ES2239393T3 - Derivados de 2-indolinona utilizados como moduladores de la actividad de la proteina-quinasa. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a nuevas 2-indolinonas y a sus sales y prodrogas fisiológicamente aceptables que modulan la actividad de la proteína quinasa y por lo tanto se espera que sean útiles en la prevención y el tratamiento de los desórdenes celulares relacionados con la proteína quinasa tales como el cáncer.

Description

Derivados de 2-indolinona utilizados como moduladores de la actividad de la proteína-quinasa.

Introducción

La presente invención se refiere a nuevos derivados de la 2-indolinona, más en particular a diaza-indolinonas sustituidas, a composiciones farmacéuticas que contienen tales compuestos y al uso de tales compuestos para la fabricación de medicamentos destinados al tratamiento de trastornos relacionados con una actividad anormal de la proteína-quinasa ("PK").

Antecedentes de la invención

Lo que sigue se presenta únicamente como información de antecedentes y no se admite que sea técnica anterior de la presente invención.

Las PK son enzimas que catalizan la fosforilación de los grupos hidroxi de los restos tirosina, serina y treonina de las proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente simple son sorprendentes; el crecimiento, la diferenciación y la proliferación celulares, es decir, virtualmente todos los aspectos de la vida celular dependen de un modo u otro de la actividad de las PK. Por otro lado, la actividad anormal de las PK se ha relacionado con una fuente de trastornos, que van desde enfermedades relativamente poco amenazadoras para la vida, como es la psoriasis, hasta enfermedades extremadamente virulentas, como es el glioblastoma (cáncer cerebral).

Las PK pueden subdividirse en dos grupos, las proteína-tirosina-quinasas (PTK) y las serina-treonina-quinasas (STK).

Uno de los principales aspectos de la actividad de las PTK es su interacción con los receptores de factor de crecimiento. Los receptores de factores de crecimiento son proteínas de la superficie celular. Cuando se fijan a un ligando de factor de crecimiento, los receptores de factor de crecimiento se convierten en una forma activa que interacciona con proteínas en la superficie interna de la membrana celular. Esto conduce a la fosforilación de los restos tirosina del receptor y otras proteínas y a la formación, dentro de la célula, de complejos con un gran número de moléculas de señal citoplasmáticas que, a su vez, afectan a numerosas respuestas celulares, por ejemplo la división celular (proliferación), la diferenciación celular, el crecimiento celular, la expresión de efectos metabólicos en un microentorno extracelular, etc. Para una revisión más completa, ver Schlessinger y Ullrich, en Neuron 9, 303-391,
1992.

Los receptores de factor de crecimiento que tienen actividad de PK se conocen como tirosina-quinasas receptoras ("RTK"). Comprenden un amplio grupo de receptores transmembrana con actividades biológicas diversas. Actualmente se han identificado por lo menos diecinueve (19) subgrupos distintos de las RTK. Un ejemplo de ellas es el subgrupo denominado RTK "HER", que incluye los EGFR (epithelial growth factor receptor), los HER2, HER3 y HER4. Estas RTK tienen un dominio extracelular glucosilado para la fijación del ligando, un dominio transmembrana y un dominio intracelular catalítico citoplasmático que puede fosforilar los restos tirosina de las
proteínas.

Otro subgrupo de las RTK es el formado por receptores de insulina (IR), receptores de factor de crecimiento I similares a la insulina (IGF-1R) y los receptores afines a los receptores de insulina (IRR). El IR y el IGF-1R interaccionan con la insulina, el IGF-I y el IGF-II para formar un heterotetrámero de dos subunidades \alpha glucosiladas totalmente extracelulares y dos subunidades \beta, que cruzan la membrana celular y que contienen el dominio tirosina-quinasa.

Un tercer subgrupo de las RTK se denomina grupo de receptores de factor de crecimiento derivados de plaquetas ("PDGFR"), que incluye el PDGFR\alpha, el PDGFR\beta, el CSFIR, el c-kit y el c-fms. Estos receptores contienen dominios extracelulares glucosilados de un número variable de bucles similares a la inmunoglobulina y un dominio intracelular en el que el dominio tirosina-quinasa está interrumpido por secuencias de aminoácido no afines.

Otro grupo que, por su similaridad con el subgrupo PDGFR, se incluye algunas veces dentro del este último grupo, es el subgrupo de receptores de quinasa hepática fetal ("flk"). Se cree que este grupo está formado por el receptor de dominio de inserto/quinasa hepática fetal 1 (KDR/FLK-1), el flk-1R, el flk-4 y la tirosina-quinasa 1 similar a la fms (flt-1).

Otro miembro del grupo de receptores de factor de crecimiento de tirosina quinasa es el factor de crecimiento de fibroblasto ("FGF"). Este grupo está formado por cuatro receptores FGFR1-4 y siete ligandos FGF1-7. Aunque todavía no se han definido bien, parece que los receptores contienen un dominio glucosilado extracelular, que lleva un número variable de bucles de tipo inmunoglobulina y un dominio intracelular, en el que la secuencia PTK está interrumpida por regiones de secuencias de aminoácidos no afines.

Un listado más completo de los subgrupos de RTK conocidos se describe en Plowman y col., DN&P 7(6), 334-339, 1994.

Además de las RTK existe también un grupo de PTK totalmente intracelulares, llamadas "tirosina-quinasas no receptoras" o "tirosina-quinasas celulares". Este último término, abreviado por "CTK", es el que se empleará en esta descripción. Las CTK no contienen dominios extracelulares ni transmembrana. Actualmente se han identificado 24 CTK, agrupadas en 11 subgrupos (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak y Ack). El subgrupo Src parece ser, con diferencia, el grupo más amplio de las CTK que incluye los elementos Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. Para una revisión más detallada de las CTK, véase Bolen, Oncogene 8, 2025-2031, 1993.

Al igual que las CTK, las serina-treonina-quinasas o STK son predominantemente intracelulares, a pesar de haber pocas quinasas receptoras del tipo STK. Las STK son las quinasas citosólicas más frecuentes; es decir, quinasas que realizan su función en aquella parte del citoplasma que es distinta de los orgánulos citoplasmáticos y del citoesqueleto. El citosol es la región dentro de la célula en la que tiene lugar la mayor parte de la actividad biosintética y metabólica intermedia de la célula; es decir, en el citosol tiene lugar la síntesis de proteínas de los ribosomas.

Las RTK, las CTK y las STK intervienen en una gran variedad de estados patogénicos, incluido un gran número de cánceres diversos. Otros estados patológicos, que se han asociados con las PTK incluyen pero no se limitan a ellas: la psoriasis, la cirrosis hepática, la diabetes, la aterosclerosis, la angiogénesis, la restinosis, las enfermedades oculares, la artritis reumatoide y otros trastornos inflamatorios, las enfermedades autoinmunes y una gran variedad de trastornos renales.

En lo que respecta al cáncer existen dos hipótesis principales, que se han propuesto para explicar la proliferación celular excesiva que conduce al desarrollo de tumores y se refieren a funciones conocidas como funciones reguladas por las PK. Es decir, se ha sugerido que el crecimiento celular maligno resulta del colapso del mecanismo que controla la división y/o diferenciación celular. Se ha constatado que los productos proteicos de un gran número de proto-oncogenes intervienen en los mecanismos de transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celulares. Estos productos proteicos de los proto-oncogenes incluyen los factores de crecimiento extracelular, los receptores PTK de factor de crecimiento transmembrana (RTK), las PTK citoplasmáticas (CTK) y las STK citosólicas, ya aludidas antes.

En vista del nexo aparente entre las actividades celulares relacionadas con las PK y un gran número de trastornos humanos, no es sorprendente que se haya dedicado un gran esfuerzo a la identificación de los mecanismos que modulan la actividad de las PK. Algunos de ellos se han abordado con ensayos biomiméticos utilizando moléculas grandes, de estructura similar a la que interviene en los actuales procesos celulares (p.ej. ligandos mutantes, solicitud US-4 966 849); receptores y anticuerpos solubles (solicitud WO 94/10202; Kendall y Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 10705-09, 1994; Kim y col., Nature 362, 841-844, 1993); ligandos de RNA (Jelinek y col., Biochemistry 33, 10450-56; Takano y col., Mol. Bio. Cell 4, 358A, 1993; Kinsella y col., Exp. Cell Res. 199, 56-62, 1992; Wright y col., J. Cellular Phys. 152, 448-57) e inhibidores de tirosina-quinasa (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; patente US-5 330 922; Mariani y col., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35, 2268,
1994).

En fechas más recientes se han efectuado intentos de identificación de moléculas pequeñas que actúan como inhibidores de las PK. Como inhibidores de las PTK se han descrito por ejemplo compuestos arilo monocíclicos, bicíclicos y heterocíclicos (PCT WO 92/20642), derivados de vinileno-azaindol (PCT WO 94/14808) y 1-ciclopropil-4-piridilquinolonas (patente US-5 330 992). Se han descrito como inhibidores de las PTK, útiles para el tratamiento del cáncer, compuestos estirilo (patente US-5 217 999), compuesto piridilo sustituidos por estirilo (patente US-5 302 606), derivados de quinazolina (solicitud EP-0 566 266 A1), selenoindoles y selenuros (PCT WO 94/03427), compuestos polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO 92/21660) y compuestos ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495).

Nuestros propios esfuerzos por identificar moléculas orgánicas pequeñas, que modulan la actividad PK y que, además, podrían ser útiles para el tratamiento y prevención de trastornos derivados de la actividad anormal de las PC, nos han llevado a descubrir un grupo de nuevos derivados de la 2-indolinona, que presentan una excelente actividad moduladora de las PK y que constituyen el objeto de esta invención.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere en general a nuevos derivados de la 2-indolinona y sus sales, que modulan la actividad de las proteína-tirosina-quinasas receptoras (RTK), proteína-tirosina-quinasas no receptoras (CTK) y proteína-quinasas de serina/treonina (STK). La invención se refiere en particular a diaza-2-indolinonas sustituidas por 3-metilidenilo.

La presente invención se refiere además a composiciones farmacológicas que contienen compuestos descritos o sus sales fisiológicamente aceptables y un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere además al uso de tales compuestos en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de trastornos relacionados con una actividad anormal de las proteína-quinasas, por ejemplo del cáncer, de otros trastornos proliferantes, diabetes, enfermedad autoinmune, trastornos inflamatorios y angiogénesis.

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1. Los compuestos

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a compuestos que tienen la estructura química general:

1

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en la que

A^{2} y A^{4} son nitrógeno y A^{1} y A^{3} son carbono o bien A^{1} y A^{3} son nitrógeno y A^{2} y A^{4} son carbono, dando por supuesto que si A^{1}, A^{2}, A^{3} y A^{4} es nitrógeno, entonces no existe R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, respectivamente;

R^{1} se elige entre el grupo formado por hidrógeno; alquilo C1-C10, cicloalquilo, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, arilo, heteroarilo, trihalometanocarbonilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi C1-C10, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, C-tioamido, guanilo, guanadinilo, ureidilo, sulfonilo y trihalometanosulfonilo;

R^{2} se elige entre el grupo formado por hidrógeno; alquilo C1-C10, cicloalquilo, arilo y halógeno;

R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por hidrógeno; alquilo C1-C10, trihalometilo, cicloalquilo, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, tiohidroxi, alcoxi C1-C10, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi C1-C10, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, N-trihalometanosulfonamido, carbonilo, aldehído, trihalometil-carbonilo, C-carboxi, O-carboxi, ciano, nitro, halógeno, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, fosfonilo, guanilo, guanadinilo, ureidilo, C-amido, N-amido, amino, amonio cuaternario, -NR^{18}R^{19};

R^{18} y R^{19}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo, arilo, carbonilo, acetilo, trihalometilcarbonilo, C-carboxi, trihalometanosulfonilo, sulfonilo, C-peptidilo y, juntos, forman un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones;

Z es oxígeno;

Q es

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2

J^{1} se elige entre el grupo formado por oxígeno, nitrógeno y azufre;

J^{2}, J^{3} y J^{4}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre, de tal manera que el anillo heteroarilo de cinco eslabones sea uno ya conocido en la técnica química, dando por supuesto además que si J^{2}, J^{3} o J^{4} es nitrógeno, oxígeno o azufre, entonces no existe R^{8}, R^{8'} o R^{8''}, respectivamente; de igual manera, cuando J^{1} es oxígeno o azufre, entonces R^{7} no existe;

R^{7} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo, trihalometilcarbonilo, arilo, guanilo, carboxilo, sulfonilo y trihalometanosulfonilo;

uno de R^{8}, R^{8'} o R^{8''} es H o un grupo -(alk_{1})rM; en el que (alk_{1}) es CH_{2}; r es un número de 1 a 3, ambos incluidos; y M se elige entre el grupo formado por hidroxi, amino, carboxi, morfolinilo, piperazinilo, tetrazolilo, N-carbamilo, O-carbamilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, sulfonilo, -S(O)_{2}OH y fosfonilo;

los dos restantes de R^{8}, R^{8'} o R^{8''}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por:

hidrógeno;

alquilo C1-C4 sin sustituir;

alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios grupos elegidos entre halógeno, hidroxilo, alcoxi C1-C4 sin sustituir, amino, S-sulfonamido, -NR^{18}R^{19} o carboxi;

alcoxi C1-C4 sin sustituir;

alcoxi C1-C4 sustituido por uno o varios halógenos;

arilo sin sustituir;

arilo sustituido por uno o varios grupos elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir; alcoxi C1-C4 sin sustituir; halógeno; trihalometilo; amino; -NR^{18}R^{19}; hidroxi y S-sulfonamido;

heteroarilo sin sustituir;

heteroarilo sustituido por uno o varios grupos elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir; alcoxi C1-C4 sin sustituir; halógeno; hidroxi; alcoxi sin sustituir; amino; y -NR^{18}R^{19};

heteroalicíclico sin sustituir;

heteroalicíclico sustituido por uno o varios grupos elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir; halógeno; hidroxi;

alcoxi sin sustituir; amino; y -NR^{18}R^{19};

halógeno;

ciano;

carboxi; y

un anillo cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heteroalicíclico de seis eslabones, formado por combinación de R^{8} y R^{8'} o de R^{8'} y R^{8''};

y las sales fisiológicamente aceptables de los mismos.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "alquilo" significa hidrocarburos alifáticos saturados, incluidos los restos de cadena lineal y los de cadena ramificada. El grupo alquilo tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Con preferencia especial es alquilo inferior, que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Si está sustituido, el o los restos sustituyentes pueden ser uno o varios, elegidos individualmente entre cicloalquilo sin sustituir, elegido entre el grupo formado por ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno; arilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por fenilo, naftalenilo y antracenilo; heteroarilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol; heteroalicíclico sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y tetrahidrofurano; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; halógeno; carbonilo; tiocarbonilo; O-carbamilo; N-carbamilo; O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo; C-amido; N-amido; C-carboxi; O-carboxi; cianato; isocianato; tiocianato; isotiocianato; nitro; sililo; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} se eligen con independencia entre sí entre el conjunto formado por hidrógeno, alquilo C1-C4 sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, ya definido antes, arilo sin sustituir, ya definido antes, carbonilo, trihalometilcarbonilo, C-carboxi, trihalometilsulfonilo, sulfonilo y, juntos, forman un anillo heteroalicíclico de cinco o de seis eslabones, ya definido antes.

Un resto "cicloalquilo" significa cualquier anillo exclusivamente carbonado, monocíclico o fusionado (es decir, anillo que comparte un par de átomos de carbono adyacentes), en el que uno o varios anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugados. El resto cicloalquilo se elige entre ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno. Un resto cicloalquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando está sustituido, el o los restos sustituyentes son uno o varios, elegidos individualmente entre el alquilo C1-C4 sin sustituir; arilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por fenilo, naftalenilo y antracenilo; heteroarilo sin sustituir elegido entre el conjunto formado por pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol; un heteroalicíclico sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por la piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y tetrahidrofurano; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; halógeno; carbonilo; tiocarbonilo; carboxi; O-carbamilo; N-carbamilo; C-amido; N-amido; nitro; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos anteriormente.

Un resto "alquenilo" significa un resto alquilo, ya definido anteriormente, que tiene por lo menos dos átomos de carbono y por lo menos un doble enlace carbono-carbono.

Un resto "alquinilo" significa un resto alquilo, ya definido antes, que tiene por lo menos dos átomos de carbono y por lo menos un triple enlace carbono-carbono.

Un resto "arilo" significa cualquier resto exclusivamente carbonato, monocíclico o policíclico por fusión de anillos (es decir, anillos que comparten pares de átomos de carbono adyacentes), que tienen un sistema de electrones pi completamente conjugados. El resto arilo se elige entre fenilo, naftalenilo y antracenilo. El resto arilo puede estar sustituido o sin sustituir. Si está sustituido, el o los grupos sustituyentes son uno o varios y se eligen entre halógeno; trihalometilo; alquilo C1-C4 sin sustituir; arilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por fenilo, naftalenilo y antracenilo; heteroarilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por el pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol; heteroalicíclico sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por la piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y tetrahidrofurano; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo; tiocarbonilo; C-carboxi; O-carboxi; O-carbamilo; N-carbamilo; O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo; C-amido; N-amido; sulfinilo, sulfonilo; S-sulfonamido; N-sulfonamido; trihalometanosulfonamido; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos anteriormente.

Tal como se emplea en esta descripción, un resto "heteroarilo" significa un resto monocíclico o de anillo fusionado (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes), que tienen en el o en los anillos uno o varios átomos elegidos entre el conjunto formado por nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, tienen un sistema de electrones pi completamente conjugados. El resto heteroarilo se elige entre el pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol. El grupo heteroarilo puede estar sustituido o sin sustituir. Si está sustituido, el o los grupos sustituyentes son uno o varios y se eligen entre alquilo C1-C4 sin sustituir; cicloalquilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por el ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno; arilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por el fenilo, naftalenilo y antracenilo; halógeno; trihalometilo; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo; tiocarbonilo; sulfonamido; carboxi; sulfinilo; sulfonilo; O-carbamilo; N-carbamilo; O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo; C-amido; N-amido; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos anteriormente.

Un resto "heteroalicíclico" significa un resto monocíclico o de anillos fusionados, que tiene en el o en los anillos uno o varios átomos elegidos entre el grupo formado por nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos pueden tener uno o varios dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugados. El resto heteroalicíclico se elige entre la piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y tetrahidrofurano. El anillo heteroalicíclico puede estar sustituido o sin sustituir. Si está sustituido, el o los grupos sustituyentes se eligen entre alquilo C1-C4 sin sustituir; cicloalquilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno; halógeno; trihalometilo; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo; tiocarbonilo; carboxi; O-carbamilo; N-carbamilo; O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo; sulfinilo; sulfonilo; C-amido; N-amido; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos anteriormente.

Un grupo "hidroxi" significa un grupo -OH.

Un grupo "alcoxi" significa tanto un resto -O-alquilo como un resto -O-cicloalquilo, en los que alquilo y cicloalquilo tienen los significados definidos anteriormente.

Un grupo "ariloxi" significa tanto un resto -O-arilo como un resto -O-heteroarilo, en los que arilo y heteroarilo tienen los significados definidos antes.

Un grupo "heteroalicicloxi" significa un resto -O-heteroalicíclico, en el que heteroalicíclico tiene el significado definido antes.

Un grupo "tiohidroxi" significa un grupo -SH.

Un grupo "tioalcoxi" significa tanto un resto -S-alquilo como un resto -S-cicloalquilo, en los que alquilo y cicloalquilo tienen los significados definidos antes.

Un grupo "tioariloxi" significa tanto un resto -S-arilo como un restos -S-heteroarilo, en los que arilo y heteroarilo tienen los significados definidos anteriormente.

Un grupo "carbonilo" significa un grupo -C(=O)-R'', en que R'' se elige entre el conjunto formado por hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (la unión se realiza sobre un carbono del anillo) y heteroalicíclico (la unión se realiza sobre un carbono del anillo), ya definidos anteriormente.

Un grupo "trihalometilcarbonilo" significa un grupo X_{3}CC(=O)- en el que X es un grupo halógeno, ya definido.

Un grupo "aldehído" significa un grupo carbonilo en el que R'' es hidrógeno.

Un grupo "tiocarbonilo" significa un grupo -C(=S)-R'', en el que R'' tiene el significado definido en la descripción.

Un grupo "O-carboxi" significa un grupo R''C(=O)O-, en el que R'' tiene el significado definido en la descripción.

Un grupo "C-carboxi" significa grupos -C(=O)OR'', en los que R'' tiene el significado definido en la descripción.

Un resto "acetilo" significa un resto -C(=O)CH_{3}.

Un grupo "carboxialquilo" significa un grupo -(CH_{2})_{s}-C(O)OR'', en el que s es 1-6 y R'' ya se ha definido antes.

Un grupo ácido carboxílico significa un grupo C-carboxi, en el que R'' es hidrógeno.

Un grupo "halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo.

Un grupo "trihalometilo" significa un grupo -CX_{3}, en que X es un grupo halógeno ya definido.

Un grupo "trihalometanosulfonilo" significa grupos X_{3}CS(=O)_{2}-, en los que X tiene el significa ya definido.

Un grupo "ciano" significa un grupo -C=N.

Un grupo "cianato" significa un grupo -CNO.

Un grupo "isocianato" significa un grupo -NCO.

Un grupo "tiocianato" significa un grupo -CNS.

Un grupo "isotiocianato" significa un grupo -NCS.

Un grupo "sulfinilo" significa un grupo -S(=O)-R'', en el que R'' tiene el significado definido en esta descripción.

Un grupo "sulfonilo" significa un grupo -S(=O)_{2}R'', en el que R'' tiene el significado definido en esta descripción.

Un grupo "sulfonamido" significa un resto -S(=O)_{2}-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos en esta descripción.

Un resto "trihalometanosulfonamido" significa un resto X_{3}CS(=O)_{2}N(R^{18})- en el que X y R^{18} tienen los significados definidos.

Un resto "O-carbamilo" es un resto -OC(=O)NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados ya definidos.

Un resto "N-carbamilo" es un resto R^{19}OC(=O)NR^{18}-, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados ya definidos.

Un resto "O-tiocarbamilo" es un resto -OC(=S)NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados ya definidos.

Un resto "N-tiocarbamilo" es un resto R^{19}OC(=S)NR^{18}-, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados ya definidos.

Un grupo "amino" significa un grupo -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} son, ambos, hidrógeno.

Un grupo "amonio cuaternario" significa un grupo -^{+}NR^{18}R^{18'}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos y R^{18'} significa lo mismo que R^{18} y R^{19}.

Un resto "C-amido" significa un resto -C(=O)-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos.

Un resto "N-amido" significa un resto R^{18}C(=O)NR^{19}-, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos.

Un resto "C-tioamido" significa un resto -C(=S)-NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos.

Un grupo "nitro" significa un grupo -NO_{2}.

Un grupo "metilenodioxi" significa un grupo -OCH_{2}O-, en el que los átomos de oxígeno están unidos a átomos de carbono adyacentes del anillo.

Un grupo "etilenodioxi" significa un grupo -OCH_{2}CH_{2}O-, en el que los átomos de oxígeno están unidos a átomos de carbono adyacentes del anillo.

Un resto "guanilo" significa un resto R^{18}R^{19}NC(=N)-, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos.

Un resto "guanadinilo" significa un resto -R^{18}NC(=N)NR^{18'}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos antes y R^{18'} tiene el mismo significado que R^{18} y R^{19}.

Un resto "ureidilo" significa un resto -NR^{18}C(=O)NR^{18'}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos antes y R^{18'} tiene el mismo significado que R^{18} y R^{19}.

Un resto "fosfonilo" significa un resto -OP(=O)_{2}OR'', en el que R'' tiene el significado definido antes.

Un resto "C-peptidilo" significa un grupo formado por la reacción del grupo 2-amino de un aminoácido con el grupo carboxi de otro aminoácido; es decir, un resto peptidilo tiene la estructura general -(NCHRC(=O)_{n}-, en el que el resto R puede ser el mismo o diferentes en función del aminoácido empleado para formar el resto peptidilo, la designación "C-peptidilo" se refiere a la situación en la que el resto peptidilo se une a una molécula de no aminoácido mediante el carbono C(=O).

Un "grupo polar" significa un grupo, en el que los núcleos de los átomos que están unidos entre sí mediante enlaces covalentes para formar el grupo no comparten los electrones del o de los enlaces covalentes, uniéndolos por igual; es decir, la nube electrónica es más densa en torno a un átomo que en torno a otro. El resultado de ello es que un extremo del o de los enlaces covalentes es relativamente negativo y el otro extremo es relativamente positivo; es decir, existe un polo negativo y un polo positivo. Los ejemplos de grupos polares incluyen, pero no se limitan a: hidroxi, alcoxi, carboxi, nitro, ciano, amino, amonio cuaternario, amido, ureidilo, sulfonamido, sulfinilo, sulfonilo, fosfono, morfolino, piperazinilo y tetrazolilo.

Un resto "espirocicloalquilo" significa un resto cicloalquilo que comparte un átomo de carbono de anillo con otro anillo.

Un grupo "espiroheteroalicíclico" significa un resto heteroalicíclico que comparte un átomo de carbono de anillo con otro anillo.

Un resto "N-hidroxilamino" significa un resto R''ONR^{18}-, en el que R'' y R^{18} tienen los significados definidos.

Un grupo "polihidroxialquilo" significa un resto alquilo no ramificado de 1 a 8 átomos de carbono, con preferencia de 1 a 4 átomos de carbono, sustituido por 2 ó más, con preferencia 3 ó más grupos exclusivamente hidroxilo.

Un grupo "morfolinilo" significa un grupo que tiene la siguiente estructura química:

3

Un resto "tetrazolilo" significa un resto que tiene la siguiente estructura química:

4

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Un resto "aminotriazolilo" significa un resto que tiene la siguiente estructura química:

5

Un resto "1-piperazinilo" significa un resto que tiene la siguiente estructura química:

6

Los ejemplos no limitantes de anillos heteroarilo de 5 eslabones Q, ya conocidos en la técnica química, incluyen los siguientes:

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7

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8

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9

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B. Características estructurales preferidas

En una forma preferida de ejecución de esta invención, R^{1}, R^{2} y R^{7} son hidrógeno.

En otra forma preferida de ejecución de esta invención, R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, con independencia entre sí, se eligen entre el conjunto formado por:

hidrógeno;

alquilo C1-C4 sin sustituir;

alquilo C1-C4 sustituido por un resto elegido entre el conjunto formado por cicloalquilo sin sustituir, halógeno, hidroxi, alcoxi C1-C4 sin sustituir, C-carboxi, arilo sin sustituir, heteroarilo sin sustituir, heteroalicíclico sin sustituir, amino, amonio cuaternario y -NR^{18}R^{19};

cicloalquilo sin sustituir;

hidroxi;

alcoxi C1-C4 sin sustituir;

alcoxi C1-C4 sustituido por un resto elegido entre el conjunto formado por uno o varios grupos halógeno, arilo sin sustituir y heteroarilo sin sustituir;

trihalometilo;

halógeno;

arilo sin sustituir;

arilo sustituido por uno o varios restos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno; trihalometilo; halógeno; hidroxi; y alcoxi C1-C4 sin sustituir;

ariloxi sin sustituir;

ariloxi sustituido por uno o varios grupos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por halógeno; alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno; arilo sin sustituir; hidroxi; alcoxi C1-C4 sin sustituir; amino y -NR^{18}R^{19};

S-sulfonamido;

heteroarilo sin sustituir;

heteroarilo sustituido por uno o varios restos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por hidrógeno; alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno; trihalometilo; halógeno; hidroxi, alcoxi C1-C4 sin sustituir; ariloxi sin sustituir; amino; S-sulfonamido y -NR^{18}R^{19};

heteroalicíclico sin sustituir;

heteroalicíclico sustituido por uno o varios restos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno; (alquilo C1-C4 sin sustituir)-alcoxi; hidroxi; amino; S-sulfonamido o -NR^{18}R^{19};

(alquilo C1-C4 sin sustituir)-C-carboxi;

ácido carboxílico;

(alquilo C1-C4 sin sustituir)-carbonilo;

aldehído;

(arilo sin sustituir)-carbonilo;

acetilo;

S-sulfonamido;

N-sulfonamido;

amino; y

-NR^{18}R^{19}.

Las formas preferidas de ejecución adicionales de la invención son aquellas en las que:

cualquiera par de R^{8}, R^{8'} y R^{8''} son restos -(alk_{1})rM;

J^{1} se elige entre el conjunto formado por nitrógeno, oxígeno y azufre y J^{2}, J^{3} y J^{4} son carbono;

J^{1} y J^{3} son nitrógeno y J^{2} y J^{4} son carbono.

En la siguiente tabla 1 se recogen ejemplos de compuestos específicos de esta invención.

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TABLA 1

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2. La bioquímica

La transducción de señales mediada por la RTK se inicia por interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando) y posterior dimerización del receptor, estimulación transitoria de la actividad intrínseca de las proteína-tirosina-quinasas y fosforilación. Los sitios de unión para ello se crean para las moléculas de transducción de señales intracelulares y conducen a la formación de complejos con un espectro de moléculas señalizadoras citoplasmáticas que facilitan la respuesta celular apropiada (p.ej. división celular, efectos metabólicos en el microentorno extracelular). Véase Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron 9, 303-391.

Se ha observado que los sitios de fosforilación de la tirosina de los receptores del factor de crecimiento actúan como sitios de fijación de alta afinidad para los dominios SH2 (homología src) de las moléculas señalizadoras, ver Fantl y col., Cell 69, 413-423, 1992; Songyang y col., Mol. Cell. Biol. 14, 2777-2785, 1994; Songyang y col., Cell 72, 767-778, 1993; y Koch y col., Science 252, 668-678, 1991. Se han identificado diversas proteínas de sustrato intracelular, que se asocian con las RTK. Pueden dividirse en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio catalítico; y (2) sustratos a los que les falta dicho dominio, pero que actúan como adaptadores y se asocian a moléculas catalíticamente activas, ver Songyang y col., Cell 72, 767-778, 1993. La especificidad de las interacciones entre los receptores y los dominios SH2 de su sustrato viene determinada por los restos aminoácido que rodean de modo adyacente al resto de tirosina fosforilada. Las diferencias en las afinidades de fijación entre los dominios SH2 y las secuencias de aminoácidos que rodean a los restos fosfotirosina de receptores concretos son coherentes con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación de sustrato, ver Songyang y col., Cell 72, 767-778, 1993. Estas observaciones sugieren que la función de cada RTK viene determinada no solo por su modelo de expresión y la disponibilidad del ligando, sino también por la disposición de las vías de transducción de señal hacia la línea de salida que se activan con un receptor particular. La fosforilación proporciona, pues, un paso regulador importante que determina la selectividad de las vías de señalización reclutadas por receptores específicos de factor de crecimiento, así como por receptores de factor de diferenciación.

Las STK, por ser primariamente citosólicas, afectan la bioquímica interna de la célula a menudo en forma de respuesta descendente a un fenómeno PTK. Las STK intervienen en el proceso de señalización que inicia la síntesis del DNA y posterior mitosis, que conducen a la proliferación celular.

De este modo, la señal PK se traduce, entre otras respuestas, en proliferación, diferenciación, crecimiento y metabolismo celulares. La proliferación celular anormal puede traducirse en un amplio abanico de trastornos y enfermedades, incluido el desarrollo de neoplasia, por ejemplo carcinoma, sarcoma, leucemia, gliobastoma, hemangioma, psoriasis, arteriosclerosis, artritis y retinopatía diabética (y otros trastornos relacionados con una angiogénesis y/o vasculogénesis incontroladas).

No se requiere un conocimiento preciso del mecanismo por el que los compuestos de la invención inhiben las PK con vistas a la puesta en práctica de la presente invención. Sin embargo, sin pretender adoptar ningún mecanismo ni teoría concretos, se cree que los compuestos interaccionan con los aminoácidos de la región catalítica de las PK. Las PK poseen como se sabe una estructura bilobulada, en la que el ATP (trifosfato de adenosina) parece fijarse sobre la hendidura existente entre ambos lóbulos, en una región en la que los aminoácidos se conservan entre las PK. Se cree que los inhibidores de las PK se fijan por interacciones no covalente, por ejemplo puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waal e interacciones iónicas en la misma región general en la que el ATP mencionado se fija sobre las PK. Más en concreto, se supone que el componente 2-indolinona de los compuestos de esta invención se fija en el espacio general que normalmente ocupa el anillo adenina del ATP. La especificidad de una molécula concreta para una PK concreta puede surgir como resultado de interacciones adicionales entre varios sustituyentes del núcleo 2-indolinona provistos de dominios aminoácido específicos de PK concretas. Por lo tanto, diferentes sustituyentes indolinona pueden contribuir a la fijación preferencial sobre PK concretas. La capacidad de seleccionar estos compuestos activos en diferentes sitios de fijación del ATP (o de otros nucleótidos) hace que los compuestos sean útiles para impactar sobre la diana constituida por cualquier proteína que tenga tal sitio; es decir, no solamente las PK, sino también las proteína-fosfatasas. Los compuestos descritos en esta invención tienen, pues, utilidad para ensayos "in vitro" sobre dichas proteínas y poseen efectos terapéuticos "in vivo" a través de dichas proteínas.

En otro aspecto, esta invención se refiere al uso de un compuesto según la invención para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad elegida entre un cáncer, elegido entre el conjunto formado por un carcinoma celular escamoso, un astrocitoma, un glioblastoma, un cáncer de mama, un glioma, un melanoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de células pequeñas, un cáncer de vejiga, un cáncer de ovarios, un cáncer de próstata, un cáncer de cabeza o de cuello; un trastorno proliferante elegido entre el conjunto formado por una restinosis, una fibrosis, una psoriasis, una osteoartritis y una artritis reumatoide; una diabetes, una enfermedad autoinmune, un trastorno inflamatorio y una angiogénesis.

3. Composiciones farmacológicas y aplicaciones terapéuticas

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene un compuesto o una sal, descritos en la presente, y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

A. Vías de administración

Tal como se emplea en esta descripción, "administrar" o "administración" significa la entrega de un compuesto, sal o profármaco de la presente invención o de una composición farmacológica que contenga un compuesto, una sal o un profármaco de esta invención, a un organismo con el fin de prevenir o tratar un trastorno relacionado con la PK.

Las vías apropiadas de administración pueden incluir, sin limitarse a ellas: la administración oral, rectal, transmucosa o intestinal; o la inyección intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.

Como alternativa, se puede administrar el compuesto en un modo más local que sistémico, por ejemplo mediante la inyección directa de un compuesto a un tumor sólido, a menudo en forma de "depot" o de formulación de liberación persistente.

Además se puede administrar el fármaco en un sistema de entrega intencionado del fármaco, por ejemplo en un liposoma que esté recubierto con un anticuerpo específico del tumor. Los liposomas pueden ser detectados y absorbidos selectivamente por el tumor.

B. Composición/formulación

Las composiciones farmacológicas de la presente invención pueden fabricarse por procesos ya conocidos de la técnica; p.ej. mediante un proceso convencional de mezclado, disolución, granulación, prensado de grageas, levigación, emulsionado, encapsulado, oclusión o liofilización.

Las composiciones farmacológicas para el uso según la presente invención pueden formularse, por tanto, de un modo convencional empleando uno o varios vehículos fisiológicamente aceptables, que comprenden excipientes y adyuvantes que facilitan el procesado de los compuestos activos en los preparados que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación idónea dependerá de la vía de administración que se elija.

Para la inyección, los compuestos de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, con preferencia en tampones fisiológicamente compatibles, por ejemplo la solución de Hank, la solución de Ringer o un tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosa pueden emplearse en la formulación penetrantes apropiados para atravesar la barrera de la mucosa. Tales penetrantes son conocidos en general en la técnica.

Para la administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente combinando los compuestos activos con excipientes farmacéuticamente aceptables, bien conocidos en la técnica. Tales excipientes permiten la formulación de los compuestos de la invención en tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, emulsiones, suspensiones y similares, para que el paciente a tratar puede ingerirlos oralmente. Los preparados farmacológicos para el uso oral pueden fabricarse empleando un excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los adyuvantes idóneos, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de gragea. Los excipientes idóneos son, en concreto, cargas de relleno, tales como azúcares, incluidas la lactosa, la sucrosa, la manita y la sorbita; los preparados de celulosa, por ejemplo el almidón de maíz, el almidón de trigo, el almidón de arroz, el almidón de patata, la gelatina, la goma tragacanto, la metilcelulosa, la hidroxipropilmetilcelulosa, la carboximetilcelulosa sódica y/o la polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea pueden añadirse elementos desintegrantes, por ejemplo polivinilpirrolidona reticulada, goma agar o ácido algínico o una sal del mismo, por ejemplo el alginato sódico.

Los núcleos de grageas se dotan de las envolturas apropiadas. A tal efecto pueden utilizarse soluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel Carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca o barniz y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes apropiados. Pueden añadirse a las envolturas de las tabletas o grageas colorantes o pigmentos para identificar o caracterizar las diferentes combinaciones de dosis del principio activo.

Las composiciones farmacológicas que pueden utilizarse por vía oral incluyen las cápsulas de tipo empuje-encaje (push-fit), fabricadas con gelatina, así como las cápsulas blandas selladas, fabricadas con gelatina y un plastificante, por ejemplo la glicerina o la sorbita. Las cápsulas empuje-encaje pueden contener los ingredientes activos mezclados con cargas de relleno, por ejemplo lactosa, aglutinantes, por ejemplo almidones y/o lubricantes, por ejemplo talco o estearato magnésico y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos apropiados, por ejemplo aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Pueden añadirse además estabilizantes.

Todas las formulaciones para la administración oral deberían presentarse en dosis idóneas para tal administración.

Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de tabletas o pastillas, formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación, los compuestos a utilizar según la presente invención se administran de modo conveniente en forma de nebulizador aerosol, a partir de un bote o nebulizador presurizado, empleando el propelente adecuado, p.ej. el diclorodifluormetano, el triclorofluormetano, el diclorotetrafluoretano, el dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse mediante una válvula que entregue una cantidad calibrada. Las cápsulas o cartuchos por ejemplo de gelatina para usar en un inhalador o insuflador pueden formularse para que contengan una mezcla pulverulenta del compuesto y una base polvo adecuada, por ejemplo lactosa o almidón.

Los compuestos pueden formularse para la administración parenteral por inyección, p.ej. por inyección de bolo o por infusión continua. Las formulaciones para la inyección pueden presentarse en forma de dosis unitaria, p.ej. en ampollas o en envases multidosis, que lleven incorporado un conservante. Las composiciones pueden adoptar la forma de suspensión, solución o emulsión en vehículos aceitosos o acuosos y pueden agentes auxiliares de formulación, por ejemplo agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las composiciones farmacológicas para la administración parenteral incluyen las soluciones acuosas de los compuestos activos en una forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse en forma de suspensiones inyectables aceitosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos idóneos incluyen los aceites grasos, por ejemplo el aceite de sésamo, o los ésteres sintéticos de ácidos grasos, por ejemplo el oleato de etilo o los triglicéridos, o los liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, por ejemplo la carboximetilcelulosa sódica, la sorbita o el dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener además estabilizantes idóneos o agentes que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la fabricación de soluciones muy concentradas.

Como alternativa, el ingrediente activo puede adoptar la forma de polvo para reconstitución antes del uso con un vehículo idóneo, p.ej. agua estéril libre de pirógenos.

Los compuestos pueden formularse también en forma de composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, p.ej. que contienen bases de supositorio convencionales, por ejemplo manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos pueden formularse también en forma de preparado "depot". Estas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Los compuestos pueden formularse por ejemplo con materiales poliméricos o hidrófobos idóneos (por ejemplo en forma de emulsión en un aceite aceptable) o con resinas de intercambio iónico o en forma de derivados de solubilidad escasa, por ejemplo en forma de una sal de solubilidad escasa.

Las composiciones farmacológicas presentes pueden contener además excipientes o vehículos idóneos, sólidos o en fase gel. Los ejemplos de tales excipientes o vehículos incluyen pero no se limitan a: carbonato cálcico, fosfato cálcico, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros, por ejemplo polietilenglicoles.

Muchos de los compuestos moduladores de las PK de la invención pueden proporcionarse en forma de sales fisiológicamente aceptables, en las que el compuesto reivindicado puede constituir la especie cargada negativamente o positivamente. Los ejemplos de sales, en las que el compuesto forma el resto cargado positivamente, incluyen pero no se limitan a: amonio cuaternario (definido anteriormente), sales como el clorhidrato, el sulfato, el carbonato, el lactato, el tartrato, el maleato, el succinato, etc., formadas por reacción de un grupo amino con el ácido apropiado. Las sales, en las que el compuesto forma la especie cargada negativamente, incluyen pero no se limitan a: las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio, formadas por reacción de un grupo ácido carboxílico de la molécula con la base apropiada (p.ej. hidróxido sódico (NaOH), hidróxido potásico (KOH), hidróxido cálcico (Ca(OH)_{2}), etc.).

C. Dosificación

Las composiciones farmacológicas idóneas para el uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito buscado.

De forma más específica, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de un compuesto que es eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto tratado.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la incumbencia de los expertos en la materia, en especial a la luz de la descripción detallada que se facilita seguidamente.

Para cualquier compuesto utilizado en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de los ensayos con cultivos celulares. A continuación puede formularse la dosificación para el uso en modelos animales, de modo que se logre un intervalo de concentraciones circulantes que incluya la IC_{50} ya determinada en el cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto a ensayar que logra una inhibición semimáxima de la actividad de la PK). Tal información puede utilizarse después para determinar con mayor precisión las dosis útiles para los humanos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos descritos en la presente pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales experimentales, p.ej. para determinar la LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción entre la LD_{50} y la ED_{50}. Son preferidos los compuestos que poseen índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos en cultivos celulares y en estudios con animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosis
destinado a pacientes humanos. La dosificación de tales compuestos se sitúa con preferencia en el intervalo de concentraciones circulantes que incluye la ED_{50} con toxicidad escasa o nula. La dosificación puede variar dentro de amplios márgenes, en función de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación, la vía de administración y la dosificación exactas podrán elegirse por parte del médico concreto en vista del estado de salud del paciente (véase p.ej. Fingl y col., "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 1975, cap. 1, p. 1).

La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse de forma individual para proporcionar niveles en plasma del resto activo, que sean suficientes para mantener los efectos de modulación de la quinasa, o bien una concentración eficaz mínima (MEC). La MEC variará para cada compuesto, pero puede estimarse a partir de los datos "in vitro"; p.ej. la concentración necesaria para lograr una inhibición del 50-90% de la quinasa utilizando los ensayos descritos en la presente. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Sin embargo pueden utilizarse ensayos HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones en plasma.

Los intervalos de dosificación empleados pueden determinarse también empleando el valor de la MEC. Los compuestos deberían administrarse empleando un régimen que mantenga niveles en plasma por encima de la MEC durante un 10-90% del tiempo, con preferencia entre el 30 y el 90% y con preferencia especial entre el 50 y el 90%.

En los casos de administración local o toma selectiva,la concentración local eficaz del fármaco puede no guardar relación con la concentración en plasma.

La cantidad de composición administrada dependerá, obviamente, del sujeto a tratar, del peso del sujeto, de la gravedad de la dolencia, de la manera de administración y del criterio del facultativo que firma la receta.

D. Envase

Si se desea, las composiciones pueden presentarse en un envase o en un dispositivo dispensador, por ejemplo un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o varias formas de dosificación unitaria, que contengan el ingrediente activo. El envase puede constar por ejemplo de una lámina de plástico o de metal, por ejemplo un envase de tipo blíster. El envase o dispositivo dispensador pueden acompañarse con la hoja de instrucciones de administración. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado además de una hoja informativa pegada sobre el recipiente en una forma prescrita por la agencia gubernativa que regula la fabricación, uso y venta de productos farmacéuticos, dicho hoja informativa deberá reflejar la aprobación de la agencia en la forma de composiciones o de administración humana o veterinaria. Dicha hoja informativa puede ser, por ejemplo, del tipo de una etiqueta aprobada por la Foods and Drug Administration de EE.UU. para la prescripción de fármacos o del tipo de folletín aprobado adjunto al producto. Las composiciones que contienen un compuesto de la invención formulado en un vehículo o excipiente farmacéuticamente compatible pueden además fabricarse, colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una enfermedad indicada. Las enfermedades apropiadas que se indican en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un tumor, la inhibición de la angiogénesis, el tratamiento de la fibrosis, de la diabetes y similares.

4. Síntesis

Los compuestos de la invención así como los 2-oxindoles y aldehídos, que son productos previos de síntesis, pueden obtenerse fácilmente empleando técnicas bien conocidas de la química. Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que se dispone de otras vías de síntesis para generar los compuestos de la invención y que las siguientes se facilitan únicamente a título de ejemplo y no son limitantes.

Procedimiento general de síntesis

Puede emplearse la siguiente metodología general para obtener los compuestos de esta invención.

Se mezclan los 2-oxindoles oportunamente sustituidos (1 equiv.), los aldehídos oportunamente sustituidos (1,2 equiv.) y la piperidina (0,1 equiv.) con etanol (1-2 ml/mmol de 2-oxindol) y después se calienta la mezcla a 90ºC durante un período de 3 a 5 horas. Se enfría la mezcla reaccionante, se concentra y se acidifica hasta pH 3. Se filtra el precipitado formado, se lava con agua hasta pH 7 y después con etanol frío, acetato de etilo y/o hexano y se seca con vacío, obteniéndose el compuesto deseado. Opcionalmente puede seguir purificándose el producto por cromatografía.

Aldehídos

Los aldehídos útiles para la síntesis de los compuestos de esta invención pueden obtenerse por numerosos procedimientos de síntesis, bien conocidos de los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden aplicar los procedimientos descritos en las siguientes publicaciones para obtener algunos de los aldehídos de esta invención:

J. Med. Chem. 36(23), 3674-3685, 1993;

Chem. Commun. 393, 1966;

Chem. Heterocycl. Compd. (EN) 10, 50-52, 1974; y

J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:EN, 1237-1243, 1974.

En la tabla 2 se recoge una lista de aldehídos adicionales que pueden utilizarse para obtener los compuestos de esta invención.

5. Evaluación biológica

Se apreciará que, en cualquier serie determinada de compuestos, se obtendrá un espectro de actividades biológicas. En sus formas preferidas de ejecución, esta invención se refiere a nuevas 2-indolinonas que poseen la capacidad de modular la actividad de las RTK, CTK y STK. Los siguientes ensayos se emplean para seleccionar aquellos compuestos que presentan la actividad deseada en un grado óptimo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

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Procedimientos de ensayo

Pueden utilizarse los siguientes ensayos "in vitro" para determinar el nivel de actividad y el efecto de los diferentes compuestos de la presente invención en una o varias PK. Pueden diseñarse ensayos similares sobre la misma base para cualquier PK, empleando métodos bien conocidos de la técnica.

Los ensayos celulares/catalíticos descritos se efectúan en un formato ELISA. El procedimiento general es el siguiente: se introduce un compuesto en células que expresan la quinasa a ensayar, ya sea de forma natural o recombinante, durante un cierto período de tiempo, después del cual, si la quinasa a ensayar es un receptor, se añade un ligando conocido para activar el receptor. Se lisan las células y se transfiere el material lisado a los hoyos de una placa ELISA recubiertos previamente con un anticuerpo específico que reconozca el sustrato de la reacción de fosforilación enzimática. Se eliminan por lavado los componentes del lisado celular que no pertenecen al sustrato y se detecta la cantidad de fosforilación del sustrato con un anticuerpo que reconozca específicamente la fosfotirosina y se compara con las células de control que no se han puesto en contacto con el compuesto ensayado.

Los ensayos celulares/biológicos descritos miden la cantidad de DNA generado en respuesta a la actividad de la quinasa a ensayar, lo cual es una medición general de la respuesta proliferante. El procedimiento general de este ensayo es el siguiente: se introduce un compuesto en células que expresan la quinasa a ensayar, ya sea de modo natural o recombinante, durante un cierto período de tiempo, después del cual, si la quinasa a ensayar es un receptor, se añade un ligando conocido para activar el receptor. Después de una incubación de por lo menos una noche se añade un reactivo para marcar el DNA, por ejemplo la bromodesoxi-uridina (BrdU) o la 3H-timidina. Se detecta la cantidad de DNA marcado ya sea con anticuerpo anti-BrdU, ya sea midiendo la radiactividad y se compara con las células de control que no se han puesto en contacto con el compuesto ensayado.

1. Ensayos celulares/catalíticos

Pueden utilizarse ensayos inmunosorbentes ligados aenzimas (ELISA) para detectar y medir la presencia de la actividad de las PK. El ensayo ELISA puede realizarse con arreglo a métodos ya conocidos, descritos por ejemplo por Voller y col., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", en Manual of Clinical Immunology, 2ª edición, 1980, coordinado por Rose y Friedman, pp. 359-371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.

El método descrito puede adaptarse para determinar la actividad con respecto a una PK específica. Por ejemplo, se facilitan seguidamente métodos preferidos para llevar a cabo los ensayos ELISA de PK específicas. La adaptación de estos métodos para determinar la actividad de un compuesto sobre otros miembros de la familia de las RTK, así como de las CTK y de las STK, es algo que puede abordarse con el acervo de conocimientos de los expertos en la materia.

a. FLK-1

Se realiza un ensayo ELISA para medir la actividad de la quinasa del receptor de la FLK-1 y, de modo más específico, la inhibición o la activación de la actividad de la TK en el receptor de la FLK-1. Se realiza específicamente el siguiente ensayo para determinar la actividad de quinasa del receptor de la FLK-1 en células diseñadas genéticamente para expresar la Flk-1.

Materiales y métodos

Materiales. Se utilizan los siguientes reactivos y materiales.

a. placas ELISA de 96 hoyos de Corning (Corning, nº de catálogo: 25805-96);

b. IgG de cabra anti-conejo de Cappel (nº de catálogo: 55641);

c. PBS (Gibco, nº de catálogo: 450-1300EB);

d. tampón TBSW (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl y 0,1% de Tween-20);

e. etanolamina patrón (etanolamina del 10% (pH 7,0), almacenada a 4ºC);

f. tampón HNTG (20 mM tampón HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2% de Triton X-100 y 10% de glicerina);

g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) en forma de patrón 100X);

h. ortovanadato sódico (0,5 M en forma de patrón 100X);

i. pirofosfato sódico (0,2 M, en forma de patrón 100X);

j. placas NUNC de polipropileno de 96 hoyos de fondo V (Applied Scientific, nº de catálogo: AS-72092);

k. células NIH3T3 C7#3 (células que expresan FLK-1);

l. DMEM con L-glutamina 1X alta en glucosa, nº de catálogo: 11965-050);

m. FBS, Gibco (nº de catálogo: 16000-028);

n. L-glutamina, Gibco (nº de catálogo: 25030-016);

o. VEGF, PeproTech. Inc. (nº de catálogo: 100-20) (guardado como patrón 1 \mug/100 \mul en H_{2}O destilada Milli-Q y almacenado a -20ºC);

p. antisuero anti-FLK-1 purificado por afinidad;

q. anticuerpo monoclonal UB40, específico de la fosfotirosina (ver Fendley y col., Cancer Research 50, 1550-1558, 1990);

r. IgG-POD de cabra anti-ratón, calidad EIA (BioRad, nº de catálogo: 172-1011);

s. solución del ácido 2,2-azino-bis-(3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfónico) (ABTS) (100 mM ácido cítrico (anhidro), 250 mM Na_{2}HPO_{4} (pH 4,0), 0,5 mg/ml de ABTS (Sigma, nº de catálogo: A-1888)), esta solución debe guardarse en la oscuridad a 4ºC, hasta el momento de su utilización;

t. H_{2}O_{2} (solución al 30%) (Fisher, nº de catálogo: H325);

u. ABTS/H_{2}O_{2} (15 ml de solución de ABTS, 2 \mul de H_{2}O_{2}) preparado 5 minutos antes del uso y mantenido a temperatura ambiente;

v. HCl patrón, 0,2 M en H_{2}O;

w. sulfóxido de dimetilo (100%) (Sigma, nº de catálogo: D-8418); e

y. tripsina-EDTA (Gibco BRL, nº de catálogo: 25200-049).

Procedimiento. Se emplea el siguiente procedimiento para realizar el ensayo:

1. Se recubren las placas ELISA de 96 hoyos de Corning con 1,0 \mug por hoyo del anticuerpo IgG anti-conejo de Cappel en 0,1 M Na_{2}CO_{3} de pH 9,6. Se completa un volumen final de 150 \mul en cada hoyo. Se recubren las placas a 4ºC durante una noche. Las placas pueden guardarse por lo menos durante dos semanas, si se almacenan a 4ºC.

2. Se cultivan las células en medio de crecimiento (DMEM, suplementado con 2,0 mM L-glutamina, 10% de FBS) en platos de cultivo apropiados, hasta que sean confluyentes a 37ºC, con un 5% de CO_{2}.

3. Se recolectan las células por tripsinización y se siembran en placas de poliestireno Corning 25850 de 96 hoyos de fondo redondo, con 25.000 células/hoyo en 200 \mul de medio de crecimiento.

4. Se cultivan las células por lo menos durante un día a 37ºC, 5% de CO_{2}.

5. Se lavan las células con D-PBS 1X.

6. Se añaden 200 \mul/hoyo de medio de desnutrición (DMEM, 2,0 mM L-glutamina, 0,1% de FBS). Se incuba a 37ºC durante una noche, 5% de CO_{2}.

7. Se diluyen los compuestos 1:20 en placas de polipropileno de 96 hoyos empleando medio de desnutrición. Se diluye el sulfóxido de dimetilo 1:20 para utilizar en los hoyos de control.

8. Se saca el medio de desnutrición de las placas de cultivo celular de 96 hoyos y se añaden 162 \mul de medio de desnutrición recién preparado a cada hoyo.

9. Se añaden 18 \mul de una dilución del compuesto diluido 1:20 (de la etapa 7) a cada hoyo más la dilución 1:20 del sulfóxido de dimetilo a los hoyos de control (+/- VEGF), hasta una dilución final de 1:200 después de la estimulación celular. La concentración final del sulfóxido de dimetilo es del 0,5%. Se incuba la placa a 37ºC, 5% de CO_{2} durante dos horas.

10. Se retira el anticuerpo no fijado de las placas ELISA por inversión de la placa para sacar el líquido. Se lava 3 veces con TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Se golpea suavemente la placa sobre una servilleta de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

11. Se bloquean las placas con TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0, 150 \mul por hoyo. Se incuba la placa durante treinta minutos, al tiempo que se agita sobre un agitador de placas de microvaloración.

12. Se lava la placa 3 veces del modo descrito en la etapa 10.

13. Se añaden a cada hoyo 0,5 \mug de antisuero de conejo policlonal anti-FLU-1 purificado por afinidad. Se ajusta el volumen final a 150 \mul/hoyo con TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Se incuba la placa durante treinta minutos con agitación.

14. Se añaden 180 \mul de medio de desnutrición a las células y se estimulan las células con 20 \mul/hoyo de una solución 10,0 mM de ortovanato sódico y 500 ng/ml de VEGF (resultando una concentración final de 1,0 mM de ortovanato sódico y 50 ng/ml de VEGF por hoyo) a 37ºC durante ocho minutos, 5% de CO_{2}. Los hoyos de control negativo reciben únicamente el medio de desnutrición.

15. Pasados ocho minutos se sacan los medios de las células y se lavan una vez con 200 \mul/hoyo de PBS.

16. Se lisan las células en 150 \mul/hoyo de HNTG con agitación a temperatura ambiente durante cinco minutos. La formulación HNTG incluye el ortovanadato sódico, pirofosfato sódico y EDTA.

17. Se lava la placa ELISA tres veces del modo descrito en la etapa 10.

18. Se trasvasan los lisados celulares de la placa de las células a la placa ELISA y se incuba con agitación durante dos horas. Se trasvasa el lisado celular por pipeteo, rascando los hoyos.

19. Se lava la placa tres veces del modo descrito en la etapa 10.

20. Se incuba la placa ELISA con 0,02 \mug/hoyo de UB40 en TBSW + 0,5% de etanolamina. Se ajusta el volumen final a 150 \mul/hoyo. Se incuba con agitación durante 30 minutos.

21. Se lava la placa tres veces del modo descrito en la etapa 10.

22. Se incuba la placa ELISA con IgG de cabra anti-ratón de tipo EIA, diluida 1:10.000, conjugada con peroxidasa de rábano rusticano en TBSW + 0,5% de etanolamina, pH 7,0. Se ajusta el volumen final a 150 \mul/hoyo. Se incuba con agitación durante treinta minutos.

23. Se lava la placa del modo descrito en la etapa 10.

24. Se añaden 100 \mul de solución ABTS/H_{2}O_{2} a cada hoyo. Se incuba durante diez minutos con agitación.

25. Se añaden 100 \mul de HCl 0,2 M para lograr una concentración final 0,1 M de HCl para interrumpir la reacción de revelado de color. Se agita durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se eliminan las burbujas con una suave corriente de aire y se lee la placa ELISA en un lector de placas ELISA a 410 nm.

b. HER-2 ELISA

Ensayo 1

Ensayo de receptor EGF-receptor quimérico HER2 en células completas

Se determina la actividad de la HER2-quinasa en células EGFR-NIH3T3 completas del modo siguiente:

Materiales y reactivos. Se utilizan los siguientes materiales y reactivos para efectuar el ensayo:

a. EGF: concentración patrón: 16,5 ILM; EGF 201, TOYOBO Co. Ltd., Japón.

b. 05-101 (UBI) (un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular del EGFR).

c. anticuerpo anti-fosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal) (véase Fendley y col., ya citado).

d. anticuerpo de detección: IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano rusticano, TAGO Inc., Burlingame, CA.

e. tampón TBST:

Tris-HCl, pH 7,2	50 mM
NaCl	150 mM
Triton X-100	0,1

f. HNTG 5X patrón:

HEPES	0,1 M
NaCl	0,75 M
glicerina	50%
Triton X-100	1,0%

g. ABTS patrón:

ácido cítrico	100 mM
Na_{2}HPO_{4}	250 mM
HCl conc.	0,5 pM
ABTS*	0,5 mg/ml
* (2,2'-azinobis(ácido 3-etilbenzotiazolinasulfónico)).

Se mantiene la solución en la oscuridad a 4ºC hasta el momento del uso.

h. Reactivos patrón de:

EDTA 100 mM, pH 7,0

Na_{3}VO_{4} 0,5 M

Na_{4}(P_{2}O_{7}) 0,2 M

Procedimiento. Se aplica el procedimiento siguiente:

A. Recubrimiento previo de la placa ELISA

1. Se recubren placas ELISA (Corning, 96 hoyos, nº de catálogo: 25805-96) con el anticuerpo 05-101 a razón de 0,5 g por hoyo en PBS, volumen final/hoyo: 100 \mul, y se almacena a 4ºC durante una noche. Las placas recubiertas son buenas durante 10 días, si se mantienen guardadas a 4ºC.

\newpage

2. El día de su utilización se quita el tampón de recubrimiento y se sustituye por 100 \mul de tampón de bloqueo (leche desnatada en polvo Carnation Instant al 5% en PBS). Se incuba la placa, se agita a temperatura ambiente(entre 23 y 25ºC) durante 30 minutos. Inmediatamente antes del uso se quita el tampón de bloqueo y se lava la placa 4 veces con tampón TBST.

B. Siembra de células

1. Para este ensayo puede utilizarse la línea celular NIH3T3 que sobreexpresa un receptor quimérico que contiene el dominio extracelular EGFR y el dominio intracelular de la HER2-quinasa.

2. Para el ensayo se eligen platos que tengan una confluencia del 80-90%. Se tripsinizan las células y se interrumpe la reacción añadiendo un 10% de suero fetal bovino. Se suspenden las células en medio DMEM (CS al 10% en medio DMEM) y se centrifuga una vez a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos.

3. Se resuspenden las células en el medio de siembra (DMEM, al 0,5% en suero bovino) y se cuentan las células empleando azul tripano. La viabilidad superior al 90% es aceptable. Se siembran las células en medio DMEM (0,5% en suero bovino) en una densidad de 10.000 células por hoyo, 100 \mul por hoyo, en una placa de microvaloración de 96 hoyos. Se incuban las células en un 5% de CO_{2} a 37ºC durante 40 horas.

C. Procedimientos de ensayo

1. Se examina con un microscopio invertido si las células sembradas están contaminadas. Se diluye el fármaco patrón (10 mg/ml en DMSO) 1:10 en medio DMEM, después se transfieren 5 \mul a un hoyo TBST hasta una dilución final de fármaco 1:200 y una concentración final de DMSO del 1%. En los hoyos de control se introduce únicamente DMSO. Se incuba en un 5% de CO_{2} a 37ºC durante dos horas.

2. Se prepara el ligando EGF: se diluye el EGF patrón en DMEM de tal manera que después se trasvasar 10 \mul de EGF diluido (dilución 1:12) se logre una concentración final de 100 nM.

3. Se prepara HNTG* fresco suficiente para 100 \mul por hoyo y se coloca sobre hielo.

HNTG* (10 ml):
HNTG patrón	2,0 ml
H_{2}O milli-Q	7,3 ml
EDTA, 100 mM, pH 7,0	0,5 ml
Na_{3}VO_{4}, 0,5 M	0,1 ml
Na_{4}(P_{2}O_{7}), 0,2 M	0,1 ml

4. Pasados 120 minutos de incubación con el fármaco se añade el ligando SGF preparado a las células, 10 \mul por hoyo, hasta una concentración final de 100 nM. En los hoyos de control se introduce únicamente el DMEM. Se incuba con agitación a temperatura ambiente durante 5 minutos.

5. Se eliminan el fármaco, el EGF y el DMEM. Se lavan las células dos veces con PBS. Se transfiere el HNTG* a las células, 100 \mul por hoyo. Se coloca sobre hielo durante 5 minutos. A continuación se elimina el tampón de bloqueo de otra placa ELISA y se lava con TBST del modo descrito antes.

6. Con una pipeta, fijada con seguridad a un aparato de micropipeteo, se rascan las células de la placa y se homogeneíza el material celular aspirando repetidamente y dispensando el tampón de lisis HNTG*. Se transfiere el lisado a una placa ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante una
hora.

7. Se retira el lisado y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo anti-Ptyr recién diluido a una placa ELISA a razón de 100 \mul por hoyo. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos en presencia del antisuero anti-Ptyr (dilución 1:3000 en TBST).

8. Se quita el anticuerpo anti-Ptyr y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo IgG anti-conejo TAGO recién diluido a la placa ELISA a razón de 100 \mul por hoyo. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos (dilución 1:3000 del anticuerpo IgG anti-conejo en TBST).

9. Se elimina el anticuerpo de detección TAGO y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere la solución de ABTS/H_{2}O_{2} recién preparada a la placa ELISA, 100 \mul por hoyo. Se incuba con agitación a temperatura ambiente durante 20 minutos (solución de ABST/H_{2}O_{2}: 1,0 \mul de H_{2}O_{2} del 30% en 10 ml de ABTS patrón).

10. Se interrumpe la reacción añadiendo 50 \mul de H_{2}SO_{4} 5N (opcional) y se determina la densidad óptica (O.D.)a 410 nm.

11. Se determina la señal de fosfotirosina máxima restando el valor de los controles negativos de los controles positivos. A continuación se calcula la inhibición porcentual del contenido en fosfotirosina de los hoyos que contienen extractos, después de haber restado los controles negativos.

c. PDGF-R ELISA

Todos los medios de cultivo celular, la glutamina y el suero fetal bovino se adquieren en Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), a menos que se indique lo contrario. Todas las células se cultivan en atmósfera húmeda con un 90-95% de aire y un 5-10% de CO_{2} a 37ºC. Todas las líneas celulares se subcultivan de forma rutinaria dos veces por semana y son negativas en micoplasma, según las determinaciones realizadas por el método Mycotect (Gibco).

Para los ensayos ELISA se cultivan células (U1242, obtenidas de Joseph Schlessinger, NYU) hasta una confluencia del 80-90% en medio de crecimiento (MEM con un 10% de FBS, NEAA, 1 mM NaPyr y 2 mM GLN) y se siembran en placas de cultivo de tejido de 96 hoyos en un 0,5% de suero, a razón de 25.000 a 30.000 células por hoyo. Después de una noche de incubación en un medio que contiene un 0,5% de suero se cambian las células a un medio exento de suero y se tratan con el compuesto a ensayar en un incubador a 37ºC durante 2 h en un 5% de CO_{2}. A continuación se estimulan las células con ligando durante 5-10 minutos y después se lisan con HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 10% de glicerina, 5 mM EDTA, 5 mM Na_{3}VO_{4}, 0,2% de Triton X-100 y 2 mM NaPyr). Se transfieren los lisados celulares (0,5 mg/hoyo en PBS) a placas ELISA que se han recubierto previamente con un anticuerpo específico de receptor y que se han bloqueado con un 5% de leche en TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl y 0,1% de Triton X-100) a temperatura ambiente durante 30 min. Se incuban los lisados a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Se lavan las placas con TBST cuatro veces y después se incuban con anticuerpo policlonal anti-fosfotirosina a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se elimina el exceso de anticuerpo anti-fosfotirosina enjuagando la placa con TBST cuatro veces. Se añade el anticuerpo IgG de cabra anti-conejo a la placa ELISA a temperatura ambiente durante 30 min y después se enjuaga con TBST cuatro veces más. Se añade a las placas ELISA el ABTS (100 mM ácido cítrico, 250 mM Na_{2}HPO_{4} y 0,5 mg/ml de 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)) más H_{2}O_{2} (1,2 ml de H_{2}O_{2} del 30% a 10 ml de ABTS) para iniciar el revelado del color. Pasados de 15 a 30 min de la adición del ABTS se registra la absorbancia a 410 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm.

d. ELISA del receptor IGF-I

Puede utilizarse el siguiente procedimiento para medir el nivel de fosfotirosina en el receptor IGF-I, que indica la actividad de tirosina-quinasa del receptor IGF-I.

Materiales y reactivos. Se utilizan los siguientes materiales y reactivos:

a. La línea celular que se utiliza en este ensayo es la 3T3/IGF-1R, una línea celular de ingeniería genética que sobreexpresa el receptor IGF-1.

b. Se cultiva la NIH3T3/IGF-1R en un incubador a 37ºC con un 5% de CO_{2}. El medio de crecimiento es DMEM + 10% de FBS (inactivado con calor) + 2 mM L-glutamina.

c. Anticuerpo 17-69 anti-IGF-1R purificado por afinidad

d. D-PBS:

KH_{2}PO_{4}	0,20 g/l
K_{2}HPO_{4}	2,16 g/l
KCl	0,20 g/l
NaCl	8,00 g/l (pH 7,2)

e. Tampón de bloqueo: TBST más un 5% de leche (leche desnatada en polvo Carnation Instant).

f. Tampón TBST:

Tris-HCl	50 mM
NaCl	150 mM (pH 7,2/HCl 10N)
Triton X-100	0,1%

Se prepara una solución patrón de TBS (10X) y se añade Triton X-100 al tampón durante la dilución.

g. Tampón HNTG:

HEPES	20 mM
NaCl	150 mM (pH 7,2/HCl 1N)

glicerina	10%
Triton X-100	0,2%

Se prepara la solución patrón (5X) y se mantiene a 4ºC.

h. EDTA/HCl: 0,5 M, pH 7,0 (NaOH) en forma de patrón 100X.

i. Na_{3}VO_{4}: 0,5 M en forma de patrón 100X y partes alícuotas se guardan a -80ºC.

j. Na_{4}P_{2}O_{7}: 0,2 M en forma de patrón 100X.

k. Factor de crecimiento 1, similar a la insulina, de Promega (nº de catálogo: G5111).

l. Antisuero policlonal anti-fosfotirosina de conejo.

m. IgG de cabra anti-conejo, conjugado con POD(anticuerpo de detección), Tago (nº de cat. 4520, lote nº 1802): Tago Inc., Burlingame, CA.

n. Solución de ABTS (2,2'-azinobis(ácido 3-etilbenzotizolinasulfónico)):

ácido cítrico	100 mM
Na_{2}HPO_{4}	250 mM (pH 4,0/HCl 1N)
ABTS	0,5 mg/ml

Se guarda la solución de ABTS en la oscuridad a 4ºC. La solución tiene que desecharse si vira al verde.

o. Peróxido de hidrógeno: solución al 30% que se guarda en la oscuridad a 4ºC.

Procedimiento. Todos los pasos que siguen se realizan a temperatura ambiente, a menos que se indique expresamente lo contrario. Todos los lavados de la placa ELISA se efectúan por enjuague de la placa con agua del grifo tres veces y después un enjuague con TBST. Se seca la placa golpeándola suavemente sobre servilletas de papel.

A. Siembra de las células

1. Las células, que se han cultivado en platos de cultivo de tejido (Corning 25020-100) hasta una confluencia del 80-90%, se recolectan con tripsina-EDTA (0,25%, 0,5 ml/D-100, GIBCO).

2. Se resuspenden las células en DMEM + 10% de FBS + 2 mM L-glutamina fresco y se transfieren a placa de cultivo de tejido de 96 hoyos (Corning, 25806-96) a razón de 20.000 células/hoyo (100 \mul/hoyo). Se incuba durante 1 día y después se sustituye el medio por un medio exento de suero (90/\mul) y se incuba a 37ºC durante una noche con un 5% de CO_{2}.

B. Recubrimiento y bloqueo de la placa ELISA

1. Se recubre la placa ELISA (Corning 25805-96) con anticuerpo anti-IGF-1R a razón de 0,5 \mug/hoyo en 100 \mul de PBS por lo menos durante 2 horas.

2. Se quita la solución de recubrimiento y se sustituye por 100 \mul de tampón de bloqueo y se agita durante 30 minutos. Se retira el tampón de bloqueo y se lava la placa inmediatamente antes de añadir el lisado.

C. Procedimientos de ensayo

1. Se ensayan los fármacos en un estado libre de suero.

2. Se diluye el fármaco patrón (en DMSO del 100%) en proporción 1:10 con DMEM en una placa de polipropileno de 96 hoyos y se transfieren 10 \mul/hoyo de esta solución a las células para lograr una dilución final del fármaco de 1:100 y una concentración final de DMSO del 1,0%. Se incuban las células a 37ºC durante 2 horas en un 5% de CO_{2}.

3. Se prepara un tampón de lisis celular fresco (HNTG*)

HNTG	2 ml
EDTA	0,1 ml
Na_{3}VO_{4}	0,1 ml
Na_{4}(P_{2}O_{7})	0,1 ml
H_{2}O	7,3 ml

4. Después de dos horas de incubación del fármaco se transfieren 10 \mul/hoyo de ligando IGF-1 200 nM en PBS a las células (concentración final = 20 nM) y se incuba a 37ºC durante 10 minutos con un 5% de CO_{2}.

5. Se quitan los medios y se añaden 100 \mul/hoyo de HNTG* y se agita durante 10 minutos. Se observan las células con el microscopio para ver si están lisadas adecuadamente.

6. Se utiliza una pipeta de 12 canales para rascar las células de la placa y se homogeneíza el lisado por aspiración repetida y dispensado. Se transfieren todos los lisados a la placa ELISA recubierta con anticuerpo y se agita durante 1 hora.

7. Se quita el lisado, se lava la placa, se transfiere el anti-pTyr (1:3.000 en TBST) 100 \mul/hoyo y se agita durante 30 minutos.

8. Se quita el anti-pTyr, se lava la placa, se transfiere el TAGO (1:3.000 con TBST) 100 \mul/hoyo y se agita durante 30 minutos.

9. Se quita el anticuerpo de detección, se lava la placa y se transfiere ABTS/H_{2}O_{2} fresco (1,2 \mul de H_{2}O_{2} sobre 10 ml de ABTS) 100 \mul/hoyo a la placa para iniciar el revelado del color.

10. Se mide la O.D. a 410 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm con un aparato Dynatec MR5000.

e. ELISA de receptor EGF

Se determina la actividad de quinasa del receptor EGF en células de ingeniería genética para expresar el EGF-Rhumano del modo descrito a continuación:

Materiales y reactivos. Se emplean los siguientes materiales y reactivos.

a. Ligando EGF: concentración patrón = 16,5 \muM; EGF 201, TOYOBO Co. Ltd., Japón.

b. Anticuerpo 05-101 (UBI) (un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular del EGFR).

c. Anticuerpo anti-fosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal).

d. Anticuerpo de detección: IgG de cabra anti-conejo, conjugado con peroxidasa de rábano rusticano, TAGO Inc., Burlingame, CA.

e. Tampón TBST:

Tris-HCl, pH 7	50 mM
NaCl	150 mM
Triton X-100	0,1

f. Patrón 5X de HNTG:

HEPES	0,1 M
NaCl	0,75 M
glicerina	50
Triton X-100	1,0%

g. Patrón de ABTS:

ácido cítrico	100 mM
Na_{2}HPO_{4}	250 mM
HCl conc.	pH 4,0
ABTS*	0,5 mg/ml

Se mantiene la solución a 4ºC en la oscuridad hasta el momento de utilizarla.

h. Reactivos patrón de:

EDTA	100 mM, pH 7,0
Na_{3}VO_{4}	0,5 M
Na_{4}(P_{2}O_{7})	0,2 M

Procedimiento. Se utiliza el procedimiento siguiente.

A. Recubrimiento previo de la placa ELISA

1. Se recubren placas ELISA (Corning, 96 hoyos, nº de catálogo: 25805-96) con el anticuerpo 05-101 a razón de 0,5 \mug por hoyo en PBS, volumen final/hoyo: 150 \mul, y se almacena a 4ºC durante una noche. Las placas recubiertas son buenas durante 10 días, si se mantienen guardadas a 4ºC.

2. El día de su utilización se quita el tampón de recubrimiento y se sustituye por tampón de bloqueo (leche desnatada en polvo Carnation Instant al 5% en PBS). Se incuba la placa, se agita a temperatura ambiente (entre 23 y 25ºC) durante 30 minutos. Inmediatamente antes del uso se quita el tampón de bloqueo y se lava la placa 4 veces con tampón TBST.

B. Siembra de células

1. Para este ensayo puede utilizarse la línea celular NIH 3T3/C7 (Honegger y col., Cell 51, 199-209, 1987).

2. Se eligen para el ensayo los platos que tengan una confluencia del 80-90%. Se tripsinizan las células y se interrumpe la reacción añadiendo un 10% de CS en medio DMEM. Se suspenden las células en medio DMEM (CS al 10% en medio DMEM) y se centrifuga una vez a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos.

3. Se resuspenden las células en medio de siembra (DMEM, al 0,5% en suero bovino) y se cuentan las células empleando azul tripano. Es aceptable una viabilidad superior al 90%. Se siembran las células en medio DMEM (al 0,5% en suero bovino) con una densidad de 10.000 células por hoyo, 100 \mul por hoyo, en una placa de microvaloración de 96 hoyos. Se incuban las células sembradas en un 5% de CO_{2} a 37ºC durante unas 40 horas.

C. Procedimientos de ensayo

1. Se comprueba si las células sembradas están contaminadas empleando un microscopio invertido. Se diluye el fármaco patrón (10 mg/ml en DMSO) 1:10 en medio DMEM, después se transfieren 5 \mul al hoyo de ensayo para una dilución final del fármaco de 1:200 y una concentración final de DMSO del 1%. En los hoyos se control se introduce únicamente DMSO. Se incuba a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante una hora.

2. Se prepara el ligando EGF: se diluye el EGF patrón en DMEM de tal manera que después de transferir 10 \mul de EGF diluido (dilución 1:12) se logre una concentración final de 25 nM.

3. Se preparan 10 ml de HNTG* fresco, suficientes para 100 \mul por hoyo, dicho HNTG* consta de: HNTG patrón (2,0 ml), H_{2}O milli-Q (7,3 ml), EDTA 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na_{3}VO_{4} 0,5 M (0,1 ml) y Na_{4}(P_{2}O_{7}) 0,2 M (0,1 ml).

4. Se coloca sobre hielo.

5. Después de una incubación de dos horas con el fármaco se añade el ligando EGF preparado a las células, 10 \mul por hoyo, para obtener una concentración final de 25 nM. En los hoyos de control se deposita únicamente DMEM. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 5 minutos.

6. Se elimina el fármaco, el EGF y el DMEM. Se lavan las células dos veces con PBS. Se transfiere el HNTG* a las células, 100 \mul por hoyo. Se coloca sobre hielo durante 5 minutos. A continuación se elimina el tampón de bloqueo de otra placa ELISA y se lava con TBST del modo descrito antes.

7. Con una pipeta fijada con seguridad a un aparato de micropipeteo se rascan las células de la placa y se homogeneíza el material celular por aspiración repetida y dispensado del tampón de lisis HNTG*. Se transfiere el lisado a una placa ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante una hora.

8. Se quita el lisado y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo anti-Ptyr recién diluido a la placa ELISA, a razón de 100 \mul por hoyo. Se incuba con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos en presencia del suero anti-Ptyr (dilución 1:3000 en TBST).

9. Se saca el anticuerpo anti-Ptyr y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo IgG anti-conejo recién diluido con TAGO 30 a la placa ELISA a razón de 100 \mul por hoyo. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos (anticuerpo IgG anti-conejo, dilución 1:3000 en TBST).

10. Se saca el anticuerpo de detección y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere la solución ABTS/H_{2}O_{2} recién preparada a la placa ELISA, 100 \mul por hoyo. Se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Solución ABTS/H_{2}O_{2}: 1,2 \mul de H_{2}O_{2} del 30% en 10 ml de ABTS patrón.

11. Se interrumpe la reacción añadiendo 50 \mul de H_{2}SO_{4} 5N (opcional) y se determina la O.D. a 410 nm.

12. Se determina la señal máxima de fosfotirosina restando el valor de los controles negativos del de los controles positivos. A continuación se calcula la inhibición porcentual del contenido de fosfotirosina de los hoyos que contienen extracto, después de la sustracción de los controles negativos.

f. Ensayo ELISA de Met-autofosforilación

Con este ensayo se determina la actividad de Met-tirosina-quinasa analizando los niveles de tirosina-quinasa de la proteína Met en el receptor Met.

1. Reactivos

a. HNTG (solución patrón 5X): se disuelven 23,83 g de HEPES y 43,83 g de NaCl en unos 350 ml de H_{2}O destilada. Se ajusta el pH a 7,2 con HCl o NaOH, se añaden 500 ml de glicerina y 10 ml de Triton X-100, se mezclan, se añade H_{2}O destilada hasta un volumen total de 1 l. Para preparar 1 l de solución de trabajo 1X se añaden 200 ml de solución patrón 5X a 800 ml de H_{2}O destilada, se comprueba el pH y se ajusta si fuera necesario y se almacena a
4ºC.

b. PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco), Gibco, nº de catálogo: 450-1300EG (solución 1X).

c. Tampón de bloqueo: se cargan sobre 500 ml de H_{2}O destilada 100 g de BSA, 12,1 g de Tris, pH 7,5, 58,44 g de NaCl y 10 ml de Tween-20, se diluye hasta un volumen total de 1 l.

d. Tampón de quinasa: a 500 ml de H_{2}O destilada se le añaden 12,1 g de TRIS, pH 7,2, 58,4 g de NaCl, 40,7 g de MgCl_{2} y 1,9 g de EGTA; se completa hasta un volumen total de 1 l con H_{2}O destilada.

e. PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), Sigma, nº de catálogo: P-7626; a 435,5 mg se le añade etanol del 100% hasta un volumen total de 25 ml; vortex.

f. ATP (fuente bacteriana), Sigma, nº de catálogo: A-7699; se guarda el polvo a -20ºC; para preparar la solución lista para el uso se disuelven 3,31 mg en 1 ml de H_{2}O dest.

g. Anti-fosfotirosina conjugada con RC-20H HRPO, de Transduction Laboratories, nº de catálogo: E120H.

h. Turbo TMB (TM) para ELISA de 1 paso (3,3',5,5'-tetrametilbencidina), de Pierce, nº de catálogo: 34022.

i. H_{2}SO_{4}, se añade 1 ml del ácido conc. (18N) a 35 ml de H_{2}O dest.

j. TRIS-HCl, Fischer, nº de catálogo: BP152-5; a 121,14 g del material se le añaden 600 ml de H_{2}O Milli-Q, se ajusta el pH a 7,5 (ó 7,2) con HCl, se completa un volumen a 1 l añadiendo H_{2}O Milli-Q.

k. NaCl, Fischer, nº de catálogo: S271-10; se prepara una solución 5M.

l. Tween-20, Fischer, nº de catálogo: S337-500.

m. Na_{3}VO_{4}, Fischer, nº de catálogo: S454-50; a 1,8 g de material se le añaden 80 ml de H_{2}O Milli-Q, se ajusta el pH a 10,0 con HCl o NaOH, se hierve en microondas, se enfría, se comprueba el pH, se repite el procedimiento hasta que el pH sea estable e igual a 10,0, se añade H_{2}O Milli-Q hasta un volumen total de 100 ml, se divide en partes alícuotas de 1 ml y se almacena a -80ºC.

n. MgCl_{2}, Fischer, nº de catálogo: M33-500; se prepara una solución 1M.

o. HEPES, Fischer, nº de catálogo: BP310-500; a 200 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 59,6 g de material, se ajusta el pH a 7,5, se completa el volumen hasta un total de 250 ml, se filtra en condiciones estériles.

p. Albúmina bovina (BSA), Sigma, nº de catálogo: A-4503; a 30 gramos de material se le añade agua destilada estéril para completar un volumen total de 300 ml, se almacena a 4ºC.

q. Tampón TBST: a aprox. 900 ml de H_{2}O dest. en una probeta graduada de 1 l se les añaden 6,057 g de TRIS y 8,766 g de NaCl, una vez disueltos, se ajusta el pH a 7,2 con HCl, se añade 1,0 ml de Triton X-100 y se completa hasta un volumen total de 1 l con H_{2}O dest.

r. IgG de cabra anti-conejo purificado por afinidad (molécula completa), Cappel, nº de catálogo: 55641.

s. Anticuerpo IgG policlonal de conejo anti-h-Met (C-28), Santa Cruz Chemical, nº de catálogo: SC-161.

t. Células quiméricas EGFR/Met transfectadas transitoriamente (EMR), (Komada y col., Oncogene 8, 2381-2390, 1993).

u. Tampón de carbonato sódico, Na_{2}CO_{3}, Fischer, nº de catálogo: S495); a 10,6 g de material se les añaden 800 ml de H_{2}O Milli-Q, una vez disueltos se ajusta el pH a 9,6 con NaOH, se completa un volumen total de 1 l con H_{2}O Milli-Q, se filtra y se almacena a 4ºC.

2. Procedimiento

Todas las etapas que siguen se llevan a cabo a temperatura ambiente, a menos que se indique explícitamente lo contrario. Todos los lavados de las placas ELISA se realizan por enjuague 4x con TBST.

A. Lisis EMR

Este procedimiento puede llevarse a cabo la noche anterior o inmediatamente antes de iniciar la captura del receptor.

1. Se descongelan rápidamente los lisados en un baño de agua a 37ºC con una agitación de remolino hasta que desaparezcan los últimos cristales.

2. Se lisan los perdigones celulares con HNTG 1x que contiene PMSF 1 mM. Se utilizan 3 ml de HNTG por cada plata de 15 cm de células. Se añade 1/2 del volumen de HNTG calculado, se trata el tubo en el vortex durante 1 min, se añade la cantidad restante de HNTG, se trata en el vortex durante otro min.

3. Se equilibran los tubos, se centrifugan a 10.000 rpm durante 10 min a 4ºC.

4. Se reúnen los líquidos sobrenadantes, se retira una parte alícuota para la determinación de la proteína.

5. Se congela rápidamente la muestra recogida en un baño de hielo seco/etanol. Esta etapa se realiza con independencia de si el lisado se va a almacenar durante una noche o bien se va a utilizar inmediatamente después de la determinación de la proteína.

6. Se efectúa la determinación de la proteína empleando el método estándar del ácido bicinconínico (BCA) (kit de reactivo para el ensayo BCA, de Pierce Chemical, nº de catálogo: 23225).

B. Procedimiento ELISA

1. Se recubren las placas ELISA de 96 hoyos de Corning con 5 \mug de anticuerpo de cabra anti-conejo por hoyo en tampón carbonato, llenando un volumen total de 50 \mul del hoyo. Se almacena durante una noche a 4ºC.

2. Se quita el anticuerpo de cabra anti-conejo no fijado invirtiendo la placa para vaciar el líquido.

3. Se añaden 150 \mul de tampón de bloqueo a cada hoyo. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 30 min.

4. Se lava 4X con TBST. Se sacude ligeramente la placa sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

5. Se añade 1 \mug de anticuerpo de conejo anti-Met por hoyo, diluido en TBST, hasta completar un volumen total de 100 \mul.

6. Se diluye el lisado en HNTG (90 \mug de lisado/100 \mul).

7. Se añaden 100 \mul de lisado diluido a cada hoyo. Se agita a temperatura ambiente durante 60 min.

8. Se lava 4X con TBST. Se sacude ligeramente sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

9. Se añaden 50 \mul del tampón de lisado 1X por hoyo.

10. Se diluyen los compuestos/extractos 1:10 en tampón quinasa 1X en una placa de polipropileno de 96 hoyos.

11. Se transfieren 5,5 \mul del fármaco diluido a los hoyos de la placa ELISA. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 20 min.

12. Se añaden 5,5 \mul de la solución 60 \muM de ATP por hoyo. No se introduce ATP en los controles negativos. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 90 min.

13. Se lava 4X con TBST. Se golpea suavemente la placa sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

\newpage

14. Se añaden 100 \mul de RC20 por hoyo (dilución 1:3000 en tampón de bloqueo). Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 30 min.

15. Se lava 4X con TBST. Se golpea suavemente la placa sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

16. Se añaden 100 \mul de Turbo-TMB por hoyo. Se incuba con agitación durante 30-60 min.

17. Se añaden 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1M por hoyo para interrumpir la reacción.

18. Se lee el resultado del ensayo en un lector ELISA Dynatech MR7000. Filtro de ensayo = 450 nm, filtro de referencia = 410 nm.

g. Ensayo ELISA bioquímico de src

Se realiza este ensayo para determinar la actividad de la proteína-quinasa src midiendo la fosforilación de un péptido biotinilado como resultado.

1. Materiales y reactivos

a. Levadura transformada con src, de Courtneidge Laboratory (Sugen, Inc., Redwood City, California).

b. Lisados celulares: se convierten en perdigones las células de levaduras que expresan src, se lavan una vez con agua, se vuelven a formar perdigones y se almacenan a -80ºC hasta el momento de su utilización.

c. Se prepara el EEEYEEYEEEYEEEYEEEY biotinilado en el extremo N por procedimientos estándar bien conocidos por los expertos en la materia.

d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.

e. Placa ELISA de 96 hoyos: Corning 96 Well Easy Wash, placa modificada de fondo plano, Corning, nº de catálogo: 25805-96. f. Placas de polipropileno de fondo en V de 96 hoyos NUNC, para diluir los compuestos, de Applied Scientific, nº de catálogo: A-72092.

g. Reactivo Vectastain ELITE ABC: Vector, Burlingame, Ca.

h. Anticuerpo monoclonal (= mab) anti-src (327): para expresar el Src recombinante se utiliza el Schizosaccharomyces pombe (Superti-Furga y col., EMBO J. 12, 2625-2634; Superti-Furga y col., Nature Biochem. 14, 600-605). Se cultiva la cepa S. pombe SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) del modo descrito y se realizan las transformaciones con plásmidos de expresión pRSP por el método del acetato de litio (Superti-Furga, ya citado). Se cultivan las células en presencia de tiamina 1 \muM para reprimir la expresión del promotor nmtl o en ausencia de tiamina para inducir la expresión.

i. Anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina, UBI 05-321 (en su lugar puede utilizarse el UB40).

j. Sustrato Turbo-TMB-peroxidasa para ELISA: Pierce Chemical.

2. Soluciones tampón

a. PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco), GIBCO PBS, GIBCO, nº de catálogo: 450-1300EB.

b. Tampón de bloqueo: leche desnatada (Carnation) al 5% en PBS.

c. Tampón carbonato: Na_{2}CO_{3} de Fischer, nº de catálogo: S495; se prepara una solución patrón 100 mM.

d. Tampón de quinasa: 1,0 ml (de una solución patrón 1M) de MgCl_{2}; 0,2 ml (de una solución patrón 1M) de MnCl_{2}; 0,2 ml (de una solución patrón 1M) de DTT; 5,0 ml (de una solución patrón 1M) de HEPES; 0,1 ml de TX-100; se completa un volumen total de 10 ml con H_{2}O Milli-Q.

e. Tampón de lisis: 5,0 HEPES (de una solución patrón 1M); 2,74 ml de NaCl (de una solución patrón 5M); 10 ml de glicerina; 1,0 ml de TX-100; 0,4 ml de EDTA (de una solución patrón 100 mM); 1,0 ml de PMSF (de una solución patrón 100 mM); 0,1 ml de Na_{3}VO_{4} (de una solución patrón 0,1 M); se completa un volumen total de 100 ml con H_{2}O Milli-Q.

f. ATP: Sigma, nº de catálogo: A-7699; se prepara una solución patrón 10 mM (5,51 mg/ml).

g. TRIS-HCl: Fischer, nº de catálogo: BP 152-5; a 600 ml de H_{2}O Milli-Q se les añaden 121,14 g de material, se ajusta el pH a 7,5 con HCl, se completa hasta un volumen total de 1 l con H_{2}O Milli-Q.

h. NaCl, Fischer, nº de catálogo: S271-10, se prepara una solución patrón 5M con H_{2}O Milli-Q.

i. Na_{3}VO_{4}, Fischer, nº de catálogo: S454-50; a 80 ml de H_{2}O Milli-Q se les añaden 1,8 g de material; se ajusta el pH a 10,0 con HCl o NaOH; se hierve en microondas; se enfría;se comprueba el pH, se repite el ajuste del pH hasta que se mantenga estable después del ciclo de calentamiento/enfriamiento; se completa un volumen total de 100 ml con H_{2}O Milli-Q; se divide en partes alícuotas de 1 ml y se almacena a -80ºC.

j. MgCl_{2}, Fischer, nº de catálogo: M33-500; se prepara una solución patrón 1M con H_{2}O Milli-Q.

k. HEPES, Fischer, nº de catálogo: BP 310-500; a 200 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 59,6 g de material; se ajusta el pH a 7,5, se completa un volumen total de 250 ml con H_{2}O Milli-Q, se filtra en condiciones estériles (solución patrón 1M).

l. Tampón TBST: a 900 ml de H_{2}O dest. se les añaden 6,057 g de TRIS y 8,766 g de NaCl; se ajusta el pH a 7,2 con HCl, se añade 1,0 ml de Triton-X100; se completa un volumen total de 1 l con H_{2}O dest.

m. MnCl_{2}, Fischer, nº de catálogo M87-100; se prepara una solución patrón 1M con H_{2}O Milli-Q.

n. DTT, Fischer, nº de catálogo: BP172-5.

o. TBS (solución salina tamponada con TRIS): a 900 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 6,057 g de TRIS y 8,777 g de NaCl; se completa un volumen total de 1 l con H_{2}O Milli-Q.

p. Mezcla de reacción de quinasa: cantidad por placa de ensayo (100 hoyos): 1,0 ml de tampón de quinasa, 200 \mug de GST-\boxempty, se completa un volumen final de 8,0 ml con H_{2}O MilliQ.

q. EEEYEEYEEEYEEEYEEEY marcado con biotina: se prepara una solución patrón del péptido (1 mM, 2,98 mg/ml) en agua, inmediatamente antes del uso.

r. Reactivo Vectastain ELITE ABC: para preparar 14 ml del reactivo de trabajo se añade 1 gota del reactivo A a 15 ml de TBST y se invierte el tubo varias veces para mezclar su contenido. Después se añade 1 gota del reactivo B. Se coloca el tubo en un agitador orbital a temperatura ambiente y se mezcla durante 30 minutos.

3. Procedimientos a. Preparación de la placa ELISA recubierta con src

1. Se recubre la placa ELISA con 0,5 \mug/hoyo de mab anti-src en 100 \mul de tampón carbonato sódico, pH 9,6, a 4ºC durante una noche.

2. Se lavan los hoyos una vez con PBS.

3. Se bloquea la placa con 0,15 ml de leche al 5% en PBS a temperatura ambiente durante 30 min.

4. Se lava la placa 5X con PBS.

5. Se añaden 10 \mug/hoyo de lisados de levadura transformada con src, diluidos en tampón de lisis (volumen total por hoyo: 0,1 ml). (La cantidad de lisado puede variar entre las partidas.) Se agita la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos.

b. Preparación de placa ELISA recubierta con anticuerpo de fosfotirosina

1. Placa 4G10: se recubre con 0,5 \mug/hoyo de 4G10 en 100 \mul de PBS durante una noche a 4ºC y se bloquea con 150 \mul de leche al 5% en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos.

c. Procedimiento del ensayo de la quinasa

1. Se quitan las proteínas no fijadas de las anteriores etapas 1-7 y se lavan las placas 5X con PBS.

2. Se añaden 0,08 ml de la mezcla de reacción de la quinasa por hoyo (que contienen 10 \mul del tampón de quinasa 10X y EEEYEEYEEEYEEEYEEEY-biotina 10 \muM (concentración final) por hoyo diluida con agua.

3. Se añaden 10 \mul del compuesto diluido en agua, que contiene un 10% de DMSO y se pre incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos.

4. Se inicia la reacción de la quinasa añadiendo 10 \mul/hoyo de ATP 0,05 mM en agua (concentración final: 5 \muM de ATP).

5. Se agita la placa ELISA a temperatura ambiente durante 15 min.

6. Se interrumpe la reacción de la quinasa añadiendo 10 \mul de EDTA 0,5 M por hoyo.

7. Se transfieren 90 \mul de líquido sobrenadante a una placa ELISA recubierta con 4G10 y bloqueada, de la anterior sección B.

8. Se incuba durante 30 min. a temperatura ambiente con agitación.

9. Se lava la placa 5X con TBST.

10. Se incuba con el reactivo Vectastain ELITE ABC (100 \mul/hoyo) a temperatura ambiente durante 30 min.

11. Se lavan los hoyos 5X con TBST.

12. Se revela con Turbo-TMB.

h. Ensayo ELISA bioquímico de la lck

Con este ensayo se determinan las actividades de proteína-quinasa de la lck midiendo la fosforilación de la
GST-\boxempty como resultado.

1. Materiales y reactivos

a. Levadura transformada con lck. Se utiliza el Schizosaccharomyces pombe (Superti-Furga y col., EMBO J. 12, 2625-2634; Superti-Furga y col., Nature Biochem. 14, 600-605) para expresar la Lck recombinante. Se cultiva la cepa S. pombe SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) del modo descrito y se realizan las transformaciones con plásmidos de expresión pRSP por el método del acetato de litio (Superti-Furga, ya citado). Se cultivan las células en presencia de tiamina 1 \muM para inducir la expresión.

b. Lisados celulares: se preparan perdigones de células de levadura que expresan la lck, se lavan con agua una vez,se vuelven a convertir en perdigones y se almacenan congeladas a -80ºC hasta el momento del uso.

c. GST-\boxempty: el DNA que codifica la proteína de fusión de la GST-\boxempty para la expresión en bacterias se obtiene de Arthur Weiss del Instituto Médico Howard Hughes de la Universidad de California, San Francisco. Se cultivan las bacterias transformadas a 25ºC con agitación durante una noche. Se purifica la GST-\boxempty por cromatografía de afinidad de glutationa, Pharmacia, Alameda, CA.

d. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.

e. Placa ELISA de 96 hoyos, Corning o6 Well Easy Wash, placa modificada de fondo plano, Corning, nº de catálogo: 25805-96.

f. Placas de polipropileno de fondo en V de 96 hoyos NUNC, para la dilución de los compuestos, Applied Scientific, nº de catálogo: AS-72092.

g. Antisuero de conejo anti-GST purificado, Amrad Corporation (Australia), nº de catálogo: 90001605.

h. IgG-HRP de cabra anti-conejo, Amersham, nº de catálogo: V010301.

i. IgG de oveja anti-ratón (H+L), Jackson Labs, nº de catálogo: 5215-005-003.

j. Mab anti-Lck (3A5), Santa Cruz Biotechnology, nº de catálogo: sc-433.

k. UBI 05-321 monoclonal anti-fosfotirosina (en su lugar puede utilizarse el UB40).

2. Soluciones tampón

a. Solución 1X de PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco), GIBCO PBS, GIBCO, nº de catálogo: 450-1300EB.

b. Tampón de bloqueo: 100 g de BSA, 12,1 g de TRIS, pH 7,5, 58,44 g de NaCl, 10 ml de Tween-20, se completa un volumen total de 1 l con H_{2}O Milli-Q.

c. Tampón carbonato: Na_{2}CO_{3} de Fischer, nº de catálogo: S495; se prepara una solución patrón 100 mM con H_{2}O Milli-Q.

d. Tampón de quinasa: 1,0 ml (de una solución patrón 1M) de MgCl_{2}; 0,2 ml (de una solución patrón 1M) de MnCl_{2}; 0,2 ml (de una solución patrón 1M) de DTT; 5,0 ml (de una solución patrón 1M) de HEPES; 0,1 ml de TX-100; se completa un volumen total de 10 ml con H_{2}O Milli-Q.

e. Tampón de lisis: 5,0 HEPES (de una solución patrón 1M); 2,74 ml de NaCl (de una solución patrón 5M); 10 ml de glicerina; 1,0 ml de TX-100; 0,4 ml de EDTA (de una solución patrón 100 mM); 1,0 ml de PMSF (de una solución patrón 100 mM); 0,1 ml de Na_{3}VO_{4} (de una solución patrón 0,1 M); se completa un volumen total de 100 ml con H_{2}O Milli-Q.

f. ATP: Sigma, nº de catálogo: A-7699; se prepara una solución patrón 10 mM (5,51 mg/ml).

g. TRIS-HCl: Fischer, nº de catálogo: BP 152-5; a 600 ml de H_{2}O Milli-Q se les añaden 121,14 g de material, se ajusta el pH a 7,5 con HCl, se completa hasta un volumen total de 1 l con H_{2}O Milli-Q.

h. NaCl, Fischer, nº de catálogo: S271-10, se prepara una solución patrón 5M con H_{2}O Milli-Q.

i. Na_{3}VO_{4}, Fischer, nº de catálogo: S454-50; a 80 ml de H_{2}O Milli-Q se les añaden 1,8 g de material; se ajusta el pH a 10,0 con HCl o NaOH; se hierve en microondas; se enfría; se comprueba el pH, se repite el ajuste del pH hasta que se mantenga estable después del ciclo de calentamiento/enfriamiento; se completa un volumen total de 100 ml con H_{2}O Milli-Q; se divide en partes alícuotas de 1 ml y se almacena a -80ºC.

j. MgCl_{2}, Fischer, nº de catálogo: M33-500; se prepara una solución patrón 1M con H_{2}O Milli-Q.

k. HEPES, Fischer, nº de catálogo: BP 310-500; a 200 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 59,6 g de material; se ajusta el pH a 7,5, se completa un volumen total de 250 ml con H_{2}O Milli-Q, se filtra en condiciones estériles (solución patrón 1M).

l. Albúmina bovina (BSA), Sigma, nº de catálogo: A4503; a 150 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 30 g de material, se completa un volumen total de 300 ml con H_{2}O Milli-Q, se filtra con un filtro de 0,22 \mum y se almacena a 4ºC.

m. Tampón TBST: a 900 ml de H_{2}O dest. se les añaden 6,057 g de TRIS y 8,766 g de NaCl; se ajusta el pH a 7,2 con HCl, se añade 1,0 ml de Triton-X100; se completa un volumen total de 1 l con H_{2}O dest.

n. MnCl_{2}, Fischer, nº de catálogo M87-100; se prepara una solución patrón 1M con H_{2}O Milli-Q.

o. DTT, Fischer, nº de catálogo: BP172-5.

p. TBS (solución salina tamponada con TRIS): a 900 ml de H_{2}O Milli-Q se le añaden 6,057 g de TRIS y 8,777 g de NaCl; se completa un volumen total de 1 l con H_{2}O Milli-Q.

q. Mezcla de reacción de quinasa: cantidad por placa de ensayo (100 hoyos): 1,0 ml de tampón de quinasa, 200 \mug de GST-\boxempty, se completa un volumen final de 8,0 ml con H_{2}O MilliQ.

2. Procedimientos a. Preparación de una placa ELISA recubierta con Lck

1. Se recubre con IgG de oveja anti-ratón a razón de 2,0 \mug/hoyo en 100 \mul de tampón carbonato sódico de pH 9,6 a 4ºC durante una noche.

2. Se lavan los hoyos una vez con PBS.

3. Se bloquea la placa con 0,15 ml de tampón de bloqueo a temp. ambiente durante 30 min.

4. Se lava la placa 5X con PBS.

5. Se añade 0,5 \mug/hoyo de mab 3A5 anti-lck en 0,1 ml de PBS a temperatura ambiente durante 1-2 horas.

6. Se lava la placa 5X con PBS.

7. Se añaden 20 \mug/hoyo de lisados de levadura transformada con lck, diluidos en tampón de lisis (volumen total por hoyo: 0,1 ml). (La cantidad de lisado puede variar entre partidas). Se agita la placa a 4ºC durante una noche para impedir la pérdida de actividad.

b. Preparación de la placa ELISA recubierta con el anticuerpo de la fosfotirosina

1. Placa UB40: 1,0 \mug/hoyo de UB40 en 100 \mul de PBS a 4ºC durante una noche y se bloquea con 150 \mul de tampón de bloqueo por lo menos durante 1 hora.

c. Procedimiento de ensayo de quinasa

1. Se quitan las proteínas no fijadas de las anteriores etapas 1-7 y se lavan las placas 5X con PBS.

2. Se añaden 0,08 ml de mezcla de reacción de quinasa por hoyo (que contienen 10 \mul de tampón de quinasa 10X y 2 \mug de GST-\boxempty por hoyo, diluido con agua).

3. Se añaden 10 \mul de compuesto diluido en agua que contiene un 10% de DMSO y se preincuba a temperatura ambiente durante 15 minutos.

4. Se inicia la reacción de la quinasa añadiendo 10 \mul/hoyo de ATP 0,1 mM en agua (concentración final de ATP: 10 \muM).

5. Se agita la placa ELISA a temperatura ambiente durante 60 min.

6. Se interrumpe la reacción de la quinasa añadiendo 10 \mul de EDTA 0,5 M por hoyo.

7. Se transfieren 90 \mul de líquido sobrenadante a una placa ELISA recubierta con 4G10 y bloqueada, de la anterior sección B.

8. Se incuba a temperatura ambiente con agitación durante 30 min.

9. Se lava la placa 5X con TBST.

10. Se incuba con anticuerpo de conejo anti-GST en una dilución 1:5000 en 100 \mul de TBST a temperatura ambiente durante 30 min.

11. Se lavan los hoyos 5X con TBST.

12. Se incuban con IgG-HRP de cabra anti-conejo en una dilución 1:20.000 en 100 \mul de TBST a temperatura ambiente durante 30 min.

13. Se lavan los hoyos 5X con TBST.

14. Se revela con Turbo TMB.

i. Ensayo para medir la función de fosforilación del Raf

En el siguiente ensayo se determina la cantidad defosforilación catalizada por RAF de su proteína diana MEK así como de la MAPK, diana de la MEK. La secuencia del gen RAF se describe en Bonner y col., Molec. Cell. Biol. 5, 1400-1407, 1985 y es fácilmente accesible en muchos bancos de datos de secuencias de genes. La construcción del vector ácido nucleico y las líneas celulares utilizadas para esta porción de la invención se describe totalmente en Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8855-8859, 1988.

Materiales y reactivos

1. Células de Sf9 (Spodoptera frugiperda); GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

2. Tampón RIPA: 20 mM Tris/HCl, pH 7,4; 137 mM NaCl; 10% de glicerina; 1 mM de PMSF; 5 mg/l de aprotenina; 0,5% de Triton X-100.

3. Proteína de fusión tiorredoxina-MEK (T-MEK): se realiza la expresión y la purificación de la T-MEK por cromatografía de afinidad con arreglo a los procedimientos del fabricante. Nº de catálogo: K 350-01 y R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-MAPK (ERK 2); se expresa la MAPK marcada con His en células XL1 Blue transformadas con el vector pUC18 que codifica la His-MAPK. Se purifica la His-MAPK por cromatografía de afinidad en Ni. Nº de catálogo: 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, del modo descrito en la presente.

5. IgG de oveja anti-ratón, Jackson Laboratories, West Grove, PA. Nº de catálogo: 515-006-008, lote nº 28563.

6. Anticuerpo específico de la proteína-quinasa RAF-1: URP2653 de UBI.

7. Tampón de recubrimiento: PBS (solución salina tamponada con fosfato), GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

8. Tampón de lavado: TBST - 50 mM Tris/HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% de Triton X-100.

9. Tampón de bloqueo: TBST, 0,1% de etanolamina, pH 7,4.

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO.

11. Tampón de quinasa (KB): 20 mM HEPES/HCl, pH 7,2; 150 mM NaCl, 0,1% de Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 mg/l de aprotenina; 75 mM de ortovanadato sódico; 0,5 mM DTT y 10 mM MgCl_{2}.

12. Mezcla de ATP: 100 mM MgCl_{2}, 300 mM ATP, 10 mCi ATP-P^{33} (DuPont-NEN)/ml.

13. Solución de interrupción: ácido fosfórico del 1%; Fisher, Pittsburgh, PA.

14. Vellones (mats) de filtro de fosfato de celulosa Wallac; Wallac, Turku, Finlandia.

15. Solución de lavado del filtro: ácido fosfórico del 1%; Fisher, Pittsburgh, PA.

16. Colector de placas Tomtec, Wallac, Turku, Finlandia.

17. Lector de placas beta Wallac nº 1205, Wallac, Turku, Finlandia.

18. Placas de polipropileno de fondo en V y 96 hoyos NUNC, para compuestos, de Applied Scientific, nº de catálogo: AS-72092.

Procedimiento

Todos los pasos siguientes se efectúan a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.

1. Recubrimiento de la placa ELISA: se recubren los hoyos ELISA con 100 ml de antisuero de oveja anti-ratón purificado por afinidad (1 mg/100 ml de tampón de recubrimiento) a 4ºC durante una noche. Las placas ELISA pueden utilizarse durante dos semanas si se almacenan a 4ºC.

2. Se invierte la placa y se quita el líquido. Se añaden 100 ml de solución de bloqueo y se incuba durante
30 min.

3. Se saca la solución de bloqueo y se lava cuatro veces con tampón de lavado. Se golpea suavemente la placa sobre servilletas de papel para eliminar el exceso de líquido.

4. Se añade 1 mg del anticuerpo específico de RAF-1 a cada hoyo y se incuba durante 1 hora. Se lava del modo descrito en el paso 3.

5. Se descongelan los lisados de células Sf9 infectadas con RAS/RAF y se diluyen con TBST hasta 10 mg/100 ml. Se añaden 10 mg de lisado diluido a los hoyos y se incuba durante 1 hora. Se agita la placa durante la incubación. No se introducen lisados en los controles negativos. Se obtienen los lisados de células de insecto Sf9 infectadas con RAS/RAF por infección de las células con baculovirus recombinantes en una MOI de 5 para cada virus y se recolectan al cabo de 48 horas. Se lavan las células una vez con PBS y se lisan en tampón RIPA. Se elimina el material insoluble por centrifugación (5 min a 10.000 rpm). Se congelan partes alícuotas de lisados en hielo seco/etanol y se almacenan a -80ºC hasta el momento de su utilización.

6. Se elimina el material no fijado y se lava del modo descrito anteriormente (paso 3).

7. Se añaden 2 mg de T-MEK y 2 mg de His-MAPK por hoyo y se ajusta el volumen a 40 ml con tampón de quinasa. Los métodos de purificación de la T-MEK y MAPK de los extractos celulares se facilitan mediante
ejemplos.

8. Se diluyen los compuestos (solución patrón: 10 mg/ml de DMSO) o los extractos previamente: 20 veces en TBST más un 1% de DMSO. Se añaden 5 ml de los compuestos/extractos prediluidos a los hoyos descritos en el paso 6. Se incuba durante 20 min. Los controles no reciben fármaco.

9. Se inicia la reacción de la quinasa por adición de 5 ml de mezcla ATP; se agitan las placas en un agitador de placas ELISA durante la incubación.

10. Se interrumpe la reacción de la quinasa después de 60 min por adición de 30 ml de solución de interrupción a cada hoyo.

11. Se coloca el vellón de fosfocelulosa y la placa ELISA en el recolector de placas Tomtec. Se recolecta y se lava el filtro con la solución de lavado de filtros siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se secan los vellones del filtro. Se sellan los vellones del filtro y se colocan en un soporte. Se inserta el soporte en un aparato de detección radiactiva y se cuantifica el fósforo radiactivo existente en los vellones del filtro.

Como alternativa se pueden transferir 40 \mul de partes alícuotas de hoyos individuales de la placa de ensayo a las posiciones correspondientes del vellón de filtro de fosfocelulosa. Se secan los filtros con aire y se colocan en una bandeja. Se agita suavemente la bandeja, cambiando la solución de lavado a intervalos de 15 min durante 1 hora. Se secan los vellones de filtro con aire. Se sellan los vellones de filtro y se colocan en un soporte, idóneo para medir el fósforo radiactivo de las muestras. Se inserta el soporte en un dispositivo de detección y se cuantifica el fósforo radiactivo de los vellones de filtro.

j. Ensayo de inhibición de CDK2/ciclina A

Con este ensayo se analiza la actividad de proteína-quinasa de la CDK2 en un sustrato exógeno.

Reactivos

A. Tampón A (80 mM Tris, pH 7,2; 40 mM MgCl_{2}): se disuelven 4,84 g de Tris (peso total = 121,1 g/mol), 4,07 g de MgCl_{2} (peso total = 203,31 g/mol) en 500 ml de H_{2}O. Se ajusta el pH a 7,2 con HCl.

B. Solución de histona H1 (0,45 mg/ml de histona H1 y 20 mM HEPES, pH 7,2 (un pH de 7,4 es correcto): se disuelven 5 mg de histona H1 (Boehringer Mannheim) en 11,111 ml de 20 mM HEPES, pH 7,2 (477 mg de HEPES, peso total = 238,3 g/mol) en 100 ml de H_{2}O bidestilada, se almacenan partes alícuotas de 1 ml a 80ºC.

C. Solución ATP (60 \muM ATP, 300 \mug/ml de BSA, 3 mM DTT): 120 \mul 10 mM ATP, 600 \mul 10 mg/ml de BSA hasta 20 ml, se almacenan partes alícuotas de 1 ml a -80ºC.

D. Solución de CDK2: cdk2/ciclina A en 10 mM HEPES, pH 7,2, 25 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 10% de glicerina, se almacena a 80ºC en partes alícuotas de 9 \mul.

Descripción del ensayo

1. Se preparan soluciones de inhibidores a tres veces la concentración final de ensayo deseada en H_{2}O bidest./
DMSO del 15% en volumen.

2. Se dispensan 20 \mul de los inhibidores a los hoyos de las placas de polipropileno de 96 hoyos (ó 20 \mul de DMSO del 15% para los controles positivos y negativos).

3. Se descongela la solución de histona H1 (1 ml/placa), la solución de ATP (1 ml/placa más 1 parte alícuota para los controles negativos) y la solución de CDK2 (9 \mul/placa). Se mantiene la CDK2 sobre hielo hasta el momento del uso. Se divide apropiadamente la solución de CDK2 en partes alícuotas para evitar la repetición de ciclos de congelación-descongelación.

4. Se diluyen 9 \mul de solución de CDK2 en 2,1 ml de tampón A (por placa). Se mezcla. Se dispensan 20 \mul a cada hoyo.

5. Se mezcla 1 ml de la solución de histona H1 con 1 ml de solución de ATP (por placa) en un tubo de 10 ml de tapón roscado. Se añade \gamma-ATP-P^{33} hasta una concentración de 0,15 \muCi/20 \mul (0,15 \muCi/hoyo en el ensayo). Se mezcla cuidadosamente para evitar la espumación del BSA. Se añaden 20 \mul a los hoyos apropiados. Se mezclan las placas en un agitador de placas. Para el control negativo se mezcla la solución de ATP con una cantidad igual de 20 mM HEPES, pH 7,2, y se añade \gamma-ATP-P^{33} hasta una concentración de 0,15 \muCi/20 \mul de solución. Se añaden 20 \mul a los hoyos apropiados.

6. Se deja que las reacciones progresen durante 60 minutos.

7. Se añaden 35 \mul de TCA del 10% a cada hoyo. Se mezcla el contenido de las placas en un agitador de placas.

8. Se depositan 40 \mul de cada muestra en una casilla de vellón de filtro P30. Se dejan secar los vellones (aprox. 10-20 minutos).

9. Se lavan los vellones de filtro 4 X 10 minutos con 250 ml de ácido fosfórico del 1% (10 ml de ácido fosfórico por litro de agua bidest.).

10. Se recuentan los vellones de filtro con un lector de placas beta.

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2. Ensayos celulares/biológicos

Ensayo 1

Ensayo de incorporación de BrdU inducida por PDGF Materiales y reactivos

(1) PDGF: PDGF B/B humana, 1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania.

(2) Reactivo de marcado de BrdU: 10 mM en PBS (pH 7,4), Boehringer Mannheim, Alemania, nº de catálogo: 1 647 229.

(3) FixDenat: solución de fijación (lista para el uso), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(4) Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina (TMB), lista para el uso, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(6) Solución de lavado de PBS: PBS 1X, pH 7,4, de fabricación propia (Sugen, Inc., Redwood City, California).

(7) Albúmina bovina (BSA): fracción V en polvo; A-8551, Sigma Chemical Co., EE.UU.

(8) Línea celular 3T3, de ingeniería genética, para expresar la PDGF-R humana.

Procedimiento

(1) Se siembran las células a razón de 8000 células/hoyo en DMEM, 10% de CS, 2 mM Gln en una placa de 96 hoyos. Se incuban las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante una noche.

(2) Después de 24 horas se lavan las células con PBS y entonces se desnutren en un medio exento de suero (0% de CS DMEM con un 0,1% de BSA) durante 24 horas.

(3) En el día 3 se añaden simultáneamente el ligando (PDGF, 3,8 nM, preparado en DMEM con un 0,1% de BSA) y los compuestos a ensayar a las células. Los hoyos de control negativo reciben DMEM exento de suero únicamente con un 0,1% de BSA; las células de control positivo reciben el ligando (PDGF) pero no el compuesto a ensayar. Los compuestos a ensayar se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 hoyos y se diluyen en series para obtener 7 concentraciones de ensayo.

(4) Después de 20 horas de la activación del ligando se añade el reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM, 0,1% de BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final = 10 \muM) durante 1,5 horas.

(5) Después de la incubación con el reactivo de marcado se quita el medio por decantación y golpeo suave de la placa invertida sobre servilletas de papel. Se añade la solución FixDenat (50 \mul/hoyo) y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas.

(6) Se quita por completo la solución FixDenat por decantación y golpes suaves en la placa invertida sobre servilletas de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en PBS, 200 \mul/hoyo) como solución de bloqueo y se incuba la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(7) Se quita la solución de bloqueo por decantación y se lavan los hoyos una vez con PBS. Se añade una solución de anti-BrdU-POD (dilución 1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 \mul/hoyo) y se incuba la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas.

(8) Se elimina por completo el anticuerpo conjugado por decantación y enjuague de los hoyos 5 veces con PBS y se seca la placa por inversión y golpes suaves sobre servilletas de papel.

(9) Se añade solución de sustrato TMB (100 \mul/hoyo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas hasta que el color revelado es suficiente para la detección fotométrica.

(10) Se mide la absorbancia de las muestra a 410 nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech de placas ELISA.

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Ensayo 2

Ensayo de incorporación BrdU inducida por EGF Materiales y reactivos

(1) EGF: EGF de ratón, 201; Toyobo Co. Ltd., Japón.

(2) Reactivo de marcado BrdU: 10 mM en PBS (pH 7,4), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(3) FixDenat: solución de fijación (lista para el uso), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(4) Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, nº de catálogo: 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Alemania.

(5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina (TMB), lista para el uso, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(6) Solución de lavado de PBS: PBS 1X, pH 7,4, de fabricación propia (Sugen, Inc., Redwood City, California).

(7) Albúmina bovina (BSA): fracción V en polvo; A-8551, Sigma Chemical Co., EE.UU.

(8) Línea celular 3T3, de ingeniería genética, para expresar la EGF-R humana.

Procedimiento

(1) Se siembran las células a razón de 8000 células/hoyo en 10% de CS, 2 mM Gln en DMEM, en una placa de 96 hoyos. Se incuban las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante una noche.

(2) Después de 24 horas se lavan las células con PBS y entonces se desnutren en un medio exento de suero (0% de CS DMEM con un 0,1% de BSA) durante 24 horas.

(3) En el día 3 se añaden simultáneamente el ligando (EGF, 2 nM, preparado en DMEM con un 0,1% de BSA) y los compuestos a ensayar a las células. Los hoyos de control negativo reciben DMEM exento de suero únicamente con un 0,1% de BSA; las células de control positivo reciben el ligando (EGF) pero no el compuesto a ensayar. Los compuestos a ensayar se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 hoyos y se diluyen en series para obtener 7 concentraciones de ensayo.

(4) Después de 20 horas de la activación del ligando se añade el reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM, 0,1% de BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final = 10 \muM) durante 1,5 horas.

(5) Después de la incubación con el reactivo de marcado se quita el medio por decantación y golpeo suave de la placa invertida sobre servilletas de papel. Se añade la solución FixDenat (50 \mul/hoyo) y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas.

(6) Se quita por completo la solución FixDenat por decantación y golpes suaves en la placa invertida sobre servilletas de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en PBS, 200 \mul/hoyo) como solución de bloqueo y se incuba la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(7) Se quita la solución de bloqueo por decantación y se lavan los hoyos una vez con PBS. Se añade una solución de anti-BrdU-POD (dilución 1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 \mul/hoyo) y se incuba la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas.

(8) Se elimina por completo el anticuerpo conjugado por decantación y enjuague de los hoyos 5 veces con PBS y se seca la placa por inversión y golpes suaves sobre servilletas de papel.

(9) Se añade solución de sustrato TMB (100 \mul/hoyo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas hasta que el color revelado es suficiente para la detección fotométrica.

(10) Se mide la absorbancia de las muestra a 410 nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech de placas ELISA.

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Ensayo 3

Incorporación de BrdU conducida por Her2 e inducida por EGF Materiales y reactivos

(1) EGF: EGF de ratón, 201; Toyobo Co. Ltd., Japón.

(2) Reactivo de marcado BrdU: 10 mM en PBS (pH 7,4), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(3) FixDenat: solución de fijación (lista para el uso), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(4) Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, nº de catálogo: 1 647 229,
Boehringer Mannheim, Alemania.

(5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina (TMB), lista para el uso, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(6) Solución de lavado de PBS: PBS 1X, pH 7,4, de fabricación propia.

(7) Albúmina bovina (BSA): fracción V en polvo; A-8551, Sigma Chemical Co., EE.UU.

(8) Línea celular 3T3, de ingeniería genética, para expresar un receptor quimérico que tenga el dominio extracelular de la EGF-R y el dominio intracelular de la Her2.

Procedimiento

(1) Se siembran las células a razón de 8000 células/hoyo en DMEM, 10% de CS, 2 mM Gln, en una placa de 96 hoyos. Se incuban las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante una noche.

(2) Después de 24 horas se lavan las células con PBS y entonces se desnutren en un medio exento de suero (0% de CSDMEM con un 0,1% de BSA) durante 24 horas.

(3) En el día 3 se añaden simultáneamente el ligando (EGF = 2 nM, preparado en DMEM con un 0,1% de BSA) y los compuestos a ensayar a las células. Los hoyos de control negativo reciben DMEM exento de suero únicamente con un 0,1% de BSA; las células de control positivo reciben el ligando (EGF) pero no el compuesto a ensayar. Los compuestos a ensayar se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 hoyos y se diluyen en series para obtener 7 concentraciones de ensayo.

(4) Después de 20 horas de la activación del ligando se añade el reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM, 0,1% de BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final = 10 \muM) durante 1,5 horas.

(5) Después de la incubación con el reactivo de marcado se quita el medio por decantación y golpeo suave de la placa invertida sobre servilletas de papel. Se añade la solución FixDenat (50 \mul/hoyo) y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas.

(6) Se quita por completo la solución FixDenat por decantación y golpes suaves en la placa invertida sobre servilletas de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en PBS, 200 \mul/hoyo) como solución de bloqueo y se incuba la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(7) Se quita la solución de bloqueo por decantación y se lavan los hoyos una vez con PBS. Se añade una solución de anti-BrdU-POD (dilución 1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 \mul/hoyo) y se incuba la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas.

(8) Se elimina por completo el anticuerpo conjugado por decantación y enjuague de los hoyos 5 veces con PBS y se seca la placa por inversión y golpes suaves sobre servilletas de papel.

(9) Se añade solución de sustrato TMB (100 \mul/hoyo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas hasta que el color revelado es suficiente para la detección fotométrica.

(10) Se mide la absorbancia de las muestra a 410 nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech de placas ELISA.

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Ensayo 4

Ensayo de incorporación de BrdU inducida por IGF1 Materiales y reactivos

(1) Ligando IGF1: humano, recombinante; G511, Promega Corp., EE.UU.

(2) Reactivo de marcado BrdU: 10 mM en PBS (pH 7,4), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(3) FixDenat: solución de fijación (lista para el uso), nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(4) Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina (TMB), lista para el uso, nº de catálogo: 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(6) Solución de lavado de PBS: PBS 1X, pH 7,4, de fabricación propia (Sugen, Inc., Redwood City, California).

(7) Albúmina bovina (BSA): fracción V en polvo; A-8551, Sigma Chemical Co., EE.UU.

(8) Línea celular 3T3, de ingeniería genética, para expresar el receptor IGF-1 humano.

Procedimiento

(1) Se siembran las células a razón de 8000 células/hoyo en DMEM, 10% de CS, 2 mM Gln, en una placa de 96 hoyos. Se incuban las células a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante una noche.

(2) Después de 24 horas se lavan las células con PBS y entonces se desnutren en un medio exento de suero (0% de CS DMEM con un 0,1% de BSA) durante 24 horas.

(3) En el día 3 se añaden simultáneamente el ligando (IGF1 = 3,3 nM, preparado en DMEM con un 0,1% de BSA) y los compuestos a ensayar a las células. Los hoyos de control negativo reciben DMEM exento de suero únicamente con un 0,1% de BSA; las células de control positivo reciben el ligando (IGF1) pero no el compuesto a ensayar. Los compuestos a ensayar se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 hoyos y se diluyen en series para obtener 7 concentraciones de ensayo.

(4) Después de 16 horas de la activación del ligando se añade el reactivo de marcado BrdU diluido (1:100 en DMEM, 0,1% de BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final = 10 \muM) durante 1,5 horas.

(5) Después de la incubación con el reactivo de marcado se quita el medio por decantación y golpeo suave de la placa invertida sobre servilletas de papel. Se añade la solución FixDenat (50 \mul/hoyo) y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas.

(6) Se quita por completo la solución FixDenat por decantación y golpes suaves en la placa invertida sobre servilletas de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en PBS, 200 \mul/hoyo) como solución de bloqueo y se incuba la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(7) Se quita la solución de bloqueo por decantación y se lavan los hoyos una vez con PBS. Se añade una solución de anti-BrdU-POD (dilución 1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 \mul/hoyo) y se incuba la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas.

(8) Se elimina por completo el anticuerpo conjugado por decantación y enjuague de los hoyos 5 veces con PBS y se seca la placa por inversión y golpes suaves sobre servilletas de papel.

(9) Se añade solución de sustrato TMB (100 \mul/hoyo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas hasta que el color revelado es suficiente para la detección fotométrica.

(10) Se mide la absorbancia de las muestra a 410 nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector Dynatech de placas ELISA.

g. Ensayo HUV-EC-C

El siguiente procedimiento puede utilizarse también para medir la actividad de un compuesto contra los PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF o Flk-1/KDR, todos los cuales se expresan naturalmente mediante células HUV-EC.

Día 0

1. Se lavan y se tripsinizan las células HUV-EC-C (células endoteliales de vena umbilical humana) (American Type Culture Collection; nº de catálogo: 1730 CRL). Se lavan dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS; obtenida de Gibco BRL; nº de catálogo: 14190-029) a razón de 1 ml/10 cm^{2} de matraz de cultivo de tejido. Se tripsinizan con tripsina al 0,05% en EDTA en una solución de disociación celular no enzimática (Sigma Chemical Company; nº de catálogo: C-1544). La tripsina al 0,05% se prepara diluyendo tripsina del 0,25% en EDTA 1 mM (Gibco; nº de catálogo: 25200-049) en la solución de disociación celular. Se tripsiniza con aprox. 1 ml/25-30 cm^{2} del matraz de cultivo de tejido a 37ºC durante unos 5 minutos. Una vez las células se han despegado del matraz se añade un volumen igual de medio de ensayo y se transfieren a un tubo estéril de centrífuga de 50 ml (Fisher Scientific; nº de catálogo: 05-539-6).

2. Se lavan las células con 35 ml de medio de ensayo en el tubo estéril de centrífuga de 50 ml añadiendo el medio de ensayo, se centrifuga a una velocidad de 200 rpm durante 10 minutos, se aspira el líquido sobrenadante y se suspende de nuevo en 35 ml de D-PBS. Se repite el lavado dos veces más con D-PBS, se suspenden de nuevo las células en aprox. 1 ml de medio de ensayo/15 cm^{2} de frasco de cultivo de tejido. El medio de ensayo consiste en medio F12K (Gibco BRL; nº de catálogo: 21127-014) + 0,5% de suero fetal bovino inactivado con calor. Se cuentan las células con un contador de Coulter Electronics Inc.) y se añade medio de ensayo a las células para obtener una concentración de 0,8 a 1,0 x 10^{5} células/ml.

3. Se añaden las células a placas de fondo plano de 96 hoyos a razón de 100 \mul/hoyo o bien de 0,8 a 1,0 x 10 células/hoyo; se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante \approx 24 h.

Día 1

1. Se realizan valoraciones del fármaco por duplicado en placas separadas de 96 hoyos, por lo general desde 50 \muM hasta 0 \muM. Se utiliza el mismo medio de ensayo, ya mencionado anteriormente en el día 0, paso 2. Se efectúan las valoraciones añadiendo 90 \mul/hoyo del fármaco en una concentración 200 \muM (4X la concentración final del hoyo) en el hoyo superior de una columna concreta de la placa. Dado que la concentración del fármaco patrón es normalmente 20 mM en DMSO, la concentración 200 \muM de fármaco contiene un 2% de DMSO.

Por lo tanto, se utiliza un diluyente que consta de un 2% de DMSO en medio de ensayo (F12K + 0,5% de suero fetal bovino) como diluyente para las valoraciones de fármaco con el fin de diluir el fármaco, pero manteniendo constante la concentración de DMSO. Se añade este diluyente a los hoyos restantes de la columna a razón de 60 \mul/hoyo. Se toman 60 \mul de los 120 \mul de la dilución 200 \muM de fármaco del hoyo superior de la columna y se mezclan con los 60 \mul del segundo hoyo de la columna. Se toman 60 \mul de este hoyo y se mezclan con los 60 \mul del tercer hoyo de la columna y así sucesivamente hasta completar valoraciones por duplicado. Cuando se ha mezcla el penúltimo hoyo, se toman 60 \mul de los 120 \mul de este hoyo y se descartan. Se deja el último hoyo con 60 \mul de DMSO/medio diluyente como control que no contiene fármaco. Se forman 9 columnas de fármaco valorado, suficientes para triplicar los hoyos para 1) VEGF (obtenido de Pepro Tech Inc., nº de catálogo: 100-200; 2) factor de crecimiento de células endoteliales (ECGF) (también conocido como factor de crecimiento de fibroblasto ácido, o aFGF) (obtenido de Boehringer Mannheim Biochemica, nº de catálogo: 1439 600); o 3) PDGF B/B humano (1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania) y el control con medios de ensayo. El ECGF se presenta en forma de preparado con heparina sódica.

2. Se transfieren 50 \mul/hoyo de las diluciones de fármaco a las placas de ensayo de 96 hoyos que contienen de 0,8 a 1,0 x 10^{4} células/100 \mul/hoyo de células HUV-EC-C del día 0 y se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante \approx 2 h.

3. Se añaden por triplicado 50 \mul/hoyo de 80 \mug/ml de VEGF, 20 ng/ml de ECGF o medio de control a cada concentración de fármaco. Al igual que para los fármacos, las concentraciones del factor de crecimiento son 4X la concentración final deseada. Se utilizan los medios de ensayo del día 0, paso 2, para ajustar las concentraciones de los factores de crecimiento. Se incuban a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante aproximadamente 24 horas. Cada hoyo tendrá 50 \mul de fármaco diluido, 50 \mul de factor de crecimiento o medio y 100 \mul de células, es decir un total de 200 \mul/hoyo. De este modo, las concentraciones 4X de los fármacos y de los factores de crecimiento quedan reducidas a 1X después de haber añadido todos los ingredientes a los hoyos.

Día 2

1. Se añade timidina-H^{3} (Amersham; nº de catálogo: TRK-686) a razón de 1 \muCi/hoyo (10 \mul/hoyo de 100 \muCi/ml de solución preparada en medio RPMI + 10% de suero fetal bovino inactivado con calor) y se incuba a 37ºC con un 5% de CO_{2} durante \approx 24 h. Nota: se prepara la timidina-H^{3} en medio RPMI porque todas las demás aplicaciones en las que se utiliza la timidina-H^{3} requieren la realización de ensayos en RPMI. La diferencia de medios en este paso probablemente no sea significativa. El RPMI se obtiene de Gibco BRL, nº de catálogo: 11875-051.

Día 3

1. Se congelan las placas a -20ºC durante una noche.

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Día 4

1. Se descongelan las placas y se recolectan con un recolector de placas de 96 hoyos (Tomtec Harvester 96®) en vellones de filtro (Wallac; nº de catálogo: 1205-401); se lee el recuento en un contado de centelleo líquido Wallac Betaplate™.

3. Modelos animales "in vivo" A. Modelos animales de injerto ajeno (xenograft)

La capacidad de los tumores humanos de crecer en forma de injertos ajenos en ratones atímicos (p.ej. el Balb/c, nu/nu) proporciona un modelo "in vivo" útil para estudiar la respuesta biológica a las terapias de tumores humanos. Después del primer trasplante ajeno de tumores humanos a ratones atímicos realizado con éxito (Rygaard y Povlsen, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77, 758-760, 1969), se han venido trasplantando y cultivado con éxito en ratones desnudos (sin pelo) múltiples líneas celulares tumorales humanas (p.ej. cáncer de mama, de pulmón, de vías génito-urinarias, gastro-intestinales, de cabeza y cuello, de glioblastoma, de hueso y de melanomas malignos). Se realizan los ensayos siguientes para determinar el nivel de actividad, la especificidad y el efecto de los diferentes compuestos de la presente invención. Para evaluar los compuestos son útiles tres tipos generales de ensayos: celulares/catalíticos, celulares/biológicos e "in vivo". El objeto de los ensayos celulares/catalíticos consiste en determinar el efecto de un compuesto en la capacidad de la TK para fosforilar tirosinas en un sustrato conocido de una célula. El objeto de los ensayos celulares/biológicos consiste en determinar el efecto de un compuesto en la respuesta biológica estimulada por una TK en una célula. El objeto de los ensayos "in vivo" consiste en determinar el efecto de un compuesto en un modelo animal de un trastorno particular, por ejemplo de un cáncer.

Las líneas celulares idóneas para los ensayos de injerto ajeno subcutáneo incluyen las células C6 (glioma, ATCC # CCL 107), células A375 (melanoma, ATCC # CRL 1619), células A431 (carcinoma epidermoide, ATCC # CRL 1555), células Calu 6 (pulmón, ATCC # HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC # CRL 1435), células SKOV3TP5 y fibroblastos NIH 3T3 generados por ingeniería genética para sobreexpresar los EGFR, PDGFR, IGF-1R y cualquier otra quinasa a ensayar. El procedimiento siguiente puede aplicarse para realizar los ensayos de injerto ajeno (xenograft):

Se obtienen los ratones atímicos hembras (BALB/c, nu/nu) de los Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Se mantienen todos los animales en condiciones de recinto limpio en jaulas microaislantes con lecho Alpha-dri. Reciben pienso estéril para roedores y agua a discreción.

Se cultivan las líneas celulares en un medio apropiado (por ejemplo MEM, DMEM, Ham's F10 o Ham's F12 más 5% - 10% de suero fetal bovino (FBS) y glutamina 2 mM (GLN)). Todos los medios de cultivo, la glutamina y el suero fetal bovino se adquieren en Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), a menos que se indique lo contrario. Todas las células se cultivan en atmósfera húmeda con un 90-95% de aire y un 5-10% de CO_{2} a 37ºC. Todas las líneas celulares se subcultivan de modo rutinario dos veces por semana y son negativas en cuanto a microplasma, según resulta del método Mycotest (Gibco).

Se recolectan las células en o casi en confluencia con tripsina al 0,05% en EDTA y se convierten en perdigones o culotes por centrifugación a 450 rpm durante 10 min. Se resuspenden los perdigones en PBS estéril o en medio (sin FBS) hasta una concentración concreta y se implantan las células en la ijada trasera de los ratones (8-10 ratones por grupo, 2-10 x 10^{6} células/animal). Se mide el crecimiento tumoral después de 3-6 semanas empleando calibres Venier. Se calculan los volúmenes de los tumores como producto de longitud x anchura x altura, a menos que se indique lo contrario. Los valores P se calculan utilizando el test t de Student. Se administran los compuestos a ensayar en 50-100 \mul de excipiente (DMSO o VPD:D5W) por inyección i.p. en diferentes concentraciones, empezando por lo general el día uno después de la implantación.

B. Modelo de invasión tumoral

Se ha desarrollado el siguiente modelo de invasión tumoral que puede utilizarse para la evaluación del valor terapéutico y de la eficacia de los compuestos identificados para inhibir selectivamente el receptor KDR/FLK-1.

Procedimiento

Como animales experimentales se emplean ratones desnudos (= sin pelo) hembras de 8 semanas de edad (Simonsen Inc.). La implantación de las células tumorales se realiza en una campana de flujo laminar. Para la anestesia se administra por vía intraperitoneal un cóctel de xilazina/cetamina (100 mg/kg de cetamina y 5 mg/kg de xilazina). Se practica una incisión central para exponer la cavidad abdominal (una longitud de aproximadamente 1,5 cm) para inyectar 10^{7} células tumorales en un volumen de 100 \mul de medio. Se inyectan las células ya sea en el lóbulo duodenal del páncreas, ya sea debajo de la membrana serosa del colon. Se cierran el peritoneo y los músculos con una sutura continua de seda 6-0 y se cierra la piel empleando grapas de heridas. Los animales se observan diaria-
mente.

Análisis

Después de 2-6 semanas, en función de las observaciones de los animales a simple vista, se sacrifican los ratones y se extirpan por incisión las metástasis tumorales locales de varios órganos (pulmón, hígado, cerebro, estómago, bazo, corazón, músculos) y se analizan (mediciones del tamaño del tumor, grado de invasión, inmunoquímica e hibridación "in situ").

D. Medición de la toxicidad celular

Los compuestos terapéuticos deberían ser más potentes en inhibir la actividad de la proteína-quinasa que en ejercer un efecto citotóxico. Una medición de la eficacia y de la toxicidad celular de un compuesto puede realizarse determinando el índice terapéutico: IC_{50}/LD_{50}. La IC_{50}, la dosis requerida para lograr una inhibición del 50%, puede medirse empleando técnicas estándar, como las descritas anteriormente. La LD_{50}, la dosis que provoca una toxicidad del 50%, puede medirse también por técnicas estándar (ver Mossman, J. Immunol. Methods 65, 55-63, 1983), midiendo la LDH liberada (Korzeniewski y Callewaert, J. Immunol. Methods 64, 313, 1983; Decker y Lohmann-Matthes, J. Immunol. Methods 115, 61, 1988), o bien midiendo la dosis letal en modelos animales. Son preferidos los compuestos que tienen un índice terapéutico grande. El índice terapéutico debería ser mayor que 2, con preferencia por lo menos 10, con preferencia especial por lo menos 50.

Conclusión

Se habrá observado, pues, que los compuestos y las composiciones farmacológicas de la presente invención son eficaces para modulas la actividad de la PK y, por lo tanto, se espera que sean eficaces como agentes terapéuticos contra los trastornos relaciones con las RTK, las CTK y las STK.

Claims (10)

1. Una 2-indolinona que tiene la estructura química:

23

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en la que

A^{2} y A^{4} son nitrógeno y A^{1} y A^{3} son carbono o bien A^{1} y A^{3} son nitrógeno y A^{2} y A^{4} son carbono, dando por supuesto que si A^{1}, A^{2}, A^{3} y A^{4} es nitrógeno, entonces no existe R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, respectivamente;

R^{1} se elige entre el grupo formado por hidrógeno; alquilo C1-C10, cicloalquilo, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, arilo, heteroarilo, trihalometanocarbonilo, heteroalicíclico, hidroxi, alcoxi C1-C10, C-carboxi, O-carboxi, C-amido, C-tioamido, guanilo, guanadinilo, ureidilo, sulfonilo y trihalometanosulfonilo;

R^{2} se elige entre el grupo formado por hidrógeno; alquilo C1-C10, cicloalquilo, arilo y halógeno;

R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por hidrógeno; alquilo C1-C10, trihalometilo, cicloalquilo, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxi, tiohidroxi, alcoxi C1-C10, ariloxi, tiohidroxi, tioalcoxi C1-C10, tioariloxi, sulfinilo, sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, N-trihalometanosulfonamido, carbonilo, aldehído, trihalometil-carbonilo, C-carboxi, O-carboxi, ciano, nitro, halógeno, cianato, isocianato, tiocianato, isotiocianato, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, fosfonilo, guanilo, guanadinilo, ureidilo, C-amido, N-amido, amino, amonio cuaternario, -NR^{18}R^{19};

R^{18} y R^{19}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo, arilo, carbonilo, acetilo, trihalometilcarbonilo, C-carboxi, trihalometanosulfonilo, sulfonilo, C-peptidilo y, juntos, forman un anillo heterocíclico de cinco o seis eslabones;

Z es oxígeno;

Q es

24

J^{1} se elige entre el grupo formado por oxígeno, nitrógeno y azufre;

J^{2}, J^{3} y J^{4}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre, de tal manera que el anillo heteroarilo de cinco eslabones sea uno ya conocido en la técnica química, dando por supuesto además que si J^{2}, J^{3} o J^{4} es nitrógeno, oxígeno o azufre, entonces no existe R^{8}, R^{8'} o R^{8''}, respectivamente; de igual manera, cuando J^{1} es oxígeno o azufre, entonces R^{7} no existe;

R^{7} se elige entre el grupo formado por hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo, trihalometilcarbonilo, arilo, guanilo, carboxilo, sulfonilo y trihalometanosulfonilo;

uno de R^{8}, R^{8'} o R^{8''} es H o un grupo -(alk_{1})rM; en el que (alk_{1}) es CH_{2}; r es un número de 1 a 3, ambos incluidos; y M se elige entre el grupo formado por hidroxi, amino, carboxi, morfolinilo, piperazinilo, tetrazolilo, N-carbamilo, O-carbamilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, sulfonilo, -S(O)_{2}OH y fosfonilo;

los dos restantes de R^{8}, R^{8'} o R^{8''}, con independencia entre sí, se eligen entre el grupo formado por:

hidrógeno;

alquilo C1-C4 sin sustituir;

alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios grupos elegidos entre halógeno, hidroxilo, alcoxi C1-C4 sin sustituir, amino, S-sulfonamido, -NR^{18}R^{19} o carboxi;

alcoxi C1-C4 sin sustituir;

alcoxi C1-C4 sustituido por uno o varios halógenos;

arilo sin sustituir;

arilo sustituido por uno o varios grupos elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir; alcoxi C1-C4 sin sustituir; halógeno; trihalometilo; amino; -NR^{18}R^{19}; hidroxi y S-sulfonamido;

heteroarilo sin sustituir;

heteroarilo sustituido por uno o varios grupos elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir; alcoxi C1-C4 sin sustituir; halógeno; hidroxi; alcoxi sin sustituir; amino; y-NR^{18}R^{19};

heteroalicíclico sin sustituir;

heteroalicíclico sustituido por uno o varios grupos elegidos entre alquilo C1-C4 sin sustituir; halógeno; hidroxi; alcoxi sin sustituir; amino; y -NR^{18}R^{19};

halógeno;

ciano;

carboxi; y

un anillo cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heteroalicíclico de seis eslabones, formado por combinación de R^{8} y R^{8'} o de R^{8'} y R^{8''};

y las sales fisiológicamente aceptables de los mismos;

y en la que:

alquilo C1-C10 está opcionalmente sustituido por cicloalquilo sin sustituir, elegido entre el grupo formado por ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno; arilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por fenilo, naftalenilo y antracenilo; heteroarilo sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol; heteroalicíclico sin sustituir, elegido entre el conjunto formado por piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y tetrahidrofurano; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; halógeno; carbonilo; tiocarbonilo; O-carbamilo; N-carbamilo; O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo; C-amido; N-amido; C-carboxi; O-carboxi; cianato; isocianato; tiocianato; isotiocianato; nitro; sililo; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} se eligen con independencia entre sí entre el conjunto formado por hidrógeno, alquilo C1-C4 sin sustituir, cicloalquilo sin sustituir, ya definido antes, arilo sin sustituir, ya definido antes, carbonilo, trihalometilcarbonilo, C-carboxi, trihalometilsulfonilo, sulfonilo y, juntos, forman un anillo heteroalicíclico de cinco o de seis eslabones, ya definido antes;

cicloalquilo se elige entre el conjunto formado por ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciclohexano, adamantano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno; y está opcionalmente sustituido por alquilo C1-C4 sin sustituir; arilo sin sustituir, ya definido antes; heteroarilo sin sustituir, ya definido antes; un heteroalicíclico sin sustituir, ya definido antes; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; halógeno; carbonilo; tiocarbonilo; carboxi; O-carbamilo; N-carbamilo; C-amido; N-amido; nitro; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos anteriormente; alquenilo C2-C10 está opcionalmente sustituido del modo indicado anteriormente para alquilo C1-C10;

alquinilo C2-C10 está opcionalmente sustituido del modo indicado anteriormente para alquilo C1-C10;

arilo se elige entre el conjunto formado por fenilo, naftalenilo y antracenilo; y está opcionalmente sustituido por halógeno; trihalometilo; alquilo C1-C4 sin sustituir; arilo sin sustituir, ya definido antes; heteroarilo sin sustituir, ya definido antes; heteroalicíclico sin sustituir, ya definido antes; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo; tiocarbonilo; C-carboxi; O-carboxi; O-carbamilo; N-carbamilo; O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo; C-amido; N-amido; sulfinilo, sulfonilo; S-sulfonamido; N-sulfonamido; trihalometanosulfonamido; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos anteriormente;

heteroarilo se elige entre el conjunto formado por pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol; y está opcionalmente sustituido por alquilo C1-C4 sin sustituir; cicloalquilo sin sustituir, ya definido antes; arilo sin sustituir, ya definido antes; halógeno; trihalometilo; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo; tiocarbonilo; sulfonamido; carboxi; sulfinilo; sulfonilo; O-carbamilo; N-carbamilo; O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo; C-amido; N-amido; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos anteriormente;

heteroalicíclico se elige entre el conjunto formado por la piperidina, morfolina, piperazina, pirrolina, pirrolidina, dihidrotiofeno y tetrahidrofurano; y está opcionalmente sustituido por alquilo C1-C4 sin sustituir; cicloalquilo sin sustituir, ya definido anteriormente; halógeno; trihalometilo; hidroxi; alcoxi C1-C4; ariloxi; tiohidroxi; tioalcoxi C1-C4; tioariloxi; ciano; nitro; carbonilo; tiocarbonilo; carboxi; O-carbamilo; N-carbamilo; O-tiocarbamilo; N-tiocarbamilo; sulfinilo; sulfonilo; C-amido; N-amido; amino y -NR^{18}R^{19}, en el que R^{18} y R^{19} tienen los significados definidos anteriormente.

2. El compuesto o la sal de la reivindicación 1, en el que R^{1} es hidrógeno.

3. El compuesto o la sal de la reivindicación 1, en el que R^{2} es hidrógeno.

4. El compuesto o la sal de la reivindicación 1, en el que R^{7} es hidrógeno.

5. El compuesto o la sal de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en el que R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}, con independencia entre sí, se eligen entre el conjunto formado por:

hidrógeno;

alquilo C1-C4 sin sustituir;

alquilo C1-C4 sustituido por un resto elegido entre el conjunto formado por cicloalquilo sin sustituir, halógeno, hidroxi, alcoxi C1-C4 sin sustituir, C-carboxi, arilo sin sustituir, heteroarilo sin sustituir, heteroalicíclico sin sustituir, amino, amonio cuaternario y -NR^{18}R^{19};

cicloalquilo sin sustituir;

hidroxi;

alcoxi C1-C4 sin sustituir;

alcoxi C1-C4 sustituido por un resto elegido entre el conjunto formado por uno o varios grupos halógeno, arilo sin sustituir y heteroarilo sin sustituir;

trihalometilo;

halógeno;

arilo sin sustituir;

arilo sustituido por uno o varios restos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno; trihalometilo; halógeno; hidroxi; y alcoxi C1-C4 sin sustituir;

ariloxi sin sustituir;

ariloxi sustituido por uno o varios grupos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por halógeno; alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno; arilo sin sustituir; hidroxi; alcoxi C1-C4 sin sustituir; amino y -NR^{18}R^{19};

S-sulfonamido;

heteroarilo sin sustituir;

heteroarilo sustituido por uno o varios restos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por hidrógeno; alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno; trihalometilo; halógeno; hidroxi, alcoxi C1-C4 sin sustituir; ariloxi sin sustituir; amino; S-sulfonamido y -NR^{18}R^{19};

heteroalicíclico sin sustituir;

heteroalicíclico sustituido por uno o varios restos elegidos con independencia entre sí entre el conjunto formado por alquilo C1-C4 sin sustituir; alquilo C1-C4 sustituido por uno o varios restos halógeno; (alquilo C1-C4 sin sustituir)-alcoxi; hidroxi; amino; S-sulfonamido o -NR^{18}R^{19};

(alquilo C1-C4 sin sustituir)-C-carboxi;

ácido carboxílico;

(alquilo C1-C4 sin sustituir)-carbonilo;

aldehído;

(arilo sin sustituir)-carbonilo;

acetilo;

S-sulfonamido;

N-sulfonamido;

amino; y

-NR^{18}R^{19}.

6. El compuesto o la sal de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que cualquier par R^{8}, R^{8'} y R^{8''} son restos -(alk_{1})rM.

7. El compuesto o la sal de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que J^{1} se elige entre el conjunto formado por nitrógeno, oxígeno y azufre y J^{2}, J^{3} y J^{4} son carbono.

8. El compuesto o la sal de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que J^{1} y J^{3} son nitrógeno y J^{2} y J^{4} son carbono.

9. Una composición farmacéutica que contiene un compuesto o una sal según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

10. El uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad elegida entre un cáncer elegido entre el grupo formado por un carcinoma celular escamoso, un astrocitoma, un glioblastoma, un cáncer de mama, un glioma, un melanoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de pulmón de células pequeñas, un cáncer de vejiga, un cáncer de ovarios, un cáncer de próstata, un cáncer de cabeza o de cuello; un trastorno proliferante elegido entre el conjunto formado por una restinosis, una fibrosis, una psoriasis, una osteoartritis y una artritis reumatoide; una diabetes, una enfermedad autoinmune, un trastorno inflamatorio y una angiogénesis.