JP3677501B2 - 蛋白質キナーゼ阻害剤としての3−(4−アミドピロール−2−イルメチリデン)−2−インドリノン誘導体 - Google Patents
蛋白質キナーゼ阻害剤としての3−(4−アミドピロール−2−イルメチリデン)−2−インドリノン誘導体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3677501B2 JP3677501B2 JP2002565978A JP2002565978A JP3677501B2 JP 3677501 B2 JP3677501 B2 JP 3677501B2 JP 2002565978 A JP2002565978 A JP 2002565978A JP 2002565978 A JP2002565978 A JP 2002565978A JP 3677501 B2 JP3677501 B2 JP 3677501B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- alkyl
- hydrogen
- hydroxy
- well
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 0 Cc1c(C2*C2)[n]c(C)c1C(N1C=*=C1)=O Chemical compound Cc1c(C2*C2)[n]c(C)c1C(N1C=*=C1)=O 0.000 description 2
- YSGPOQDTHDLUGE-ZETCQYMHSA-N NC[C@@H](CN1CCOCC1)O Chemical compound NC[C@@H](CN1CCOCC1)O YSGPOQDTHDLUGE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- DGVQCMQXVSSBRV-KXEKANOJSA-N CCCCC(/C(/c1c(C)ccc(Cl)c1)=C\c1c(C)c(C(NC[C@@H](CN2CCOCC2)O)=O)c(C)[nH]1)O Chemical compound CCCCC(/C(/c1c(C)ccc(Cl)c1)=C\c1c(C)c(C(NC[C@@H](CN2CCOCC2)O)=O)c(C)[nH]1)O DGVQCMQXVSSBRV-KXEKANOJSA-N 0.000 description 1
- CGTRPRJNILQJMW-BEWREHSGSA-N Cc1c(/C=C(/c2cc(F)ccc2N2)\C2=O)[nH]c(C)c1C(N(C)C[C@@H](CN1CCOCC1)O)=O Chemical compound Cc1c(/C=C(/c2cc(F)ccc2N2)\C2=O)[nH]c(C)c1C(N(C)C[C@@H](CN1CCOCC1)O)=O CGTRPRJNILQJMW-BEWREHSGSA-N 0.000 description 1
- IQTKIDMHPBIXQC-UHFFFAOYSA-N Cc1c(C2OC2)[nH]c(C)c1C([n]1cncc1)=O Chemical compound Cc1c(C2OC2)[nH]c(C)c1C([n]1cncc1)=O IQTKIDMHPBIXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYGFTBXVXVMTGB-UHFFFAOYSA-N O=C1Nc2ccccc2C1 Chemical compound O=C1Nc2ccccc2C1 JYGFTBXVXVMTGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
- C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
- C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D471/04—Ortho-condensed systems
Description
本出願は,米国特許仮出願60/312,361(2001年8月15日出願)および60/268,683(2001年2月15日出願)に基づく優先権を主張する。これらの出願の全内容を本明細書の一部としてここに引用する。
本発明は,蛋白質キナーゼ("PK")の活性を調節するある種の3−(4−アミドピロール−2−イルメチリデン)−2−インドリノン誘導体に関する。したがって,本発明の化合物は,異常なPK活性に関連する疾患の治療に有用である。これらの化合物を含む医薬組成物,これらの化合物を含む医薬組成物を用いて疾病を治療する方法,およびこれらを製造する方法も開示される。
R1は,水素,ハロ,アルキル,ハロアルコキシ,シクロアルキル,ヘテロ脂環式,ヒドロキシ,アルコキシ,−C(O)R8,−NR9R10および−C(O)NR12R13からなる群より選択され;
R2は,水素,ハロ,アルキル,トリハロメチル,ヒドロキシ,アルコキシ,シアノ,−NR9R10,−NR9C(O)R10,−C(O)R8,−S(O)2NR9R10および−SO2R14(ここで,R14は,アルキル,アリール,アラルキル,ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである)からなる群より選択され;
R3,R4およびR5は,独立して,水素またはアルキルであり;
Zは,アリール,ヘテロアリール,複素環,または−NR15R16であり,ここで,R15およびR16は,独立して,水素またはアルキルであり;またはR15およびR16は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R6は,水素またはアルキルからなる群より選択され;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され;
R8は,ヒドロキシ,アルコキシ,およびアリールオキシからなる群より選択され;
R9およびR10は,独立して,水素,アルキル,シアノアルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され;または
R9およびR10は,一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R12およびR13は,独立して,水素,アルキル,ヒドロキシアルキル,およびアリールからなる群より選択され;またはR12およびR13は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノを形成し;
R17は,ヒドロキシ,アルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される]
の化合物またはその薬学的に許容しうる塩である。
R1は,水素,ハロ,アルキル,シクロアルキル,ヘテロ脂環式,ヒドロキシ,アルコキシ,−C(O)R8,−NR9R10および−C(O)NR12R13からなる群より選択され;
R2は,水素,ハロ,アルキル,トリハロメチル,ヒドロキシ,アルコキシ,シアノ,−NR9R10,−NR9C(O)R10,−C(O)R8,−S(O)2NR9R10および−SO2R14(ここで,R14は,アルキル,アリール,アラルキル,ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである)からなる群より選択され;
R3,R4およびR5は,独立して,水素またはアルキルであり;
Zは,アリール,ヘテロアリール,複素環,または−NR15R16であり,ここで,R15およびR16は,独立して,水素またはアルキルであり;またはR15およびR16は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R6は,水素またはアルキルからなる群より選択され;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され;
R8は,ヒドロキシ,アルコキシ,およびアリールオキシからなる群より選択され;
R9およびR10は,独立して,水素,アルキル,シアノアルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され;または
R9およびR10は,一緒になってヘテロシクロ基を形成し;
R12およびR13は,独立して,水素,アルキルおよびアリールからなる群より選択され,またはR12およびR13は,これらが結合している窒素原子と一緒になって複素環を形成し;
R17は,ヒドロキシ,アルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される,
式Iの化合物またはその薬学的に許容しうる塩である。
R1,R3,R4,およびR5は水素であり;
R2は,フルオロであり,これはインドリノン環の5位に存在し;
Zはモルホリン−4−イルであり;
R6およびR7はメチルである]
の化合物である。
好ましくは,*Cの立体化学は(S)である。
Rは,水素またはアルキルであり;
R1は,水素,ハロ,アルキル,ハロアルコキシ,シクロアルキル,ヘテロ脂環式,ヒドロキシ,アルコキシ,−C(O)R8,−NR9R10および−C(O)NR12R13からなる群より選択され;
R2は,水素,ハロ,アルキル,トリハロメチル,ヒドロキシ,アルコキシ,シアノ,−NR9R10,−NR9C(O)R10,−C(O)R8,−S(O)2NR9R10および−SO2R14(ここで,R14は,アルキル,アリール,アラルキル,ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである)からなる群より選択され;
R3,R4およびR5は,独立して,水素またはアルキルであり;
Zは,アリール,ヘテロアリール,複素環,または−NR15R16であり,ここで,R15およびR16は,独立して,水素またはアルキルであり;またはR15およびR16は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R6は,水素またはアルキルからなる群より選択され;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され;
R8は,ヒドロキシ,アルコキシ,およびアリールオキシからなる群より選択され;
R9およびR10は,独立して,水素,アルキル,シアノアルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され;または
R9およびR10は,一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R12およびR13は,独立して,水素,アルキル,ヒドロキシアルキル,およびアリールからなる群より選択され;またはR12およびR13は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノを形成し;
R17は,ヒドロキシ,アルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択される]
の化合物またはその薬学的に許容しうる塩である。
特に記載しない限り,明細書および特許請求の範囲において用いられる以下の用語は,以下に議論される意味を有する。
発明の概要においては最も広い定義を記載したが,以下に記載されるある種の式(I)の化合物が好ましい。
R6は,水素およびアルキル,好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,tert−ブチル,イソブチル,またはn−ブチルからなる群より選択され,より好ましくは水素またはメチルであり;および
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され,ここでR17は,ヒドロキシ,アルキル,シクロアルキル,アリール,またはヘテロアリールであり,より好ましくは,R7は,水素,メチル,エチル,イソプロピル,n−ブチル,イソブチルまたはtert−ブチル,フェニル,ベンゾイル,アセチルまたはカルボキシであり,さらにより好ましくは,メチル,水素またはフェニルである。
R6は,水素およびアルキル,好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,tert−ブチル,イソブチル,またはn−ブチルからなる群より選択され,より好ましくは水素またはメチルであり,最も好ましくはメチルであり;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され,ここでR17は,ヒドロキシ,アルキルまたはアリールであり,およびR7は,より好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,n−ブチル,イソブチルまたはtert−ブチル,フェニル,ベンゾイル,アセチルまたはカルボキシであり,さらに好ましくは,メチル,水素またはフェニルであり;および
R3,R4,およびR5は水素であり;および
Zはアリールである。
R6は,水素およびアルキル,好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,tert−ブチル,イソブチル,またはn−ブチルからなる群より選択され,より好ましくは水素またはメチルであり,最も好ましくはメチルであり;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され,ここで,R17は,ヒドロキシ,アルキルまたはアリールであり,およびR7は,より好ましくは,水素,メチル,エチル,イソプロピル,n−ブチル,イソブチルまたはtert−ブチル,フェニル,ベンゾイル,アセチルまたはカルボキシであり,さらに好ましくはメチル,水素またはフェニルであり,最も好ましくはメチルであり;および
R3,R4,およびR5は水素であり;および
Zはヘテロアリールであり,好ましくはトリアジニル,テトラゾリル,イミダゾリル,ピリジニル,ピリミジニルまたはピラジニルである。
R6は,水素およびアルキル,好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,tert−ブチル,イソブチル,またはn−ブチルからなる群より選択され,より好ましくは水素またはメチルであり,最も好ましくはメチルであり;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され,ここで,R17は,ヒドロキシ,アルキルまたはアリールであり,およびR7は,より好ましくは,水素,メチル,エチル,イソプロピル,n−ブチル,イソブチルまたはtert−ブチル,フェニル,ベンゾイル,アセチルまたはカルボキシであり,さらに好ましくはメチル,水素またはフェニルであり;および
R3,R4,およびR5は水素であり;および
Zは複素環である。
R6は,水素およびアルキル,好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,tert−ブチル,イソブチル,またはn−ブチルからなる群より選択され,より好ましくは水素またはメチル,最も好ましくはメチルであり;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され,ここで,R17は,ヒドロキシ,アルキルまたはアリールであり,およびR7は,より好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,n−ブチル,イソブチルまたはtert−ブチル,フェニル,ベンゾイル,アセチルまたはカルボキシであり,さらに好ましくは,メチル,水素またはフェニルであり,最も好ましくはメチルであり;および
R3,R4,およびR5は水素であり;および
Zは−NR15R16であり,ここで,R15およびR16は,一緒になってヘテロシクロアミノ,好ましくはピペリジン−1−イル,N−メチルピペリジン−1−イル,ピペラジン−1−イル,N−メチルピロリジン−1−イル,ピロリジン−1−イル,モルホリン−4−イル,チオモルホリン−4−イル,チオモルホリノ−1−オキシド,チオモルホリノ−1,1−ジオキシド,4−エチルオキシカルボニルメチルピペラジン−1−イル,3−オキソピペラジン−1−イル,イミダゾリジン−1−イル−2−オン,ピロリジン−1−イル−2−オン,2−オキソホモピペラジン−1−イル,またはテトラヒドロピリミジン−1−イル−2−オン,より好ましくはモルホリン−4−イルを形成する。
R6は,水素およびアルキル,好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,tert−ブチル,イソブチル,またはn−ブチルからなる群より選択され,より好ましくは水素またはメチルであり;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17からなる群より選択され,ここで,R17は,ヒドロキシ,アルキルまたはアリールであり,およびR7は,より好ましくは水素,メチル,エチル,イソプロピル,n−ブチル,イソブチルまたはtert−ブチル,フェニル,ベンゾイル,アセチルまたはカルボキシであり,さらに好ましくはメチル,水素またはフェニルであり;および
R3,R4,およびR5は水素であり;および
Zは−NR15R16であり,ここで,R15およびR16は,アルキルであり,好ましくはジエチルアミノ,ジメチルアミノ,またはエチルアミノである。
R1は,水素,アルキル,−C(O)NR12R13,未置換シクロアルキルであり,好ましくは水素,3,4−ジメトキシフェニルアミノカルボニル,4−メトキシ−3−クロロフェニル−アミノカルボニルであり,さらに好ましくは水素またはメチルであり,最も好ましくは水素であり;および
R2は,水素,シアノ,ハロ,低級アルコキシ,または−S(O)2NR9R10であり,ここで,R9は水素であり,およびR10は,水素,アリールまたはアルキルであり,これはオキシインドール環の5位に存在し,好ましくはR2は,水素,クロロ,ブロモ,フルオロ,メトキシ,エトキシ,フェニル,ジメチルアミノスルホニル,3−クロロフェニル−アミノスルホニル,カルボキシ,メトキシ,アミノスルホニル,メチルアミノスルホニル,フェニルアミノスルホニル,ピリジン−3−イル−アミノスルホニル,ジメチルアミノスルホニル,イソプロピルアミノ−スルホニルであり,より好ましくは水素,フルオロ,またはブロモである。最も好ましくは,R2はフルオロであり,これはインドリノン環の5位に存在する。
その触媒活性が本発明の化合物により調節されるPKには,蛋白質チロシンキナーゼが含まれ,これには2つのタイプがある:レセプターチロシンキナーゼ(RTK)および細胞性チロシンキナーゼ(CTK),およびセリン−トレオニンキナーゼ(STK)である。RTKに媒介されるシグナル伝達は,特定の成長因子(リガンド)との細胞外相互作用により開始され,次にレセプターが二量化し,固有の蛋白質チロシンキナーゼ活性が過渡的に刺激され,リン酸化する。このことにより,内部シグナル伝達分子用の結合部位が形成され,種々の細胞質シグナリング分子との複合体の形成につながり,これは,適切な細胞応答(例えば,細胞分裂,細胞外微小環境に及ぼす代謝的効果等)を促進する。Schlessinger and Ullrich,1992,Neuron 9:303−391を参照。
本発明の化合物またはその薬学的に許容しうる塩は,そのままでヒト患者に,または,上述の物質が適当な担体または賦形剤と混合されている医薬組成物中で投与することができる。薬剤の処方および投与の手法は,"Remington’s Pharmacological Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA.,の最新版に見いだすことができる。
以下の一般的方法論を用いて本発明の化合物を製造することができる:
適切に置換された2−オキシインドール(1当量),適切に置換された3−カルボキシ−5−ホルミルピロール(1.2当量)および塩基(0.1当量)を溶媒(1−2ml/mmol2−オキシインドール)中で混合し,次に混合物を約2から約12時間加熱する。冷却した後,形成する沈澱物を濾過し,冷エタノールまたはエーテルで洗浄し,真空乾燥して,対応する5−(2−オキソ−1,2−ジヒドロインドール−(3Z)−イリデンメチル)−1−H−ピロール−3−カルボン酸を得る。沈澱物が形成しない場合には,反応混合物を濃縮し,残渣をジクロロメタン/エーテル中で砕き,得られる固体を濾過により回収し,乾燥する。生成物は任意にクロマトグラフィーによりさらに精製してもよい。
実施例1
5−[5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−ンドール−(3Z)−イリデン−メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸の合成
工程1
ジメチルホルムアミド(25mL,3eq.)を氷浴中で撹拌しながら冷却した。これにPOCl3(1.1eq.,10.8mL)を加えた。30分後,DMF(2M,40mL)中の3,5−ジメチル−4−エチルエステルピロール(17.7g,105.8mmol)の溶液を反応液に加え,撹拌を続けた。2時間後,反応液を水(250mL)で希釈し,1N水性NaOHでpH=11に塩基性にした。白色固体を濾過により除去し,水,次にヘキサンですすぎ,乾燥して,5−ホルミル−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸エチルエステル(19.75g,95%)を褐色固体として得た。1H NMR(360MHz,DMSO−d6)δ12.11(brs,1H,NH),9.59(s,1H,CHO),4.17(q,J=6.7Hz,2H,OCH 2CH3),2.44(s,3H,CH 3),2.40(s,3H,CH 3),1.26(d,J=6.7Hz,3H,OCH2CH 3)
工程2
5−ホルミル−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸エチルエステル(2g,10mmol)をメタノール(3mL)および水(10mL)に溶解した水酸化カリウム(3g,53mmol)の溶液に加えた。混合物を3時間還流し,室温に冷却し,6N塩酸でpH3に酸性にした。固体を濾過により回収し,水で洗浄し,真空オーブン中で一夜乾燥して,5−ホルミル−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(1.6g,93%)を得た。1H NMR(300MHz,DMSO−d6)δ12.09(s,br,2H,NH&COOH),9.59(s,1H,CHO),2.44(s,3H,CH3),2.40(s,3H,CH3)
工程3
5−フルオロイサチン(8.2g,49.7mmol)を50mLのヒドラジン水和物に溶解し,1時間還流した。次に反応混合物を氷水に注加した。次に沈殿物を濾過し,水で洗浄し,真空オーブンで乾燥して,5−フルオロ−2−オキシインドール(7.5g)を得た。
工程4
エタノール(3mL)中の5−フルオロオキシインドール(100mg,0.66mmol),5−ホルミル−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(133mg,0.79mmol),および10滴のピペリジンの反応混合物を60℃で一夜撹拌し,濾過した。固体を1Mの水性塩酸溶液,水で洗浄し,乾燥して,5−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(201mg,定量的)を黄色固体として得た。MS m/z(相対強度,%)299([M−1]+.,100)
5−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデン−メチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(3−ジエチルアミノ−2−ヒドロキシ−プロピル)−アミドの合成
工程1
2−クロロメチルオキシラン(95g,1.03mole)に30℃で水(3.08g,0.17mole)およびジエチルアミン(106.2mL,1.03mole)の混合物を加えた。次に反応混合物を28−35℃で6時間撹拌し,20−25℃に冷却して,1−クロロ−3−ジエチルアミノ−プロパン−2−オールを得た。
工程2
78mLの水中の水酸化ナトリウム(47.9g,1.2mole)の溶液に1−クロロ−3−ジエチルアミノ−プロパン−2−オールを加えた。生成物を20−25℃で1時間撹拌し,178mLの水で希釈し,エーテルで2回抽出した。合わせたエーテル溶液を固体水酸化カリウムで乾燥し,蒸発させて,135gの粗生成物を得,これを分留して,純粋なグリシジルジエチルアミン(98g,76%)を油状物として得た。
工程3
25%(w/w)の水酸化アンモニウム(25mL,159mmole)の氷冷溶液にグリシジルジエチルアミン(3.2g,24.8mmol)を10分間かけて滴加した。反応混合物を0−5℃で1時間撹拌し,次に室温で14時間撹拌した。得られた反応混合物を蒸発させ,蒸留(84−90℃,500−600mT)して,1−アミノ−3−ジエチルアミノ−プロパン−2−オール(3.3g,92%)を得た。MS m/z147([M+1]+.)
工程4
1.0mLのDMF中の5−ホルミル−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(100mg,0.43mmol),EDC(122.7mg,0.64mmol)およびHOBt(86.5mg,0.64mmol)の溶液に1−アミノ−3−ジエチルアミノ−プロパン−2−オール(93.2mg,0.64mmol)を加えた。得られた反応溶液を室温で一夜撹拌し,蒸発させた。残渣を10mLの水に懸濁し,濾過した。固体を飽和炭酸水素ナトリウムおよび水で洗浄し,高真空オーブンで一夜乾燥して,粗生成物を得,これをカラムクロマトグラフィーで精製し,トリエチルアミンを含む6%メタノール−ジクロロメタン(2滴/100mLの6%メタノール−ジクロロメタン)で溶出して,5−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(3−ジエチルアミノ−2−ヒドロキシ−プロピル)−アミド(62mg,34%)を黄色固体として得た。1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ13.70(s,1H,NH−1’),10.90(s,1H,NH−1),7.76(dd,J=2.38,9.33Hz,1H,H−4),7.72(s,1H,ビニル−H),7.60(m,br.,1H,CONHCH2CH(OH)−CH2N(C2H5)2−4’),6.93(dt,J=2.38,8.99Hz,1H,H−5),6.85(dd,J=4.55,8.99Hz,1H,H−6),3.83(m,br,1H,OH),3.33(m,4H),2.67(m,br,5H),2.46(s,3H,CH3),2.44(s,3H,CH3),1.04(m,br,6H,CH3x2).MS m/z(相対強度,%)427([M+1]+.,100)
5−[5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデン−メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−モルホリン−4−イル−プロピル)−アミドの合成
工程1
エタノール(50mL)中のモルホリン(2.6mL,30mmol)およびエピクロロヒドリン(2.35ml,30mmol)の混合物を70℃で一夜撹拌した。溶媒を除去した後,残渣を塩化メチレン(50mL)で希釈した。沈殿した透明固体を真空濾過により回収して,1−クロロ−3−モルホリン−4−イル−プロパン−2−オール(2.0g,37%)を得た。1H NMR(DMSO−d6)δ3.49(t,J=4.8Hz,2H),3.60(t,J=4.6Hz,2H),3.75(m,4H,2xCH2),4.20(dd,J=5.2,12Hz,2H),4.54(m,2H),4.62(m,1H,CH),6.64(d,J=6.4Hz,1H,OH).MS(m/z)180.2(M+1)
工程2
1−クロロ−3−モルホリン−4−イル−プロパン−2−オール(2.0g,11mmol)をメタノール中NH3(25重量,20mL)の溶液で室温で処理した。窒素を反応混合物中に吹き込んでアンモニアを除去した。溶媒を蒸発させて,1−アミノ−3−モルホリン−4−イル−プロパン−2−オール(2.0g,91%)の塩酸塩を得た。1H NMR(DMSO−d6)δ2.30(d,J=6.0Hz,2H),2.36(m,4H,NCH2),2.65(dd,J=8.4,12.8Hz,1H),2.91(dd,J=3.6,12.8Hz,1H),3.52(m,4H,OCH2),3.87(m,1H,CH),5.32(s,1H,OH),8.02(brs.,3H,NH3 +).MS(m/z)161.1(M+1)
工程3
5−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(120mg,0.4mmol)を1−アミノ−3−モルホリン−4−イル−プロパン−2−オール(74mg,0.48mmol)と縮合させて,5−[5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−モルホリン−4−イル−プロピル)−アミド(65mg,36%)を沈殿させた。母液を蒸発乾固させ,残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して,追加の2N(70mg,39%)を得た。1H NMR(DMSO−d6)δ2.28(m,1H),2.32(m,1H),2.40(m,4H),2.40,2.42(2xs,6H,2xCH3),3.15(s,1H),3.31(m,1H),3.55(m,4H),3.78(m,1H),4.73(brs,1H,OH),6.82(dd,J=4.5,8.4Hz,1H),6.90(td,2J=2.8,3J=10.0Hz,1H),7.53(m,1H),7.70(s,1H),7.74(dd,J=2.0,9.6Hz,1H)(芳香族およびビニル),10.87(s,1H,CONH),13.66(s,1H,NH).LC−MS(m/z)441.4(M−1)
機械的撹拌,熱電対および滴下漏斗を備えた1Lの3ツ口丸底フラスコに,モルホリン(91.5g,91.5ml,1.05mole,1.0eq.)および200mlのメタノールを入れた。R−エピクロロヒドリン(100g,84.5ml,1.08mole,1.03eq.)を滴下漏斗から約30分間かけて加えながら溶液を急速に撹拌した。温度をモニターし,フラスコの温度が27℃に達したときに,反応液を氷水浴で冷却した。透明溶液を18時間撹拌した。反応はGCにより測定した(5滴の反応混合物を1mlのエタノールで希釈し,15mDB−5キャピラリーGCカラムに注入し,以下のパラメータで運転した:インジェクター250℃,検出器250℃,初期オーブン温度28℃,10℃/分で250℃に加熱)。反応が完了したとき,3%未満のモルホリンが残存していた。溶液を10℃に冷却し,温度を15℃未満に保持しながらメタノール(233g,1.08mole,247ml)中のナトリウムメトキシドの25重量%溶液を滴加した。得られた白色スラリーを10−15℃で2時間撹拌し,GCにより上述の条件を用いて調べた。クロロヒドリンは認められなかった。混合物を50℃の浴およびフルハウスバキュームを用いて回転蒸発器で濃縮した。得られた混合物を水(500ml)および塩化メチレンで希釈した。相を分離し,水性相を塩化メチレン(500ml)で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し,濃縮して,透明な無色油状物を得た。これにより,145g,収率97%の1,2−エポキシ−3−モルホリン−4−イルプロパンを得た。1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ3.3(dd,4H),3.1(m,1H),2.6(dd,1H),2.5(dd,1H),2.4(m,4H),2.2(dd,2H);13C NMR(100MHz,DMSO−d6)δ65.4,60.1,53.1,48.9,43.4
2,4−ジメチル−5−[2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−モルホリン−4−イル−プロピル)−アミドの合成
5−(2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(113mg,0.4mmol)を1−アミノ−3−モルホリン−4−イル−プロパン−2−オール(74mg,0.48mmol)と縮合させて,2,4−ジメチル−5−[2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−モルホリン−4−イル−プロピル)−アミド(77mg,45.3%)を沈殿させた。1H NMR(DMSO−d6)δ2.27(m,1H),2.32(m,1H),2.40(m,4H),2.40,2.42(2xs,6H,2xCH3),3.15(s,1H),3.32(m,1H),3.55(m,4H),3.77(m,1H),4.74(d,J=4.8Hz,1H,OH),6.86(d,J=7.6Hz,1H),6.96(t,J=7.2Hz,1H),7.10(t,J=7.6Hz,1H),7.49(t,J=5.6Hz,1H),7.61(s,1H),7.77(d,J=8.0Hz,1H)(芳香族およびビニル),10.88(s,1H,CONH),13.62(s,1H,NH).LC−MS(m/z)425.4(M+1)
5−[5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデン−メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−モルホリン−4−イル−プロピル)−アミドの合成
5−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(126.6mg,0.4mmol)を1−アミノ−3−モルホリン−4−イル−プロパン−2−オール(74mg,0.48mmol)と縮合させて,5−[5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−モルホリン−4−イル−プロピル)−アミド(107mg,58%)を沈殿させた。1H NMR(DMSO−d6)δ2.29(m,1H),2.33(m,1H),2.39(m,4H),2.40,2.42(2xs,6H,2xCH3),3.15(s,1H),3.37(m,1H),3.55(m,4H),3.77(m,1H),4.74(d,J=4.8Hz,1H,OH),6.85(d,J=8.4Hz,1H),7.11(dd,J=2.0,8.0Hz,1H),7.53(t,J=5.6Hz,1H),7.75(s,1H),7.97(d,J=2.0Hz,1H)(芳香族およびビニル),10.99(s,1H,CONH),13.62(s,1H,NH).LC−MS(m/z)457.4(M−1)
5−[5−ブロモ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデン−メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−モルホリン−4−イル−プロピル)−アミドの合成
5−(5−ブロモ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(72.2mg,0.2mmol)を1−アミノ−3−モルホリン−4−イル−プロパン−2−オール(38mg,0.24mmol)と縮合させて,5−[5−ブロモ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−モルホリン−4−イル−プロピル)−アミド(55mg,55%)を沈殿させた。1H NMR(DMSO−d6)δ2.27(m,1H),2.32(m,1H),2.39(m,4H),2.41,2.42(2xs,6H,2xCH3),3.13(s,1H),3.35(m,1H),3.55(m,4H),3.77(m,1H),4.74(d,J=4.4Hz,1H,OH),6.80(d,J=8.4Hz,1H),7.24(dd,J=2.0,8.0Hz,1H),7.51(t,J=5.6Hz,1H),7.76(s,1H),8.09(d,J=2.0Hz,1H)(芳香族およびビニル),10.99(s,1H,CONH),13.62(s,1H,NH).LC−MS(m/z)503.4(M−1)
2,4−ジメチル−5−[2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデン−メチル]−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−アミドの合成
工程1
エタノール(50mL)中の3−[1,2,3]トリアゾール(2.0g,29mmol),エピクロロヒドリン(3.4ml,43.5mmol)およびN,N−ジイソプロピル−エチルアミン(2.6mL,15mmol)の混合物を室温で一夜撹拌した。溶媒を除去した後,残渣をフラッシュクロマトグラフィー(CH2Cl2/CH3OH=100/1−100/2−100/4)により精製して,1−クロロ−3−(1,2,3)−トリアゾール−2−イルプロパン−2−オール(2.1g,45%)を得た。1H NMR(CDCl3)δ3.52(m,2H,OHおよびCH2),3.60(dd,J=5.2,11.2Hz,1H),4.36(m,1H,CH),4.68(m,2H),7.67(s,2H).MS(m/z)162.1(M+1)および1−クロロ−3−(1,2,3)トリアゾール−1−イルプロパン−2−オール(2.3g,49%).1H NMR(CDCl3)δ3.56(s,1H),3.57(s,1H),4.35(m,1H),4.53(dd,J=7.2,14Hz,1H),4.67(dd,J=3.8,14Hz,1H),7.67(s,1H),7.71(s,1H).MS(m/z)162.1(M+1)
工程2
1−クロロ−3(1,2,3)トリアゾール−1−イルプロパン−2−オール(2.3g,13mmol)を密封圧力容器中でメタノール(25重量%,20mL)中のNH3の溶液で60℃で一夜処理した。室温に冷却した後,反応混合物中に窒素を曝気して,アンモニアを除去した。溶媒を蒸発させて,1−アミノ−3−(1,2,3)トリアゾール−1−イルプロパン−2−オール(2.57g,100%)の塩酸塩を得た。1H NMR(DMSO−d6)δ2.68(dd,J=8.8,12.8Hz,1H),2.97(dd,J=3.6,12.8Hz,1H),4.15(m,1H),4.44(dd,J=6.4,14Hz,1H),4.57(dd,J=4.6,14Hz,1H),5.95(d,J=5.2Hz,1H,OH),7.77(s,1H),8.01(brs.,3H,NH3 +),8.12(s,1H).MS(m/z)143.1(M+1)
工程3
5−(2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(113mg,0.4mmol)を1−アミノ−3(1,2,3)トリアゾール−1−イル−プロパン−2−オール(85mg,0.48mmol)と縮合させて,2,4−ジメチル−5−[2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−アミド(70mg,41%)を沈殿させた。1H NMR(DMSO−d6)δ2.45,2.48(2xs,6H,2xCH3),3.35(m,2H),4.02(m,1H),4.32(dd,J=7.6,14Hz,1H),4.53(dd,J=3.4,14Hz,1H),5.43(d,J=5.6Hz,1H,OH),6.91(d,J=7.6Hz,1H),7.01(t,J=7.6Hz,1H),7.15(t,J=8.0Hz,1H),7.66(s,1H),7.12(t,J=5.6Hz,1H),7.74(s,1H),7.77(d,J=7.6Hz,1H),8.11(s,1H),10.93(s,1H,CONH),13.68(s,1H,NH).LC−MS(m/z)405.4(M−1)
5−[5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデン−メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−アミドの合成
5−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(120mg,0.4mmol)を1−アミノ−3(1,2,3)トリアゾール−1−イル−プロパン−2−オール(85mg,0.48mmol)と縮合させて,5−[5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−アミド(100mg,62%)を沈殿させた。1H NMR(DMSO−d6)δ2.42,2.44(2xs,6H,2xCH3),3.27(m,2H),3.98(m,1H),4.27(dd,J=7.6,14Hz,1H),4.50(dd,J=3.4,13.6Hz,1H),5.38(d,J=5.6Hz,1H,OH),6.82(dd,J=4.4,8.4Hz,1H),6.91(td,2J=2.4,3J=9.0Hz,1H),7.70(m,3H),7.75(dd,J=2.4,9.2Hz,1H),8.11(s.1H),10.93(s,1H,CONH),13.73(s,1H,NH).LC−MS(m/z)423.4(M−1)
5−[5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデン−メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−アミドの合成
5−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(126.6mg,0.4mmol)を1−アミノ−3(1,2,3)トリアゾール−1−イル−プロパン−2−オール(85mg,0.48mmol)と縮合させて,5−[5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−アミド(48mg,27%)を沈殿させた。1H NMR(DMSO−d6)δ2.42,2.44(2xs,6H,2xCH3),3.27(m,2H),3.99(m,1H),4.28(dd,J=7.8,14Hz,1H),4.51(dd,J=3.2,14Hz,1H),5.39(d,J=6.0Hz,1H,OH),6.85(d,J=8.4Hz,1H),7.12(dd,J=2.0,8.2Hz,1H),7.70(m,2H),7.74(s,1H),7.97(d,J=2.0Hz,1H),8.07(s,1H),10.99(s,1H,CONH),13.65(s,1H,NH).LC−MS(m/z)439.4(M−1)
5−[5−ブロモ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデン−メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−アミドの合成
5−(5−ブロモ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(144.4mg,0.4mmol)を1−アミノ−3(1,2,3)トリアゾール−1−イル−プロパン−2−オール(85mg,0.48mmol)と縮合させて,5−[5−ブロモ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−(3Z)−イリデンメチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸(2−ヒドロキシ−3−[1,2,3]トリアゾール−1−イル−プロピル)−アミド(130mg,67%)を沈殿させた。1H NMR(DMSO−d6)δ2.41,2.44(2xs,6H,2xCH3),3.27(m,2H),3.99(m,1H),4.28(dd,J=7.6,14Hz,1H),4.50(dd,J=3.6,14Hz,1H),5.40(d,J=5.6Hz,1H,OH),6.81(d,J=8.4Hz,1H),7.24(dd,J=2.0,8.0Hz,1H),7.70(m,2H),7.77(s,1H),8.07(s.1H),8.10(d,J=1.6Hz,1H),11.0(s,1H,CONH),13.64(s,1H,NH).LC−MS(m/z)485.4(M−1)
5−(5−ブロモ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸,5−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸,5−(2−オキソ−1,2−ジヒドロ−インドール−3−イリデンメチル)−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸の合成は,“PYRROLE SUBSTITUTED 2−INDOLINONE−−PROTEIN KINASE INHIBITORS”と題する米国特許出願09/783,264(本出願人の出願,2001年2月14日出願)に記載されており,その開示をすべて本明細書の一部としてここに引用する。
1−アミノ−3−(1,l−ジオキソ−λ6−チオモルホリン−4−イル)−プロパン−2−オールの合成
(S)または(R)−1−メチルアミノ−3−モルホリン−4−イル−プロパン−2−オールの合成
アミン側鎖の製造
3−(1−H−テトラゾール−1−イル)]−2−ヒドロキシ−1−クロロプロパンおよび3−(2−H−テトラゾール−2−イル)−2−ヒドロキシ−1−クロロプロパン
無水アセトニトリル(30ml)中の6.905gのテトラゾール(100mmol)および1.75mlのジイソプロピルエチルアミン(10mmol)および11.73mlのエピクロロヒドリン(150mmol)を60℃で4時間撹拌した。得られた溶液を蒸発させ,ハイバックで乾燥し,シリカのカラムでクロロホルム−メタノール100:8で精製した。第1の画分から純粋な3−(2−H−テトラゾール−2−イル)−2−ヒドロキシ−1−クロロプロパン,6.215g(無色油状物,収率38%)が得られ,第2の画分から9.208gの純粋な3−(1−H−テトラゾール−1−イル)]−2−ヒドロキシl−1−クロロプロパン(粘着性ガム;収率57%)を得た。
9.110gの3−(1−H−テトラゾール−1−イル)]−2−ヒドロキシ−1−クロロプロパン,15gの炭酸カリウムおよび130mlの飽和メタノール性アンモニアを21時間撹拌し,次に濾過し,蒸発させた。残渣をシリカのカラムでクロロホルム−メタノール−水性アンモニア80:35:4で精製した。7.326gの白色粘着性ガム(91.5%(th))を得た。
6.105gの3−(2−H−テトラゾール−2−イル)]−2−ヒドロキシ−1−クロロプロパン,10gの炭酸カリウムおよび95mlの飽和メタノール性アンモニアを21時間撹拌し,次に濾過し,蒸発させた。残渣をシリカのカラムでクロロホルム−メタノール−水性アンモニア60:25:2で精製して,3.726gの白色結晶固体(69.5%(th))を得た。
4.7mlのエピクロロヒドリン(60mmol)を,トリフルオロエタノール(5ml)中のcis−2,6−ジメチルモルホリン(4.607g,40mmol)の氷冷溶液に加えた。溶液を0−5℃で1時間撹拌し,冷浴をはずし,室温でさらに5時間撹拌した。混合物をハイバックで蒸発させ,得られた油状残渣を無水エタノール(50ml)に溶解し,溶液を氷浴で冷却し,固体ナトリウムメトキシド(2.27g)を2回に分けて加え,混合物を0−5℃で2時間撹拌した。次に反応混合物を濾過し,塩をエタノール(30ml)で洗浄し,合わせた濾液を氷冷濃水性アンモニア(200ml)に加えた。混合物を室温で12時間撹拌し,次にハイバックで蒸発させた。残渣をシリカのカラムでクロロホルム−メタノール−7Mメタノール性アンモニア80:15:3の混合物で精製して,5.75gの白色結晶吸湿性固体を得た(76.3%(th))。
無水アセトニトリル中の3.423gの3−メチル−2,5−ジオキソイミダゾリジン(3.423g)および3.60mlのRエピクロロヒドリン(−)(99%e.e.)および0.30mlのバートン(Barton)塩基(1.5mmol)を60℃で20時間撹拌した。得られた溶液をハイバックで蒸発させ,シリカのカラムでクロロホルム−メタノールの混合物(5−20%メタノールの勾配)で精製して,5.572gのクロロ−化合物を白色非晶質固体(収率90%)として得た。塩化物は以下のようにしてアミンに変換した。得られたヒドロキシ−クロロ中間体をメタノール性アンモニア(アンモニアガスで飽和)に溶解し,炭酸カリウムを加え,混合物を密封フラスコ中で2.5日撹拌した。反応混合物を濾過し,濾液を蒸発させた。残渣をシリカカラムでクロロホルム−メタノール−濃水性アンモニア80:15:1.5の混合物で精製した。
5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(2H−テトラゾール−2−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物22)(一般的方法)
72mgの3−(2−H−テトラゾール−2−イル)]−2−ヒドロキシ−1−アミノプロパンを,105mg(0.25mmol)の5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸1−オキシ−7−アザベンズトリアゾールエステル<(3Z)−3−({3,3−ジメチル−4−カルボキシ−1−H−ピロール−2−イル}メチレン)−5−フルオロ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−オン(480mg;1.6mmol)をDMF(5ml)でヒューニッヒ塩基(3.0mol;0.525ml)の存在下でHATU試薬(570mg;1.5mmol)で活性化し,クロロホルム(5ml)で沈殿させ,高真空で乾燥することにより収率92%(579mg)で純粋な形で単離することにより製造した>の無水ジメチルアセトアミド(1.5ml)中のスラリーに加えた。混合物を30分間撹拌し,ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン20:1(3ml)の混合物に懸濁し,冷蔵庫(5℃)で1時間放置して結晶化させ,濾過し,沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し,ハイバックで乾燥して,106mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(2H−テトラゾール−2−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物23)(一般的方法)
72mgの3−(2−H−テトラゾール−2−イル)]−2−ヒドロキシ−1−アミノプロパンを,109mg(0.25mmol)の5−[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸1−オキシ−7−アザベンズトリアゾールエステル<(3Z)−3−([3,3−ジメチル−4−カルボキシ−1−H−ピロール−2−イル)メチレン)−5−クロロ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−オン(1.520g;4.8mmol)をDMF(20ml)中でヒューニッヒ塩基(9.0mmol;1.58ml)の存在下でHATU試薬(1.768g;4.65mmol)で活性化し,クロロホルム(20ml)で沈殿させ,高真空で乾燥して収率94%(1.907g)で純粋な形で単離することにより製造した>の無水ジメチルアセトアミド(1.5ml)中のスラリーに加えた。混合物を30分間撹拌し,ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン20:1(3ml)の混合物に懸濁し,冷蔵庫(5℃)で1時間放置して結晶化させ,濾過し,沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し,ハイバックで乾燥して,109mgの橙色結晶固体を得た。
N−[2−ヒドロキシ−3−(2H−テトラゾール−2−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−5−[(Z)−[2−オキソ−5−(トリフルオロメトキシ)−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン]メチル)−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物24)(一般的方法)
72mgの3−(2−H−テトラゾール−2−イル)]−2−ヒドロキシ−1−アミノプロパンを,121.5mg(0.25mmol)の5−[(Z)−(5−トリフルオロメトキシ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸1−オキシ−7−アザベンズトリアゾールエステル<(3Z)−3−((3,3−ジメチル−4−カルボキシ−1−H−ピロール−2−イル)メチレン)−5−トリフルオロメトキシ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−オン(1.768g;4.8mmol)をDMF(25ml)中のヒューニッヒ塩基(9.0mmol;1.58ml)の存在下でHATU試薬(1.758g;4.8mmol)で活性化し,蒸発させ,無水アセトニトリルで沈殿させ,高真空中で乾燥することにより収率85.5%(1.929g)で純粋な形で単離することにより製造した>の無水ジメチルアセトアミド(1.5ml)中のスラリーに加えた。混合物を30分間撹拌し,ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン20:1(3ml)の混合物に懸濁し,冷蔵庫(5℃)で1時間放置して結晶化させ,濾過し,沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し,ハイバックで乾燥した。収率113mgで橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(1H−テトラゾール−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物25)
実施例14の方法にしたがって,72mgの対応するアミンから113mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(1H−テトラゾール−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物26)
実施例15の方法にしたがって,72mgの対応するアミンから122mgの橙色結晶固体を得た。
N−[2−ヒドロキシ−3−(1H−テトラゾール−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−5−[(Z)−[2−オキソ−5−(トリフルオロメトキシ)−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン]メチル]−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物27)
実施例16の方法にしたがって,72mgの対応するアミンから118mgの橙色結晶固体を得た。
N−[3−[(2R,6S)−2,6−ジメチルモルホリン−4−イル]−2−ヒドロキシプロピル)−5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物28)
実施例14の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから99mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[3−[(2R,6S)−2,6−ジメチルモルホリン−4−イル]−2−ヒドロキシプロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物29)
実施例15の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから101mgの橙色結晶固体を得た。
N−[3−[(2R,6S)−2,6−ジメチルモルホリン−4−イル]−2−ヒドロキシプロピル]−2,4−ジメチル−5−[(Z)−[2−オキソ−5−(トリフルオロメトキシ)−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン]メチル]−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物30)
実施例16の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから89mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[(2S)−2−ヒドロキシ−3−(3−メチル−2,5−ジオキソイミダゾリジン−1−イル)]2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物34)
実施例14の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから109mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[(2S)−2−ヒドロキシ−3−(3−メチル−2,5−ジオキソイミダゾリジン−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物36)
実施例15の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから107mgの橙色結晶固体を得た。
N−[(2S)−2−ヒドロキシ−3−(3−メチル−2,5−ジオキソイミダゾリジン−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−5−{(Z)−[2−オキソ−5−(トリフルオロメトキシ)−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン]メチル}−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物35)
実施例16の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから123mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[(2R)−2−ヒドロキシ−3−(3−メチル−2,5−ジオキソイミダゾリジン−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物31)
実施例14の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから110mgの橙色結晶固体を得た。
5[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[(2R)−2−ヒドロキシ−3−(3−メチル−2,5−ジオキソイミダゾリジン−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物32)
実施例15の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから103mgの橙色結晶固体を得た。
N−[(2R)−2−ヒドロキシ−3−(3−メチル−2,5−ジオキソイミダゾリジン−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−5−{(Z)−[2−オキソ−5−(トリフルオロメトキシ)−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデンメチル}−1H−ピロール−3−カルボキサミド(化合物33)
実施例16の方法にしたがって,95mgの対応するアミンから120mgの橙色結晶固体を得た。
5−ホルミル−2−メチル−4−フェニル−1H−ピロール−3−カルボン酸エチルエステル
化合物11−21の合成の方法
DMSO中に,各オキシインドールの0.36M溶液および各アルデヒドの0.576M溶液を調製する。200μLのDMSOの存在下で300μLの適当なオキシインドールを300μLの適当なアルデヒドと混合する。次に,40mgのジエチレントリアミンスカベンジャー樹脂を加える。混合物をロビンズ(Robbins)ブロックに入れ,ブロックを密封し,60℃のオーブン中に入れ,18時間振盪する。
18時間後,ロビンズブロックをオーブンから取り出す。ブロックの上部シールを除き,800μLのDMSOを混合物に加える。次に,ブロックを再び密封し,60℃のオーブンに入れ,1時間連続して回転させる。
1時間が経過した後,ロビンズブロックをオーブンから取り出し,冷却させる。ロビンズブロックの下部シールを注意深く除き,ブロック全体を濾過装置に取り付け,ここで,新たに合成された化合物を樹脂から濾別する。
3−[1−H−(7−アザベンズトリアゾリル)−オキシ]−2−ヒドロキシ−1−アミノプロパン
無水クロロホルム中の4.083gの1−ヒドロキシ−7−アザベンズトリアゾール(30mmol)および0.53mlのジイソプロピルアミン(3mmol)および4.70mlのエピクロロヒドリンを60℃で2時間撹拌した。反応混合物をシリカのカラムに負荷し,クロロホルム−メタノール混合物100:3で溶出した。得られたヒドロキシ−クロロ中間体(4.83g,淡黄色油状物,収率70%)をメタノール性アンモニア(100ml,アンモニアガスで飽和)に溶解し,8.3gの炭酸カリウムを加え,混合物を密封フラスコ中で2.5日間撹拌した。反応混合物を濾過し,濾液を蒸発させた。残渣をクロロホルム−メタノール−濃水性アンモニア80:15:1.5の混合物でシリカカラムで精製して,2.793gの白色結晶固体を得た(塩化物から合計63%)。
無水クロロホルム中の12.162gのヒドロキシアザベンズトリアゾール(90mmol),1.59mlのジイソプロピルエチルアミン(9mmol)および14.1mlのエピクロロヒドリン(180mmol)を55℃で2時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ,残渣をハイバックで乾燥し,次にシリカカラムでクロロホルム−メタノール100:5の混合物で精製した。第1の画分から3−[1−H−(ベンズトリアゾリル)−オキシ]−2−ヒドロキシ−1−クロロプロパン10.570g(淡黄蜂蜜色;収率51.5%)を,次に3−[1−H−(ベンズトリアゾリル−3−N−オキシド)]−2−ヒドロキシ−1−クロロプロパン9.990g(白色結晶固体,収率48.5%)を得た。
3−[1−H−(ベンズトリアゾリル−3−N−オキシド)]−2−ヒドロキシ−1−クロロプロパンのアミノ分解により,3−[1−H−(7−アザベンズトリアゾリル)−オキシ]−2−ヒドロキシ−1−アミノプロパンの合成と同様にして表題化合物を製造した。
5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(3H−[1,2,3]トリアゾロ[4,5−b]ピリジン−3−イルオキシ)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(一般的方法)
105mgの3−[1−H−(7−アザベンズトリアゾリル)−オキシ]−2−ヒドロキシ−1−アミノプロパンを,105mg(0.25mmol)の5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸1−オキシ−7−アザベンズトリアゾールエステル<DMF(5ml)中の(3Z)−3−({3,3−ジメチル−4−カルボキシ−1−H−ピロール−2−イル}メチレン)−5−フルオロ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−オン(480mg;1.6mmol)mmol;0.525ml)をクロロホルム(5ml)で沈殿させ,高真空下で乾燥することにより収率92%(579mg)で純粋な形で単離することにより製造した>の無水ジメチルアセトアミド(1.5ml)中のスラリーに加えた。混合物を30分間撹拌し,ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン20:1(3ml)の混合物に懸濁し,冷蔵庫(5℃)中で1時間放置して結晶化させ,濾過し,沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し,ハイバックで乾燥して,121mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(3H−[1,2,3]トリアゾロ[4,5−b]ピリジン−3−イルオキシ)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(一般的方法)
105mgの3−[1−H−(7−アザベンズトリアゾリル)−オキシ]−2−ヒドロキシ−1−アミノプロパンを,109mg(0.25mmol)の5−[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸1−オキシ−7−アザベンズトリアゾールエステル<(3Z)−3−({3,3−ジメチル−4−カルボキシ−1−H−ピロール−2−イル}メチレン)−5−クロロ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−オン(1.520g;4.8mmol)をヒューニッヒ塩基(9.0mmol;1.58ml)の存在下でDMF(20ml)中でHATU試薬(1.768g;4.65mmol)で活性化し,クロロホルム(20ml)で沈殿させ,高真空下で乾燥することにより収率94%(1.907g)で純粋な形で単離することにより製造した>の無水ジメチルアセトアミド(1.5ml)中のスラリーに加えた。混合物を30分間撹拌し,ハイバックで蒸発させた。残渣をメタノール−ジエチルアミン20:1(3ml)の混合物に懸濁し,冷蔵庫(5℃)で1時間放置して結晶化させ,濾過し,沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し,ハイバックで乾燥して,130mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−トリフルオロメトキシ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(3H−[1,2,3]トリアゾロ[4,5−b]ピリジン−3−イルオキシ)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド(一般的方法)
105mgの3−[1−H−(7−アザベンズトリアゾリル)−オキシ]−2−ヒドロキシ−1−アミノプロパンを,121.5mg(0.25mmol)の5−[(Z)−(5−トリフルオロメトキシ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボン酸1−オキシ−7−アザベンズトリアゾールエステル<(3Z)−3−({3,3−ジメチル−4−カルボキシ−1−H−ピロール−2−イル}メチレン)−5−トリフルオロメトキシ−1,3−ジヒドロ−2H−インドール−2−オン(1.768g;4.8mmol)をヒューニッヒ塩基(9.0mmol;1.58ml)の存在下でDMF(25ml)中でHATU試薬(1.758g;4.8mmol)で活性化し,蒸発させ,無水アセトニトリルで沈殿させ,高真空下で乾燥することにより収率85.5%(1.929g)で純粋な形で単離することにより製造した>の無水ジメチルアセトアミド(1.5ml)中のスラリーに加えた。混合物を30分間撹拌し,ハイバックで乾燥した。残渣をメタノール−ジエチルアミン20:1(3ml)の混合物に懸濁し,冷蔵庫(5℃)で1時間放置して結晶化させ,濾過し,沈殿物を氷冷メタノールで洗浄し,ハイバックで乾燥して,142mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−フルオロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(3−オキシド−1H−1,2,3−ベンゾトリアゾール−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド
実施例32の方法にしたがって,105mgの対応するアミンから120mgの橙色結晶固体を得た。
5−[(Z)−(5−クロロ−2−オキソ−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン)メチル]−N−[2−ヒドロキシ−3−(3−オキシド−1H−1,2,3−ベンゾトリアゾール−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−1H−ピロール−3−カルボキサミド
実施例33の方法にしたがって,105mgの対応するアミンから127mgの橙色結晶固体を得た。
N−[2−ヒドロキシ−3−(3−オキシド−1H−1,2,3−ベンゾトリアゾール−1−イル)プロピル]−2,4−ジメチル−5−[(Z)−[2−オキソ−5−(トリフルオロメトキシ)−1,2−ジヒドロ−3H−インドール−3−イリデン]メチル)−1H−ピロール−3−カルボキサミド
実施例34の方法にしたがって,105mgの対応するアミンから141mgの橙色結晶固体を得た。
以下のアッセイを用いて,最適な程度の所望の活性を示す化合物を見いだす。
A.アッセイ方法
以下のアッセイを用いて,活性のレベルおよび本発明の種々の化合物が1またはそれ以上のPKに及ぼす影響を決定することができる。任意のPKについて,当該技術分野においてよく知られる手法を用いて同じように同様のアッセイを設計することができる。
このアッセイは,ポリ(glu,tyr)ペプチドにおけるGST−Flklのチロシンキナーゼ活性を分析する。
1.Corning96−ウエルELISAプレート(CorningカタログNo.5805−96)
2.ポリ(glu,tyr)4:1,lyophilizate(Sigmaカタログ#P0275)
3.ポリ(glu,tyr)(pEY)被覆アッセイプレートの調製:100μlPBS中の2μg/ウエルのポリ(glu,tyr)(pEY)を加え,室温で2時間保持するか,4℃で一夜保持する。プレートをよく覆って蒸発を防ぐ。
4.PBS緩衝液:1Lにつき,0.2gKH2PO4,1.15gNa2HPO4,0.2gKClおよび8gNaClを約900mlのdH2O中で混合する。すべての試薬が溶解したとき,HClでpHを7.2に調節する。dH2Oで総容量を1Lとする。
5.PBST緩衝液:1LのPBS緩衝液に1.0mlTween20を加える。
6.TBB−ブロッキング緩衝液:1Lにつき,1.21gTRIS,8.77gNaCl,1mlTWEEN−20を約900mlのdH2O中で混合する。HClでpHを7.2に調節する。10gBSAを加え,撹拌して溶解させる。dH2Oで総容量を1Lとする。濾過して粒子状物質を除去する。
7.1%BSA,PBS中:1x作業溶液を作成するためには,10gBSAを約990mlのPBS緩衝液に加え,撹拌して溶解させる。PBS緩衝液で総容量を1Lに調節し,濾過して,粒子状物質を除去する。
8.50mMHepespH7.5
9.sf9組換えバキュロウイルストランスフォーメーションから精製したGST−Flklcd(SUGEN,Inc.)。
10.4%DMSO,dH2O中
11.10mMATP,dH2O中
12.40mMMnCl2
13.キナーゼ希釈緩衝液(KDB):10mlHepes(pH7.5),1ml5MNaCl,40μlの100mMオルトバナジン酸ナトリウムおよび0.4mlの5%BSA(dH2O中)を88.56mlのdH2O中で混合する。
14.NUNC96−ウエルV底ポリプロピレンプレート,Applied Scientificカタログ#AS−72092
15.EDTA:14.12gエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を約70mldH2Oに混合する。EDTAが溶解するまで10NNaOHを加える。pHを8.0に調節する。dH2Oで総容量を100mlに調節する。
16.1抗体希釈緩衝液:10mlのPBS緩衝液中5%BSAを89.5mlのTBSTと混合する。
17.西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ホスホチロシンモノクローナル抗体(PY99HRP,Santa Cruz Biotech)
18.2,2’−アジノビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸(ABTS,Moss,Cat.No.ABST)
19.10%SDS
1.Corning96−ウエルELISAプレートを無菌PBS中の2μgのポリEYペプチドで,材料および試薬の工程3に記載されるように被覆する。
2.プレートを逆さにすることにより未結合液体をウエルから除去する。TBSTで1回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて,過剰の液体を除去する。
3.100μlの1%BSA(PBS中)を各ウエルに加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
4.工程2を繰り返す。
5.ウエルを50mMHEPES(pH7.5)(150μl/ウエル)に浸漬する。
6.試験化合物を96−ウエルポリプロピレンプレート中でdH2O/4%DMSOで所望の最終アッセイ濃度の4倍に希釈する。
7.25μlの希釈試験化合物をELISAプレートに加える。対照ウエルには,25μlのdH2O/4%DMSOを加える。
8.25μlの40mMMnCl2および4xATP(2μM)を各ウエルに加える。
9.25μlの0.5MEDTAを陰性対照ウエルに加える。
10.GST−Flklを0.005μg(5ng)/ウエルでKDBで希釈する。
11.50μlの希釈酵素を各ウエルに加える。
12.振盪しながら室温で15分間インキュベートする。
13.50μlの250mMEDTA(pH8.0)を加えることにより反応を停止する。
14.TBSTで3回洗浄し,プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。
15.抗体希釈緩衝液中で1:5,000に希釈した100μl/ウエルの抗ホスホチロシンHRPコンジュゲートを加える。振盪しながら室温で90分間インキュベートする。
16.工程14と同様に洗浄する。
17.100μlのrtABTS溶液を各ウエルに加える。
18.振盪しながら10−15分間インキュベートする。泡を除去する。
19.20μlの10%SDSを各ウエルに加えることにより反応を停止する。
20.DynatechMR7000ELISAリーダーで,試験フィルタ410nM,参照フィルタ630nMで結果を読む。
このアッセイを用いて,ELISAアッセイにおいて,HAエピトープタグ付け全長pyk2(FL.pyk2−HA)のインビトロキナーゼ活性を測定する。
1.Corning96−ウエルElisaプレート
2.12CA5モノクローナル抗HA抗体(SUGEN,Inc.)
3.PBS(ダルベッコリン酸緩衝化食塩水(Gibcoカタログ#450−1300EB)
4.TBST緩衝液:1Lにつき,8.766gNaCl,6.057gTRISおよび1mlの0.1%TritonX−100を約900mldH2O中で混合する。pHを7.2に調節し,容量を1Lとする。
5.ブロッキング緩衝液:1Lにつき,100g10%BSA,12.1g100mMTRIS,58.44g1MNaClおよび10mLの1%TWEEN20を混合する。
6.sf9細胞溶解物からのFL.pyk2−HA(SUGEN,Inc.)
7.4%DMSO,MilliQueH2O中
8.10mMATP,dH2O中
9.1MMnCl2
10.1MMgCl2
11.1Mジチオスレイトール(DTT)
12.10Xキナーゼ緩衝液リン酸化:5.0ml1MHepes(pH7.5),0.2ml1MMnCl2,1.0ml1MMgCl2,1.0ml10%TritonX−100を2.8mldH2O中で混合する。使用直前に0.1ml1MDTTを加える。
13.NUNC96−ウエルV底ポリプロピレンプレート
14.500mMEDTA,dH2O中
15.抗体希釈緩衝液:100mLにつき,1mL5%BSA/PBSおよび1mL10%Tween−20を88mLTBS中で混合する。
16.HRP−コンジュゲート化抗PtyrPY99),Santa Cruz BiotechCat.No.SC−7020
17.ABTS,Moss,Cat.No.ABST−2000
18.10%SDS
1.Corning96ウエルELISAプレートを100μlPBS中の0.5μg/ウエルの12CA5抗HA抗体で被覆する。4℃で一夜保存する。
2.プレートを逆さにすることにより未結合HA抗体をウエルから除去する。プレートをdH2Oで洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて,過剰の液体を除去する。
3.150μlのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
4.プレートをTBS−Tで4回洗浄する。
5.溶解物をPBS中で希釈する(1.5μg溶解物/100μlPBS)。
6.100μlの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で1時間振盪する。
7.工程4と同様に洗浄する。
8.50μlの2Xキナーゼ緩衝液を捕捉pyk2−HAを含むELISAプレートに加える。
9.25μlの4%DMSO中400μM試験化合物を各ウエルに加える。対照ウエルには4%DMSOのみを用いる。
10.25μlの0.5MEDTAを陰性対照ウエルに加える。
11.25μlの20pMATPをすべてのウエルに加える。振盪しながら10分間インキュベートする。
12.25μlの500mMEDTA(pH8.0)をすべてのウエルに加えることにより反応を停止する。
13.工程4と同様に洗浄する。
14.100μlのHRPコンジュゲート化抗Ptyr(1:6000に希釈,抗体希釈緩衝液中)を各ウエルに加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
15.プレートをTBSTで3回,PBSで1回洗浄する。
16.100μlのABST溶液を各ウエルに加える。
17.必要ならば,20μlの10%SDSを各ウエルに加えることにより発色反応を停止する。
18.ELISAリーダーで,試験フィルタ410nM,参照フィルタ630nMでプレートを読む。
このアッセイを用いて,ELISAアッセイでFGF1−Rのインビトロキナーゼ活性を測定する。
1.Costar96−ウエルElisaプレート(Corningカタログ#3369)
2.ポリ(Glu−Tyr)(Sigmaカタログ#P0275)
3.PBS(Gibcoカタログ#450−1300EB)
4.50mMHepes緩衝液溶液
5.ブロッキング緩衝液(5%BSA/PBS)
6.精製GST−FGFR1(SUGEN,Inc.)
7.キナーゼ希釈緩衝液:500μlの1MHepes(GIBCO),20μlの5%BSA/PBS,10μlの100mMオルトバナジン酸ナトリウムおよび50μlの5MNaClを混合する。
8.10mMATP
9.ATP/MnCl2リン酸化ミックス:20μlのATP,400μlの1MMnCl2および9.56mlのdH2Oを混合する。
10.NUNC96−ウエルV底ポリプロピレンプレート(Applied Scientificカタログ#AS−72092)
11.0.5MEDTA
12.0.05%TBST
500μlのTWEENを1リットルのTBSに加える。
13.ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清(SUGEN,Inc.)
14.ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(Biosource,カタログ#ALI0404)
15.ABTS溶液
16.ABTS/H2O2溶液
1.Costar96ウエルELISAプレートを1μg/ウエルの100μlPBS中ポリ(Glu,Tyr)で被覆する。4℃で一夜保存する。
2.被覆したプレートをPBSで1回洗浄する。
3.150μlの5%BSA/PBSブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
4.プレートをPBSで2回,次に50mMHepesで1回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体および泡を除去する。
5.25μlの0.4mM試験化合物(4%DMSO中),または4%DMSO単独(対照)をプレートに加える。
6.精製GST−FGFR1を希釈緩衝液(5μキナーゼ/50μlKDB/ウエル)で希釈する。
7.50μlの希釈キナーゼを各ウエルに加える。
8.25μl/ウエルの新たに調製したATP/Mn++(0.4ml1MMnCl2,40μl10mMATP,9.56mldH2O,新たに調製)を加えることによりキナーゼ反応を開始する
9.これは迅速なキナーゼ反応であり,ATPの添加と同様の様式で25μlの0.5MEDTAを加えることにより停止しなければならない。
10.プレートを新たなTBSTで4回洗浄する。
11.抗体希釈緩衝液を作成する:50mlにつき,5mlの5%BSA,250μlの5%ミルクおよび50μlの100mMバナジン酸ナトリウムを混合し,0.05%TBSTで最終容量とする。
12.100μl/ウエルの抗ホスホチロシン(1:10000希釈,ADB中)を加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
13.工程10と同様に洗浄する。
14.100μl/ウエルのBiosourceヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(1:6000希釈,ADB中)を加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
15.工程10と同様に洗浄し,次にPBSで洗浄して泡および過剰のTWEENを除去する。
16.100μlのABTS/H2O2溶液を各ウエルに加える。
17.振盪しながら10−20分間インキュベートする。泡を除去する。
18.DynatechMR7000Elisaリーダーで,試験フィルタ410nM,参照フィルタ630nMでアッセイを読む。
このアッセイを用いて,ELISAアッセイにおいてFGF1−Rのインビトロキナーゼ活性を測定する。
1.Corning96−ウエルElisaプレート
2.SUMO1モノクローナル抗EGFR抗体(SUGEN,Inc.)
3.PBS
4.TBST緩衝液
5.ブロッキング緩衝液:100mlにつき,5.0gカーネーションインスタント無脂ミルクを100mlPBSと混合する。
6.A431細胞溶解物(SUGEN,Inc.)
7.TBS緩衝液:
8.TBS+10%DMSO:1Lにつき,1.514gTRIS,2.192gNaClおよび25mlDMSOを混合物し,dH2Oで総容量1リットルとする。
9.ATP(アデノシン−5’−三リン酸,ウマ筋肉,SigmaCat.No.A−5394),1.0mM溶液,dH2O中。この試薬は,使用直前に作成し氷上に保持しなければならない。
10.1.0mMMnCl2
11.ATP/MnCl2リン酸化ミックス:10mlを作成するには,300μlの1mMATP,500μlのMnCl2および9.2mlのdH2Oを混合する。使用直前に調製し,氷上に保持する。
12.NUNC96−ウエルV底ポリプロピレンプレート
13.EDTA
14.ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清(SUGEN,Inc.)
15.ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(BiosourceCat.No.ALI0404)
16.ABTS
17.30%過酸化水素
18.ABTS/H2O2
19.0.2MHCl
1.Corning96ウエルELISAプレートをウエルあたり100μlPBS中の0.5μgのSUM01で被覆する。4℃で一夜保存する。
2.プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合SUMO1をウエルから除去する。dH2Oで1回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて,過剰の液体を除去する。
3.150μlのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
4.プレートを脱イオン水で3回,次にTBSTで1回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて,過剰の液体および泡を除去する。
5.溶解物をPBS中で希釈する(7μg溶解物/100μlPBS)。
6.100μlの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で1時間振盪する。
7.プレートを上述の4と同様に洗浄する。
8.120μlのTBSを捕捉EGFRを含むELISAプレートに加える。
9.試験化合物をTBS中に1:10で希釈し,ウエル中に入れる。
10.13.5μlの希釈試験化合物をELISAプレートに入れる。対照ウエルには10%DMSO中13.5μlのTBSを加える。
11.振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
12.15μlのリン酸化ミックスを陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに加える。最終ウエル容量は約150μlであり,各ウエル中3μMATP/5mMMnCl2の最終濃度となるはずである。振盪しながら5分間インキュベートする。
13.振盪しながら16.5μlのEDTA溶液を加えることにより反応を停止させる。さらに1分間振盪する。
14.脱イオン水で4回,TBSTで2回洗浄する。
15.ウエルあたり100μlの抗ホスホチロシン(1:3000希釈,TBST中)を加える。振盪しながら室温で30−45分間インキュベートする。
16.上述の4と同様に洗浄する。
17.100μlのBiosourceヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(1:2000希釈,TBST中)を各ウエルに加える。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
18.上述の4と同様に洗浄する。
19.100μlのABTS/H2O2溶液を各ウエルに加える。
20.振盪しながら5−10分間インキュベートする。泡を除去する。
21.必要ならば,100μlの0.2MHCl/ウエルを加えることにより反応を停止させる。
22.DynatechMR7000ELISAリーダーでアッセイを読む:試験フィルタ410nM,参照フィルタ630nM。
このアッセイを用いて,ELISAアッセイにおいてFGF1−Rのインビトロキナーゼ活性を測定する。
1.Corning96−ウエルElisaプレート
2.28D4C10モノクローナル抗PDGFR抗体(SUGEN,Inc.)
3.PBS
4.TBST緩衝液
5.ブロッキング緩衝液(EGFRバイオアッセイと同じ)
6.PDGFR−発現NIH3T3細胞溶解物(SUGEN,Inc.)
7.TBS緩衝液
8.TBS+10%DMSO
9.ATP
10.MnCl2
11.キナーゼ緩衝液リン酸化ミックス:10mlにつき,250μl1MTRIS,200μl5MNaCl,100μl1MMnCl2および50μl100mMTritonX−100を十分なdH2O中で混合して,10mlとする。
12.NUNC96−ウエルV底ポリプロピレンプレート
13.EDTA
14.ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清(SUGEN,Inc.)
15.ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(BiosourceCat.No.ALI0404)
16.ABTS
17.過酸化水素,30%溶液
18.ABTS/H2O2
19.0.2MHCl
1.Corning96ウエルELISAプレートをウエルあたり100μlのPBS中0.5μg28D4C10で被覆し,4℃で一夜保存する。
2.プレートを逆さにして液体を除去することにより未結合28D4C10をウエルから除去する。dH2Oで1回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。
3.150μlのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
4.プレートを脱イオン水で3回,次にTBSTで1回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて,過剰の液体および泡を除去する。
5.溶解物をHNTG中で希釈する(10μg溶解物/100μlHNTG)
6.100μlの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で60分間振盪する。
7.プレートを工程4に記載されるように洗浄する。
8.80μlの作業キナーゼ緩衝液ミックスを捕捉PDGFRを含むELISAプレートに加える。
9.試験化合物を96−ウエルポリプロピレンプレート中でTBS中で1:10に希釈する。
10.10μlの希釈試験化合物をELISAプレートに加える。対照ウエルには,10μlのTBS+10%DMSOを加える。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
11.10μlのATPを陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに直接加える(最終ウエル容量は約100μlであり,各ウエルは20μMATPであるはずである)。振盪しながら30分間インキュベートする。
12.10μlのEDTA溶液を各ウエルに加えることにより反応を停止する。
13.脱イオン水で4回,TBSTで2回洗浄する。
14.ウエルあたり100μlの抗ホスホチロシン(1:3000希釈,TBST中)を加える。振盪しながら室温で30−45分間インキュベートする。
15.工程4と同様に洗浄する。
16.100μlのBiosourceヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(1:2000希釈,TBST中)を各ウエルに加える。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
17.工程4と同様に洗浄する。
18.100μlのABTS/H2O2溶液を各ウエルに加える。
19.振盪しながら10−30分間インキュベートする。泡を除去する。
20.必要ならば,100μl/ウエルの0.2MHClを加えることにより反応を停止させる。
21.DynatechMR7000ELISAリーダーで,試験フィルタ410nM,参照フィルタ630nMでアッセイを読む。
このアッセイを用いて,全細胞におけるHER−2キナーゼ活性をELISAフォーマットで測定する。
1.DMEM(GIBCOカタログ#11965−092)
2.ウシ胎児血清(FBS,GIBCOカタログ#16000−044),水浴中で56℃で30分間熱不活性化する。
3.トリプシン(GIBCOカタログ#25200−056)
4.L−グルタミン(GIBCOカタログ#25030−081)
5.HEPES(GIBCOカタログ#15630−080)
6.成長培地:500mlDMEM,55ml熱不活性化FBS,10mlHEPESおよび5.5mlL−グルタミンを混合する。
7.血清飢餓培地:500mlDMEM,2.5ml熱不活性化FBS,10mlHEPESおよび5.5mlL−グルタミンを混合物する。
8.PBS
9.平底96−ウエル組織培養マイクロタイタープレート(Corningカタログ#25860)
10.15cm組織培養皿(Corningカタログ#08757148)
11.Corning96−ウエルELISAプレート
12.NUNC96−ウエルV底ポリプロピレンプレート
13.Costarトランスファーカートリッジ,Transtar96(Costarカタログ#7610)用
14.SUMO1:モノクローナル抗EGFR抗体(SUGEN,Inc.)
15.TBST緩衝液
16.ブロッキング緩衝液:5%カーネーションインスタントミルク,PBS中
17.EGFリガンド:EGF−201,Shinko American,Japan.。粉体を100μlの10mMHClに懸濁する。100μlの10mMNaOHを加える。800μlのPBSを加え,エッペンドルフチューブに移し,使用するまで−20℃で保存する。
18.HNTG溶解緩衝液:保存5XHNTG用には,23.83gHepes,43.83gNaCl,500mlグリセロールおよび100mlTritonX−100および十分なdH2Oを混合して1Lの溶液とする。1XHNTG*用には,2mlHNTG,100L0.1MNa3VO4,250μl0.2MNa4P2O7および100μlEDTAを混合する。
19.EDTA
20.Na3VO4.保存溶液を作成するためには,1.84gNa3VO4を90mldH2Oと混合する。pHを10に調節する。電子レンジで1分間沸騰させる(溶液は透明になる)。室温に冷却する。pHを10に調節する。pHが10で安定するまで加熱/冷却のサイクルを繰り返す。
21.200mMNa4P2O7
22.ホスホチロシン特異的ウサギポリクローナル抗血清(抗Ptyr抗体,SUGEN,Inc.)
23.アフィニティー精製抗血清,ヤギ抗ウサギIgG抗体,ペルオキシダーゼコンジュゲート(Biosourceカタログ#ALI0404)
24.ABTS溶液
25.30%過酸化水素溶液
26.ABTS/H2O2
27.0.2MHCl
1.Corning96ウエルELISAプレートをPBS中1.0μg/ウエルのSUM01で被覆する。最終容量100μl/ウエル。4℃で一夜保存する。
2.使用の日に,被覆緩衝液を除去し,プレートをdH2Oで3回,TBST緩衝液で1回洗浄する。このアッセイにおいては,特に記載しない限り,すべての洗浄はこのように行う。
3.100μlのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。プレートを振盪しながら室温で30分間インキュベートする。使用直前にプレートを洗浄する。
4.このアッセイにはEGFr/HER−2キメラ/3T3−C7細胞株を用いる。
5.80−90%コンフルエントの皿を選択する。トリプシン処理により細胞を回収し,1000rpmで室温で5分間遠心分離する。
6.細胞を血清飢餓培地に懸濁し,トリパンブルーで計数する。90%より高い生存度が必要である。細胞を血清飢餓培地に2,500細胞/ウエルの密度で,90μl/ウエルで96ウエルマイクロタイタープレートに播種する。播種した細胞を37℃,5%CO2で一夜インキュベートする。
7.播種の2日後にアッセイを開始する。
8.試験化合物を4%DMSOに溶解する。次に試料をプレート上で直接血清飢餓DMEMでさらに希釈する。典型的には,この希釈は1:10またはそれより高い。次にすべてのウエルを細胞プレートにさらに1:10希釈して加える(10μlの試料および培地を90μlの血清飢餓培地に加える。最終DMSO濃度は1%以下でなければならない。標準的連続希釈を用いてもよい。
9.5%CO2,37℃で2時間インキュベートする。
10.保存EGF(16.5μM)を暖めたDMEMで150nMに希釈することによりEGFリガンドを調製する。
11.100μl/ウエルに十分な量のHNTG*を新たに調製する。氷上に置く。
12.試験化合物とともに2時間インキュベートした後,調製したEGFリガンドを細胞に50μl/ウエルで加える。最終濃度は50nMである。陽性対照ウエルには同量のEGFを加える。陰性対照にはEGFを加えない。37℃で10分間インキュベートする。
13.試験化合物,EGF,およびDMEMを除去する。細胞をPBSで1回洗浄する。
14.HNTG*を細胞に100μl/ウエルで移す。氷上に5分間置く。この間にブロッキング緩衝液をELISAプレートから除去し,洗浄する。
15.細胞をマイクロピペッターでプレートから掻き取り,HNTG*溶解緩衝液を繰り返し吸引分配することにより細胞材料をホモジナイズする。溶解物を,被覆しブロッキングし洗浄したELISAプレートに移す。あるいは,Costarトランスファーカートリッジを用いて溶解物をプレートに移す。
16.振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
17.溶解物を除去し,洗浄する。新たに希釈した抗Ptyr抗体(1:3000,TBST中)をELISAプレートに100μl/ウエルで加える。
18.振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
19.抗Ptyr抗体を除去し,洗浄する。新たに希釈したBIOSOURCE抗体をELISAプレートに加える(1:8000,TBST中,100μl/ウエル)。
20.振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
21.BIOSOURCE抗体を除去し,洗浄する。新たに調製したABTS/H2O2溶液をELISAプレートに100μl/ウエルで加える。
22.振盪しながら5−10分間インキュベートする。泡を除去する。
23.100μl/ウエルの0.2MHClを加えて反応を停止する。
24.DynatechMR7000ELISAリーダーで,試験フィルタセット410nMおよび参照フィルタ630nMでアッセイを読む。
このアッセイを用いて,シンチレーションプロキシミティーアッセイ(SPA)におけるヒトcdk2/サイクリンAのインビトロセリン/トレオニンキナーゼ活性を測定する。
1.Wallac96−ウエルポリエチレンテレフタレート(flexi)プレート(Wallacカタログ#1450−401)
2.Amersham Redivue[γ33P]ATP(Amershamカタログ#AH9968)
3.Amershamストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンSPAビーズ(Amershamカタログ#RPNQ0007)。ビーズはPBS中でマグネシウムまたはカルシウムなしで20mg/mlで再構成しなければならない。
4.Sf9細胞から精製した活性化cdk2/サイクリンA酵素複合体(SUGEN,Inc.)
5.ビオチニル化ペプチド基質(Debtide).ペプチドビオチン−X−PKTPKKAKKLをdH2Oに5mg/mlの濃度で溶解する。
6.ペプチド/ATP混合物:10mlにつき,9.979mldH2O,0.00125ml"コールド"ATP,0.010mlDebtideおよび0.010mlγ33P−ATPを混合する。ウエルあたり最終濃度は,0.5μM"コールド"ATP,0.1μgDebtideおよび0.2μCiγ33P−ATPである。
7.キナーゼ緩衝液:10mlにつき,8.85mldH2O,0.625mlTRIS(pH7.4),0.25ml1MMgCl2,0.25ml10%NP40を混合し,使用直前に0.025ml1MDTTを新たに加える。
8.10mMATP,dH2O中
9.1MTris,HClでpHを7.4に調節する。
10.1MMgCl2
11.1MDTT
12.PBS(Gibcoカタログ#14190−144)
13.0.5MEDTA
14.停止溶液:10mlにつき,9.25mlPBS,0.005ml100mMATP,0.1ml0.5MEDTA,0.1ml10%TritonX100および1.25mlの20mg/mlSPAビーズを混合する。
1.試験化合物の溶液を5%DMSO中に所望の最終濃度の5倍で調製する。各ウエルに10μlを加える。陰性対照用には,10μlの5%DMSO飲みをウエルに加える。
2.5μlのcdk2/サイクリンA溶液を2.1ml2xキナーゼ緩衝液で希釈する。
3.20μlの酵素を各ウエルに加える。
4.10μlの0.5MEDTAを陰性対照ウエルに加える。
5.キナーゼ反応を開始させるため,20μlのペプチド/ATP混合物を各ウエルに加える。振盪せずに1時間インキュベートする。
6.200μlの停止溶液を各ウエルに加える。
7.少なくとも10分間保持する。
8.プレートを約2300rpmで3−5分間回転させる。
9.Triluxまたは類似のリーダーを用いてプレートを計数する。
このアッセイを用いて,基質のmetトランスリン酸化のアゴニスト/アンタゴニストを同定する手段として,ポリ(グルタミン酸:チロシン(4:1))基質のホスホチロシンレベルを測定する。
1.Corning96−ウエルElisaプレート,Corningカタログ#25805−96
2.ポリ(glu,tyr)4:1,Sigma,Cat.No;P0275
3.PBS,Gibcoカタログ#450−1300EB
4.50mMHEPES
5.ブロッキング緩衝液:25gのウシ血清アルブミン,SigmaCat.NoA−7888,を500mlPBSに溶解し,4μmフィルターを通して濾過する。
6.Metキナーゼドメインを含む精製GST融合蛋白質,Sugen,Inc
7.TBST緩衝液
8.10%水性(MilliQueH2O)DMSO
9.10mM水性(dH2O)アデノシン−5’−三リン酸,SigmaCat.No.A−5394
10.2Xキナーゼ希釈緩衝液:100mlにつき,10mL1MHEPES,pH7.5,0.4mL5%BSA/PBS,0.2mL0.1Mオルトバナジン酸ナトリウムおよび1mL5M塩化ナトリウムを88.4mLdH2O中で混合する。
11.4XATP反応混合物:10mLにつき,0.4mL1M塩化マンガンおよび0.02mL0.1MATPを9.56mLdH2O中で混合する。
12.4X陰性対照混合物:10mLにつき,0.4mL1M塩化マンガンを9.6mLdH2O中に混合する。
13.NUNC96−ウエルV底ポリプロピレンプレート,Applied Scientificカタログ#S−72092
14.500mMEDTA
15.抗体希釈緩衝液:100mLにつき,10mL5%BSA/PBS,0.5mL5%カーネーションインスタントミルク,PBS中,および0.1mL0.1Mオルトバナジン酸ナトリウムを88.4mLTBST中で混合する。
16.ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体,Sugen,Inc
17.ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体,Biosource,Inc
18.ABTS溶液:1Lにつき,19.21gクエン酸,35.49gNa2HPO4および500mgABTSを十分なdH2O中で混合し,1Lとする。
19.ABTS/H2O2:15mLABST溶液と2μlH2O2を使用の5分前に混合する。
20.0.2MHCl
1.ELISAプレートを100μlPBS中2μgのポリ(Glu−Tyr)で被覆し,4℃で一夜保存する。
2.プレートを150μlの5%BSA/PBSで60分間ブロッキングする。
3.プレートをPBSで2回,50mMHepes緩衝液,pH7.4で1回洗浄する。
4.50μlの希釈キナーゼをすべてのウエルに加える。
(精製キナーゼはキナーゼ希釈緩衝液中で希釈する。最終濃度は10ng/ウエルとなるはずである)。
5.25μlの試験化合物(4%,DMSO中)または対照にはDMSO単独(4%,dH2O中)をプレートに加える。
6.キナーゼ/化合物混合物を15分間インキュベートする。
7.25μlの40mMMnCl2を陰性対照ウエルに加える。
8.25μlのATP/MnCl2混合物を他のすべてのウエル(陰性対照を除く)に加える。5分間インキュベートする。
9.25μlの500mMEDTAを加えて反応を停止させる。
10.プレートをTBSTで3回洗浄する。
11.抗体希釈緩衝液中で1:10,000に希釈した100μlのウサギポリクローナル抗Ptyrを各ウエルに加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
12.プレートをTBSTで3回洗浄する。
13.BiosourceHRPコンジュゲート化抗ウサギ抗体を抗体.希釈緩衝液中に1:6,000で希釈する。100μl/ウエルを加え,振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
14.プレートをPBSで1回洗浄する。
15.100μlのABTS/H2O2溶液を各ウエルに加える。
16.必要ならば,100μl/ウエルの0.2MHClを加えることにより発色反応を停止させる。
17.DynatechMR7000elisaリーダーで,試験フィルタ410nM,参照フィルタ630nMでプレートを読む。
このアッセイを用いて,基質のgst−IGF−1トランスリン酸化のアゴニスト/アンタゴニストを同定するために,ポリ(グルタミン酸:チロシン)(4:1)中のホスホチロシンレベルを測定する。
1.Corning96−ウエルElisaプレート
2.ポリ(Glu−tyr)(4:1),SigmaCat.No.P0275
3.PBS,Gibcoカタログ#450−1300EB
4.50mMHEPES5.TBBブロッキング緩衝液:1Lにつき,100gBSA,12.1gTRIS(pH7.5),58.44g塩化ナトリウムおよび10mL1%TWEEN−20を混合する。
6.IGF−1キナーゼドメインを含む精製GST融合蛋白質(Sugen,Inc.)
7.TBST緩衝液:1Lにつき,6.057gTris,8.766g塩化ナトリウムおよび0.5mlTWEEN−20を混合し,dH2Oで1リットルとする。
8.4%DMSO,Milli−QH2O中
9.10mMATP,dH2O中
10.2Xキナーゼ希釈緩衝液:100mLにつき,10mL1MHEPES(pH7.5),0.4mL5%BSA,dH2O中,0.2mL0.1Mオルトバナジン酸ナトリウムおよび1mL5M塩化ナトリウムを混合し,dH2Oで100mLとする。
11.4XATP反応混合物:10mLにつき,0.4mL1MMnCl2および0.008mL0.01MATPおよび9.56mLdH2Oを混合する。
12.4X陰性対照混合物:0.4mLの1M塩化マンガンを9.60mLdH2Oと混合する。
13.NUNC96−ウエルV底ポリプロピレンプレート
14.500mMEDTA,dH2O中
15.抗体希釈緩衝液:100mLにつき,10mL5%BSA(PBS中),0.5mL5%カーネーションインスタント無脂ミルク(PBS中)および0.1mL0.1Mオルトバナジン酸ナトリウムを88.4mLTBSTと混合する。
16.ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体,Sugen,Inc
17.ヤギ抗ウサギHRPコンジュゲート化抗体,Biosource
18.ABTS溶液
20.ABTS/H2O2:使用の5分前に15mLABTSを2μlH2O2と混合する。
21.0.2MHCldH2O中
1.ELISAプレートを2.0μg/ウエルのポリ(Glu,Tyr)4:1(SigmaP0275)100μlPBSで.被覆する。プレートを4℃で一夜保存する。
2.プレートをPBSで1回洗浄する。
3.100μlのTBBブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。プレートを振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
4.プレートをPBSで1回,50mMHepes緩衝液pH7.5で2回洗浄する。
5.25μlの4%DMSO中の試験化合物(10mM試験化合物の100%DMSO中の保存溶液をdH2Oで希釈することにより得る)をプレートに加える。
6.10.0ngのgst−IGF−1キナーゼ(50μlキナーゼ希釈緩衝液中)をすべてのウエルに加える。
7.25μlの4XATP反応混合物をすべての試験ウエルおよび陽性対照ウエルに加えることによりキナーゼ反応を開始させる。25μlの4X陰性対照混合物をすべての陰性対照ウエルに加える。振盪しながら室温で10分間インキュベートする。
8.25μlの0.5MEDTA(pH8.0)をすべてのウエルに加える。
9.プレートをTBST緩衝液で4回洗浄する。
10.ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清を,100μlの抗体希釈緩衝液中1:10,000の希釈ですべてのウエルに加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
11.プレートを工程9と同様に洗浄する。
12.100μlのBiosource抗ウサギHRPを抗体希釈緩衝液中1:10,000の希釈ですべてのウエルに加える。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
13.プレートを工程9と同様に洗浄し,さらにPBSで1回洗浄して,泡および過剰のTween−20を減少させる。
14.100μlのABTS/H2O2を各ウエルに加えることにより発色させる。
15.約5分後,試験フィルタ410nm,参照フィルタ630nmでELISAリーダーを読む。
以下のアッセイは,選択されたレセプターを発現するよう遺伝子工学的に改変された細胞を使用して,DNA中へのBrdU取り込みを決定することにより,リガンド−誘導性DNA合成の活性に及ぼす目的化合物の影響を評価する。
以下の材料,試薬および方法は,以下のBrdU取り込みアッセイのそれぞれについて一般的である。特定のアッセイにおける変更は特に記載される。
1.適当なリガンド
2.工学的に改変した適当な細胞
3.BrdU標識試薬:10mM,PBS(pH7.4)中(Boehringer Mannheim,Germany)
4.FixDenat:固定溶液(即使用可)(Boehringer Mannheim,Germany)
5.抗−BrdU−POD:マウスモノクローナル抗体,ペルオキシダーゼとコンジュゲート化(Boehringer Mannheim,Germany)
6.TMB基質溶液:テトラメチルベンジジン(TMB,Boehringer Mannheim,Germany)
7.PBS洗浄溶液:1XPBS,pH7.4
8.アルブミン,ウシ(BSA),画分V粉体(Sigma Chemical Co.,USA)
1.細胞を8000細胞/ウエルで,10%CS,2mMGln,DMEM中で96ウエルプレートに播種する。細胞を37℃で5%CO2で一夜インキュベートする。
2.24時間後,細胞をPBSで洗浄し,次に無血清培地(0%CSDMEM,0.1%BSA)中で24時間血清飢餓とする。
3.第3日に,適当なリガンドおよび試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには無血清DMEM,0.1%BSAのみを加える。陽性対照細胞にはリガンドを加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は,無血清DMEM中でリガンドとともに96ウエルプレート中で調製し,連続希釈して7種類の試験濃度とする。
4.リガンド活性化の18時間後,希釈BrdU標識試薬(1:100,DMEM中,0.1%BSA)を加え,細胞をBrdU(最終濃度=10μM)とともに1.5時間インキュベートする。
5.標識試薬とともにインキュベートした後,デカントし逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。FixDenat溶液を加え(50μl/ウエル),プレートをプレート振盪器で室温で45分間インキュベートする。
6.デカントし逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくことによりFixDenat溶液をよく除去する。ミルク(5%脱水ミルク,PBS中,200μl/ウエル)をブロッキング溶液としてを加え,プレートをプレート振盪器で室温で30分間インキュベートする。
7.デカントすることによりブロッキング溶液を除去し,ウエルをPBSで1回洗浄する。抗−BrdU−POD溶液(1:200希釈,PBS中,1%BSA)を加え(50μl/ウエル),プレートをプレート振盪器で室温で90分間インキュベートする。
8.デカントし,ウエルをPBSで5回すすぐことにより抗体コンジュゲートをよく除去し,プレートを逆さにし,ペーパータオル上で軽くたたくことにより乾燥する。
9.TMB基質溶液を加え(100μl/ウエル),プレート振盪器で室温で20分間,発色が光学的検出に十分となるまでインキュベートする。
10.試料の吸収をDynatechELISAプレートリーダーで410nmで測定する("デュアル波長"モード,参照波長として490nmでフィルターを読む)。
材料および試薬:
1.マウスEGF,201(ToyoboCo.,Ltd.,Japan)
2.3T3/EGFRc7
材料および試薬:
1.マウスEGF,201(ToyoboCo.,Ltd.,Japan)
2.3T3/EGFr/Her2/EGFr(EGFrおよびHer−2キナーゼドメイン)
材料および試薬:
1.マウスEGF,201(ToyoboCo.,Ltd.,Japan)
2.3T3/EGFr/Her4/EGFr(EGFrおよびHer−4キナーゼドメイン)
材料および試薬:
1.ヒトPDGFB/B(Boehringer Mannheim,Germany)
2.3T3/EGFRc7
材料および試薬:
1.ヒトFGF2/bFGF(GibcoBRL,USA)
2.3T3c7/EGFr
材料および試薬:
1.ヒト,組換え(G511,Promega Corp.,USA)
2.3T3/IGFlr
材料および試薬:
1.インスリン,結晶,ウシ,亜鉛(13007,GibcoBRL,USA)
2.3T3/H25
材料および試薬:
1.組換えヒトHGF(Cat.No.249−HG,R&DSystems,Inc.USA)
2.BxPC−3細胞(ATCCCRL−1687)
1.細胞をRPMI10%FBS中で96ウエルプレートに9000細胞/ウエルで播種する。細胞を37℃で5%CO2中で一夜インキュベートする
2.24時間後,細胞をPBSで洗浄し,次に100μlの無血清培地(RPMI,0.1%BSA)中で24時間血清飢餓とする。
3.第3日に,リガンド(1μg/mlでRPMI,0.1%BSA中で調製;最終HGF濃度200ng/ml)および試験化合物を含有する25μlを細胞に加える。陰性対照ウエルには25μlの無血清RPMI,0.1%BSAのみを加える。陽性対照細胞にはリガンド(HGF)を加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は,96ウエルプレートで,リガンドを含む無血清RPMI中でその最終濃度の5倍で調製し,一連の希釈を作成して7種類の試験濃度とする。典型的には,試験化合物の最高最終濃度は100μMであり,1:3希釈を用いる(すなわち,最終試験化合物濃度範囲は0.137−100μMである)。
4.リガンド活性化の18時間後,12.5μlの希釈BrdU標識試薬(1:100,RPMI,0.1%BSA)を各ウエルに加え,細胞をBrdU(最終濃度は10pM)とともに1時間インキュベートする。
5.一般的方法と同じ。
6.一般的方法と同じ。
7.デカントすることによりブロッキング溶液を除去し,ウエルをPBSで1回洗浄する。抗−BrdU−POD溶液(1:100希釈,PBS中,1%BSA)を加え(100μl/ウエル),プレートを室温でプレート振盪器で90分間インキュベートする。
8.一般的方法と同じ。
9.一般的方法と同じ。
10.一般的方法と同じ。
このアッセイを用いて,PDGF−R,FGF−R,VEGF,aFGFまたはFlk−1/KDR(これらはすべてHUV−EC細胞により天然に発現されている)に対する化合物の活性を測定する。
1. HUV−EC−C細胞(ヒト臍静脈内皮細胞,(American Type Cuture Collection;カタログNo.1730CRL)を洗浄し,トリプシン処理する。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水(D−PBS;Gibco BRL;カタログNo.14190−029から入手)で2回,約1ml/10cm2組織培養フラスコで洗浄する。非酵素細胞解離溶液(Sigma 化学 Company;カタログNo.C−1544)中で0.05%トリプシン−EDTAでトリプシン処理する。0.05%トリプシンは,0.25%トリプシン/1mMEDTA(Gibco;カタログNo.25200−049)を細胞解離溶液中で希釈することにより作成する。約1ml/25−30cm2組織培養フラスコで37℃で約5分間トリプシン処理する。細胞をフラスコからはがした後,等量のアッセイ培地を加え,50ml滅菌遠心分離管(Fisher Scientific;カタログNo.05−539−6)に移す。
2. 50ml滅菌遠心分離管中にアッセイ培地を加えることにより,細胞を約35mlのアッセイ培地で洗浄し,約200gで10分間遠心分離し,上清を吸引し,35mlのD−PBSに再懸濁する。D−PBSでさらに2回洗浄し,細胞を約1ml/組織培養フラスコ15cm2のアッセイ培地に再懸濁する。アッセイ培地は,F12K培地(Gibco BRL;カタログNo.21127−014)+0.5%熱不活性化ウシ胎児血清からなる。Coulter Counter(商標)(Coulter Electronics,Inc.)で細胞を計数し,アッセイ培地を細胞に加えて0.8−1.0x105細胞/mlの濃度とする。
3. 細胞を96ウエル平底プレートに100μl/ウエルまたは0.8−1.0x104細胞/ウエルで加える;37℃,5%CO2で約24時間インキュベートする。
1. 試験化合物の2倍滴定を別々の96ウエルプレート中に作成する。一般に,50μMから0μMまで。上述の第0日,工程2と同じアッセイ培地を用いる。滴定は,90μl/ウエルの試験化合物を200μM(4X最終ウエル濃度)で特定のプレートカラムの最上のウエルに加えることにより行う。試験化合物保存液濃度は通常DMSO中20mMであるため,200μMの薬剤濃度は2%DMSOを含む。
したがって,DMSO濃度を一定に保持しながら薬剤を希釈するために,アッセイ培地中(F12K+0.5%ウシ胎児血清)2%DMSOとした希釈剤を,試験化合物滴定の希釈剤として用いる。この希釈物をカラム中の残りのウエルに60μl/ウエルで加える。カラムの最上ウエル中の120μlの200μM試験化合物希釈物から60μlを採取し,カラムの第2のウエル中の60μlと混合する。このウエルから60μlを採取し,カラム中の第3のウエル中の60μlと混合し,2倍滴定が完了するまでこれを続ける。最後から2番目のウエルが混合されたとき,このウエル中の120μlの60μlを採取し,これを廃棄する。最後のウエルには薬剤非含有対照として60μlのDMSO/培地希釈物を加える。以下のアッセイの,滴定する試験化合物の三重のウエルに十分な9つのカラムを作成する:(1)VEGF(Pepro Tech Inc.,から入手,カタログNo.100−200,(2)内皮細胞成長因子(ECGF)(酸性繊維芽細胞成長因子またはaFGFとしても知られる)(Boehringer Mannheim Biochemicaから入手,カタログNo.1439600);または(3)ヒトPDGF B/B(1276−956,Boehringer Mannheim,Germany)およびアッセイ培地対照。ECGFはヘパリンナトリウムを有する調製物として得た。
2. 50μl/ウエルの試験化合物希釈物を,第0日からのHUV−EC−C細胞0.8−1.0x104細胞/100μl/ウエルを含む96ウエルアッセイプレートに移し,37℃,5%CO2で約2時間インキュベートする。
3. 三重に,80μg/mlVEGF,20ng/mlECGF,または各試験化合物の条件に対する培地対照を50μl/ウエルで加える。試験化合物については,成長因子濃度は所望の最終濃度の4倍である。第0日,工程2からのアッセイ培地を用いて,成長因子の濃度を調節する。37℃,5%CO2で約24時間インキュベートする。各ウエルに50μlの試験化合物希釈物,50μlの成長因子または培地,および100μlの細胞を加え,総量200μl/ウエルとする。すなわち,すべてをウエルに加えたとき,4倍濃度の試験化合物および成長因子は1倍となる。
1. 3H−チミジン(Amersham;カタログNo.TRK−686)を1μCi/ウエル(RPMI培地+10%熱不活性化ウシ胎児血清中で調製した100μCi/ml溶液を10μl/ウエル)で加え,37℃,5%CO2で約24時間インキュベートする。RPMIはGibco BRLから入手する,カタログNo.11875−051
第3日
1. プレートを−20℃で一夜凍結する。
第4日
1. プレートを融解し,96ウエルプレート回収器(Tomtec Harvester96(登録商標))でフィルターマット(Wallac;カタログNo.1205−401)上に回収する;Wallac Betaplate(商標)液体シンチレーション計数機で計数する。
化合物を評価するために用いられてきたかまたは用いることができるバイオアッセイを如何に詳細に記載する。化合物1−9を試験し,これらがflkGST,FGFR1およびPDGFアッセイにおいて活性であることが見いだされた。
A.異種移植片動物モデル
ヒト腫瘍が無胸腺マウス(例えば,Balb/c,nu/nu)中で異種移植片として成長する能力は,ヒト腫瘍の治療に対する生物学的応答を研究するのに有用なインビボモデルを提供する。ヒト腫瘍の無胸腺マウスへの最初の成功的な異種移植(Rygaard and Povlsen,1969,Acta Pathol.Microbial.Scand.77:758−760)以来,多くの異なるヒト腫瘍細胞株(例えば,乳房,肺,尿生殖器,胃腸,頭頸部,神経膠芽細胞腫,骨,および悪性黒色腫)が移植され,ヌードマウス中での成長に成功してきた。以下のアッセイを用いて,本発明の種々の化合物の活性,特異性および効果のレベルを決定することができる。3種類の一般的アッセイ,すなわち細胞/触媒,細胞/生物学的およびインビボアッセイが化合物の評価に有用である。細胞/触媒アッセイの目的は,TKが細胞中の既知の基質上のチロシンをリン酸化する能力に及ぼす化合物の影響を判定することである。細胞/生物学的アッセイの目的は,細胞中でTKにより刺激される生物学的応答に及ぼす化合物の影響を判定することである。インビボアッセイの目的は,特定の疾患,例えば癌の動物モデルにおける化合物の影響を判定することである。
以下の腫瘍侵襲モデルが開発されており,KDR/FLK−1レセプターを選択的に阻害すると同定された化合物の治療的価値および有効性を評価するために用いることができる。
8週齢のヌードマウス(雌)(Simonsen Inc.)を実験動物として用いる。腫瘍細胞の移植は,層流フード内で行うことができる。麻酔用に,キシラジン/ケタミンカクテル(100mg/kgケタミンおよび5mg/kgキシラジン)を腹膜内に投与する。中線切開を行って,腹腔を露出して(約1.5cmの長さ),容量100μlの培地中の107個の腫瘍細胞を注入する。細胞は,膵臓の十二指腸葉または結腸の漿膜下に注入する。腹膜および筋肉を6−0絹連続縫糸により縫合し,皮膚は創傷クリップを用いて縫合する。動物は毎日観察する。
動物の全体的所見により2−6週間後,マウスを殺し,局所腫瘍の種々の臓器(肺,肝臓,脳,胃,脾臓,心臓,筋肉)への転移を調べ,分析する(腫瘍サイズ,侵襲の程度,免疫化学,およびインサイチオハイブリダイゼーション測定等)。
このアッセイを用いて,c−kitチロシンリン酸化のレベルを検出する。MOPE(ヒト急性骨髄性白血病)細胞を0.1%血清中で一夜血清飢餓とした。リガンド刺激の前に細胞を化合物で前処理した(血清飢餓と同時)。細胞を250ng/mlrh−SCFで15分間刺激した。刺激後,細胞を溶解させ,抗−c−kit抗体で免疫沈澱させた。ホスホチロシンおよび蛋白質レベルはウエスタンブロッティングにより決定した。
M07E細胞を血清飢餓とし,リン酸化実験について記載したように,化合物で前処理した。細胞を100μlRPMI+10%血清中で4X105細胞/ウエルで96ウエル皿に播種した。rh−SCF(100ng/mL)を加え,プレートを48時間インキュベートした。48時間後,10μlの5mg/mlMTT(臭化3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム)を加え,4時間インキュベートした。酸イソプロパノール(100μlのイソプロパノール中0.04NHCl)を加え,波長550nmで光学密度を測定した。
M07E細胞を10%FBS中でrh−GM−CSF(10ng/mL)およびrh−IL−3(10ng/mL)とともに+/−SCFおよび+/−化合物でインキュベートした。試料は24および48時間にアッセイした。活性化カスパーゼ−3を測定するためには,試料をPBSで洗浄し,氷冷70%エタノールで透過性にした。次に,細胞をPE−コンジュゲート化ポリクローナルウサギ抗活性カスパーゼ−3で染色し,FACSにより分析した。切断されたPARPを測定するためには,試料を溶解させ,抗PARP抗体を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。
本発明の化合物を評価するために用いることができる追加のアッセイには,限定されないが,bio−flk−1アッセイ,全細胞におけるEGFレセプター−HER2キメラレセプターアッセイ,bio−srcアッセイ,bio−lckアッセイおよびrafのリン酸化機能を測定するアッセイが含まれる。これらのアッセイのそれぞれのプロトコルは,米国特許出願09/099,842(図面を含め本明細書の一部としてここに引用する)に見いだすことができる。
治療用化合物は,細胞毒性効果を示すよりもレセプターチロシンキナーゼ活性においてより強力でなければならない。化合物の有効性および細胞毒性の尺度は,治療指数,すなわち,IC50/LD50を決定することにより得ることができる。IC50(50%の阻害を達成するのに必要な用量)は,本明細書に記載されるもの等の標準的な手法を用いて測定することができる。LD50(50%の毒性をもたらす用量)もまた,放出されるLDHの量を測定することにより(Korzeniewski and Callewaert,1983,J.Immunol.Methods,64:313,Decker and Lohmann−Matthes,1988,J.Immunol.Methods,115:61),または動物モデルにおける致死用量を測定することにより,標準的な手法により測定することができる(Mossman,1983,J.Immunol.Methods,65:55−63)。より大きい治療指数を有する化合物が望ましい。治療指数は,2より高くあるべきであり,好ましくは少なくとも10,より好ましくは少なくとも50である。
Claims (7)
- 式(I):
R1は,水素,ハロ,アルキル,ハロアルコキシ,シクロアルキル,ヘテロ脂環式,ヒドロキシ,アルコキシ,−C(O)R8,−NR9R10および−C(O)NR12R13からなる群より選択され;
R2は,水素,ハロ,アルキル,トリハロメチル,ヒドロキシ,アルコキシ,シアノ,−NR9R10,−NR9C(O)R10,−C(O)R8,−S(O)2NR9R10および−SO2R14(ここで,R14は,アルキル,アリール,アラルキル,ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである)からなる群より選択され;
R3,R4およびR5は,独立して,水素またはアルキルであり;
Zは,アリール,ヘテロアリール,複素環,または−NR15R16であり,ここで,R15およびR16は,独立して,水素またはアルキルであり;またはR15およびR16は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R6は,水素またはアルキルからなる群より選択され;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17(下で定義される)からなる群より選択され;
R8は,ヒドロキシ,アルコキシおよびアリールオキシからなる群より選択され;
R9およびR10は,独立して,水素,アルキル,シアノアルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され;または
R9およびR10は,一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R12およびR13は,独立して,水素,アルキル,ヒドロキシアルキル,およびアリールからなる群より選択され;またはR12およびR13は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノを形成し;
R17は,アルキル,シクロアルキル,アリール,ヒドロキシおよびヘテロアリールからなる群より選択される]
の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。 - R1は,水素,ハロ,アルキル,シクロアルキル,ヘテロ脂環式,ヒドロキシ,アルコキシ,−C(O)R8,−NR9R10および−C(O)NR12R13からなる群より選択され;R2は,水素,ハロ,アルキル,トリハロメチル,ヒドロキシ,アルコキシ,シアノ,−NR9R10,−NR9C(O)R10,−C(O)R8,−S(O)2NR9R10および−SO2R14(ここで,R14は,アルキル,アリール,アラルキル,ヘテロアリールおよびヘテロアラルキルである)からなる群より選択され;
R3,R4およびR5は,独立して,水素またはアルキルであり;
Zは,アリール,ヘテロアリール,複素環,または−NR15R16であり,ここで,R15およびR16は,独立して,水素またはアルキルであり;またはR15およびR16は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R6は,水素またはアルキルからなる群より選択され;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17(下で定義される)からなる群より選択され;
R8は,ヒドロキシ,アルコキシおよびアリールオキシからなる群より選択され;
R9およびR10は,独立して,水素,アルキル,シアノアルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され;または
R9およびR10は,一緒になってヘテロシクロ基を形成し;
R12およびR13は,独立して,水素,アルキルおよびアリールからなる群より選択され,またはR12およびR13は,これらが結合している窒素原子と一緒になって複素環を形成し;
R17は,アルキル,シクロアルキル,アリール,ヒドロキシおよびヘテロアリールからなる群より選択される,請求項1記載の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。 - 式(II):
Rは,水素またはアルキルであり;
R1は,水素,ハロ,アルキル,ハロアルコキシ,シクロアルキル,ヘテロ脂環式,ヒドロキシ,アルコキシ,−C(O)R8,−NR9R10および−C(O)NR12R13からなる群より選択され;
R2は,水素,ハロ,アルキル,トリハロメチル,ヒドロキシ,アルコキシ,シアノ,−NR9R10,−NR9C(O)R10,−C(O)R8,−S(O)2NR9R10および−SO2R14(ここで,R14は,アルキル,アリール,アラルキル,ヘテロアリールおよびヘテロアラルキル)からなる群より選択され;
R3,R4およびR5は,独立して,水素またはアルキルであり;
Zは,アリール,ヘテロアリール,複素環,または−NR15R16であり,ここで,R15およびR16は,独立して,水素またはアルキルであり;またはR15およびR16は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノ基を形成し;
R6は,水素またはアルキルからなる群より選択され;
R7は,水素,アルキル,アリール,ヘテロアリール,および−C(O)R17(下で定義される)からなる群より選択され;
R8は,ヒドロキシ,アルコキシおよびアリールオキシからなる群より選択され;
R9およびR10は,独立して,水素,アルキル,シアノアルキル,シクロアルキル,アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され;または
R9およびR10は,一緒になって,ヘテロシクロアミノ基を形成し;
R12およびR13は,独立して,水素,アルキル,ヒドロキシアルキル,およびアリールからなる群より選択され;またはR12およびR13は,これらが結合している窒素原子と一緒になってヘテロシクロアミノを形成し;
R17は,アルキル,シクロアルキル,アリール,ヒドロキシ,およびヘテロアリールからなる群より選択される]
の化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26868301P | 2001-02-15 | 2001-02-15 | |
US31236101P | 2001-08-15 | 2001-08-15 | |
PCT/US2002/004407 WO2002066463A1 (en) | 2001-02-15 | 2002-02-15 | 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethlidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004522776A JP2004522776A (ja) | 2004-07-29 |
JP3677501B2 true JP3677501B2 (ja) | 2005-08-03 |
JP2004522776A5 JP2004522776A5 (ja) | 2005-12-22 |
Family
ID=26953263
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002565978A Expired - Fee Related JP3677501B2 (ja) | 2001-02-15 | 2002-02-15 | 蛋白質キナーゼ阻害剤としての3−(4−アミドピロール−2−イルメチリデン)−2−インドリノン誘導体 |
Country Status (41)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US6653308B2 (ja) |
EP (1) | EP1370554B1 (ja) |
JP (1) | JP3677501B2 (ja) |
KR (1) | KR100884858B1 (ja) |
CN (1) | CN100338059C (ja) |
AP (1) | AP1718A (ja) |
AR (1) | AR042586A1 (ja) |
AT (1) | ATE307128T1 (ja) |
AU (1) | AU2002247133B2 (ja) |
BG (1) | BG108098A (ja) |
BR (1) | BR0207494A (ja) |
CA (1) | CA2438314C (ja) |
CR (1) | CR7056A (ja) |
CZ (1) | CZ20032414A3 (ja) |
DE (1) | DE60206736T2 (ja) |
DK (1) | DK1370554T3 (ja) |
EA (1) | EA007186B1 (ja) |
EE (1) | EE200300385A (ja) |
ES (1) | ES2251580T3 (ja) |
GE (1) | GEP20053600B (ja) |
HK (1) | HK1059621A1 (ja) |
HR (1) | HRP20030657B1 (ja) |
HU (1) | HUP0303146A3 (ja) |
IL (2) | IL157418A0 (ja) |
IS (1) | IS2411B (ja) |
MA (1) | MA26997A1 (ja) |
MX (1) | MXPA03007367A (ja) |
MY (1) | MY126235A (ja) |
NO (1) | NO326604B1 (ja) |
NZ (1) | NZ527572A (ja) |
OA (1) | OA12834A (ja) |
PE (1) | PE20021006A1 (ja) |
PL (1) | PL364176A1 (ja) |
RS (1) | RS51026B (ja) |
SI (1) | SI1370554T1 (ja) |
SK (1) | SK11332003A3 (ja) |
TN (1) | TNSN03055A1 (ja) |
TW (1) | TWI324155B (ja) |
UA (1) | UA75635C2 (ja) |
WO (1) | WO2002066463A1 (ja) |
ZA (2) | ZA200306335B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011526917A (ja) * | 2008-06-30 | 2011-10-20 | サイレーン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | オキシインドール化合物 |
Families Citing this family (71)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6861442B1 (en) * | 1998-12-30 | 2005-03-01 | Sugen, Inc. | PYK2 and inflammation |
AR042586A1 (es) * | 2001-02-15 | 2005-06-29 | Sugen Inc | 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa |
TWI259081B (en) * | 2001-10-26 | 2006-08-01 | Sugen Inc | Treatment of acute myeloid leukemia with indolinone compounds |
AU2003216282A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-09-09 | Pharmacia And Upjohn Company Llc | Process for preparing indolinone derivatives |
US20040018528A1 (en) * | 2002-05-17 | 2004-01-29 | Sugen, Inc. | Novel biomarkers of tyrosine kinase inhibitor exposure and activity in mammals |
AR042042A1 (es) * | 2002-11-15 | 2005-06-08 | Sugen Inc | Administracion combinada de una indolinona con un agente quimioterapeutico para trastornos de proliferacion celular |
US20040209937A1 (en) * | 2003-02-24 | 2004-10-21 | Sugen, Inc. | Treatment of excessive osteolysis with indolinone compounds |
DE10334582A1 (de) * | 2003-07-28 | 2005-02-24 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von Maleinsäureanhydrid |
KR20060058728A (ko) * | 2003-10-02 | 2006-05-30 | 파마시아 앤드 업존 캄파니 엘엘씨 | 피롤-치환된 인돌리논 화합물의 염 및 다형체 |
MXPA06004438A (es) | 2003-10-24 | 2006-06-20 | Schering Ag | Derivados de indolinona y su uso en el tratamiento de enfermedades como el cancer. |
JP2007512353A (ja) * | 2003-11-26 | 2007-05-17 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 高機能インドリノン系プロテインキナーゼ阻害剤 |
WO2005111023A1 (en) | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Pfizer Products Inc. | Pyrimidine derivatives for the treatment of abnormal cell growth |
US20060009510A1 (en) * | 2004-07-09 | 2006-01-12 | Pharmacia & Upjohn Company Llc | Method of synthesizing indolinone compounds |
DE602006021142D1 (de) * | 2005-02-03 | 2011-05-19 | Gen Hospital Corp | Verfahren zur behandlung von gefitinib-resistentem krebs |
BRPI0607579A2 (pt) * | 2005-03-23 | 2009-09-15 | Pfizer Prod Inc | uso de anticorpo anti-ctla4 e indolinona para a preparação de medicamentos para o tratamento de cáncer |
BRPI0608096A2 (pt) | 2005-04-26 | 2009-11-10 | Pfizer | anticorpos p-caderina |
MX2007014810A (es) * | 2005-05-26 | 2008-02-21 | Scripps Research Inst | Inhibidores de la proteina quinasa mejoradas a base de indolinona. |
UA94060C2 (ru) | 2005-09-07 | 2011-04-11 | Эмджен Фримонт Инк. | Моноклональное антитело, которое специфически связывает alk-1 |
US20090012085A1 (en) * | 2005-09-20 | 2009-01-08 | Charles Michael Baum | Dosage forms and methods of treatment using a tyrosine kinase inhibitor |
RU2008110083A (ru) * | 2005-09-22 | 2009-10-27 | Зе Скрипс Ресеч Инститьют (Us) | Ингибиторы протеинкиназы на основе алкоксииндолинонов |
BRPI0620939A2 (pt) * | 2005-12-29 | 2011-11-29 | Scripps Research Inst | derivados de aminoácido de indolinona com base em inibidores de proteìna quinase |
EA200802058A1 (ru) | 2006-05-09 | 2009-06-30 | Пфайзер Продактс Инк. | Производные циклоалкиламинокислот и их фармацевтические композиции |
US20070282318A1 (en) * | 2006-05-16 | 2007-12-06 | Spooner Gregory J | Subcutaneous thermolipolysis using radiofrequency energy |
EP2061758A4 (en) | 2006-09-11 | 2011-11-30 | Curis Inc | A ZINC BINDING GROUP CONTAINING SUBSTITUTED 2-INDOLINONE AS PTK INHIBITORS |
KR20090077914A (ko) * | 2006-09-11 | 2009-07-16 | 쿠리스 인코퍼레이션 | 항증식제로서의 다작용성 소분자 |
AU2007294686B2 (en) | 2006-09-15 | 2013-10-31 | Equinox Sciences, Llc | Kinase inhibitor compounds |
WO2008127707A1 (en) * | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Receptor tyrosine kinase profiling |
WO2008145398A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-04 | Pfizer Italia S.R.L. | 4-arylpyrrole substituted 2-indoline derivatives active as protein kinase inhibitors |
WO2009014941A1 (en) * | 2007-07-24 | 2009-01-29 | Shenzen Chipscreen Bioscience, Ltd. | 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethlidene)-2-indolinone derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors |
CL2008002793A1 (es) * | 2007-09-20 | 2009-09-04 | Cgi Pharmaceuticals Inc | Compuestos derivados de amidas sustituidas, inhibidores de la actividad de btk; composicion farmaceutica que los comprende; utiles en el tratamiento del cancer, trastornos oseos, enfermedades autoinmunes, entre otras |
US20100256392A1 (en) * | 2007-11-21 | 2010-10-07 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Polymorphs of sunitinib base and processes for preparation thereof |
EP2274303B1 (en) * | 2008-03-31 | 2012-08-29 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Processes for preparing sunitinib and salts thereof |
US8158656B2 (en) * | 2008-05-16 | 2012-04-17 | Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. | 2-indolinone derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors |
EP2292613B1 (en) | 2008-05-23 | 2015-09-30 | Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry | Dihydroindolinone derivatives |
US20100029491A1 (en) * | 2008-07-11 | 2010-02-04 | Maike Schmidt | Methods and compositions for diagnostic use for tumor treatment |
KR20110036588A (ko) | 2008-07-24 | 2011-04-07 | 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 | 수니티닙 아세테이트 및 이의 다형을 통한 수니티닙 말레이트의 제조 방법 |
US8211901B2 (en) | 2009-05-22 | 2012-07-03 | Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. | Naphthamide derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors |
CN101906076B (zh) | 2009-06-04 | 2013-03-13 | 深圳微芯生物科技有限责任公司 | 作为蛋白激酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的萘酰胺衍生物、其制备方法及应用 |
SG10201510152RA (en) | 2009-07-13 | 2016-01-28 | Genentech Inc | Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer |
FR2948940B1 (fr) * | 2009-08-04 | 2011-07-22 | Servier Lab | Nouveaux derives dihydroindolones, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent |
WO2011027249A2 (en) | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Pfizer Inc. | Benzimidazole derivatives |
AU2010292060A1 (en) | 2009-09-11 | 2012-04-12 | Genentech, Inc. | Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent |
CN102612566B (zh) | 2009-09-17 | 2016-02-17 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 用于癌症患者中诊断学用途的方法和组合物 |
WO2011073521A1 (en) | 2009-12-15 | 2011-06-23 | Petri Salven | Methods for enriching adult-derived endothelial progenitor cells and uses thereof |
EP2550263A4 (en) * | 2010-03-23 | 2013-07-24 | Univ Johns Hopkins | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASE |
WO2011153224A2 (en) | 2010-06-02 | 2011-12-08 | Genentech, Inc. | Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer |
SG187018A1 (en) | 2010-07-19 | 2013-02-28 | Hoffmann La Roche | Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy |
JP2013538338A (ja) | 2010-07-19 | 2013-10-10 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 抗癌治療への応答可能性の増大した患者を同定する方法 |
WO2012012750A1 (en) | 2010-07-23 | 2012-01-26 | Trustees Of Boston University | ANTI-DEsupR INHIBITORS AS THERAPEUTICS FOR INHIBITION OF PATHOLOGICAL ANGIOGENESIS AND TUMOR CELL INVASIVENESS AND FOR MOLECULAR IMAGING AND TARGETED DELIVERY |
WO2012042421A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-05 | Pfizer Inc. | Method of treating abnormal cell growth |
EP2630134B9 (en) | 2010-10-20 | 2018-04-18 | Pfizer Inc | Pyridine-2- derivatives as smoothened receptor modulators |
WO2012139019A2 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Beta Pharma, Inc. | New indolinone protein kinase inhibitors |
US20140107151A1 (en) * | 2011-05-17 | 2014-04-17 | Principia Biophama Inc. | Tyrosine kinase inhibitors |
WO2013042006A1 (en) | 2011-09-22 | 2013-03-28 | Pfizer Inc. | Pyrrolopyrimidine and purine derivatives |
ES2731833T3 (es) | 2012-09-10 | 2019-11-19 | Principia Biopharma Inc | Compuestos pirazolopirimidínicos comos inhibidores de cinasas |
CN103274986A (zh) * | 2013-06-20 | 2013-09-04 | 湖南欧亚生物有限公司 | 一种舒尼替尼中间体的合成和精制方法 |
FR3008411B1 (fr) * | 2013-07-12 | 2015-07-03 | Servier Lab | Nouveau sel de la 3-[(3-{[4-(4-morpholinylmethyl)-1h-pyrrol-2-yl]methylene}-2-oxo-2,3-dihydro-1h-indol-5-yl)methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione, sa preparation, et les formulations qui le contiennent |
UA115388C2 (uk) | 2013-11-21 | 2017-10-25 | Пфайзер Інк. | 2,6-заміщені пуринові похідні та їх застосування в лікуванні проліферативних захворювань |
SG11201606858RA (en) | 2014-02-21 | 2016-09-29 | Principia Biopharma Inc | Salts and solid form of a btk inhibitor |
WO2015155624A1 (en) | 2014-04-10 | 2015-10-15 | Pfizer Inc. | Dihydropyrrolopyrimidine derivatives |
PT3137460T (pt) | 2014-04-30 | 2019-12-30 | Pfizer | Derivados de di-heterociclo ligado a cicloalquilo |
WO2016001789A1 (en) | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Pfizer Inc. | Pyrimidine derivatives as pi3k inhibitors for use in the treatment of cancer |
MA41197B1 (fr) | 2014-12-18 | 2021-01-29 | Principia Biopharma Inc | Traitement de le pemphigus |
CN104592143B (zh) * | 2015-01-23 | 2017-04-05 | 四川大学 | 一种噁唑烷酮类化合物的制备方法 |
US20180305350A1 (en) | 2015-06-24 | 2018-10-25 | Principia Biopharma Inc. | Tyrosine kinase inhibitors |
WO2017009751A1 (en) | 2015-07-15 | 2017-01-19 | Pfizer Inc. | Pyrimidine derivatives |
MX2018002574A (es) | 2015-08-31 | 2019-02-25 | Dong A Socio Holdings Co Ltd | Compuestos heteroarilo y su uso como farmacos terapeuticos. |
CN106928114B (zh) * | 2015-12-31 | 2020-07-28 | 韶远科技(上海)有限公司 | 含有脲基的环状手性氨基类化合物及其可放大工艺和用途 |
IL263815B (en) | 2016-06-29 | 2022-07-01 | Principia Biopharma Inc | Modified release formulations of 2-[3-[4-amino-3-(2-fluoro-4-phenoxy-phenyl)pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-1-yl]piperidine-1-carbonyl]-4 -Methyl-4-[4-(Oxtan-3-yl)piperazin-1-yl)pent-2-ananitrile |
EP3860976A1 (en) * | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ichnos Sciences S.A. | Indolinone compounds for use as map4k1 inhibitors |
WO2023081923A1 (en) | 2021-11-08 | 2023-05-11 | Frequency Therapeutics, Inc. | Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof |
Family Cites Families (100)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL104796C (ja) | 1957-08-19 | |||
DE878539C (de) | 1939-08-17 | 1953-06-05 | Hoechst Ag | Verfahren zur Herstellung von Methinfarbstoffen |
US2622960A (en) * | 1948-03-16 | 1952-12-23 | A P W Products Company Inc | Glyoxal treatment of absorbent paper to improve wet strength |
BE507136A (ja) | 1950-11-18 | |||
BE553661A (ja) | 1955-12-23 | |||
NL96047C (ja) | 1956-06-08 | |||
NL251055A (ja) | 1959-04-29 | |||
FR1398224A (fr) | 1964-05-06 | 1965-05-07 | Ici Ltd | Procédé de teinture de matières textiles de polyacrylonitrile |
US3308134A (en) | 1965-10-22 | 1967-03-07 | Mcneilab Inc | Spiro(indan-2, 3'-indoline)-1, 2'-diones |
US3551571A (en) | 1967-05-19 | 1970-12-29 | Endo Lab | Methods for reducing pain,reducing fever and alleviating inflammatory syndromes with heteroaromatic pyrrol-3-yl ketones |
US3564016A (en) | 1968-03-07 | 1971-02-16 | Endo Lab | Method of decarbonylation |
US4070366A (en) | 1968-06-12 | 1978-01-24 | Canadian Patents & Development Limited | Alkylation process |
FR1599772A (ja) | 1968-09-17 | 1970-07-20 | ||
US3922163A (en) | 1970-01-30 | 1975-11-25 | Upjohn Co | Organic compounds and process |
US3715364A (en) | 1970-12-28 | 1973-02-06 | Merck & Co Inc | Nitroimidazole carboxamides |
DE2159360A1 (de) | 1971-11-30 | 1973-06-14 | Bayer Ag | Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel |
DE2159362A1 (de) | 1971-11-30 | 1973-06-14 | Bayer Ag | Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel |
DE2159361A1 (de) | 1971-11-30 | 1973-06-14 | Bayer Ag | Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel |
DE2159363A1 (de) | 1971-11-30 | 1973-06-14 | Bayer Ag | Antimikrobielle mittel |
GB1384599A (en) | 1972-05-04 | 1975-02-19 | Colgate Palmolive Co | Coloured detergent compositions |
JPS4918256A (ja) * | 1972-06-09 | 1974-02-18 | ||
US3880871A (en) | 1973-09-27 | 1975-04-29 | Squibb & Sons Inc | Isothiocyanophenyl substituted imidazoles |
US4002643A (en) | 1975-06-27 | 1977-01-11 | Mcneil Laboratories, Inc. | Preparation of β-acyl pyrroles |
US4002749A (en) | 1975-08-12 | 1977-01-11 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Substituted indolinones |
US4053613A (en) | 1975-09-17 | 1977-10-11 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones |
GR73560B (ja) | 1979-02-24 | 1984-03-15 | Pfizer | |
US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
US4343923A (en) | 1980-08-07 | 1982-08-10 | Armstrong World Industries, Inc. | Process for reducing the acid dye uptake of polyamide textile materials with N-acylimidazole compound |
CH646956A5 (de) | 1981-12-15 | 1984-12-28 | Ciba Geigy Ag | Imidazolide. |
EP0095285A1 (en) | 1982-05-21 | 1983-11-30 | Sumitomo Chemical Company, Limited | N-acylimidazoles, their production and use |
DE3310891A1 (de) | 1983-03-25 | 1984-09-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Neue indolinon-(2)-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte |
US4489089A (en) | 1983-04-06 | 1984-12-18 | American Cyanamid Company | Substituted N-[ω-(1H-imidazol-1-yl)alkyl]-amides |
EP0124482B1 (de) | 1983-04-29 | 1989-11-08 | Ciba-Geigy Ag | Neue Imidazolide und deren Verwendung als Härter für Polyepoxidverbindungen |
DE3415138A1 (de) | 1984-04-21 | 1985-10-31 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | N-(azolylcarbamoyl)-hydroxylamine und diese enthaltende fungizide |
DE3426419A1 (de) | 1984-07-18 | 1986-01-23 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Neue oxindol-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte |
US4560700A (en) | 1985-02-08 | 1985-12-24 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Pyrrole-3-carboxylate cardiotonic agents |
JPH078851B2 (ja) | 1985-07-29 | 1995-02-01 | 鐘淵化学工業株式会社 | 3−フエニルチオメチルスチレン誘導体 |
US4966849A (en) | 1985-09-20 | 1990-10-30 | President And Fellows Of Harvard College | CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression |
WO1993012786A1 (en) | 1986-07-10 | 1993-07-08 | Howard Harry R Jr | Indolinone derivatives |
US4853404A (en) | 1986-10-13 | 1989-08-01 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Phenoxyacetic acid derivatives composition and use |
US5089516A (en) | 1987-03-11 | 1992-02-18 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity |
EP0304493B1 (en) | 1987-03-11 | 1992-09-02 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Hydroxystyrene derivatives |
US5202341A (en) | 1987-03-11 | 1993-04-13 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Hydroxystyrene compounds having tyrosine kinase inhibiting activity |
US5043348A (en) | 1987-04-24 | 1991-08-27 | Cassella Aktiengesellschaft | Pyrrolealdehydes, their preparation and their use |
US5217999A (en) | 1987-12-24 | 1993-06-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase |
DE3808071A1 (de) | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von acylierten imidazolen |
US4868304A (en) | 1988-05-27 | 1989-09-19 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Synthesis of nitrogen heterocycles |
CA1339784C (en) | 1988-06-23 | 1998-03-31 | Shinya Inoue | Pyrrolecarboxylic acid derivatives |
JPH06104658B2 (ja) | 1988-06-23 | 1994-12-21 | 三菱化成株式会社 | ピロールカルボン酸誘導体 |
GB8816944D0 (en) | 1988-07-15 | 1988-08-17 | Sobio Lab | Compounds |
DE3824658A1 (de) | 1988-07-15 | 1990-01-18 | Schering Ag | N-hetaryl-imidazolderivate |
US5084280A (en) | 1988-12-15 | 1992-01-28 | Chapman Chemical Company | Wood preservation composition and method |
DE3902439A1 (de) | 1989-01-27 | 1990-08-02 | Basf Ag | Pflanzenschuetzende mittel auf basis von 1-aryl- bzw. 1-hetarylimidazolcarbonsaeureestern |
US5047554A (en) | 1989-04-18 | 1991-09-10 | Pfizer Inc. | 3-substituted-2-oxindole derivatives |
EP0429685B1 (en) | 1989-07-25 | 1997-10-29 | Taiho Pharmaceutical Company, Limited | Oxoindole derivative |
US5258357A (en) | 1989-10-07 | 1993-11-02 | Basf Aktiengesellschaft | Carboxamides, their preparation and their use as herbicides |
CA2032421A1 (en) | 1989-12-20 | 1991-06-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Pyrrolealdehyde derivative |
GB9004483D0 (en) | 1990-02-28 | 1990-04-25 | Erba Carlo Spa | New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation |
CA2012634A1 (en) | 1990-03-20 | 1991-09-20 | Hassan Salari | Tyrphostins for treatment of allergic, inflammatory and cardiovascular diseases |
US5302606A (en) | 1990-04-16 | 1994-04-12 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase |
US5196446A (en) | 1990-04-16 | 1993-03-23 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Certain indole compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase |
CH680293A5 (ja) * | 1990-06-26 | 1992-07-31 | Lonza Ag | |
IT1247509B (it) | 1991-04-19 | 1994-12-17 | Univ Cagliari | Composti di sintesi atti all'impiego nella terapia delle infezioni da rhinovirus |
US5480883A (en) | 1991-05-10 | 1996-01-02 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase |
SG64322A1 (en) | 1991-05-10 | 1999-04-27 | Rhone Poulenc Rorer Int | Bis mono and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit egf and/or pdgf receptor tyrosine kinase |
GB9115160D0 (en) | 1991-07-12 | 1991-08-28 | Erba Carlo Spa | Methylen-oxindole derivatives and process for their preparation |
US5124347A (en) | 1991-07-31 | 1992-06-23 | Warner-Lambert Co. | 3-5-ditertiarybutylphenyl-4-hydroxymethylidene derivatives of 1,3-dihydro-2H-indole-2-ones as antiinflammatory agents |
HU219131B (hu) | 1991-10-18 | 2001-02-28 | Monsanto Co. | Módszer és fungicid készítmény növények torsgombabetegségének gátlására és a hatóanyagok |
US5389661A (en) | 1991-12-05 | 1995-02-14 | Warner-Lambert Company | Imidazole and 1,2,4-triazole derivatives with angiotensin II antagonist properties |
US5322950A (en) | 1991-12-05 | 1994-06-21 | Warner-Lambert Company | Imidazole with angiotensin II antagonist properties |
AU661533B2 (en) | 1992-01-20 | 1995-07-27 | Astrazeneca Ab | Quinazoline derivatives |
FR2689397A1 (fr) | 1992-04-01 | 1993-10-08 | Adir | Utilisation des dérivés de la 3-(3,5-Ditert-Butyl-4-Hydroxybenzylidenyl) Indoline-2-one pour l'obtention de médicaments. |
DE4211531A1 (de) | 1992-04-06 | 1993-10-07 | Cassella Ag | Verfahren zur Herstellung von Pyrrolderivaten |
FR2694004B1 (fr) | 1992-07-21 | 1994-08-26 | Adir | Nouvelles 3-(Hydroxybenzylidényl)-indoline-2-ones et 3-(hydroxybenzylidényl)-indoline-2-thiones, leurs procédés de préparation, et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent. |
US5565324A (en) | 1992-10-01 | 1996-10-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags |
US5330992A (en) | 1992-10-23 | 1994-07-19 | Sterling Winthrop Inc. | 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones |
GB9226855D0 (en) | 1992-12-23 | 1993-02-17 | Erba Carlo Spa | Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation |
JP3507124B2 (ja) | 1993-05-26 | 2004-03-15 | 塩野義製薬株式会社 | ベンジリデン誘導体の製造法 |
EP0632102B1 (de) | 1993-06-28 | 1997-04-02 | Bayer Ag | Massefärben von Kunststoffen |
US5332736A (en) | 1993-11-01 | 1994-07-26 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Anti-convulsant aroyl aminoacylpyrroles |
US5610173A (en) | 1994-01-07 | 1997-03-11 | Sugen, Inc. | Formulations for lipophilic compounds |
GB9507298D0 (en) | 1995-04-07 | 1995-05-31 | Pharmacia Spa | Substituted indolylmethylene-oxindale analogues as tyrosine kinase inhibitors |
US5880141A (en) | 1995-06-07 | 1999-03-09 | Sugen, Inc. | Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease |
US5786488A (en) | 1996-11-13 | 1998-07-28 | Sugen, Inc. | Synthetic methods for the preparation of indolyquinones |
JP3246712B2 (ja) | 1995-11-15 | 2002-01-15 | 株式会社トクヤマ | エテニルアミド化合物の製造方法 |
DE19602525A1 (de) * | 1996-01-25 | 1997-08-07 | Starck H C Gmbh Co Kg | Sphärische Keramikformkörper, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie deren Verwendung |
EP0788890A1 (en) | 1996-02-06 | 1997-08-13 | Agfa-Gevaert N.V. | Dyes and dye-donor elements for thermal dye transfer recording |
CA2206201A1 (en) | 1996-05-29 | 1997-11-29 | Yoshiaki Isobe | Pyrazole derivatives and their pharmaceutical use |
ATE255090T1 (de) | 1996-08-01 | 2003-12-15 | Merckle Gmbh | Acylpyrroldicarbonsäuren und acylindoldicarbonsäuren sowie ihre derivate als hemmstoffe der cytosolischen phospholipase a2 |
US6133305A (en) | 1997-09-26 | 2000-10-17 | Sugen, Inc. | 3-(substituted)-2-indolinones compounds and use thereof as inhibitors of protein kinase activity |
HUP0103617A2 (hu) | 1998-05-29 | 2002-02-28 | Sugen, Inc. | Protein kinázt gátló, pirrolilcsoporttal helyettesített 2-indolszármazékok, e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények, valamint e vegyületek alkalmazása |
US6462072B1 (en) | 1998-09-21 | 2002-10-08 | Gpi Nil Holdings, Inc. | Cyclic ester or amide derivatives |
JP2002542147A (ja) | 1998-12-14 | 2002-12-10 | セレジィ ファーマシューティカルス, インコーポレイテッド | 肛門直腸障害の処置のための組成物および方法 |
WO2000035920A2 (en) * | 1998-12-17 | 2000-06-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | 4,5-azolo-oxindoles |
BR9916327A (pt) | 1998-12-17 | 2001-09-18 | Hoffmann La Roche | Oxindóis de 4-alquenila (e alquinila) como inibidores de cinases dependentes de ciclina, em particular, cdk2 |
US6284894B1 (en) | 1998-12-18 | 2001-09-04 | Nycomed Imaging As | Preparation of allylic aromatic compounds |
CA2399358C (en) * | 2000-02-15 | 2006-03-21 | Sugen, Inc. | Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors |
MY128450A (en) * | 2000-05-24 | 2007-02-28 | Upjohn Co | 1-(pyrrolidin-1-ylmethyl)-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives |
AR042586A1 (es) * | 2001-02-15 | 2005-06-29 | Sugen Inc | 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa |
AU2003216282A1 (en) * | 2002-02-15 | 2003-09-09 | Pharmacia And Upjohn Company Llc | Process for preparing indolinone derivatives |
-
2002
- 2002-02-14 AR ARP020100509A patent/AR042586A1/es unknown
- 2002-02-15 BR BR0207494-0A patent/BR0207494A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-15 DE DE60206736T patent/DE60206736T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-15 EA EA200300793A patent/EA007186B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-02-15 MX MXPA03007367A patent/MXPA03007367A/es active IP Right Grant
- 2002-02-15 DK DK02714897T patent/DK1370554T3/da active
- 2002-02-15 CZ CZ20032414A patent/CZ20032414A3/cs unknown
- 2002-02-15 AU AU2002247133A patent/AU2002247133B2/en not_active Ceased
- 2002-02-15 CA CA2438314A patent/CA2438314C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-15 JP JP2002565978A patent/JP3677501B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-15 IL IL15741802A patent/IL157418A0/xx active IP Right Grant
- 2002-02-15 SK SK1133-2003A patent/SK11332003A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2002-02-15 OA OA1200300211A patent/OA12834A/en unknown
- 2002-02-15 SI SI200230238T patent/SI1370554T1/sl unknown
- 2002-02-15 KR KR1020037010772A patent/KR100884858B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-02-15 RS YUP-717/03A patent/RS51026B/sr unknown
- 2002-02-15 TW TW091102595A patent/TWI324155B/zh not_active IP Right Cessation
- 2002-02-15 US US10/076,140 patent/US6653308B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-15 NZ NZ527572A patent/NZ527572A/en unknown
- 2002-02-15 PE PE2002000134A patent/PE20021006A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-02-15 HU HU0303146A patent/HUP0303146A3/hu unknown
- 2002-02-15 MY MYPI20020528A patent/MY126235A/en unknown
- 2002-02-15 PL PL02364176A patent/PL364176A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-02-15 WO PCT/US2002/004407 patent/WO2002066463A1/en active IP Right Grant
- 2002-02-15 CN CNB028066804A patent/CN100338059C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-15 GE GE5287A patent/GEP20053600B/en unknown
- 2002-02-15 AT AT02714897T patent/ATE307128T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-02-15 UA UA2003087745A patent/UA75635C2/uk unknown
- 2002-02-15 EE EEP200300385A patent/EE200300385A/xx unknown
- 2002-02-15 AP APAP/P/2003/002836A patent/AP1718A/en active
- 2002-02-15 ES ES02714897T patent/ES2251580T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-15 EP EP02714897A patent/EP1370554B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-07-08 TN TNPCT/US2002/004407A patent/TNSN03055A1/en unknown
- 2003-08-14 IS IS6913A patent/IS2411B/is unknown
- 2003-08-14 IL IL157418A patent/IL157418A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-08-14 HR HR20030657A patent/HRP20030657B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-08-14 ZA ZA2003/06335A patent/ZA200306335B/en unknown
- 2003-08-14 NO NO20033608A patent/NO326604B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-08-14 CR CR7056A patent/CR7056A/es unknown
- 2003-08-15 MA MA27282A patent/MA26997A1/fr unknown
- 2003-08-15 BG BG108098A patent/BG108098A/bg unknown
- 2003-09-08 US US10/656,907 patent/US7179910B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-03-25 HK HK04102229A patent/HK1059621A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-07-14 ZA ZA200405615A patent/ZA200405615B/en unknown
-
2006
- 2006-08-28 US US11/511,981 patent/US7256189B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-07-18 US US11/779,807 patent/US7582756B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011526917A (ja) * | 2008-06-30 | 2011-10-20 | サイレーン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | オキシインドール化合物 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3677501B2 (ja) | 蛋白質キナーゼ阻害剤としての3−(4−アミドピロール−2−イルメチリデン)−2−インドリノン誘導体 | |
JP3663382B2 (ja) | ピロール置換2−インドリノン蛋白質キナーゼ阻害剤 | |
US7157460B2 (en) | Use of 8-amino-aryl-substituted imidazopyrazines as kinase inhibitors | |
US20040138269A1 (en) | Substituted pyrroles as kinase inhibitors | |
AU2002247133A1 (en) | 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethlidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors | |
JP2004518669A (ja) | 4−アリール置換インドリノン | |
JP2003534323A (ja) | 3−(ピロール−2−イルメチリデン)−2−インドリノン誘導体のマンニッヒ塩基プロドラッグ | |
JP2004502686A (ja) | 4−ヘテロアリール−3−ヘテロアリーリデニル−2−インドリノンおよび蛋白質キナーゼ阻害剤としてのその使用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040929 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040929 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20040929 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20041117 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050216 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050323 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050419 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050509 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090513 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100513 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110513 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120513 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130513 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130513 Year of fee payment: 8 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |