DE60111358T2

DE60111358T2 - 3-(pyrolyllacton)-2-indolinon verbindungen zur verwendung als kinase-hemmstoffe

Info

Publication number: DE60111358T2
Application number: DE60111358T
Authority: DE
Inventors: Peng Cho Tang; Todd A. Miller; Xiaoyuan Li; Ruofei Zhang; Jingrong Cui; Ping Huang; Chung Chen Wei
Original assignee: Sugen LLC
Current assignee: Sugen LLC
Priority date: 2000-02-28
Filing date: 2001-02-28
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2021-03-01
Also published as: US20020042427A1; WO2001064681A3; EP1259514B1; ATE297395T1; CA2400649A1; AU2001241798A1; WO2001064681A2; JP2003525296A; EP1259514B9; DE60111358D1; EP1259514A2; US6465507B2; ES2243461T3

Description

QUERVERWEIS
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität gemäß 35 U.S.C. 119(e) der provisorischen U.S. Anmeldung mit der Seriennummer 60/185,536 die am 28. Februar 2000 eingereicht wurde.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft bestimmte Indolinonverbindungen, Verfahren zu ihrer Synthese und die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit, die durch eine Proteinkinase vermittelt wird.
STAND DER TECHNIK
Die folgende Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung dient dem Verständnis der Erfindung, ist aber nicht als Beschreibung oder Bestandteil des Stands der Technik vorgesehen.
Die zelluläre Signalübertragung ist ein grundlegender Mechanismus, bei dem extrazelluläre Stimuli in das Innere von Zellen weitergegeben werden und im Anschluss verschiedene zelluläre Prozesse regulieren. Einer der biochemischen Schlüsselmechanismen der Signalübertragung umfasst die reversible Phosphorylierung von Proteinen. Die Phosphorylierung von Polypeptiden reguliert die Aktivität reifer Proteine durch Veränderung ihrer Struktur und Funktion. Das Phosphat sitzt meistens an der Hydroxylgruppe (-OH) von Serin-, Threonin- oder Tyrosinaminosäuren in Proteinen.
Enzyme, welche die Phosphorylierung zellulärer Effektoren vermitteln, fallen generell in zwei Klassen. Die erste Klasse besteht aus Proteinkinasen, die eine Phosphatgruppe von Adenosintriphosphat auf Proteinsubstrate transferieren. Die zweite Klasse besteht aus Proteinphosphatasen, die Phosphatgruppen von Phosphorylproteinsubstraten hydrolisieren. Die gegensätzlichen Funktionen von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen balancieren und regulieren den Signalfluss in Signalübertragungsprozessen.
Proteinkinasen und Proteinphosphatasen werden im Allgemeinen in zwei Gruppen eingeteilt – Proteine des Rezeptor- und des Nicht-Rezeptortyps. Die meisten Proteinphosphatasen des Rezeptortyps enthalten zwei konservierte katalytische Domänen, von denen jede ein Segment aus 240 Aminosäureresten umfasst. Saito et al., 1991, Cell Growth and Diff. 2: 59-65. Rezeptorproteinphosphatasen können auf Grundlage ihrer Aminosäuresequenzdiversität ihrer extrazellulären Domänen weiter unterteilt werden. Saito et al., supra; Krueger et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7417-7421.
Proteinkinasen und Proteinphosphatasen werden auf Basis der Aminosäuren, an denen sie angreifen, weiterhin typischerweise in drei Klassen eingeteilt. Einige katalysieren die Addition oder Hydrolyse von Phosphat nur an Serin oder Threonin, einige katalysieren die Addition oder Hydrolyse von Phosphat nur an Tyrosin, und einige katalysieren die Addition oder Hydrolyse von Phosphat an Serin, Threonin und Tyrosin.
Kinasen können die katalytische Aktivität anderer Proteinkinasen regulieren, welche an der Zellproliferation beteiligt sind. Proteinkinasen mit nicht entsprechender Aktivität sind weiterhin an einigen Krebsarten beiteilig. Abnormal erhöhte Niveaus an Zellproliferation sind mit Rezeptor- und Nicht-Repzeptorproteinkinasen mit unregulierter Aktivität assoziiert.
Zusätzlich zu ihrer Rolle in der zellulären Proliferation wird angenommen, dass Proteinkinasen auch an zellulären Differenzierungsprozessen beteiligt sind. Zelldifferenzierung erfolgt in einigen Zellen nach Stimulationen mit Nervenwachstumsfaktor (Nerve Growth Factor, NGF) oder epidermalem Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor, EGF). Zelluläre Differenzierung ist charakterisiert durch schnelle Membranumformung (membrans ruffling), Zellabflachung und Erhöhung der Zelladhäsion. Chao, 1992, Cell 68: 995-997.
Im Bemühen, neue Behandlungsformen für Krebs und andere Erkrankungen zu entdecken, haben biomedizinische Forscher und Chemiker Moleküle konzipiert, synthetisiert und getestet, welche die Funktion von Proteinkinasen hemmen. Einige kleine organische Moleküle bilden eine Klasse von Verbindungen, welche die Funktion von Proteinkinasen modulieren. Beispiele für Moleküle, von denen eine Hemmung der Funktion von Proteinkinasen berichtet wurde, sind bis-monozyklische, bizyklische oder heterozyklische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylen-Azaindolderivate (PCT WO 94/14808), 1-Cyclopropyl-4-pyridyl-quinolone (U.S. Patent Nr. 5,330,992), Styrylverbindungen (U.S. Patent Nr. 5,217,999 von Levitzki et al. mit dem Titel "Styryl Compounds which Inhibit EGF Receptor Protein Tyrosin Kinase"), styryl-substituierte Pyridylverbindungen (U.S. Patent Nr. 5,302,606), bestimmte Quinazolinderivate (EP Anmeldung Nr. 0 566 266 A1), Seleoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), trizyklische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495).
Die Verbindungen, die Zellmembranen überwinden (traverse) können und resistent gegenüber Säurehydrolyse sind, sind potentiell vorteilhafte Therapeutika, da sie nach oraler Verabreichung an Patienten in hohem Maße bioverfügbar werden können. Viele dieser Proteinkinaseinhibitoren hemmen jedoch die Funktion von Proteinkinasen nur schwach. Zusätzlich hemmen viele eine Reihe von Proteinkinasen und werden daher als Therapeutika für Krankheiten multiple Nebenwirkungen verursachen.
Trotz des signifikanten Fortschritts, der bei der Entwicklung von Verbindungen zur Behandlung von Krebs gemacht wurde, bleibt in diesem Bereich (in the art) ein Bedarf bestehen, spezielle Strukturen und Substitutionsmuster zu identifizieren, welche Verbindungen bilden, die zur Modulation der Funktion spezieller Proteinkinasen in der Lage sind. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte Indolinonverbindungen und die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, die durch eine Proteinkinase vermittelt wird.
Demzufolge stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt eine Verbindung gemäß Formel I bereit:
wobei:

(a) jedes R₁ unabhängig und optional aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: (i) Wasserstoff; (ii) gesättigtem Alkyl, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst; (iii) einem mono- oder bizyklischen aromatischen C₆-C₁₂ Ring oder einem heteroaromatischen Ring, der fünf bis zehn Ringatome enthält, wobei ein, zwei oder drei Ringatome aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel besteht, und wobei die übrigen Ringatome Kohlenstoff sind, der optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, C₁-C₄ Alkoxy, Halogen, Trihalomethyl, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; (iv) einem Alkohol der Formel -(X₁)_n1-OH oder einem Alkoxyalkyl der Formel -(X₂)_n2-O-X₃, wobei X₁, X₂ und X₃ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem Alkyl, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, und einem sechsgliedrigen aromatischen Ring besteht, und wobei n1 und n2 unabhängig 0 oder 1 sind; (v) einem Halogen; (vi) einer Carboxylsäure der Formel -(X₄)_n4-COOH oder einem Ester der Formel -(X₅)_n5-COO-X₆, wobei X₄, X₅ und X₆ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Alkyl, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, besteht, und wobei n4 und n5 unabhängig 0 oder 1 sind; (vii) einem Amid der Formel -(X₇)_n7-NHCOX₈ oder der Formel -(X₉)_n9-CONX₁₀X₁₁, wobei X₇ und X₉ jeweils unabhängig ein Alkyl sind, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, und wobei n7 und n9 unabhängig 0 oder 1 sind, und wobei X₈, X₁₀ und X₁₁ jeweils unabhängig Wasserstoff oder ein Alkyl sind, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, oder wobei X₁₀ und X₁₁ zusammengenommen einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring oder einen fusionierten bizyklischen Ring bilden; (viii) einem Sulfonamid der Formel -(X₁₂)_n12-SO₂NX₁₃X₁₄ wobei X₁₂ ein Alkyl ist, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, und wobei n12 0 oder 1 ist, und wobei X₁₃ und X₁₄ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen, heteroaromatischen, aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring besteht, wobei das Alkyl und jeder Ring optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sind, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, Hydroxy, Halogen, Trihalomethyl, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; oder wobei X₁₃ und X₁₄ zusammengenommen einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring oder einen fusionierten bizyklischen Ring bilden, der optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, Halogen, Trihalomethyl, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; (ix) einem Amin der Formel -(X₁₆)_n16-NX₁₇X₁₈, wobei X₁₆ ein Alkyl ist, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, und wobei n16 0 oder 1 ist, und wobei X₁₇ und X₁₈ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen, heteroaromatischen oder aliphatischen Ring besteht, wobei jeder Ring optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, Halogen, Trihalomethyl, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; (x) zwei benachbarten R₁ Gruppen, die zusammen mit zwei benachbarten A, B, D oder E einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring bilden;
(b) R₂, R₃ und R₄ Wasserstoff sind;
(c) R₅ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff und gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl besteht;
(d) A, B, D und E jeweils unabhängig Kohlenstoff oder Stickstoff sind, vorausgesetzt dass keines, eines oder zwei von A, B, D und E Stickstoff ist, und vorausgesetzt dass kein R₁ an A, B, D oder E angeheftet ist, wenn ein beliebiges von A, B, D oder E Stickstoff ist;
(e) G Stickstoff oder Sauerstoff ist, vorausgesetzt dass R₅ fehlt, wenn G Sauerstoff ist;
(f) m 2, 3 oder 4 ist; und
(g) q 1 oder 2 ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

In einem zweiten Aspekt betrifft diese Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine oder mehr Verbindungen gemäß Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.
In einem dritten Aspekt betrifft diese Erfindung die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit, die durch eine Proteinkinase vermittelt wird. Solche Krankheiten umfassen beispielsweise und nicht einschränkend Krebs, Diabetes, hepatische Cirrhose, kardivaskuläre Krankheiten, wie zum Beispiel Arteriosklerose, Angiogenese, immunologische Krankheiten, wie zum Beispiel Autoimmunkrankheiten, und Nierenerkrankungen. Obwohl nicht auf eine bestimmte Proteinkinase eingeschränkt, nimmt man an, dass die Verbindungen der Erfindung selektiv für die Proteinkinase CDK2 gegenüber anderen Kinasen sind, wie zum Beispiel FLK, FGFR, EGFR, PDGFR und SRC.
In einem vierten Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Modulation der katalytischen Aktivität von PKs, insbesondere von Rezeptortyrosinkinasen (RTKs), Nicht-Rezeptorproteintyrosinkinasen (CTKs) und Serin/Threonin-Proteinkinasen (STKs), unter Verwendung einer Verbindung dieser Erfindung, welches in vitro durchgeführt werden kann. Insbesondere wird die Rezeptorproteinkinase, deren katalytische Aktivität durch eine Verbindung dieser Erfindung moduliert werden, aus der Gruppe ausgewählt, die aus EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R und FGFR-4R besteht. Die zelluläre Tyrosinkinase, deren katalytische Aktivität durch eine Verbindung dieser Erfindung moduliert wird, wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk besteht. Die Serin/Threonin-Proteinkinase, deren katalytische Aktivität durch eine Verbindung dieser Erfindung moduliert wird, wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus CDK2 und Raf besteht.
In einem fünften Aspekt betrifft diese Erfindung die Verwendung einer Verbindung gemäß Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments, das bei der Behandlung einer Krankheit zeckdienlich ist, welche durch eine abnormale Proteinkinase-Aktivität vermittelt wird.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Die folgenden Begriffe, die in der Patentbeschreibung und in den Ansprüchen verwendet werden, haben die unten diskutierten Bedeutungen, außer es ist etwas anderes angegeben:
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Alkyl" eine aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe. Die Alkylgruppe kann eine "gesättigte Alkylgruppe" sein, was bedeutet, dass sie keine Alken- oder Alkyngruppen enthält. Die Alkylgruppe kann ebenfalls eine "ungesättigte Alkylgruppe" sein, was bedeutet, dass sie mindestens eine Alken- oder Alkyngruppe enthält. Eine "Alkengruppe" bezeichnet eine Gruppe, die aus mindestens zwei Kohlenstoffatomen und mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung besteht, und eine "Alkyngruppe" bezeichnet eine Gruppe, die aus mindestens zwei Kohlenstoffatomen und mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung besteht. Die Alkylgruppe, ob gesättigt oder ungesättigt, kann verzweigt, nicht-verzweigt oder zyklisch sein.
Die Alkylgruppe weist 1 bis 10 Kohlenstoffatome auf (wann immer hier vorkommend, bezieht sich ein nummerischer Bereich, wie zum Beispiel "eins bis zehn", auf jede ganze Zahl innerhalb des angegebenen Bereichs; zum Beispiel bedeutet "ein bis zehn Kohlenstoffatome", dass die Alkylgruppe aus einem Kohlenstoffatom, zwei Kohlenstoffatomen, drei Kohlenstoffatomen etc. bestehen kann bis zu und einschließlich 10 Kohlenstoffatomen). Am meisten bevorzugt wird ein "Niederalkyl" (lower alkyl), das ein bis vier Kohlenstoffatome aufweist, zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert-Butyl oder iso-Butyl. Die Alkylgruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn sie substituiert ist, ist (sind) die Substituentengruppe (Substituentengruppen) vorzugsweise eine oder mehr Gruppen, die individuell und unabhängig ausgewählt werden aus Hydroxy, Alkoxy, Mercapto, Alkylthio, Cyano, Halo, Carbonyl, Nitro und Amino.
Der Begriff "aromatisch" bezeichnet eine mono- oder bizyklische aromatische Gruppe aus 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, die mindestens einen Ring aufweist, der ein konjugiertes Pi-Elektronensystem besitzt, zum Beispiel Phenyl-, Naphthyl- oder Anthracengruppen.
Der Begriff "heteroaromatisch" bezeichnet eine mono- oder bizyklische aromatische Gruppe aus fünf bis zehn Ringatomen, wobei ein, zwei oder drei Ringatome aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel besteht, und wobei die verbleibenden Ringatome Kohlenstoff sind, zum Beispiel Pyridin, Pyrrol, Thiophen, Indol, Imidadzol, Quinolin, Isoquinolin, Pyrazin, Furan, Pyrimidin, Oxazol, Triazol, Pyrazol und dergleichen.
Der Begriff "aliphatischer Ring" bezeichnet eine gesättigte zyklische Gruppe aus drei bis zehn Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclohexan und dergleichen.
Der Begriff "heteroaliphatischer Ring" bezeichnet eine gesättigte zyklische Gruppe aus fünf bis zehn Ringatomen, wobei ein, zwei, oder drei Ringatome aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Stickstoff, Schwefel, Sulfoxid, Sulfon, der -SO₂O-Gruppe oder Sauerstoff besteht, und wobei die verbliebenen Ringatome Kohlenstoff sind, zum Beispiel Tetrahydropyran, Piperidin, Pyrrolidin, Piperazin, Morpholin, und dergleichen.
Der Begriff "Amin" bezeichnet eine chemische Gruppe der Formel -NR_aR_b, wobei R_a und R_b unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, einem gesättigten oder ungesättigten Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, wobei der Ring optional mit einem, zwei oder drei Substituenden substituiert ist, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Alkyl-, Halogen-, Trihalomethyl-, Carboxylat-, Nitro- und Estergruppen besteht.
Der Begriff "Halogen" bezeichnet ein Atom, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Fluor, Chlor, Brom und Iod besteht.
Der Begriff "Trihalometyl" bezeichnet die -CX₃ Gruppe, wobei X ein Halogen ist, zum Beispiel Trifluormethyl.
Der Begriff "Carboxylsäure" oder "Carboxylat" bezeichnet eine chemische Gruppe mit der Formel -(R)_n-COOH, wobei R aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem gesättigten oder ungesättigten Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist.
Der Begriff "Ester" bezeichnet eine chemische Gruppe mit der Formel -(R)_n-COOR', wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem gesättigten oder ungesättigten Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist.
Der Begriff "Aldehyd" bezeichnet eine chemische Gruppe mit der Formel -(R)_n-COH, wobei R aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem gesättigten oder ungesättigten Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist.
Der Begriff "Alkoxy" bezeichnet eine Gruppe -OR_c, wobei R_c ein unsubstituiertes Niederalkyl ist, zum Beispiel Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy und dergleichen.
Der Begriff "fusionierter bizyklischer Ring" bezeichnet einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen heteroaliphatischen Ring, der mit einem aromatischen oder heteroaromatischen Ring fusioniert ist. Ein nicht einschränkendes Beispiel eines fusionierten bizyklischen Rings ist:
"Optional" bedeutet, dass das anschließend beschriebene Ereignis oder der Umstand nicht notwendigerweise erfolgen muss, und dass die Beschreibung Beispiele umfasst, bei denen das Ereignis oder der Umstand eintritt, und Bespiele, bei denen er nicht eintritt. Zum Beispiel bedeutet "Alkylgruppe optional substituiert mit Halogen", dass das Halogen vorliegen kann, jedoch nicht vorliegen muss, und dass die Beschreibung Situationen beinhaltet, unter den die Alkylgruppe mit einer Halogengruppe substituiert ist, und Situationen, unter denen die Alkylgruppe nicht mit der Halogengruppe substituiert ist.
Verbindungen, welche die gleiche molekulare Formel aufweisen, die sich jedoch in der Art oder Sequenz der Bindung ihrer Atome oder in der räumlichen Anordnung ihrer Atome unterscheiden, werden als "Isomere" bezeichnet. Isomere, die sich in der räumlichen Anordnung ihrer Atome unterscheiden, werden als "Stereoisomere" bezeichnet. Stereoisomere, die keine Spiegelbilder voneinander darstellen, werden als "Diastereomere" bezeichnet, und diejenigen die nichtüberlagerbare Spiegelbilder voneinander darstellen, werden als "Enantiomere" bezeichnet. Wenn eine Verbindung ein asymmetrisches Zentrum aufweist, wenn sie zum Beispiel an vier verschiedene Gruppen gebunden ist, ist ein paar an Enantiomeren möglich. Ein Enantiomer kann durch die absolute Konfiguration seines asymmetrischen Zentrums charakterisiert werden und wird durch die R- und S-Sequenzierregeln von Cahn und Prelog beschrieben oder durch die Art, in der das Molekül die Ebene des polarisierten Lichts rotiert, und wird als rechtsdrehend oder linksdrehend bezeichnet (i.e. als (+)- bzw. als (-)-Isomer). Eine chirale Verbindung kann als jedes der individuellen Enantiomere oder als eine Mischung davon vorliegen. Ein Gemisch, das gleiche Anteile der Enantiomere enthält, wird als "racemisches" Gemisch bezeichnet.
Die Verbindungen dieser Erfindung können ein oder mehr asymmetrische Zentren besitzen. Derartige Verbindungen können daher als individuelle (R)- oder (S)-Stereoismere oder als Mischungen davon erzeugt werden. Falls zum Beispiel der R₁ Substituent in einer Verbindung gemäß Formel (I) 2-Methoxyethyl ist, dann ist das Kohlenstoffatom, an das die Methoxygruppe angeheftet ist, ein asymmetrisches Zentrum, und daher kann die Verbindung gemäß Forme (I) als (R)- oder (S)- Stereoisomer vorliegen. Sofern nicht anders angegeben, soll die Beschreibung oder Nomenklatur einer bestimmten Verbindung in der Patentbeschreibung und den Ansprüchen beide individuellen Enantiomere und Mischungen davon, racemisch oder andere, umfassen. Die Verfahren zur Bestimmung der Stereochemie und zur Trennung von Stereoisomeren sind im Stand der Technik bekannt (siehe die Diskussion in Kapitel 4 von "Advanced Origanic Chemestry", 4. Auflage, J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).
Die Verbindungen gemäß Formel (I) können die Phänomene des Tautomerismus und des strukturellen Isomerismus zeigen. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Verbindungen eine E- oder eine Z-Konfiguration bezüglich (about) der Doppelbindung annehmen, welche die 2-Indolinongruppe mit der Pyrrolgruppe verbindet, oder sie können eine Mischung aus E und Z darstellen. Diese Erfindung umfasst jede tautomere oder strukturell isomere Form und Mischungen davon, welche die Fähigkeit besitzen, die RTK-, CTK- und/oder STK-Aktivität zu modulieren, und ist nicht auf eine beliebige tautomere oder strukturell isomere Form beschränkt.
Eine "pharmazeutische Zusammensetzung" bezeichnet ein Gemisch aus einer oder mehr der hier beschriebenen Verbindungen oder physiologisch/pharmazeutisch annehmbarer Salze oder Vorstufen (prodrugs) davon mit anderen chemischen Komponenten, wie zum Beispiel physiologisch/pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen und Exzipienten.
Der Zweck einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist die erleichterte Verabreichung einer Verbindung an einen Organismus.
Wie hier verwendet, bezeichnet ein "pharmazeutisch annehmbarer Trägerstoff" einen Trägerstoff oder ein Verdünnungsmittel, das keine signifikante Irritation gegenüber einem Organismus hervorruft, und das die biologische Aktivität und die Eigenschaften der verabreichten Verbindung nicht aufhebt.
Ein "pharmazeutisch annehmbarer Exipent" bezeichnet eine inerte Substanz, die zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegeben wird, um die Verabreichung einer Verbindung weiter zu erleichtern. Nicht einschränkende Beispiele für Exipienten umfassen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker und Typen von Stärke, Cellulosederivate, Gelatine, Pflanzenöle und Polyethylenglykole.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff "pharmazeutisch annehmbares Salz" diejenigen Salze, welche die biologische Wirksamkeit und die Eigenschaften der Ausgangsverbindung (parent compound) bewahren. Solche Salze umfassen:

(1) ein Salz durch Säurezugabe (acid addition salt), das durch Reaktion der freien Base der Ausgangsverbindung mit anorganischen Säuren erhalten wird, wie zum Beispiel Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Perchlorsäure und dergleichen, oder mit organischen Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, Oxalsäure, (D)- oder (L)-Äpfelsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, oder Malonsäure und dergleichen, vorzugsweise mit Salzsäure oder (L)-Äpfelsäure, wie zum Beispiel dem L-Äpfelsäuresalz von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-carboxylsäure(2-diethylaminoethyl)amid; oder
(2) Salze, die gebildet werden, wenn ein saures Proton, das in der Ausgangsverbindung vorliegt, entweder durch ein Metallion ersetzt wird, zum Beispiel ein Alkalimetallion, ein Erdalkalimetallion oder ein Aluminiumion, oder mit einer organischen Base koordiniert, wie zum Beispiel Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Trimethamin, N-Methylglucamin und dergleichen.

"PK" bezeichnet Rezeptorproteintyrosinkinasen (RTKs) Nicht-Rezeptor- oder "zelluläre" Tyrosinkinasen (CTKs) und Serin/Treonin-Kinasen (STKs).
"Modulation" oder "modulieren" bezeichnet die Veränderung der katalytischen Aktivität von Proteinkinasen, insbesondere der Kinase CDK2. Im speziellen bezeichnet "modulieren" die Aktivierung der katalytischen Aktivität, vorzugsweise die Aktivierung oder Inhibition der katalytischen Aktivität von Proteinkinasen, insbesondere der Kinase CDK2, in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung oder des Salzes, dem die Proteinkinasen, insbesondere die Kinase CDK2, ausgesetzt sind, oder noch bevorzugter die Inhibition der katalytischen Aktivität von Proteinkinasen, insbesondere der Kinase CDK2.
"Therapeutisch wirksame Menge" bezeichnet die Menge der verabreichten Verbindung, die in einem gewissen Ausmaß eines oder mehr der Symptome der zu behandelnden Erkrankung lindert. In Bezug auf die Behandlung von Krebs bezeichnet eine therapeutisch wirksame Menge die Menge, welche die Wirkung aufweist:

(1) Reduktion der Größe des Tumors;
(2) Inibition (d.h. Verlangsamung in einem gewissen Ausmaß, vorzugsweise Stoppen) der Tumormetastasenbildung;
(3) Inibition in einem gewissen Ausmaß (d. h. Verlangsamung in einem gewissen Ausmaß, vorzugsweise Stoppen) des Tumorwachstums; und/oder
(4) Linderung in einem gewissen Ausmaß (oder vorzugsweise Elimination) von einem oder mehr Symptomen, die mit Krebs assoziiert sind.

Der Begriff "Funktion" bezeichnet die zelluläre Rolle einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefamilie umfasst Mitglieder, die zahlreiche Schritte in Signalkaskaden regulieren, einschließlich von Kaskaden, die Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Genexpression, Muskelkontraktion, Glucosemetabolismus, zelluläre Proteinsynthese und die Regulation des Zellzyklus kontrollieren.
Im Zusammenhang mit der Erfindung definiert der Begriff "katalytische Aktivität" die Rate, mit der eine Proteinkinase ein Substrat phosphoryliert. Die katalytische Aktivität kann zum Beispiel gemessen werden durch Bestimmen der Menge eines Substrats, das in ein Produkt umgesetzt wird, als Funktion der Zeit. Die Phosphorylierung eines Substrats erfolgt am aktiven Zentrum einer Proteinkinase. Das aktive Zentrum ist normalerweise eine Spalte (cavity), in der das Substrat an die Proteinkinase bindet und phosphoryliert wird.
Der Begriff "Substrat", wie hier verwendet, bezeichnet ein Molekül, das durch eine Proteinkinase phorphoryliert wird. Das Substrat ist vorzugsweise ein Peptid und noch bevorzugter ein Protein.
Der Begriff "aktiviert" bezeichnet die Erhöhung der zellulären Funktion einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefunktion ist vorzugsweise die Interaktion mit einem natürlichen Bindungspartner, und am meisten bevorzugt die katalytische Aktivität.
Der Begriff "inhibiert" bezeichnet die Verminderung der zellulären Funktion einer Proteinkinase. Die Proteinkinasefuntion ist vorzugsweise die Interaktion mit einem natürlichen Bindungspartner, und am meisten bevorzugt die katalytische Aktivität.
Der Begriff "moduliert" bezeichnet die Veränderung der Funktion einer Proteinkinase durch Erhöhen oder Vermindern der Wahrscheinlichkeit, dass ein Komplex zwischen einer Proteinkinase und einem Bindungspartner gebildet wird. Ein Modulator erhöht vorzugsweise die Wahrscheinlichkeit, dass solch ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem Bindungspartner gebildet wird, noch bevorzugter erhöht oder vermindert er in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung, der die Proteinkinase ausgesetzt ist, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem Bindungspartner gebildet wird, und am meisten bevorzugt vermindert er die Wahrscheinlichkeit, dass ein Komplex zwischen der Proteinkinase und dem Bindungspartner gebildet wird. Ein Modulator aktiviert vorzugsweise die katalytische Aktivität einer Proteinkinase, noch bevorzugter aktiviert oder inhibiert er die katalytische Aktivität einer Proteinkinase in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung, der die Proteinkinase ausgesetzt ist, und am meisten bevorzugt hemmt er die katalytische Aktivität einer Proteinkinase.
Der Begriff "Komplex" bezeichnet eine Zusammensetzung (assembly) aus mindestens zwei Molekühlen, die aneinander gebunden sind. Signalübertragungskomplexe enthalten oft mindestens zwei Proteinmoleküle, die aneinander gebunden sind.
Der Begriff "Bindungspartner" bezeichnet eine Verbindung, die in Zellen an eine Proteinkinase bildet. Bindungspartner können eine Rolle bei der Weiterleitung eines Signals in einem Proteinkinase-Signalübertragungsprozess spielen. Eine Veränderung in der Interaktion zwischen einer Proteinkinase und einem Bindungspartner kann sich selbst als eine erhöhte oder verminderte Wahrscheinlichkeit manifestieren, dass die Interaktion gebildet wird, oder als eine erhöhte oder verminderte Konzentration des Komplexes aus Proteinkinase und Bindungspartner. Ein Bindungspartner kann ein natürlicher Bindungspartner sein, wobei der Bindungspartner einer ist, der die Proteinkinase während einer normalen zellulären Funktion bindet. Andere Moleküle, welche die Proteinkinase binden, können jedoch ebenfalls Bindungspartner der Proteinkinase sein.
Ein Proteinkinase-Bindungspartner kann an die intrazelluläre Region einer Proteinkinase mit hoher Affinität binden. Eine hohe Affinität bedeutet eine Gleichgewichtsbindungskonstante in der Größenordnung von 10^–6 M oder weniger. Zusätzlich kann ein natürlicher Bindungspartner ebenfalls transient mit der intrazellulären Region einer Proteinkinase interagieren und diese chemisch modifizieren. Natürliche Bindungspartner einer Proteinkinase werden aus einer Gruppe auswählt, die umfasst, aber nicht beschränkt ist auf SRC Homologie 2(SH2) oder 3(SH3) Domänen, andere Phosphoryltyrosin-Bindedomänen (PTB), Guaninnukleotid-Austauschfaktoren, Proteinphosphatasen und anderen Proteinkinasen besteht. Verfahren zur Bestimmung von Veränderungen in den Interaktionen zwischen Proteinkinasen und ihren natürlichen Bindungspartnern sind im Stand der Technik verfügbar.
Der Begriff "inkontaktbringen", wie hier verwendet, bezeichnet das Mischen einer Lösung, die eine Verbindung gemäß der Erfindung umfasst, mit einem Flüssigmedium, das die Zellen des Verfahrens enthält. Die Lösung, welche die Verbindung umfasst, kann ferner eine weitere Komponente umfassen, wie zum Beispiel die Dimethylsulfoxid (DMSO), das die Aufnahme der Verbindung oder der Verbindungen in die Zellen des Verfahrens erleichtert. Die Lösung, welche die Verbindung gemäß der Erfindung umfasst, kann zum Medium, das die Zellen enthält, durch Verwenden einer Abgabevorrichtung gegeben werden, wie zum Beispiel einer auf einer Pipette basierenden Vorrichtung oder einer auf einer Spritze basierenden Vorrichtung.
Die Verbindungen der Erfindung modulieren vorzugsweise die Aktivität der Proteinkinase in vitro. Diese Verbindungen zeigen vorzugsweise positive Ergebnisse in einem oder mehr in vitro Assays für einen Aktivität, welche der Behandlung der in Frage stehenden Krankheit oder Fehlfunktion entspricht (wie zum Beispiel die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Assays).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifikation von Verbindungen, welche die Funktion der Proteinkinase modulieren, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen der Zellen, welche die Proteinkinase exprimieren, mit der Verbindung; und (b) ÜBerwachen einer Wirkung auf die Zellen. Die Wirkung auf die Zellen ist vorzugsweise eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung im Zellphänotyp, bevorzugter ist es eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung in der Zellproliferation, noch bevorzugter ist es eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung in der katalytischen Aktivität der Proteinkinase und am meisten bevorzugt ist es eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung in der Interaktion zwischen der Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner, wie hier beschrieben.
Der Begriff "Überwachen" bezeichnet die Beobachtung der Wirkung der Zugabe einer Verbindung zu den Zellen des Verfahrens. Die Wirkung kann in einer Veränderung des Zellphänotyps, der Zellproliferation, der katalytischen Aktivität der Proteinkinase oder in der Interaktion zwischen einer Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner manifestiert werden.
Der Begriff "Wirkung" beschreibt eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung im Zellphänotyp oder der Zellproliferation. "Wirkung" kann weiterhin eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung in der katalytischen Aktivität der Proteinkinase beschreiben. "Wirkung" kann ferner eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung in einer Interaktion zwischen der Proteinkinase und einem natürlichen Bindungspartner beschreiben.
Der Begriff "Zellphänotyp" bezeichnet die äußere Erscheinung einer Zelle oder eines Gewebes oder die Funktion der Zelle oder eines Gewebes. Beispiele für Zellphänotypen sind die Zellgröße (Reduktion oder Vergrößerung), Zellproliferation (erhöhte oder verminderte Zellzahlen), Zelldifferenzierung (eine Veränderung oder das Fehlen einer Veränderung in der Zellform), des Zellüberleben, Apoptose (Zelltod) oder die Verwendung eines metabolischen Nährstoffs (z.B. Glukoseaufnahme). Veränderungen oder das Fehlen von Veränderungen im Zellphänotyp können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren einfach gemessen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation der Verbindungen der Erfindung, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Lysieren der Zellen, um ein Zelllysat zu erzeugen, das die Proteinkinase umfasst; (b) Adsorbieren der Proteinkinase an einen Antikörper; (c) Inkubieren der adsorbierten Proteinkinase mit einem Substrat oder mit Substraten; und (d) Adsorbieren des Substrats oder der Substrate an einen festen Träger oder Antikörper.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Schritt des Überwachens der Wirkung auf die Zellen die Messung der Phosphatkonzentration des Substrats oder der Substrate.
Der Begriff "Antikörper" bezeichnet einen Antikörper (z.B. einen monoklonalen oder einen polyklonalen Antikörper) oder ein Antikörperfragment, das spezifische Bindungsaffinität für die Proteinkinase oder ihr Fragment aufweist.
Mit "spezifischer Bindungsaffinität" ist gemeint, dass der Antikörper Zielpolypeptide (Proteinkinase-Polypeptide) unter spezifizierten Bedingungen mit höherer Affinität bindet als andere Polypeptide. Antikörper mit spezifischer Bindungsaffinität für eine Proteinkinase können in Verfahren zur Detektion der Gegenwart und/oder Menge einer Proteinkinase in einer Probe verwendet werden, indem die Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen derart in Kontakt gebracht wird, dass ein Immunkomplex gebildet wird und die Gegenwart und/oder Menge des an die Proteinkinase konjugierten Antikörpers gemessen wird.
Diagnostische Kits zur Durchführung derartiger Verfahren können so konzipiert werden, dass sie ein erstes Behältnis umfassen, welches den Antikörper enthält, und ein zweites Behältnis, welches ein Konjugat eines Bindungspartners des Antikörpers und eine Markierung enthält, wie zum Beispiel ein Radioisotop. Der diagnostische Kit kann ferner die Mitteilung einer von der FDA zugelassenen Verwendung enthalten sowie Instruktionen dafür.
Der Begriff "polyklonal" bezeichnet Antikörper, die heterogene Populationen an Antikörpermolekülen darstellen, die aus den Seren von Tieren stammen, welche mit einem Antigen oder einem funktionellen antigenen Derivat davon immunisiert wurden.
Für die Herstellung polyklonaler Antikörper können verschiedene Wirtstiere mittels Injektion mit dem Antigen immunisiert werden. Abhängig von der Wirtsspezies können verschiedene Adjuvantien verwendet werden, um die immunologische Antwort zu erhöhen.
"Monoklonale Antikörper" sind im wesentlichen homogene Populationen von Antikörpern gegenüber einem bestimmten Antigen. Sie können durch ein beliebiges Verfahren erhalten werden, das für die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorgesehen ist. Monoklonale Antikörper können mit Hilfe von Fachleuten bekannten Verfahren erhalten werden. Siehe z.B. Kohler et al., Nature 256: 495-497 sowie U.S. Patent Nr. 4,376,110.
Der Begriff "Antikörperfragment" bezeichnet einen Teil eines Antikörpers, oft die hypervariable Region und Teile der umgebenden schweren und leichten Ketten, das spezifische Bindungsaffinität für ein bestimmtes Molekül zeigt. Eine hypervariable Region ist ein Teil eines Antikörpers, der physikalisch an das Zielpolypeptid bindet.
Der Begriff "Abweichung" (aberration) in Verbindung mit einem Signalübertragunsprozess bezeichnet eine Proteinkinase, die in einem Organismus über- oder unterexprimiert ist, die mutiert ist, sodass ihre katalytische Aktivität niedriger oder höher ist als die Kinaseaktivität des Wildtyp-Proteins, die mutiert ist, sodass sie nicht länger mit einem natürlichen Bindungspartner interagieren kann, die nicht länger durch eine andere Proteinkinase oder Proteinphosphatase modifiziert wird oder nicht länger mit einem natürlichen Bindungspartner interagiert.
Der Begriff "Förderung oder Zerstörung der abnormalen Interaktion" bezeichnet ein Verfahren, das durch Verabreichung einer Verbindung gemäß der Erfindung an Zellen oder Gewebe in einem Organismus bewerkstelligt werden kann. Eine Verbindung kann eine Interaktion zwischen einer Proteinkinase und natürlichen Bindungspartnern durch Bildung günstiger Interaktionen mit multiplen Atomen an der Kontaktfläche des Komplexes fördern. Alternativ kann eine Verbindung eine Interaktion zwischen einer Proteinkinase und natürlichen Bindungspartnern durch Beeinträchtigung günstiger Interaktionen zwischen den Atomen an der Kontaktfläche des Komplexes hemmen.
Der Begriff "Indolinon" wird so verwendet, wie der Begriff üblicherweise im Stand der Technik verstanden wird, und umfasst eine große Unterklasse substituierter oder unsubstituierter Verbindungen, die aus einer Aldehyd-Einheit und einer Oxindol-Einheit synthetisiert werden können.
Der Begriff "Onxindol" bezeichnet eine Oxindol-Verbindung, die mit chemischen Substituenten substituiert ist. Oxindol-Verbindungen weisen die allgemeine Struktur auf:
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
In bevorzugten Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine Verbindung gemäß Formel (I), wobei

(a) jedes R₁ unabhängig und optional aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: (i) Wasserstoff; (ii) Methyl, Ethyl, Propyl, Ethylen, Propylen oder Butylen; (iii) einem Alkohol der Formel -(X₁)_n1-OH oder einem Alkoxyalkyl der Formel -(X₂)_n2-O-X₃, wobei X₁, X₂ und X₃ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Methylen, Ethylen oder Propylen besteht, und wobei n1 und n2 unabhängig 0 oder 1 sind; (iv) Fluor, Chlor oder Brom; (v) einer Carboxylsäure der Formel -(X₄)_n4-COOH, wobei X₄ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Methylen, Ethylen oder Propylen besteht, besteht, und wobei n4 0 oder 1 ist; (vi) einem Amid der Formel -(X₇)_n7-NHCOX₈ oder der Formel -(X₉)_n9-CONX₁₀X₁₁, wobei X₇ und X₉ jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Methylen, Ethylen und Propylen besteht, und wobei n7 und n9 unabhängig 0 oder 1 sind, und wobei X₈, X₁₀ und X₁₁ jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl und Propyl besteht, oder wobei X₁₀ und X₁₁ zusammengenommen einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen heteroaliphatischen Ring bilden; (vii) einem Sulfonamid der Formel -(X₁₂)_n12-SO₂NX₁₃X₁₄, wobei X₁₂ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Methylen, Ethylen oder Propylen besteht, und wobei n12 0 oder 1 ist, und wobei X₁₃ und X₁₄ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl und Phenyl besteht, wobei das Methyl, Ethyl, Propyl und Phenyl optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sind, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxy, Halogen, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; oder wobei X₁₃ und X₁₄ zusammengenommen einen fusionierten bizyklischen Ring bilden; oder (viii) zwei benachbarten R₁ Gruppen, die zusammen mit zwei benachbarten A, B, D oder E einen sechsgliedrigen heteroaliphatischen Ring bilden;
(b) A, B, D und E Kohlenstoff sind;
(c) G Stickstoff oder Sauerstoff ist;
(d) m 1 oder 2 ist; und
(e) q 2 ist.

Noch bevorzugter wird R₁ in Formel (I) unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, die aus Methyl, Methoxy, 2-Hydroxyethyl, Phenyl, 2-Methoxyphenyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 4- Fluorphenyl, 4-Chlorphenyl, 4-Bromphenyl, 4-Iodphenyl, 3-Carboxyphenyl, Pyridyl, -NHC(O)CH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -COOH, -SO₂NH(CH₃), -SO₂NH₂, -SO₂N(CH₃)₂, -SO₂NH(CH(CH₃)₂), -SO₂NH(C₆H₅), -SO₂NH(3-Chlorphenyl) und -SO₂N(CH₃)(3-Chlorphenyl) besteht, und wobei m 1 oder 2 ist.
Die bevorzugten Indolinon-Verbindungen der Erfindung sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Einige der obigen Verbindungen weisen die Struktur gemäß Formel (II) auf, wobei die Substituenten in Tabelle 2 definiert
Tabelle 2
Zwei der Verbindungen aus Tabelle 1 weisen die Struktur gemäß Formel (III) auf, wobei die Substituenten in Tabelle 3 definiert sind.
Tabelle 3
ALLGEMEINE SYNTHESE
Im Allgemeinen können die Verbindungen gemäß Formel (I) hergestellt werden durch Umsetzen eines Oxindols, das die folgende Struktur aufweist,
mit einem Aldehyd oder Keton, das die folgende Struktur
wobei R₁, R₃, R₄, R₅, A, B, D, E, G, m und q das Gleiche darstellen wie in der Zusammenfassung der Erfindung beschrieben.
Das Oxindol wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus 4-Methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid, 4-Methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 4-(2-Hydroxy-ethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-5-phenyl-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureamid, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureisopropylamid, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamid, N-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl)-acetamid, 2-Oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol, 5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-carboxylsäure, 6-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-(2-Methoxyphenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-(3-Methoxy-phenyl)-2-oxo- 1,2-dihydro-indol, 6-(4-Methoxy-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-(4-Fluor-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydro-indol, 5-(2,3-Dihydro-indol-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-(3,4-Dihydro-2H-quinolin-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-(5-Brom-2,3-dihydro-indol-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlorphenyl)-methylamid, 6-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Chlor-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 7-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 3-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl)-benzoesäure, , 3-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl)-benzoesäure, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlorphenyl)-amid, 5-Brom-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäuredimethylamid, 2-Oxo-5-(pyrrolidin-1-carbonyl)-1,2-dihydro-indol, 5-(Morpholin-4-carbonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol und
besteht.
Das Aldehyd wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-2-formypyrano[3,4-c]pyrrol und 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-(1H-2-formyl-pyrrolo)[3,4-c]pyridin besteht.
Die Reaktion wird in der Gegenwart einer Base durchgeführt. Die Base ist vorzugsweise eine Stickstoffbase (nitrogen base) oder eine anorganische Base. "Stickstoffbasen" werden üblicherweise im Stand der Technik verwendet und aus azyklischen und zyklischen Aminen ausgewählt. Beispiele für Stickstoffbasen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Ammonium, Methylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Triethylamin, Anilin, 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene, Diisopropylethylamin, Pyrrolidin, Piperidin und Pyridin oder substituiertes Pyridin (z.B. 2,6-Di-tert-butylpyridin).
"Anorganische Basen" sind Basen, die keine Kohlenstoffatome enthalten. Beispiele für anorganische Basen umfasssen, sind aber nicht beschränkt auf Hydroxid-, Phosphat-, Bisulfat-, Hydrosulfid (SH^–)- und Amidanionen. Fachleute wissen, welche Stickstoffbase oder anorganische Base den Erfordernissen der Reaktionsbedingung entsprechen würde. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann die verwendete Base Pyrrolidin oder Piperidin sein. In anderen Ausführungsformen kann die Base das Hydroxidanion sein, vorzugsweise als Natrium- oder Kaliumsalz verwendet.
Die Synthese der Verbindungen gemäß der Erfindung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmittel. Das Lösungsmittel der Reaktion ist vorzugsweise ein protisches Lösungsmittel oder ein aprotisches Lösungsmittel. "Protische Lösungsmittel" sind diejenigen, die zur Abgabe eines Protons an einen gelösten Stoff (Solut) imstande sind. Beispiele für erotische Lösungsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Alkohole und Wasser. "Aprotische Lösungsmittel" sind diejenigen Lösungsmittel, die unter normalen Reaktionsbedingungen kein Proton an einen gelösten Stoff abgeben. Typische organische Lösungsmittel, wie z.B. Hexan, Toluol, Benzen, Methylenchlorid, Dimethylformamid, Chloroform und Tetrahydroforan sind einige Beispiele für aprotische Lösungsmittel. Andere aprotische Lösungsmittel liegen ebenfalls im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist das Lösungsmittel der Reaktion ein Alkohol, der vorzugsweise Isopropanol oder am meisten bevorzugt Ethanol sein kann. Wasser ist ein weiteres bevorzugtes protisches Lösungsmittel. Dimethylformamid, das in der Chemie als DMF bekannt ist, ist ein bevorzugtes aprotisches Lösungsmittel.
Das Syntheseverfahren der Erfindung erfordert, dass die Reaktion bei erhöhten Temperaturen stattfindet, worunter Temperaturen zu verstehen sind, die größer sind als die Raumtemperatur. Die erhöhte Temperatur liegt vorzugsweise bei etwa 30-150°C, noch bevorzugter liegt sie bei 80-100°C, und am meisten bevorzugt liegt sie bei etwa 80-90°C, was in etwa der Temperatur entspricht, bei der Ethanol siedet (i.e. der Siedepunkt von Ethanol). Mit "etwa eine bestimmte Temperatur" ist gemeint, dass der Temperaturbereich vorzugsweise innerhalb von 10°C der angegebenen Temperatur liegt, noch bevorzugter innerhalb von 5°C der angegebenen Temperatur, und am meisten bevorzugt innerhalb von 2°C der angegebenen Temperatur. Daher ist beispielsweise mit "etwa 80°C" gemeint, dass der Temperaturbereich vorzugsweise 80 ± 10°C, bevorzugter 80 ± 5°C, und am meisten bevorzugt 80 ± 2°C beträgt.
Das Oxindol in der kombinatorischen Bibliothek wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus 4-Methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid, 4-Methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 4-(2-Hydroxy-ethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-5-phenyl-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureamid, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureisopropylamid, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamid, N-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl)-acetamid, 2-Oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol, 5-Fluoro-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indole-6-carboxylsäure, 6-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-(2-Methoxy-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-(3-Methoxy-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-(4-Methoxy-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 6-(4-Fluor-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydro-indol, 5-(2,3-Dihydro-indol-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-(3,4-Dihydro-2H-quinolin-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-(5-Brom-2,3-dihydro-indol-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-2,3- dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlor-phenyl)-methyl-amid, 6-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 5-Chlor-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 7-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 3-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl)-benzoesäure, 3-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl)-benzoesäure, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlor-phenyl)-amid, 5-Brom-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol, 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäuredimethylamid, 2-Oxo-5-(pyrrolidin-1-carbonyl)-1,2-dihydro-indol, 5-(Morpholin-4-carbonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol und
besteht.
Das Aldehyd wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-2-formylpyrano[3,4-c]pyrrol, 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-(1H-2-formyl-pyrrolo)[3,4-c]pyridin und
besteht.
Das Syntheseverfahren der Erfindung kann durch den Schritt des Screenings einer Bibliothek auf eine Verbindung mit der gewünschten Aktivität und Struktur begleitet werden – somit Bereitstellen eines Verfahrens zur Synthese einer Verbindung zunächst durch Screening auf eine Verbindung mit den gewünschten Eigenschaften und anschließendes chemisches Synthetisieren dieser Verbindung.
Verwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, die zur Regulation und/oder Modulation der zellulären Signaltransduktion und, in besonderen Ausführungsformen, der Rezeptor- und der Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase-Signaltransduktion imstande sind.
Die Rezeptorkinase-vermittelte Signaltransduktion wird durch die extrazelluläre Interaktion mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, gefolgt von Rezeptordimerisierung, transienter Stimulation der intrinsischen Proteinkinaseaktivität und Phosphorylierung. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluäre Signalübertragungsmoleküle erzeugt, und dies führt zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmatischen Signalmolekülen, welche die geeignete zelluläre Antwort erleichtern (z.B. Zellteilung, metabolische Effekte gegenüber der extrazellulären Mikroumgebung). Siehe, Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9: 303-391.
Es wurde gezeigt, dass Tyrosinphosphorylierungsstellen in Wachstumsfaktorrezeptoren als hochaffine Bindungsstellen für SH2 (src Homology) Domänen von Signalmolekülen fungieren. Fantl et al., 1992, Cell 69: 413-423; Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785); Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778; und Koch et al., 1991, Science 252: 668-678. Mehrere intrazelluläre Substratproteine, die mit Rezeptorkinasen assoziieren, wurden identifiziert. Diese können in zwei prinzipielle Gruppen eingeteilt werden: (1) Substrate, die eine katalytische Domäne aufweisen; und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, die aber als Adaptoren dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Die Spezifität der Interaktionen zwischen Rezeptoren und den SH2 Domänen ihrer Substrate wird durch die Aminosäurereste bestimmt, die den phosphorylierten Tyrosinrest unmittelbar umgeben. Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2 Domänen und den Aminosäuresequenzen, die den Phosphotyrosinrest umgeben, für bestimmte Rezeptoren sind konsistent mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofilen. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Diese Beobachtungen suggerieren, dass die Funktion jeder Rezeptorkinase nicht nur durch die Expressionsmuster und die Ligandenverfügbarkeit bestimmt wird, sondern auch durch die Anordnung von Downstream-Signaltransdurktionswegen, die von einem bestimmten Rezeptor aktiviert werden. Demzufolge stellt die Phosphorylierung einen wichtigen regulatorischen Schritt bereit, der die Selektivität von Signalwegen bestimmt, die von spezifischen Wachstumsfaktorrezeptoren sowie Differenzierungsfaktorrezeptoren verwendet werden.
Die Kinasesignalübertragung hat unter anderen Antworten Zellproliferation, Differenzierung und Metabolismus zur Folge. Eine abnormale Zellproliferation kann einen weiten Bereich von Fehlfunktionen und Krankheiten zur Folge haben, einschließlich der Entwicklung einer Neoplasie, wie z.B. Karzinom, Sarkom, Leukämie, Glioblastom, Hämangiom, Psoriasis, Arteriosklerose, Arthritis und diabetische Retinopathie (oder andere Fehlfunktionen, die eine unkontrollierte Angiogenese und/oder Vaskulogenese betreffen).
Erkrankungen, die durch die Verbindungen der Erfindung behandelt werden
Diese Erfindung ist daher auf Verbindungen gerichtet, welche die Kinasesignalübertragung durch Beeinflussen der enzymatischen Aktivität der RKs und/oder der Nicht-Rezeptorkinasen und Interferieren mit dem Signal, das durch solche Proteine übertragen wird, regulieren, modulieren und/oder inhibieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, welche Rezeptortyrosinkinase (RTK)- und/oder Nicht-Rezeptorkinase-vermittelte Signaltransduktionswege regulieren, modulieren und/oder inhibieren, als ein therapeutischer Ansatz zur Heilung zahlreicher Tumorarten einschließlich, aber nicht beschränkt auf Karzinom, Sarkom, Erythroblastom, Glioblastom, Meningiom, Astrocytom, Melanom und Myoblastom. Indikationen können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hirntumore, Blasenkrebs, Einerstockkrebs, Darmkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Magenkrebs, Blutkrebs, Lungenkrebs und Knochenkrebs.
Die hier beschriebenen Verbindungen können zur Behandlung von Fehlfunktionen verwendet werden, welche eine unregulierte Kinasesingalübertragung betreffen, einschließlich Fehlfunktionen der Zellproliferation, fibrotische Fehlfunktionen und metabolische Fehlfunktionen.
Fehlfunktionen der Zellproliferation, die mit Hilfe der vorliegenden Erfindung behandelt und weiter untersucht werden können, umfassen Krebsarten, proliferative Fehlfunktionen der Blutgefäße und proliferative Fehlfunktionen mesangialer Zellen.
Proliferative Fehlfunktionen der Blutgefäße betreffen angiogenetische und vaskulogenetische Fehlfunktionen, die im Allgemeinen eine abnormale Proliferation von Blutgefäßen zur Folge haben. Die Bildung bzw. das Ausbreiten von Blutgefäßen, oder Vaskulogenese bzw. Angiogenese, spielen wichtige Rollen in einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wie zum Beispiel Embryonalentwicklung, die Bildung des Corpus luteum, Wundheilung und Organregeneration. Sie spielen ferner eine vorherrschende Rolle in der Entwicklung von Krebs. Weitere Beispiele für proliferative Fehlfunktionen von Blutgefäßen umfassen Arthritis, wobei neue kapillare Blutgefäße in das Gelenk eindringen und den Knorpel zerstören, sowie okulare Erkrankungen, wie beispielsweise diabetische Retinopathie, wobei neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper (vitreous) eindringen, ausbluten und Erblindung verursachen. Umgekehrt werden ebenfalls Fehlfunktionen miteinbezogen, die das Schrumpfen (shrinkage), die Kontraktion oder den Verschluss von Blutgefäßen betreffen, wie z.B. Restenose.
Fibrotische Fehlfunktionen bezeichnen die abnormale Bildung extrazellulärer Matrix. Beispiele für fibrotische Fehlfunktionen umfassen hepatische Cirrhose und proliferative Fehlfunktionen mesangialer Zellen. Hepatische Cirrhose wird charakterisiert durch den Anstieg an Bestandteilen der extrazellulären Matrix, der die Bildung einer hepatischen Vernarbung zur Folge hat. Hepatische Cirrhose kann Krankheiten hervorrufen, wie etwa die Cirrhose der Leber. Eine erhöhte extrazelluläre Matrix, welche eine hepatische Vernarbung zur Folge hat, kann ferner durch virale Infektion verursacht werden, wie zum Beispiel bei Hepatitis. Lipocyten scheinen eine primäre Rolle bei der hepatischen Cirrhose zu spielen. Andere fibrotische Fehlfunktionen, die hier miteinbezogen sind, umfassen Arteriiosklerose (siehe unten).
Proliferative Fehlfunktionen mesangialer Zellen bezeichnen Fehlfunktionen, die durch eine abnormale Proliferation mesangialer Zellen hervorgerufen werden. Proliferative mesangiale Fehlfunktionen umfassen verschiedene humane Nierenerkrankungen, wie z.B. Glomerulonephritis, diabetische Nephropathie, bösartige Nephrosklerose, thrombotische mikroangiopathische Syndrome, Transplantatabstoßung und Glomerulopathien. Der PDGF-R wurde mit der Aufrechterhaltung der mesangialen Zellproliferation in Verbindung gebracht. Floege et al., 1993, Kidney International 43: 47S-54S.
PTKs wurden mit derartigen Fehlfunktionen der Zellprolifieration assoziiert. Zum Beispiel wurden einige Mitglieder der RTK Familie mit der Entwicklung von Krebs assoziiert. Einige dieser Rezeptoren, wie z.B. der EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233; Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) und der PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene 7: 627-633) werden in vielen Tumoren überexprimiert und/oder dauerhaft durch autokrine Schleifen (loops) aktiviert. Tatsächlich wurden in den meisten üblichen und schweren Krebsformen die Überexpressionen dieser Rezeptoren (Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci. 111: 119-133; Dickson et al., 1992, Canver Treatment Res. 61: 249-273; Korc et al., 1992, J. Clin. Ivest. 90: 1352-1360) und autokrine Schleilfen (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol. 118: 1057-1070; Kore et al., supra; Akbasak and Suner-Abkasak et al., supra) nachgewiesen. Der EGFR wurde zum Beispiel mit Schuppenzellkarzinom, Astrocytom, Glioblastom, Krebsarten im Kopf- und Halsbereich, Lungenkrebs und Blasenkrebs assoziiert. HER2 wurde mit Brustkrebs, Eierstockkrebs, Darmkrebs, Lungekrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Blasenkrebs assoziiert. Der PDGF-R wurde mit Glioblaston, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Melanom und Prostatakrebs assoziiert. Die RTK c-met wurde im Allgemeinen mit Hepatokarzinogenese und demzufolge mit hepatozellulärem Karzinom assoziiert. Zusätzlich wurde c-met mit der Bildung maligner Tumore in Verbindung gebracht. Im Speziellen wurde die RTK c-met unter anderen Krebsarten mit Kolorektal-, Thyroid-, Pankreas- und Darmkarzinom, Leukämie und Lymphom assoziiert. Weiterhin wurde die Überexpression des c-met Gens in Patienten mit Hodgkin's Erkrankung, Burkitt's Erkrankung und in einer lymphomen Zelllinie detektiert.
Der IGF-1R, der mit der Nährstoffversorgung und mit Typ-II Diabetes in Zusammenhang gebracht wird, wurde zusätzlich auch mit verschiedenen Krebsarten assoziiert. Zum Beispiel wurde IGF-1 als autokriner Wachstumsstimulator für mehrere Tumortypen impliziert, z. B. für humane Brustkrebskarzinomzellen (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418-1423) und kleine Lungentumorzellen (Macauley et al., 1990, Cancer Res. 50: 2511-2517). Zusätzlich scheint IGF-1, der integral in das normale Wachstum und die Differenzierung des Nervensystems involviert ist, ein autokriner Stimulator humaner Gliomas zu sein. Sandberg-Nordgvist et al., 1993, Cancer Res. 53: 2475-2478. Die Bedeutung des IGF-1R und seiner Liganden in der Zellproliferation wird weiter durch die Tatsache unterstrichen, dass viele Zelltypen (Fibroblasten, epitheliale Zellen, Glattmuskelzellen, T-Lymphozyten, Myeloidzellen, Chondrozyten, Osteoblasten, die Stammzellen des Knochenmarks) durch IGF-1 zum Wachstum stimuliert werden. Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression 1: 301-326. In einer Reihe von Publikationen schlägt Baserga sogar vor, dass IGF-1R eine zentrale Rolle in den Mechanismen der Transformation spielt, und als solches einen bevorzugten Angriffspunkt für therapeutische Interventionen für ein breites Spektrum an humanen bösartigen Tumoren darstellen könnte. Baserga, 1995, Cancer Res. 55: 249-252, Baserga, 1994, Cell 79: 927-930; Coppola et. al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 4588-4595.
Die Assoziation zwischen Abnomalitäten in RTKs und einer Erkrankung sind jedoch nicht auf Krebs beschränkt. Zum Beispiel wurden RTKs mit metabolischen Erkrankungen assoziiert, wie z.B. Psoriasis, Diabetes mellitus, Wundheilung, Entzündung und neurodegenerative Erkrankungen. Diese Erkrankungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Bluthochdruck, Depression, generelle Angstkrankheit, Phobien, postraumatisches Stresssyndrom, Persönlichkeitsstörung (avoidant personality disorder), sexuelle Dysfunktion, Essstörungen, Fettleibigkeit, chemische Abhängigkeiten, gehäufte Kopfschmerzen, Migräne, Schmerz, Alzheimer Erkrankung, obsessive-kompulsive Fehlfunktion, Panikerkankung (panic disorder), Erinnerungsstörungen, Parkinson Erkrankung, endokrine Fehlfunktionen, Vasospasmus, cerebellare Ataxie und Fehlfunktionen des Gastointestinaltrakts. Zum Beispiel wird der EGF-R in der cornealen und dermalen Wundheilung indiziert. Deffekte im Insulin-R und im IGF-1R werden in Typ-II Diabetes mellitus indiziert. Eine vollständigere Korrelation zwischen spezifischen RTKs und ihren therapeutischen Indikationen ist dargestellt in Plowan et al., 1994, DN&P 7: 334-339.
Nicht nur Kinasen des Rezeptortyps, sondern auch viele zelluläre Kinasen (CKs) einschließlich src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr, yrk (Übersichtsartikel in Bolen et al., 1992, FASEB J. 6: 3403-3409) sind in proliferative und metabolische Signalübertragungswege involviert, und somit in Indikationen der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel wurde mutiertes src (v-src) als ein Onkoprotein (pp60^V-src) in Hühnern nachgewiesen. Außerdem überträgt sein zelluläres Homolog, das Protoonkogen pp60^c-src, onkogene Signale zahlreicher Rezeptoren. Zum Beispiel führt die Überexpression von IGF-R oder HER2/neu in Tumoren zur konstitutiven Aktivierung von pp60^c-src die charakteristisch für die maligne Zelle ist, die aber der normalen Zelle fehlt. Auf der anderen Seite zeigen Mäuse, die defizient für die Expression von c-src sind, eine osteopetrotischen Phänotyp, der eine Schlüsselbeteiligung von c-src in der Osteoklastenfunktion und eine mögliche Beteiligung in verwandten Fehlfunktionen anzeigt. In ähnlicher Weise wird Zap 70 in die T-Zellsignalübertragung impliziert.
Weiterhin ist die Identifikation von CTK-modulierenden Verbindungen zur Verbesserung oder sogar Synergierung mit auf RTKs gerichteten (aimed) Blockern ein Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Schließlich wurden sowohl RTKs als auch Kinasen des Nicht-Rzeptortyps mit Hyperimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls effektiv bei der Behandlung von Erkrankungen, die das PYK-2 Protein betreffen. Dieses Protein, seine zelluläre Funktion und Erkrankungen, welche diese betreffen, sind detailliert im U.S. Patent Nr. 5,837,524, erteilt am 17. November 1998 mit dem Titel "PYK2 RELATED PRODUCTS AND METHODS", und im U.S. Patent Nr. 5,837,815, erteilt am 17. November 1998 mit dem Titel "PYK2 RELATED PRODUCTS AND METHODS" dargestellt, die beide durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind.
Zusätzlich sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wirksam gegen rheumatoide Arthritis. Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische inflammatorische Erkrankung, die durch multiple Zelltypen und zelluläre Prozesse vermittelt wird. Eingeschlossen in diese sind die Infiltration von Makrophagen und T-Zellen und die Beteiligung von Angiogenese. Um die Verwendung von kleinen Molekülen als Inhibitoren zur Behandlung von RA zu untersuchen, wurden einige der Verbindungen der Erfindung, die Tyrosinkinaseinhibitoren sind, in einem Rattenkollagen-induzierten Arthritismodell charakterisiert. Diese Verbindungen hemmen die Tyrosinkinasen FLK-1/KDR, PYK2 und ZAP-70 in unterschiedlichen Ausmaßen in biochemischen Kinaseassays (siehe die nachfolgenden Beispiele). Zusätzlich sind die Verbindungen aktiv in zellulären Assays, die gegen Zellen gerichtet sind, welche an der Pathogenese von RA beteiligt sind: Hemmung der T-Zell-Proliferation vermittelt durch ZAP-70 Aktivität, Inhibition der BEGF-stimulierten HUVEC-Proliferation, vermittelt durch FLK-1/KDR Aktivierung, und Hemmung der TNF-alpha Produktion aus Makrophagen, die aus murinem Knochenmark stammen, vermittelt durch PYK2 Aktivierung. In einem Nagetierkollagen-induzierten Arthritismodell, das die histologischen und pathalogischen Veränderungen nachahmt, die mit humaner RA assoziiert sind, sind diese Verbindungen schließlich wirksam in der Hemmung der Gelenkschwellung, wenn sie nach dem Zeitpunkt der Immunisierung mit Kollagen täglich verabreicht werden.
Der KDR/FLK-1 Rezeptor und VEGF
Normale Vaskulogenese und Angiogenese spielen wichtige Rollen in einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wie z.B. Embryonalentwicklung, Wundheilung, Organregeneration und weibliche Reproduktionsprozesse, wie z.B. Follikelentwicklung im Corpus luteum während der Ovulation und plazentales Wachstum nach der Schwangerschaft. Folkman and Shing, 1992, J. Biological Chem. 267: 10931-34. Viele Erkrankungen werden jedoch durch dauerhaft unregulierte oder nicht entsprechende Angiogenese verursacht. Neue kapillare Blutgefäße dringen z.B. bei Arthritis in das Gelenk ein und zerstören den Knorpel. Bei Diabetes dringen neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper ein, bluten aus und verursachen erblindung. Folkman, 1987, in: Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraete, et. al, Hrsg.), Leuven University Press, Leuven, S. 583-596. Okulare Neovaskularisation ist die am weitesten verbreitete Ursache von Blindheit und dominiert etwa zwanzig (20) Augenkrankheiten.
Außerdem wurden Vaskulogenese und/oder Angiogenese mit dem Wachstum bösartiger fester Tumore und Metastasenbildung assoziiert. Ein Tumor muss das Wachstum neuer kapillarer Blutgefäße kontinuierlich stimulieren, damit der Tumor selbst wächst. Weiterhin stellen neue Blutgefäße, die in einen Tumor eingebettet sind, einen Zugang für Tumorzellen bereit, um in den Blutkreislauf einzudringen und Metastasen an entfernten Stellen des Körpers zu bilden. Folkman, 1990, J. Nat. Cancer Inst. 82: 4-6; Klagsbrunn and Soker, 1993, Current Biology 3: 699-702; Folkman, 1991, J. Natl. Cancer Inst. 82: 4-6; Weidner et al., 1991, New Engl. J. Med. 324: 1-5.
Mehrere Polypeptide mit in vitro Aktivität zur Förderung des endothelialen Zellwachstums wurden identifiziert. Beispiele umfassen den sauren und den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF, bFGF; fibroblastic growth factor), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF, vascular endothelial growth factor) und den plazentalen Wachstumsfaktor (placental growth factor). Vor kurzem wurde berichtet, dass im Gegensatz zu aFGF und bFGF VEGF ein Mitogen darstellt, das spezifisch für endothiale Zellen ist. Ferrara and Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 19461-19566.
Demzufolge stellt die Identifikation spezifischer Rezeptoren, an die VEGF bindet, eine wichtige Verbesserung im Verständnis der Regulation der endothelialen Zellproliferation dar. Es wurden zwei strukturell eng verwandte RTKs identifiziert, die VEGF mit hoher Affinität binden: der flt-1 Rezeptor (Shibuya et al., 1990, Oncogene 5: 519-524; De Vries et al., 1992, Science 255: 989-991) und der KDR/FLK-1 Rezeptor der in der U.S. Patentanmeldung Nr. 08/193,829 diskutiert wird. Konsequenterweise wurde vermutet, dass diese RTKs eine Rolle bei der Modulation und Regulation der endothelialen Zellproliferation spielen können.
Belege, wie z.B. die in der ebenfalls anhängigen U.S. Anmeldung mit der Seriennummer 08/193,829 dargestellte Offenbarung, suggerieren deutlich, dass VEGF nicht nur für die endotheliale Zellproliferation verantwortlich ist, sondern auch ein primärer Regulator der normalen und pathologischen Angiogenese ist. Siehe allgemein, Klagsburn and Soker, 1993, Current Biology 3: 699-702; Houck et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 26037. Außerdem wurde gezeigt, dass KDR/FLK-1 und flt-1 in proliferierenden endothelialen Zellen eines wachsenden Tumors im Übermaß exprimiert werden, nicht aber in den umgebenden ruhenden endothelialen Zellen. Plate et al., 1992, Nature 359: 845-848; Shweiki et al., 1992, Nature 359: 843-845.
Identifikation von Agonisten und Antagonisten des KDR/FLK-1 Rezeptors
Angesichts der abgeleiteten Bedeutung von RTKs bei der Kontrolle, Regulation und Modulation der endothelialen Zellproliferation und potentiell der Vaskulogenese und/oder Angiogenese wurden zahlreiche Versuche mit Hilfe einer Vielzahl von Ansätzen unternommen, RTK "Inhibitoren" zu identifizieren. Diese umfassen die Verwendung mutierter Liganden (U.S. Patent Nr. 4,996,849) sowie lösliche Rezeptoren und Antikörper (Anmeldung Nr. WO 94/10202; Kendall and Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10705-10709; Kim et al., 1993, Nature 362: 841-44) und RNA Liganden (Jellinek et al., 1994, Biochemistry 33: 10450-10456).
Weiterhin wurden Kinaseinhibitoren (WO 94/03427, WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; U.S. Patent Nr. 5,330,992; Mariani et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35: 2268), sowie Inhibitoren identifiziert, welche an Rezeptorkinase- Signaltransduktionswegen angreifen, wie z.B. Proteinkinase C Inhibitoren (Schluchter et al., 1991, Cancer Res. 51: 682-687; Takano et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella et al., 1992, Exp. Cell Res. 199: 56-62; Wright et al., 1992, J. Cellular Phys. 152: 448-57).
Kürzlich wurden Versuche unternommen, kleine Moleküle, die als Kinaseinhibitoren wirken, zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs zu identifizieren. In Konsequenz besteht ein unbefriedigter Bedarf hinsichtlich der Identifikation und Generierung wirksamer kleiner Verbindungen, die selektiv die Signaltransduktion des KDR/FLK-1 Rezeptors inhibieren, um effektiv und spezifisch Vaskulogenese zu supprimieren.
Einige der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen eine exzellente Aktivität in biologischen Assays, und folglich kann erwartet werden, dass diese Verbindungen sowie verwandte Verbindungen wirksam bei der Behandlung durch Flk vermittelter Erkrankungen sind, wie z.B. diejenigen, die durch eine dauerhafte unregulierte oder nicht entsprechend regulierte Angiogenese verursacht werden.
Pharmazeutische Formulierungen und Verabreichung
Die hier beschriebenen Verbindungen können einem humanen Patienten per se verabreicht werden oder in pharamzeutischen Zusammensetzungen, in denen sie mit anderen Wirkstoffen, wie z.B. in der Kombinationstherapie, oder geeigneten Trägerstoffen oder Exzipienten gemischt werden. Verfahren zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung können in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Auflage, gefunden werden.
a) Verabreichungswege
Geeignete Verabreichungswege können z.B. eine orale, rektale, transmucosale oder intestinale Verabreichung, eine parenterale Abgabe einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intravenöser und intramedullärer Injektionen, sowie intrathekale, direkte intraventrikuläre, intraperitonale, intranasale oder intraokulare Injektionen umfassen.
Alternativ kann die Verbindung eher in einer lokalen als in einer systemischen Art und Weise verabreicht werden, z.B. via Injektion der Verbindung direkt in einen festen Tumor, oft in einem Depot oder als Sustained release-Formulierung.
Weiterhin kann das Arzneimittel in einem gerichteten Arzneimittelabgabesystem verabreicht werden, z.B. in einem Liposom, das mit einem tumorspezifischen Antikörper beschichtet ist. Die Liposomen sind gegen den Tumor gerichtet und werden selektiv von diesen aufgenommen.
b) Zusammensetzung/Formulierung
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Weise hergestellt werde, die selbst bekannt ist, z.B. mit Hilfe konventioneller Verfahren zum Mischen, Lösen, Granulieren, Herstellen von Dragees, Verreiben, Emulgieren, Verkapseln, Einfangen oder Lyophilisieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können daher auf konventionelle Weise formuliert werden, unter Verwendung von einem oder mehr physiologisch akzeptablen Trägerstoffen, die Exzipienten und Hilfsstoffe umfassen, die das Prozessieren der Wirkstoffe in Präparationen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Eine geeignete Formulierung hängt von der gewählten Art der Verabreichung ab.
Für eine Injektion können die Agentien der Erfindung in wässrigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie z.B. Hank's Lösung, Ringer's Lösung oder physiologischer Salinepuffer. Für eine transmucosale Verabreichung werden in der Formulierung durch Durchdringungsmittel (Penetrantien) verwendet, die für die zu überwindende Barriere geeignet sind. Derartige Durchdringungsmittel sind allgemein im Stand der Technik bekannt.
Für eine orale Verabreichung können die Verbindungen einfach durch Kombination der Wirkstoffe mit im Stand der Technik bekannten pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffenn formuliert werden. Solche Trägerstoffe ermöglichen es, dass die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Schlämme, Suspensionen und dergleichen zur oralen Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten formuliert werden. Pharmazeutische Präparationen für eine orale Verwendung können durch Mischen von einem oder mehr festen Exzipienten mit einer oder mehr Verbindungen der Erfindung erhalten werden, optional durch Zerreiben der erhaltenen Mischung und Prozessierung der Mischung von Granula nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, falls gewünscht, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Exzipienten sind insbesondere Füllstoffe, wie zum Beispiel Zucker einschließlich Laktose, Sucrose, Mannitol oder Sorbitol, Cellulosepräparationen, wie z.B. Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Traganthgummi (gum tragacanth), Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Poylvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht, können disintegrierende Agentien zugegeben werden, wie z.B. das quervernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie z.B. Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Zu diesem Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopol-Gel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel und Lösungsmittelmischungen enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen zur Identifikation oder zur Charakterisierung verschiedener Kombinationen von Wirkstoffdosierungen gegeben werden.
Pharmazeutische Präparationen, die oral verwendet werden können, umfassen Push-fit Kapseln aus Gelatine sowie weiche versiegelte Kapseln (soft sealed capsules) aus Gelatine und einem Weichmacher, wie z.B. Glycerin oder Sorbitol. Die Pushfit Kapseln können die Wirkstoffe gemischt mit Füllstoffen enthalten, wie z.B. Laktose, mit Bindemitteln, wie z.B. Stärken, und/oder mit Gleitmitteln, wie z. B. Talk oder Magnesiumstearat, und optional mit Stabilisatoren. In weichen Kapseln können die Wirkstoffe in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert werden, wie z.B. Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigem Polyethylenglykol. Zusätzlich können Stabilisatoren zugegeben werden. Alle Formulierungen für eine orale Verabreichung sollten in Dosierungen vorliegen, die für eine solche Verabreichung geeignet sind.
Für eine buccale Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Pastillen aufgenommen werden, die auf konventionelle Art formuliert sind.
Für eine Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen für eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung konventionell in Form eines Aerosolsprays auf unter Druck stehenden Packungen oder einer Spraydose (nebuliser) unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels abgegeben, wie z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder andere geeignete Gase. Im Fall eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosiseinheit durch Bereitstellen eines Ventils zur Abgabe einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Es können Kapseln und Umhüllungen (cartridges), z.B. aus Gelatine, für eine Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator formuliert werden, die ein Pulvergemisch der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis enthalten, wie z.B. Laktose oder Stärke.
Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion formuliert werden, z.B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion. Formulierungen für eine Injektion können in Einheitsdosisformen hergestellt werden, z.B. in Ampullen oder in Behältnissen mit multiplen Dosen, mit einem zugegebenen Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können z.B. in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln vorliegen und können formulierungsgemäße Agentien enthalten, wie z.B. Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsagentien.
Pharmazeutische Formulierungen für eine parenterale Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der Wirkstoffe in wasserlösliche Form. Zusätzlich können Suspensionen der Wirkstoffe als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen fettreiche Öle, wie z.B. Sesamöl, oder synthetische Fettsäureesther, wie z.B. Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Optional kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Agentien enthalten, welche die Solubilität der Verbidungen erhöhen, um die Präparation hoch konzentrierter Lösungen zu ermöglichen.
Alternativ kann der Wirkstoff in Puderform zur Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreiem, Wasser vor der Verwendung vorlegen.
Die Verbindungen können ferner in rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie z.B. Suppositorien oder Retentionsklistiere (retention enemas), die etwa eine konventionelle Basis eines Suppositoriums enthalten, wie z. B. Kakaobutter oder andere Glyceride.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen ferner als Depotpräparation formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantation (z.B. subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Demzufolge können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien (z.B. als Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder mit Ionenaustauscherharzen formuliert werden, oder als schlecht lösliche Derivate, z. B. als ein schlecht lösliches Salz.
Ein pharmazeutischer Träger für die hydrophoben Verbindungen der Erfindung ist ein Co-solvent System, das Benzylalkohol, einen nicht-polaren Surfactant, ein mit Wasser mischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase umfasst. Das Co-solvent System kann das VPD Co-solvent System sein. VPD ist eine Lösung aus 3% w/v Benzylalkohol, 8% w/v des nicht-polaren Surfactants Polysorbat 80 und 65% w/v Polyethylenglykol 300, mit absolutem Alkohol auf das Volumen gebracht. Das VPD Co-solvent System (VPD:D5W) besteht aus VPD, das 1:1 in einer 5%igen Dextroselösung in Wasser verdünnt ist. Dieses Co-solvent System löst hydrophobe Verbindungen gut und ruft selbst nach systemischer Verabreichung nur eine geringe Toxizität hervor. Natürlicherweise können die Eigenschaften eines Co-solvent Systems beträchtlich variiert werden, ohne seine Solubilitäts- und Toxizitätseigenschaften zu zerstören. Weiterhin kann die Identität der Co-solvent Komponenenten variiert werden: z. B. können anstelle von Polysorbat 80 andere gering toxische nicht-polare Surfactants verwendet werden; die Fraktionsgröße des Polyethylenglykols kann variiert werden; andere biokompatible Polymere können Polyethylenglykol ersetzen, z.B. Polyvinylpyrrolidon; und andere Zucker oder Polysacchararide können Dextrose ersetzen.
Alternativ können andere Abgabesystem für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposomen und Emulsionen sind bekannte Beispiele für Abgabevehikel oder Trägerstoffe für hydrophobe Arzneimittel. Bestimmte organische Lösungsmittel, wie z.B. Dimethylsulfoxid, können ebenfalls verwendet werden, obwohl üblicherweise auf Kosten einer größeren Toxizität. Weiterhin können die Verbindungen mit Hilfe eines Sustained release-Systems abgegeben werden, wie z.B. semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das therapeutische Agenz erhalten. Verschiedene Sustained release-Materialien wurden etabliert und sind Fachleuten bekannt. Abhängig von ihrer chemischen Natur können Sustained release-Kapseln die Verbindungen für wenige Wochen bis zu mehr als 100 Tagen freisetzen. Abhängig von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagenzes können zusätzliche Strategien für die Proteinstabilisierung verwendet werden.
Viele der PTK-modulierenden Verbindungen der Erfindung können als Salze mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen bereitgestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren gebildet werden einschließlich, aber nicht beschränkt auf Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, etc. Salze tendieren dazu, in wässerigen oder anderen protischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechenden freien Basen.
c) Effektive Dosierung
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Zusammensetzungen, bei denen die Wirkstoffe in einer Menge enthalten sind, die zur Erreichung des beabsichtigten Zwecks wirksam ist. Insbesondere bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge der Verbindung, die zur Aufhebung, Linderung oder Verbesserung der Symptome einer Erkrankung oder zur Verlängerung des Überlebens des zu behandelnden Patienten wirksam ist. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmannes, insbesondere im Lichte der hier bereitgestellten detaillierten Offenbarung.
Für jede der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis initial aus Zellkulturessays abgeschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis in Tiermodellen bestimmt werden, um einen Konzentrationsbereich im Blutkreislauf (ciculating concentration range) zu bestimmen, der die IC₅₀ beinhaltet, wie in der Zellkultur bestimmt (i.e. die Konzentration der Testverbindung, bei der eine halbmaximale Hemmung der PTK Aktivität erreicht wird). Eine derartige Information kann verwendet werden, um die in Menschen verwendbaren Dosen exakter zu bestimmen. Die Toxizität und die therapeutische Effizienz der hier beschriebenen Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder experimentellen Tiersystemen bestimmt werden, zum Beispiel zur Bestimmung der LD₅₀ (die Dosis, die für 50% der Population letal ist) und der ED₅₀ (die Dosis, die für 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index und kann als Rate zwischen LD₅₀ und ED₅₀ ausgedrückt werden. Bevorzugt werden Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes zeigen. Die aus diesen Zellkulturassays und Tierstudien erhaltenen Daten können zur Bestimmung eines Dosisbereiches für eine Verwendung in Menschen eingesetzt werden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs der im Blut zirkulierenden Konzentrationen, der die ED₅₀ umfasst, mit einer geringen oder keiner Toxizität. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches in Abhängigkeit von der verwendeten Dosierungsform und der verwendeten Art der Verabreichung variieren. Die exakte Formulierung, die Art der Verabreichung und die Dosierung können vom Arzt angesichts des Zustandes des Patienten gewählt werden. (Siehe zum Beispiel Fing et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Kap. 1 S. 1).
Die Dosierungsmenge und das Dosierungsintervall können individuell eingestellt werden, um Plasmakonzentrationen der aktiven Komponente bereitzustellen, die ausreichend sind, um die kinase-modulierenden Wirkungen aufrechtzuerhalten oder die minimale effektive Konzentration (MEC). Die MEC variiert für jede Verbindung, kann aber aus in vitro Daten abgeschätzt werden; zum Beispiel die Konzentration, die bei Verwendung der hier beschriebenen Essays notwendig ist, um 50-90% Inhibition der Kinase zu erreichen. Die Dosierungen, die notwendig sind, um die MEC zu erreichen, hängen von individuellen Charakteristika und der Art der Verabreichung ab. Es können jedoch HPLC Essays oder Bioessays verwendet werden, um die Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
Dosierungsintervalle können ebenfalls unter Verwendung des Wertes für die MEC bestimmt werden. Die Verbindungen sollten mit Hilfe eines Behandlungssystems (regimen) verabreicht werden, das Plasmaniveaus oberhalb der MEC für 10-90% der Zeit, vorzugsweise zwischen 30-90% und am meisten bevorzugt zwischen 50-90% aufrechterhält.
In Fällen einer lokalen Verabreichung oder selektiven Aufnahme braucht die effektive lokale Konzentration des Arzneimittels nicht in Bezug zur Plasmakonzentration zu stehen.
Die Menge der verabreichten Zusammensetzung hängt natürlich vom zu behandelnden Patienten, vom Gewicht des Patienten, von der Schwere der Erkrankung, von der Art der Verabreichung und von der Beurteilung durch den verschreibenden Arzt ab.
Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Formulierungen der Verbindungen, Verfahren zur Bestimmung der an einen Patienten zu verabreichenden Mengen der Verbindungen und Arten der Verabreichung der Verbindungen an einen Organismus werden ferner offenbart in den U.S. Patenten Nr. 5,792,783; 5,880,141; 5,786,488; 5,834,504; 5,880,141; 5,883,113; 5,883,116; 5,886,020 und in den Internationalen Patentpublikationen WO 96/22976 und WO 98/50356, die alle durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen sind. Fachleute werden erkennen, dass solche Beschreibungen auf die vorliegende Erfindung anwendbar sind und einfach adaptiert werden können.
d) Verpackung
Die Zusammensetzungen können, falls gewünscht, in einer Packung oder Dispensiervorrichtung präsentiert werden, welche eine oder mehr Dosierungseinheiten mit dem Wirkstoff enthalten können. Die Packung kann zum Beispiel eine Metall- oder Plastikfolie umfassen, wie zum Beispiel eine Blister-Packung. Der Packung oder Dispensiervorrichtung können Instruktionen zur Verabreichung beigegeben werden. Der Packung oder dem Dispenser kann ferner eine Mitteilung in einer durch eine Regierungsbehörde vorgeschriebenen Form beigegeben werden, die mit dem Behältnis assoziiert ist, und welche die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln reguliert, wobei die Mitteilung die Zulassung in Form eines Polypeptids für eine human- oder veterinärmedizinische Verabreichung durch die Behörde wiederspiegelt. Eine solche Mitteilung kann zum Beispiel die durch die U.S. Food and Drug Administration zugelassene Kennzeichnung für verschreibungspflichtige Arzneimittel oder ein zugelassenes Produktinsert sein. Zusammensetzungen, die eine Verbindung gemäß der Erfindung umfassen und in einem kompatiblen pharmazeutischen Trägerstoff formuliert sind, können ebenfalls hergestellt, in ein geeignetes Behältnis gegeben und für die Behandlung eines indizierten Zustandes gekennzeichnet werden. Geeignete Zustände, die auf dem Kennzeichen angegeben sind, können die Behandlung eines Tumors, die Inhibition von Angiogenese, die Behandlung von Fibrose, Diabetes und dergleichen umfassen.
Untersuchungen
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Hemmung des größten Teils der Proteinkinaseaktivität untersucht. Die biologischen Assays und die Ergebnisse dieser Inhibitionsstudien werden hier dargestellt. Einige der zur Messung der Modulation der Proteinkinasefunktion verwendeten Verfahren sind im Hinblick auf den Hochdurchsatzaspekt des Verfahrens ähnlich denen, die beschrieben sind in der internationalen Publikation WO 98/07695, veröffentlicht am 26. März 1998 von Tang et al. mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease" (Lyon & yon Aktenzeichen Nr. 221/187-PCT), und der U.S. Anmeldung mit der Seriennummer 08/702,232 von Tang et al. mit dem Titel "Indolinone Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the Treatment of Disease", eingereicht am 23. August 1996. Sowohl die 08/702,232 Anmeldung als auch die internationale Publikation WO 98/07695 sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einschließlich aller Zeichnungen hier eingeschlossen.
BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele sind nicht einschränkend und lediglich repräsentativ für verschiedene Aspekte und Merkmale der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele beschreiben Syntheseverfahren für die Verbindungen gemäß der Erfindung sowie Verfahren zur Messung einer Wirkung einer Verbindung auf die Funktion von Proteinkinasen.
Die in den Verfahren verwendeten Zellen sind kommerziell verfügbar. Die Nukleinsäurevektoren, die in den Zellen enthalten sind, sind ebenfalls kommerziell verfügbar und die Sequenzen der Gene für die verschiedenen Proteinkinasen sind in Sequenzdatenbanken leicht zugänglich. Demzufolge kann ein Durchschnittsfachmann die Zelllinien einfach und schnell durch Kombinieren der kommerziell verfügbaren Zellen, der kommerziell verfügbaren Nukleinsäurevektoren und der Proteinkinasegene erzeugen, indem er Verfahren verwendet, die Durchschnittsfachleuten einfach zur Verfügung stehen.
SYNTHESEVERFAHREN
BEISPIEL 1: VERFAHREN ZUR SYNTHESE DER VERBINDUNGEN DER ERFINDUNG
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit Hilfe des nachfolgenden allgemeinen Verfahrens synthetisiert werden.
Allgemeines Verfahren zur Kondensation von Oxindol und Aldehyd
Zu einer Mischung aus Oxindol (1 equiv.) und Aldehyd (1-1.2 equiv.) in Ethanol (0.1 M) wurde Piperidin (1 eq.) drei Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um das gewünschte Produkt zu ergeben (28-97% Ausbeute).
Herstellung von 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd
1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU, 8.39 ml, 56.1 mMol) wurde zu einer gerührten Mischung aus Tosylmethylisocyanid (10.95 g, 56.1 mmol) in Tetrahydrofuran (THF, 56 ml) bei 0°C gegeben. Nach 15 Minuten wurde 5,6-Dihdydro-2H-pyran-2-on (5 g, 51 mMol) zur Mischung gegeben. Die Mischung wurde anschließend bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit Solelösung (brine) gequencht und anschließend mit THF mehrere Male extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden getrocknet (Natriumsulfat), filtriert und konzentriert, um 6,7-Dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 11.49 (br s, 1H, NH), 7.41 (m, 1H), 6.67 (m, 1H), 4.32 (t, J = 5.9 Hz, 2H, CH₂), 2.73 (t, J = 5.9 Hz, 2H, CH₂). MS 138 [M⁺+1]
6,7-Dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on (5 g, 36 mmol) wurde unter Standardbedingungen der Vilsmeier-Reaktion unter Verwendung von N,N-Dimethylformamid (DM F, 1.2 eq.) und Phosphoroxychlorid (POCl₃, 1.1 eq.) in Dichlormethan formuliert. Das obige Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. Das präzipitierte Salz wurde filtriert, mit Dichlormethan gewaschen, in Wasser suspendiert und mit 6 N Natronlauge auf pH = 12 eingestellt. Die Festphase wurde mit einem Ethanol/Wasser-Gemisch (1:1) gewaschen, um 3.5 g (58%) 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 12.73 (br s, 1H, NH), 9.36 (s, 1H, CHO), 7.78 (s, 1H), 4.44 (t, J = 6.08 Hz, 2H, CH₂CH ₂O), 3.10 (t, J = 6.08 Hz, 2H, CH₂CH ₂O). MS 166 [M⁺+1]
Herstellung von 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd
2-Oxo-piperidin-1-carboxylsäure-tert-butylester (3.8 g, 19 mMol) in THF (12 ml) wurde bei –78°C tropfenweise zu gekühltem Lithiumdiisopropylamid (LDA, 19 ml, 2.0 M Lösung in Heptan/THF/Ehtylbenzen) gegeben. Nach 35 Minuten Rühren bei –78°C wurde zur Mischung tropfenweise eine Lösung aus Phenyldisulfid (4.15 g, 19 mMol) und Hexamethylphosphoramid (HMPA, 3.3 ml, 19 mMol) in THF (10 mL) gegeben. Die Mischung wurde bei –78°C gerührt und anschließen allmählich auf Raumtemperatur erwärmt. Die Reaktion wurde in Wasser (200 ml) gegossen und mit Ether (3 ×) extrahiert. Die kombinierten Etherextrakte wurden nacheinander mit 10% NaOH und Wasser gewaschen und wurden anschließend getrocknet und konzentriert, um 2-Oxo-3-phenylsulfanyl-piperidin-1-carboxylsäure-tert-butylester als Öl zu ergeben. Das Öl wurde im folgenden Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
3-Chlorperoxybenzoesäure (mCPBA, 4.7 g, 70%, 1 Äquivalent) wurde portionsweise zu einer gekühlten Lösung (0°C) des obigen 2-Oxo-3-phenylsulfanyl-piperidin-1-carboxylsäure-tert-butylesters in Dichlormethan (100 ml) und gesättigtem Natriumdicarbonat (NaHCO₃, 20 ml) gegeben. Die Mischung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und gerührt, bis die Reaktion durch TLC vollständig war. Das Reaktionsgemisch wurde im Anschluss mit Dichlormethan extrahiert, mit NaHCO₃ (gesättigt) gewaschen und getrocknet, um 3-Benzensulfonyl-2- oxo-piperidin-1-carboxylsäure-tert-butylester als Öl zu ergeben. Dieses wurde direkt im nachfolgenden Schritt verwendet.
3-Benzensulfonyl-2-oxo-piperidin-1-carboxylsäure-tert-butylester aus dem obigen Schritt in Toluol (50 ml) wurde für eine Stunde bei 80°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, und das erhaltene Öl wurde mittels Säulenchromatographie (20-30% EtOAc in Hexan) gereinigt, um 2 g 6-Oxo-3,6-dihydro-2H-pyridin-1-carboxylsäure-tert-butylester als Öl zu ergeben.
¹H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 6.91 (dt, 1H, COCH=CHCH₂), 5.81 (dt, J = 1.8 & 9.3 Hz, 1H, COCH=CHCH₂), 3.72 (t, J = 6.4 Hz, 2H, CONCH₂), 2.38 (m, 2H, CONCH₂), 1.44 (s, 9H, 3 × CH₃).
DBU (1.65 ml, 11 mMol) wurde zu einer gerührten Lösung aus Tosylmethylisocyanid (2.18 g, 11 mMol) in THF (11 ml) bei 0°C gegeben. Nach 15 Minuten Rühren wurde 6-Oxo-3,6-dyhydro-2H-pyridin-1-carboboxylsäure-tert-butylester (2 g, 10 mMol) aus dem obigen Schritt zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für vier Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem NaCl gequencht und mit THF extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden getrocknet und konzentriert, um 2 g (85%) 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-5-carboxylsäure-tert-butylester als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 11.38 (br s, 1H, NH), 7.34 (m, 1H), 6.61 (s, 1H), 3.81 (t, J = 6.0 Hz, 2H, CH₂), 2.67 (t, J = 6.0 Hz, 2H, CH₂), 1.44 (s, 9H, 3 × CH₃).
MS APCI neg. 235[M⁺–1]
POCl₃ (0.646 ml, 6.93 mMol) wurde tropfenweise zu eiskaltem DMF (1.5 ml, 18.9 mMol) gegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch wieder auf –5°C abgekühlt, und es wurde eine Lösung des obigen 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-5-carboxylsäure-tert-butylesters (1.5 g, 3.6 mMol) in DMF (3 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für sechs Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Eiswürfeln gequencht, gefolgt von der Zugabe von 10 N Kaliumhydroxid, wodurch der pH auf 11-12 eingestellt wurde. Nach 30 Minuten Rühren wurde die Mischung mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit Solelösung gewaschen, getrocknet und konzentriert, um 1.2 g 1-Formyl-4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrolo[3,4-c] pyridin-5-carboxylsäure-tert-butylester zu ergeben.
Ein Gemisch aus 1-Formyl-4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-5-carboxylsäure-tert-butylester (1.2 g, 4.54 mMol) in 50% Trifluoressigsäure in Dichlormethan wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde konzentriert, und der Rückstand (residue) wurde aus Dichlormethan rekristallisiert, um 400 mg (75%) 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c] pyridin-5-carbaldehyd zu erhalten.
¹H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12.30 (br s, 1H, NH), 9.60 (s, 1H, CHO), 7.46 (s, 1H), 7.34 (br s, 1H, NH), 3.36 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH₂), 2.95 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH₂).
MS 165 [M⁺+1]
Herstellung von 5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo [3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd
1-Methyl-2-piperidon (4.54 ml, 40 mMol) in THF (25 mL) wurde tropfenweise bei –78°C zu gekühltem Lithiumdiisopropylamid (LDA, 40 mL, 2.0 M Lösung in Heptan/THF/Ethylbenzen) gegeben. Nach 35 minütigem Rühren bei –78°C wurde zur Mischung tropfenweise eine Lösung aus Phenyldisulfid (8.8 g, 40 mMol) und Hexamethylphosphoramid (HMPA, 7 ml, 40 mMol) in THF (20 mL) gegeben. Das Gemisch wurde bei –78°C gerührt und anschließend allmählich auf Raumtemperatur aufgewärmt. Die Reaktion wurde in Wasser (400 ml) gegossen und mit Ether extrahiert (3 × 150 ml). Die kombinierten Etherextrakte wurden nacheinander mit 10% NaOH, Wasser, 10% HCl und anschließend Wasser gewaschen, getrocknet und konzentriert, um 10 g ( > 100 Ausbeute der Rohsubstanz (crude yield)) 3-Benzensulfonyl-1-mehtyl-piperidin-2-on als Öl zu ergeben. Das Öl wurde im anschließenden Schritt ohne weitere Reinigung verwendet.
MS APCI +ve 222 [M⁺+1].
3-Chlorperoxybenzoesäure (mCPBA, 4.9 g, 70%, 1 Äquivalent) wurde portionsweise zu einer gekühlten Lösung (0°C) aus 1-Methyl-3-phenylsulfonyl-piperidin-2-one (5 g, 22.6 mMol) in Dichlormethan (100 ml) und gesättigtem NaHCO₃ (wässrig (aq.)) (20 ml) gegeben. Das Gemisch wurde langsam auf Raumtemperatur aufgewärmt und gerührt, bis die Reaktion durch TLC vollständig war. Das Reaktionsgemisch wurde im Anschluss mit Dichlormethan extrahiert, mit gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen und getrocknet, um 4.7 g (82% Rohausbeute) 3-Benzensufonyl-1-methyl-piperidin-2-on als Öl zu ergeben.
Ein Gemisch aus 3-Benzensulfonyl-1-methyl-piperidin-2-On aus dem vorangegangenen Schritt in Toluol (50 m) wurde für eine Stunde auf 80°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, und der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie (80% EtOAc in Hexan) gereinigt, um 1.1 g (53% Rohausbeute) 1-Methyl-5,6-dihydro-1H-pyridin-2-on als Flüssigkeit zu ergeben.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 6.60 (dt, 1H, COCH=CHCH₂), 5.72 (dt, J = 1.8 & 9.7 Hz, 1H, COCH=CHCH₂), 3.35 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CONCH₂), 2.82 (s, 3H, CH₃), 2.33 (m, 2H, CONCH₂CH₂), 1.44 (s, 9H, 3 × CH₃).
MS APCI +ve 112 [M⁺+1].
Zu einer gerührten Lösung aus Lithium-bis(trimethylsilyl)amid (11 ml einer 1 M Lösung in THF), gekühlt auf –78°C unter Stickstoff, wurde tropfenweise eine Lösung aus Tosylmethylisocyanid (1.9 g, 10 mMol) in THF (45 ml) gegeben. Nach 40 minütigem Rühren bei –78°C wurde eine Lösung aus 1-Methyl-5,6-dihydro-1H-pyridin-2-on (1.1 g, 10 mMol) in THF (10 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde konzentriert, und der Rückstand wurde zwischen Wasser (150 ml) und Dichlormethan (150 ml) aufgeteilt. Die wässrige Lösung wurde mit Dichlormethan (3 ×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden konzentriert und unter Hochvakuum getrocknet. Der erhaltene Schaum wurde aus Dichlormethan rekristallisiert, um 633 mg (42%) 5-Methyl-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-one als schwach gelben Feststoff zu ergeben.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 11.0 (br s, 1H, NH), 7.08 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 3.42 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 2.89 (s, 3H, CH₃), 2.70 (t, J = 6.6 Hz, 2H CH₂).
5-Methyl-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on wurde unter Standard Vilsmeier Bedingungen unter Verwendung von DMF (3 Äquiv.) und POCl₃ (1.1 Äquiv.) formyliert, um 250 mg (33%) 5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd zu ergeben.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12.37 (br s, 1H, NH), 9.60 (s, 1H, CHO), 7.45 (s, 1H), 3.52 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 3.04 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 2.92 (s, 3H, CH₃).
MS m/z 179 [M⁺+1].
Verbindung IN-001:
4-Methyl-2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid.
4-Methyl-2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid (0.2 g, 0.83 mMol) wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd (1.2 Äq., 0.17 g) kondensiert, um 0.31 g (97%) der im Titel genannten Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.77 (s, 1H, NH), 11.42 (s, 1H, NH-CO), 7.92 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.1 Hz, ArH), 7.69 (s, 1H), 7.42 (q, J = 4.5Hz, 1H, SO₂NH), 6.89 (d, J = 8. 5 Hz, 1H), 4.49 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CO₂CH ₂CH₂), 3.08 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CO₂CH₂CH ₂), 2.84 (s, 3H, CH₃), 2.42 (d, J = 4.7 Hz, 3H; SO₂NHCH ₃). MS 388 [M⁺+1].
Verbindung IN-002:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-l-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid.
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid (0.2 g, 0.88 mMol) wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd (1.2 Äq., 0.18 g) kondensiert, um 0.26 g (79%) der im Titel genannten Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.74 (s, 1H, NH), 11.45 (s, 1H, NH-CO), 8.28 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.0 (s, 1H, C=CH), 7.95 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.60 (dd, J =1.9 und 8.3 Hz, 1H), 7.21 (m, 1H, SO₂NH), 7.05 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.50 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CO₂CH ₂CH₂), 3.18 (t, J = 5. 8 Hz, 2H, CO₂CH₂CH ₂) 2. 41 (d, J = 5. 2 Hz, 3H, SO₂NHCH ₃). MS 374 [M⁺+1].
Verbindung IN-003:
1-(4-Methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
4-Methyl-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 295.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-004:
1-(5-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-Methoxy-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 311.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-005:
1-(6-Methoxy-2-oxo-1-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-Methoxy-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehye kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 311.2 [MM].
Verbindung IN-006:
1-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-Brom-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 359.2 & 361.1 [M⁺+1].
Verbindung IN-007:
1-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-Chlor-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 315.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-008:
1-[4-(2-Hydroxy-ethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
4-(2-Hydroxy-ethyl)-1,3-dihydro-indol-2-on (0.1 g, 0.6 mMol) wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd (1.2 Äq., 0.06 g) kondensiert, um 0.5 g (28%) der im Titel genannten Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.87 (s, 1H, NH), 11.07 (s, 1H, NH-CO), 7.90 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H, C=CH), 7.09 (m, 1H), 6.84 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.89 (t, J = 4.8 Hz, 1H, CH₂CH₂OH), 4.49 (t, J = 6.0 Hz, 2H, CO₂CH ₂CH₂ pyrrol), 3.70 (m, 2H, HOCH₂CH ₂Ar and CO₂CH₂CH ₂ pyrrol).
MS m/z 325.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-009:
1-(2-Oxo-5-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-Phenyl-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 357.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-010:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylene)-2,3-dibydro-1H-indol-5-sulfonsäureamid.
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureamid wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 360.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-011:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-l-ylmethylene)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfosäuredimethylamid.
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-l-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 388.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-012:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylene)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureisopropylamid.
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureisopropylamid wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 402.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-013:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylene)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamid.
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamide wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 436.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-014:
N-[2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylene)-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl]-acetamid.
N-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl)-acetamid wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 338.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-015:
1-(2-Oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-Phenyl-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 357.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-016:
1-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 299.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-017:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure.
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 325.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-018:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indole-6-carboxylic acid
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indole-6-carboxylsäure wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 325.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-019:
1-(6-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-Chlor-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 315.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-020:
1-(6-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-Brom-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 359.2 & 361 [M⁺+1].
Verbindung IN-021:
1-[6-(2-Methoxy-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-(2-Methoxy-phenyl)-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 387.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-022:
1-[6-(3-Methoxy-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-(3-Methoxy-phenyl)-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 387.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-023:
1-[6-(4-Methoxy-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-(4-Methoxy-phenyl)-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 387.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-024:
1-[6-(4-Fluor-phenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-(4-Fluor-phenyl)-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 375.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-025:
1-(2-Oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-Pyridin-3-yl-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 358.4 [M⁺+1].
Verbindung IN-026:
1-[5-(2,3-Dihydro-indol-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
Zu einem Gemisch aus 5-Chlorsulfonyl-2-oxindol (5 g, 21.6 mMol) and Indolin (2.9 ml, 26 mMol) in THF (20 ml) wurde Pyridin (3.4 g, 43 mMol) gegeben. Nach einem Tag Rühren bei Raumtemperatur wurde das Präzipitat mittels Filtration gesammelt, mit Wasser in Ethanol (20%) gewaschen, getrocknet, mit 60 ml heißem Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um 7.5 g (über 100) 5-(2,3-Dihydro-indol-1-sulfonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on als pinkfarbenen Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10.76 (br s, 1H, NH), 7.62 (m, 2H), 7.43 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.13-7.18 (m, 2H), 6.95 (dt, J = 0.9 & 7.5 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.87 (t, J = 8.5 Hz, 2H, CH₂CH₂), 3.51 (s, 2H, CH₂), 2.91 (t, J = 8.5 Hz, 2H, CH₂CH₂). MS-EI314 [M⁺].
5-(2,3-Dihydro-indol-1-sulfonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 462.3 [M⁺+1].
Verbindung IN-027:
1-[5-(3,4-Dihydro-2H-quinolin-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-(3,4-Dihydro-2H-quinolin-1-sulfonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 476.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-028:
1-[5-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2-sulfonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 476.3 {M⁺+1].
Verbindung IN-029:
1-[5-(5-Brom-2,3-dihydro-indol-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-(5-Brom-2,3-dihydro-indol-1-sulfonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 540.3 & 542 [M⁺+1].
Verbindung IN-030:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlor-phenyl)-methyl-amid.
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlor-phenyl)-methyl-amid wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 484.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-031:
1-(6-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydfo-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
6-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 299.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-032:
1-(5-Chlor-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-Chlor-4-methyl-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 329.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-033:
1-(7-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
7-Chlor-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 315.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-034:
3-[2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl]-benzoesäure.
3-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl)-benzoesäure wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 401.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-035:
3-[2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl]-benzoesäure.
3-(2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl)-benzoesäure wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 401.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-036:
2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlor-phenyl)-amid.
2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlor-phenyl)-amid wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 470.2 [M⁺+1].
Verbindung IN-037:
1-(5-Brom-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on.
5-Brom-4-methyl-1,3-dihydro-indol-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 373.2 & 375 [M⁺+1].
Verbindung IN-038:
1-(2-Oxo-5-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
Ein Gemisch aus 5-Phenyl-1,3-dihydro-indol-2-on (41.8 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (1 Äquivalent) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten (sealed) Röhrchen bei 80°C für 3 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.58 (s, 1H, NH), 11.06 (br s, 1H, NH), 8.16 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.86 (s, 1H, H-Vinyl), 7. 68-7.71 (m, 3H), 7.40-7.48 (m, 4H), 7.31 (m, 1H), 6.95 (d, J = 8. 1 Hz, 1H), 3.41 (m, 2H, CH₂), 3.02 (t, J = 6. 4 Hz, 2H, CH₂). MS m/z 356 [M⁺+1].
Verbindung IN-039:
1-(2-Oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
Ein Gemisch aus 6-Phenyl-1,3-dihydro-indol-2-on (41.8 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (1 Äquivalent) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 3 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.55 (s, 1H, NH), 11.09 (br s, 1H, NH), 7.86 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.72 (s, 1H, H-Vinyl), 7.68 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 7.64 (m, 2H), 7.45 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.30-7.40 (m, 3H), 7.10 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 3.41 (m, 2H, CH₂), 2.99 (t, J = 6. 7 Hz, 2H, CH₂). MS m/z 356 [M⁺+1].
Verbindung IN-040:
1-(6-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-yIidenemethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
Ein Gemisch aus 6-Brom-1,3-dihydro-indol-2-on (42.4 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (1 Äquivalent) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 3 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆) δ 13.45 (s, 1H, NH), 11.09 (br s, 1H, NH), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H, H-Vinyl), 7.70 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.41 (br s, 1H, NH), 7.19 (dd, J = 1.4 & 8.4 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 1.4Hz, 1H), 3.39 (m, 2H, CH₂), 2.96 (t, J = 6.4 Hz, 2H, CH₂). MS m/z 358 & 360 [M⁺+1].
Verbindung IN-041:
1-(6-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
Ein Gemisch aus 6-Chlor-1,3-dihydro-indol-2-on (33.5 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (1 Äquivalent) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 3 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.45 (s, 1H, NH), 11.10 (br s, 1H, NH), 7.80 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H, H-Vinyl), 7.68 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.40 (br s, 1H, NH), 7.05 (dd, J = 1.8 & 8.1 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 3.40 (m, 2H, CH₂), 2.97 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH₂). MS m/z 314 [M⁺+1].
Compound IN-042:
2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylene)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid.
Ein Gemisch aus 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid (48 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (1 Äquivalent) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 3 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.51 (s, 1H, NH), 11.25 (br s, 1H, NH), 8.29 (d, J = 1.6Hz, 1H), 8.03 (s, 1H, H-Vinyl), 7.73 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 1.6 & 8.2 Hz, 1H), 7.43 (br s, 1H, NH), 7.07 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.43 (m, 2H, CH₂), 3.06 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 2.60 (s, 6H, 2 × CH₃). MS m/z 387 [M⁺+1].
Verbindung IN-043:
2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäuredimethylamid.
Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP, 3.5 g, 6.72 mMol) wurde zu einem Gemisch aus 5-Carboxy-2-oxindol (1 g, 5.6 mMol), Dimethylamin (5.6 ml of 2.0 M in THF, 11.2 mMol) und Triethylamin (2.0 ml, 14 mMol) in Dichlormethan gegeben. Nach drei Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit mehr Dichloromethan verdünnt, mit Wasser, gesättigtem Natriumbicarbonat und Sole (brine) gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt, um 480 mg (42%) 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäuredimethylamid zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 10.50 (br s, 1H, NH), 7.23 (m, 2H), 6.81 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 3.49 (s, 2H, CH₂), 2.93 (s, 6H, 2 × CH₃). MS-EI m/z 204 [M⁺].
Ein Gemisch aus 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure-dimethylamid (40.8 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (1 Äq.) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 3 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.53 (s, 1H, NH), 11.14 (br s, 1H, NH), 7.92 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H, H-Vinyl), 7.68 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.40 (br s, 1H, NH), 7.20 (dd, J = 1.3 & 8.0 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.40 (m, 2H, CH₂), 2.99 (m, 2H, CH₂), 2.97 (s, 6H, 2 × CH₃). MS 351 m/z [M⁺+1].
Verbindung IN-044:
1-[2-Oxo-5-(pyrrolidine-1-carbonyl)-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
PyBOP (3.5 g, 6.72 mMol) wurde zu einem Gemisch aus 5-Carboxy-2-oxindol (1 g, 5.6 mMol), Pyrrolidin (0.5 ml, 6.2 mMol) und Triethylamin (2.0 ml, 14 mMol) in Dichloromethan gegeben. Nach vier Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit mehr Dichloromethan verdünnt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Sole gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt, um 5-(Pyrrolidin-1-carbonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 10.52 (br s, 1H, NH), 7.37 (m, 2H), 6.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.49 (s, 2H, CH₂), 3.42 (m, 4H, 2 × CH₂), 1.81 (m, 4H, 2 × CH₂). MS-EI m/z 230 [M⁺].
Ein Gemisch aus 5-(Pyrrolidin-1-carbonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on (46 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (1 Äquivalent) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 3 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.52 (s, 1H, NH), 11.14 (br s, 1H, NH), 8.02 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H, H-Vinyl), 7.69 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.40 (br s, 1H, NH), 7.32 (dd, J = 1.3 & 7.7 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 3.39-3.48 (m, 6H), 3.0 (t, J = 6.4 Hz, 2H, CH₂), 1.84 (m, 4H, 2 × CH₂). MS m/z 377 [M⁺+1].
Verbindung IN-045:
1-[5-(Morpholin-4-carbonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
PyBOP (3.5 g, 6.72 mMol) wurde zu einem Gemisch aus 5-Carboxy-2-oxindol (1 g, 5.6 mMol), Morpholin (0.5 ml, 6.2 mMol) und Triethylamin (2.0 ml, 14 mMol) in Dichloromethan gegeben. Nach vier Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit mehr Dichloromethan verdünnt, mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Sole gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt, um 5-(Morpholin-4-carbonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 10.54 (br s, 1H, NH), 7.24 (m, 2H), 6.83 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.56 (m, 4H, 2 × CH₂), 3.49 (s, 2H, CH₂), 3.47 (m, 4H, 2 × CH₂) MS APCI neg. m/z 245 [M⁺–1]].
Ein Gemisch aus 5-(Morpholin-4-carbonyl)-1,3-dihydro-indol-2-on (49.2 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (1 Äq.) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 3 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.52 (s, 1H, NH), 11.16 (br s, 1H, NH), 7.92 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H, H-Vinyl), 7.69 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.41 (br s, 1H, NH), 7.21 (dd, J = 1.4 & 7.9 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 3.59 (m, 4H, 2 × CH₂), 3.52 (m, 4H, 2 × CH₂), 3.41 (m, 2H, CH₂) 3.0 (t, J = 6. 6 Hz, 2H, CH₂. MS m/z 393 [M⁺+1].
Verbindung IN-046:
1-[4-(2-Hydroxy-ethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl]-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
Ein Gemisch aus 4-(2-Hydroxy-ethyl)-1,3-dihydro-indol-2-on (35.4 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (32.8 mg, 0.2 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13. 62 (br s, 1H, NH), 11.0 (s, 1H, NH), 7.66 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H, H-Vinyl), 7.38 (br s, 1H, NH), 7.07 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.89 (t, J = 4.7 Hz, 1H, OH), 3.70 (m, 2H, CH₂), 3.41 (m, 2H, CH₂), 3.06 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH₂), 2.89 (t, J = 6. 4 Hz, 2H, CH₂). MS m/z 324 [M⁺+1].
Verbindung IN-047:
1-(5-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
Ein Gemisch aus 5-Methoxy-1,3-dihydro-indol-2-on (32.6 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (32.8 mg, 0.2 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.65 (br s, 1H, NH), 10.79 (s, 1H, NH), 7.70 (s, 1H, H-Vinyl), 7.66 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.38 (br s, 1H, NH), 6.75 (m, 2H), 3.41 (m, 2H, CH₂), 3.32 (s, 3H, OCH₃), 2.99 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH₂). MS m/z 310 [M⁺+1].
Verbindung IN-048:
1-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indoI-3-ylidenemethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
Ein Gemisch aus 5-Fluor-1,3-dihydro-indol-2-on (30.2 mg, 0.2 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-l-carbaldehyd (32.8 mg, 0.2 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.57 (br s, 1H, NH), 10.98 (s, 1H, NH), 7.77 (s, 1H, H-Vinyl), 7.73 (dd, J = 2.6 & 9.3 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.40 (br s, 1H, NH), 6.96 (m, 1H), 6.84 (dd, 1H), 3.41 (m, 2H, CH₂), 2.98 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH₂). MS m/z 298 [M⁺+1].
Verbindung IN-049:
1-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on.
Ein Gemisch aus 5-Brom-1,3-dihydro-indol-2-on (23 mg, 0.11 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-l-carbaldehyd (29.7 mg, 0.18 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 26 mg (67%) der im Titel genannten Verbindung zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.52 (br s, 1H, NH), 11.09 (br s, 1H, NH), 8.08 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H, H-Hinyl), 7.70 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.41 (br s, 1H, NH), 7.29 (dd, J = 2.3 & 8.3 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.40 (m, 2H, CH₂), 2.99 (t, J = 6.5 Hz, 2H, CH₂). MS m/z 358/360
Verbindung IN-050:
2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylene)-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure.
Ein Gemisch aus 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure (44.5 mg, 0.25 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (41 mg, 0.25 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 6 Stunden erhitzt und mit kaltem Ethanol gewaschen. Der Feststoff wurde im Anschluss im Methanol gelöst, das unlösliche Material wurde entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert, um 20 mg (25%) der im Titel genannten Verbindung als gelben Feststoff zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.59 (s, 1H, NH), 11.10 (br s, 1H, NH), 8.24 (s, 1H), 7.76 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.65 (m, 2H), 7.37 (br s, 1H, NH), 6.78 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.38 (m, CH₂), 3.0 (t, 2H, CH₂, ). MS m/z 324 [M⁺+1].
Verbindung IN-051:
2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureamid.
Ein Gemisch aus 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureamid (63 mg, 0.3 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (50 mg, 0.3 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 89 mg (82%) der im Titel genannten Verbindung zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.50 (s, 1H, NH), 11.22 (br s, 1H, NH), 8.27 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H, H-Vinyl), 7.72 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 1.5 & 8.0 Hz, 1H), 7.42 (br s, 1H, NH), 7.17 (br s, 2H, NH₂), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.40 (m, 2H, CH₂), 3.02 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂).
MS m/z 359 [M⁺+1].
Verbindung IN-052:
2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1 -ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid.
Ein Gemisch aus 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid (66 mg, 0.3 mMol), 4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (50 mg, 0.3 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde in einem verschweißten Röhrchen bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit kaltem Ethanol gewaschen und getrocknet, um 50 mg (45%) der im Titel genannten Verbindung zu ergeben.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.51 (br s, 1H, NH), 11.2 (br s, 1H, NH), 8.26 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.94 (s, 1H, H-Vinyl), 7.73 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 1.3 & 8.0 Hz, 1H), 7.42 (br s, 1H, NH), 7.20 (m, 1H, CH₃NH), 7.05 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.40 (m, 2H, CH₂, 3.04 (t, J = 6. 5 Hz, 2H, CH₂), 2.40 (br s, 3H, CH₃). MS m/z 373 [M⁺+1].
Verbindung IN-053:
4-Hydroxyethyl-2-oxindol (5 g, 28.2 mMol) wurde unter Rühren bei Raumtemperatur in 20 ml Chlorsulfonsäure gelöst. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch unter Rühren langsam zu eiskaltem Wasser (300 ml) gegeben. Die Festsubstanz wurde gefiltert und getrocknet, um 1.9 g (28%) 6,6-Dioxo-3,6,8,9-tetrahydro-1H-7-oxa-6λ⁶-thia-3-azacyclopenta[α]naphthalen-2-on als weißes Pulver zu erhalten.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 10.79 (s, 1H, NH), 7.65 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar-H), 6.90 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar-H), 4.87 (t, J = 5. 7 Hz, 2H, CH ₂SO₂) 3.51 (s, 2H, CH ₂CO), 3.04 (t, J = 5.9 Hz, 2H, CH ₂Ar). MS m/z 239 [M⁺].
6,6-Dioxo-3,6,8,9-tetrahydro-1H-7-oxa-6λ⁶-thia-3-azacyclopenta[α]naphthalen-2-on (0.1 g, 0.4 mMol) wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd (1.2 Äq., 0.08 g) kondensiert, um 0.08 g (50%) des gewünschten Produkts zu ergeben.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13.75 (s, 1H, NH), 11.55 (s, 1H, NH-CO), 7.95 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.55 (s, 1H, C=CH), 7.04 (d, J = 8.2 Hz), 4.95 (t, J = 5. 3Hz, 2H, SO, CH ₂CH₂Ar), 4.5 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CO₂CH ₂CH₂ Pyrrol), 3.55 (t, J = 5.0 Hz, 2H, SO₃CH₂ CH ₂Ar), 3.09 (t, J = 5.7 Hz, 2H, CO₂CH₂CH ₂ Pyrrol).
Verbindung IN-054:
Ein Gemisch aus 4-(2-Hydroxy-ethyl)-1,3-dihydro-indol-2-on (35.4 mg, 0.2 mMol), 5-Methyl-4-Oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (35.6 mg, 0.2 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13.59 (br s, 1H, NH), 10.96 (br s, 1H, NH), 7.64 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 7.54 (s, 1H, H-Vinyl), 7.07 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 4.86 (m, 1H, OH), 3.71 (m, 2H, CH₂OH), 3.57 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH₂), 3.07 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH₂), 2.98 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 2.95 (s, 3H, CH₃).
MS m/z 338 [M⁺+1]
Verbindung IN-055:
Ein Gemisch aus 5-Brom-1,3-dihydro-indol-2-on (42.4 mg, 0.2 mMol), 5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (35.6 mg, 0.2 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13.47 (br s, 1H, NH), 11.04 (br s, 1H, NH), 8.06 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.81 (s, 1H, H-Vinyl), 7.68 (t, J = 3.3 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 1.9 & 8.5 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 6.7 Hz, 2H, CH₂), 3.08 (t, J = 6.7 Hz, 2H, CH₂) 2.95 (s, 3H, CH₃).
MS m/z 372/374 [M⁺+1].
Verbindung IN-056:
Ein Gemisch aus 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure (35.4 mg, 0.2 mMol), 5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (35.6 mg, 0.2 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Die Reaktion wurde mit 1 N HCl behandelt, und das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13.46 (br s, 1H, NH), 12.6 (v br s, 1H, COOH), 11.26 (s, 1H, NH), 8.40 (s, 1H), 7.87 (s, 1H, H-Vinyl), 7.80 (t, J = 8 Hz, 1H), 7.68 (dd, J = 3.1 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 8 Hz, 1H), 3.57 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 3.13 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 2.95 (s, 3H, CH₃).
MS m/z 338 [M⁺+1].
Verbindung IN-057:
Ein Gemisch aus 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid (45.2 mg, 0.2 mMol), 5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (35.6 mg, 0.2 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13.47 (br s, 1H, NH), 11.28 (v br s, 1H, NH), 8.24 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H, H-Vinyl), 7.71 (t, J = 3.2 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 1.5 & 8.2 Hz, 1H), 7.15 (m, 1H, CH₃NH), .7.05 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 3.3 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 2.95 (s, 3H, CH₃), 2.42 (s, 3H, CH₃).
MS m/z 387 [M⁺+1].
Verbindung IN-058:
Ein Gemisch aus 2-Oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid (48 mg, 0.2 mMol), 5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-carbaldehyd (35.6 mg, 0.2 mMol) und 0.1 ml Piperidin in Ethanol (1 ml) wurde bei 80°C für 4 Stunden erhitzt. Das Präzipitat wurde mittels Vakuumfiltration gesammelt, mit Ethanol gewaschen und getrocknet, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
¹HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13.48 (br s, 1H, NH), 11.35 (v br s, 1H, NH), 8.26 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 8.0 (s, 1H, H-Vinyl), 7.72 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 7.54 (dd, J = 1.5 & 8.2 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.58 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 3.15 (t, J = 6.6 Hz, 2H, CH₂), 2.96 (s, 3H, CH₃), 2.61 (s, 6H, 2 × CH₃).
MS m/z 401 [M⁺+1].
Verbindung IN-059:
1,3-Dihydro-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 282 [M⁺+1].
Verbindung IN-060:
4-(3-Chlor-4-fluor-phenylamino)-5,7-dihydro-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-on wurde mit 4-Oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-carbaldehyd kondensiert, um die im Titel genannte Verbindung zu ergeben.
MS m/z 426 [M⁺+1].
ASSAYVERFAHREN
Die folgenden in vitro Assays können verwendet werden, um das Aktivitätsniveau und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehr der PKs zu bestimmen. Ähnliche Essays können auf Grundlage der gleichen Prinzipien für eine beliebige PK unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren konzipiert werden.
Für die Evaluierung der Verbindungen werden drei allgemeine Assaytypen verwendet: zellulär/katalytisch, zellulär/biologisch und in vivo. Das Ziel der zellulären/katalytischen Assays ist die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung auf die Fähigkeit einer TK, Tyrosine in einem bekannten Substrat in einer Zelle zu phosphorylieren. Das Ziel der zellulären/biologischen Assays ist die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung auf die biologische Antwort, die durch eine TK in einer Zelle stimuliert wird. Das Ziel der in vivo Assays ist die Bestimmung der Wirkung einer Verbindung in einem Tiermodell einer bestimmten Krankheit, wie zum Beispiel Krebs.
Die hier beschriebenen zellulären/katalytischen Assays werden in einem ELISA-Format durchgeführt. Das allgemeine Prozedere ist wie folgt: Eine Verbindung wird in Zellen eingebracht, welche die Testkinase entweder natürlich oder rekombinant exprimieren, und zwar, falls die Testkinase ein Rezeptor ist, einige Zeit nachdem ein Ligand zugegeben wurde, von dem bekannt ist, dass er den Rezeptor aktiviert. Die Zellen werden lysiert, und das Lysat wird in die Wells einer ELISA Platte transferiert, die zuvor mit einem spezifischen Antikörper beschichtet wurden, der das Substrat der enzymatischen Phophorylierungsreaktion erkennt. Nicht-Substrat Komponenten des Zelllysats werden weggewaschen, und das Ausmaß der Phosphorylierung des Substrats wird im Vergleich zu Kontrollzellen, die nicht mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wurden, mit einem Antikörper detektiert, der spezifisch Phosphotyrosin erkennt.
Die hier beschriebenen zellulären/biologischen Assays messen die als Antwort auf die Aktivierung einer Testkinase gebildete DNA-Menge, die ein allgemeines Maß für eine polyferative Antwort darstellt. Das allgemeine Prozedere dieses Assays ist wie folgt: Eine Verbindung wird in Zellen eingebracht, welche die Testkinase entweder natürlich oder rekombinant exprimieren, und zwar, falls die Testkinase ein Rezeptor ist, einige Zeit nachdem ein Ligand zugegeben wurde, von dem bekannt ist, dass er den Rezeptor aktiviert. Nach Inkubation mindestens über Nacht wird ein DNA-Markierungsreagenz, wie zum Beispiel Bromdeoxiuridin (BrdU) oder 3H-Thymidin zugegeben. Die Menge markierter DNA wird entweder mit einem Anti-BrdU Antikörper oder durch Messen der Radioaktivität bestimmt und mit Kontrollzellen verglichen, die nicht mit einer Testsubstanz in Kontakt gebracht wurden.
Zelluläre/katalytische Essays
Enzym-gekoppelte Immunadsorbentassays (ELISA) können verwendet werden, um das Vorhandensein einer PK Aktivität zu detektieren und zu messen. Der ELISA kann gemäß bekannter Verfahren durchgeführt werden, die zum Beispiel beschrieben sind in Voller et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay," In: Manual of Clinical Immunology. 2. Aufl., herausgegeben von Rose und Friedman, S. 359-371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.
Das offenbarte Protokoll kann zur Bestimmung der Aktivität bezüglich einer spezifischen PK angepasst werden. Zum Beispiel sind die bevorzugten Protokolle zur Durchführung von ELISA Experimenten für spezifische PKs nachfolgend dargestellt. Die Anpassung dieser Protokolle zur Bestimmung der Aktivität einer Verbindung für andere Mitglieder der RTK Familie sowie für CTKs und STKs liegt innerhalb des Wissens des Fachmanns.
BEISPIEL 2: FLK-1
Es wurde ein ELISA Assay durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-1 Rezeptors zu messen, und insbesondere die Inhibition oder Aktivierung der TK Aktivität des FLK-1 Rezeptors. Im Speziellen wurde der nachfolgende Assay durchgeführt, um die Kinaseaktivität des FLK-1 Rezeptors in Zellen zu messen, die genetisch modifiziert (engineered) wurden, um FLK-1 zu expremieren.
Materialien und Methoden:
Materialien
Die nachfolgenden Reagenzien und Verbrauchsmaterialien wurden verwendet:

a. Coming 96-Well ELISA Platten (Corning Katalog Nr. 25805-96).
b. Cappel Ziege anti-Kaninchen IgG (Katalog Nr. 55641).
c. PBS (Gibco Katalog Nr. 450-1300EB).
d. TBSW Puffer (50 mM Tris (pH 7.2), 150 nM NaCl und 0.1% Tween-20).
e. Ethanolamin Stammlösung (10% Ethanolamin (pH 7.0), gelagert bei 4 °C).
f. HNTG Puffer (20 mM HEPES Puffer (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.2% Triton X-100 und 10% Glyzerin).
g. EDTA (0.5 M (pH 7.0) als 100 × Stammlösung).
h. Natriumorthovanadat (0.5 M als 100 × Stammlösung).
i. Natriumpyrophosphat (0.2 M als 100 × Stammlösung).
j. NUNC 96-Well Polypropylenplatten mit V-Boden (Applied Scientific Katalog Nr. AS-72092).
k. NIH3T3 C7#3 Zellen (FLK-1 exprimierende Zellen).
l. DMEM mit 1 × Hochglukose L-Glutamin (Katalog Nr. 11965-050).
m. FBS, Gibco (Katalog Nr. 16000-028).
n. L-Glutamin, Gibco (Katalog Nr. 25030-016).
o. VEGF, PeproTech, Inc. (Katalog Nr. 100-20)(aufbewahrt als 1 μg/10Oμl Stammlösung in Milli-Q dH₂O und gelagert bei –20°C).
p. Affinitätsgereinigtes anti-FLK-1 Antiserum. q. Monoklonaler UB40 Antikörper, spezifisch für Phosphotyrosin (siehe Fendley et al., 1990, Cancer Research 50: 1550-1558).
r. EIA Grad Ziege anti-Maus IgG-POD (BioRad Katalog Nr. 172-1011).
s 2,2-Azino-bis(3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) Lösung (100 mM Zitronensäure (wasserfrei), 250 mM Na₂HPO₄ (pH 4.0), 0.5 mg/ml ABTS (Sigma Katalog Nr. A-1888)), Lösung sollte bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4°C gelagert werden.
t. H₂O₂ (30% Lösung) (Fisher Katalog Nr. H325).
u. ABTS/H₂O₂ (15 ml ABTS Lösung, 2 μL H₂O₂), 5 Minuten vor der Verwendung herstellen und bei Raumtemperatur belassen.
v. 0.2 M HCI Stammlösung in H₂O.
w. Dimethylsulfoxid (100) (Sigma Katalog Nr. D-8418).
y. Trypsin-EDTA (Gibco BRL Katalog Nr. 25200-049).

Protokoll:
Das nachfolgende Protokoll wurde zur Durchführung des Essays verwendet:

1. Beschichten von Corning 96-Well ELISA Platten pro Well mit 1.0 μg Cappel Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper in 0.1 M Na₂CO₃, pH 9.6. Einstellen des Endvolumens auf 150 μl pro Well. Beschichten der Platten über Nacht bei 4°C. Die Platten können bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
2. Anzucht der Zellen bei 37°C, 5% CO₂ in Wachstumsmedium (DMEM, supplementiert mit 2.0 mM L-Glutamin, 10% FBS) in geeigneten Kulturschalen bis zur Konfluenz.
3. Ernten der Zellen durch Trypsinieren und Aussäen in Corning 25850 Polystyrol 96-Well Platten mit abgerundetem Boden in einer Dichte von 25.000 Zellen/Well in 200 μl Wachstumsmedium.
4. Anzucht der Zellen für mindestens einen Tag bei 37°C, 5% CO₂.
5. Einmaliges Waschen der Zellen mit D-PBS.
6. Zugabe von 200 μl/Well Hungermedium (DMEM, 2.0 mM 1-Glutamin, 0.1% FBS). Inkubation über Nacht bei 37°C, 5% CO₂.
7. 1:20 Verdünnung der Verbindungen in Polypropylen 96-Well Platten unter Verwendung von Hungermedium, 1:20 Verdünnung von Dimethylsulfoxid zur Verwendung in Kontrollwells.
8. Entfernen des Hungermediums aus den 96-Well Zellkulturplatten und Zugabe von 162 μl frischem Hungermedium zu jedem Well.
9. Zugabe von 18 μl der 1:20 verdünnten Verdünnung der Verbindung (aus Schritt 7) zu jedem Well plus der 1:20 verdünnten Dimethylsulfoxid-Verdünnung zu den Kontrollwells (+/- VEGF), um eine finale Verdünnung von 1:200 nach der Zellstimulation zu erhalten. Die finale Dimethylsulfoxid-Konzentration beträgt 0.5%. Inkubation der Platte bei 37°C, 5% CO₂ für zwei Stunden.
10. Entfernen des ungebundenen Antikörpers von den ELISA Platten durch Umdrehen der Platten, um die Flüssigkeit zu entfernen. Dreimaliges Waschen mit TBSW + 0.5% Ethanolamin, pH 7.0. Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Luftblasen zu entfernen.
11. Blockieren der Platten mit TBSW + 0.5% Ethanolamin, pH 7.0, 150 μl/Well. Inkubation der Platte 30 Minuten unter Schütteln auf einem Mikortiterplattenschüttler.
12. Dreimaliges Waschen, wie in Schritt 10 beschrieben.
13. Zugabe von 0.5 μg/Well affinitätsgereinigtem polyklonalem anti-FLU-1 Kaninchen-Antiserum. Einstellen des Endvolumens auf 150 μl/Well mit TBSW + 0.5% Ethanolamin, pH 7.0. Inkubation der Platte für 30 Minuten unter Schütteln.
14. Zugabe von 180 μl Hungermedium zu den Zellen und Stimulation der Zellen mit 20 μl/Well 10.0 mM Natriumorthovanadat und 500 ng/mL VEGF (resultierend in einer Endkonzentration von 1.0 mM Natriumorthovanadat und 50 ng/ml VEGF pro Well) für 8 Minuten bei 37°C, 5% CO₂. In negative Kontrollwells wird nur Hungermedium gegeben.
15. Nach 8 Minuten sollte das Medium von den Zellen entfernt werden, und diese sollten einmal mit 200 μl PBS pro Well gewaschen werden.
16. Lyse der Zellen unter Schütteln bei Raumtemperatur für 5 Minuten in 150 μl HNTG/Well. Die HNTG Formulierung umfasst Natriumorthovanadat, Natriumpyrophosphat und EDTA.
17. Dreimaliges Waschen der ELISA Platte, wie in Schritt 10 beschrieben.
18. Transfer der Zelllysate aus den Zellkulturplatten in die ELISA Platte und Inkubation unter Schütteln für 2 Stunden. Zum Transfer wird das Zelllysat auf- und abpipettiert, während die Wells ausgekratzt werden.
19. Dreimaliges Waschen der Platte, wie in Schritt 10 beschrieben.
20. Inkubation der ELISA Platte mit 0.02 μg/Well UB40 in TBSW + 0.5% Ethanolamin. Einstellen des Endvolumens auf 150 μl/Well. Inkubation unter Schütteln für 30 Minuten.
21. Dreimaliges Waschen der Platte, wie in Schritt 10 beschrieben.
22. Inkubation der ELISA Platte mit einem 1:10.000 verdünnten EIA-Grad Ziege anti-Maus-IgG, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist, in TBSW + 0.5% Ethanolamin, pH 7.0. Einstellen des Endvolumens auf 150 μl/Well. Inkubation unter Schütteln für 30 Minuten.
23. Waschen der Platte, wie in Schritt 10 beschrieben.
24. Zugabe von 100 μl ABTS/H₂O₂ Lösung pro Well. Inkubation unter Schütteln für 10 Minuten.
25. Zugabe von 100 μl 0.2 M HCl, um eine Endkonzentration von 0.1 M HCl einzustellen, um die Farbentwicklung der Reaktion zu stoppen. Schütteln für eine Minute bei Raumtemperatur. Entfernen der Luftblasen durch langsamen Luftstrom (slow stream of air) und Lesen der ELISA Platte in einem ELISA Plattenlesegerät bei 410nm.

BEISPIEL 3: GST-FLK-1 BIOESSAY
Dieser Essay analysiert die Tyrosinkinaseaktivität von GST-FLK-1 bezüglich Poly(Glu-Tyr)-Peptiden.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning 96-Well ELISA Platten (Corning Katalog Nr. 25805-96)
2. Poly(Glu-Try) 4:1, Lyophilisat (Sigma Katalog # P0275). Herstellung einer 1 mg/ml Lösung von Poly(Glu-Try) in steriler PBS und Lagerung in 1 ml Aliquots bei –20°C.
3. Herstellung Poly(Glu-Try) (pEY)-beschichteter Assayplatten: Beschichten mit 2 μg/Well Poly(Glu-Try) (pEY) in 100 μl PBS bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder bei + 4°C über Nacht. Die Platten müssen gut abgedeckt werden, um Verdunstung zu verhindern.
4. PBS Puffer: Um einen Liter einer 1 × Arbeitslösung herzustellen, werden 0.02 g KH₂PO₄, 1.15 g Na₂HPO₄, 0.2 g KCl und 8 g NaCl in ungefähr 900 mL dH₂O gelöst. Wenn alle Reagenzien gelöst sind, wird der pH mit HCl auf 7.2 eingestellt. Das Gesamtvolumen wird mit dH₂O auf 1 l gebracht.
5. PBS-Tw Puffer: Zu 1 l PBS Puffer werden 1.0 mL Tween-20 gegeben und gerührt, bis sich dieses gelöst hat.
6. TBB Blockierungspuffer: Um 1 l einer 1 × Arbeitslösung herzustellen, werden 1.21 g TRIS, 8.77 g NaCl, 1 ml Tween-20 in ungefähr 900 ml dH₂O gelöst. Der pH wird mit HCl auf 7.2 eingestellt. Es werden 10 g BSA zugegeben und gerührt, bis sich dieses gelöst hat. Das Gesamtvolumen wird mit dH₂O auf 1 l gebracht. Die Lösung wird filtriert, um etwaige Partikel zu entfernen.
7. 1% BSA in PBS: Um eine 1 × Arbeitslösung herzustellen werden 10 g BSA zu etwa 990 ml PBS Puffer gegeben und gerührt, um dieses zu lösen. Das Gesamtvolumen wird mit PBS auf 1 l eingestellt und filtriert, um etwaige Partikel zu entfernen.
8. 50 mM Hepes, pH 7.5.
9. GST-FLK1cd, gereinigt aus mit rekombinanten Baculoviren transfizierten Sf9 Zellen.
10. 4% DMSO in dH₂O.
11. 10 mM ATP in dH₂O.
12. 40 mM MnCl₂.
13. Kinaseverdünnungspuffer (KDB): Gemischt werden 10 ml Hepes (pH 7.5), 1 ml 5 M Natriumchlorid, 40 μL 100 mM NaVO₄ und 0.4 ml 5% BSA (in dH₂O) mit 88.56 mL dH₂O.
14. NUNC 96-Well Polypropylenplatten mit V-Boden, Appplied Scientific Katalog # AS-72092.
15. EDTA: Mischen von 14.12 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit ungefähr 70 ml dH₂O. Zugabe von 10 N NaOH, bis sich das EDTA löst. Einstellen des pH auf 8.0. Einstellen des Gesamtvolumens auf 100 ml mit dH₂O.
16. 1 × Antikörperverdünnungspuffer: Mischen von 10 ml 5% BSA (in PDS Puffer) mit 89.5 ml TBSTw.
17. Monoklonaler anti-Phosphotyrosinantikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).
18. 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-Sulfonsäure)(ABTS, Moss, Kat. Nr. ABST).
19. 10% SDS.

Verfahren

1. Beschichten von Corning 96-Well ELISA Platten mit 2 μg polyEY Peptid in steriler PBS, wie in Schritt 3 von Materialen und Methoden beschrieben.
2. Entfernen von ungebundener Flüssigkeit aus dem Wells durch Umdrehen der Platte, einmaliges Waschen mit TBSTw. Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Zugabe von 100 μl 1% BSA in PBS zu jedem Well. Inkubation unter Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur.
4. Wiederholung von Schritt 2.
5. Beschicken (Soak) der Wells mit 50 mM Hepes pH 7.5 (150 μl/Well).
6. Verdünnung der Testverbindung mit dH₂O/4% DMSO auf das Vierfache der gewünschten Endkonzentration im Assay in 96-Well Polypropylenplatten.
7. Zugabe von 25 μl verdünnter Testverbindung zur ELISA Platte. Zu Kontrollwells (Wells, die keine Testverbindung enthalten) werden 25 μl dH₂O/4% DMSO gegeben.
8. Zugabe von 25 μl 40 mM MnCl₂ mit 4 × ATP (2 μM) zu allen Wells.
9. Zugabe von 25 μl 0.5 M EDTA zu den Wells der Negativkontrolle.
10. Verdünnung von GST-Flk1 auf 0.005 μg (5 ng)/Well in KDB. Zu 50 ml KDB werden 100 μl 0.050 mg/ml GST-Flk1 Enzym gegeben.
11. Zugabe von 50 μl verdünntem Enzym zu jedem Well.
12. Inkubation unter Schütteln für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 50 μl 250 mM EDTA (pH 8.0).
14. Dreimaliges Waschen mit TBSTw und Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
15. Zugabe von 100 μl anti-Phosphotyrosinantikörper/HRP-Konjugat pro Well, 1:5000 Verdünnung in Antikörper-Verdünnungspuffer. Inkubation unter Schütteln für 90 Minuten bei Raumtemperatur.
16. Waschen, wie oben in Schritt 14 beschrieben.
17. Zugabe von 100 μl ABTS-Lösung (Raumtemperatur) zu jedem Well.
18. Inkubation unter Schütteln für 10 bis 15 Minuten. Entfernen aller Luftblasen.
19. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 20 μl 10% SDS.
20. Lesen des Assays mit einem Dynatech MR7000 ELISA Lesegerät: Testfilter bei 410 nM; Referenzfilter bei 630 nM

BEISPIEL 4: PYK2 BIOESSAY
Diesee Assay wird verwendet, um die in vitro Kinaseaktivität von HA Epitop-markiertem, vollständigem pyk2(FL.pyk2-HA) in einem ELISA Assay zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning 96-Well ELISA Platten (Corning Katalog # 25805-96).
2. 12CA5 monoklonal anti-HA Antikörper.
3. PBS (Dulbecco's phosphat-gepufferte Saline, Gibco Katalog # 450-1300EB)
4. TBST Puffer: Mischen von 8.766 g NaCl, 6.057 g TRIS und 1 ml 0.1 % Triton X-100 in etwa 900 mL dH₂O, Einstellen des pH auf 7.2, Einstellen des Volume auf 1 l.
5. Blockierungspuffer: Mischen von 100 g 10% BSA, 12.1 g 100 mM TRIS, 58.44 g 1 M NaCl und 10 mL of 1 % TWEEN-20.
6. FL.pyk2-HA aus Sf9 Zelllysaten.
7. 4% DMSO in Milli-Q H₂O.
8. 10 mM ATP in dH₂O.
9. 1 M MnCl₂.
10. 1 M MgCl₂.
11. 1 M Dithiothreitol (DTT).
12. 10 × Kinasepuffer Phosphorylierungsgemisch: Mischen von 5.0 ml 1 M Hepes (pH 7.5), 0.2 ml 1 M MnCl₂, 1.0 ml MgCl₂, 1.0 ml 10% Triton X-100 in 2.8 ml dH₂O. Unmittelbar vor Gebrauch Zugabe von 0.1 mL 1 M DTT.
13. NUNC 96-Well Polypropylenplatten mit V-Boden (Applied Scientific Katalog # AS-72092).
14. EDTA
15. Biotin-konjugierter anti-Phosphotyrosin mAB (Upstate Biotechnology Inc., Klon 4G10, Kat.# 16-103, Ser. # 14495).
16. Vectastain Elite ABC Reagenz (Avidin-Peroxidasekonjugat, Vector Laborotories (PK-6100)).
17. ABTS Lösung: Mischen von 19.21 g Zitronensäure und 35.49 g Na₂HPO₄ in etwa 900 ml dH₂O. Einstellen des pH auf 4.0 mit Phosphorsäure. Zugabe von 5 oder 10 g ABST. Wenn alles gelöst ist, Filtrieren.
18. Wasserstoffperoxid: 30% Lösung.
19. ABTS/H₂O₂: Mischen von 15 ml ABTS Lösung mit 3 μl 30% H₂O₂ 5 Minuten vor Verwendung.
20. 0.2 M HCl.

Verfahren :

1. Beschichten von Corning 96-Well ELISA Platten mit 0.5 μg pro Well 12CA5 anti-HA Antikörper in 100 μl PBS. Lagerung über Nacht bei 4°C.
2. Entfernen des ungebundenen HA-Antikörpers aus den Wells durch Umdrehen der Platte. Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Zugabe von 150 μl Blockierungspuffer zu jedem Well. Inkubation unter Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur.
4. Waschen der Platten mit TBS-T.
5. Verdünnen des Lysats in PBS (1.5 μg Lysat/100 μl PBS).
6. Zugabe von 100 μl des verdünnten Lysats zu jedem Well. Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
7. Waschen, wie in Schritt 4.
8. Zugabe von 50 μl 2 × Kinasepuffer zur ELISA Platte, die gebundenes (captured) pyk2-HA enthält.
9. Zugabe von 25 μl 40 μM Testverbindung in 4% DMSO oder 4% DMSO alleine (Kontrolle) zur Platte.
10. Zugabe von 25 μl 0.5 M EDTA zu dem Wells der Negativkontrolle.
11. Zugabe von 25 μl 20 μM ATP zu allen Wells. Inkubation unter Schütteln für 10 Minuten.
12. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 25 μl 500 mM EDTA (pH 8.0) zu allen Wells.
13. Waschen wie in Schritt 4.
14. Zugabe von 100 μl biotin-Konjugiertem anti-Phospotyrosin mAB (1:5000 Verdünnung in Blockierungspuffer) zu alles Wells. Inkubation unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
15. Herstellung von Vectastain ABC-Reagenz. Inkubation für 30 Minuten für die komplette Kopplung von Avidin mit dem biotinylierten HRP. Zugabe von einem Tropfen (oder 50 μl) Reagenz A zu 15 ml Blockierungspuffer. Mischen durch mehrmaliges Umdrehen des Röhrchens. Zugabe von einem Tropfen (oder 5.0 μl) Reagenz B und erneutes Mischen. Inkubation des ABC-Reagenzes bei Raumtemperatur, um das Mischen zu ermöglichen, während der Biotin-4G10 anti-Phosphotyrosinantikörper in der Assayplatte inkubiert.
16. Waschen wie in Schritt 4.
17. Zugabe von 100 μl vorbereitetem Vectastain/Peroxidase-Konjugat/Well. Inkubation unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
18. Waschen wie in Schritt 4, anschließend einmal mit PBS.
19. Zugabe von 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu jedem Well.
20. Inkubation unter Schütteln für 10-15 Minuten. Entfernen jeglicher Luftblasen.
21. Falls notwendig, Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 μl 0.2 M HCl pro Well.
22. Lesen des Assays mit einem Dynatech MR 700 ELISA Lesegerät mit einem Testfilter bei 410 nm und einem Referenzfilter bei 630 nm.

BEISPIEL 5: FGFR1 BIOESSAY
Dieser Assay wird verwendet, um die in vitro Kinaseaktivität von FGF1-R in einem ELISA Assay zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Costar 96-Well ELISA Platten (Corning Katalog # 3369).
2. Poly(Glu, Tyr)(Sigma Katalog # PO275).
3. PBS (Gibco Katalog # 450-1300EB).
4. 40 mM Hepes Pufferlösung.
5. Blockierungspuffer (5% BSA/PBS).
6. Gereinigter GST-FGFR1.
7. Kinaseverdünnungspuffer: Mischen von 500 μl 1 M Hepes (GIBCO), 20 μl 5% BSA/PBS, 10 μl 100 mM Natriumorthovanadat und 50 μl 5 M NaCl.
8. 10 mM ATP.
9. 1 M MnCl₂.
10. ATP/MnCl₂ Phosphorylierungsgemisch: Mischen von 20 μl ATP, 400 μl MnCl₂ and 9.56 ml dH₂O.
11. NUNC 96-Well Polypropylenplatten mit V-Boden (Applied Scientific Katalog # AS-72092).
12. 0.5 M EDTA.
13. 0.05 TBST: Zugeben von 500 μL TWEEN zu 1 Liter TBS.
14. ployklonaler Kaninchen anti-Phosphotyrosinserum.
15. Ziege anti-Kaninchen IgG Peroxidasekonjugat (Biosource, Catalog # ALI0404).
16. ABTS Lösung.
17. 30% Wasserstoffperoxid.
18. ABTS/H₂O₂.

Verfahren:

1. Beschichten von Costar 96 Well-ELISA Platten mit 1 μg pro well Poly(Glu, Tyr) in 100 μl PBS. Lagerung über Nacht bei 4°C.
2. Einmaliges Waschen der beschichteten Platten mit PBS.
3. Zugabe von 150 μl 5% BSA/PBS Blockierungspuffer zu jedem Well. Inkubation unter Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
4. Zweimaliges Waschen der Platte mit PBS, anschließend einmaliges Waschen mit 50 mM Hepes. Ausklopfen der Platten auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Luftblasen zu entfernen.
5. Zugabe von 25 μl 0.4 mM Testverbindung in 4% DMSO oder DMSO alleine (Kontrollen) zur Platte.
6. Verdünnen von gereinigtem GST-FGFR1 in Kinaseverdünnungspuffer (5 ng Kinase/50 μl KDB/Well).
7. Zugabe von 50 μl der verdünnten Kinase zu jedem Well.
8. Starten der Kinasereaktion durch Zugabe von 25 μl frisch hergestelltem ATP/Mn²⁺ pro Well (0.4 ml 1 M MnCl₂, 40 μl 10 mM ATP, 9.56 ml dH₂O).
9. Dies ist eine schnelle Kinasereaktion und muss daher mit 25 μl 0.5 M EDTA gestoppt werden, in einer Weise ähnlich der Zugabe von ATP.
10. Viermaliges Waschen der Platte mit frischem TBST.
11. Herstellung von Antikörperverdünnungspuffer: Pro 50 ml werden 5 ml 5% BSA, 250 μl 5% Milch und 50 μl 100 mM Natriumvanadat gemischt und mit 0.05 TBST auf das Gesamtvolumen gebracht.
12. Zugabe von 100 μl anti-Phosphotyrosinantikörper pro Well (1:10000 Verdünnung in ADB). Inkubation unter Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
13. Waschen wie in Schritt 10.
14. Zugabe von 100 μl pro Well Biosource Ziege anti-Kaninchen IgG/Peroxidasekonjugat (1:6000 Verdünnung in ADB). Inkubation unter Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
15. Waschen wie in Schritt 10 und anschließend mit PBS, um Luftblasen und uberschüssiges TWEEN zu entfernen.
16. Zugabe von 100 μl ABTS/H₂O₂ Lösung zu jedem Well.
17. Inkubation unter Schütteln für 10-20 Minuten. Entfernen jeglicher Luftblasen.
18. Lesen des Assays mit einem Dynatech MR 7000 ELISA Lesegerät: Testfilter bei 410 nm, Referenzfilter bei 630 nm.

BEISPIEL 6: ZELLULÄRER HER-2 KINASEASSAY
Dieser Assay wird verwendet, um die Her-2 Kinaseaktivität in ganzen Zellen in einem ELISA-Format zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. DMEM (GIBCO Katalog # 11965-092).
2. Fötales Rinderserum (FBS, GIBCO Katalog # 1600-044), hitzeinaktiviert in einem Wasserbad für 30 min bei 56°C.
3. Trypsin (GIBCO Katalog # 25200-056).
4. L-Glutamin (GIBCO Katalog # 15630-080.
5. HEPES (GIBCO Katalog # 15630-080).
6. Wachstumsmedium: Mischen von 500 mL DMEM, 55 ml hitzeinaktiviertem FBS, 10 ml HEPES und 5.5 ml L-Glutamin.
7. Hungermedium (starve media): Mischen von 500 mL DMEM, 2.5 ml hitzeinaktiviertem FBS, 10 ml HEPES und 5.5 ml L-Glutamin.
8. PBS.
9. 96-Well Gewebekultur-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Coming Katalog # 25860).
10. 15 cm Gewebekulturschalen (Corning Katalog # 08757148).
11. Corning 96-Well ELISIA Platten.
12. NUNC 96-well Polypropylenplatten mit V-Boden.
13. Costar Transferkartuschen (cartridges) für den Transtar 96 (Costar Katalog # 7610).
14. SUMO 1: monoklonaler anti-EGFR Antikörper.
15. TBST Puffer
16. Blockierungspuffer: 5% Carnation Instant Milk^® in PBS.
17. EGF Ligand: EGF-201, Shinko American, japan. Suspensionspuder in 100 μl of 10 mM HCl. Zugabe von 100 μl 10 mM NaOH. Zugabe von 800 μl PBS und Transfer in ein Eppendorf-Röhrchen zur Lagerung bei –20°C.
18. HNTG Lysepuffer: Für eine 5 × HNTG Stammlösung: Mischen von 23.83 g Hepes, 43.83 g NaCl, 500 ml Glyzerin und 100 ml Triton X-100 and ausreichend dH₂O, um insgesamt 1 l Lösung herzustellen. Für 1 × HNTG*: Mischen von 2 ml HNTG, 100 μl 0.1 M Na₃VO₄, 250 μl 0.2 M Na₄P₂O₇ und 100 μl EDTA.
19. EDTA.
20. Na₃VO₄: Für die Herstellung einer Stammlösung: Mischen von 1.84 g Na₃VO₄ mit 90 ml dH₂O. Einstellen des pH auf 10. Aufkochen in der Mikrowelle für eine Minute (Lösung wird klar). Abkühlen auf Raumtemperatur. Einstellen des pH auf 10. Wiederholen des Heiz/Kühl-Zyklus, bis der pH bei 10 bleibt.
21. 200 mM Na₄P₂O₇.
22. Polyklonales Kaninchen Antiserum, spezifisch für Phosphotryrosine (anti-Ptyr Antikörper).
23. Affinitätsgereinigtes Antiserum, Ziege anti-Kaninchen IgG-Antikörper/Peroxidasekonjugat (Biosource Cat# ALI0404).
24. ABTS Lösung.
25. 30% Wasserstoffperoxidlösung.
26. ABTS/H₂O₂
27. 0.2 M HCl

Verfahren

1. Beschichten von Corning 96-Well ELISA Platten mit SUMO1 in einer Konzentation von 1.0 μg pro Well in PBS, 100 μL Gesamtvolumen/Well. Lagerung über Nacht bei 4°C.
2. Am Tag der Verwendung Entfernen des Beschichtungspuffers und dreimaliges Waschen der Platte mit dH₂O und einmaliges Waschen mit TBST Puffer. Alle Waschschritte in diesem Assay sollten auf dies Art erfolgen, außer es ist anders angegeben.
3. Zugabe von 100 μl Blockierungspuffer zu jedem Well. Inkubation der Platte unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Unmittelbar vor der Verwendung Waschen der Platte wie oben angegeben.
4. Verwenden einer EGFr/HER-2 Chimäre/3T3-C7 Zelllinie für diesen Assay.
5. Auswahl von Zellkulturgefäßen mit 80-90% Konfluenz, Ernten der Zellen durch Trypsinierung und Zentrifugation bei 1000 rpm bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
6. Resuspendieren der Zellen in Hungermedium und Zählen der Zellen mit Trypan Blau. Eine Lebensfähigkeit von mehr als 90% ist erforderlich. Aussäen der Zellen in Hungermedium in einer Dichte von 2500 Zellen pro Well, 90 μl pro Well in einer 96-Well Mikrotiterplatte. Inkubation der ausgesäten Zellen über Nacht bei 37°C unter 5% CO₂.
7. Starten des Assays 2 Tage nach dem Aussäen.
8. Verdünnung der Testverbindung:

Primäres Sceening:
Die Proben werden direkt in eine Polypropylenplatte verdünnt, welche Hunger-DMEM enthält. In Abhängigkeit von den zu screenenden Proben ist diese Verdünnung 1:10 oder höher. Die gleiche Menge an DMSO wird in die Kontrollwells gegeben. Alle Wells werden dann in einer 1:10 Verdünnung (10 μl Probe und Medium in 90 μl Hungermedium) in eine Zellplatte transferiert. Die Finale DMSO Konzentration beträgt 1% oder weniger.
Sekundäres Screening:
Zehn Proben werden in die Wells 2-11 von Reihe A einer Polypropylenplatte gegeben. Diese Wells enthalten lediglich Hunger-DMEM. Für eine 1:10 Verdünnung werden 10 μl der Lösung der Testverbindung in 90 μl Medium verwendet. Die übrigen Wells (einschließlich der Kontrollen) enthalten ein DMSO/Medien-Gemisch. Der Prozentsatz an DMSO in diesem Gemisch wird in dem ersten Verdünnungsfaktor bestimmt, zum Beispiel in diesem Beispiel 1:10. Die DMSO Konzentration beträgt daher 10%. Die gleiche Menge an Arzneimittel und Medium aus Reihe A wird in Reihe B gegeben, die DMSO und Medium enthält. Die gleiche Menge wird dann entnommen und in Reihe C gegeben etc. Dies sind 1:2 Verdünnungen. Alle Wells werden im Anschluss in einer 1:10 Verdünnung (10 μl Probe und Medium in 90 μl Hungermedium) in die Zellplatte gegeben. Die DMSO Endkonzentration beträgt 1% oder weniger.

9. Inkubation unter 5% CO₂ bei 37°C für 2 Stunden.
10. Herstellung des EGF Liganden durch Verdünnen der EGF-Stammlösung (16.5 μM) in warmem DMEM auf 150 nM.
11. Herstellung von frischem HNTG*, ausreichend für 100 μl pro Well. Inkubation auf Eis.
12. Nach 2 Stunden Inkubation mit der Testverbindung Zugabe des vorbereiteten EGF Liganten zu den Zellen, 50 μl pro Well, für eine Endkonzentration von 50 nM. Die gleiche Menge an EGF wird in die Wells der Positivkontrolle gegeben. Die Negativkontrollen enthalten kein EGF. Inkubation bei 37°C für 10 Minuten.
13. Entfernen von Testverbindung, EGF und DMEM. Einmaliges Waschen der Zellen mit PBS.
14. Transfer von HNTG* zu den Zellen, 100 μl pro Well. Inkubation auf Eis für 5 Minuten. Zwischenzeitlich Entfernen des Blockierungspuffers von der ELISA Platte und Waschen.
15. Abkratzen der Zellen von der Platte mit einer Pipettenspitze, die sicher in einer Mikropipette (micropipettor) fixiert ist, und Homogenisieren des Zellmaterials durch wiederholtes Ansaugen und Dispensieren des HNTG* Lysepuffers. Transfer des Lysats in eine beschichtete, blockierte und gewaschene ELISA Platte. Alternativ kann eine Costar Transferkartusche zum Transfer des Lysats in die ELISA Platte verwendet werden.
16. Inkubation unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
17. Entfernen des Lysats, Waschen. Transfer des frisch verdünnten anti-Ptyr Antikörpers (1:3000 in TBST) in die ELISA Platte, 100 μl pro Well.
18. Inkubation unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
19. Entfernen des anti-Ptyr Antikörpers, Waschen. Transfer des frisch verdünnten BIOSOURCE Antikörpers in die ELISA Platte (1:8000 in TBST, 100 μl pro Well).
20. Inkubation unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
21. Entfernen des BIOSOURCE Antikörpers, Waschen. Transfer einer frisch hergestellten ABTS/H₂O₂ Lösung in die ELISA Platte, 100 μl pro Well.
22. Inkubation unter Schütteln für 5-10 Minuten. Entfernen jeglicher Luftblasen.
23. Falls notwendig, Stoppen der Reaktion durch Zugabe von μl 0.2 M HCl pro Well.
24. Lesen des Assays mit einem Dynatech MR 7000 ELISA Lesegerät: Testfilter eingestellt auf 410 nm, Referenzfilter auf 630 nm.

BEISPIEL 7: CDK2/CYCLIN A ASSAY
Das nachfolgende Protokoll beschreibt das zur Analyse der Serin/Threonin-Proteinkinaseaktivität von CDK2/Cyclin A in einer SPA verwendete Verfahren. Die Methode beschreibt ferner das Protokoll für das initiale Screening von Arzneimitteln zur Inhibition oder Aktivierung der Kinaseaktivität.
Materialien und Reagenzien:

1. Wallec 96-Well Polyethylenterephtalat (flexi)-Platten (Wallec Katalog # 1450-401).
2. Amersham Redivue [γ³³P] ATP (Amersham Katalog # AH9968).
3. Amersham Streptavidin-beschichtete Polyvinyltolol-SPA-Partikel (Amersham Katalog # RPMQ0007). Rekonstituierte Partikel in PBS ohne Magnesium oder Calcium in einer Konzentration von 20 mg/ml. Lagerung der rekonstituierten Partikel bei 4°C.
4. Aktivierter CDK2/Cyclin A-Enzymkomplex, gereinigt aus SF9 Zellen, –80°C, 200 μl Aliquots.
5. Biotinyliertes Peptidsubstrat (deb-tide). Das Peptid Biotin-X-PKTPKKAKKL gelöst in dH₂O in einer Konzentration von 5 mg/ml. Lagerung bei –80°C in 100 μl Aliquots.
6. Peptid/ATP-Gemisch:
7. 2.5 × Kinasepuffer;
8. 10 mM ATP (Sigma Katalog # A-5394).
9. 1 M Tris, pH 7.4
10. 1 M MgCl₂
11. 1 M DTT
12. PBS (Dulbecco's phosphat-gepufferte Saline) ohne Magnesium oder Calcium (Gibco Katalog # 14190-144)
13. EDTA (14.12 g per 100 ml)
14. Stopplösung:

Verfahren:

1. Herstellen von Inhibitorlösungen in 5 × der gewünschten Endkonzentration in 5% DMSO. Zugabe von 10 μl zu jedem Well. Bei Negativkontrollen Zugabe von 10 μl 5% DMSO.
2. Verdünnen von 5 μl CDK2/Cyclin A Lösung in 2.1 ml 2 × Kinasepuffer (pro Platte).
3. Zugabe von 20 μl Enzym pro Well. Dies kann mit Hilfe einer Handpipette oder mit dem Titertek Multidrop erfolgen.
4. Zugabe von 10 μl 0.5 M EDTA zu den Wells der Negativkontrolle.
5. Um die Kinasereaktion zu starten, Zugabe von 20 μl Peptid/ATP-Gemisch mit Hilfe einer Handpipette oder des Titertek Multidrops. Inkubation auf der Laborbank hinter einer Radioaktivitätsabschirmung für 1 Stunde.
6. Zugabe von 200 μl Stopplösung pro Well mit Hilfe des Titertek Multidrops oder einer Handpipette.
7. Inkubation für mindestens 10 Minuten.
8. Zentrifugieren der Platte bei ungefähr 2300 rpm für 3-5 Minuten.
9. Zählen der Platte mit einem Trilux Lesegerät unter Verwendung von Protokoll # 28 (Brian's SPA Essay).

BEISPIEL 8: PDGF-R ELISA
Alle Zellkulturmedien, Glutamin und fötales Rinderserum werden von Gibco Life Technologie (Grand Island, NY) bezogen außer es ist etwas anders angegeben. Alle Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre mit 90 bis 95% Luft und 5-10% CO₂ bei 37°C angezogen. Alle Zelllinien wurden routinemäßig 2 × die Woche subkultiviert und waren negativ bezüglich Mycoplasmen, wie mit Hilfe des Mycotect-Verfahrens (Gibco) bestimmt.
Für ELISA Assays wurden die Zellen (U1242, erhalten von Joseph Schlessinger, NYU) bis zu einer Konfluenz von 80-90% in Wachstumsmedium (MEM mit 10% FBS, NEAA, 1 mM NaPyr und 2 mM GLN) angezogen und in 96-Well Gewebekulturplatten in 0.5% Serum in einer Dichte on 25000 bis 30000 Zellen pro Well ausgesät. Nach Inkubation über Nacht in 0.5% serum-haltigem Medium wurden die Zellen in serum-freies Medium überführt und 2 Stunden mit der Testverbindung in einem 5% CO₂, 37°C Inkubator behandelt. Die Zellen wurden im Anschluss für 5-10 Minuten mit dem Liganden stimuliert, gefolgt von der Lyse mit HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10% Glyzerin, 5 mM EDTA, 5 mM Na₃VO₄, 0.2% Triton X-100 und 2 mM NAPyr). Die Zelllysate (0.5 mg/Well in PBS) wurden auf ELISA Platten transferiert, welche zuvor mit einem rezeptor-spezifischen Antikörper beschichtet wurden, und die mit 5% Milch in TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl und 0.1% Triton X-100) bei Raumtemperatur für 30 Minuten geblockt wurden. Die Lysate wurden unter Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 4 × mit TBST gewaschen und anschließend mit einem polyklonalen anti-Phosphotyrosinantikörper 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiger anti-Phosphotyrosinantikörper wurde durch viermaliges Spülen der Platte mit TBST entfernt. Ein Ziege anti-Kaninchen IgG-Antikörper wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur zur ELISA Platte gegeben, gefolgt von viermaligem Spülen mit TBST. ABTS (100 mM Zitronensäure, 250 mM Na₂HPO₄ und 0.5mg/ml 2,2'-Azino-bis (3-etylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) plus H₂O₂ (1.2 ml 30%iges H₂O₂ auf 10 ml ABTS) wurde in die ELISA Platten gegeben, um die Farbentwicklung zu starten. Die Absorbtion bei 410 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm wurde etwa 15-30 Minuten nach ABTS-Zugabe analysiert.
Beispiel 9: IGF-1 Rezeptor ELISA
Das nachfolgede Protokoll nach verwendet werden, um das Phosphotyrosinniveau des IGF-1 Rezeptors zu messen, welches IGF-1 Rezeptor Tyrosinkinaseaktivität anzeigt.
Materialien und Reagenzien:
Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:

a. Die in diesem Assay verwendete Zelllinie ist 3T3/IGF-1R, eine Zelllinie, die genetisch modifiziert (engineered) wurde, um den IGF-1 Rezeptor überzuexprimieren.
b. NIH3T3/IGF-1R wird in einem Inkubator mit 5% CO2 bei 37°C angezogen. Das Wachstumsmedium ist DMEM plus 10% FBS (hitzeinaktiviert) plus 2 mM L-Glutamin.
c. Affinitätsgereinigter anti-IGF-1R Antikörper 17-69.
d. D-PBSS:

KH₂PO₄ 0.20 g/l

K₂HPO₄ 2.16 g/l

KCl 0.20 g/l

NaCg 8.00 g/l (pH 7.2)
e. Blocking Buffer: TBST plus 5% Milk (Carnation Instant Non-Fat Dry Milk).
f. TBST Puffer:

Tris-HCl 50 mM

NaCl 150 mM (pH 7.2/HCl 10 N)

Triton X-100 0.1%

Eine Stammlösung of TBS (10 ×) wird hergestellt, und Triton X-100 wird während der Verdünnung zum Puffer gegeben.
g. HNTG Buffer:

HEPES 20 mM

NaCl 150 mM (pH 7.2/HCl 1N)

Glyzerin 10%

Triton X-100 0.2%

Eine Stammlösung (5X) wird hergestellt und bei 4°C gelagert.
h. EDTA/HCl: 0.5 M pH 7.0 (NaOH) als 100 × Stammlösung.
i. Na₃VO₄: 0.5 M als 100 × Stammlösung. Aliquots werden bei –80°C gelagert.
j. Na₄P₂O₇: 0.2 M als 100 × Stammlösung.
k. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (insulin-like growth factor) von Promega (Ca# G5111).
l. Polyklonales Kaninchen anti-Phosphotyrosineantiserum.
m. Ziege anti-Kaninchen IgG/POD Konjugat(Detektionsantikörper), Tago (Kat. Nr. 4520, Lot Nr. 1802): Tago, Inc. Burlingame, CA.
n. ABTS (2,2'-Azinobis (3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) Lösung:

Zitronensäure 100 mM

Na₂HPO₄ 250 mM (pH 4.0/1 N HCl)

ABTS 0.5 mg/ml

Die ABTS Lösung sollte dunkel und bei 4°C aufbewahrt werden. Die Lösung sollte entsorgt werden, wenn sie sich grün verfärbt.
o. Wasserstoffperoxid: 30% Lösung, wird dunkel und bei 4°C aufbewahrt.

Verfahren:
Alle nachfolgenden Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, außer es ist speziell angegeben. Alle Waschschritte der ELISA Platte werden durch dreimaliges Spülen der Platte mit Leitungswasser (tap water), gefolgt von einmaligem Spülen mit TBST durchgeführt. Die Platte wird durch Ausklopfen auf Papiertüchern getrocknet.
A. Aussäen der Zellen:

1. Die Zellen, die in einer Gewebekulturschale (Corning 25020-100) bis zu einer Konfluenz von 80-90% angezogen wurden, werden mit Trypsin-EDTA (0.25, 0.3 ml/D-100, Gibco) geerntet.
2. Resuspendieren der Zellen in frischem DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin und Transfer in eine 96-Well Gewebekulturplatte (Corning 25806-96) in einer Dichte von 20000 Zellen/Well (100 μl/Well). Inkubation für 1 Tag, anschließend Medienwechsel zu serumfreiem Medium (90 μl) und Inkubation bei 5% CO₂ und 37°C über Nacht.

B. Beschichten und Blockieren der ELISA Platte:

1. Beschichten der ELISA Platte (Corning 25805-96) mit anti-IGF-1R Antikörper in einer Konzentration von 0.5 μg/Well in 100 μl PBS für mindestens 2 Stunden.
2. Entfernen der Beschichtungslösung und Ersetzen mit 100 μl Blockierungspuffer und Schütteln für 30 Minuten. Entfernen des Blockierungspuffers und Waschen der Platte unmittelbar vor der Zugabe des Lysats.

C Assayverfahren:

1. Die Arzneimittel werden unter serumfreien Bedingungen getestet.
2. Verdünnung der Arzneimittelstammlösung (in 100 DMSO) 1:10 mit DMEM in einer 96-Well Polypropylenplatte und Transfer von 10 μl pro Well dieser Lösung zu den Zellen, um eine finale Arzneimittelverdünnung von 1:100 und eine finale DMSO-Konzentration von 1.0% zu erreichen. Inkubation der zellen bei 5% CO₂ und 37°C für 2 Stunden.
3. Herstellung von frischem Zelllysepuffer (HNTG*) HNTG 2 ml EDTA 0.1 ml Na₃VO₄ 0.1 ml Na₄ (P₂O₇) 0.1 ml H₂O 7.3 ml
4. Nach Arzneimittelinkubation für 2 Stunden Transfer von 10 μl/Well 200 nM IGF-1 Ligand in PBS zu den Zellen (Endkonzentration 20 nM) und Inkubation bei 5% CO₂ und 37°C für 10 Minuten.
5. Entfernen des Mediums und Zugabe von 100 μl HNTG*/Well und Schütteln für 10 Minuten. Betrachtung der Zellen unter dem Miktroskop, um zu beurteilen, ob sie adäquat lysiert sind.
6. Verwenden einer Zwölfkanalpipette, um die Zellen von der Platte zu kratzen, und Homogenisieren des Lysats durch wiederholtes Ansaugen und Dispensieren. Transfer des gesamten Lysats in die mit Antikörper beschichtete ELISA Platte und Schütteln für 1 Stunde.
7. Entfernen des Lysats, Waschen der Platte, Transfer von 100 μl/Well anti-pTyr Antikörper (1:3000 mit TBST) und Schütteln für 30 Minuten.
8. Entfernen des anti-pTyr Antikörpers, Waschen der Platte, Transfer von 100 μl/Well TAGO (1:3000 mit TBST) und Schütteln für 30 Minuten.
9. Entfernen des Detektionsantikörpers, Waschen der Platte und Transfer von 100 μl/Well frischem ABTS/H₂O₂ (1.2 μl H₂O₂ auf 10 ml ABTS) zur Platte, um die Farbentwicklung zu starten.
10. Messen der OD bei 410 nm mit einer Referenzwellenlänge von 360 nm in einem Dynatec MR 5000.

BEISPIEL 10: EGF REZEPTOR ELISA
Die EGF Rezeptor-Kinaseaktivität in Zellen, die genetisch modifiziert wurden, um den humanen EGF-R zu exprimieren, wurde wie nachfolgend beschrieben gemessen.
Materialien und Reagenzien:
Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:

a. EGF Ligand: Konzentration der Stammlösung =16.5 μM; EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japan.
b. 05-101 (UBI) (ein monoklonaler Antikörper, der eine extrazelluläre EGFR Domäne erkennt).
c. anti-Phosphotyrosinantikörper (anti-Ptyr)(polyklonal).
d. Detectionsantikörper: Ziege anti-Kaninchen IgG Meerrettichperoxidase-Konjugat, TAGO, Inc. Burlingame, CA.
e. TBST Puffer:

Tris-HCl, pH 7 50 mM

NaCl 150 mM

Triton X-100 0.1
f. HNTG 5 × Stammlösung:

HEPES 0.1 M

NaCl 0.75 M

Glyzerin 50

Triton X-100 1.0%
g. ABTS Stammlösung:

Zitronensäure 100 mM

Na₂HPO4₄ 250 mM

HCl, konz. 4.0 pH

BTS 0.5 mg/ml

Aufbewahren der Lösung im Dunkeln bei 4°C bis zur Verwendung.
h. Reagenzstammlösungen von:

EDTA 100mM pH 7.0

Na₃VO₄ 0.5 M

Na₄(P₂O₇) 0.2 M

Verfahren
Das folgende Protokoll wurde verwendet:
A. Präbeschichtung der ELISA Platte:

1. Beschichten von ELISA Platten (Corning, 96-Well, Katalog # 25805-96) mit 0.5μg/Well 05-101 Antikörper in PBS, 150 μl Endvolumen pro Well und Lagerung über Nacht bei 4°C. Beschichtete Platten können bis zu 10 Tagen aufbewahrt werden, wenn sie bei 4°C gelagert werden.
2. Am Tag der Verwendung Entfernen des Beschichtungspuffers und Ersetzen durch Blockierungspuffer (5% Carnation fettfreie Instanttrockenmilch in PBS). Inkubation der Platte unter Schütteln bei Raumtemperatur (etwa 23°C-25°C) für 30 Minuten. Unmittelbar vor der Verwendung Entfernen des Blockierungspuffers und viermaliges Waschen der Platte mit TBST Puffer.

B. Aussäen der Zellen:

1. Die Zelllinie NIH 3T3/C7 (Honegger, et al., Cell 51: 199-209, 1987) kann für diesen Assay verwendet werden.
2. Auswählen von Zellkulturgefäßen mit 80-90% Konfluenz für das Experiment. Trypsinieren der Zellen und Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 10% CS DMEM Medium. Suspendieren der Zellen in DMEM Medium (10% CS DMEM Medium) und einmaliges Zentrifugieren bei 1000 rpm bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
3. Resuspendieren der Zellen in Medium zum Aussäen (DMEM, 0.5% Rinderserum) und Zählen der Zellen unter Verwendung von Trypan Blau. Eine Lebensfähigkeit von mehr als 90% ist akzeptabel. Aussäen der Zellen in DMEM Medium (0.5% Rinderserum) in einer Dichte von 10000 Zellen pro Well, 100 μl pro Well, in einer 96-Well Mikroteterplatte. Inkubation der ausgesäten Zellen in 5% CO₂ bei 37°C für etwa 40 Stunden.

C. Assayverfahren:

1. Untersuchen der ausgesäten Zellen auf Kontaminationen mit Hilfe eines Inversmikroskops. Verdünnen der Arzneimittelstammlösung (10 mg/ml in DMSO) 1:10 in DMEM Medium, anschließend Transfer von 5 μl in ein Testwell, um eine finale Arzneimittelverdünnung von 1:200 und eine DMSO Endkonzentration von 1% zu ergeben. Die Kontrollwells enthalten nur DMSO. Inkubation bei 5% CO₂ und 37°C für eine Stunde.
2. Herstellung des EGF Liganden: Verdünnen der EGF Stammlösung in DMEM, sodass nach Transfer von 10 μl verdünntem EGF (1:12 Verdünnung) eine Endkonzentration von 25 nM erreicht wird.
3. Herstellung von 10 ml frischem HNTG*, ausreichend für 100 μl/Well, wobei HNTG* umfasst: HNTG Stammlösung (2.0 ml), Milli-Q H₂O (7.3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7.0 (0.5 ml), Na₃VO₄ 0.5 M (0.1 ml) und Na₄(P₂O₇), 0.2 M (0.1 ml).
4. Inkubation auf Eis.
5. Nach 2 Stunden Inkubation mit dem Arzneimittel Zugabe des vorbereiteten Liganden zu den Zellen, 10 μl/Well, um eine Endkonzentration von 25 nM zu ergeben. Die Kontrollwells enthalten nur DMEM. Inkubation unter Schütteln bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
6. Entfernen von Arzneimittel, EGF und DMEM. Zweimaliges Waschen der Zellen mit PBS. Transfer von 100 μl/Well HNTG* zu den Zellen. Inkubation auf Eis für 5 Minuten. Währenddessen Entfernen des Blockierungspuffers von der anderen ELISA Platte und Waschen mit TBST wie oben beschrieben.
7. Abkratzen der Zellen mit einer Pipettenspitze, die sicher an einer Mikropipette befestigt ist, und Homogenisieren des Zellmaterials durch wiederholtes Ansaugen und Dispensieren des HNTG* Lysepuffers. Transfer des Lysats in eine beschichtete, blockierte und gewaschene ELISA Platte. Inkubation unter Schütteln bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
8. Entfernen des Lysats und viermaliges Waschen mit TBST. Transfer von 100 μl/Well frisch verdünntem anti-Ptyr Antikörper in die ELISA Platte. Inkubation unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten in der Gegenwart des anti-pTyr Antiserums (1:3000 Verdünnung in TBST).
9. Entfernen des anti-pTyr Antikörpers und viermaliges Waschen mit TBST. Transfer von 100 μl/Well des frisch verdünnten TAGO 30 anti-Kaninschen IgG Antikörpers in die ELISA Platte. Inkubation unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 Minuten (anti-Kaninchen IgG-Antikörper: 1:3000 Verdünnung in TBST).
10. Entfernen des Detektionsantikörpers und viermaliges Waschen mit TBST. Transfer von 100 μl/Well frisch hersgestellter ABTS/H₂O₂ Lösung in die ELISA Platte. Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten. ABTS/H₂O₂ Lösung: 1.2 μl 30%iges H₂O₂ in 10ml ABTS Stammlösung.
11. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 50 μl 5 N Schwefelsäure (optional) und Bestimmen der OD bei 410 nm.
12. Das maximale Phophotyrosinsignal wird durch Subtraktions des Werts der Negativkontrollen von den Positivkontrollen bestimmt. Die prozentuale Hemmung des Phophotyrosingehalts für extrakt-enthaltende Wells wird nach Subtraktion der Negativkontrollen im Anschluss bestimmt.

BEISPIEL 11: MET AUTOPHOPHORYLIERUNGSASSAY ELISA
Dieser Assay bestimmt die Met-Tyrosinkinaseaktivität durch Analyse der Met-Proteintyrosinkinaseniveaus bezüglich des Met Rezeptors.
Materialien und Reagenzien:
Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:

a. HNTG (5 × Stammlösung): Lösen von 23.83 g HEPES und 43.83 g NaCl in etwa 350 ml dH₂O. Einstellen des pH auf 7.2 mit HCl oder NaOH, Zugabe von 500 ml Glyzerin und 10 ml Triton X-100, Mischen, Zugabe von dH₂O bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter. Zur Herstellung von einem Liter 1 × Arbeitslösung Zugabe von 200 ml 5 × sStammlösung zu 800 ml dH₂O, Überprüfen und Einstellen des pH, sofern notwendig, Lagerung bei 4°C.
b. PBS (Dulbecco's phosphat-gepufferte Saline), Gibco Katalog # 450-1300EB (1 × Lösung).
c. Blockierungspuffer: zu 500 ml dH₂O werden 100 g BSA, 12.1 g Tris, pH 7.5, 58.44 g NaCl und 10 ml Tween-20 gegeben und auf 1 l Gesamtvolumen verdünnt.
d. Kinasepuffer: Zu 500ml dH₂O werden 12.1 g Tris, pH 7.2, 58.4 g NaCl, 40.7 g MgCl₂ und 1.9 g EGTA gegeben und mit dH₂O auf 1 l Gesamtvolumen gebracht.
e. PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), Sigma Katalog # P-7626, zu 435.5 mg wird 100 Ethanol bis zu einem Gesamtvolumen von 25 ml gegeben, Vortexen.
f. ATP (bakterielle Quelle), Sigma Katalog # A-7699, Lagerung des Pulvers bei –20°C, zur Herstllung einer Arbeitslösung werden 3.31 mg in 1 ml dH₂O gelöst.
g. RC-20H HRPO-konjugierter anti-Phophotyrosinantikörper, Transductions Labaratories Katalog # E120H.
h. Pierce 1-Step^TM Turbo-ELISA (3,3',5,5'-Tetrametylbenzidin, Pierce Katalog # 34002).
i. H₂SO₄, Zugabe von 1 ml konzentrierter Schwefelsäure (18 N) zu 35 ml dH₂O.
j. Tris/HCl, Fischer Katalog # BP152-5, zu 121.14 g werden 600 ml Milli-Q H₂O gegeben, der pH wird auf 7.5 (oder 7.2) mit HCl eingestellt, das Gesamtvolumen wird mit Milli-Q H₂O auf 1 l eingestellt.
k. NaCl, Fischer Katalog # S271-10, Herstellung einer 5 M Lösung.
l. Tween-20, Fischer Katalog # S337-500.
m. Na₃VO₄, Fischer Katalog # S454-50, zu 1.8 g werden 80 ml Milli-Q H₂O gegeben, Einstellen des pH auf 10.0 mit HCl oder NaOH, Aufkochen in der Mikrowelle, Abkühlen, Überprüfen des pH, Wiederholen des Verfahrens, bis der pH stabil bei 10.0 bleibt, Zugabe von Milli-Q H₂O bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml, Herstellung von 1 ml Aliquots und Lagerung bei –80°C.
n. MgCl₂, Fischer Katalog # M33-500, Herstellung einer 1 M Lösung.
o. HEPES, Fischer Katalog # BP310-500, zu 200 ml Milli-Q H₂O werden 59.6 g gegeben, Einstellen des pH auf 7.5, Einstellen des Gesamtvolumens auf 250 ml, Sterilfiltration.
p. Bovines Albumin (BSA), Sigma Katalog # A-4503, zu 30 g wird steriles destiliertes Wasser gegeben, um ein Gesamtvolumen von 300 ml zu erreichen, Lagerung bei 4°C.
q. TBST Puffer: Zu ungefähr 900 ml dH₂O in einem graduierten 1 l-Zylinder werden 6.057 g Tris und 8.766 g NaCl gegeben; wenn diese gelöst sind, Einstellen des pH auf 7.2 mit HCl, Zugabe von 1.0 ml Triton X-100 und Einstellen des Gesamtvolumens auf 1 l mit dH₂O.
r. Affinitätsgereinigter Ziege-anti-Kaninchen IgG-Antikörper (gesamtes Molekül), Cappel Kat. # 55641.
s. Polyklonaler anti-h-Met (C-28) Kaninchen IgG-Antikörper, Santa Cruz Chemical, Kat. # SC-161.
t. Transient transfizierte EGFR/Met chimäre Zellen (EMR) (Komada et al., Oncogene 8: 2381-2390 (1993)).
u. Natriumcarbonatpuffer (Na₂CO₄, Fischer Kat. # S495): Zu 10.6 g werden 800 ml Milli-Q H₂O gegeben; wenn dieses gelöst ist, Einstellen des pH auf 9.6 mit NaOH, Einstellen des Gesamtvolumens auf 1 l mit Milli-Q H₂O, Filtration, Lagerung bei 4°C.

Verfahren
Alle nachfolgenden Schritte werden bei Raumtemepratur durchgeführt, außer es ist etwas anderes angegeben. Alle Waschschritte der ELISA Platte werden durch viermaliges Spülen mit TBST durchgeführt.
A. EMR Lyse:
Dieses Verfahren kann in der Nacht vor oder unmittelbar vor dem Start der Rezeptorimmobilisierung durchgeführt werden.

1. Schnelles Auftauen der Lysate in einem 37° Wasserbad unter schüttelnder Bewegung, bis die letzten Kristalle verschwinden.
2. Lyse des Zellpeletts mit 1 × HNTG mit 1 ml PMSF. Verwenden von 3 ml HNTG pro 15 cm Zellkulturschale. Zugabe der Hälfte des kalkulierten HNTG Volumens, Vortexen des Röhrchens für 1 Minute, Zugabe der verbliebenen Menge an HNTG, vortexen für eine weitere Minute.
3. Ausbalancieren der Röhrchen, Zentrifugieren bei 10000 × g und 4°C für 10 Minuten.
4. Vereinigen der Überstände, Entnahme eines Aliquots zur Proteinbestimmung.
5. Schnelles Einfrieren der vereinigten Proben in einem Trockeneis/Ethanol-Bad. Dieser Schritt wird unabhängig davon durchgeführt, ob das Lysat über Nacht gelagert oder unmittelbar nach der Proteinbestimmung verwendet wird.
6. Duchführung einer Proteinbestimmung mit Hilfe eines Standard Bicinchoninsäure (BCA)-Verfahrens (BCA Assay Reagent Kit von Pierce Chemical, Kat. # 23225).

B. ELISA Vefahren:

1. Beschichten von Corning 96-Well ELISA Platten mit 5 μg/Well Ziege-anti-Kaninchen Antikörper in Carbonatpuffer in einem Gesamtvolumen von 50 μl pro Well. Lagerung über Nacht bei 4°C.
2. Entfernen des ungebundenen Ziege-anti-Kaninchenantikörpers durch Umdrehen der Platte, um die Flüssigkeit zu entfernen.
3. Zugabe von 150 μl Blockierungspuffer zu jedem Well. Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln.
4. Viermaliges Waschen mit TBST. Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Luftblasen zu entfernen.
5. Zugabe von 1 μg/Well Kaninchen-anti-Met-Antikörper, verdünnt in TBST, in einem Gesamtvolumen von 100 μl/Well.
6. Verdünnen des Lysats in HNTG (90 μg Lysat/100 μl).
7. Zugabe von 100 μl verdünntem Lysat zu jedem Well. Schütteln bei Raumtemperatur für 60 Minuten.
8. Viermaliges Waschen mit TBST. Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssgkeit und Luftblasen zu entfernen.
9. Zugabe von 50 μl Lysepuffer/Well.
10. Verdünnen der Verbindungen/Extrakte 1:10 in 1 × Kinasepuffer in einer 96-Well Polypropylenplatte.
11. Transfer von 5.5 μl verdünntem Arzneimittel in die Wells einer ELISA Platte. Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln für 20 Minuten.
12. Zugabe von 5.5 μl 60 μM ATP-Lösung pro Well. Die Negativkontrollen enthalten kein ATP. Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln für 90 Minuten.
13. Viermaliges Waschen mit TBST. Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Luftblasen zu entfernen.
14. Zugabe von 100 μl pro Well RC20 Antikörper (1:3000 Verdünnung in Blockierungspuffer). Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln.
15. Viermaliges Waschen mit TBST. Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit und Luftblasen zu entfernen.
16. Zugabe von 100 μl/Well Turbo-TMB. Inkubation unter Schütteln für 30-60 Minuten.
17. Zugabe von 100 μL 1 M H₂SO₄ pro Well, um die Reaktion zu stoppen.
18. Lesen des Assays mit einem Dynatech MR 7000 ELISA Lesegerät. Testfilter bei 450 nm, Referenzfilter bei 410 nm.

BEISPIEL 12: BIOCHEMISCHER SRC ELISA-ASSAY
Dieser Essay wird verwendet, um die Src-Proteinkinaseaktivität zu messen, welche die Phosphorylierung eines biotinylierten Peptids als Ausgabegröße bestimmt.
Materialen und Reagenzien:
Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:

a. Hefe transformiert mit.
b. Zelllysate: Hefezellen, welche src expremieren, werden pelletiert, einmal mit Wasser gewaschen, repelletiert und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
c. N-terminal biotinyliertes EEEYEEYEEEYEEEYEEEY wird mittels Fachleuten bekannter Standardverfahren hergestellt.
d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.
e. 96-Well ELISA Platte: Corning 96 Well Easy Wash, modifizierte Platte mit flachem Boden, Corning Katalog # 25805-96.
f. NUNC 96-Well Polypropylenplatten mit V-Boden für die Verdünnung von Verbindungen: Applied Scientific Katalog # A-72092.
g. Vecastain ELITE ABC Reagenz: Vektor, Burlingame, CA.
h. anti-src (372) mAB: Schizosaccharomyces pombe wurde verwendet, um rekombinantes Src zu exprimieren (Superti-Furga, et al., EMBO J. 12: 2625-2634; Superti-Furga, et al., Nature Biochem. 14: 600-605.). S. pombe Stamm SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) wurde wie beschrieben angezogen, und Transformationen mit den pRSP Expressionsplasmiden wurden mit Hilfe des Lithiumacetat-Verfahrens (Superti-Furga, supra) durchgeführt. Die Zellen wurden in der Gegenwart von 1 μM Thiamin angezogen, um die Expression vom nmtl Promotor zu reprimieren, oder in Abwesenheit von Thiamin, um die Expression zu induzieren.
i. Monoklonaler anti-Phosphotyrosinantikörper, UBI 05-321 (stattdessen kann UB40 verwendet werden).
j. Turbo TMB ELISA Peroxidasesubstrat: Pierce Chemical.

Pufferlösungen:

a. PBS (Dulbecco's Phosphat-gepufferte Saline), GIBCO PBS, GIBCO Katalog # 450-1300EB.
b. Blockierungspuffer: 5% fettfreie Milch (Carnation) in PBS.
c. Carbonatpuffer: Na₂CO₄ von Fischer, Kat. # S495, Herstellung einer 100 mM Stammlösung.
d. Kinasepuffer: 1.0 ml (einer 1 M Stammlösung) MgCl₂, 0.2 ml (einer 1 M Stammlösung) MnCl₂, 0.2 ml (einer 1 M Stammlösung) DTT, 5.0 ml (einer 1 M Stammlösung) HEPES und 0.1 ml TX-100, mit Milli-Q H₂O auf 1 l Gesamtvolumen bringen.
e. Lysepuffer: 5.0 ml HEPES (einer 1 M Stammlösung), 2.74 ml (einer 5 M Stammlösung), 10 ml Glyzerin, 1.0 ml TX-100, 0.4 ml EDTA (einer 100 mM Stammlösung), 1.0 ml PMSF (einer 100 mM Stammlösung), 0.1 ml Na₃VO₄ (einer 0.1 M Stammlösung), mit Milli-Q H₂O auf 100 ml Gesamtvolumen bringen.
f. ATP: Sigma Katalog # A-7699, Herstellen einer 10 mM Stammlösung (5.51 mg/ml).
g. Tris/HCl, Fischer Katalog # BP152-5, zu 600 ml Milli-Q H₂O werden 121.14 g gegeben, der pH wird auf 7.5 mit HCl eingestellt, das Gesamtvolumen wird mit Milli-Q H₂O auf 1 l eingestellt.
h. NaCl, Fischer Katalog # S271-10, Herstellung einer 5 M Lösung.
i. Na₃VO₄, Fischer Katalog # S454-50, zu 80 ml Milli-Q H₂O werden 1.8 g gegeben, Einstellen des pH auf 10.0 mit HCl oder NaOH, Aufkochen in der Mikrowelle, Abkühlen, Überprüfen des pH, Wiederholen des Verfahrens, bis der pH nach dem Erhitzen/Abkühlen-Zyklus stabil bei 10.0 bleibt, Zugabe von Milli-Q H₂O bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml, Herstellung von 1 ml Aliquots und Lagerung bei –80°C.
j. MgCl₂, Fischer Katalog # M33-500, Herstellung einer 1 M Stammlösung mit Milli-Q H₂O.
k. HEPES, Fischer Katalog # BP310-500, zu 200 ml Milli-Q H₂O werden 59.6 g gegeben, Einstellen des pH auf 7.5, Einstellen des Gesamtvolumens auf 250 ml mit Milli-Q H₂O, Sterilfiltration.
l. TBST Puffer: Zu 900 ml dH₂O werden 6.075 g TRIS und 8.766 g Natriumchlorid gegeben, Einstellen des pH auf 7.2 mit HCl, Zugabe von 1.0 mL Tritron-X100, Einstellen des Gesamtvolumens auf 1 l mit dH₂O.
m. MnCl₂: Fischer Katalog # M87-100, Herstellen einer 1 M Stammlösung mit Milli-Q H₂O.
n. DTT: Fischer Katalog # BP-172-5.
o. TBS (TRIS-gepufferte Saline): Zu 900 ml Milli-Q H₂O werden 6.057 g TRIS und 8.77 g NaCl gegeben, Einstellen des Gesamtvolumens auf 1 l mit Milli-Q H₂O.
p. Kinasereaktionsgemisch: Menge pro Assayplatte (100 Wells): 1.0 ml Kinasepuffer, 200 μg GST-ζ, Einstellen des Gesamtvolumens auf 8.0 ml mit Milli-Q H₂O.
q. Biotin-markiertes EEEYEEYEEEYEEEYEEEY: Herstellen einer frischen Peptidstammlösung (1 mM, 2.98 mg/ml) unmittelbar vor der Verwendung.
r. Vectastain ELITE ABC Reagenz: Um 14 ml Arbeitsreagenz herzustellen, wird ein Tropfen von Reagenz A zu 15 ml TBST gegeben, und das Röhrchen wird zum Mischen mehrere Male umgedreht. Im Anschluss wird ein Tropfen Reagenz B zugegeben. Das Röhrchen wird auf einen Orbitalschüttler gegeben und 30 Minuten gemischt.

Verfahren
A. Herstellung einer mit src beschichteten ELISA Platte:

1. Beschichten der ELISA Platte mit 0.5 μg/Well anti-src mAB in 100 μl Natriumcarbonatpuffer, pH 9.6 bei 4°C über Nacht.
2. Einmaliges Waschen der Wells mit PBS.
3. Blockieren der Platte mit 0.15 ml 5% Milch in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Fünfmaliges Waschen der Wells mit PBS.
5. Zugabe von 10 μg/Well mit src transformierter Hefelysate, verdünnt in Lysepuffer (0.1 ml Gesamtvolumen pro Well). (Die Menge an Lysat kann zwischen den Chargen variieren.) Schütteln der Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

B. Herstellung einer mit Phosphotyrosinantikörper beschichteten ELISA Platte:

1. 4G10 Platte: Beschichten mit 0.5 μg/Well 4G10 in 100 μl PBS bei 4°C über Nacht und Blockieren mit 0.15 ml 5% Milch in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

C. Kinaseassayverfahren:

1. Entfernen der ungebundenen Proteine von den obigen Schritten 1-7 und fünfmaliges Waschen der Platten mit PBS.
2. Zugabe von 0.08 ml Kinasereaktionsgemisch pro Well (enthält 10 μl 10 × Kinasepuffer und 10 μM (Endkonzentration) Biotin-EEEYEEYEEEYEEEYEEEY pro Well, verdünnt in Wasser).
3. Zugabe von 10 μl Verbindung, verdünnt in Wasser mit 10% DMSO, und Präinkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Starten der Kinasereaktion durch Zugabe von 10 μl/Well 0.05 mM ATP in Wasser (5 μM ATP Endkonzentration).
5. Schütteln der ELISA Platte für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Stoppen der Kinasereaktion durch Zugabe von 10 μl 0.5 M EDTA pro Well.
7. Transfer von 90 μl Überstand in eine blockierte 4G10-beschichtete ELISA Platte aus dem obigen Abschnitt B.
8. Inkubation unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
9. Fünfmaliges Waschen der Platte mit TBST.
10. Inkubation mit Vectastain ELITE ABC-Reagenz (100 μl/Well) für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Fünfmaliges Waschen der Platte mit TBST.
12. Entwickeln mit Turbo-TMB.

EXAMPLE 13: BIOCHEMISCHER LCK ELISA-ASSAY
Dieser Assay wird verwendet, um die lck Proteinkinaseaktivitäten zu messen, indem die Phsphorylierung von GST-ζ als Ausgabegröße gemessen wird.
Materialien und Reagenzien:
Die folgenden Materialien und Reagenzien wurden verwendet:

a. Hefe transformiert mit lck. Schizosaccharomyces pombe wurde verwendet, um rekombinantes Lck zu exprimieren (Superti-Furga, et al., EMBO J. 12: 2625-2634; Superti-Furga, et al., Nature Biochem. 14: 600-605.). S. pombe Stamm SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) wurde wie beschrieben angezogen, und Transformationen mit den pRSP Expressionsplasmiden wurden mit Hilfe des Lithiumacetat-Verfahrens (Superti-Furga, supra) durchgeführt. Die Zellen wurden in der Gegenwart von 1 μM Thiamin angezogen, um die Expression zu induzieren.
b. Zelllysate: Hefezellen, die lck exprimieren, werden pelletiert, einmal in Wasser gewaschen, repelletiert und bis zur Verwendung bei –80°C eingefroren
c. GST-ζ: Die DNA, die das GST-ζ Fusionsprotein zur Expression in Bakterien kodiert, wurde von Arthur Weiss, Howard Hughes Medical Institute an der University of California, San Francicsco bezogen. Transformierte Bakterien wurde über Nacht unter Schütteln bei 25°C angezogen. GST-ζ wurde mittels Glutathion-Affinitätschromatographie (Pharmacia, Alameda, CA) gereinigt.
d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.
e. 96-Well ELISA Platte: Corning 96-Well Easy Wash, modifizierte Platte mit flachem Boden, Corning Kat. # 25805-96.
f. NUNC 96-Well Polypropylenplatten mit V-Boden für die Verdünnung der Verbindungen. Applied Scientific Kat. # AS-72092.
g. Gereinigtes Kaninchen-anti-GST Antiserum: Amrad Corporation (Australien) Kat. # 90001605.
h. Ziege anti-Kaninchen IgG-HRP: Amersham Kat. V010301. i. Schaf anti-Maus IgG (H + L): Jackson Labs Kat. # 5215-005-003.
j. anti-Lck (3A5) mAB: Santa Cruz Biotechnology Kat. # sc-433.
k. Monoklonaler anti-Phosphotyrosin UBI 05-321 (UB40 kann stattdessen verwendet werden).

Pufferlösungen:

a. PBS (Dulbecco's phosphat-gepufferte Saline), 1 × Lösung, GIBCO PBS, GIBCO Katalog # 450-1300EB.
b. Blockierungspuffer: 100 g BSA, 12.1 g Tris, pH 7.5, 58.44 g NaCl, 10 ml Twen-20, Einstellen von 1 l Gesamtvolumen mit Milli-Q H₂O.
c. Carbonatpuffer: Na₂CO₄ von Fischer, Kat. # S495, Herstellung einer 100 mM Stammlösung Milli-Q H₂O.
d. Kinasepuffer: 1.0 ml (einer 1 M Stammlösung) MgCl₂, 0.2 ml (einer 1 M Stammlösung) MnCl₂, 0.2 ml (einer 1 M Stammlösung) DTT, 5.0 ml (einer 1 M Stammlösung) HEPES und 0.1 ml TX-100, mit Milli-Q H₂O auf 1 l Gesamtvolumen bringen.
e. Lysepuffer: 5.0 ml HEPES (einer 1 M Stammlösung), 2.74 ml (einer 5 M Stammlösung), 10 ml Glyzerin, 1.0 ml TX-100, 0.4 ml EDTA (einer 100 mM Stammlösung), 1.0 ml PMSF (einer 100 mM Stammlösung), 0.1 ml Na₃VO₄ (einer 0.1 M Stammlösung), mit Milli-Q H₂O auf 100 ml Gesamtvolumen bringen.
f. ATP: Sigma Katalog # A-7699, Herstellen einer 10 mM Stammlösung (5.51 mg/ml).
g. Tris/HCl, Fischer Katalog # BP152-5, zu 600 ml Milli-Q H₂O werden 121.14 g gegeben, der pH wird auf 7.5 mit HCl eingestellt, das Gesamtvolumen wird mit Milli-Q H₂O auf 1 l eingestellt.
h. NaCl, Fischer Katalog # S271-10, Herstellung einer 5 M Lösung.
i. Na₃VO₄, Fischer Katalog # S454-50, zu 80 ml Milli-Q H₂O werden 1.8 g gegeben, Einstellen des pH auf 10.0 mit HCl oder NaOH, Aufkochen in der Mikrowelle, Abkühlen, Überprüfen des pH, Wiederholen des Verfahrens, bis der pH nach dem Erhitzen/Abkühlen-Zyklus stabil bei 10.0 bleibt, Zugabe von Milli-Q H₂O bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml, Herstellung von 1 ml Aliquots und Lagerung bei –80°C.
j. MgCl₂, Fischer Katalog # M33-500, Herstellung einer 1 M Stammlösung mit Milli-Q H₂O.
k. HEPES, Fischer Katalog # BP310-500, zu 200 ml Milli-Q H₂O werden 59.6 g gegeben, Einstellen des pH auf 7.5, Einstellen des Gesamtvolumens auf 250 ml mit Milli-Q H₂O, Sterilfiltration.
l. Bovines Albumin (BSA), Sigma Kat. # A4503, zu 150 ml Milli-Q H₂O werden 30 g gegeben, Einstellen von 300 ml Gesamtvolumen mit Milli-Q H₂O, Filtration durch 0.22 μm Filter, Lagerung bei 4°C.
m. TBST Puffer: Zμ 900 ml dH₂O werden 6.075 g TRIS und 8.766 g Natriumchlorid gegeben, Einstellen des pH auf 7.2 mit HCl, Zugabe von 1.0 mL Tritron-X100, Einstellen des Gesamtvolumens auf 1 l mit dH₂O.
n. MnCl₂: Fischer Katalog # M87-100, Herstellen einer 1 M Stammlösung mit Milli-Q H₂O.
o. DTT: Fischer Katalog # BP-172-5.
p. TBS (TRIS-gepufferte Saline): Zu 900 ml Milli-Q H₂O werden 6.057 g TRIS und 8.77 g NaCl gegeben, Einstellen des Gesamtvolumens auf 1 l mit Milli-Q H₂O.
q. Kinasereaktionsgemisch: Menge pro Assayplatte (100 Wells): 1.0 ml Kinasepuffer, 200 μg GST-ζ, Einstellen des Gesamtvolumens auf 8.0 ml mit Milli-Q H₂O.

Verfahren
A. Herstellung einer mit Lck beschichteten ELISA Platte:

1. Beschichten der ELISA Platte mit 2.0 μg/Well Schaf anti-Maus IgG in 100 μl Natriumcarbonatpuffer, pH 9.6 bei 4°C über Nacht.
2. Einmaliges Waschen der Wells mit PBS.
3. Blockieren der Platte mit 0.15 ml Blockierungspuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Fünfmaliges Waschen der Wells mit PBS.
5. Zugabe von 0.5 μg/Well anti-lck (mAB 3A5) in 0.1 ml PBS bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden.
6. Fünfmaliges Waschen der Wells mit PBS.
7. Zugabe von 20 μg/Well mit lck transformierter Hefelysate, verdünnt in Lysepuffer (0.1 ml Gesamtvolumen pro Well). (Die Menge an Lysat kann zwischen den Chargen variieren.) Schütteln der Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur.

B. Herstellung einer mit Phosphotyrosinantikörper beschichteten ELISA Platte:

1. UB40 Platte: Beschichten mit 1.0 μg/Well UB40 in 100 μl PBS bei 4°C über Nacht und Blockieren mit 0.15 ml Blockierungspuffer für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur.

C. Kinaseassayverfahren:

1. Entfernen der ungebundenen Proteine von den obigen Schritten 1-7 und fünfmaliges Waschen der Platten mit PBS.
2. Zugabe von 0.08 ml Kinasereaktionsgemisch pro Well (enthält 10 μl 10 × Kinasepuffer und 2 μ GST-ζ pro Well, verdünnt in Wasser).
3. Zugabe von 10 μl Verbindung, verdünnt in Wasser mit 10% DMSO, und Präinkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Starten der Kinasereaktion durch Zugabe von 10 μl/Well 0.1 mM ATP in Wasser (10 μM ATP Endkonzentration).
5. Schütteln der ELISA Platte für 60 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Stoppen der Kinasereaktion durch Zugabe von 10 μl 0.5 M EDTA pro Well.
7. Transfer von 90 μl Überstand in eine blockierte 4G10-beschichtete ELISA Platte aus dem obigen Abschnitt B.
8. Inkubation unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
9. Fünfmaliges Waschen der Platte mit TBST.
10. Inkubation mit Kaninchen anti-GST Antikörper in einer Verdünnung von 1:5000 in 100 μl TBST für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Fünfmaliges Waschen der Platte mit TBST.
12. Inkubation mit Ziege anti-Kaninchen IgG-HRP in einer Verdünnung von 1:20000 in 100 μl TBST für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Fünfmaliges Waschen der Platte mit TBST.
14. Entwickeln mit Turbo-TMB.

BEISPIEL 14: ASSAY, DER DIE PHOSPHORYLIERUNGSFUNKTION VON RAF MISST
Der folgende Assay misst die Menge RAF-katalysierter Phosphorylierung seines Zielproteins MEK sowie des Zielproteins von MEK, MAPK. Die RAF Gensequenz wird in Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol. 5: 1400-1407 beschrieben und ist in multiplen Gensequenzdatenbanken leicht zugänglich. Die Konstruktion des Nukleinsäurevektors und der Zelllinien, die für diesen Teil der Erfindung verwendet werden, werden in Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 8855-8859 vollständig beschrieben.
Materialien und Reagenzien:

1. Sf9 (Spodoptera frugiperda) Zellen, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
2. RIPA Puffer: 20 mM Tris/HCl, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10% Glyzerin, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 0.5% Triton X-100.
3. Thioredoxin/MEK-Fusionsprotein (T-MEK): T-MEK Expression und Reinigung mittels Affinitätschromatographie wurden entsprechend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kat. # K350-01 und R350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
4. His-MAPK (ERK-2). His-markierte MAPK wurde in XL1 Blue-Zellen exprimiert, die mit einem His-MAPK kodierenden pUC18 Vektor transformiert wurden. His-MAPK wurde mittels Ni-Affinituatschromatographie gereinigt. Cat. # 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, wie hier beschrieben.
5. Schaf anti-Maus IgG, Jackson Laboratories, west Grove, PA. Katalog # 515-006-008, Lot # 28563.
6. RAF-1 Proteinkinase-spezifischer Antikörper URP2653 von UBI.
7. Beschichtungspuffer: PBS, phosphat-gepufferte Saline, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.
8. Waschpuffer: TBST – 50 mM Tris/HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100.
9. Blockierungspuffer: TBST, 0.1% Ethanolamin, pH 7.4.
10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.
11. Kinasepuffer (KB): 20 mM HEPES/HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/l Aprotenin, 75 mM Natriumorthovanadat, 0.5 mM DTT und 10 mM MgCl₂.
12. ATP-Gemisch: 100 mM MgCl₂, 300 mM ATP, 10 mCi ³³P ATP (Dupont NEN)/ml.
13. Stopp-Lösung: 1% Phosphorsäure, Fisher, Pittsburgh, PA.
14. Wallac Cellulosephosphatfiltermatten, Wallac, Turku, Finnland.
15. Filterwaschlösung: : 1% Phosphorsäure, Fisher, Pittsburgh, PA.
16. Tomtec Platten-Harvester, Wallac, Turku, Finnland
17. Wallac Beta Plattenlesegerät # 1205, Wallac, Turku, Finnland.
18. NUNC 96-Well Polypropylenplatten mit V-Boden für Verbindungen, Applied Scientific, Katalog # AS-72092

Verfahren
Alle folgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, außer es ist etwas anderes angegeben.

1. Beschichten der ELISA Platte: Die ELISA Wells werden mit 100 μl affinitätsgereinigtem Schaf anti-Maus Antiserum (1 mg/100 ml Beschichtungspuffer) über Nacht bei 4°C beschichtet.
2. Umdrehen der Platte und Entfernen der Flüssigkeit. Zugabe von 100 μl Blockierungslösung und Inkubation für 30 Minuten.
3. Entfernen der Blockierungslösung und viermaliges Waschen mit Waschpuffer. Ausklopfen der Platte auf einem Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
4. Zugabe von 1 mg RAF 1-spezifischem Antikörper zu jedem Well und Inkubation für 1 Stunde. Waschen wie in Schritt 3 beschrieben.
5. Auftauen der Lysate der mit RAS/RAF infizierten Sf9 Zellen und Verdünnen mit TBST auf 100 mg/100 ml. Zugabe von 10 mg verdünntem Extrakt zu den Wells und Inkubation für eine Stunde. Schütteln der Platten während der Inkubation. Negativkontrollen enthalten kein Lysat. Die Lysate der mit RAS/RAV infizierten SF9-Insektenzellen werden hergestellt, nachdem die Zellen mit rekombinanten Baculoviren in einer MOI von 5 für jedes Virus infiziert und 48 Stunden später geerntet wurden. Die Zellen werden einmal mit PBS gewaschen und in RIPA-Puffer lysiert. Unlösliches Material wird mittels Zentrifugation (5 Minuten bei 10000 × g) entfernt. Aliquots der Lysate werden in Trockeneis/Ethanol eingefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert.
6. Entfernen von nicht-gebundenem Material und Waschen wie oben angegeben (Schritt 3).
7. Zugabe von 2 μg T-MEK und 2 μg His-MAPK/Well und Einstellen des Volumens auf 40 μl mit Kinasepuffer. Verfahren zur Reinigung von T-MEK und MAPK aus Zellextrakten werden hier beispielhaft dargestellt.
8. 20-fache Vorverdünnung der Verbindungen (Stammlösung 10 mg/ml DMSO) oder der Extrakte in TBST mit 1% DMSO. Zugabe von 5 μl der vorverdünnten Verbindungen/Extrakte zu den Wells, wie in Schritt 6 beschrieben. Inkubation für 20 Minuten. Kontrollen enthalten kein Arzneimittel.
9. Starten der Kinase-Reaktion durch Zugabe von 5 μl ATP-Gemisch. Schütteln der Platten auf einem ELISA Platten-Schüttler während der Inkubation.
10. Stoppen der Kinase-Reaktion nach 60 Minuten durch Zugabe von 30 μl Stopp-Lösung zu jedem Well.
11. Platzieren der Phosphocellulosematte und der ELISA

Platte in den Tomtec Platten-Harvester. Ernten und Waschen der Filter mit der Filterwaschlösung gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Trocknen der Filtermatten. Versiegeln der Filtermatten und Einsetzen in eine Halterung. Einsetzen der Halterung in die Vorrichtung zur radioaktiven Detektion und Quantifizieren des radioaktiven Phosphors auf den Filtermatten.
Alternativ werden 40 μl Aliquots aus den einzelnen Wells der Assayplatte in die entsprechenden Positionen einer Phosphocellulosefiltermatte transferiert. Nach Lufttrocknen der Filter werden die Filter in eine Schale gegeben. Vorsichtiges Schütteln der Schale, Wechseln der Waschlösung in 15 minütigen Intervallen für eine Stunde. Lufttrocknen der Filtermatten. Versiegeln der Filtermatten und Einsetzen in eine Halterung, die zur Messung des radioaktiven Phosphors in den Proben geeignet ist. Einsetzen der Halterung in ein Detektionsgerät und Quantifizieren des radioaktiven Phosphors auf den Filtermatten.
Zelluläre/biologische Assays
BEISPIEL 15: ALLGEMEINES VERFAHREN FÜR BrdU-INKORPORATIONSASSAYS
Die nachfolgenden Assays verwenden Zellen, die genetisch modifiziert (engineered) wurden, um einen Rezeptor von Interesse zu exprimieren, und sie evaluieren den Effekt einer Verbindung von Interesse hinsichtlich der Aktivität der liganden-induzierten DNA-Synthese durch Bestimmen der BrdU-Inkorporation in die DNA.
Die folgenden Materialien, Reagenzien und Verfahren werden allgemein für jeden der folgenden BrdU-Inkorporationsassays verwendet. Variationen in spezifischen Assays sind angegeben.
Materialen und Reagenzien:

1. Der geeignete Ligand
2. Die geeigneten genetisch modifizierten Zellen
3. BrdU-Markierungsreagenz: 10 mM, in PBS (pH 7.4) (Boehringer Mannheim, Deutschland).
4. FixDenat: Fixierlösung (gebrauchsfertig) (Boehringer Mannheim, Deutschland).
5. Anti-BrdU-POD: monoklonaler Maus-Antikörper, konjugiert mit Peroxidase (Boehringer Mannheim, Deutschland).
6. TMB-Substratlösung: Tetramethylbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim, Deutschland).
7. PBS-Waschlösung: 1 × PBS, pH 7.4.
8. Bovines Albumin (BSA), Fraktion 5, Pulver, (Sigma Chemical Co., USA)

Allgemeines Verfahren:

1. Die Zellen werden in einer Dichte von 8000 Zellen/Well in 10% CS, 2 mM Glutamin in DMEM in einer 96 Well-Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
2. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen, und im Anschluss werden sie 24 Stunden in serumfreiem Medium (0% CS DMEM mit 0.1% BSA) inkubiert.
3. An Tag 3 werden der geeignete Ligand und die Testverbindung gleichzeitig zu den Zellen gegeben. Die Negativkontrollen enthalten nur serumfreies DMEM mit 0.1% BSA. Die Positivkontrollen enthalten den Liganden, aber keine Testverbindung. Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit Ligand in einer 96 Well-Platte hergestellt und seriell für sieben Testkonzentrationen verdünnt.
4. Nach 18 Stunden Ligandenaktivierung wird verdünntes BrdU-Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0.1% BSA) zugegeben, und die Zellen werden 1.5 Stunden mit BrdU (Endkonzentration 10 μM) inkubiert.
5. Nach Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und Ausklopfen der umgedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. FixDenat-Lösung wird zugegeben (50 μl/Well), und die Platten werden 45 Minuten auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur inkubiert.
6. Die FixDenat-Lösung wird sorgfältig durch Dekantieren und Ausklopfen der umgedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Milch wird als Blockierungslösung zugegeben (5% wasserfreie Milch in PBS, 200 μl/Well), und die Platte wird auf einem Plattenschüttler 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
7. Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt, und die Wells werden einmal mit PBS gewaschen. Anti-BrdU-POD Lösung (1:2000 Verdünnung in PBS, 1% BSA) wird zugegeben (50 μl/Well), und die Platte wird auf einem Plattenschüttler 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
8. Das Antikörperkonjugat wird sorgfältig durch Dekantieren und fünfmaliges Spülen der Wells mit PBS entfernt, und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
9. TMB Substratlösung wird zugegeben (100 μl/Well) und 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung zur photometrischen Detektion ausreichend ist.
10. Die Absorption der Proben wird mit einem Dynatech ELISA-Platten Lesegerät bei 410 nm gemessen (im "Dual Wavelength-Modus" mit einem Filter bei 490 nm als Referenzwellenlänge).

BEISPIEL 16: EGF-INDUZIERTER BrdU-INKORPORATIONSASSAY
Das Verfahren ist das Gleiche als das oben beschriebene allgemeine Verfahren mit Ausnahme der folgenden Änderungen:
Materialien und Reagenzien:

1. Maus-EGF 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan)
2. 3T3/EGFRc7

BEISPIEL 17: EGF-INDUZIERTER HER 2-GESTEUERTER BrdU-INKORPORATIONSASSAY
Das Verfahren ist das Gleiche als das oben beschriebene allgemeine Verfahren mit Ausnahme der folgenden Änderungen:
Materialien und Reagenzien:

1. Maus-EGF 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan)
2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr mit einer Her-2 Kinasedomäne)

BEISPIEL 18: EGF-INDUZIERTER HER 4-GESTEUERTER BrdU-INKORPORATIONSASSAY
Das Verfahren ist das Gleiche als das oben beschriebene allgemeine Verfahren mit Ausnahme der folgenden Änderungen:
Materialien und Reagenzien:

1. Maus-EGF 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan)
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr mit einer Her-4 Kinasedomäne)

BEISPIEL 19: PDGF-INDUZIERTER BrdU-INKORPORATIONSASSAY
Das Verfahren ist das Gleiche als das oben beschriebene allgemeine Verfahren mit Ausnahme der folgenden Änderungen:
Materialien und Reagenzien:

1. Humaner PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Deutschland)
2. 3T3/EGFRc7

BEISPIEL 20: FGF-INDUZIERTER BrdU-INKORPORATIONSASSAY
Das Verfahren ist das Gleiche als das oben beschriebene allgemeine Verfahren mit Ausnahme der folgenden Änderungen:
Materialien und Reagenzien:

1. Humaner FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA)
2. 3T3c7/EGFr

BEISPIEL 21: IGF1-INDUZIERTER BrdU-INKORPORATIONSASSAY
Das Verfahren ist das Gleiche als das oben beschriebene allgemeine Verfahren mit Ausnahme der folgenden Änderungen:
Materialien und Reagenzien:

1. Humaner rekombinanter IGF1 (G511, Promega Corp., USA)
2. 3T3/IGF1r

BEISPIEL 22: INSULIN-INDUZIERTER BrdU-INKORPORATIONSASSAY
Das Verfahren ist das Gleiche als das oben beschriebene allgemeine Verfahren mit Ausnahme der folgenden Änderungen:
Materialien und Reagenzien:

1. Insulin, kristallin, bovin, Zink (13007, Gibco BRL, USA)

BEISPIEL 23: HGF-INDUZIERTER BrdU-INKORPORATIONSASSAY
Das Verfahren ist das Gleiche als das oben beschriebene allgemeine Verfahren mit Ausnahme der folgenden Änderungen:
Materialien und Reagenzien:

1. Rekombinanter humaner HGF (Katalognummer 249-HG, R&D Systems, Inc. USA)
2. BXPC-3 Zellen (ATCC CRL-1687)

Verfahren

1. Die Zellen werden in einer Dichte von 9000 Zellen/Well in RPMI, 10% FBS in einer 96 Well-Platte ausgesät. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
2. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen, und im Anschluss werden sie in 100 μl serumfreiem Medium (RPMI mit 0.1% BSA) inkubiert.
3. An Tag 3 werden 25 μl Ligand (hergestellt in einer Konzentration von 1 μg/ml in RPMI mit 0.1% BSA, HGF Endkonzentration 200 ng/ml) und die Testverbindungen zu den Zellen gegeben. Zu den Negativkontrollen werden nur 25 μl serumfreies RPMI mit 0.1% BSA gegeben. Zu den Positivkontrollen wird der Ligand (HGF), aber keine Testverbindung gegeben. Die Testverbindungen werden in einer 5 × höheren Konzentration als ihre Endkonzentration in serumfreiem RPMI mit Ligand in einer 96 Well-Platte hergestellt und seriell für die sieben Testkonzentrationen verdünnt. Typischerweise beträgt die höchste Endkonzentration der Testverbindung 100 μM, und es werden 1:3 Verdünnungen verwendet (d.h. der Bereich der Endkonzentrationen der Testverbindungen liegt zwischen 0.137-100 μM).
4. Nach 18 Stunden Ligandenaktivierung werden 12.5 μl verdünntes BrdU-Markierungsreagenz (1:10 in RPMI, 0.1% BSA) zu jedem Well gegeben, und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration 10 μM) eine Stunde inkubiert.
5. Analog zum allgemeinen Verfahren.
6. Analog zum allgemeinen Verfahren.
7. Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren entfernt, und die Wells werden einmal mit PBS gewaschen. Anti-BrdU-POD Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) wird zugegeben (100 μl/Well), und die Platte wird auf einem Plattenschüttler 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
8. Analog zum allgemeinen Verfahren.
9. Analog zum allgemeinen Verfahren.
10. Analog zum allgemeinen Verfahren.

BEISPIEL 24: HUV-EC-C ASSAY
Das folgende Protokoll kann ferner verwendet werden, um die Aktivität einer Verbindung gegenüber PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF oder FLK-1/KDR zu messen, die alle natürlicherweise von HUV-EC-C Zellen exprimiert werden.
TAG 0:

1. Waschen und Trypsinieren der HUV-EC-C Zellen (humane endotheliale Zellen der Nabelschnurvene, American Type Culture Collection, Katalognummer 1730 CRL). Zweimaliges Waschen mit etwa 1 ml/10 cm² Gewebekulturflasche Dulbecco's phosphatgepufferte Saline (D-PBS, bezogen von Gibco BRL, Katalognummer 14190-029). Trypsinieren mit 0.05 Trypsin-EDTA in einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung (Sigma Chemical Company, Katalognummer C-1544). Das 0.05 Trypsin wurde durch Verdünnen von 0.25 Trypsin/1 mM EDTA (Gibco, Katalognummer 25200-049) in der Zelldissoziationslösung hergestellt. Trypsinieren mit etwa 1 ml/25-30 cm² Gewebekulturflasche für etwa 5 Minuten bei 37°C. Nachdem sich die Zellen von der Flasche abgelöst haben, Zugabe des gleichen Volumens Assay-Medium und Transfer in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen (Fisher Scientific, Katalognummer 05-539-6).
2. Waschen der Zellen mit etwa 35 ml Assaymedium im sterilen 50 ml Zentrifugenröhrchen durch Zugabe des Assaymediums, Zentrifugation für 10 Minuten bei ungefähr 200 × g, Absaugen des Überstands und Resuspendieren mit 35 ml D-PBS. Zweimaliges Wiederholen des Waschschrittes mit D-PBS, Resuspendieren der Zellen in etwa 1 ml Assaymedium/15 cm² Gewebekulturflasche. Das Assaymedium besteht aus F12K Medium (Gibco BRL, Katalognummer 21127-014) + 0.5% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum. Zählen der Zellen mit einem Coulter-Counter, Coulter Electronics, Inc.) und Zugabe von Assaymedium zu den Zellen, um eine Konzentration von 0.8-1.0 × 10⁵ Zellen/ml zu erhalten.
3. Zugeben der Zellen in eine 96 Well-Platte mit flachem Boden (flat-botoom plates) in einer Konzentration von 100 μl/Well oder 0.8-1.0 × 10⁹ Zellen/Well, Inkubation für etwa 24 Stunden bei 37°C, 5% CO₂.

TAG 1:

1. Herstellung zweifacher Arzneimitteltitrationen in separaten 96 Well-Platten, im Allgemeinen 50 μM-0 μM. Verwenden des gleichen Assaymediums, das an Tag 0 in Schritt 2 verwendet wurde. Die Titrationen werden durch Zugeben von 90 μl Arzneimittel/Well in einer Konzentration von 200 μM (4 × die Endkonzentration) in das oberste Well einer bestimmten Spalte der Platte hergestellt. Da die Konzentration der Stammlösung üblicherweise 20 mM in DMSO beträgt, enthält die 200 μM Arzneimittelkonzentration 2% DMSO. Daher wird das Verdünnungsmittel mit 2% DMSO in Assaymedium (F12K + 0.5% fötales Rinderserum) als Verdünnungsmittel für die Arzneimitteltitrationen verwendet, um das Arzneimittel zu verdünnen, die DMSO Konzentration jedoch konstant zu halten. Zugabe dieses Verdünnungsmittels zu den verbliebenen Wells in der Spalte in einer Konzentration von 60 μl/Well. Entnahme von 60 μl von den 120 μl der 200 μM Arzneimittelverdünnung im obersten Well der Spalte und Mischen mit 60 μl im zweiten Well der Spalte. Entnahme von 60 μl dieses Wells und Mischen mit den 60 μl im dritten Well der Spalte μsw., bis die zweifachen Titrationen vollständig sind. Wenn das vorletzte Well gemischt ist, Entnahme von 60 der 120 μl in diesem Well und Verwerfen derselben. Belassen der 60 μl DMSO/Medienverdünnungsmittel im letzten Well als Kontrolle, die kein Arzneimittel enthält. Herstellen von 9 Spalten mit titrierten Arzneimitteln, ausreichend für eine Dreifachbestimmung für (1) VEGF (bezogen von Pepro Tech Inc., Katalognummer 100-200, (2) endothelialen Zellwachstumsfaktor (ECGF) (ebenfalls bekannt als saurer Fibroblastenwachstumsfaktor oder aFGF) (bezogen von Boehringer Mannheim Biochemica, Katalognummer 1439600), oder (3) humanen PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Deutschland) und Assaymedium -Kontrolle. ECGF wird als Präparation mit Natriumheparin verwendet.
2. Transfer von 50 μl/Well der Arzneimittelverdünnungen in die 96 Well-Assayplatten, die 0.8-1.0 × 10⁹ HUV-EC-C Zellen/100 μl/Well von Tag 0 enthalten, und Inkubation für ungefähr 2 Stunden bei 37°C, 5% CO₂.
3. Zugabe von 50 μl/Well in Dreifachbestimmung von 80 μg/ml VEG F, 20 ng/ml ECGF oder Medienkontrolle zu jeder Arzneimittelkonzentration. Wie bei den Arzneimitteln betragen die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren viermal die gewünschte Endkonzentration. Verwenden des Assaymediums von Tag 1, Schritt 2 zur Herstellung der Konzentrationen der Wachstumsfaktoren. Inkubation für ungefähr 24 Stunden bei 37°C, 5% CO₂. Jedes Well enthält 50 μl Arzneimittelverdünnung, 50 μl Wachstumsfaktor oder Medium und 100 μl Zellen, was einem Gesamtvolumen von 200 μl/Well entspricht. Somit werden die vierfachen Konzentrationen der Arzneimittel und der Wachstumsfaktoren zu einer 1 × Konzentration, sobald alle Komponenten zu den Wells gegeben wurden.

TAG 2:

1. Zugabe von 3H-Thymidin (Amersham, Katalognummer TRK-686) in einer Konzentration von 1 μCi/Well (10 μl/Well einer 100 μCi/ml Lösung in RPMI Medium + 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum) und Inkubation für ungefähr 24 Stunden bei 37°C, 5% CO₂. Anmerkung: ³H-Thymidin wird in RPMI-Medium hergestellt, da alle anderen Anwendungen, für die ³H-Thymidin verwendet wird, Experimente beinhalten, die in RPMI durchgeführt werden. Die Unterschiede im Medium in diesem Schritt sind möglicherweise nicht signifikant. RPMI wurde von Gibco BRL bezogen, Katalognummer 111875-051.

TAG 3:

1. Einfrieren der Platten über Nacht bei –20°C.

TAG 4:

1. Auftauen der Platten und Ernten mit einem 96 Well-Plattenharvester (Tomtec Harvester 96^®) auf Filtermatten (Wallac, Katalognummer 1205-401), Auswerten der Counts mit einem Wallac Betaplate^TM Flüssigszintillationszähler.

In vivo-Tiermodelle
BEISPIEL 25: HETEROTRANSPLANTAT-TIERMODELLE
Die Fähigkeit humaner Tumore, als Heterotransplantate in athymen Mäusen (z.B. Balb/c, nu/nu) zu wachsen, stellt ein zweckmäßiges in vivo Modell zur Untersuchung der biologischen Antwort für Therapien humaner Tumore bereit. Seit der ersten erfolgreichen Heterotransplantation humaner Tumore in athyme Mäuse (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758-760), wurden viele verschiedene humane Tumorzelllinien (z.B. Brust-, Lungen-, Urogenital-, Gastrointestinal-, Kopf- und Halsbereich-, Glioblastom-, Knochen- und bösartige Melanome) transplantiert und erfolgreich in Nacktmäusen angezogen. Die folgenden Assays können verwendet werden, um das Aktivitätsniveau, die Spezifität und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu bestimmen.
Geeignete Zelllinien für subkutane Heterotransplantatexperimente umfassen C6 Zellen (Gliom, ATCC # CCL 107), A375 Zellen (Melanom, ATCC # CRL 1619), A431 Zellen (epidermales Karzinom, ATCC # CRL 1555), Calu6 Zellen (Lunge, ATTC # HTB 56), PC3 Zellen (Prostata, ATCC # CRL 1435) und NIH 3T3-Fibroblasten, die genetisch modifiziert wurden, um EGFR, PDGFR, IGF-1R oder eine beliebige andere Testkinase überzuexprimieren. Das folgende Protokoll kann zur Durchführung von Heterotransplantatexperimenten verwendet werden:
Weibliche atyhme Mäuse (BALB/c, nu/nu) werden von Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) bezogen. Alle Tiere werden unter Reinraumbedingungen in Mikroisolatorkäfigen mit Alpha-dri Streu gehalten. Sie erhalten steriles Nagetierfutter und Wasser nach Belieben.
Die Zelllinien werden in geeignetem Medium (z.B. MEM, DMEM, Ham's F10 oder Ham's F12 plus 5-10% fötales Rinderserum (FBS) und 2 mM Glutamin (GLN)) angezogen. Alle Zellkulturmedien, Glutamin und fötales Rinderserum werden von Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) bezogen, außer es ist etwas anderes angegeben. Alle Zellen werden in einer feuchten (humid) Atmosphäre mit 90-95% Luft und 5-10% CO₂ bei 37°C angezogen. Alle Zelllinien werden routinemäßig zweimal die Woche subkultiviert und sind negativ für Mycoplasmen, wie mit Hilfe der Mycotect-Methode (Gibco) bestimmt wurde.
Die Zellen werden bei oder nahe Konfluenz mit 0.05 Trypsin-EDTA geerntet und bei 450 × g zehn Minuten pelletiert. Die Pellets werden in sterilem PBS oder in Medium (ohne FBS) in einer bestimmten Konzentration resuspendiert, und die Zellen werden in die hintere Flanke der Mäuse (8-10 Mäuse pro Gruppe, 2-10 × 10⁶ Zellen pro Tier) implantiert. Das Tumorwachstum wird über 3-6 Wochen mit Hilfe einer Schublehre gemessen. Tumorvolumina werden als Produkt aus Länge × Breite × Höhe berechnet, außer es ist etwas anderes angegeben. P-Werte werden mit Hilfe des Student's T-Tests berechnet. Testverbindungen in 50-100 μl Exzipient (z.B. DMSO oder VPD:D5W) werden mit Hilfe einer IP-Injektion in verschiedenen Konzentrationen abgegeben, im Allgemeinen ab Tag 1 nach der Implantation.
BEISPIEL 26: TUMORINVASIONSMODELL
Das nachfolgende Tumorinvasionsmodell wurde entwickelt und kann möglicherweise für die Evaluierung des therapeutischen Werts und der Effizienz der identifizierten Verbindungen verwendet werden, um selektiv den KDR/FLK-1 Rezeptor oder CDK2 zu inhibieren.
Verfahren
8 Wochen alte Nacktmäuse (Weibchen, Simonsen Inc.) wurden als Tiermodell verwendet. Die Implantation von Tumorzellen wurde in einer laminaren Zellkulturbank durchgeführt. Zur Anästhesie wurde ein Xylazin/Ketamin-Cocktail (100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin) intraperitoneal verabreicht. Es wird ein zentraler Einschnitt (midline incision) durchgeführt, um die Bauchhöhle zu exponieren (ungefähr 1.5 cm lang), um 10⁷ Tumorzellen in einem Volumen von 100 μl Medium zu injizieren. Die Zellen werden entweder in den duodenalen Lobus der Bauchspeicheldrüse oder unter die Serosa des Kolons injiziert. Das Peritoneum und die Muskeln werden mit einer kontinuierlichen Wundnaht mit einem 6-0 Seidenfaden (silk continuous suture) geschlossen, und die Haut wird mit Hilfe von Wundklammern geschlossen. Die Tiere wurden täglich beobachtet.
Analyse:
Abhängig von den Wachstumsbeobachtungen der Tiere wurden die Mäuse nach 2-6 Wochen getötet, und die lokalen Tumormetastasen verschiedener Organe (Lunge, Leber, Hirn, Magen, Milz, Herz, Muskel) wurden entnommen und analysiert (Messungen der Tumorgröße, des Invasionsgrads, Immunchemie und in situ Hybridisierung).
BEISPIEL 27: MESSUNG DER ZELLTOXIZITÄT
Therapeutische Verbindungen sollten potenter bezüglich der Inhibition der Proteinkinaseaktivität sein als in der Ausübung eines cytotoxischen Effekts. Ein Maß für die Effektivität und Zelltoxizität einer Verbindung kann durch Bestimmung des therapeutischen Index IC₅₀/LD₅₀ erhalten werden. Die IC₅₀, die zur Erzielung einer 50%igen Inhibition erforderliche Dosis, kann mit Hilfe von Standardverfahren gemessen werden, wie zum Beispiel den hier beschriebenen. Die LD₅₀, die in einer 50%igen Toxizität resultierende Dosierung, kann mit Hilfe von Standardverfahren gemessen werden (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55-63), durch Bestimmen der Menge an freigesetzter LDH (Korzeniewski and Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64: 313; Decker and Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115: 61) oder durch Bestimmen der letalen Dosis in Tiermodellen. Verbindungen mit einem hohen therapeutischen Index werden bevorzugt. Der therapeutische Index sollte größer als 2 sein, vorzugsweise mindestens 10, noch bevorzugter mindestens 50.
BEISPIEL 28: DIE AKTIVITÄT DER VERBINDUNGEN DER ERFINDUNG
Die biologische oder biochemische Aktivität einiger Verbindungen der Erfindung wurden mit Hilfe der oben beschriebenen Assays bestimmt. Die IC₅₀-Werte wurden für mehrere Verbindungen der Erfindung gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4
Alle in der Patentbeschreibung erwähnten Patente und Publikationen zeigen das Wissen der Fachleute an, welche die Erfindung betrifft. Alle Patente und Publikationen werden hier durch Bezugnahme im gleichen Umfang eingeschlossen, wie wenn jede einzelne Publikation spezifisch und individuell als durch Bezugnahme eingeschlossen angegeben werden würde.
Die hier illustrativ beschriebene Erfindung kann bei Fehlen eines beliebigen Elements oder beliebiger Elemente, einer Einschränkung oder Einschränkungen durchgeführt werden, welche hier nicht spezifisch offenbart ist. Somit kann zum Beispiel jeder der Begriffe "umfassen", "im wesentlichen bestehen aus" und "bestehen aus" durch die jeweils zwei anderen Begriffe ersetzt werden. Die verwendeten Begriffe und Ausdrücke werden beschreibend und nicht einschränkend verwendet, und es ist nicht beabsichtigt, dass durch die Verwendung solcher Begriffe und Ausdrücke jegliche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder von Teilen davon ausgeschlossen werden, sondern es wird erkannt, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Schutzbereichs der beanspruchten Erfindung möglich sind. Somit sollte es selbstverständlich sein, dass, obwohl die vorliegende Erfindung spezifisch durch bevorzugte Ausführungsformen und optionale Merkmale offenbart wurde, Modifikationen und Variationen der hier offenbarten Konzepte von Fachleuten entwickelt werden können, und dass solche Modifikationen und Variationen als innerhalb des Schutzbereichs liegend betrachtet werden, so wie dieser durch die nachfolgenden Ansprüche definiert ist.
Wenn Merkmale oder Aspekte der Erfindung von Markush-Gruppen beschrieben werden, werden Fachleute weiterhin erkennen, dass die Erfindung dadurch ebenfalls in Form eines jeden einzelnen Mitglieds oder von Subgruppen von Mitgliedern der Markush-Gruppe beschrieben wird. Falls z.B. X beschrieben wird als ausgewählt aus der Gruppe, die aus Brom, Chlor und Iod besteht, werden Ansprüche, in denen X Brom ist, und Ansprüche, in denen X Brom und Chlor ist, vollständig beschrieben.
Die Erfindung wurde hier in breiter und generischer Form beschrieben. Jede engere Spezies und subgenerische Gruppierung, die in die generische Offenbarung fällt, stellt ebenfalls einen Teil der Erfindung dar. Dies umfasst die generische Beschreibung der Erfindung unter der Voraussetzung oder negativen Limitierung, dass ein beliebiger Gegenstand aus dem Genus entfernt wird, unabhängig davon, ob das entfernte Material hier spezifisch angegeben wurde oder nicht.

Claims

Verbindung der Formel (I):
wobei: (a) jedes R₁ unabhängig und optional aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: (i) Wasserstoff; (ii) gesättigtem Alkyl, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst; (iii) einem mono- oder bizyklischen aromatischen C₆-C₁₂ Ring oder einem heteroaromatischen Ring, der fünf bis zehn Ringatome enthält, wobei ein, zwei oder drei Ringatome aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel besteht, und wobei die übrigen Ringatome Kohlenstoff sind, der optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, C₁-C₄ Alkoxy, Halogen, Trihalomethyl, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; (iv) einem Alkohol der Formel -(X₁)_n1-OH oder einem Alkoxyalkyl der Formel -(X₂)_n2-O-X₃, wobei X₁, X₂ und X₃ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem Alkyl, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, und einem sechsgliedrigen aromatischen Ring besteht, und wobei n1 und n2 unabhängig 0 oder 1 sind; (v) einem Halogen; (vi) einer Carboxylsäure der Formel -(X₄)_n4-COOH oder einem Ester der Formel -(X₅)_n5-COO-X6, wobei X₄, X₅ und X₆ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Alkyl, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, besteht, und wobei n4 und n5 unabhängig 0 oder 1 sind; (vii) einem Amid der Formel -(X₇)_n7-NHCOX₈ oder der Formel -(X₉)_n9-CONX₁₀X₁₁, wobei X₇ und X₉ jeweils unabhängig ein Alkyl sind, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, und wobei n7 und n9 unabhängig 0 oder 1 sind, und wobei X₈, X₁₀ und X₁₁ jeweils unabhängig Wasserstoff oder ein Alkyl sind, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, oder wobei X₁₀ und X₁₁ zusammengenommen einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring oder einen fusionierten bizyklischen Ring bilden; (viii) einem Sulfonamid der Formel -(X₁₂)_n12-SO₂X₁₃X₁₄, wobei X₁₂ ein Alkyl ist, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, und wobei n12 0 oder 1 ist, und wobei X₁₃ und X₁₄ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen, heteroaromatischen, aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring besteht, wobei das Alkyl und jeder Ring optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sind, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, Hydroxy, Halogen, Trihalomethyl, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; oder wobei X₁₃ und X₁₄ zusammengenommen einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring oder einen fusionierten bizyklischen Ring bilden, der optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, Halogen, Trihalomethyl, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; (ix) einem Amin der Formel -(X₁₆)_n16-NX₁₇X₁₈, wobei X₁₆ ein Alkyl ist, das eine verzweigte oder gerade Kette aus einem bis fünf Kohlenstoffatomen umfasst, und wobei n16 0 oder 1 ist, und wobei X₁₇ und X₁₈ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen, heteroaromatischen oder aliphatischen Ring besteht, wobei jeder Ring optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, Halogen, Trihalomethyl, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; (x) zwei benachbarten R₁ Gruppen, die zusammen mit zwei benachbarten A, B, D oder E einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aliphatischen oder heteroaliphatischen Ring bilden; (b) R₂, R₃ und R₄ Wasserstoff sind; (c) R₅ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff und gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl besteht; (d) A, B, D und E jeweils unabhängig Kohlenstoff oder Stickstoff sind, vorausgesetzt dass keines, eines oder zwei von A, B, D und E Stickstoff ist, und vorausgesetzt dass kein R₁ an A, B, D oder E angeheftet ist, wenn ein beliebiges von A, B, D oder E Stickstoff ist; (e) G Stickstoff oder Sauerstoff ist, vorausgesetzt dass R₅ fehlt, wenn G Sauerstoff ist; (f) m 2, 3 oder 4 ist; und (g) q 1 oder 2 ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei (a) jedes R₁ unabhängig und optional aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: (i) Wasserstoff; (ii) Methyl, Ethyl, Propyl, Ethylen, Propylen oder Butylen; (iii) einem Alkohol der Formel -(X₁)_n1-OH oder einem Alkoxyalkyl der Formel -(X₂)_n2-O-X₃, wobei X₁, X₂ und X₃ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Methylen, Ethylen oder Propylen besteht, und wobei n1 und n2 unabhängig 0 oder 1 sind; (iv) Fluor, Chlor oder Brom; (v) einer Carboxylsäure der Formel -(X₄)_n4-COOH, wobei X₄ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Methylen, Ethylen oder Propylen besteht, besteht, und wobei n4 0 oder 1 ist; (vi) einem Amid der Formel -(X₇)_n7-NHCOX₈ oder der Formel -(X₉)_n9-CONX₁₀X₁₁, wobei X₇ und X₉ jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Methylen, Ethylen und Propylen besteht, und wobei n7 und n9 unabhängig 0 oder 1 sind, und wobei X₈, X₁₀ und X₁₁ jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl und Propyl besteht, oder wobei X₁₀ und X₁₁ zusammengenommen einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen heteroaliphatischen Ring bilden; (vii) einem Sulfonamid der Formel -(X₁₂)_n12-SO₂NX₁₃X₁₄, wobei X₁₂ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Methylen, Ethylen oder Propylen besteht, und wobei n12 0 oder 1 ist, und wobei X₁₃ und X₁₄ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl und Phenyl besteht, wobei das Methyl, Ethyl, Propyl und Phenyl optional mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sind, welche unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Hydroxy, Halogen, -NH₂, -NO₂, -(R)_n-COOH und -(R)_n-COOR' besteht, wobei R und R' unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus gesättigtem oder ungesättigtem C₁-C₁₀ Alkyl und einem fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen aromatischen oder heteroaromatischen Ring besteht, und wobei n 0 oder 1 ist; oder wobei X₁₃ und X₁₄ zusammengenommen einen fusionierten bizyklischen Ring bilden; oder (viii) zwei benachbarten R₁ Gruppen, die zusammen mit zwei benachbarten A, B, D oder E einen sechsgliedrigen heteroaliphatischen Ring bilden; (b) A, B, D und E Kohlenstoff sind; (c) G Stickstoff oder Sauerstoff ist; (d) m 1 oder 2 ist; und (e) q 2 ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei jedes R₁ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Methyl, Methoxy, 2-Hydroxyethyl, Phenyl, 2-Methoxyphenyl, 3-Methoxyphenyl, 4-Methoxyphenyl, 4-Fluorphenyl, 4-Chlorphenyl, 4-Bromphenyl, 4-Iodphenyl, 3-Carboxyphenyl, Pyridyl, -NHC(O)CH₃, -C(O)N(CH₃)₂, -COOH, -SO₂NH(CH₃), -SO₂NH₂, -SO₂N(CH₃)₂, -SO₂NH(CH(CH₃)₂), -SO₂NH(C₆H₅), -SO₂NH(3-Chlorphenyl) und -SO₂N(CH₃)(3-Chlorphenyl) besteht, und wobei m 1 oder 2 ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus 4-Methyl-2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid, 2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid, 1-(4-Methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(5-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(6-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-[4-(2-Hydroxyethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(2-Oxo-5-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureamid, 2-Oxo-3-(4-oxo- 2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid, 2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäureisopropylamid, 2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäurephenylamid, N-[2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl]-acetamid, 1-(2-Oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäure, 2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-6-carboxylsäure, 1-(6-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(6-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-[6-(2-Methoxyphenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-[6-(3-Methoxyphenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-[6-(4-Methoxyphenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-[6-(4-Fluorphenyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(2-Oxo-6-pyridin-3-yl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-[5-(2,3-Dihydro-indol-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-[5-(3,4-Dihydro-2H-quinolin-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-[5-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4- c]pyrrol-4-on, 1-[5-(5-Brom-2,3-dihydro-indol-1-sulfonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlorphenyl)-methylamid, 1-(6-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(5-Chlor-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(7-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 3-[2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl]-benzoesäure, 3-[2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-6-yl]-benzoesäure, 2-Oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydro-pyrano[3,4-c]pyrrol-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäure(3-chlorphenyl)-amid, 1-(5-Brom-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on, 1-(2-Oxo-5-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-(2-Oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-(6-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-(6-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid, 2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2,3-dihydro-1H-indol-5-carboxylsäuredimethylamid, 1-[2-Oxo-5-(pyrrolidin-1-carbonyl)-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-[5-(Morpholin-4-carbonyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-[4-(2- Hydroxyethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-(5-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2,3-dihydo-1H-indol-5-carboxylsäure, 2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2,3-dihydo-1H-indol-5-sulfonsäureamid, 2-Oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2,3-dihydo-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid,
1-[4-(2-Hydroxyethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl]-5-methyl-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 1-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-5-methyl-2,5,6,7-tetrahydro-pyrrolo[3,4-c]pyridin-4-on, 3-(5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2-oxo-2,3-dihydo-1H-indol-5-carboxylsäure, 3-(5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2-oxo-2,3-dihydo-1H-indol-5-sulfonsäuremethylamid, 3-(5-Methyl-4-oxo-4,5,6,7-tetrahydro-2H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-1-ylmethylen)-2-oxo-2,3-dihydo-1H-indol-5-sulfonsäuredimethylamid, 1-(2-Oxo-1,2-dihydro-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-ylidenmethyl)-6,7-dihydro-2H-pyrano[3,4-c]pyrrol-4-on und 4-(3-Chlor-4-fluor-phenylamino)-5-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahydropyrano[3,4-c]-pyrrol-1-methylen)-5,7-dihydro-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-on besteht.
Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche besteht aus:
Verbindung mit der Formel:
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträger umfasst.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträger umfasst, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, die durch eine Proteinkinase vermittelt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei der Organismus ein Mensch ist und der krankhafte Zustand Krebs ist.
Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei der Krebs aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Plattenepithelkarzinom, Astrocytom, Kaposi's Sarkom, Glioblastom, Lungenkrebs, Blasenkrebs, Krebs im Kopf- und Halsbereich, Melanom, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Brustkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, Gliom, Colorektalkrebs, Urogenitalkrebs und Gastrointestinalkrebs besteht.