ES2243461T3 - Compuestos de 3-(pirolillactona) -2-indolinona como inhibidores quinasa. - Google Patents
Compuestos de 3-(pirolillactona) -2-indolinona como inhibidores quinasa.Info
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Abstract
Un compuesto de **fórmula**, donde cada R1 es independientemente y opcionalmente seleccionado del grupo formado por: (i) hidrógeno; (ii)alquilo saturado formado por una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono; (iii) un anillo aromático mono o bicíclico C6-C12, o un anillo heteroaromático que contiene de 5 a 10 átomos en el anillo, donde uno, dos o tres átomos del anillo son seleccionados del grupo formado por nitrógeno, oxígeno o azufre. Los átomos del anillo restante son carbono, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por alquilo C1-C18, alcoxi C1-C4, halógeno, trihalometilo, -NH2, -NO2, -(R)n-COOH y -(R)n-COOR'', donde R y R'' son independientemente seleccionados del grupo formado por alquilo saturado o insaturado C1-C10 y un anillo aromático de cinco o seis miembros o anillo heteroaromático, y donde n es 0 ó 1; (iv)un alcohol de fórmula -(X1)n1-OH ó un alcoxialquilo de fórmula -(X2)n2-O-X3, donde X1, X2, y X3 son independientemente seleccionados del grupo formado por un alquilo que comprende una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono y un anillo aromático de seis miembros; y nl y n2 son independientemente 0 ó 1; (v) un halógeno; (vi) un ácido carboxílico de fórmula -(X4)n4-COOH ó éster de fórmula -(X5)n5-COO-X6, donde X4, X5, y X6 son independientemente seleccionados del grupo formado por un alquilo que comprenda una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono, y n4 y n5 son independientemente 0 ó 1; (vii) una amida de fórmula -(X7)n7-NHCOX8, o de fórmula -(X9)n9-CONX10X11, donde X7 y X9 son cada uno independientemente un alquilo que comprenda una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono, n7 y n9 son independientemente 0 ó 1.
Description
Compuestos de
3-(pirolillactona)-2-indolinona como
inhibidores quinasa.
Esta solicitud reivindica prioridad bajo 35
U.S.C. 119(e) a la Solicitud Provisional con nº de serie
60/185.536, archivada el 28 de Febrero del 2000.
La invención se refiere a ciertos compuestos de
indolinona, su método de síntesis, y al uso de dichos compuestos en
la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una
enfermedad mediada por una protein quinasa.
La descripción siguiente del antecedente de la
invención se proporciona para ayudar a comprender la invención, pero
no se admite que describa o constituya la materia previa de la
invención.
La transducción de señal celular es un mecanismo
fundamental por el que se transmite la estimulación extracelular al
interior de las células y subsiguientemente regula diversos procesos
celulares. Uno de los mecanismos bioquímicos claves de la
transducción de señal implica la fosforilación reversible de
proteínas. La fosforilación de polipéptidos regula la actividad de
proteínas maduras alterando su estructura y función. El fosfato
generalmente se encuentra en la fracción del hidroxilo de la serina,
treonina, o aminoácidos de tirosina en las proteínas.
Los enzimas que median en la fosforilación de los
efectores celulares normalmente se clasifican en dos clases. La
primera clase consta de protein quinasas que transfieren un fosfato
de la adenosina trifosfato a sustratos proteicos. La segunda clase
consta de protein fosfatasas que hidrolizan fosfatos de sustratos
proteicos fosforilo. Las funciones de conversión de protein quinasas
y protein fosfatasas equilibran y regulan el flujo de señales en los
procesos de transducción de señal.
Las protein quinasas y protein fosfatasas
generalmente se dividen en dos grupos -proteínas tipo receptor y
tipo no receptor. La mayoría de protein fosfatasas tipo receptor
contiene dos dominios catalíticos conservados, cada uno de los
cuales abarca un segmento de 240 residuos aminoacídicos (Saito et
al., 1991, Cell Growth and Diff.
2:59-65). Las protein fosfatasas receptoras pueden
además subclasificarse en base a la diversidad de secuencias
aminoacídicas de sus dominios extracelulares (Saito et al.,
supra; Krueger et al., 1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:7417-7421).
Las protein quinasas y protein fosfatasas
generalmente también se dividen en tres clases dependiendo de los
aminoácidos sobre los que actúan. Algunas catalizan la adición o
hidrólisis de fosfato sobre la serina o treonina solamente, algunas
catalizan la adición o hidrólisis de fosfato en la tirosina
solamente, y algunas catalizan la adición o hidrólisis de fosfato
sobre serina, treonina, y tirosina.
Las quinasas pueden regular la actividad
catalítica de otras protein quinasas implicadas en la proliferación
celular. Las protein quinasas con actividad inapropiada también
están implicadas en algunos tipos de cáncer. Los niveles
anormalmente elevados de proliferación celular están asociados a las
protein quinasas receptoras y no receptoras con actividad no
regulada.
Además de su papel en la proliferación celular,
se cree que las protein quinasas están implicadas en los procesos de
diferenciación celular. La diferenciación celular tiene lugar en
algunas células sobre la estimulación del factor de crecimiento
nervioso (NGF) o del factor de crecimiento epidermal (EGF). La
diferenciación celular se caracteriza por un encrespamiento rápido
de la membrana, un aplanamiento celular, y un incremento en la
adhesión celular (Chao, 1992, Cell
68:995-997).
En un esfuerzo por descubrir los tratamientos
nuevos del cáncer y otras enfermedades, investigadores biomédicos y
químicos han diseñado, sintetizado, y probado moléculas que inhiben
la función de las protein quinasas. Algunas moléculas orgánicas
pequeñas forman una clase de compuestos que modula la función de las
protein quinasas. Ejemplos de moléculas que se ha descubierto que
inhiben la función de las protein quinasas son compuestos arilo
bis-monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos (PCT
WO 92/20642), derivados vinileno-azaindole (PCT WO
94/14808),
1-ciclopropil-4-piridil-quinolonas
(Patente Estadounidense nº 5.217.999, y titulada ``Styryl Compounds
which Inhibit EGF Receptor Protein Tyrosine Kinase), compuestos
piridilo estiril sustituidos (Patente Estadounidense nº 5.302.606),
ciertos derivados quinazolina (Solicitud PE nº 0 566 266 A1),
seleoindoles y selenidas (PCT WO 94/03427), compuestos tricíclicos
polihidroxiílicos (PCT WO 92/21660), y compuestos de ácido
benzilfosfónico (PCT WO 91/15495).
Los compuestos que pueden atravesar membranas
celulares y son resistentes a la hidrólisis ácida son potencialmente
terapéuticos ventajosos ya que pueden llegar a ser altamente
biodisponibles tras ser administrados oralmente a pacientes. Sin
embargo, muchos de los inhibidores de protein quinasa sólo inhiben
débilmente la función de las protein quinasas. Además, muchos
inhiben varias protein quinasas, y por lo tanto, causarán múltiples
efectos adversos como terapéuticos para enfermedades.
A pesar del progreso significativo que se ha
hecho en el desarrollo de compuestos para el tratamiento del
cáncer,todavía existe en la materia la necesidad de identificar las
estructuras particulares y los patrones de sustitución que forman
los compuestos capaces de modular la función de las protein quinasas
concretas. La presente invención satisface esta necesidad.
La presente invención está dirigida a ciertos
compuestos de indolinona y al uso de dichos compuestos en la
elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad
mediada por una protein quinasa.
Así, en un primer aspecto, la invención
proporciona un compuesto de Fórmula (I):
donde:
- (a)
- cada R_{1} es independiente y opcionalmente seleccionado del grupo compuesto por:
- (i)
- hidrógeno;
- (ii)
- alquilo saturado que comprende una cadena simple o ramificada de uno a cinco átomos de carbono;
- (iii)
- un anillo aromático C_{6}-C_{12}, mono o bicíclico, o anillo heteroaromático que contiene de 5 a 10 átomos en el anillo, donde uno, dos o tres átomos del anillo son seleccionados del grupo compuesto por nitrógeno, oxígeno o azufre, siendo los restantes átomos del anillo átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo compuesto por un alquilo C_{1}-C_{10}, alcoxi C_{1}-C_{4}, halógeno, trihalometilo, -NH2, -NO2, -(R)_{n}-COOH y -(R)_{n}-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo compuesto por alquilo C_{1}-C_{10} insaturado y un anillo aromático o heteroaromático de cinco-seis miembros, y donde n es 0 ó 1;
- (iv)
- un alcohol de fórmula -(X_{1})n_{1}-OH ó un alcoxialquilo de fórmula -(X_{2})n_{2}-O-X_{3}, donde X_{1}, X_{2}, y X_{3} son independientemente seleccionados del grupo compuesto por un alquilo que comprende una cadena simple o ramificada de uno a cinco átomos de carbono y un anillo aromático de 6 miembros; y n_{1} y n_{2} son independientemente 0 ó 1;
- (v)
- un halógeno;
- (vi)
- un ácido carboxílico de fórmula -(X_{4})n_{4}-COOH o un éster de fórmula -(X_{5})n_{5}-COO-X_{6}, donde X_{4}, X_{5}, y X_{6} son independientemente seleccionados del grupo compuesto por un alquilo que comprenda una cadena simple o ramificada de uno a cinco átomos de carbono, y n_{4} y n_{5} son independientemente 0 ó 1;
- (vii)
- una amida de fórmula -(X_{7})n_{7}-NHCOX_{8}, o de fórmula -(X_{9})n_{9}-CONX_{10}X_{11}, donde X_{7} y X_{9} son cada uno, independientemente, un alquilo que comprende una cadena simple o ramificada de uno a cinco átomos de carbono, y n_{7} y n_{9} son independientemente 0 ó 1; y donde X_{8}, X_{10} y X_{11} son cada uno independientemente hidrógeno o un alquilo que comprende una cadena simple o ramificada de uno a cinco átomos de carbono; o donde X_{10} y X_{11} forman juntos un anillo alifático o heteroalifático de cinco o seis miembros o un anillo bicíclico fusionado;
- (viii)
- una sulfonamida de fórmula -(X_{12})n_{12}-SO_{2}NX_{13}X_{14}, donde X_{12} es un alquilo que comprende una cadena simple o ramificada de uno a cinco átomos de carbono; n_{12} es 0 ó 1; y X_{13} y X_{14} son independientemente seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, y un anillo de cinco o seis miembros, aromático, heteroaromático, alifático, o heteroalifático, donde el alquilo y cada anillo es opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo compuesto por un alquilo C_{1}-C_{10}, hidroxi, halógeno, trihalometilo, -NH_{2}, -NO_{2}, -(R)n-COOH y -(R)n-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo compuesto por alquilo C_{1}-C_{10} saturado o insaturado y un anillo aromático o heteroaromático de cinco o seis miembros, y donde n es 0 ó 1; o donde X_{13} y X_{14} forman un anillo de cinco o seis miembros, alifático o heteroalifático, o un anillo bicíclico fusionado, opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo compuesto por un alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno, trihalometilo, -NH_{2}, -NO_{2}, -(R)n-COOH y -(R)n-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo compuesto por un alquilo saturado o insaturado C_{1}-C_{10} y un anillo de cinco o seis miembros, aromático o heteroaromático, y donde n es 0 ó 1;
- (ix)
- una amina de fórmula -(X_{16})n_{16}-NX_{17}X_{18}, donde X_{16} es un alquilo que comprende una cadena simple o ramificada de uno a cinco átomos de carbono; n_{16} es 0 ó 1; y X_{17} y X_{18} son independientemente seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10} saturado o insaturado, y un anillo de cinco o seis miembros, heteroaromático, o alifático donde cada anillo es opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo compuesto por un alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno, trihalometilo, -NH_{2}, -NO_{2}, -(R)n-COOH y -(R)n-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo compuesto por un alquilo saturado o insaturado C_{1}-C_{10} y un anillo de cinco o seis miembros aromático o heteroaromático, y donde n es 0 ó 1;
- (x)
- dos grupos R1 adyacentes junto con dos A, B, D, o E adyacentes forman un anillo de cinco o seis miembros alifático o heteroalifático.
- (b)
- R_{2}, R_{3} y R_{4} son hidrógeno.
- (c)
- R_{5} es seleccionado del grupo compuesto por hidrógeno y alquilo C_{1}-C_{10} saturado o insaturado.
- (d)
- A, B, D y E son cada uno independientemente carbono o nitrógeno; a condición de que ninguno, uno o dos del grupo A, B, D, y E sea nitrógeno; y a condición de que cuando cualquiera de A, B, D o E sea nitrógeno, R_{1} no se una a dichos A, B, D o E;
- (e)
- G es nitrógeno u oxígeno, con la condición de que cuando G sea oxígeno, R_{5} esté ausente.
- (f)
- m es 2, 3, ó 4; y
- (g)
- q es 1 ó 2 o una sal farmacéuticamente aceptable.
En un segundo aspecto está invención esta
dirigida a una composición farmacéutica que comprende uno o más
compuesto(s) de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente
aceptable de los mismos y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
En un tercer aspecto, esta invención esta
dirigida al uso de dichos compuestos en la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por una
protein quinasa. Tales enfermedades incluyen a forma de ejemplo,
pero no exclusivamente, cáncer, diabetes, cirrosis hepática,
enfermedades cardiovasculares tales como arteriosclerosis,
angiogénesis, enfermedades inmunológicas tales como enfermedad
autoinmune y enfermedad renal. Aunque no se limite a una protein
quinasa en particular, se cree que los compuestos de la invención
son selectivos para protein quinasas CDK2 sobre otras quinasas tales
como FLK, FGFR, EGFR, PDGFR, y SRC.
En un cuarto aspecto, esta invención está
dirigida a un método para modular la actividad catalítica de los PK,
en particular, tirosin quinasas receptoras (RTK), protein tirosin
quinasas no receptoras (CTK) y serina/treonina protein quinasas
(STK), usando un compuesto de esta invención que se puede llevar a
cabo in vitro. En particular, la protein quinasa receptora
cuya actividad catalítica se modula por un compuesto de esta
invención se selecciona del grupo que incluye EGF, HER2, HER3, HER4,
IR, IGF-1R, IRR, PDGFR\alpha, PDGFR\beta, CSFIR,
C-Kit, C-fms,
Flk-1R, Flk4, KDR/FLk-1,
Flt-1, FGFR-1R,
FGFR-2R, FGFR-3R y
FGFR-4R. La tirosin quinasa celular, cuya actividad
catalítica se modula por un compuesto de esta invención, se
selecciona del grupo compuesto por Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70,
Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr y Yrk. La
serina-treonina protein quinasa, cuya actividad
catalítica se modula por un compuesto de esta invención, se
selecciona del grupo compuesto por CDK2 y Raf.
En un quinto aspecto, esta invención está
dirigida al uso de un compuesto de Fórmula (I) en la preparación de
un medicamento útil en el tratamiento de una enfermedad mediada por
una actividad protein quinasa anormal.
A menos que se indique lo contrario, los
siguientes términos utilizados en la especificación y las
reivindicaciones tienen los significados descritos seguidamente:
Tal como se usa aquí, el término "alquilo"
se refiere a un grupo hidrocarburo alifático. La fracción alquilo
puede ser un grupo "alquilo saturado", lo que significa que no
contiene ninguna fracción de alqueno o alquino. La fracción alquilo
puede ser también una fracción de "alquilo insaturado", lo que
significa que contiene como mínimo una fracción de alqueno o
alquino. Una fracción "alqueno" se refiere a un grupo compuesto
por al menos dos átomos de carbono y al menos un doble enlace
carbono-carbono, y una fracción "alquino" se
refiere a un grupo compuesto por al menos dos átomos de carbono y al
menos un triple enlace carbono-carbono. La fracción
alquilo, sea saturada o insaturada, puede ser ramificada, no
ramificada o cíclica.
El grupo alquilo tiene de 1 a 10 átomos de
carbono (cuando aparezca en adelante un rango numérico como "1 a
10" se refiere a cada número entero en ese rango; por ejemplo
"1 a 10 átomos de carbono" significa que el grupo alquilo puede
contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de
carbono, etc., hasta los 10 átomos de carbono incluidos).
Preferentemente se trata de un alquilo "inferior" con de 1 a 4
átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo,
n-butilo, terc-butilo,
iso-butilo. El grupo alquilo puede estar sustituido
o no sustituido. Cuando es sustituido, los grupos sustituyentes son
preferiblemente uno o más grupos seleccionados individual e
independientemente de hidroxi, alcoxi, mercapto, alquiltio, ciano,
halo, carbonil, nitro y amino.
El término "aromático" se refiere a un grupo
aromático mono o bicíclico de 6 a 12 átomos de carbono que tiene al
menos un anillo con un sistema de electrones pi conjugado, por
ejemplo, los grupos antraceno, fenil o naftil.
El término "heteroaromático" se refiere a un
grupo aromático mono o bicíclico de 5 a 10 átomos en el anillo donde
uno, dos o tres átomos del anillo pertenecen al grupo formado por
nitrógeno, oxígeno o azufre, siendo de carbono el resto de átomos
del anillo, por ejemplo, piridina, pirrol, tiofeno, indol, imidazol,
quinolina, isoquinolina, pirazina, furano, pirimidina, oxazol,
triazol, pirazol y similares.
El término "anillo alifático" se refiere al
grupo cíclico saturado de 3 a 10 átomos de carbono, por ejemplo
ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclohexano y
similares.
El término "anillo heteroalifático" se
refiere a un grupo cíclico saturado de 5 a 10 átomos en el anillo
donde uno, dos o tres átomos pertenecen al grupo compuesto por
nitrógeno, azufre, sulfóxido, sulfona, grupo -SO_{2}O u oxígeno,
siendo carbono el resto de átomos del anillo, por ejemplo,
tetrahidropirano, piperidina, pirrolidina, piperazina, morfolina y
similares.
El término "amina" se refiere a una fracción
química de fórmula -NR_{a}R_{b}, donde R_{a} y R_{b} son
seleccionados independientemente del grupo compuesto por hidrógeno,
alquilo saturado o instaurado, y anillos aromáticos de cinco o seis
miembros, así como anillos heteroaromáticos, donde el anillo puede
ser sustituido con uno, dos o tres sustituyentes de forma
independiente seleccionados del grupo compuesto por fracciones
alquilo, halógeno, trihalometilo, carboxilato, nitro y éster.
El término "halógeno" se refiere a un átomo
del grupo compuesto por flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "trihalometil" se refiere al
grupo -CX_{3}, donde X es un halógeno, por ejemplo el
trifluorometilo.
El término "ácido carboxílico" o
"carboxilato" se refiere a una fracción química de fórmula
-(R)_{n}-COOH, donde R forma parte del
grupo compuesto por alquilos saturados e instaurados y los anillos
aromáticos de cinco o seis miembros, así como los anillos
heteroaromáticos, y donde n es 0 ó 1.
El término "éster" se refiere a una fracción
química de fórmula -(R)_{n}-COOR', donde R
y R' son seleccionados independientemente del grupo compuesto por
alquilos saturados o insaturados y anillos aromáticos o anillos
heteroaromáticos de cinco o seis miembros y donde n es 0 ó 1.
El término "aldehído" se refiere a una
fracción química con fórmula -(R)_{n}-CHO,
donde R es seleccionada de un grupo compuesto por alquilo saturado o
insaturado y anillos aromáticos de cinco o seis miembros o
anillosheteroaromáticos y donde n es 0 ó 1.
El término "alcoxi" se refiere al grupo
-OR_{c}, donde R_{c} es un alquilo inferior sin sustituir, por
ejemplo metoxi, etoxi, propoxi, butoxi y similares.
El término "anillo bicíclico fusionado" se
refiere al anillo heteroalifático de cinco o seis miembros fusionado
con un anillo aromático o heteroaromático. Un ejemplo no limitante
de un anillo bicíclico fusionado es:
"opcional" u "opcionalmente" significa
que el hecho o circunstancia descritos posteriormente pueden, pero
no necesariamente, ocurrir y que la descripción incluye ejemplos
donde la situación o circunstancia ocurre y ejemplos donde no
ocurre. En el caso "grupo alquilo opcionalmente sustituido con
halógeno", eso significa que el halógeno puede estar presente o
no, y la descripción incluye situaciones donde el grupo alquilo está
sustituido con un grupo halógeno y situaciones donde el grupo
alquilo no está sustituido con el grupo halógeno.
Los compuestos que tienen la misma fórmula
molecular pero difieren en la naturaleza o secuencia de la unión de
sus átomos o la organización de sus átomos en el espacio son
llamados "isómeros". Los isómeros que se diferencian por la
organización de sus átomos en el espacio se llaman
"estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes
especulares entre ellos se llaman "diastereómeros" y aquéllos
que no son imágenes superponibles entre sí se llaman
"enantiómeros". Cuando un compuesto tiene un centro asimétrico,
por ejemplo, está unido a cuatro grupos diferentes, se hace posible
la existencia de un par de enantiómeros. Un enantiómero puede
caracterizarse por la configuración absoluta de su centro asimétrico
y viene descrito por las leyes de secuenciación R- y S- de Cahn y
Prelog, o por la manera en la que la molécula rota el plano de la
luz polarizada y es designada como dextrógira o levógira (p.ej.,
como isómeros (+) o (-) respectivamente). Un compuesto quiral puede
existir como enantiómero individual o como una mezcla. Una mezcla
que contenga proporciones iguales de enatiómeros recibe el nombre de
"mezcla racémica".
Los compuestos de esta invención pueden contener
uno o más centros asimétricos. Estos compuestos pueden, por tanto,
producirse como estereoisómeros (R)- o (S)- individuales o como
mezclas de los mismos. Por ejemplo, si el sustituyente R^{1} en un
compuesto de Fórmula (I) es 2-metoxietilo, entonces
el carbono al que se une el grupo metoxi es un centro asimétrico y,
por lo tanto, el compuesto de Fórmula (I) puede existir como
estereoisómero (R)- o (S)-. A menos que se indique lo contrario, la
descripción y nomenclatura de compuestos particulares en las
especificaciones y reivindicaciones pretende incluir tanto los
enantiómeros individuales como las mezclas, ya sean racémicas o no,
de los mismos. Los métodos para la determinación de estereoquímica y
la separación de estereoisómeros son conocidas en la materia (ver
discussion en el capítulo 4 de "Advanced Organic
Chemistry", 4ª edición J. March, John Wiley e hijos, Nueva York,
1992).
Los compuestos de Fórmula (I) pueden mostrar los
fenómenos de tautomerismo y de isomerismo estructural. Por ejemplo,
los compuestos que aquí se describen pueden adoptar la configuración
E o la Z en el enlace doble entre la fracción
2-indolinona y la fracción pirrol, o pueden ser una
mezcla de E y Z. Esta invención incluye cualquier forma isomérica
estructural o tautomérica, y las mezclas de los mismos, que tienen
la capacidad de modular la actividad RTK, CTK y/o STK, y no está
limitada a una sola forma isomérica estructural o tautomérica.
Una "composición farmacéutica" se refiere a
la mezcla de uno o más compuestos aquí descritos, o sales
fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables o las profármacos de
las mismas, con otros compuestos químicos, tales como excipientes y
portadores fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables. El
propósito de una composición farmacéutica es facilitar la
administración de un compuesto a un organismo.
Tal como se usa aquí, un "vehículo
farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o diluyente
que no provoca irritación significativa en un organismo y no anula
la actividad y las propiedades biológicas del compuesto
administrado.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable"
se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición
farmacéutica para facilitar la administración de un compuesto.
Ejemplos, sin limitación, de excipientes pueden ser el carbonato de
calcio, el fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón,
derivados de la celulosa, gelatina, aceites vegetales y glicoles
polietilenos.
Tal como se usa aquí, el término "sal
farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que
retienen la efectividad y las propiedades biológicas del compuesto
del que proceden. Estas sales incluyen:
(i) sal de adición ácida, que se obtiene por
reacción de la base libre del compuesto padre con ácidos inorgánicos
como el ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido
fosfórico, ácido sulfúrico, ácido perclórico y similares, o con
ácidos orgánicos como el ácido acético, ácido oxálico, ácido málico
(D) o (L), ácido maleico, ácido metanosulfónico, ácido
etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico,
ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido masónico y
similares, preferiblemente ácido clorhídrico o ácido
(L)-málico como la sal L-malato del
ácido
5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilico
y la (2-dietilaminoetil)amida; o
(ii) sales formadas cuando un protón acídico
presente en el compuesto padre es o bien reemplazado por un ión
metálico (p.ej. un ión álcali metálico, un ión alcalinotérreo, o un
ión de aluminio) o se coordina con una base orgánica como la
etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina,
N-metilglucamina, y similares.
"PK" se refiere al receptor tirosin quinasa
(RTK), tirosin quinasa no receptor o "celular" (CTK) y
serina-treonin quinasa (STK).
"Modulación" o "modulante" se refiere a
la alteración de la actividad catalítica de las protein quinasas, en
particular la quinasa CDK2. Concretamente, modulante se refiere a la
activación de la actividad catalítica, preferiblemente la activación
o inhibición de la actividad catalítica de protein quinasas, en
particular CDK2, dependiendo de la concentración del compuesto o sal
a la que se expone la protein quinasa, en particular la quinasa
CDK2, o preferiblemente, la inhibición de la actividad catalítica de
las protein quinasas, en particular la quinasa CDK2.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" se
refiere a la cantidad de compuesto administrado que mitigará, en
parte, uno o más de los síntomas de la enfermedad tratada. Con
referencia al tratamiento contra el cáncer, una cantidad
terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad que tiene el
efecto de:
(1) reducir el tamaño del tumor;
(2) inhibir (esto es, ralentizar hasta cierto
punto, preferiblemente parar) la metástasis del tumor;
(3) inhibir (esto es, ralentizar hasta cierto
punto, preferiblemente parar) el crecimiento del tumor; y/o
(4) mitigar, hasta cierto punto (preferiblemente
eliminar) uno o más síntomas asociados con el cáncer.
El término "función" se refiere al papel
celular de la protein quinasa. La familia protein quinasa incluye
miembros que regulan muchos pasos de las cascadas de señalización,
incluyendo cascadas del control del crecimiento celular, migración,
diferenciación, expresión genética, contracción muscular,
metabolismo de la glucosa, síntesis proteica celular y regulación
del ciclo celular.
El término "actividad catalítica", en el
contexto de la invención, define el ritmo al que la protein quinasa
fosforila un sustrato. La actividad catalítica puede medirse, por
ejemplo, determinando la cantidad de sustrato convertido en producto
en función del tiempo. La fosforilación de un sustrato ocurre en el
centro activo de la protein quinasa. El centro activo es normalmente
una cavidad en la que el sustrato se une a la protein quinasa y es
fosforilado.
El término "sustrato", tal como se usa aquí,
se refiere a una molécula fosforilada por una protein quinasa. El
sustrato es preferiblemente un péptido y preferentemente una
proteína.
El término "activar" se refiere a
incrementar la función celular de una protein quinasa. La función de
la protein quinasa es preferiblemente la interacción con una pareja
de unión natural y preferentemente la actividad catalítica.
El término "inhibir" se refiere a disminuir
la función celular de una protein quinasa. La función de la protein
quinasa es preferiblemente la interacción con una pareja de unión
natural y preferentemente la actividad catalíti-
ca.
ca.
El término "modular" se refiere a alterar la
función de una protein quinasa incrementando o disminuyendo la
probabilidad de que se forme un complejo entre una protein quinasa y
una pareja de unión. Un modulador preferiblemente aumenta la
probabilidad de que esos complejos se formen entre las protein
quinasas y las parejas de unión, y preferentemente aumentan o
disminuyen la probabilidad de que un complejo se forme entre la
protein quinasa y la pareja de unión en función de la concentración
del compuesto expuesto a la protein quinasa. Idóneamente disminuye
la probabilidad de que un complejo se forme entre la protein quinasa
y su pareja de unión. Un modulador preferiblemente activa la
actividad catalítica de una protein quinasa, pero preferentemente
activa o inhibe la actividad catalítica de una protein quinasa en
función de la concentración del compuesto expuesto a la protein
quinasa, e idóneamente inhibe la actividad catalítica de la protein
quinasa.
El término "complejo" se refiere a la unión
de por lo menos dos moléculas ligadas entre si. Los complejos de
transducción de la señal a menudo contienen por lo menos dos
moléculas proteicas ligadas entre si.
El término "pareja de unión" se refiere al
compuesto que se une a la protein quinasa en las células. Las
parejas de unión pueden jugar un papel importante en la propagación
de la señal en el proceso de transducción de señal de la protein
quinasa. Un cambio en la interacción entre la protein quinasa y su
pareja de unión puede manifestarse como un aumento o disminución en
la probabilidad de que se cree una interacción, o un aumento o
descenso de la concentración de los complejos de protein
quinasa/pareja de unión. Una pareja de unión puede ser una pareja de
unión natural, en cuyo caso la pareja de unión es la que se une a la
protein quinasa durante la función celular normal. Sin embargo,
otras moléculas que se unen a la protein quinasa son también parejas
de unión de la protein quinasa.
Una pareja de unión de la protein quinasa puede
unirse a la región intracelular de la protein quinasa con una gran
afinidad. La alta afinidad representa una constante de unión en
equilibrio del orden de 10^{-6}M o menos. Además, una pareja de
unión natural puede también interactuar de forma transitoria con la
región intracelular de la protein quinasa y modificarla
químicamente. Las parejas de unión naturales de la protein quinasa
pertenecen a un grupo que incluye, pero no exclusivamente, los
dominios SH2 y SH3 (de homología al dominio 2 y 3 de la proteína
SRC), otros dominios de unión a fosforiltirosina (PTB),
factores de cambio de nucleótidos de guanina, fosfatasas proteicas,
y otras protein quinasas. Existen métodos para determinar los
cambios en las interacciones entre las protein quinasas y sus
parejas de unión natural.
El término "contactar", tal como se usa
aquí, se refiere a mezclar una solución que contiene un compuesto de
la invención con un medio líquido bañando las células del método. La
solución que contiene el compuesto puede contener también otro
componente, como el dimetilsulfóxido (DMSO), que facilita la
absorción del compuesto o compuestos a dentro de la célula del
método. La solución que contiene el compuesto de la invención puede
añadirse al medio que baña las células utilizando un dispositivo de
dispensación, basado en pipetas o en jeringas.
Los compuestos de la invención modulan
preferiblemente la actividad de la protein quinasa in vitro.
Estos componentes preferiblemente muestran resultados positivos en
uno o más ensayos in vitro para una actividad correspondiente
al tratamiento de la enfermedad o trastorno en cuestión (como los
ensayos descritos en los ejemplos posteriores).
La invención también pone de relieve un método
para identificar compuestos que modulan la función de la protein
quinasa, cuyos pasos son: (a) contactar células que expresan la
protein quinasa con el compuesto; y (b) monitorizar el efecto sobre
las células. El efecto sobre las células es preferiblemente un
cambio o ausencia de cambio en el fenotipo de la célula,
preferentemente es un cambio o ausencia de cambio en la
proliferación celular, de forma aún más preferente es un cambio o
ausencia de cambio en la actividad catalítica de la protein quinasa,
e idóneamente es un cambio o ausencia de cambio en la interacción
entre la protein quinasa con una pareja de unión natural, como aquí
se describe.
El término "monitorizar" se refiere a
observar el efecto de la adición de compuestos a las células del
método. El efecto puede manifestarse en un cambio en el fenotipo
celular, proliferación celular, actividad catalítica de la protein
quinasa, o en la interacción entre la protein quinasa y su pareja de
unión natural.
El término "efecto" describe un cambio o
ausencia de cambio en el fenotipo celular o proliferación celular.
"Efecto" también puede describir un cambio o ausencia de cambio
en la actividad catalítica de la protein quinasa. "Efecto"
también puede describir un cambio o ausencia de cambio en la
interacción entre la protein quinasa y su pareja de unión
natural.
El término "fenotipo celular" se refiere a
la apariencia exterior de una célula o tejido, o la función de la
célula o tejido. Ejemplos de fenotipos celulares son el tamaño
celular (reducción o aumento), proliferación celular (aumento o
disminución en el número de células), diferenciación celular (cambio
o ausencia de cambio en la forma celular), supervivencia celular,
apoptosis (muerte celular) o la utilización de un nutriente
metabólico (p.ej. absorción de glucosa). Actualmente es posible
medir los cambios o la ausencia de cambios en el fenotipo celular
mediante técnicas conocidas en este campo.
En una realización preferida, la invención pone
de relieve un método para identificar los compuestos de la
invención, siguiendo los siguientes pasos: (a) lisar las células
para verter un lisado compuesto por protein quinasa; (b) adsorber la
protein quinasa a un anticuerpo; (c) incubar la protein quinasa
adsorbida con un sustrato o sustratos; y (d) adsorber el sustrato o
sustratos a un soporte sólido o anticuerpo.
En otras realizaciones preferidas, el paso de
monitorizar el efecto sobre las células incluye medir la
concentración de fosfato del sustrato o sustratos.
El término "anticuerpo" se refiere a un
anticuerpo (p.ej., un anticuerpo monoclonal o policlonal), o
fragmento de anticuerpo, con afinidad de unión específica para
protein quinasa o su fragmento.
Por "afinidad de unión específica" se
entiende que el anticuerpo se une a polipéptidos diana (protein
quinasa) con mayor afinidad que con la que se une a otros
polipéptidos bajo las condiciones especificadas. Los anticuerpos con
afinidad de unión específica a una protein quinasa pueden usarse en
métodos para detectar la presencia y/o cantidad de protein quinasa
en una muestra al poner en contacto la muestra con el anticuerpo
bajo condiciones tales que se forma un inmunocomplejo y detectar la
presencia y/o cantidad de conjugado de anticuerpos para la protein
quinasa. Los equipos de diagnóstico para llevar a cabo estos métodos
pueden construirse para incluir un primer contenedor con anticuerpo
y un segundo contenedor con conjugado de una pareja de unión del
anticuerpo y una señal, como por ejemplo, un radioisótopo. El equipo
de diagnóstico puede incluir también notificación de las
instrucciones y el uso aceptado por la FDA.
El término "policlonal" se refiere a los
anticuerpos que son poblaciones heterogéneas de moléculas de
anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un
antígeno o derivado funcional de un antígeno. Para la producción de
anticuerpos policlonales, se puede inmunizar varios animales huésped
mediante inyección con antígeno. Se puede utilizar varios adyuvantes
para aumentar la respuesta inmunológica, en función de la especie
del
huésped.
huésped.
Los "anticuerpos monoclonales" son
poblaciones sustancialmente homogéneas de anticuerpos para un
antígeno concreto. Pueden obtenerse mediante cualquier técnica que
provoque la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas
celulares continuas en cultivo. Los anticuerpos monoclonales pueden
obtenerse mediante métodos conocidos por aquéllos expertos en la
materia. Ver, por ejemplo, Kohler, et al., Nature
256:495-497 (1975), y la Patente
Estadounidense nº 4.376.110.
El término "fragmento de anticuerpo" se
refiere a una porción de un anticuerpo, normalmente la región y las
porciones de las cadenas pesadas y ligeras circundantes, que
manifiesta una afinidad de unión específica para una molécula
concreta. Una región hipervariable es una porción de un anticuerpo
que se une físicamente al polipéptido diana.
El término "aberración", en conjunción con
un proceso de transducción de señal, se refiere a una protein
quinasa que está sub- o sobreexpresada en un organismo, mutada de
tal forma que su actividad catalítica es menor o mayor que la de la
protein quinasa salvaje, mutada de tal forma que no puede seguir
interactuando con una pareja de unión natural, no puede seguir
siendo modificada por otra protein quinasa o protein fosfatasa, o no
puede seguir interactuando con una pareja de unión natural.
Los términos "fomentar o interrumpir la
interacción anormal" se refieren a un método que puede llevarse a
cabo mediante la administración de un compuesto de la invención a
las células o tejidos en un organismo. Un compuesto puede fomentar
la interacción entre una protein quinasa y su pareja de unión
natural formando interacciones favorables con múltiples átomos en la
interfaz del complejo. Como alternativa, un compuesto puede inhibir
una interacción entre una protein quinasa y sus parejas de unión
naturales comprometiendo las interacciones favorables entre átomos
en la interfaz del complejo.
El término "indolinona" se usa tal y como se
entiende comúnmente en la materia e incluye una gran subclase de
compuestos sustituidos o no sustituidos que pueden ser sintetizados
a partir de una fracción de aldehído y una fracción oxindol.
El término "oxindol" se refiere a un
compuesto de oxindol sustituido con sustityentes químicos. Los
compuestos de oxindol tienen la estructura general siguiente:
En realizaciones preferidas, la invención se
refiere a un compuesto de Fórmula (I) donde
(a) cada R1 es opcional e independientemente
seleccionado del grupo compuesto por (i) hidrógeno; (ii) metilo,
etilo, propilo, etileno, propileno, o butileno; (iii) un alcohol de
fórmula -(X_{1})n_{1}-OH o un
alcoxialquilo de fórmula
(X_{2})_{n2}-O-X_{3},
donde X_{1}, X_{2}, y X_{3} son independientemente
seleccionados del grupo compuesto por metileno, etileno, o
propileno, y n1 y n2 son independientemente 0 ó 1; (iv) flúor,
cloro, o bromo; (v) un ácido carboxílico de fórmula
-(X_{4})_{n4}-COOH, donde X_{4} se selecciona del grupo compuesto por metileno, etileno, o propileno, y n4 es 0 ó 1; (vi) una amida de fórmula -(X_{7})n_{7}-NHCOX_{8}, o de fórmula -(X_{9})n_{9}-CONX_{l0}X_{11}, donde X_{7} y X_{9} son cada uno independientemente seleccionados del grupo compuesto por metileno, etileno, y propileno, y n_{7} y n_{9} son independientemente 0 ó 1, X_{8}, X_{10}, y X_{11} son cada uno independientemente seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, metilo, etilo, propilo, o donde X_{10} y X_{11} juntos forman un anillo de cinco o seis miembros heteroalifático; (vii) una sulfonamida de fórmula -(X_{12})n_{12}-SO_{2}NX_{13}X_{14}, donde X_{12} se selecciona del grupo compuesto por metileno, etileno, o propileno, y n_{12} es 0 ó 1, X_{13}, y X_{14} son independientemente seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, metilo, etilo, propilo, y fenilo, el metilo, etilo, propilo, y fenilo están opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo compuesto por halógeno, hidroxi, -NH_{2},-NO_{2}, -(R)_{n}-COOH y -(R)-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo compuesto por alquilo saturado o insaturado C_{1}-C_{10} y un anillo de cinco o seis miembros aromático o heteroaromático: y donde n es 0 ó 1; o donde X_{13} y X_{14} juntos forman un anillo fusionado bicíclico; o (viii) dos grupos R_{1} adyacentes junto con dos A, B, D, o E adyacentes forman un anillo heteroalifático de seis miembros; (b) A, B, D, y E son carbonos (c) G es nitrógeno u oxígeno; (d) m es 1 ó 2; y (e) q es 2.
-(X_{4})_{n4}-COOH, donde X_{4} se selecciona del grupo compuesto por metileno, etileno, o propileno, y n4 es 0 ó 1; (vi) una amida de fórmula -(X_{7})n_{7}-NHCOX_{8}, o de fórmula -(X_{9})n_{9}-CONX_{l0}X_{11}, donde X_{7} y X_{9} son cada uno independientemente seleccionados del grupo compuesto por metileno, etileno, y propileno, y n_{7} y n_{9} son independientemente 0 ó 1, X_{8}, X_{10}, y X_{11} son cada uno independientemente seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, metilo, etilo, propilo, o donde X_{10} y X_{11} juntos forman un anillo de cinco o seis miembros heteroalifático; (vii) una sulfonamida de fórmula -(X_{12})n_{12}-SO_{2}NX_{13}X_{14}, donde X_{12} se selecciona del grupo compuesto por metileno, etileno, o propileno, y n_{12} es 0 ó 1, X_{13}, y X_{14} son independientemente seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, metilo, etilo, propilo, y fenilo, el metilo, etilo, propilo, y fenilo están opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo compuesto por halógeno, hidroxi, -NH_{2},-NO_{2}, -(R)_{n}-COOH y -(R)-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo compuesto por alquilo saturado o insaturado C_{1}-C_{10} y un anillo de cinco o seis miembros aromático o heteroaromático: y donde n es 0 ó 1; o donde X_{13} y X_{14} juntos forman un anillo fusionado bicíclico; o (viii) dos grupos R_{1} adyacentes junto con dos A, B, D, o E adyacentes forman un anillo heteroalifático de seis miembros; (b) A, B, D, y E son carbonos (c) G es nitrógeno u oxígeno; (d) m es 1 ó 2; y (e) q es 2.
Aún más preferiblemente, R_{1} en la Fórmula I
es independientemente seleccionado del grupo compuesto por metilo,
metoxi, 2-hidroxietilo, fenilo,
2-metoxifenilo, 3-metoxifenilo,
4-metoxifenilo, 4-fluorofenilo,
4-clorofenilo, 4-bromofenilo,
4-yodofenilo, 3-carboxifenilo,
piridilo, -NHC(O)CH3,
-C(O)N(CH_{3}), -COOH,
-SO_{2}NH(CH_{3}), -SO_{2}NH_{2},
-SO_{2}N(CH_{3})_{2},
-SO_{2}NH(CH(CH_{3})_{2}),
-SO_{2}NH(C_{6}H_{5}),
-SO_{2}NH(3-clorofenilo), y
-SO_{2}N(CH_{3})(3-clorofenilo), y m es 1
ó 2.
Los compuestos de indolinona preferidos de la
invención se enumeran en la Tabla 1.
Alguno de los compuestos anteriores tiene la
estructura de Fórmula II, con los sustituyentes que se definen en la
Tabla 2.
Dos de los compuestos de la Tabla 1 tienen la
estructura de la Fórmula III, con los sustituyentes como se define
en la Tabla 3
En general, los compuestos de la Fórmula I se
pueden preparar por reacción de un oxindol que tiene la siguiente
estructura
Con un aldehído o cetona que tiene la siguiente
estructura
Donde R_{1}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, A, B,
D, E, G, m, y q son como se describe en el Resumen de la
Invención.
El oxindol seleccionado del grupo compuesto por
4-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida,
4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-metoxi-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-metoxi-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
4-(2-hidroxi-etil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
2-oxo-5-fenil-1,2-dihidro-indol,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilsulfonamida,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-isopropilsulfonamida,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-fenilsulfonamida,
N-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-il)-acetamida,
2-oxo-6-fenil-1,2-dihidro-indol,
5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
ácido
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico,
ácido
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-carboxílico,
6-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-(2-metoxi-fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-(3-metoxi-fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-(4-metoxi-fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-(4-fluoro-fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
2-oxo-6-piridin-3-il-1,2-dihidro-indol,
5-(2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-(3,4-dihidro-2H-quinolin-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-(3,4-dihidro-1H-isoquinolin-2-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihi-
dro-indol, 5-(5-bromo-2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol, 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-cloro-fenil)metilsulfonamida, 6-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol, 5-cloro-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol, 7-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol, ácido 3-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-il)-benzoico, ácido 3-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-il)-benzoico, 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-cloro-fenil)-sulfonamida, 5-bromo-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol, 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilcarboxamida, 2-oxo-5-(pirrolidina-1-carbonil)-1,2-dihidro-indol, 5-(morfolin-4-carbonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol, y
dro-indol, 5-(5-bromo-2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol, 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-cloro-fenil)metilsulfonamida, 6-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol, 5-cloro-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol, 7-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol, ácido 3-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-il)-benzoico, ácido 3-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-il)-benzoico, 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-cloro-fenil)-sulfonamida, 5-bromo-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol, 2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilcarboxamida, 2-oxo-5-(pirrolidina-1-carbonil)-1,2-dihidro-indol, 5-(morfolin-4-carbonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol, y
El aldehído se selecciona del grupo compuesto por
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-2-formilpirano[3,4-c]pirrol
y
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-(1H-2-formil-pirrol)[3,4-c]piridina.
La reacción se lleva a cabo en presencia de una
base. La base es preferiblemente una base nitrogenada o una base
inorgánica. Las "Bases nitrogenadas" son comúnmente usadas en
la materia y son seleccionadas de aminas acíclicas y cíclicas. Entre
los ejemplos de bases nitrogenadas se incluye, pero no
exclusivamente, amoníaco, metilamina, trimetilamina, trietilamina,
anilina,
1,8-diazabiciclo-[5.4.0]undec-7-eno,
diisopropiletilamina, pirrolidina, piperidina, y piridina o
piridina sustituida (p.ej.,
2,6-di-terc-butilpiridina).
Las "Bases inorgánicas" son bases que no contienen ningún átomo
de carbono. Entre los ejemplos de bases inorgánicas se incluye,
pero no exclusivamente, hidróxido, fosfato, bisulfato, hidrosulfuro
(SH^{-}), y aniones amida. Aquéllos que sean expertos en la
materia sabrán que la base nitrogenada o inorgánica satisfaría los
requisitos de las condiciones de reacción. En ciertas realizaciones
de la invención, la base usada puede ser pirrolidina o piperidina.
En otras realizaciones la base puede ser el anión hidróxido,
preferiblemente usado como su sal de sodio o potasio.
La síntesis de los compuestos de la invención
generalmente tiene lugar en un solvente. El solvente de la invención
es preferiblemente un solvente prótico o un solvente aprótico. Los
"Solventes próticos" son aquéllos que son capaces de dar un
protón a un soluto. Ejemplos de solventes próticos se incluye, pero
no exclusivamente, alcoholes y agua. Los "Solventes apróticos"
son aquéllos que, bajo condiciones de reacción normales, no dan un
protón a un soluto. Los solventes orgánicos típicos, tales como
hexano, tolueno, benceno, cloruro de metileno, dimetilformamida,
cloroformo, tetrahidrofurano, son algunos de los ejemplos de
solventes orgánicos. Otros solventes apróticos también están
incluidos en el alcance de la presente invención. En algunas
realizaciones preferidas, el solvente de la reacción es un alcohol,
que puede ser preferiblemente isopropanol o preferentemente etanol.
El agua es otro solvente prótico preferido. La dimetilformamida,
conocida en el campo de la química como DMF, es un solvente aprótico
preferido.
El método sintético de la invención exige que la
reacción tenga lugar a elevadas temperaturas, que son mayores que la
temperatura ambiente. Preferiblemente, la temperatura elevada es de
alrededor de 30-150ºC, más preferentemente oscila
entre alrededor de 80-100ºC, e idóneamente oscila
entre alrededor de 80-90ºC, que es aproximadamente
la temperatura a la que hierve el etanol (es decir, el punto de
ebullición del etanol). Por "alrededor" de una temperatura
concreta se entiende que el rango de temperatura está
preferiblemente dentro de 10ºC respecto a la temperatura nombrada,
preferentemente dentro de 5ºC respecto a la temperatura nombrada, e
idóneamente de 2ºC respecto a la temperatura nombrada. Por lo tanto,
a modo de ejemplo, por "alrededor de 80ºC" se entiende que el
rango de temperatura es preferiblemente de 80\pm10ºC,
preferentemente de 80\pm5ºC, e idóneamente de 80\pm2ºC.
El oxindol en la biblioteca combinatoria es
preferiblemente seleccionado del grupo compuesto por ácido
4-metil-2-oxo-2,3-dihidro-4-indol-5-sulfónico,
metilamida,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida,
4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-metoxi-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-metoxi-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
4-(2-hidroxi-etil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
2-oxo-5-fenil-1,2-dihidro-indol,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilsulfonamida,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-isopropilsulfonamida,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-fenilsulfonamida,
N-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-il)-acetamida,
2-oxo-6-fenil-1,2-dihidro-indol,
5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
ácido
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico,
ácido
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-carboxílico,
6-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-(2-metoxi-fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-(3-metoxi-fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-(4-metoxi-fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
6-(4-fluoro-fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
2-oxo-6-piridin-3-il-1,2-dihidro-indol,
5-(2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-(3,4-dihidro-2H-quinolin-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-(3,4-dihidro-1H-isoquinolin-2-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-(5-bromo-2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-(clorofenil)-metilsulfonamida,
6-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
5-cloro-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
7-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
ácido
3-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-indo-5-il)-benzoico,
3-(2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-il)-benzoico,
ácido
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-cloro-fenil)sulfonamida,
5-bromo-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol,
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilcarboxamida,
2-oxo-5-(pirroli-
din-1-carbonil)-1,2-dihidroindol, 5-(morfolin-4-carbonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol, y
din-1-carbonil)-1,2-dihidroindol, 5-(morfolin-4-carbonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol, y
El aldehído es preferiblemente seleccionado del
grupo compuesto por
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-2-formilpirano[3,4-c]pirrol,
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-(1H-2-formil-pirrolo)[3,4-c]piridina,
y
El método sintético de la invención puede estar
acompañado por un cribado de una biblioteca para buscar un compuesto
con la actividad y estructura deseadas -proporcionando así un método
de síntesis de un compuesto mediante, un cribado inicial en busca de
un compuesto con las propiedades deseadas y la posterior síntesis
química de este compuesto.
La presente invención está relacionada con
compuestos capaces de regular y/o modular la transducción de señal
celular y, en realizaciones preferidas, la transducción de señal de
trirosin quinasa receptora y no receptora.
La transducción de señal mediada por la quinasa
receptora se inicia por interacción extracelular con un factor de
crecimiento específico (ligando), seguida por la dimerización del
receptor, una estimulación transitoria de la actividad intrínseca de
la protein quinasa y una fosforilación. Los sitios de unión son, de
esta manera, creados por moléculas de transducción de señal y van
dirigidos a la formación de complejos con un espectro de moléculas
de señalización citoplasmática que facilitan la respuesta celular
apropiada (p.ej., división celular, efectos metabólicos al
microambiente extracelular). Ver, Schlessinger y Ullrich, 1992,
Neuron 9:303-391.
Se ha observado que los sitios de fosforilación
de la tirosina en los receptores de factor de crecimiento funcionan
como sitios de unión de alta afinidad para los dominios SH2
(homología src) de moléculas de señalización. Fantl et
al., 1992, Cell 69:413-423;
Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol.
14:2777-2785); Songyang et al., 1993,
Cell 72:767-778; y Koch et
al., 1991, Science 252:668-678.
Muchas de las proteínas del sustrato intracelular que se asocian con
las quinasas receptoras han sido identificadas. Pueden ser divididas
en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio
catalítico; y (2) sustratos que carecen de tal dominio pero sirven
como adaptadores y se asocian con moléculas activas catalíticamente
(Songyang et al., 1993, Cell
72:767-778). La especificidad de las
interacciones entre receptores y dominios SH2 de sus sustratos se
determina por los residuos aminoacídicos inmediatamente contiguos al
residuo tirosina fosforilado. Las diferencias en las afinidades de
unión entre los dominios SH2 y las secuencias aminoacídicas
contiguas a los residuos fosfotirosina en receptores concretos son
consecuentes con las diferencias observadas en sus perfiles de
fosforilación de sustrato. Songyang et al., 1993, Cell
72:767-778. Estas observaciones sugieren que
la función de cada receptor quinasa viene dada no sólo por su patrón
de expresión y disponibilidad de ligando, sino también por la
selección de las vías de transducción de señal corriente abajo que
se activan con un receptor concreto. Así la fosforilación
proporciona un paso regulador importante que determina la
selectividad de las vías de señalización empleadas por receptores de
factor de crecimiento específico, así como los receptores del factor
de diferenciación.
La transducción de la señal quinasa da como
resultado, entre otras respuestas, la proliferación, la
diferenciación y el metabolismo celular. La proliferación de células
anormales puede ocasionar un gran número de enfermedades y
trastornos, incluyendo el desarrollo de neoplasia como el carcinoma,
sarcoma, leucemia, glioblastoma, hemangioma, soriasis,
arteriosclerosis, artritis y retinopatía diabética (u otros
trastornos relacionados con angiogénesis y/o vasculogénesis
incontroladas)
Esta invención está por tanto dirigida a
compuestos que regulan, modulan y/o inhiben la transducción de la
señal quinasa afectando la actividad enzimática de los RK y/o las
quinasas no receptoras, o interfiriendo la señal transducida
mediante dichas proteínas. Más concretamente, la presente invención
está dirigida a compuestos que regulan, modulan y/o inhiben el
receptor tirosin quinasa (RTK) y/o las vías de transducción de señal
mediadas por las quinasas no receptoras como enfoque terapéutico
para curar varios tipos de tumores, incluyendo, pero no
exclusivamente, el carcinoma, sarcoma, eritroblastoma, glioblastoma,
meningioma, astrocitoma, melanoma y miobalastoma. Las indicaciones
pueden incluir, pero no exclusivamente, cánceres cerebrales,
cánceres de vejiga, cánceres de ovario, cánceres gástricos, cánceres
de páncreas, cánceres de colon, cánceres de sangre, cánceres de
pulmón y cánceres de huesos.
Los compuestos descritos aquí son útiles para el
tratamiento de trastornos relacionados con la transducción de señal
quinasa no reguladas, incluyendo los trastornos de proliferación
celular, los trastornos fibróticos y los metabólicos.
Los trastornos de proliferación celular, que
pueden tratarse o estudiarse mediante la presente invención,
incluyen cánceres, trastornos de proliferación de células vasculares
y trastornos de proliferación de células mesangiales.
Los trastornos de células vasculares se refieren
a trastornos angiogénicos y vasculogénicos que generalmente tienen
como resultado la proliferación anormal de los vasos sanguíneos. La
formación y propagación de los vasos sanguíneos, vasculogénesis y
angiogénesis respectivamente, juegan papeles importantes en varios
procesos fisiológicos como el desarrollo embrionario, la formación
del cuerpo lúteo, regeneración de cicatrices y órganos dañados.
También tienen un papel importante en el desarrollo del cáncer.
Otros ejemplos de trastornos de proliferación vascular incluyen
artritis, donde los nuevos vasos sanguíneos capilares invaden las
articulaciones y destruyen el cartílago, y enfermedades oculares,
como la retinopatía diabética, donde los capilares de la retina
invaden el vítreo, sangran y causan ceguera. En cambio, los
trastornos relacionados con la retracción, contracción oclusión de
los vasos sanguíneos, como restenosis, también están implicados.
Los trastornos fibróticos se refieren a la
formación anormal de matriz extracelular. Entre los ejemplos de
trastornos fibróticos se encuentra la cirrosis hepática y los
trastornos de proliferación de células mesangiales. La cirrosis
hepática se caracteriza por un aumento en los constituyentes de la
matriz extracelular que provoca la formación de una cicatriz
hepática. La cirrosis hepática puede causar enfermedades como la
cirrosis del hígado. Una matriz extracelular aumentada que provoca
una cicatriz hepática también puede estar causada por una infección
viral como la hepatitis. Los lipocitos parecen jugar un papel básico
en la cirrosis hepática. Otros trastornos fibróticos implicados
incluyen la arteriosclerosis (ver abajo).
Los trastornos proliferativos de células
mesangiales se refieren a trastornos ocasionados por proliferación
anormal de las células mesangiales. Los trastornos proliferativos
mesangiales incluyen varias enfermedades renales humanas, como la
glomerulonefritis, la nefropatía diabética, la nefrosclerosis
maligna, los síndromes microangiopáticos trombóticos, el rechazo a
transplantes y las glomerulopatías. Se ha visto que el
PDGF-R está implicado en el mantenimiento de la
proliferación de células mesangiales. Floege et al., 1993,
Kidney International 43:47S-54S.
Se ha asociado los PTK con los trastornos
proliferativos de esas células. Por ejemplo, algunos miembros de la
familia de los RTK se han asociado con el desarrollo del cáncer.
Algunos de estos receptores, como el EGFR (Tuzi et al., 1991,
Br. J. Cancer 63:227-223; Torp et
al., 1992, APMIS 100:713-719), el
HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science
244:707-712) y el PDGF-R
(Kumabe et al., 1992, Oncogene
7:627-633), están sobreexpresados en muchos
tumores y/o activadospersistentemente por bucles autocrinos. De
hecho, se ha demostrado que en los cánceres más comunes y graves,
existe una sobreexpresión de este receptor (Akbasak y
Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol.
Sci. 111:119-133; Dickinson et
al., 1992, Cancer Treatment Res.
61:249-273; Corp. et al., 1992, J.
Clin. Invest. 90:1352-1360) y bucles
autocrinos (Lee y Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.
118:1057-1070; Corp. et al.,
supra; Akbasak y Suner-Akbasak et al.,
supra). Por ejemplo, el receptor EGFR ha sido relacionado con
el carcinoma celular escamoso, el astrocitoma, el glioblastoma, el
cáncer de cuello y cabeza, el cáncer de pulmón y de vejiga. El
PDGF-R se ha asociado con el glioblastoma, cáncer de
pulmón, ovario, próstata y el melanoma. El RTK c-met
se ha asociado generalmente con la hepatocarcinogénesis, y por lo
tanto, con el carcinoma hepatocelular. Asimismo, se ha relacionado
el c-met con la formación de tumores malignos. Más
concretamente, el RTK c-met se ha relacionado con,
entre otros cánceres, el colorectal, tiroideo, carcinoma pancreático
y gástrico, leucemia y linfoma. Además, se ha detectado una
sobreexpresión del gen de c-met en pacientes con la
enfermedad de Hodgkin, la enfermedad de Burkitt y la línea celular
del linfoma.
El IGF-IR, además de estar
implicado en el soporte nutricional y en la diabetes de
tipo-II, también se le ha relacionado con varios
tipos de cánceres. Por ejemplo, se ha relacionado el
IGF-I como un estimulador del crecimiento autocrino
para varios tipos de tumores, p.ej. de las células del carcinoma en
el cáncer de mama humano (Arteaga et al., 1989, J. Clin.
Invest. 84:1418-1423) y las células
pequeñas de tumores pulmonares (Macauley et al., 1990,
Cancer Res. 50:2511-2517). Además, el
IGF-I, involucrado integralmente en el crecimiento
normal y la diferenciación del sistema nervioso, parece ser un
estimulador autocrino de los gliomas humanos
(Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer
Res. 53:2475-2478). La importancia del
IGR-IR y sus ligandos en la proliferación celular se
apoya en el hecho de que muchos tipos de células en cultivos
(fibroblastos, células epiteliales, células de músculo liso,
linfocitos T, células mieloides, condrocitos, osteoblastos, células
madre de la médula ósea) están estimuladas para crecer por el
IGF-I (Goldring y Goldring, 1991, Eukaryotic Gene
Expression 1:301-326. En varias
publicaciones, Baserga incluso sugiere que el
IGF-I-R juega un papel central en
los mecanismos de transformación y consecuentemente, podría ser una
diana preferente para intervenciones terapéuticas para un espectro
más amplio de enfermedades (Baserga, 1995, Cancer Res.
55:249-252; Baserga, 1994, Cell
79:927-930; Coppola et al., 1994,
Mol. Cell. Biol. 14:4588-4595).
La asociación entre anormalidades en los RTK y
algunas enfermedades no están restringidas al cáncer. Por ejemplo,
los RTK están asociados a enfermedades metabólicas como la soriasis,
la diabetes mellitus, la cicatrización de heridas, inflamaciones y
enfermedades neurodegenerativas. Estas enfermedades incluyen, pero
no exclusivamente, hipertensión, depresión, trastorno de ansiedad
generalizada, fobias, síndrome de estrés
post-traumático, síndrome de personalidad por
evitación, disfunción sexual, trastornos alimenticios, obesidad,
dependencia de fármacos, cefalea tipo cluster, migraña, dolor,
enfermedad de Alzheimer, trastorno
compulsivo-obsesivo, trastorno de pánico, trastornos
de la memoria, enfermedad de Parkinson, trastornos endocrinos,
vasoespasmos, ataxia cerebelar y trastornos del tracto intestinal.
Por ejemplo, el EGF-R está indicado en la
cicatrización de heridas dérmicas y de la córnea. Defectos en la
Insulina R y en el IGF-1R están indicados en la
diabetes mellitus. En Plowman et al., 1994, DN&P
7:334-339 puede encontrarse una correlación
más completa entre los RTK específicos y sus indicaciones
terapéuticas.
No sólo los receptores del tipo quinasa, sino
también muchas quinasas celulares (CK), incluidas las src, abl, fps,
yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr, yrk (estudiados por Bolen et
al., 1992, FASEB J. 6:3403-3409)
están involucradas en la vía de transducción de la señal metabólica
y proliferativa, y por lo tanto en las indicaciones para la presente
invención. Por ejemplo, se ha demostrado que el src mutado
(v-src) es una oncoproteína
(pp60^{v-src}) en el pollo. Además, su homólogo
celular, el proto-oncógeno
pp60^{s-src} transmite señales oncogénicas de
muchos receptores. Por ejemplo, la sobreexpresión de
EGR-R o HER2/neu en tumores lleva a la activación
constitutiva de pp60^{c-src}, que es
característico de la célula maligna pero ausente en la célula
normal. Por otro lado, los ratones con deficiencia de la expresión
c-src muestran un fenotipo osteopetrótico, lo que
indica una participación clave de c-src en la
función de los osteoclastos y una posible participación en
trastornos relacionados. De forma similar, el Zap 70 está implicado
en la señalización de las células T.
Además, la identificación de compuestos
moduladores de CTK para aumentar o incluso sinergizar con
bloqueadores de RTK es un aspecto de la presente invención.
Finalmente, tanto las RTK como las quinasas del
tipo no receptor tienen conexión con los trastornos
hiperinmunes.
Los compuestos de la presente invención también
son efectivos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con
la proteína PYK-2. Esta proteína, su función celular
y enfermedades relacionadas, están explicadas con detalle en la
Patente Estadounidense nº 5.837.524, publicada el 17 de Noviembre de
1998 y titulada "PYK2 RELATED PRODUCTS AND METHODS", y la
Patente Estadounidense nº 5.837.814, publicada el 17 de noviembre de
1998 y titulada "PYK2 RELATED PRODUCTS AND METHODS". Ambas
están incorporadas aquí por esta referencia en su totalidad,
incluyendo cualquier figura.
Además, los compuestos de la presente invención
sonefectivos contra la artritis reumática. La artritis reumática
(AR) es una enfermedad inflamatoria crónica mediada por múltiples
tipos de células y de procesos celulares. Ahí se incluye la
infiltración de macrófagos y células T, y la participación de la
angiogénesis. Para investigar la utilidad de los inhibidores de
moléculas pequeñas para el tratamiento de AR, algunos de los
compuestos de la invención, que son inhibidores tirosin quinasa, se
caracterizaron en un modelo de artritis inducida en colágeno de
rata. Estos compuestos inhiben las tirosin quinasas
FLK-1/KDR, PYK2 y ZAP-70 en varios
grados en ensayos bioquímicos de quinasa. (Ver los ejemplos abajo).
Los compuestos son activos en ensayos celulares con diana en las
células implicadas en la patogénesis de la AR: inhibición de la
proliferación de células T mediada por la actividad del
ZAP-70, inhibición de la proliferación de HUVEC
estimulada por BEGF mediada por la activación de
FLK-1/KDR, y la inhibición de la producción de
TNF-\alpha a partir de macrófagos derivados de la
médula ósea murina mediados por la activación PYK2. Finalmente en un
modelo de artritis inducida en colágeno de roedor, que simula los
cambios histológicos y patológicos asociados con la AR humana, estos
compuestos son eficaces para inhibir la tumefacción de las
articulaciones cuando se dosifica a diario a partir de la
inmunización del colágeno.
La vasculogénesis y angiogénesis normales tienen
papeles importantes en varios procesos fisiológicos como el
desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la regeneración
de órganos y los procesos reproductores femeninos, como el
desarrollo folicular en el cuerpo lúteo durante la ovulación y el
crecimiento placental tras el embarazo. Folkman y Shin g, 1992,
J. Biological Chem. 267:10931-34. Sin
embargo, muchas enfermedades están impulsadas por una persistente
angiogénsis inapropiada o irregulada. Por ejemplo, en la artritis,
los nuevos vasos sanguíneos capilares invaden la articulación y
destruyen el cartílago. En la diabetes los nuevos capilares de la
retina invaden el vítreo, sangran y causan ceguera (Forman, 1987,
en: Congreso of Thrombosis and Haemostasis (Verstraete,
et. al, eds.), Leuven University Press, Leuven, p.
583-596). La neovascularización ocular es la causa
más común de ceguera y domina aproximadamente veinte (20)
enfermedades oculares.
Además, la vasculogénesis y/o angiogénesis se han
asociado con el crecimiento de tumores malignos sólidos y
metástasis. Un tumor debe estimular continuamente el crecimiento de
vasos sanguíneos capilares para que el propio tumor crezca. Los
nuevos vasos sanguíneos incrustados en un tumor proporcionan la
entrada a células tumorales para entrar a la circulación y provocar
metástasis en zonas lejanas del cuerpo (Forman, 1990, J. Natl.
Cancer Inst. 82:4-6; Klagsbrunn y Soker,
1993, Current Biology 3:699-702;
Folkman, 1991, J. Natl. Cancer Inst.
82:4-6; Weidner et al., 1991, New
Engl. J. Med. 324:1-5).
Se ha identificado varios polipéptidos con
actividad in vitro promotora de crecimiento celular
endotelial. Entre los ejemplos se encuentra el factor de crecimiento
fibroblástico ácido y básico (aFGF, bFGF), el factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento placental. Al
contrario que para el aFGF y el bFGF, se ha informado recientemente
de que el VEGF es un mitógeno específico celular endotelial (Ferrara
y Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. ComM.
161:851-858; Abisman et al., 1990,
J. Biol. Chem. 265:19461-19566).
De esta forma, la identificación de los
receptores específicos a los que se une el VEGF es un avance
importante en la comprensión de la regulación de la proliferación de
células endoteliales. Se ha identificado dos RTK muy relacionados
que se unen al VEGF con una gran afinidad: el receptor
flt-1 (Shibuya et al., 1990, Oncogene
5:519-524; De Vries et al., 1992,
Science 255:989-991) y el receptor
KDR/FLK-1, explicado en la solicitud de Patente
Estadounidense nº 08/193.829. Consecuentemente se ha supuesto que
estos RTK pueden tener un rol en la modulación y regulación de la
proliferación celular endotelial.
Las pruebas, como la revelación expuesta en la
solicitud con número de serie 08/193.829, sugieren firmemente que el
VEGF no es sólo responsable de la proliferación celular endotelial,
sino que también es un regulador primordial de la angiogénesis
normal y patológica. Ver Klagsburn y Soker, 1993, Current
Biology 3:699-702; Houck et al.,
1992, J. Biol. Chem. 267:26031-26037.
Se ha demostrado que el KDR/FLK-1 y
flt-1 se expresan abundantemente en las células
endoteliales proliferándose en un tumor creciente, pero no en las
células endoteliales quiescentes circundantes. Plate et al.,
1992, Nature 359:845-848; Shweiki
et al., 1992, Nature
359:843-845.
En vista de la importancia que se deduce de las
RTK en el control, la regulación y la modulación de la proliferación
de las células epiteliales y potencialmente la vasculogénesis y/o
angiogénesis, se ha hecho varios intentos de identificar los
"inhibidores" de RTK utilizando varios enfoques. Entre ellos,
la utilización de ligandos mutantes (Patente Estadounidense nº
4.966.849); anticuerpos y receptores solubles (Solicitud nº WO
94/10202; Kendall y Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU
90:10705-10709; Kim et al., 1993,
Nature 362:841-844); y ligandos de RNA
(Jellinek et al., 1994, Biochemistry
33:10450-10456).
Además, los inhibidores de quinasa (WO 94/03427;
WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente Estadounidense nº
5.330.992; Mariano et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer
Res. 35:2268), y los inhibidores que actúan sobre las
vías de transducción de la señal del receptor quinasa, tales como
los inhibidores de la protein quinasa C, ya han sido identificados
(Schuchter et al., 1991, Cancer Res.
51:682-687; Takano et al., 1993,
Mol. Bio. Cell 4:358A; Kinsella et al., 1992,
Exp. Cell Res. 199:56-62; Wright et
al., 1992, J. Cellular Phys.
152:448-57).
Más recientemente se han realizado intentos para
identificar pequeñas moléculas que actúan como inhibidores de
quinasa para ser usadas en el tratamiento del cáncer. Por
consiguiente, existe una necesidad no satisfecha de identificación y
generación de pequeños compuestos efectivos que inhiban de forma
selectiva la transducción de señal del receptor
KDR/FLK-1 para suprimir la vasculogénesis de forma
efectiva y específica.
Algunos de los compuestos de la presente
invención demuestran una excelente actividad en ensayos biológicos
y, así, se espera que estos compuestos, y sus derivados, sean
efectivos en el tratamiento de trastornos relacionados con Flk, como
aquéllos impulsados por angiogénesis persistentemente inapropiada o
no regulada.
Los compuestos descritos aquí pueden
administrarse a un paciente humano per se, o en composiciones
farmacéuticas, donde se mezclan con otros ingredientes activos, como
en una terapia de combinación, o un portador o
excipien-
te(s). En la última edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, se puede encontrar las técnicas para la administración de los compuestos de aplicación instantánea.
te(s). En la última edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, se puede encontrar las técnicas para la administración de los compuestos de aplicación instantánea.
Las rutas de administración apropiadas pueden
incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal, transmucosal o
intestinal, liberación parenteral, incluyendo intramuscular,
subcutánea, intravenosa, inyecciones intramedulares, así como
inyecciones intratecales, intraventriculares directas,
intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Por otra parte, uno puede administrar el
compuesto de forma local en vez de sistémica, por ejemplo, mediante
una inyección del compuesto directamente en el tumor sólido,
normalmente en una formulación de liberación sostenida o
retardada.
Uno puede administrar el fármaco mediante un
sistema de liberación de la fármaco con un objetivo concreto, por
ejemplo, en un liposoma recubierto de anticuerpos específicos de
tumores. Los liposomas tendrán como diana los tumores, y éstos los
escogerán de forma selectiva.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden fabricarse de maneras distintas, por ejemplo,
mediante un proceso de mezcla convencional, disolviendo, granulando,
haciendo grageas, levigando, emulsionando, encapsulando, entrapando
o liofilizando.
Las composiciones farmacéuticas, de acuerdo con
lapresente invención pueden formularse de forma convencional
utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables,
incluyendo excipientes y auxiliares que facilitan el trocamiento de
los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse
farmacéuticamente. Una formulación correcta depende de la ruta de
administración escogida.
Para inyecciones, los agentes de la invención
pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones
compatibles fisiológicamente, como la solución de Hank, solución de
Ringer, o un tampón salino fisiológico. Para administración
transmucosal, los penetrantes apropiados para hacer permeable la
barrera se usan en la formulación. Estos penetrantes son
generalmente conocidos por los entendidos en la materia.
Para administración oral, los compuestos pueden
ser fácilmente formulados combinando los compuestos activos con
portadores aceptables farmacéuticamente, ya conocidos por los
entendidos. Estos portadores permiten a los compuestos de la
invención ser formulados como comprimidos, pastillas, grageas,
cápsulas, líquidos, geles, siropes, leches, suspensiones y
similares, para su ingestión por parte del paciente a tratar. Las
preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse mezclando
uno o más excipientes sólidos con uno o más compuestos de la
invención, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando
la mezcla de gránulos, tras añadir, si se desea, auxiliares
apropiados para obtener núcleos de grageas y comprimido. Los
excipientes apropiados son, concretamente, rellenos tales como
azúcares, incluyendo la lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol;
preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz,
almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina,
goma tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa,
carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se
desea, se puede añadir agentes desintegrantes, tales como la
pirrolidina polivinilo de ligamento cruzado, agar, o ácido algínico,
o una sal de dichos compuestos, como el alginato de sodio.
Los núcleos de grageas deben llevar las cubiertas
apropiadas. Para este propósito puede utilizarse disoluciones de
azúcar concentrado, que pueden contener opcionalmente goma arábica,
talco, pirrolidona polivinol, gel carbopol, glicol polietileno, y/o
dióxido de titanio, soluciones lacquer, y los solventes orgánicos
apropiados, así como las mezclas de solventes. También se puede
añadir tintes o pigmentos a las cubiertas de los comprimidos o
grageas para la identificación o para caracterizar diferentes
combinaciones de dosis de los compuestos activos.
Entre las preparaciones farmacéuticas que pueden
usarse oralmente se encuentran las cápsulas push-fit
hechas de gelatina, así como las cápsulas blandas hechas de gelatina
y un plastificador como el glicerol o el sorbitol. Las cápsulas
push-fit pueden contener los ingredientes activos
mezclados junto con un relleno como la lactosa, aglutinantes como
los almidones, y/o lubricantes como el esterato de magnesio o talco
y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los
compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en los líquidos
apropiados, como aceites grasos, parafina líquida, o glicoles de
polietileno líquido. También se puede añadir estabilizadores. Todas
las formulaciones para administración oral deben estar en las dosis
adecuadas para dicha administración.
Para administración bucal, las composiciones
deben tomar forma de comprimidos o grageas formuladas de manera
convencional.
Para la administración por inhalación, los
compuestos, de acuerdo con la presente invención, son liberados
convenientemente en la forma de una presentación en spray aerosol,
ya sea envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un
propergol, por ejemplo, el diclorodifluorometano, el
triclorofluorometano, el diclorotetrafluoroetano, el dióxido de
carbono u otro gas adecuado. En caso de un aerosol presurizado, la
unidad de dosis puede estar determinada por la provisión de una
válvula para liberar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos
de, por ejemplo, gelatina, para su uso en un inhalador o insuflador
pueden formularse conteniendo una mezcla de polvo del compuesto y
una base de polvo aceptable, como la lactosa o el almidón.
Los compuestos pueden formularse para
administración parenteral con inyección, p.ej. con una inyección en
bolo o una infusión continua. Las formulaciones para inyección
pueden presentarse en dosis de unidades de, por ejemplo, ampollas o
en contenedores multi-dosis con un conservante
añadido. Las composiciones pueden tomar varias formas como
suspensiones, soluciones o emulsiones en aceite o medio acuoso, y
pueden contener agentes formulatorios, tales como agentes
suspensores, estabilizantes y/o dispersantes.
Entre las formulaciones farmacéuticas para
administración parenteral se encuentran las soluciones acuosas de
compuestos activos en forma hidrosoluble. Las suspensiones de
compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección
aceitosa adecuadas. Los solventes lipofílicos o vehículos apropiados
incluyen aceites grasos, como el aceite de sésamo o los ésteres de
ácidos grasos sintéticos, como el oleato de etilo o triglicéridos, o
liposomas. Las suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener
sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como la
celulosa de carboximetil de sodio, el sorbitol o el dextrano.
Opcionalmente, la suspensión puede contener también los
estabilizadores o agentes apropiados que aumenten la solubilidad de
los compuestos y así obtener soluciones altamente concentradas.
Por otro lado, el ingrediente activo puede estar
en forma de polvo para una constitución con un vehículo apropiado,
p.ej., agua libre de pirógeno estéril, antes de su uso.
Los compuestos también pueden estar formulados en
composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de
retención, que contengan bases de supositorio convencionales, como
manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
anteriormente, los compuestos también pueden formularse como
preparaciones retardadas. Formulaciones con una acción tan duradera
pueden ser administradas mediante la implantación (por ejemplo de
forma subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular.
Así, los compuestos pueden formularse con los materiales poliméricos
o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo como una emulsión en un
aceite aceptable) o resinas de intercambio de iones, o como
derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
Un vehículo farmacéutico para los compuestos
hidrofóbicos de la invención es un sistema
co-solvente compuesto por alcohol bencilo, un
surfactante no polar, un polímero orgánico miscible en agua y una
fase acuosa. El sistema co-solvente puede ser el
sistema co-solvente VPD. El VPD es una solución de
3% p/v de alcohol bencilo, 8% p/v del surfactante no polar
Polisorbato 80, y 65% p/v de glicol polietileno, hecha para
volúmenes en etanol absoluto. El sistema co-solvente
VPD (VDP:D5W) consta de VPD diluido 1:1 con dextrosa 5% en solución
acuosa. Este sistema co-solvente disuelve bien
compuestos hidrofóbicos, y por sí mismo produce baja toxicidad en
administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un
sistema co-solvente pueden variarse
considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y
toxicidad. La identidad de los componentes del
co-solvente pueden variarse: por ejemplo, se puede
utilizar otros surfactantes no polares de baja toxicidad en lugar
del Polisorbato 80; el tamaño de la fracción de glicol polietileno
puede variarse; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar el
glicol polietileno, p.ej. la pirrolidona polivinilo; y otros
azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.
Se puede usar otros sistemas de liberación para
compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los liposomas y las
emulsiones son ejemplos conocidos de tansportadores o vehículos de
liberación para fármacos hidrofóbicas. También puede usarse algunos
solventes orgánicos como el dimetilsulfóxido, aunque normalmente a
costa de una toxicidad mayor. Los compuestos pueden liberarse
utilizando un sistema de liberación sostenida, como las matrices
semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan el
agente terapéutico. Se ha establecido varios materiales de
liberación sostenida y son conocidos por aquéllos expertos en la
materia. Las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar los
compuestos, según su naturaleza química, durante un periodo de pocas
semanas o incluso más de 100 días. Según la naturaleza química y la
estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se puede utilizar
estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.
Muchos de los compuestos moduladores de PTK de la
invención pueden encontrarse como sales con contraiones compatibles
farmacéuticamente. Se puede formar sales farmacéuticamente
compatibles con muchos ácidos, entre los que se encuentran, pero no
exclusivamente, el sulfúrico, acético, láctico, tartárico, maleico,
succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes
acuosos u otros solventes próticos que en las formas básicas libres
correspondientes.
Las composiciones farmacéuticas apropiadas para
utilizar en la presente invención incluyen composiciones donde los
ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para
conseguir su objetivo. Más concretamente, una cantidad
terapéuticamente efectiva significa una cantidad de compuesto
efectiva para impedir, aliviar o mejorar los síntomas de la
enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto en tratamiento.
La determinación de la cantidad terapéuticamente efectiva está
totalmente dentro de la capacidad de aquéllos expertos en la
materia, especialmente a la luz de los descubrimientos detallados
aquí.
Para cualquier compuesto usado en los métodos de
la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse
inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Por ejemplo,
una dosis puede formularse en modelos de animales para conseguir un
rango de concentración circulante que incluye el IC_{50}, tal y
como se determinó en cultivo celular (es decir, la concentración del
compuesto examinado que consigue una inhibición de la actividad PTK
equivalente a la mitad del máximo). Esta información puede usarse
para determinar más precisamente las dosis útiles en humanos.
La eficacia tóxica y terapéutica de los
compuestos descritos aquí puede determinarse mediante procedimientos
farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales
experimentales para determinar el DL_{50} (la dosis letal para el
50% de la población) y el DE_{50} (la dosis terapéuticamente
efectiva en el 50% de la población). La proporción de dosis entre
tóxico y con efectos terapéuticos es el índice terapéutico y puede
expresarse como la proporción entre DL_{50} y ED_{50}. Se
prefiere los compuestos con índices terapéuticos elevados. Los datos
obtenidos de esos ensayos con cultivos celulares y con estudios
animales pueden usarse para formular una escala de dosis para el uso
en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra
preferiblemente en un rango de concentraciones en circulación que
incluyen el DE_{50} con baja o nula toxicidad. La dosificación
puede variar dentro de este rango en función de la forma de
dosificación y la ruta de administración empleadas. La formulación
exacta, la ruta de administración y la dosificación pueden escogerse
por el médico individualmente en vista de las condiciones del
paciente (ver Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological
Basis of Therapeutics", Ch. 1, p.1).
La cantidad de dosis y el intervalo puede
ajustarse deforma individual para proporcionar niveles de plasma de
la fracción activa que sean suficientes para mantener los efectos
modulantes de la quinasa, o una concentración efectiva mínima (CEM).
La CEM varia para cada compuesto pero puede estimarse a partir de
los datos in vitro, como la concentración necesaria para
conseguir una inhibición del 50-90% de la quinasa
utilizando los ensayos descritos aquí. Las dosis necesarias para
conseguir la CEM dependen de las características individuales y de
la ruta de administración. Sin embargo, se puede utilizar ensayos
HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones de plasma.
Los intervalos de dosificación pueden
determinarse también utilizando el valor CEM. Los compuestos deben
administrarse usando un régimen que mantiene los niveles de plasma
por encima de la CEM para 10-90% del tiempo,
preferiblemente entre 30-90% y preferentemente entre
50-90%.
En casos de administración local o ingestión
selectiva, la concentración local efectiva de la fármaco no está
necesariamente relacionada con la concentración de plasma.
La cantidad de composición administrada
dependerá, obviamente, del sujeto a tratar, del peso del mismo, de
la gravedad de su aflicción, la forma de administración y el juicio
del médico que prescribe.
Los métodos para preparar formulaciones
farmacéuticas de los compuestos, los métodos para determinar las
cantidades de compuestos que hay que administrar a un paciente, y
las formas de administrar compuestos a un organismo están también
descritas en las Patentes Estadounidenses nº 5.792.783, 5.88.141,
5.786.488, 5.834.504, 5.880.141, 5.883.133, 5.883.116, 5.886.020,
así como en los números de la publicación de patentes
internacionales WO 96/22976 y WO 98/50356. Todos ellos están
incorporados por referencia en su totalidad, incluyendo cualquier
figura. Aquéllos expertos en la materia apreciaran que tales
descripciones son aplicables a la presente invención y pueden
adaptarse fácilmente a la misma.
Las composiciones pueden presentarse en un envase
o en un dispensador que contenga una o más formas de dosis unitarias
que contengan el ingrediente activo. El envase puede estar compuesto
por una lámina de metal o de plástico, como un envase de blíster. El
envase o dispensador puede ir acompañado de instrucciones de
administración. El envase o dispensador también puede ir acompañado
con una nota asociada al contenedor en la forma prescrita por la
agencia gubernamental reguladora de la fabricación, el uso, o la
venta de productos farmacéuticos. La nota refleja la aprobación por
parte de la agencia de la forma de polinucleótido para
administración humana o veterinaria. Dicha nota puede ser la
etiqueta, aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos
(FDA) americana, para fármacos con prescripción, o la impresión del
producto aprobado. Las composiciones que contienen un compuesto de
la invención formulado en un vehículo farmacéutico compatible pueden
también ser preparadas, dispuestas en un contenedor apropiado, y
etiquetadas para el tratamiento en una condición indicada. Las
condiciones apropiadas indicadas en la etiqueta pueden incluir el
tratamiento de un tumor, la inhibición de la angiogénesis, el
tratamiento de fibrosis, diabetes y similares.
Se analizó la capacidad de inhibición de la
actividad de la mayoría de proteínas quinasa que demostraban los
compuestos de la presente invención. Los ensayos biológicos y los
resultados de estos estudios de inhibición se pueden encontrar aquí.
Algunos de los métodos utilizados para medir la modulación de la
función de la proteína quinasa son similares a los descritos en la
Publicación Internacional nº WO 98/07695, publicada el 26 de Marzo
de 1998, por Tang et al., y titulada "Indolinone
Combinatorial Libraries and Related Products and Methods for the
Treatment of Disease" (Lyon & Lyon Docket nº
221/187-PCT) y la Solicitud Estadounidense con
número de serie 08/702.232, por Tang et al., y titulada
"Indoline Combinatorial Libraries and Related Products and Methods
for the Treatment of Disease", archivada el 23 de agosto de 1996,
respecto al elevado rendimiento del método. Tanto la solicitud
08/702.232 como la Publicación Internacional nº WO 98/07695 se
incorporan aquí por referencia en su totalidad, incluyendo cualquier
figura.
Los ejemplos siguientes no son limitantes y son
meramente representativos de varios aspectos y características de la
presente invención. Los ejemplos describen métodos para sintetizar
compuestos de la invención y métodos para medir un efecto de un
compuesto sobre la función de la protein quinasa.
Las células usadas en los métodos están
disponibles a nivel comercial. Los vectores de ácido nucleico
hospedados por las células también están disponibles a nivel
comercial, y las secuencias de genes para las diferentes protein
quinasas están fácilmente disponibles en bancos de datos de
secuencias. Así, una persona de experticia ordinaria en la materia
puede fácilmente recrear las líneas celulares de forma oportuna
combinando las células comercialmente disponibles, los vectores de
ácido nucleico comercialmente disponibles, y los genes de protein
quinasa, utilizando técnicas fácilmente accesibles a personas con
conocimientos ordinarios sobre la materia.
\newpage
Los compuestos de la presente invención pueden
ser sintetizados usando el siguiente procedimiento general:
A una mezcla de oxindol (1 eq.) y aldehído
(1-1,2 eq.) en etanol (0,1 M) se añadió piperidina
(1 eq.). La mezcla se calentó en un baño de aceite a 90ºC durante
1-3 h. El precipitado se recogió por filtración al
vacío, se lavó con etanol y se secó para dar (28-97%
de rendimiento) del producto deseado.
1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(DBU, 8,39 ml, 56,1 mmol) se añadió a una mezcla agitada de
tosilmetil isocianida (10,95 g, 56,1 mmol) en tetrahidrofurano (THF,
56 ml) a 0ºC. Después de 15 minutos, a la mezcla se añadió
5,6-dihidro-2H-piran-2-ona
(5 g, 51 mmol). La mezcla luego se agitó a temperatura ambiente
durante dos horas. La reacción se paró con salmuera y se extrajo con
THF varias veces. Los extractos combinados se secaron (sulfato
sódico), se filtraron y se concentraron para dar
6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 11,49 (br s, 1H, NH), 7,41
(m, 1H), 6,67 (m, 1H), 4,32 (t, J = 5,9Hz, 2H, CH_{2}),
2,73 (t, J = 5,9Hz, 2H, CH_{2}). MS 138 [M^{+}+1]
6,7-Dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona
(5 g, 36 mmol) se formuló bajo la reacción estándar de Vilsmeier
usando N,N-dimetilformamida (DMF, 1,2 eq.) y
oxicloruro de fósforo (POCl_{3}, 1,1 eq.) en diclorometano. La
mezcla anterior se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El
precipitado salino se filtró, se lavó con diclorometano, se
suspendió en agua y se basificó con hidróxido de sodio 6N hasta pH =
12. La mezcla se agitó durante 5 minutos y se filtró. El sólido se
lavó con una mezcla de etanol/agua (1:1) para dar 3,5 g (58%) de
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,73 (br s, 1H, NH), 9,63
(s, 1H, CHO), 7,78 (s, 1H), 4,44 (t, J = 6,08Hz, 2H,
CH_{2}CH_{2}O), 3,10 (t, J = 6,08Hz, 2H,
CH_{2}CH_{2}O). MS 166 [M^{+}+1].
2-Oxo-piperidin-1-carboxilato
de terc-butilo (3,8 g, 19 mmol) en THF (12 ml) se
añadió gota a gota a una diisopropilamida de litio (LDA, 19 ml,
solución 2,0 M en heptano/THF/etilbenceno) a -78ºC. Después de
agitar durante 35 minutos a -78ºC, a la mezcla se añadió gota a gota
una solución de disulfuro de fenilo (4,15 g, 19 mmol) y
hexametilfosforamida (HMPA, 3,3 ml, 19 mmol) en THF (10 ml). La
mezcla se agitó a -78ºC y luego se calentó gradualmente a
temperatura ambiente. La reacción se purificó en agua (200 ml) y se
extrajo con éter (3x). Los extractos de éter combinados se lavaron
consecutivamente con 10% NaOH y agua, y luego se secaron y se
concentraron para dar
2-oxo-3-fenilsulfanil-piperidin-1-carboxilato
de terc-butilo como un aceite. El aceite se usó en
el siguiente paso sin más purificación.
Se añadió ácido
3-Cloroperoxibenzoico (mCPBA, 4,7 g, 70%, 1
equivalente) gota a gota a una solución fría (0ºC) del
2-oxo-3-fenilsulfanil-piperidina-1-carboxilato
de terc-butilo en diclorometano (100 ml) y bicarbonato sódico
saturado (NaHCO, 20 ml). La mezcla se dejó calentar lentamente a
temperatura ambiente hasta que la reacción se completó por TLC.
La mezcla de reacción luego se extrajo con
diclorometano, se lavó con NaHCO_{3} (sat.) y se secó para dar
3-bencenosulfonil-2-oxo-piperidin-l-carboxilato
de terc-butilo como un aceite. Se usó directamente
en el siguiente paso.
3-Bencenosulfonil-2-oxo-piperidina-1-carboxilato
de terc-butilo del anterior en tolueno (50 ml) se
calentó a 80ºC durante una hora. La mezcla de reacción se concentró
y el aceite resultante se purificó por cromatografía en columnas
(20-30% EtOAc en Hexano) para dar 2 g de
6-oxo-3,6-dihidro-2H-piridina-1-carboxilato
de terc-butilo como un aceite.
RMN^{1}H (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 6,91 (dt, 1H,
COCH=CHCH_{2}), 5,81 (dt, J = 1,8 & 9,3Hz, 1H,
COCH=CHCH_{2}), 3,72 (t, J = 6,4Hz, 2H, CONCH_{2}, 2,38
(m, 2H, CONCH_{2}CH_{2}), 1,44 (s, 9H, 3xCH_{3}).
DBU (1,65 ml, 11 mmol) se añadió a una solución
agitada de isocianuro de tosilmetilo (2,18 g, 11 mmol) en THF (11
ml) a 0ºC. Después de agitar durante 15 minutos;
6-oxo-3,6-dihidro-2H-piridin-1-carboxilato
de terc-butilo (2 g, 10 mmol) anterior se añadió y
la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla
de reacción se paró con NaCl saturado y se extrajo con THF.
Los extractos combinados se secaron y se
concentraron para dar 2 g (85%) de
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridina-5-carboxilato
de terc-butilo en forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 11,38 (br s, 1H, NH), 7,34
(m, 1H), 6,61 (s, 1H), 3,81 (t, J = 6,0Hz, 2H, CH_{Z}),
2,67 (t, J = 6,0Hz, 2H CH_{2}), 1,44 (s, 9H,
3xCH_{3}).
MS APCI neg. 235 [M^{+}-1].
Se añadió POCl_{3} (0,646 ml, 6,93 mmol) gota a
gota al DMF helado (1,5 ml, 18,9 mmol). Después de agitar a
temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla se
re-enfrió hasta -5ºC y a esto se añadió una
solución del anterior
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridina-5-carboxilato
de terc-butilo (1,5 g, 6,3mol) en DMF (3 ml). La
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. La mezcla de
reacción se enfrió con cubitos de hielo seguido por la adición de
hidróxido potásico 10N, ajustando el pH hasta 11-12.
Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla se extrajo con
acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con salmuera,
se secaron y se concentraron para dar 1,2 g de
1-formil-4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridina-5-carboxilato
de terc-butilo.
Una mezcla de
1-formil-4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridina-5-carboxilato
de terc-butilo (1,2 g, 4,54 mmol) en 50% de ácido
trifluoroacético en diclorometano se agitó a temperatura ambiente
durante 30 minutos. La reacción se concentró y el residuo se
recristalizó a partir de diclorometano para dar 400 mg (75%) de
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído.
RMN^{1}H (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,30 (br s, 1H, NH), 9,60
(s, 1H, CHO), 7,46 (s, 1H), 7,34 (br s, 1H, NH); 3,36 (t, J =
6,5Hz, 2H, CH_{2}), 2,95 (t, J = 6.5Hz, 2H, CH_{2}).
MS 165 [M^{+}+ 1].
Se añadió
1-Metil-2-piperidona
(4,54 ml, 40 mmol) en THF (25 ml) gota a gota a la diisopropilamida
de litio fría (LDA, 40 ml, solución 2,0 M en
heptano/THF/etilbenceno) a -78ºC. Después de agitar durante 35
minutos a -78ºC, a la mezcla se añadió gota a gota una solución de
disulfuro de fenilo (8,8 g, 40 mmol) y hexametilfosforamida (HMPA, 7
ml, 40 mmol) en THF (20 ml). La mezcla se agitó a -78ºC y luego se
calentó gradualmente a temperatura ambiente. La reacción se vertió
en agua (400 ml) y se extrajo con éter(3x1 50 ml). Los
extractos de éter se lavaron consecutivamente con 10% NaOH, agua,
10% HCl y luego agua, se secaron y se concentraron para dar 10 g
(>100% rendimiento bruto) de
3-bencenosulfonil-1-metil-piperidin-2-ona
como un aceite. El aceite se usó en el siguiente paso sin más
purificación.
MS APCI +ve 222 [M^{+}+1].
Se añadió gota a gota ácido
3-Cloroperoxibenzoico (mCPBA, 4,9 g, 70%, 1
equivalente) a una solución fría (0ºC) de
1-metil-3-fenilsulfanil-piperidin-2-ona
(5 g, 22,6 mmol) en diclorometano (100 ml) y NaHCO_{3}
saturado(aq) (20 ml). La mezcla se dejó calentar lentamente a
temperatura ambiente y se agitó hasta que la reacción se completó
por TLC. La mezcla de reacción luego se extrajo con diclorometano,
se lavó con bicarbonato sódico saturado y se secó para dar 4,7 g
(82% rendimiento bruto) de
3-bencenosulfonil-1-metil-piperidin-2-ona
como un aceite.
Una mezcla de
3-bencenosulfonil-1-metil-piperidin-2-ona,
a partir del paso previo, en tolueno (50 ml) se calentó hasta 80ºC
durante una hora. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se
purificó por cromatografía en columna (80% EtOAc en Hex) para dar
1,1 g (53% rendimiento bruto) de
1-metil-5,6-dihidro-1H-piridin-2-ona
en forma líquida.
RMN ^{1}H (360 MHz, DMSO-d6)
\delta 6,60 (dt, 1H, COCH=CHCH_{2}), 5,72 (dt, J =
1,8 & 9,7Hz, 1H, COCH=CHCH_{2}), 3,35 (t, J = 7,2Hz,
2H, CONCH_{2}), 2,82 (s, 3H, CH_{3}), 2,33 (m, 2H,
CONCH_{2}CH_{2}), 1,44 (s, 9H, 3xCH_{3}).
MS APCI +ve 112 [M^{+}+1].
Se enfrió hasta -78ºC bajo nitrógeno una solución
agitada de litiobis (trimetilsilil)amida (11 ml de solución
1M en THF) y se añadió gota a gota una solución de tosilmetil
isocianuro (1,9 g, 10 mmol) en THF (45 ml). Después de la agitación
durante 40 minutos a -78ºC, se añadió una solución de
1-metil-5,6-dihidro-1H-piridin-2-ona
(1,1 g, 10 mmol) en THF (10 ml) y la mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante la noche. La reacción se concentró y el residuo se
dividió entre agua (150 ml) y diclorometano (150 ml). La fase acuosa
se extrajo con diclorometano (3x). Las capas orgánicas combinadas se
concentraron y se secaron sometidas al vacío. La espuma resultante
se recristalizó a partir de diclorometano para dar 633 mg (42%) de
5-metil-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona
en forma de sólido amarillo claro.
RMN ^{1}H (360 MHz, DMSO-d6)
\delta 11,0 (br s, 1H, NH), 7,08 (s,1 H), 6,53 (s, 1H), 3,42 (t,
J = 6,6Hz, 2H, CH_{2}), 2,89 (s, 3H, CH_{3}), 2,70 (t,
J = 6,6Hz, 2H CH_{2}).
5-Metil-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona
se formuló bajo condiciones estándar Vilsmeier usando DMF (3 eq.) y
POCl_{3} (1,1 eq.) para dar 250 mg (33%) de
5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído.
RMN^{1}H (360 MHz,
DMSO-d_{6}) 612,37 (br s, 1H, NH), 9,60 (s, 1H,
CHO), 7,45 (s, 1H), 3,52 (t, J= 6,6Hz, 211, CH_{2}), 3,04
(t, J = 6,6Hz, 2H, CH_{2}), 2,92 (s, 3H, CH_{3}).
MS m/z 179 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-001
4-Metil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida
(0,2 g, 0,83 mmol) se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
(1,2 eq., 0,17 g) para dar 0,31 g (97%) del compuesto del título en
forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,77 (s, 1H, NH), 11,42 (s,
1H, NH-CO), 7,92 (d, J = 3,3Hz, 1H), 7,72 (d,
J = 8,1Hz, ArH), 7,69 (s, 1H), 7,42 (q, J = 4,5Hz, 1H,
SO_{2}NH), 6,89 (d, J = 8,5Hz, 1H), 4,49 (t, J =
5,8Hz, 2H, CO_{2}CH_{2}CH_{2}), 3,08 (t, J = 5,8Hz,
2H, CO_{2}CH_{2}CH_{2}), 2,84 (s, 3H, CH_{3}), 2,42 (d,
J = 4,7Hz, 3H; SO_{2}NHCH_{3}). MS 388 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-002
2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida
(0,2 g, 0,88 mmol) se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrolo-1-carbaldehído
(1,2 eq., 0,18 g) para dar 0,26 g (79%) del compuesto del título en
forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,74 (s, 1H, NH), 11,45 (s,
1H, NH-CO), 8,28 (d, J = 1,9Hz, 1H), 8,0 (s,
1H, C=CH), 7,95 (d, J = 3,2Hz,1 H), 7,60 (dd, J = 1,9
y 8,3Hz, 1H), 7,21 (m, 1H, SO_{2}NH), 7,05 (d, J = 8,2Hz,
1H), 4,50 (t, J = 5,8Hz, 2H, CO_{2}CH_{2}CH_{2}), 3,18
(t, J = 5,8Hz, 2H, CO_{2}CH_{2}CH_{2}), 2,41 (d,
J = 5,2Hz, 3H, SO_{2}NHCH_{3}). MS 374 [M^{+}+l].
Compuesto
NI-003
4-Metil-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título.
MS m/z 295,2 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-004
5-Metoxi-l,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 311,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-005
6-Metoxi-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título.
MS m/z 311.2 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-006
5-Bromo-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 359,2 & 361,1
[M^{+}+1].
\newpage
Compuesto
NI-007
5-Cloro-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 315,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-008
4-(2-Hidroxi-etil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
(0,1 g, 0,6 mmol) se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
(1,2 eq., 0,06 g) para dar 0,5 g (28%) del compuesto del título
como un sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,87 (s, 1H, NH), 11,07 (s,
1H, NH-CO), 7,90 (d, J = 3,0Hz, 1H), 7,55
(s, 1H, C=CH), 7,09 (m, 1H), 6,84 (d, J = 7,6Hz, 1H),
6,76 (d, J = 7,7Hz, 1H), 4,89 (t, J = 4,8Hz, 1H,
CH_{2}CH_{2}OH), 4,49 (t, J = 6,0Hz, 2H,
CO_{2}CH_{2}CH_{2}pirrol), 3,70 (m, 2H, HOCH_{2}CH_{2}Ar y
CO_{2}CH_{2}CH_{2}pirrol). MS m/z 325,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-009
5-Fenil-l,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 357,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-010
2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 360,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-011
2-Oxo-2,3-dihidro-4H-indol-5-dimetilsulfonamida
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 388,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-012
2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-isopropilsulfonamida
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 402.2
[M\pm1].
Compuesto
NI-013
2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-fenilsulfonamida
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 436.2
[M^{+}+l].
Compuesto
NI-014
N-(2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-il)-acetamida
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 338,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-015
6-Fenil-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 357,2
[M^{+}+1].
\newpage
Compuesto
NI-016
5-Fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 299,2 [M+1].
Compuesto
NI-017
Ácido
2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 325,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-018
Ácido
Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-carboxílico
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 325,2 [M+1].
Compuesto
NI-019
6-Cloro-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 315,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-020
6-Bromo-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 359,2 & 361
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-021
6-(2-Metoxi-Fenil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 387,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-022
6-(3-Metoxi-Fenil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbal-dehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 387,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-023
6-(4-Metoxi-Fenil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbal-dehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 387,2
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-024
6-(4-Fluoro-Fenil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 375,2
[M^{+}+1].
\newpage
Compuesto
NI-025
6-Piridin-3-il-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 358,4
[M^{+}+1].
Compuesto
IN-026
A una mezcla de
5-clorosulfonil-2-oxindol
(5 g, 21,6 mmol) e indolina (2,9 ml, 26 mmol) en THF (20 ml) se
añadió piridina (3,4 g, 43 mmol). Tras agitar a temperatura ambiente
durante un día, el precipitado se recogió por filtración, se lavó
con agua en etanol (20%), se secó, se lavó con 60 ml de etanol
caliente y se secó al vacío para dar 7,5 g (sobre 100%) de
5-(2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
en forma de sólido rosa.
RMN^{1}H (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,76 (br s, 1H, NH), 7,62
(m, 2H), 7,43 (d, J = 8,0Hz, I H), 7,13-1,18
(m, 2H), 6,95 (dt, J = 0,9 & 7,5Hz, 1H), 6,90 (d,
J = 8,0Hz,1H), 3,87 (t, J = 8,5Hz, 2H,
CH_{2}CH_{2}), 3,51 (s, 2H, CH), 2,91 (t, J = 8,5Hz, 2H,
CH_{2}CH_{2}). MS-EI 314 [M^{+}].
5-(2,3-Dihidro-indol-1-sulfonil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]
pirrol-1-carbaldehído para dar el compuesto del título. MS m/z 462,3 [M^{+}+1].
pirrol-1-carbaldehído para dar el compuesto del título. MS m/z 462,3 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-027
5-(3,4-Dihidro-2H-quinolin-1-sulfonil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 476,2 [M+1].
Compuesto
NI-028
5-(3,4-Dihidro-1H-isoquinolin-2-sulfonil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 476,3
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-029
5-(5-Bromo-2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 540,3 & 542
[M^{+}+1].
Compuesto
IN-030
2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-cloro-fenil)-metil-sulfonamida
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 484,2
[M^{+}+1].
Compuesto
IN-031
6-Fluoro-l,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-l-carbaldehído
para dar compuesto del título m/z 299,2 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-032
5-Cloro-4-metil-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbalde-hído
para dar el compuesto del título m/z 329,2 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-033
7-Cloro-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 315,2 [M+1].
Compuesto
NI-034
Ácido
3-(2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-il)-benzoico
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título.
MS m/z 401,2 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-035
Ácido
3-(2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-6-il)-benzoico
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbaldehído
para dar el compuesto del título.
MS m/z 401,2 [M^{+}+I].
Compuesto
NI-036
2-Oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-clorofenil)sulfotamida
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]
pirrol-1-carbaldehído para dar el compuesto del título. MS m/z 470,2 [M^{+}+1].
pirrol-1-carbaldehído para dar el compuesto del título. MS m/z 470,2 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-037
5-Bromo-4-metil-1,3-dihidro-indol-2-ona
se condensó con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-carbal-dehído
para dar el compuesto del título. MS m/z 373,2 & 375
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-038
Una mezcla de
5-Fenil-1,3-dihidro-indol-2-ona
(41,8 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]
piridina-1-carbaldehído (1 equivalente) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. El precipitado se recogió por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para dar el compuesto del título en forma de sólido amarillo.
piridina-1-carbaldehído (1 equivalente) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. El precipitado se recogió por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para dar el compuesto del título en forma de sólido amarillo.
RMN ^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,58 (s, 1H, NH), 11,06 (br
s, 1H, NH), 8,16 (d, J = 1.3Hz, 1H), 7,86 (s, 1H,
H-vinilo), 7,68-7,71 (m, 3H),
7,40-7,48 (m, 4H), 7,31(m, 1H), 6,95 (d,
J = 8,1Hz, 1H), 3,41 (m, 2H, CH_{Z}), 3,02 (t, J =
6,4Hz, 2H, CH_{2}). MS m/z 356 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-039
Una mezcla de
6-Fenil-1,3-dihidro-indol-2-ona
(41,8 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(1 equivalente) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se calentó
en un tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. El precipitado se recogió
por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para dar el
compuesto del título en forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,55 (s, 1H, NH), 11,09 (br
s, 1H, NH), 7,86 (d, J = 7,7Hz, l H), 7,72 (s, l H,
H-vinilo), 7,68 (d, J = 3,4Hz, l H), 7,64 (m, 2H),
7,45 (t, J = 7,5Hz, 2H), 7,30-7,40 (m, 3H),
7,10 (d, J = 1,2Hz,1H), 3,41 (m, 2H, CH_{2}), 2,99
(t, J = 6,7Hz, 2H, CH,). MS m/z 356 [M^{+}+1].
\newpage
Compuesto
NI-040
Una mezcla de
6-bromo-1,3-dihidro-indol-2-ona
(42,4 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridi-na-1-carbaldehído
(1 equivalente) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se calentó
en un tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. El precipitado se recogió
por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para dar el
compuesto del título en forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,45 (s, 1H, NH), 11,09 (br
s, 1H, NH), 7,74 (d, J = 8,4Hz, 1H), 7,74 (s, 1H,
H-vinilo), 7,70 (d, J = 3,3Hz, 1H), 7,41 (br
s, 1H, NH), 7,19 (dd, J = 1,4 & 8,4Hz, 1H), 7,01
(d, J = 1, 4Hz, 1H), 3,39 (m, 2H, CH_{2}), 2,96 (t,
J = 6,4Hz, 2H, CH_{2}). MS m/z 358 & 360
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-041
Una mezcla de
6-cloro-1,3-dihidro-indol-2-ona
(33,5 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-carbaldehído
(1 equivalente) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se calentó
en un tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. El precipitado se recogió
por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para dar el
compuesto del título en forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,45 (s, 1H, NH), 11,10 (br
s, 1H, NH), 7,80 (d, J = 8,1Hz, 1H), 7,73 (s, 1H,
H-vinilo), 7,68 (d, J = 3,2Hz, 1H), 7,40 (br
s, 1H, NH), 7,05 (dd, J = 1,8 & 8,1Hz, 1H), 6,88 (d,
J = 1,8Hz, 1H), 3,40 (m, 2H, CH_{2}), 2,97 (t, J =
6,5Hz, 2H, CH_{2}). MS m/z 314 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-042
Una mezcla de
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetil-sulfonamida
(48 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-carbaldehído
(1 equivalente) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se calentó
en un tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. El precipitado se recogió
por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para dar el
compuesto del título en forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,51 (s, 1H, NH), 11,25 (br
s, 1H, NH), 8,29 (d, J = 1,6Hz, 1H), 8,03 (s, 1H,
H-vinilo), 7,73 (d, J = 3,2Hz, 1H), 7,53 (dd,
J = 1,6 & 8,2Hz, 1H), 7,43 (br s, 1H, NH), 7,07 (d,
J = 8,2Hz, 1H), 3,43 (m, 2H, CH_{2}), 3,06 (t, J =
6,6Hz, 2H, CH_{2}), 2,60 (s, 6H, 2xCH_{3}). MS m/z 387
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-043
Se añadió
benzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio
hexafluorofosfato (PyBOP, 3,5 g, 6,72 mmol) a una mezcla de
5-carboxi-2-oxindol
(1 g, 5,6 mmol), dimetilamina (5,6 ml de THF 2,0 M, 11,2 mmol) y
trietilamina (2,0 ml, 14 mmol) endiclorometano. Tras agitar a
temperatura ambiente durante 3 horas, la reacción se diluyó con más
diclorometano, se lavó con agua, bicarbonato sódico concentrado y
salmuera, se secó y se concentró. El residuo se purificó por
cromatografía de columna para obtener 480 mg (42%) de
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilcarboxamida.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,50 (br s, 1H, NH), 7,23
(m, 2H), 6,81 (d, J = 6.9Hz, 1H), 3,49 (s, 2H, CH_{2}),
2,93 (s, 6H, 2xCH_{3}). MS-EI m/z 204
[M+].
Una mezcla de
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilcarboxamida
(40,8 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetra-hidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(1 eq.) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se calentó en un
tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. Se recogió el precipitado
mediante una filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para
obtener el compuesto del título en forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,53 (br s, 1H, NH), 11,14
(br s, 1H, NH), 7,92 (d, J = 1,3Hz, 1H), 7,82 (s, 1H,
H-vinilo), 7,68 (d, J = 2,7Hz, 1H), 7,40 (br
s, 1H, NH), 7,20 (dd, J = 1,3 & 8,0Hz, 1H), 6,89 (d,
J = 8,0Hz, 1H), 3,40 (m, 2H, CH_{2}), 2,99 (m, 2H,
CH_{2}), 2,97 (s, 6H, 2xCH_{3}). MS 351 m/z
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-044
Se añadió PyBOP (3,5 g, 6,72 mmol) a una mezcla
de
5-carboxi-2-oxindol
(1 g, 5,6 mmol), pirrolidina (0,5 ml, 6,2 mmol) y trietilamina (2,0
ml, 14 mmol) en diclorometano. Tras agitar a temperatura ambiente
durante 4 horas, la reacción fue diluida con más diclorometano, se
lavó con bicarbonato sódico saturado y salmuera, se secó y se
concentró. El residuo se purificó por cromatografía de columna para
obtener
5-pirrolidina-1-carbonil)-1,3-dihidro-indol-2-ona.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,52 (br s, 1H, NH), 7.37
(m, 2H), 6,80 (d, J = 8,5Hz, 1H), 3,49 (s, 2H,
CH_{2}), 3,42 (m, 4H, 2xCH_{2}), 1,81 (m, 4H, 2xCH_{2}).
MS-EI m/z 230 [M+].
Una mezcla de
5-pirrolidina-1-carbonil)4,3-dihidro-indol-2-ona
(46 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(1 equivalente) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml), se calentó
en un tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. Se recogió el
precipitado por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó
para obtener el compuesto del título en forma de sólido
amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,52 (s, 1H, NH), 11,14 (br
s, 1H, NH), 8,02 (d, J = 1,3Hz, 1H), 7,83 (s, 1H,
H-vinilo), 7,69 (d, J = 2,9Hz, 1H),
7,40 (br s, 1H, NH), 7,32 (dd, J = 1,3 & 7,7Hz,
1H), 6,89 (d, J = 7,7Hz, 1H), 3,39-3,48 (m,
6H), 3,0 (t, J = 6,4Hz, 2H, CH,),1,84 (m, 4H, 2xCH,). MS
m/z 377 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-045
Se añadió PyBOP (3,5 g, 6,72 mmol) a una mezcla
de
5-carboxi-2-oxindol
(1 g, 5,6 mmol), morfolina (0,5 ml, 6,2 mmol) y trietilamina (2,0
ml, 14 mmol) en diclorometano. Tras agitar a temperatura ambiente
durante 4 horas, la reacción se diluyó con más diclorometano, se
lavó con bicarbonato sódico saturado y salmuera, se secó y se
concentró. El residuo se purificó por cromatografía de columna para
obtener
5-morfolina-4-carbonil-1,3-dihidro-indol-2-ona.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,54 (br s, 1H, NH), 7,24
(m, 2H), 6,83 (d, J = 7.6Hz, 1H), 3,56 (m, 4H, 2xCH_{2}),
3,49 (s, 2H, CH_{2}), 3,47 (m, 4H, 2xCH_{2}). MS APCI neg.
m/z 245 [M^{+}-1].
Una mezcla de
5-(morfolina-4-carbonil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
(49,2 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(1 eq.) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se calentó en un
tubo sellado a 80ºC durante 3 horas. Se recogió el precipitado por
filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para obtener el
compuesto del título en forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,52 (s, 1H, NH), 11,16 (br
s, 1H, NH), 7,92 (d, J = 1,4Hz, 1H), 7,83 (s, 1H,
H-vinilo), 7,69 (d, J = 3,0Hz, 1H),
7,41(br s, 1H, NH), 7,21(dd, J = 1,4
& 7,9Hz, 1H), 6,91 (d, J = 7,9Hz, 1H), 3.59 (m, 4H,
2xCH_{2}), 3,52 (m, 4H, 2xCH_{2}), 3,41 (m, 2H, CH_{2}), 3,0
(t, J = 6,6Hz, 2H, CH_{2}. MS m/z 393
[M^{+}+l].
Compuesto
NI-046
Una mezcla de
4-(2-hidroxi-etil)-1,3-dihidro-indol-2-ona
(35,4 mg, 0,2 mmol),
4-oxo4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo-[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(32,8 mg, 0,2 mmol) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se
calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el
precipitado por filtración al vació, se lavó con etanol frío y se
secó para obtener el compuesto del título.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,62 (br s, 1H, NH), 11,0
(s, 1H, NH), 7,66 (d, J = 3,0Hz, 1H), 7,55 (s, 1H,
H-vinilo), 7,38 (br s, 1H, NH), 7,07 (t, J =
7,6Hz, 1H), 6,83 (d, J = 7,6Hz, 1H), 6,76 (d, J =
7,6Hz, 1H), 4,89 (t, J = 4,7Hz, 1H, 0H), 3,70 (m, 2H,
CH_{2}), 3,41 (m, 2H, CH_{2}), 3,06 (t, J = 7,2Hz,
2H, CH_{2}), 2,89 (t, J = 6,4Hz, 2H, CH_{2}). MS
m/z 324 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-047
Una mezcla de
5-metoxi-1,3-dihidro-indol-2-ona
(32,6 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo-[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(32,6 mg, 0,2 mmol) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se
calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el
precipitado por filtración al vació, se lavó con etanol frío y se
secó para obtener el compuesto del título.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,65 (br s, 1H, NH), 10,79
(s, 1H, NH), 7,70 (s, 1H, H-vinilo), 7,66 (d,
J = 2,8Hz, 1H), 7,47 (d, J = 2,4Hz, 1H), 7,38 (br s,
1H, NH), 6,75 (m, 2H), 3,41 (m, 2H, CH_{2}), 3,32 (s, 3H,
OCH_{3}, 2,99 (t, J = 6,5Hz, 2H, CH_{2}). MS m/z
310 [M^{+}+1].
\newpage
Compuesto
NI-048
Una Mezcla de
5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona
(30,2 mg, 0,2 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(32,8 mg, 0,2 mmol) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se
calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el
precipitado por filtración al vacío, se lavó con etanol frío y se
secó para obtener el compuesto del título.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,57 (br s, 1H, NH), 10,98
(s, 1H, NH), 7,77 (s, 1H, H-vinilo), 7,73 (dd,
J = 2,6 & 9,3Hz, 1H), 7,70 (d, J = 2,7Hz, 1H),
7,40 (br s, 1H, NH), 6,96 (m,1 H), 6,84 (dd, 1H), 3,41 (m, 2H,
CH_{2}), 2,98 (t, J = 6,5Hz, 2H, CH,). MS m/z 298
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-049
Una mezcla de
5-bromo-1,3-dihidro-indol-2-ona
(23 mg, 0,11 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piri-dina-1-carbaldehído
(29,7 mg, 0,18 mmol) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se
calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el
precipitado por filtración al vacío, se lavó con etanol frío y se
secó para obtener 26mg (67%) del compuesto del título.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,52 (br s, 1H, NH), 11,09
(br s, 1H, NH), 8,08 (d, J = 2,3Hz, 1H), 7,83 (s, 1H,
H-vinilo), 7,70 (d, J = 3,0Hz, 1H), 7,41 (br
s, 1H, NH), 7,29 (dd, J = 2,3 & 8,3Hz, 1H), 6,82 (d,
J = 8,3Hz, 1H), 3,40 (m, 2H, CH_{2}), 2,99 (t, J =
6,5Hz, 2H, CH_{2}). MS m/z 358/360
Compuesto
NI-050
Una mezcla de ácido
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico
(44,5 mg, 0,25 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(41 mg, 0,25 mmol) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se
calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 6 horas. Se recogió el
precipitado por filtración al vacío y se lavó con etanol frío. Luego
se disolvió el sólido en metanol, los insolubles se eliminaron, y el
filtrado se concentró para obtener 20 mg (25%) del compuesto del
título en forma de sólido amarillo.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,59 (s, 1H, NH), 11,10 (br
s, 1H, NH), 8,24 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,8Hz, 1H), 7,65 (m,
2H), 7,37 (br s, 1H, NH), 6,78 (d, J = 8,1Hz, 1H), 3.38 (m,
CH_{2}), 3,0 (t, 2H, CH_{2}). MS m/z 324
[M^{+}+1].
Compuesto
NI-051
Una mezcla de
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida
(63 mg, 0,3 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(50 mg, 0,3 mmol) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se
calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el
precipitado por filtración al vacío, se lavó con etanol frío y se
secó para obtener 89 mg (82%) del compuesto del título.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,50 (s, 1H, NH), 11,22 (br
s, 1H, NH), 8,27 (d, J = 1,5Hz, 1H), 7,88 (s, 1H,
H-vinilo), 7,72 (d, J = 3,0Hz, 1H), 7,64 (dd,
J = 1,5 & 8,0Hz, 1H), 7,42 (br s, 1H, NH), 7,17 (br s,
2H, NH_{2}), 7,01(d, J = 8,0Hz, 1H), 3,40 (m,
2H, CH_{2}), 3,02 (t, J = 6,6Hz, 2H, CH_{2}). MS
m/z 359 [M^{+}+ 1].
Compuesto
NI-052
Una mezcla de
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida
(66 mg, 0,3 mmol),
4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(50 mg, 0,3 mmol) y 0,1 ml de piperidina en etanol (1 ml) se
calentó en un tubo sellado a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el
precipitado por filtración al vacío, se lavó con etanol frío y se
secó para obtener 50 mg (45%) del compuesto del título.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,51 (br s, 1H, NH), 11,2
(br s, 1H, NH), 8,26 (d, J = 1,3Hz, 1H), 7,94 (s, 1H,
H-vinilo), 7,73 (d, J = 3,1Hz, 1H),
7,58 (dd, J = 1,3 & 8,0Hz, 1H), 7,42 (br s, 1H,
NH), 7,20 (m, 1H, CH_{3}NH), 7,05 (d, J = 8,0Hz, 1H), 3,40
(m, 2H, CH_{2}), 3,04 (t, J = 6,5Hz, 2H, CH_{2}), 2,40
(br s, 3H, CH_{3}). MS m/z 373 [M^{+}+1].
\newpage
Compuesto
NI-053
Se disolvió
4-hidroxietil-2-oxindol
(5 g, 28,2 mmol) en 20 ml de ácido clorosulfónico con agitador a
temperatura ambiente. Tras 30 Min, la mezcla de reacción se añadió
lentamente a agua helada (300 ml) con un agitador. Se filtró el
sólido y se secó para conseguir 1,9 g (28%) de
6,6-dioxo-3,6,8,9-tetrahidro-1H-7-oxa-6\lambda^{6}-tia-3-aza-ciclopenta[\alpha]naftalen-2-ona
en forma de polvo blanco.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,79 (s, 1H, NH), 7,65 (d,
J = 8,2Hz, 1H, Ar-H), 6,90 (d, J =
8,2Hz, 1H, Ar-H), 4,87 (t, J = 5,7Hz, 2H,
CH_{2}OSO_{2}), 3,51 (s, 2H, CH_{2}CO), 3,04 (t, J =
5,9Hz, 2H, CH_{2}Ar). MS m/z 239 [M^{+}].
Se condensó
6,6-dioxo-3,6,8,9-tetrahidro-1H-7-oxa-6\lambda^{6}-tia-3-aza-ciclopenta[\alpha]naftalen-2-ona
(0,1 g, 0,4 mmol) con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrolo-1-carbaldehído
(1,2 eq., 0,08 g) para obtener 0,08 g (50%) del producto
deseado.
RMN^{1}H (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,75 (s, 1H, NH), 11,55 (s,
1H, NH-CO), 7,95 (d, J = 2,9Hz, 1H), 7,69
(d, J = 8,0Hz, 1H), 7,55 (s, 1H, C=CH), 7,04 (d, J =
8,2Hz), 4,95 (t, J = 5,3Hz, 2H, SO_{3}CH_{2}CH_{2}Ar),
4,5 (t, J = 5,8Hz, 2H, CO_{2}CH_{2}CH_{2}pirrol), 3,55
(t, J = 5,0Hz, 2H, SO_{3}CH_{2}CH_{2}Ar), 3,09 (t,
J = 5,7Hz, 2H, CO_{2}CH_{2}CH_{2}pirrol).
Compuesto
NI-054
Una mezcla de
4-(2-hidroxi-etil)4,3-dihidro-indol-2-ona
(35,4 mg, 0,2 mmol),
5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(35,6 mg, 0,2 mmol) y piperidina (0,1 ml) en etanol (1 ml) se
calentó a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el precipitado por
filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para obtener el
compuesto del título.
RMN^{1}H (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,59 (br s, 1H, NH), 10,96
(br s, 1H, NH), 7,64 (d, J = 2,9Hz, 1H), 7,54 (s, 1H,
H-vinilo), 7,07 (t, J = 7,7Hz, 1H), 6,83 (d,
J = 7,7Hz, 1H), 6,76 (d, J = 7,7Hz, 1H), 4,86 (m, 1H,
OH), 3,71 (m, 2H, CH_{2}OH), 3,57 (t, J = 6,9Hz, 2H,
CH_{2}), 3,07 (t, J = 6,9Hz, 2H, CH_{2}), 2,98 (t,
J = 6,6Hz 2H, CH_{2}), 2,95 (s, 3H, CH_{3}).
MS m/z 338 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-055
Una mezcla de
5-bromo-1,3-dihidro-indol-2-ona
(42,4 mg, 0,2 mmol),
5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(35,6 mg, 0,2 mmol) y piperidina (0,1 ml) en etanol (1 ml) se
calentó a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el precipitado por
filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para obtener el
compuesto del título.
RMN^{1}H (360 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 13,47 (br s, 1H, NH), 11,04 (br s, 1H, NH), 8,06 (d,
J = 1,9Hz, 1H), 7,81 (s, 1H, H-vinilo), 7,68
(t, J = 3,3Hz, 1H), 7,29 (dd, J = 1,9 & 8,5Hz,
1H), 6,82 (d, J = 8,5Hz ,1H), 3,58 (t, J = 6,7Hz, 2H,
CH_{2}), 3,08 (t, J = 6,7Hz, 2H, CH_{2}), 2,95 (s, 3H,
CH_{3}).
MS m/z 372/374 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-056
Una mezcla de ácido
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico
(35,4 mg, 0,2 mmol),
5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(35,6 mg, 0,2 mmol) y piperidina (0,1 ml) en etanol (1 ml) se
calentó a 80ºC durante 4 horas. La reacción se trató con HCl 1N y el
precipitado se recogió por filtración al vacío, se lavó con etanol y
se secó para obtener el compuesto del título.
RMN^{1}H (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,46 (br s, 1H, NH), 12,6 (v
br S, 1H, COOH), 11,26 (s, 1H, NH), 8,40 (s, 1H), 7,87 (s, 1H,
H-vinilo), 7,80 (t, J = 8Hz, 1H), 7,68 (dd,
J = 3,1Hz, 1H), 6,95 (d, J = 8Hz, 1H), 3,57 (t,
J = 6,6Hz, 2H, CH_{2}), 3,13 (t, J = 6,6Hz,
2H, CH_{2}), 2,95 (s, 3H, CH_{3}).
MS m/z 338 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-057
Una mezcla de
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsul-fonamida
(45,2 mg, 0,2 mmol),
5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetra-hidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído
(35,6 mg, 0,2 mmol) y piperidina (0,1 ml) en etanol (1 ml) se
calentó a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el precipitado por
filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para obtener el
compuesto del título.
RMN^{1}H (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,47 (br s, 1H, NH), 11,28
(v br s, 1H, NH), 8,24 (d, J = 1,5Hz, 1H), 7,91 (s,
1H, H-vinilo), 7,71 (t, J = 3,2Hz, 1H), 7,58
(dd, J = 1,5 & 8,2Hz, 1H), 7,15 (m, 1H,
CH_{3}NH), 7,05 (d, J = 8,2Hz, 1H), 3,58 (t, J =
6,6Hz, 2H, CH_{2}), 3,13 (t, J = 6,6Hz, 2H, CH_{2}),
2,95 (s, 3H, CH_{3}), 2,42 (s, 3H, CH_{3}).
MS m/z 387 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-058
Una mezcla de
2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilsulfonamida
(48 mg, 0,02 mmol),
5-metil-4-oxo-4,5,6,-tetra-
hidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído (35,6 mg, 0,2 mmol) y piperidina (0,1 ml) en etanol (1 ml) se calentó a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el precipitado por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para obtener el compuesto del título.
hidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridina-1-carbaldehído (35,6 mg, 0,2 mmol) y piperidina (0,1 ml) en etanol (1 ml) se calentó a 80ºC durante 4 horas. Se recogió el precipitado por filtración al vacío, se lavó con etanol y se secó para obtener el compuesto del título.
RMN^{1}H (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,48 (br s, 1H, NH), 11,35
(v br s, 1H, NH), 8,26 (d, J = 1,5Hz, 1H), 8,0 (s, 1H,
H-vinilo), 7,72 (t, J = 2,8Hz, 1H), 7,54
(dd, J = 1,5 & 8,2Hz, 1H), 7,08 (d, J = 8,2Hz,
1H), 3,58 (t, J = 6,6Hz, 2H, CH_{2}), 3,15 (t,
J = 6,6Hz, 2H, CH_{2}), 2,96 (s, 3H, CH_{3}), 2,61 (s,
6H, 2xCH_{3}).
MS m/z 401 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-059
Se condensó
1,3-dihidro-pirrolo[2,3-b]piridin-2-ona
con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrolo-1-carbaldehído
para obtener el compuesto del título.
MS m/z 282 [M^{+}+1].
Compuesto
NI-060
Se condensó
4-(3-Cloro-4-fluoro-fenilamino)-5,7-dihidro-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-ona
con
4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrolo-1-carbaldehído
para obtener el compuesto del título.
MS m/z 426 [M^{+}+1].
Los siguientes ensayos in vitro pueden
usarse para determinar el nivel de actividad y el efecto de los
diferentes compuestos sobre la presente invención en una o más PK.
Ensayos similares pueden diseñarse usando las mismas directrices
para cualquier PK usando técnicas conocidas por los expertos en la
materia.
Hay tres tipos de ensayos útiles para evaluar
compuestos: celular/catalítico, celular/biológico y el in
Vitro. El objetivo del ensayo celular/catalítico es el de
determinar el efecto de un compuesto sobre la capacidad de una TK
para fosforilar tirosinas en un sustrato conocido de la célula. El
objetivo del ensayo celular/biológico es el de determinar el efecto
de un compuesto sobre la respuesta biológica estimulada por una TK
en una célula. El objetivo de un ensayo in vitro es el de
determinar el efecto de un compuesto en un modelo animal de un
trastorno concreto, como por ejemplo el cáncer.
Los análisis celulares/catalíticos descritos aquí
se realizan en un formato ELISA. El procedimiento general es el que
sigue: un compuesto se introduce en células que expresan la quinasa
del test, de forma natural o recombinante, durante un periodo de
tiempo, tras el cual, si la quinasa del test es un receptor, se
añade un ligando cuya función de activación del receptor sea
conocida. Las células se lisan y el lisado se transfiere a los
pocillos de una placa ELISA previamente recubierta con un anticuerpo
específico que reconoce el sustrato de la reacción de fosforilación
enzimática. Los componentes de la parte que no es sustrato de la
célula lisada se eliminan y se detecta la cantidad de fosforilación
en el sustrato con un anticuerpo que reconoce específicamente la
fosfotirosina comparada con células de control que no están en
contacto con un compuesto del test.
Los ensayos celulares/biológicos que se describen
aquí miden la cantidad de DNA fabricada como respuesta a la
activación de la quinasa del test, que es una medida general de la
respuesta proliferativa. El procedimiento general para este ensayo
es el siguiente: se introduce un compuesto en células que expresan
la quinasa del test, ya sea de forma natural o recombinante, durante
un periodo de tiempo, tras el cual, si la quinasa del test es un
receptor, se añade un ligando cuya función de activación del
receptor es conocida. Tras una incubación que dura como mínimo una
noche, se añade un reactivo que marque el DNA, como la
Bromodeoxi-uridina (BrdU) o la
3H-timidina. La cantidad de DNA marcado se detecta
con un anticuerpo anti-BrdU o midiendo la
radiactividad, para luego comparar los resultados con los de las
células de control que no están en contacto con un compuesto del
test.
Los ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas
(ELISA) pueden usarse para detectar y medir la presencia de
actividad PK. El ELISA puede llevarse a cabo de acuerdo con los
protocolos descritos en, por ejemplo, Soller, et al., 1980,
"Enzyme Linked I mMunosorbent Assay", en: Manual of Clinical
Inmunology, 2ª edición por Rose y Friedman, p.
359-371 Am. Soc. Of Microbiology, Washington,
D.C.
El protocolo que se revela puede adaptarse para
determinar la actividad respecto a una PK concreta. Por ejemplo, los
protocolos preferidos para realizar experimentos ELISA para PK
concretas se muestran seguidamente. La adaptación de estos
protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros
miembros de la familia RTK, así como para CTK y STK, se encuentra
dentro del campo de conocimiento de aquéllos expertos en medir la
presencia de actividad PK. El ELISA puede realizarse de acuerdo con
los protocolos conocidos que se describen en, por ejemplo, Soller,
et al., 1980, "Enzime Linked I mMunosorbent Assay", en
Manual of Clinical Inmunology, 2ª ed., editado por Rose y
Friedman, p. 359-371 Am. Soc. Of Microbiology,
Washington, D.C.
El protocolo que se revela puede adaptarse para
determinar la actividad respecto a una PK específica. Por ejemplo,
los protocolos preferidos para realizar experimentos ELISA para PK
concretas se proporcionan seguidamente. La adaptación de estos
protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros
miembros de la familia RTK, así como para CTK y STK, está dentro del
campo de conocimiento de aquéllos expertos en la materia.
Se realizó un ensayo ELISA para medir la
actividad quinasa del receptor FLK-1, y más
específicamente, la inhibición o activación de la actividad TK sobre
el receptor FLK-1. Concretamente, el siguiente
ensayo se llevó a cabo para medir la actividad del receptor
FLK-1 en células creadas genéticamente para expresar
FLK-1.
Se usaron los siguientes reactivos y
proveedores:
a. Placas ELISA de 96 pocillos Corning (catálogo
de Corning nº 25805-96);
b. IgG anti-conejo de cabra de
Laboratorios Cappel (catálogo nº 55641);
c. PBS (catálogo de Gibco nº
450-1300EB);
d. Tampón TBSW (Tris 50 mM (pH 7,2), NaCl 150 mM
y 0,1% de Tween-20);
e. Disolución stock de etanolamina (10%
etanolamina (pH 7,0) guardado a 4ºC);
f. Tampón HNT G (tampón HEPES 20 mM (pH 7,5),
NaCl 150 mM, 0,2 de Triton X-100, y 10% de
glicerol);
g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) en una disolución stock
100X);
h. Ortovanadato de sodio (0,5 M en una disolución
100X);
i. Pirofosfato de sodio (0,2 M en una disolución
stock 100X);
j. Placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos
con fondo en V (catálogo de Applied Scientific nº
AS-72092);
k. Células NIH3T3 C7#3 (células que expresan
FLK-1);
l. DMEM con L-Glutamina a 1X de
glucosa (catálogo nº 11965-050);
m. FBS, Gibco (catálogo nº
16000-028);
n. L-Glutamina, Gibco (catálogo
nº 25030-016);
o. VEGF, PeptroTech, Inc. (catálogo nº
100-20)(guardado como 1 \mug/100 \mul stock en
Milli-Q dH_{2}O y guardado a -20ºC);
p. Antisuero de afinidad con
anti-FLK-1 purificado;
q. Anticuerpos monoclonales UB40 específicos para
fosfotirosina (ver, Fendley et al., 1990, Cancer
Research 50:1550-1558);
r. IgG-POD
anti-ratón de cabra grado EIA (catálogo de BioRad nº
172-1011);
s. Solución de ácido
2-2-azino-bis(3-etilbenz-tiazolina-6-sulfónico
(ABTS) (ácido cítrico (anhídrido) 100 mM, Na_{2}HPO_{4} 250 mM
(pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (catálogo Sigma nº
A-1888)). La solución debe guardarse en la oscuridad
a 4ºC hasta que se vaya a usar;
t. H_{2}O_{2} (30% solución) (catálogo de
Fisher nº H325);
u. ABTS/H_{2}O_{2} (15 ml de solución ABTS, 2
\mul de H_{2}O_{2}) preparada 5 minutos antes de usar y
mantenida luego a temperatura ambiente;
v. HCl stock 0,2 M en H_{2}O
w. Dimetilsulfóxido (100%)(catálogo de Sigma nº
D-8418); y
x. Tripsina-EDTA (catálogo de
Gibco BRL nº 25200-049).
El ensayo se realizó siguiendo el protocolo que
se detalla a continuación:
1. cubrir las placas Corning ELISA de 96 pocillos
con 1,0 \mul por pocillo con anticuerpo anti de conejo Cappel en
0,1 M de Na_{2}CO_{3} pH 9,6. Se lleva a un volumen final de 150
\mul por pocillo. Las placas se cubren durante la noche a 4ºC. Se
puede guardar las placas hasta dos semanas a una temperatura de
4ºC.
2. hacer crecer las células en medios de
crecimiento (DMEM, complementado con 2,0 mM de
L-Glutamina, 10% FBS) en discos de cultivo adecuados
hasta confluencia a 37ºC, 5% CO_{2}.
3. recuperar las células de cultivo por
tripsinización y sembrar en placas Corning 25850 de poliestireno de
96 pocillos con fondo redondeado, 25.000 células/pocillo en 200
\mul de medio de crecimiento.
4. hacer crecer las células durante un día a
37ºC, 5% CO_{2}.
5. lavar las células con D-PBS
1X
6. añadir 200 \mul/pocillo de medio libre de
suero (DNEM, 1-Glutamina 2,0 mM, 0,1% FBS). Incubar
durante la noche a 37ºC, 5% CO_{2}.
7. diluir los compuestos 1:20 en placas de
polipropileno de 96 pocillos utilizando medio libre de suero. Diluir
dimetilsulfóxido 1:20 para su uso en pocillos de control.
8. eliminar el medio libre de suero de las placas
de cultivo celular de 96 pocillos y añadir 162 \mul de medio libre
de suero fresco a cada pocillo.
9. añadir 18 \mul de 1:20 de disolución de
compuesto (del paso 7) a cada pocillo más una dilución 1:20 de
dimetilsulfóxido a los pocillos de control (+/- VEGF), para una
dilución final de 1:200 tras la estimulación celular. El
dimetilsulfóxido está a 0,5%. Incubar la placa a 37ºC, 5% CO_{2}
durante dos horas.
10. eliminar de las placas ELISA los anticuerpos
no unidos mediante la inversión de la placa para eliminar el
líquido. Lavar 3 veces con TBSW + 0,5% etanolamina, pH 7,0. Golpear
suavemente la placa sobre una servilleta de papel para eliminar el
exceso de líquido y burbujas.
11. bloquear las placas con TBSW + 0,5%
etanolamina, pH 7,0, 150 \mul por pocillo. Incubar la placa
durante 30 minutos mientras se agita en un agitador para placas
microtituladas.
12. lavar la placa 3 veces tal y como se describe
en el paso 10.
13. añadir 0,5 \mug/pocillo de antisuero de
conejo policlonal anti-FLU-1 de
afinidad purificada. Llevar a un volumen final de 150 \mul/pocillo
con TBSW + 0,5% etanolamina pH 7,0. Incubar la placa durante 30
minutos mientras se agita.
14. añadir 180 \mul de medio libre de suero a
las células y estimular las células con 20 \mul/pocillo de
ortovanadato de sodio 10,0 mM y 500 ng/ml de VEGF (cuyo resultado es
una concentración final de 1,0 mM de ortovanadato de sodio y 50
ng/ml de VEGF por pocillo) durante ocho minutos a 37ºC, 5% CO_{2}.
Los pocillos de control negativos únicamente reciben medio libre de
suero.
15. tras ocho minutos, los medios deberán
eliminarse de las células y lavarse una vez con 200 \mul/pocillo
de PBS.
16. lisar las células en 150 \mul/pocillo de
HNTG mientras se agita a temperatura ambiente durante cinco minutos.
La formulación del HNT G incluye ortovanadato de sodio, pirofosfato
de sodio y EDTA.
17. lavar la placa de ELISA tres veces tal y como
se describe en el paso 10.
18. transferir el lisado de células de la placa
celular a la placa ELISA e incubar mientras se agita durante 2
horas. Para transferir el lisado celular hay que pipetear mientras
se desecha los pocillos.
19. lavar la placa tres veces tal y como se
describe en el paso 10.
20. incubar la placa ELISA con 0,02
\mug/pocillo de UB40 en TBSW + 0,5% de etanolamina. Llevar a un
volumen final de 150 \mul/pocillo. Incubar mientras se agita
durante treinta minutos.
21. lavar la placa tres veces tal y como se
describe en el paso 10.
22. incubar la placa ELISA con peroxidasa de
rábano picante conjugada de IgG anti-ratón de cabra
de grado EIA diluida 1:10.000, en TBSW + 0,5% de etanolamina, pH
7,0. Llevar a un volumen final de 150 \mul/pocillo. Incubar
mientras se agita durante treinta minutos.
23. lavar la placa tal y como se describe en el
paso 10.
24. añadir 100 \mul de solución
ABTS/H_{2}O_{2} a los pocillos. Incubar diez minutos mientras
se agita.
25. añadir 100 \mul de HCl a 0,2 M para una
solución final de HCl 0,1 M para parar el desarrollo del color de la
reacción. Agitar durante un minuto a temperatura ambiente. Eliminar
las burbujas con un chorro de aire lento y leer la placa ELISA en un
lector de placas ELISA a 410nm.
Este ensayo analiza la actividad tirosin quinasa
del GST-Flk-1 sobre los péptidos
poly glu tyr.
1. placas ELISA de 96 pocillos Corning (catálogo
de Corning nº 25805-96).
2. poly glu tyr 4:1, liofilizado (catálogo de
Sigma # P0275). Preparar 1 mg/ml de poly glu tyr en PBS estéril y
guardar alícuotas de 1 ml a -20ºC.
3. preparación de placas de ensayo cubiertas con
poly glu tyr (pEY): cubrir 2 \mug/pocillo de poly glu tyr (pEY) en
100 \mul de PBS a temperatura ambiente durante 2 horas o a +4ºC
durante la noche. Cubrir los pocillos de la placa para evitar la
evaporación.
4. tampón PBS: para elaborar 1 litro de una
solución con utilización a 1x, mezclar 0,02 g de KH_{2}PO_{4},
1,15 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,2 g de KCl y 8 g de NaCl en
aproximadamente 900 ml de dH_{2}O. Cuando todos los reactivos se
hayan disuelto, ajustar el pH a 7,2 con HCl. Llevar el volumen total
a 1 litro con dH_{2}O.
5. tampón PBS-Tw: para 1 litro de
tampón PBS, añadir 1,0 ml de Tween-20. Remover hasta
que esté totalmente disuelto.
6. tampón de bloqueo TBB: para elaborar un litro
de una solución a 1x, mezclar 1,21 g TRIS, 8,77 g de NaCl, y 1 ml de
Tween-20 en aproximadamente 900 ml dH_{2}O.
Ajustar el pH a 7,2 con HCl. Añadir 10 g de BSA y remover hasta
disolver. Llevar a un volumen total de 1 litro con dH_{2}O.
Filtrar para eliminar la materia particulada.
7. 1% de BSA en PBS: para hacer una solución de
rendimiento 1x, añadir 10 g de BSA a aproximadamente 990 ml de
tampón PBS, remover hasta su disolución. Ajustar el volumen total a
1 litro con tampón PBS, filtrar para eliminar la materia
particulada.
8. Hepes 50 mM a pH 7,5.
9. GST-FLK-1 cd
purificado a partir de la transformación de baculovirus
recombinante sf9
10. 4% DMSO en dH_{2}O.
11. 10 mM de ATP en dH_{2}O.
12. MnCl_{2} 40 mM.
13. tampón de dilución quinasa (KDB): Mezclar 10
ml de Hepes (pH 7,5), 1 ml de NaCl a 5 M, 40 \mul de NaVO_{4}
100 mM y 0,4 ml de BSA 5% en dH_{2}O con 88,56 ml de
dH_{2}O.
14. placas NUNC de polipropileno de 96 pocillos
con fondo en V de Applied Scientific (catálogo
#AS-72092).
15. EDTA: mezclar 14,12 g de ácido
etilendiaminotetracético (EDTA) con aproximadamente 70 ml
dH_{2}O. Añadir 10N de NaOH hasta que se disuelva el EDTA.
Ajustar el pH a 8,0. Ajustar el volumen total a 100 ml con
dH_{2}O.
16. 1 tampón de dilución de anticuerpos: mezclar
10 ml de 5% BSA en tampón PBS con 89,5 ml de TBSTw.
17. anti-fosfotirosina monoclonal
conjugada a peroxidasa de rábano picante (PY99 HRP, Santa Cruz
Biotech).
18. ácido
2,2'-Azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-sulfónico
(ABTS, Moss, Cat. nº ABST).
19. 10% SDS.
1. cubrir las placas ELISA Corning de 96 pocillos
con 2 \mug de péptido poliEY en PBS estéril tal y como se
describe en el paso 3 de Materiales y Reactivos.
2. eliminar el líquido no ligado de los
pocillosmediante una inversión de la placa. Lavar una vez con
TBSTw. Golpear suavemente la placa sobre una servilleta de papel
para eliminar el exceso de líquido.
3. añadir 100 \mul de BSA 1% en PBS a cada
pocillo. Incubar, con agitación, durante 1h a temperatura
ambiente.
4. repetir el paso 2.
5. remojar los pocillos con Hepes 50 mM a pH 7,5
(150 \mul/pocillo).
6. diluir el compuesto del test con dH_{2}O/4%
DMSO hasta 4 veces la concentración del ensayo final deseada en
placas de polipropileno de 96 pocillos.
7. añadir 25 \mul del compuesto del test a la
placa ELISA. Para los pocillos de control (pocillos que no reciben
ningún compuesto del test), añadir 25 \mul de dH_{2}O/4%
DMSO.
8. añadir 25 \mul de MnCl_{2} 40 mM con ATP
4x (2 \muM) a todos los pocillos.
9. añadir 25 \mul de EDTA a 0,5 M a los
pocillos de control negativo.
10. diluir
GST-FLK-1 0,005 \mug (5ng)/pocillo
en KDB. Para 50 ml de KDB añadir 100 \mul de enzima
GST-FLK-1 a 0,50 mg/ml.
11. añadir 50 \mul de enzima diluido a cada
pocillo.
12. incubar, con agitación, durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
13. parar la reacción mediante la adición de 50
\mul de EDTA 250 mM (pH 8,0).
14. Lavar 3 veces con TBSTw y golpear suavemente
la placa sobre una servilleta de papel para eliminar el exceso de
líquido.
15. añadir 100 \mul por pocillo de conjugado
anti-fosfotirosina HRP, dilución 1:5.000 en tampón
de dilución de anticuerpo. Incubar con agitación durante 90 minutos
a temperatura ambiente.
16. lavar tal y como se describe anteriormente en
el apartado 14.
17. añadir a cada pocillo 100 \mul de solución
ABTS a temperatura ambiente
18. incubar, con agitación, durante
10-15 minutos. Eliminar cualquier burbuja.
19. Parar la reacción añadiendo 20 \mul de SDS
10%.
20. Leer el ensayo con el lector de ELISA
Dynatech MR7000: filtro del test a 410 nM; filtro de referencia a
630 nM.
Este ensayo se utiliza para medir la actividad
quinasa in Vitro del epítopo HA marcado de longitud completa
pyk2 (FL pyk2-HA) en un ensayo ELISA.
1. placas ELISA Corning de 96 pocillos (catálogo
de Corning #25805-96).
2. anticuerpos anti-HA
monoclonales 12CA5.
3. PBS (solución salina tamponada con fosfatos
Dulbecco, catálogo de Gibco #450-1300EB)
4. tampón TBST: mezclar 8,766 g de NaCl, 6,057 g
de TRIS y 1 ml de Triton X-100 a 0,1% en
aproximadamente 900 ml dH_{2}O. Ajustar el pH a 7,2, y llevar el
volumen a 1 litro.
5. tampón de bloqueo: mezclar 100 g de BSA 10%,
12,1 g de TRIS a 100 mM, 58,44 g de NaCl a 1 My 10 ml de
Tween-10 a 1%.
6. FL.pyk2-HA de lisados de
células sf9.
7. 4% DMSO en MilliQ H_{2}O.
8. ATP 10 mM en dH_{2}O.
9. MnCl_{2} 1M
10. MgCl_{2} 1M
11. Ditiotreitol (DTT) 1M
12. mezcla de fosforilación del tampón quinasa
10X: mezclar 5,0 ml de Hepes 1 M(pH 7,5), 0,2 ml de
MnCl_{2} 1 M, 1,0 ml de MgCl_{2}, 1,0 ml de Triton
X-100 al 10% con 2,8 ml dH_{2}O. Justo antes de
usar, añadir 0,1 ml de DTT 1M.
13. placas de polipropileno NUNC de 96 pocillos
con fondo en forma de V (catálogo de Applied Scientific #
AS-72092).
14. EDTA
15. mab anti-fosfotirosina
conjugado de biotina (Upstate Biotechnology In., clon 4G10 catálogo
# 16-103, ser. # 14495).
16. reactivo Vectastain Elite ABC (conjugado
peroxidasa de avidina, Vector Laboratories
(PK-6100)).
17. solución ABTS: mezclar 19,21 g de ácido
cítrico con 35,49 g de Na_{2}HPO_{4} en aproximadamente 900 ml
dH_{2}O. Ajustar el pH a 4,0 con ácido fosfórico. Añadir de 5 a 10
g de ABST. Cuando esté todo disuelto, filtrar.
18. solución de peróxido de hidrógeno al 30%.
19. ABTS/H_{2}O: mezclar 10 ml de solución ABTS
con 3 \mul de H_{2}O_{2} al 30% cinco minutos antes de
usar.
20. HCl 0,2M
1. Cubrir las placas ELISA Corning de 96 pocillos
con0,5 \mul por pocillo de anticuerpo anti-HA
12CA5 en 100 \mul de PBS. Guardar toda la noche a 4ºC.
2. Eliminar los anticuerpos HA no ligados de los
pocillos mediante la inversión de la placa. Golpear suavemente la
placa sobre una servilleta de papel para eliminar el exceso de
líquido.
3. añadir 150 \mul de tampón de bloqueo a cada
pocillo. Incubar, con agitación, durante una hora a temperatura
ambiente.
4. lavar las placas con
TBS-T.
5. diluir el lisado en PBS (1,5 \mug de
lisado/100 \mul de PBS).
6. añadir 100 \mul de lisado diluido a cada
pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante una hora.
7. lavar como se indica en el paso 4.
8. añadir 50 \mul de tampón quinasa 2X a la
placa ELISA que contiene pyk2-HA capturado.
9. añadir 25 \mul de compuesto del test a 40
\muM en DMSO 4% o DMSO solo (control) a la placa.
10. añadir 25 \mul de EDTA 0,5 M a los pocillos
de control negativo.
11. añadir 25 \mul de ATP 20 \muM a todos los
pocillos. Incubar, con agitación, durante 10 minutos.
12. parar la reacción añadiendo 25 \mul de EDTA
500 mM (pH 8,0) a todos los pocillos.
13. lavar como se indica en el paso 4.
14. añadir 100 \mul de mab
anti-fosfotirosina conjugado a la biotina (dilución
1:5000 en tampón de bloqueo) a cada pocillo. Incubar, con agitación,
durante 30 minutos a temperatura ambiente.
15. preparar el reactivo Vectastain ABC. Dejar
reposar 30 minutos para un aparejamiento completo entre la avidina y
la HRP biotinilada. Añadir 1 gota (ó 50 \mul) del reactivo A a 15
ml de tampón de bloqueo. Mezclar mediante la inversión del tubo
varias veces. Añadir 1 gota (ó 50 \mul) de reactivo B y mezclar de
nuevo. Permitir que el reactivo ABC se mezcle a temperatura ambiente
mientras la anti-fosfotirosina
biotin-4G10 se incuba en la placa de ensayo.
16. lavar como se indica en el paso 4.
17. añadir 100 \mul por pocillo de conjugado de
peroxidasa Vectastain preparado. Incubar, con agitación, durante 30
minutos a temperatura ambiente.
18. lavar como se indica en el paso 4, y luego
lavar una vez con PBS.
19. añadir 100 \mul de la solución
ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
20. incubar, con agitación, durante
10-15 minutos. Eliminar cualquier burbuja.
21. en caso de ser necesario, parar la reacción
añadiendo 100 \mul de HCl 0,2 Mpor pocillo.
22. leer el ensayo en el lector ELISA Dynatech
MR7000 con el filtro de test a 410 nM y el filtro de referencia a
630 nM.
Este ensayo se usa para medir la actividad
quinasa in vitro del FGF-1-R
en un ensayo ELISA.
1. placas ELISA Costar de 96 pocillos (catálogo
de Corning # 3369).
2. Poly(Glu,Tyr) (catálogo de Sigma #
PO275).
3. PBS (catálogo de Gibco #
450-1300EB).
4. solución de tampón Hepes 50 mM
5. tampón de bloqueo (BSA/PBS 5%).
6. GST-FGFR1 purificado
7. tampón de dilución quinasa: mezclar 500 \mul
de Hepes 1 M(Gibco), 20 \mul de BSA/PBS 5%, 10 \mul de
ortovanadato de sodio 100 mM y 50 \mul de NaCl 5 M.
8. ATP 10 mM
9. MnCl2 1 M
10. mezcla de fosforilación ATP/MnCl_{2}:
mezclar 20 \mul de ATP, 100 \mul de MnCl_{2} y 9,56 ml
dH_{2}O.
11. placas de polipropileno NUNC de 96 pocillos
con fondo en forma de V (catálogo de Applied Scientific #
AS-72092).
12. EDTA 0,5 M.
13. TBST 0,05%: añadir 500 \mul de Tween a 1
litro de TBS.
14. suero anti-fosfotirosina
policlonal de conejo.
15. conjugado peroxidasa IgG
anti-conejo de cabra (catálogo de Biosource #
ALI0404).
16. solución ABTS
17. peróxido de hidrógeno 30%.
18. ABTS/H_{2}O_{2}
1. cubrir placas ELISA Costar de 96 pocillos con
1 \mug por pocillo de Poly(Glu,Tyr) en 100 \mul PBS.
Guardar toda la noche a 4ºC.
2. lavar las placas cubiertas una vez con
PBS.
3. añadir 150 \mul de 5% BSA/PBS de tampón de
bloqueo a cada pocillo. Incubar, con agitación, durante 1 hora a
temperatura ambiente.
4. lavar la placa 2 veces con PBS, luego una vez
con Hepes 50 mM. Golpear suavemente las placas sobre una servilleta
de papel para eliminar el exceso de líquido y burbujas.
5. añadir 25 \mul del compuesto del test a 0,4
mM en DMSO 4% o DMSO 4% solo (control) a las placas.
6. diluir GST-FGFR1 en tampón de
dilución quinasa (5 ng quinasa/50 \mul KDB/pocillo).
7. añadir 50 \mul de quinasa diluida a cada
pocillo.
8. iniciar la reacción quinasa añadiendo 25
\mul/pocillo de ATP/Mn^{++} recién preparada (0,4 ml de
MnCl_{2} 1 M, 40 \mul de ATP 10 mM, 9,56 ml dH_{2}O) recién
preparado).
9. esta es una reacción de quinasa rápida y debe
pararse con 25 \mul de EDTA 0,5 M de forma similar a la adición
de ATP.
10. lavar la placa 4 veces con TBST fresco.
11. elaborar un tampón de dilución de anticuerpo:
por 50 ml: mezclar 5 ml de BSA 5%, 250 \mul de leche 5% y 50
\mul de vanadato de sodio 100 mM. Llevar al volumen final con
TBST 0,05%.
12. añadir 100 \mul por pocillo de
anti-fosfotirosina (dilución 1:10000 en ADB).
Incubar, con agitación, durante una hora a temperatura ambiente.
13. lavar tal como se indica en el paso 10.
14. añadir 100 \mul por pocillo de conjugado de
peroxidasa IgG anti-conejo de cabra BioSource
(dilución 1:6000 en ADB). Incubar, con agitación, durante 1 hora a
temperatura ambiente.
15. lavar tal como se indica en el paso 10 y
luego con PBS para eliminar las burbujas y el exceso de Tween.
16. añadir 100 \mul de solución
ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
17. incubar, con agitación, durante
10-20 minutos. Eliminar cualquier burbuja.
18. leer el ensayo en el lector ELISA Dynatech
MR7000: filtro del test a 410 nM, filtro de referencia a 630
nM.
Este ensayo se usó para medir la actividad
quinasa HER-2 en células completas en un formato
ELISA.
1. DNEM (catálogo de Gibco
#11965-092).
2. suero bovino fetal (GBS, catálogo de Gibco
#16000-044), calentar inactivado en un baño de agua
durante 30 minutos a 56ºC.
3. tripsina (catálogo de Gibco #
25200-056).
4. L-Glutamina (catálogo de Gibco
# 25030-081).
5. Hepes (catálogo de Gibco
#15630-080).
6. medios de crecimiento: mezclar 500 ml DNEM, 55
ml de FBS inactivado por calor, 10 ml de Hepes y 5,5 ml de
L-Glutamina.
7. medios libres de suero: mezclar 500 ml de
DNEM, 2,5 ml de FBS inactivado por calor, 10 ml de Hepes y 5,5 ml
de L-Glutamina.
8. PBS.
9. placas microtituladas de cultivo tisular de 96
pocillos con fondo plano (catálogo de Corning # 25860).
10. 15 cm de discos de cultivo tisular (catálogo
de Corning # 08757148).
11. placas ELISA Corning de 96 pocillos.
12. placas de polipropileno NUNC de 96 pocillos
con fondo en forma de V.
13. cartuchos Transfer Costar para el Transtar 96
(catálogo de Costar # 7610).
14. SUMO 1: anticuerpo anti-EGFR
monoclonal.
15. tampón TBST.
16. tampón de bloqueo: 5% de Leche instantánea
Carnation en PBS.
17. ligando EGF: EGF-201, Shinko
American, Japan. Suspender el polvo en 100 \mul de HCl 10 mM.
Añadir 100 \mul de NaOH 10 mM. Añadir 800 \mul de PBS y
transferirlo a un tubo Eppendorf para su almacenaje a -20ºC.
18. tampón de lisis HNTG:
Para HNT G 5X stock: mezclar 23,83 g de Hepes,
43,83 g de NaCl, 500 ml de glicerol y 100 ml de Triton
X-100 y dH_{2}O suficiente para hacer una solución
total de 1 litro.
Para HNTG* 1X: mezclar 2ml de HNT G, 100 \mul
de Na_{3}VO_{4} 0,1 M, 250 \mul de Na_{4}P_{2}O_{7} y
100 \mul de EDTA.
19. EDTA.
20. Na_{3}VO_{4}.
Para hacer una solución stock: mezclar 1,84 g de
Na_{3}VO_{4} con 90 ml de dH_{2}O. Ajustar el pH a 10. Hervir
en el microondas durante un minuto (la solución se vuelve más
clara). Enfriar hasta temperatura ambiente. Ajustar pH a 10. Repetir
el ciclo de calentar/enfriar hasta que el pH se mantenga en 10.
21. Na_{4}P_{2}O_{7} 200 mM.
22. antisuero policlonal de conejo específico
para fosfotirosina (anticuerpo anti-Ptyr).
23. antisuero de afinidad purificada, anticuerpo
de cabra anti IgG de conejo, conjugado de peroxidasa (catálogo de
Biosource # ALI0404).
24. solución ABTS.
25. solución de peróxido de hidrógeno al 30%.
26. ABTS/H_{2}O_{2}.
27. HCl 0,2 M.
1. cubrir las placas ELISA Corning de 96 pocillos
con SUMO1 a 1,0 \mug por pocillo en PBS, 100 \mul de volumen
final/pocillo. Almacenar durante la noche a 4ºC.
2. en el día de su utilización, eliminar el
tampón de recubrimiento y lavar la placa 3 veces con dH_{2}O y una
vez con tampón TBST. Todos los lavados en este ensayo deben hacerse
de esta manera, a menos que se especifique lo contrario.
3. añadir 100 \mul de tampón de bloqueo a cada
pocillo. Incubar la placa, con agitación, durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Justo antes de su uso, lavar la placa como se
ha descrito anteriormente.
4. utilizar la línea celular
EGFr/HER-2 quimera/3T3-C7 para este
ensayo.
5. escoger los discos con 80-90%
de confluencia. Recoger las células por tripsinización y
centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5
minutos.
6. resuspender las células en medio libre de
suero y contar con azul de tripano. Es necesaria una viabilidad por
encima del 90%. Sembrar las células en medio libre de suero a una
densidad de 2.500 células por pocillo, 90 \mul por pocillo en una
placa microtitulada de 96 pocillos. Incubar las células sembradas
toda la noche a 37ºC bajo CO_{2} al 5%.
7. empezar el ensayo dos días después del
sembrado.
8. dilución del compuesto del test:
Se diluye las muestras directamente en una placa
de polipropileno que contiene medio libre de suero -DNEM. Esta
dilución será de 1:10 o mayor, dependiendo de las muestras
estudiadas. Se pone la misma cantidad de DMSO en los pocillos de
control. Todos los pocillos se transfieren luego a la placa celular
a una dilución de 1:10 (10 \mul de muestra y medio en 10 \mul de
medio libre de suero). La concentración final de MSO será de 1% o
menor.
Se pone diez muestras en los pocillos 2 al 11 de
la fila A de una placa de polipropileno. Estos pocillos contienen
DMEM totalmente libre de suero. Para una dilución 1:10, hay que usar
10 \mul de solución del compuesto del test en 90 \mul de medio.
El resto de los pocillos (incluyendo los de control) tendrán una
mezcla de DMSO/medio. El porcentaje de DMSO en la mezcla viene
determinado por el primer factor de dilución, esto es, en este
ejemplo, 1:10. La concentración de DMSO es, por lo tanto, del 10%.
Se pone una cantidad equivalente de fármaco y medio de la fila A en
la fila B, que contiene DMSO y medio. La misma cantidad se aparta
luego y se pone en la fila C, etc. Hay diluciones 1:2. Todos los
pocillos se transfieren luego a la placa celular a una dilución de
1:10 (10 \mul de muestra y medio en 90 \mul de medio libre de
suero). La concentración final de DMSO será de 1% o menor.
9. incubar bajo CO_{2} al 5% a 37ºC durante 2
horas.
10. preparar el ligando EGF mediante la dilución
de EGF stock (16,5 \muM) en DNEM templado a 150 nM.
11. preparar suficiente HNTG* fresco para
administrar 100 \mul por pocillo. Ponerlo en hielo.
12. tras 2 horas de incubación con el compuesto
del test, añadir el ligando EGF preparado a las células, 50 \mul
por pocillo, para una concentración final de 50 nM. Los pocillos de
control positivo reciben la misma cantidad de EGF. Los de control
negativo no reciben EGF. Incubar a 37ºC durante 10 minutos.
13. eliminar el compuesto del test, EGF, y DNEM.
Lavar las células una vez con PGS.
14. transferir HNTG* a las células, 100 \mul
por pocillo. Ponerlo en hielo durante 5 minutos. Mientras tanto
eliminar el tampón de bloqueo de la placa ELISA y lavar.
15. con una punta de pipeta bien sujeta a la
micropipeta, raspar las células de la placa y homogeneizar el
material celular mediante una repetida aspiración y administración
de tampón de lisis HNTG*. Transferir el lisado a una placa de ELISA
lavada, recubierta y bloqueada. Alternativamente, uno puede utilizar
un cartucho de transferencia Costar para transferir el lisado a la
placa ELISA.
16. incubar, con agitación, a temperatura
ambiente durante una hora.
17. eliminar el lisado, lavar. Transferir el
anticuerpo anti-Ptyr recién diluido (1:3000 en
TBST) a la placa ELISA, 100 \mul por pocillo.
18. incubar, con agitación, a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
19. eliminar el anticuerpo
anti-Ptyr, lavar. Transferir el anticuerpo Biosource
recién diluido a la placa ELISA (1:8000 en TBST, 100 \mul por
pocillo).
20. incubar, con agitación, a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
21. eliminar el anticuerpo biosource, lavar.
Transferir la solución ABTS/H_{2}O_{2} recién preparada a la
placa ELISA, 100 \mul por pocillo.
22. incubar, con agitación, durante
5-10 minutos. Eliminar cualquier burbuja.
23. en caso necesario, parar la reacción con la
adición de \mul de HCl a 0,2 M por pocillo.
24. leer el ensayo en el lector ELISA Dynatech
MR7000: filtro del test a 410 nM, filtro de referencia a 630
nM.
El siguiente protocolo describe los
procedimientos utilizados para analizar la actividad protein
serina/treonina quinasa de la cdk2/ciclina A en un SPA. El
procedimiento también describe el protocolo para el estudio inicial
de fármacos para la inhibición o activación de la actividad
quinasa.
1. placas de polietileno teraftalato de 96
pocillos (flexi) Wallac (catálogo de Wallac #
1450-401).
2. Redivue Amersham [\gamma^{33}P] ATP
(catálogo de Amersham # AH 9968).
3. perlas SPA de poliviniltolueno recubiertas con
estreptavidina (catálogo de Amersham # RPNQ0007). Reconstituir las
perlas en PBS sin magnesio ni calcio, a 20 mg/ml. Guardar las perlas
reconstituidas a 4ºC.
4. complejo del enzima cdk2/ciclina A activado
purificado de células Sf9, a -80ºC, alícuotas de 200 \mul.
5. sustrato peptídico biotinilado (debtide).
Biotina-X-PKTPKKAKKL peptídica
disuelta en dH_{2}O a concentración de 5 mg/ml. Guardada en
alícuotas de 100 \mul a -80ºC.
6. mezcla péptido/ATP:
| Reactivo | Concentración | Concentración | Cantidad | Concentración |
| stock | útil 2,5X | por 10 ml | final del pocillo | |
| dH_{2}O | 10 ml | 9,979 ml | - - - | |
| ATP frío | 10 mM | 1,25 \muM | 0,00125 ml | 0,5 \muM |
| Debtide | 5 mg/ml | 0,005 mg/ml | 0,010 ml | 0,1 \mug/pocillo |
| ATP \gamma^{33} P | 10 \muCi/\mul | 10 \muCi/ml | 0,010 ml | 0,2 \muCi/pocillo |
7. tampón quinasa 2,5X
| Reactivo | Solución | Cantidad | Concentración | Concentración |
| stock | por 10 ml | activa | final del pocillo | |
| dH_{2}O | 55,5 M | 8,85 ml | - - - | |
| Tris pH 7,4 | 1 M | 0,65 ml | 62,5 mM | Tris 25 mM |
| MgCl_{2} | 1 M | 0,25 ml | 25 mM | MgCl_{2} 10 mM |
| NP40 | 10% | 0,25 ml | 0,25% | NP40 0,1% |
| *DTT (añadir | 1 M | 0,025 ml | 2,5 mM | DTT 1 mM |
| fresco) |
8. ATP 10 mM (catálogo de Sigma #
A-5394).
9. Tris 1 M, pH 7,4.
10. MgCl_{2} 1 M
11. DTT 1 M
12. PBS (solución salina tamponada con fosfatos
Dulbecco) sin magnesio ni calcio (catálogo de Gibco #
14190-144).
13. EDTA (14,12 g por 100 ml)
14. solución de parada (STOP):
| Reactivo | Solución stock | Cantidad por 10 ml | Concentración activa |
| PBS | 9,25 ml | ||
| ATP | 100 mM | 0,005 ml | 50 \muM |
| EDTA | 0,5 M | 0,1 ml | 5 mM |
| Triton 100X | 10% | 0,1 ml | 0,1% |
| Perlas SPA | 20 mg/ml | 1,25 ml | 0,5 mg/pocillo (200 \mul) |
1. preparar soluciones de inhibidores a 5x de la
concentración final deseada en 5% de DMSO. Añadir 10 \mul a cada
pocillo. Para los controles negativos añadir 10 \mul de DMSO al
5%.
2. diluir 5 \mul de solución de cdk2/ciclina A
en 2,1 ml de tampón quinasa 2x (por placa)
3. añadir 20 ml de enzima por pocillo. Se puede
añadir utilizando una pipeta manual o con la Titertek
Multidrop.
4. añadir 10 \mul de EDTA 0,5 M a los pocillos
de control negativos.
5. para iniciar la reacción quinasa, añadir 20
\mul de mezcla péptido/ATP utilizando o bien una pipeta manual o
la Titertek Multidrop. Dejar reposar en la poyata detrás del escudo
reactivo durante 1 hora.
6. añadir 200 \mul de solución de parada por
pocillo usando o bien la Titertek Multidrop o una pipeta manual.
7. dejar reposar por lo menos 10 minutos.
8. centrifugar la placa a aproximadamente 2300
rpm durante 3-5 minutos.
9. contar la placa en el lector Trilux utilizando
el protocolo # 28 (ensayo de SPA de Brian).
Todos los medios de cultivo celulares, glutamina,
y suero bovino fetal, fueron adquiridos de Gibco Life Technologies
(Grand Island, NY) a menos que se especifique lo contrario. Todas
las células crecieron en una atmósfera húmeda de
90-95% de aire y 5-10% CO_{2} a
37ºC. Todas las líneas celulares fueron subcultivadas rutinariamente
dos veces a la semana y resultaron negativas para micoplasma, según
se determinó por el método Mycotect (Gibco).
Para los ensayos ELISA, las células (U1242,
obtenidas de Joseph Schlessinger, NYU) crecieron hasta una
confluencia de 80-90% en medio de crecimiento (MEM
con FBS al 10%, NEAA, NaPyr 1 mM y GLN 2 mM) y se sembraron en
placas de cultivo tisular de 96 pocillos con suero al 0,5% y
25.000-30.000 células por pocillo. Tras una
incubación durante la noche en medio con suero al 0,5%, se puso las
células en medio libre de suero y se trataron con el compuesto del
test durante 2 horas en un incubador con CO_{2} al 5% y a 37ºC.
Las células fueron luego estimuladas con ligandos durante
5-10 minutos seguido de una lisis con HNT G (Hepes
20 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10%, EDTA 5 mM, Na_{3}VO_{4} 5
mM, Triton X-100 al 0,2%, y NaPyr 2 mM). Los lisados
celulares (0,5 Mg/pocillo en PBS) se transfirieron a placas ELISA
previamente recubiertas con anticuerpos de receptores específicos, y
que habían sido bloqueadas con leche al 5% en TBST
(Tris-HCl 50 mM pH 7,2, NaCl 150 mM y Triton
X-100 al 0,1%) a temperatura ambiente durante 30
minutos. Los lisados se incubaron con agitador durante una hora a
temperatura ambiente. Las placas se lavaron con TBST cuatro veces y
luego se incubaron con anticuerpo anti-fosfotirosina
policlonal a temperatura ambiente durante 30 minutos. El exceso de
anticuerpos anti-fosfotirosina se eliminó aclarando
la placa con TBST cuatro veces. Se añadió anticuerpo IgG
anti-conejo de cabra a la placa ELISA durante 30
minutos a temperatura ambiente, seguido de un aclarado con TBST
cuatro veces más. Se añadió a las placas ELISA ABTS (ácido cítrico
100 mM, Na_{2}HPO_{4} 250 mM y ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-sulfónico
a 0,5 mg/ml)), junto con H_{2}O_{2} (1,2ml de H_{2}O_{2} a
30% a 10 ml de ABTS) para iniciar el desarrollo del color. Se grabó
la absorbancia a 410 nm con una longitud de onda de referencia de
630 nm durante de 15 a 30 minutos tras la adición de ABTS.
El siguiente protocolo puede usarse para medir
los niveles de fosfotirosina en los receptores
IGF-I, lo que indica la actividad tirosin quinasa de
los receptores IGF-I.
Se utilizó los siguientes materiales y
reactivos:
a. la línea celular utilizada en este ensayo es
3T3/IGF-1R, una línea celular diseñada genéticamente
para sobreexpresar receptores de IGF-1.
b. se hace crecer NIH3T3/IGF-1R
en una incubadora con CO_{2} 5% a 37ºC. El medio de crecimiento es
DMEM + FBS 10% (inactivado por calor) + L-glutamina
2 mM.
c. anticuerpo 17-69
anti-IGF-1R de afinidad
purificada.
d. D-PBS:
| KH_{2}PO_{4} | 0,20 g/l |
| K_{2}HPO_{4} | 2,16 g/l |
| KCl | 0,20 g/l |
| NaCl | 8,00 g/l (pH 7,2) |
e. tampón de bloqueo: TBST con Leche 5% (Leche en
polvo desnatada instantánea de la marca Carnation).
f. tampón TBST:
| Tris-HCl | 50 mM |
| NaCl | 150 mM (pH 7,2/HCl 1N) |
| Triton X-100 | 0,1% |
Se prepara una solución stock de TBS (10X), y se
añade Triton X-100 al tampón durante la
dilución.
g. tampón HNTG:
| HEPES | 2 mM |
| NaCl | 150 mM (pH 7,2/HCl 1N) |
| Glicerol | 10% |
| Triton X-100 | 0,2% |
Se prepara una solución stock (5X) y se guarda a
4ºC.
h. EDTA/HCl: NaOH 0,5 M pH 7,0 como stock
100X.
i. Na_{3}VO_{4}: 0,5 M como stock 100X y se
guardan alícuotas a -80ºC.
j. Na_{4}P_{2}O_{7}: 0,2 M como stock
100X.
k. factor-1 de crecimiento
similar al de la insulina de Promega (catálogo # G5111).
l. antisuero anti-fosfotirosina
policlonal de conejo.
m. conjugado POD (anticuerpo de detección) de
cabra anti IgG de conejo, Tago (catálogo # 4520, Lote nº 1802);
Tago, Inc., Burlingame, CA.
n. solución ABTS (ácido
2,2'-azino-bis(3-etilbenz-tiazolin-6-sulfónico):
| ácido cítrico | 100 mM |
| Na_{2}HPO_{4} | 250 mM (pH 4,0/1N HCl) |
| ABTS | 0,5 mg/ml |
La solución ABTS debe guardarse en la oscuridad a
4ºC. La solución debe eliminarse cuando se vuelve verde.
o. peróxido de hidrógeno: solución al 30%
guardada en la oscuridad a 4ºC.
Todos los pasos siguientes se llevan a cabo a
temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Todas los
lavados de las placas ELISA se realizan enjuagando la placa con agua
del grifo tres veces, seguido de un aclarado con enjuague TBST.
Golpear suavemente las placas para secarlas con servilletas de
papel
1. se añade a las células, que han crecido en una
placa de cultivo tisular (Corning 25020-100), con
una confluencia de 80-90%,
Tripsina-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100,
Gibco).
2. se resuspende las células en DMEM fresco + FBS
10% + L-Glutamina 2 mM, y se transfiere a una placa
de cultivo tisular de 96 pocillos (Corning,
25806-96) a 20.000 células/pocillo (100
\mul/pocillo). Se incuba durante un día y luego se reemplaza el
medio por un medio libre de suero (90 \mul) y se incuba en
CO_{2} 5% a 37ºC toda la noche.
1. cubrir la placa ELISA (Corning
25805-96) con anticuerpo
anti-IGF-1R a 0,5 \mug/pocillo en
100 \mul de PBS durante por lo menos 2 horas.
2. eliminar la solución de cubierta y
reemplazarla con 100 \mul de tampón de bloqueo. Agitar durante 30
minutos. Eliminar el tampón de bloqueo y lavar la placa justo antes
de añadir el lisado.
1. se prueban los fármacos en condiciones libres
de suero.
2. se diluye el fármaco stock (en DMSO 100%) 1:10
con DMEM en una placa de polipropileno de 96 pocillos, y se
transfiere 10 \mul/pocillo de esta solución a las células para
conseguir una dilución final de fármaco de 1:100, y una
concentración final de DMSO de 1,0%. Se incuban las células en
CO_{2} al 5% a 37ºC durante 2 horas.
3. se prepara un tampón de lisis celular fresco
(HNTG*)
| HNT G | 2 ml |
| EDTA | 0,1 ml |
| Na_{3}VO_{4} | 0,1 ml |
| Na_{4}(P_{2}O_{7}) | 0,1 ml |
| H_{2}O | 7,3 ml |
4. tras la incubación de la fármaco durante dos
horas, se transfiere 10 \mul/pocillo de ligando
IGF-1 200 nM en PBS a las células (concentración
final = 20 nM), y se incuba a 5% de CO_{2} a 37ºC durante 10
minutos.
5. eliminar el medio, añadir 100 \mul/pocillo
de HNTG* y agitar durante 10 minutos. Observar las células en el
microscopio para ver si se han lisado adecuadamente.
6. utilizar una pipeta de 12 canales para raspar
las células de la placa y homogeneizar el lisado por aspiraciones y
liberaciones repetidas. Transferir todo el lisado a la placa ELISA
recubierta de anticuerpo y agitar durante 1 hora.
7. eliminar el lisado, lavar la placa, transferir
100 \mul/pocillo de anti-pTyr (1:3.000 con TBST),
y agitar durante 30 Minutos.
8. eliminar el anti-pTyr, lavar
la placa, transferir 100 \mul/pocillo de TAGO (1:3.000 con TBST),
y agitar durante 30 minutos.
\newpage
9. eliminar el anticuerpo de detección, lavar la
placa, y transferir 100 \mul/pocillo de ABTS/H_{2}O_{2} fresco
(1,2 \mul H_{2}O_{2} a 10 ml de ABTS) a la placa para iniciar
el desarrollo del color.
10. medir la DO a 410 nm con una longitud de onda
de referencia de 630 nm en el Dynatec MR5000.
Se mide la actividad quinasa del receptor EGF en
células genéticamente diseñadas para expresar EGF-R
humano de la siguiente manera:
Se utilizó los siguientes materiales y
reactivos:
a. ligando EGF: concentración stock = 16,5
\mul, EGF 201, TOYOBO, Co., LTD. Japón.
b. 05-101 (UBI) (un anticuerpo
monoclonal que reconoce un dominio extracelular de EGFR).
c. anticuerpo anti-fosfotirosina
(anti-Ptyr)(policlonal).
d. anticuerpo de detección: cabra anti IgG de
conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante, TAGO, Inc.,
Burlingame, CA.
e. tampón TBST:
| Tris-HCl, pH 7 | 50 mM |
| NaCl | 150 mM |
| Triton X-100 | 0,1 |
f. HNT G 5X stock:
| HEPES | 0,1 M |
| NaCl | 0,75 M |
| Glicerol | 50 |
| Triton X-100 | 1,0% |
g. ABTS stock:
| Ácido cítrico | 100 mM |
| Na_{2}HPO_{4} | 250 mM |
| HCl, conc. | 4,0 pH |
| ABTS | 0,5 mg/ml |
Guardar la solución en la oscuridad a 4ºC hasta
que se use.
h. reactivos stock de:
EDTA 100 mM pH 7,0
Na_{3}VO_{4} 0,5 M
Na_{4}(P_{2}O_{7}) 0,2 M
Se utilizó el siguiente protocolo:
1. cubrir las placas ELISA (Corning de 96
pocillos, catálogo # 25805-96) con anticuerpos
05-101 a 0,5 \mug/pocillo en PBS, siendo 150
\mul el volumen final/pocillo. Guardar toda la noche a 4ºC. Las
placas cubiertas se pueden usar hasta 10 días cuando se guardan a
4ºC.
2. en el día de uso, eliminar el tampón de
cubierta y reemplazar con tampón de bloqueo (5% de leche en polvo
desnatada instantánea de la marca Carnation en PBS). Incubar la
placa, con agitación, a temperatura ambiente (entre 23 y 25ºC)
durante 30 minutos. Justo antes de usar, eliminar el tampón de
bloqueo y lavar la placa 4 veces con tampón TBST.
1. se puede usar la línea celular NIH 3T3/C7
(Honegger, et al., Cell 51:199-209,
1987) para este ensayo.
2. escoger las placas con un
80-90% de confluencia para el experimento.
Tripsinizar las células y parar la reacción añadiendo medio CS DMEM
al 10%. Suspender las células en medio DMEM (medio CS DMEM al 10%) y
centrifugar una vez a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5
minutos.
3. resuspender las células en medio de sembrado
(DMEM, suero bovino 0,5%) y contar las células usando azul de
tripano. Se considera aceptable una viabilidad por encima del 90%.
Se siembra las células en medio DMEM (suero bovino al 0,5%) a una
densidad de 10.000 células por pocillo, 100 \mul por pocillo, en
una placa microtituladas de 96 pocillos. Incubar las células
sembradas en CO_{2} al 5% a 37ºC durante 40 horas.
1. estudiar la posible contaminación en las
células sembradas utilizando un microscopio invertido. Diluir la
fármaco stock (10 mg/ml en DMSO) 1:10 en medio DMEM, luego
transferir 5 \mul a un pocillo de test hasta una dilución final de
fármaco de 1:2000 y una concentración final de DMSO de 1%. Se
administra en los pocillos de control DMSO solo. Se incuba en
CO_{2} 5% a 37ºC durante una hora.
2. preparar ligando EGF: diluir EGF stock en DMEM
para después transferir 10 \mul de EGF diluido (dilución 1:12). Se
obtiene una concentración final 25 nM.
3. preparar 10 ml de HNTG* fresco suficiente para
100 \mul por pocillo. El HNTG* está compuesto por: HNT G stock
(2,0 ml), H_{2}O Milli-Q (7,3 ml), EDTA 100 mM, pH
7,0 (0,5 ml), Na_{3}VO_{4} 0,5 M (0,1 ml) y
Na_{4}(P_{2}O_{7}), 0,2 M(0,1 ml).
4. poner en hielo.
5. tras dos horas de incubación con el fármaco,
añadir ligando EGF preparado a las células, 10 \mul por pocillo,
para alcanzar una concentración final de 25 mM. A los pocillos de
control sólo se les añade DMEM. Incubar, con agitación, a
temperatura ambiente, durante 5 minutos.
6. eliminar el fármaco, EGF y DMEM. Lavar las
células dos veces con PBS, transferir HNTG* a las células, 100
\mul por pocillo. Poner en hielo durante 5 minutos. Mientras
tanto, eliminar el tampón de bloqueo de otra placa ELISA y lavar con
TBST como se ha descrito anteriormente.
7. con una punta de pipeta bien fijada a la
micropipeta, raspar las células de la placa y homogeneizar el
material celular mediante aspiraciones y liberaciones repetidas y
añadiendo tampón de lisado HNTG*. Transferir el lisado a una placa
ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Incubar, con agitación, a
temperatura ambiente durante una hora.
8. eliminar el lisado y lavar 4 veces con TBST.
Transferir el anticuerpo anti Ptyr recién diluido a la placa ELISA
(100 \mul por pocillo). Incubar con agitación a temperatura
ambiente durante 30 minutos en presencia del antisuero
anti-Ptyr (dilución en TBST 1:3000).
9. eliminar el anticuerpo
anti-Ptyr y lavar 4 veces con TBST. Transferir el
anticuerpo IgG anti-conejo TAGO 30 recién diluido a
la placa ELISA (100 \mul por pocillo). Incubar, con agitación, a
temperatura ambiente durante 30 minutos (anticuerpo anti IgG de
conejo: dilución en TBST 1:3000).
10. eliminar el anticuerpo de detección y lavar 4
veces con TBST. Transferir la solución de ABTS/H_{2}O_{2} recién
preparada a la placa ELISA (100 \mul por pocillo). Incubar a
temperatura ambiente durante 20 minutos. Solución ABTS/H2O2: 1,2
\mul 30% H_{2}O_{2} en 10 ml de ABTS stock.
11. parar la reacción añadiendo 50 \mul 5N de
H_{2}SO_{4} (opcional) y determinar la DO a 410 nm.
12. la señal de fosfotirosina máxima se determina
restando el valor de los controles negativos a los controles
positivos. Se calcula la inhibición porcentual del contenido de
fosfotirosina en los pocillos que contienen extracto, tras la
sustracción de los controles negativos.
Este ensayo determina la actividad Met tirosin
quinasa analizando los niveles de Met protein tirosin quinasa en el
receptor Met.
Se usó los siguientes materiales y reactivos:
a. HNT G (solución stock 5X): Disolver 23,83 g de
HEPES y 43,83 g de NaCl en aproximadamente 350 ml de dH_{2}O.
Ajustar el pH a 7,2 con HCl o NaOH, añadir 500 ml de glicerol y 10
ml de Triton X-100, mezclar, y añadir dH_{2}O
hasta un volumen total de 1 litro. Para fabricar 1 litro de solución
efectiva 1X, añadir 200 ml de solución stock 5X a una solución de
800 ml de dH_{2}O. Comprobar y ajustar el pH para conseguir el
necesario. Guardar a 4ºC.
b. PBS (Solución salina tamponada con fosfato
Dulbecco), catálogo de Gibco # 450-1300EB (solución
1X).
c. tampón de bloqueo: poner 100 g de BSA y 12,1 g
de Tris pH 7,5, 58,44 g de NaCl y 10 ml de Tween-20
en 500 ml de dH_{2}O. Diluir hasta un volumen total de 1
litro.
d. tampón quinasa: añadir 12,1 g TRIS pH 7,2,
58,4 g de NaCl, 40,7 g de MgCl_{2} y 1,9 g de EGTA a 500 ml de
dH_{2}O.
e. PMSF (fenilmetilsulfonil fluoruro), catálogo
de Sigma # P-7626, a 435,5 Mg. Añadir etanol 100% a
25 ml de volumen total. Pasar por el vórtex.
f. ATP (fuente bacteriana), catálogo de Sigma #
A-7699. Guardar los polvos a -20ºC. Para fabricar
la solución, disolver 3,31 mg en 1 ml de dH_{2}O.
g. anti-fosfotirosina conjugada
RC-20H HRPO, catálogo de Transduction Laboratories
# E120H.
h. Pierce 1-Step® Turbo
TMB-ELISA
(3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, catálogo de Pierce
# 34022).
i. añadir 1 ml de H_{2}SO_{4} concentrado
(18N) a 35 ml de dH_{2}O.
j. TRIS HCl, catálogo de Fischer #
BP152-5; para 121,14 g de material, añadir 600 ml
de H_{2}O MilliQ, ajustar el pH a 7,5 (ó 7,2) con HCl. Llevar el
volumen a un litro con H_{2}O MilliQ.
k. NaCl, catálogo de Fischer #
S271-10. Fabricar una solución 5 M.
l. Tween-20, catálogo de Fischer
# S337-500.
m. Na_{3}VO_{4}, catálogo de Fischer #
S454-50, a 1,8 g de material, añadir 80 ml de
H_{2}O MilliQ, ajustar el pH a 10,0 con HCl o NaOH, hervir en el
microondas, enfriar, comprobar el pH, repetir el procedimiento hasta
que el pH se estabilice a 10,0. Añadir H_{2}O MilliQ para un
volumen total de 100 ml. Hacer alícuotas de 1 ml y guardar a
-80ºC.
-80ºC.
n. MgCl_{2}, catálogo de Fischer #
M33-550. Fabricar una solución 1 M.
o. HEPES, catálogo de Fischer
#BP310-500. Añadir 59,6 g de material a 200 ml de
H_{2}O MilliQ, ajustar el pH a 7,5, y llevar hasta un volumen
final de 250 ml. Esterilizar el filtro.
p. albúmina bovina (BSA), catálogo de Sigma #
A-4503. Añadir agua destilada estéril a 30 g de
material para hacer un volumen total de 300 ml. Guardar a 4ºC.
q. tampón TBST: añadir 6,057 g de TRIS y 8,766 g
de NaCl a aproximadamente 900 ml de dH_{2}O en un cilindro de un
litro graduado. Cuando esté disuelto, ajustar el pH a 7,2 con HCl,
añadir 1,0 ml de Triton X-100, y llevar el volumen
total a 1 litro con dH_{2}O.
r. anticuerpo IgG de conejo de afinidad
purificada de cabra (molécula entera), catálogo de Cappel #
55641.
s. anticuerpo IgG policlonal de conejo anti
h-Met (C-28), catálogo de Santa Cruz
Chemical # SC-161.
t. células quiméricas EGFR/Met transfectadas
transitoriamente (EMR) (Komada et al., Oncogene,
8:2381-2390 (1993).
u. tampón de carbonato de sodio
(Na_{2}CO_{4}, catálogo de Fischer # S495): añadir 200 ml de
H_{2}O MilliQ a 10,6 g de material. Cuando esté disuelto, ajustar
el pH a 9,6 con NaOH. Llevar hasta un volumen total de 1 litro con
H_{2}O MilliQ, filtrar y guardar a 4ºC.
Los siguientes pasos se realizan a temperatura
ambiente, a menos que se especifique lo contrario. Todas las veces
que se lavan las placas ELISA se hace enjuagando con TBST 4X.
Este procedimiento puede realizarse la noche
antes o justo antes de iniciar la captura del receptor.
1. descongelar los lisados rápidamente en un baño
de agua a 37ºC con movimiento en espiral hasta que desaparezcan los
últimos cristales.
2. lisar el pellet celular con HNT G 1X que
contenga PMSF 1 mM. Usar 3 ml de HNT G para 15 cm de placas con
células. Añadir ½ del volumen calculado de HNTG. Poner el tubo en el
vórtex durante un minuto y añadir el resto de HNTG. Poner en el
vórtex otro minuto.
3. equilibrar los tubos, centrifugar a 10.000x g
durante 10 minutos a 4ºC.
4. juntar los sobrenadantes, extraer una alícuota
para la determinación proteica.
5. congelar rápidamente la muestra unida en un
baño de hielo seco/etanol. Este paso se lleva a cabo
independientemente de si el lisado se guarda durante la noche o si
se usa justo después de la determinación proteica.
6. llevar a cabo la determinación proteica
utilizando el método del ácido bicinconínico estándar (BCA). Juego
de reactivos de ensayo BCA del catálogo de Pierce Chemical #
23225.
1. cubrir las placas ELISA de 96 pocillos Corning
con 5 \mug por pocillo de anticuerpo de cabra
anti-conejo en tampón carbonado para conseguir un
volumen total en cada pocillo de 50 \mu. Guardar durante la noche
a 4ºC.
2. eliminar el anticuerpo
anti-conejo de cabra no ligado mediante la inversión
de las placas para eliminar el líquido.
3. añadir 150 \mul de tampón de bloqueo a cada
pocillo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con
agitación.
4. lavar cuatro veces con TBST. Golpear
suavemente la placa sobre una servilleta de papel para eliminar las
burbujas y el exceso de líquido.
5. añadir 1 \mul por pocillo de anticuerpo de
conejo anti-Met en TBST para alcanzar un volumen
total por pocillo de 100 \mul.
6. diluir el lisado en HNT G (90 \mug
lisado/100 \mul)
7. añadir 100 \mul de lisado diluido a cada
pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 60 minutos.
8. lavar cuatro veces con TBST. Golpear
suavemente sobre una servilleta de papel para eliminar las burbujas
y el exceso de líquido.
9. añadir 50 \mul de tampón de lisado 1X por
pocillo.
10. diluir los compuestos/extractos 1:10 en
tampón quinasa 1X en una placa de 96 pocillos de polipropileno.
11. transferir 5,5 \mul de fármaco diluida a
los pocillos de la placa ELISA. Incubar a temperatura ambiente, con
agitación, durante 20 minutos.
12. añadir 5,5 \mul/pocillo de solución ATP 60
\muM. A los controles negativos no se les añade ATP. Incubar a
temperatura ambiente durante 90 minutos, con agitación.
13. lavar cuatro veces con TBST. Golpear
suavemente la placa sobre una servilleta de papel para eliminar las
burbujas y el exceso de líquido.
14. añadir 100 \mul por pocillo de RC20
(dilución 1:3000 en tampón de bloqueo). Incubar durante 30 minutos a
temperatura ambiente con agitación.
15. lavar cuatro veces con TBST. Golpear
suavemente la placa sobre una servilleta de papel para eliminar las
burbujas y el exceso de líquido.
16. añadir 100 \mul por pocillo de
Turbo-TMB. Incubar con agitación durante
30-60 minutos.
17. añadir 100 \mul por pocillo de
H_{2}SO_{4} 1 M para parar la reacción.
18. leer el ensayo en un lector de ELISA Dynatech
MR7000. Filtro del test = 450 nm; filtro de referencia =
\hbox{410 nm.}
Este ensayo se usa para determinar la actividad
protein quinasa midiendo la fosforilación de un péptido
biotinilado.
Se utilizó los siguientes materiales y
reactivos:
a. levadura transformada con
b. lisados celulares: se pelletea células de
levadura que expresan src, se lava una vez con agua, se
re-pelletea, y se guarda a -80ºC hasta su uso.
c. el EEEYEEYEEEYEEEYEEEY biotinilado del extremo
N terminal se prepara para procedimientos estándar conocidos por
los expertos en la materia.
d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.
e. placa ELISA de 96 pocillos: placa Corning de
96 pocillos de fácil lavado, con el fondo plano modificado, catálogo
de Corning # 25805-96.
f. placas de polipropileno NUNC de 96 pocillos
con fondo en forma de V para la dilución de compuestos: catálogo de
Applied Scientific # A-72092.
g. Reactivo Vecastain ELITE ABC: Vector,
Burlingame, CA.
h. mab anti-src (327): se usó
Schizosaccharomyces Pombe para expresar el Src recombinante
(Superti-Furga et al., EMBO J.,
12:2625-2634; Superti-Furga
et al., Nature Biochem.,
14:600-605). La cepa de S. Pombe
SP200 (h-s leal.32 ura4 ade210)se cultivó
como se ha descrito y con el método del acetato de litio
(Superti-Furga, supra), se llevó a cabo las
transformaciones con plásmidos de expresión de pRSP. Las células
crecieron en presencia de tiamina 1 \muM para reprimir la
expresión del promotor nmtl o en ausencia de tiamina para inducir a
la expresión.
i. anti-fosfotirosina monoclonal,
UBI 05-321 (puede sustituirse por UB40).
j. sustrato peroxidasa Turbo
TMB-ELISA: Pierce Chemical.
a. PBS (Solución salina tamponada con fosfato
Dulbecco): Gibco PBS, catálogo de Gibco #
450-1300EB.
b. tampón de bloqueo: 5% leche desnatada
(Carnation) en PBS.
c. tampón carbonado: Na_{2}CO_{4} de Fischer,
catálogo # S495. Fabricar una solución stock 100 mM.
d. tampón quinasa: 1,0 ml (de una solución stock
1M) de MgCl_{2}; 0,2 ml (de una solución stock 1M) de MnCl_{2};
0,2 ml (de una solución stock 1 M) de DTT; 5,0 ml (de una solución
stock 1 M) de HEPES; 0,1 ml de TX-100. Se lleva a un
volumen total de 10 ml con H_{2}O MilliQ.
e. tampón de lisado: 5,0 ml de HEPES (de una
solución stock 1 M); 2,74 ml de NaCl (de una solución stock 5 M); 10
ml de glicerol; 1,0 ml de TX-100; 0,4ml de EDTA (de
una solución stock 100 mM); 1,0 ml de PMSF (de una solución stock
100 mM); 0,1 ml de Na_{3}VO_{4} (de una solución stock 0,1 M).
Llevar a un volumen total de 100 ml con H_{2}O MilliQ.
f. ATP (catálogo de Sigma #
A-7699). Fabricar una solución stock 10 mM (5,51
mg/ ml).
g. TRIS-HCl: catálogo de Fischer
# BP152-5. Añadir 121,14 g de material a 600 ml de
H_{2}O MilliQ, ajustar el pH a 7,5 con HCl, y llevar a un volumen
total de 1 litro con H_{2}O MilliQ.
h. NaCl (catálogo de Fischer #
S271-10). Fabricar una solución stock 5 M con
H_{2}O MilliQ.
i. Na_{3}VO_{4} (catálogo de Fischer #
S454-50). Añadir 1,8 g de material a 80 ml de
H_{2}O MilliQ. Ajustar el pH a 10,0 con HCl o NaOH. Hervir en el
microondas, enfriar, comprobar el pH y repetir el ajuste de pH hasta
que permanezca estable tras el ciclo de calentar/enfriar. Llevar a
un volumen total de 100 ml con H_{2}O MilliQ. Hacer alícuotas de 1
ml y guardar a -80ºC.
j. MgCl_{2} (catálogo de Fischer #
M33-500). Fabricar una solución stock 1 M con
H_{2}O MilliQ.
k. HEPES (catálogo de Fischer # BP
310-500). Añadir 59,6 g de material a 200 ml de
H_{2}O MilliQ, ajustar el pH a 7,5 y llevar a un volumen total de
250 ml con H_{2}O MilliQ filtrada estéril con dH_{2}O (solución
stock 1 M).
l. tampón TBST: añadir 6,057 g de Tris y 8,766 g
de NaCl a 900 ml de dH_{2}O. Ajustar el pH a 7,2 con HCl, añadir
1,0 ml de Triton-X100. Llevar a un volumen total de
1 litro con dH_{2}O.
m. MnCl_{2} (catálogo de Fischer #
M87-100). Fabricar una solución stock 1 M con
H_{2}O MilliQ.
n. DTT (catálogo de Fischer # BP
172-5).
o. TBS (solución salina tamponada TRIS). Añadir
6,057 g de TRIS y 8,777 g de NaCl a 900 ml de H_{2}O MilliQ.
Llevar a un volumen total de 1 litro con H_{2}O MilliQ.
p. Mezcla de reacción quinasa. Cantidad por placa
de ensayo (100 pocillos): 1,0 ml de tampón quinasa, 200 \mug de
GST-\zeta. Llevar a un volumen final de 8,0 ml con
H_{2}O MilliQ.
q. EEEYEEYEEEYEEEYEEEY marcado con biotina.
Fabricar solución stock de péptidos (2,98 mg/ ml, 1 mM) en agua
justo antes de usar.
r. Reactivo Vectastain ELITE ABC. Para
preparar 10 ml del reactivo activo, añadir una gota de reactivo A a
15 ml de TBST e invertir el tubo varias veces para mezclarlo. Luego
añadir una gota de reactivo B. Poner el tubo en un agitador orbital
a temperatura ambiente y mezclar durante 30 minutos.
1. Cubrir la placa de ELISA con 0,5
\mug/pocillo con mab anti src en 100 \mul de tampón de
carbonato de sodio a pH 9,6. incubar toda la noche a 4ºC.
2. lavar los pocillos una vez con PBS.
3. bloquear la placa con 0,15 ml de leche 5% en
PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. lavar la placa cinco veces con PBS.
5. añadir 10 \mug/pocillo de lisados de
levadura con el src transformado diluida en tampón de lisado (0,1 ml
de volumen total por pocillo). La cantidad de lisado puede variar
entre los lotes. Agitar la placa durante 20 minutos a temperatura
ambiente.
1. placa 4G10: cubrir 0,5 \mug/pocillo 4G10 en
100 \mul de PBS durante la noche a 4ºC y bloquear con 150 \mul
de leche al 5% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente.
1. eliminar las proteínas no ligadas en los pasos
1-7 anteriores, y lavar las placas cinco veces con
PBS.
2. añadir 0,08 ml de mezcla de reacción quinasa
por pocillo (compuesta por 10 \mul de tampón quinasa 10X y
biotina-EEEYEEYEEEYEEEYEEEY 10 \muM por pocillo
diluida en agua).
3. añadir 10 \mul de compuesto diluido en agua
compuesto por DMSO 10%, y preincubar durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
4. iniciar la reacción quinasa añadiendo 10
\mul/pocillo de ATP 0,05 mM en agua (ATP final 5 \muM).
5. agitar la placa ELISA durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
6. parar la reacción quinasa añadiendo 10 \mul
de EDTA 0,5 M por pocillo.
7. transferir 90 \mul de sobrenadante a una
placa ELISA recubierta con 4G10 bloqueado en la sección B,
arriba.
8. incubar durante 30 minutos, mientras se agita,
a temperatura ambiente.
9. lavar la placa cinco veces con TBST.
10. incubar con reactor Vectastain ELITE ABC (100
\mul/pocillo) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
11. lavar las placas cinco veces con TBST.
12. desarrollar con Turbo TMB.
Este ensayo se usa para determinar la actividad
de la protein quinasa lck midiendo la fosforilación de
GST-\zeta.
Se usó los siguientes materiales y reactivos:
a. levadura con lck transformado. Se usó
Schizosaccharomyces Pombe para expresar Lck recombinante
(Superti-Furga, et al., EMBO J.,
12:2625-2634; Superti-Furga,
et al., Nature Biotech.,
14:600-605). Se cultivó la cepa SP200 de
S. Pombe (h-s leal.32 ura4 ade210) como se ha
descrito y las transformaciones se realizaron con plásmidos de
expresión de pRSP mediante el método de acetato de litio
(Superti-Furga, supra). Las células crecieron
en presencia de tiamina 1 \muM para inducir a la expresión.
b. lisados celulares: pelletear las células de
levadura que expresan lck. Lavar una vez con agua,
re-pelletear y guardar congelado a -80ºC hasta su
uso.
c. GST-\zeta: el DNA que
codifica para la proteína de fusión GST-\zeta para
la expresión en bacterias obtenidas gracias a Arthur Weiss del
instituto médico Howard Hughes en la universidad de California, San
Francisco. Las bacterias transformadas crecieron durante la noche,
con agitación, a 25ºC. Se purificó el GST-\zeta
por cromatografía de afinidad a la glutationa, Pharmacia, Alameda,
CA.
d. DMSO. Sigma, St Louis, MO.
e. placas ELISA de 96 pocillos: placas Corning de
96 pocillos, fáciles de lavar, con el fondo plano modificado
(catálogo de Corning # 25805-96).
f. placas de polipropileno NUNC de 96 pocillos
con fondo en forma de V para la dilución de compuestos (catálogo de
Applied Scientific # AS-72092).
g. antisuero anti-GST de conejo
purificado (catálogo de Amrad Corporation (Australia) #
90001605).
h. IgG-HRP
anti-conejo de cabra (catálogo de Amersham #
V010301).
i. IgG (H+L) anti-ratón de oveja
(catálogo de Amersham #
5215-005-003).
j. Mab anti-Lck (3A5) (catálogo
de Santa Cruz Biotechnology # sc-433).
k. UBI 05-321
anti-fosfotirosina monoclonal (puede sustituirse por
UB40).
a. solución PBS 1X (solución salina tamponada con
fosfato Dulbecco): Gibco PBS, catálogo de Gibco #
450-1300EB.
b. tampón de bloqueo: 100 g de BSA, 12,1 g de
TRIS-pH 7,5, 58,44 g de NaCl, 10 ml de
Tween-20. Llevar a un volumen total de 1 litro con
H_{2}O MilliQ.
c. tampón carbonado: Na_{2}CO_{4} de Fischer
(catálogo de Fischer # S495). Fabricar una solución 100 mM con
H_{2}O MilliQ.
d. tampón quinasa: 1,0 ml de MgCl_{2} (de una
solución stock 1 M); 0,2 ml de MnCl_{2} (de una solución stock 1
M); 0,2 ml de DTT (de una solución 1M); 0,5 ml de HEPES (de una
solución stock 1 M); 0,1 ml de TX-100. Llevar a un
volumen total de 10 ml con H_{2}O MilliQ.
e. tampón de lisado: 5,0 ml de HEPES (de una
solución stock 1 M); 2,74 ml de NaCl (de una solución stock 5 M); 10
ml de glicerol, 1,0 ml de TX-100; 0,4 ml de EDTA (de
una solución stock 100 mM); 1,0 ml de PMSF (de una solución stock
100 mM); 0,1 ml de Na_{3}VO_{4} (de una solución stock 0,1 M).
Llevar a un volumen total de 100 ml con H_{2}O MilliQ.
f. ATP (catálogo de Sigma #
A-7699). Fabricar una solución stock 10 mM (5,51
mg/ml).
g. TRIS-HCl (catálogo de Fischer
# BP 152-5). Añadir 121,14 g de material a 600 ml de
H_{2}O MilliQ y ajustar el pH a 7,5 con HCl. Llevar a un volumen
total de 1 litro con H_{2}O MilliQ.
h. NaCl (catálogo de Fischer #
S271-10). Fabricar una solución stock 5 M con
H_{2}O MilliQ.
i. Na_{3}VO_{4} (catálogo de Fischer #
S454-50). Añadir 1,8 g de material a 80 ml de
H_{2}O MilliQ y ajustar el pH a 10,0 con HCl o NaOH. Hervir en el
microondas, enfriar, comprobar el pH, repetir el ajuste de pH hasta
que permanezca estable tras el ciclo de calentar/enfriar. Llevar a
un volumen total de 100 ml con H_{2}O MilliQ; hacer alícuotas de 1
ml y guardar a -80ºC.
j. MgCl_{2} (catálogo de Fischer #
M33-500). Fabricar una solución stock con H_{2}O
MilliQ.
k. HEPES (catálogo de Fischer # BP
310-500). Añadir 59,6 g de material a 200 ml de
H_{2}O MilliQ, ajustar el pH a 7,5 y llevar a un volumen total de
250 ml con H_{2}O MilliQ. Filtrar para esterilizar (solución stock
1M).
l. albúmina bobina (BSA) (catálogo de Sigma # A
4503). Añadir 30 g de material a 150 ml de H_{2}O MilliQ. Llevar a
un volumen total de 300 ml con H_{2}O MilliQ. Filtrar a través de
un filtro de 0,22 \mum. Guardar a 4ºC.
m. tampón TBST. Añadir 6,057 g de TRIS y 8,766 g
de NaCl a 900 ml de dH_{2}O. Ajustar el pH a 7,2 con HCl, y añadir
1,0 ml de Triton-X100. Llevar a un volumen total de
1 litro con dH_{2}O.
n. MnCl_{2} (catálogo de Fischer #
M87-100). Fabricar una solución stock 1 M con
H_{2}O MilliQ.
o. DTT (catálogo de Fischer # BP
172-5).
p. TBS (solución salina tamponada de Tris).
Añadir 6,057 g de Tris y 8,777 g de NaCl a 900 ml de H_{2}O
MilliQ. Llevar a un volumen total de 1 litro con H_{2}O
MilliQ.
q. Mezcla de reacción quinasa: cantidad por placa
de ensayo (100 pocillos): 1,0 ml de tampón quinasa, 200 \mug de
GST-\zeta. Llevar a un volumen final de 8,0 ml con
H_{2}O MilliQ.
1. cubrir 2,0 \mug/pocillo de IgG
anti-ratón de oveja en 100 \mul de tampón
carbonado de sodio a pH 9,6 durante la noche a 4ºC.
2. lavar bien una vez con PBS.
3. bloquear la placa con 0,15 ml de tampón de
bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. lavar la placa cinco veces con PBS.
5. añadir 0,5 \mug/pocillo de anti lck (mab
3A5) en 0,1 ml de PBS a temperatura ambiente durante
1-2 horas.
6. lavar la placa cinco veces con PBS.
7. añadir 20 \mug/pocillo de lisados de
levadura transformada con lck diluido en tampón de lisado (0,1 ml de
volumen total por pocillo). (La cantidad de lisado puede variar
según los lotes). Agitar la placa a 4ºC durante la noche para evitar
la pérdida de actividad.
1. placa UB40: 1 \mug/pocillo de UB40 en 100
\mul de PBS durante la noche a 4ºC y bloquear con 150 \mul de
tampón de bloqueo durante una hora como mínimo.
1. eliminar las proteínas no ligadas en los pasos
1-7 de arriba, y lavar las placas cinco veces con
PBS.
2. añadir 0,08 ml de mezcla de reacción quinasa
por pocillo (contiene 10 \mul de tampón quinasa 10X y 2 \mug de
GST-\zeta por pocillo diluido en agua).
3. añadir 10 \mul de compuesto diluido en agua,
compuesto por DMSO 10% y preincubar durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
4. iniciar la reacción quinasa añadiendo 10
\mul/pocillo de ATP 0,1 mM en agua (ATP final 10 \muM).
5. agitar la placa ELISA durante 60 minutos a
temperatura ambiente.
6. parar la reacción quinasa añadiendo 10 \mul
de EDTA 0,5 M por pocillo.
7. transferir 90 \mul de sobrenadante a una
placa ELISA cubierta con 4G10 bloqueado en la sección B,
arriba.
8. incubar mientras se agita durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
9. lavar la placa cinco veces con TBST.
10. incubar con anticuerpo
anti-GST de conejo a una dilución 1:5000 en 100
\mul de TBST durante 30 minutos a temperatura ambiente.
11. lavar los pocillos cinco veces con TBST.
12. incubar con cabra anti IgG de
conejo-HRP en dilución 1:20.000 en 100 \mul de
TBST durante 30 minutos a temperatura ambiente.
13. lavar los pocillos cinco veces con TBST.
14. desarrollar con Turbo TMB.
El siguiente ensayo estudia la cantidad de
fosforilación catalizada por el RAF de su proteína diana MEK, así
como la diana del MEK, el MAPK. La secuencia génica del RAF se
describe en Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol.
5:1400-1407, y está fácilmente accesible en
múltiples bancos de datos de secuencias génicas. La construcción del
vector del ácido nucleico y las líneas celulares utilizadas para
esta porción de la invención se describen en Morrison et al.,
1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:8855-8859.
1. células Sf9 (Spodoptera frugiperda);
Gibco-BRL, Gaitherburg, MD.
2. tampón RIPA: Tris/HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 137
mM, glicerol 10%, PMSF 1 mM, Aprotinina 5 Mg/l, Triton
X-100 0,5%;
3. proteína de fusión
tioredoxin-MEK (T-MEK): se realizó
la expresión T-MEK y una purificación por
cromatografía de afinidad de acuerdo con los procedimientos del
fabricante. (catálogo # K 350-01 y R
350-40, Invitrogen Coral, San Diego, CA).
4. His-MAPK (ERK 2): se expresó
en células azules XL1 transformadas con el vector pUC18 que codifica
para His-MAPFK. Se purificó el
His-MAPK por cromatografía de afinidad al Níquel
(catálogo # 27-4949-01, Pharmacia,
Alameda, CA), tal y como se describe aquí.
5. Oveja anti IgG de ratón (catálogo de Jackson
laboratories, West Grove, PA, #
515-006-008, Lote # 28563).
6. anticuerpo específico para protein quinasa
RAF-1: URP2653 de UBI.
7. tampón de cubrimiento: PBS (solución salina
tamponada con fosfato), Gibco-BRL, Gaitherburg,
MD.
8. tampón de lavado:
TBST-Tris/HCl pH 7,2 50 mM, NaCl 150 mM, Triton
X-100 al 0,1%.
9. tampón de bloqueo: TBST, etanolamina al 0,1%,
pH 7,4.
10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.
11. tampón quinasa (TQ): HEPES/HCl 20 mM a pH
7,2, NaCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,1%, PMSF a 1
mM, 5 Mg/l aprotinina, ortovanadato de sodio 75 mM, DTT a 0,5 mM y
MgCl_{2} al 10 mM.
12. mezcla ATP: MgCl_{2} 100 mM, ATP 300 mM,
^{33}P ATP 10 MCi(Dupont-NEN)/ml.
13. solución de parada: ácido fosfórico al 1%;
Fisher, Pittsburg, PA.
14. esponjas de filtro de fosfocelulosa de
Wallac; Wallac, Turku, Finlandia.
15. solución para lavar el filtro: ácido
fosfórico 1%, Fisher, Pittsburg, PA.
16. recogedor de placa Tomtec (Tomtec plate
harvester), Wallac, Turku, Finlandia.
17. lector de placas beta Wallac # 1205, Wallac,
Turku, Finlandia.
18. placas de polipropileno NUNC de 96 pocillos
con fondo en forma de V para compuestos (catálogo de Applied
Scientific # AS-72092).
Todos los pasos siguientes se llevaron a cabo a
temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.
1. recubrimiento de las placas ELISA: los
pocillos ELISA se cubren con 200 ml de antisuero purificado de
afinidad de oveja anti-ratón (1 mg/100 ml de tampón
de cubrimiento) toda la noche a 4ºC. Las placas ELISA pueden usarse
durante dos semanas cuando se guardan a 4ºC.
2. invertir la placa y eliminar el líquido.
Añadir 100 ml de solución de bloqueo e incubar durante 30
minutos.
3. eliminar la solución de bloqueo y lavar cuatro
veces con tampón de lavado. Golpear suavemente la placa sobre una
servilleta de papel para eliminar el exceso de líquido.
4. añadir 1 mg de anticuerpo específico para
RAF-1 a cada pocillo e incubar durante 1 hora. Lavar
como se describe en el paso 3.
5. descongelar los lisados de células Sf9
infectadas con RAS/RAF y diluir con TBST a 10 mg/100 ml. Añadir 10
mg de lisado diluido a los pocillos e incubar durante 1 hora. Agitar
la placa durante la incubación. Los controles negativos no reciben
lisado. Los lisados de células de insecto Sf9 infectadas con RAS/RAF
se preparan tras ser infectadas con baculovirus recombinantes a un
MOI de 5 para cada virus, y se cultivan durante 48 horas.
Posteriormente, las células se lavan una vez con PBS y se lisan en
tampón RIPA. El material no soluble se elimina por centrifugación (5
minutos a 10.000 x g). Se congela alícuotas de lisados en hielo
seco/etanol y se guarda a -80ºC hasta su uso.
6. eliminar el material no ligado y lavar como se
ha descrito anteriormente (paso 3).
7. añadir 2 mg de T-MEK y 2 mg de
His-MAEPK por pocillo y ajustar el volumen a 40 ml
con tampón quinasa. Los métodos para purificar T-MEK
y MAPK a partir de extractos celulares pueden encontrase aquí en los
ejemplos.
8. pre-diluir los compuestos
(solución stock de 10 mg/ml de DMSO) o los extractos (20 veces en
exceso) en TBST más DMSO 1%. Añadir 5 ml de los compuestos/extractos
pre-diluidos a los pocillos descritos en el paso 6.
incubar durante 20 minutos. Los controles no reciben fármaco.
9. iniciar la reacción quinasa añadiendo 5 ml de
mezcla ATP. Agitar las placas en un agitador de placas ELISA durante
la incubación.
10. parar la reacción quinasa tras 60 minutos
añadiendo 30 ml de solución de parado a cada pocillo.
11. poner la esponja de fosfocelulosa y la placa
ELISA en el recogedor de placa Tomtec. Recoger y lavar el filtro con
la solución de lavado de filtro, de acuerdo con las recomendaciones
del fabricante. Secar las esponjas del filtro. Sellar las esponjas
del filtro y colocarlas en su soporte. Insertar el soporte en un
aparato de detección de radiactividad y cuantificar el fósforo
radiactivo en las esponjas del filtro.
De forma alternativa, se puede transferir
alícuotas de40 ml de pocillos individuales del ensayo en las
posiciones correspondientes en la esponja del filtro de
fosfocelulosa. Tras secar los filtros al aire, hay que poner los
filtros en una bandeja. Hay que balancear suavemente la bandeja,
cambiando la solución de lavado en intervalos de 15 minutos durante
1 hora. Secar al aire las esponjas del filtro. Sellar las esponjas
del filtro y colocarlas en un soporte adecuado para medir el fósforo
radiactivo en las muestras. Insertar el soporte en un aparato de
detección y cuantificar el fósforo radiactivo en las esponjas del
filtro.
Los siguientes ensayos usan células diseñadas
para expresar un receptor de interés y evaluar el efecto de un
compuesto de interés en la actividad de síntesis de DNA inducida por
un ligando determinando la incorporación BrdU en el DNA.
Los siguientes materiales, reactivos, y el
procedimiento son generales para cada uno de los siguientes ensayos
de incorporación BrdU. Se anotan las variaciones en ensayos
específicos.
1. El ligando apropiado.
2. Las células diseñadas apropiadas.
3. Reactivo marcador de BrdU: 10 mM, en PBS (pH
7,4) (Boehringer Mannheim, Germany).
4. FixDenat: solución de fijación (preparado para
usar) (Boehringer Mannheim, Germany).
5. Anta-BrdU-POD:
conjugado de anticuerpo de ratón monoclonal con peroxidasa
(Boehringer Mannheim, Germany).
6. Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina
(TMB, Boehringer Mannheim, Germany).
7. Solución de lavado PBS: IX PBS, pH 7,4.
8. Albúmina Bovina (BSA), polvos de la fracción V
(Sigma Chemical Co., USA).
1. Las células se siembran a 8000 células/pocillo
en 10% CS, 2 mM Gln en DMEM, en una placa de 96 pocillos. Las
células se incuban durante toda la noche a 37ºC en CO_{2} 5%.
2. Tras 24 horas, las células se lavan con PBS, y
entonces se elimina su suero en medio libre de suero (0% CS DMEM con
0,1% BSA) durante 24 horas.
3. El día 3, el ligando apropiado y el compuesto
de prueba se añaden a las células simultáneamente. Los pocillos de
control negativo reciben DMEM libre de suero con 0,1% BSA solamente;
las células de control positivo reciben el ligando pero no el
compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM
libre de suero con el ligando en una placa de 96 pocillos, y se
diluyen en serie para 7 concentraciones de prueba.
4. Después de 18 horas de la activación del
ligando, se añade el reactivo marcador BrdU diluido (1:100 en DMEM,
0,1% BSA) y las células se incuban con BrdU (concentración
final-l0 \muM) durante 1,5 horas.
5. Tras la incubación con el reactivo marcador,
el medio se extrae por decantación y se golpea ligeramente la placa
invertida en una toalla de papel. Se añade solución de FixDenat (50
\mul/pocillo) y las placas se incuban a temperatura ambiente
durante 45 minutos en un agitador de placas.
6. La solución FixDenat se extrae completamente
por decantación y con golpes ligeros de la placa invertida en una
toalla de papel. Se añade leche (leche deshidratada 5% en PBS, 200
\mul/pocillo) como una solución bloqueante y la placa se incuba
durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
7. La solución bloqueante se extrae por
decantación y los pocillos se lavan una vez con PBS. Se añade
solución de Anti-BrdU-POD (dilución
1:200 en PBS, 1% BSA) (50 \mul/pocillo) y la placa se incuba
durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
8. El conjugado de anticuerpos se extrae
completamente por decantación y enjuagando los pocillos 5 veces con
PBS, y la placa se seca invirtiéndola y golpeándola ligeramente en
una toalla de papel.
9. Se añade la solución del sustrato TMB (100
\mul/pocillo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura
ambiente en un agitador de placas hasta que el cambio de color sea
suficiente para la detección fotométrica.
10. La absorbancia de las muestras se mide a 410
nm (en modo de "longitud de onda dual" con un filtro de lectura
a 490 nm, como una longitud de onda referente) en un lector de
placas Dynatech ELISA.
El procedimiento es el mismo que el procedimiento
general, esquematizado anteriormente, excepto por los siguientes
cambios:
1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd.,
Japan).
2. 3T3/EGFRc7.
El procedimiento es el mismo que el procedimiento
general, esquematizado anteriormente, excepto por los cambios
siguientes:
1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd.,
Japan).
2. 3T3IEGFr/Her2/EGFr (EGFr con un dominio
quinasa Her-2).
El procedimiento es el mismo que el procedimiento
general, esquematizado anteriormente, excepto por los cambios
siguientes:
1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd.,
Japan).
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr con un dominio
quinasa Her-4).
El procedimiento es el mismo que el procedimiento
general, esquematizado anteriormente, excepto por los cambios
siguientes:
1. PDGF Humano B/13 (Boehringer Mannheim,
Germany).
2. 3T3/EGFRc7.
El procedimiento es el mismo que el procedimiento
general, esquematizado anteriormente, excepto por los cambios
siguientes:
1. FGF2 humano/bFGF (Gibco BRL, USA).
2. 3T3c7/EGFr
El procedimiento es el mismo que el procedimiento
general, esquematizado anteriormente, excepto por los siguientes
cambios:
1. Humano, recombinante (G511, Promega Corp.,
USA)
2. 3T3/IGF1r.
El procedimiento es el mismo que el procedimiento
general, esquematizado anteriormente, excepto por el uso de los
cambios siguientes:
1. Insulina, cristalino, bovino, Zinc (13007,
Gibco BRL, USA).
El procedimiento es el mismo que el procedimiento
general, esquematizado anteriormente, excepto por el uso de los
cambios siguientes:
1. HGF humano recombinante (Cat. No.
249-H G, R&D Systems, Inc. USA).
2. Células
BxPC-3-células (ATCC
CRL-1687).
1. Las células se siembran a 9000 células/pocillo
en RPMI 10% FBS en una placa de 96 pocillos. Las células se incuban
toda la noche a 37ºC en 5% CO_{2}.
2. Tras 24 horas, las células se lavan con PBS, y
luego se elimina su suero en 100 \mul de medio libre de suero
(RPMJ con 0.1% BSA) durante 24 horas.
3. El día 3, 25 \mul que contienen ligando
(preparado a 1 \mug/ml en RPMI con 0,1% BSA; conc final HGF
= 200 ng/ ml) y los compuestos de prueba se añaden a las células.
Los pocillos de control negativo reciben 25 \mul de RPMI libre de
suero con 0,1% BSA solamente; las células de control positivo
reciben el ligando (HGF) pero no los compuestos de prueba. Los
compuestos de prueba se preparan a 5 veces su concentración final en
RPMI libre de suero con un ligando en una placa de 96 pocillos, y se
diluyen en serie para 7 concentraciones de prueba.
Generalmente, la concentración final más alta del
compuesto de prueba es 100 \muM, y se usan diluciones 1:3
(esdecir, el rango de concentración final del compuesto de prueba
es 0,137-100 \muM).
4. Tras 18 horas de la activación del ligando, se
añaden 12,5 \mul del reactivo marcador de BrdU diluido (1:100 en
RPMI, 0,1% BSA) a cada pocillo y las células se incuban con BrdU
(concentración final = 10 \muM) durante 1 hora.
5. Lo mismo que el Procedimiento General.
6. Lo mismo que el Procedimiento General.
7. La solución bloqueante se extrae por
decantación y las células se lavan una vez con PBS. Se añade
solución Anti-BrdU-POD (dilución
1:100 en PBS, 1% BSA) (100 \mul/pocillo) y la placa se incuba
durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
8. Lo mismo que el Procedimiento General.
9. Lo mismo que el Procedimiento General.
10. Lo mismo que el Procedimiento General.
El siguiente protocolo también se puede usar para
medir la actividad de un compuesto frente a PDGF-R,
FGF-R, VEGF, aFGF o Flk-11KDR, los
cuales son todos naturalmente expresados por células
HUV-EC.
1. Lavar y tripsinizar células
HUV-EC-C (células endoteliales de la
vena umbilical), (American Type Culture Collection; catálogo nº 1730
CRL). Lavar con tampón salino fosfatado de Dulbecco
(D-PBS; obtenido de Gibco BRL; catálogo nº
14190-029) dos veces a aproximadamente 1 ml/10
cm^{2} del frasco del cultivo del tejido. Tripsinizar con 0,05%
tripsina-EDTA en una solución de disociación celular
no-enzimática. (Sigma Chemical Company; catálogo nº
C4544). La tripsina 0,05% se hizo por dilución 0.25% tripsina/1 mM
EDTA (Gibco; catálogo nº 25200-049) en la solución
de disociación celular. Tripsinizar aproximadamente 1
ml/25-30 cm^{2} del frasco del cultivo celular
durante aproximadamente 5 minutos a 37ºC. Después de que las células
se hayan soltado del frasco, añadir un volumen equivalente del medio
de ensayo y transferir a un tubo de centrifugación de 50 ml estéril
(Fisher Scientifc; catálogo nº 05-539.6).
2. Lavar las células con aproximadamente 35 ml de
medio de ensayo en un tubo de centrifugación de 50 ml estéril
añadiendo el medio de ensayo. Centrifugar durante 10 minutos a
aproximadamente 200 g, aspirar el sobrenadante, y resuspender con 35
ml D-PBS. Repetir el lavado dos veces más con
D-PBS, resuspender las células en aproximadamente 1
ml de medio de ensayo/15 cm^{2} del frasco del cultivo del tejido.
El medio de ensayo está formado por medio F12K (Gibco BRL; catálogo
nº 21127-014) + 0,5% de suero bovino fetal
inactivado por calor. Contar las células con un Contador Coulter®,
Coulter Electronics, Inc.) y añadir el medio de ensayo a las células
para obtener una concentración de 0,8-1,0 x 10^{5}
células/ml.
3. Añadir células a las placas de 96 pocillos de
fondo plano a 100 ml/pocillo ó 0,8-1,0 x 10^{4}
células/pocillo; incubar durante aproximadamente 24 horas a 37ºC, 5%
CO_{2}.
1. Componer diluciones seriadas del fármaco en
placas separadas de 96 pocillos, en concentraciones generalmente de
50 mM hasta 0 \muM en una escala de dobles. Usar el mismo medio de
ensayo que se menciona en el día 0, el paso 2 anterior. Las
diluciones se hacen añadiendo 90 \mul/pocillo de fármaco hasta 200
\muM (4X la concentración final del pocillo) hasta la superficie
de la placa de una columna concreta de la placa. Puesto que la
concentración de fármaco en stock normalmente está en DMSO 20 mM,
una concentración de fármaco 200 \muM contiene DMNSO 2%.
Por lo tanto, el diluyente compuesto por DMSO 2%
en elmedio de ensayo (F12K + 0,5% de suero bovino fetal) se usa
como diluyente para las diluciones del fármaco con el fin de
diluirlo pero mantener constante la concentración de DMSO. Añadir
este diluyente a los pocillos restantes en la columna a 60
\mul/pocillo. Coger 60 \mul de los 120 \mul de la dilución de
fármaco 200 \muM en la superficie del pocillo de la columna y
mezclar con los 60 \mul en el segundo pocillo de la columna. Coger
60 \mul de este pocillo y mezclar con los 60 \mul en el tercer
pocillo de la columna, y seguir con el mismo mecanismo hasta
completar la serie de diluciones. Cuando el pocillo siguiente se ha
mezclado, hay que coger 60 \mul de los 120 \mul en este pocillo
y descartarlo. Dejar el último pocillo con 60 \mul de DMSO/medio
diluyente como un control que no contiene fármaco. Hacer 9 columnas
de fármaco diluido, suficiente para triplicar los pocillos por 1)
VEGF (obtenido de Pepro Tech Inc., catálogo nº 100.200); 2) factor
de crecimiento de células endoteliales (ECGF) (también conocido como
factor de crecimiento de fibroblasto acídico, o un FGF) (obtenido de
Boehringer Mannheim Biochemical, catálogo nº 1439 600); y 3) PDGF
B/B humano (1276-956, Boehringer Mannheim, Germany)
y medio de ensayo de control. El ECGF se presenta como una
preparación con heparina sódica.
2. Transferir 50 \mul/pocillo de las diluciones
del fármaco en placas de ensayo de 96 pocillos que contienen las
0,8-1,0x10^{4} células/100 \mul/pocillo de las
células del HUV-EC-C del día 0 e
incubar durante aproximadamente 2 horas a 37ºC, CO_{2} 5%.
3. Por triplicado, añadir 50 \mul/pocillo de 80
\mug/ml VEGF, 10 ng/ml de ECGF, o medio de control para cada
condición del fármaco. Como con los fármacos, las concentraciones
del factor de crecimiento son cuatro veces la concentración final
deseada. Utilizar el medio de ensayo del día 0, paso 2, para
fabricar las concentraciones de los factores de crecimiento. Incubar
durante aproximadamente 24 horas a 37ºC, CO_{2} 5%. Cada pocillo
tendrá 50 \mul de dilución de la fármaco, 50 \mul de factor
medio de crecimiento, y 100 \mul de células, un total de 200
\mul/pocillo total. Así, las concentraciones 4X de fármaco y
factores de crecimiento pasan a ser 1X en cuanto se añade todo a los
pocillos.
1. añadir ^{3}H-timidina
(catálogo de Amersham # TRK-686) a 1 \muCi/pocillo
(10 \mul/pocillo de la solución de 100 \muCi/ml fabricada en
medio RPMI + suero bovino fetal inactivado por calor al 10%) e
incubar durante aproximadamente 24 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%.
Nota: la 3H-timidina se fabrica en medio RPMI
porque todas las demás aplicaciones para las que se usa la
^{3}H-timidina implican experimentos realizados en
RPMI. La diferencia de medios en este paso no es probablemente
significativa. El RPMI se obtuvo de Gibco BRL, catálogo #
11875-051.
1. congelar las placas durante la noche a
-20ºC
1. Descongelar las placas y recoger con un
recogedor de placas de 96 pocillos (Recogedor Tomtec 96®) en
esponjas de filtros (catálogo de Wallac # 1205-401).
Leer los recuentos en un contador de centelleo líquido Wallac
Betaplate®.
La capacidad de los tumores humanos para crecer
como xenoinjertos en ratones atímicos (p.ej., Balb/c, nu/nu)
proporciona un modo útil in vivo para estudiar la respuesta
biológica a terapias para tumores humanos. Desde el primer
xenotransplante de tumores humanos con éxito en ratones atímicos,
(Rygaard y Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand.
77:758-760), diferentes células tumorales humanas
(p.ej., mamarias, de pulmón, genitales, gastrointestinales, de
cerebro y cuello, glioblastoma, de hueso, y melanomas malignos) han
sido trasplantadas y han crecido satisfactoriamente en ratones
desnudos. Los siguientes ensayos se pueden usar para determinar el
nivel de la actividad, especificidad y efecto de los diferentes
compuestos de la presente invención.
Las líneas celulares adecuadas para experimentos
de xenoinjertos subcutáneos incluyen células C6 (glioma, ATCC # CCL
107), células A375 (melanoma, ATCC # CRL 1619), células A431
(carcinoma epidermoide, ATCC # CRL 1555), células Calu 6 (pulmón,
ATCC # HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC # CRL 1435) y
fibroblastos NIH 3T3 genéticamente diseñados para sobreexpresar
EGFR, PDGFR, YGF-1R o cualquier otro test quinasa.
El siguiente protocolo se puede usar para realizar experimentos con
xenoinjertos:
Se obtiene de Simonsen Laboratories (Gilroy, CA)
Hembras de ratones atímicos (BALE/c, nu/nu). Todos los animales se
mantienen bajo condiciones de ambiente limpio en cabinas
Micro-aislantes con recubrimiento
Alpha-dry. Reciben comida estéril de roedor y agua a
voluntad.
Las líneas celulares crecen en medios apropiados
(por ejemplo, MEM, DMEM, Ham's F10, o Ham's F12 plus 5% -10% suero
fetal bovino (FBS) y glutamina 2 mM (GLN)). Todos los medios de
cultivo celular, glutamina, y suero fetal bovino se adquieren de
Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) a menos que se
especifique lo contrario. Todas las células crecen en una atmósfera
húmeda de 90-95% de aire y 5-10% de
CO_{2} a 37ºC. Todas las líneas celulares rutinariamente se
subcultivan dos veces a la semana y son negativas para el micoplasma
como se ha determinado por el método Mycotect.
Las células se cultivan cerca de la confluencia,
o en confluencia plena, con 0,05% Tripsina-EDTA y se
aglomeran a 450 x g durante 10 min. Los pellets se resuspenden en
PBS estéril o medio (sin FBS) a una concentración particular y las
células se implantan en la ijada trasera del ratón
(8-10 ratones por grupo, 2-10 x
10^{6} células animales). El crecimiento del tumor se mide sobre
las 3 hasta las 6 semanas usando calibradores. Los volúmenes del
tumor se calculan como un producto de longitud x anchura x peso a
menos que se indique lo contrario. Los valores P se calculan usando
la prueba T de Student. Los compuestos de prueba en
50-100 \muL de excipiente (p.ej., DMSO, o VPD:D5W)
se administran por inyección IP a diferentes concentraciones
generalmente empezando el día posterior a la implantación.
El siguiente modelo de invasión del tumor se ha
desarrollado y puede ser usado para la evaluación de los valores
terapéuticos y la eficacia de los compuestos identificados para
inhibir selectivamente el receptor KDR/FLK-1 o
CDK2.
Los ratones desnudos de 8 semanas (hembras)
(Simonsen Inc.) se usaron como animales experimentales. La
implantación de células tumorales se realizó en una campana de flujo
laminar. Para anestesiar, se administraron Xylazina/Cóctel de
Ketamina (100 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de Xylazina)
intraperitonealmente. Se hizo una incisión en la línea media para
exponer la cavidad abdominal (aproximadamente 1,5 cm de longitud)
para inyectar 10^{7} células tumorales en un medio de volumen 100
\mul. Las células se inyectaron en cualquiera de los lóbulos del
páncreas o bajo la membrana serosa del colon. El peritoneo y los
músculos se cierran con una sutura continua de seda
6-0 y la piel se cierra usando grapas de sutura. Los
animales se observaron diariamente.
Tras 2-6 semanas, dependiendo de
las observaciones ordinarias de los animales, los ratones se
sacrifican, y las metástasis de los tumores locales, a varios
órganos, (pulmón, hígado, cerebro, estómago, bazo, corazón, músculo)
se escisan y se analizan (medidas del tamaño del tumor, grado de
invasión, inmunoquímica, e hibridación in situ).
Los compuestos terapéuticos deberían ser más
potentes en inhibir la actividad protein quinasa que en ejercer un
efecto citotóxico. Una medida de la efectividad y toxicidad celular
de un compuesto puede ser obtenida por determinación del índice
terapéutico:
IC_{50}/LD_{50}. IC_{so}, la dosis
requerida para conseguir una inhibición del 50%, puede ser medida
usando técnicas estándar tales como aquellas descritas aquí.
LD_{50} la dosis que resulta en una toxicidad del 50%, también
puede ser medida por técnicas estándar (Mossman,1983, J. Inmunol.
Methods, 65:55.63), midiendo la cantidad de LDH liberada
(Korzeniewski y Callewaert, 1983, J. Inmunol. Methods,
64:313; Decker y Lohmann-Matches, 1988, J.
Inmunol. Methods, 1:15:61), o midiendo la dosis letal en
modelos de animales. Se prefieren compuestos con un índice
terapéutico alto. El índice terapéutico debería ser mayor que 2,
preferiblemente al menos 10, preferentemente al menos 50.
La actividad biológica o bioquímica de algunos de
los compuestos de la invención se estudió usando los ensayos
descritos anteriormente. Los valores de IC_{50} se midieron para
muchos de los compuestos de la invención. Los resultados se muestran
en la Tabla 4 siguiente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Todas las patentes y publicaciones mencionadas en
la especificación son indicativas de los niveles de aquéllosexpertos
en este campo, al que pertenece la invención. Todas las patentes y
publicaciones se incorporan aquí por referencia a la misma extensión
que si cada publicación individual fuera específicamente e
individualmente indicada para ser incorporada por referencia.
La invención descrita aquí ilustrativamente puede
ser practicada de forma adecuada en ausencia de cualquier elemento o
elementos, limitación o limitaciones que no se incluyen
específicamente aquí. De este modo, por ejemplo, cada vez que aquí
aparece alguno de los términos "comprender", "estar compuesto
esencialmente por" y "estar compuesto por", los tres
términos pueden ser indistintamente intercambiables. Los términos y
expresiones que han sido empleados son usados como términos de
descripción y no de limitación, y no hay intención de que en el uso
de estos términos y expresiones se excluya ningún equivalente de las
características mostradas o partes de las mismas, pero se reconoce
que varias modificaciones son posibles en el alcance de esta
invención reivindicada. De este modo, debería entenderse que aunque
la presente invención ha sido específicamente revelada por
realizaciones preferidas y características opcionales, la
modificación y variación de los conceptos aquí revelados pueden ser
recurridas por aquéllos expertos en el campo, y se considera que
tales modificaciones y variaciones están al alcance de esta
invención, tal y como se define en las reivindicaciones
adjuntas.
Además, donde las características o aspectos de
la invención se describen en términos de grupos Markush, aquéllos
expertos en el campo reconocerán que la invención también es así
descrita en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de
miembros del grupo Markush. Por ejemplo, si X se describe como
seleccionado del grupo compuesto por bromo, cloro, y yodo, las
reivindicaciones para X siendo bromo y reivindicaciones para X
siendo bromo y cloro están descritas completamente.
La invención se ha descrito ampliamente y
genéricamente aquí. Cada una de las especies y grupos de subgéneros
más concretos están dentro de la divulgación también forman parte de
la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención
con una condición o limitación negativa eliminando cualquier
cuestión de género, independientemente de si el material excisado es
específicamente citado aquí.
Claims (10)
1. Un compuesto de fórmula I:
donde:
(a) cada R_{1} es independientemente y
opcionalmente seleccionado del grupo formado por
- (i)
- hidrógeno;
- (ii)
- alquilo saturado formado por una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono;
- (iii)
- un anillo aromático mono o bicíclico C_{6}-C_{12}, o un anillo heteroaromático que contiene de 5 a 10 átomos en el anillo, donde uno, dos o tres átomos del anillo son seleccionados del grupo formado por nitrógeno, oxígeno o azufre. Los átomos del anillo restante son carbono, opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10}, alcoxi C_{1}-C_{4}, halógeno, trihalometilo, -NH_{2}, -NO_{2}, -(R)_{n}-COOH y -(R)_{n}-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo formado por alquilo saturado o insaturado C_{1}-C_{10} y un anillo aromático de cinco o seis miembros o anillo heteroaromático, y donde n es 0 ó 1;
- (iv)
- un alcohol de fórmula -(X_{1})_{n1}-OH ó un alcoxialquilo de fórmula -(X_{2})_{n2}-O-X_{3}, donde X_{1}, X_{2}, y X_{3} son independientemente seleccionados del grupo formado por un alquilo que comprende una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono y un anillo aromático de seis miembros; y n_{l} y n_{2} son independientemente 0 ó 1;
- (v)
- un halógeno;
- (vi)
- un ácido carboxílico de fórmula -(X_{4})_{n4}-COOH ó éster de fórmula -(X_{5})_{n5}-COO-X_{6}, donde X_{4}, X_{5}, y X_{6} son independientemente seleccionados del grupo formado por un alquilo que comprenda una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono, y n_{4} y n_{5} son independientemente 0 ó 1;
- (vii)
- una amida de fórmula -(X_{7})_{n7}-NHCOX_{8}, o de fórmula -(X_{9})_{n9}-CONX_{10}X_{11}, donde X_{7} y X_{9} son cada uno independientemente un alquilo que comprenda una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono, n_{7} y n_{9} son independientemente 0 ó 1,
- Y donde X_{9}, X_{10},y X_{11} son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo que comprende una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono, o donde X_{10} y X_{11} tomados juntos forman un anillo alifático o heteroalifático de cinco o seis miembros o un anillo bicíclico fusionado;
- (viii)
- una sulfonamida de fórmula -(X_{12})n_{12}-SO_{2}NX_{13}X_{14}, donde X_{12} es un alquilo que comprende una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono; n_{12} es 0 ó 1; y X_{13} y X_{14} son independientemente seleccionados del grupo formado por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, y un anillo aromático, heteroaromático, alifático, o heteroalifático de cinco o seis miembros, donde el alquilo y cada anillo es opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10}, hidroxi, halógeno, trihalometilo, -NH_{2}, -NO_{2}, -(R)_{n}-COOH y -(R)_{n}-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo formado por un anillo de cinco a seis miembros saturados o insaturados, un alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo aromático o heteroaromático de cinco o seis miembros, y donde n es 0 ó 1;
- o donde X_{13} y X_{14} juntos forman un anillo de cinco o seis miembros alifático o heteroalifático o un anillo bicíclico fusionado opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno, trihalometilo, -NH_{2}, -NO_{2}, -(R)_{n}-COOH y -(R)_{n}-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo formado por un alquilo saturado o insaturado C_{1}-C_{l0} y un anillo de cinco o seis miembros aromático o heteroaromático, y donde n es 0 ó 1;
- (ix)
- una amina de fórmula -(X_{16})_{n16}-NX_{17}X_{18}, donde X_{16} es un alquilo que comprende una cadena ramificada o simple de uno a cinco átomos de carbono; n_{16} es 0 ó 1; y
- X_{17} y X_{18} son independientemente seleccionados del grupo formado por hidrógeno, alquilo saturado o insaturado C_{1}-C_{10}, y un anillo de cinco o seis miembros aromático, heteroaromático, o alifático, donde cada anillo es opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10}, halógeno, trihalometilo, -NH_{2}, -NO_{2}, -(R)_{n}-COOH y -(R)_{n}-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo formado por un alquilo saturado o insaturado C_{1}-C_{10} y un anillo de cinco o seis miembros aromático o heteroaromático, y donde n es 0 ó 1;
- (x)
- dos grupos R_{1} adyacentes junto con dos A, B, D, o E forman un anillo de cinco o seis miembros alifático o heteroalifático;
(b) R_{2}, R_{3}, y R_{4} son
hidrógeno;
(c) R_{5} es seleccionado del grupo formado por
hidrógeno y un alquilo saturado o insaturado
C_{1}-C_{10};
(d) A, B, D, y E son cada uno independientemente
carbono o nitrógeno; con la condición de que uno, o dos de A, B, D,
y E sea nitrógeno; y con la condición de que cuando cualquiera de A,
B, D, o E sea nitrógeno, R_{1} no se una a dichos A, B, D, o
E;
(e) G es nitrógeno u oxígeno, con la condición de
que cuando G es oxígeno, R_{5} esté ausente;
(f) m es 2, 3, ó 4; y
(g) q es l, ó 2.
2. El compuesto de la reivindicación 1, donde
(a) cada R_{1}, es independientemente y
opcionalmente seleccionado del grupo formado por:
- (i)
- hidrógeno;
- (ii)
- metilo, etilo, propilo, etileno, propileno, o butileno;
- (iii)
- un alcohol de fórmula -(X_{1})_{n1}-OH o un alcoxialquilo de fórmula -(X_{2})_{n2}-O-X3, donde X_{1}, X_{2}, y X_{3} son independientemente seleccionados del grupo formado por metileno, etileno, o propileno, y n_{l} y n_{2} son independientemente 0 ó 1;
- (iv)
- flúor, cloro, o bromo;
- (v)
- un ácido carboxílico de fórmula -(X_{4})_{n4}-COOH, donde X es seleccionado del grupo formado por metileno, etileno, o propileno, y n_{4} es 0 ó 1;
- (vi)
- una amida de fórmula -(X_{7})_{n7}-NHCOX_{8}, o de fórmula -(X_{9})_{n9}-CONX_{10}X_{11}, donde X_{7} y X_{9} son cada uno independientemente seleccionados del grupo formado por metileno, etileno, y propileno, y n_{7} y n_{9} son independientemente 0 ó 1; X_{8}, X_{10}, y X_{11} son, cada uno independientemente seleccionado del grupo formado por hidrógeno, metilo, etilo, y propilo, o donde X_{10} y X_{11} juntos forman un anillo heteroalifático de cinco o seis miembros;
- (vii)
- una sulfonamida de fórmula -(X_{12})n_{12}-SO_{2}NX_{14}X_{13}, donde X_{12} es seleccionado del grupo formado por metileno, etileno, o propileno, y n_{12} es 0 ó 1; X_{13} y X_{14} son independientemente seleccionados del grupo formado por hidrógeno, metilo, etilo, propilo, y fenilo. Estos metilo, etilo, propilo, y fenilo son opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo formado por hidroxi, halógeno, -NH_{2}, -NO_{2}, -(R)_{n}-COOH y -(R)_{n}-COOR', donde R y R' son independientemente seleccionados del grupo formado por alquilo C_{1}-C_{10} y un anillo de cinco o seis miembros aromático o heteroaromático, y donde n es 0 ó 1; o donde X_{13} y X_{14} juntos forman un anillo bicíclico fusionado; o
- (viii)
- dos grupos R_{1} adyacentes junto con dos A, B, D, o E adyacentes forman un anillo heteroalifático de seis miembros;
(b) A, B, D, y E son carbonos
(c) G es nitrógeno u oxígeno;
(d) m es 1 ó 2; y
(e) q es 2.
3. El compuesto de la reivindicación 1, donde
cada R_{1} es independientemente seleccionado del grupo formado
por metilo, metoxi, 2-hidroxietilo, fenilo,
2-metoxifenilo, 3-metoxifenilo,
4-metoxifenilo, 4-fluorofenilo,
4-clorofenilo, 4-bromofenilo,
4-yodofenilo, 3-carboxifenilo,
piridilo, -NHC(O)CH_{3},
-C(O)N(CH_{3})_{2}, -COOH,
-SO_{2}NH(CH_{3}), -SO_{2}NH_{2},
-SO_{2}N(CH_{3})_{2},
-SO_{2}NH(CH(CH_{3})_{2}),
-SO_{2}NH(C_{6}H_{5}),
-SO_{2}NH(3-clorofenil), y
-SO_{2}N(CH_{3}) (3-clorofenil), y m es 1
ó 2.
4. El compuesto de la reivindicación 1, donde
dicho compuesto se selecciona del grupo formado por
4-metil-2-oxa-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida,
2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida,
1-(4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7^{-}dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona,1-(5-metoxi-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona,
1-(6-metoxi-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona,
1-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,1-dihidro-2H-pirano[3,4-c]
pirrol-4-ona, 1-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano [3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[4-(2-hidroxi-etil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(2-oxo-5-Fenil-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida, 2-oxo-3-(4-oxo2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-
ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilsulfonamida, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-isopropilsulfonamida, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-fenilsulfonamida, N-[2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-6-il]-acetamida, 1-(2-oxo-6-Fenil-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano
[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, ácido 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]-pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico, ácido 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]-pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-6-carboxí-lico, 1-(6-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(6-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[6-(2-metoxi-Fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenme-
til]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4c]pirrol-4-ona, 1-[6-(3-metoxi-Fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihi-
dro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[6-(4-metoxi-Fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[6-(4-fluoro-Fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pi-
rrol-4-ona, 1-(2-oxo-6-piridin-3-il-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[5-
(2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-
ona, 1-[5-(3,4-dihidro-2H-quinolina-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[5-(3,4-dihidro-1H-isoquinolin-2-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[5-(5-bromo-2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-
1H-indol-5(3-cloro-Fenil)-metilsulfonamida, 1-(6-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(5-cloro-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(1-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, ácido 3-[2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-il]-benzoico, ácido 3-[2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-6-il]-benzoico, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-cloro-Fenil)sulfonamida, 1-(5-bromo-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(2-oxo-5-Fenil-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin4-ona, 1-(2-oxo-6-Fenil-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 1-(6-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo
[3,4-c]piridin-4-ona, 1-(6-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 2-oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno}-2,3-dihidro-4H-indol-5-dimetilsulfonamida, 2-oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilcarboxamida, 1-[2-oxo-5-(pirrolidin-1-carbonil)-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona,
1-[5-(morfolin-4-carbonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 1-[4-(2-hidroxi-etil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 1-(5-metoxi-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 1-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]-piridin-4-ona, 1-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-iliden-
metil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, ácido 2-oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piri-
din-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico, 2-oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida, 2-oxo-3-{4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida,
pirrol-4-ona, 1-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano [3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[4-(2-hidroxi-etil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(2-oxo-5-Fenil-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida, 2-oxo-3-(4-oxo2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-
ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilsulfonamida, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-isopropilsulfonamida, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-fenilsulfonamida, N-[2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-6-il]-acetamida, 1-(2-oxo-6-Fenil-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano
[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, ácido 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]-pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico, ácido 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]-pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-6-carboxí-lico, 1-(6-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(6-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[6-(2-metoxi-Fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenme-
til]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4c]pirrol-4-ona, 1-[6-(3-metoxi-Fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihi-
dro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[6-(4-metoxi-Fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[6-(4-fluoro-Fenil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pi-
rrol-4-ona, 1-(2-oxo-6-piridin-3-il-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[5-
(2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-
ona, 1-[5-(3,4-dihidro-2H-quinolina-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[5-(3,4-dihidro-1H-isoquinolin-2-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-[5-(5-bromo-2,3-dihidro-indol-1-sulfonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-
1H-indol-5(3-cloro-Fenil)-metilsulfonamida, 1-(6-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(5-cloro-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(1-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, ácido 3-[2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-il]-benzoico, ácido 3-[2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-6-il]-benzoico, 2-oxo-3-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidro-pirano[3,4-c]pirrol-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-(3-cloro-Fenil)sulfonamida, 1-(5-bromo-4-metil-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, 1-(2-oxo-5-Fenil-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin4-ona, 1-(2-oxo-6-Fenil-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 1-(6-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo
[3,4-c]piridin-4-ona, 1-(6-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 2-oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno}-2,3-dihidro-4H-indol-5-dimetilsulfonamida, 2-oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilcarboxamida, 1-[2-oxo-5-(pirrolidin-1-carbonil)-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona,
1-[5-(morfolin-4-carbonil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 1-[4-(2-hidroxi-etil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 1-(5-metoxi-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, 1-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]-piridin-4-ona, 1-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-iliden-
metil)-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, ácido 2-oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piri-
din-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico, 2-oxo-3-(4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-sulfonamida, 2-oxo-3-{4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida,
1-[4-(2-hidroxietil)-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-5-metil-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona,
1-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-5-metil-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, ácido 3-(5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico, 3-(5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida, 3-(5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c}piridin-1-ilmetileno)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilsulfonamida, 1-(2-oxo-1,2-dihidro-pirrolo[2,3-b]piridin-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, y 4-(3-cloro-4-fluoro-Fenilamino)-5-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidropirano[3,4-c]-pirrol-1-ilmetileno)-5,7-dihidro-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-ona.
1-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil]-5-metil-2,5,6,7-tetrahidro-pirrolo[3,4-c]piridin-4-ona, ácido 3-(5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxílico, 3-(5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c]piridin-1-ilmetileno)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-metilsulfonamida, 3-(5-metil-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-2H-pirrolo[3,4-c}piridin-1-ilmetileno)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-dimetilsulfonamida, 1-(2-oxo-1,2-dihidro-pirrolo[2,3-b]piridin-3-ilidenmetil)-6,7-dihidro-2H-pirano[3,4-c]pirrol-4-ona, y 4-(3-cloro-4-fluoro-Fenilamino)-5-(4-oxo-2,4,6,7-tetrahidropirano[3,4-c]-pirrol-1-ilmetileno)-5,7-dihidro-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-ona.
5. Un compuesto seleccionado del grupo formado
por:
6. Un compuesto que tiene la fórmula:
7. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. El uso de una composición farmacéutica que
comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y
un excipiente farmacéuticamente aceptable en la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por una
protein quinasa.
9. El uso de la reivindicación 8, donde el
organismo es un humano y dicha condición anormal es cáncer.
10. El uso de la reivindicación 9 donde dicho
cáncer es seleccionado del grupo formado por carcinoma de células
escamosas, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cáncer de
pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro y cuello, melanoma,
cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de
células pequeñas de pulmón, glioma, cáncer colorectal, cáncer
genitourinario y cáncer gastrointestinal.
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