ES2251741T3 - Bibliotecas combinatorias de indolinona y productos afines y metodos para el tratamiento de enfermedades. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS ORGANICAS, CAPACES DE MODULAR, REGULAR Y/O INHIBIR LA TRANSDUCCION DE LA SEÑAL DE LA PROTEINA QUINASA. DICHOS COMPUESTOS SON UTILES PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA TRANSDUCCION DE LA SEÑAL DE LA PROTEINA QUINASA NO REGULADA, INCLUYENDO ENFERMEDADES DE PROLIFERACION CELULAR COMO EL CANCER, LA ARTERIOSCLEROSIS, LA ARTRITIS Y LA RESTENOSIS, Y ENFERMEDADES METABOLICAS, COMO LA DIABETES. LA INVENCION DESCRIBE COMPUESTOS DE INDOLINONA QUE INHIBEN POTENTEMENTE A LAS PROTEINA QUINASAS, ASI COMO PRODUCTOS Y PROCEDIMIENTOS RELACIONADOS. SE PUEDEN OBTENER INHIBIDORES ESPECIFICOS PARA LA PROTEINA QUINASA FLK, MEDIANTE LA ADICION DE SUSTITUYENTES QUIMICOS A LA 3 - [(INDOL 3 - IL) METILEN] - 2 - INDOLINONA, ESPECIALMENTE EN LA POSICION 1'' DEL ANILLO INDOL. LOS COMPUESTOS DE INDOLINONA QUE INHIBEN ESPECIFICAMENTE LAS PROTEINA QUINASAS FLK Y EL FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DE PLAQUETAS, PUEDEN ALBERGAR UNA FRACCION TETRAHIDROINDOL O CICLOPENTANO - B - PIRROL. LOS COMPUESTOS DE INDOLINONA QUE ESTAN MODIFICADOS POR SUSTITUYENTES, ESPECIALMENTE EN LA POSICION 5 DEL ANILLO DE OXINDOL, PUEDEN ACTIVAR LAS PROTEINA QUINASAS DE FORMA EFECTIVA. LA INVENCION DESCRIBE ASIMISMO NUEVOS COMPUESTOS DE INDOLINONA HIDROSOLUBLES QUE SON INHIBIDORES DE TIROSINA QUINASA, ASI COMO PRODUCTOS Y PROCEDIMIENTOS RELACIONADOS.

Description

Bibliotecas combinatorias de indolinona y productos afines y métodos para el tratamiento de enfermedades.

Introducción

La presente invención se refiere a nuevos compuestos capaces de modular, regular y/o inhibir la transducción de señales de proteína-quinasas.

La presente invención se refiere además a un método de síntesis de estos compuestos, a composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos y al uso de tales compuestos en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de trastornos relacionados con la transducción de señales de proteína-quinasas desreguladas, incluidos los trastornos metabólicos y de proliferación celular.

Antecedentes de la invención

La siguiente descripción de los antecedentes de la invención se facilita para ayudar la comprensión de la invención, pero no pretende ser ni describir la técnica anterior de la invención.

Las proteína-quinasas y las proteína-fosfatasas regulan un amplio abanico de procesos celulares, incluidos el metabolismo, la proliferación celular, la diferenciación celular y la supervivencia celular, mediante la participación en los mecanismos de transducción de señales. Las alteraciones de la función celular de las proteína-quinasas o de las proteína-fosfatasas pueden dar lugar a diversos estados en un organismo. Por ejemplo, muchos tipos de tumores cancerosos están asociados con el aumento de actividad de proteína-quinasas específicas. La degeneración de las células y de los tejidos puede estar asociada con disminuciones de la actividad de proteína-quinasas concretas.

La transducción de señales celulares es un mecanismo fundamental, mediante el cual se transmiten los estímulos extracelulares al interior de las células. Uno de los mecanismos bioquímicos fundamentales de la transducción de señales implica la fosforilación reversible de las proteínas. La fosforilación de aminoácidos regula la actividad de las proteínas maduras, alterando su estructura y funcionamiento.

El fosfato reside con gran frecuencia en los restos hidroxilo de los aminoácidos serina, treonina o tirosina de las proteínas. Las enzimas que median la fosforilación de los efectores celulares se dividen en dos grupos. Las proteína-fosfatasas hidrolizan los restos fosfato de los sustratos fosforil-proteína, mientras que las proteína-quinasas transfieren un resto fosfato del adenosina-trifosfato a los sustratos proteicos. Las funciones inversas de las proteína-quinasas y de las proteína-fosfatasas equilibran y regulan el flujo de señales en los procesos de transducción de
señales.

Las proteína-quinasas se dividen en dos grupos: las proteínas de tipo receptor y las de tipo no receptor. Las proteína-quinasas de tipo receptor constan de una región extracelular, una región transmembrana y una región intracelular. Una parte de la región intracelular de las proteína-quinasas de tipo receptor alberga un dominio catalítico. Las proteína-quinasas de tipo no receptor no albergan regiones extracelulares ni transmembrana, pero sí contienen una región similar a las regiones intracelulares de sus homónimos de tipo receptor.

Las proteína-quinasas se dividen además en tres grupos, atendiendo a los aminoácidos sobre los que actúan. Algunas incorporan el fosfato solamente sobre la serina o la treonina, algunas incorporan el fosfato solamente sobre la tirosina y algunas incorporan el fosfato sobre la serina, la treonina y la tirosina.

En un esfuerzo por descubrir nuevos tratamientos de enfermedades, los investigadores biomédicos y los químicos han diseñado, sintetizado y ensayado moléculas que inhiben el funcionamiento de las proteína-quinasas. Algunas moléculas orgánicas pequeñas forman un grupo de compuestos que modulan el funcionamiento de las proteína-
quinasas.

Los compuestos que pueden atravesar las membranas celulares y son resistentes a la hidrólisis ácida son productos terapéuticos potencialmente ventajosos y pueden convertirse en altamente biodisponibles cuando se administran a los pacientes por vía oral. Sin embargo, muchos de estos inhibidores de proteína-quinasas inhiben de forma solamente débil el funcionamiento de las proteína-quinasas. Además, muchos de ellos inhiben una gran variedad de proteína-quinasas y como consecuencia pueden provocar múltiples efectos secundarios cuando se aplican como agentes terapéuticos para tratar enfermedades.

Sin embargo, algunos compuestos de indolinona forman grupos de moléculas orgánicas resistentes a los ácidos y capaces de atravesar membranas que pueden inhibir de forma potente solamente proteína-quinasas específicas. La síntesis de la indolinona, los métodos para verificar la actividad biológica de las indolinonas y los modelos de inhibición de algunos derivados de indolinona se describen en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada el 19 de diciembre de 1996 y titulada "Compuestos de bencilideno-Z-indolinona para el tratamiento de enfermedades", de Tang y col. (Lyon & Lyon Docket nº 223/298) y la publicación de patente internacional nº WO 96/22976, publicada con fecha 1 de agosto de 1996, de Ballinari y col.

A pesar del progreso significativo que se ha conseguido en el desarrollo de productos farmacéuticos basados en indolinonas, sigue habiendo demanda en la técnica por identificar las estructuras concretas y los modelos de sustitución que provocan la inhibición de proteína-quinasas concretas y otras actividades biológicas especificadas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a moléculas orgánicas capaces de modular, regular y/o inhibir la transducción de señales de las proteína-quinasas. Tales compuestos son útiles para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la transducción de señales descontrolada de proteína-quinasas, incluidas las enfermedades de proliferación celular, como son el cáncer, la aterosclerosis, la artritis y la restenosis y las enfermedades metabólicas, por ejemplo la diabetes. Las proteína-quinasas aludidas incluyen, pero no se limitan a: la Flk, el FDFR, el PDGFR y
el raf.

La presente invención describe compuestos de indolinona que inhiben de forma potente las proteína-quinasas y productos y métodos afines.

Los compuestos de indolinona, que inhiben específicamente la FLK y las proteína-quinasas del factor de crecimiento derivado de plaquetas, pueden albergar restos tetrahidroindol o ciclopentano-b-pirrol.

Este invención describe nuevos compuestos de indolinona solubles en agua que son inhibidores de la tirosina-quinasa y productos y métodos afines.

Los compuestos de la invención representan una nueva generación de agentes terapéuticos potenciales para enfermedades causadas por una o varias proteína-quinasas no funcionales. Las enfermedades neurodegenerativas están incluidas dentro de este grupo de enfermedades, que abarca pero sin limitarse a ellas la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Los compuestos pueden modificarse de tal manera que sean específicos de su diana o dianas y, por consiguiente, provocarán pocos efectos secundarios y por ello constituyen una nueva generación de agentes terapéuticos anticancerosos potenciales. Estas propiedades son mejoras significativas con respecto a los agentes terapéuticos anticancerosos utilizados convencionalmente, que provocan múltiples efectos secundarios y debilitan de forma nociva a los pacientes.

Se cree que los compuestos de la invención reducirán al mínimo y destruirán los tumores sólidos inhibiendo específicamente la actividad de la proteína-quinasa FLK o que por lo menos modularán o inhibirán el crecimiento tumoral y/o las metástasis. La proteína-quinasa FLK regula la proliferación de los vasos sanguíneos durante la angiogénesis. Un mayor nivel de angiogénesis acompaña el crecimiento de tumores cancerosos en células, dado que los tumores cancerosos tienen que alimentarse con sangre oxigenada durante su crecimiento. Por consiguiente, la inhibición de la proteína-quinasa FLK y la correspondiente reducción de la angiogénesis privará a los tumores de sus nutrientes y con gran probabilidad los destruirá.

Aunque no se requiera una comprensión precisa del mecanismo por el que los compuestos inhiben las PTK (p.ej. el receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos [FGFR1]) para la puesta en práctica de la presente invención, se cree que los compuestos interaccionan con los aminoácidos de la región catalítica de las PTK. Las PTK poseen como se sabe una estructura bilobulada y el ATP parece fijarse en la hendidura entre ambos lóbulos, en una región en la que los aminoácidos se conservan entre las PTK; los inhibidores de las PTK se cree que se fijan sobre las PTK mediante interacciones covalentes, por ejemplo enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Waals o enlaces iónicos, en el mismo espacio general que ocupa el anillo adenina del ATP. La especificidad para una PTK concreta puede conferirse a un inhibidor indolinona de PTK mediante las interacciones entre los constituyentes alrededor del núcleo oxindol con los dominios de aminoácidos específicos de las PTK individuales. Por consiguiente, diferentes sustituyentes de indolinona pueden contribuir a una fijación preferencial sobre una PTK concreta. La capacidad para seleccionar estos compuestos activos en diferentes sitios de fijación del ATP o de otros nucleótidos los convierte en útiles para alcanzar como diana cualquier proteína que disponga de tal sitio, no solo proteína-tirosina-quinasas, sino también serina/treonina-quinasas y proteína-fosfatasas. Por lo tanto, estos compuestos tienen utilidad para ensayos in vitro con tales proteínas y para efectos terapéuticos in vivo a través de dichas
proteínas.

\newpage

En un primer aspecto, la invención se refiere a un compuesto de indolinona de la siguiente fórmula:

1

2

en las que

(a) R_{1} se elige entre el grupo formado por:

(i)

hidrógeno;

(ii)

alquilo C_{1}-C_{10} que está opcionalmente sustituido por un anillo heterocíclico, monocíclico o bicíclico, de cinco, seis, ocho, nueve o diez eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por uno o varios halógenos o sustituyentes trihalometilo;

(iii)

un anillo heterocíclico, monocíclico o bicíclico, de cinco, seis, ocho, nueve o diez eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por uno o varios halógenos o sustituyentes trihalometilo;

(iv)

cetonas de las fórmulas -CO-R_{19}, en las que R_{19} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10} o un anillo heterocíclico de cinco a seis eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(v)

un ácido carboxílico de la fórmula -(R_{12})_{n}-COOH o un éster de la fórmula -(R_{13})_{m}-COO-R_{14}, en la que R_{12}, R_{13} y R_{14} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, y n y m con independencia entre sí son el número 0 ó 1;

(vi)

una sulfona de la fórmula -(SO_{2})-R_{15}, en la que R_{15} se elige entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por un resto alquilo C_{1}-C_{10};

(vii)

un -(R_{16})_{n}-(indol-1-ilo) o un -(R_{17})_{m}-CHOH-(R_{18})p-(indol-1-ilo), en los que el resto indol está opcionalmente sustituido por un aldehído y R_{16}, R_{17} y R_{18} son alquilo C_{1}-C_{10} y n, m y p, con independencia entre sí, son 0 ó 1;

(viii)

junto con un sustituyente que ocupe la posición 2' del anillo indol forma un resto tricíclico, cada anillo del resto tricíclico es un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(b) R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{10}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por:

(i)

hidrógeno;

(ii)

alquilo C_{1}-C_{10}, que está opcionalmente sustituido por un anillo heterocíclico, monocíclico o bicíclico, de cinco, seis, ocho, nueve o diez eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por uno o varios sustituyentes halógeno, aldehído o trihalometilo;

(iii)

un anillo heterocíclico, monocíclico o bicíclico, de cinco, seis, ocho, nueve o diez eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por uno o varios sustituyentes halógeno o trihalometilo;

(iv)

cetonas de la fórmulas -CO-R_{20}, en la que R_{20} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(v)

un ácido carboxílico de la fórmula -(R_{21})_{n}-COOH o un éster de la fórmula -(R_{22})-COO-R_{23}, en la que R_{21}, R_{22} y R_{23} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, y m y n con independencia entre sí son 0 ó 1;

(vi)

halógeno;

(vii)

un alcohol de la fórmula (R_{24})_{m}-OH o un éter de la fórmula -(R_{24})_{n}-O-R_{25}, en las que R_{24} y R_{25} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, y m y n con independencia entre sí son 0 ó 1;

(viii)

-NR_{26}R_{27}, en la que R_{26} y R_{27} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por hidrógeno, oxígeno, alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(ix)

-NHCOR_{28}, en el que R_{28} se elige entre el grupo formado por hidroxilo, alquilo C_{1}-C_{10}, un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno, -(R)_{n}-COOH, en el que R se elige entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} o arilo constituido por un grupo aromático monocíclico, bicíclico o tricíclico de 5 ó 6 eslabones, en el que por lo menos un anillo tiene un sistema conjugado de electrones pi y en el que n es 0 ó 1, o bien -(R)_{n}-COOR', en el que R y R' con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} o arilo constituido por un grupo aromático monocíclico, bicíclico o tricíclico de 5 ó 6 eslabones, en el que por lo menos un anillo tiene un sistema conjugado de electrones pi y en el que n es 0 ó 1;

(x)

-SO_{2}NR_{29}R_{30}, en el que R_{29} y R_{30} se eligen entre el grupo formado por hidrógeno, oxígeno, alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(xi)

dos cualesquiera de R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6} y R_{6'} o dos cualesquiera de R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{10}, tomados juntos, forman un resto heterocíclico, bicíclico o tricíclico, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, y está fusionado con el anillo de seis eslabones del indol, cada anillo del resto multicíclico es un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre; y

(c) R_{11} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{10}

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

El término "alquilo" significa un hidrocarburo alifático saturado de cadena lineal, ramificada o cíclica, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, con preferencia es un alquilo inferior de 1 a 7 átomos de carbono y con mayor preferencia de 1 a 4 átomos de carbono. Los grupos alquilo típicos incluyen el metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares. El grupo alquilo puede estar sustituido y algunos sustituyentes típicos del alquilo incluyen el hidroxilo, ciano, alcoxi, oxígeno, azufre, nitroxi, halógeno, -N(CH_{3})_{2}, amino y -SH.

El término "metilo" significa un resto alquilo saturado de un átomo de carbono. El término "etilo" indica un resto alquilo saturado de dos átomos de carbono. El término "propilo" indica un resto alquilo saturado de tres átomos de carbono. El término "butilo" indica un resto alquilo saturado de cuatro átomos de carbono. El término "pentilo" significa un resto alquilo saturado de cinco átomos de carbono.

El término "arilo" significa un grupo aromático que tiene por lo menos un anillo provisto de un sistema conjugado de electrones pi e incluye tanto a los grupos arilo carbocíclicos (p.ej. fenilo) como a los arilo heterocíclicos (p.ej. piridina). Los restos arilo incluyen anillos monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos, de los que cada anillo tiene con preferencia cinco o seis eslabones. El resto arilo puede estar sustituido y los sustituyentes típicos del arilo incluyen halógeno, trihalometilo, hidroxilo, -SH, -OH, -NO_{2}, amina, tioéter, ciano, alcoxi, alquilo y amino.

Los términos "heterociclo" o "heterocíclico" indican compuestos que forman un anillo y contienen hasta cuatro heteroátomos, los átomos restantes que forman el anillo son átomos de carbono. Por ejemplo, cada anillo de la estructura puede contener cero, uno, dos, tres o cuatro átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre dentro del anillo. El anillo puede estar con preferencia saturado con átomos de hidrógeno, con mayor preferencia alberga una o varias insaturaciones y con preferencia especial contiene un sistema arilo de electrones pi conjugados. Los anillos son con preferencia anillos de once, doce, trece o catorce eslabones, con mayor preferencia de ocho, nueve o diez eslabones y con preferencia especial de cinco o seis eslabones. Son ejemplos de tales anillos el furilo, el tienilo, el pirrol, el imidazolilo, el indolilo, el piridinilo, el tiadiazolilo, el tiazolilo, el piperazinilo, el dibenzofuranilo y el dibenzotienilo. Los anillos heterocíclicos de la invención pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o varios grupos funcionales, que están unidos por lo general a dichos anillos, p.ej. hidroxi, bromo, flúor, cloro, yodo, mercapto o tio, ciano, cianoamido, alquiltio, heterociclo, arilo, heteroarilo, carboxilo, oxo, alcoxicarbonilo, alquilo, alquenilo, nitro, amino, alcoxilo, amido y similares. Las estructuras de algunos anillos heterocíclicos preferidos son anillos fusionados, que se han mencionado anteriormente.

El término "aldehído" indica un grupo químico de la fórmula -(R)_{n}-CHO, en la que R se elige entre el conjunto formado por alquilo y arilo y n es 0 ó 1.

El término "cetona" indica un resto químico de la fórmula -(R)_{n}-CO-R', en la que R y R' se eligen entre el conjunto formado por alquilo y arilo y n es 0 ó 1.

El término "ácido carboxílico" indica un resto químico de la fórmula -(R)_{n}-COOH, en la que R se elige entre el conjunto formado por alquilo y arilo y n es 0 ó 1.

El término "éster" indica un resto químico de la fórmula -(R)_{n}-COOR', en la que R y R' con independencia entre sí se eligen entre el conjunto formado por alquilo y arilo y n es 0 ó 1.

El término "sulfona" indica un resto químico de la fórmula -SO_{2}-R, en el que R se elige entre el grupo formado por alquilo y arilo.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" indica una formulación de un compuesto que no provoca irritación significativa en un organismo y no merma la actividad biológica ni las propiedades del compuesto. Las sales farmacéuticas pueden obtenerse por reacción de un compuesto de la invención con ácidos inorgánicos, por ejemplo el ácido clorhídrico, el ácido bromhídrico, el ácido sulfúrico, el ácido nítrico, el ácido fosfórico, el ácido metanosulfónico, el ácido etanosulfónico, el ácido p-toluenosulfónico, el ácido salicílico y similares.

El término "profármaco" indica un agente que se convierte "in vivo" en el fármaco original. En ciertas situaciones, los profármacos pueden ser más fáciles de administrar que el fármaco original. Por ejemplo, el profármaco puede estar biodisponible por administración oral, pero el compuesto original no, o el profármaco puede tener una solubilidad mejor que permita su administración intravenosa.

Una forma preferida de ejecución de la invención se refiere a los compuestos de indolinona de las estructuras VIII y IX, en las que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10} y R_{11} son hidrógeno.

En otra forma preferida de ejecución, la invención se refiere a compuestos de oxindolinona de las estructuras VIII y XI, en las que R_{8} es bromo, cloro o NH_{2} y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{7}, R_{9}, R_{10} y R_{11} son hi-
drógeno.

En otra forma preferida de ejecución más, la invención se refiere a compuestos de indolinona de las estructuras VIII y XI, en las que R_{7} es metilo y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{8}, R_{9}, R_{10} y R_{11} son hidró-
geno.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de síntesis de un compuesto indolinona, dicho método consta de los pasos siguientes:

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(a) hacer reaccionar un aldehído de la fórmula X u XI con un oxindol de la fórmula XII,

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3

4

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5

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en las que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10} y R_{11} tienen los significados descritos y

(b) separar el compuesto indolinona de los reactivos aldehído y oxindol.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un compuesto oxindolinona de la invención y un vehículo o diluyente fisiológicamente aceptable.

En otro aspecto, la invención se refiere al compuesto indolinona o una sal descrita en esta solicitud que modula la actividad catalítica de una proteína-quinasa.

El término "modula" indica la capacidad de un compuesto de alterar la actividad catalítica de una proteína-quinasa. Un modulador activa con preferencia la actividad catalítica de una proteína-quinasa, con mayor preferencia: activa o inhibe la actividad catalítica de una proteína-quinasa en función de la concentración de compuesto a la que se expone la proteína-quinasa o con preferencia especial: inhibe la actividad catalítica de una proteína-quinasa.

El término "proteína-quinasa" define un grupo de proteínas que regulan una gran variedad de funciones celulares. Las proteína-quinasas regulan funciones celulares mediante la fosforilación reversible de sustratos proteicos, de este modo la proteína sustrato sufre un cambio de conformación. El cambio conformacional modula la actividad catalítica del sustrato o su capacidad de interaccionar con otros reactivos de fijación.

En el contexto de la invención, el término "actividad catalítica" define la velocidad con la que una proteína-quinasa fosforila un sustrato. La actividad catalítica puede medirse, por ejemplo, determinando la cantidad de un sustrato que se convierte en un producto, en función del tiempo. La fosforilación de un sustrato tiene lugar en un sitio activo de una proteína-quinasa. El sitio activo es normalmente una cavidad, en la que el sustrato se fija sobre la proteína-quinasa y se fosforila.

Una forma preferida de ejecución de la invención se refiere a un compuesto de indolinona que inhibe la actividad catalítica de una proteína-quinasa FLK. La indolinona inhibe con preferencia la actividad catalítica de la proteína-quinasa FLK con una IC50 de menos de 50 \muM, con mayor preferencia con una IC50 de menos de 5 \muM y con preferencia especial con una IC50 inferior de menos de 0,5 \muM.

El término "FLK" indica una proteína-quinasa que fosforila los restos tirosina de los sustratos proteicos. La proteína-quinasa FLK regula las funciones celulares en respuesta al factor de crecimiento VEGF. Estas funciones celulares incluyen, pero no se limitan a: la proliferación celular y, en particular, la proliferación de vasos sanguíneos en tejidos.

En el contexto de la invención, el término "IC_{50}" indica un parámetro que describe la concentración de una indolina concreta que se requiere para inhibir en un 50% la actividad catalítica de la proteína-quinasa FLK. El parámetro IC_{50} puede medirse utilizando un ensayo descrito en esta solicitud y variando la concentración de un compuesto indolinona concreto.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un compuesto indolinona o una sal de la invención y un vehículo o diluyente fisiológicamente aceptable.

El término "composición farmacéutica" indica una mezcla de un compuesto indolinona de la invención y otros componentes químicos, por ejemplo vehículos o diluyentes. La composición farmacéutica facilita la administración de un compuesto a un organismo. En la técnica existen múltiples técnicas de administración de un compuesto, incluidas, pero sin limitarse a ellas: la administración oral, la inyección, el aerosol, la administración parenteral y la tópica. Las composiciones farmacéuticas pueden fabricarse también por reacción de compuestos con ácidos inorgánicos, tales como el ácido clorhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares.

El término "fisiológicamente aceptable" define un vehículo o un diluyente que no causa irritación significativa en un organismo y no merma la actividad biológica ni las propiedades del compuesto.

El término "vehículo" indica un compuesto químico que facilita la incorporación de un compuesto a las células o tejidos. Por ejemplo, el sulfóxido de dimetilo (DMSO) es un vehículo utilizado habitualmente, porque facilita la absorción de muchos compuestos orgánicos en las células o en los tejidos de un organismo.

El término "diluyente" define a compuestos químicos diluidos en agua que disolverán el compuesto de interés y estabilizarán la forma biológicamente activa del compuesto. En la técnica se utilizan como diluyentes las sales disueltas en soluciones tamponadas. Una solución tamponada que se utiliza habitualmente es la solución salina tamponada con fosfato, porque imita las condiciones salinas de la sangre humana. Dado que las sales tamponadas pueden controlar el pH de una solución en concentraciones bajas, un diluyente tamponado raramente modifica la actividad biológica de un compuesto.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del compuesto indolinona de la invención para la fabricación de un medicamento destinado a prevenir o tratar un estado anormal del organismo. El estado anormal va asociado con una aberración en los mecanismos de transducción de señales, caracterizada por una interacción entre una proteína-quinasa y un reactivo natural de fijación.

El término "prevenir" indica un método para impedir que el organismo adquiera un estado anormal.

El término "tratar" indica un método para aliviar o eliminar un estado anormal del organismo.

El término "organismo" indica cualquier ser viviente que consta por lo menos de una célula. Un organismo puede ser tan simple como una sola célula eucariótica o tan complejo como un mamífero.

El término "estado anormal" indica una función de las células o de los tejidos de un organismo que se aparta de sus funcionales normales en el organismo. Un estado anormal puede indicar la proliferación celular, la diferenciación celular o la supervivencia celular.

Los estados proliferantes celulares aberrantes incluyen el cáncer, por ejemplo los trastornos fibróticos y mesangiales, la angiogénesis anormal y la vasculogénesis, la curación de las heridas, la psoriasis, la diabetes mellitus y la inflamación.

Los estados de diferenciación aberrante incluyen, pero no se limitan a: los trastornos neurodegenerativos, las velocidades lentas de curación de las heridas y las técnicas de injerto de tejidos.

Los estados aberrantes de supervivencia celular indican los estados en los que se activan o se suprimen los mecanismos de muerte celular (apóptosis) programada. Un gran número de proteína-quinasas están asociadas con los mecanismos de la apóptosis. Las aberraciones de la función de cualquier proteína-quinasa pueden conducir a la inmortalidad celular o a la muerte prematura de las células.

La proliferación, diferenciación y supervivencia celulares son fenómenos que se miden fácilmente por métodos ya conocidos de la técnica. Estos métodos pueden incluir la observación del número de células o el aspecto de las células con el microscopio a lo largo del tiempo (días).

El término "administración" indica un método de incorporación de un compuesto a las células o a los tejidos de un organismo. El estado anormal puede prevenirse o tratarse cuando las células o tejidos de un organismo existen dentro del organismo o fuera del organismo. Las células que existen fuera del organismo pueden mantenerse o cultivarse en platos de cultivo celular. Para células albergadas dentro del organismo existen muchas métodos en la técnica para administrar compuestos, incluidas (pero sin limitarse a ellas) las aplicaciones oral, parenteral, dérmica, por inyección y por aerosol. Para las células que se hallan fuera del organismo existen múltiples métodos en la técnica para administrar los compuestos, incluidas (pero sin limitarse a ellas) las técnicas de microinyección celular, las técnicas de transformación y las técnicas de transporte.

El estado aberrante puede prevenirse o tratarse también por administración a un organismo de un grupo de células que tengan una aberración en un proceso de transducción de señales. Entonces puede hacerse el seguimiento del efecto de la administración de un compuesto en la función de un organismo. La técnica contempla múltiples métodos para introducir un grupo de células en un organismo, así como métodos para administrar un compuesto a un organismo. El organismo es con preferencia una rana, con mayor preferencia un ratón, una rata, un conejo, un cobaya o una cabra, con preferencia especial un mono o un simio.

El término "mecanismos de transducción de señales" indica las moléculas que propagan una señal extracelular a través de las membranas celulares para convertirla en una señal intracelular. Entonces, esta señal puede estimular una respuesta celular. Las moléculas de polipéptido que participan en los procesos de transducción de señales son por ejemplo proteína-quinasas de receptor o de no receptor, proteína-fosfatasas de receptor o de no receptor, factores de intercambio de nucleótidos y factores de transcripción.

El término "aberración" en relación con un proceso de transducción de señales indica una proteína-quinasa que está sobre- o infra-expresada en un organismo, que ha mutado de tal manera que su actividad catalítica es menor o mayor que la actividad de la proteína-quinasa de tipo salvaje, que ha mutado de tal manera que ya no interacciona con el reactivo natural de fijación, que ya no se modifica por acción de otra proteína-quinasa o de otra proteína-fosfatasa o que ya no interacciona con los reactivos naturales de fijación.

El término "reactivo natural de fijación" indica un polipéptido que normalmente se fija sobre la región intracelular de una proteína-quinasa en una célula. Estos reactivos naturales de fijación pueden desempeñar un papel importante en la propagación de una señal en un proceso de transducción de señales de proteína-quinasas. El reactivo natural de fijación puede fijarse sobre una región intracelular de una proteína-quinasa con alta afinidad. Alta afinidad significa una constancia de fijación en equilibrio del orden del 10^{-6} M o menos. Sin embargo, un reactivo natural de fijación puede interacción también de forma transitoria con una región intracelular de una proteína-quinasa y modificarla químicamente. Los reactivos naturales de fijación de proteína-quinasas se eligen entre el grupo formado por, pero sin limitarse a ellos, los dominios de homología src 2 (SH2) o 3 (SH3), otros dominios de fijación de la fosforil-tirosina (PTB) y otras proteína-quinasas u otras proteína-fosfatasas.

El término "promover o romper la interacción anormal" indica un método que puede llevarse a cabo administrando un compuesto de la invención a células o tejidos de un organismo. Un compuesto puede promover una interacción entre una proteína-quinasa y los reactivos naturales de fijación formando interacciones favorables con múltiples aminoácidos en la interfase del complejo. Como alternativa, un compuesto puede inhibir una interacción entre una proteína-quinasa y los reactivos naturales de fijación comprometiendo las interacciones favorables formadas entre los aminoácidos en la interfase del complejo.

Una forma preferida de ejecución de la invención se refiere al uso descrito anteriormente, en el que el organismo es un mamífero.

El término mamífero indica con preferencia organismos del tipo ratones, ratas, conejos, cobayas y cabras, con mayor preferencia monos y simios y con preferencia especial los humanos.

Otra forma preferida de ejecución de la invención se refiere al uso descrito anteriormente, en el que la proteína quinasa es la proteína-quinasa FLK o una proteína-quinasa de factor de crecimiento derivado de plaquetas.

La indolinona inhibe con preferencia la actividad catalítica de la proteína-quinasa del factor de crecimiento derivado de plaquetas con una IC_{50} de menos del 50 \muM, con mayor preferencia con una IC_{50} de menos de 5 \muM y con preferencia especial con una IC_{50} de menos de 0,5 \muM.

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El término "factor de crecimiento derivado de plaquetas" indica una proteína-quinasa que fosforila los restos tirosina de los sustratos. La proteína-quinasa del factor de crecimiento derivado de plaquetas regular las funciones celulares en respuesta al factor de crecimiento PDGF. Estas funciones celulares incluyen, pero no se limitan a la proliferación celular.

Las fórmulas químicas mencionadas en esta solicitud pueden presentar fenómenos de tautomería o de isomería estructural. Por ejemplo, los compuestos descritos en la presente pueden adoptar una conformación cis o trans con respecto al doble enlace que conecta el sustituyente de la posición 3 del anillo de la indolinona o pueden ser mezclas de isómeros cis y trans. Aunque las fórmulas representadas en esta descripción representen únicamente una forma tautómera o isómera estructural posible, se da por supuesto que la invención abarca todas las formas tautómeras o isómeras estructurales y las mezclas de las mismas que posean la capacidad de regular, inhibir y/o modular la transducción de señales de tirosina-quinasa o la proliferación celular y no se limitan a ninguna forma tautómera ni isómera estructural individual que se utilice para dibujar las fórmulas.

Además de los compuestos descritos anteriormente, la invención se refiere además, si procede, a las formas solvatadas y no solvatadas de los compuestos (p.ej. las formas hidratadas) que tienen la capacidad de regular y/o modular la proliferación celular.

Los compuestos descritos pueden obtenerse por cualquier proceso conocido que sea aplicable a la obtención de compuestos químicamente afines. Los procesos idóneos se ilustran en los ejemplos. Los materiales de partida necesarios pueden obtenerse por procedimientos estándar de la química orgánica.

La actividad y eficacia relevantes de un compuesto individual como agente para afectar la transducción de señales mediada por la tirosina-quinasa de receptor puede determinarse aplicando las técnicas disponibles. Con preferencia se somete un compuesto a una serie de exploraciones para determinar la capacidad del compuesto para modular, regular y/o inhibir la proliferación celular. Estas exploraciones, en el orden de ejecución, incluyen los ensayos bioquímicos, los ensayos de cultivo celular y los ensayos in vivo.

El resumen de la invención recién descrito no es limitante y otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras y tablas

En la tabla 1 se recogen los oxindoles preferidos que pueden utilizarse en la presente invención.

En la tabla 2 se recogen ejemplos de compuestos de la invención. La tabla ilustra la estructura molecular de cada indolinona, el peso molecular del compuesto y la fórmula química del mismo.

En las tabla 3 y 4 se recogen la actividad biológica de los compuestos seleccionados de la invención. Se da una lista de las estructuras químicas de los compuestos y de los valores IC_{50} medidos en los ensayos biológicos de inhibición de la proteína-quinasa FLK-1 y en la proteína-quinasa del factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGFR).

En la tabla 5 se recogen los nombres de diversos compuestos de indolinona de la presente invención.

En la tabla 6 se recogen los datos de quinasa de los compuestos que figuran en la lista de la tabla 5, determinados aplicando los ensayos descritos en la presente.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere en parte al diseño de inhibidores de proteína-quinasa que eliminen los tumores desconectándolos de sus fuentes de alimentación. Los inhibidores se diseñan para fijar específicamente proteína-quinasas sobreexpresadas en el sistema vascular que abastece a los tumores con alimentos. Una de las proteína-quinasas diana es la FLK-1, que está sobreexpresada en células endoteliales proliferantes de un tumor en crecimiento, pero no en las células endoteliales quiescentes que lo envuelven, Plate y col., Nature 359, 845-858, 1992.

La FLK-1 se activa después de la fijación del VDGF, un fuerte regulador de la proliferación celular endotelial así como de la angiogénesis normal y patológica, ver Klagsburn y Soker, Current Biology 3, 699-702, 1993. Por lo tanto, los compuestos que inhiben específicamente la proteína-quinasa FLK son potenciales agentes anticancerosos, ya que reducen el sistema vascular que nutre a los tumores. Estos inhibidores tendrán como resultado probable la minimización e incluso la eliminación de los tumores sólidos. Además, los compuestos que inhiben específicamente la FLK representarán potencialmente una nueva generación de agentes terapéuticos anticancerosos, ya que con mucha probabilidad provocarán pocos efectos secundarios. Estas propiedades potenciales suponen una mejora deseada con respecto a los agentes anticancerosos utilizados habitualmente, que provocan múltiples efectos secundarios y debilitan nocivamente a los pacientes.

Síntesis de compuestos de indolinona

Los compuestos indolinona de la invención se sintetizan por reacción de un aldehído con un oxindol, del modo descrito en los ejemplos que se facilitan. Las descripciones y los métodos para la síntesis de los compuestos de indolinona se proporcionan en los ejemplos que siguen. Los ejemplos describen en su totalidad los disolventes, las temperaturas, las técnicas de separación y otras condiciones utilizadas para la invención. Otras técnicas de síntesis, por ejemplo las descritas en las publicaciones de patente internacional WO 96/22976, publicada con fecha 1 de agosto de 1996, de Ballinari y col., y la WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col., pueden ser también útiles o adaptarse según los conocimientos de los técnicos en la materia para obtener los compuestos de la presente invención. Las descripciones de los métodos aplicados para la síntesis específica de los compuestos de indolinona de la invención se publican a continuación.

Actividad biológica de los compuestos indolinona

En los ensayos biológicos puede verificarse la capacidad de los compuestos de indolinona de la invención para activar o para inhibir las proteína-quinasas. Los métodos empleados para medir la modulación de la indolinona sobre la función de la proteína-quinasa se describen a continuación. Se comprueba la capacidad de los compuestos de indolinona de la invención para inhibir la proteína-quinasa FLK. El ensayo biológico y los resultados de estos estudios de inhibición se describen a continuación.

Enfermedades que pueden ser objetivo del tratamiento con los compuestos de indolinona

Las proteína-quinasas son moléculas reguladoras esenciales que controlan una gran variedad de funciones celulares. Por esta razón, cualquier alteración de la función de una proteína-quinasa puede provocar un estado anormal en el organismo. Una de las muchas funciones controladas por las proteína-quinasas es la proliferación celular.

Las alteraciones de la función de una proteína-quinasa que normalmente regular la proliferación celular pueden conducir a un estado ampliado o disminuido de proliferación celular, que se manifiesta en ciertas enfermedades. Los estados proliferantes celulares aberrantes incluyen el cáncer, por ejemplo los trastornos fibróticos y mesangiales, la angiogénesis y la vasculogénesis anormales, la curación de las heridas, la psoriasis, la restenosis, la diabetes mellitus y la inflamación.

Los trastornos fibróticos y los trastornos de proliferación de células mesangiales se describen en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

Los trastornos angiogénicos y vasculogénicos resultan de una proliferación excesiva de los vasos sanguíneos. La proliferación de vasos sanguíneos es necesaria en un gran número de procesos fisiológicos normales, por ejemplo el desarrollo embrionario, la formación del cuerpo lúteo, la curación de las heridas y la regeneración de un órgano. Sin embargo, la proliferación de vasos sanguíneos es esencial además para el desarrollo de tumores cancerosos. Otros ejemplos de trastornos de proliferación de vasos sanguíneos incluyen la artritis, en la que los nuevos capilares sanguíneos invaden la articulación y destruyen el cartílago. Además, los trastornos de proliferación de vasos sanguíneos incluyen las enfermedades oculares, por ejemplo la retinopatía diabética, en la que los nuevos capilares de la retina invaden el humor vítreo, sangran y causan la ceguera. Al revés, los trastornos relacionados con el estrechamiento, la contracción o el cierre de vasos sanguíneos, por ejemplo la restenosis, intervienen también en la regulación adversa de las RPK o de las RPP.

Además, la vasculogénesis y la angiogénesis están asociadas con el crecimiento de tumores sólidos malignos y con las metástasis. Un tumor sólido que crece vigorosamente requiere un nutriente y un abastecimiento sanguíneo rico en oxígeno para continuar creciendo. Por consiguiente, un número anormalmente grande vasos sanguíneos capilares crecen a menudo de forma sincronizada con el tumor y actúan como líneas de abastecimiento del mismo. Además de aportar nutrientes al tumor, los nuevos vasos sanguíneos incrustados en el tumor proporcionan una puerta para la entrada de células tumorales en el torrente circulatorio y metastasizarse en sitios distantes del organismo, ver Folkman: J. Natl. Cancer Inst. 82, 4-6, 1990.

Los trastornos angiogénicos y vasculogénicos están estrechamente relacionados con la proteína-quinasa FLK. La FLK-1 se activa por fijación del VEGF, un fuerte regulador de la proliferación de células endoteliales así como de la angiogénesis normal y patológica, ver Klagsburn y Soker: Current Biology 3, 699-702, 1993. Por lo tanto, los compuestos que inhiben específicamente la proteína-quinasa FLK son potenciales agentes anticancerosos, porque pueden reducir el sistema vascular que nutre a los tumores. Estos inhibidores producirán con gran probabilidad una minimización e incluso una eliminación de los tumores sólidos. Además, los compuestos que inhiben específicamente la FLK representarán potencialmente una nueva generación de agentes terapéuticos anticancerosos, dado que con gran probabilidad provocarán pocos efectos secundarios. Estas propiedades potenciales constituyen una mejora significativa con respecto a los agentes terapéuticos anticancerosos utilizados habitualmente, que provocan múltiples efectos secundarios y debilitan nocivamente a los pacientes.

Además de la proliferación celular, algunas RPK y RPP regulan las penúltimas funciones celulares, la supervivencia celular y la muerte celular. El factor de crecimiento derivado de gliales (GDNF) activa el c-ret, por ejemplo colocando múltiples receptores c-ret juntos, en una proximidad estrecha, y promoviendo la fosforilación cruzada de las regiones intracelulares. Las moléculas de transducción de señales, que forman un complejo con el c-ret como resultado de estos restos fosforilo, por ejemplo el grb-2, sos, ras y raf, propagan una señal a la célula que promueve la supervivencia de neuronas. Por ello, los compuestos que promueven las interacciones de estas moléculas estimuladoras de c-ret podrían ampliar la actividad de la c-ret. Como alternativa, las proteína-fosfatasas pueden eliminar los restos fosforilo situados en la región intracelular de la c-ret como respuesta al GDNF y de este modo inhibir la capacidad de señalización de la c-ret. Por consiguiente, los compuestos que inhiben las fosfatasas de la c-ret ampliarán la capacidad de señalización de la c-ret. En el contexto de la presente invención, la proteína-quinasa c-ret podría activarse con compuestos indolinona que estén modificados por sustituyentes, en particular en la posición 5 del anillo oxindol.

La c-ret interviene en el desarrollo y supervivencia de neuronas entéricas, sinápticas y sensoras y de neuronas del sistema renal, después de estimularse con el GDNF. La falta de mutaciones funcionales en la c-ret puede conducir a la enfermedad de Hirschsprung, por ejemplo, que se manifiesta en forma de disminución de la inervación del tracto intestinal de los pacientes. Por lo tanto, los compuestos que activan la c-ret son potenciales agentes terapéuticos para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, incluidos, pero sin limitarse a ellos, la enfermedad de Hirschsprung, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica. Los compuestos que inhiben la función de la c-ret son posibles agentes anticancerosos, dado que la sobreexpresión de la ret en las células participa en el cáncer, por ejemplo en el cáncer de tiroides.

Composiciones farmacéuticas y administración de compuestos de indolinona

Los métodos de fabricación de formulaciones farmacéuticas de los compuestos, los métodos de determinación de las cantidades de los compuestos que hay que administrar a un paciente y los modos de administración de los compuestos a un organismos se describen en la publicación de patente internacional nº WO 96/22976, publicada con fecha 1 de agosto de 1996, de Ballinari y col.

Los expertos en la materia sabrán comprender que dichas descripciones son aplicables a la presente invención y que pueden adaptarse fácilmente a ella. El mecanismo de tal acción y los posibles usos de tales compuestos se describen en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

Los compuestos descritos en la presente solicitud pueden administrarse a un paciente humano tal cual o en composiciones farmacéuticas en las que se mezclan con vehículos o excipientes idóneos. Las técnicas de formulación y de administración de los compuestos de la presente solicitud pueden hallarse en la última edición del manual "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, o en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha de 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

Dosificación eficaz

Las composiciones farmacéuticas idóneas para el uso en la presente invención incluyen aquellas composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr la finalidad pretendida. Más en concreto, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de compuesto que es eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o para prolongar la supervivencia del sujeto tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz es una tarea que compete a la capacidad de los expertos en la materia, en especial a la luz de la publicación detallada que se facilita en la presente y en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

Envase

Si se desea, las composiciones pueden presentarse en un envase o en un dispositivo dispensador que puede contener una o varias unidades de dosificación que contengan el ingrediente activo según la descripción facilitada en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes no son limitadores y son únicamente representativos de varios aspectos y características de la presente invención. Los ejemplos ilustran los métodos de síntesis de compuestos de indolinona de la invención. Los ejemplos ilustran además la especificidad y la potencia con la que estos compuestos inhiben la función de la proteína-quinasa en las células.

Ejemplo 1

Síntesis de compuestos

Los compuestos de la presente invención pueden sintetizarse con arreglo a técnicas bien conocidas, como son las descritas en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col. Los siguientes métodos son métodos preferidos de síntesis de los compuestos de la invención reivin-
dicada.

(a) Obtención del 4-metil-2-oxindol

Se añade con agitación el oxalato de dietilo (30 ml) en 20 ml de éter seco a 19 g de etóxido potásico en suspensión en 50 ml de éter seco. Se enfría la mezcla en un baño de hielo y se añaden lentamente 20 ml de 3-nitro-o-xileno en
20 ml de éter seco. Se calienta a reflujo la mezcla viscosa de color rojo oscuro durante 0,5 h, se concentra para obtener un sólido de color rojo oscuro y se trata con hidróxido sódico del 10% hasta que se haya disuelto la práctica totalidad del sólido. Se trata la mezcla de color rojo oscuro con peróxido de hidrógeno del 30% hasta que desaparezca el color oscuro. Se filtra el sólido y se acidifica el líquido filtrado con ácido clorhídrico 6N. Se recoge el precipitado resultante por filtración con vacío, se lava con agua y se seca con vacío, obteniéndose 9,8 g (rendimiento: 45%) del ácido
1-metil-6-nitrofenilacético en forma de sólido blanco mate. Se hidrogena el sólido en metanol con paladio al 10% sobre carbón, obteniéndose 9,04 g del compuesto epigrafiado en forma de sólido blanco.

(b) Obtención del 5-nitro-2-oxindol

Se disuelve el 2-oxindol (6,5 g) en 25 ml de ácido sulfúrico concentrado y se mantiene la mezcla entre -10 y -15ºC al tiempo que se le añaden por goteo 2,1 ml de ácido nítrico fumante. Una vez finalizada la adición del ácido nítrico se agita la mezcla reaccionante a 0ºC durante 0,5 h y se vierte sobre agua-hielo. Se recoge el precipitado por filtración, se lava con agua y se cristaliza en ácido acético del 50%. A continuación se filtran los cristales finos, se lavan con agua y se secan con vacío, obteniéndose 6,3 g (70%) del 5-nitro-2-oxindol.

(c) Obtención del 5-amino-2-oxindol

Se hidrogena el 5-nitro-2-oxindol (6,3 g) en metanol con paladio al 10% sobre carbón, obteniéndose 3,0 g (rendimiento: 60%) del compuesto epigrafiado en forma de sólido blanco.

(d) Obtención del 5-fluor-2-oxindol

Se disuelve la 5-fluorisatina (8,2 g) en 50 ml de hidrazina hidratada y se mantiene en ebullición a reflujo durante
1 h. Seguidamente se vierte la mezcla reaccionante sobre agua-hielo. Después se filtra el precipitado, se lava con agua y se seca en una estufa de vacío, obteniéndose 6,0 g del 5-fluor-2-oxindol (rendimiento: 79%).

(e) Obtención del 5-bromo-2-oxindol

Se enfría a -10ºC el 2-oxindol (1,3 g) en 20 ml de acetonitrilo y se le añaden lentamente con agitación 2,0 g de N-bromosuccinimida. Se agita la mezcla reaccionante a -10ºC durante 1 hora y a 0ºC durante 2 horas. Se recoge el precipitado, se lava con agua y se seca, obteniéndose 1,9 g (rendimiento: 90%) del compuesto epigrafiado.

(f) Obtención del 5-carboxi-2-oxindol

Paso 1

Síntesis del 5-metoxicarbonil-2-oxindol

Se mantiene en ebullición a reflujo el 5-yodo-2-oxindol (17 g) con 2 g de diacetato de paladio, 18,15 g de trietilamina, 150 ml de metanol, 15 ml de sulfóxido de dimetilo y 2,6 g de DPPP en una atmósfera saturada de monóxido de carbono. Después de 24 horas se filtra la mezcla reaccionante para separar el catalizador y se concentra el líquido filtrado. Se cromatografía el material concentrado a través de gel de sílice con acetato de etilo al 30% en hexano. Se concentran las fracciones que contienen producto y se dejan en reposo. Se recoge el producto precipitado por filtración con vacío, obteniéndose 0,8 g (7%) del compuesto epigrafiado en forma de sólido blanco mate.

Paso 2

Síntesis del 2-carboxi-2-oxindol

Se mantiene en ebullición a reflujo durante 3 horas el 3-metoxicarbonil-2-oxindol (1 g) y 1 g de hidróxido sódico en 20 ml de metanol. Se enfría la mezcla reaccionante y se concentra a sequedad. Se disuelve el residuo en agua y se extrae dos veces con acetato de etilo. Se acidifica la capa acuosa con ácido clorhídrico 6 N y se recoge el sólido precipitado, se lava con agua y se seca, obteniéndose 0,7 g (78%) del compuesto epigrafiado en forma de sólido blanco mate.

(g) Obtención del 5-carboxietil-2-oxindol

Paso 1

Síntesis del 5-cloroacetil-2-oxindol

Se añade a temperatura ambiente el cloruro de aluminio (30,8 g) y 2-oxindol (5,0 g) a 200 ml de disulfuro de carbono y se agita la mezcla. Se añade cloruro de cloroacetilo (3,8 ml) y se continúa la agitación durante 1 hora. Se calienta la mezcla a reflujo durante 3 horas, se enfría y se decanta el disolvente. Se agita el residuo en agua-hielo hasta que se obtiene una suspensión de un sólido. Se recoge el sólido por filtración con vacío, se lava con agua y se seca, obteniéndose 7,0 g (rendimiento: 90%) del compuesto epigrafiado.

Paso 2

Síntesis del 5-cloroetil-2-oxindol

Se añade el 5-cloroacetil-2-oxindol (7,0 g) a 25 ml de ácido trifluoracético y se enfría la mezcla con agitación en un baño de hielo. Se añade por goteo durante 2 minutos el trietilsilano (12,3 ml). Después se agita la agitación a temperatura ambiente durante 4 horas y se vierte sobre agua-hielo. Se añade hexano, se agita la mezcla vigorosamente y se recoge el sólido por filtración con vacío y se lava con hexano, obteniéndose 5,9 g (rendimiento: 91%) del producto en forma de sólido blanco.

Paso 3

Síntesis del 5-cianoetil-2-oxindol

Se añade cianuro potásico (2,02 g) a 15 ml de sulfóxido de dimetilo y se calienta a 90ºC. Se añade lentamente y con agitación el 5-cloroetil-2-oxindol (3,0 g) disuelto en 5 ml de sulfóxido de dimetilo y se calienta la mezcla reaccionante a 150ºC durante 2 horas. Se enfría la mezcla, se vierte sobre agua-hielo y se recoge el precipitado por filtración con vacío, se lava con agua y se seca, obteniéndose el producto en bruto. Se cromatografía el material en bruto a través de gel de sílice en metanol al 5% en cloroformo, obteniéndose 1,2 g (rendimiento: 42%) del compuesto epigrafiado.

Paso 4

Síntesis del 5-carboxietil-2-oxindol

Se mantiene en ebullición a reflujo durante 4 horas el 5-cianoetil-2-oxindol (4,02 g) en 10 ml de agua que contiene 25 ml de ácido clorhídrico concentrado. Se enfría la mezcla, se añade agua y se recoge el sólido resultante por filtración con vacío, se lava con agua y se seca, obteniéndose 1,9 g (rendimiento: 44%) del compuesto epigrafiado en forma de sólido blanco.

(h) Obtención del 3,5-dimetilpirrol-2-carboxaldehído

Se mantiene en reflujo 4 horas el 5-cianoetil-2-oxindol (4,02 g) en 10 ml de agua que contiene 25 ml de ácido clorhídrico concentrado. Se enfría la mezcla, se añade agua y se recoge el sólido resultante por filtración con vacío, se lava con agua y se seca, obteniéndose 1,9 g (rendimiento: 44%) del compuesto epigrafiado en forma de sólido blanco.

(i) Obtención del 3,5-dimetilpirrol-2-carboxaldehído

A una solución de dimetilformamida (80,4 g) en 1 l de dicloroetano se le añade a 0ºC durante unos minutos el oxicloruro de fósforo (153,3 g) y se agita la mezcla reaccionante a 0ºC durante 1-2 h. Se añade por goteo el
2,4-dimetilpirrol (114,6 g) a la solución anterior a una temperatura inferior a 5ºC. Una vez finalizada la adición se calienta la mezcla reaccionante y se aísla la capa acuosa y se guarda. Se extrae la fase orgánica de nuevo con 300 ml de agua y se combinan las dos fases acuosas. Se extrae la fase acuosa con 200 ml de dicloroetano y se desecha la fase orgánica. Se enfría la fase acuosa a 10ºC y se ajusta a pH 10 con hidróxido sódico del 10%. Se agita la mezcla a 10ºC durante 2 h. Se recoge el sólido amarillo por filtración con vacío y se lava a fondo con agua. Se seca el sólido a temperatura ambiente con vacío, obteniéndose 110,8 g (rendimiento: 90%) del 2,4-dimetil-5-formilpirrol.

(j) Obtención del 3,5-dietilpirrol-2-carboxaldehído

Se calienta a 95-100ºC durante 1,25 h una solución de 25,0 g de la 3,5-heptanodiona y 42,3 g del clorhidrato del aminomalonato de dietilo en 200 ml de ácido acético. Se añade acetato sódico, se agita la mezcla reaccionante durante 5,35 h y se enfría durante 4 h. Se filtra la sal y se lava con ácido acético. A continuación se concentra la solución de ácido acético y se vierte el residuo sobre 800 ml de agua. Se filtra el sólido amarillo y se seca durante una noche en una estufa conectada al vacío, obteniéndose 36,0 g del 3,5-dietilpirrol-2-carboxalato de etilo en forma de líquido anaranjado (rendimiento: 92%).

Por descarboxilación del 3,5-dietilpirrol-2-carboxalato de etilo por hidrólisis se obtiene el 2,4-dietilpirrol. A continuación se sintetiza el compuesto epigrafiado por reacción de Vilsmeier del 2,4-dietilpirrol en las mismas condiciones utilizadas para la obtención del 3,5-dimetilpirrol-5-carboxaldehído.

(k) Obtención del 3,5-diisopropilpirrol-2-carboxaldehído

El procedimiento es el mismo que el empleado para la obtención del 3,5-dietilpirrol-2-carboxaldehído, excepto que ahora se parte de la 2,6-dimetil-3,5-heptanodiona.

Ejemplo 2

Inhibición de la FLK con compuestos de indolinona de la invención

Se lleva a cabo un ensayo inmunoenzimático (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) para medir la actividad catalítica del receptor de la FLK-1 y, más en concreto, la inhibición o la activación causada por los compuestos de indolinona en la actividad catalítica del receptor de FLK-1. Específicamente se lleva a cabo el siguiente ensayo para medir la actividad catalítica del receptor de FLK-1 en las células FLK-1/NIH3T3.

Los materiales y el método para el ensayo ELISA de la FLK-1 se describen en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada el 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

Se ensayan los compuestos seleccionados en el ensayo ELISA de la FLK-1. Los resultados de las mediciones IC50 se recogen en las tablas. Se pone de manifiesto que los derivados de compuestos 3-[(indol-3-il)metileno]-2-indolinona con un sustituyente metilo en la posición 1' son los inhibidores más potentes del grupo de compuestos probados en este ensayo.

Ejemplo 3

Ensayos de la RTK in vitro

Los siguientes ensayos "in vitro" pueden utilizarse para determinar los niveles de actividad y de efecto de los diferentes compuestos de la presente invención en una o en varias de las RTK. Pueden diseñarse ensayos similares con las mismas líneas para cualquier tirosina-quinasa utilizando métodos bien conocidos de la técnica.

(a) Ensayo inmunoenzimático (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)

Puede utilizarse el ensayo inmunoenzimático (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) para detectar y medir la presencia de actividad de la tirosina-quinasa. El ensayo ELISA puede llevarse a cabo con arreglo a métodos ya conocidos, que se describen por ejemplo en Voller y col., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", en el "Manual of Clinical Immunology", 2ª ed., coordinado por Rose y Friedman, pp. 359-371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C., 1980.

El método publicado puede adaptarse para determinar la actividad con respecto a una RTK específica. Por ejemplo, los métodos preferidos para llevar a cabo los ensayos ELISA para RTK específicas se describen a continuación. La adaptación de estos métodos para determinar la actividad de un compuesto para otros miembros de la familia RTK así como para otros tirosina-quinasas de receptor o de no receptor, incumbe a la competencia de los expertos en la materia.

(i) ELISA de la FLK-1

Se lleva a cabo un ensayo ELISA para medir la actividad de quinasa del receptor FLK-1 y más en concreto la inhibición o la activación de la actividad de la proteína-tirosina-quinasa en el receptor FLK-1. Se lleva a cabo específicamente el siguiente ensayo para medir la actividad de tirosina-quinasa del receptor FLK-1 en las células FLK-1/NIH3T3.

Materiales y métodos Materiales

Se utilizan los siguientes reactivos y materiales.

a. placas Corning de 96 hoyos para ELISA (Corning, nº de catálogo: 25805-96);

b. IgG de cabra anti-conejo (Cappel, nº de catálogo: 55641);

c. PBS (Gibco, nº de catálogo: 450-1300EB);

d. tampón TBSW (Tris 50 mM, pH 7,2; NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,1%);

e. etanolamina patrón (etanolamina del 10%, pH 7,0; almacenada a 4ºC);

f. tampón HNTG (tampón HEPES 20 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,2% y glicerina del 10%);

g. EDTA (0,5 M, pH 7,0, en forma de patrón 100X);

h. ortovanadato sódico (0,5 M, como patrón 100X);

i. pirofosfato sódico (0,2 M, como patrón 100X);

j. placas NUNC de polipropileno de 96 hoyos y fondo en V (Applied Scientific, nº de catálogo: AS-72092);

k. células NIH3T3 C7#3 (células que expresan la FLK-1);

l. DMEM con 1X de L-glutamina de alto contenido en glucosa (nº de catálogo: 11965-050);

m. FBS, Gibco (nº de catálogo: 16000-028);

n. L-glutamina, Gibco (nº de catálogo: 25030-016);

o. VEGF, PeproTech, Inc. (nº de catálogo: 100-20) (guardado como 1 \mug/100 \mul de patrón en dH_{2}O purificada por Milli-Q y almacenado a -20ºC);

p. antisuero anti-FLK-1 purificado por afinidad, que se obtiene o se purifica del modo siguiente:

1.

Se prepara una columna de agarosa activada con tresilo/Flk-1-D por incubación a 4ºC durante una noche de 10 ml de agarosa activada con tresilo con 20 ml de la proteína de fusión de GST-Flk-1-D purificada en tampón de bicarbonato sódico 100 mM (pH 9,6).

2.

Se lava la columna una vez con PBS.

3.

Se bloquean los sitios en exceso de la columna con glicina 2M a 4ºC durante 2 horas.

4.

Se lava la columna con PBS.

5.

Se incuba la columna a 4ºC durante 2 horas con sangrado de producción de conejo anti-Flk-1D.

6.

Se lava la columna con PBS.

7.

Se eluye el antisuero con ácido cítrico 100 mM, pH 3,0 y se neutraliza inmediatamente el líquido eluido con Tris 2 M, pH 9,0.

8.

Se dializa el líquido eluido frente al PBS a 4ºC durante una noche con 3 cambios de tampón (la proporción entre muestra y tampón es de 1:100).

9.

Se ajusta el antisuero dializado al 5% de glicerina y se almacena a 80ºC en partes alícuotas pe- queñas.

q. Anticuerpo monoclonal UB40 específico de la fosfotirosina (véase Fendley y col., Cancer Research 50, 1550-1558, 1990);

r. IgG-POD de cabra anti-ratón, calidad EIA (BioRad, nº de catálogo: 172-1011);

s. solución de ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) (ácido cítrico (anhidro) 100 mM), Na_{2}HPO_{4} 250 mM (pH 4,0), 0,5 mg/ml de ABTS (Sigma, nº de catálogo: A-1888)), la solución tiene que almacenarse a 4ºC en la oscuridad hasta el momento de su utilización;

t. H_{2}O_{2} (solución al 30%) (Fisher, nº de catálogo: H325);

u. ABTS/H_{2}O_{2} (15 ml de solución de ABTS, 2 \mul de H_{2}O_{2}) prepara 5 minutos antes del uso y mantenida a temperatura ambiente;

v. solución patrón de HCl 0,2 M en H_{2}O;

w. sulfóxido de dimetilo (100%) (Sigma, nº de catálogo: D-8418); y

x. tripsina-EDTA (Gibco BRL nº de catálogo: 25200-049).

Método

Se aplica el siguiente método para llevar a cabo el ensayo:

1. Se recubren las placas Corning de 96 hoyos para ELISA con 1,0 \mug de anticuerpo IgG anti-conejo de Cappel por hoyo en Na_{2}CO_{3} 0,1 M, pH 9,6. Se ajusta el volumen final a 150 \mul por hoyo. Se recubren las placas a 4ºC durante una noche. Se pueden guardar las placas almacenadas hasta dos semanas, si se almacenan a 4ºC.

2. Se cultivan las células en medio de crecimiento (DMEM, suplementado con L-glutamina 2,0 mM, 10% de FBS) en platos idóneos para el cultivo hasta confluencia a 37ºC, con un 5% de CO_{2}.

3. Se recolectan las células por tripsinización y se siembran en placas Corning 25850 de poliestireno, de 96 hoyos, de fondo redondo, a razón de 25.000 células/hoyo en 200 \mul de medio de cultivo.

4. Se cultivan las células por lo menos un día a 37ºC, con un 5% de CO_{2}.

5. Se lavan las células con D-PBS 1X.

6. Se añaden 200 \mul/hoyo de medio de desnutrición (DMEM, L-glutamina 2,0 mM, 0,1% de FBS). Se incuba a 37ºC durante una noche, con un 5% de CO_{2}.

7. Se diluyen los compuestos/extractos 1:20 en placas de polipropileno de 96 hoyos empleando medio de desnutrición. Se diluye con sulfóxido de dimetilo 1:20 para los hoyos de control.

8. Se retira el medio de desnutrición de las placas de cultivo de 96 hoyos y se añaden 162 \mul de medio de desnutrición fresco a cada hoyo.

9. Se añaden 18 \mul de una dilución de compuesto/extracto diluido 1:20 (del paso 7) a cada hoyo más la dilución 1:20 en sulfóxido de dimetilo para los hoyos de control (± VEGF), para una dilución final 1:200 después de la estimulación celular. La concentración final de sulfóxido de dimetilo es del 0,5%. Se incuba la placa a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante dos horas.

10. Se retira el anticuerpo no fijado de las placas ELISA invirtiendo la placa para quitar el líquido. Se lavan 3 veces con TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Se golpea la placa suavemente con una toalla de papel para quitar el exceso de líquido y las burbujas.

11. Se bloquean las placas con TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0, 150 \mul por hoyo. Se incuban las placas durante treinta minutos, al tiempo que se agita en un aparato agitador de placas de microvaloración.

12. Se lava la placa 3 veces del modo descrito en el paso 10.

13. Se añaden 0,5 \mug/hoyo de antisuero policlonal de conejo anti-FLU-1 purificado por afinidad. Se ajusta el volumen final a 150 \mul/hoyo con TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Se incuba la placa durante treinta minutos, con agitación.

14. Se añaden 180 \mul de medio de desnutrición a las células y se estimulan con 20 \mul/hoyo de ortovanadato sódico 10,0 mM y 500 ng/ml de VEGF (resultando una concentración final de 1,0 mM de ortovanadato sódico y 50 ng/ml de VEGF por hoyo) a 37ºC durante ocho minutos, con un 5% de CO_{2}. Los hoyos negativos de control reciben solamente el medio de desnutrición.

15. Después de ocho minutos debería retirarse el medio de las células y lavarlas una vez con 200 \mul/hoyo
de PBS.

16. Se lisan las células en 150 \mul/hoyo de HNTG al tiempo que se agita a temperatura ambiente durante cinco minutos. La formulación de HNTG incluye ortovanadato sódico, pirofosfato sódico y EDTA.

17. Se lava la placa ELISA tres veces del modo descrito en el paso 10.

18. Se transfieren los lisados celulares de la placa de las células a la placa ELISA y se incuba agitando durante dos horas. Para la transferencia del lisado celular se pipetea arriba y abajo, al tiempo que se rascan los hoyos.

19. Se lava la placa tres veces del modo descrito en el paso 10.

20. Se incuba la placa ELISA con 0,02 \mug/hoyo de UB40 en TBSW + 0,5% de etanolamina. Se ajusta el volumen final a 150 \mul/hoyo. Se incuba con agitación durante 30 minutos.

21. Se lava la placa tres veces del modo descrito en el paso 10.

22. Se incuba la placa ELISA IgG de cabra anti-ratón, calidad EIA, diluida 1:10.000, conjugada con peroxidasa de rábano rusticano en TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Se ajusta el volumen final a 150 \mul/hoyo. Se incuba con agitación durante treinta minutos.

23. Se lava la placa del modo descrito en el paso 10.

24. Se añaden 100 \mul de una solución de ABTS/H_{2}O_{2} por hoyo. Se incuba durante diez minutos con agitación.

25. Se añaden 100 \mul de HCl 0,2 M para llegar a un HCl 0,1 M final para interrumpir la reacción de revelado de color. Se agita a temperatura ambiente durante 1 minuto. Se eliminan las burbujas con una ligera corriente de aire y se lee la placa ELISA en un lector de placas ELISA a 410 nm.

(ii) ELISA de la HER-2

Los ensayos ELISA de HER-2 se describen en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

(iii) ELISA del PDGF-R

Se describe un ensayo ELISA del PDGF-R en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

(iv) ELISA de la IGF-I

El método ELISA de IGF-I que se describe en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col. puede utilizarse para medir el nivel de fosfotirosina en el receptor de IGF-I, que indica la actividad de la tirosina-quinasa del receptor IGF-I.

(v) ELISA de receptor de EGF

Se mide la actividad de quinasa del receptor de EGF (ensayo EGFR-NIH3T3) en células enteras del modo descrito en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

(vi) ELISA de receptor de insulina celular

Se utiliza el método descrito en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col. para determinar si los compuestos de la presente invención poseen actividad sobre la tirosina-quinasa de receptor de insulina.

(vii) ENSAYO ELISA del EGFR Finalidad

Proporcionar un método consistente de medición de la actividad de quinasa del EGFR "in vitro" en un ensayo inmunoenzimático (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA).

Alcance. El método siguiente describe los procedimientos utilizados para analizar la actividad de la proteína-tirosina-quinasa sobre el EGFR en un ELISA. El procedimiento describe además el protocolo para la exploración inicial de fármacos para la inhibición o la activación de la actividad de la proteína-tirosina-quinasa.

Reactivos y materiales

1. Placas Corning de 96 hoyos para ELISA, Corning, nº de catálogo: 25805-96.

2. Anticuerpo monoclonal anti-EGFR 05-101 (producto comercial de UB1), -80ºC, partes alícuotas de 1 ml.

3. PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco; Gibco, nº de catálogo: 450-1300EB)

formulación: KCl 2,7 mM; KH_{2}PO_{4} 1,1 mM; MgCl_{2} (anhidro) 0,5 mM; NaCl 138 mM; Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM.

4. Tampón TBST

formulación: Tris 50 mM, pH 7,2; NaCl 150 mM; 0,1% de Triton X-100.

5. Tampón de bloqueo

formulación: leche instantánea Carnation al 5% en PBS

6. Lisado de células A431

Las células A431 pueden adquirir a muchos suministradores comerciales y pueden utilizarse lisadas aplicando métodos convencionales ya conocidos de los expertos en la materia o del modo descrito para la lisis de las células 3T3 en el ensayo celular del EGF descrito en esta solicitud; -80ºC, partes alícuotas de 1 ml.

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7. Tampón TBS

formulación: Tris 50 mM, pH 7,2; NaCl 150 mM

8. TBS + 10% de DMSO

formulación: DMSO al 10% en tampón TBS (DMSO de Sigma, nº de catálogo: D-2650).

9. Mezcla de fosforilación ATP/MnCl_{2}

formulación: ATP 0,03 mM (adenosina-5'-trifosfato, Sigma, nº de catálogo: A-5394); MnCl_{2} 50 mM

Se prepara reciente en H2O purificada en autoclave Milli-Q inmediatamente antes del uso.

Se guarda en hielo hasta el momento del uso.

10. Placas NUNC de polipropileno de 96 hoyos de fondo en V (Applied Scientific, nº de catálogo: AS-72092).

11. EDTA

formulación: EDTA 200 mM, pH 8,0.

12. Suero anti-fosfotirosina policlonal de conejo o anticuerpo monoclonal UB40 específico de la fosfotirosina o mab 4610 de UBI, Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nueva York, nº de catálogo 05-321; -80ºC, partes alícuotas
de 1 ml

Se descongela un vial de 1 ml y se divide en volúmenes más pequeños para almacenarlos a -80ºC.

El antisuero es estable durante semanas cuando se descongela y se almacena a 4ºC.

13. IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa

Biosource, nº de catálogo: ALI0404

14. Solución de ABTS

formulación: ácido cítrico (anhidro) 100 mM; Na_{2}HPO_{4} 250 mM, pH 4,0; ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) 0,5 mg/ml (Sigma, nº de catálogo: A-1888)

Se mantiene la solución a 4ºC en la oscuridad hasta el momento del uso.

15. Solución de peróxido de hidrógeno del 30%

Fisher, nº de catálogo: H325

Se almacena a 4ºC en la oscuridad hasta el momento del uso.

16. ABTS/H_{2}O_{2}

formulación: 15 ml de solución de ABTS y 2 \mul de H_{2}O_{2}

Se prepara 5 minutos antes del uso a temperatura ambiente.

17. Solución patrón de HCl 0,2 M en H_{2}O.

Procedimiento

1. Se recubren las placas Corning de 96 hoyos para ELISA con 0,5 \mug de anticuerpo 05-101 por hoyo.

Se ajusta el volumen final de cada hoyo a 100 \mu con PBS.

Se recubren las placas a 4ºC durante una noche.

2. Se retira el 05-101 no fijado de los hoyos invirtiendo la placa para quitar el líquido.

Se lava llenando los hoyos 1x con H2O destilada.

Se golpea suavemente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.

3. Se bloquean las placas con leche al 5% en PBS. 150 \mul por hoyo. Se incuba la placa con agitación durante 30 minutos en un agitador de placas de microvaloración.

4. Se lava la placa 3x con agua desionizada, después una vez con TBST.

5. Se añaden 5 \mug de lisado de células A431 a cada hoyo (fuente de EGFR).

Se añade PBS hasta un volumen final de 100 \mul por hoyo.

Se incuba con agitación durante 30 minutos.

6. Se lava del modo descrito en el paso 4.

7. En este momento se añaden los fármacos o los extractos a los hoyos.

Se diluyen los fármacos/extractos 1:100 (a menos que se indica otra cosa) en TBS + un 10% de DMSO en placas de polipropileno de 96 hoyos.

Se añaden 120 \mul de TBS a las placas ELISA que contienen el EGFR capturado.

Se añaden 13,5 \mul de fármacos/extractos diluidos a la placa ELISA.

A los hoyos de control (hoyos en los que no se deposita fármaco alguno) se les añaden 135 \mul de TBS + 1% de DMSO.

Se incuba la placa con agitación durante 30 minutos.

8. Se añaden 15 \mul de mezcla de fosforilación ATP 0,03 mM + MnCl_{2} 50 mM directamente a todos los hoyos, excepto al hoyo de control negativo, que no recibe ATP/MnCl_{2} (ver diagrama). (Volumen final en el hoyo: 150 \mul; concentración final en hoyo: ATP 3 \muM/MnCl2 5 mM.)

Se incuba durante 5 minutos con agitación vigorosa.

*NOTA: Es crítico que el ATP/MnCl2 fosforile al receptor solamente durante 5 minutos. Lo mejor es añadir el ATP/MnCl_{2} con el pipeteador de 12 canales, 1 fila cada vez, dejando 20 segundos entre dos filas sucesivas, de modo que la reacción pueda interrumpirse con EDTA exactamente al cabo de 5 minutos (esto depende del número de placas que se fosforilan en cada partida). Se agita después de cada adición.

9. Después de 5 minutos se interrumpe la reacción, se añaden 16,5 \mul de EDTA 200 mM, pH 8,0, para llegar a
20 mM finales, se agita continuamente después de cada adición. Esto se realiza utilizando el mismo método temporal que antes. Después de que la última fila haya recibido el EDTA, se agita la placa durante un minuto más.

10. Se lava 4x con agua desionizada, dos veces con TBST.

11. Se añade suero de conejo policlonal anti-fosfotirosina. Se diluye 1:3000 en TBST. Se añaden 100 \mul por hoyo. Se incuba 30-45 min. con agitación

12. Se lava del modo descrito antes en el paso 4.

13. Se añade anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa, de BioSource.

Se diluye 1:2000 en TBST.

Se añaden 100 \mul por hoyo.

Se incuba durante 30 minutos con agitación.

14. Se lava del modo descrito en el paso 4.

15. Se añaden 100 \mul de ABTS/solución de H_{2}O_{2} a cada hoyo.

Se incuba con agitación durante 5 - 10 minutos.

Se eliminan las burbujas.

16. Si fuera necesario se interrumpe la reacción con la adición de 100 \mul de HCl 0,2 M a cada hoyo.

17. Se lee el material del ensayo en un lector de ELISA del tipo Dynatech MR7000.

Filtro de ensayo: 410 nM

Filtro de referencia: 630 nM

(b) Ensayos de cultivo celular

Pueden llevarse a cabo los ensayos de cultivo celular del modo descrito en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col., para medir el efecto de los compuestos reivindicados en el crecimiento celular como resultado de la interacción de los compuestos con una o varias
RTK.

(vi) Ensayo para medir la función de fosforilación del Raf

El siguiente ensayo ilustra la cantidad de fosforilación catalizada por el RAF de su proteína diana MED así como de la diana de la MEK, la MAPK. La secuencia genética del RAF se describe en Bonner y col., Molec. Cell. Biol. 5, 1400-1407, 1985; y es fácilmente accesible en bancos de datos de secuencias genéticas múltiples. La construcción del vector del ácido nucleico y de las líneas celulares para esta porción de la invención se describe con detalle en Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8855-8859, 1988.

Materiales y reactivos

1. células de Sf9 (Spodoptera frugiperda); GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

2. tampón RIPA: Tris 20 mM/HCl, pH 7,4; NaCl 137 mM; 10% de glicerina; PMSF 1 mM, aprotenina 5 mg/l; 0,5% de Triton X-100.

3. proteína de fusión tiorredoxina-MEK (T-MEK): se realizan la expresión de la T-MEK y su purificación por cromatografía de afinidad con arreglo a los procedimientos del fabricante; nº de catálogo: K 350-01 y R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-MAPK (ERK 2); se expresa la MAPK marcada con His en células XL1 Blue transformadas con el vector pUC18 que codifica a la His-MAPK. Se purifica la His-MAPK por cromatografía de afinidad de Ni; nº de catálogo: 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA.

5. IgG de oveja anti-ratón: Jackson Laboratories, West Grove, PA; nº de catálogo: 515-006-008; lote nº 28563.

6. anticuerpo específico de la proteína-quinasa RAF-1: URP2653 de UBI.

7. tampón de recubrimiento: PBS; solución salina tamponada con fosfato, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

8. tampón de lavado: TBST - Tris 50 mM/HCl, pH 7,2; NaCl 150 mM; 0,1% de Triton X-100.

9. tampón de bloqueo: TBST, 0,1% de etanolamina, pH 7,4.

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.

11. Tampón de quinasa (KB): Hepes 20 mM/HCl, pH 7,2; NaCl 150 mM; 0,1% de Triton X-100; PMSF 1 mM; aprotenina 5 mg/l; ortovanadato sódico 75 \muM; DTT 0,5 mM y MgCl_{2} 10 mM.

12. mezcla de ATP: MgCl_{2} 100 mM; ATP 300 \muM; ATP \gamma-P^{33} 10 \muCi (DuPont-NEN)/ml.

13. solución de interrupción: ácido fosfórico del 1%; Fisher, Pittsburgh, PA.

14. esteras de filtro de fosfato de celulosa Wallac; Wallac, Turku, Finlandia.

15. solución de lavado de filtro: ácido fosfórico del 1%; Fisher, Pittsburgh, PA.

16. recolector de placas Tomtec; Wallac, Turku, Finlandia.

17. lector de placas beta de Wallac nº 1205; Wallac, Turku, Finlandia.

18. placas de polipropileno NUNC de 96 hoyos de fondo en V para los compuestos; Applied Scientific, nº de catálogo: AS-72092.

Procedimiento

Todos los pasos se llevan a cabo a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.

1. Recubrimiento de la placa ELISA: se recubren los hoyos ELISA con 100 \mul de antisuero purificado por afinidad de oveja anti-ratón (1 \mug/100 \mul de tampón de recubrimiento) a 4ºC durante una noche. Las placas ELISA pueden utilizarse durante dos semanas si se guardan a 4ºC.

2. Se invierte la placa y se quita el líquido. Se añaden 100 \mul de solución de bloqueo y se incuba durante 30 min.

3. Se quita la solución de bloqueo y se lava cuatro veces con tampón de lavado. Se golpea suavemente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.

4. Se añade 1 \mug de Sumo 22 purificado por hoyo, se incuba durante 1 hora y se lava del modo descrito en el
paso 3.

5. Se descongelan los lisados de células Sf9 infectadas con RAS/RAF y se diluyen con TBST hasta 10 \mug/100 \mul. Se añaden 10 \mug de lisado diluido a los hoyos y se incuba durante 1 hora. Se agita la placa durante la incubación. Los controles negativos no reciben lisado. Se preparan lisados de células de insecto Sf9 infectadas con RAS/RAF después de haber infectado las células con baculovirus recombinantes a una MOI de 5 para cada virus y se recolectan al cabo de 48 horas. Se lavan las células una vez con PBS y se lisan con tampón RIPA. Se elimina el material insoluble por centrifugación (5 min a 10.000 rpm). Se congelan partes alícuotas de los lisados en hielo seco/etanol y se almacenan a -80ºC hasta el momento de su utilización.

6. Se retira el material no fijado y se lava del modo descrito antes (paso 3).

7. Se añaden 2 \mug de T-MEK y 2 \mug de His-MAPK a cada hoyo y se ajusta el volumen a 40 \mul con tampón de quinasa.

8. Se prediluyen los compuestos (solución patrón 10 mg/ml de DMSO) o los extractos 20 veces en TBST más 1% de DMSO. Se añaden 5 \mul de los compuestos/extractos prediluidos a los hoyos descritos en el paso 6. Se incuba durante 20 min. Los hoyos de control no reciben fármaco alguno.

9. Se inicia la reacción de la quinasa por adición de 5 \mul de mezcla ATP; durante la incubación se continúa la agitación de las placas en un agitador de placas ELISA.

10. Se interrumpe la reacción de la quinasa después de 60 min por adición de 30 \mul de solución de interrupción a cada hoyo.

11. Se colocan una estera (mat) de fosfocelulosa y la placa ELISA en un recolector de placas Tomtec. Se recolecta y se lava el filtro con la solución de lavado de filtros con arreglo a las recomendaciones del fabricante. Se secan las esteras de filtro. Se sellan las esteras de filtro y se colocan en un portafiltros. Se inserta el portafiltros en el aparato de detección de radiactividad y se cuantifica el fósforo radiactivo que se halla en las esteras de filtro.

Como alternativa pueden trasladarse partes alícuotas de 40 \mul de los hoyos individuales de la placa de ensayo a las posiciones correspondientes de la estera de filtro de fosfocelulosa. Después de secar los filtros con aire, se colocan dichos filtros sobre una bandeja. Se agita suavemente la bandeja, cambiando la solución de lavado a intervalos de 15 min, durante 1 hora. Se secan las esteras de filtro con aire. Se sellan las esteras de filtro y se colocan en un portafiltros, idóneo para la medición del fósforo radiactivo de las muestras. Se inserta el portafiltros en el dispositivo de detección y se cuantifica el fósforo radiactivo de las esteras de filtro.

(c) Toxicidad y modelos animales

La medición de la toxicidad celular y en modelos animales "in vivo" se describen en la publicación de patente internacional nº WO 96/40116, publicada con fecha 19 de diciembre de 1996, de Tang y col.

(d) Ensayo de quinasa bioquímica MET

Puede realizarse un ensayo de quinasa bioquímica met para la met en general del modo descrito anteriormente para otras quinasas, para ello se sustituye la o las otras quinasas. En concreto, las placas ELISA se recubren con anticuerpos Fc de cabra anti-conejo, que se utilizan para capturar anticuerpos policlonales de conejo que son productos comerciales (Santa Cruz Biotechnology) sobre el dominio citoplásmico de la MET humana. Los lisados se preparan a partir de células 293T, que se han transfectado transitoriamente con un receptor quimérico compuesto por el dominio extracelular del EGFr y el dominio transmembrana y el citoplásmico del receptor de MET, o a partir de células NCI-H441 (una línea celular de adenocarcinoma pulmonar humano), que expresa niveles endógenos elevados de MET. Los receptores quiméricos, o MET, de estos lisados se capturan en las placas recubiertas con anticuerpos. Después de eliminar por lavado las proteínas extrañas se añaden los compuestos a ensayar y se realiza un ensayo "in vitro" de la quinasa con adición de un tampón de quinasa apropiado (que contenga ATP, iones metálicos divalentes, etc.). La incorporación del fosfato a los receptores capturados se detecta con un anticuerpo anti-fosfotirosina conjugado con peroxidasa de rábano rusticano, empleando el TMB como sustrato para la detección colori-
métrica.

La presente invención no se limita en su alcance a las formas de ejecución ejemplificadas, que se pretende que sean ilustrativas de aspectos concretos de la invención. Obviamente, a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas, los expertos en la materia podrán intuir varias modificaciones de la invención además de las descritas anteriormente. Tales modificaciones están contempladas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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TABLA 1

6

7

8

TABLA 2

9

TABLA 3

10

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TABLA 4

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TABLA 5

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TABLA 6

Código de barras/fila y	quinasa Flk	EGFR bioquímico	PDGF-quinasa	Met-quinasa
columna de placa
	% de inhibición	% de inhibición	% de inhibición	% de inhibición
10721/A05	12,5	41,4		52,9
10721/B05	45,9	76,8		70,8
10721/C05	56,4	68,1		48,7
10721/D05	-25,1	47,0		91,9
10721/E05	10,8	61,3		69,9
10721/F05	8,1	20,5		67,8
10721/G05	-15,1	7,7		8,6

Claims (13)

1. El compuesto indolinona de la fórmula VIII o IX

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en las que

(a) R_{1} se elige entre el grupo formado por:

(i)

hidrógeno;

(ii)

alquilo C_{1}-C_{10} que está opcionalmente sustituido por un anillo heterocíclico, monocíclico o bicíclico, de cinco, seis, ocho, nueve o diez eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por uno o varios halógenos o sustituyentes trihalometilo;

(iii)

un anillo heterocíclico, monocíclico o bicíclico, de cinco, seis, ocho, nueve o diez eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por uno o varios halógenos o sustituyentes trihalometilo;

(iv)

cetonas de las fórmulas -CO-R_{19}, en las que R_{19} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10} o un anillo heterocíclico de cinco a seis eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(v)

un ácido carboxílico de la fórmula -(R_{12})_{n}-COOH o un éster de la fórmula -(R_{13})_{m}-COO-R_{14}, en la que R_{12}, R_{13} y R_{14} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, y n y m con independencia entre sí son el número 0 ó 1;

(vi)

una sulfona de la fórmula -(SO_{2})-R_{15}, en la que R_{15} se elige entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por un resto alquilo C_{1}-C_{10};

(vii)

un -(R_{16})_{n}-(indol-1-ilo) o un -(R_{17})_{m}-CHOH-(R_{18})p-(indol-1-ilo), en los que el resto indol está opcionalmente sustituido por un aldehído y R_{16}, R_{17} y R_{18} son alquilo C_{1}-C_{10} y n, m y p, con independencia entre sí, son 0 ó 1;

(viii)

junto con un sustituyente que ocupe la posición 2' del anillo indol forma un resto tricíclico, cada anillo del resto tricíclico es un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(b) R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{10}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por:

(i)

hidrógeno;

(ii)

alquilo C_{1}-C_{10}, que está opcionalmente sustituido por un anillo heterocíclico, monocíclico o bicíclico, de cinco, seis, ocho, nueve o diez eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por uno o varios sustituyentes halógeno, aldehído o trihalometilo;

(iii)

un anillo heterocíclico, monocíclico o bicíclico, de cinco, seis, ocho, nueve o diez eslabones, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por uno o varios sustituyentes halógeno o trihalometilo;

(iv)

cetonas de la fórmulas -CO-R_{20}, en la que R_{20} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(v)

un ácido carboxílico de la fórmula -(R_{21})_{n}-COOH o un éster de la fórmula -(R_{22})-COO-R_{23}, en la que R_{21}, R_{22} y R_{23} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, y m y n con independencia entre sí son 0 ó 1;

(vi)

halógeno;

(vii)

un alcohol de la fórmula (R_{24})_{m}-OH o un éter de la fórmula -(R_{24})_{n}-O-R_{25}, en las que R_{24} y R_{25} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, y m y n con independencia entre sí son 0 ó 1;

(viii)

-NR_{26}R_{27}, en la que R_{26} y R_{27} con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por hidrógeno, oxígeno, alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(ix)

-NHCOR_{28}, en el que R_{28} se elige entre el grupo formado por hidroxilo, alquilo C_{1}-C_{10}, un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, dicho anillo está opcionalmente sustituido por alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno, -(R)_{n}-COOH, en el que R se elige entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} o arilo constituido por un grupo aromático monocíclico, bicíclico o tricíclico de 5 ó 6 eslabones, en el que por lo menos un anillo tiene un sistema conjugado de electrones pi y en el que n es 0 ó 1, o bien -(R)_{n}-COOR', en el que R y R' con independencia entre sí se eligen entre el grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} o arilo constituido por un grupo aromático monocíclico, bicíclico o tricíclico de 5 ó 6 eslabones, en el que por lo menos un anillo tiene un sistema conjugado de electrones pi y en el que n es 0 ó 1;

(x)

-SO_{2}NR_{29}R_{30}, en el que R_{29} y R_{30} se eligen entre el grupo formado por hidrógeno, oxígeno, alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre;

(xi)

dos cualesquiera de R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6} y R_{6'} o dos cualesquiera de R_{7}, R_{8}, R_{9} y R_{10}, tomados juntos, forman un resto heterocíclico, bicíclico o tricíclico, que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre, y está fusionado con el anillo de seis eslabones del indol, cada anillo del resto multicíclico es un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones que contiene nitrógeno, oxígeno o azufre; y

(c) R_{11} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{10}

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto o una sal de la fórmula VIII y IX de la reivindicación 1, en las que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10} y R_{11} son hidrógeno.

3. El compuesto o una sal de la fórmula VIII y IX de la reivindicación 1, en las que R_{8} es bromo, cloro o NH_{2} y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{7}, R_{9}, R_{10} y R_{11} son hidrógeno.

4. El compuesto o una sal de la fórmula VIII y IX de la reivindicación 1, en las que R_{7} es metilo y R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{8}, R_{9}, R_{10} y R_{11} son hidrógeno.

5. El compuesto o sal de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, dicho compuesto o sal modulan la actividad catalítica de una proteína-quinasa.

6. El compuesto o sal de la reivindicación 5, dicho compuesto o sal modulan la actividad catalítica de una proteína-quinasa FLK.

7. El compuesto o sal de la reivindicación 5, dicho compuesto o sal modulan la actividad catalítica de una proteína quinasa de receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas.

8. Un método de síntesis de un compuesto de indolinona de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4 o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, dicho método consta de los pasos siguientes:

(a) hacer reaccionar un aldehído de la fórmula X u XI con un oxindol de la fórmula XII,

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en las que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{3'}, R_{4}, R_{4'}, R_{5}, R_{5'}, R_{6}, R_{6'}, R_{7}, R_{8}, R_{9}, R_{10} y R_{11} tienen los significados definidos en la reivindicación 1,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

9. Una composición farmacéutica que contiene un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo o diluyente fisiológicamente aceptable.

10. El uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 para la fabricación de un medicamento destinado a prevenir o tratar un estado anormal de un organismo, dicho estado anormal está asociado con una aberración en el mecanismo de transducción de señales, caracterizada por una interacción entre una proteína-quinasa y un reactivo natural de fijación.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que el organismo es un mamífero.

12. El uso de la reivindicación 10, en el que la proteína-quinasa es una proteína-quinasa FLK.

13. El uso de la reivindicación 10, en el que la proteína-quinasa es una proteína-quinasa de receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas.