (en) 2004-09-17 2009-04-15 Eisai R&D Management Co., Ltd. Medicinal composition with improved stability and reduced gelation properties
CN100432071C (zh) * 2004-11-05 2008-11-12 中国科学院上海药物研究所 取代1h－吲哚－2－酮类化合物及其制备方法和用途
GT200500321A (es) * 2004-11-09 2006-09-04 Compuestos y composiciones como inhibidores de proteina kinase.
WO2006101692A1 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Pfizer Products Inc. Anti-ctla4 antibody and indolinone combination therapy for treatment of cancer
EP1877444A2 (en) 2005-04-26 2008-01-16 Pfizer, Inc. P-cadherin antibodies
BRPI0609957A2 (pt) * 2005-05-12 2010-05-11 Pfizer uso de malato de sunitinib na preparação de um medicamento para o tratamento de cáncer
CN101626767A (zh) 2005-05-18 2010-01-13 阵列生物制药公司 Mek的杂环抑制剂及其使用方法
US20110178097A1 (en) 2005-05-23 2011-07-21 Novartis Ag Crystalline and other forms of 4-amino-5-fluoro-3-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1h-benzimidazol-2-yl]-1h-quinolin-2-one lactic acid salts
BRPI0611419A2 (pt) * 2005-05-26 2010-09-08 Scripps Research Inst composto, sal, tautÈmero ou pró-fármaco, método para a modulação da atividade catalìtica de uma proteìna cinase e processo para a sìntese de uma pirrolil-indolinona
JP5066446B2 (ja) * 2005-08-01 2012-11-07 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 血管新生阻害物質の効果を予測する方法
WO2007015578A1 (ja) 2005-08-02 2007-02-08 Eisai R & D Management Co., Ltd. 血管新生阻害物質の効果を検定する方法
SI1933871T1 (sl) 2005-09-07 2013-10-30 Amgen Fremont Inc. Humana monoklonska protitelesa proti aktivin receptorju podobni kinazi-1
KR101050906B1 (ko) * 2005-09-19 2011-07-20 화이자 프로덕츠 인크. 피롤 치환된 2-인돌리논의 고체 염 형태
WO2007052849A1 (ja) 2005-11-07 2007-05-10 Eisai R & D Management Co., Ltd. 血管新生阻害物質とc-kitキナーゼ阻害物質との併用
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
AU2006335099A1 (en) * 2005-12-29 2007-07-19 The Scripps Research Institute Amino acid derivatives of indolinone based protein kinase inhibitors
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
CN101007801A (zh) * 2006-01-27 2007-08-01 上海恒瑞医药有限公司 吡咯取代的2－二氢吲哚酮衍生物、其制法与医药上的用途
AR060358A1 (es) 2006-04-06 2008-06-11 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolinas para la inhibicion de pdk 1
TW200813091A (en) 2006-04-10 2008-03-16 Amgen Fremont Inc Targeted binding agents directed to uPAR and uses thereof
CN101472915A (zh) 2006-04-19 2009-07-01 诺瓦提斯公司 吲唑化合物和抑制cdc7的方法
EP2258700A1 (en) 2006-05-09 2010-12-08 Pfizer Products Inc. Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
AU2007252506C1 (en) * 2006-05-18 2012-07-19 Eisai R & D Management Co., Ltd. Antitumor agent for thyroid cancer
DE102006024834B4 (de) * 2006-05-24 2010-07-01 Schebo Biotech Ag Neue Indol-Pyrrol-Derivate und deren Verwendungen
WO2008001956A1 (en) * 2006-06-29 2008-01-03 Eisai R & D Management Co., Ltd. Therapeutic agent for liver fibrosis
US7838542B2 (en) 2006-06-29 2010-11-23 Kinex Pharmaceuticals, Llc Bicyclic compositions and methods for modulating a kinase cascade
JP2009543810A (ja) 2006-07-13 2009-12-10 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド インターロイキン２１およびチロシンキナーゼ阻害剤の併用治療の方法
CL2007002225A1 (es) 2006-08-03 2008-04-18 Astrazeneca Ab Agente de union especifico para un receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (pdgfr-alfa); molecula de acido nucleico que lo codifica; vector y celula huesped que la comprenden; conjugado que comprende al agente; y uso del agente de un
TW200817409A (en) 2006-08-04 2008-04-16 Takeda Pharmaceutical Fused heterocyclic derivative and use thereof
CA2659851C (en) 2006-08-23 2014-02-25 Kudos Pharmaceuticals Limited 2-methylmorpholine pyrido-, pyrazo- and pyrimido-pyrimidine derivatives as mtor inhibitors
WO2008026748A1 (en) 2006-08-28 2008-03-06 Eisai R & D Management Co., Ltd. Antitumor agent for undifferentiated gastric cancer
CN101553482B (zh) 2006-09-15 2013-11-20 艾科睿制药公司 激酶抑制剂化合物
AU2007317926A1 (en) 2006-11-02 2008-05-15 Acceleron Pharma Inc. ALK1 receptor and ligand antagonists and uses thereof
US8053461B2 (en) 2006-11-06 2011-11-08 Theravalues Corporation Oxindole derivative
JP5357763B2 (ja) 2006-11-06 2013-12-04 トレロ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン誘導体およびピラゾロ［１，５−ａ］ピリダジン誘導体およびプロテインキナーゼインヒビターとしてのこれらの使用
WO2008067756A1 (fr) 2006-12-04 2008-06-12 Jiangsu Simcere Pharmaceutical R & D Co., Ltd. Dérivés de 3-pyrrolo-cyclohexylène-2-dihydro-indolinone et utilisations de ceux-ci
EP2119707B1 (en) 2007-01-29 2015-01-14 Eisai R&D Management Co., Ltd. Composition for treatment of undifferentiated-type of gastric cancer
DE602008005715D1 (de) 2007-02-06 2011-05-05 Pfizer 2-amino-5,7-dihydro-6h-pyrroloä3,4-düpyrimidinderivate als hsp-90-inhibitoren zur behandlung von krebs
US8044056B2 (en) 2007-03-20 2011-10-25 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Adenine compound
US20090004213A1 (en) 2007-03-26 2009-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Combination therapy using active immunotherapy
US20090042906A1 (en) * 2007-04-26 2009-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating cancers associated with constitutive egfr signaling
WO2008138184A1 (fr) 2007-05-14 2008-11-20 Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co.Ltd. Dérivés de pyrrolo-azacycles, leur procédé de fabrication et leur utilisation en tant qu'inhibiteurs de protéine kinases
WO2008145398A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Pfizer Italia S.R.L. 4-arylpyrrole substituted 2-indoline derivatives active as protein kinase inhibitors
CA2689514C (en) 2007-06-05 2015-09-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterobicyclic compounds as kinase inhibitors
WO2009025358A1 (ja) 2007-08-23 2009-02-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited 複素環化合物およびその用途
US20090062368A1 (en) * 2007-08-29 2009-03-05 Protia, Llc Deuterium-enriched sunitinib
WO2009033033A2 (en) 2007-09-06 2009-03-12 Boston Biomedical, Inc. Compositions of kinase inhibitors and their use for treatment of cancer and other diseases related to kinases
AU2008309383B2 (en) 2007-10-11 2012-04-19 Astrazeneca Ab Pyrrolo [2, 3 -D] pyrimidin derivatives as protein kinase B inhibitors
JP5638244B2 (ja) 2007-11-09 2014-12-10 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 血管新生阻害物質と抗腫瘍性白金錯体との併用
WO2009067686A2 (en) * 2007-11-21 2009-05-28 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Sunitinib hemi-l-malate, polymorphs and preparation thereof, polymorphs of racemic sunitinib malate, compositins containing sunitinib base and malic acid and preparation thereof
US20100256392A1 (en) * 2007-11-21 2010-10-07 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Polymorphs of sunitinib base and processes for preparation thereof
CN101939314B (zh) * 2007-12-12 2014-04-02 麦迪凯姆股份公司 3-吡咯取代的2-吲哚酮的多晶型物
PL2690101T3 (pl) 2007-12-19 2015-12-31 Genentech Inc 5-anilinoimidazopirydyny i sposoby zastosowania
PE20091523A1 (es) 2007-12-20 2009-10-29 Novartis Ag Derivados de tiazol como inhibidores de la enzima fosfatidilinositol 3-cinasa (pi3k)
EP2220092B1 (en) 2007-12-21 2012-06-06 Genentech, Inc. Azaindolizines and methods of use
EP2248804A4 (en) * 2008-01-29 2014-09-10 Eisai R&D Man Co Ltd COMBINED USE OF AN ANGIOGENESIS INHIBITOR AND A TAXANE
EP2240174A1 (en) * 2008-02-13 2010-10-20 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical compositions comprising n-ý2-(diethylamino)ethyl¨-5-ý(5-fluoro-1,2- dihydro-2-oxo-3h-indol-3-ylidene)methyl¨-2,4-dimethyl-1h-pyrrole-3-carboxamide
EP2090306A1 (en) 2008-02-13 2009-08-19 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical compositions comprising N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
EP2113248A1 (en) 2008-04-29 2009-11-04 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical composition comprising N-[2-(diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2-,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
CN101255154B (zh) * 2008-02-18 2011-09-07 靳广毅 一种取代的2-吲哚啉酮衍生物和制备方法及其应用
JP2011512396A (ja) * 2008-02-21 2011-04-21 ジェネリクス・（ユーケー）・リミテッド 新規な多形およびその調製方法
EP2098521A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-09 Ratiopharm GmbH Crystal forms of N-[2-(diethylamino) ethyl]-5-[fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrolle-3-carboxamide and methods for their prepparation
KR20100119582A (ko) * 2008-03-31 2010-11-09 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 수니티닙 및 이의 염을 제조하는 방법
EP2280960A1 (en) * 2008-04-16 2011-02-09 Natco Pharma Limited Novel polymorphic forms of sunitinib base
US8158656B2 (en) * 2008-05-16 2012-04-17 Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. 2-indolinone derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
WO2009140928A1 (zh) * 2008-05-23 2009-11-26 上海医药工业研究院 二氢吲哚酮衍生物
US8263547B2 (en) 2008-05-28 2012-09-11 Massachusetts Institute Of Technology DISC-1 pathway activators in the control of neurogenesis
ES2392762T3 (es) * 2008-06-13 2012-12-13 Medichem, S.A. Procedimiento para preparar una sal de malato de 2-indolinona sustituida con 3-pirrol
WO2009157011A1 (en) * 2008-06-23 2009-12-30 Natco Pharma Limited Process for the preparation of high purity sunitinib and its pharmaceutically acceptable salt
EP2138167A1 (en) 2008-06-24 2009-12-30 ratiopharm GmbH Pharmaceutical composition comprising N-[2-(Diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene) methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
WO2009156837A2 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Medichem, S.A. Amorphous form of a 3-pyrrole substituted 2-indolinone malate salt
WO2010002933A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Cylene Pharmaceuticals, Inc. Oxindole compounds
US20110200612A1 (en) 2008-06-30 2011-08-18 Michael Schuster Treatment of eye diseases and excessive neovascularization using combined therapy
DE102008031038A1 (de) 2008-06-30 2009-12-31 Alexander Priv.-Doz. Dr. Dömling Sutent zur Anwendung in der Organtransplantation
WO2010001167A2 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Generics [Uk] Limited Novel process
EP2297138A1 (en) * 2008-07-10 2011-03-23 Generics [UK] Limited Processes for the preparation of crystalline forms of sunitinib malate
EP2342195B1 (en) 2008-07-24 2014-09-10 Medichem, S.A. Crystalline forms of a 3-pyrrole substituted 2-indolinone malate salt
KR20110036588A (ko) 2008-07-24 2011-04-07 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 수니티닙 아세테이트 및 이의 다형을 통한 수니티닙 말레이트의 제조 방법
WO2010017541A2 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treatment of neurodegenerative disease
AU2009286520A1 (en) * 2008-08-25 2010-03-04 Generics [Uk] Limited Crystalline form of sunitinib and processes for its preparation
EP2350129B1 (en) 2008-08-25 2015-06-10 Amplimmune, Inc. Compositions of pd-1 antagonists and methods of use
CA2735006A1 (en) * 2008-08-25 2010-03-11 Amplimmune, Inc. Pd-1 antagonists and methods of use thereof
AU2009286521A1 (en) * 2008-08-25 2010-03-04 Generics [Uk] Limited Novel polymorphs of sunitinib and processes for their preparation
US8961930B2 (en) * 2008-09-05 2015-02-24 Imperial Innovations Limited Isatin derivatives for use as in vivo imaging agents
CN102264763B (zh) 2008-09-19 2016-04-27 米迪缪尼有限公司 定向于dll4的抗体及其用途
EP2350056A1 (en) * 2008-10-10 2011-08-03 Medichem, S.A. Process for preparing a 3-pyrrole subsituted 2-indolinone malate salt
EP2181991A1 (en) 2008-10-28 2010-05-05 LEK Pharmaceuticals D.D. Novel salts of sunitinib
EP2186809A1 (en) 2008-11-13 2010-05-19 LEK Pharmaceuticals D.D. New crystal form of sunitinib malate
US20100222371A1 (en) * 2008-11-20 2010-09-02 Children's Medical Center Corporation Prevention of surgical adhesions
EP2399921B1 (en) 2008-12-01 2015-08-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compound and use thereof
JO3101B1 (ar) 2008-12-02 2017-09-20 Takeda Pharmaceuticals Co مشتقات بنزوثيازول كعوامل مضادة للسرطان
TW201028410A (en) 2008-12-22 2010-08-01 Astrazeneca Ab Chemical compounds 610
WO2010072740A2 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Astrazeneca Ab TARGETED BINDING AGENTS DIRECTED TO α5β1 AND USES THEREOF
US8329740B2 (en) 2009-01-02 2012-12-11 Hetero Research Foundation Polymorphs of sunitinib malate
TWI447108B (zh) 2009-01-16 2014-08-01 Exelixis Inc Ｎ－（４－｛〔６，７雙（甲氧基）喹啉－４－基〕氧基｝苯基）－ｎ’－（４－氟苯基）環丙烷－１，１－二甲醯胺之蘋果酸鹽及其結晶型
CN108727407B (zh) 2009-02-05 2022-01-28 伊缪诺金公司 新型苯并二氮杂䓬衍生物
AU2010210986A1 (en) 2009-02-09 2011-08-25 Supergen, Inc. Pyrrolopyrimidinyl Axl kinase inhibitors
TW201035088A (en) 2009-02-27 2010-10-01 Supergen Inc Cyclopentathiophene/cyclohexathiophene DNA methyltransferase inhibitors
WO2010098888A1 (en) * 2009-02-27 2010-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Uses of chemicals to modulate gsk-3 signaling for treatment of bipolar disorder and other brain disorders
US8785457B2 (en) 2009-03-13 2014-07-22 Cellzome Limited Pyrimidine derivatives as mTOR inhibitors
WO2010108503A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Life & Brain Gmbh Promotion of neuronal integration in neural stem cell grafts
WO2010118986A1 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Cellzome Limited Fluoro substituted pyrimidine compounds as jak3 inhibitors
US8530492B2 (en) 2009-04-17 2013-09-10 Nektar Therapeutics Oligomer-protein tyrosine kinase inhibitor conjugates
EP2255792A1 (en) 2009-05-20 2010-12-01 Ratiopharm GmbH Pharmaceutical compositions for N-[2-(Diethylamino)ethyl]5-[(fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indole-3-ylidene) methyl]-2,4-dimenthyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
US8211901B2 (en) 2009-05-22 2012-07-03 Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. Naphthamide derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
EP2264027A1 (en) * 2009-05-27 2010-12-22 Ratiopharm GmbH Process for the preparation of N-[2-(Diethylamino)ethyl]-5-[(5-fluoro-1,2-dihydro-2-oxo-3H-indol-3-ylidene) methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxamide
US8389580B2 (en) 2009-06-02 2013-03-05 Duke University Arylcyclopropylamines and methods of use
CN101906076B (zh) 2009-06-04 2013-03-13 深圳微芯生物科技有限责任公司 作为蛋白激酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的萘酰胺衍生物、其制备方法及应用
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
WO2011004200A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Generics [Uk] Limited Novel pyrrole derivatives
FR2948940B1 (fr) * 2009-08-04 2011-07-22 Servier Lab Nouveaux derives dihydroindolones, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
CA2771675A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Cellzome Limited Ortho substituted pyrimidine compounds as jak inhibitors
WO2011033472A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Ranbaxy Laboratories Limited Salts of sunitinib
MX2012004020A (es) 2009-10-20 2012-05-08 Cellzome Ltd Analogos de heterociclilo pirazolopirimidina como inhibidores de jak.
WO2011058521A2 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of crystalline form i of l-malic acid salt of sunitinib
WO2011061613A1 (en) 2009-11-19 2011-05-26 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of crystalline form ii of l-malic acid salt of sunitinib
EP2504364B1 (en) 2009-11-24 2017-08-09 Medimmune Limited Targeted binding agents against b7-h1
WO2011068233A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Imidazoquinolines which act via toll - like receptors (tlr)
WO2013022801A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Forsight Vision4, Inc. Small molecule delivery with implantable therapeutic device
WO2011095802A1 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Generics [Uk] Limited Hplc method for analyzing sunitinib
WO2011100325A2 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sicor Inc. Polymorphs of sunitinib salts
CN105001334A (zh) 2010-02-10 2015-10-28 伊缪诺金公司 Cd20抗体及其用途
BR112012019635A2 (pt) 2010-02-22 2016-05-03 Hoffmann La Roche compostos inibidores de pirido[3,2-d] pirimidina pi3k delta e métodos de uso
WO2011104555A2 (en) * 2010-02-25 2011-09-01 Generics [Uk] Limited Novel process
EP2542536B1 (en) 2010-03-04 2015-01-21 Cellzome Limited Morpholino substituted urea derivatives as mtor inhibitors
US20130123511A1 (en) 2010-03-04 2013-05-16 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the direct preparation of malic acid salt of sunitinib
CN102858739A (zh) * 2010-03-10 2013-01-02 斯索恩有限公司 酰胺化吡咯甲酸酯化合物的方法
AU2011228765A1 (en) 2010-03-18 2012-10-11 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of malic acid salt of sunitinib
EP2550263A4 (en) 2010-03-23 2013-07-24 Univ Johns Hopkins COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF NEURODEEGENERATIVE DISEASES
WO2011128699A2 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Generics [Uk] Limited Novel process
KR20130094693A (ko) 2010-04-30 2013-08-26 셀좀 리미티드 Ｊａｋ 저해제로서의 피라졸 화합물
WO2011138565A1 (fr) 2010-05-05 2011-11-10 Biorebus Association pharmaceutique contenant l'acide lipoïque, l'acide hydroxycitrique et une somatostatine a titre de principes actifs
EP2392324A1 (en) 2010-06-01 2011-12-07 Societe De Coordination De Recherches Therapeutiques Rhenium complexes and their pharmaceutical use
SA111320519B1 (ar) 2010-06-11 2014-07-02 Astrazeneca Ab مركبات بيريميدينيل للاستخدام كمثبطات atr
ES2573515T3 (es) 2010-06-25 2016-06-08 Eisai R&D Management Co., Ltd. Agente antitumoral que emplea compuestos con efecto inhibitorio de cinasas combinados
EP2588105A1 (en) 2010-07-01 2013-05-08 Cellzome Limited Triazolopyridines as tyk2 inhibitors
KR20130120439A (ko) 2010-07-09 2013-11-04 제넨테크, 인크. 항-뉴로필린 항체 및 사용 방법
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
WO2012022681A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Cellzome Limited Heterocyclyl pyrazolopyrimidine analogues as selective jak inhibitors
WO2012027716A1 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Collabrx, Inc. Method to treat melanoma in braf inhibitor-resistant subjects
WO2012042421A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Pfizer Inc. Method of treating abnormal cell growth
JP5732541B2 (ja) 2010-11-01 2015-06-10 サイノファーム （クンシャン） バイオケミカル テクノロジ カンパニー リミテッド ２−シリロキシ−ピロールを使用する３−（（ピロール−２−イル）メチレン）−２−ピロロンの調製方法
WO2012059941A1 (en) * 2010-11-04 2012-05-10 Ind-Swift Laboratories Limited Process for preparation of sunitinib malate and salts thereof
CA2815330A1 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Cellzome Limited Pyridine compounds and aza analogues thereof as tyk2 inhibitors
EP2640384A1 (en) 2010-11-18 2013-09-25 Synta Pharmaceuticals Corp. Preselection of subjects for therapeutic treatment with oxygen sensitive agents based on hypoxic status
WO2012068549A2 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Forsight Vision4, Inc. Therapeutic agent formulations for implanted devices
AR083868A1 (es) 2010-12-03 2013-03-27 Lilly Co Eli Compuestos de oxazol[5,4-b]piridin-5-ilo
EP2654797B1 (en) 2010-12-23 2017-11-08 Nektar Therapeutics Polymer-des-ethyl sunitinib conjugates
WO2012088529A1 (en) * 2010-12-23 2012-06-28 Nektar Therapeutics Polymer-sunitinib conjugates
AR085039A1 (es) 2011-01-31 2013-08-07 Novartis Ag DERIVADOS DE PURINA, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS COMPRENDEN Y SU USO EN LA PREPARACION DE MEDICAMENTOS PARA TRATAR ENFERMEDADES MODULADAS POR LA INHIBICION DE LA PI3K DE CLASE I Y/O mTOR
MY183977A (en) 2011-02-15 2021-03-17 Immunogen Inc Cytotoxic benzodiazepine derivatives
WO2012110774A1 (en) 2011-02-17 2012-08-23 Cancer Therapeutics Crc Pty Limited Selective fak inhibitors
US20130324532A1 (en) 2011-02-17 2013-12-05 Cancer Therapeutics Crc Pty Limited Fak inhibitors
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
US8630703B2 (en) 2011-03-09 2014-01-14 Technion Research & Development Foundation Limited Treatment utilizing hydrophobic weak bases chemotherapeutic agents and illumination
CN102115469A (zh) * 2011-03-21 2011-07-06 浙江大学 吲哚啉-2-酮类衍生物的制备和用途
EP2694511A1 (en) 2011-04-04 2014-02-12 Cellzome Limited Dihydropyrrolo pyrimidine derivatives as mtor inhibitors
BR112013025679A2 (pt) * 2011-04-08 2016-07-19 Beta Pharma Inc inibidores de proteína quinase de novos compostos de indolinona
US8962650B2 (en) 2011-04-18 2015-02-24 Eisai R&D Management Co., Ltd. Therapeutic agent for tumor
WO2012143320A1 (en) 2011-04-18 2012-10-26 Cellzome Limited (7h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl)amine compounds as jak3 inhibitors
CN102898402B (zh) * 2011-04-26 2016-01-20 北京大学 一种苯并异硒唑酮修饰的吡咯甲酸酯取代的吲哚酮类化合物及其应用
ES2705950T3 (es) 2011-06-03 2019-03-27 Eisai R&D Man Co Ltd Biomarcadores para predecir y valorar la capacidad de respuesta de sujetos con cáncer de tiroides y de riñón a compuestos de lenvatinib
ES2671748T3 (es) 2011-07-21 2018-06-08 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores heterocíclicos de proteína quinasas
AU2012288892B2 (en) 2011-07-28 2016-04-21 Cellzome Limited Heterocyclyl pyrimidine analogues as JAK inhibitors
WO2013017479A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Cellzome Limited Pyrazolo[4,3-c]pyridine derivatives as jak inhibitors
WO2013017480A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Cellzome Limited Pyrazolo[4,3-c]pyridine derivatives as jak inhibitors
EP2760863A1 (en) 2011-09-20 2014-08-06 Cellzome Limited Pyrazolo[4,3-c]pyridine derivatives as kinase inhibitors
WO2013041652A1 (en) 2011-09-21 2013-03-28 Cellzome Limited Morpholino substituted urea or carbamate derivatives as mtor inhibitors
ES2592219T3 (es) 2011-10-07 2016-11-28 Cellzome Limited Derivados de {(4-(4-morfolino-dihidrotieno[3,4-d]pirimidin-2-il)aril}urea o carbamato como inhibidores de mTOR
CN102499917B (zh) 2011-10-25 2014-12-17 澳门大学 吲哚酮类化合物在制备神经保护药物中的应用
BR112014009890A2 (pt) 2011-10-28 2020-10-27 Novartis Ag derivados de purina e seu uso no tratamento de doença
CN103130774B (zh) * 2011-11-22 2016-06-22 齐鲁制药有限公司 具有酪氨酸激酶抑制作用的化合物及其制备方法和应用
CN103127096B (zh) * 2011-12-02 2015-11-25 杨子娇 吡咯基取代的吲哚类化合物在治疗青光眼病的应用
US20130178520A1 (en) 2011-12-23 2013-07-11 Duke University Methods of treatment using arylcyclopropylamine compounds
CN104169272A (zh) 2011-12-23 2014-11-26 赛尔佐姆有限公司 作为激酶抑制剂的嘧啶-2,4-二胺衍生物
CN102491932A (zh) * 2011-12-26 2012-06-13 天津科技大学 一种3-吲哚啉酮类衍生物及其制备方法及其应用
US9206163B2 (en) 2012-03-23 2015-12-08 Laurus Labs Private Ltd. Process for the preparation of sunitinib and its acid addition salts thereof
CN104394868A (zh) 2012-04-20 2015-03-04 安基生技制药股份有限公司 嘌呤类似物的环丙烷羧酸酯
CN102653521B (zh) * 2012-04-27 2014-08-06 首都师范大学 吲哚-2-酮的哌嗪硫代甲酰肼衍生物及其制备方法和用途
PL399027A1 (pl) 2012-04-27 2013-10-28 Instytut Farmaceutyczny Sposób otrzymywania N-[2-(dietylamino)etylo]-5-formylo-2,4-dimetylo-1H-pirolo-3-karboksyamidu o wysokiej czystosci i jego zastosowanie do wytwarzania sunitynibu
CN107746852B (zh) 2012-05-04 2021-10-08 辉瑞公司 前列腺相关抗原及基于疫苗的免疫治疗疗法
WO2013173283A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Novartis Ag Dosage regimen for a pi-3 kinase inhibitor
CN104583235B (zh) 2012-06-08 2019-03-01 苏特罗生物制药公司 含位点特异非天然氨基酸残基的抗体、其制备和使用方法
US9732161B2 (en) 2012-06-26 2017-08-15 Sutro Biopharma, Inc. Modified Fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014026243A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Cancer Therapeutics Crc Pty Limited Vegfr3 inhibitors
HK1211208A1 (zh) 2012-08-22 2016-05-20 Immunogen, Inc. 細胞毒性苯並二氮呯衍生物
SG11201501464TA (en) 2012-08-31 2015-03-30 Sutro Biopharma Inc Modified amino acids comprising an azido group
WO2014041349A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Cancer Therapeutics Crc Pty Ltd Tetrahydropyran-4-ylethylamino- or tetrahydropyranyl-4-ethyloxy-pyrimidines or -pyridazines as isoprenylcysteincarboxymethyl transferase inhibitors
WO2014045101A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Cellzome Gmbh Tetrazolo quinoxaline derivatives as tankyrase inhibitors
WO2014062838A2 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Pkm2 modulators and methods for their use
US9260426B2 (en) 2012-12-14 2016-02-16 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1H-pyrazolo [3, 4-b] pyridine derivatives as salt inducible kinase 2 (SIK2) inhibitors
MX2015004979A (es) 2012-12-21 2015-07-17 Eisai R&D Man Co Ltd Forma amorfa de derivado de quinolina y metodo para su produccion.
HK1219422A1 (zh) 2013-02-28 2017-04-07 Immunogen, Inc. 包含细胞结合剂及细胞毒素剂的轭合物
HK1219423A1 (zh) 2013-02-28 2017-04-07 Immunogen, Inc. 包含细胞结合剂及细胞毒素剂的轭合物
SG10201806965XA (en) * 2013-03-13 2018-09-27 Boston Biomedical Inc 3-(aryl or heteroaryl) methyleneindolin-2-one derivatives as inhibitors of cancer stem cell pathway kinases for the treatment of cancer
EP2968113B8 (en) 2013-03-14 2020-10-28 Forsight Vision4, Inc. Systems for sustained intraocular delivery of low solubility compounds from a port delivery system implant
KR20210149232A (ko) 2013-03-14 2021-12-08 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. Ｊａｋ2 및 ａｌｋ2 억제제 및 이들의 사용 방법
AR095443A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Fundación Centro Nac De Investig Oncológicas Carlos Iii Heterociclos condensados con acción sobre atr
US9206188B2 (en) 2013-04-18 2015-12-08 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines as ITK and JAK inhibitors
CN104119321B (zh) * 2013-04-28 2017-09-08 齐鲁制药有限公司 二氢吲哚酮衍生物的二马来酸盐及其多晶型物
ES2687968T3 (es) 2013-05-14 2018-10-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. Biomarcadores para pronosticar y evaluar la reactividad de sujetos con cáncer de endometrio a compuestos con lenvatinib
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
WO2015006555A2 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
FR3008411B1 (fr) * 2013-07-12 2015-07-03 Servier Lab Nouveau sel de la 3-[(3-{[4-(4-morpholinylmethyl)-1h-pyrrol-2-yl]methylene}-2-oxo-2,3-dihydro-1h-indol-5-yl)methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione, sa preparation, et les formulations qui le contiennent
EP3039424B1 (en) 2013-08-28 2020-07-29 Crown Bioscience, Inc. (Taicang) Gene expression signatures predictive of subject response to a multi-kinase inhibitor and methods of using the same
WO2015054658A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
CA2838585A1 (en) 2013-10-18 2015-04-18 Hari Babu Matta An ascorbic acid salt of sunitinib
CA2838587A1 (en) 2013-10-18 2015-04-18 Hari Babu Matta Pure crystalline form ii of l-malic acid salt of sunitinib and processes for its preparation
KR102196884B1 (ko) 2013-11-01 2020-12-30 화이자 인코포레이티드 전립선-연관 항원의 발현을 위한 벡터
WO2015083101A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Novartis Ag Dosage regimen for an alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor
CN104829596B (zh) * 2014-02-10 2017-02-01 石家庄以岭药业股份有限公司 吡咯取代吲哚酮类衍生物、其制备方法、包含该衍生物的组合物、及其用途
CN103923014A (zh) * 2014-05-05 2014-07-16 宁夏宝马药业有限公司 环肌酸制备方法
BR112017002466A2 (pt) 2014-08-08 2017-12-05 Forsight Vision4 Inc formulações estáveis e solúveis de inibidores da tirosina cinase do receptor, e métodos para a sua preparação
KR20230043234A (ko) 2014-08-28 2023-03-30 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 고순도의 퀴놀린 유도체 및 이를 제조하는 방법
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
EP3789027A1 (en) 2015-01-13 2021-03-10 Kyoto University Bosutinib, sunitinib, tivozanib, imatinib, nilotinib, rebastinib or bafetinib for preventing and/or treating amyotrophic lateral sclerosis
HRP20231692T1 (hr) 2015-02-25 2024-03-15 Eisai R&D Management Co., Ltd. Postupak za suzbijanje gorčine derivata kinolina
KR20240064733A (ko) 2015-03-04 2024-05-13 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 암을 치료하기 위한 pd-1 길항제 및 vegfr/fgfr/ret 티로신 키나제 억제제의 조합
BR112017022666A8 (pt) 2015-04-20 2022-10-18 Tolero Pharmaceuticals Inc Preparando resposta à alvocidib por perfilamento mitocondrial
WO2016184793A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for treating a patient with vegfr inhibitor-resistant metastatic renal cell carcinoma
JP6510075B2 (ja) 2015-05-18 2019-05-08 トレロ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド バイオアベイラビリティが高いアルボシジブプロドラッグ
GB201510019D0 (en) 2015-06-09 2015-07-22 Cancer Therapeutics Crc Pty Ltd Compounds
AU2016279474B2 (en) 2015-06-16 2021-09-09 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anticancer agent
KR20180034538A (ko) 2015-08-03 2018-04-04 톨레로 파마수티컬스, 인크. 암의 치료를 위한 병행 요법
EP3338779B1 (en) 2015-08-20 2021-06-30 Eisai R&D Management Co., Ltd. Lenvatinib in combination with etoposide and ifosfamide for use in treating a tumor
WO2017053638A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Graybug Vision, Inc. Compounds and compositions for the treatment of ocular disorders
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
US20180280370A1 (en) 2015-11-02 2018-10-04 Novartis Ag Dosage regimen for a phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor
EP3373978A4 (en) 2015-11-12 2019-06-26 Graybug Vision, Inc. AGGREGATION OF MICROPARTICLES FOR THERAPY
KR20180104106A (ko) 2016-01-27 2018-09-19 서트로 바이오파마, 인크. anti-CD74 항체 접합체, anti-CD74 항체 접합체를 포함하는 조성물 및 anti-CD74 항체 접합체의 이용 방법
JP2019508405A (ja) 2016-02-08 2019-03-28 ヴィトリサ セラピューティクス， インコーポレイテッド 改良された硝子体内半減期を有する組成物およびその使用
EP3228630A1 (en) 2016-04-07 2017-10-11 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Combination of an apelin antagonist and an angiogenesis inhibitor for the treatment of cancer
CN107459519A (zh) 2016-06-06 2017-12-12 上海艾力斯医药科技有限公司 稠合嘧啶哌啶环衍生物及其制备方法和应用
EP3507305A1 (en) 2016-09-02 2019-07-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of treating b cell disorders
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
KR20190084063A (ko) 2016-10-28 2019-07-15 이칸 스쿨 오브 메디슨 엣 마운트 시나이 Ｅｚｈ２-매개성 암 치료용 조성물 및 방법
US11279694B2 (en) 2016-11-18 2022-03-22 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
CN110177780B (zh) 2016-12-05 2022-11-01 阿普罗斯治疗公司 含有酸性基团的嘧啶化合物
US10786502B2 (en) 2016-12-05 2020-09-29 Apros Therapeutics, Inc. Substituted pyrimidines containing acidic groups as TLR7 modulators
CA3045037A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Compositions and methods for treating cdk4/6-mediated cancer
EP3362471B1 (en) 2016-12-19 2021-11-17 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Profiling peptides and methods for sensitivity profiling
WO2018147275A1 (ja) 2017-02-08 2018-08-16 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 腫瘍治療用医薬組成物
CN106916143B (zh) * 2017-03-14 2019-09-27 哈尔滨医科大学 一种预防和治疗冠心病的药物及其应用
CN110662543A (zh) 2017-03-23 2020-01-07 灰色视觉公司 用于治疗眼部疾病的药物和组合物
MX2019013363A (es) 2017-05-10 2020-01-13 Graybug Vision Inc Microparticulas de liberacion extendida y suspensiones de las mismas para terapia medica.
SG11201910100PA (en) 2017-05-16 2019-11-28 Eisai R&D Man Co Ltd Treatment of hepatocellular carcinoma
EP3658588A1 (en) 2017-07-26 2020-06-03 Sutro Biopharma, Inc. Methods of using anti-cd74 antibodies and antibody conjugates in treatment of t-cell lymphoma
US11497756B2 (en) 2017-09-12 2022-11-15 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment regimen for cancers that are insensitive to BCL-2 inhibitors using the MCL-1 inhibitor alvocidib
SG11202002310UA (en) 2017-09-18 2020-04-29 Sutro Biopharma Inc Anti- folate receptor alpha antibody conjugates and their uses
WO2019075367A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Tolero Pharmaceuticals, Inc. PKM2 ACTIVATORS IN COMBINATION WITH OXYGEN REACTIVE SPECIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
NL2019801B1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Univ Leiden Delivery vectors
US11472799B2 (en) 2018-03-06 2022-10-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Serine threonine kinase (AKT) degradation / disruption compounds and methods of use
EP3539536A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 MH10 Spolka z ograniczona odpowiedzialnoscia A pharmaceutical composition of sunitinib or its salt thereof in its polymorphic form i
WO2020216450A1 (en) 2019-04-25 2020-10-29 Synthon B.V. Pharmaceutical composition comprising amorphous sunitinib
WO2019236496A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Apros Therapeutics, Inc. Pyrimidine compounds containing acidic groups useful to treat diseases connected to the modulation of tlr7
GB201810092D0 (en) 2018-06-20 2018-08-08 Ctxt Pty Ltd Compounds
JP2021527666A (ja) 2018-06-21 2021-10-14 アイカーン スクール オブ メディスン アット マウント シナイ Ｗｄ４０反復ドメインタンパク質５（ｗｄｒ５）分解／破壊化合物および使用の方法
GB201810581D0 (en) 2018-06-28 2018-08-15 Ctxt Pty Ltd Compounds
KR20210038906A (ko) 2018-07-26 2021-04-08 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. 비정상적 acvr1 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법 및 그에 사용하기 위한 acvr1 억제제
EP3852811A1 (en) 2018-09-17 2021-07-28 Sutro Biopharma, Inc. Combination therapies with anti-folate receptor antibody conjugates
MX2021006544A (es) 2018-12-04 2021-07-07 Sumitomo Pharma Oncology Inc Inhibidores de cinasa dependiente de ciclina 9 (cdk9) y polimorfos de los mismos para uso como agentes para el tratamiento de cancer.
KR20210107069A (ko) 2018-12-21 2021-08-31 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 컨쥬게이트와 키나아제 저해제의 조합
KR20210146290A (ko) 2019-02-12 2021-12-03 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. 헤테로시클릭 단백질 키나제 억제제를 포함하는 제제
US11793802B2 (en) 2019-03-20 2023-10-24 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia (AML) with venetoclax failure
WO2020188015A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Onxeo A dbait molecule in combination with kinase inhibitor for the treatment of cancer
US11712433B2 (en) 2019-03-22 2023-08-01 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising PKM2 modulators and methods of treatment using the same
CN113646303A (zh) 2019-03-28 2021-11-12 安普利亚治疗有限公司 Fak抑制剂的盐和晶型
US20220362394A1 (en) 2019-05-03 2022-11-17 Sutro Biopharma, Inc. Anti-bcma antibody conjugates
CN118908962A (zh) * 2019-05-06 2024-11-08 西奈山伊坎医学院 作为hpk1的降解剂的异双功能化合物
AU2020335054A1 (en) 2019-08-31 2022-03-24 Etern Biopharma (Shanghai) Co., Ltd. Pyrazole derivative for FGFR inhibitor and preparation method therefor
JP2023500906A (ja) 2019-11-08 2023-01-11 インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） キナーゼ阻害剤に対する獲得抵抗性を有するがんの処置方法
WO2021148581A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Onxeo Novel dbait molecule and its use
WO2021178597A1 (en) 2020-03-03 2021-09-10 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific glutamine tags, methods of their preparation and methods of their use
CN111233841A (zh) * 2020-03-17 2020-06-05 湖北扬信医药科技有限公司 一种舒尼替尼有关物质及其制备方法和用途
US12103924B2 (en) 2020-06-01 2024-10-01 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mitogen-activated protein kinase kinase (MEK) degradation compounds and methods of use
JP7633786B2 (ja) * 2020-09-18 2025-02-20 日本化薬株式会社 スニチニブリンゴ酸塩を有効成分とする医薬錠剤
WO2023278424A1 (en) * 2021-06-28 2023-01-05 The Regents Of The University Of California Methods for treating and ameliorating t cell related diseases
CN113717159A (zh) * 2021-09-16 2021-11-30 中国药科大学 吲哚酮类化合物及其药物组合物、制备方法及用途
KR20240115979A (ko) 2021-11-08 2024-07-26 프로젠토스 테라퓨틱스, 인크. 혈소판-유래 성장 인자 수용체(pdgfr) 알파 억제제 및 이의 용도
CN119255825A (zh) 2022-05-24 2025-01-03 第一三共株式会社 抗-cdh6抗体-药物缀合物的剂量方案
EP4547284A1 (en) 2022-06-30 2025-05-07 Sutro Biopharma, Inc. Anti-ror1 antibodies and antibody conjugates, compositions comprising anti-ror1 antibodies or antibody conjugates, and methods of making and using anti-ror1 antibodies and antibody conjugates
WO2024017372A1 (zh) * 2022-07-22 2024-01-25 成都百裕制药股份有限公司 一种吲哚酮衍生物及其应用
CN118221652B (zh) * 2022-12-19 2025-06-06 沈阳药科大学 一种吲哚-2-酮衍生物及其制备方法和用途
WO2024188282A1 (zh) * 2023-03-14 2024-09-19 康百达（四川）生物医药科技有限公司 吲哚酮衍生物及其在医药上的应用
WO2025081117A2 (en) 2023-10-13 2025-04-17 Sutro Biopharma, Inc. Anti-tissue factor antibodies and antibody conjugates, compositions comprising anti-tissue factor antibodies or antibody conjugates, and methods of making and using anti-tissue factor antibodies and antibody conjugates

Family Cites Families (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL230368A (sr) 1957-08-19
DE878539C (de) 1939-08-17 1953-06-05 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von Methinfarbstoffen
BE507136A (sr) 1950-11-18
BE553661A (sr) 1955-12-23
BE558210A (sr) 1956-06-08
NL251055A (sr) 1959-04-29
FR1398224A (fr) 1964-05-06 1965-05-07 Ici Ltd Procédé de teinture de matières textiles de polyacrylonitrile
US3308134A (en) 1965-10-22 1967-03-07 Mcneilab Inc Spiro(indan-2, 3'-indoline)-1, 2'-diones
US3551571A (en) 1967-05-19 1970-12-29 Endo Lab Methods for reducing pain,reducing fever and alleviating inflammatory syndromes with heteroaromatic pyrrol-3-yl ketones
US3564016A (en) 1968-03-07 1971-02-16 Endo Lab Method of decarbonylation
US4070366A (en) 1968-06-12 1978-01-24 Canadian Patents & Development Limited Alkylation process
FR1599772A (sr) 1968-09-17 1970-07-20
US3922163A (en) 1970-01-30 1975-11-25 Upjohn Co Organic compounds and process
US3715364A (en) 1970-12-28 1973-02-06 Merck & Co Inc Nitroimidazole carboxamides
DE2159362A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159363A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Antimikrobielle mittel
DE2159360A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159361A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
GB1384599A (en) 1972-05-04 1975-02-19 Colgate Palmolive Co Coloured detergent compositions
US3880871A (en) 1973-09-27 1975-04-29 Squibb & Sons Inc Isothiocyanophenyl substituted imidazoles
US4002643A (en) 1975-06-27 1977-01-11 Mcneil Laboratories, Inc. Preparation of β-acyl pyrroles
US4002749A (en) 1975-08-12 1977-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Substituted indolinones
US4053613A (en) 1975-09-17 1977-10-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones
DE2855306A1 (de) 1978-12-21 1980-07-10 Boehringer Sohn Ingelheim Mittel zur senkung der herzfrequenz
GR73560B (sr) 1979-02-24 1984-03-15 Pfizer
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4343923A (en) 1980-08-07 1982-08-10 Armstrong World Industries, Inc. Process for reducing the acid dye uptake of polyamide textile materials with N-acylimidazole compound
CH646956A5 (de) 1981-12-15 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Imidazolide.
EP0095285A1 (en) 1982-05-21 1983-11-30 Sumitomo Chemical Company, Limited N-acylimidazoles, their production and use
US4493642A (en) 1982-12-27 1985-01-15 Bogdon Glendon J Orthodontic device and associated orthodontic method
DE3310891A1 (de) 1983-03-25 1984-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue indolinon-(2)-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4489089A (en) 1983-04-06 1984-12-18 American Cyanamid Company Substituted N-[ω-(1H-imidazol-1-yl)alkyl]-amides
DE3480392D1 (en) 1983-04-29 1989-12-14 Ciba Geigy Ag Imidazolides and their use as curing agents for polyepoxides
DE3415138A1 (de) 1984-04-21 1985-10-31 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen N-(azolylcarbamoyl)-hydroxylamine und diese enthaltende fungizide
DE3426419A1 (de) 1984-07-18 1986-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue oxindol-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4560700A (en) 1985-02-08 1985-12-24 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Pyrrole-3-carboxylate cardiotonic agents
JPH078851B2 (ja) 1985-07-29 1995-02-01 鐘淵化学工業株式会社 ３−フエニルチオメチルスチレン誘導体
JPS6229570A (ja) 1985-07-29 1987-02-07 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd ３，５−ジイソプロピルベンジリデン複素環式化合物
JPS6239564A (ja) 1985-08-13 1987-02-20 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd α−ベンジリデン−γ−ブチロラクトンまたはγ−ブチロラクタム誘導体
US4966849A (en) 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
WO1993012786A1 (en) 1986-07-10 1993-07-08 Howard Harry R Jr Indolinone derivatives
US4853404A (en) 1986-10-13 1989-08-01 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Phenoxyacetic acid derivatives composition and use
JPS63141955A (ja) 1986-12-03 1988-06-14 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd トリベンジルアミン誘導体
US5089516A (en) 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
EP0304493B1 (en) 1987-03-11 1992-09-02 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hydroxystyrene derivatives
US5202341A (en) 1987-03-11 1993-04-13 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hydroxystyrene compounds having tyrosine kinase inhibiting activity
US5043348A (en) 1987-04-24 1991-08-27 Cassella Aktiengesellschaft Pyrrolealdehydes, their preparation and their use
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
DE3808071A1 (de) 1988-03-11 1989-09-21 Basf Ag Verfahren zur herstellung von acylierten imidazolen
US4868304A (en) 1988-05-27 1989-09-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Synthesis of nitrogen heterocycles
CA1339784C (en) 1988-06-23 1998-03-31 Shinya Inoue Pyrrolecarboxylic acid derivatives
JPH06104658B2 (ja) 1988-06-23 1994-12-21 三菱化成株式会社 ピロールカルボン酸誘導体
DE3824658A1 (de) 1988-07-15 1990-01-18 Schering Ag N-hetaryl-imidazolderivate
GB8816944D0 (en) 1988-07-15 1988-08-17 Sobio Lab Compounds
US5084280A (en) 1988-12-15 1992-01-28 Chapman Chemical Company Wood preservation composition and method
DE3902439A1 (de) 1989-01-27 1990-08-02 Basf Ag Pflanzenschuetzende mittel auf basis von 1-aryl- bzw. 1-hetarylimidazolcarbonsaeureestern
US5047554A (en) 1989-04-18 1991-09-10 Pfizer Inc. 3-substituted-2-oxindole derivatives
EP0429685B1 (en) 1989-07-25 1997-10-29 Taiho Pharmaceutical Company, Limited Oxoindole derivative
US5258357A (en) 1989-10-07 1993-11-02 Basf Aktiengesellschaft Carboxamides, their preparation and their use as herbicides
CA2032421A1 (en) 1989-12-20 1991-06-21 Mitsubishi Chemical Corporation Pyrrolealdehyde derivative
GB9004483D0 (en) 1990-02-28 1990-04-25 Erba Carlo Spa New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation
CA2012634A1 (en) 1990-03-20 1991-09-20 Hassan Salari Tyrphostins for treatment of allergic, inflammatory and cardiovascular diseases
EP0526488B1 (en) 1990-04-02 1994-11-30 Pfizer Inc. Benzylphosphonic acid tyrosine kinase inhibitors
US5196446A (en) 1990-04-16 1993-03-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Certain indole compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5302606A (en) 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
JP2944721B2 (ja) 1990-08-22 1999-09-06 生化学工業株式会社 エンドトキシンの測定剤
WO1992007830A2 (en) 1990-10-29 1992-05-14 Pfizer Inc. Oxindole peptide antagonists
IT1247509B (it) 1991-04-19 1994-12-17 Univ Cagliari Composti di sintesi atti all'impiego nella terapia delle infezioni da rhinovirus
US5480883A (en) 1991-05-10 1996-01-02 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
AU658646B2 (en) 1991-05-10 1995-04-27 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Bis mono-and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
WO1992021660A1 (en) 1991-05-29 1992-12-10 Pfizer, Inc. Tricyclic polyhydroxylic tyrosine kinase inhibitors
GB9115160D0 (en) 1991-07-12 1991-08-28 Erba Carlo Spa Methylen-oxindole derivatives and process for their preparation
US5124347A (en) 1991-07-31 1992-06-23 Warner-Lambert Co. 3-5-ditertiarybutylphenyl-4-hydroxymethylidene derivatives of 1,3-dihydro-2H-indole-2-ones as antiinflammatory agents
JPH0558894A (ja) 1991-08-27 1993-03-09 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 抗腫瘍剤
AU664392B2 (en) 1991-10-18 1995-11-16 Monsanto Technology Llc Fungicides for the control of take-all disease of plants
US5389661A (en) 1991-12-05 1995-02-14 Warner-Lambert Company Imidazole and 1,2,4-triazole derivatives with angiotensin II antagonist properties
US5322950A (en) 1991-12-05 1994-06-21 Warner-Lambert Company Imidazole with angiotensin II antagonist properties
GB9300059D0 (en) 1992-01-20 1993-03-03 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
FR2689397A1 (fr) 1992-04-01 1993-10-08 Adir Utilisation des dérivés de la 3-(3,5-Ditert-Butyl-4-Hydroxybenzylidenyl) Indoline-2-one pour l'obtention de médicaments.
DE4211531A1 (de) 1992-04-06 1993-10-07 Cassella Ag Verfahren zur Herstellung von Pyrrolderivaten
ES2148229T3 (es) 1992-05-20 2000-10-16 Merck & Co Inc Eteres y tioeteres en la posicion 17 de 4-aza-esteroides.
FR2694004B1 (fr) 1992-07-21 1994-08-26 Adir Nouvelles 3-(Hydroxybenzylidényl)-indoline-2-ones et 3-(hydroxybenzylidényl)-indoline-2-thiones, leurs procédés de préparation, et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
RU2155187C2 (ru) 1992-08-06 2000-08-27 Варнер-Ламберт Компани Производные индола, их таутомеры, смеси их изомеров или отдельные изомеры и фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция с антиопухолевой или ингибирующей протеин-тирозинкиназу активностью и способ торможения зависящего от протеин-тирозинкиназы заболевания или борьбы с аберрантным ростом клеток млекопитающего или человека.
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5330992A (en) 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
ATE399181T1 (de) 1992-10-28 2008-07-15 Genentech Inc Verwendung von antagonisten des zellwachstumsfaktors vegf
GB9226855D0 (en) 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
JP3507124B2 (ja) 1993-05-26 2004-03-15 塩野義製薬株式会社 ベンジリデン誘導体の製造法
EP0632102B1 (de) 1993-06-28 1997-04-02 Bayer Ag Massefärben von Kunststoffen
GB9313638D0 (en) 1993-07-01 1993-08-18 Erba Carlo Spa Arylidene and heteroarylidene oxindole derivatives and process for their preparation
US5332736A (en) 1993-11-01 1994-07-26 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-convulsant aroyl aminoacylpyrroles
US5502072A (en) 1993-11-26 1996-03-26 Pfizer Inc. Substituted oxindoles
GB9326136D0 (en) 1993-12-22 1994-02-23 Erba Carlo Spa Biologically active 3-substituted oxindole derivatives useful as anti-angiogenic agents
US5610173A (en) 1994-01-07 1997-03-11 Sugen, Inc. Formulations for lipophilic compounds
AU2096895A (en) 1994-03-07 1995-09-25 Sugen, Incorporated Receptor tyrosine kinase inhibitors for inhibiting cell proliferative disorders and compositions thereof
GB9412719D0 (en) 1994-06-24 1994-08-17 Erba Carlo Spa Substituted azaindolylidene compounds and process for their preparation
GB9423997D0 (en) 1994-11-28 1995-01-11 Erba Carlo Spa Substituted 3-arylidene-7-azaoxindole compounds and process for their preparation
GB9501567D0 (en) 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
GB9507298D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Pharmacia Spa Substituted indolylmethylene-oxindale analogues as tyrosine kinase inhibitors
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5786488A (en) 1996-11-13 1998-07-28 Sugen, Inc. Synthetic methods for the preparation of indolyquinones
JP3246712B2 (ja) 1995-11-15 2002-01-15 株式会社トクヤマ エテニルアミド化合物の製造方法
ATE243034T1 (de) 1996-01-17 2003-07-15 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Intimale verdickungsinhibitoren
EP0788890A1 (en) 1996-02-06 1997-08-13 Agfa-Gevaert N.V. Dyes and dye-donor elements for thermal dye transfer recording
WO1997034920A1 (en) 1996-03-21 1997-09-25 Sugen, Inc. Assays for kdr/flk-1 receptor tyrosine kinase inhibitors
WO1997036867A1 (en) 1996-03-29 1997-10-09 Pfizer Inc. Benzyl(idene)-lactam derivatives, their preparation and their use as selective (ant)agonists of 5-ht1a- and/or 5-ht1d receptors
CA2206201A1 (en) 1996-05-29 1997-11-29 Yoshiaki Isobe Pyrazole derivatives and their pharmaceutical use
WO1998005637A1 (de) 1996-08-01 1998-02-12 Merckle Gmbh Acylpyrroldicarbonsäuren und acylindoldicarbonsäuren sowie ihre derivate als hemmstoffe der cytosolischen phospholipase a¿2?
EP0931152A2 (en) 1996-08-21 1999-07-28 Sugen, Inc. Crystal structures of a protein tyrosine kinase
ES2251741T3 (es) 1996-08-23 2006-05-01 Sugen, Inc. Bibliotecas combinatorias de indolinona y productos afines y metodos para el tratamiento de enfermedades.
WO1998024432A2 (en) 1996-12-05 1998-06-11 Sugen, Inc. Use of indolinone compounds as modulators of protein kinases
AU743024B2 (en) 1997-03-05 2002-01-17 Sugen, Inc. Formulations for hydrophobic pharmaceutical agents
WO1998045708A1 (en) 1997-04-08 1998-10-15 Sugen, Inc. Study and treatment of diseases related to specific cellular functions of receptor protein tyrosine kinases
CA2289102A1 (en) * 1997-05-07 1998-11-12 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
EP1007042A4 (en) 1997-06-13 2001-07-04 Sugen Inc NEW HETEROCYCLIC COMPOUNDS FOR MODULATING THE PROTEIN-TYROSIN-ENZYME-RELATED CELLULAR SIGNAL TRANSDUCTION
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
US6133305A (en) 1997-09-26 2000-10-17 Sugen, Inc. 3-(substituted)-2-indolinones compounds and use thereof as inhibitors of protein kinase activity
UA58476C2 (uk) 1997-10-09 2003-08-15 Санофі-Сентелябо Похідні 8-азабіцикло[3.2.1]октан-3-метанаміну, фармацевтична композиція та лікарський засіб
EP1066257A2 (en) 1998-03-26 2001-01-10 Sugen, Inc. Heterocylic classes of compounds for the modulating tyrosine protein kinase
DE19816624A1 (de) 1998-04-15 1999-10-21 Boehringer Ingelheim Pharma Neue substituierte Indolinone, ihre Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
AU759226B2 (en) 1998-05-29 2003-04-10 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
DE19826940A1 (de) 1998-06-17 1999-12-23 Bayer Ag Substituierte N-Aryl-O-alkyl-carbamate
AU5468499A (en) 1998-08-04 2000-02-28 Sugen, Inc. 3-methylidenyl-2-indolinone modulators of protein kinase
US6462072B1 (en) 1998-09-21 2002-10-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Cyclic ester or amide derivatives
EP1143956A3 (en) 1998-12-14 2001-12-12 Cellegy Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for the treatment of anorectal disorders
PT1157019E (pt) * 1998-12-17 2003-06-30 Hoffmann La Roche 4-alcenil (e alcinil) oxindolos como inibidores dequinases dependentes de ciclina em particular cdk2
US6284894B1 (en) 1998-12-18 2001-09-04 Nycomed Imaging As Preparation of allylic aromatic compounds
EP1139754A4 (en) * 1998-12-31 2002-12-18 Sugen Inc 3-HETEROARYLIDENYL-2-INDOLINONE COMPOUNDS FOR MODULATION OF PROTEIN KINASE ACTIVITY AND IN CANCER CHEMOTHERAPY
CA2368041A1 (en) 1999-03-24 2000-09-28 Sugen, Inc. Indolinone compounds as kinase inhibitors
DK1233943T3 (da) * 1999-11-24 2011-08-15 Sugen Inc Ioniserbare indolinon derivater og anvendelse deraf som PTK ligander
PT1255536E (pt) * 1999-12-22 2006-09-29 Sugen Inc Derivados de indolinona para a modulacao da tirosina proteina cinase de tipo c-kit
RS50444B (sr) 2000-02-15 2010-03-02 Sugen Inc. Inhibitori 2-indolinon protein kinaze supstituisani pirolom
MY128449A (en) 2000-05-24 2007-02-28 Sugen Inc Prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
US6635640B2 (en) * 2000-06-30 2003-10-21 Sugen, Inc. 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
JP2004518669A (ja) * 2000-12-20 2004-06-24 スージェン・インコーポレーテッド ４−アリール置換インドリノン

Also Published As

Publication number Publication date
US6573293B2 (en) 2003-06-03
BG65764B1 (bg) 2009-10-30
SK13262002A3 (sk) 2003-03-04
US20040063773A1 (en) 2004-04-01
CY2010004I2 (el) 2012-01-25
MY130363A (en) 2007-06-29
NO2010002I2 (no) 2010-12-06
FR10C0003I1 (fr) 2010-03-05
NZ520640A (en) 2005-04-29
JP2003523340A (ja) 2003-08-05
KR20030003229A (ko) 2003-01-09
EP1255752B1 (en) 2007-08-08
US20050176802A1 (en) 2005-08-11
LU91657I2 (fr) 2010-05-03
HU228979B1 (en) 2013-07-29
CY2008004I2 (el) 2009-11-04
NL300430I1 (nl) 2010-03-01
WO2001060814A2 (en) 2001-08-23
EA005996B1 (ru) 2005-08-25
NL300332I1 (nl) 2008-03-03
NO20023831D0 (no) 2002-08-13
CR20120007A (es) 2012-02-24
CY1108032T1 (el) 2011-04-06
BE2010C009I2 (sr) 2020-01-30
SI1255752T1 (sl) 2007-12-31
LTC1255752I2 (lt) 2019-08-26
NL300430I2 (nl) 2010-04-01
CA2399358A1 (en) 2001-08-23
CO5280092A1 (es) 2003-05-30
BR0108394A (pt) 2004-06-22
LU91407I2 (fr) 2008-03-10
ES2290117T3 (es) 2008-02-16
US7572924B2 (en) 2009-08-11
US20070010569A1 (en) 2007-01-11
BRPI0117360B1 (pt) 2018-11-13
LU91407I9 (sr) 2018-12-28
TWI306860B (en) 2009-03-01
IS6501A (is) 2002-08-13
AR034118A1 (es) 2004-02-04
AU2001239770B2 (en) 2006-01-05
HUP0204433A2 (hu) 2003-04-28
PL211834B1 (pl) 2012-06-29
LTPA2008002I1 (lt) 2019-02-25
KR100713960B1 (ko) 2007-05-02
BRPI0108394B8 (pt) 2021-05-25
NO325532B1 (no) 2008-06-09
DK1255752T3 (da) 2007-11-26
US20020156292A1 (en) 2002-10-24
ME00415B (me) 2011-10-10
NO2008019I2 (no) 2011-10-17
EP1255752A2 (en) 2002-11-13
AU3977001A (en) 2001-08-27
NO2010002I1 (no) 2010-03-08
CA2399358C (en) 2006-03-21
IL151127A0 (en) 2003-04-10
NO2019005I1 (no) 2019-02-11
BRPI0117360B8 (pt) 2021-07-06
CN1329390C (zh) 2007-08-01
PL361209A1 (en) 2004-09-20
UA73976C2 (uk) 2005-10-17
NO20023831L (no) 2002-10-15
FR08C0002I1 (sr) 2008-03-21
WO2001060814A3 (en) 2002-01-24
FR10C0003I2 (fr) 2012-06-22
DE122008000002I1 (de) 2008-04-17
FR08C0002I2 (fr) 2009-01-02
JP3663382B2 (ja) 2005-06-22
YU61402A (sh) 2005-07-19
CY2010004I1 (el) 2012-01-25
HUP0204433A3 (en) 2007-08-28
HRP20020751A2 (en) 2004-12-31
CY2008004I1 (el) 2009-11-04
PE20011083A1 (es) 2001-10-26
BRPI0108394B1 (pt) 2018-12-11
DE60129794D1 (de) 2007-09-20
DE122010000004I1 (de) 2010-04-15
HK1051188A1 (en) 2003-07-25
MXPA02008021A (es) 2004-04-05
PT1255752E (pt) 2007-10-17
CZ303705B6 (cs) 2013-03-27
CR20120009A (es) 2012-02-07
SK287142B6 (sk) 2010-01-07
ATE369359T1 (de) 2007-08-15
NO2008019I1 (no) 2009-01-12
HRP20020751B1 (hr) 2011-01-31
BRPI0117360A2 (pt) 2012-01-24
US7125905B2 (en) 2006-10-24
IS2491B (is) 2009-01-15
BG107078A (bg) 2003-04-30
CN1439005A (zh) 2003-08-27
DE60129794T2 (de) 2007-12-06
NL300332I2 (nl) 2008-04-01
CZ20023081A3 (cs) 2003-02-12
EA200200862A1 (ru) 2003-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS50444B (sr) Inhibitori 2-indolinon protein kinaze supstituisani pirolom
AU2002247133B2 (en) 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethlidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors
US6635640B2 (en) 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
AU2001239770A1 (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US20030100555A1 (en) Prodrugs of a 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
HK1051188B (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
HK1059621B (en) 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors