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Einführung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die die Proteinkinasesignaltransduktion
modulieren, regulieren und/oder inhibieren können.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Synthetisieren
dieser Verbindungen, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese
Verbindungen umfassen und die Verwendung solcher Verbindungen zur
Herstellung eines Arzneimittels zum Vorbeugen und/oder Behandeln
von Störungen,
die mit einer unregulierten Proteinkinasesignaltransduktion, einschließlich zellproliferativen
und metabolischen Störungen, im
Zusammenhang stehen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
folgende Beschreibung des Hintergrundes der Erfindung wird bereitgestellt,
um das Verständnis der
Erfindung zu erleichtern, sie soll jedoch nicht zur Beschreibung
des Standes der Technik der Erfindung dienen.
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Proteinkinasen
und Proteinphosphatasen regulieren eine breite Vielfalt von zellulären Prozessen,
die den Metabolismus, die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung
und das Zellüberleben
durch Teilnehmen an den Signaltransduktionswegen einschließen. Veränderungen
in der zellulären
Funktion einer Proteinkinase oder einer Proteinphosphatase können verschiedene
Erkrankungszustände
in einem Organismus zur Folge haben. Zum Beispiel hängen viele
Arten von Krebstumoren mit einer Zunahme der Aktivität spezifischer
Proteinkinasen zusammen. Die Zell- und Gewebedegeneration kann auch
mit der Abnahme der Aktivität
von bestimmten Proteinkinasen zusammenhängen.
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Die
zelluläre
Signaltransduktion ist ein fundamentaler Mechanismus, bei dem extrazelluläre Reize
in das Innere der Zelle weitergeleitet werden. Einer der biochemischen
Schlüsselmechanismen
der Signaltransduktion schließt
die reversible Phosphorylierung von Proteinen ein. Die Phosphorylierung
von Aminosäuren reguliert
die Aktivität
von reifen Proteinen durch Verändern
ihrer Struktur und Funktion.
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Das
Phosphat befindet sich am häufigsten
am Hydroxylrest von Serin, Threonin oder Tyrosinaminosäuren in
Proteinen. Enzyme, die die Phosphorylierung von zellulären Effektoren
vermitteln, fallen in zwei Klassen. Während Proteinphosphatasen Phosphatreste
an Phosphorylproteinsubstraten hydrolisieren, übertragen Proteinkinasen einen
Phosphatrest von Adenosintriphosphat auf Proteinsubstrate. Die umgekehrten
Funktionen von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen balancieren
und regulieren den Signalfluss in Signaltransduktionsprozessen.
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Proteinkinasen
werden in zwei Gruppen aufgeteilt – Rezeptor- und Nichtrezeptor-Proteintypen.
Rezeptorproteinkinasen umfassen einen extrazellulären Bereich,
einen Transmembranbereich und einen intrazellulären Bereich. Ein Teil des intrazellulären Bereiches
von Rezeptorproteinkinasen beherbergt eine katalytische Domäne. Während Nichtrezeptorproteinkinasen
keine extrazellulären
oder Transmembranbereiche beherbergen, umfassen sie doch einen Bereich,
der den intrazellulären
Bereichen ihrer Rezeptorgegenstücke ähnelt.
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Proteinkinasen
sind weiterhin auf Grundlage der Aminosäuren auf die sie wirken in
drei Klassen unterteilt. Einige fügen Phosphat nur an Serin oder
Threonin, einige fügen
Phosphat nur an Tyrosin und einige fügen Phosphat nur an Serin,
Threonin und Tyrosin.
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Im
Bemühen
neue Behandlungen für
Erkrankungen zu entdecken, haben biomedizinische Forscher und Chemiker
Moleküle,
die die Funktion der Proteinkinasen inhibieren, entworfen, synthetisiert
und getestet. Einige kleine organische Moleküle bilden eine Klasse von Verbindungen,
die die Funktion von Proteinkinasen modulieren.
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Die
Verbindungen, die Zellmembranen überqueren
können
und gegenüber
einer Säurehydrolyse
resistent sind, sind potentiell vorteilhafte Therapeutika, da sie,
nachdem sie dem Patienten oral verabreicht worden sind, biologisch
gut verfügbar
werden können.
Jedoch inhibieren viele dieser Proteinkinaseinhibitoren die Funktion
von Proteinkinasen nur schwach. Zusätzlich inhibieren viele eine
Vielzahl von Proteinkinasen und werden daher als Therapeutika für Erkrankungen
multiple Nebenwirkungen verursachen.
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Einige
Indolinonverbindungen bilden jedoch Klassen von säureresistenten
und membranpermeablen organischen Molekülen, die möglicherweise nur spezifische
Proteinkinasen inhibieren. Die Indolinonsynthese, Verfahren zum
Testen der biologischen Aktivität
von Indolinonen und Inhibitionsmuster einiger Indolinonderivate
sind in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116,
die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht
worden ist und mit „Benzylidene-Z-Indolinone Compounds
for the Treatment of Disease" von
Tang et al. (Lyon & Lyon
Aktennummer 223/298) betitelt worden ist, und der Internationalen
Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/22976, die am 1. August 1996 veröffentlicht worden ist, von
Ballinari et al. beschrieben.
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Trotz
der signifikanten Fortschritte, die bei der Entwicklung von auf
Indolinon basierenden Pharmazeutika gemacht worden sind, bleibt
im Stand der Technik ein Bedarf zur Identifikation der besonderen
Strukturen und Substitutionsmuster, die die Inhibition von bestimmten
Proteinkinasen verursachen und andere näher beschriebene biologische
Aktivitäten,
bestehen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft organische Moleküle, die die Proteinkinasesignaltransduktion
modulieren, regulieren und/oder inhibieren können. Solche Verbindungen sind
zur Behandlung von Erkrankungen, die mit der unregulierten Proteinkinasesignaltransduktion,
einschließlich
von Zellproliferationserkrankungen, wie z.B. Krebs, Arteriosklerose,
Arthritis und Restenose, und metabolischen Erkrankungen, wie z.B.
Diabetes, zusammenhängen,
verwendbar. Die betroffenen Proteinkinasen schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf FLK, FGFR, PDGFR und raf.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Indolinonverbindungen, die möglicherweise
Proteinkinasen inhibieren, und damit im Zusammenhang stehende Produkte
und Verfahren.
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Indolinonverbindungen,
die die FLK- und die Plättchenwachstumsfaktor-Rezeptorproteinkinasen
inhibieren, können
einen Tetrahydroindol- oder Cyclopentan-b-Pyrrolrest beherbergen.
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Diese
Erfindung betrifft neue wasserlösliche
Indolinonverbindungen, die Tyrosinkinaseinhibitoren sind und damit
im Zusammenhang stehende Produkte und Verfahren.
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Die
Verbindungen der Erfindung repräsentieren
eine neue Generation von potentiellen Therapeutika für Erkrankungen,
die durch eine oder mehrere nicht funktionale Proteinkinasen verursacht
werden. Neurodegenerative Erkrankungen fallen in diese Klasse von
Erkrankungen, die einschließen,
jedoch nicht begrenzt sind auf die Parkinson Erkrankung und die
Alzheimer Erkrankung. Die Verbindungen können modifiziert werden, so
dass sie für
ihr Ziel oder Ziele spezifisch sind, und demnach weniger Nebenwirkungen
verursachen und daher eine neue Generation von potentiellen Krebstherapeutika
darstellen. Diese Eigenschaften sind wichtige Verbesserungen gegenüber den
derzeit verwendeten Krebstherapeutika, die viele Nebenwirkungen haben
und die Patienten auf schädliche
Weise schwächen.
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Es
wird vermutet, dass die Verbindungen der Erfindung feste Tumoren
durch spezifisches Inhibieren der Aktivität der FLK-Proteinkinase minimieren
und auslöschen
werden, oder zumindest das Tumorwachstum und/oder Metastasen modulieren
oder inhibieren werden. Die FLK-Proteinkinase reguliert die Proliferation
von Blutgefäßen während der
Angiogenese. Erhöhte
Angiogeneseraten begleiten das Krebstumorwachstum in Zellen, da
Krebstumoren durch sauerstoffhaltiges Blut während des Wachstums ernährt werden
müssen.
Daher werden die Inhibition der FLK-Proteinkinase und die entsprechenden
Verringerungen der Angiogenese die Tumoren in Bezug auf die Nährstoffe
aushungern und sie höchstwahrscheinlich
auslöschen.
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Da
ein genaues Verständnis
des Mechanismus durch den Verbindungen PTK's inhibieren (z.B. der Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor
1 [FGFR1]), nicht erforderlich ist, um die vorliegende Erfindung
auszuführen,
glaubt man, dass die Verbindungen mit den Aminosäuren des katalytischen Bereiches
der PTK's interagieren.
PTK's besitzen für gewöhnlich eine
zweilappige Struktur und ATP scheint in der Spalte zwischen den zwei
Lappen in einem Bereich zu binden, in dem die Aminosäuren bei
PTK's konserviert
sind; man glaubt, dass die Inhibitoren von PTK's an die PTK's durch nicht kovalente Interaktionen,
wie z.B. Wasserstoffbrückenbindung,
Van-der-Waals Interaktionen und ionische Bindung, im gleichen allgemeinen
Bereich binden, der ATP an die PTK's bindet. Man glaubt insbesondere, dass
die Oxindolkomponente der Verbindungen der vorliegenden Erfindung
im gleichen allgemeinen Raum bindet, der durch den Adeninring von
ATP besetzt wird. Die Spezifität
eines Indolinon-PTK-Inhibitors
für eine
bestimmte PTK kann durch Interaktionen zwischen den Konstituenten
um den Oxindolkern herum mit Aminosäuredomänen, die für individuelle PTK's spezifisch sind, übertragen
werden. Daher können
verschiedene Indolinonsubstituenten zur bevorzugten Bindung an bestimmte PTK's beitragen. Die
Fähigkeit
solche Verbindungen auszuwählen,
die an verschiedenen ATP oder anderen Nukleotidbindungsstellen aktiv
sind, macht sie beim gezielten Ansteuern aller Proteine mit einer
solchen Stelle, nicht nur Proteintyrosinkinasen, sondern auch Serin/Threoninkinasen
und Proteinphosphatasen, verwendbar. Demnach haben solche Verbindungen
einen Nutzen für
in vitro Assays für
solche Proteine, und für
die therapeutische Wirkung durch solche Proteine in vivo.
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In
einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine Indolinonverbindung
der folgenden Formel
wobei
- (a) R1 aus der Gruppe
ausgewählt
wird, die besteht aus:
(i) Wasserstoff;
(ii) C1-C10 Alkyl, das
optional mit einem monozyklischen oder bizyklischen fünf-, sechs-,
acht-, neun- oder zehngliedrigem
Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen
Ring substituiert ist, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren
Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist;
(iii)
ein fünf-,
sechs-, acht-, neun- oder zehngliedriger monozyklischer oder bizyklischer
Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer
Ring, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder
Trihalomethylsubstituenten substituiert ist;
(iv) einem Keton
der Formel -CO-R19, wobei R19 aus
der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht,
ausgewählt
wird;
(v) einer Carbonsäure
der Formel -(R12)n-COOH
oder einem Ester der Formel -(R13)m-COO-R14, wobei
R12, R13 und R14 unabhängig
voneinander aus der Gruppe, die aus C1-C10 Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht,
ausgewählt werden,
und n und m unabhängig
voneinander 0 oder 1 sind;
(vi) ein Sulfon der Formel -(SO2)-R15, wobei R15 aus der Gruppe, die aus C1-C10 Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht,
ausgewählt
wird, wobei der Ring optional mit einem C1-C10 Alkylrest substituiert ist;
(vii)
ein -(R16)n-(Indol-1-yl)
oder -(R17)m-CHOH-(R18)p-(Indol-1-yl), wobei
der Indolrest optional mit einem Aldehyd substituiert ist, und R16, R17 und R18 C1-C10 Alkyl,
und n, m und p unabhängig
voneinander 0 oder 1 sind;
(viii) zusammengenommen mit einem
2' Substituenten
des Indolrings einen trizyklischen Rest bildet, wobei jeder Ring
in dem trizyklischen Rest ein fünf-
oder sechsgliedriger Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender
heterozyklischer Ring ist;
- (b) R2, R3,
R3',
R4, R4', R5,
R5',
R6, R6', R7,
R8, R9 und R10 unabhängig
voneinander aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus
(i)
Wasserstoff;
(ii) C1-C10 Alkyl,
das optional mit einem monozyklischen oder bizyklischen fünf-, sechs-,
acht-, neun- oder zehngliedrigem
Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen
Ring substituiert ist, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren
Halogen- oder Trihalomethylsubstituenten substituiert ist;
(iii)
ein fünf-,
sechs-, acht-, neun- oder zehngliedriger monozyklischer oder bizyklischer
Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer
Ring, wobei der Ring optional mit einem oder mehreren Halogen- oder
Trihalomethylsubstituenten substituiert ist;
(iv) einem Keton
der Formel -CO-R20, wobei R20 aus
der Gruppe, die aus Wasserstoff, C1-C10 Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel enthaltenden heterozyklischen Ring besteht,
ausgewählt
wird;
(v) einer Carbonsäure
der Formel -(R21)n-COOH
oder einem Ester der Formel -(R22)m-COO-R23, wobei
R21, R22 und R23 unabhängig
voneinander aus der Gruppe, die aus C1-C10 Alkyl oder einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem heterozyklischen Ring besteht,
ausgewählt werden,
und n und m unabhängig
voneinander 0 oder 1 sind;
(vi) Halogen;
(vii) einem Alkohol
der Formel (R24)m-OH
oder einem Ether der Formel -(R24)n-O-R25, wobei R24 und
R25 unabhängig voneinander aus der Gruppe,
die aus C1-C10 Alkyl
und einem fünf-
oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem
heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden, und m und n unabhängig voneinander
0 oder 1 sind;
(viii) -NR26R27, wobei R26 und
R27 unabhängig voneinander aus der Gruppe,
die aus Wasserstoff, Sauerstoff, C1-C10 Alkyl und einem fünf- oder sechsgliedrigen Stickstoff,
Sauerstoff oder Schwefel enthaltenden heterozyklischen Ring besteht,
ausgewählt
werden;
(ix) -NHCOR28, wobei R28 aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Hydroxyl,
C1-C10 Alkyl, einem fünf- oder
sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem
heterozyklischen Ring, wobei der Ring optional substituiert ist
mit C1-C10 Alkyl,
Halogen, -(R)n-COOH, wobei R aus der Gruppe
ausgewählt
wird, die besteht aus C1-C10 Alkyl
oder Aryl einschließlich
einer monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen fünf- oder
sechsgliedrigen aromatischen Gruppe, wobei mindestens ein Ring ein
konjugiertes pi-Elektronensystem
besitzt und wobei n 0 oder 1 ist, oder -(R)n-COOR', wobei R und R' unabhängig voneinander
aus der Gruppe ausgewählt
werden, die besteht aus C1-C10 Alkyl
oder Aryl einschließlich
einer monozyklischen, bizyklischen oder trizyklischen fünf- oder
sechsgliedrigen aromatischen Gruppe, wobei mindestens ein Ring ein
konjugiertes pi-Elektronensystem besitzt und wobei n 0 oder 1 ist;
(x)
-SO2NR29R30, wobei R29 und
R30 aus der Gruppe, die aus Wasserstoff,
Sauerstoff, C1-C10 Alkyl
und einem fünf-
oder sechsgliedrigen Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltendem
heterozyklischen Ring besteht, ausgewählt werden;
(xi) zwei
beliebige von R3, R3', R4, R4', R5,
R5',
R6 oder R6' oder zwei
beliebige von R7, R8,
R9 oder R10 zusammengenommen
einen bizyklischen oder trizyklischen Stickstoff, Sauerstoff oder
Schwefel enthaltenden heterozyklischen Rest bilden, der mit dem
sechsgliedrigen Ring des Indoles verbunden ist, wobei jeder Ring in
dem multizyklischen Rest ein fünf-
oder sechsgliedriger Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender heterozyklischer
Ring ist;
und
- (c) R11 Wasserstoff oder C1-C10 Alkyl ist;
oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz davon.
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Der
Begriff „Alkyl" betrifft eine gerade
Kette, einen verzweigten oder zyklisch gesättigten oder zyklisch gesättigten
aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, bevorzugt
ein niederes Alkyl mit von 1 bis 7 Kohlenstoffen und am meisten
bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffen. Typische Alkylgruppen schließen Methyl, Ethyl,
Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tertiäres Butyl, Pentyl, Hexyl und ähnliches
ein. Die Alkylgruppe kann substituiert sein und einige typische
Alkylsubstituenten schließen
Hydroxyl, Cyano, Alkoxy, Sauerstoff, Schwefel, Nitroxy, Halogen,
-N(CH3)2, Amino
und -SH ein.
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Der
Begriff „Methyl" betrifft einen gesättigten
Alkylrest eines Kohlenstoffs. Der Begriff „Ethyl" betrifft einen gesättigten Alkylrest mit zwei
Kohlenstoffen. Der Begriff „Propyl" betrifft einen gesättigten
Alkylrest mit drei Kohlenstoffen. Der Begriff „Butyl" betrifft einen gesättigten Alkylrest mit vier
Kohlenstoffen. Der Begriff „Pentyl" betrifft einen gesättigten
Alkylrest mit fünf
Kohlenstoffen.
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Der
Begriff „Aryl" betrifft eine aromatische
Gruppe, die wenigstens einen Ring mit einem konjugierten Pi-Elektronensystem
aufweist und sowohl carbozyklisches Aryl (z.B. Phenyl) als auch
heterozyklische Arylgruppen (z.B. Pyridin) einschließt. Arylreste
schließen
monozyklische, bizyklische und trizyklische Ringe ein, wobei jeder
Ring bevorzugt fünf
oder sechs Mitglieder aufweist. Der Arylrest kann substituiert sein,
und typische Arylsubstituenten schließen Halogen, Trihalomethyl,
Hydroxyl, -SH, -OH, -NO2, Amin, Thioether,
Cyano, Alkoxy, Alkyl und Amino ein.
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Die
Begriffe „Heterozyklus" oder „heterozyklisch" betreffen Verbindungen,
die einen Ring bilden und bis zu vier Heteroatome enthalten, wobei
der Rest der Atome, die den Ring bilden, Kohlenstoffe sind. Demnach kann
jeder Ring in der Struktur null, ein, zwei, drei oder vier Stickstoff-,
Sauerstoff- oder Schwefelatome innerhalb des Rings enthalten. Der
Ring kann bevorzugt mit Wasserstoffatomen gesättigt sein, noch bevorzugter eine
oder mehrere Nichtsättigungen
beherbergen und am meisten bevorzugt ein Aryl konjugiertes Pi-Elektronensystem
enthalten. Die Ringe sind bevorzugt elf-, zwölf-, dreizehn- oder vierzehngliedrige
Ringe, noch bevorzugter acht-, neun- oder zehngliedrige Ringe und
am meisten bevorzugt fünf-
oder sechsgliedrige Ringe. Beispiele für solche Ringe sind Furyl,
Thienyl, Pyrrol, Imidazolyl, Indolyl, Pyridinyl, Thiadiazolyl, Thiazolyl,
Piperazinyl, Dibenzfuranyl, Dibenzthienyl. Die heterozyklischen
Ringe der Erfindung können
wahlweise mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen substituiert
sein, die für
gewöhnlich
an solche Ringe gebunden sind, wie z.B. Hydroxyl, Brom, Fluor, Chlor,
Jod, Mercapto oder Thio, Cyano, Cyanoamido, Alkylthio, Heterozyklen,
Aryl, Heteroaryl, Carboxyl, Oxo, Alkoxycarbonyl, Alkyl, Alkenyl,
Nitro, Amino, Alkoxyl, Amido und ähnliche. Strukturen einiger
bevorzugter heterozyklischer Ringe sind die fusionierten Ringe,
die weiter oben dargestellt worden sind.
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Der
Begriff „Aldehyd" betrifft einen chemischen
Rest mit der Formel -(R)n-CHO, wobei R aus
der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Alkyl oder Aryl besteht, und n 0 oder 1 ist.
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Der
Begriff „Keton" betrifft einen chemischen
Rest mit der Formel -(R)n-CO-R', wobei R und R' aus der Gruppe ausgewählt werden,
die aus Alkyl oder Aryl besteht, und n 0 oder 1 ist.
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Der
Begriff „Carbonsäure" betrifft einen chemischen
Rest mit der Formel -(R)n-COOH, wobei R
aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Alkyl oder Aryl besteht, und n 0 oder 1 ist.
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Der
Begriff „Ester" betrifft einen chemischen
Rest mit der Formel -(R)n-COOR', wobei R und R' unabhängig ausgewählt werden
aus der Gruppe, die aus Alkyl oder Aryl besteht, und n 0 oder 1
ist.
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Der
Begriff „Sulfon" betrifft einen chemischen
Rest mit der Formel -SO2-R, wobei R aus
der Gruppe ausgewählt
wird, die aus Alkyl oder Aryl besteht.
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Der
Begriff „pharmazeutisch
annehmbares Salz" betrifft
eine Formulierung einer Verbindung, die keine bedeutsame Reizung
bei einem Organismus verursacht und die biologische Aktivität und die
Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt. Pharmazeutische Salze
können
durch Umsetzen einer Verbindung der Erfindung mit anorganischen
Säuren,
wie zum Beispiel Salzsäure,
Hydrobromsäure,
Schwefelsäure,
Salpetersäure,
Phosphorsäure,
Methansulfonsäure,
Ethansulfonsäure,
p-Toluensulfonsäure,
Salicylsäure
und ähnliche, erhalten
werden.
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Der
Begriff „Arzneimittelvorstufe" betrifft ein Agens,
das in vivo in die Arzneimittelendstufe umgewandelt wird. Arzneimittelvorstufen
können
in einigen Situationen einfacher verabreicht werden als die Arzneimittelendstufe.
Zum Beispiel kann die Arzneimittelvorstufe durch orale Verabreichung
biologisch verfügbar
sein, die ausgereifte Form jedoch nicht, oder die Arzneimittelvorstufe
kann die Löslichkeit
verbessern, um eine intravenöse
Verabreichung zu ermöglichen.
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Ein
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung betrifft Indolinonverbindungen der Struktur VIII und
XI, wobei R1, R2,
R3, R3', R4,
R4',
R5, R5', R6,
R6',
R7, R8, R9, R10 und R11 Wasserstoff sind.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung Oxindolinonverbindungen der Struktur VIII
und XI, wobei R8 Brom, Chlor oder NH2 ist, und R1, R2, R3, R3', R4, R4', R5,
R5',
R6, R6', R7,
R9, R10 und R11 Wasserstoff sind.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung Indolinonverbindungen der Struktur VIII und
XI, wobei R7 Methyl ist und R1,
R2, R3, R3',
R4, R4', R5,
R5',
R6, R6', R7,
R9, R10 und R11 Wasserstoff sind.
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In
einem anderen Aspekt beschreibt die Erfindung ein Verfahren zum
Synthetisieren einer Indolinonverbindung, wobei das Verfahren die
Schritte umfasst:
- (a) Umsetzen eines Aldehyds
der Formel X oder XI mit einem Oxindol der Formel XII, wobei
R1, R2, R3, R3', R4,
R4',
R5, R5', R6,
R6',
R7, R8, R9, R10 und R11 hierin beschrieben werden; und
- (b) Abtrennen der Indolinonverbindung von den Aldehyd- und Oxindolreaktanden
abtrennt.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die eine Oxindolinonverbindung der Erfindung und einen physiologisch
annehmbaren Träger
oder Verdünnungsmittel
umfasst.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Indolinonverbindung
oder ein hierin beschriebenes Salz, das die katalytische Aktivität einer
Proteinkinase moduliert.
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Der
Begriff „Modulieren" betrifft die Fähigkeit
einer Verbindung die katalytische Aktivität einer Proteinkinase zu verändern. Ein
Modulator aktiviert bevorzugt die katalytische Aktivität einer
Proteinkinase, noch bevorzugter aktiviert oder inhibiert die katalytische
Aktivität
einer Proteinkinase abhängig
von der Konzentration der Verbindung, die der Proteinkinase ausgesetzt
wird, oder am meisten bevorzugt inhibiert die katalytische Aktivität einer
Proteinkinase.
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Der
Begriff „Proteinkinase" definiert eine Klasse
von Proteinen, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen reguliert. Proteinkinasen
regulieren zelluläre
Funktionen durch reversibles Phosphorylieren von Proteinsubstraten,
die dadurch die Konformation des Substratproteins verändern. Die
Konformationsänderung
moduliert die katalytische Aktivität des Substrates oder seine
Fähigkeit
mit anderen Bindungspartnern zu interagieren.
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Der
Begriff „katalytische
Aktivität" definiert im Kontext
der Erfindung die Rate, mit der eine Proteinkinase ein Substrat
phosphoryliert. Die katalytische Aktivität kann zum Beispiel durch Bestimmen
der Menge eines Substrates, das in ein Produkt umgewandelt wird,
als eine Funktion der Zeit gemessen werden. Die Phosphorylierung
eines Substrates tritt an der aktiven Stelle einer Proteinkinase
auf. Die aktive Stelle ist normalerweise eine Höhlung, in der das Substrat
an die Proteinkinase bindet und phosphoryliert wird.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung betrifft eine Indolinonverbindung, die die katalytische Aktivität einer
FLK-Proteinkinase inhibiert. Das Indolinon inhibiert bevorzugt die
katalytische Aktivität
der FLK-Proteinkinase mit einem IC50 von
weniger als 50 μM,
noch bevorzugter mit einem IC50 von weniger
als 5 μM
und am meisten bevorzugt mit einem IC50 von
weniger als 0,5 μM.
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Der
Begriff „FLK" betrifft eine Proteinkinase,
die Proteinsubstrate an Tyrosinresten phosphoryliert. Die FLK-Proteinkinase
reguliert die zellulären
Funktionen als Reaktionen auf den VEGF-Wachstumsfaktor. Diese zellulären Funktionen
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die zelluläre Proliferation und besonders die
Proliferation von Blutgefäßen in Geweben.
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Der
Begriff „IC50" im
Kontext der Erfindung betrifft einen Parameter, der die Konzentration
eines bestimmten Indolinons, das zur Inhibition von 50 % der katalytischen
Aktivität
der FLK-Proteinkinase erforderlich ist, beschreibt. Der IC50-Parameter
kann mittels eines hierin beschriebenen Assays und durch Verändern der Konzentration
einer bestimmten Indolinonverbindung gemessen werden.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die eine Indolinonverbindung oder ein Salz der Erfindung und einen
physiologisch annehmbaren Träger
oder ein Verdünnungsmittel
umfasst.
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Der
Begriff „pharmazeutische
Zusammensetzung" betrifft
eine Mischung einer Indolinonverbindung der Erfindung mit anderen
chemischen Komponenten, wie z.B. Verdünnungsmitteln oder Trägern. Die
pharmazeutische Zusammensetzung erleichtert das Verabreichen der
Verbindung an einen Organismus. Mehrere Techniken zum Verabreichen
einer Verbindung sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf die orale, Injektions-, Aerosol,
parenterale und topikale Verabreichung. Pharmazeutische Zusammensetzungen
können
auch durch Umsetzen von Verbindungen mit anorganischen Säuren, wie zum
Beispiel Salzsäure,
Hydrobromsäure,
Schwefelsäure,
Salpetersäure,
Phosphorsäure,
Methansulfonsäure,
Ethansulfonsäure,
p-Toluensulfonsäure,
Salicylsäure
und ähnliche
erhalten werden.
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Der
Begriff „physiologisch
annehmbar" definiert
einen Träger
oder ein Verdünnungsmittel,
der/das keine bedeutsame Reizung bei einem Organismus verursacht
und die biologische Aktivität
und Eigenschaften der Verbindung nicht aufhebt.
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Der
Begriff „Träger" definiert eine chemische
Verbindung, die das Einbringen einer Verbindung in die Zellen oder
in die Gewebe vereinfacht. Zum Beispiel ist Dimethylsulfoxid (DMSO)
ein herkömmlich
verwendeter Träger,
der die Aufnahme von vielen organischen Verbindungen in die Zellen
oder die Gewebe eines Organismus erleichtert.
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Der
Begriff „Verdünnungsmittel" definiert in Wasser
verdünnte
chemische Verbindungen, die sowohl die entsprechende Verbindung
auflösen
als auch die biologisch aktive Form der Verbindung stabilisieren.
In gepufferten Lösungen
aufgelöste
Salze werden im Stand der Technik als Verdünnungsmittel verwendet. Eine herkömmlich verwendete
Pufferlösung
ist die Phosphat gepufferte Salzlösung, da es die Salzbedingungen
des menschlichen Blutes mimt. Da Puffersalze den pH einer Lösung bei
niedrigen Konzentrationen kontrollieren können, modifiziert ein gepuffertes
Verdünnungsmittel
selten die biologische Aktivität
einer Verbindung.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung beschreibt die Verwendung einer Indolinonverbindung
der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels zum Vorbeugen
oder Behandeln eines abnormalen Zustandes in einem Organismus. Der
abnormale Zustand steht im Zusammenhang mit einer Anomalie in einem
Signaltransduktionsweg, der durch eine Interaktion zwischen einer
Proteinkinase und einem natürlichen
Bindungspartner gekennzeichnet ist.
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Der
Begriff „Vorbeugen" betrifft ein Verfahren,
das den Organismus am Erlangen des abnormalen Zustandes hindert.
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Der
Begriff „Behandeln" betrifft ein Verfahren
zum Lindern oder Aufheben des abnormalen Zustandes im Organismus.
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Der
Begriff „Organismus" betrifft jede lebende
Entität,
die aus mindestens einer Zelle besteht. Ein Organismus kann so einfach
sein wie eine eukaryotische Zelle oder so komplex wie ein Säugetier.
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Der
Begriff „abnormaler
Zustand" betrifft
eine Funktion in den Zellen oder den Geweben eines Organismus, die
von ihren normalen Funktionen im Organismus abweicht. Ein abnormaler
Zustand kann die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung oder
das Zellüberleben
betreffen.
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Abweichende
zellproliferative Bedingungen schließen Krebsarten, wie zum Beispiel
fibrotische- und mesangiale Störungen,
eine abnormale Angiogenese und Vaskulogenese, die Wundheilung, Psoriasis,
Diabetes mellitus und eine Entzündung
ein.
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Abweichende
Differenzierungszustände
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf neurodegenerative Störungen,
langsame Wundheilungsraten und Gewebetransplantationstechniken.
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Abweichende
Zellüberlebensbedingungen
betreffen Zustände,
in denen die Wege des programmierten Zelltods (Apoptose) aktiviert
oder aufgehoben sind. Viele Proteinkinasen sind mit den Apoptose-Wegen
assoziiert. Abweichungen bei der Funktion einer der Proteinkinasen
können
zur Zellunsterblichkeit oder zum verfrühten Zelltod führen.
-
Die
Zellproliferation, Differenzierung und das Überleben sind Phänomene,
die durch Verfahren im Stand der Technik einfach gemessen werden.
Diese Verfahren können
das Beobachten der Zellzahl oder das Auftreten von Zellen unter
einem Mikroskop in Bezug auf die Zeit (Tage) einschließen.
-
Der
Begriff „Verabreichen" betrifft ein Verfahren
zum Einbringen einer Verbindung in Zellen oder Gewebe eines Organismus.
Den abnormalen Zustand kann man vorbeugen oder behandeln werden,
wenn die Zellen oder Gewebe des Organismus innerhalb des Organismus
oder außerhalb
des Organismus existieren. Zellen, die außerhalb des Organismus existieren,
können
in Zellkulturschalen gehalten werden oder wachsen. Für Zellen,
die innerhalb des Organismus liegen, existieren viele Techniken
im Stand der Technik zum Verabreichen von Verbindungen, einschließlich (jedoch
nicht begrenzt auf) orale, parenterale, dermale, Injektions- und
Aerosolanwendungen. Für
Zellen außerhalb
des Organismus existieren im Stand der Technik mehrere Techniken
zum Verabreichen der Verbindungen einschließlich (jedoch nicht begrenzt
auf) Zellmikroinjektionstechniken, Transformationstechniken und
Trägertechniken.
-
Dem
abweichenden Zustand kann man auch durch das Verabreichen einer
Gruppe von Zellen mit einer Abweichung in einem Signaltransduktionsprozess
an einem Organismus vorbeugen oder behandeln. Die Wirkung des Verabreichens
einer Verbindung auf die Funktion des Organismus kann dann beobachtet
werden. Der Stand der Technik enthält mehrere Verfahren zum Einführen einer
Gruppe von Zellen in einen Organismus als auch Verfahren zum Verabreichen
einer Verbindung an einen Organismus. Der Organismus ist bevorzugt ein
Frosch, noch bevorzugter eine Maus, Ratte, Hase, Meerschweinchen
oder Ziege, und am meisten bevorzugt ein Affe oder Menschenaffe.
-
Der
Begriff „Signaltransduktionsweg" betrifft die Moleküle, die
ein extrazelluläres
Signal durch die Zellmembran verbreiten und es zu einem intrazellulären Signal
werden lassen. Dieses Signal kann dann eine zelluläre Reaktion
stimulieren. Die Polypeptidmoleküle,
die in Signaltransduktionsprozessen involviert sind, sind für gewöhnlich Rezeptor-
und Nichtrezeptorproteinkinasen, Rezeptor- und Nichtrezeptorproteinphosphatasen, Nukleotidaustauschfaktoren
und Transkriptionsfaktoren.
-
Der
Begriff „Abweichung" in Verbindung mit
einem Signaltransduktionsprozess, betrifft eine Proteinkinase, die
in einem Organismus über-
oder unterexprimiert ist, mutiert ist, so dass ihre katalytische
Aktivität niedriger
oder höher
ist als die der Wildtypproteinkinaseaktivität, mutiert ist, so dass sie
nicht länger
mit einem natürlichen
Bindungspartner interagieren kann, nicht länger durch eine andere Proteinkinase
oder Proteinphosphatase modifiziert ist oder nicht länger mit
einem natürlichen
Bindungspartner interagiert.
-
Der
Begriff „natürlicher
Bindungspartner" betrifft
ein Polypeptid, das normalerweise an den intrazellulären Bereich
einer Proteinkinase in einer Zelle bindet. Diese natürlichen
Bindungspartner können
eine Rolle beim Vermehren eines Signals in einem Proteinkinasesignaltransduktionsprozess
spielen. Der natürliche
Bindungspartner kann mit hoher Affinität an einen intrazellulären Bereich
einer Proteinkinase binden. Eine hohe Affinität stellt eine Gleichgewichtsbindungskonstante
in einer Größenordnung
von 10–6 M
oder weniger dar. Jedoch kann ein natürlicher Bindungspartner auch
vorübergehend
mit dem intrazellulären
Bereich einer Proteinkinase interagieren und ihn chemisch modifizieren.
Natürliche
Bindungspartner der Proteinkinase werden aus einer Gruppe ausgewählt, die
aus, jedoch nicht begrenzt auf, src Homologie 2 (SH2) oder 3 (SH3)
Domänen anderen
phosphoryltyrosinbindenden (PTB) Domänen und anderen Proteinkinasen
oder Proteinphosphatasen besteht.
-
Der
Begriff „Fördern oder
Zerstören
der abnormalen Interaktion" betrifft
ein Verfahren, das durch das Verabreichen einer Verbindung der Erfindung
an Zellen oder Gewebe in einem Organismus durchgeführt werden
kann. Eine Verbindung kann eine Interaktion zwischen einer Proteinkinase
und einem natürlichen
Bindungspartnern durch das Ausbilden von günstigen Interaktionen mit mehreren
Aminosäuren
an der Komplexschnittstelle fördern.
Alternativ dazu kann eine Verbindung eine Interaktion zwischen einer
Proteinkinase und einem natürlichen
Bindungspartner durch das Kompromittieren von günstigen Interaktionen, die
zwischen Aminosäuren
an der Komplexschnittstelle ausgebildet werden, inhibieren.
-
Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung betrifft die oben beschriebene Verwendung, wobei der
Organismus ein Säugetier
ist.
-
Der
Begriff Säugetier
betrifft bevorzugt solche Organismen, wie Mäuse, Ratten, Hasen, Meerschweinchen
und Ziegen, noch bevorzugter Affen und Menschenaffen und am meisten
bevorzugt Menschen.
-
Eine
andere bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung betrifft die oben beschriebene Verwendung, wobei die
Proteinkinase die FLK-Proteinkinase oder ein Plättchenwachstumsfaktor-Proteinkinase
ist.
-
Das
Indolinon inhibiert bevorzugt die katalytische Aktivität der Plättchenwachstumsfaktor-Proteinkinase
mit einem IC50 von weniger als 50 μM, noch bevorzugter
mit einem IC50 von weniger als 5 μM und am
meisten bevorzugt mit einem IC50 von weniger
als 0,5 μM.
-
Der
Begriff „Plättchenwachstumsfaktor" betrifft eine Proteinkinase,
die Substrate an Tyrosinresten phosphoryliert. Die Plättchenwachstumsfaktor-Proteinkinase
reguliert zelluläre
Funktionen in Reaktion auf den PDGF-Wachstumsfaktor. Diese zellulären Funktionen
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die zelluläre Proliferation.
-
Die
hierin in Bezug genommenen chemischen Formeln können das Phänomen der Tautomerie oder der
strukturellen Isomerie aufweisen. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen
Verbindungen eine cis- oder trans-Konformation über die Doppelbindung, die
den Indolinon 3-Substituenten mit dem Indolinonring verbindet, annehmen
oder können
Mischungen von cis- und trans-Isomeren sein. Da die Abbildung der
Formeln in der Beschreibung nur eine mögliche tautomere oder strukturell
isomere Form darstellen kann, sollte deutlich werden, dass die Erfindung
jede tautomere oder strukturell isomere Form oder Mischungen davon,
die die Fähigkeit
besitzt, die Tyrosinkinasesignaltransduktion oder Zellproliferation
zu regulieren, inhibieren und/oder modulieren, umfasst, und ist
nicht begrenzt auf irgendeine tautomere oder strukturell isomere
Form, die in der Abbildung der Formeln verwendet wird.
-
Zusätzlich zu
den oben beschriebenen Verbindungen betrifft die Erfindung weiterhin,
wenn anwendbar, sowohl solvatierte als auch unsolvatierte Formen
der Verbindungen (z.B. hydrierte Formen), die die Zellproliferation
regulieren und/oder modulieren können.
-
Die
hierin beschriebenen Verbindungen können durch jedes Verfahren
hergestellt werden, von dem bekannt ist, dass es bei der Herstellung
der chemisch verwandten Verbindungen anwendbar ist. Geeignete Verfahren
werden in den Beispielen dargestellt. Notwendige Ausgangsmaterialien
können
durch Standardverfahren der organischen Chemie erhalten werden.
-
Die
individuelle relevante Aktivität
und Wirksamkeit einer Verbindung als Agens, das die Rezeptortyrosinkinase-vermittelte
Signaltransduktion beeinflusst, kann mit den verfügbaren Techniken
bestimmt werden. Bevorzugt wird eine Verbindung einer Serie von
Untersuchungen unterzogen, um die Fähigkeit der Verbindung zu bestimmen,
die Zellproliferation zu modulieren, regulieren und/oder inhibieren.
Diese Untersuchungen, in der Reihenfolge in der sie durchgeführt werden,
schließen
biochemische Assays, Zellwachstumsassays und in vivo Experimente
ein.
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Die
oben beschriebene Zusammenfassung der Erfindung ist nicht begrenzend
und andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der
folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung und von den Ansprüchen deutlich.
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Kurze Beschreibung der
Figuren und Tabellen
-
Tabelle
1 zeigt bevorzugte Oxindole, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können.
-
Tabelle
2 zeigt Beispiele von Verbindungen der Erfindung. Die Tabelle stellt
die Molekülstruktur
jedes Indolinons, das Molekulargewicht der Verbindung und die chemische
Formel der Verbindung dar.
-
Tabellen
3 und 4 zeigen die biologische Aktivität von ausgewählten Verbindungen
der Erfindung. Aufgelistet sind die chemische Struktur der Verbindung
mit IC50-Werten, die in biologischen Inhibitionsassays
mit FLK-1 und der Plättchenwachstumsfaktor-Proteinkinase
(PDGFR) gemessen worden sind.
-
Tabelle
5 zeigt die Namen verschiedener Indolinonverbindungen der vorliegenden
Erfindung.
-
Tabelle
6 zeigt Kinasedaten für
die in Tabelle 5 aufgelisteten Verbindungen, wie sie mit den hierin
beschriebenen Assays bestimmt wurden.
-
Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
-
Die
Erfindung ist zum Teil auf das Entwerfen von Proteinkinaseinhibitoren,
die Tumoren durch Abtrennen ihrer Quellen vom zum Überleben
notwendigen zerstören.
Die Inhibitoren werden so entworfen, damit sie spezifisch Proteinkinasen
binden, die im Gefäßsystem,
das die Tumoren mit dem zum Überleben
notwendigen versorgt, überexprimiert
werden. Ein solches Proteinkinaseziel ist FLK-1, das in den proliferierenden
Endothelzellen eines wachsenden Tumors, jedoch nicht in den umgebenden
stillen Endothelzellen, überexprimiert
wird. Plate et al., 1992, Nature 359: 845–848.
-
FLK-1
wird durch Bindung von VEGF, einem starken Regulator der Endothelzellenproliferation
als auch der normalen und pathologischen Angiogenese, aktiviert.
Klagsburn und Soker, 1993, Current Biology 3: 699–702. Demnach
sind Verbindungen, die die FLK-Proteinkinase spezifisch inhibieren,
mögliche
Antikrebsagenzien, da sie das Gefäßsystem, das die Tumoren ernährt, verkleinern.
Diese Inhibitoren werden höchstwahrscheinlich
zum Minimieren und sogar zum Zerstören von festen Tumoren führen. Darüber hinaus
werden Verbindungen, die FLK spezifisch inhibieren, möglicherweise
eine neue Generation von Krebstherapeutika repräsentieren, da sie höchstwahrscheinlich
weniger Nebenwirkungen verursachen werden. Diese möglichen
Eigenschaften sind eine willkommene Verbesserung gegenüber den
derzeit verwendeten Krebstherapeutika, die vielfach Nebenwirkungen
verursachen und Patienten ernsthaft schwächen.
-
Synthese der Indolinonverbindungen
-
Die
Indolinonverbindungen der Erfindung werden durch Umsetzen eines
Aldehyds mit einem Oxindol, wie in den hierin bereitgestellten Beispielen
dargestellt, synthetisiert. Beschreibungen von Verfahren zum Synthetisieren
von Indolinonverbindungen werden in den hierin beschriebenen Beispielen
bereitgestellt. Die Beispiele beschreiben vollständig die Lösungsmittel, Temperaturen,
Trennungstechniken und andere Bedingungen, die für die Erfindung verwendet werden.
Andere synthetische Techniken, wie z.B. solche, die in der internationalen
Patentveröffentlichung
WO 96/22967, die am 1. August 1996 veröffentlicht worden ist, von
Ballinari et al. und der WO 98/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht
worden ist, von Tang et al. beschrieben werden, können ebenfalls
durch den die Verbindungen der vorliegenden Erfindung herstellenden
Fachmann verwendet oder angepasst werden. Beschreibungen der Verfahren,
die zum spezifischen Synthetisieren der Indolinonverbindungen der
Erfindung verwendet werden, werden hierin offenbart.
-
Biologische Aktivität von Indolinonverbindungen
-
Indolinonverbindungen
der Erfindung können
auf ihre Fähigkeit
die Proteinkinasen in biologischen Assays zu aktivieren oder inhibieren,
getestet werden. Die Verfahren, die zum Messen der Indolinonmodulation einer
Proteinkinasefunktion verwendet werden, werden hierin beschrieben.
Indolinonverbindungen der Erfindung wurden auf ihre Fähigkeit
getestet, die FLK-Proteinkinase zu inhibieren. Das biologische Assay
und die Ergebnisse dieser Inhibitionsstudien werden hierin beschrieben.
-
Durch Indolinonverbindungen
zu behandelnde Zielerkrankungen
-
Proteinkinasen
sind essentielle regulatorische Moleküle, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen kontrollieren.
Aus diesem Grund kann jede Veränderung
in der Funktion einer Proteinkinase einen abnormalen Zustand in
einem Organismus verursachen. Eine der vielen Funktionen, die durch
Proteinkinasen kontrolliert werden, ist die Zellproliferation.
-
Veränderungen
in der Funktion einer Proteinkinase, die normalerweise die Zellproliferation
reguliert, kann zu erhöhten
oder verringerten zellproliferativen Zuständen, die in bestimmten Erkrankungen
offenkundig sind, führen.
Abweichende zellproliferative Zustände schließen Krebsarten, wie z.B. fibrotische
oder mesangiale Störungen,
eine abnormale Angiogenese und Vaskulogenese, Wundheilung, Psoriasis,
Restenose, Diabetes mellitus und Entzündungen ein.
-
Fibrotische
Störungen
und mesangiale zellproliferative Störungen werden in der internationalen
Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben.
-
Angiogene
und vaskulogene Störungen
ergeben sich aus einer übermäßigen Proliferation
von Blutgefäßen. Die
Proliferation von Blutgefäßen ist
bei einer Vielzahl von normalen physiologischen Prozessen, wie z.B.
der embryonalen Entwicklung, der Corpus luteum Ausbildung, der Wundheilung
und der Organregeneration erforderlich. Jedoch ist die Blutgefäßproliferation
auch bei der Krebstumorentwicklung erforderlich. Andere Beispiele
für proliferative
Störungen
der Blutgefäße schließen Arthritis
ein, bei der neue kapillare Blutgefäße in das Gelenk eindringen
und den Knorpel zerstören.
Zusätzlich
schließen
proliferative Erkrankungen der Blutgefäße Augenerkrankungen ein, wie
z.B. die diabetische Retinopathie, bei der neue Kapillaren in der
Retina in den Glaskörper
eindringen, bluten und eine Erblindung verursachen. Umgekehrt stehen
Störungen,
die mit dem Schrumpfen, der Kontraktion oder dem Schließen von
Blutgefäßen zusammenhängen, wie
z.B. der Restenose, ebenfalls mit der nachteiligen Regulation von
RPK's oder RPP's in Verbindung.
-
Darüber hinaus
stehen die Vaskulogenese und Angiogenese mit dem Wachstum von malignen
festen Tumoren und Metastasen im Zusammenhang. Ein energisch wachsender
Krebstumor erfordert eine nährstoff- und
sauerstoffreiche Blutzufuhr, um das Wachstum fortzusetzen. Als Konsequenz
davon wächst
häufig
eine abnormal große
Anzahl von kapillaren Blutgefäßen in Übereinstimmung
mit dem Tumor und dient als Versorgungsleitung für den Tumor. Zusätzlich zur
Zulieferung von Nährstoffen
an den Tumor stellen die neuen Blutgefäße, die in den Tumor eingebettet
sind, eine Schnittstelle für
Tumorzellen dar, um in den Kreislauf einzutreten und an entfernten
Stellen im Organismus zu metastasieren. Folkman, 1990, J. Natl.
Cancer Inst. 82: 4–6.
-
Angiogene
und vaskulogene Störungen
stehen im engen Zusammenhang mit der FLK-Proteinkinase. FLK-1 wird
durch das Binden von VEGF, einem starken Regulator sowohl der Proliferation
von Endothelzellen als auch der normalen und pathologischen Angiogenese,
aktiviert. Klagsburn und Soker, 1993, Current Biology 3: 699-702.
Deshalb sind Verbindungen, die die FLK-Proteinkinase spezifisch
inhibieren mögliche
Antikrebsagenzien, da sie das Gefäßsystem verkleinern, das die
Tumoren versorgt. Diese Inhibitoren werden höchstwahrscheinlich zum Minimieren
und sogar zum Zerstören
von festen Tumoren führen.
Darüber
hinaus repräsentieren
Verbindungen, die FLK spezifisch inhibieren, möglicherweise eine neue Generation
von Krebstherapeutika, da sie höchstwahrscheinlich
weniger Nebenwirkungen verursachen. Diese möglichen Eigenschaften sind
eine signifikante Verbesserung gegenüber den derzeit verwendeten
Krebstherapeutika, die multiple Nebenwirkungen verursachen und den
Patienten auf schädliche
Weise schwächen.
-
Zusätzlich zur
Zellproliferation regulieren einige RPK's und RPP's die vorletzten zellulären Funktionen, das
Zellüberleben
und den Zelltod. Der Gliawachstumsfaktor (GDNF) aktiviert c-ret,
zum Beispiel durch das Zusammenbringen multipler c-ret-Rezeptoren
in unmittelbare Umgebung zueinander und Fördern der Kreuzphosphorylierung
der intrazellulären
Bereiche. Signaltransduktionsmoleküle, die mit c-ret einen Komplex
in Folge dieser Phosphorylreste, wie z.B. grb-2, sos, ras, und raf,
bilden, verbreiten ein Signal in der Zelle, dass das Überleben
der Neuronen fördert.
Demnach werden die Verbindungen, die die Interaktionen dieser stimulatorischen
Moleküle
des c-ret fördern,
die Aktivität
von c-ret verstärken.
-
Alternativ
dazu können
Proteinphosphatasen die Phosphorylreste, die im intrazellulären Bereich
von c-ret in Reaktion auf GDNF angeordnet sind, entfernen und dadurch
die Signalgebungsfähigkeit
von c-ret inhibieren. Daher verstärken Verbindungen, die die
Phosphatasen von c-ret inhibieren, die Signalgebungskapazität von c-ret.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung könnte die c-ret-Proteinkinase
durch Indolinonverbindungen, die mit Substituenten, besonders in
der 5-Position des Oxindolrings, modifiziert sind, aktiviert werden.
-
c-ret
steht mit der Entwicklung und dem Überleben von enterischen, synaptischen
und sensorischen Neuronen und Neuronen des Nierensystems nach der
Stimulation durch GDNF in Verbindung. Das Fehlen von Funktionsmutationen
in c-ret kann zur Hirschsprung's
Erkrankung führen,
die sich zum Beispiel selbst in einer Verringerung der Intestinaltraktinnervation
bei Patienten manifestiert. Daher sind Verbindungen, die c-ret aktivieren,
mögliche
therapeutische Agenzien für
die Behandlung von neurodegenerativen Störungen, die einschließen, jedoch
nicht beschränkt
sind auf die Hirschsprung's
Erkrankung, Parkinson Erkrankung, Alzheimer Erkrankung und die amyotrophe
Lateralsklerose. Verbindungen, die die c-ret-Funktion inhibieren,
sind mögliche
Antikrebsagenzien, da die Überexpression
von ret in Zellen mit Krebsarten, wie z.B. Schilddrüsenkrebs,
in Verbindung steht.
-
Pharmazeutische Zusammensetzungen
und Verabreichung von Indolinonverbindungen
-
Verfahren
zum Herstellen pharmazeutischer Formulierungen der Verbindungen,
Verfahren zum Bestimmen der Mengen der an einen Patienten zu verabreichenden
Verbindungen und Arten der Verabreichung der Verbindungen an einen
Organismus sind in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/22976, die
am 1. August 1996 veröffentlicht
worden ist, von Ballinari et al. offenbart.
-
Der
Fachmann wird erkennen, dass solche Beschreibungen auf die vorliegende
Erfindung anwendbar sind und einfach daran angepasst werden können. Der
Mechanismus einer solchen Wirkung und mögliche Verwendungen für diese
Verbindungen sind in der internationalen Patentveröffentlichung
WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben.
-
Die
hierin beschriebenen Verbindungen können einem menschlichen Patienten
per se oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen sie
mit geeigneten Trägern
oder einem Zusatzstoff(en) vermischt sind, verabreicht werden. Techniken
zum Formulieren und Verabreichen der Verbindungen der derzeitigen
Anmeldung, findet man in „Remington's Pharmaceutical
Sciences", Mack
Publishing Co., Easton, PA, letzten Ausgabe oder in der internationalen
Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al.
-
Wirksame Dosierung
-
Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen
ein, wobei die aktiven Inhaltsstoffe in einer Menge enthalten sind,
die wirksam ist, um den beabsichtigten Zweck zu erzielen. Eine therapeutisch
wirksame Menge bedeutet besonders eine Menge der Verbindung, die
den Symptomen der Erkrankung wirksam Vorbeugen, sie lindern oder verbessern
kann oder das Überleben
des zu behandelnden Subjektes verlängert. Das Bestimmen einer
therapeutisch wirksamen Menge liegt innerhalb der Fähigkeit
eines Fachmanns, besonders im Hinblick auf die detaillierte Offenbarung,
die hierin und in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. Wo 96/40116,
die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht
worden ist, von Tang et al. bereitgestellt wird.
-
Verpackung
-
Die
Zusammensetzungen können,
falls gewünscht,
in einer Verpackung oder einer Dispenservorrichtung präsentiert
werden, die eine oder mehrere Formen der Dosierungseinheit mit dem
aktiven Inhaltsstoff gemäß der Beschreibung,
die in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116,
die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht
wurde, von Tang et al. bereitgestellt wird, enthalten.
-
Beispiele
-
Die
untenstehenden Beispiele sind nicht begrenzend und sind lediglich
repräsentativ
für verschiedene Aspekte
und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele stellen
Verfahren zum Synthetisieren von Indolinonverbindungen der Erfindung
dar. Die Beispiele zeigen sowohl die Spezifität als auch die Möglichkeiten,
mit der diese Verbindungen die Proteinkinasefunktion in Zellen inhibieren.
-
Beispiel 1: Synthese der
Verbindung
-
Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannter Techniken, wie
zum Beispiel denen, die in der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben worden sind, synthetisiert werden. Im Folgenden
werden bevorzugte Verfahren zum Synthetisieren der Verbindungen
der beanspruchten Erfindung dargestellt.
- (a)
Herstellung von 4-Methyl-2-oxindol. Dietyhloxalat (30 ml) in 20
ml trockenem Ether wurde unter Rühren zu
19 g Kaliumethoxid, das in 50 ml getrocknetem Ether suspendiert
wurde, gegeben. Die Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt und 20
ml 3-Nitro-O-xylen in 20 ml trockenem Ether wurden langsam zugegeben. Die
zähflüssige, dunkelrote
Mischung wurde für
0,5 h bis zum Reflux erhitzt, zu einem dunkelroten Feststoff konzentriert
und mit 10 % Natriumhydroxid behandelt, bis sich fast der gesamte
Feststoff aufgelöst
hat. Die dunkelrote Mischung wurde mit 30 % Wasserstoffperoxid behandelt,
bis die rote Farbe nach gelb umschlägt. Alternativ dazu wurde die
Mischung mit 10 % Natriumhydroxid und 30 % Wasserstoffperoxid behandelt,
bis die dunkle Farbe nicht länger
vorhanden war. Der Feststoff wurde abgefiltert und das Filtrat mit 6
N Salzsäure
angesäuert.
Das sich daraus ergebende Präzipitat
wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Wasser gewaschen und
unter einem Vakuum getrocknet, um 9,8 g (45 % Ausbeute) an 1-Methyl-6-nitrophenylessigsäure als
cremefarbenen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wurde in Methanol über 10 % Palladium
auf Kohlenstoff hydriert, um 9,04 g der Titelverbindung als weißen Feststoff
zu erhalten.
- (b) Herstellung von 5-Nitro-2-oxindol. Das 2-Oxindol (6,5 g)
wurde in 25 ml konzentrierter Schwefelsäure aufgelöst und die Mischung bei –10, –15°C gehalten,
während
2,1 ml rauchender Salpetersäure
tropfenweise zugegeben wurden. Nach der Zugabe der Salpetersäure wurde
die Reaktionsmischung bei 0°C
für 0,5 h
gerührt
und in Eiswasser gegossen. Das Präzipitat wurde durch Filtration
gesammelt, mit Wasser gewaschen und aus 50 % Essigsäure kristallisiert.
Der Endkristall wurde dann gefiltert, mit Wasser gewaschen und unter
einem Vakuum getrocknet, um 6,3 g (70 %) 5-Nitro-2-oxindol zu erhalten.
- (c) Herstellung von 5-Amino-2-oxindol. Das 5-Nitro-2-oxindol (6,3 g) wurde
in Methanol über
10 % Palladium auf Kohlenstoff hydriert, um 3,0 g (60 % Ausbeute)
der Titelverbindung als weißen
Feststoff zu erhalten.
- (d) Herstellung von 5-Fluor-2-oxindol. 5-Fluorisatin (8,2 g)
wurde in 50 ml Hydrazinhydrat aufgelöst und für 1 h refluxiert. Die Reaktionsmischungen
wurden dann in Eiswasser gegossen. Das Präzipitat wurde dann gefiltert,
mit Wasser gewaschen und unter einem Vakuumofen getrocknet, um 6,0
g 5-Fluour-2-oxindol (79 % Ausbeute) zu erhalten.
- (e) Herstellung von 5-Brom-2-oxindol. 2-Oxindol (1,3 g) in 20
ml Acetonitril wurden auf –10°C gekühlt und 2,0
g an N-Bromsuccinimid wurden langsam unter Rühren zugegeben. Die Reaktion
wurde für
1 h bei –10°C und 2 h
bei 0°C
gerührt.
Das Präzipitat
wurde eingesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 1,9
g (90 % Ausbeute) der Titelverbindung zu erhalten.
- (f) Herstellung von 5-Carboxy-2-oxindol
Schritt 1. Synthese
von 5-Methoxycarbonyl-2-oxindol.
5-Iod-2-oxindol (17 g) wurden
mit 2 g Palladiumdiacetat, 18,15 g Triethylamin, 150 ml Methanol,
15 ml Dimethylsulfoxid und 2,6 g DPPP in einer Atmosphäre, die
mit Kohlenmonoxid gesättigt
war, refluxiert. Nach 24 Stunden wurde die Reaktion gefiltert, um
den Katalysator zu entfernen und das Filtrat konzentriert. Das Konzentrat
wurde auf einem Silikagel in 30 % Ethylacetat in Hexan chromatographiert.
Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden konzentriert
und stehengelassen. Das präzipitierte
Produkt wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, um 0,8 g (7 %) der
Titelverbindung als cremefarbenen Feststoff zu erhalten.
Schritt
2: Synthese von 5-Carboxy-2-oxindol.
5-Methoxycarbonyl-2-oxindol
(1 g) und 1 g Natriumhydroxid in 20 ml Methanol wurden für 3 Stunden
refluxiert. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und bis zur Trockne konzentriert.
Der Reststoff wurde in Wasser aufgelöst und zweimal mit Ethylacetat
extrahiert. Die wässrige
Schicht wurde mit 6 N Salzsäure
angesäuert
und der präzipitierte
Feststoff gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 0,7
g (78 %) der Titelverbindung als cremefarbenen Feststoff zu erhalten.
- (g) Herstellung von 5-Carboxyethyl-2-oxindol
Schritt 1:
Synthese von 5-Chloracetyl-2-oxindol.
Aluminiumchlorid (30,8
g) und 2-Oxindol (5,0 g) wurden zu 200 ml Kohlenstoffdisulfid bei
Raumtemperatur gegeben und die Mischung gerührt. Chloracetylchlorid (3,8
ml) wurde zugegeben und es wurde für 1 Stunde weiter gerührt. Die
Mischung wurde für
3 Stunden bis zum Reflux erhitzt, gekühlt und das Lösungsmittel abdekantiert.
Der Reststoff wurde in Eiswasser gerührt bis er zu einer festen
Suspension wurde. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt,
in Wasser gewaschen und getrocknet, um 7,0 g (90 % Ausbeute) der
Titelverbindung zu erhalten.
Schritt 2: Synthese von 5-Chlorethyl-2-oxindol.
5-Chloracetyl-2-oxindol
(7,0 g) wurden zu 25 ml Trifluoressigsäure gegeben und die Mischung
in einem Eisbad unter Rühren
gekühlt.
Triethylsilan (12,3 ml) wurde tropfenweise über 2 Minuten zugegeben. Die
Reaktion wurde dann bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt und
in Eiswasser gegossen. Hexan wurde zugegeben, die Mischung intensiv
gerührt,
und der Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt und mit Hexan
gewaschen, um 5,9 g (91 % Ausbeute) des Produktes als weißen Feststoff
zur erhalten.
Schritt 3: Synthese von 5-Cyanoethyl-2-oxindol.
Kaliumcyanid
(2,02 g) wurde zu 15 ml Dimethylsulfoxid gegeben und auf 90°C erhitzt.
5-Chlorethyl-2-oxindol (3,0 g), das in 5 ml Dimethylsulfoxid aufgelöst wurde,
wurde langsam unter Rühren
zugegeben und die Reaktion für
2 Stunden auf 150°C
erhitzt. Die Mischung wurde gekühlt,
in Eiswasser gegossen und das Präzipitat
durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet,
um das Rohprodukt zu erhalten. Das Rohmaterial wurde auf einem Silikagel
in 5 % Methanol in Chloroform chromatographiert, um 1,2 g (42 %
Ausbeute) der Titelverbindung zu erhalten.
Schritt 4: Synthese
von 5-Carboxyethyl-2-oxindol.
5-Cyanoethyl-2-oxindol (4,02
g) in 10 ml Wasser, das 25 ml konzentrierte Salzsäure enthält, wurde
für 4 Stunden
refluxiert. Die Mischung wurde gekühlt, Wasser zugegeben und der
sich daraus ergebene Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt,
mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 1,9 g (44 % Ausbeute) der
Titelverbindung als gelben Feststoff zu erhalten.
- (h) Herstellung von 3,5-Dimethylpyrrol-2-carboxaldehyd
5-Cyanoethyl-2-oxindol
(4,02 g) in 10 ml Wasser, das 25 ml konzentrierte Salzsäure enthält, wurde
für 4 Stunden
refluxiert. Die Mischung wurde gekühlt, Wasser zugegeben und der
sich daraus ergebene Feststoff durch Vakuumfiltration gesammelt,
mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 1,9 g (44 % Ausbeute) der
Titelverbindung als gelben Feststoff zu erhalten.
- (i) Herstellung von 3,5-Dimethylpyrrol-2-carboaldehyd
Zu
einer Lösung
aus Dimethylformamid (80,4 g) und 1 l Dichlorethan bei 0°C wurde über ein
paar Minuten Phosphoroxidchlorid (153,3 g) zugegeben und die Reaktion
für 1–2 h bei
0°C gerührt, 2,4-Dimethylpyrrol (114,6
g) wurde tropfenweise zur obigen Lösung bei einer Temperatur von
weniger als 5°C
gegeben. Nachdem Beendigung der Zugabe wurde der Reaktionsansatz
erhitzt und die wässrige
Schicht isoliert und sicher aufbewahrt. Die organische Schicht wurde
wiederum mit 300 ml Wasser extrahiert und die zwei wässrigen Schichten
kombiniert. Die wässrige
Phase wurde mit 200 ml Dichlorethan extrahiert und die organische Schicht
verworfen. Die wässrige
Phase wurde auf 10°C
abgekühlt
und mit 10 % Natriumhydroxid auf pH 10 eingestellt. Die Mischung
wurde bei 10°C
für 2 h
gerührt.
Der gelbe Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt und gründlich mit
Wasser gewaschen. Der Feststoff wurde bei Raumtemperatur unter einem Vakuum
getrocknet, um 110,8 g (90 % Ausbeute) 2,4-Dimethyl-5-formylpyrrol
zu erhalten.
- (j) Herstellung von 3,5-Diethylpyrrol-2-carboxaldehyd:
Die
Lösung
aus 25,0 g 3,5-Heptandion und 42,3 g Diethylaminomalonathydrochlorid
in 200 ml Essigsäure wurde
für 1,25
h auf 95–100°C erhitzt.
Natriumacetat wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde für 5,35 h
gerührt
und für
4 h abgekühlt.
Das Salz wurde gefiltert und mit Essigsäure gewaschen. Die Essigsäurelösung wurde
dann konzentriert und der Reststoff in 800 ml Wasser gegossen. Der
gelbe Feststoff wurde abgefiltert und in einem Vakuumofen über Nacht
getrocknet, um 36,0 g Ethyl-3,5-diethylpyrrol-2-carboxalat als orangene
Flüssigkeit
(92 % Ausbeute) zu erhalten.
Die Decarboxylierung von Ethyl-3,5-diethylpyrrol-2-carboxalat nach der
Hydrolyse ergab 2,4-Diethylpyrrol. Die Titelverbindung wurde dann über die
Vilsmeier Formulierung von 2,4-Diethylpyrrol unter den gleichen Bedingungen,
die für
die Herstellung von 3,5-Dimethylpyrrol-5-carboxaldehyd verwendet
wurden, synthetisiert.
- (k) Herstellung von 3,5-Diisopropylpyrrol-2-carboxaldehyd
Der
Verfahrensablauf war der gleiche wie der für die Herstellung von 3,5-Diethylpyrrol-2-carboxaldehyd,
mit der Ausnahme, dass mit 2,6-Dimethyl-3,5-heptandion begonnen
wurde.
-
Beispiel 2: FLK-Inhibition
durch Indolinonverbindungen der Erfindung
-
Ein
Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA) wurde durchgeführt, um
die katalytische Aktivität
des FLK-1-Rezeptors und noch spezifischer die Inhibition oder Aktivierung
der katalytischen Aktivität
des FLK-1-Rezeptors durch die Indolinonverbindungen zu messen. Besonders
das folgende Assay wurde durchgeführt, um die katalytische Aktivität des FLK-1-Rezeptors in FLK-1/NIH3T3-Zellen
zu messen.
-
Die
Materialien und das Protokoll für
das FLK-1 ELISA-Assay
entsprechen denen/dem, die in der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben werden.
-
Die
ausgewählten
Verbindungen wurden im FLK-1 ELISA-Assay getestet. Die IC50 Messungen werden in den Tabellen wiedergegeben.
Derivate von 3-[(Indol-3-yl)methylen]-2-indolinonverbindungen mit einem Methylsubstituenten
in der 1'-Position erwiesen
sich als die wirksamsten Inhibitoren der Gruppe von Verbindungen,
die im Assay getestet worden sind.
-
Beispiel 3: In Vitro RTK-Assays
-
Die
folgenden in vitro-Assays können
verwendet werden, um das Aktivitätsniveau
und die Wirksamkeit der unterschiedlichen Verbindungen der vorliegenden
Erfindung auf eine oder mehrere der RTK's zu bestimmen. Vergleichbare Assays
können
auf die gleiche Art für
jede Tyrosinkinase mit im Stand der Technik bekannten Techniken
entworfen werden.
-
(a) Festphasen-Enzymimmunoassay
(ELISA)
-
Festphasen-Enzymimmunoassays
(ELISA) können
verwendet werden, um die Anwesenheit der Tyrosinkinaseaktivität zu detektieren
und zu messen. Der ELISA kann gemäß bekannter Protokolle, die
zum Beispiel von Voller, et al., 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", in: Manual of Clinical
Immunology, 2. Ausgabe, überarbeitet
von Rose und Friedman, S. 359–371,
Am. Soc. Of Micorbiology, Washington, D.C. beschrieben werden, durchgeführt werden.
-
Das
offenbarte Protokoll kann zum Bestimmen der Aktivität in Bezug
auf eine spezifische RTK angepasst werden. Zum Beispiel werden die
bevorzugten Protokolle zum Durchführen der ELISA-Experimente
für spezifische
RTK's weiter unten
bereitgestellt. Das Anpassen dieser Protokolle zum Bestimmen der
Aktivität
einer Verbindung für
andere Mitglieder der RTK-Familie
als auch anderer Rezeptor- und Nichtrezeptortyrosinkinasen, liegt
innerhalb des Schutzumfangs derer im Stand der Technik.
-
(i) FLK-1 ELISA
-
Es
wurde ein ELISA-Assay durchgeführt,
um die Kinaseaktivität
des FLK-1-Rezeptors und besonders die Inhibition oder Aktivierung
der Proteintyrosinkinaseaktivität
des FLK-1-Rezeptors zu messen. Es wurde insbesondere das folgende
Assay durchgeführt,
um die Kinaseaktivität
des FLK-1-Rezeptors
in FLK-1/NIH3T3-Zellen zu messen.
-
Materialien und Methoden
-
Materialien.
-
Die
folgenden Reagenzien und Hilfsstoffe wurden verwendet:
- a. Corning 96-Kammer ELISA-Platten (Corning Katalog Nr. 25805-96);
- b. Cappel Anti-Hasen IgG von der Ziege (Katalog Nr. 55641);
- c. PBS (Gibco Katalog Nr. 450-1300EB);
- d. TBSW-Puffer (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl und 0,1 % Tween-20);
- e. Ethanolaminstammlösung
(10 % Ethanolamin (pH 7,0), gelagert bei 4°C);
- f. HNTG-Puffer (20 mM HEPES-Puffer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2
% Triton X-100 und 10 % Glycerol);
- g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) als 100× Stammlösung);
- h. Natriumorthovanadat (0,5 M als 100× Stammlösung);
- i. Natriumpyrophosphat (0,2 M als 100× Stammlösung);
- j. NUNC V-bödige
96-Kammer-Polypropylenplatten (Applied Scientific Katalog Nr. AS-72092);
- k. NIH3T3 C7#3-Zellen (FLK-1 exprimierende Zellen);
- l. DMEM mit 1× hoher
Glukose, L-Glutamin (Katalog Nr. 11965-050);
- m. FBS, Gibco (Katalog Nr. 16000-028);
- n. L-Glutamin, Gibco (Katalog Nr. 25030-016);
- o. VEGF, PeproTech, Inc. (Katalog Nr. 100-20) (als 1 μg/100 μl Stammlösung in
Milli-Q dH2O aufbewahrt und bei –20°C gelagert);
- p. Affinitätsgereinigtes
Anti-FLK-1-Antiserum, das wie folgt erhalten oder gereinigt werden
kann:
1. Man stellt eine durch Tresyl aktivierte Agarose/Flk-1-D-Säule durch
Inkubieren von 10 ml Tresyl-aktivierter Agarose mit 20 mg gereinigtem
GST-Flk-1-D-Fusionsprotein in 100 mM Natriumbicarbonat (pH 9,6)-Puffer über Nacht
bei 4°C
her.
2. Man wäscht
die Säule
einmal mit PBS.
3. Man blockiert die überzähligen Stellen auf der Säule für 2 Stunden
bei 4°C
mit 2 M Glycin.
4. Man wäscht
die Säule
mit PBS.
5. Man inkubiert die Säule mit vom Hasen gewonnenes
(production bleed) Anti-Flk-1D für
2 Stunden bei 4°C.
6.
Man wäscht
die Säule
mit PBS.
7. Man eluiert das Antiserum mit 100 mM Zitronensäure, pH
3,0, und neutralisiert das Eluat sofort mit 2 M Tris, pH 9,0.
8.
Man dialysiert das Eluat über
Nacht gegen PBS bei 4°C,
bei drei Pufferwechseln (Probe zu Pufferverhältnis ist 1:100).
9. Man
stellt das dialysierte Antiserum auf 5 % Glycerol ein und lagert
es bei –80°C in kleinen
Aliquots.
- q. Monoklonaler Antikörper
UB40, der für
Phosphotyrosin spezifisch ist (siehe, Fendley, et al., 1990, Cancer Research
50: 1550–1558);
- r. EIA reines Anti-Maus IgG-POD von der Ziege (BioRad Katalog
Nr. 172–1011);
- s. 2,2-Azino-bis(3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)-Lösung (100
mM Zitronensäure
(wasserfrei), 250 mM Na2HPO4 (pH
4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma Katalog Nr. A-1888)), die Lösung sollte
im Dunklen bei 4°C
gelagert werden, bis sie verwendet wird;
- t. H2O2 (30
% Lösung)
(Fisher Katalog Nr. H325);
- u. ABTS/H2O2 (15
ml ABTS-Lösung,
2 μl H2O2) wird 5 Minuten
vor der Verwendung hergestellt und bei Raumtemperatur stehengelassen;
- v. 0,2 M HCl-Stammlösung
in H2O;
- w. Dimethylsulfoxid (100 %) (Sigma Katalog Nr. D-8418); und
- x. Trypsin-EDTA (Gibco BRL Katalog Nr. 25200-049).
-
Protokoll.
-
Das
folgende Protokoll wurde zur Durchführung des Assays verwendet:
- 1. Man beschichtet Corning 96-Kammer-ELISA-Platten
mit 1,0 μg
pro Kammer Cappel Anti-Hasen-IgG-Antikörper in 0,1 M Na2CO3, pH 9,6. Man stellt das Endvolumen auf
150 μl pro
Kammer ein. Man beschichtet die Platten über Nacht bei 4°C. Die Platten
können
bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden, wenn sie bei 4°C gelagert
werden.
- 2. Man kultiviert die Zellen in Wachstumsmedium (DMEM, supplementiert
mit 2,0 mM L-Glutamin, 10 % FBS) in geeigneten Kulturschalen bis
zur Konfluenz bei 37°C,
5 % CO2.
- 3. Man erntet die Zellen durch Trypsinieren ab und impft sie
in Corning 25850 rundbödigen
96-Polystyrenkammer-Zellplatten
mit 25.000 Zellen/Kammer in 200 μl
Wachstumsmedium an.
- 4. Man kultiviert die Zellen wenigstens einen Tag bei 37°C, 5 % CO2.
- 5. Man wäscht
die Zellen mit D-PBS 1×.
- 6. Man gibt 200 μl/Kammer
des Mediums zum Aushungern (DMEM, 2,0 mM L-Glutamin, 0,1 % FBS)
zu. Man inkubiert über
Nacht bei 37°C,
5 % CO2.
- 7. Man verdünnt
die Verbindungen/Extrakte 1:20 in 96-Polypropylenkammerplatten mit dem Medium
zum Aushungern. Man verdünnt
das Dimethylsulfoxid 1:20 für
die Verwendung in den Kammern mit den Kontrollen.
- 8. Man entfernt das Medium zum Aushungern aus den 96-Kammer-Zellkulturplatten
und gibt 162 μl
frisches Medium zum Aushungern in jede Kammer.
- 9. Man gibt 18 μl
einer 1:20 verdünnten
Verbindungs-/Extraktverdünnung (aus
Schritt 7) in jede Kammer und zusätzlich die 1:20 Dimethylsulfoxidverdünnung in
die Kammern mit den Kontrollen (+/– VEGF) für eine Endverdünnung von
1:200 nach der Zellstimulation. Die Endkonzentration des Dimethylsulfoxid
beträgt
0,5 %. Man inkubiert die Platte bei 37°C, 5 % CO2 für zwei Stunden.
- 10. Man entfernt den ungebundenen Antikörper aus den ELISA-Platten
durch Umdrehen der Platten, um die Flüssigkeit zu entfernen. Man
wäscht
sie dreimal mit TBSW + 0,5 % Ethanolamin, pH 7,0. Man klopft die
Platte auf einem Papiertuch aus, um die überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
- 11. Man blockiert die Platten mit TBSW + 0,5 % Ethanolamin,
ph 7,0, 150 μl
pro Kammer. Man inkubiert die Platte 30 Minuten unter Schütteln auf
einem Mikrotiterplattenschüttler.
- 12. Man wäscht
die Platten dreimal, wie in Schritt 10 beschrieben.
- 13. Man gibt 0,5 μg/Kammer
des affinitätsgereinigten
Anti-FLU-1 polyklonalen
Antiserums vom Hasen zu. Man stellt das Endvolumen auf 150 μl/Kammer
mit TBSW + 0,5 % Ethanolamin, pH 7,0, ein. Man inkubiert die Platte
unter Schütteln
für 30
Minuten.
- 14. Man gibt 180 μl
Medium zum Aushungern zu den Zellen und stimuliert die Zellen mit
20 μl/Kammer
an 10,0 mM Natriumorthovanadat und 500 ng/ml VEGF (was zu einer Endkonzentration
von 1,0 mM Natriumorthovanadat und 50 ng/ml VEGF pro Kammer führt) für acht Minuten
bei 37°C,
5 % CO2. Die Kammern mit den Negativkontrollen
erhalten nur Medium zum Aushungern.
- 15. Nach acht Minuten sollte das Medium von den Zellen entfernt
werden und diese einmal mit 200 μl/Kammer
TBS gewaschen werden.
- 16. Man lysiert die Zellen mit 150 μl/Kammer HNTG unter Schütteln bei
Raumtemperatur für
fünf Minuten. Die
HNTG-Formulierung
enthält
Natriumorthovanadat, Natriumpyrophosphat und EDTA.
- 17. Man wäscht
die ELISA-Platte dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
- 18. Man überträgt die Zelllysate
aus der Zellplatte in die ELISA-Platte und inkubiert sie unter Schütteln für zwei Stunden.
Zum Übertragen
des Zelllysates, pipettiert man auf und ab, während die Kammern ausgeschabt
werden.
- 19. Man wäscht
die Platten dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
- 20. Man inkubiert die ELISA-Platte mit 0,02 μg/Kammer UB40 in TBSW + 0,5
% Ethanolamin. Man stellt das Endvolumen auf 150 μl/Kammer
ein. Man inkubiert unter Schütteln
für 30
Minuten.
- 21. Man wäscht
die Platten dreimal wie in Schritt 10 beschrieben.
- 22. Man inkubiert die ELISA-Platten mit auf 1:10000 verdünntem EIA
reinen Anti-Maus-IgG von der Ziege, das mit der Meerrettichperoxidase
konjugiert ist, in TBSW + 0,5 % Ethanolamin, pH 7,0. Man stellt
das Endvolumen auf 150 μl/Kammer
ein. Man inkubiert unter Schütteln
für dreißig Minuten.
- 23. Man wäscht
die Platte wie in Schritt 10 beschrieben.
- 24. Man gibt 100 μl
ABTS/H2O2-Lösung zur
Kammer. Man inkubiert zehn Minuten unter Schütteln.
- 25. Man gibt 100 μl
an 0,2 M HCl für
eine Endkonzentration von 0,1 M HCl zu, um die Farbentwicklungsreaktion
zu stoppen. Man schüttelt
1 Minute bei Raumtemperatur. Man entfernt die Blasen mit einem leichten Luftstrom
und liest die ELISA-Platte in einem ELISA-Plattenlesegerät bei 410
nm aus.
-
(ii) HER-2-ELISA
-
HER-2-ELISA-Assays
werden in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116,
die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht
worden ist, von Tang et al. beschrieben.
-
(iii) PDGF-R-ELISA
-
Ein
PDGF-R-ELISA wird in der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben.
-
(iv) IGF-I-ELISA
-
Das
IGF-I-ELISA Protokoll, das in der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben wird, kann verwendet werden, um das Phosphotyrosinniveau
am IGF-I-Rezeptor, der die IGF-I Rezeptortyrosinkinaseaktivität bezeichnet,
zu messen.
-
(v) EGF-Rezeptor-ELISA
-
Die
Kinaseaktivität
des EGF-Rezeptors (EGFR-NIH3T2-Assay) in ganzen Zellen wurde so
gemessen, wie es in der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben wird.
-
(vi) Zellulärer Insulinrezeptor-ELISA
-
Das
Protokoll, das in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 96/40116,
die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht
worden ist, von Tang et al. beschrieben wird, wurde verwendet, um
zu bestimmen, ob die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine
Insulinrezeptortyrosinkinaseaktivität besitzen.
-
(vii) EGFR-ELISA-ASSAY
-
Zweck
-
Bereitstellen
eines einheitlichen Verfahrens zum Messen der in vitro Kinaseaktivität von EGFR
in einem Festphasen-Enzymimmunoassay
(ELISA).
-
Umfang.
-
Das
folgende Protokoll beschreibt die Verfahren, die zum Analysieren
der Proteintyrosinkinaseaktivität am
EGFR in einem ELISA verwendet werden. Der Verfahrensablauf beschreibt
auch das Protokoll für
das anfängliche
Screenen von Arzneimitteln zur Inhibition oder Aktivierung der Proteintyrosinkinaseaktivität.
-
Reagenzien und Hilfsmittel.
-
- 1. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten
Corning
Katalog #25805-96
- 2. 05-101 monoklonaler Anti-EGFR-Antikörper (kommerziell erhältlich bei
UB1)
–80°C, 1 ml Aliquots
- 3. PBS (Dulbecco's
Phospat gepufferte Salzlösung)
Gibco
Katalog # 450-1300EB
Formulierung:
2,7 mM KCL
1,1
mM KH2PO4
0,5
mM MgCl2 (wasserfrei)
138 mM NaCl
8,1
mM Na2HPO4
- 4. TBST-Puffer
Formulierung:
50 mM Tris pH 7,2
150
mM NaCl
0,1 % Triton X-100
- 5. Blockierpuffer
Formulierung:
5 % Carnation lösliche Milch
in PBS
- 6. A431 Zelllysat
A431 Zellen sind bei mehreren kommerziellen
Quellen erhältlich
und können
mit konventionellen Verfahren, die dem Fachmann im Stand der Technik
bekannt sind oder wie für
die Lyse von 3T3-Zellen im zellulären EGF-Assay, das hierin beschrieben
wird, beschrieben, lysiert. –80°C, 1 ml Aliquots
- 7. TBS-Puffer
Formulierung:
50 mM Tris pH 7,2
150
mM NaCl
- 8. TBS + 10 % DMSO
Formulierung:
10 % DMSO in TBS-Puffer
(DMSO
von Sigma, Katalog # D-2650)
- 9. ATP/MnCl2-Phosphorylierungsmischung
Formulierung:
0,03
mM ATP
(Adenosin-5'-triphosphat,
Sigma Katalog # A-5394)
50 mM MnCl2
Man
stellt es in autoklaviertem Milli-Q H2O
kurz vor der Verwendung her.
Man lagert es bis zur Verwendung
auf Eis.
- 10. NUNC V-bödige
96-Kammer-Polypropylenplatten
Applied Scientific Katalog #
AS-72092
- 11. EDTA
Formulierung:
200 mM EDTA, pH 8,0.
- 12. Polyklonales Anti-Phosphotyrosinserum vom Hasen, oder monoklonaler
Antikörper
UB40, der für
Phosphotyrosin spezifisch ist oder UBI's mab 4610, Upstate Biotechnology, Lake
Placid, New York, Katalog # 05-321
–80°C, 1 ml Aliquots
Man taut
eine 1 ml Phiole auf, und aliquotiert sie in kleinere Volumen und
lagert sie bei –80°C.
Das
Antiserum ist über
Wochen stabil, wenn es aufgetaut und bei 4°C gelagert wird.
- 13. Anti-Hasen-IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege.
Biosource
Katalog # ALI0404
- 14. ABTS-Lösung
Formulierung:
100
mM Zitronensäure
(wasserfrei)
250 mM Na2HPO4,
pH 4,0
0,5 mg/ml ABTS
(2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)
(Sigma
Katalog # A-1888)
Man lagert die Lösung bis zur Verwendung bei
4°C im Dunklen.
- 15. Wasserstoffperoxid 30 % Lösung.
Fisher Katalog #
H325
Man lagert es im Dunklen bei 4°C bis zur Verwendung.
- 16. ABTS/H2O2
Formulierung:
15
ml ABTS-Lösung
2 μl H2O2
Man stellt
es 5 Minuten vor der Verwendung bei Raumtemperatur her.
- 17. 0,2 M HCl-Stammlösung
in H2O
-
Verfahrensablauf:
-
- 1. Man beschichtet Corning 96-Kammer-ELISA-Platten
mit 0,5 μg
pro Kammer 05-101 Antikörper.
Man
stellt das Endvolumen mit PBS auf 100 μl pro Kammer ein.
Man beschichtet
die Platten über
Nacht bei 4°C.
- 2. Man entfernt ungebundenes 05-101 durch Umdrehen der Platte,
um die Flüssigkeit
zu entfernen, aus den Kammern.
Man wäscht 1× durch Füllen der Kammern mit destilliertem
H2O.
Man klopft die Platte auf einem
Papiertuch aus, um die überschüssige Flüssigkeit
zu entfernen.
- 3. Man blockiert die Platte mit 5 % Milch in PBS.
150 μl pro Kammer
Man
inkubiert die Platte 30 Minuten unter Schütteln auf einem Mikrotiterplattenschüttler.
- 4. Man wäscht
die Platte 3× mit
deionisiertem Wasser und dann einmal mit TBST.
- 5. Man gibt 7 μg
A431 Zelllysat pro Kammer (EGFR Quelle) zu.
Man gibt PBS bis
zum Endvolumen von 100 μl
pro Kammer zu.
Man inkubiert 30 Minuten unter Schütteln.
- 6. Man wäscht
wie in Schritt 4 beschrieben.
- 7. An diesem Punkt werden die Arzneimittel oder die Extrakte
in die Kammern gegeben.
Man verdünnt die Arzneimittel/Extrakte
1:100 (soweit nicht anders angegeben) in TBS + 10 % DMSO in 96-Kammer-Polypropylenplatten.
Man
gibt 120 μl
TBS in die ELISA-Platte, die eingefangenes EGFR enthält.
Man
gibt 13,5 μl
verdünnte
Arzneimittel/Extrakte in die ELISA-Platte.
In die Kammern mit
den Kontrollen (Kammern, die kein Arzneimittel erhalten) gibt man
135 μl TBS
+ 1 % DMSO.
Man inkubiert die Platte 30 Minuten unter Schütteln.
- 8. Man gibt 15 μl
einer 0,03 mM ATP + 50 mM MnCl2-Phosphorylierungsmischung
direkt in alle Kammern, mit Ausnahme der Kammer mit der Negativkontrolle,
die kein ATP/MnCl2 erhält (siehe Diagramm).
(150 μl Endvolumen
in der Kammer mit einer Endkonzentration von 3 μM ATP/5 mM MnCl2 in
der Kammer)
Man inkubiert 5 Minuten unter starkem Schütteln.
*BEACHTE:
Es ist wichtig, dass ATP/MnCl2 den Rezeptor
nur für
5 Minuten phosphoryliert. Man gibt das ATP/MnCl2 am
besten mit einer Zwölfkanalpipette
jeweils Reihe für
Reihe zu, wobei 20 Sekunden zwischen jeder Reihe gelassen werden,
so dass die Reaktion mit EDTA exakt 5 Minuten später gestoppt wird (dies hängt von
der Anzahl der Platten ab, die in einem Batch phosphoryliert werden).
Man schüttelt
zwischen jeder Zugabe.
- 9. Um nach 5 Minuten die Reaktion zu stoppen, gibt man 16,5 μl an 200
mM EDTA, pH 8,0, für
eine Endkonzentration von 20 mM in der Kammer zu und schüttelt fortwährend zwischen
jeder Zugabe. Dies wird, wie weiter oben, durch Verwenden des gleichen
zeitlichen Verfahrensablaufes erreicht. Nachdem die letzte Reihe
EDTA erhalten hat, schüttelt
man die Platte für
eine zusätzliche
Minute.
- 10. Man wäscht
4× mit
deionisiertem Wasser und zweimal mit TBST.
- 11. Man gibt polyklonales Anti-Phosphotyrosinserum vom Hasen
zu.
Man verdünnt
1:3000 in TBST.
Man gibt 100 μl pro Kammer zu.
Man inkubiert
30–45
Minuten unter Schütteln.
- 12. Man wäscht
wie weiter oben in Schritt 4 beschrieben.
- 13. Man gibt BioSource Anti-Hasen, Peroxidase konjugierten Antikörper zu.
Man
verdünnt
1:2000 in TBST.
Man gibt 100 μl pro Kammer zu.
Man inkubiert
30 Minuten unter Schütteln.
- 14. Man wäscht
wie in Schritt 4 beschrieben.
- 15. Man gibt 100 μl
der ABTS/H2O2-Lösung in
die Kammer.
Man inkubiert 5 bis 10 Minuten unter Schütteln.
Man
entfernt die Blasen.
- 16. Falls erforderlich, stoppt man die Reaktion durch Zugabe
von 100 μl
0,2 M HCl pro Kammer.
- 17. Man liest das Assay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Lesegerät aus.
Testfilter:
410 nm
Referenzfilter: 630 nm
-
(b) Zellwachstumsassays
-
Die
Zellwachstumsassays, die in der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben werden, können durchgeführt werden,
um die Wirkung der beanspruchten Verbindungen auf das Zellwachstum
infolge der Interaktion der Verbindungen mit einer oder mehreren
RTK's zu messen.
-
(vi) Assay, das die Phosphorylierungsfunktion
von Raf misst.
-
Das
folgende Assay beschreibt die Menge der RAF-katalyisierten Phosphorylierung ihres
Zielproteins MEK als auch des Ziels von MEK, MAPK. Die RAF-Gensequenz
wird von Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400–1407 beschrieben
und ist in mehreren Gensequenzdatenbanken einfach zugänglich.
Die Konstruktion des Nukleinsäurevektors
und der Zelllinien, die für
diesen Abschnitt der Erfindung verwendet werden, werden vollständig von
Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8855–8859 beschrieben.
-
Materialien und Reagenzien
-
- 1. Sf9 (Spodoptera frugiperda)-Zellen; GIBCO-BRL,
Gaithersburg, MD.
- 2. RIPA-Puffer: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4, 137 mM NaCl, 10 % Glycerol,
1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 0,5 % Triton X-100;
- 3. Thioredoxin-MEK-Fusionsprotein (T-MEK): T-MEK
Expression
und die Reinigung durch Affinitätschromatographie
wurden entsprechend den Verfahren des Herstellers durchgeführt. Katalog
# K 350-01 und R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
- 4. His-MAPK (EPK 2); Mit His markiertes MAPK wurde in XL1 Blue-Zellen
exprimiert, die mit dem pUC18-Vektor, der für His-MAPK kodiert, transformiert wurden.
His-MAPK wurde durch Ni-Affinitätschromatographie
gereinigt. Kat# 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA.
- 5. Anti-Maus-IgG vom Schaf: Jackson Laboratories, West Grove,
Pa Katalog, # 515-006-008, Charge# 28563.
- 6. RAF-1 Proteinkinase spezifischer Antikörper: URP2653 von UBI.
- 7. Beschichtungspuffer: PBS, Phosphat gepufferte Salzlösung, GIBCO-BRL,
Gaithersburg, MD
- 8. Waschpuffer: TBST – 50
mM Tris/HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100
- 9. Blockierpuffer: TBST, 0,1 % Ethanolamin, pH 7,4
- 10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO
- 11. Kinasepuffer (KB): 20 mM HEPES/HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl,
0,1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 75 μM Natriumorthovanadat,
0,5 mM DTT und 10 mM MgCl2.
- 12. ATP Mischung: 100 mM MgCl2, 300 μM ATP, 10 μCi γ-33p ATP (Dupont-NEN)/ml.
- 13. Stopplösung:
1 % Phosphorsäure;
Fisher, Pittsburgh, PA.
- 14. Wallac Zellulose-Phosphatfiltermatten; Wallac, Turku, Finnland.
- 15. Filterwaschlösung:
1 % Phosphorsäure,
Fisher, Pittsburgh, PA.
- 16. Tomtec-Plattenernter, Wallac, Turku, Finnland.
- 17. Wallac Beta-Plattenlesegerät # 1205, Wallac, Turku, Finnland.
- 18. NUNC V-bödige
96-Kammer-Polypropylenplatten für
Verbindungen, Applied Scientific Katalog # AS-72092.
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Verfahrensablauf
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Alle
folgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, soweit
nichts anderes angegeben wird.
- 1. ELISA-Plattenbeschichtung:
ELISA-Kammern werden mit 100 μl
affinitätsgereinigtem
Anti-Maus-Anitserum vom Schaf (1 μg/100 μl Beschichtungspuffer) über Nacht
bei 4°C beschichtet.
Die ELISA-Platten können
für zwei
Wochen verwendet werden, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
- 2. Man dreht die Platte um und entfernt die Flüssigkeit.
Man gibt 100 μl
der Blockierlösung
zu und inkubiert für
30 min.
- 3. Man entfernt die Blockierlösung und wäscht viermal mit dem Waschpuffer.
Man klopft die Platte auf einem Papiertuch aus, um die überschüssige Flüssigkeit
zu entfernen.
- 4. Man gibt 1 μg
des gereinigten Sumo 22 in jede Kammer und inkubiert für 1 Stunde.
Man wäscht
wie in Schritt 3 beschrieben.
- 5. Man taut die Lysate von RAS/RAF-infizierten Sf9-Zellen auf
und verdünnt
sie mit TBST auf 10 μg/100 μl. Man gibt
10 μg des
verdünnten
Lysats in die Kammern und inkubiert für 1 Stunde. Man schüttelt die
Platte während
der Inkubation. Die Negativkontrollen erhalten kein Lysat. Die Lysate
von RAS/RAF-infizierten Sf9-Insektenzellen
werden vorbereitet, nachdem die Zellen mit dem rekombinaten Baculoviren
bei einer MOI von 5 für
jedes Virus infiziert worden sind, und 48 Stunden später geerntet.
Die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer lysiert.
Unlösliches
Material wird durch Zentrifugation (5 min bei 10.000 × g) entfernt.
Aliquots der Lysate werden in trockenem Eis/Ethanol gefroren und
bei –80°C bis zur Verwendung
gelagert.
- 6. Man entfernt ungebundenes Material und wäscht wie weiter oben (Schritt
3).
- 7. Man gibt 2 μg
T-MEK und 2 μg
His-MAPK pro Kammer zu und stellt das Volumen mit dem Kinasepuffer auf
40 μl ein.
- 8. Man verdünnt
die Verbindungen (Stammlösung
10 mg/ml DMSO) oder Extrakte 20-fach in TBST plus 1 % DMSO vor.
Man gibt 5 μl
der vorverdünnten
Verbindungen/Extrakte in die Kammern, wie in Schritt 6 beschrieben.
Man inkubiert für
20 min. Die Kontrollen erhalten kein Arzneimittel.
- 9. Man startet die Kinasereaktion durch Zugabe von 5 μl der ATP-Mischung;
man schüttelt
die Platten während
der Inkubation auf einem ELISA-Plattenschüttler.
- 10. Man stoppt die Kinasereaktion nach 60 min durch Zugabe von
30 μl Stopplösung in
jede Kammer.
- 11. Man ordnet die Phosphozellulosematte und die ELISA-Platte im Tomtec-Plattenernter
an. Man entnimmt und wäscht
den Filter mit der Filterwaschlösung
entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Man trocknet die
Filtermatten. Man versiegelt die Filtermatten und ordnet sie in
der Halterung an. Man setzt die Halterung in den radioaktiven Detektionsapparat
ein und quantifiziert den radioaktiven Phosphor auf den Filtermatten.
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Alternativ
dazu können
40 μl Aliquots
aus den einzelnen Kammern der Assayplatte auf die entsprechenden
Positionen auf der Phosphozellulosefiltermatte übertragen werden. Nach dem
Lufttrocknen der Filter, stellt man die Filter in einen Korb. Man
rüttelt
sanft am Korb, wechselt für
1 Stunde die Waschlösung
in 15 min Intervallen. Man trocknet die Filtermatten an der Luft.
Man versiegelt die Filtermatten und ordnet sie in einer Halterung
an, die für
das Messen des radioaktiven Phosphors in den Proben geeignet ist.
Man setzt die Halterung in eine Detektionsvorrichtung und quantifiziert
den radioaktiven Phosphor auf den Filtermatten.
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(c) Toxizität und Tiermodelle
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Die
Messung der Zelltoxizität
und die in vivo Tiermodelle werden in der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 96/40116, die am 19. Dezember 1996 veröffentlicht worden ist, von
Tang et al. beschrieben.
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(d) MET Biochemisches
Kinaseassay
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Ein
met biochemisches Kinaseassay kann im Allgemeinen, wie weiter oben
für andere
Kinasen beschrieben, durch Substituieren dieser oder einer anderen
Kinase für
met durchgeführt
werden. Insbesondere die ELISA-Platten werden mit Anti-Hasen-Fc- Antikörpern von
der Ziege, die verwendet werden, um kommerziell erhältliche
(von Santa Cruz Biotechnology) polyklonale Antikörper vom Hasen gegen die cytoplasmatische Domäne von menschlichem
MET einzufangen, beschichtet. Lysate werden aus 293T-Zellen, die
mit einem chimären
Rezeptor, der aus der extrazellulären Domäne des EGFr und der transmembranen
und cytoplasmatischen Domäne
des MET-Rezeptors zusammengesetzt ist, transiententransfiziert,
oder aus NCI-H441-Zellen (eine menschliche Lungenadenokarzinomzelllinie),
die hohe endogene MET-Mengen exprimiert, hergestellt. Die chimären Rezeptoren
oder MET, aus diesen Lysaten werden auf den mit Antikörpern beschichteten
Platten eingefangen. Nach dem Abwaschen von nicht gebrauchten Proteinen,
werden die Testverbindungen zugegeben und ein in vitro Kinaseassay
wird durch Zugabe eines geeigneten Kinasepuffers (der ATP, divalente
Metallionen, etc. enthält)
durchgeführt.
Der Einbau von Phosphat in die eingefangenen Rezeptoren wird mit
einem Anti-Phosphotyrosinantikörperkonjugat
mit einer Meerrettichperoxidase unter Verwendung von TMB als Substrat
für eine
kolorimetrische Detektion detektiert.
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Die
vorliegende Erfindung soll durch die exemplarisch dargestellten
Ausführungsformen,
die zur Illustration von einzelnen Aspekten der Erfindung dienen,
nicht im Schutzumfang begrenzt werden. In der Tat werden verschiedene
Modifikationen der Erfindung zusätzlich
zu denen, die hierin beschrieben werden, dem Fachmann ausgehend
von der vorhergehenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen
deutlich werden. Solche Modifikationen sollen innerhalb des Schutzumfangs
der beigefügten
Ansprüche
fallen.
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