JP2003525296A - キナーゼ阻害剤としての３−（ピロリルラクトン）−２−インドリノン化合物 - Google Patents

キナーゼ阻害剤としての３−（ピロリルラクトン）−２−インドリノン化合物

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JP2003525296A JP2001564178A JP2001564178A JP2003525296A JP 2003525296 A JP2003525296 A JP 2003525296A JP 2001564178 A JP2001564178 A JP 2001564178A JP 2001564178 A JP2001564178 A JP 2001564178A JP 2003525296 A JP2003525296 A JP 2003525296A
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    • C07D491/04—Ortho-condensed systems

Abstract

(57)【要約】 本発明は，式（Ｉ）のある種のインドリノン化合物，その合成方法，および本発明のインドリノン化合物からなるコンビナトリアルライブラリに関する。本発明はまた，本発明のインドリノン化合物を用いて蛋白質キナーゼの機能を調節する方法，および蛋白質キナーゼおよび関連するシグナル伝達経路の機能を調節することにより疾病を治療する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】クロス・リファレンス 本出願は，米国特許仮出願６０／１８５，５３６（２０００年２月２８日出願
）に基づく優先権を主張する。この開示はその全体を本明細書の一部としてここ
に引用する。
【０００２】発明の分野 本発明は，ある種のインドリノン化合物，その合成方法，および本発明のイン
ドリノン化合物からなるコンビナトリアルライブラリに関する。本発明はまた，
本発明の化合物を用いて，蛋白質キナーゼ，特にＣＤＫ２蛋白質キナーゼの機能
を調節する方法，および蛋白質キナーゼ，特にＣＤＫ２蛋白質キナーゼの機能，
および関連するシグナル伝達経路を調節することにより疾病を治療する方法に関
する。
【０００３】発明の背景 以下の本発明の背景の記載は，本発明の理解を助けるために提供されるもので
あり，本発明に対する先行技術であるかまたはこれを記載すると認めるものでは
ない。
【０００４】 細胞シグナル伝達は，細胞外の刺激が細胞の内部にリレーされ，次に多様な細
胞プロセスを制御する基本的なメカニズムである。シグナル伝達の鍵となる生化
学的メカニズムの１つには，蛋白質の可逆的リン酸化が関与する。ポリペプチド
のリン酸化は，成熟蛋白質の構造および機能を変化させることによりその活性を
制御する。リン酸は，ほとんどの場合，蛋白質中のセリン，トレオニン，または
チロシンアミノ酸のヒドロキシル基（−ＯＨ）に存在する。
【０００５】 細胞エフェクターのリン酸化を媒介する酵素は一般に２つの群に分けられる。
第１の群は，アデノシン三リン酸から蛋白質基質にリン酸基を転移する蛋白質キ
ナーゼからなる。第２の群は，ホスホリル蛋白質基質からのリン酸基を加水分解
する蛋白質ホスファターゼからなる。蛋白質キナーゼと蛋白質ホスファターゼの
逆の機能は，シグナル伝達プロセスにおけるシグナルの流れを平衡させ制御する
。
【０００６】 蛋白質キナーゼおよび蛋白質ホスファターゼは，一般に２つのグループに分け
られる：レセプターおよび非レセプタータイプの蛋白質。ほとんどのレセプター
タイプ蛋白質ホスファターゼは，２つの保存された触媒ドメインを含み，それぞ
れは，２４０アミノ酸残基のセグメントを包含する（Ｓａｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．
，１９９１，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆ．２：５９−６５）。
レセプター蛋白質チロシンホスファターゼは，さらに，その細胞外ドメインのア
ミノ酸配列の多様性に基づいて副分類することができる（Ｓａｉｔｏ，ｅｔ ａ
ｌ．，上掲；Ｋｒｕｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７４１７−７４２１）。
【０００７】 蛋白質キナーゼおよび蛋白質ホスファターゼはまた，これが作用するアミノ酸
に基づいて，典型的には３つのクラスに分けられる。あるものはセリンまたはト
レオニンのみでリン酸の付加または加水分解を触媒し，あるものはチロシンのみ
でリン酸の付加または加水分解を触媒し，あるものはセリン，トレオニン，およ
びチロシンでリン酸の付加または加水分解を触媒する。
【０００８】 チロシンキナーゼは，細胞増殖に関与する他の蛋白質キナーゼの触媒活性を制
御することができる。不適切な活性を有する蛋白質キナーゼはまた，ある種の癌
に関与する。異常に上昇したレベルの細胞増殖は，制御されない活性を有するレ
セプターおよび非レセプター蛋白質キナーゼと関連する。
【０００９】 蛋白質キナーゼは，細胞増殖におけるその役割に加えて，細胞分化プロセスに
関与していると考えられている。細胞分化は，ある細胞においては，神経成長因
子（ＮＧＦ）または表皮成長因子（ＥＧＦ）刺激によって生ずる。細胞分化は，
急速な膜波打ち運動，細胞の平板化，および細胞接着の増加により特徴づけられ
る（Ｃｈａｏ，１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：９９５−９９７）。
【００１０】 癌およびその他の疾病の新規な治療を発見することをめざして，生物医学研究
者および化学者は，蛋白質キナーゼの機能を阻害する分子を設計し，合成し，試
験してきた。いくつかの小さい有機分子は蛋白質キナーゼの機能を調節する化合
物の一群を形成する。蛋白質キナーゼの機能を阻害することが報告されている分
子の例としては，限定されないが，ビス単環式，二環式または複素環式アリール
化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２），ビニレン−アザインドール誘導体（
ＰＣＴ ＷＯ９４／１４８０８），１−シクロプロピル−４−ピリジル−キノロ
ン類（米国特許５，３３０，９９２），スチリル化合物（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ ｅ
ｔ ａｌ． 米国特許５，２１７，９９９，表題"Ｓｔｙｒｙｌ ｃｏｍｐｏｕ
ｎｄｓ ｗｈｉｃｈ Ｉｎｈｉｂｉｔ ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ），スチリル置換ピリジル化合物（米
国特許５，３０２，６０６），ある種のキナゾリン誘導体（欧州特許出願０５６
６２６６Ａ１），セレオインドール類およびセレニド類（ＰＣＴ ＷＯ９４／０
３４２７），三環式ポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０），
およびベンジルホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５）が挙げられ
る。
【００１１】 細胞膜を横切ることができ，酸加水分解に耐性の化合物は，患者に経口投与さ
れた後に高度に生物利用性となることができるため，治療剤として利点を有する
可能性がある。しかし，これらの蛋白質キナーゼ阻害剤の多くは，蛋白質キナー
ゼの機能を弱くしか阻害しない。さらに，多くは種々の蛋白質キナーゼを阻害し
，したがって，疾病の治療剤として多くの副作用を引き起こすであろう。
【００１２】 癌を治療するための化合物の開発における著しい進歩にもかかわらず，当該技
術分野においては，特定の蛋白質キナーゼの機能を調節することができる化合物
を形成する特定の構造および置換パターンを同定することが求められている。本
発明はこの要求を満たすものである。
【００１３】発明の概要 本発明は，ある種のインドリノン化合物，およびこれらの化合物を用いて，蛋
白質キナーゼ，特にＣＤＫ２蛋白質キナーゼにより媒介される疾病を治療する方
法に関する。
【００１４】 すなわち，第１の観点において，本発明は，式（Ｉ）：
【化５】 ［式中： （ａ）各Ｒ1は，独立して任意に，（ｉ）−（ｘｉｖ）からなる群より選択され
： （ｉ）水素； （ｉｉ）ハロゲン，トリハロメチル，アルコキシ，カルボキシレート，アミノ，
ニトロ，エステル，および５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪
族環，またはヘテロ脂肪族環からなる群より選択される１，２，または３個の置
換基で任意に置換されていてもよい飽和または不飽和アルキルであって，ここで
各環は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニ
トロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２，または３個の
置換基で任意に置換されていてもよく； （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
ト，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２
，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい芳香族環または複素芳香族
環； （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
，アミノ，ニトロ，エステル，およびアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハ
ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より
独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい
芳香族環または複素芳香族環からなる群より独立して選択される１，２，または
３個の置換基で任意に置換されていてもよい脂肪族環またはヘテロ脂肪族環； （ｖ）式−（Ｘ1）n1−ＯＨのアルコールまたは式−（Ｘ2）n2−Ｏ−Ｘ3のアル
コキシアルキルであって，ここで，Ｘ1，Ｘ2，およびＸ3は，独立して，飽和ま
たは不飽和アルキル，アミド，および５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香
族環，脂肪族環，またはヘテロ脂肪族環からなる群より選択され，ここで，アル
キルおよび各環は，アルキル，アルコキシ，アリール，ヘテロアリール，ハロゲ
ン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルから
なる群より独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されて
いてもよく，；およびｎ１およびｎ２は，独立して，０または１であり； （ｖｉ）ハロゲンまたはトリハロメチル； （ｖｉｉ）式−（Ｘ4）n4−ＣＯＯＨのカルボン酸または式−（Ｘ5）n5−ＣＯＯ
−Ｘ6のエステルであって，ここで，Ｘ4，Ｘ5，およびＸ6は，独立して，アルキ
ルおよび５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環，またはヘテ
ロ脂肪族環からなる群より選択され；およびｎ４およびｎ５は，独立して，０ま
たは１であり； （ｖｉｉｉ）式−（Ｘ7）n7−ＮＨＣＯＸ8，−（Ｘ7）n7−ＮＨＣＳＸ8，−（Ｘ 9 ）n9−ＣＯＮＸ10Ｘ11，または式−（Ｘ9）n9−ＣＳＮＸ10Ｘ11のアミドまたは
チオアミドであって，ここで，Ｘ7およびＸ9は，それぞれ独立して，アルキルお
よび５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環，またはヘテロ脂
肪族環からなる群より選択され，ここで，各環は，アルキル，ハロゲン，トリハ
ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より
独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されていてもよく
；ｎ７およびｎ９は独立して，０または１であり；およびＸ8，Ｘ10，およびＸ1 1 は，それぞれ独立して，水素，アルキル，ヒドロキシル，アルコキシ，および
５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環，またはヘテロ脂肪族
環からなる群より選択され，ここで，環は，アルキル，アルコキシ，チオアルキ
ル，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２，
または３個の置換基で任意に置換されていてもよく；またはＸ10およびＸ11は，
一緒になって，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミ
ノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２，または
３個の置換基で任意に置換されていてもよい５員のまたは６員の脂肪族環または
ヘテロ脂肪族環または縮合二環を形成してもよく； （ｉｘ）式−（Ｘ12）n12−ＳＯ2ＮＸ13Ｘ14または式−（Ｘ12）n12−ＮＸ13−
ＳＯ2−Ｘ14のスルホンアミドであって，ここで，Ｘ12は，アルキル，および５
員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環，またはヘテロ脂肪族環
からなる群より選択され，ここで，アルキルおよび各環は，アルキル，ハロゲン
，ヒドロキシ，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエ
ステルからなる群より独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に
置換されていてもよく；ｎ１２は，０，１，または２であり；およびＸ13，およ
びＸ14は，独立して，水素，アルキル，および５員または６員の芳香族環，ヘテ
ロ芳香族環，３員，４員，５員または６員の脂肪族環，またはヘテロ脂肪族環か
らなる群より選択され，ここで，アルキルおよび各環は，アルキル，アルコキシ
，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，トリハロメチル，アルデヒド，カルボ
キシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択され
る１，２，または３個の置換基で任意に置換されていてもよく；または，Ｘ13お
よびＸ14は，一緒になって，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシ
レート，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１
，２，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい５員のまたは６員の脂
肪族環またはヘテロ脂肪族環または縮合二環を形成し； （ｘ）式−（Ｘ15）n15−ＳＯ3Ｈのスルホンであって，ここで，Ｘ15は，アルキ
ル，および５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環，またはヘ
テロ脂肪族環からなる群より選択され，ここで，アルキルおよび各環は，アルキ
ル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエ
ステルからなる群より独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に
置換されていてもよく；ｎ１５は，０，１，または２であり； （ｘｉ）式−（Ｘ16）n16−ＮＸ17Ｘ18のアミンであって，ここで，Ｘ16は，飽
和または不飽和アルキル，および５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環
，または脂肪族環からなる群より選択され；ｎ１６は０または１であり；および
Ｘ17およびＸ18は，独立して，水素，飽和または不飽和アルキル，および５員の
または６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，または脂肪族環からなる群より選択さ
れ，ここで，各環は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２，
または３個の置換基で任意に置換されていてもよく； （ｘｉｉ）式−（Ｘ19）n19−ＣＯ−Ｘ20のケトンであって，ここで，Ｘ19およ
びＸ20は，独立して，アルキルおよび５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香
族環，脂肪族環，またはヘテロ脂肪族環からなる群より選択され，ここで，アル
キルおよび各環は，アルキル，５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，
脂肪族環，またはヘテロ脂肪族環，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
ト，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２
，または３個の置換基で任意に置換されていてもよく；およびｎ１９は０または
１であり； （ｘｉｉｉ）式−ＮＯ2のニトロ基；または （ｘｉｖ）２つの隣接するＲ1基は，一緒になって，２つの隣接するＡ，Ｂ，Ｄ
，またはＥとともに，任意に置換されていてもよい５員のまたは６員の脂肪族環
またはヘテロ脂肪族環を形成し； （ｂ）Ｒ2およびＲ4は，それぞれ独立して，（ｉ）−（ｉｖ）からなる群より選
択され： （ｉ）水素； （ｉｉ）ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，エス
テル，および５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環，または
ヘテロ脂肪族環からなる群より選択される１，２，または３個の置換基で任意に
置換されていてもよい飽和または不飽和アルキルであって，各環は，アルキル，
ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステ
ルからなる群より独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換
されていてもよく； （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
ト，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２
，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい芳香族環または複素芳香族
環；および （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
，アミノ，ニトロ，エステル，およびアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハ
ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より
独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい
芳香族環または複素芳香族環からなる群より独立して選択される１，２，または
３個の置換基で任意に置換されていてもよい脂肪族環またはヘテロ脂肪族環； （ｃ）Ｒ3およびＲ5は，それぞれ独立して，（ｉ）−（ｉｖ）からなる群より選
択され： （ｉ）水素； （ｉｉ）ヒドロキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，
ニトロ，エステル，および５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪
族環，またはヘテロ脂肪族環からなる群より選択される１，２，または３個の置
換基で任意に置換されていてもよい飽和または不飽和アルキルであって，各環は
，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，
およびエステルからなる群より独立して選択される１，２，または３個の置換基
で任意に置換されていてもよく； （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
ト，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２
，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい芳香族環または複素芳香族
環；および （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
，アミノ，ニトロ，エステル，およびアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハ
ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より
独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい
芳香族環または複素芳香族環からなる群より独立して選択される１，２，または
３個の置換基で任意に置換されていてもよい脂肪族環またはヘテロ脂肪族環； （ｄ）Ａ，Ｂ，Ｄ，およびＥは，それぞれ独立して，炭素または窒素であり，た
だしＡ，Ｂ，Ｄ，およびＥの０，１，または２個が窒素であり；かつ，Ａ，Ｂ，
Ｄ，またはＥのいずれかが窒素である場合，前記Ａ，Ｂ，Ｄ，またはＥにはＲ1
が結合しておらず； （ｅ）Ｇは窒素または酸素であり，ただし，Ｇが酸素であるときＲ5は存在せず
； （ｆ）ｍは，２，３，または４であり；および （ｇ）ｑは１，２，３，または４である］ の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を提供する。
【００１５】 第２の観点においては，本発明は，式（Ｉ）の１またはそれ以上の化合物また
はその薬学的に許容しうる塩および薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物
に関する。
【００１６】 第３の観点においては，本発明は，生物，特にヒトにおいて，蛋白質キナーゼ
，特に，ＣＤＫ２蛋白質キナーゼの異常な活性により媒介される疾病を治療する
方法に関する。該方法は，前記生物に式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を投与
することを含む。そのような疾病には，例として，限定されないが，癌，糖尿病
，肝硬変，心臓血管疾病，例えばアテローム性動脈硬化症，新脈管形成，免疫学
的疾病，例えば自己免疫疾病および腎臓疾病が含まれる。いかなる特定の蛋白質
キナーゼにも限定されないが，本発明の化合物は，他のキナーゼ，例えば，ＦＬ
Ｋ，ＦＧＦＲ，ＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，およびＳＲＣと比較してＣＤＫ２蛋白質
キナーゼに対して選択的であると考えられる。
【００１７】 第４の観点においては，本発明は，本発明の化合物を用いて，ＰＫ，特に，レ
セプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ），非レセプター蛋白質チロシンキナーゼ（
ＣＴＫ）およびセリン／トレオニン蛋白質キナーゼ（ＳＴＫ）の触媒活性を調節
する方法に関し，該方法は，インビトロで行ってもインビボで行ってもよい。特
に，その触媒活性が本発明の化合物により調節されるレセプター蛋白質キナーゼ
は，ＥＧＦ，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，ＨＥＲ４，ＩＲ，ＩＧＦ−１Ｒ，ＩＲＲ，Ｐ
ＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，Ｃ−Ｋｉｔ，Ｃ−ｆｍｓ，Ｆｌｋ−１
Ｒ，Ｆｌｋ４，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，ＦＧＦＲ−１Ｒ，ＦＧＦＲ−
２Ｒ，ＦＧＦＲ−３ＲおよびＦＧＦＲ−４Ｒからなる群より選択される。その触
媒活性が本発明の化合物により調節される細胞性チロシンキナーゼは，Ｓｒｃ，
Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，ＺＡＰ７０，Ｆｅｓ／Ｆｐｓ，Ｆａｋ，Ｊａ
ｋ，Ａｃｋ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，Ｆｇｒおよび
Ｙｒｋからなる群より選択される。その触媒活性が本発明の化合物により調節さ
れるセリン−トレオニン蛋白質キナーゼは，ＣＤＫ２およびＲａｆからなる群よ
り選択される。
【００１８】 第５の観点においては，本発明は，異常な蛋白質キナーゼ活性により媒介され
る疾病を治療するのに有用な医薬品の製造における，式（Ｉ）の化合物の使用に
関する。
【００１９】 第６の観点においては，本発明は，オキシインドールをアルデヒドまたはケト
ンと反応させることにより形成することができる少なくとも１０種類のインドリ
ノン化合物のコンビナトリアルライブラリを提供し，ここで，オキシインドール
は以下の構造を有し：
【化６】 アルデヒドまたはケトンは以下の構造を有する：
【化７】 ［式中，Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，ｍ，およびｑは本明細書に
記載されるとおりである］。
【００２０】 最後に，本発明はまた，蛋白質キナーゼを発現する細胞を本発明の化合物また
は塩と接触させ，次にその影響について前記細胞をモニターすることにより，蛋
白質キナーゼの触媒活性を調節する化学化合物を同定する方法に関する。
【００２１】発明の詳細な説明 定義 特に記載しない限り，明細書および特許請求の範囲において用いられる以下の
用語は，以下に議論される意味を有する。
【００２２】 本明細書において用いられる場合，"アルキル"との用語は，脂肪族炭化水素基
を表す。アルキル成分は，"飽和アルキル"基（すなわち，アルケンまたはアルキ
ン成分を含まない）でありうる。アルキル成分はまた，"不飽和アルキル"成分（
少なくとも１つのアルケンまたはアルキン成分を含む）であってもよい。"アル
ケン"成分とは，少なくとも２つの炭素原子および少なくとも１つの炭素−炭素
二重結合からなる基を表し，"アルキン"成分とは，少なくとも２つの炭素原子お
よび少なくとも１つの炭素−炭素三重結合からなる基を表す。アルキル成分は，
飽和であっても不飽和であってもよく，分枝鎖，非分枝鎖，または環状であって
もよい。
【００２３】 アルキル基は，１−２０個の炭素原子を有する（数値範囲，例えば"１−２０"
は，本明細書において記載される場合には常に，所定の範囲内の各整数を表す。
例えば，"１−２０個の炭素原子"とは，アルキル基が１個の炭素原子，２個の炭
素原子，３個の炭素原子，以下同様にして，２０個までの炭素原子からなってい
てもよいことを意味する。ただし，この定義はまた，"アルキル"との用語が数値
範囲が示されずに用いられることもカバーする）。より好ましくは，これは１−
１０個の炭素原子を有する"中級"サイズのアルキルである。最も好ましくはこれ
は１−４個の炭素原子を有する"低級"アルキルであり，例えば，メチル，エチル
，プロピル，イソプロピル，ｎ−ブチル，ｔｅｒｔ−ブチル，ｉｓｏ−ブチルが
含まれる。アルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい。置換され
ている場合，置換基は，好ましくは，独立して，ヒドロキシ，アルコキシ，メル
カプト，アルキルチオ，シアノ，ハロ，カルボニル，ニトロ，およびアミノから
個々に独立して選択される１またはそれ以上の基である。
【００２４】 "芳香族"との用語は，共役したパイ電子系を有する少なくとも１つの環を有す
る，６−１２個の炭素原子を有する単環または二環の芳香族基を表し，例えば，
フェニル，ナフチルまたはアントラセン基が含まれる。
【００２５】 "複素芳香族"との用語は，５−１０個の環原子を有する単環または二環芳香族
基であって，ここで，１，２または３個の環原子は窒素，酸素またはイオウから
なる群より選択され，残りの環原子は炭素である基を表し，例えば，ピリジン，
ピロール，チオフェン，インドール，イミダゾール，キノリン，イソキノリン，
ピラジン，フラン，ピリミジン，オキサゾール，トリアゾール，ピラゾール等が
含まれる。
【００２６】 "脂肪族環"との用語は，３−１０個の炭素原子を含む飽和環状基を表し，例え
ば，シクロプロパン，シクロブタン，シクロペンタン，シクロヘキサン等が含ま
れる。
【００２７】 "ヘテロ脂肪族環"との用語は，１，２または３個の環原子が，窒素，イオウ，
スルホキシド，スルホン，−ＳＯ2Ｏ−基または酸素からなる群より選択され，
残りの環原子は炭素である，５−１０個の環原子を有する飽和環状基を表し，例
えば，テトラヒドロピラン，ピペリジン，ピロリジン，ピペラジン，モルホリン
等が含まれる。
【００２８】 "アミン"との用語は，式−ＮＲａＲｂの化学成分を表し，ここで，Ｒａおよび
Ｒｂは，独立して，水素，飽和または不飽和のアルキル，および５員または６員
の芳香族環または複素芳香族環からなる群より選択され，環は，アルキル，ハロ
ゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，ニトロ，およびエステル成分からな
る群より独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されてい
てもよい。
【００２９】 "ハロゲン"との用語は，フッ素，塩素，臭素およびヨウ素からなる群より選択
される原子を表す。
【００３０】 "トリハロメチル"との用語は，−ＣＸ3基を表し（式中，Ｘはハロゲンである
），例えばトリフルオロメチルが含まれる。
【００３１】 "カルボン酸"または"カルボキシレート"との用語は，式−（Ｒ）n−ＣＯＯＨ
を有する化学成分を表す（式中，Ｒは，飽和または不飽和のアルキルおよび５員
または６員の芳香族環または複素芳香族環からなる群より選択され，ｎは０また
は１である）。
【００３２】 "エステル"との用語は，式−（Ｒ）n−ＣＯＯＲ’を有する化学成分を表す（
式中，ＲおよびＲ’は，独立して，飽和または不飽和のアルキルおよび５員また
は６員の芳香族環または複素芳香族環からなる群より選択され，ｎは０または１
である。
【００３３】 "アルデヒド"との用語は，式−（Ｒ）n−ＣＨＯを有する化学成分を表す（式
中，Ｒは，独立して，飽和または不飽和のアルキルおよび５員または６員の芳香
族環または複素芳香族環からなる群より選択され，ｎは０または１である。１
【００３４】 "アルコキシ"との用語は，−ＯＲｃ基（式中，Ｒｃは，未置換低級アルキルで
ある）を表し，例えば，メトキシ，エトキシ，プロポキシ，ブトキシ等が含まれ
る。
【００３５】 "縮合二環"との用語は，芳香族環または複素芳香族環と縮合した５または６員
のヘテロ脂肪族環を表す。縮合二環の非限定的例は以下のとおりである：
【化８】
【００３６】 "任意"または"任意に"とは，その後に記載される事象または状況が生じてもよ
いが生じる必要はないこと，およびその記述がその事象または状況が生ずる場合
と生じない場合とを含むことを意味する。例えば，"ハロゲンで任意に置換され
ているアルキル基"とは，ハロゲンが存在してもよいが存在する必要はないこと
，およびその記述がアルキル基がハロゲン基で置換されている状況とアルキル基
がハロゲン基で置換されていない状況とを含むことを意味する。
【００３７】 同じ分子式を有するが，その原子の結合の種類または順序またはその原子の空
間の配置が異なる化合物は，"異性体"と称される。その原子の空間の配置が異な
る異性体は，"立体異性体"と称される。互いに鏡像ではない立体異性体は，"ジ
アステレオマー"と称され，互いに重ね合わせられない鏡像であるものは"エナン
チオマー"と称される。化合物が不斉中心を有する場合，例えば，これが４つの
異なる基と結合している場合，１対のエナンチオマーが可能である。エナンチオ
マーは，その不斉中心の絶対コンフィギュレーションにより特徴づけることがで
き，ＣａｈｎおよびＰｒｅｌｏｇのＲ−およびＳ−の順序規則により，または分
子が偏光平面のまわりに回転して，右旋性または左旋性として（すなわち，それ
ぞれ（＋）または（−）−異性体として）示されることにより記述される。キラ
ル化合物は個々のエナンチオマーとして，またはそれらの混合物として存在しう
る。同じ割合のエナンチオマーを含む混合物は"ラセミ混合物"と称される。
【００３８】 本発明の化合物は，１またはそれ以上の不斉中心を有するかもしれない。した
がって，そのような化合物は，個々の（Ｒ）−または（Ｓ）−立体異性体として
，またはそれらの混合物として製造することができる。例えば，式（Ｉ）の化合
物のＲ1置換基が２−メトキシエチルである場合，メトキシ基が結合している炭
素は不斉中心であり，したがって，式（Ｉ）の化合物は（Ｒ）−または（Ｓ）−
立体異性体として存在しうる。特に記載しない限り，本明細書および特許請求の
範囲における特定の化合物の記述または命名は，個々のエナンチオマーおよびそ
の混合物（ラセミまたはそれ以外）の両方を含むことが意図される。立体異性体
の立体化学の決定および分離の方法は当該技術分野においてよく知られている（
"Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ"，第４版，Ｊ．Ｍａ
ｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２
の第４節の考察を参照）。
【００３９】 式（Ｉ）の化合物は，互変異性および構造的異性の現象を示すかもしれない。
例えば，本明細書に記載される化合物は，２−インドリノン成分をピロール成分
につなぐ二重結合のまわりにＥまたはＺコンフィギュレーションをとることがで
きるか，またはＥおよびＺの混合物でありうる。本発明は，ＲＴＫ，ＣＴＫおよ
び／またはＳＴＫ活性を調節する能力を有するすべての互変異性および構造的異
性型およびそれらの混合物を包含し，特定の１つの互変異性および構造的異性型
に限定されない。
【００４０】 "医薬組成物"とは，本明細書に記載される１またはそれ以上の化合物またはそ
の生理学的に／薬学的に許容しうる塩またはプロドラッグと，他の化学成分，例
えば，生理学的に／薬学的に許容しうる担体および賦形剤との混合物を表す。医
薬組成物の目的は，化合物の生物への投与を容易にすることである。
【００４１】 式（Ｉ）の化合物はまたプロドラッグとしても作用することができる。"プロ
ドラッグ"とは，インビボで親薬剤に変換される薬剤を表す。プロドラッグは，
場合により，親薬剤より投与が容易であるかもしれないため，しばしば有用であ
る。例えば，プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能であるが，親薬
剤はそうではない。プロドラッグはまた，親薬剤よりも医薬組成物中で改良され
た溶解性を有するかもしれない。プロドラッグの例は，限定されないが，エステ
ル（"プロドラッグ"）として投与されて，水溶性であることが移動に不利である
細胞膜の通過を容易にし，次に，水溶性であることが有利である細胞内に入った
後，代謝的に加水分解されて活性種のカルボン酸となるような，本発明の化合物
であろう。
【００４２】 プロドラッグのさらに別の例は，短いポリペプチド，例えば，限定されないが
，末端アミノ基を介して本発明の化合物のカルボキシ基に結合した２−１０アミ
ノ酸のポリペプチドであり，ポリペプチドはインビボで加水分解されるかまたは
代謝されて活性分子を放出する。式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは本発明の範
囲内である。
【００４３】 さらに，式（Ｉ）の化合物が生物，例えばヒトの体内で酵素により代謝されて
，代謝産物を生成し，これが蛋白質キナーゼの活性を調節しうることが企図され
る。そのような代謝産物は本発明の範囲内である。
【００４４】 "コンビナトリアルライブラリ"とは，化合物の多次元アレイにおいて，１つの
次元の各化合物を他の次元の各化合物と反応させることにより形成されるすべて
の化合物を表す。本発明の文脈においては，アレイは２次元であり，一方の次元
は本発明の全オキシインドールであり，他方の次元は本発明の全アルデヒドであ
る。インドリノン化合物を形成するために，各オキシインドールを各アルデヒド
と反応させることができる。このようにして形成されるすべてのインドリノン化
合物は，本発明の範囲内である。また，本発明のオキシインドールのいくつかと
本発明のすべてのアルデヒド，またはすべてのオキシインドールとアルデヒドの
いくつかと，またはオキシインドールのいくつかとアルデヒドのいくつかとを反
応させることにより形成される，より小さいコンビナトリアルライブラリも，本
発明の範囲内である。
【００４５】 本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる担体"とは，生物に有意な
刺激を引き起こさず，投与された化合物の生物学的活性および特性を排除しない
担体または希釈剤を表す。
【００４６】 "薬学的に許容しうる賦形剤"とは，医薬組成物に添加して化合物の投与をさら
に容易にする不活性物質を表す。賦形剤の例には，限定されないが，炭酸カルシ
ウム，リン酸カルシウム，種々の糖および各種のデンプン，セルロース誘導体，
ゼラチン，植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００４７】 本明細書において用いる場合，"薬学的に許容しうる塩"との用語は，親化合物
の生物学的効力および特性を保持している塩を表す。そのような塩には，以下の
ものが含まれる： （ｉ）親化合物の遊離塩基を，例えば塩酸，臭化水素酸，硝酸，リン酸，硫酸，
および過塩素酸等の無機酸と，または酢酸，シュウ酸，（Ｄ）または（Ｌ）リン
ゴ酸，マレイン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホ
ン酸，サリチル酸，酒石酸，クエン酸，コハク酸またはマロン酸等の有機酸と，
好ましくは，塩酸または（Ｌ）−リンゴ酸と反応させることにより得られる酸付
加塩，例えば５−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−
３−イリデンメチル）−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸（
２−ジエチルアミノエチル）アミドのＬ−リンゴ酸塩；または （２）親化合物中に存在する酸性プロトンが，金属イオン，例えば，アルカリ金
属イオン，アルカリ土類金属イオン，またはアルミニウムイオンで置き換えられ
るか，または有機塩基，例えばエタノールアミン，ジエタノールアミン，トリエ
タノールアミン，トロメタミン，Ｎ−メチルグルカミン等と配位することにより
形成される塩。
【００４８】 "ＰＫ"とは，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ（ＲＴＫ），非レセプターま
たは"細胞性"チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）およびセリントレオニンキナーゼ（Ｓ
ＴＫ）を表す。
【００４９】 "調節"または"調節する"とは，蛋白質キナーゼ，特にＣＤＫ２キナーゼの触媒
活性が変化することを表す。特に，調節するとは，蛋白質キナーゼ，特にＣＤＫ
２キナーゼの触媒活性が活性化されることを表し，好ましくは，蛋白質キナーゼ
，特にＣＤＫ２キナーゼが暴露される化合物または塩の濃度に依存して蛋白質キ
ナーゼ，特にＣＤＫ２キナーゼの触媒活性が活性化または阻害され，またはより
好ましくは，蛋白質キナーゼ，特にＣＤＫ２キナーゼの触媒活性が阻害されるこ
とを表す。
【００５０】 "治療上有効量"とは，治療される疾患の１またはそれ以上の症状をある程度緩
和するであろう，投与される化合物の量を表す。癌の治療に関しては，治療上有
効量は， （１）腫瘍の大きさを減少させる， （２）腫瘍の転移を阻害する（すなわち速度をある程度減じる，好ましくは停止
する）， （３）腫瘍の成長をある程度阻害する（すなわち速度をある程度減じる，好まし
くは停止する），および／または （４）癌に関連した１またはそれ以上の症状をある程度緩和する（または，好ま
しくは除去する）という効果を有する量を表す。
【００５１】 "機能"との用語は，蛋白質キナーゼの細胞における役割を表す。蛋白質キナー
ゼのファミリーには，シグナリングカスケードの多くの段階，例えば，細胞成長
，移動，分化，遺伝子発現，筋肉構築，グルコース代謝，細胞性蛋白質合成およ
び細胞サイクルの制御を制御するカスケードを制御するメンバーが含まれる。
【００５２】 本発明の文脈においては，"触媒活性"との用語は，蛋白質キナーゼが基質をリ
ン酸化する速度を規定する。触媒活性は，例えば，生成物に変換される基質の量
を時間の関数として決定することにより測定することができる。基質のリン酸化
は，蛋白質キナーゼの活性部位において生ずる。活性部位は，通常は，基質が蛋
白質キナーゼに結合し，リン酸化される空洞である。
【００５３】 本明細書において用いられる場合，"基質"との用語は，蛋白質キナーゼにより
リン酸化される分子を表す。基質は，好ましくはペプチドであり，より好ましく
は蛋白質である。
【００５４】 "活性化する"との用語は，蛋白質キナーゼの細胞性機能を増加させることを表
す。蛋白質キナーゼの機能は，好ましくは，天然の結合パートナーとの相互作用
であり，最も好ましくは触媒活性である。
【００５５】 "阻害する"との用語は，蛋白質キナーゼの細胞性機能を低下させることを表す
。蛋白質キナーゼの機能は，好ましくは，天然の結合パートナーとの相互作用で
あり，最も好ましくは触媒活性である。
【００５６】 "調節する"との用語は，蛋白質キナーゼと結合パートナーとの間に複合体が形
成される確率を増加または減少させることにより，蛋白質キナーゼの機能を変化
させることを表す。調節剤は，好ましくは，蛋白質キナーゼと結合パートナーと
の間にそのような複合体が形成される確率を増加させ，より好ましくは，蛋白質
キナーゼに暴露される化合物の濃度に依存して，蛋白質キナーゼと結合パートナ
ーとの間に複合体が形成される確率を増加または減少させ，最も好ましくは，蛋
白質キナーゼと結合パートナーとの間に複合体が形成される確率を減少させる。
調節剤は，好ましくは，蛋白質キナーゼの触媒活性を活性化し，より好ましくは
，蛋白質キナーゼに暴露される化合物の濃度に依存して，蛋白質キナーゼの触媒
活性を活性化または阻害し，または最も好ましくは，蛋白質キナーゼの触媒活性
を阻害する。
【００５７】 "複合体"との用語は，互いに結合する少なくとも２つの分子の組み合わせを表
す。シグナル伝達複合体はしばしば，互いに結合する少なくとも２つの蛋白質分
子を含む。
【００５８】 "結合パートナー"との用語は，細胞において蛋白質キナーゼに結合する化合物
を表す。結合パートナーは，蛋白質キナーゼシグナル伝達プロセスにおいてシグ
ナルを伝播する役割を果たすことができる。蛋白質キナーゼと結合パートナーと
の間の相互作用の変化は，相互作用が形成される可能性の増加または減少，また
は蛋白質キナーゼ／結合パートナー複合体の濃度の増加または減少した濃度とし
て現れることができる。結合パートナーは天然の結合パートナーであってもよく
，この場合，結合パートナーは，細胞の正常な機能の間に蛋白質キナーゼに結合
するものである。しかし，蛋白質キナーゼに結合する他の分子もまた蛋白質キナ
ーゼの結合パートナーである。
【００５９】 蛋白質キナーゼの結合パートナーは，蛋白質キナーゼの細胞外または細胞内領
域に高い親和性をもって結合することができる。高い親和性とは，１０-6Ｍのオ
ーダーまたはそれより低い平衡結合定数を表す。さらに，天然の結合パートナー
はまた，蛋白質キナーゼの細胞内領域と過渡的に相互作用して，これを化学的に
修飾することができる。蛋白質キナーゼの天然の結合パートナーは，限定されな
いが，ＳＲＣホモロジー２（ＳＨ２）または３（ＳＨ３）ドメイン，他のホスホ
リルチロシン結合（ＰＴＢ）ドメイン，グアニンヌクレオチド交換因子，蛋白質
ホスファターゼ，および他の蛋白質キナーゼから選択される。蛋白質キナーゼと
その天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化を検出する方法は，当該技術
分野において容易に利用可能である。
【００６０】 本明細書において用いられる場合，"接触させる"との用語は，本発明の化合物
を含む溶液をこの方法の細胞を浸す液体培地と混合することを表す。化合物を含
む溶液はまた，化合物のこの方法の細胞内への取り込みを容易にする他の成分，
例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいてもよい。本発明の化合物
を含む溶液は，輸送装置，例えばピペットに基づく装置またはシリンジに基づく
装置を用いることにより，細胞を浸す培地に加えることができる。
【００６１】 本発明の化合物は，好ましくはインビトロで蛋白質キナーゼの活性を調節する
。これらの化合物は，好ましくは問題とする疾病または疾患の治療に対応する活
性についての１またはそれ以上のインビトロアッセイ（以下の実施例において記
載されるようなアッセイ）において陽性の結果を示す。
【００６２】 本発明はまた，蛋白質キナーゼの機能を調節する化合物を同定する方法を特徴
とする。該方法は，以下の工程を含む：（ａ）蛋白質キナーゼを発現する細胞を
化合物と接触させ；そして（ｂ）細胞に及ぼす影響をモニターする。細胞に及ぼ
す影響は，好ましくは，細胞表現型の変化または無変化であり，より好ましくは
，これは細胞増殖の変化または無変化であり，さらに好ましくは，これは蛋白質
キナーゼの触媒活性の変化または無変化であり，最も好ましくは，これは本明細
書に記載されるような蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用
の変化または無変化である
【００６３】 "モニターする"との用語は，化合物をこの方法の細胞に加える影響を観察する
ことを表す。影響は，細胞表現型，細胞増殖，蛋白質キナーゼ触媒活性，または
蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化として現れるこ
とができる。
【００６４】 "影響"との用語は，細胞表現型または細胞増殖の変化または無変化を記述する
。"影響"はまた，蛋白質キナーゼの触媒活性の変化または無変化を記述しうる。
"影響"はまた，蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用の変化
または無変化を記述しうる。
【００６５】 "細胞表現型"との用語は，細胞または組織の外見，または細胞または組織の機
能を表す。細胞表現型の例は，細胞の大きさ（縮小または拡大），細胞増殖（細
胞の数の増加または減少），細胞分化（細胞の形の変化または無変化），細胞生
存，アポトーシス（細胞死），代謝栄養物の利用（例えばグルコース取り込み）
である。細胞表現型の変化または無変化は，当該技術分野において知られる技術
により容易に測定される。
【００６６】 好ましい態様においては，本発明は，本発明の化合物を同定する方法を特徴と
する。該方法は以下の工程を含む：（ａ）細胞を溶解させて蛋白質キナーゼを含
む溶解物とし；（ｂ）蛋白質キナーゼを抗体に吸着させ；（ｃ）吸着した蛋白質
キナーゼを基質とともにインキュベートし；そして（ｄ）基質を固体支持体また
は抗体に吸着させる。
【００６７】 別の好ましい態様においては，細胞に及ぼす影響をモニターする工程は，基質
のリン酸濃度を測定することを含む。
【００６８】 "抗体"との用語は，蛋白質キナーゼまたはそのフラグメントに特異的結合親和
性を有する抗体（例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体），また
は抗体フラグメントを表す。
【００６９】 "特異的結合親和性"とは，抗体が，特定の条件下において，他のポリペプチド
に結合するより高い親和性をもって標的（蛋白質キナーゼ）ポリペプチドに結合
することを意味する。蛋白質キナーゼに対して特異的結合親和性を有する抗体は
，免疫複合体が形成するような条件下で試料を抗体と接触させ，蛋白質キナーゼ
に結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，試料中の蛋白質
キナーゼの存在および／または量を検出するための方法において用いることがで
きる。そのような方法を実施するための診断キットは，抗体を含む第１の容器，
および抗体の結合パートナーと標識，例えば放射性同位体とのコンジュゲートを
有する第２の容器を含むように構築することができる。診断キットはまた，ＦＤ
Ａに認可された用途の通知およびその指針を含んでいてもよい。
【００７０】 "ポリクローナル"との用語は，抗原またはその抗原性機能的誘導体で免疫した
動物の血清から誘導される抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクロー
ナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫す
ることができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を
増加させることができる。
【００７１】 "モノクローナル抗体"は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団であ
る。モノクローナル抗体は，連続細胞株の培養物による抗体分子の生成を与える
任意の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる
方法により得ることができる。例えば，Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒ
ｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５），および米国特許．４，３７６，１１
０を参照されたい。
【００７２】 "抗体フラグメント"との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示
する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す
。超可変領域は，物理的にポリペプチド標的に結合する抗体の部分である。
【００７３】 本発明はまた，キナーゼシグナル伝達を制御する方法を特徴とする。該方法は
，被験者に，治療上有効量の本明細書に記載される本発明の化合物を投与するこ
とを含む。
【００７４】 さらに，本発明は，生物において異常な状態を予防または治療する方法を特徴
とし，ここで，異常な状態は，蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の
相互作用により特徴づけられるシグナル伝達経路の異常に関連する。該方法は，
以下の各工程を含む：（ａ）本明細書に記載される本発明の化合物を投与し；そ
して（ｂ）異常な相互作用を促進または中断させる。生物は，好ましくは哺乳動
物であり，異常な状態は好ましくは癌である。別の好ましい態様においては，異
常な状態は，新脈管形成関連疾患または，皮膚，眼，神経，心血管または免疫の
疾患である。異常な状態のいくつかの特定の例には，高血圧，鬱病，一般的不安
症，恐怖症，外傷後ストレス症候群，思春期人格障害，性的不全，摂取疾患，肥
満，化学物質依存症，群発性頭痛，片頭痛，疼痛，アルツハイマー病，強迫性障
害，恐慌性障害，記憶障害，パーキンソン病，内分泌疾患，血管痙攣，小脳性運
動失調，および胃腸管疾患が含まれる。
【００７５】 シグナル伝達プロセスに関して，"異常"との用語は，生物において過剰発現ま
たは過小発現されているか，その触媒活性が野生型蛋白質キナーゼ活性より低い
かまたは高いように変異しているか，天然の結合パートナーともはや相互作用す
ることができないように変異しているか，もはや別の蛋白質キナーゼまたは蛋白
質ホスファターゼにより修飾されることができないか，またはもはや天然の結合
パートナーと結合することができない蛋白質キナーゼを表す。
【００７６】 "異常な相互作用を促進または破壊する"との用語は，本発明の化合物を生物の
細胞または組織に投与することにより達成することができる方法を表す。化合物
は，複合体界面において多数の原子と望ましい相互作用を形成することにより，
蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相互作用を促進することができ
る。あるいは，化合物は，複合体界面において原子間に形成される望ましい相互
作用を妨害することにより，蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの間の相
互作用を阻害することができる。
【００７７】 "インドリノン"との用語は，当該技術分野において一般に理解されているよう
に用いられ，アルデヒド成分とオキシインドール成分から合成することができる
置換または非置換化合物の大きなサブクラスを含む。
【００７８】 "オキシインドール"との用語は，化学置換基で置換されているオキシインドー
ル化合物を表す。オキシインドール化合物は以下の一般構造のものである：
【化９】
【００７９】好ましい態様 好ましい態様においては，本発明は式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容
しうる塩に関し，ここで， （ａ）各Ｒ1は，独立して任意に，（ｉ）−（ｘｉｖ）からなる群より選択され
： （ｉ）水素； （ｉｉ）１−５個の炭素原子を含む分枝鎖または直鎖飽和アルキル； （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
ト，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２
，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい芳香族環または複素芳香族
環；および （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
，アミノ，ニトロ，エステル，およびアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハ
ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より
独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されていてもよい
芳香族環または複素芳香族環からなる群より独立して選択される１，２，または
３個の置換基で任意に置換されていてもよい脂肪族環またはヘテロ脂肪族環； （ｖ）式−（Ｘ1）n1−ＯＨのアルコールまたは式−（Ｘ2）n2−Ｏ−Ｘ3のアル
コキシアルキルであって，ここで，Ｘ1，Ｘ2およびＸ3は，独立して，１−５個
の炭素原子の分枝鎖または直鎖を含むアルキルおよび６員の芳香族環からなる群
より選択され；およびｎ１およびｎ２は，独立して，０または１であり； （ｖｉ）ハロゲン； （ｖｉｉ）式−（Ｘ4）n4−ＣＯＯＨのカルボン酸または式−（Ｘ5）n5−ＣＯＯ
−Ｘ6のエステルであって，ここで，Ｘ4，Ｘ5およびＸ6およびは，独立して，１
−５個の炭素原子の分枝鎖または直鎖を含むアルキルであり，およびｎ４および
ｎ５は，独立して，０または１であり； （ｖｉｉｉ）式−（Ｘ7）n7−ＮＨＣＯＸ8，または式−（Ｘ9）n9−ＣＯＮＸ10
Ｘ11のアミドであって，Ｘ7およびＸ9は，それぞれ独立して，１−５個の炭素原
子の分枝鎖または直鎖を含むアルキルであり，ｎ７およびｎ９は，独立して，０
または１であり；Ｘ8，Ｘ10およびＸ11は，それぞれ独立して，水素または１−
５個の炭素原子の分枝鎖または直鎖を含むアルキルであり；およびＸ10およびＸ 11 は，一緒になって，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２，
または３個の置換基で任意に置換されていてもよい５員のまたは６員の脂肪族環
またはヘテロ脂肪族環を形成し； （ｉｘ）式−（Ｘ12）n12−ＳＯ2ＮＸ13Ｘ14のスルホンアミドであって，ここで
Ｘ12は１−５個の炭素原子の分枝鎖または直鎖を含むアルキルであり；ｎ１２は
０または１であり；Ｘ13およびＸ14は，独立して，水素，アルキル，および５員
のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環，またはヘテロ脂肪族環か
らなる群より選択され，アルキルおよび各環は，アルキル，ハロゲン，ヒドロキ
シ，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルから
なる群より独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されて
いてもよく；または，Ｘ13およびＸ14は，一緒になって，アルキル，ハロゲン，
トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる
群より独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意に置換されていて
もよい５員のまたは６員の脂肪族環またはヘテロ脂肪族環を形成し； （ｘ）式−（Ｘ15）n15−ＳＯ3ＨＸ16のスルホンであって，ここで，Ｘ15は１−
５個の炭素原子の分枝鎖または直鎖を含むアルキルであり；およびｎ１５は，０
，１，または２であり；および （ｘｉ）式−（Ｘ16）n16−ＮＸ17Ｘ18のアミンであって，ここで，Ｘ16は１−
５個の炭素原子の分枝鎖または直鎖を含むアルキルであり；ｎ１６は，０または
１であり，およびＸ17およびＸ18は，独立して，水素，飽和または不飽和アルキ
ル，および５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，または脂肪族環から
なる群より選択され； （ｘｉｉ）式−（Ｘ19）n19−ＣＯ−Ｘ20のケトンであって，ここで，Ｘ19およ
びＸ20は，独立して，アルキルおよび５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香
族環，脂肪族環，またはヘテロ脂肪族環からなる群より選択され，ここで，アル
キルおよび各環は，アルキル，５員のまたは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，
脂肪族環，またはヘテロ脂肪族環，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
ト，アミノ，ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１，２
，または３個の置換基で任意に置換されていてもよく；およびｎ１９は０または
１であり； （ｘｉｉｉ）式−ＮＯ2のニトロ基；または （ｘｉｖ）２つの隣接するＲ1は，一緒になって，２つの隣接するＡ，Ｂ，Ｄ，
またはＥとともに，５員または６員の脂肪族環またはヘテロ脂肪族環を形成し； （ｂ）Ｒ2，Ｒ3，およびＲ4は水素であり； （ｃ）Ａ，Ｂ，Ｄ，およびＥは，それぞれ独立して，炭素または窒素であり，た
だし，Ａ，Ｂ，Ｄ，およびＥの０，１，または２個は窒素であり，好ましくはＡ
，Ｂ，Ｄ，およびＥは炭素であり；およびＡ，Ｂ，Ｄ，またはＥのいずれかが窒
素であるとき，Ａ，Ｂ，Ｄ，またはＥにはＲ1は結合しておらず； （ｄ）Ｇは窒素または酸素であり，ただし，Ｇが酸素であるときＲ5は存在せず
； （ｅ）ｍは，２，３，または４であり；および （ｆ）ｑは，１，２，または３である。
【００８０】 より好ましくは，式Ｉの化合物において， （ａ）各Ｒ1は，独立して任意に， （ｉ）水素； （ｉｉ）メチル，エチル，プロピル；エチレン，プロピレン，またはブチレン； （ｉｉｉ）式−（Ｘ1）n1−ＯＨのアルコールまたは式−（Ｘ2）n2−Ｏ−Ｘ3の
アルコキシアルキルであって，ここで，Ｘ1，Ｘ2，およびＸ3は，独立して，メ
チレン，エチレン，またはプロピレンからなる群より選択され，およびｎ１およ
びｎ２は，独立して，０または１であり； （ｉｖ）フルオロ，クロロ，またはブロモ； （ｖ）式−（Ｘ4）n4−ＣＯＯＨのカルボン酸であって，ここで，Ｘ4は，メチレ
ン，エチレン，またはプロピレンからなる群より選択され，およびｎ４は０また
は１であり； （ｖｉ）式−（Ｘ7）n7−ＮＨＣＯＸ8，または式−（Ｘ9）n9−ＣＯＮＸ10Ｘ11
のアミドであって，ここで，Ｘ7およびＸ9は，それぞれ独立して，メチレン，エ
チレン，およびプロピレンからなる群より選択され，およびｎ７およびｎ９は，
独立して，０または１であり，Ｘ8，Ｘ10，およびＸ11は，それぞれ独立して，
水素，メチル，エチル，およびプロピルからなる群より選択され，またはＸ10お
よびＸ11は，一緒になって，５員または６員のヘテロ脂肪族環を形成し； （ｖｉｉ）式−（Ｘ12）n12−ＳＯ2ＮＸ13Ｘ14のスルホンアミドであって，Ｘ12 は，メチレン，エチレン，またはプロピレンからなる群より選択され，およびｎ
１２は，０または１であり，Ｘ13およびＸ14は，独立して，水素，メチル，エチ
ル，プロピル，およびフェニルからなる群より選択され，メチル，エチル，プロ
ピル，およびフェニルは，ハロゲン，ヒドロキシ，カルボキシレート，アミノ，
ニトロ，およびエステルからなる群より独立して選択される１またはそれ以上の
置換基で任意に置換されていてもよく，またはＸ13およびＸ14は，一緒になって
縮合二環を形成し；または （ｖｉｉｉ）２つの隣接するＲ1基は，一緒になって，２つの隣接するＡ，Ｂ，
Ｄ，またはＥとともに６員のヘテロ脂肪族環を形成し； からなる群より選択され； （ｂ）Ａ，Ｂ，Ｄ，およびＥは炭素であり； （ｃ）Ｘは，窒素または酸素であり； （ｄ）ｍは４であり；および （ｅ）ｑは２である。
【００８１】 さらにより好ましくは，式ＩのＲ1は，独立して，メチル，メトキシ，２−ヒ
ドロキシエチル，フェニル，２−メトキシフェニル，３−メトキシフェニル，４
−メトキシフェニル，４−フルオロフェニル，４−クロロフェニル，４−ブロモ
フェニル，４−ヨードフェニル，３−カルボキシフェニル，ピリジル，−ＮＨＣ
（Ｏ）ＣＨ3，−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ3）2，−ＣＯＯＨ，−ＳＯ2ＮＨ（ＣＨ3），
−ＳＯ2ＮＨ2，−ＳＯ2Ｎ（ＣＨ3）2，−ＳＯ2ＮＨ（ＣＨ（ＣＨ3）2），−ＳＯ 2 ＮＨ（Ｃ6Ｈ5），−ＳＯ2ＮＨ（３−クロロフェニル），および−ＳＯ2Ｎ（Ｃ
Ｈ3）（３−クロロフェニル）からなる群より選択される。
【００８２】 本発明の好ましいインドリノン化合物は，表１に示される。 表１
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】
【表３】
【００８５】
【表４】
【００８６】 上述の化合物のいくつかは，式ＩＩの構造を有し，ここで，置換基は表２に示
されるとおりである。 表２
【化１０】
【００８７】
【表５】
【００８８】
【表６】
【００８９】 表１の化合物の２つは式ＩＩＩの構造を有し，ここで，置換基は表３に示され
るとおりである。 表３
【化１１】
【表７】
【００９０】一般合成 一般に，式（Ｉ）の化合物は，以下の構造：
【化１２】 を有するオキシインドールを，以下の構造：
【化１３】 ［式中，Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，ｍ，およびｑは発明の概要
において記載されるとおりである］ を有するアルデヒドまたはケトンと反応させることにより製造することができる
。
【００９１】 オキシインドールは，４−メチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イ
ンドール−５−スルホン酸メチルアミド，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−５−スルホン酸メチルアミド，４−メチル−２−オキソ−１，２
−ジヒドロ−インドール，５−メトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
ドール，６−メトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，５−ブロ
モ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，５−クロロ−２−オキソ−１
，２−ジヒドロ−インドール−４−（２−ヒドロキシ−エチル）−２−オキソ−
１，２−ジヒドロ−インドール，２−オキソ−５−フェニル−１，２−ジヒドロ
−インドール，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホ
ン酸アミド，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン
酸ジメチルアミド，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−ス
ルホン酸イソプロピルアミド，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドー
ル−５−スルホン酸フェニルアミド，Ｎ−（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１
Ｈ−インドール−６−イル）−アセトアミド，２−オキソ−６−フェニル−１，
２−ジヒドロ−インドール，５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イ
ンドール，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−カルボン酸
，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−カルボン酸，６−ク
ロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，６−ブロモ−２−オキソ−
１，２−ジヒドロインドール，６−（２−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−
１，２−ジヒドロ−インドール，６−（３−メトキシ−フェニル）−２−オキソ
−１，２−ジヒドロ−インドール，６−（４−メトキシ−フェニル）−２−オキ
ソ−１，２−ジヒドロ−インドール，６−（４−フルオロ−フェニル）−２−オ
キソ−１，２−ジヒドロ−インドール，２−オキソ−６−ピリジン−３−イル−
１，２−ジヒドロ−インドール，５−（２，３−ジヒドロ−インドール−１−ス
ルホニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，５−（３，４−ジヒ
ドロ−２Ｈ−キノリン−１−スルホニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イ
ンドール，５−（３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−スルホニル）−
２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，５−（５−ブロモ−２，３−ジヒ
ドロ−インドール−１−スルホニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インド
ール，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３
−クロロフェニル）−メチル−アミド，６−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジ
ヒドロ−インドール，５−クロロ−４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ
−インドール，７−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，３−
（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−イル）−安息香酸，
３−（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−イル）−安息香
酸，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３−
クロロ−フェニル）−アミド，５−ブロモ−４−メチル−２−オキソ−１，２−
ジヒドロ−インドール，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５
−カルボン酸ジメチルアミド，２−オキソ−５−（ピロリジン−１−カルボニル
）−１，２−ジヒドロ−インドール，５−（モルホリン−４−カルボニル）−２
−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，および
【化１４】 からなる群より選択される。
【００９２】 アルデヒドは，４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−２−ホルミルピ
ラノ［３，４−ｃ］ピロールおよび４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ
−（１Ｈ−２−ホルミル−ピロロ）［３，４−ｃ］ピリジンからなる群より選択
される。
【００９３】 反応は塩基の存在下で行う。塩基は，好ましくは，窒素塩基または無機塩基で
ある。"窒素塩基"は，当該技術分野において一般に用いられ，非環状および環状
アミンから選択される。窒素塩基の例には，限定されないが，アンモニア，メチ
ルアミン，トリメチルアミン，トリエチルアミン，アニリン，１，８−ジアザビ
シクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン，ジイソプロピルエチルアミン，ピロ
リジン，ピペリジン，およびピリジンまたは置換ピリジン（例えば，２，６−ジ
−ｔｅｒｔブチルピリジン）が含まれる。"無機塩基"とは，炭素原子を含まない
塩基である。無機塩基の例には，限定されないが，水酸化物，リン酸塩，亜硫酸
塩，水硫化物（ＳＨ−），およびアミドアニオンが含まれる。当業者には，いず
れの窒素塩基または無機塩基が所望の反応条件の要求に適合するかが明らかであ
る。本発明のある態様においては，用いる塩基は，ピロリジンまたはピペリジン
でありうる。別の態様においては，塩基は水酸アニオンであってもよく，好まし
くは，そのナトリウムまたはカリウム塩として用いられる。
【００９４】 本発明の化合物の合成は一般に溶媒中で実施する。反応の溶媒は，好ましくは
，プロトン性溶媒または非プロトン性溶媒である。"プロトン性溶媒"とは，溶質
にプロトンを与えることができる溶媒である。プロトン性溶媒の例には，限定さ
れないが，アルコールおよび水が含まれる。"非プロトン性溶媒"とは，通常の反
応条件下で，溶質にプロトンを与えない溶媒である。典型的な有機溶媒，例えば
，ヘキサン，トルエン，ベンゼン，塩化メチレン，ジメチルホルムアミド，クロ
ロホルム，テトラヒドロフランは，プロトン性溶媒のいくつかの例である。他の
非プロトン性溶媒もまた，本発明の範囲に含まれる。ある好ましい態様において
は，反応の溶媒はアルコールであり，これは好ましくは，イソプロパノールであ
ってもよく，最も好ましくはエタノールである。水は別の好ましいプロトン性溶
媒である。化学の技術分野においてＤＭＦとして知られるジメチルホルムアミド
は，好ましい非プロトン性溶媒である。
【００９５】 本発明の合成方法では，反応が高温，すなわち室温より高い温度で行われるこ
とが必要である。より好ましくは，高温は好ましくは約３０−１５０℃であり，
より好ましくは約８０−１００℃であり，最も好ましくはエタノールが沸騰する
温度である約８０−９０℃である（すなわち，エタノールの沸点）。ある温度に
ついて"約"とは，温度範囲が，好ましくは挙げられる温度の１０℃の範囲内，よ
り好ましくは，挙げられる温度の５℃の範囲内，最も好ましくは，挙げられる温
度の２℃の範囲内であることを意味する。したがって，例として，"約８０℃"と
は，温度範囲が好ましくは，８０±１０℃，より好ましくは，８０±５℃，最も
好ましくは，８０±２℃であることを意味する。
【００９６】 コンビナトリアルライブラリ中のオキシインドールは，好ましくは，４−メチ
ル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸メチル
アミド，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸メ
チルアミド，４−メチル２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，５−メト
キシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，６−メトキシ−２−オキソ
−１，２−ジヒドロ−インドール，５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ
−インドール，５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール，４−（
２−ヒドロキシ−エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，２−
オキソ−５−フェニル−１，２−ジヒドロインドール，２−オキソ−２，３−ジ
ヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸アミド，２−オキソ−２，３−ジヒ
ドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルアミド，２−オキソ−２，３
−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸イソプロピルアミド，２−オキ
ソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸フェニルアミド，Ｎ
−（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−イル）−アセトア
ミド，２−オキソ−６−フェニル−１，２−ジヒドロ−インドール，５−フルオ
ロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，２−オキソ−２，３−ジヒド
ロ−１Ｈ−インドール−５−カルボン酸，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−６−カルボン酸，６−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−
インドール，６−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，６−（
２−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，６−
（３−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，６
−（４−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，
６−（４−フルオロ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール
，２−オキソ−６−ピリジン−３−イル−１，２−ジヒドロ−インドール，５−
（２，３−ジヒドロ−インドール−１−スルホニル）−２−オキソ−１，２−ジ
ヒドロ−インドール，５−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−スルホニ
ル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，５−（３，４−ジヒドロ−
１Ｈ−イソキノリン−２−スルホニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
ドール，５−（５−ブロモ−２，３−ジヒドロインドール−１−スルホニル）−
２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−
１Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３−クロロ−フェニル）−メチル−アミド
，６−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，５−クロロ−４
−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，７−クロロ−２−オキ
ソ−１，２−ジヒドロ−インドール，３−（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１
Ｈ−インドール−５−イル）−安息香酸，３−（２−オキソ−２，３−ジヒドロ
−１Ｈ−インドール−６−イル）−安息香酸，２−オキソ−２，３−ジヒドロ−
１Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３−クロロ−フェニル）−アミド，５−ブ
ロモ−４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール，２−オキソ−
２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−カルボン酸ジメチルアミド，２−オ
キソ−５−（ピロリジン−１−カルボニル）−１，２−ジヒドロインドール，５
−（モルホリン−４−カルボニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドー
ル，および
【化１５】 からなる群より選択される。
【００９７】 アルデヒドは，好ましくは，４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−２
−ホルミルピラノ［３，４−ｃ］ピロール，４−オキソ−４，５，６，７−テト
ラヒドロ−１Ｈ−２−ホルミル−ピロロ）［３，４−ｃ］ピリジン，および
【化１６】 からなる群より選択される。
【００９８】 本発明の合成方法には，所望の活性および構造の化合物についてライブラリを
スクリーニングする工程が付随することができる。すなわち，最初に所望の特性
を有する化合物をスクリーニングし，次に化学的にその化合物を合成することに
より，化合物を合成する方法を提供する。
【００９９】用途 本発明は，細胞性シグナル伝達，好ましい態様においてはレセプターおよび非
レセプターチロシンキナーゼシグナル伝達を制御および／または調節することが
できる化合物に関する。
【０１００】 レセプターキナーゼ媒介性シグナル伝達は，特定の成長因子（リガンド）との
細胞外相互作用により開始され，続いて，レセプターの二量化，固有の蛋白質キ
ナーゼ活性の過渡的刺激およびリン酸化が生ずる。このようにして形成された細
胞内シグナル伝達分子用の結合部位は，適切な細胞性応答（例えば，細胞分裂，
細胞外微小環境に対する代謝的効果）を容易にする一連の細胞質シグナリング分
子との複合体の形成につながる。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒ
ｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ ９：３０３−３９１を参照されたい。
【０１０１】 成長因子レセプターのチロシンリン酸化部位は，シグナリング分子のＳＨ２（
ｓｒｃホモロジー）ドメインの高親和性結合部位として機能することが示されて
いる（Ｆａｎｔｌ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：４１３−４２３；
Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
４：２７７７−２７８５）；Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅ
ｌｌ ７２：７６７−７７８；およびＫｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５２：６６８−６７８）。レセプターキナーゼに付随するいくつ
かの細胞内基質蛋白質が同定されている。これらは２つの主要な群に分けること
ができる：（１）触媒ドメインを有する基質；および（２）そのようなドメイン
を有しないがアダプターとして作用し，触媒的に活性な分子と会合する基質（Ｓ
ｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８）
。レセプターとその基質のＳＨ２ドメインとの間の相互作用の特異性は，リン酸
化されるチロシン残基のすぐ近傍のアミノ酸残基により決定される。特定のレセ
プター上におけるＳＨ２ドメインとホスホチロシン残基の周りのアミノ酸配列と
の間の結合親和性の相違は，基質のリン酸化プロファイルにおいて観察される相
違と一致する（Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：
７６７−７７８）。これらの知見は，各レセプターキナーゼの機能が，その発現
のパターンおよびリガンド利用性のみならず，特定のレセプターにより活性化さ
れる下流のシグナル伝達経路のアレイによっても決まることを示唆する。すなわ
ち，リン酸化は，特定の成長因子レセプターならびに分化因子レセプターにより
リクルートされるシグナリング経路の選択性を決定する重要な制御工程を提供す
る。
【０１０２】 キナーゼシグナル伝達により，他の応答の中でも特に，細胞増殖，分化および
代謝が生ずる。異常な細胞増殖により，新生物の発達を含む広範な疾患および疾
病，例えば癌腫，肉腫，白血病，神経膠芽細胞腫，血管腫，乾癬，アテローム性
動脈硬化症，関節炎および糖尿病性網膜症（または制御されない新脈管形成およ
び／または脈管形成に関連する他の疾患）が生ずる。
【０１０３】本発明の化合物により標的とすべき標的疾病 したがって，本発明は，ＲＫおよび／または非レセプターキナーゼの酵素活性
に影響を与え，そのような蛋白質により伝達されるシグナルに干渉することによ
り，キナーゼシグナル伝達を制御，調節および／または阻害する化合物に関する
。より詳細には，本発明は，多くの種類の固形腫瘍，例えば，限定されないが，
癌腫，肉腫，赤芽球腫，神経膠芽細胞腫，髄膜腫，星状細胞腫，黒色腫および筋
原細胞腫を治癒するための治療的方法として，レセプターチロシンキナーゼ（Ｒ
ＴＫ）および／または非レセプターキナーゼ媒介性シグナル伝達経路を制御，調
節および／または阻害する化合物に関する。適応症には，限定されないが，脳癌
，膀胱癌，卵巣癌，胃癌，膵臓癌，結腸癌，血液癌，肺癌および骨癌が含まれる
。
【０１０４】 本明細書に記載される化合物は，制御されないキナーゼシグナル伝達に関連す
る疾患，例えば，細胞増殖性疾患，繊維性疾患および代謝性疾患の治療に有用で
ある。
【０１０５】 本発明によって治療またはさらに研究することができる細胞増殖疾患には，癌
，血管増殖疾患およびメサンギウム細胞増殖疾患が含まれる。
【０１０６】 血管増殖性疾患とは，一般に血管の異常な増殖を引き起こす新脈管形成性およ
び脈管形成性疾患を表す。血管の形成および広がり，またはそれぞれ脈管形成お
よび新脈管形成は，種々の生理学的プロセス，例えば，胚発生，黄体形成，創傷
治癒および臓器再生において重要な役割を果たす。これらはまた，癌の発達にお
いても中枢的役割を果たす。血管増殖疾患の他の例には，新たな毛細血管が関節
に侵入して，軟骨を破壊する関節炎，および眼性疾病，例えば網膜中の新たな毛
細血管が硝子体に侵入し，出血し，失明を引き起こす糖尿病性網膜症が含まれる
。逆に，血管の収縮，攣縮または閉塞に関連する疾患，例えば再狭窄における関
与も示唆されている。
【０１０７】 繊維性疾患とは，細胞外マトリックスの異常な形成を表す。繊維性疾患の例に
は，肝硬変およびメサンギウム細胞増殖性疾患が含まれる。肝硬変は，肝臓瘢痕
の形成を引き起こす細胞外マトリックスの組成の増加を特徴とする。肝硬変は，
肝臓の硬変等の疾病を引き起こしうる。肝臓瘢痕を引き起こす細胞外マトリック
スの増加はまた，肝炎ウイルス等のウイルス感染に起因する。脂肪細胞は，肝硬
変において主要な役割を果たすようである。示唆されている他の繊維性疾患には
，アテローム性動脈硬化症（以下を参照）が含まれる。
【０１０８】 メサンギウム細胞増殖疾患とは，メサンギウム細胞の異常な増殖により引き起
こされる疾患を表す。メサンギウム増殖疾患には，種々のヒト腎臓疾病，例えば
，糸球体腎炎，糖尿病性腎症，悪性腎硬化症，血栓性細小血管症候群，移植拒絶
，および糸球体症が含まれる。ＰＤＧＦ−Ｒは，メサンギウム細胞増殖の維持に
関与することが示唆されている（Ｆｌｏｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｋｉ
ｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４３：４７Ｓ−５４Ｓ）。
【０１０９】 ＰＴＫはそのような細胞増殖性疾患に関連づけられてきた。例えば，ＲＴＫフ
ァミリーのいくつかのメンバーが癌の発生と関連づけられている。ＥＧＦＲ（Ｔ
ｕｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２２７−２
３３，Ｔｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＡＰＭＩＳ １００：７１３−７１
９），ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４４：７０７−７１２），およびＰＤＧＦ−Ｒ（Ｋｕｍａｂｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９２，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：６２７−６３３）等のこれらのレセ
プターのいくつかは多くの腫瘍において過剰発現され，および／またはオートク
リンループにより持続的に活性化される。事実，ほとんどの一般的かつ重症の癌
においては，これらのレセプターの過剰発現（Ａｋｂａｓａｋ ａｎｄ Ｓｕｎ
ｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．
，１１１：１１９−１３３，Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓ．６１：２４９−２７３，Ｋｏｒｃ ｅｔ
ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０，１３５２−１３６０
），およびオートクリンループ（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，１９９２
，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１８：１０５７−１０７０，Ｋｏｒｃ ｅｔ
ａｌ．，前掲，Ａｋｂａｓａｋ ａｎｄ Ｓｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ ｅｔ
ａｌ．，前掲）が示されている。例えば，ＥＧＦＲは扁平上皮癌，星状細胞腫，
神経芽細胞腫，頭頚部癌，肺癌，および膀胱癌と関連づけられている。ＨＥＲ２
は乳，卵巣，胃，肺，膵臓，および膀胱の癌と関連づけられている。ＰＤＧＦ−
Ｒは神経芽細胞腫，ならびに肺，卵巣，黒色腫および前立腺の癌と関連づけられ
ている。ＲＴＫ ｃ−ｍｅｔは一般に肝臓腫瘍発生に，したがって肝細胞腫瘍に
関連づけられている。さらに，ｃ−ｍｅｔは悪性腫瘍形成に関連づけられている
。より詳細には，ＲＴＫ ｃ−ｍｅｔは，他の癌の中でも特に，結腸直腸，甲状
腺，膵臓，および胃の癌腫，および白血病およびリンパ腫と関連づけられている
。さらに，ｃ−ｍｅｔ遺伝子の過剰発現はまたホジキン病およびバーキット病の
患者およびリンパ種細胞株で検出されている。
【０１１０】 ＩＧＦ−ＩＲは，栄養上の支持およびＩＩ型糖尿病に関係づけられていること
に加えて，いくつかの型の癌に関係づけられている。例えば，ＩＧＦ−Ｉはいく
つかの型の腫瘍，例えばヒト乳癌の癌腫細胞（Ａｒｔｅａｇａ ｅｔ ａｌ．，
１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４１８−１４２３），および
小細胞肺腫瘍（Ｍａｃａｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．，５０：２５１１−２５１７）のオートクリン成長刺激因子として示唆さ
れている。さらに，ＩＧＦ−Ｉは神経系の正常な成長および分化に完全に関与し
ており，ヒトの神経膠腫のオートクリン刺激因子であるように見える。Ｓａｎｄ
ｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５３：２４７５−２４７８。細胞増殖におけるＩＧＦ−ＩＲとそのリガンド
の重要性は，培養されている多くの細胞型（線維芽細胞，上皮細胞，平滑筋細胞
，Ｔリンパ球，骨髄性細胞，軟骨細胞，および骨芽細胞（骨髄の幹細胞）がＩＧ
Ｆ−Ｉによって成長するよう刺激されるという事実によってさらに支持される。
Ｇｏｌｄｒｉｎｇ ａｎｄ Ｇｏｌｄｒｉｎｇ，１９９１，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉ
ｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１：３０１−３２６。一連の発表におい
てＢａｓｅｒｇａは，ＩＧＦ−ＩＲが形質転換の機構において中心的な役割を果
たしていること，またそれ自体がヒトの広範囲の悪性腫瘍に対する治療的介入の
ための好ましい標的となり得ることを示唆している。Ｂａｓｅｒｇａ，１９９５
，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：２４９−２５２，Ｂａｓｅｒｇａ，１９９４
，Ｃｅｌｌ ７９：９２７−９３９，Ｃｏｐｐｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９４
，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：４５８８−４５９５。
【０１１１】 しかし，ＲＴＫの異常と疾病との間の関連性は，癌に限られない。例えば，Ｒ
ＴＫは，乾癬，真性糖尿病，創傷治癒，炎症，および神経変性性疾病等の代謝性
疾病に関連づけられている。これらの疾病には，限定されないが，高血圧，鬱病
，一般的不安症，恐怖症，外傷後ストレス症候群，思春期人格障害，性的不全，
摂取疾患，肥満，化学物質依存症，群発性頭痛，片頭痛，疼痛，アルツハイマー
病，強迫性障害，恐慌性障害，記憶障害，パーキンソン病，内分泌疾患，血管痙
攣，小脳性運動失調，および胃腸管疾患が含まれる。例えば，ＥＧＦ−Ｒは角膜
および皮膚の創傷治癒と関連づけられている。ＩＩ型の真性糖尿病においてイン
スリン−ＲおよびＩＧＦ−１Ｒの欠陥が示されている。特定のＲＴＫとそれらの
治療上の摘要との間のさらに完全な相関関係は，Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．
，１９９４，ＤＮ＆Ｐ７：３３４−３３９に記載されている。
【０１１２】 レセプタータイプのキナーゼのみならず，多くの細胞性キナーゼ（ＣＫ），例
えばｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｐｓ，ｙｅｓ，ｆｙｎ，ｌｙｎ，ｌｃｋ，ｂｌｋ，ｈｃ
ｋ，ｆｇｒ，ｙｒｋ（Ｂｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＦＡＳＥＢ Ｊ．
６：３４０３−３４０９により概説されている）が，増殖および代謝シグナル伝
達経路に，したがって本発明の摘要に関与している。例えば，変異体ｓｒｃ（ｖ
−ｓｒｃ）は，ニワトリにおける腫瘍蛋白質（ｐｐ６０v-src）であることが示
されている。さらに，その細胞性相同体であるプロトオンコジンｐｐ６０c-src
は，多くのレセプターの発癌シグナルを伝達する。例えば，腫瘍におけるＥＧＦ
−ＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は，ｐｐ６０c-srcの構成的活性化につ
ながり，これは悪性腫瘍細胞に特徴的であるが正常細胞にはない。一方，ｃ−ｓ
ｒｃの発現を欠如しているマウスは大理石骨病の表現型を示し，破骨細胞機能に
おけるｃ−ｓｒｃの重要な関与と，関連する疾患における関与の可能性を暗示し
ている。同様に，Ｚａｐ７０はＴ細胞シグナリングに関与することが示唆されて
いる。
【０１１３】 さらに，ＣＴＫ調節化合物を同定して，ＲＴＫを目標とするブロッカーを増大
させるか，さらに相乗効果を得ることは，本発明の１つの観点である。
【０１１４】 さらに，ＲＴＫおよび非レセプタータイプのキナーゼの両方が，過免疫疾患に
関連づけられている。
【０１１５】 さらに，本発明の化合物はまた，ＰＹＫ−２蛋白質に関連する疾病の治療にも
有効である。この蛋白質，その細胞性機能，およびこれに関連する疾病は，"Ｐ
ＹＫ２ ＲＥＬＡＴＥＤ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ"と題す
る米国特許５，８３７，５２４（１９９８年１１月１７日発行）および，"ＰＹ
Ｋ２ ＲＥＬＡＴＥＤ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ"と題する
米国特許５，８３７，８１５（１９９８年１１月１７日発行）に詳細に記載され
ている（これらの両方は，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引
用する）。
【０１１６】 さらに，本発明の化合物は，慢性関節リウマチにも有効である。慢性関節リウ
マチ（ＲＡ）は複数のタイプの細胞および細胞プロセスにより媒介される慢性の
炎症性疾病である。これらには，マクロファージおよびＴ細胞の浸潤，および新
脈管形成の関与が含まれる。ＲＡの治療における小分子阻害剤の有用性を調べる
ために，チロシンキナーゼ阻害剤である本発明の化合物のいくつかを，ラットコ
ラーゲン誘導性関節炎モデルにおいて特性決定した。これらの化合物は，生化学
的キナーゼアッセイにおいてチロシンキナーゼＦＬＫ−１／ＫＤＲ，ＰＹＫ２，
およびＺＡＰ−７０を様々な程度で阻害する（下記の実施例を参照）。さらに，
化合物は，ＲＡの病理学における関与が示唆されている細胞を標的とする細胞ア
ッセイにおいて活性である：ＺＡＰ−７０活性により媒介されるＴ細胞増殖の阻
害，ＦＬＫ−１／ＫＤＲ活性化により媒介されるＢＥＧＦ刺激ＨＵＶＥＣ増殖の
阻害，およびＰＹＫ２活性化により媒介されるネズミ骨髄由来マクロファージか
らのＴＮＦ−α産生の阻害。さらに，ヒトＲＡに伴う組織学的および病理学的変
化を模倣する齧歯類コラーゲン誘導性関節炎モデルにおいて，これらの化合物は
，コラーゲン免疫の時点から毎日投与したとき，関節腫脹を阻害するのに有効で
ある。
【０１１７】ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターおよびＶＥＧＦ 正常な脈管形成および新脈管形成は，胚発生，損傷治癒，臓器再生等の種々の
生理学的過程，および排卵期の黄体における濾胞形成と妊娠後の胎盤の成長等の
女性の生殖過程において，重要な役割を果たす。Ｆｏｌｋｍａｎ ａｎｄ Ｓｈ
ｉｎｇ，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１
−３４。しかし，多くの疾病が，制御されないまたは不適切な新脈管形成の持続
により推進される。例えば，関節炎においては，新たな毛細血管が関節に侵入し
，軟骨を破壊する。糖尿病においては，網膜中の新たな毛細血管が硝子体に侵入
し，出血して失明を引き起こす（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９８７：Ｃｏｎｇｒｅｓｓ
ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（Ｖｅｒｓｔ
ｒａｅｔｅ，ｅｔ．ａｌ，ｅｄｓ．），Ｌｅｕｖｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，ｐｐ．５８３−５９６）。眼性新生血管形成は，失
明の最も一般的な原因であり，ほぼ２０種の眼性疾病において支配的である。
【０１１８】 さらに，脈管形成および／または新脈管形成は，悪性固形腫瘍の成長および転
移に関連づけられている。腫瘍は，腫瘍それ自体が成長するために，新たな毛細
血管の増殖を刺激しつづけなければならない。さらに，腫瘍中に埋め込まれた新
たな血管は，腫瘍細胞が循環中に入り，身体の遠い部位に転移するための道を提
供する（Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．
８２：４−６；Ｋｌａｇｓｂｒｕｎｎ ａｎｄ Ｓｏｋｅｒ，１９９３，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０２；Ｆｏｌｋｍａｎ，１９９１，
Ｊ．Ｎａｔｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：４−６；Ｗｅｉｄｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ，１９９１，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：１−５）。
【０１１９】 インビトロ内皮細胞成長促進活性を有するいくつかのポリペプチドが同定され
ている。例としては，酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ，ｂＦＧ
Ｆ），血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および胎盤成長因子が挙げられる。ａＦＧ
ＦおよびｂＦＧＦとは異なり，ＶＥＧＦは内皮細胞特異的な細胞分裂促進物質で
あることが最近報告された（Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ｈｅｎｚｅｌ，１９８９
，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６１：８５１−８５
８；Ｖａｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
．５：１９４６１−１９５６６）。
【０１２０】 すなわち，ＶＥＧＦが結合する特異的レセプターの同定は，内皮細胞増殖の制
御の理解の重要な進歩である。高親和性をもってＶＥＧＦに結合する２つの構造
的に密接に関連するＲＴＫが同定されている：ｆｌｔ−１レセプター（Ｓｈｉｂ
ｕｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：５１９−５２４；Ｄ
ｅＶｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９
９１）およびＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプター（米国特許出願０８／１９３，８２
９において議論されている）。したがって，これらのＲＴＫが内皮細胞増殖の調
節および制御において役割を果たすであろうと推定されている。
【０１２１】 同時係属中のの米国特許出願０８／１９３，８２９に記載される開示等の証拠
は，ＶＥＧＦが内皮細胞増殖の原因であるのみならず，正常なおよび病的な新脈
管形成の主要な制御因子であることを強く示唆する。一般に，Ｋｌａｇｓｂｕｍ
ａｎｄ Ｓｏｋｅｒ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：６９
９−７０２；Ｈｏｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６７：２６０３１−２６０３７を参照されたい。さらに，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１
およびｆｌｔ−１は，成長している腫瘍の増殖しつつある内皮細胞において大量
に発現されているが，周囲の静止内皮細胞においては発現されていないことが示
されている（Ｐｌａｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８
４５−８４８；Ｓｈｗｅｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５
９：８４３−８４５）。
【０１２２】ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストの同定 内皮細胞増殖，および潜在的には脈管形成および／または新脈管形成の管理，
制御および調節におけるＲＴＫの推定される重要性の観点から，種々の方法を用
いてＲＴＫ"阻害剤"を同定するための多くの試みが行われてきた。これらには，
変異体リガンド（米国特許４，９６６，８４９）；可溶性レセプターおよび抗体
（ＷＯ９４／１０２０２；Ｋｅｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，１９９４，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０７０５−１０７０
９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４
）；およびＲＮＡリガンド（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１０４５０−１０４５６）の使用が含まれる。
【０１２３】 さらに，キナーゼ阻害剤（ＷＯ９４／０３４２７；ＷＯ９２／２１６６０；Ｗ
Ｏ９１／１５４９５；ＷＯ９４／１４８０８；米国特許５，３３０，９９２；Ｍ
ａｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．３５：２２６８），およびレセプターキナーゼシグナル伝達経
路に作用する阻害剤，例えば蛋白質キナーゼＣ阻害剤が同定されている（Ｓｃｈ
ｕｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：６８２
−６８７）；Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｃｅｌ
ｌ ４：３５８Ａ，Ｋｉｎｓｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｅｘｐ．Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｓ．１９９：５６−６２；Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，
Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓ．７５２：４４８−５７）。
【０１２４】 最近，癌の治療において用いるために，キナーゼ阻害剤として作用する小分子
を同定する試みが行われている。したがって，脈管形成を有効にかつ特異的に抑
制するためにＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターのシグナル伝達を選択的に阻害する
有効な小化合物を同定し生成することについての満たされていない要求が存在す
る。
【０１２５】 本発明のある化合物は生物学的アッセイにおいて優れた活性を示し，したがっ
て，これらの化合物および関連する化合物は，Ｆｌｋ関連疾患，例えば持続する
制御されないまたは不適切な新脈管形成により推進される疾患の治療に有効であ
ることが予測される。
【０１２６】医薬処方および投与 本明細書に記載される化合物は，そのままヒトの患者に投与するか，または組
み合わせ治療におけるように，これを他の活性成分とともに適当な担体または賦
形剤と混合した医薬組成物中で投与することができる。本明細書に記載される化
合物の製剤および投与の技術は，"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍｃｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．
，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に見いだされる。
【０１２７】ａ）投与の経路 適当な投与経路は，例えば，経口，直腸，経粘膜，または腸管投与，あるいは
筋肉内，皮下，静脈内，骨髄内等の非経口輸送，ならびに髄内，直接心室内，腹
腔内，鼻腔内，または眼内の注射を含む。
【０１２８】 あるいは，化合物は，全身的方法ではなく局所に，例えば化合物を固形腫瘍内
に直接，しばしばデポ剤または持続放出製剤中で注射することにより投与しても
よい。
【０１２９】 さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，
例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与してもよい。リポソ
ームは腫瘍にターゲティングされ，選択的に取り込まれるであろう。
【０１３０】ｂ）組成物／処方 本発明の医薬組成物は，それ自体知られる方法，例えば慣用の混合，溶解，顆
粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾燥により製造
することができる。
【０１３１】 すなわち，本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性物質を薬剤
として使用することができる製品に加工することを容易にする賦形剤および補助
剤を含む，１またはそれ以上の生理学的に許容しうる担体を用いて，慣用の方法
で処方することができる。適切な処方は，選択される投与経路に依存する。
【０１３２】 注射用には，本発明の薬剤を水性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンゲル溶
液，または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中で処方することが
できる。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が処方に用いられる
。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に知られている。
【０１３３】 経口投与のためには，化合物を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許
容しうる担体と混合することにより化合物を容易に製剤することができる。その
ような担体は，本発明の化合物を，治療すべき患者による経口摂取のための錠剤
，丸薬，糖衣剤，カプセル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液等として
製剤することを可能とする。経口で使用するための医薬製剤は，１またはそれ以
上の固体賦形剤を１またはそれ以上の本発明の化合物と混合し，得られた混合物
を任意にすりつぶし，所望の場合には適当な助剤を加えた後に，顆粒の混合物を
加工して，錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適当な担体には，特に，
ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトール等の糖類；トウモロコ
シデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセルロ
ース製品，ゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および／または
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の増量剤などの賦形剤が含まれる。所望の場
合には，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギン酸またはその
塩，例えばアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤を加えてもよい。
【０１３４】 糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のために
は，濃縮された糖溶液を用いることができる。これは，アラビアゴム，タルク，
ポリビニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／
または二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を
任意に含むことができる。識別のため，あるいは活性成分の用量の異なる組合せ
を特徴づけるため，染料または色素を錠剤または糖衣剤コーティングに添加して
もよい。
【０１３５】 経口で使用することができる医薬製剤は，ゼラチンから作成されるプッシュフ
ィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロール，ソルビトール等の可塑
剤から作成される密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成
分を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクおよ
びステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤，さらに任意に安定剤との混合物中に含
むことができる。軟カプセルにおいては，活性化合物は脂肪油，流動パラフィン
，または液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁するこ
とができる。さらに安定剤を添加してもよい。経口投与用のすべての処方は，そ
のような投与に適当な用量で調製すべきである。
【０１３６】 口内投与のためには，組成物は，慣用的な方法で錠剤またはトローチ剤の形を
とることができる。
【０１３７】 吸入による投与用には，本発明に従って用いられる物質は，噴射剤，例えば，
ジクロロジフルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオ
ロエタン，二酸化炭素または他の適当な気体を用いて，加圧されたパックまたは
ネブライザーからエアロゾルスプレイの形状で便利に輸送される。加圧されたエ
アロゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられたバルブによ
り調節することができる。例えば吸入器または注入器において使用するためのゼ
ラチン製のカプセルおよびカートリッジは，化合物の粉末混合物と，ラクトース
またはデンプン等の適当な粉末基剤とを含むよう処方することができる。
【０１３８】 化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に処方する
ことができる。注射用の処方は，単位用量にて，例えばアンプルにて，あるいは
添加された保存料と共に多用量容器中で提供することができる。組成物は油性ま
たは水性のベヒクル中で，懸濁液，溶液，または乳濁液等の形状をとることがで
き，懸濁剤，安定剤および／または分散剤等の処方物質を含んでいてもよい。
【０１３９】 非経口投与用の薬剤組成物は，水溶性の形態の活性化合物の水性溶液を含む。
さらに，活性化合物の懸濁液は，適当な油性の注入用懸濁液として調製すること
ができる。適切な親油性溶媒またはベヒクルには，ゴマ油等の脂肪油，オレイン
酸エチルまたはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル，またはリポソーム等を
含む。水性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ソルビ
トール，またはデキストラン等の，懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでいて
もよい。任意に，懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にする，当
該化合物の溶解性を増加させる適当な安定剤または薬剤を含んでいてもよい。
【０１４０】 あるいは，活性成分は粉体の形態であって，使用前に適当なベヒクル，例えば
発熱物質を含まない滅菌水を用いて構成することができる。
【０１４１】 化合物はまた，例えばカカオバターまたは他のグリセリド等の慣用の坐剤基剤
を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に処方することができる。
【０１４２】 上述した処方に加えて，化合物はまたデポ製剤として処方することができる。
そのような長時間作用性の処方は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によ
るか，または筋肉内注射により投与することができる。すなわち，化合物は，適
当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば薬理学的に許容される油剤中の乳
濁液として），イオン交換樹脂と共に，溶けにくい塩等の溶けにくい誘導体とし
て，処方することができる。
【０１４３】 本発明の疎水性化合物のための薬学的担体は，ベンジルアルコール，非極性界
面活性剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系である。共溶媒系
はＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは，３％（ｗ／ｖ）ベンジルアルコー
ル，８％（ｗ／ｖ）非極性界面活性剤ポリソルベート８０，および６５％（ｗ／
ｖ）ポリエチレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である。
ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液中
に１：１で希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，そ
れ自体，全身投与に際して低い毒性を示す。本来，共溶媒系の比率は，その溶解
性および毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，共
溶媒成分の種類も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面活性
剤をポリソルベート８０の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコール
の分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニルピ
ロリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖または
多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
【０１４４】 あるいは，疎水性の医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソー
ムおよび乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく
知られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた
用いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。さらに，化合物は，持続
放出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの準透過性マトリックスを用
いて輸送することができる。種々の持続放出材料が確立されており，当業者には
よく知られている。持続放出カプセルはその化学的性質に応じて，数週間から１
００日を越える期間，化合物を放出する。治療薬剤の化学的性質および生物学的
安定性に応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用いてもよい。
【０１４５】 本発明のＰＴＫ調節物質の多くは，薬学的に適合性のカウンターイオンとの塩
として提供することができる。薬学的に適合性の塩は，多くの酸，例えば，限定
されないが，塩酸，硫酸，酢酸，乳酸，酒石酸，マレイン酸，コハク酸等を用い
て形成することができる。塩は，対応する遊離塩基の形に比べて，水性または他
のプロトン性溶媒においてより溶解性が高い傾向にある。
【０１４６】ｃ）有効投与量 本発明において用いるのに適した医薬組成物には，活性成分がその意図する目
的を達成するのに有効な量で含まれる組成物が含まれる。より詳細には，治療上
有効量とは，疾病の症状を予防，緩和，または改善するか，または治療中の患者
の生存を延長するのに有効な化合物の量を意味する。治療上有効量の決定は，特
に本明細書において提供された詳細な開示を考慮すれば，十分に当業者の能力の
範囲内である。
【０１４７】 本発明の方法において用いられる任意の化合物について，治療上有効な用量は
，最初は細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば，動物モデルにお
いて，培養細胞において決定されたＩＣ50（すなわちＰＴＫ活性の最大阻害の半
分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するような用量を処
方することができる。そのような情報は，ヒトにおける有用な用量のさらに正確
な決定のために用いることができる。
【０１４８】 本明細書に記載される化合物の毒性および治療上有効性は，培養細胞または実
験動物における標準的な薬学的方法，例えば，ＬＤ50（集団の５０％に致死的な
用量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するため
の方法により決定することができる。毒性と治療的効果との間の用量の比は治療
指数であり，これはＬＤ50とＥＤ50との間の比率として表すことができる。高い
治療指数を示す化合物が好ましい。これらの培養細胞アッセイおよび動物研究か
ら得られるデータは，ヒトにおいて用いるための投与量の範囲を定式化するため
に用いることができる。そのような化合物の投与量は，好ましくは，ＥＤ50を含
み毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内にある。投与量は，用いる投
与形態および用いる投与経路により，この範囲内で様々でありうる。正確な製剤
，投与経路，および投与量は，個々の医師が，患者の状態を考慮して選択するこ
とができる（例えば，Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒ
ｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃ
ｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０１４９】 投与量および間隔は，個々に，活性成分がキナーゼ調節効果を維持するのに十
分な血漿レベル，すなわち最小有効濃度（ＭＥＣ）を与えるよう調節することが
できる。ＭＥＣは，各化合物について異なるが，インビトロのデータ，例えば，
本明細書に記載されるアッセイを用いて，キナーゼの５０−９０％の阻害を達成
するのに必要な濃度から見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投
与量は，個々の特性および投与経路に依存するであろう。しかし，ＨＰＬＣアッ
セイまたはバイオアッセイを用いて血漿濃度を決定することができる。
【０１５０】 投与間隔もまた，ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は，１０−
９０％の時間，好ましくは３０−９０％の時間，最も好ましくは５０−９０％の
時間，ＭＥＣより高い血漿レベルを維持する投与計画を用いて投与すべきである
。
【０１５１】 局所投与または選択的取り込みの場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度
とは関係ないであろう。
【０１５２】 投与される組成物の量は，もちろん，治療中の患者，患者の体重，苦痛の激し
さ，投与方法，および担当医師の判断に依存するであろう。
【０１５３】 化合物の医薬処方を製造する方法，患者に投与すべき化合物の量を決定する方
法，および化合物を生物に投与するモードは，米国特許５，７９２，７８３，５
，８８０，１４１，５，７８６，４８８，５，８３４，５０４，５，８８０，１
４１，５，８８３，１１３，５，８８３，１１６，５，８８６，０２０，および
国際公開ＷＯ９６／２２９７６およびＷＯ９８／５０３５６に開示されており，
これらはすべて図面を含めその全体を本明細書の一部としてここに引用する。当
業者は，そのような記載が本発明に適用可能であり，容易に適合させることがで
きることを理解するであろう。
【０１５４】ｄ）包装 組成物は，所望の場合には，活性成分を含む１またはそれ以上の単位用量形を
含んでいてもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。
パックは，例えば，ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むこ
とができる。パックまたはディスペンサー装置には，投与の指示が添付されてい
てもよい。パックまたはディスペンサー装置はまた，薬剤の製造，用途，または
販売を規制する政府機関によって規定された形式の，容器に付随した注意書が添
付されていてもよく，その注意書は当該組成物の形状について，あるいはヒトま
たは獣医学的投与についての当該機関による承認を反映するものである。かかる
注意書は，例えば米国食品医薬品局により処方箋調剤薬として承認されたラベル
によるものか，または承認された製品に差込まれたものでもよい。適合した薬学
的担体中で処方された，本発明の化合物を含む組成物もまた調製され，適当な容
器内に配置され，さらに指示された条件による処置のためにラベルを付すことが
できる。ラベル上に示される適切な状態としては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻
害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる。
【０１５５】試験 本発明の化合物を，ほとんどの蛋白質キナーゼ活性を阻害するその能力につい
て試験した。生物学的アッセイおよびこれらの阻害研究の結果は本明細書に記載
される。蛋白質キナーゼ機能の調節を測定するために用いる方法のいくつかは，
方法のハイスループットの観点に関する，Ｔａｎｇらの，"Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎ
ｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅ
ｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ"と題する国際公開ＷＯ９８／０７６９５
（１９９８年３月２６日公開，Ｌｙｏｎ＆Ｌｙｏｎ書類番号２２１／１８７−Ｐ
ＣＴ）および米国特許出願０８／７０２， ２３２（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，
表題"Ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅ
ｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ"，１９９６年
８月２３日出願）と同様である。出願０８／７０２，２３２および国際公開ＷＯ
９８／０７６９５の両方とも，図面を含めその全体を本明細書の一部としてここ
に引用する。
【０１５６】実施例 以下の実施例は，非限定的なものであり，本発明の種々の観点および特徴の代
表例にすぎない。実施例は，本発明の化合物を合成する方法，および蛋白質キナ
ーゼの機能に及ぼす化合物の影響を測定する方法を記載する。
【０１５７】 この方法において用いられる細胞は，市販されている。細胞に含まれる核酸ベ
クターもまた市販されており，種々の蛋白質キナーゼの遺伝子の配列は配列デー
タバンクで容易にアクセス可能である。すなわち，当業者は，市販の細胞，市販
の核酸ベクター，および蛋白質キナーゼ遺伝子を当業者には容易に利用可能な手
法を用いて組み合わせることにより，短時間で容易に細胞株を再形成することが
できる。
【０１５８】合成方法 実施例１：本発明の化合物の合成方法 本発明の化合物は，以下の一般的方法を用いて合成することができる。 オキシインドールとアルデヒドとの縮合の一般的方法 エタノール中のオキシインドール（１当量）およびアルデヒド（１−１．２当量
）の混合物（０．１Ｍ）に，ピペリジン（１当量）を加えた。混合物を９０℃の
油浴中で１−３時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗
浄し，乾燥して，（２８−９７％収率）の所望の生成物を得た。
【０１５９】 ４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−
１−カルボアルデヒドの製造 １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ，８．３
９ｍＬ，５６．１ｍｍｏｌ）を，テトラヒドロフラン（ＴＨＦ，５６ｍＬ）中の
トシルメチルイソシアニド（１０．９５ｇ，５６．１ｍｍｏｌ）の撹拌混合物に
０℃加えた。１５分後，この混合物に５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オ
ン（５ｇ，５１ｍｍｏｌ）を加えた。次に混合物を室温で２時間撹拌した。反応
をブラインで急冷し，ＴＨＦで数回抽出した。合わせた抽出物を乾燥し（硫酸ナ
トリウム），濾過し，濃縮して，６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ
］ピロール−４−オンを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１１．４９（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），７．４１（ｍ，１Ｈ），６．６７（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｔ，Ｊ＝５．
９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．７３（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ
１３８［Ｍ+＋１］
【０１６０】 ６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン（５ｇ，
３６ｍｍｏｌ）は，ジクロロメタン中でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
，１．２当量）およびオキシ塩化リン（ＰＯＣｌ3，１．１当量）を用いて，標
準的なビルスマイヤー反応条件下で形成した。上述の混合物を室温で１時間撹拌
した。沈澱した塩を濾過し，ジクロロメタンで洗浄し，水に懸濁し，６Ｎ水酸化
ナトリウムで塩基性にしてｐＨ＝１２とした。混合物を５分間撹拌し，濾過した
。固体をエタノール／水混合物（１：１）で洗浄して，３．５ｇ（５８％）の４
−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１
−カルボアルデヒドを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１２．７３（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），９．６３（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），７．７８（ｓ，１Ｈ），４．４４（ｔ，
Ｊ＝６．０８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2Ｏ），３．１０（ｔ，Ｊ＝６．０８Ｈｚ，
２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）．ＭＳ１６６［Ｍ+＋１］
【０１６１】 ４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリ
ジン−１−カルボアルデヒドの製造 ＴＨＦ（１２ｍＬ）中の２−オキソ−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−
ブチルエステル（３．８ｇ，１９ｍｍｏｌ）を冷却リチウムジイソプロピルアミ
ド（ＬＤＡ，１９ｍＬ，２．０Ｍ溶液，ヘプタン／ＴＨＦ／エチルベンゼン中）
に−７８℃で滴加した。−７８℃で３５分間撹拌した後，混合物にＴＨＦ（１０
ｍＬ）中のフェニルジスルフィド（４．１５ｇ，１９ｍｍｏｌ）およびヘキサメ
チルホスホルアミド（ＨＭＰＡ，３．３ｍＬ，１９ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した
。混合物を−７８℃で撹拌し，次にゆっくりと室温まで暖めた。反応液を水（２
００ｍＬ）に注加し，エーテル（３ｘ）で抽出した。合わせたエーテル性抽出物
を１０％ＮａＯＨで，次に水で洗浄し，次に乾燥し，濃縮して，２−オキソ−３
フェニルスルファニル−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
を油状物として得た。油状物をさらに精製することなく次の工程で用いた。
【０１６２】 ３−クロロペルオキシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ，４．７ｇ，７０％，１当量）を
，ジクロロメタン（１００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3
，２０ｍＬ）中の上述の２−オキソ−３−フェニルスルファニルピペリジン−１
−カルボン酸ｔｅｓｔ−ブチルエステルの冷却（０℃）溶液に少しずつ加えた。
混合物をゆっくり室温まで暖め，ＴＬＣにより判定して反応が完了するまで撹拌
した。次に反応混合物をジクロロメタンで抽出し，ＮａＨＣＯ3（飽和）で洗浄
し，乾燥して，３−ベンゼンスルホニル−２−オキソ−ピペリジン−１−カルボ
ン酸ｔｅｒ−ブチルエステルを油状物として得た。これを次の工程で直接用いた
。
【０１６３】 トルエン（５０ｍＬ）の上述の３−ベンゼンスルホニル−２−オキソ−ピペリ
ジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを８０℃で１時間加熱した。反
応混合物を濃縮し，得られた油状物をカラムクロマトグラフィー（２０−３０％
ＥｔＯＡｃ，ヘキサン中）により精製して，２ｇの６−オキソ−３，６−ジヒド
ロ−２Ｈ−ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを油状物として
得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ６．９１（ｄｔ，１Ｈ，ＣＯＣ
Ｈ＝ＣＨＣＨ，），５．８１（ｄｔ，Ｊ＝１．８＆９．３Ｈｚ，１Ｈ，ＣＯＣＨ
＝ＣＨＣＨ2），３．７２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＯＮＣＨ2），２．３
８（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＣＨ2ＣＨ2），１．４４（ｓ，９Ｈ，３ｘＣＨ3）
【０１６４】 ＤＢＵ（１．６５ｍＬ，１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１１ｍＬ）中のトシルメチ
ルイソシアニド（２．１８ｇ，１１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に０℃で加えた。１５
分間撹拌した後，上述からの６−オキソ−３，−ジヒドロ−２Ｈ−ピリジン−１
−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｇ，１０ｍｍｏｌ）を加え，混合物
を室温で４時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＣＩで急冷し，ＴＨＦで抽出し
た。合わせた抽出物を乾燥し，濃縮して，２ｇ（８５％）の４−オキソ−２，４
，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−５−カルボン酸ｔｅ
ｒｔ−ブチルエステルを黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１１．３８（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），７．３４（ｍ，１Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝６．
０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．６７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），１．
４４（ｓ，９Ｈ，３ｘＣＨ3） ＭＳＡＰＣＩｎｅｇ．２３５［Ｍ+−１］
【０１６５】 ＰＯＣｌ3（０．６４６ｍＬ，６．９３ｍｍｏｌ）を氷冷ＤＭＦ（１．５ｍＬ
，１８．９ｍｍｏｌ）に滴加した。室温で３０分間撹拌した後，混合物を再び−
５℃に冷却し，これにＤＭＦ（３ｍＬ）中の上述の４−オキソ−２，４，６，７
−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−５−カルボン酸ｔｅｒ−ブチ
ルエステル（１．５ｇ，６．３ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を室温で６時
間撹拌した。反応混合物を角氷で急冷し，次に１０Ｎ水酸化カリウムを加えてｐ
Ｈを１１−１２に調節した。３０分間撹拌した後，混合物を酢酸エチルで抽出し
た。合わせた抽出物をブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮して，１．２ｇの１−ホ
ルミル−４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピ
リジン−５−カルボン酸ｔｅｒ−ブチルエステルを得た。
【０１６６】 ジクロロメタン中５０％のトリフルオロ酢酸中の１−ホルミル−４−オキソ−
２，４，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−５カルボン酸
ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．２ｇ，４．５４ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３
０分間撹拌した。反応液を濃縮し，残渣をジクロロメタンから再結晶して，４０
０ｍｇ（７５％）の４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ
［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒドを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１２．３０（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），９．６０（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），７．４６（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｂｒ
ｓ，１Ｈ，ＮＨ），３．３６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９５
（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨＯ） ＭＳ１６５［Ｍ+＋１］
【０１６７】 ５−メチル−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，
４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒドの製造 ＴＨＦ（２５ｍＬ）中の１−メチル−２−ピペリドン（４．５４ｍＬ，４０ｍ
ｍｏｌ）を，冷却したリチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ，４０ｍＬ，２．
０Ｍ溶液，ヘプタン／ＴＨＦ／エチルベンゼン中）に−７８℃で滴加した。−７
８℃で３５分間撹拌した後，混合物にＴＨＦ（２０ｍＬ）中のフェニルジスルフ
ィド（８．８ｇ，４０ｍｍｏｌ）およびヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ
，７ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。混合物を−７８℃で撹拌し，次に
ゆっくりと室温まで暖めた。反応液を水（４００ｍＬ）に注加し，エーテル（３
ｘ１５０ｍＬ）で抽出した。合わせたエーテル性抽出物を１０％ＮａＯＨ，水，
１０％ＨＣｌ，次に水で順番に洗浄し，乾燥し，濃縮して，１０ｇ（＞１００％
粗収率）の３−ベンゼンスルホニル−１−メチル−ピペリジン−２−オンを油状
物として得た。油状物をさらに精製することなく次の工程で用いた。 ＭＳＡＰＣＩ＋ｖｅ２２２［Ｍ+＋１］
【０１６８】 ３−クロロペルオキシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ，４．９ｇ，７０％，１当量）を
，ジクロロメタン（１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ3（ａｑ．）（２０ｍＬ
）中の１−メチル−３−フェニルスルファニル−ピペリジン−２−オン（５ｇ，
２２．６ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に少しずつ加えた。混合物をゆっくり室
温まで暖め，ＴＬＣにより判定して反応が完了するまで撹拌した。次に反応混合
物をジクロロメタンで抽出し，飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し，乾燥して，４
．７ｇ（８２％粗収率）の３−ベンゼンスルホニル−１−メチル−ピペリジン−
２−オンを油状物として得た。
【０１６９】 トルエン（５０ｍＬ）中の前工程からの３−ベンゼンスルホニル−１−メチル
−ピペリジン−２−オンの混合物を８０℃で１時間加熱した。反応混合物を濃縮
し，残渣をカラムクロマトグラフィー（８０％ＥｔＯＡｃ，Ｈｅｘ中）により精
製して，１．１ｇ（５３％粗収率）の１−メチル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピ
リジン−２−オンを液体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ６．６０（ｄｔ，１Ｈ，ＣＯＣ
Ｈ＝ＣＨＣＨ2），５．７２（ｄｔ，Ｊ＝１．８＆９．７Ｈｚ，１Ｈ，ＣＯＣＨ
＝ＣＨＣＨ2），３．３５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，ＣＯＮＣＨ2），２．８
２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．３３（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＣＨ2ＣＨ2），１．４４
（ｓ，９Ｈ，３ｘＣＨ3） ＭＳＡＰＣＩ＋ｖｅ１１２［Ｍ+＋１］
【０１７０】 −７８℃に冷却したリチウムビス（トリメチルシリル）アミド（１１ｍＬの１
Ｍ溶液，ＴＨＦ中）の撹拌溶液に窒素下でＴＨＦ（４５ｍＬ）中のトシルメチル
イソシアニド（１．９ｇ，１０ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。−７８℃で４０分
間撹拌した後，ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１−メチル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−
ピリジン−２−オン（１．１ｇ，１０ｍｍｏｌ）の溶液を加え，混合物を室温で
一夜撹拌した。反応液を濃縮し，残渣を水（１５０ｍＬ）とジクロロメタン（１
５０ｍＬ）との間に分配した。水性層をジクロロメタン（３ｘ）で抽出した。合
わせた有機層を濃縮し，高真空下で乾燥した。得られた泡状物をジクロロメタン
から再結晶して，６３３ｍｇ（４２％）の５−メチル−２，５，６，７−テトラ
ヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４−オンを淡黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１１．０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ
），７．０８（ｓ，１Ｈ），６．５３（ｓ，１Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝６．６
Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ，），２．８９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ，），２．７０（ｔ，Ｊ＝６
．６Ｈｚ，２ＨＣＨ2）
【０１７１】 ５−メチル−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン
−４−オンを，標準的ビルスマイヤー条件下で，ＤＭＦ（３当量）およびＰＯＣ
ｌ3（１．１当量）を用いてホルミル化して，２５０ｍｇ（３３％）の５−メチ
ル−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］
ピリジン−１−カルボアルデヒドを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１２．３７（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），９．６０（ｓ，１Ｈ，ＣＨＯ），７．４５（ｓ，１Ｈ），３．５２（ｔ，
Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2 ），２．９２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3） ＭＳｍ／ｚ１７９［Ｍ+＋１］
【０１７２】 化合物ＩＮ−００１： ４−メチル−２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−
ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ
−インドール−５−スルホン酸メチルアミド ４−メチル−２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン
酸メチルアミド（０．２ｇ，０．８３ｍｍｏｌ）を４−オキソ−２，４，６，７
−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１カルボアルデヒド（１．２
当量，０．１７ｇ）と縮合させて，０．３１ｇ（９７％）の表題化合物を黄色固
体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．７７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．４２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ），７．９２（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ
），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＡｒＨ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．４
２（ｑ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ，ＳＯ2ＮＨ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ
，１Ｈ），４．４９（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＯ2ＣＨ2ＣＨ2），３．０
８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＯ2ＣＨ2ＣＨ2），２．８４（ｓ，３Ｈ，Ｃ
Ｈ3），２．４２（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，３Ｈ，ＳＯ2ＮＨＣＨ3）．ＭＳ３８８
［Ｍ+＋１］
【０１７３】 化合物ＩＮ−００２： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−５−スルホン酸メチルアミド ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸メチルアミ
ド（０．２ｇ，０．８８ｍｍｏｌ）を４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒド
ロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１カルボアルデヒド（１．２ｅｑ，０．１
８ｇ）と縮合させて，０．２６ｇ（７９％）の表題化合物を黄色固体として得た
。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．７４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．４５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ），８．２８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ
），８．０（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），７．９５（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），
７．６０（ｄｄ，Ｊ＝１．９ａｎｄ８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｍ，１Ｈ，
ＳＯ2ＮＨ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５０（ｔ，Ｊ＝５
．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＯ2ＣＨ2ＣＨ2），３．１８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，
ＣＯ2ＣＨ2ＣＨ2），２．４１（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，３Ｈ，ＳＯ2ＮＨＣＨ3）
．ＭＳ３７４［Ｍ+＋１］
【０１７４】 化合物ＩＮ−００３： １−（４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ４−メチル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，
６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒド
と縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ２９５．２［Ｍ+＋１］
【０１７５】 化合物ＩＮ−００４： １−（５−メトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オ
ン ５−メトキシ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４
，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒ
ドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３１１．２［Ｍ+＋１］
【０１７６】 化合物ＩＮ−００５： １−（６−メトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オ
ン ６−メトキシ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４
，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒ
ドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３１１．２［Ｍ+＋１］
【０１７７】 化合物ＩＮ−００６： １−（５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ５−ブロモ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，
６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒド
と縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３５９．２＆３６１．１［Ｍ+＋１］
【０１７８】 化合物ＩＮ−００７： １−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ５−クロロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，
６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒド
と縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３１５．２［Ｍ+＋１］
【０１７９】 化合物ＩＮ−００８： １−［４−（２−ヒドロキシ−エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
ドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ
］ピロール−４−オン ４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オン（
０．１ｇ，０．６ｍｍｏｌ）を４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピ
ラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒド（１．２当量，０．０６ｇ
）と縮合させて，０．５ｇ（２８％）の表題化合物を黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．８７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．０７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ），７．９０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ
），７．５５（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ），７．０９（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｄ，
Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），４．８９（
ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＺＣＨ2ＯＨ），４．４９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈ
ｚ，２Ｈ，ＣＯ2ＣＨ2ＣＨ2ピロール），３．７０（ｍ，２Ｈ，ＨＯＣＨ2ＣＨ2
ＡｒおよびＣＯ2ＣＨ2ＣＨ2ピロール）．ＭＳｍ／ｚ３２５．２［Ｍ+＋１］
【０１８０】 化合物ＩＮ−００９： １−（２−オキソ−５−フェニル−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オ
ン ５−フェニル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４
，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒ
ドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３５７．２［Ｍ+＋１］
【０１８１】 化合物ＩＮ−０１０： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−５−スルホン酸アミド ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸アミドを４
−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１
−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３６０．２［Ｍ+＋１］
【０１８２】 化合物ＩＮ−０１１： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−５−スルホン酸ジメチルアミド ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸ジメチルア
ミドを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロ
ール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３８８．２［Ｍ+＋１］
【０１８３】 化合物ＩＮ−０１２： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−５−スルホン酸イソプロピルアミド ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸イソプロピ
ルアミドを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］
ピロール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ４０２．２［Ｍ+＋１］
【０１８４】 化合物ＩＮ−０１３： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−５−スルホン酸フェニルアミド ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸フェニルア
ミドを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロ
ール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ４３６．２［Ｍ+＋１］
【０１８５】 化合物ＩＮ−０１４： Ｎ−［２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ
［３，４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イン
ドール−６−イル］−アセトアミド Ｎ−（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−イル）−アセト
アミドを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピ
ロール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３３８．２［Ｍ+＋１］
【０１８６】 化合物ＩＮ−０１５： １−（２−オキソ−６−フェニル−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オ
ン ６−フェニル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４
，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒ
ドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３５７．２［Ｍ+＋１］
【０１８７】 化合物ＩＮ−０１６： １−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オ
ン ５−フルオロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４
，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒ
ドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ２９９．２［Ｍ+＋１］
【０１８８】 化合物ＩＮ−０１７： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−５−カルボン酸 ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−カルボン酸を４−オキ
ソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カル
ボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３２５．２［Ｍ+＋ｌ］
【０１８９】 化合物ＩＮ−０１８： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−６−カルボン酸 ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−カルボン酸を４−オキ
ソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カル
ボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３２５．２［Ｍ+＋１］
【０１９０】 化合物ＩＮ−０１９： １−（６−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン
６−クロロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，
６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒド
と縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３１５．２［Ｍ+＋１］
【０１９１】 化合物ＩＮ−０２０： １−（６−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ６−ブロモ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，
６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒド
と縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３５９．２＆３６１［Ｍ+＋１］
【０１９２】 化合物ＩＮ−０２１： １−［６−（２−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
ドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ
］ピロール−４−オン ６−（２−メトキシ−フェニル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを
４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−
１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３８７．２［Ｍ+＋１］
【０１９３】 化合物ＩＮ−０２２： １−［６−（３−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
ドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ
］ピロール−４−オン ６−（３−メトキシ−フェニル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを
４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−
１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３８７．２［Ｍ+＋１］
【０１９４】 化合物ＩＮ−０２３： １−［６−（４−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
ドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ
］ピロール−４−オン ６−（４−メトキシ−フェニル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを
４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−
１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３８７．２［Ｍ+＋１］
【０１９５】 化合物ＩＮ−０２４： １−［６−（４−フルオロ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
ドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ
］ピロール−４−オン ６−（４−フルオロ−フェニル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを
４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−
１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３７５．２［Ｍ+＋１］
【０１９６】 化合物ＩＮ−０２５： １−（２−オキソ−６−ピリジン−３−イル−１，２−ジヒドロ−インドール−
３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロー
ル−４−オン ６−ピリジン−３−イル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキ
ソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カル
ボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３５８．４［Ｍ+＋１］
【０１９７】 化合物ＩＮ−０２６： １−［５−（２，３−ジヒドロ−インドール−１−スルホニル）−２−オキソ−
１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２
Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の５−クロロスルホニル−２−オキシインドール（５ｇ，
２１．６ｍｍｏｌ）およびインドリン（２．９ｍＬ，２６ｍｍｏｌ）の混合物に
，ピリジン（３．４ｇ，４３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１日撹拌した後，沈澱
物を濾過により回収し，エタノール中水（２０％）で洗浄し，乾燥し，６０ｍＬ
の熱エタノールで洗浄し，真空下で乾燥して，７．５ｇ（１００％以上）の５−
（２，３−ジヒドロ−インドール−１−スルホニル）−１，３−ジヒドロ−イン
ドール−２−オンをピンク色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１０．７６（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），７．６２（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．１
３−７．１８（ｍ，２Ｈ），６．９５（ｄｔ，Ｊ＝０．９＆７．５Ｈｚ，１Ｈ）
，６．９０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２
Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2），３．５１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９１（ｔ，Ｊ＝８．５
Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＨ2）．ＭＳ−ＥＩ３１４［Ｍ+］． ５−（２，３−ジヒドロ−インドール−１−スルホニル）−１，３−ジヒドロ−
インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［
３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た
。 ＭＳｍ／ｚ４６２．３［Ｍ+＋１］
【０１９８】 化合物ＩＮ−０２７： １−［５−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−スルホニル）−２−オキ
ソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ
−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ５−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−スルホニル）−１，３−ジヒド
ロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラ
ノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を
得た。 ＭＳｍ／ｚ４７６．２［Ｍ+＋１］
【０１９９】 化合物ＩＮ−０２８： １−［５−（３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−スルホニル）−２−
オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒ
ドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ５−（３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−スルホニル）−１，３−ジ
ヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−
ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合
物を得た。 ＭＳｍ／ｚ４７６．３［Ｍ+＋１］
【０２００】 化合物ＩＮ−０２９： １−［５−（５−ブロモ−２，３−ジヒドロ−インドール−１−スルホニル）−
２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７−
ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ５−（５−ブロモ−２，３−ジヒドロ−インドール−１−スルホニル）−１，３
−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒド
ロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題
化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ５４０．３＆５４２［Ｍ+＋１］
【０２０１】 化合物ＩＮ−０３０： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−５−スルホン酸（３−クロロ−フェニル）−メチル−アミド ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３−クロ
ロ−フェニル）−メチル−アミドを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ
−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化
合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ４８４．２［Ｍ+＋１］
【０２０２】 化合物ＩＮ−０３１： １−（６−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オ
ン ６−フルオロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４
，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒ
ドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ２９９．２［Ｍ+＋１］
【０２０３】 化合物ＩＮ−０３２： １−（５−クロロ−４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−
３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロー
ル−４−オン ５−クロロ−４−メチル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキ
ソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カル
ボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３２９．２［Ｍ+＋１］
【０２０４】 化合物ＩＮ−０３３： １−（７−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン ７−クロロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキソ−２，４，
６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒド
と縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３１５．２［Ｍ+＋１］
【０２０５】 化合物ＩＮ−０３４： ３−［２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ
［３，４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イン
ドール−５−イル］−安息香酸 ３−（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−イル）−安息香
酸を４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロー
ル−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ４０１．２［Ｍ+＋１］
【０２０６】 化合物ＩＮ−０３５： ３−［２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ
［３，４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イン
ドール−６−イル］−安息香酸 ３−（２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−６−イル）−安息香
酸を４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロー
ル−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ４０１．２［Ｍ+＋１］
【０２０７】 化合物ＩＮ−０３６： ２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，
４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール
−５−スルホン酸（３−クロロ−フェニル）−アミド ２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３−クロ
ロ−フェニル）−アミドを４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ
［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得
た。 ＭＳｍ／ｚ４７０．２［Ｍ+＋１］
【０２０８】 化合物ＩＮ−０３７： １−（５−ブロモ−４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−
３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロー
ル−４−オン ５−ブロモ−４−メチル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを４−オキ
ソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カル
ボアルデヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ３７３．２＆３７５［Ｍ+＋１］
【０２０９】 化合物ＩＮ−０３８： １−（２−オキソ−５−フェニル−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−
４−オン エタノール（１ｍＬ）中の５−フェニル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−
オン（４１．８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６，７−テトラ
ヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒド（１当量
）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で８０で３時間加熱した。
沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物を
黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．０６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．１６（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）
，７．８６（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．６８−７．７１（ｍ，３Ｈ），７．
４０−７．４８（ｍ，４Ｈ），７．３１（ｍ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝８．
１Ｈｚ，１Ｈ），３．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），３．０２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈ
ｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３５６［Ｍ+＋１］
【０２１０】 化合物ＩＮ−０３９： １−（２−オキソ−６−フェニル−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−
４−オン エタノール（１ｍＬ）中の６−フェニル−１，３−ジヒドロ−インドール−２−
オン（４１．８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６，７−テトラ
ヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒド（１当量
）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で８０℃で３時間加熱した
。沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物
を黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．０９（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．８６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）
，７．７２（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．６８（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ）
，７．６４（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３０−
７．４０（ｍ，３Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），３．４１（ｍ
，２Ｈ，ＣＨ2），２．９９（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ
３５６［Ｍ+＋１］
【０２１１】 化合物ＩＮ−０４０： １−（６−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４
−オン エタノール（１ｍＬ）中の６−ブロモ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オ
ン（４２．４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒ
ドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒド（１当量）
および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で８０℃で３時間加熱した。
沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物を
黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．４５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．０９（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）
，７．７４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．７０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ）
，７．４１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．１９（ｄｄ，Ｊ＝１．４＆８．４Ｈｚ
，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），３．３９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ 2 ），２．９６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ３５８＆３６０［Ｍ + ＋１］
【０２１２】 化合物ＩＮ−０４１： １−（６−クロロ−２−オキソ−ｌ，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４
−オン エタノール（１ｍＬ）中の６−クロロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オ
ン（３３．５ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒ
ドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒド（１当量）
および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で８０℃で３時間加熱した。
沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物を
黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．４５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．１０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）
，７．７３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．６８（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ）
，７．４０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．０５（ｄｄ，Ｊ＝１．８＆８．１Ｈｚ
，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ 2 ），２．９７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３１４［Ｍ+
＋１］
【０２１３】 化合物ＩＮ−０４２： ２−オキソ−３−（４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ
［３，４−ｃ］ピリジン−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イン
ドール−５−スルホン酸ジメチルアミド エタノール（１ｍＬ）中の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
５−スルホン酸ジメチルアミド（４８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４
，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１カルボ
アルデヒド（１当量）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で８０
℃で３時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，乾
燥して，表題化合物を黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．２５（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２９（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ）
，８．０３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．７３（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ）
，７．５３（ｄｄ，Ｊ１．６＆８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｂｒｓ，１Ｈ，
ＮＨ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），３．４３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2
），３．０６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．６０（ｓ，６Ｈ，２
ｘＣＨ3）．ＭＳｍ／ｚ３８７［Ｍ+＋１］
【０２１４】 化合物ＩＮ−０４３： ２−オキソ−３−（４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ
［３，４−ｃ］ピリジン−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イン
ドール−５−カルボン酸ジメチルアミド ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオ
ロホスフェート（ＰｙＢＯＰ，３．５ｇ，６．７２ｍｍｏｌ）を，ジクロロメタ
ン中の５−カルボキシ−２−オキシインドール（１ｇ，５．６ｍｍｏｌ），ジメ
チルアミン（５．６ｍＬの２．０Ｍ，ＴＨＦ中，１１．２ｍｍｏｌ）およびトリ
エチルアミン（２．０ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。室温で３時間撹
拌した後，反応液を追加のジクロロメタンで希釈し，水，飽和炭酸水素ナトリウ
ムおよびブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィ
ーにより精製して，４８０ｍｇ（４２％）の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１
Ｈ−インドール−５−カルボン酸ジメチルアミドを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１０．５０（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），７．２３（ｍ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），３．４
９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９３（ｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3）．ＭＳ−ＥＩｍ／ｚ
２０４［Ｍ+］ エタノール（１ｍＬ）中の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
５−カルボン酸ジメチルアミド（４０．８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ
−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１カ
ルボアルデヒド（１当量）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で
８０℃で３時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し
，乾燥して，表題化合物を黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．１４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９２（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）
，７．８２（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．６８（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ）
，７．４０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．２０（ｄｄ，Ｊ＝１．３＆８．０Ｈｚ
，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ 2 ），２．９９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９７（ｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3）．ＭＳ
３５１ｍ／ｚ［Ｍ+＋１］
【０２１５】 化合物ＩＮ−０４４： １−［２−オキソ−５−（ピロリジン−１−カルボニル）−１，２−ジヒドロ−
インドール−３−イリデンメチル］−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［
３，４−ｃ］ピリジン−４−オン ＰｙＢＯＰ（３．５ｇ，６．７２ｍｍｏｌ）を，ジクロロメタン中の５−カルボ
キシ−２−オキシインドール（１ｇ，５．６ｍｍｏｌ），ピロリジン（０．５ｍ
Ｌ，６．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．０ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）の
混合物に加えた。室温で４時間撹拌した後，反応液を追加のジクロロメタンで希
釈し，飽和炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残
渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して，５−（ピロリジン−１−カルボ
ニル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１０．５２（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），７．３７（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），３．４
９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2），３．４２（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ2），１．８１（ｍ，４
Ｈ，２ｘＣＨ2） ＭＳ−ＥＩｍ／ｚ２３０［Ｍ+］ エタノール（１ｍＬ）中の５−（ピロリジン−１−カルボニル）−１，３−ジヒ
ドロ−インドール−２−オン（４６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，
５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボ
アルデヒド（１当量）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で８０
℃で３時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，乾
燥して，表題化合物を黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．１４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０２（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ）
，７．８３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．６９（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ）
，７．４０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．３２（ｄｄ，Ｊ＝１．３＆７．７Ｈｚ
，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３９−３．４８（ｍ，
６Ｈ），３．０（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），１．８４（ｍ，４Ｈ，
２ｘＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３７７［Ｍ+＋１］
【０２１６】 化合物ＩＮ−０４５： １−［５−（モルホリン−４−カルボニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−
インドール−３−イリデンメチル］−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［
３，４−ｃ］ピリジン−４−オン ＰｙＢＯＰ（３．５ｇ，６．７２ｍｍｏｌ）を，ジクロロメタン中の５−カルボ
キシ−２−オキシインドール（１ｇ，５．６ｍｍｏｌ），モルホリン（０．５ｍ
Ｌ，６．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．０ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）の
混合物に加えた。室温で４時間撹拌した後，反応液を追加のジクロロメタンで希
釈し，飽和炭酸水素ナトリウムおよびブラインで洗浄し，乾燥し，濃縮した。残
渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して，５−（モルホリン−４−カルボ
ニル）−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１０．５４（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），３．５
６（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ2），３．４９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2），３．４７（ｍ，４
Ｈ，２ｘＣＨ2） ＭＳＡＰＣＩｎｅｇ．ｍ／ｚ２４５［Ｍ+−１］ エタノール（１ｍＬ）中の５−（モルホリン−４−カルボニル）−１，３−ジヒ
ドロ−インドール−２−オン（４９．２ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−
４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カ
ルボアルデヒド（１当量）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で
８０℃で３時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し
，乾燥して，表題化合物を黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．１６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９２（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ）
，７．８３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．６９（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）
，７．４１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．２１（ｄｄ，Ｊ＝１．４＆７．９Ｈｚ
，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｍ，４Ｈ，２ｘ
ＣＨ2），３．５２（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ2），３．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），
３．０（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３９３［Ｍ+＋１］
【０２１７】 化合物ＩＮ−０４６： １−［４−（２−ヒドロキシ−エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
ドール−３−イリデンメチル］−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，
４−ｃ］ピリジン−４−オン エタノール（１ｍＬ）中の４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１，３−ジヒドロ
−インドール−２−オン（３５．４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，
５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボ
アルデヒド（３２．８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）および０．１ｍＬのピペリジンの
混合物を密封管中で８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，
冷エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．６２（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１１．０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．６６（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），
７．５５（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．３８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．０
７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６
．７６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．８９（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，
ＯＨ），３．７０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），３．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），３．０
６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．８９（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２
Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３２４［Ｍ+＋１］
【０２１８】 化合物ＩＮ−０４７： １−（５−メトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−
４−オン エタノール（１ｍＬ）中の５−メトキシ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−
オン（３２．６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６，７−テトラ
ヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒド（３２．
８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で
８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，冷エタノールで洗浄
し，乾燥して，表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ，）δ１３．６５（ｂｒｓ，１Ｈ，
ＮＨ），１０．７９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），
７．６６（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ
），７．３８（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．７５（ｍ，２Ｈ），３．４１（ｍ，
２Ｈ，ＣＨ2），３．３２（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ3），２．９９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈ
ｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３１０［Ｍ+＋１］
【０２１９】 化合物ＩＮ−０４８： １−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデ
ンメチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−
４−オン エタノール（１ｍＬ）中の５−フルオロ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−
オン（３０．２ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６，７−テトラ
ヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒド（３２．
８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で
８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，冷エタノールで洗浄
し，乾燥して，表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５７（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１０．９８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７
．７３（ｄｄ，Ｊ＝２．６＆９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈ
ｚ，１Ｈ），７．４０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．９６（ｍ，１Ｈ），６．８
４（ｄｄ，１Ｈ），３．４１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９８（ｔ，Ｊ＝６．５
Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ２９８［Ｍ+＋１］
【０２２０】 化合物ＩＮ−０４９： １−（５−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデン
メチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４
−オン エタノール（１ｍＬ）中の５−ブロモ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オ
ン（２３ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒド
ロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒド（２９．７ｍ
ｇ，０．１８ｍｍｏｌ）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を密封管中で８
０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，冷エタノールで洗浄し
，乾燥して，２６ｍｇ（６７％）の表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５２（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１１．０９（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０８（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１
Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．７０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１
Ｈ），７．４１（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．２９（ｄｄ，Ｊ＝２．３＆８．３
Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ，
ＣＨ2），２．９９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３５８／
３６０
【０２２１】 化合物ＩＮ−０５０： ２−オキソ−３−（４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ
［３，４−ｃ］ピリジン−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イン
ドール−５−カルボン酸 エタノール（１ｍＬ）中の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
５−カルボン酸（４４．５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６
，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデ
ヒド（４１ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を
密封管中で８０℃で６時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，冷エタノ
ールで洗浄した。次に固体をメタノールに溶解し，不溶性物質を除去し，濾液を
濃縮して，２０ｍｇ（２５％）の表題化合物を黄色固体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．１０（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２４（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｄ，
Ｉ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｍ，２Ｈ），７．３７（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．３８（ｍ，ＣＨ2），３．
０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３２４［Ｍ+＋１］
【０２２２】 化合物ＩＮ−０５１： ２−オキソ−３−（４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ
［３，４−ｃ］ピリジン−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イン
ドール−５−スルホン酸アミド エタノール（１ｍＬ）中の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
５−スルホン酸アミド（６３ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，５，６
，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデ
ヒド（５０ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）および０．１ｍＬのピペリジンの混合物を，
密封管中で８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，冷エタノ
ールで洗浄し，乾燥して，８９ｍｇ（８２％）の表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．２２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２７（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）
，７．８８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．７２（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ）
，７．６４（ｄｄ，Ｊ＝１．５＆８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｂｒｓ，１Ｈ
，ＮＨ），７．１７（ｂｒｓ，２Ｈ，ＮＨ2），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ
，１Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），３．０２（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２
Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳｍ／ｚ３５９［Ｍ+＋１］
【０２２３】 化合物ＩＮ−０５２： ２−オキソ−３−（４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ
［３，４−ｃ］ピリジン−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イン
ドール−５−スルホン酸メチルアミド エタノール（１ｍＬ）中の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
５−スルホン酸メチルアミド（６６ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ），４−オキソ−４，
５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボ
アルデヒド（５０ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）および０．１ｍＬのピペリジンの混合
物を密封管中で８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，冷エ
タノールで洗浄し，乾燥して，５０ｍｇ（４５％）の表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５１（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１１．２（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２６（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ
），７．９４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．７３（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ
），７．５８（ｄｄ，Ｊ＝１．３＆８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｂｒｓ，１
Ｈ，ＮＨ），７．２０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ3ＮＨ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈ
ｚ，１Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，
２Ｈ，ＣＨ2），２．４０（ｂｒｓ，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳｍ／ｚ３７３［Ｍ+＋
１］
【０２２４】 化合物ＩＮ−０５３： ４−ヒドロキシエチル−２−オキシインドール（５ｇ，２８．２ｍｍｏｌ）を２
０ｍＬのクロロスルホン酸に室温で撹拌しながら溶解した。３０分後，反応混合
物を氷水（３００ｍＬ）に撹拌しながらゆっくり加えた。固体を濾過し，乾燥し
て，１．９ｇ（２８％）の６，６−ジオキソ−３，６，８，９−テトラヒドロ−
１Ｈ−７−オキサ−６λ6−チア−３−アザシクロペンタ［α］ナフタレン−２
−オンを白色粉体として得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１０．７９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，７．６５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８）
．２Ｈｚ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．８７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2Ｏ
ＳＯ2），３．５１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ2ＣＯ），３．０４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，
２Ｈ，ＣＨ2Ａｒ）．ＭＳｍ／ｚ２３９［Ｍ+］ ６，６−ジオキソ−３，６，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−７−オキサ−６λ6
−チア−３−アザ−シクロペンタ［α］ナフタレン−２−オン（０．１ｇ，０．
４ｍｍｏｌ）を４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−
ｃ］ピロール−１−カルボアルデヒド（１．２当量，０．０８ｇ）と縮合させて
，０．０８ｇ（５０％）の所望の生成物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．７５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，１１．５５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−ＣＯ），７．９５（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ
），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ）
，７．０４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），４．９５（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ，Ｓ
Ｏ3ＣＨ2ＣＨ2Ａｒ），４．５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＯ2ＣＨ2ＣＨ2ピ
ロール），３．５５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ，ＳＯ3ＣＨ2ＣＨ2Ａｒ），３
．０９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＯ2ＣＨ2ＣＨ2ピロール）
【０２２５】 化合物ＩＮ−０５４： エタノール（１ｍＬ）中の４−（２−ヒドロキシ−エチル）−１，３−ジヒドロ
−インドール−２−オン（３５．４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），５−メチル−４−
オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン
−１−カルボアルデヒド（３５．６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）およびピペリジン（
０．１ｍＬ）の混合物を８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収
し，エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．５９（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１０．９６（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．６４（ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１
Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．０７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１
Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ
，１Ｈ），４．８６（ｍ，１Ｈ，ＯＨ），３．７１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ，ＯＨ），
３．５７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），３．０７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈ
ｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９５
（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3） ＭＳｍ／ｚ３３８［Ｍ+＋１］
【０２２６】 化合物ＩＮ−０５５： エタノール（１ｍＬ）中の５−ブロモ−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オ
ン（４２．４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），５−メチル−４−オキソ−４，５，６，
７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カルボアルデヒ
ド（３５．６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）およびピペリジン（０．１ｍＬ）の混合物
を８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄
し，乾燥して，表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．４７（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１１．０４（ｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０６（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１
Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．６８（ｔ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１
Ｈ），７．２９（ｄｄ，Ｊ＝１．９＆８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｄ，Ｊ＝
８．５Ｈｚ，１Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），３．０
８（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）；ＭＳ
ｍ／ｚ３７２／３７４［Ｍ+＋１］
【０２２７】 化合物ＩＮ−０５６： エタノール（１ｍＬ）中の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
５−カルボン酸（３５．４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），５−メチル−４−オキソ−
４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−カ
ルボアルデヒド（３５．６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）およびピペリジン（０．１ｍ
Ｌ）の混合物を８０℃で４時間加熱した。反応液を１ＮＨＣｌで処理し，沈澱物
を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物を得た。 1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．４６（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１２．６（ｖｂｒｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ），１１．２６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）
，８．４０（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．８０（ｔ，
Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｄｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄ
，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），３．５７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），３．
１３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3） ＭＳｍ／ｚ３３８［Ｍ+＋１］
【０２２８】 化合物ＩＮ−０５７： エタノール（１ｍＬ）中の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
５−スルホン酸メチルアミド（４５．２ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），５−メチル−
４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリ
ジン−１−カルボアルデヒド（３５．６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）およびピペリジ
ン（０．１ｍＬ）の混合物を８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により
回収し，エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．４７（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１１．２８（ｖｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２４（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，
１Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．７１（ｔ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，
１Ｈ），７．５８（ｄｄ，Ｊ＝１．５＆８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｍ，１
Ｈ，ＣＨ3ＮＨ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ
＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），３．１３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2）
，２．９５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．４２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3） ＭＳｍ／ｚ３８７［Ｍ+＋１］
【０２２９】 化合物ＩＮ−０５８： エタノール（１ｍＬ）中の２−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
５−スルホン酸ジメチルアミド（４８ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ），５−メチル−４
−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジ
ン−１−カルボアルデヒド（３５．６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）およびピペリジン
（０．１ｍＬ）の混合物を８０℃で４時間加熱した。沈澱物を真空濾過により回
収し，エタノールで洗浄し，乾燥して，表題化合物を得た。1 Ｈ−ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ１３．４８（ｂｒｓ，１Ｈ，Ｎ
Ｈ），１１．３５（ｖｂｒｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２６（ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，
１Ｈ），８．０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ビニル），７．７２（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１
Ｈ），７．５４（ｄｄ，Ｊ＝１．５＆８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝
８．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），３．１
５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ2），２．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），２．
６１（ｓ，６Ｈ，２ｘＣＨ3） ＭＳｍ／ｚ４０１［Ｍ+＋１］
【０２３０】 化合物ＩＮ−０５９： １，３−ジヒドロ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−２−オンを４−オキソ−２
，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−カルボアル
デヒドと縮合させて，表題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ２８２［Ｍ+＋１］
【０２３１】 化合物ＩＮ−０６０： ４−（３−クロロ−４−フルオロ−フェニルアミノ）−５，７−ジヒドロ−ピロ
ロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−オンを４−オキソ−２，４，６，７−テトラ
ヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１カルボアルデヒドと縮合させて，表
題化合物を得た。 ＭＳｍ／ｚ４２６［Ｍ+＋１］
【０２３２】アッセイ方法 以下のインビトロアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の，１つまたはそ
れ以上のＰＫに対する活性および効果のレベルを決定することができる。同様に
して，当該技術分野においてよく知られる技術を用いて，任意のＰＫについて類
似のアッセイを設計することができる。
【０２３３】 化合物を評価するためには３種類の一般的アッセイが有用である：細胞／触媒
，細胞／生物学およびインビボ。細胞／触媒アッセイの目的は，細胞において既
知の基質上のチロシンをリン酸化するＴＫの能力に及ぼす化合物の影響を判定す
ることである。細胞／生物学アッセイの目的は，細胞においてＴＫにより刺激さ
れる生物学的応答に及ぼす化合物の影響を判定することである。インビボアッセ
イの目的は，特定の疾患，例えば癌の動物モデルにおける化合物の影響を判定す
ることである。
【０２３４】 本明細書に記載される細胞／触媒アッセイは，ＥＬＩＳＡフォーマットで実施
する。一般的方法は以下のとおりである：天然にまたは組換え的に試験キナーゼ
を発現する細胞に化合物を導入する。ある時間が経過した後，試験キナーゼがレ
セプターである場合には，レセプターを活性化することが知られているリガンド
を加える。細胞を溶解し，酵素的リン酸化反応の基質を認識する特異的抗体であ
らかじめコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウエルに溶解物を移す。細胞溶
解物の非基質成分を洗い流し，ホスホチロシンを特異的に認識する抗体で基質の
リン酸化の量を検出し，試験化合物と接触させていない対照細胞と比較する。
【０２３５】 本明細書に記載される細胞／生物学的アッセイは，試験キナーゼの活性化に応
答して生成したＤＮＡの量を測定し，これは一般的な増殖性応答の測定である。
このアッセイの一般的方法は次のとおりである：天然にまたは組換え的に試験キ
ナーゼを発現する細胞に化合物を導入する。ある時間が経過した後，試験キナー
ゼがレセプターである場合にはレセプターを活性化することが知られているリガ
ンドを加える。少なくとも一夜インキュベーションした後，ＤＮＡ標識試薬，例
えばブロモデオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）または３Ｈ−チミジンを加える。抗
ＢｒｄＵ抗体でまたは放射活性を測定することにより標識されたＤＮＡの量を検
出し，試験化合物と接触させていない対照細胞と比較する。
【０２３６】細胞／触媒アッセイ 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて，ＰＫ活性の存在
を検出し測定することができる。ＥＬＩＳＡは，例えば，Ｖｏｌｌｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，１９８０（"Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ
ｔ Ａｓｓａｙ，" Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，第２版，Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ編，ｐｐ３５９−３７１
Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ
．Ｃ．）に記載の既知のプロトコルに従って実施することができる。
【０２３７】 開示されるプロトコルを，特定のＰＫに関する活性を判定するように適合させ
ることができる。例えば，特定のＰＫに関するＥＬＩＳＡ実験を実施するための
好ましいプロトコルは以下に記載される。ＲＴＫファミリーの他のメンバー，な
らびにＣＴＫおよびＳＴＫに対する化合物の活性を判定するためにこれらのプロ
トコルを適合させることは，十分に当業者の知識の範囲内である。
【０２３８】実施例２：ＦＬＫ−１ ＥＬＩＳＡアッセイを実施して，ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性，より
詳細にはＦＬＫ−１レセプター上のＴＫ活性の阻害または活性化を測定した。詳
細には，以下のアッセイを実施して，Ｆｌｋ−１を発現するように遺伝子工学処
理された細胞において，ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性を測定した。
【０２３９】材料および方法 材料 以下の試薬および供給物を用いた。 ａ． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ
Ｎｏ．２５８０５−９６）； ｂ． Ｃａｐｐｅｌヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログＮｏ．５５６４１）； ｃ． ＰＢＳ（ＧｉｂｃｏカタログＮｏ．４５０−１３００ＥＢ）； ｄ． ＴＢＳＷ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．２），１５０ｍＭＮａＣｌ
および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）； ｅ． エタノールアミン保存液（１０％エタノールアミン（ｐＨ７．０），４℃
で保存）； ｆ． ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，および１０％グリセロール）； ｇ． ＥＤＴＡ（０．５Ｍ（ｐＨ７．０）１００Ｘ保存液として）； ｈ． オルトバナジウム酸ナトリウム（０．５Ｍ，１００Ｘ保存液として）； ｉ． ピロリン酸ナトリウム（０．２Ｍ，１００Ｘ保存液として）； ｊ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＮｏ．ＡＳ−７２０９２）； ｋ． ＮＩＨ３Ｔ３ Ｃ７＃３細胞（ＦＬＫ−１発現細胞）； ｌ． ＤＭＥＭ，１Ｘ高グルコースＬ−グルタミン含有（カタログＮｏ．１１９
６５−０５０）； ｍ． ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ（カタログＮｏ．１６０００−０２８）； ｎ． Ｌ−グルタミン，Ｇｉｂｃｏ（カタログＮｏ．２５０３０−０１６）； ｏ． ＶＥＧＦ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カタログＮｏ．１００−２０
）Ｍｉｌｌｉ−ＱｄＨ2Ｏ中１μｇ／１００μｌ保存液として保持し，−２０℃
で保存； ｐ． アフィニティー精製抗ＦＬＫ−１抗血清； ｑ． ホスホチロシン特異的ＵＢ４０モノクローナル抗体（Ｆｅｎｄｌｅｙ，ｅ
ｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５５０−１
５５８を参照）； ｒ． ＥＩＡ等級ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ（ＢｉｏＲａｄカタログＮｏ．１
７２−１０１１）； ｓ． ２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸（ＡＢＴ
Ｓ）溶液（１００ｍＭクエン酸（無水），２５０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4（ｐＨ４．０
），０．５ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳ（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ａ−１８８８）），
溶液は，使用まで暗所で４℃で保存しなければならない； ｔ． Ｈ2Ｏ2（３０％溶液）（ＦｉｓｈｅｒカタログＮｏ．Ｈ３２５）； ｕ． ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2（１５ｍｌＡＢＴＳ溶液，２μｌＨ2Ｏ2）使用の５分間
に調製，室温に保持； ｖ． ０．２ＭＨＣｌ保存液，Ｈ2Ｏ中； ｗ． ジメチルスルホキシド（１００％）（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ｄ−８４
１８）；および ｙ． トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログＮｏ．２５２００−
０４９）
【０２４０】プロトコル 以下のプロトコルを用いてアッセイを実施した： １． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，ウエルあたり１．０μ
ｇの，０．１ＭＮａ2ＣＯ3（ｐＨ９．６）中Ｃａｐｐｅｌ抗ウサギＩｇＧ抗体，
でコーティングする。最終容量をウエルあたり１５０μｌとする。プレートを４
℃で一夜コーティングする。プレートは，４℃で保存したとき，２週間まで保存
することができる。 ２． 細胞を適当な培養皿中で成長培地（ＤＭＥＭ，２．０ｍＭＬ−グルタミン
，１０％ＦＢＳを補充）中で，コンフルエントとなるまで３７℃，５％ＣＯ2で
成長させる。 ３． トリプシン処理により細胞を回収し，Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８５０ポリスチ
レン９６ウエル丸底細胞プレートに，２００μｌの成長培地中２５，０００細胞
／ウエルで播種する。 ４． 細胞を３７℃，５％ＣＯ2で少なくとも１日成長させる。 ５． 細胞をＤ−ＰＢＳ １Ｘで洗浄する。 ６． ２００μｌ／ウエルの飢餓培地（ＤＭＥＭ，２．０ｍＭ ｌ−グルタミン
，０．１％ＦＢＳ）を加える。３７℃，５％ＣＯ2で一夜インキュベートする。 ７． 化合物をポリプロピレン９６ウエルプレート中で飢餓培地を用いて１：２
０に希釈する。対照ウエルで使用するために，ジメチルスルホキシドを１：２０
に希釈する。 ８． ９６ウエル細胞培養プレートから飢餓培地を除去し，１６２μｌの新たに
調製した飢餓培地を各ウエルに加える。 ９． １：２０に希釈された化合物希釈物１８μｌ（工程７より）を各ウエルに
加え，１：２０ジメチルスルホキシド希釈物を対照ウエルに加え（＋／−ＶＥＧ
Ｆ），細胞刺激の後，１：２００の最終希釈とする。最終ジメチルスルホキシド
は０．５％である。プレートを３７℃，５％ＣＯ2で２時間インキュベートする
。 １０． プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合抗体をＥＬＩ
ＳＡプレートから除去する。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７．０
で３回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体およ
び気泡を除去する。 １１． ウエルあたり１５０μｌのＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ
７．０でプレートをブロッキングする。プレートをマイクロタイタープレート振
盪器で振盪しながら，３０分間インキュベートする。 １２． プレートを工程１０で記載したように３回洗浄する。 １３． ０．５μｇ／ウエルのアフィニティー精製抗ＦＬＵ−１ポリクローナル
ウサギ抗血清を加える。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミンｐＨ７．０で最終
容量を１５０μｌ／ウエルとする。プレートを振盪しながら３０分間インキュベ
ートする。 １４． 細胞に１８０μｌの飢餓培地を加え，２０μｌ／ウエルの１０．０ｍＭ
オルトバナジウム酸ナトリウムおよび５００ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ（最終濃度；ウ
エルあたり１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムおよび５０ｎｇ／ｍｌＶＥ
ＧＦ）で３７℃，５％ＣＯ2で８分間細胞を刺激する。陰性対照ウエルには飢餓
培地のみを加える。 １５． ８分後，培地を細胞から除去し，２００μｌ／ウエルのＰＢＳで１回洗
浄しなければならない。 １６． １５０μｌ／ウエルのＨＮＴＧ中で室温で５分間振盪しながら細胞を溶
解させる。ＨＮＴＧ配合物はオルトバナジウム酸ナトリウム，ピロリン酸ナトリ
ウムおよびＥＤＴＡを含む。 １７． ＥＬＩＳＡプレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。 １８． 細胞溶解物を細胞プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し，振盪しなが
ら２時間インキュベートする。細胞溶解物を移すには，ウエルを掻きながらピペ
ットアップおよびダウンを行う。 １９． プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。 ２０． ＥＬＩＳＡプレートを０．０２μｇ／ウエルのＴＢＳＷ＋０５％エタノ
ールアミン中のＵＢ４０とともにインキュベートする。最終容量を１５０μｌ／
ウエルとする。振盪しながら３０分間インキュベートする。 ２１． プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。 ２２． ＥＬＩＳＡプレートを，ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７
．０中で１：１０，０００に希釈したＥＩＡ等級ヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲ
ート西洋ワサビペルオキシダーゼとともにインキュベートする。最終容量を１５
０μｌ／ウエルとする。振盪しながら３０分間インキュベートする。 ２３． 工程１０で記載したようにプレートを洗浄する。 ２４． １００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液をウエルに加える。振盪しながら１
０分間インキュベートする。 ２５． １００μｌの０．２ＭＨＣｌを０．１ＭＨＣｌ最終濃度となるように加
えて，発色反応を停止する。室温で１分間振盪する。ゆっくりした空気の流れで
気泡を除去し，ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍ
で読む。
【０２４１】実施例３：ＧＳＴ−ＦＬＫ−１バイオアッセイ このアッセイは，ポリｇｌｕ，ｔｙｒペプチドにおけるＧＳＴ−Ｆｌｋｌのチ
ロシンキナーゼ活性を分析する。
【０２４２】材料および試薬： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ
Ｎｏ．５８０５−９６） ２．ポリｇｌｕｔｙｒ４：１，ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ（Ｓｉｇｍａカタログ
＃Ｐ０２７５）。滅菌ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬのポリｇｌｕｔｙｒを調製し，１
ｍｌアリコート中で−２０℃で保存する。 ３．ポリｇｌｕｔｙｒ（ｐＥＹ）被覆アッセイプレートの調製：１００μｌＰＢ
Ｓ中の２μｇ／ウエルのポリ（ｇｌｕ，ｔｙｒ）（ｐＥＹ）を加え，室温で２時
間保持するか，４℃で一夜保持する。プレートをよく覆って蒸発を防ぐ。 ４．ＰＢＳ緩衝液：１Ｌにつき，０．２ｇＫＨ2ＰＯ4，１．１５ｇＮａ2ＨＰＯ4 ，０．２ｇＫＣｌおよび８ｇＮａＣｌを約９００ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合する。
すべての試薬が溶解したとき，ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。ｄＨ2Ｏで総
容量を１Ｌとする。 ５．ＰＢＳ−Ｔｗ緩衝液：１ＬのＰＢＳ緩衝液に１．０ｍｌＴｗｅｅｎ２０を加
える。溶解するまで撹拌する。 ６．ＴＢＢ−ブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１．２１ｇＴＲＩＳ，８．７７
ｇＮａＣｌ，１ｍｌＴＷＥＥＮ−２０を約９００ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合する。
ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する。１０ｇＢＳＡを加え，撹拌して溶解させる。
ｄＨ2Ｏで総容量を１Ｌとする。濾過して粒子状物質を除去する。 ７．１％ＢＳＡ，ＰＢＳ中：１ｘ作業溶液を作成するためには，１０ｇＢＳＡを
約９９０ｍｌのＰＢＳ緩衝液に加え，撹拌して溶解させる。ＰＢＳ緩衝液で総容
量を１Ｌに調節し，濾過して，粒子状物質を除去する。 ８．５０ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．５ ９．ｓｆ９組換えバキュロウイルストランスフォーメーションから精製したＧＳ
Ｔ−Ｆｌｋｌｃｄ。 １０．４％ＤＭＳＯ，ｄＨ2Ｏ中 １１．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中 １２．４０ｍＭＭｎＣｌ2 １３．キナーゼ希釈緩衝液（ＫＤＢ）：１０ｍｌＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５），１
ｍｌ５ＭＮａＣｌ，４０μｌの１００ｍＭＮａＶＯ4および０．４ｍｌの５％Ｂ
ＳＡ（ｄＨ2Ｏ中）を８８．５６ｍｌのｄＨ2Ｏ中で混合する。 ．１４．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２ １５．ＥＤＴＡ：１４．１２ｇエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を約７０ｍ
ｌｄＨ2Ｏに混合する。ＥＤＴＡが溶解するまで１０ＮＮａＯＨを加える。ｐＨ
を８．０に調節する。ｄＨ2Ｏで総容量を１００ｍｌに調節する。 １６．第１抗体希釈緩衝液：１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液中５％ＢＳＡを８９．５ｍ
ｌのＴＢＳＴｗと混合する。 １７．西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ホスホチロシンモノ
クローナル抗体（ＰＹ９９ＨＲＰ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ） １８．２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（
ＡＢＴＳ，Ｍｏｓｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＢＳＴ） １９．１０％ＳＤＳ
【０２４３】方法： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレートを無菌ＰＢＳ中の２μｇの
ポリＥＹペプチドで，材料および試薬の工程３に記載されるように被覆する。 ２．プレートを逆さにすることにより未結合液体をウエルから除去する。ＴＢＳ
Ｔで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体を
除去する。 ３．１００μｌの１％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）を各ウエルに加える。振盪しながら室
温で１時間インキュベートする。 ４．工程２を繰り返す。 ５．ウエルを５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（１５０μｌ／ウエル）に浸漬
する。 ６．試験化合物を９６−ウエルポリプロピレンプレート中でｄＨ2Ｏ／４％ＤＭ
ＳＯで所望の最終アッセイ濃度の４倍に希釈する。 ７．２５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエルには
，２５μｌのｄＨ2Ｏ／４％ＤＭＳＯを加える。 ８．２５μｌの４０ｍＭＭｎＣｌ2および４ｘＡＴＰ（２μＭ）を各ウエルに加
える。 ９．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。 １０．ＧＳＴ−Ｆｌｋｌを０．００５μｇ（５ｎｇ）／ウエルでＫＤＢで希釈す
る。５０ｍｌのＫＤＢにつき，１００μｌの０．０５０ｍｇ／ｍＬＧＳＴ−Ｆｌ
ｋｌ酵素を加える。 １１．５０μｌの希釈酵素を各ウエルに加える。 １２．振盪しながら室温で１５分間インキュベートする。 １３．５０μｌの２５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えることにより反応を
停止する。 １４．ＴＢＳＴで３回洗浄し，プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰
の液体を除去する。 １５．抗体希釈緩衝液中で１：５，０００に希釈した１００μｌ／ウエルの抗ホ
スホチロシンＨＲＰコンジュゲートを加える。振盪しながら室温で９０分間イン
キュベートする。 １６．工程１４と同様に洗浄する。 １７．１００μｌの室温のＡＢＴＳ溶液を各ウエルに加える。 １８．振盪しながら１０−１５分間インキュベートする。泡を除去する。 １９．２０μｌの１０％ＳＤＳを各ウエルに加えることにより反応を停止する。 ２０．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１
０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭで結果を読む。
【０２４４】実施例４：ＰＹＫ２バイオアッセイ このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイにおいて，ＨＡエピトープタグ付
け全長ｐｙｋ２（ＦＬ．ｐｙｋ２−ＨＡ）のインビトロキナーゼ活性を測定する
。
【０２４５】材料および試薬： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ
＃２５８０５−９６） ２．１２ＣＡ５モノクローナル抗ＨＡ抗体 ３．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１
３００ＥＢ） ４．ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌにつき，８．７６６ｇＮａＣｌ，６．０５７ｇＴＲＩ
Ｓおよび１ｍｌの０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を約９００ｍｌｄＨ2Ｏ中で
混合する。ｐＨを７．２に調節し，容量を１Ｌとする。 ５．ブロッキング緩衝液：１Ｌにつき，１００ｇ１０％ＢＳＡ，１２．１ｇ１０
０ｍＭＴＲＩＳ，５８．４４ｇ１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＬの１％ＴＷＥＥＮ２
０を混合する。 ６．ｓｆ９細胞溶解物からのＦＬ．ｐｙｋ２−ＨＡ ７．４％ＤＭＳＯ，ＭｉｌｌｉＱｕｅＨ2Ｏ中 ８．１０ｍＭＡＴＰ，ｄＨ2Ｏ中 ９．１ＭＭｎＣｌ2 １０．１ＭＭｇＣｌ2 １１．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ） １２．１０Ｘキナーゼ緩衝液リン酸化：５．０ｍｌ１ＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５
），０．２ｍｌ１ＭＭｎＣｌ2，１．０ｍｌ１ＭＭｇＣｌ2，１．０ｍｌ１０％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００を２．８ｍｌｄＨ2Ｏ中で混合する。使用直前に０．１ｍ
ｌ１ＭＤＴＴを加える。 １３．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ＃ＡＳ−７２０９２） １４．ＥＤＴＡ １５．ビオチンコンジュゲート化抗ホスホチロシンｍａｂ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，クローン４Ｇ１０；カタログ＃１６−１
０３，シリアル＃１４４９５） １６．Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ試薬（アビジンペルオキシダ
ーゼコンジュゲート，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｉｅｓ（ＰＫ−６１０
０） １７．ＡＢＴＳ溶液：１９．２１ｇのクエン酸および３５．４９ｇのＮａ2ＨＰ
Ｏ4を約９００ｍＬのｄＨ2Ｏ中で混合する。リン酸でｐＨを４．０に調節する。
５または１０ｇのＡＢＳＴを加える。すべて溶解したときに濾過する。 １８．過酸化水素３０％溶液 １９．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2：使用の５分前に１５ｍＬのＡＢＴＳ溶液と３μｌの３
０％Ｈ2Ｏ2を混合する。 ２０．０．２ＭＨＣｌ
【０２４６】方法： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを１００μｌＰＢＳ中の０．
５μｇ／ウエルの１２ＣＡ５抗ＨＡ抗体で被覆する。４℃で一夜保存する。 ２．プレートを逆さにすることにより未結合ＨＡ抗体をウエルから除去する。プ
レートをｄＨ2Ｏで洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過
剰の液体を除去する。 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
１時間インキュベートする。 ４．プレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄する。 ５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（１．５μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。 ６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で１時間振盪する。 ７．工程４と同様に洗浄する。 ８．５０μｌの２Ｘキナーゼ緩衝液を捕捉ｐｙｋ２−ＨＡを含むＥＬＩＳＡプレ
ートに加える。 ９．２５μｌの４％ＤＭＳＯ中４０μＭ試験化合物を各ウエルに加える。対照ウ
エルには４％ＤＭＳＯのみを用いる。 １０．２５μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。 １１．２５μｌの２０μＭＡＴＰをすべてのウエルに加える。振盪しながら１０
分間インキュベートする。 １２．２５μｌの５００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）をすべてのウエルに加える
ことにより反応を停止する。 １３．工程４と同様に洗浄する。 １４．１００μｌのビオチンコンジュゲート化抗ホスホチロシンｍａｂ（１：５
０００希釈，ブロッキング緩衝液中）を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
３０分間インキュベートする。 １５．ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣ試薬を作成する。アビジンとビオチニル化Ｈ
ＲＰを完全にカップリングさせるために３０分間放置する。１滴（または５０μ
ｌ）の試薬Ａを１５ｍＬのブロッキング緩衝液に加える。管を数回逆さにするこ
とにより混合する。１滴（または５０μｌ）の試薬Ｂを加え，再び混合する。ビ
オチン−４Ｇ１０抗ホスホチロシンをアッセイプレートでインキュベートする間
，ＡＢＣ試薬を室温で混合させる。 １６．工程４と同様に洗浄する。 １７．調製したＶｅｃｔａｓｔａｉｎペルオキシダーゼコンジュゲートを１００
μｌ／ウエルで加える。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 １８．工程４と同様に洗浄し，次にＰＢＳで１回洗浄する。 １９．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液を各ウエルに加える。 ２０．振盪しながら１０−１５分間インキュベートする。泡を除去する。 ２１．必要ならば，１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣＩを加えることにより反
応を停止する。 ２２．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタ４１
０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
【０２４７】実施例５：ＦＧＦＲ１バイオアッセイ このアッセイを用いて，ＥＬＩＳＡアッセイでＦＧＦ１−Ｒのインビトロキナ
ーゼ活性を測定する。
【０２４８】材料および試薬： １．Ｃｏｓｔａｒ９６−ウエルＥｌｉｓａプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃
３３６９） ２．ポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｐ０２７５） ３．ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１３００ＥＢ） ４．５０ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液溶液 ５．ブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ／ＰＢＳ） ６．精製ＧＳＴ−ＦＧＦＲ１ ７．キナーゼ希釈緩衝液：５００μｌの１ＭＨｅｐｅｓ（ＧＩＢＣＯ），２０μ
ｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳ，１０μｌの１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムお
よび５０μｌの５ＭＮａＣｌを混合する。 ８．１０ｍＭＡＴＰ ９．１ＭＭｎＣｌ2 １０．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ2リン酸化ミックス：２０μｌのＡＴＰ，４００μｌの
１ＭＭｎＣｌ2および９．５６ｍｌのｄＨ2Ｏを混合する。 １１．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２） １２．０．５ＭＥＤＴＡ １３．０．０５％ＴＢＳＴ ５００μｌのＴＷＥＥＮを１リットルのＴＢＳに加える。 １４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清 １５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ，カタログ＃ＡＬＩ０４０４） １６．ＡＢＴＳ溶液 １７．３０％過酸化水素 １８．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2
【０２４９】方法： １．Ｃｏｓｔａｒ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ウエルの１００μｌ
ＰＢＳ中ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）で被覆する。４℃で一夜保存する。 ２．被覆したプレートをＰＢＳで１回洗浄する。 ３．１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。
振盪しながら室温で１時間インキュベートする。 ４．プレートをＰＢＳで２回，次に５０ｍＭＨｅｐｅｓで１回洗浄する。プレー
トをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。 ５．２５μｌの０．４ｍＭ試験化合物（４％ＤＭＳＯ中），または４％ＤＭＳＯ
単独（対照）をプレートに加える。 ６．精製ＧＳＴ−ＦＧＦＲ１を希釈緩衝液（５μキナーゼ／５０μｌＫＤＢ／ウ
エル）で希釈する。 ７．５０μｌの希釈キナーゼを各ウエルに加える。 ８．２５μｌ／ウエルの新たに調製したＡＴＰ／Ｍｎ＋＋（０．４ｍｌ１ＭＭｎ
Ｃｌ2，４０μｌ１０ｍＭＡＴＰ，９．５６ｍｌｄＨ2Ｏ，新たに調製）を加える
ことによりキナーゼ反応を開始する ９．これは迅速なキナーゼ反応であり，ＡＴＰの添加と同様の様式で２５μｌの
０．５ＭＥＤＴＡを加えることにより停止しなければならない。 １０．プレートを新たなＴＢＳＴで４回洗浄する。 １１．抗体希釈緩衝液を作成する：５０ｍｌにつき，５ｍｌの５％ＢＳＡ，２５
０μｌの５％ミルクおよび５０μｌの１００ｍＭバナジン酸ナトリウムを混合し
，０．０５％ＴＢＳＴで最終容量とする。 １２．１００μｌ／ウエルの抗ホスホチロシン（１：１００００希釈，ＡＤＢ中
）を加える。振盪しながら室温で１時間インキュベートする。 １３．工程１０と同様に洗浄する。 １４．１００μｌ／ウエルのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシ
ダーゼコンジュゲート（１：６０００希釈，ＡＤＢ中）を加える。振盪しながら
室温で１時間インキュベートする。 １５．工程１０と同様に洗浄し，次にＰＢＳで洗浄して泡および過剰のＴＷＥＥ
Ｎを除去する。 １６．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 １７．振盪しながら１０−２０分間インキュベートする。泡を除去する。 １８．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００Ｅｌｉｓａリーダーで，試験フィルタ４１
０ｎＭ，参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
【０２５０】実施例６：細胞性ＨＥＲ−２キナーゼアッセイ このアッセイを用いて，全細胞におけるＨＥＲ−２キナーゼ活性をＥＬＩＳＡ
フォーマットで測定する。
【０２５１】材料および試薬： １．ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯカタログ＃１１９６５−０９２） ２．ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯカタログ＃１６０００−０４４），水浴
中で５６℃で３０分間熱不活性化する。 ３．トリプシン（ＧＩＢＣＯカタログ＃２５２００−０５６） ４．Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯカタログ＃２５０３０−０８１） ５．ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯカタログ＃１５６３０−０８０） ６．成長培地：５００ｍｌＤＭＥＭ，５５ｍｌ熱不活性化ＦＢＳ，１０ｍｌＨＥ
ＰＥＳおよび５．５ｍｌＬ−グルタミンを混合する。 ７．血清飢餓培地：５００ｍｌＤＭＥＭ，２．５ｍｌ熱不活性化ＦＢＳ，１０ｍ
ｌＨＥＰＥＳおよび５．５ｍｌＬ−グルタミンを混合物する。 ８．ＰＢＳ ９．平底９６−ウエル組織培養マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタ
ログ＃２５８６０） １０．１５ｃｍ組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ＃０８７５７１４８） １１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６−ウエルＥＬＩＳＡプレート １２．ＮＵＮＣ９６−ウエルＶ底ポリプロピレンプレート １３．Ｃｏｓｔａｒトランスファーカートリッジ，Ｔｒａｎｓｔａｒ９６（Ｃｏ
ｓｔａｒカタログ＃７６１０）用 １４．ＳＵＭＯ１：モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体 １５．ＴＢＳＴ緩衝液 １６．ブロッキング緩衝液：５％カーネーションインスタントミルク，ＰＢＳ中 １７．ＥＧＦリガンド：ＥＧＦ−２０１，Ｓｈｉｎｋｏ Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｊ
ａｐａｎ。粉体を１００μｌの１０ｍＭＨＣｌに懸濁する。１００μｌの１０ｍ
ＭＮａＯＨを加える。８００μｌのＰＢＳを加え，エッペンドルフチューブに移
し，使用するまで−２０℃で保存する。 １８．ＨＮＴＧ溶解緩衝液：保存５ＸＨＮＴＧ用には，２３．８３ｇＨｅｐｅｓ
，４３．８３ｇＮａＣｌ，５００ｍｌグリセロールおよび１００ｍｌＴｒｉｔｏ
ｎＸ−１００および十分なｄＨ2Ｏを混合して１Ｌの溶液とする。１ＸＨＮＴＧ
＊用には，２ｍｌＨＮＴＧ，１００Ｌ０．１ＭＮａ3ＶＯ4，２５０μｌ０．２Ｍ
Ｎａ4Ｐ2Ｏ7および１００μｌＥＤＴＡを混合する。 １９．ＥＤＴＡ ２０．Ｎａ3ＶＯ４．保存溶液を作成するためには，１．８４ｇＮａ3ＶＯ4を９
０ｍｌｄＨ2Ｏと混合する。ｐＨを１０に調節する。電子レンジで１分間沸騰さ
せる（溶液は透明になる）。室温に冷却する。ｐＨを１０に調節する。ｐＨが１
０で安定するまで加熱／冷却のサイクルを繰り返す。 ２１．２００ｍＭＮａ4Ｐ2Ｏ7 ２２．ホスホチロシン特異的ウサギポリクローナル抗血清（抗Ｐｔｙｒ抗体） ２３．アフィニティー精製抗血清，ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体，ペルオキシダーゼ
コンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅカタログ＃ＡＬＩ０４０４） ２４．ＡＢＴＳ溶液 ２５．３０％過酸化水素溶液 ２６．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2 ２７．０．２ＭＨＣｌ
【０２５２】方法： １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１．０μｇ／ウエ
ルのＳＵＭ０１で被覆する。最終容量１００μｌ／ウエル。４℃で一夜保存する
。 ２．使用の日に，被覆緩衝液を除去し，プレートをｄＨ2Ｏで３回，ＴＢＳＴ緩
衝液で１回洗浄する。このアッセイにおいては，特に記載しない限り，すべての
洗浄はこのように行う。 ３．１００μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。プレートを振盪しな
がら室温で３０分間インキュベートする。使用直前にプレートを洗浄する。 ４．このアッセイにはＥＧＦｒ／ＨＥＲ−２キメラ／３Ｔ３−Ｃ７細胞株を用い
る。 ５．８０−９０％コンフルエントの皿を選択する。トリプシン処理により細胞を
回収し，１０００ｒｐｍで室温で５分間遠心分離する。 ６．細胞を血清飢餓培地に懸濁し，トリパンブルーで計数する。９０％より高い
生存度が必要である。細胞を血清飢餓培地に２，５００細胞／ウエルの密度で，
９０μｌ／ウエルで９６ウエルマイクロタイタープレートに播種する。播種した
細胞を３７℃，５％ＣＯ2で一夜インキュベートする。 ７．播種の２日後にアッセイを開始する。 ８．試験化合物希釈： 一次スクリーニング： 試料は血清飢餓ＤＭＥＭを含むポリプロピレンプレート中で直接希釈する。この
希釈は，スクリーニングする試料により，１：１０またはそれより高い。対照ウ
エルには同量のＤＭＳＯを加える。次にすべてのウエルを細胞プレートに１：１
０希釈で移す（１０μｌの試料および培地を９０μｌの血清飢餓培地に加える）
。最終ＤＭＳＯ濃度は１％またはそれ未満となる。 二次スクリーニング： １０種類の試料をポリプロピレンプレートの列Ａのウエル２−１１に加える。こ
れらのウエルはストレート飢餓ＤＭＥＭを含む。１：１０希釈のためには，１０
μｌの試験化合物溶液を９０μｌの培地中で用いる。残りのウエル（対照を含む
）にはＤＭＳＯ／培地混合物が含まれるであろう。この混合物中のＤＭＳＯのパ
ーセンテージは，初期希釈因子，この例では１：１０により決定する。したがっ
て，ＤＭＳＯ濃度は１０％である。列Ａからの同量の薬剤および培地をＤＭＳＯ
および培地を含む列Ｂに加える。次に同量を取り出し列Ｃに加え，以下同様にす
る。このようにして１：２希釈を作成する。次にすべてのウエルを１：１０希釈
で細胞プレートに移す（１０μｌの試料および培地を９０μｌの血清飢餓培地に
加える）。最終ＤＭＳＯ濃度は１％またはそれ未満となる。 ９．５％ＣＯ2，３７℃で２時間インキュベートする。 １０．保存ＥＧＦ（１６．５μＭ）を暖めたＤＭＥＭで１５０ｎＭに希釈するこ
とによりＥＧＦリガンドを調製する。 １１．１００μｌ／ウエルに十分な量のＨＮＴＧ＊を新たに調製する。氷上に置
く。 １２．試験化合物とともに２時間インキュベートした後，調製したＥＧＦリガン
ドを細胞に５０μｌ／ウエルで加える。最終濃度は５０ｎＭである。陽性対照ウ
エルには同量のＥＧＦを加える。陰性対照にはＥＧＦを加えない。３７℃で１０
分間インキュベートする。 １３．試験化合物，ＥＧＦ，およびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで１回洗
浄する。 １４．ＨＮＴＧ＊を細胞に１００μｌ／ウエルで移す。氷上に５分間置く。この
間にブロッキング緩衝液をＥＬＩＳＡプレートから除去し，洗浄する。 １５．マイクロピペッターにしっかり固定したピペットチップを用いて細胞をプ
レートから掻き取り，ＨＮＴＧ＊溶解緩衝液を繰り返し吸引分配することにより
細胞材料をホモジナイズする。溶解物を，被覆しブロッキングし洗浄したＥＬＩ
ＳＡプレートに移す。あるいは，Ｃｏｓｔａｒトランスファーカートリッジを用
いて溶解物をプレートに移す。 １６．振盪しながら室温で１時間インキュベートする。 １７．溶解物を除去し，洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗体（１：３００
０，ＴＢＳＴ中）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウエルで加える。 １８．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 １９．抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，洗浄する。新たに希釈したＢＩＯＳＯＵＲＣＥ
抗体をＥＬＩＳＡプレートに加える（１：８０００，ＴＢＳＴ中，１００μｌ／
ウエル）。 ２０．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 ２１．ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ抗体を除去し，洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ／
Ｈ2Ｏ2溶液をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ウエルで加える。 ２２．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。泡を除去する。 ２３．１００μｌ／ウエルの０．２ＭＨＣｌを加えて反応を停止する。 ２４．ＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーで，試験フィルタセッ
ト４１０ｎＭおよび参照フィルタ６３０ｎＭでアッセイを読む。
【０２５３】実施例７：ＣＤＫ２／サイクリンＡアッセイ 以下のプロトコルは，ＳＰＡにおけるｃｄｋ２／サイクリンＡの蛋白質セリン／
トレオニンキナーゼ活性を分析するために用いる方法を記載する。この方法はま
た，キナーゼ活性の阻害または活性化についての薬剤の初期スクリーニングのプ
ロトコルも記載する。
【０２５４】材料および試薬： １．Ｗａｌｌａｃ９６−ウエルポリエチレンテレフタレート（ｆｌｅｘｉ）プレ
ート（Ｗａｌｌａｃカタログ＃１４５０−４０１） ２．Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｒｅｄｉｖｕｅ［γ33Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍカ
タログ＃ＡＨ９９６８） ３．Ａｍｅｒｓｈａｍストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ
（Ａｍｅｒｓｈａｍカタログ＃ＲＰＮＱ０００７）。ビーズはＰＢＳ中でマグネ
シウムまたはカルシウムなしで２０ｍｇ／ｍｌで再構成しなければならない。 ４．Ｓｆ９細胞から精製した活性化ｃｄｋ２／サイクリンＡ酵素複合体。２００
μｌアリコート中，−８０℃ ５．ビオチニル化ペプチド基質（ｄｅｂ−ｔｉｄｅ）：ペプチドビオチン−Ｘ−
ＰＫＴＰＫＫＡＫＫＬをｉｎｄＨ２Ｏ中に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解する。１０
０μｌアリコート中で−８０℃で保存する。 ６．ペプチド／ＡＴＰ混合物：
【表８】 ７．２．５Ｘキナーゼ緩衝液
【表９】 ８．１０ｍＭＡＴＰ（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ａ−５３９４） ９．１ＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．４ １０．１ＭＭｇＣｌ２ １１．１ＭＤＴＴ １２．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水），マグネシウムまたはカルシウ
ムなし（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１４１９０−１４４） １３．ＥＤＴＡ（１４．１２ｇ／１００ｍＬ） １４．停止溶液：
【表１０】
【０２５５】方法： １．試験化合物の溶液を５％ＤＭＳＯ中に所望の最終濃度の５倍で調製する。各
ウエルに１０μｌを加える。陰性対照用には，１０μｌの５％ＤＭＳＯ飲みをウ
エルに加える。 ２．５μｌのｃｄｋ２／サイクリンＡ溶液を２．１ｍｌ２ｘキナーゼ緩衝液で希
釈する。 ３．２０μｌの酵素を各ウエルに加える。 ４．１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを陰性対照ウエルに加える。 ５．キナーゼ反応を開始させるため，２０μｌのペプチド／ＡＴＰ混合物をハン
ドピペットまたはＴｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐを用いて加える。実験
ベンチの上で反応性シールドの後に１時間放置する。 ６．２００μｌの停止溶液をＴｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐまたはハン
ドピペットを用いて各ウエルに加える。 ７．少なくとも１０分間保持する。 ８．プレートを約２３００ｒｐｍで３−５分間回転させる。 ９．Ｔｒｉｌｕｘリーダーでプロトコル＃２８（ＢｒｉａｎＳＰＡアッセイ）を
用いてプレートを計数する。
【０２５６】実施例８：ＰＤＧＦ−ＲＥＬＩＳＡ すべての細胞培養培地，グルタミンおよびウシ胎児血清は，特に記載しないか
ぎり，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌ
ａｎｄ，ＮＹ）から購入した。すべての細胞は，９０−９５％空気および５−１
０％ＣＯ2の湿潤雰囲気下で３７℃で成長させた。すべての細胞株は，日常的に
１週間に２回サブカルチャーし，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉｂｃｏ）によりマイ
コプラズマがないことを確認した。
【０２５７】 ＥＬＩＳＡアッセイのためには，細胞（Ｕ１２４２，Ｊｏｓｅｐｈ Ｓｃｈｌ
ｅｓｓｉｎｇｅｒ，ＮＹＵから入手）を成長培地（ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，ＮＥ
ＡＡ，１ｍＭ ＮａＰｙｒおよび２ｍＭＧＬＮ含有）で８０−９０％コンフルエ
ントまで成長させ，９６ウエル組織培養プレートに０．５％血清中で，ウエルあ
たり２５，０００−３０，０００細胞を播種した。０．５％血清含有培地で一夜
インキュベーションした後，細胞を無血清培地に移し，５％ＣＯ2，３７℃イン
キュベーター中で試験化合物で２時間処理した。次に細胞をリガンドで５−１０
分間刺激し，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１０％グリ
セロール，５ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭＮａ3ＶＯ4，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０，および２ｍＭＮａＰｙｒ）で溶解した。細胞溶解物（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／
ウエル）をレセプター特異的抗体であらかじめ被覆し，ＴＢＳＴ（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００）中５％ミルクで室温で３０分間ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに
移した。溶解物を振盪しながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＴ
ＢＳＴで４回洗浄し，次にポリクローナル抗ホスホチロシン抗体とともに室温で
３０分間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで４回すすぐことにより過剰
の抗ホスホチロシン抗体を除去した。ＥＬＩＳＡプレートにヤギ抗ウサギＩｇＧ
抗体を室温で３０分間加え，次にＴＢＳＴでさらに４回すすいだ。ＡＢＴＳ（１
００ｍＭクエン酸，２５０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4および０．５ｍｇ／ｍＬ２，２'−
アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）），およびＨ2Ｏ2（１
．２ｍＬ３０％Ｈ2Ｏ2を１０ｍｌＡＢＴＳに加える）をＥＬＩＳＡプレートに加
えて発色を開始させた。ＡＢＴＳ添加の約１５から３０分後，４１０ｎｍおよび
６３０ｎｍの参照波長における吸光度を記録した。
【０２５８】実施例９：ＩＧＦ−ＩレセプターＥＬＩＳＡ 以下のプロトコルを用いて，ＩＧＦ−Ｉレセプター上のホスホチロシンレベル
を測定することができ，これはＩＧＦ−Ｉレセプターチロシンキナーゼ活性を示
す。
【０２５９】材料および試薬 以下の材料および試薬を用いた： ａ． このアッセイにおいて用いる細胞株は，ＩＧＦ−１レセプターを過剰発現
するように遺伝子工学処理された細胞株３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒである。 ｂ． ＮＩＨ３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒを，５％ＣＯ2，３７℃のインキュベーター
で成長させる。成長培地はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活性化）＋２ｍＭＬ−
グルタミンである。 ｃ． アフィニティー精製抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体１７−６９ ｄ． Ｄ−ＰＢＳ： ＫＨ2ＰＯ4 ０．２０ｇ／ｌ Ｋ2ＨＰＯ4 ２．１６ｇ／ｌ ＫＣｌ ０．２０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ８．００ｇ／ｌ（ｐＨ７．２） ｅ． ブロッキング緩衝液：ＴＢＳＴプラス５％ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎイ
ンスタント脱脂乾燥ミルク） ｆ． ＴＢＳＴ緩衝液： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ １０Ｎ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１％ ＴＢＳ（１０Ｘ）の保存溶液を調製し，希釈の間に緩衝液にＴｒｉｔｏｎＸ−１
００を加える。 ｇ． ＨＮＴＧ緩衝液： ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ １Ｎ） グリセロール １０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．２％ 保存溶液（５Ｘ）を調製し，４℃で保存する。 ｈ． ＥＤＴＡ／ＨＣｌ：０．５ＭｐＨ７．０（ＮａＯＨ），１００Ｘ保存液と
して ｉ． Ｎａ3ＶＯ4：１００Ｘ保存液として０．５Ｍ，アリコートは−８０℃で保
存する。 ｊ． Ｎａ4Ｐ2Ｏ7：１００Ｘ保存液として０．２Ｍ ｋ． インスリン様成長因子−１，Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｃａｔ＃Ｇ５１１１） ｌ．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清 ｍ． ヤギ抗ウサギＩｇＧ，ＰＯＤコンジュゲート（検出抗体），Ｔａｇｏ（Ｃ
ａｔ．Ｎｏ．４５２０，ＬｏｔＮｏ．１８０２）：Ｔａｇｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｎ． ＡＢＴＳ（２，２'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン硫酸））
溶液： クエン酸 １００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 ２５０ｍＭ（ｐＨ４．０／１ＮＨＣｌ） ＡＢＴＳ ０．５ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴＳ溶液は暗所で４℃で保存しなければならない。溶液は緑色に変色したと
きは廃棄しなければならない。 ｏ． 過酸化水素：３０％溶液を暗所で４℃で保存する。
【０２６０】方法 以下のすべての工程は，特に記載しないかぎり，室温で実施する。すべてのＥ
ＬＩＳＡプレート洗浄は，プレートを水道水で３回すすぎ，ＴＢＳＴで１回すす
ぐことにより実施する。プレートを軽くたたいてペーパータオルで乾燥させる。
【０２６１】Ａ．細胞播種 ： １． 組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５０２０−１００）で８０−９０％コンフ
ルエントまで成長させた細胞を，トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％，０．５ｍ
ｌ／Ｄ−１００，ＧＩＢＣＯ）で回収する。 ２． 細胞を新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭＬ−グルタミン中に再懸濁
し，９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５８０６−９６）に２０
，０００細胞／ウエル（１００μｌ／ウエル）で移す。１日インキュベートし，
次に培地を無血清培地（９０／μｌ）で置き換え，５％ＣＯ2，３７℃で一夜イ
ンキュベートする。
【０２６２】Ｂ．ＥＬＩＳＡプレートコーティングおよびブロッキング ： １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８０５−９６）を，１００μｌ
ＰＢＳ中の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で０．５μｇ／ウエルで少なくとも２時間コーテ
ィングする。 ２． コーティング溶液を除去し，１００μｌのブロッキング緩衝液で置き換え
，３０分間振盪する。ブロッキング緩衝液を除去し，溶解物を加える直前にプレ
ートを洗浄する。
【０２６３】Ｃ．アッセイ方法 ： １． 薬剤は，無血清条件で試験する。 ２． 薬剤保存液（１００％ＤＭＳＯ中）を９６ウエルポリプロピレンプレート
中でＤＭＥＭで１：１０に希釈し，１０μｌ／ウエルのこの溶液を細胞に移して
，最終薬剤希釈１：１００，最終ＤＭＳＯ濃度１．０％とする。細胞を５％ＣＯ 2 中で３７℃で２時間インキュベートする。 ３． 新鮮な細胞溶解緩衝液（ＨＮＴＧ＊）を調製する。 ＨＮＴＧ ２ｍｌ ＥＤＴＡ ０．１ｍｌ Ｎａ3ＶＯ4 ０．１ｍｌ Ｎａ4（Ｐ2Ｏ7） ０．１ｍｌ Ｈ2Ｏ ７．３ｍｌ ４． 薬剤を２時間インキュベートした後，１０μｌ／ウエルのＰＢＳ中２００
ｎＭＩＧＦ−１リガンドを細胞に移し（最終濃度２０ｎＭ），５％ＣＯ2で３７
℃で１０分間インキュベートする。 ５． 培地を除去し，１００μｌ／ウエルのＨＮＴＧ＊を加え，１０分間振盪す
る。細胞を顕微鏡下で観察して，これらが適切に溶解したか否かを見る。 ６． １２チャネルピペットを用いて細胞をプレートから掻き取り，吸引と分配
を繰り返すことにより溶解物をホモジナイズする。すべての溶解物を抗体コーテ
ィングＥＬＩＳＡプレートに移し，１時間振盪する。 ７． 溶解物を除去し，プレートを洗浄し，抗ｐＴｙｒ（ＴＢＳＴ中１：３，０
００）を１００μｌ／ウエルで移し，３０分間振盪する。 ８． 抗ｐＴｙｒを除去し，プレートを洗浄し，ＴＡＧＯ（ＴＢＳＴ中１：３，
０００）を１００μｌ／ウエルで移し，３０分間振盪する。 ９． 検出抗体を除去し，プレートを洗浄し，新鮮なＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2（１．２
μｌＨ2Ｏ2を１０ｍｌＡＢＴＳに加える）を１００μｌ／ウエルでプレートに移
して，発色を開始させる。 １０． ＤｙｎａｔｅｃＭＲ５０００で参照波長６３０ｎｍで４１０ｎｍのＯＤ
を測定する。
【０２６４】実施例１０：ＥＧＦレセプターＥＬＩＳＡ ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された細胞中のＥＧＦレセプター
キナーゼ活性を以下に記載するように測定した。
【０２６５】材料および試薬 以下の材料および試薬を用いた： ａ． ＥＧＦリガンド：保存液濃度＝１６．５μＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢ
Ｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ ｂ． ０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体） ｃ． 抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル） ｄ． 検出抗体：ヤギ抗ウサギｌｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲー
ト，ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｅ． ＴＢＳＴ緩衝液： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１ ｆ． ＨＮＴＧ ５Ｘ保存液： ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．７５Ｍ グリセロール ５０ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １．０％ ｇ． ＡＢＴＳ保存液： クエン酸 １００ｍＭ ＮａＶＯ4 ２５０ｍＭ ＨＣｌ（濃） ４．０ｐＨ ＡＢＴＳ* ０．５ｍｇ／ｍｌ 溶液は使用するまで暗所で４℃で保存する。 ｈ． 試薬保存液： ＥＤＴＡ １００ｍＭ ｐＨ７．０ Ｎａ3ＶＯ4 ０．５Ｍ Ｎａ4（Ｐ2０7） ０．２Ｍ
【０２６６】方法 以下のプロトコルを用いた：Ａ．ＥＬＩＳＡプレートのプレコート １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエル，Ｃａｔ．＃２５８０
５−９６）をウエルあたりＰＢＳ中０．５μｇ，１５０μｌ最終容量／ウエルの
０５−１０１抗体でコーティングし，４℃で一夜保存する。コーティングしたプ
レートは４℃で保存した場合１０日間まで良好に使用しうる。 ２． 使用の日，コーティング緩衝液を除去し，ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中
５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント脱脂乾燥ミルク）で置き換える。プレート
を振盪しながら室温（約２３℃−２５℃）で３０分間インキュベートする。使用
の直前に，ブロッキング緩衝液を除去し，プレートをＴＢＳＴ緩衝液で４回洗浄
する。
【０２６７】Ｂ．細胞播種 １． このアッセイにはＮＩＨ３Ｔ３／Ｃ７細胞株（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ５１：１９９−２０９，１９８７）を用いることができる。 ２． ８０−９０％コンフルエントの皿を実験用に選択する。細胞をトリプシン
処理し，１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地を加えることにより反応を停止させる。細胞
をＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地）中に懸濁し，１０００ｒｐｍで室
温で５分間，１回遠心分離する。 ３． 細胞を播種培地（ＤＭＥＭ，０．５％ウシ血清）に再懸濁し，トリパンブ
ルーを用いて細胞を計数する。９０％を越える生存率が許容範囲である。細胞を
９６ウエルマイクロタイタープレート上で，ＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）
中に，ウエルあたり１０，０００細胞の密度でウエルあたり１００μｌで播種す
る。播種した細胞を５％ＣＯ2，３７℃で約４０時間インキュベートする。
【０２６８】Ｃ．アッセイ方法 １． 倒立顕微鏡を用いて，播種した細胞のコンタミネーションを調べる。試験
化合物保存液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈
し，次に５μｌを試験ウエルに移して，１：２００の最終薬剤希釈および１％の
最終ＤＭＳＯ濃度とする。対照ウエルにはＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ2，
３７℃で１時間インキュベートする。 ２． ＥＧＦリガンドの調製：保存液ＥＧＦを，１０μｌの希釈ＥＧＦ（１：１
２希釈）を移したときに２５ｎＭの最終濃度が得られるように，ＤＭＥＭ中で希
釈する。 ３． ウエルあたり１００μｌに十分なように新鮮なＨＮＴＧ*１０ｍｌを調製
する。ＨＮＴＧ＊は以下のものを含む：ＨＮＴＧ保存液（２．０ｍｌ），ｍｉｌ
ｌｉ−ＱＨ2Ｏ（７．３ｍｌ），ＥＤＴＡ，１００ｍＭ，ｐＨ７．０（０．５ｍ
ｌ），Ｎａ3ＶＯ4０．５Ｍ（０．１ｍｌ）およびＮａ4（Ｐ2Ｏ7），０．２Ｍ（
０．１ｍｌ） ４． 氷上に置く。 ５． 薬剤とともに２時間インキュベーションした後，調製したＥＧＦリガンド
を，ウエルあたり１０μｌで，２５ｎＭの最終濃度となるように細胞に加える。
対照ウエルにはＤＭＥＭのみを加える。振盪しながら室温で５分間インキュベー
トする。 ６． 試験化合物，ＥＧＦおよびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄
する。ＨＮＴＧ*をウエルあたり１００μｌで細胞に移す。氷上に５分間置く。
その間に，他のＥＬＩＳＡプレートからブロッキング緩衝液を除去し，上述した
ようにＴＢＳＴで洗浄する。 ７. マイクロピペッターにぴったりと固定したピペットチップを用いて，細胞
をプレートからはがし，ＨＮＴＧ*溶解緩衝液を繰り返し吸引および分配するこ
とにより，細胞物質をホモジナイズする。コーティングし，ブロッキングし，洗
浄したＥＬＩＳＡプレートに溶解物を移す。振盪しながら室温で１時間インキュ
ベートする。 ８． 溶解物を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗
体をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。抗Ｐｔｙｒ抗血清（
ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で，振盪しながら室温で３０分間インキ
ュベートする。 ９． 抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡ
ＧＯ３０抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートにウエルあたり１００μｌで
移す。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：
ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）。 １０． 検出抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ
／Ｈ2Ｏ2溶液をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。室温で２
０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液：１０ｍｌＡＢＴＳ保存液中
１．２μｌの３０％Ｈ2Ｏ2）。 １１． ５０μｌの５ＮＨ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止し（任意），４
１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。 １２． 最大ホスホチロシンシグナルは，陰性対照の値を陽性対照の値から差し
引くことにより決定する。次に，陰性対照を差し引いた後，抽出物含有ウエルに
ついてのホスホチロシン含有量のパーセント阻害を計算する。
【０２６９】実施例１１：Ｍｅｔ自己リン酸化アッセイ−ＥＬＩＳＡ このアッセイは，Ｍｅｔレセプター上のＭｅｔ蛋白質チロシンキナーゼレベル
を分析することにより，Ｍｅｔチロシンキナーゼ活性を決定する
【０２７０】材料および試薬 以下の材料および試薬を用いた： ａ． ＨＮＴＧ（５Ｘ保存溶液）：２３．８３ｇＨＥＰＥＳおよび４３．８３ｇ
ＮａＣｌを約３５０ｍｌｄＨ2Ｏに溶解する。ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを７
．２に調節し，５００ｍｌグリセロールおよび１０ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００
を加え，混合し，ｄＨ2Ｏを加えて総容量を１Ｌとする。１Ｘ作業溶液１Ｌを作
成するためには，２００ｍｌの５Ｘ保存溶液を８００ｍｌｄＨ2Ｏに加え，必要
に応じてｐＨを調べて調節し，４℃で保存する。 ｂ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水），Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．＃４５
０−１３００ＥＢ（１Ｘ溶液） ｃ． ブロッキング緩衝液：５００ｍｌｄＨ2Ｏ中に，１００ｇＢＳＡ，１２．
１ｇＴｒｉｓ−ｐＨ７．５，５８．４４ｇＮａＣｌおよび１０ｍｌＴｗｅｅｎ−
２０を加え，希釈して総容量１Ｌとする。 ｄ． キナーゼ緩衝液：５００ｍｌｄＨ2Ｏに，１２．１ｇＴＲＩＳ（ｐＨ７．
２），５８．４ｇＮａＣｌ，４０．７ｇＭｇＣｌ2および１．９ｇＥＧＴＡを加
え，ｄＨ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｅ． ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃
Ｐ−７６２６，４３５．５ｍｇに１００％エタノールを総容量２５ｍｌとなるよ
うに加え，ボルテックスする。 ｆ． ＡＴＰ（細菌起源），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，粉末を−２
０℃で保存する；作業溶液を作成するためには，３．３１ｍｇを１ｍｌｄＨ2Ｏ
中に溶解する。 ｇ． ＲＣ−２０Ｈ ＨＲＰＯコンジュゲート化抗ホスホチロシン，Ｔｒａｎｓ
ｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ．＃Ｅ１２０Ｈ ｈ． Ｐｉｅｒｃｅ １−Ｓｔｅｐ（商標）Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（
３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン），Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．＃３４
０２２ ｉ． Ｈ2ＳＯ4，濃硫酸１ｍｌ（１８Ｎ）を３５ｍｌｄＨ2Ｏに加える。 ｊ． ＴＲＩＳ ＨＣＬ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５；材料１
２１．１４ｇに６００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏを加え，ＨＣｌでｐＨを７．
５（または７．２）に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで容量を１Ｌとする。 ｋ． ＮａＣｌ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，５Ｍ溶液を作成
する。 ｌ． Ｔｗｅｅｎ−２０，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ３３７−５００ ｍ． Ｎａ3ＶＯ4，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０，材料１．８ｇ
に８０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏを加え，ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを１０
．０に調節し，電子レンジで沸騰させ，冷却し，ｐＨを調べ，ｐＨが１０．０で
安定となるまでこの工程を繰り返し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏを加えて総容量１０
０ｍｌとし，１ｍｌアリコートを作成し，−８０℃で保存する。 ｎ． ＭｇＣｌ2，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，１Ｍ溶液を作
成する。 ｏ． ＨＥＰＥＳ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００，２００ｍ
ｌＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，材料５９．６ｇを加え，ｐＨを７．５に調節し，総
容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する。 ｐ． アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−４５０３，材
料３０ｇに滅菌蒸留水を加えて総容量３００ｍｌとし，４℃で保存する。 ｑ． ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌの目盛り付きシリンダー中の約９００ｍｌのｄＨ2
Ｏに６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加え，溶解したとき，
ＨＣｌでｐＨを７．２に調節し，１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え，ｄ
Ｈ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｒ． ヤギアフィニティー精製抗体ウサギＩｇＧ（全分子），Ｃａｐｐｅｌ Ｃ
ａｔ．＃５５６４１ ｓ． 抗ｈ−Ｍｅｔ（Ｃ−２８）ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体，Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔ．＃ＳＣ−１６１ ｔ． 過渡的にトランスフェクションされたＥＧＦＲ／Ｍｅｔキメラ細胞（ＥＭ
Ｒ）（Ｋｏｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２３８１−２３９
０（１９９３） ｕ． 炭酸ナトリウム緩衝液，（Ｎａ2ＣＯ4，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４
９５）：材料１０．６ｇに８００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏを加え，溶解した
とき，ＮａＯＨでｐＨを９．６に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１Ｌと
し，濾過し，４℃で保存する。
【０２７１】方法 以下の工程は，特に記載のない限り，全て室温で実施する。ＥＬＩＳＡプレー
ト洗浄は全てＴＢＳＴで４回すすぐことにより行う。Ａ．ＥＭＲ溶解 この方法は，レセプター捕捉の開始の前夜または直前に実施することができる
。 １． 溶解物を３７℃の水浴中で渦巻き動作により最後の結晶が消失するまで急
速に溶解する。 ２． 細胞ペレットを１ｍＭＰＭＳＦを含有する１Ｘ ＨＮＴＧ中で溶解する。
１５ｃｍ皿の細胞あたり３ｍｌのＨＮＴＧを用いる。計算したＨＮＴＧ容量の１
／２を加え，管を１分間ボルテックスし，残量のＨＮＴＧを加え，さらに１分間
ボルテックスする。 ３． 管の釣り合いをとり，１０，０００ｘｇ，１０分間，４℃で遠心分離する
。 ４． 上清をプールし，アリコートを除去して蛋白質測定を行う。 ５． プールしたサンプルをドライアイス／エタノール浴中で急速凍結する。こ
の工程は，溶解物を一夜保存するか蛋白質測定後に直ちに使用するかにかかわら
ず実施する。 ６． 標準的ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法を用いて蛋白質測定を実施する（ＢＣ
Ａアッセイ試薬キット，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔ．＃２３２２
５）。
【０２７２】Ｂ．ＥＬＩＳＡ法 １． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，総ウエル容量５０μｌ
，ウエルあたり５μｇの炭酸塩緩衝液中のヤギ抗ウサギ抗体でコーティングする
。４℃で一夜保存する。 ２． プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合ヤギ抗ウサギ抗
体を除去する。 ３． １５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら３０
分間インキュベートする。 ４． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過
剰の液体および気泡を除去する。 ５． ウエル総容量１００μｌに対して，ＴＢＳＴ中で希釈したウサギ抗Ｍｅｔ
抗体をウエルあたり１μｇ加える。 ６． 溶解物をＨＮＴＧで希釈する（９０μｇ溶解物／１００μｌ）。 ７． 希釈した溶解物１００μｌを各ウエルに加える。６０分間振盪する。 ８． ＴＢＳＴで４回洗浄する。ペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体お
よび気泡を除去する。 ９． ウエルあたり５０μｌの１Ｘ溶解物緩衝液を加える。 １０． 化合物／抽出物をポリプロピレン９６ウエルプレート中で１Ｘキナーゼ
緩衝液中で１：１０に希釈する。 １１． 希釈した化合物５．５μｌをＥＬＩＳＡプレートウエルに移す。振盪し
ながら室温で２０分間インキュベートする。 １２． ウエルあたり５．５μｌの６０μＭＡＴＰ溶液を加える。陰性対照には
ＡＴＰを加えない。振盪しながら９０分間インキュベートする。 １３． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて
過剰の液体および気泡を除去する。 １４． ウエルあたり１００μｌのＲＣ２０（ブロッキング緩衝液中１：３００
０希釈）を加える。振盪しながら３０分間インキュベートする。 １５． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて
過剰の液体および気泡を除去する。 １６． ウエルあたり１００μｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢを加える。振盪しながら
３０−６０分間インキュベートする。 １７． ウエルあたり１００μｌの１ＭＨ2ＳＯ4を加えて反応を停止させる。 １８． Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読
む。試験フィルター＝４５０ｎｍ，参照フィルター＝４１０ｎｍ。
【０２７３】実施例１２：生化学的ｓｒｃアッセイ−ＥＬＩＳＡ このアッセイを用いて，ビオチニル化ペプチドのリン酸化を読出しとして測定
することにより，ｓｒｃ蛋白質キナーゼ活性を決定する。
【０２７４】材料および試薬： 以下の材料および試薬を用いた： ａ． ｓｒｃでトランスフォームした酵母 ｂ． 細胞溶解物：ｓｒｃを発現する酵母細胞をペレット化し，水で１回洗浄し
，再びペレット化して，使用するまで−８０℃で保存する。 ｃ． Ｎ−末端ビオチニル化ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹは，当業
者に周知の標準的な方法により調製する。 ｄ． ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ｅ． ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥａｓｙ Ｗ
ａｓｈ，改変平底プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．＃２５８０５−９６ ｆ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ−底ポリプロピレンプレート，化合物の希釈用：Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．＃Ａ−７２０９２ ｇ． Ｖｅｃａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬：Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌ
ｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｈ． 抗ｓｒｃ（３２７）ｍａｂ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
Ｐｏｍｂｅを用いて組換えＳｒｃを発現させる（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，
ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒｔｉ−
Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：６００−
６０５）。Ｓ．Ｐｏｍｂｅ ＳＰ２００株（ｈ−ｓ ｌｅｕｌ．３２ ｕｒａ４
ａｄｅ２１０）を記載されたように増殖させ，酢酸リチウム法（Ｓｕｐｅｒｔ
ｉ−Ｆｕｒｇａ，（上掲））によりｐＲＳＰ発現プラスミドでトランスフォーム
する。細胞は１μＭチアミンの存在下で増殖させてｎｍｔｌプロモーターの発現
を抑制するか，またはチアミンの非存在下で増殖させて発現を誘導する。 ｉ． モノクローナル抗ホスホチロシン，ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ４
０を用いることができる） ｊ． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡペルオキシダーゼ基質：Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ
【０２７５】緩衝溶液： ａ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）：ＧＩＢＣＯ ＰＢＳ，ＧＩＢ
ＣＯ Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ ｂ． ブロッキング緩衝液：５％無脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ），ＰＢＳ中 ｃ 炭酸塩緩衝液：Ｎａ2ＣＯ4，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃａｔ．＃Ｓ４９５，１００
ｍＭ保存溶液を作成する。 ｄ． キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｇＣｌ2；０．２ｍ
ｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｎＣｌ2；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＤＴＴ；
５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＨＥＰＥＳ；０．１ｍｌＴＸ−１００；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１０ｍｌとする。 ｅ． 溶解緩衝液：５．０ＨＥＰＥＳ（１Ｍ保存溶液から）；２．７４ｍｌＮａ
Ｃｌ（５Ｍ保存溶液から）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌＴＸ−１００；
０．４ｍｌＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液から）；１．０ｍｌＰＭＳＦ（１００
ｍＭ保存溶液から）；０．１ｍｌＮａ3ＶＯ4（０．１Ｍ保存溶液から）；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１００ｍｌとする。 ｆ． ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，１０ｍＭ保存溶液（５．
５１ｍｇ／ｍｌ）を作成する。 ｇ． ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５，６００
ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに１２１．１４ｇの物質を加え，ＨＣｌでｐＨを７
．５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｈ． ＮａＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで５Ｍ保存溶液を作成する。 ｉ． Ｎａ3ＶＯ4：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０；８０ｍｌのＭ
ｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，１．８ｇの物質を加える；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨ
を１０．０に調節する；電子レンジ中で沸騰させる；冷却する；ｐＨを調べ，加
熱／冷却サイクルの後にｐＨが安定に維持されるまでｐＨ調節を繰り返す；Ｍｉ
ｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１００ｍｌとする；１ｍｌのアリコートを作成し，−
８０℃で保存する。 ｊ． ＭｇＣｌ2：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。 ｋ． ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００；２００ｍ
ｌＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，５９．６ｇの物質を加え，ｐＨを７．５に調節し，
ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する（１Ｍ保存溶液）
。 ｌ． ＴＢＳＴ緩衝液：ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ2Ｏに，６．０５７
ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加える；ＨＣｌでｐＨを７．２に調節
し，１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎ−Ｘ10０を加える；ｄＨ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｍ． ＭｎＣｌ2：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ８７−１００，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで１Ｍ保存溶液とする。 ｎ． ＤＴＴ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１７２−５ ｏ． ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝化食塩水）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに
，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７７７ｇＮａＣｌを加える；ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで総容量を１Ｌとする。 ｐ． キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウエル）１枚あたりの量
：１．０ｍｌキナーゼ緩衝液，２００μｇＧＳＴ−ζ，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで
最終容量８．０ｍｌとする。 ｑ． ビオチン標識ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ：水中のペプチド
保存溶液（１ｍＭ，２．９８ｍｇ／ｍｌ）を使用の直前に新たに作成する。 ｒ． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬：１４ｍｌの作業用試薬
を調製するためには，１滴の試薬Ａを１５ｍｌＴＢＳＴに加え，管を数回逆さに
して混合する。次に１滴の試薬Ｂを加える。管を室温で環状振盪器に入れ，３０
分間混合する。
【０２７６】方法 ａ．ｓｒｃでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）
中の０．５μｇ／ウエルの抗ｓｒｃｍａｂで，４℃で一夜コーティングする。 ２． ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。 ３． プレートをＰＢＳ中５％ミルク０．１５ｍｌで，室温で３０分間ブロッキ
ングする。 ４． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ５． 溶解緩衝液中で希釈した，ｓｒｃでトランスフォームした酵母の溶解物を
１０μｇ／ウエルで加える（ウエルあたり総容量０．１ｍｌ）。（溶解物の量は
，バッチにより異なるであろう）。プレートを室温で２０分間振盪する。ｂ．ホスホチロシン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ４Ｇ１０プレート：１００μｌＰＢＳ中の０．５μｇ／ウエルの４Ｇ１０
で４℃で一夜コーティングし，１５０μｌのＰＢＳ中５％ミルクで室温で３０分
間ブロッキングする。ｃ．キナーゼアッセイ法 １． 工程１−７からの未結合蛋白質を除去し，プレートをＰＢＳで５回洗浄す
る。 ２． ウエルあたり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（ウエルあたり１０μｌ
の１０Ｘキナーゼ緩衝液および１０μＭ（最終濃度）のビオチン−ＥＥＥＹＥＥ
ＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ，水中に希釈）を加える。 ３． １０％ＤＭＳＯを含有する水中に希釈した１０μｌの化合物を加え，室温
で１５分間プレインキュベートする。 ４． １０μｌ／ウエルの水中０．０５ｍＭＡＴＰ（最終５μＭＡＴＰ）を加え
ることにより，キナーゼ反応を開始させる。 ５． ＥＬＩＳＡプレートを室温で１５分間振盪する。 ６． ウエルあたり１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることによりキナーゼ反
応を停止させる。 ７． ９０μｌの上清を，ブロッキングした４Ｇ１０コーティングＥＬＩＳＡプ
レートに移す。 ８． 振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 ９． プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １０． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬（１００μｌ／ウエル
）とともに室温で３０分間インキュベートする。 １１． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １２． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢで発色させる。
【０２７７】実施例１３：生化学的ｌｃｋアッセイ−ＥＬＩＳＡ このアッセイを用いて，ＧＳＴ−ζのリン酸化を読出しとして測定することに
より，ｌｃｋ蛋白質キナーゼ活性を決定する。
【０２７８】材料および試薬： 以下の材料および試薬を用いた： ａ． ｌｃｋでトランスフォームした酵母：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ Ｐｏｍｂｅを用いて組換えＬｃｋを発現させる（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕ
ｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒ
ｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：６
００−６０５）。Ｓ．Ｐｏｍｂｅ ＳＰ２００株（ｈ−ｓ ｌｅｕｌ．３２ ｕ
ｒａ４ ａｄｅ２１０）を記載されたように増殖させ，ｐＲＳＰ発現プラスミド
で酢酸リチウム法によりトランスフォームする（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，
（上掲））。細胞を１μＭチアミンの存在下で増殖させ，発現を誘導する。 ｂ． 細胞溶解物：ｌｃｋを発現する酵母細胞をペレット化し，水で１回洗浄し
，再ペレット化し，使用するまで−８０℃で凍結保存する。 ｃ． ＧＳＴ−ζ：細菌中で発現させるためのＧＳＴ−ζ融合蛋白質をコードす
るＤＮＡは，Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ，ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆ
ｒａｎｃｉｓｃｏのＡｒｔｈｕｒ Ｗｅｉｓｓから入手する。トランスフォーム
した細菌を振盪しながら２５℃で一夜増殖させる。ＧＳＴ−ζは，グルタチオン
アフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃ
Ａ）により精製する。 ｄ． ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ｅ． ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥａｓｙ Ｗ
ａｓｈ，改変平底プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．＃２５８０５−９６ ｆ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ−底ポリプロピレンプレート，化合物希釈用：Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．＃ＡＳ−７２０９２ ｇ． 精製ウサギ抗ＧＳＴ抗血清：Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕ
ｓｔｒａｌｉａ）Ｃａｔ．＃９０００１６０５ ｈ． ヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃａｔ．＃Ｖ０１０
３０１ ｉ． ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ Ｃａｔ．＃
５２１５−００５−００３ ｊ． 抗Ｌｃｋ（３Ａ５）モノクローナル抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣａｔ＃ｓｃ−４３３ ｋ． 抗ホスホチロシンモノクローナル抗体ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ
４０を用いてもよい）
【０２７９】緩衝溶液： ａ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）１Ｘ溶液：ＧＩＢＣＯＰＢＳ，
ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ ｂ． ブロッキング緩衝液：１００ｇＢＳＡ，１２．１ｇＴＲＩＳ−ｐＨ７．５
，５８．４４ｇＮａＣｌ，１０ｍｌＴｗｅｅｎ−２０，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで
総容量１Ｌとする。 ｃ． 炭酸緩衝液：Ｎａ2ＣＯ4，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃａｔ．＃Ｓ４９５；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで１００ｍＭ溶液とする。 ｄ． キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＭｇＣｌ2；０．２ｍ
ｌ（１Ｍ保存溶液より）ＭｎＣｌ2；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＤＴＴ；
５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＨＥＰＥＳ；０．１ｍｌＴＸ−１００；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１０ｍｌとする。 ｅ． 溶解緩衝液：５．０ＨＥＰＥＳ（１Ｍ保存溶液より）；２．７４ｍｌＮａ
Ｃｌ（５Ｍ保存溶液より）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌＴＸ−１００；
０．４ｍｌＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液より）；１．０ｍｌＰＭＳＦ（１００
ｍＭ保存溶液より）；０．１ｍｌＮａ3ＶＯ4（０．１Ｍ保存溶液より）；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１００ｍｌとする。 ｆ． ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，１０ｍＭ保存溶液（５．
５１ｍｇ／ｍｌ）を作成する。 ｇ． ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５，６００
ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，１２１．１４ｇの物質を加え，ＨＣｌでｐＨを
７．５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｈ． ＮａＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで５Ｍ保存溶液を作成する。 ｉ． Ｎａ3ＶＯ4：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０；８０ｍｌのＭ
ｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，１．８ｇの物質を加える；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨ
を１０．０に調節する；電子レンジ中で沸騰させる；冷却する；ｐＨを調べ，加
熱／冷却サイクルの後にｐＨが安定となるまでｐＨ調節を繰り返す；Ｍｉｌｌｉ
Ｑ Ｈ2Ｏで総容量１００ｍｌとする；１ｍｌのアリコートを作成し，−８０℃
で保存する。 ｊ． ＭｇＣｌ2：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。 ｋ． ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００；２００ｍ
ｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，５９．６ｇの物質を加え，ｐＨを７．５に調節し
，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する（１Ｍ保存溶液
）。 ｌ． アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ４５０３；１５
０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，３０ｇの物質を加え，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで
総容量３００ｍｌとし，０．２２μｍフィルターを通して濾過し，４℃で保存す
る。 ｍ． ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ2Ｏに，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび
８．７６６ｇＮａＣｌを加える；ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する；１．０ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ10０を加える；ｄＨ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｎ． ＭｎＣｌ2：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ８７−１００，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。 ｏ． ＤＴＴ；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１７２−５ ｐ． ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝化食塩水）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに
，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７７７ｇＮａＣｌを加える；ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｑ キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウエル）１枚あたりの量：
１．０ｍｌキナーゼ緩衝液，２００μｇＧＳＴ−ζ，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで最
終容量８．０ｍｌとする。
【０２８０】方法： ａ．ＬｃｋでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． １００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中のヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ２．０μｇ／ウエルで，４℃で一夜コーティングする。 ２． ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。 ３． プレートを０．１５ｍｌのブロッキング緩衝液で室温で３０分間ブロッキ
ングする。 ４． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ５． ０．１ｍｌＰＢＳ中の抗ｌｃｋ（モノクローナル抗体３Ａ５）を０．５μ
ｇ／ウエルで室温で１−２時間加える。 ６． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ７． 溶解緩衝液中に希釈した，ｌｃｋでトランスフォームした酵母の溶解物を
２０μｇ／ウエルで加える（ウエルあたり総容量０．１ｍｌ）。プレートを４℃
で一夜振盪して活性の喪失を防止する。ｂ．ホスホチロシン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ＵＢ４０プレート：１００μｌＰＢＳ中の１．０μｇ／ウエルＵＢ４０を
４℃で一夜加え，１５０μｌのブロッキング緩衝液で少なくとも１時間ブロッキ
ングする。ｃ．キナーゼアッセイ法 １． 工程１−７からの未結合蛋白質を除去し，プレートをＰＢＳで５回洗浄す
る。 ２． ウエルあたり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（ウエルあたり，水で希
釈した１０μｌの１０Ｘキナーゼ緩衝液および２μｇＧＳＴ−ζを含む）を加え
る。 ３． １０％ＤＭＳＯを含有する水中で希釈した化合物１０μｌを加え，室温で
１５分間プレインキュベートする。 ４． 水中０．１ｍＭＡＴＰ（最終濃度１０μＭＡＴＰ）を１０μｌ／ウエルで
加えることによりキナーゼ反応を開始させる。 ５． ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間振盪する。 ６． ウエルあたり１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることによりキナーゼ反
応を停止させる。 ７． ９０μｌの上清を，上述のＢ節からのブロッキングした４Ｇ１０コーティ
ングＥＬＩＳＡプレートに移す。 ８． 振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 ９． プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １０． １００μｌＴＢＳＴ中１：５０００に希釈したウサギ抗ＧＳＴ抗体とと
もに室温で３０分間インキュベートする。 １１． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １２． １００μｌのＴＢＳＴ中１：２０，０００に希釈したヤギ抗ウサギ−Ｉ
ｇＧ−ＨＲＰとともに室温で３０分間インキュベートする。 １３． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １４． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢで発色させる。
【０２８１】実施例１４：ＲＡＦのリン酸化機能を測定するアッセイ 以下のアッセイは，ＲＡＦにより触媒される，その標的蛋白質ＭＥＫならびに
ＭＥＫの標的であるＭＡＰＫのリン酸化の量を測定する。ＲＡＦ遺伝子配列は，
Ｂｏｎｎｅｒら（１９８５，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４００−
１４０７）に記載されており，多くの遺伝子配列データバンクにおいて容易にア
クセス可能である。核酸ベクターの構築および本発明のこの部分において用いら
れる細胞株は，Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８８５５−８８５９）にすべて記載されている。
【０２８２】材料および試薬 １． Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞；ＧＩＢＣ
Ｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２． ＲＩＰＡ緩衝液：２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣ１ｐＨ７．４，１３７ｍＭＮａ
Ｃｌ，１０％グリセロール，１ｍＭＰＭＳＦ，５ｍｇ／Ｌアプロテニン，０．５
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００； ３． チオレドキシン−ＭＥＫ融合蛋白質（Ｔ−ＭＥＫ）：Ｔ−ＭＥＫ 発現およびアフィニティークロマトグラフィーによる精製は，製造元の方法に従
って実施する。カタログ＃Ｋ３５０−０１およびＲ３５０−４０，Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ４． Ｈｉｓ−ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）；Ｈｉｓ−タグＭＡＰＫは，Ｈｉｓ−ＭＡ
ＰＫをコードするｐＵＣ１８ベクターによりトランスフォームしたＸＬ１ Ｂｌ
ｕｅ細胞中で発現させる。Ｈｉｓ−ＭＡＰＫはＮｉ−アフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製する。Ｃａｔ＃２７−４９４９−０１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ
，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，本明細書に記載されたとおり。 ５． ヤギ抗マウスＩｇＧ：Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅ
ｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ．カタログ，＃５１５−００６−００８，Ｌｏｔ＃２８
５６３ ６． ＲＡＦ−１蛋白質キナーゼ特異的抗体：ＵＲＰ２６５３，ＵＢＩ ７． コーティング緩衝液：ＰＢＳ；リン酸緩衝化食塩水，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ８． 洗浄緩衝液：ＴＢＳＴ−５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＬｐＨ７．２，１５０ｍ
ＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ９． ブロッキング緩衝液：ＴＢＳＴ，０．１％エタノールアミンｐＨ７．４ １０． ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ １１． キナーゼ緩衝液（ＫＢ）：２０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）
，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭＰＭＳＦ，５
ｍｇ／Ｌアプロテニン，７５ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム，０．５ＭＭＤ
ＴＴおよび１０ｍＭＭｇＣｌ2 １２． ＡＴＰ混合物：ｌ００ｍＭＭｇＣｌ2，３００ｍＭＡＴＰ，１０ｍＣｉ3 3 ＰＡＴＰ（ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ）／ｍＬ １３ 停止溶液：１％リン酸；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ １４． Ｗａｌｌａｃリン酸セルロースフィルターマット；Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕ
ｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ １５． フィルター洗浄溶液：１％リン酸，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ，ＰＡ １６． Ｔｏｍｔｅｃプレート回収機，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌ
ａｎｄ １７． Ｗａｌｌａｃベータプレートリーダー＃１２０５，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕ
ｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ １８． 化合物用に，ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２
【０２８３】方法 以下のすべての工程は，特に指示しないかぎり，室温で実施した。 １． ＥＬＩＳＡプレートコーティング：ＥＬＩＳＡウエルを１００ｍｌのヤギ
抗マウスアフィニティー精製抗血清（１ｍｇ／ｌ００ｍＬコーティング緩衝液）
で４℃で一夜コーティングする。ＥＬＩＳＡプレートは，４℃で保存したとき，
２週間使用することができる。 ２． プレートを逆さにして液体を除去する。１００ｍＬのブロッキング溶液を
加え，３０分間インキュベートする。 ３． ブロッキング溶液を除去し，洗浄緩衝液で４回洗浄する。プレートをペー
パータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。 ４． 各ウエルに１ｍｇのＲＡＦ−１特異的抗体を加え，１時間インキュベート
する。工程３に記載したように洗浄する。 ５． ＲＡＳ／ＲＡＦで感染させたＳｆ９細胞からの溶解物を解凍し，ＴＢＳＴ
で１０ｍｇ／１００ｍＬに希釈する。１０ｍｇの希釈溶解物をウエルに加え，１
時間インキュベートする。インキュベーションの間，プレートを振盪する。陰性
対照には溶解物を加えない。各ウイルスにつきＭＯＩ５で細胞を組換えバキュロ
ウイルスで感染させた後，ＲＡＳ／ＲＡＦで感染させたＳｆ９昆虫細胞からの溶
解物を調製し，４８時間後に回収する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し，ＲＩＰＡ緩
衝液中で溶解する。不溶物質を遠心分離（５分間，１００００ｘｇ）により除去
する。溶解物のアリコートをドライアイス／エタノール中で凍結し，使用まで−
８０℃で保存する。 ６． 非結合物質を除去し，上に簡単に述べたように洗浄する（工程３）。 ７． ウエルあたり２ｍｇのＴ−ＭＥＫおよび２ｍｇのＨｉｓ−ＭＡＥＰＫを加
え，キナーゼ緩衝液で容量を４０ｍＬに調節する。細胞抽出物からＴ−ＭＥＫお
よびＭＡＰＫを精製する方法は，本明細書の実施例に記載される。 ８． 化合物（保存溶液１０ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ）または抽出物をＴＢＳＴプラ
ス１％ＤＭＳＯ中であらかじめ２０倍に希釈する。５ｍＬのあらかじめ希釈した
化合物／抽出物を工程６に記載したウエルに加える。２０分間インキュベートす
る。対照には薬剤を加えない。 ９． ５ｍＬＡＴＰミックスを加えることによりキナーゼ反応を開始する。イン
キュベーションの間，ＥＬＩＳＡプレート振盪器でプレートを振盪する。 １０． ６０分後，３０ｍＬの停止溶液を各ウエルに加えることによりキナーゼ
反応を停止する。 １１． ホスホセルロースマットおよびＥＬＩＳＡプレートをＴｏｍｔｅｃプレ
ート回収機中に置く。フィルターを回収し，フィルター洗浄溶液で製造元の推奨
にしたがってこれを洗浄する。フィルターマットを乾燥する。フィルターマット
を密封し，ケース中に置く。ケースを放射活性検出装置に入れ，フィルターマッ
ト上の放射活性リンを定量する。 あるいは，アッセイプレートの個々のウエルからの４０ｍＬのアリコートを，
ホスホセルロースフィルターマットの対応する位置に移すことができる。フィル
ターを風乾した後，フィルターをトレイ中に置く。トレイを穏やかにロックし，
洗浄溶液を１５分間ごとに１時間交換する。フィルターマットを風乾する。フィ
ルターマットを密封し，サンプル中の放射活性リンを測定するのに適当なケース
中に入れる。ケースを検出装置に入れ，フィルターマット上の放射活性リンを定
量する。
【０２８４】細胞／生物学的アッセイ 実施例１５：ＦＯＲＢＲＤＵ取り込みアッセイの一般的方法 以下のアッセイは，目的とするレセプターを発現するよう遺伝子工学的に改変さ
れた細胞を使用して，ＤＮＡ中へのＢｒｄＵ取り込みを決定することにより，リ
ガンド−誘導性ＤＮＡ合成の活性に及ぼす目的化合物の影響を評価する。 以下の材料，試薬および方法は，以下のＢｒｄＵ取り込みアッセイのそれぞれに
ついて一般的である。特定のアッセイにおける変更は特に記載される。
【０２８５】材料および試薬： １．適当なリガンド ２．工学的に改変した適当な細胞 ３．ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ４．ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ５．抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：マウスモノクローナル抗体，ペルオキシダーゼとコ
ンジュゲート化（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
６．ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ７．ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４ ８．アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），画分Ｖ粉体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，ＵＳＡ）
【０２８６】一般的方法： １．細胞を８０００細胞／ウエルで，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ，ＤＭＥＭ中で
９６ウエルプレートに播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ2で一夜インキュベー
トする。 ２．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳＤＭＥＭ，
０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。 ３．第３日に，適当なリガンドおよび試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対
照ウエルには無血清ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡのみを加える。陽性対照細胞には
リガンドを加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，無血清ＤＭＥＭ中で
リガンドとともに９６ウエルプレート中で調製し，連続希釈して７種類の試験濃
度とする。 ４．リガンド活性化の１８時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（１：１００，ＤＭＥ
Ｍ中，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）ととも
に１．５時間インキュベートする。 ５．標識試薬とともにインキュベートした後，デカントし逆さにしたプレートを
ペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶
液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で４５分間イ
ンキュベートする。 ６．デカントし逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより
ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ミルク（５％脱水ミルク，ＰＢＳ中，２
００μｌ／ウエル）をブロッキング溶液としてを加え，プレートをプレート振盪
器で室温で３０分間インキュベートする。 ７．デカントすることによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回
洗浄する。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１：２００希釈，ＰＢＳ中，１％ＢＳＡ
）を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で９０分間イ
ンキュベートする。 ８．デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲートを
よく除去し，プレートを逆さにし，ペーパータオル上で軽くたたくことにより乾
燥する。 ９．ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２
０分間，発色が光学的検出に十分となるまでインキュベートする。 １０．試料の吸収をＤｙｎａｔｅｃｈＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍ
で測定する（"デュアル波長"モード，参照波長として４９０ｎｍでフィルターを
読む）。
【０２８７】実施例１６：ＥＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 方法は，上で概要を記載した一般的方法と同じであるが，ただし以下の点を変更
する：材料および試薬： １．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ） ２．３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７
【０２８８】実施例１７：ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ−２−推進性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 方法は，上で概要を記載した一般的方法と同じであるが，ただし以下の点を変更
する：材料および試薬： １．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ） ２．３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ２／ＥＧＦｒ（ＥＧＦｒおよびＨｅｒ−２キナー
ゼドメイン）
【０２８９】実施例１８：ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ−４−推進性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 方法は，上で概要を記載した一般的方法と同じであるが，ただし以下の点を変更
する：材料および試薬： １．マウスＥＧＦ，２０１（ＴｏｙｏｂｏＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ） ２．３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ４／ＥＧＦｒ（ＥＧＦｒおよびＨｅｒ−４キナー
ゼドメイン）
【０２９０】実施例１９：ＰＤＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 方法は，上で概要を記載した一般的方法と同じであるが，ただし以下の点を変更
する：材料および試薬： １．ヒトＰＤＧＦＢ／Ｂ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ） ２．３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７
【０２９１】実施例２０：ＦＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 方法は，上で概要を記載した一般的方法と同じであるが，ただし以下の点を変更
する：材料および試薬： １．ヒトＦＧＦ２／ｂＦＧＦ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＵＳＡ） ２．３Ｔ３ｃ７／ＥＧＦｒ
【０２９２】実施例２１：ＩＧＦ１−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 方法は，上で概要を記載した一般的方法と同じであるが，ただし以下の点を変更
する：材料および試薬： １．ヒト，組換え（Ｇ５１１，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ） ２．３Ｔ３／ＩＧＦｌｒ
【０２９３】実施例２２：インスリン−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 方法は，上で概要を記載した一般的方法と同じであるが，ただし以下の点を変更
する：材料および試薬： １．インスリン，結晶，ウシ，亜鉛（１３００７，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＵＳＡ）
【０２９４】実施例２３：ＨＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 方法は，上で概要を記載した一般的方法と同じであるが，ただし以下の点を変更
する：材料および試薬： １．組換えヒトＨＧＦ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２４９−ＨＧ，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，
Ｉｎｃ．ＵＳＡ） ２．ＢｘＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６８７）
【０２９５】方法： １．細胞をＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中で９６ウエルプレートに９０００細胞／ウエ
ルで播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ2中で一夜インキュベートする ２．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に１００μｌの無血清培地（ＲＰＭ
Ｉ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。 ３．第３日に，リガンド（１μｇ／ｍｌでＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ中で調製；
最終ＨＧＦ濃度２００ｎｇ／ｍｌ）および試験化合物を含有する２５μｌを細胞
に加える。陰性対照ウエルには２５μｌの無血清ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡのみ
を加える。陽性対照細胞にはリガンド（ＨＧＦ）を加えるが試験化合物は加えな
い。試験化合物は，９６ウエルプレートで，リガンドを含む無血清ＲＰＭＩ中で
その最終濃度の５倍で調製し，一連の希釈を作成して７種類の試験濃度とする。
典型的には，試験化合物の最高最終濃度は１００μＭであり，１：３希釈を用い
る（すなわち，最終試験化合物濃度範囲は０．１３７−１００μＭである）。 ４．リガンド活性化の１８時間後，１２．５μｌの希釈ＢｒｄＵ標識試薬（１：
１００，ＲＰＭＩ，０．１％ＢＳＡ）を各ウエルに加え，細胞をＢｒｄＵ（最終
濃度は１０ｐＭ）とともに１時間インキュベートする。 ５．一般的方法と同じ。 ６．一般的方法と同じ。 ７．デカントすることによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回
洗浄する。抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（１：１００希釈，ＰＢＳ中，１％ＢＳＡ
）を加え（１００μｌ／ウエル），プレートを室温でプレート振盪器で９０分間
インキュベートする。 ８．一般的方法と同じ。 ９．一般的方法と同じ。 １０．一般的方法と同じ。
【０２９６】実施例２４：ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ また，以下のプロトコルを用いて，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＦＧＦ−Ｒ，ＶＥＧＦ，ａ
ＦＧＦまたはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（これらはすべてＨＵＶ−ＥＣ細胞により天然
に発現されている）に対する化合物の活性を測定することができる。
【０２９７】第０日 １． ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞，（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；カタログＮｏ．１７３０ＣＲＬ）
を洗浄し，トリプシン処理する。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．１４１９０−０２９から入手）で２回，約
１ｍｌ／１０ｃｍ2組織培養フラスコで洗浄する。非酵素細胞解離溶液（Ｓｉｇ
ｍａ 化学 Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログＮｏ．Ｃ−１５４４）中で０．０５％ト
リプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理する。０．０５％トリプシンは，０．２５
％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ；カタログＮｏ．２５２００−０４
９）を細胞解離溶液中で希釈することにより作成する。約１ｍｌ／２５−３０ｃ
ｍ2組織培養フラスコで３７℃で約５分間トリプシン処理する。細胞をフラスコ
からはがした後，等量のアッセイ培地を加え，５０ｍｌ滅菌遠心分離管（Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ．０５−５３９−６）に移す。 ２． ５０ｍｌ滅菌遠心分離管中にアッセイ培地を加えることにより，細胞を約
３５ｍｌのアッセイ培地で洗浄し，約２００ｇで１０分間遠心分離し，上清を吸
引し，３５ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。Ｄ−ＰＢＳでさらに２回洗浄し，細
胞を約１ｍｌ／組織培養フラスコ１５ｃｍ2のアッセイ培地に再懸濁する。アッ
セイ培地は，Ｆ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．２１１２７−
０１４）＋０．５％熱不活性化ウシ胎児血清からなる。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕ
ｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で細
胞を計数し，アッセイ培地を細胞に加えて０．８−１．０ｘ１０5細胞／ｍｌの
濃度とする。 ３． 細胞を９６ウエル平底プレートに１００μｌ／ウエルまたは０．８−１．
０ｘ１０4細胞／ウエルで加える；３７℃，５％ＣＯ2で約２４時間インキュベー
トする。
【０２９８】第１日 １． 試験化合物の２倍滴定を別々の９６ウエルプレート中に作成する。一般に
，５０μＭから０μＭまで。上述の第０日，工程２と同じアッセイ培地を用いる
。滴定は，９０μｌ／ウエルの試験化合物を２００μＭ（４Ｘ最終ウエル濃度）
で特定のプレートカラムの最上のウエルに加えることにより行う。試験化合物保
存液濃度は通常ＤＭＳＯ中２０ｍＭであるため，２００μＭの薬剤濃度は２％Ｄ
ＭＳＯを含む。 したがって，ＤＭＳＯ濃度を一定に保持しながら薬剤を希釈するために，アッ
セイ培地中（Ｆ１２Ｋ＋０．５％ウシ胎児血清）２％ＤＭＳＯとした希釈剤を，
試験化合物滴定の希釈剤として用いる。この希釈物をカラム中の残りのウエルに
６０μｌ／ウエルで加える。カラムの最上ウエル中の１２０μｌの２００μＭ試
験化合物希釈物から６０μｌを採取し，カラムの第２のウエル中の６０μｌと混
合する。このウエルから６０μｌを採取し，カラム中の第３のウエル中の６０μ
ｌと混合し，２倍滴定が完了するまでこれを続ける。最後から２番目のウエルが
混合されたとき，このウエル中の１２０μｌの６０μｌを採取し，これを廃棄す
る。最後のウエルには薬剤非含有対照として６０μｌのＤＭＳＯ／培地希釈物を
加える。以下のアッセイの，滴定する試験化合物の三重のウエルに十分な９つの
カラムを作成する：（１）ＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，から入
手，カタログＮｏ．１００−２００，（２）内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）（酸
性繊維芽細胞成長因子またはａＦＧＦとしても知られる）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから入手，カタログＮｏ．１４３
９６００）；または（３）ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ（１２７６−９５６，Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアッセイ培地対照。
ＥＣＧＦはヘパリンナトリウムを有する調製物として得た。 ２． ５０μｌ／ウエルの試験化合物希釈物を，第０日からのＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ
細胞０．８−１．０ｘ１０4細胞／１００μｌ／ウエルを含む９６ウエルアッセ
イプレートに移し，３７oＣ，５％ＣＯ2で約２時間インキュベートする。 ３． 三重に，８０μｇ／ｍｌＶＥＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌＥＣＧＦ，または各試
験化合物の条件に対する培地対照を５０μｌ／ウエルで加える。試験化合物につ
いては，成長因子濃度は所望の最終濃度の４倍である。第０日，工程２からのア
ッセイ培地を用いて，成長因子の濃度を調節する。３７℃，５％ＣＯ2で約２４
時間インキュベートする。各ウエルに５０μｌの試験化合物希釈物，５０μｌの
成長因子または培地，および１００μｌの細胞を加え，総量２００μｌ／ウエル
とする。すなわち，すべてをウエルに加えたとき，４倍濃度の試験化合物および
成長因子は１倍となる。
【０２９９】第２日 １． 3Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログＮｏ．ＴＲＫ−６８６）を
１μＣｉ／ウエル（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清中で調製した
１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／ウエル）で加え，３７℃，５％ＣＯ2で約
２４時間インキュベートする。注：３Ｈ−チミジンはＲＰＭＩ培地中で作成する
。これは，３Ｈ−チミジンを含む実験に用いるすべての他の用途はＲＰＭＩ中で
行ったためである。この工程における培地の相違はおそらくは有意ではない。Ｒ
ＰＭＩはＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手する，カタログＮｏ．１１８７５−０５１ 第３日 １． プレートを−２０℃で一夜凍結する。第４日 １． プレートを融解し，９６ウエルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖ
ｅｓｔｅｒ９６（登録商標））でフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ；カタログＮ
ｏ．１２０５−４０１）上に回収する；Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商
標）液体シンチレーション計数機で計数する。
【０３００】インビボ動物モデル 実施例２５：異種移植片動物モデル ヒト腫瘍が無胸腺マウス（例えば，Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）中で異種移植
片として成長する能力は，ヒト腫瘍の治療に対する生物学的応答を研究するのに
有用なインビボモデルを提供する。ヒト腫瘍の無胸腺マウスへの最初の成功的な
異種移植（Ｒｙｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｏｖｌｓｅｎ，１９６９，Ａｃｔａ Ｐ
ａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｓｃａｎｄ．７７：７５８−７６０）以来，
多くの異なるヒト腫瘍細胞株（例えば，乳房，肺，尿生殖器，胃腸，頭頸部，神
経膠芽細胞腫，骨，および悪性黒色腫）が移植され，ヌードマウス中での成長に
成功してきた。以下のアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の活性，特異性
および効果のレベルを決定することができる。
【０３０１】 皮下異種移植片実験に適した細胞株としては，Ｃ６細胞（神経膠腫，ＡＴＣ
Ｃ＃ＣＣＬ１０７），Ａ３７５細胞（黒色腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６１９），Ａ
４３１細胞（類表皮癌腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５），Ｃａｌｕ６細胞（肺，
ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ５６），ＰＣ３細胞（前立腺，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５），
およびＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＩＧＦ−１Ｒまたは任意の他の試験キナーゼを過
剰発現するように遺伝子工学処理されたＳＫＯＶ３ＴＰ５細胞およびＮＩＨ３Ｔ
３繊維芽細胞が挙げられる。以下のプロトコルを用いて異種移植片実験を行うこ
とができる。
【０３０２】 雌無胸腺マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）はＳｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）から入手する。すべての動物は，ク
リーンルーム条件下で，マイクロアイソレーターケージでアルファドライ敷きわ
らで維持する。動物には，滅菌齧歯類食および水を任意に与える。
【０３０３】 細胞株は，適当な培地（例えば，ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，Ｈａｍ'ｓＦ１０，ま
たはＨａｍ'ｓＦ１２プラス５％−１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ
グルタミン（ＧＬＮ））中で成長させる。すべての細胞培養培地，グルタミン，
およびウシ胎児血清は，特に断らない限り，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入する。すべての細
胞は，９０−９５％空気および５−１０％ＣＯ2の湿潤環境下で３７℃で成長さ
せる。すべての細胞株は，週に２回，定期的に継代し，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇ
ｉｂｃｏ）により判定して，マイコプラズマについては陰性である。
【０３０４】 細胞は，コンフルエント，またはそれに近い状態で，０．０５％トリプシン
−ＥＤＴＡで回収し，４５０ｘｇで１０分間ペレット化する。ペレットを滅菌Ｐ
ＢＳまたは培地（ＦＢＳなし）中に懸濁して特定の濃度とし，細胞をマウス（１
群あたり，８−１０匹のマウス，２−１０ｘ１０6細胞／動物）の後側腹部内に
移植する。腫瘍成長は，ベニエカリパスを用いて３−６週間にわたり測定する。
腫瘍体積は，とくに記載のないかぎり，長さｘ幅ｘ高さの積として計算する。Ｐ
値は，スチューデントｔ−テストを用いて計算する。５０−１００μｌの賦形剤
（ＤＭＳＯ，またはＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）中の試験化合物は，通常は移植後の第１日
から初めて，異なる濃度でＩＰ注入により輸送することができる。
【０３０５】実施例２６：腫瘍侵襲モデル 以下の腫瘍侵襲モデルが開発されており，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターまた
はＣＤＫ２を選択的に阻害すると同定された化合物の治療的価値および有効性を
評価するために用いることができる。
【０３０６】方法 ８週齢のヌードマウス（雌）（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｉｎｃ．）を実験動物とし
て用いる。腫瘍細胞の移植は，層流フード内で行うことができる。麻酔用に，キ
シラジン／ケタミンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキ
シラジン）を腹膜内に投与する。中線切開を行って，腹腔を露出して（約１．５
ｃｍの長さ），容量１００μｌの培地中の１０7個の腫瘍細胞を注入する。細胞
は，膵臓の十二指腸葉または結腸の漿膜下に注入する。腹膜および筋肉を６−０
絹連続縫糸により縫合し，皮膚は創傷クリップを用いて縫合する。動物は毎日観
察する。
【０３０７】分析 動物の全体的所見により２−６週間後，マウスを殺し，局所腫瘍の種々の臓器
（肺，肝臓，脳，胃，脾臓，心臓，筋肉）への転移を調べ，分析する（腫瘍サイ
ズ，侵襲の程度，免疫化学，およびインサイチオハイブリダイゼーション測定等
）。
【０３０８】実施例２７：細胞毒性の測定 治療用化合物は，細胞毒性効果を示すよりも蛋白質キナーゼの阻害活性におい
てより強力でなければならない。化合物の有効性および細胞毒性の尺度は，治療
指数，すなわち，ＩＣ50／ＬＤ50を決定することにより得ることができる。ＩＣ 50 （５０％の阻害を達成するのに必要な用量）は，本明細書に記載されるもの等
の標準的な手法を用いて測定することができる。ＬＤ50（５０％の毒性をもたら
す用量）もまた，放出されるＬＤＨの量を測定することにより（Ｋｏｒｚｅｎｉ
ｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４：３１３，Ｄｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎｎ−Ｍａ
ｔｔｈｅｓ，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１５：６１）
，または動物モデルにおける致死用量を測定することにより，標準的な手法によ
り測定することができる（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３）。より大きい治療指数を有する化合物が望ま
しい。治療指数は，２より高くあるべきであり，好ましくは少なくとも１０，よ
り好ましくは少なくとも５０である。
【０３０９】実施例２８：本発明の化合物の活性 本発明の化合物のいくつかの生物学的および生化学的活性を上述したアッセイ
を用いて試験した。本発明の化合物のいくつかについてＩＣ５０値を測定した。
結果は以下の表４に示される。
【０３１０】 表４
【表１１】
【０３１１】
【表１２】
【０３１２】 当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，なら
びに本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するで
あろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定
の化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なもので
あって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許
請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用
途をなすであろう。
【０３１３】 当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示
される本発明に対して置換基の変更および改変をなすことができることを容易に
理解するであろう。
【０３１４】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する
技術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊
行物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に
，本明細書の一部として引用される。
【０３１５】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されて
いない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，
例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的
になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換える
ことができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用
いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，
示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図す
るものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可
能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本
発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更お
よび変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義され
る本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０３１６】 さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語で記載されて
いる場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメン
バーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう
。例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載
されている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素であ
る特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０３１７】 本明細書においては，本発明を広くかつ一般的に記載している。一般的開示
に含まれるより狭い種および亜属のそれぞれのグループもまた本発明の一部を形
成する。これには，除かれたものが具体的に記載されているか否かにかかわらず
，属から任意の主題を除く「ただし・・・」またはネガティブ限定を含む発明の
一般的記載が含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/4725 Ａ６１Ｋ 31/4725 31/5377 31/5377 Ａ６１Ｐ 1/00 Ａ６１Ｐ 1/00 11/00 11/00 13/08 13/08 13/10 13/10 15/00 15/00 17/00 17/00 25/00 25/00 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｄ 491/052 Ｃ０７Ｄ 491/052 519/00 519/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 タン，ペン・チョウ アメリカ合衆国 94556 カリフォルニア 州 モラーガ，カミーノ リカルド 827 (72)発明者 ミラー，トッド・エー アメリカ合衆国 97701 オレゴン州 ベ ンド，ホロー ツリー レイン，エヌ．イ ー．1713 (72)発明者 リ，シャオユアン アメリカ合衆国 94024 カリフォルニア 州 ロス アルトス，ヴィクトリア コー ト 2020 (72)発明者 ツァン，ルオーフェイ アメリカ合衆国 94404 カリフォルニア 州 フォスター シティ，ガル アベニュ ー 1046 (72)発明者 キュイ，ジンロン アメリカ合衆国 94404 カリフォルニア 州 フォスター シティ，アークチュラス サークル 808 (72)発明者 ファン，ピン アメリカ合衆国 94040 カリフォルニア 州 マウンテン ビュー，ウィッツ ロー ド 117 (72)発明者 ウェイ，チャン・チェン アメリカ合衆国 94404 カリフォルニア 州 フォスター シティ，コモンズ レイ ン 39 Ｆターム(参考） 4C050 AA01 BB04 CC18 EE01 FF02 GG03 HH04 4C065 AA05 BB04 CC01 DD02 EE02 HH05 JJ04 KK01 LL01 PP18 4C072 MM08 UU01 4C086 AA01 AA02 AA03 CA05 CB05 CB22 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA59 ZA66 ZA81 ZA89 ZB26 ZC20

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式（Ｉ）： 【化１】 上記式において， （ａ）各Ｒ1は次の（ｉ）〜（ｘｉｖ）から構成される基から，独立して任意に
    選択される： （ｉ）水素 （ｉｉ）ハロゲン，トリハロメチル，アルコキシ，カルボキシレート，アミノ，
    ニトロ，エステル，および５員若しくは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪
    族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから選択される１，２または
    ３個の基で任意に置換された飽和または不飽和アルキルであって，各環はアルキ
    ル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエス
    テルから構成されるグループから独立的に選択される１，２または３の置換基で
    任意に置換されており （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
    ト，アミノ，ニトロ，およびエステルから構成されるグループから独立して選ば
    れる１，２または３の置換基で任意に置換された芳香族環またはヘテロ芳香族環 （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
    ，アミノ，ニトロ，エステル，およびアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハ
    ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグ
    ループから独立して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換された芳香族
    環またはヘテロ芳香族環から構成されるグループから独立して選択される１，２
    または３個の置換基で任意に置換された脂肪族またはヘテロ脂肪族環 （ｖ）一般式−（Ｘ1）ｎ1−ＯＨで表されるアルコールまたは一般式−（Ｘ2）
    ｎ2−Ｏ−Ｘ3で表されるアルコキシアルキル ここで，Ｘ1，Ｘ2，およびＸ3は，飽和または不飽和アルキル，アミド，並びに
    ５員若しくは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環
    から構成されるグループから独立して選択され，アルキルおよび各環は，アルキ
    ル，アルコキシ，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，トリハロメチル，カル
    ボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立
    して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換されており，ｎ１およびｎ２
    はそれぞれ独立して０または１である （ｖｉ）ハロゲンまたはトリハロメチル （ｖｉｉ）一般式−（Ｘ4）ｎ4−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸または一般式−
    （Ｘ5）ｎ5−ＣＯＯ−Ｘ6で表されるエステル ここで，Ｘ4，Ｘ5，およびＸ6はアルキル，５員若しくは６員の芳香族環，ヘテ
    ロ芳香族環，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから独立し
    て選択され，ｎ４およびｎ５はそれぞれ独立して０または１であり （ｖｉｉｉ）一般式−（Ｘ7）ｎ7−ＮＨＣＯＸ8，−（Ｘ7）ｎ7−ＮＨＣＳＸ8，
    −（Ｘ9）ｎ9−ＣＯＮＸ10Ｘ11または−（Ｘ9）ｎ9−ＣＳＮＸ10Ｘ11で表される
    アミドまたはチオアミド ここで，Ｘ7およびＸ9は，それぞれ，アルキル，並びに５員若しくは６員芳香環
    ，ヘテロ芳香族環，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから
    独立して選択され，各環は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシ
    レート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選
    ばれる１，２または３個の置換基で任意に置換されており，ｎ７およびｎ９は，
    それぞれ独立して０または１であり，Ｘ8，Ｘ10，およびＸ11は，それぞれ，水
    素，アルキル，ヒドロキシ，アルコキシ，並びに５員若しくは６員の芳香族環，
    ヘテロ芳香族環，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから独
    立して選択され，各環は，アルキル，アルコキシ，チオアルキル，アリール，ヘ
    テロアリール，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ
    およびエステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２または３個
    の置換基で任意に置換されており，または，Ｘ10およびＸ11は，一緒になって，
    アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよ
    びエステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２または３個の置
    換基で任意に置換された各環を有する５員若しくは６員の脂肪族，ヘテロ脂肪族
    環または縮合二環を形成し （ｉｘ）一般式−（Ｘ12）ｎ12−ＳＯ2ＮＸ13Ｘ14，または一般式−（Ｘ12）ｎ1 2 −ＮＸ13−ＳＯ2−Ｘ14，で表されるスルホンアミド ここで，Ｘ12は，アルキル並びに５員若しくは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環
    ，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択され
    ，アルキルおよび各環は，アルキル，ハロゲン，ヒドロキシ，トリハロメチル，
    カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから
    独立して選ばれる１，２または３個の置換基で任意に置換されており，ｎ１２は
    ０または１であり，Ｘ13，およびＸ14は，水素，アルキル，および５員または６
    員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，３員，４員，５員または６員の脂肪族環，また
    はヘテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択され，ここで，アル
    キルおよび各環は，アルキル，アルコキシ，アリール，ヘテロアリール，ハロゲ
    ン，トリハロメチル，アルデヒド，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，および
    エステルから構成されるグループから独立して選択される１，２，または３の置
    換基で任意に置換されており，または，Ｘ13およびＸ14は一緒になって，アルキ
    ル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエス
    テルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２または３の置換基で任
    意に置換された５員，６員の脂肪族環，ヘテロ脂肪族環または縮合二環を形成し （ｘ）一般式−（Ｘ15）ｎ15−ＳＯ3Ｈで表されるスルホン ここで，Ｘ15は，アルキル，および５員若しくは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族
    環，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択さ
    れ，ここで，アルキルおよび各環は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カ
    ルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独
    立して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換されており，ｎ１５は，０
    ，１または２であり （ｘｉ）一般式−（Ｘ16）ｎ16−ＮＸ17Ｘ18で表されるアミン ここで，Ｘ16は，飽和または不飽和アルキル，５員若しくは６員の芳香族環，ヘ
    テロ芳香族環または脂肪族環であり，ｎ１６は０または１であり，Ｘ17またはＸ 18 は，水素，飽和または不飽和アルキル，並びに，アルキル，ハロゲン，トリハ
    ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグ
    ループから独立して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換された各環を
    有する５員若しくは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環またはヘテロ脂
    肪族環から構成されるグループから独立して選択され （ｘｉｉ）一般式−（Ｘ19）ｎ19−ＣＯ−Ｘ20で表されるケトン ここで，Ｘ19およびＸ20はそれぞれ，アルキル並びに５員若しくは６員の芳香族
    環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループか
    ら独立して選択され，アルキルおよび各環は，アルキル，５員若しくは６員芳香
    環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環，ハロゲン，トリハロメチ
    ル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループ
    から独立して選ばれる１，２または３個の置換基で任意に置換されており，ｎ１
    ９は０または１であり （ｘｉｉｉ）一般式−ＮＯ2で表されるニトロ基 （ｘｉｖ）２つの隣接したＲ1基は一緒になって，２つの隣接Ａ，Ｂ，Ｄまたは
    Ｅと共に，任意に置換された５員若しくは６員の芳香族環またはヘテロ芳香族環
    を形成し （ｂ）Ｒ2およびＲ4は，それぞれ，次の（ｉ）〜（ｉｖ）から構成されるグルー
    プから独立して選択される： （ｉ）水素 （ｉｉ）ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，エス
    テル，並びに，５員若しくは６員芳香環，ヘテロ芳香族環，脂肪族環またはヘテ
    ロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択さる１，２または３の置換
    基で任意に置換された飽和または不飽和アルキルであり，各環は，アルキル，ハ
    ロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルか
    ら独立して選ばれる１，２または３個の置換基で任意に置換されており （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
    ト，アミノ，ニトロおよびエステルから独立して構成されるグループから選ばれ
    る１，２または３の置換基で任意に置換された芳香族環またはヘテロ芳香族環 （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
    ，アミノ，ニトロ，エステル，並びにアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハ
    ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグ
    ループから独立して選ばれる１，２または３個の置換基で任意に置換された芳香
    族環またはヘテロ芳香族環から独立して選択される１，２または３の置換基で任
    意に置換された脂肪族環またはヘテロ脂肪族環 （ｃ）Ｒ3およびＲ5は，それぞれ次のグループから選択される： （ｉ）水素 （ｉｉ）ヒドロキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，
    ニトロ，エステル，および５員若しくは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，脂肪
    族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから選択される１，２または
    ３の置換基で任意に置換された飽和または不飽和アルキルであって，各環は，ア
    ルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，およ
    びエステルから独立して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換されてお
    り （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
    ト，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選ばれ
    る１，２または３の置換基で任意に置換された芳香族環またはヘテロ芳香族環 （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
    ，アミノ，ニトロ，エステル，並びにアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハ
    ロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから独立して選ば
    れる１，２または３個の置換基で任意に置換された芳香族環またはヘテロ芳香族
    環から構成されるグループから独立して選択される１，２または３の置換基で任
    意に置換された脂肪族環またはヘテロ脂肪族環 （ｄ）Ａ，Ｂ，ＤおよびＥはそれぞれ独立して炭素または窒素であり，ただし，
    Ａ，Ｂ，ＤおよびＥの０，１または２個が窒素であり，Ａ，Ｂ，ＤおよびＥのい
    ずれかが窒素である場合は，Ａ，Ｂ，ＤまたはＥにＲ1は結合しておらず （ｅ）Ｇは窒素または酸素であり，ただし，Ｇが酸素のとき，Ｒ5は存在せず （ｆ）ｍは，２，３，または４であり，かつ， （ｈ）ｑは，１，２，３または４である， で表される化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
  2. 【請求項２】一般式（Ｉ）： 【化２】 式中， （ａ）各Ｒ1は，独立して，任意に以下の（ｉ）−（ｘｉｖ）であり： （ｉ）水素 （ｉｉ）ハロゲン，トリハロメチル，アルコキシ，カルボキシレート，アミノ，
    ニトロ，エステル，５員芳香環，５員ヘテロ芳香環，５員脂肪族環，５員ヘテロ
    脂肪族環，６員芳香環，６員へテロ芳香環，６員脂肪族環，６員へテロ脂肪族環
    から構成されるグループから選択される１，２，または３の置換基で任意に置換
    されている飽和または不飽和アルキルであって，前記５員環は，アルキル，ハロ
    ゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから
    独立して選択される１，２または３の個の置換基で任意に置換されており （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
    ト，アミノ，ニトロおよびエステルから独立して選択される１，２または３個の
    置換基で任意に置換された芳香環またはヘテロ芳香族環 （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
    ，アミノ，ニトロ，エステル，芳香族環およびヘテロ芳香族環から構成されるグ
    ループから独立されて置換された１，２または３個の置換基で任意に置換された
    脂肪族環またはヘテロ脂肪族環であって，前記環は，アルキル，アルコキシ，ハ
    ロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルか
    ら構成されるグループから独立して選択される１，２または３個の置換基で任意
    に置換されており （ｖ）一般式−（Ｘ1）ｎ1−ＯＨで表されるアルコールまたは一般式−（Ｘ2）
    ｎ2−Ｏ−Ｘ3で表されるアルコキシアルキル ここで，Ｘ1,Ｘ2,およびＸ3は，飽和または不飽和アルキル，アミド，５員芳香
    族環，５員ヘテロ芳香族環，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員芳香族環
    ，６員へテロ芳香族環，６員脂肪族環，６員へテロ脂肪族環から構成されるグル
    ープから独立して選択され，ここで，前記アルキルまたは前記５員若しくは６員
    環は，アルキル，アルコキシ，アリール，ヘテロアリール，ハロゲン，トリハロ
    メチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグル
    ープから独立して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換されており，ｎ
    １およびｎ２はそれぞれ独立して０または１であり （ｖｉ）ハロゲンまたはトリハロメチル （ｖｉｉ）一般式−（Ｘ4）ｎ4−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸または一般式−
    （Ｘ5）ｎ5−ＣＯＯ−Ｘ6 ここで，Ｘ4,Ｘ5,およびＸ6は，アルキル，５員芳香族環，５員ヘテロ芳香族環
    ，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員芳香族環，６員へテロ芳香族環，６
    員脂肪族環，６員へテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択され
    ，ｎ４およびｎ５はそれぞれ独立して０または１であり （ｖｉｉｉ）一般式−（Ｘ7）ｎ7−ＮＨＣＯＸ8，−（Ｘ7）ｎ7−ＮＨＣＳＸ8，
    −（Ｘ9）ｎ9−ＣＯＮＸ10Ｘ11または−（Ｘ9）ｎ9−ＣＳＮＸ10Ｘ11で表される
    アミドまたはチオアミド， ここで，Ｘ7およびＸ9は，それぞれ，アルキル，５員芳香族環，５員ヘテロ芳香
    族環，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員芳香族環，６員へテロ芳香族環
    ，６員脂肪族環，６員へテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択
    され，ここで，前記５員または６員環は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル
    ，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループか
    ら独立して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換されており， ｎ７およびｎ９は，それぞれ独立して０または１であり， Ｘ8，Ｘ10，およびＸ11は，それぞれ，水素，アルキル，ヒドロキシ，アルコキ
    シ，５員芳香環，５員ヘテロ芳香環，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員
    芳香族環，６員へテロ芳香族環，６員脂肪族環，６員へテロ脂肪族環から構成さ
    れるグループから独立して選択され，ここで，前記５員または６員環は，アルキ
    ル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエス
    テルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２または３個の置換基で
    任意に置換されており，または，Ｘ10およびＸ11は，一緒になって，アルキル，
    ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステル
    から構成されるグループから独立して選ばれる１，２または３個の置換基で任意
    に置換された５員または６員脂肪族環若しくはヘテロ脂肪族環または縮合二環を
    形成し （ｉｘ）一般式−（Ｘ12）ｎ12−ＳＯ2ＮＸ13Ｘ14，または一般式−（Ｘ12）ｎ1 2 −ＮＸ13−ＳＯ2−Ｘ14，で表されるスルホンアミド ここで，Ｘ12は，アルキル，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員芳香環，
    ６員へテロ芳香環，６員脂肪族環，６員へテロ脂肪族環から構成されるグループ
    から独立して選択され，前記アルキルまたは５員若しくは６員環は，アルキル，
    ハロゲン，水素，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエ
    ステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２または３の置換基で
    任意に置換されており， ｎ１２は０，１または２であり， Ｘ13およびＸ14は，それぞれ独立して，水素，アルキル，５員芳香環，５員ヘテ
    ロ芳香環，６員芳香環，６員へテロ芳香環，３員脂肪族環，４員脂肪族環，５員
    脂肪族環，６員脂肪族環，３員へテロ脂肪族環，４員へテロ脂肪族環，５員へテ
    ロ脂肪族環および６員へテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択
    され，ここで，前記アルキル基は，アルキル，アルコキシ，アリール，ヘテロア
    リール，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロおよび
    エステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２または３個の置換
    基で任意に置換されており， 前記５または６員芳香環は，アルキル，アルコキシ，アリール，ヘテロアリール
    ，ハロゲン，トリハロメチル，アルデヒド，カルボキシレート，アミノおよびエ
    ステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２または３個の置換基
    で任意に置換されており， 前記５または６員へテロ芳香環は，アルキル，アルコキシ，アリール，ヘテロア
    リール，ハロゲン，トリハロメチル，アルデヒド，カルボキシレート，アミノ，
    ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２また
    は３の置換基で任意に置換されており， 前記３，４，５または６員脂肪環は，アルキル，アルコキシ，アリール，ヘテロ
    アリール，ハロゲン，トリハロメチル，アルデヒド，カルボキシレート，アミノ
    ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２ま
    たは３の置換基で任意に置換されており， 前記３，４，５または６員へテロ脂肪環は，アルキル，アルコキシ，アリール，
    ヘテロアリール，ハロゲン，トリハロメチル，アルデヒド，カルボキシレート，
    アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選ばれる１
    ，２または３の置換基で任意に置換されており，または Ｘ13およびＸ14は，一緒になって，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カル
    ボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立
    して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換された５員若しくは６員脂肪
    族環またはヘテロ脂肪族環または縮合二環を形成し （ｘ）一般式−（Ｘ15）ｎ15−ＳＯ3Ｈで表されるスルホン ここで，Ｘ15は，アルキル，５員芳香族環，５員へテロ芳香族環，５員脂肪族環
    ，６員芳香族環，６員脂肪族環および６員へテロ脂肪族環から構成されるグルー
    プから選択され，ここで，前記アルキルまたは前記５員若しくは６員環は，アル
    キル，ハロゲン，水素，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロお
    よびエステルから構成されるグループから独立に選ばれる１，２または３の置換
    基で任意に置換されており， ｎ１５は，０，１または２であり （ｘｉ）一般式−（Ｘ16）ｎ16−ＮＸ17Ｘ18で表されるアミン ここで，Ｘ16は，飽和または不飽和アルキル，５員芳香族環，５員ヘテロ芳香族
    環，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員芳香族環，６員へテロ芳香族環，
    ６員脂肪族環，６員へテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択さ
    れ， ｎ１６は，０または１であり， Ｘ17およびＸ18は，水素，飽和アルキル，不飽和アルキル，５員芳香族環，５員
    ヘテロ芳香族環，６員芳香族環，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員芳香
    族環，６員脂肪族環および６員へテロ脂肪族環から構成されるグループから独立
    して選択され， ここで，前記５または６員環は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボ
    キシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立し
    て選ばれる１，２または３個の置換基で任意に置換されており （ｘｉｉ）一般式−（Ｘ19）ｎ19−ＣＯ−Ｘ20で表されるケトン ここで，Ｘ19およびＸ20はそれぞれ，アルキル，５員芳香族環，５員ヘテロ芳香
    族環，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員芳香族環，６員へテロ芳香族環
    ，６員脂肪族環および６員へテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して
    選択され， ここで，前記アルキル基，５または６員環は，アルキル，５員芳香族環，５員ヘ
    テロ芳香族環，６員芳香族環，５員脂肪族環，５員ヘテロ脂肪族環，６員芳香族
    環，６員脂肪族環，６員へテロ脂肪族環，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキ
    シレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して
    選ばれる１，２または３個の置換基で任意に置換されており， ｎ１９は，０または１であり （ｘｉｉｉ）一般式−ＮＯ2で表されるニトロ基；または （ｘｉｖ）隣接する２つのＲ1基は，一緒になって，隣接する２つのＡ，Ｂ，Ｄ
    またはＥと共に，任意に置換された５員または６員脂肪族またはヘテロ脂肪族環
    を形成し （ｂ）Ｒ2およびＲ4は，それぞれ独立して以下の（ｉ）−（ｉｖ）であり： （ｉ）水素 （ｉｉ）ハロゲン，トリハロメチル，アルコキシ，カルボキレート，アミノ，ニ
    トロ，エステル，５員芳香環，５員ヘテロ芳香環，５員脂肪環，５員ヘテロ脂肪
    環，６員芳香族環および６員へテロ芳香環から構成される１，２または３個の置
    換基で任意に置換された飽和または不飽和のアルキルであって， ここで，前記５または６員置換基は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カ
    ルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独
    立して選択される１，２または３個の置換基で任意に置換されており （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
    ト，アミノ，ニトロ，およびエステルから構成されるグループから独立して選択
    される１，２，または３個の置換基で任意に置換された芳香族またはヘテロ芳香
    族環 （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，アルコキシ，カル
    ボキレート，アミノ，ニトロ，エステル，芳香族環，およびヘテロ芳香族環から
    構成されるグループから独立して選択される１，２，または３個の置換基で任意
    に置換された脂肪族またはヘテロ脂肪族環であって， ここで，前記環は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，
    アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選択される
    １，２または３の置換基で任意に置換されており （ｃ）Ｒ3およびＲ5は，それぞれ独立して，以下の（ｉ）−（ｉｖ）であり： （ｉ）水素 （ｉｉ）水素，ハロゲン，トリハロメチル，アルコキシ，カルボキシレート，ア
    ミノ，ニトロ，エステル，５員芳香環，５員ヘテロ芳香環，５員脂肪環，５員ヘ
    テロ脂肪環，６員芳香族環，６員へテロ芳香環，６員脂肪環，６員へテロ脂肪環
    から構成されるグループから独立して選択される１，２または３の置換基で任意
    に置換された飽和または不飽和のアルキルであって， ここで，前記５または６員置換基は，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カ
    ルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独
    立して選択される１，２または３の置換基で任意に置換されており （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
    ト，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選択さ
    れる１，２または３の置換基で任意に置換されている芳香族またはヘテロ芳香族
    環 （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
    ，アミノ，ニトロ，エステル，芳香族環，ヘテロ芳香族環から構成されるグルー
    プから独立して選択される１，２または３個の置換基で任意に置換された脂肪族
    またはヘテロ脂肪族環であって， ここで，前記環は，アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボ
    キシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立し
    て選択される１，２または３の置換基で任意に置換されており； （ｄ）Ａ，Ｂ，ＤおよびＥはそれぞれ独立して炭素または窒素であり，Ａ，Ｂ，
    ＤおよびＥのうち０，１または２個が窒素であり，Ａ，Ｂ，ＤおよびＥのいずれ
    かが窒素である場合は，前記Ａ，Ｂ，ＤまたはＥにはＲ1は結合しておらず； （ｅ）Ｇは窒素または酸素であり，Ｇが酸素であるとき，Ｒ5は存在せず； （ｆ）ｍは，２，３または４であり， （ｉ）ｑは，１，２，３または４である で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
  3. 【請求項３】 （ａ）各Ｒ1は，独立して，かつ任意に次のグループから選択さ
    れ： （ｉ）水素 （ｉｉ）炭素原子数１−５の枝分れまたは直鎖の炭素からなる飽和アルキル （ｉｉｉ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレー
    ト，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選択さ
    れる１，２または３個の置換基で任意に置換された芳香族またはヘテロ芳香族環 （ｉｖ）アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート
    ，アミノ，ニトロ，エステル，および，アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリ
    ハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニトロ，エステル，芳香族環およびヘ
    テロ芳香族環から構成されるグループから独立されて選択される１，２または３
    の置換基で任意に置換された脂肪族環またはヘテロ脂肪族環 （ｖ）一般式−（Ｘ1）ｎ1−ＯＨで表されるアルコールまたは一般式−（Ｘ2）
    ｎ2−Ｏ−Ｘ3で表されるアルコキシアルキル ここで，Ｘ1，Ｘ2，およびＸ3は，炭素原子数１−５の枝分かれまたは直鎖のア
    ルキルおよび６員芳香環から構成されるグループから独立して選択され，ｎ１お
    よびｎ２はそれぞれ独立して０または１であり （ｖｉ）ハロゲン （ｖｉｉ）一般式−（Ｘ4）ｎ4−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸または一般式−
    （Ｘ5）ｎ5−ＣＯＯ−Ｘ6で表されるエステル ここで，Ｘ4，Ｘ5およびＸ6は，それぞれ独立して，炭素原子数１−５の枝分れ
    または直鎖のアルキルであり，ｎ４およびｎ５は，それぞれ独立して０または１
    であり （ｖｉｉｉ）一般式−（Ｘ7）ｎ7−ＮＨＣＯＸ8または−（Ｘ9）ｎ9−ＣＯＮＸ1 0 Ｘ11で表されるアミド ここで，Ｘ7およびＸ9は，それぞれ，独立して炭素原子数５またはそれ以下の枝
    分かれしたまたは直鎖のアルキルであり，ｎ７およびｎ９は独立して０または１
    であり，Ｘ8，Ｘ10およびＸ11は，それぞれ独立して水素または１−５の炭素原
    子の枝分かれまたは直鎖からなるアルキルであり，または，Ｘ10およびＸ11は一
    緒になって，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ
    ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２ま
    たは３の置換基で任意に置換された５員若しくは６員芳香環，ヘテロ芳香族環，
    脂肪族環またはヘテロ脂肪族環または縮合二環であり （ｉｘ）一般式−（Ｘ12）ｎ12−ＳＯ2ＮＸ13Ｘ14，で表されるスルホンアミド
    ここで，Ｘ12は，炭素原子数１−５の枝分かれまたは直鎖のアルキルであり，ｎ
    １２は０または１であり，Ｘ13およびＸ14は，それぞれ，水素，アルキルおよび
    ５員若しくは６員の芳香族，へテロ芳香族，脂肪族またはヘテロ脂肪族環から構
    成されるグループから独立して選択され，ここで，アルキルおよび各環は，アル
    キル，ハロゲン，ヒドロキシ，トリハロメチル，カルボキシレート，アミノ，ニ
    トロおよびエステルから構成されるグループから独立して選ばれる１，２または
    ３個の置換基で任意に置換されており，または Ｘ13およびＸ14は一緒になって，アルキル，ハロゲン，トリハロメチル，カルボ
    キシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独立し
    て置換される５員または６員脂肪族，へテロ脂肪族環または縮合二環を形成し （ｘ）一般式−（Ｘ15）ｎ15−ＳＯ3Ｈで表されるスルホン ここで，Ｘ15は，炭素原子数１−５の枝分かれまたは直鎖のアルキルであり，ｎ
    １５は，０，１または２であり （ｘｉ）一般式−（Ｘ16）ｎ16−ＮＸ17Ｘ18で表されるアミン ここで，Ｘ16は，飽和または不飽和アルキル，５員若しくは６員芳香環，ヘテロ
    芳香族環，脂肪族環であり，ｎ16は０または１であり，Ｘ17またはＸ18は，水素
    ，飽和または不飽和アルキル，５員若しくは６員の芳香族環，ヘテロ芳香族環，
    脂肪族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから独立して選択され （ｘｉｉ）一般式−（Ｘ19）ｎ19−ＣＯ−Ｘ20で表されるケトン ここで，Ｘ19およびＸ20はそれぞれ，アルキル，５員若しくは６員の芳香族環，
    ヘテロ芳香族環，脂肪族環またはヘテロ脂肪族環から構成されるグループから独
    立して選択され，ここでアルキルおよび各環は，ハロゲン，トリハロメチル，カ
    ルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから独
    立して選ばれる１，２または３個の置換基で任意に置換されており，ｎ１９は，
    ０または１であり， （ｘｉｉｉ）一般式−ＮＯ2で表されるニトロ基，または （ｘｉｖ）２つの隣接したＲ1基は一緒になって，２つの隣接Ａ，Ｂ，Ｄまたは
    Ｅと共に，任意に置換された５員若しくは６員芳香環またはヘテロ芳香族環を形
    成し （ｂ）Ｒ2,Ｒ3およびＲ4は，水素であり， （ｃ）Ａ，Ｂ，ＤおよびＥは，それぞれ独立して炭素または窒素であり，ただし
    ，Ａ，Ｂ，ＤおよびＥの０，１，または２個が窒素であり，Ａ，Ｂ，ＤまたはＥ
    のいずれかが窒素である場合，Ａ，Ｂ，ＤまたはＥにＲ1は結合しておらず （ｅ）Ｘは窒素または酸素であり （ｆ）ｍは２，３または４であり， （ｉ）ｑは１または２である， 請求項１記載の化合物。
  4. 【請求項４】 （ａ）各Ｒ1が次のグループから独立して，かつ任意に選択され
    ： （ｉ）水素 （ｉｉ）メチル，エチル，プロピル，エチレン，プロピレンまたはブチレン （ｉｉｉ）一般式−（Ｘ1）ｎ1−ＯＨで表されるアルコール，または一般式−（
    Ｘ2）ｎ2−Ｏ−Ｘ3であるアルコキシアルキル ここで，Ｘ1，Ｘ2，およびＸ3は，メチレン，エチレン，またはプロピレンから
    構成されるグループから独立して選択され，ｎ１およびｎ２はそれぞれ独立して
    ０または１であり （ｉｖ）フルオロ，クロロまたはブロモ （ｖ）一般式−（Ｘ4）ｎ4−ＣＯＯＨで表されるカルボン酸 ここで，Ｘ4は，メチレン，エチレンまたはプロピレンから構成されるグループ
    から選択され，ｎ４は，０または１であり （ｖｉ）一般式−（Ｘ7）ｎ7−ＮＨＣＯＸ8または−（Ｘ9）ｎ9−ＣＯＮＸ10Ｘ1 1 で表されるアミド ここで，Ｘ7およびＸ9は，それぞれ，メチレン，エチレンおよびプロピレンから
    構成されるグループから独立して選択され，ｎ７およびｎ９は独立して０または
    １であり，Ｘ8，Ｘ10およびＸ11は，それぞれ水素，メチル，エチルおよびプロ
    ピルから構成されるグループから独立して選択され，またはＸ10およびＸ11は一
    緒になって，５員若しくは６員ヘテロ脂肪族環を形成し （ｖｉｉ）一般式−（Ｘ12）ｎ12−ＳＯ2ＮＸ13Ｘ14，で表されるスルホンアミ
    ド ここで，Ｘ12は，メチレン，エチレンまたはプロピレンから構成されるグループ
    から選択され，ｎ１２は０または１であり，Ｘ13およびＸ14は，それぞれ，水素
    ，メチル，エチル，プロピルおよびフェニルから構成されるグループから選択さ
    れ，上記メチル，エチル，プロピルおよびフェニルは，ハロゲン，ヒドロキシ，
    カルボキシレート，アミノ，ニトロおよびエステルから構成されるグループから
    独立して選ばれる１，２または３の置換基で任意に置換されており，またはＸ13 およびＸ14は一緒になって縮合二環を形成し， （ｖｉｉｉ）２つの隣接したＲ1グループは一緒になって２つの隣接Ａ，Ｂ，Ｄ
    またはＥと共に６員ヘテロ脂肪族環を形成し （ｂ）Ａ，Ｂ，ＤおよびＥは炭素であり， （ｃ）Ｘは窒素または酸素であり， （ｄ）ｍは，１または２であり，かつ （ｅ）ｑは２である， 請求項１記載の化合物。
  5. 【請求項５】 各Ｒ1がメチル，メトキシ，２−ヒドロキシエチル，フェニル，
    ２−メトキシフェニル，３−メトキシフェニル，４−メトキシフェニル，４−フ
    ルオロフェニル，４−クロロフェニル，４−ブロモフェニル，４−ヨードフェニ
    ル，３−カルボキシフェニル，ピリジル，−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ3，−Ｃ（Ｏ）Ｎ
    （ＣＨ3）2，−ＣＯＯＨ，−ＳＯ2ＮＨ（ＣＨ3），ＳＯ2ＮＨ（ＣＨ（ＣＨ3）2
    ），−ＳＯ2ＮＨ（Ｃ6Ｈ5），−ＳＯ2ＮＨ（３−クロロフェニル）および−ＳＯ 2 Ｎ（ＣＨ3）（３−クロロフェニル）であり，ｍは１または２である，請求項１
    記載の化合物。
  6. 【請求項６】前記化合物が，４−メチル−２−オキソ−３−（４−オキソ−２，
    ４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ〔３，４−ｃ〕ピロール−１−イルメチレン
    ）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸メチルアミド，２−
    オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ〔３，４−
    ｃ〕ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５
    −スルホン酸メチルアミド，１−［４−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ
    −インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，
    ４−ｃ］ピロール−４−オン，１−［５−メトキシ−２−オキソ−１，２−ジヒ
    ドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［
    ３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−［６−メトキシ−２−オキソ−１，２−
    ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラ
    ノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−［５−ブロモ−２−オキソ−１，２
    −ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピ
    ラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−（５−クロロ−２−オキソ−１，
    ２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−
    ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−［４−（２−ヒドロキシ−エチ
    ル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６
    ，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，２−オキソ
    −３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピ
    ロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スル
    ホン酸イソプロピルアミド，１−（２−オキソ−５−フェニル−１，２−ジヒド
    ロ−インドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３
    ，４−ｃ］ピロール−４−オン，２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，
    ７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，
    ３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸アミド，２オキソ−３−（ジ
    ヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸イソプロピルアミト，２−オキソ−
    ３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ２−オキソ−３−（
    ４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−
    １−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸イ
    ソプロピルアミト，Ｎ−［２−オキソ−３−（４−オクソ−２，４，６，７−テ
    トラヒドロピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−イルメチレン）−２，３−ジヒ
    ドロ−１Ｈ−インドール−６−イル］−アセトアミド，１−（２−オキソ−６−
    フェニル−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジ
    ヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−（５−フルオロ
    −２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−６，７
    −ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，２−オキソ−３
    −（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロー
    ル−ｌ−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−カルボン
    酸，２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドローピラノ［
    ３，４−ｃ］ピロール−ｌ−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インド
    ール−６−カルボン酸，１−（６−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドローイ
    ンドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−
    ｃ］ピロール−４−オン，１−［６−ブロモ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−
    インドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４
    −ｃ］ピロール−４−オン，１−［６−（２−メトキシーフェニル）−２−オキ
    ソ−１，２−ジヒドローインドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ
    −２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−［６−（３−メトキシ
    −フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチ
    ル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１
    −［６−（４−メトキシ−フェニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インド
    ール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］
    ピロール−４−オン，１−［６−（４−フロロ−フェニル）−２−オキソ−１，
    ２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−
    ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−（２−オキソ−６−ピリジン−
    ３−イル−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジ
    ヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−［５−（２，３
    −ジヒドロ−インドール−１−スルホニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロー
    インドール−３−イリデンメチル］−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４
    −ｃ］ピロール−４−オン，１−［５−（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−
    １スルフォニル）−２−オキソ−１，２−ジヒドローインドール−３−イリデン
    メチル］−６，７ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，
    １−［５−（３，４−ジヒドロ−１Ｈイソキノリン−２−スルフォニル）−２−
    オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−６，７ジヒド
    ロ−２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，２−オキソ−３−（４−
    オクソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−
    イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール５−スルホン酸（３−ク
    ロローフェニル）−メチル−アミド，１−（６−フルオロ−２−オキソ−１，２
    −ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピ
    ラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−（５−クロロ−４メチル−２オキ
    ソ−１，２−ジヒドローインドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ
    −２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，１−（７−クロロ−２オキ
    ソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ
    −２Ｈ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−４−オン，３−［２−オキソ−３−（
    ４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ〔３，４−ｃ〕ピロール−
    １−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−イル］−安息
    香酸，３−［２−オキソ−３−（４−オキソ−２，４，６，７−テトラヒドロ−
    ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−イリデンメチレン）−２，３−ジヒドロ−
    １Ｈ−インドール−６−イル］−安息香酸，２−オキソ−３−（４−オキソ−２
    ，４，６，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｃ］ピロール−１−イルメチレ
    ン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸（３−クロローフ
    ェニル）−アミド，１−（５−ブロモ−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ
    −インドール−３−イリデンメチル）−６，７−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，
    ４−ｃ］ピロール−４−オン，１−（２−オキソ−５−フェニル−１，２−ジヒ
    ドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピ
    ロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４−オン，１−（２−オキソ−６−フェニル−１
    ，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，５，６，７−テトラ
    ヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４−オン，１−（６−ブロモ−２−オ
    キソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，５，６，７
    −テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４−オン，１−（６−クロロ
    −２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，５
    ，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４−オン，２−オキ
    ソ−３−（４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４
    −ｃ］ピリジン−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−
    ５−スルホン酸ジメチルアミド，２−オキソ−３−（４−オキソ−４，５，６，
    ７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジンーｌ−イルメチレン）
    −２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５カルボン酸−ジメチルアミド，１−
    ［２−オキソ−５−（ピロリジン−１−カルボニル）−１，２−ジヒドロ−イン
    ドール−３−イリデンメチル］−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，
    ４−ｃ］ピリジン−４−オン，１−［５−（モルフォリン−４−カルボニル）−
    ２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル］−２，５，
    ６，７−テトタヒドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４−オン，１−［４−
    （２−ヒドロキシ−エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３
    −イリデンメチル］−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ−［３，４−ｃ］
    ピリジン−４−オン，１−（５−メトキシ−２オキソ−１，２−ジヒドロ−イン
    ドール−３−イリデンメチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピロロ［３，
    ４−ｃ］ピリジン−４−オン，１−（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒ
    ドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，５，６，７−テトラヒドロ−ピ
    ロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４−オン，１−（５−ブロモ−２−オキソ−１，
    ２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−２，５，６，７−テトラヒ
    ドロ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−４−オン，２−オキソ−３−（４−オキ
    ソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１
    −イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−カルボン酸，２
    −オキソ−３−（４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［
    ３，４−ｃ］ピリジン−１−イルメチレン）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インド
    ール−５−スルホン酸アミド，２−オキソ−３−（４−オキソ−４，５，６，７
    −テトラヒドロ−２Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］ピリジン−１−イルメチレン）−
    ２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−５−スルホン酸メチルアミド，および 【化３】 から構成されるグループから選ばれる，請求項１記載の化合物。
  7. 【請求項７】 次式： 【化４】 から構成されるグループから選ばれる化合物。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の化合物および薬学的に許容しうる賦形剤を含む
    医薬組成物。
  9. 【請求項９】 請求項３に記載の化合物および薬学的に許容しうる賦形剤を含む
    医薬組成物。
  10. 【請求項１０】 請求項６に記載の化合物および薬学的に許容しうる賦形剤を含
    む医薬組成物。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の化合物および薬学的に許容しうる賦形剤を含
    む医薬組成物を投与することを含む，生物において蛋白質キナーゼにより媒介さ
    れる疾病を治療する方法。
  12. 【請求項１２】 請求項３に記載の化合物および薬学的に許容しうる賦形剤を含
    む医薬組成物を投与することを含む，生物において蛋白質キナーゼにより媒介さ
    れる疾病を治療する方法。
  13. 【請求項１３】 請求項６に記載の化合物および薬学的に許容しうる賦形剤を含
    む医薬組成物を投与することを含む，生物において蛋白質キナーゼにより媒介さ
    れる疾病を治療する方法。
  14. 【請求項１４】 生物がヒトであり，疾病が癌である，請求項１３に記載の方法
    。
  15. 【請求項１５】 癌が，扁平上皮癌，星状細胞腫，カポジ肉腫，神経膠芽細胞腫
    ，肺癌，膀胱癌，脳頚部癌，黒色腫，卵巣癌，前立腺癌，乳癌，小細胞肺癌，神
    経膠腫，結腸直腸癌，尿生殖器癌および胃腸癌から構成されるグループから選ば
    れる，請求項１４に記載の方法。
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