TWI324155B - 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors - Google Patents

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TWI324155B
TWI324155B TW091102595A TW91102595A TWI324155B TW I324155 B TWI324155 B TW I324155B TW 091102595 A TW091102595 A TW 091102595A TW 91102595 A TW91102595 A TW 91102595A TW I324155 B TWI324155 B TW I324155B
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Huiping Guan
Li Sun
Congxin Liang
Peng Cho Tang
Chung Chen Wei
Vojkovsky Tomas
Jin Qingwu
Matthew Herrinton Paul
A Mauragis Michael
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Sugen Inc
Upjohn Co
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Description

1324155 A7 B7 五、發明説明（1 先前申請案 本申清案主張2001年8月15曰申請之臨時專利申請案 60M2,361及2001年2月15日巾請之60/268 683之優先權，該兩 申請案均併於本文供參考。 發明背景 發明頜域 本發明有關一種3-(4-胺基吡咯_2_基亞竿基）_2_二氫峭哚 酮衍生物，其可調節蛋白激酶（“PKs”）活性。本發明化合物 因此可用以治療與異常PK活性有關之失調。本發明亦揭示 一種包括孩等化合物之醫藥組合物、利用該包括該等化合 物之醫藥組合物治療疾病之方法及其製備方法。 相關領域 PKs為催化蛋白質之酪胺酸、絲胺酸及蘇胺酸殘基上之羥 基磷醱化之酵素。此看似簡單活性之結果令人驚訝；細胞 生長、分化及增殖’亦即細胞壽命之所有可見特徵與p K活 性有關。再者，異常PK活性與宿主失調有關，範圍自相對 播生命威脅之疾病如牛皮癬至極具危險性疾病如神經膠母 細胞瘤（腦癌）。 PKs可便利地區分為兩類，蛋白質酪胺酸激酶（pTKs)及 絲胺酸·蘇胺酸激酶（STKs)。 PTK活性之最主要目的之一為其與生長因子受體有關。 生長因子受體為細胞表面蛋白質。當藉生長因子配位基結 合時’生長因子受體轉化成活性態’其與細胞膜内表面上 之蛋白質相互作用。此引起受體及其他蛋白質路胺酸殘基 -6 - 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1324155 A7 ______B7 ____ 五、發明説明（2 ) 上之磷醯化且引起細胞内形成與各種胞漿發訊分子之錯合 物’其接著影響數種細胞反應如細胞分株（增殖作用）、細胞 分化、細胞生長、代謝效果表現至細胞外微環境等。更完 整之討論參見 Schlessinger 及 Ullrich, Neuron, 9:303-391(1992)，其併 於本文供參考（包含任何圖式及其中描述）。 具PTK活性之生長因子受體已知為受體酪胺酸激酶 (“RTKS”）。其包括具多種生物活性之大族群轉膜受體β目 前’已鑑定出至少19種PTKs之不同次族群。該等實例為稱 為“HER” RTKs之次族群，其包含EGFR(表皮生長因子受 體）、HER2、HER3及HER4。該等RTKs由細胞外糖化配 位基結合區域、轉膜區域及細胞内胞漿催化區域所構成， 其可使蛋白質上之酪胺酸殘基磷醯化。 另一類RTK族群係由胰島素受體（ir)、似胰島素生長因 子I受體（IGF-IR)及胰島素受體相關受體（IRR)。1汉及1(}1：· iR與腠島素、IGF-I及IGF-II相互作用形成兩種整體細胞 外糖化α次早元及兩種沒次單元之雜四聚物，其通過細胞 膜且含有酪胺酸激酶區域。 第二類RTK次族群稱為血小板衍生之生長因子受體 (“PDGFR”）群’其包含 PDGFRa 'PDGFR/3 'CSFIR、 c-kit及c-fms。該等受體係由糖化細胞外區域（由可變數之 似免挽球蛋白迴路所構成）及細胞内區域所構成，其中龄胺 酸激酶區域由不相關胺基酸序列所插入。 另一類由於其與PDGFR次族群之相似性，因此有時包本 於後者族群之另一類為胎兒肝激酶（“ k ”）受體次族群。此 _本紙張尺度適巾g g家標準(CN&) A4規格(21G X 297公爱) ------ 1324155 A7 ___B7__ 五、發明説明（3^^ -- 群相信係由激酶插入區域-受體胎兒肝激•_1(KDr/flk_ 1 ' VEGF-R2)、flk-lR、fik_4 及fms_似酪胺酸激酶 l(flt-l)所構成。 酪胺酸激酶生長因子受體族群之又一成員為纖維母細胞 生長因子（“FGF”）受體亞群。此亞群係由四種受禮、 FGFR1-4、及七種配位基、FGF1-7所構成。雖然尚未充 分界定’但似乎該受體係由含可變數之似免疫球蛋白迴路 之糖化細胞外區域及其中酪胺酸激酶序列係由不相關胺基 酸序列所插入之細胞内區域所構成。 又其他類之酪胺酸激酶生長因子受體族群為脈管内皮生 長因子（“VEGF”）受體亞族群。VEGF為類似於pdGF之二 聚糖蛋白’但具有不同生物功能及不同之體内標的細胞特 異性。尤其，目前被認為扮演主要角色之VEGF為脈管形成 及血管形成。 已知RTK次族群之更完整列示述於plowman等人，DN&P. 7(6):334-339 (1994)，其併於本文供參考，包含任何圖式， 若其已於文中描述。 除了 RTKs以外’亦存在有完整細胞内PTKs族群，稱為 “非受體酶胺酸激酶”或“細胞酪胺酸激酶”。本文中將使用 受者，縮寫為“CTK”。CTKs未含有細胞外及轉膜區域。目 前，於11個次族群中已鑑定出超過24種CTKs(Src、Frk、 Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes、Fps、Fak、Jak 及 Ack)。該Src次族群目前為最大族群之CTKs且包含Src、 Y e s、F y η、L y η、L c k、B1 k、H c k、F g r 及 Y r k。C T K s 之 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
装 玎
1324155 A7 B7 ) 五、發明説明（4 更詳細討論參見Bolen，Oncogene, 8:2〇25-2031 (1993)，其併於本 文供參考，包含任何圖式，若其已於文中描述。 絲胺酸/蘇胺酸激酶，STKs，如同CTKs，主要為細月包 外’但有少數STK型之受體激酶。STKs為最普遍之細胞溶 質激酶；亦即在胞聚細胞器及細胞支架以外之胞漿;部分發 揮其功能之激酶。該細胞溶質為細胞内發生大多細胞中間 性代謝及生合成活性之區域；如在核糖體上合成蛋白質之 細胞溶質。 RTKs、CTKs及STKs均與宿主病原性病況有關聯，尤其 包含癌症。與PTKs有關聯之其他病原性病況包含（但不限 於）牛皮癖、肝硬化、糖尿病、血管形成、再阻塞、眼疾 病、風濕性關節炎及其他發炎失調、免疫學失調如自動免 疫疾病、心血管疾病如如動脈硬化及各種腎疾病。 有關癌症’發展出解釋衍生腫瘤發展之過度細胞增殖之 兩種主要理論有關已知受P K調節之功能。亦即，已提示惡 性細胞生長源自控制細胞分株及/或分化之機制破壞。已顯 示數種致癌基因腫原（Pr〇t〇-〇nc〇genes )之蛋白質產物與調節細 胞生長及.分化之訊號傳導路徑有關。致癌基因原之該等蛋 白質產物包含上述之胞外生長因子、轉膜生長因子PTK受 體（RTKs)、胞漿PTKs(CTKs)及細胞溶質STKs。 蓉於PK-相關細胞活性與廣泛種類人類失調間之明顯關 聯’已有相當多研究嘗試鑑定調節PK活性之方式並不令人 意外。有些此研冗已包含使用在涉及確實細胞過程者上繪 出之大分子之生物模擬方式（如突變配位基（US申請號 -9- I纸張尺度適财S S家料(CMS) A4規格(210X297公 1324155 A7 B7 五、發明説明（5 ) 4，966，849)、可溶受體及抗體（申請號W0 94/10202、Kendall 及 Thomas, Proc. Nat’l Acad. Sci.· 90:10705-09(1994) ' Kim 等人，Nature, 362:841-844(1993) ； RNA 配位基（Jelinek 等人，生物化犖.33:10450- 56) ; Takano 等人，分子生物細胞，4:358A(1993) ; Kinsella 等人， Exp. Cell. Res. 199:56-62(1992) ; Wright 等人，J. Cellular Phvs.. 152:448- 57) 及酪胺酸激酶抑制劑（WO 94/03427 ; WO 92/21660 ; WO 91/15495 ; WO 94/14808 ; USP 5,330,992 ; Mariani 等人，Proc. Am. Assoc· Cancer Res·· 35:2268Π994、、。 除了上述以外，已嘗試鑑定作為P K抑制劑作用之小分 子。例如，雙-單環、雙環及雜環芳基化合物（PCT WO 92/20642 )、伸乙婦基氮雜吲哚衍生物（PCT WO 94/14808 )及1 -環丙基-4 -吡啶喳啉酮（USP 5,330,992 )已描述為酪胺酸激酶抑 制劑。苯乙埽基化合物（USP 5,217,999)、苯乙締基-取代之吡啶 化合物（USP 5,302,606)、喳唑啉衍生物（ΕΡ申請號0 566 266 Α1)、 硒吲哚（selenaindoles)及硒化物（PCT WO 94/03427 )、三環聚羥 基化合物（PCT WO 92/21660)及芊基膦酸化合物（PCT w〇 91/15495 )均描述為可用以治療癌症之p T K抑制劑。 發明概述 本發明有關某種3 - (4 -胺基吡咯-2 -基亞甲基）-2 -二氫啕嗓 酮衍生物，其展現p K調節活性且因此可用於治療與異常Ρ κ 活性有關之失調。 本發明一具體例為式（I)化合物： -10 - 本泜張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1324155 A7 B7 ) 五、發明説明（6 0
(I) 其中： R1係選自氫、鹵素、烷基、鹵烷氧基、環烷基、雜脂環 基、羥基、烷氧基、-C(0)R8、-NR9R1Q及-C(0)NR12R13所成之組 群； R2係選自氫、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、 氰基、-NR9RI()、-NR9C(0)R1()、-C(0)R8、-SPhNR9!^◦及-S02R14 (其 中R14為烷基、芳基、芳烷基、雜芳基及雜芳烷基）所成之 組群； R3、R4及R5獨立為氫或烷基； Z為芳基、雜芳基、雜環基或-NR15R16其中R15及R16獨立為 氫或烷基；或R15及R16與其所附接之氮原子一起形成雜環基 胺基； R6係選自氩或燒基所成之組群； R係選自氫 '院基、芳基、雜芳基及-C(〇)R17所成組群； R8係選自羥基、烷氧基及芳氧基所成之組群； R9及RlQ獨立選自氫、烷基、氰基烷基、環烷基、芳基及 雜芳基所成組群；或 R9及RlQ —起形成雜環基胺基； -11 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 ___ B7 五、發明説明（7 ) R及R13獨立選自氫、燒基 '經基垸基及芳基所成组群； 或R12及R13與其所附接之氮原子一起形成雜環基胺基； R17係選自羥基、烷基、環烷基、芳基及雜芳基所成組 群； 或其醫藥可接受性鹽。 另一具體例為式I化合物其中： R1係選自氫、鹵素、烷基、環烷基、雜脂環基、經基、 烷氧基、-C(0)R8、-NR9R10及-C(0)NR12R13 ; R2係選自氫、鹵素、烷基、三鹵甲基 '羥基、烷氧基、 氰基、-NR9R1()、-NR9C(0)R1。、-C(0)R8、-S(0)2NR9R1()及-S02R14(其 中R14為健基、芳基、芳烷基、雜芳基及雜芳烷基）所成組 群； R3、R4及R5獨立為氳或烷基； Z為芳基、雜芳基、雜環基或_NRi5Ri6其中R】5及r〗6獨立為 氫或燒基；或R15及RlS與其所附接之氮原子一起形成雜環基 胺基； R係選自氫或燒基所成之組群； R7係選自氫、烷基、芳基 '雜芳基及·〇Ρ)ρΠ所成組群； R8係選自羥基、烷氧基及芳氧基所成之組群； R及R1Q獨立選自氫、烷基、氰基烷基、環烷基、芳基及 雜芳基所成組群；或 R9及R10 —起形成雜環基；
Rl2&Rl3獨立選自氫、烷基及芳基所成組群；或R12及R!3 與其所附接之氮原子一起形成雜環基； -12- 本紙張尺度適財S g家標準(CNS) A4規格(21Q χ 297公爱) 丄324155 A7 B7 五、發明説明（8 R係選自羥基、统基、環烷基、芳基及雜芳基所成組 群； 或其醫藥可接受性鹽。 另—具體例為式（la)化合物：
其中：
Rl、R3、R4 及 R5為氫； R2為氟及位於二氫吲哚酮環之5-位置； Z為嗎b林-4 -基； R6及R7為甲基。 較好*C之立體化學性為（S)。 另一具體例為式（II)化合物： 0
(ΪΙ) -13- 本泜張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（9 )
其中： R為氫或坑基； R1係選自氫、鹵素、烷基、鹵烷氧基、環烷基、雜脂環 基、羥基、烷氧基、-C(0)R8、-NR9R1Q及-C(0)NR12R13所成之組 群； R2係選自氫、鹵素、烷基、三鹵甲基、羥基、烷氧基、 氰基、-NR9R10、-nr9c(o)r1()、-C(0)R8、-s(o)2nr9r1()及-so2r14 (其 中R14為烷基、芳基、芳烷基、雜芳基及雜芳烷基）所成之 組群； R3、R4及R5獨立為氫或烷基； Z為芳基、雜芳基、雜環基或_NRi5Ri6其中Rb及R16獨立為 氫或烷基；或R.15及R16與其所附接之氮原子一起形成雜環基 胺基； R6係選自氫或垸基所成之組群； R7係選自氫、烷基、芳基、雜芳基及_C(〇)R17所成组群； R8係選自羥基、烷氧基及芳氧基所成之組群； R9及R1Q獨立選自氫、烷基、氰基烷基、環烷基、芳基及 雜芳基所成组群；或 R9及R1Q—起形成雜環基胺基； R12及R13獨立選自氫、统基、經基垸基及芳基所成組群； 或R12及R13與其所附接之氮原子一起形成雜環基胺基； R17係選自羥基、烷基、環烷基、芳基及雜芳基所成組 群； 或其醫藥可接受性鹽。 -14- 本纸張尺度適用t固國家揉準(CNS) A4規格(210X297公爱0 丄 W4155
發明説明 另一具體例係有關一種醫藥組合物，包括式I、&或11之 化合物及其醫藥可接受性載體或賦型劑。 另.’、體例係有關一種調節蛋白激酶催化活性之方法， 包括使蛋白激酶與式丨、Ia*n之化合物或鹽接觸。此方法 之蛋白激酶可為受體酪胺酸激酶、非受體酪胺酸激酶及絲 胺酸-蘇胺酸激酶。 另一具體例為治療或預防有機體蛋白激酶相關失調之方 法’包括對該有機體投與治療有效量之包括式I、ia或η之 化合物及其醫藥可接受性載體或賦型劑之醫藥組合物。此 方法之蛋白激酶可為受體醏胺酸激酶、非受體酪胺酸激酶 及絲胺酸-蘇胺酸激酶。該激酶相關失調可為EgfR相關失 調' PDGFR相關失調、IGFR相關失調及flk相關失調。該 蛋白激酶失調亦可為squamous細胞癌瘤、星I®胞瘤、卡波希 氏肉瘤、神經膠母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色 瘤、卵巢癌、前列腺癌 '乳癌 '小細胞肺癌、神經膠瘤、 結直腸癌、泌尿道癌及胃腸癌。再者，該蛋白激酶失調亦 可為糖尿病、自動免疫失調、過度增殖失調、再阻塞、纖 維變性、牛皮癬、von Heppel-Lindau疾病、骨關節炎、風濕性 關節炎、血管形成、發炎失調、免疫學失調及心血管失 調。該等方法可用於治療人類。 另一具體例，本發明有關製備式（I)化合物之方法。 最後’本發明亦有關鑑定可調節蛋白激酶催化活性之化 學化合物之方法，係使表現該蛋白激酶之細胞與本發明化 合物或鹽接觸接著追蹤該細胞效果。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（11 發明詳細說明 定義 除非另有說明，否則說明書及申請專利範圍中使用之下 列名詞具有如下意義： “烷基”代表含1-20個碳原子之飽和脂族烴基，包含直鏈 及分支鏈基（可有數種範圍；如“ 1-20”代表該烷基可含有1 個碳原子、2個碳原子、3個碳原子等，高達且包含20個碳 原子）。更好’其為含1至10個碳原子之中度大小烷基，如 甲基、乙基、丙基、2 -丙基、正丁基、異丁基、第三丁 基、戊基等。最好，其為具有1至4個碳原子之低碳烷基， 如如甲基、乙基、丙基、2 -丙基、正丁基、異丁基或第三 丁基等。烷基可經取代或未經取代，且當經取代時，取代 基較好為齒素 '羥基、低碳烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳 基、雜脂環基、C(0)R8、NR9R1Q 及 c(o)nr9r10。 “環燒基”代表3至8員全碳單環、全碳5 -員/6-員或6 -員 /6-員稠合雙環或多環稠合環（“稠合’，環系統代表系統中各環 共用系統中彼此環之相鄰一隊碳原子），其中一或多個環可 含有一或多個雙鍵但環均不具有完全共軛之π-電子系統。 環烷基之未受限制之實例為環丙烷、環丁烷、環戊烷、環 戊締、環己烷、環己二烯、金剛烷、環庚烷、環庚三烯 等。環燒基可經取代或未取代。當經取代時，取代基較好 為一或多個’更好一或兩個取代基，獨立選自低碳烷基、 三鹵烷基、鹵素、羥基、低碳烷氧基、經一或多個（更好一 或兩個）彼此獨立選自卣素、羥基、低碳烷基或低碳烷氧基 -16- 本紙張尺度適用τ國困家標準(CNS) Μ規格(⑽χ 297公董〉 1324155 A7
之基取代之芳基、视情況經—或多個（較妤一或兩個）彼此獨 i選自_素'羥基、低碳烷基或低碳烷氧基之基取代之芳 虱基、％中含1至3個氮原子之6_員雜芳基(環中之碳可視情 況經一或多個’較好一或兩個彼此獨立選自齒素、羥基、 低碳烷基或低碳烷氧基之基取代）、環中含丨至3個選自氮' 氧及硫之雜原子之5_員雜芳基（環中之碳及氮原子可視情況 經一或多個，較好一或兩個彼此獨立選自鹵素、羥基、低 碳烷基或低碳烷氧基之基取代）、環中含丨至3個選自氮、氧 及硫之雜原子之5-或6-員雜脂環基（其中之碳及氮（若存在） 可視情況經一或多個，較好一或兩個彼此獨立選自南素' 趙基、低碳烷基或低碳烷氧基之基取代）、氫硫基 低碳烷 基）硫基、視情況經一或多個（較好一或兩個）彼此獨立選自 由素、經基、低碳烷基或低碳烷氧基之基取代之芳硫基、 氰基、醯基、硫醯基：胺甲醯基、N_胺甲醯基、〇_硫代 胺甲醯基、N -硫代胺甲酿基、C -酿胺基、N -醯胺基 '硝 基、N-磺醯胺基' S-磺醯胺基 ' R9C(0)0-及-NR9R10(其中 R9及R10如上述）。 稀基代表由至少兩個碳原子及至少一個碳_碳雙鍵所構 成之上述定義之烷基。代表性實例包含（但不限於）乙缔基、 1-丙烯基、2-丙烯基、1-、2-或3-丁烯基等》 “炔基”代表由至少兩個碳原子及至少一個碳-碳參鍵所構 成之上述定義之烷基。代表性實例包含（但不限於）乙块基、 1-丙炔基' 2-丙炔基、1-、2-或3-丁炔基等。 “芳基”代表含1至12個碳原子且具有完全共概之r•電子 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) A7 B7 五、發明説明（U ) 系統之全碳單環或稠合環多環（亦即共用相鄰一對碳原子脂 環）。芳基之非限制實例為苯基、莕基及蔥基。芳基可經取 代或未取代。經取代時，取代基較好為一或多個，較好 '一或二個，甚至更好一或兩個獨立選自低碳烷基、三 由烷基、商素、羥基、低碳烷氧基、氫硫基、（低碳烷基）硫 基 '氰基、醯基 '硫醯基、0_胺甲醯基' ^^胺〒醯基、〇· 石λ代胺甲醯基、N -硫代胺甲酿基、c ·酿胺基、n -醯胺基、 確基、Ν -磺醯胺基、s -磺醯胺基、R9s(〇)_、R9s(〇)2_ ' 'C(〇)〇R9'R9C(〇)〇-及 _nr9r1〇(其中 R9 及 Rl0 如上述）。較好， 芳基視情況經一或兩個獨立選自卣素 '低碳烷基、三鹵境 基、羥基、氫硫基、氰基、N -醯胺基、單或二烷胺基、羧 基或N-磺醯胺基之取代基取代。 “雜芳基”代表含一' 二、三或四個選自N、〇或S之環雜 原子及其餘環原子為C且具有完全共軛之π電子系統之含5 至12個環原子之單環或稠合環（亦即共用相鄰一對原子之 環）。未取代雜芳基之未限制實例為峨嘻、吱喃、P塞吩、咪 唆、P号啥、p塞峻、峨吨、7比咬、p密淀、p查淋、異p奎淋、喝 呤 '四唑、三畊及咔唑。該雜芳基可經取代或未取代《經 取代時，取代基較好為一或多個，較好一、二或三個，甚 至更好一或兩個獨立選自低碳烷基、三鹵烷基'鹵素、羥 基 '低竣烷氧基、氩硫基、（低後烷基）硫基、氰基、醯基、 硫醯基、0-胺甲醯基、N-胺甲醢基、0-硫代胺甲醯基'N-硫代胺甲醯基' C-醯胺基、N-醯胺基、硝基、N-磺醯胺 基、S -磺醯胺基、R9S(0)-、R9s(0)2-、-C(0)0R9、R9C(〇)〇-及 -18- 本紙張尺度適用中固國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) A7
• NR9R10 (其中 、_p、 、丹TUR如上逑）。較好，該雜芳基視情況經一 或兩個獨立選自齒素、低碳烷基'三画烷基'羥基、氫与 基氰基N-酿胺基、單或二坑胺基、幾基或N_續酷胺差 之取代基取代。 “雜脂環基”代表含5至9個環原子之單環或雙環基，其中 -或兩個環原子為選“、〇或5⑼η(其中之整數) 之環雜原子及其餘環原子為c。該環亦可具有一或多個雙 鍵。然而該環不具有完全共軛之π電子系統。未取代雜脂 環基I非限制實例為吡咯啶基、哌啶基、哌_基 '嗎啉 基、硫嗎啉基、高哌，井基等。該雜脂環基可經取代或未取 代。經取代時’取代基較好為一或多個，較好一.、二或三 個’甚至更好一或兩個獨立選自低碳烷基、三鹵烷基'鹵 素、羥基、低碳烷氧基、氫硫基、（低碳烷基）硫基、氰基、 酿基、硫臨基、0-碑甲酿基、Ν -胺甲醯基、〇 -硫代胺甲酷 基、Ν -硫代胺甲酿基、C -酿胺基、Ν -酿胺基、硝基、Ν -續 醯胺基、S -磺醯胺基、R9S(〇)-、R9S(0)2-、-C(0)0R9、 R9C(0)0-及-NR9RlG(其中R9及R1G如上述）。較好，該雜脂環 基視情況經一或兩個獨立選自画素、低碳娱:基 '三鹵燒 基、羥基、氫硫基、氰基、N-醯胺基、單或二烷胺基、羧 基或N-磺醯胺基之取代基取代。 “雜環基”代表含3至8個環原子之飽和環狀基，其中一或 兩個環原子為選自N、0或S(0)n(其中η為〇至2之整數）之環 雜原子及其餘環原子為C，其中一或兩個C原子可視情況經 羰基置換。該雜環可視情況經一、二或三個獨立選自可視 -19- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
裝 訂
k 1324155 A7 ___ R7 五、發明說明（μ ) 情泥經一或兩個獨立選自羧基或酯基之取代基取代之低碳 &基、齒烷基、氰基烷基、由素、硝基、氰基、羥基、烷 氧基、胺基、單烷胺基、二烷胺基、芳烷基、雜芳烷基及 -COR(其中R為烷基）之取代基取代。更詳言之，該雜環基 包含（但不限於）四氫吡喃基、2,2-二甲基-1,3-二氧雜環戊 燒 '哌啶基、N-甲基哌啶-3 -基、哌〃井基、N-甲基吡咯啶 -J -基、峨洛症基、嗎〇林基、硫嗎〇林基、硫嗎林-1 -氧化物、 硫嗎啉-丨，〗-二氧化物、4-乙基氧羰基哌啩基、3-氧代哌畊 基、2 -咪唑酮基、2 -吡咯酮基、2 -氧代高哌畊基、四氫嘧 啶-2-酮及其衍生物。較好該雜環基視情況經一或兩個獨立 選自由素、低碳烷基、經羧基或酯取代之低碳烷基、羥基 或單或二烷胺基之取代基取代。 “雜環基胺基”意指含3至8個環原子之飽和環狀基，其中 至少一個環原子氮且視情況一或兩個其他環原子為選自N、 0或S(0)n(其中η為0至2之整數）之環雜原子及其餘環原子 為C，其中一或兩個C原子可視情況經羰基置換。該雜環基 胺基可視情況經一、二或三個獨立選自可視情況經一或兩 個獨立選自羧基或酯基之取代基取代之低碳烷基、鹵烷 基、氰基烷基、画素、硝基、氰基、羥基、烷氧基、胺 基、單烷胺基、二烷胺基、芳烷基、雜芳烷基及-COR(其 中R為烷基）之取代基取代。更詳言之，該雜環基胺基包含 (但不限於）Β底- 1 -基、β底Β并-1 -基、0比鸣· - 1 -基、嗎°林-4 -基、碗鳴**株-4 -基、硫嗎林-1 -氧化物、硫嗎 林-1，1 -二氧化 物、4 -乙基氧羰基哌畊-1-基、3 -氧代哌畊-1-基、2 -咪唑 -20- 本纸張尺度適用中國国家標準<CNS) Α4規格(210X 297公I)
装 訂
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酮1基、2·吡咯酮基、2_氧代高哌畊基四氫嘧啶_2_ 酮、及其衍生物。較好，該雜環基視情況經一或兩個獨立 選自卣素、低碳烷基、經羧基或酯取代之低碳烷基、羥基 或單或—烷胺基之取代基取代。該雜環基胺基為上述定義 之雜環基次族群。 “#1基”代表-0H基。 燒氧基代表-〇_(烷基）及_〇_(未取代環烷基）兩者。代 ，實:包含(但不限於)例如甲氧基、乙*基、丙氧基、丁 氧基蟓丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基等。 鹵烷氧基代表· 〇 _(鹵烷基）。代表性實例包含（但不限 於）例如三氟甲氧基、三溴甲氧基等。 芳氧基代表-0-芳基及_〇_雜芳基兩者如本文定義。 代表，實例包含（但不限於）苯氧基、財氧基"夫喃氧基、 魂吩氧基κ氧基”㈣氧基等，及其衍生基。 “氫破基”代表· S Η基。 烷硫基代表(烷基）及·未取代環烷基）兩者。代表 性實：包含(但不限於)例纟甲硫基、乙硫基' 丙硫基、丁硫 基％丙硫基、環丁碌基、環戊硫基、環己硫基等。 i芳硫基”代表_s_芳基及_s_雜芳基兩者如本文定義。 弋衣丨只例I S (但不限於）苯硫基、吡啶硫基、呋喃硫基、 °塞吩硫基、錢衫、㈣絲等，及其衍生基。 “酿基”代表-C(0)_R"基，其中R"係選自氫、低碳烷基三 函甲基、未取代環垸基、梘情況經-或多個（較好-、二或 三個）選自低錢基、三自甲基、低碳燒氧基、函素及 -21 -
1324155 A7 __B7 明説明（17~) -NR9R1G基之取代基取代之芳基、視情況經一或多個（較好 一、二或三個广選自低碳烷基、三鹵甲基、低碳烷氧基、鹵 素及- NR R基之取代基取代之雜芳基（經由環碳鍵結）、及 視情況經一或多個（較好一、二或三個）選自低碳烷基' _ 二囪 甲基、低碳烷氧基、自素及_Nr9R〗〇基之取代基取代之雜 脂環基所成之基。代表性醯基包含（但不限於）乙醯基、=々 乙醯基、苯甲醯基等。 ％ “醛”代表其中R"為氫之醯基。 “硫醯基”代表-C⑶-R"基’其中R"如前述定義。 “酯代表-C(0)0-R"基，其中R"如前述定義但R"不為氫。 “乙醯基”代表-C(0)CH3基。 “鹵素”代表氟、氯、溴或碘，較好為氟或氣。 二鹵甲基代表-CX3基其中X為前述定義之鹵素。 “三鹵甲烷磺醯基”代表X3CS(=〇)2_基其中X如前述定義。 散基”代表-C^N基。 “ S -磺醯胺基”代表_s(〇)2NR9R1Q基而R9及R1。如前述定義。 “N-磺醯胺基”代表_NR9S(0)2Ri〇基而尺9及尺1()如前述定義。 “ 0 -胺甲醯基”代表_〇C(〇)NR12R13基而R12及R13如前述定 義β “Ν-胺甲醯基”代表R9〇C(〇)NRl0·基而R9及Rl 〇如前述定 義。 “ 0 -硫代胺甲醯基”代表·〇(：⑸NR!2R13基而Rl2及如前述 定義。 "" “N-硫代胺甲醯基”代表R9〇C(S)NR1〇_基而R9及Rio如前逑 -22- 本纸張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ 297公釐) 1324155 A7
定義。 “胺基’’代表-NR9R10基，其中R9及Rl〇如前述定義。 “C·醯胺基，，代表-C(〇)NR9Rl〇基而R9及Rl0如前述定義。 “N -醯胺基”代表^9(3(0)^10•基而尺9及尺1(3如前述定義。 “硝基”代表402基。 “鹵烷基”代表經一或多個相同或不同自原子取代之上述 定義之燒基’較好低碳烷基’如·CHad、-CF3、_CH2C巧' -CH2CC13 等。 “羥基烷基”代表經一或多個羥基取代之上述定義之烷 基，較好低碳烷基，如羥基甲基、1或2·羥基乙基、12_ ' 1，3-或2,3-二羥基丙基等。 “芳烷基”代表經一或多個上述定義之芳基取代之上述定 義之烷基，較好低碳烷基，如-CH2苯基、-(CH2)2苯基、 -(CH2)3苯基、CH3CH(CH3)CH2苯基等及其衍生基。 “雜芳烷基”代表經一或多個上述定義之雜芳基取代之上 述定義之燒基’較好低碳燒基，如_ch2吹咬基、-(CH2)2 π密咬基、-(CH2)3味也基等及其衍生基。 “早焼胺基代表- NHR基其中R為前述定義之统基或未取 代之環烷基，如T胺基' (1-甲基乙基）胺基、環己基胺墓 等。 “二烷胺基”代表-NRR基其中各R獨立為前述定義之烷基 或未取代之環烷基’二甲胺基、二乙胺基' (1-甲基乙基）_ 乙胺基、環己基甲胺基、環戊基甲胺基等。 “視情況”意指隨後定義或情況未必會發生且該描述包含 -23- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐〉 1324155 A7 B7 五、發明説明 其中發生該事件或環境之例及未發生之例。例如，“視情兄 經垸基取代之雜知·基意指坑基未必存在且該插述包本其中 雜環基經烷基取代之例及雜環基未經烷基取代之例。 “2-二氫4哚酮”、“二氫吲哚-2-酮，，及“2-氧吲哚”於本文 中交互使用代表具有下列化學結構之分子：
吡咯”代表具有下列化學結構之分子：
具有相同分子式但其性質或原子鍵結順序或其在空間中 之分予排列不同之化合物稱為“異構物”。空間原子排列不 同之異構物稱為“立體異構物”。彼此不為鏡相之立體異構 物稱為“非對映異構物”及彼此為非重疊鏡相者稱為“對映異 構物”。當化合物具有不對稱中心，例如’其鍵結至四個不 同基時，可能有一對對映異構物。對映異構物特徵可為其 不對稱中心之絕對組態且藉Cahn&Prel〇g之汉_及5_定序規 則所描述，«其中分子繞著該㈣光平面之方式描述且 稱為右旋或左旋（亦即分別為（+)或（_)_異構物）。對掌性化 合物可以個別對映異構物或其混合物存在。含等比例之對 -24- 210X297 公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（20 ) 映異構物之混合物稱為“消旋混合物”。 本發明化合物可帶有一或多個不對稱中心，此化合物因 此可製得個別（R)-或（S)-立體異構物或其混合物。例如式（I) 化合物中-CONHCHR3-CR4(OH)CR5Z中帶有羥基之碳原子可存 在為（R)-或（S)-立體異構物。除非另有說明，說明書及申 請專利範圍中特定化合物之描述或命名欲包含個別對映異 構物及混合物兩者、消旋物或其他。決定立體化學性及分 離立體異構物之方法為本技藝悉知（參見“高等有機化學”第 4 章，第 4 版，J. March 編輯，John Wiley and Sons ’ 組約， 1992)。 式（I)化合物可展現互變體及結構異構之性能。例如，本 文所述化合物可採用有關使2 -二氫吲哚酮基團連接至吡咯 基團之雙鍵之E或Z組態或可為E及Z之混合物。本發明包含 任何帶有調節RTK、CTK及/或STK活性之能力之互變體或 結構異構物及其混合物且不限於任一種互變體或結構異構 態。 “醫藥組合物”代表一或多種本文化合物或其生理/醫藥可 接受性鹽或其前藥與其他化學成分如生理/醫藥可接受性載 體及賦型劑之混合物。醫藥組合物目的係加速化合物對有 機體投藥。 式（I)化合物亦可以前藥作用。“前藥”代表於體内可轉化 成原藥之藥物。經常使用前藥因有些例中其比原藥更易投 藥之故。例如，其可藉口服投藥供生物利用而原藥則否。 前藥亦可能比原藥具有更改良之醫藥組合物中之溶解度。 -25- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（21 ) 前藥實例（但不限於）可為以酯投藥之本發明化合物（“前藥”） 以加速穿過細胞膜，在該處水溶解度不利於移動但接著一 旦在細胞内側（在該處水溶解度有利）可代謝水解成羧酸（活 性主體）。 前藥之又一實例可為短多肽，例如（但不限於）2-10個胺 基酸多肽，經由終端胺基酸鍵結至本發明化合物之羧基， 其中多肽於體内水解或代謝釋出活性分子。式（1)化合物之 前藥在本發明範圍内^ 此外’期望式（I)化合物可藉有機體如人類體内之酵素代 謝產生可調節蛋白激酶活性之代謝物。此代謝物在本發明 範圍内。 本文所用之“生理/醫藥可接受性載體，，代表對有機體不引 起明顯刺激且不消除投藥化合物之生物活性及性質之載體 或稀釋劑。 “醫藥可接受性賦型劑”代表添如至醫藥組合物中以進一 步加速化合物投藥之情性物質。賦型劑實例（但不限於）包含 碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖及澱粉類、纖維素衍生物、明 膠、植物油及聚乙二醇》 本文所用之“醫藥可接受性鹽”代表維持原化合物之生物 有效性及性質之該等鹽。此鹽包含： (1)藉由原化合物之游離驗與無機酸如鹽酸、氯溪酸、 确酸、鱗酸、硫疲及過氯酸等或與有機酸如乙酸草酸、 (D)或（L)蘋果酸、馬來酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、對_甲苯 磺酸、水楊酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸等反應 -26- 本紙張尺度適用令國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公嫠) ------- 1324155 A7 B7 五、發明説明（22 之酸加成鹽’較好為鹽酸或（L)_蘋果酸；或 (2)當原化合物中存在之酸性部分經金屬離子如鹼金屬 離子、驗土金屬離子或鋁離子置換時所形成之鹽；或與有 機驗如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、、N _甲基 葡糖胺等之配位體。 “PK”代表受體蛋白質酪胺酸激酶（RTKs)、非受體或“細 胞”酵胺酸數酶（CTKs)及絲胺酸-蘇胺酸激酶（STKs)。 “方法”代表芫成既定式項之方式、手段、技術及程序， 包含（但不限於）本身已知或化學、醫藥、生物 '生化及藥物 領域精通者由已知方式、手段、技術及程序所發展之該等 方式、手段、技術及程序》 “調節”代表改變RTKs、CTKs及STKs催化活性。尤其， 調節代表RTKs ' CTKs及STKs催化活性之活化作用，較好 為RTKs、CTKs及STKs催化活性之活化作用或抑制作用， 視RTK、CTK或STK所暴露之化合物或鹽濃度而定，更好 為RTKs、CTKs及STKs催化活性之抑制作用。 “催化活性”代表酪胺酸在RTKs&/或CTKs直接或間接影 響下之磷醯化作用或絲胺酸及蘇胺酸在STKs直接或間接影 響下之磷醯化作用。 “接觸’’代表使本發明化合物與標的Ρκ在一起，其方式為 該化合物可直接（亦即與激酶本身相互作用）或間接（亦即藉 與激酶催化活性有關之另一分子相互作用）影響ρκ·化活性 之方式。此“接觸”可於《體外”，亦即於試管中、培養皿等 中完成。試管中，接觸可僅包含化合物及所需卩反或可包含 ^24155 A7
全細胞。細胞亦可維持或生長於細胞培養基凰中且與環境 中之化合物接觸。此說明書中，特定化合物影響PK相關失 調之能力，亦即下述定義化合物之IC50可在嘗試於多種複 合活有機體體内使用化合物之前測定。就有機體外之細胞 而言，存在有多種方法，且為本技藝悉知者，與化合物接 觸獲得PKs包含（但不限於）直接細胞微注射及數種轉膜載體 技術。 體外代表於人造環境中進行之程序，如（但不限於）試管 中或培養基中。 “體内’’代表於活有機體内進行之程序，如（但不限於）小 鼠、老鼠或兔子中進行。 “PK相關失調”、“PK驅動之失調”及“異常!>尺活性，，均代 表具有不適當’亦即在或更一般更超過PK催化活性下之特 徵之病況，其中特定PK可為RTK、CTK或STK。不適當催 化活性可因下列結果而升高：（1)於正常不會表現p K s之細 胞中之PK表現，（2)引起不欲細胞增殖、分化及/或生長之 増加PK表現，或（3)於細胞增殖、分化及/或生長中引起不 欲還原之降低P K表現。P K之過度活性代表編碼特定ρ κ之 基因擴增或可能與細胞增殖、分化及/或生長失調有關之ρκ 活性量產生（亦即當Ρ Κ量增加，則細胞失調之一或多個病徵 嚴重性增加）。當然低於活性（under-activity)則相反，其中細 胞失調之一或多個病徵嚴重性因為PK活性量降低而增加3 “治療”代表舒緩或解除PK調節之細胞失調及/或其伴隨病 徵之方法。尤其有關癌症’遠等名詞意指患有癌症之個體 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公嫠） ' ' 1324155 A7 B7 五、發明説明（24 ) 預期壽命將增加或疾病之一或多個病徵將減少。 “有機體”代表由至少一種細胞所構成之任何活體。活體 可簡單地為例如單一真核細胞或複雜如動物包含人類。 “治療有效量”代表投與化合物舒緩欲治療失調之_或多 種病徵至某些程度之量。有關癌症之治療，治療有效量代 表具有下列效果之量： (1) 減小腫瘤大小； (2) 抑制（亦即減緩至某程度，較好停止）腫瘤遷移； (3) 抑制至某程度（亦即減緩至某程度，較好停止）之腫瘤 生長；及/或 (4) 舒緩至某程度（或較好消除）之與癌有關—或多種病 徵。 “追縱”意指觀察或偵測化合物與表現特定P K之細胞接觸 之效果》所觀察或偵測之效果可為細胞表型變化、p κ催化 活性變化或PK與天然結合夥伴相互作用之變化。觀察或偵 測此效果之技術為本技藝悉知β 上述效果係選自細胞表型變化或變化消失、該蛋白激酶 催化活性變化或變化消失、或該蛋白激酶與本發明最終目 的之天然結合夥伴相互作用之變化或變化消失。 細胞表型”意指細胞或組織之表面外觀或細胞或組織之 生物功能。細胞表型實例（但不限於）為細胞大小、細胞生 長、細胞増殖、細胞分化、細胞存活、細胞凋亡及營養吸 收及利用《此表型特徵可藉本技藝已知技術測量。 天然結合夥伴”代表結合至細胞中特定ρ κ之聚肽，天然
裝 訂
k -29 1324155 A7 B7 五、發明説明（25 ) 結合夥伴可於PK -調節訊號傳導過程傳播中扮演重要角色。 天然結合夥伴與PK相互作用改變可因PK/天然結合夥伴複 合物增高或降低濃度而自身顯現，結果PK調節訊號傳導之 能力可見地改變。 本發明代表性實例示於下表la。 30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） ^24155 A7
五、發明説明（¾ ) 表1 a 一 丨 化合物編號 结構 名稱 MSmfe 1 5 - ( 5 -氟· 2 -氧代-1，2 -二氫 β 哚-3-亞基f基）-2,4 -二甲基 -1H -吡咯-3-羧酸（3 -二乙胺 基-2-羥基丙基）醯胺 427 [M+1J 2 ντ^ΓίΓ〇 5-[5 -氟-2-氧代-1,2 -二氫 "ί|哚-(3 Z )-亞基甲基】-2，4 -二甲基-1Η -吡咯-3-羧酸（2丨 超表-3 - *馬•休-4-基丙基）酿胺 441 [M-U 一 3 Η 2,4-二甲基-5·(2-氧代-1,2-二氫Ί丨哚-(3Ζ)-亞基甲基） -1Η -吡咯-3-羧酸（2 -羥基 -3 -嗎啉-4-基丙基）醯胺 433 [W-1] 4 5-[5 -氣-2-氧代-1，2 -二氩 吲哚-(3 Ζ )-亞基甲基】-2，4 -二甲基-1Η -吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基）醯胺 4S7 IM-11 5 *pri：T〇 “Op 5-[5-溴-2·氧杈-1，2-二氩 吲哚-(3 Z )-亞基甲基】-2,4 -二甲基-1H -吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-嗎啉-4-基丙基）醯胺 601 pvl-1] 503 [M-1] Θ 2.4-二甲基-5-[2-氧代-1,2-二氫Ml哚-(3Z)-亞基甲基] •1H-吡咯*3-羧酸（2-羥基 •3-[1,2,3]三唑-1-基丙基）醯胺 405 [M-1] 7 5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫"4丨哚 •(3Z)-亞基甲基]-2,4-二甲 基-1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基 -3-[1,2,3]三唑-1-基丙基）醢胺 423 (M-1] a 5-[5-氯-2-氧代·1，2-二氫 ，哚-(3Ζ)-亞基甲基】-2,4-二 ‘甲基-1Η-毗咯-3-羧酸（2-羥基 -3-[1,2,3】三唑-1-基丙基）醯胺 439 [M-1J 9 5·[5-溴-2-氧代-1,2-二氩4 哚-(3Ζ)-亞基甲基】-2.4-二甲 基-1Η-呲咯-3-羧酸（2-羥基-3-[1,2,3]三唑-1-基丙基）醯胺 483 [M-1] 485 [M-1] -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐） 1324155
7 7 A B 五、發明説明（27 10
Η工〇 -2基啶Η- h亞 ί-1 苯3-Τ基 氣*--3甲 3-¾ .-(氫β4,胺 14(2--2醯 Ζ2，Ϊ1 .{(-1}-丙-3 .5-代基基咯 氧 甲-1吡 11 12
- 胺 胺基-2基醢 ibl·# 二} #N-5 (-基1-^-vfH代 ί ITt.氧<? ({基基«-4-丙笨-21H A-ii 3 ,基甲二 士-2甲亞3- \)/ - J ， (3基-5基-2 基.j3 胺:4-2’ 乙5-2S-(-凝咯氧醯 -}咕2-幾 * P—I ·甲噪 [4基基-"ίι {丙苯-Ν-.? -3-基3-¾ }經-基· Z ,基甲氫 (3-2甲亞二 13
胺 t2-二 乙羰Ι-ί -| }HJ-3 ; (-基-1-n2,2 -按基}-醯 u¥代羧 ({基-甲氧5-4-丙-3亞2--5{[ιϊ)-ΐ -羥甲Τ基-»? -32-5--2乙Η- Z)-)-咯基-1 (3基基0tt#2氮 14 15 16
-J(1幻苯Γ.' 胺-i.)-s 基胺 基醢 代亞幾 氡--乙(4(2--3-3 二-({-2嗓洛 (4 - )I匕 3-1--5基·η [3基基羰Η Η Ν-丙甲基-3-1 羥2-啉二基 基 -氮 (3Z)-3-{[4-({[3-(二乙胺基） -2-羥基丙基】胺基}羰基） -3-(4 -氣笨基）-5 -甲基-1H-«比咯-2 -基]亞甲基} - N -異丙基-2-氧代- 2,3 -二氫-1H-11弓丨哚-5 -羧醯胺 胺-卩-乙羰·5甲3 二}°亞 (-基基 1 -r 3-胺苯基基醯 11氣2笨援 ,(i二-t-.o-{[4基4-t 代 ΐ -Μ(2Η 氧 Υ 3 : 1 -1· SW/2 3 - 2 Η Ζ)-)-基1--1 (3基基甲基氫 32
本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格（210 X 297公釐) 1324155
A B
胺-卩氧电 乙羰· 二}}3:r> (-基基 1} _ 3-胺苯4基β [_氟 2 乙οί ¾¾ ,{i2’-nl-i3-ΓΗ-(二 • 2 3 * N t z))-)-基}-3’ (3基基甲基-2 代 胺 醯 胺 ) 醯 基超f V羧 苯2-- /55-基七>; 氛基012哚 4-胺¾基 T -(乙}-2甲 Η [3二基咯二-1 3-{3-(λ?Λ -{[基ΗΝ . ζ)'(丙7}-,3 (3-4基基基-2 Η 二<f基 3 (------24 氩Η 叩Si\}-1 -N丙嗎2.基 ΐ基5-(-1甲胺 苯矽.U基醯 基-2¾亞叛 )(2 ---«基-{卜-3-3 (4胺-5基哚咯 4-乙基羰啕吡 (3Z)-3-{ [3-(4-氯笨基）-4-({[3-(二乙胺基）-2 -羥基丙 基]胺基}羰基）-5-甲基-ΙΗ-被咯-2 ·基]亞甲基} - 2、氧代 -N -笨基-2，3 ·二氩-I Η - 4。朵 -5 -羧醢胺 羥基 °-甲}-佞 基2 -基3，^ 苯)-·?甲 Λ,1¾¾ 胺· r—IL 5 (4乙}f-IL,; [3一-基-2-2+ -{nH-Z({[S7 2·丙Η -氫 (3-4基-1-Ν二 5-1丙咯 -(H-[2> 吡 3}H- 基-i-z - N - Η [(氫1--2-1 5-二基唑基 氟哚 羥基
} 甲 !)2Ηΐ 氧亞-(4醯 2-3--3-2,羧 -基I 「甲 四， 3 1’甲 <甲 1)2Η'_一 氧亞-(4胺 2-3--3-2醯 1-^-基 1幾 '-^羥基3-505-丙-rH-[2> 咯士基？ [(IL1--2H 5-二基唑-1 .四 基 33
本紙法尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（29 24 25 26 27
-•-甲-& 唑-5—-m -E3基三 ¥-3 H-甲-(H-咯 -(2--1:4 3 4代氫Η ά--2-1-1nk} 2丙Λ-1甲 r^)z)] ;2基{(基基 氧 亞胺 -醯 2 Ϊ» )vv ^-5-1]1胺 氧亞-(4-醢 2-3--3-2-¾ l-fe·基彳 3SI z - N - Η [(氫l--l-l 5-二基唑基 1’甲-二胺 ΐ·)1Η4-醯 氧亞-(2,羧 * * 3 * -2 3 ,;13,|-^ (5·2·基-0 -H[ - Η ^ί·1 [(氫]-唑基 5二基四甲 -#l-t2]2 甲 )[iz)k 2;基{(基亞 基 氟哚-3 -G9基三»?|洛 H--frH.< -(1-T7H-3 4,代氫-1 氧- 1-氧 -:甲" 唑5丨 胺 醯 羧 2β
胺 -1盛 ? }2基羧 ^-1,甲3- 2,丙-«.亞吡 )·基-23-H-6SM氟1-1 R’2-5-»il基 (2]-)-(h, -[基 Z3Η-- 3 - /V - ^ {-4-[氫,4 29 30 31
氫3-4-二-{-基 2-N琳甲 1’]-嗎二 V基基4- i2;r胺 2-基，}醢 -亞6,基羧 氣-2丙-* 3 - 3 5 · }基--(哚6S羥咯 -比 Z *； R2-0 [(h(21-Η 5--3i-l 味基} 嗎甲基 基二甲幻vli '·一-2U3-醯 6 }:後 2,基-5哚-¾ )-丙代 4-3 6S基氧H-哈 R’羥2-:4 (2-2-H1S -[]-Z 二-3s:{ - } {TT2,基 N--4-5-1甲 氮 -οι ,4 二 2 ; 2，-Ν基]-胺 1- 7甲基醯 4 甲(3ί V) ^ 3 2- L-!i·- 1-亞基-1 -111-¾ 5 - ·唑Η 4- 2咪-1 Z-»?R代基 t(H(2氧甲 5- -3t 二二 34 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格（210X297公釐） 1324155 A7 B7
5-[(Z)-(5 -氣-2-氧代-1,2 -二氫 -3 Η-啕哚-3-亞基）甲基]-Ν· [(2R)-2-羥基-3-(3 -甲基 -2,5 -二氧代咪唑啶-1-基）丙基] -2,4-二甲基-111-吡咯-3-羧醯胺 N二二甲亞 5 ,5,氟 -24-三3-胺甲；^:?k (3丙 5H-㈡ -)-3^ -3基 21·吡 基1--1^ .}二 Η 羥έ-ζ-ιί -^ ί>2 -2"{ ?} ΛΜ5-*1基 R#· }甲 (2代基基1 [(氧甲氧基 Η {，， 3 Γ12 2 35 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
Z 氫 彳胺 二 基醯 丙瘦 2:N基^f lip 基 3 基甲·- 代 -1洛 d 甲 3 · 氧>·(啶# 2-基-3唑Η-^基咪-1 • 3經代基 '•w-朵 2氧" 二二 ^ S --2 5 4 基-2-朵㈤ ϋ •基代·:3· -(3-}^iH --i[2IL-吡 基1)-二H- ffz2--l h5--1基 s? }f (2代基基1 .-^氧〒氧基 N-二二甲亞 5 氟 2 4三3-胺 « ，V > ·」· 氫 -- 二 5,4， Λ 22 2^-]-胺 11基基睡 ς·基甲^w 代-竣 l^3 -\7 /ι\^φ 3 基/ - 2-J31 各 -亞-.Μ 氯-基.呢4 5--輕咬Η {哚-良1 •,02味- ^代基 [(H2S氧甲 5--3[(二二 ¾亞：胺 --[^, 3 32 --- -[}--5幵咯 N基基-3吡 啉二2-嗎· 硫4 化 .·氫Ι-4 Η 甲二1 4-(Γϊ VT3H二 ^ (3 -ί -—--4 2:ΐ V 二]醯 -¾基2-基¾ 二丙1，甲· - 3 1^一 \1/ -1度咯 -(t氧亞说 3-2 · --0 --2 3 I r^L) - - Η Ν基氟嗓-1 5 i' 2 胺 2 1沐- 1’基14,胺 id 氧基化基羧 2--i氧丙3-i.--l•一#--朵1經比 5 0 ，- P (^i 2 )-〕-(-2H ZH[3基. [(-3. T 基 5-氫-Ν-4δ- 二 4基.- 2 1休甲 1，基 4 二 -甲〆-代 >碎4， 氧基化2胺 2-亞氧^—^驢 13-二基羧 溴--丙--'1，基-3 ¥(1羥咯 }ί-- ·吡 ζ Η 3 2-β 5-氩^基-1 5 f\
1324155 A7 B7 五、發明説明（31 42 43 44
-啉Η- 2 嗎1 1,甲.- .}3& 氧-5¾二 -2--3-2-,4-氟味)-2胺 ysl-醯 (51-^(2基m )-3η-[λ (Zi-'N基J, t氧]-.咯 5-二基-4吡 2-114 liiH-•甲嗎It Λ)-- 氧基-3基 -亞基甲 v:? 5-嗓1,胺 -(»iR-&, >i-2l.]羧 ZH{基. 5-氳-N基«. 2 *# 1’甲-V .}3 二 代基«.-+-胺:!?，㈣ -2-32-J-? 氣哚)-基-3 5-2t^ -HI - α Ζ)-3Ν-ΤΗ- ultl·啉 7 5.二基嗎基 v2f 基 甲 代基1· 氧亞經4·胺 23 - ’璉 :-2·2羧 氮嗓 -Ms 基 3 乂 2¾^ -(H[(洛 ζ)?Ν-Λί [(IL1--4H 5-二基啉-1 本發明其他代表性化合物如下表 表lb 示 所 b 化合物編號 稱 名
1N 结構
5-(5 -氟-2-氧代-1，2 -二虱 4哚-3 -亞基甲基）-2，4 -二 甲基·1Η·吡咯-3-羧酸（3-二甲胺基-2-羥基丙基）瞌胺
-36- 本紙張尺度逋用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1324155 Α7 Β7
' H 2 1伐 基-3基2-Η- 胺 iu 乙旋5基氫 •3/ ^ 1^- 二}o甲二 -(基基i -胺 [3胺笨 j2.3，醯 {[^)氟基-2致 -(基二-基-4 丙，--2苯-5 U基,4咯：哚 3-羥(2吡·Ν»?[ 3-{[4-({[3-(二乙胺基）-2-羥基丙基】胺基}羰基）-3-(4-氟笨基）-5-f基-1H -吡咯- 2-基]亞甲基}-N -異丙基-2-氧 代- 2,3 -二氫朵- 5- ¾ 睡胺 3-{[4-({[3-(二乙胺基）-2-羥基丙基】胺基}羰基）-3-(2,4-二氟苯基）-5 -甲基-1H -吡咯 -2-基]亞甲基}-N-(2-羥基 乙基）-2 -氧代- 2,3 -二氫-1H--51嗓-5 -幾睡胺 3-{[3-(4-氰基笨基）-4-({[3-(二乙胺基）-2-羥基丙基]胺 基}羰基）-5 -甲基-1H -吡咯- 2-基]亞甲基}-义>^-二甲基-2-氧1 代-2 . 3 -二氫-1 Η -丨哚-5 -致醯胺 -39-
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(2l〇x 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（35 )
19N
2 ON
21N
22N
23N
4-(4 -氛基苯基）-Ν-[3-(二乙胺 基卜2·超基丙基]-2 -甲產-5-{ [ 5 -(嗎啉-4 .基羰基）· 2 -氧代 -1，2 -二氫-3 Η -叫|哚-3 -亞基]甲 基}—ΙΗ-»比洛-3-幾链胺
3 _{ [3 -(4-氯笨基）-4-({[3 - (二乙胺基）-2 -羥基丙基]胺 基}叛墓）_5·甲基-1Η-»比洛 -2 -基]亞甲基}·2 -氧代-Ν-笨 基- 2,3 -二氫朵-5-幾驢胺 3-{[3-(4-氣苯基）-4-({[3-(二乙胺基）-2-羥基丙基]胺 基}羰基）-5 -甲基-1H -吡咯- 2-基]亞甲基}-2 -氧代-N-苯基 -2，3 -二氫-1 Η -翎哚-5 -羧醢胺
5-[(5 -氟-2-氧代-1,2 -二氫 -3 Η - 4哚-3 -亞基）甲基]-Ν -[2-羥基-3-(2Η-四唑-2-基） 丙基]-2,4-二甲基-111-吡咯 -3 -羧醯胺
Η 5-[(5 -氣-2-氧代·1，2 -二氩 -3Η-叫丨哚-3-亞基）甲基卜Ν-[2 -經基- 3- (2Η -四吐-2-基） 丙基]-2,4-二甲基-1只-吡咯 -3 -羧醢胺 -40- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1324155 Α7 Β7 五、發明説明（36 24Ν
-,—, Μ 2 { - } * - 2基 唑-51’甲 四基ΛΙ Η·甲基基胺 2二氧亞睡VV3·-敌 3 4 *1 2’氟哚-3 呈]-'*,?咯 -#基 5Η-吡 VI5-H- Ν基氧氫-1 基
2SN Ο
ΟΗ 5 - [ ( 5 -氟-2 -氧代-1，2 -二氫 -3 Η - Μ丨哚-3 -亞基）甲基]-N -[2-羥基-3-(1Η-四唑-1-基） 丙基】-2,4 -二甲基-1Η·吡咯 -3 -羧醯胺 26Ν 27Ν
Η 氫NiJ略 二]--吡 2-基 IH-，甲吐1 -9 - 代基，基 V1H〒• - ί 二 23 -- 1--34’胺 ./基-2醯 5 d經1竣 [(H*#基 f * 3 2 θ 3 5 - - -[-- 1 /1» - 1/ --2基 唑-51V 四基)-^]f H-甲基基胺 1二氧亞醯 -(-甲3-羧 3 4 - · V-1哚-3 -[2k"H3H N基氧氫-1 23Ν
4-氣哚基 I --"p ΜY4-胺 ί岌2’睡 V二]-羧 ，丙2-基3-6,基1，甲. 2¾-,0洛 -[t代基f 3-2氧亞-5 {] - ' Η Ν-基-2-3-1 -41 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1324155 Α7 Β7 五、發明説明（37 Ν ο 3 Ν 4 3 Ν 5 3
NH
NH 2-基 1’甲啉--胺 1)¾-¾.¾^ 2--3-基-3 ^-6-.^--i%基比 σ α ,(-5[2羥扣 (u^ * IH -3 3 2 l 5 - /\ , - 氩Ν 基基 甲 胺 基醯 4-f氧 rn« 二厂-- 啉-甲哚-3 嗎4,氟"!!咯 基-2三i-吡 \>/\H - 基5·-3» \一丙<-氩-1 6 基L^二} .I氧--基 [2羥-2-Fi 3 2 ί 1 1J -{]--{)-基 Ν-基-5基亞 甲 οκνο — .基幾 代基甲M3-氧-ii3-基f * /IV . 2 3 - 1 比 _ -、3 I-0 -Y基il 5 - % - [(Ht咪基 5-·312代子 ，·甲
-氧二 氩 Ν 二4-f2:’胺 2-基 2V
/甲甲胺 .一-一氟3·醯 '54三^-複 2，{^·--- I J 基ϋ 甲基弋H# 3-丙 ί:4 ^)2-11 基E-z)2 基 2-? } j -[味-5基基 N-代基氧亞
3 6N
37N 3-[(5 -氣-2-氧代-1，2 -二氫- 3Η· β哚-3 -亞基）甲基】-Ν - [ 2 -羥基 -3-(3 -甲基-2, 5 -二氧代咪唑啶 -1-基）丙基】-2,4-二甲基-1H-吡咯-3 -羧醯胺 N - [ 3 - ( 1 . 1 -二氧化硫嗎啉-4 -基）-2-羥基丙基]-2,4-二甲基 -5-[(2 -氧代-1.2 -二氫- 3H-°4丨哚-3 -亞基）甲基]-1 Η ·吡咯 -3 -羧醢胺 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4规格(210 X 297公釐）
發明説明 A7 B7
38N
N - [ 3 - ( 1，1 -二氧化硫嗎_啉-4 -基）-2 -經;丙基]氣- 2-氡代-〖，2 -二氫-3 K哚-3 -亞 基）甲基]-2,4 -二甲基- IH -吡咯 -3 -羧醯胺
39N
n^vV H oh 、 5-[(5-氣-2-氡 & -3 Η - Μ丨哚-3 -亞基）甲基卜 [3 - ( 1，1 -二氧化硫嗎B林_ 4 ·基） -2 -經基丙基]-2,4 - 一甲基-1H 吡咯-3 -幾醯胺
4 ON
5 - [( 5 -溴· 2 -氧代-1，2 -二氫-3 Η _ 啕哚-3·亞基）甲基]-Ν·[3 乂1， 二氧化硫嗎淋-4 -基）-2_經塞 丙基卜2，4·二甲基-1 Η-吡咯 -3 -叛睡胺 本發明其他代表化合物示於下表1表1 c 化合物編號 結構 名稱
46S 5-((Z)-5-氟-2-氧代-1,2-二氫· 啕哚· 3，亞基甲基）-2，4 -二甲基 -I Η ;吨咯-3 -羧酸〇 R ) - 2二羥基 -3 -嗎啉-4-基-丙產_)-甲基-醯胺 43- 本紙張尺度適用中國國家樣準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（39 表1 a-1 c所列之化合物僅為例舉而非用以限制本發明範 圍。 較佳具體例 雖然最大定義已見於本發明概述，但較好為下述之某些 式（I)化合物。 式（I)化合物較佳為其中： R6係選自氫或烷基所成之組群’較佳為氫、甲基、乙基、 異丙基、弟二丁基、異丁基或正丁基，更好為氫或甲基； 及 R7係選自氫、烷基、芳基、雜芳基及所成組群，其 中R為致基、燒基、環燒基 '芳基或雜芳基，及更妤R7為 氫、甲基 '乙基、異丙基、正·、異或第三丁基、苯基 '苯 甲醯基、乙醯基或羧基，甚至更好為甲基、氫或苯基。 2. 另一較佳式（I)化合物為其中： R6係選自氫或烷基所成之組群，較佳為氫、甲基、乙基、 異丙基、第二丁基、異丁基或正丁基，更好為氫或甲基， 最好為甲基； R7係選自氫 '烷基、芳基、雜芳基及_c(〇)Ri7所成组群， 其中R17為幾基、烷基或芳基，及R7更好為氫、甲基、乙 基、異丙基、正-、異或第三丁基、苯基、笨甲醯基、乙醢 基或羧基，甚至更好為甲基、氫或苯基；及 R3、R4及R5為氫；及 Z為芳基。 3. 另一較佳式（I)化合物為其中： -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱〉 1324155 A7 ___B7 五、發明説明（4〇 ) R係選自氩或炫基所成之組群，較佳為氫、甲基、乙基、 異丙基、第三丁基、異丁基或正丁基，更好為氫或甲基’ 最好為甲基； R係選自氫、炫基、芳基、雜芳基及_C(〇)R17所成组群，其 中R17為超基、燒基或芳基，及R7更好為氫 '甲基、乙基、 異丙基、正-、異或第三丁基、苯基、苯甲醯基、乙醯基或 幾基’甚至更好為甲基、氫或苯基，最好為甲基；及 Rh R4及R5為氫；及 Z為雜芳基，較好為三"井基、四吨基、咪咬基、β比咬基、喊 咬基或17比°井基。 4. 另一較佳式（I)化合物為其中： R係選自氣或燒基所成之組群，較佳為氣 '甲基、乙基、 異丙基、第三丁基、異丁基或正丁基，更好為氫或甲基， 最好為甲基； R7係選自氫、烷基、芳基 '雜芳基及-C(0)R17所成組群， 其中R17為羥基、烷基或芳基，及R7更好為氫、甲基、乙 基、異丙基、正-、異或第三丁基、苯基、苯甲醯基、乙醯 基或羧基，甚至更好為甲基、氩或苯基；及 R3、R4及R5為氫；及 Z為雜環基。 5. 另一較佳式（I)化合物為其中： R0係選自氫或烷基所成之组群，較佳為氫、甲基、乙基、 異丙基、第三丁基、異丁基或正丁基，更好為氫或甲基’ 最好為甲基； -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明Ui ) R7係選自氫、烷基、芳基、雜芳基及_c(0)Ri7所成組群，其 中R17為羥基、烷基或芳基，及R7更好為氫、甲基 '乙基、 異丙基、正-、異或第三丁基、笨基、苯甲醯基、乙醯基或 羧基，甚至更好為甲基、氫或苯基，最好為甲基；及 R3、R4及R5為氫；及 Z為-NR15R16其中尺15及尺16 一起形成雜環基胺基，較好為哌 啶-1 -基、N -甲基哌啶-1 -基、哌__ 4 _基、N -甲基吡咯啶 -1-基、吡咯啶_1-基、嗎啉-4-基、硫嗎啉_4_基、硫嗎啉 -1 -氧化物、硫嗎啉-1，1 _二氧化物、4 •乙氧羰基甲基哌畊 -1-基、3 -氧代味味_1_基、味吐咬_1_基-2_銅、u比嘻咬·ι_ 基-2-酮、2-氧代高哌畊-ΐ_基或四氩嘧啶基_2_酮，更好 為嗎〃林-4 -基。 6. 另一較佳式（I)化合物為其中： R6係選自氩或烷基所成之組群，較佳為氫 '甲基、乙基' 異丙基、第三丁基、異丁基或正丁基，更好為氫或甲基； R7係選自氫 '烷基 '芳基、雜芳基及_c(〇)Rn所成組群，其 中R17為羥基、烷基或芳基’及R7更好為氫、甲基、乙基、 異丙基、正-、異或第三丁基、笨基、苯甲醯基、乙醯基或 羧基’甚至更好為甲基、氫或苯基；及 R3、R4及R5為氫；及 Z為其中及R!6為烷基’較好為二乙胺基、二甲 胺基或乙胺基。 7. 上述較佳及更佳化合物⑴.⑷中，甚至更佳之化合物為 其中： -46- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公费） 1324155 A7 B7 五、發明説明（42 ) R1為氫、烷基、-C(0)NR12R13 '未取代環烷基，較好為 氫、3,4-二甲氧基苯基胺基羰基、4-甲氧基-3-氣苯基胺基 羰基，.甚至更好為氫或甲基，最好為氫；及 R2為氫、氰基、鹵素、低碳烷氧基或S (0)2NR9R1<3其中R9 為氫及R1()為氫、芳基或烷基且在氧吲哚環之5-位置，較好 R2為氫、氣、溴 '氟、甲氧基、乙氧基、苯基、二甲胺基 磺醯基、3 -氣苯基-胺基磺醯基、羧基、曱氧基、胺基磺醯 基、甲基胺基磺醯基、苯基胺基磺醯基、吡啶-3-基-胺基磺 醯基、二甲胺基磺醯基、異丙胺基-磺醯基，更好為氫、氟 或溴。最好R2為氟且位於二氫峭哚酮環之5-位置。 上述較佳、更佳及甚至更佳化合物中， -CONHCH(R3)*CR4(OH)CR5Z鏈中帶有羥基且以*表示之碳原子 之立體化學性為RS、R或S，更好為S。 利用性 其催化活性受本發明化合物調節之PKs包含蛋白質酪胺酸 激酶（其有兩類：受體酪胺酸激酶（RTKs)及細胞酪胺酸激 酶（CTKs))及絲胺酸-蘇胺酸激酶（STKs)。RTK調節之訊 號傳導係由於與特異生長因子（配位基）之胞外相互作用而起 始，接著受體二聚化、固有蛋白質酪胺酸激酶活性之暫時 刺激作用及磷醯化作用。因此對細胞内訊號傳導分子產生 結合位置且與可促進適當細胞反應（如對胞外微環境之細胞 分株、代謝效果等）之胞漿發訊分子之光譜形成複合。參見 Schlessinger 及 Ullrich, 1992, Neuron. 9:303-391。 已顯示生長因子受體上之酪胺酸磷醯化位置因發訊分子 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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k 1324155 A7 B7 五、發明説明（43 ) 之SH2(src同源性）區域之高親和性結合位置而發揮功能。 Fantl 等人，1992 ,細胞 69:413-423，Songyang 等人,1994，分子細 胞生物學 14:2777-2785)，Songyang 等人，1993，細胞 72:767-778 及Koch等人，1991,科學,252:668-678。已鑑定出與RTKs有 關之數種胞内受質蛋白質。其可分為兩大類：（1)具有催化 區域之受質，及（2)缺乏此區域但可作為接合物且與催化活 性分子有關之受質。Songyang等人，1993 ,細胞72:767-778。 受體與其受質S H2區域間之相互作用特異性係藉跟隨在磷醯 化酪胺酸殘基周圍之胺基酸殘基所決定。SH2區域及特定受 體上磷醯酪胺酸殘基周圍之胺基酸序列間之結合親和性差 異與其受質磷酿化輪廟所觀察者一致。Songyang等人，1993， 細胞72:767-778。該等觀察提示各RTK之功能不僅由其表現 圖形及配位基利用性所決定，亦由藉特定受體活化之下游 訊號傳導路徑排列所決定。因此，磷醯化提供決定由特異 生長因子受體以及分化因子受體所維持之發訊路徑之選擇 性之重要調節步驟。 主要為溶胞質之STKs影響細胞之内部生化性，經常作為 對PTK事件之下線（down-line)反應。STKs與起始DNA合成 之發訊過程有關且隨後有絲分裂引起細胞增殖。 因此，該等反應中，PK訊號傳導導致細胞增殖、分化、 生長及代謝。異常細胞增殖可導致失調及疾病之廣泛分 布，包含發展贅瘤如癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤及血管 瘤、失調如白血癌、牛皮癖、動脈硬化、關節炎及糖尿病 視網膜病及其他與未控制之血管形成及/或脈管形成有關之 -48- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155
失調。 然而，雖未受任何料機制或理論所限制，但相信該化 合物與PKs催化區域中之胺基酸相互作用。pKs典型上帶有 雙葉結構其中ATP結合於其中胺基酸保存pKs之區域中兩葉 間之裂口處。PKs之抑制劑相信可藉非共價相互作用如氫 鍵、凡德瓦爾力及離子相互作用結合於其巾前述ΑΤρ結合 至PKs之相同一般區域。更詳言之，認為本發明之2_二氫吲 哚酮化合物結合於ΑΤΡ腺甞環所正常佔據之—般空間。特 定分子對特定ΡΚ之特異性接著可因為2•二氫吲哚酮核心上 之各種取代基與對特定PKs特異之胺基酸區域間之額外相互 作用結果而升高。因此’不同二氫啕哚酮取代基可造成對 特定PKs之優勢結合。選擇在不同ατρ(或其他核苷酸）結合 位置活化之化合物之能力使本發明化合物可標的具有此位 置之任何蛋白質。因此本文揭示之化合物具有體外分析此 蛋白質之利用性以及經由與此蛋白質相互作用展現體内治 療效果。 此外，本發明化合物提供治療多種實心腫瘤之治療方 法’包含（但不限於）癌瘤、肉瘤包含卡波西氏肉瘤、紅血球 母細胞瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、星細胞瘤、黑色瘤及 肌胚細胞瘤。本發明亦包含治療或預防非實心腫瘤癌如白 血癌。適應症可包含（但不限於）腦癌、膀胱癌、卵巢癌、胃 癌、胰癌、結腸癌、血癌、肺癌及骨癌。 本文化合物可用以預防、治療及研究之不適當Ρ κ活性有 關之障礙類型進一步實例（但不限於）為細胞增殖失調、纖維 -49- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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k. 1324155 A7 B7 五、發明説明（45 ) 變性失調及代謝失調。 本發明可預防、治療或研究之細胞增殖失調包含癌症、 血管增殖夫調及腎小球細胞增殖失調。 血管增殖失調代表與異常脈管形成（血管形成）及血管形成 (血管擴大）有關之障礙。雖然脈管形成及血管形成在各種正 常生理過程如胚胎發展、corpus luteum形成、外傷癌·癒·及器官 再生中扮演重要角色，但其在癌症發展而導致維持腫瘤存 活所需之新毛細血管形成中扮演中柩角色。血管增殖失調 之其他實例包含關節炎（其中新毛細血管侵入關節及破壞軟 骨）及眼疾病如糖尿病視網膜病（其中視網膜中新毛細血管侵 襲玻璃體、流血及引起視盲）。 已鑑定出兩種結構相關RTKs可以高親和性結合VEGF : fms -狀酵胺酸 l(flt-l)受體（Shibuya 等人，1990, Oncogene. 5:519-524 ; DeVries 等人，1992，科學.255:989-991)及KDR/FLK-1 受 體，亦稱為VEGF-R2。血管内皮生長因子（VEGF)已報導 為具體外内皮細胞生長促進活性之内皮細胞特異有絲分裂 原。Ferrara & Henzel, 1989，Biochein. Biophvs. Res. Comm.. 161:851-858 ; Vaisman 等人，19%，生物化學期刊，265:19461-19566。美 國專利申請號08/193,829、08/038,596及07/975,750所述之資訊強 烈提示VEGF不僅負貴内皮細胞增殖，亦為正常及病理血管 形成之主要調節物。一般參見Klagsbum & Soker，1993，Current Biology, 3(10)699-702 ; Houck 等人，1992，生物化犖期刊. 267:26031-26037。 正常脈管形成及血管形成在各種生理過程如胚胎發展、 -50- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 ：< 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（46 ) 外傷癌癒、器官再生及女性生殖過程如排卵期間corpus luteum 中滤泡發展及生產後胎盤生長中扮演重要角色。Folkman & Shing, 1992,生物化學期刊..267(16):10931-34。未控制之脈管 形成及/或血管形成與如糖尿病之疾病有關以及與生長所賴 之血管形成相關之惡性實心腫瘤有關Klagsbum & Soker，1993, Current Biology. 3(10):699-702 i Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst” 82:4-6 ; Weidner 等人，1991，New Engl. J_ Med., 324:1-5。 VEGF於血管形成及脈管形成期間内皮細胞增殖及移動中 所推測之角色顯示該等過程中KDR/FLK-1受體之重要角 色。如糖尿病（Folkman, 198，XIth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta 等人編輯）第 583-596 頁，Leuven 大學出版 社，Leuven)及關節炎以及惡性腫瘤生長之疾病可源自未控制 之血管形成。參見例如 Folkman，1971, N. Enel. J. Med.. 285:1182-1186。VEGF特異結合之受體為調整及調節脈管形成及/或血 管形成及由此過程引起之各種與異常細胞生長有關之嚴重 疾病之重要及有力治療標的。Plowman等人，1994，DN&P, 7⑹:334-339。更特定言之，KDR/FLK-1受體於新脈管形成 中之高度特異角色使其為治療癌症及與血管未控制形成有 關之其他疾病之治療方法選擇標的。 因此’本發明提供一種可調整及/或調節酪胺酸激酶訊號 傳導（包含KDR/FLK-1受體訊號傳導）以抑制或促進血管形 成及/或脈管形成之化合物，亦即可抑制、避免或干擾 KDR/FLK-1受配位體如VEGF活化時所傳導之訊號之化合 物。雖然相信本發明化合物沿著酪胺酸激酶訊號傳導路徑 -51 - 本纸張尺度適用十國國家標準(CNS) A4规格（210 X 297公釐） 1324155 A7 R7 五、發明説明（47 ) 作用在受體或其他成分，但其亦可直接作用在肇因為未控 制之血管形.成之腫瘤細胞。 雖然基因“flk-I”受體之人類及鼠類相對物之命名不同， 但於許多方面可互換使用。該鼠類受體Flk-Ι及其人類相對 物KDR在細胞内區域内共用93.4%序列同原性。類似地， 鼠類FLK-1結合具有如鼠類VEGF之相同親和性之人類 VEGF，且據此藉衍生自任一物種之配位基所活化。Millauer 等人，1993, Cell, 72:835-846 ; Quinn 等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537。FLK- 1在293細胞（人類胚胎腎纖維母細 胞）中共表現時與人類RTK受質（如PLC-T或p85)有關且隨 後使其酪胺酸磷醯化。 因此倚賴FLK-1受體之模型可直接應用以了解KDR受 體。例如，於鑑定可調節鼠類訊號傳導路徑之化合物之方 法中使用鼠類FLK-1受體可直接應用於鑑定可用以調節人 類訊號傳導路徑之化合物，亦即可調節與KDR受體有關之 活性。因此，鑑定為體外KDR/FLK-1之抑制劑之化學化合 物可確定適用於體内模型。體内小鼠及老鼠動物模型兩者 已證明具有檢視藥劑對KDR/FLK-1誘發之訊號傳導路徑作 用之臨床潛力之優異價值。 因此，本發明提供一種可調整、調節及/或抑制脈管形成 及/或血管形成之化合物，係藉由影響KDR/FLK-1受體之 酵素活性及千擾KDR/FLK-1傳導之訊號。因此，本發明提 供一種治療許多實心腫瘤之治療方法，該腫瘤包含（但不限 於）神經膠母細胞瘤、黑色瘤及卡波西氏肉瘤、及卵巢、 -52- 本纸浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 1324155 A7 B7 五、發明説明（48 ) 肺、乳房、前列腺、胰、結腸及表皮癌瘤。此外’數據提 示投與可抑制KDR/FLK-1調節之訊號傳導路徑之化合物亦 可用以治療血管瘤、再阻塞及糖尿病視網膜病。 再者，本發明有關藉其他受體調節之路徑抑制脈管形成 及血管形成，包含包括flt-Ι受體之路徑。 受體酪胺酸激酶調節之訊號傳導係藉與特異生長因子（配 位基）胞外相互作用而起始’接著受體二聚化、固有蛋白質 酪胺酸激酶活性之暫時刺激作用及自動磷醯化。因此對胞 内訊號傳導分子產生結合位置，其引起與胞漿發訊分子之 光譜形成複合物而促進適當細胞反應’如對胞外微環境之 細胞分株及代謝效果。參見Schlessinger及Ullrich, 1992, Neuron. 9:1-20。 KDR/FLK-1胞内區域與PDGF-yS受體胞内區域之相近 同原性（5 0.3 %同原性）及/或相關fl t-1受體之同原性顯示誘 發重疊之訊號傳導路徑。例如’就PDGF-yS受體而言’ src 族群（Twamley 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:7696-7700)、磷醯肌醇-3、激酶（Hu 等人，1992. Mol. Cell. Biol.. 12:981-990)、構脂酶cr(Kashishian & Cooper，1993, Mol. Cell. Biol.. 4:49-51)、ras-GTP 酶-活化蛋白質（Kashishian 等人，1992, EMBO J., 11:1373-1382)、PTP-ID/syp (Kazlauskas 等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90:6939-6943)、Grb2 (Arvidsson 等人，1994, Mol. Cell. Biol.. 14:6715-6726)及接合物分子 S h c 及 N c k (Nishimura 等人，1993, Mol. Cell. Biol.. 13:6889-6896)成員已顯示可結合至包含不同自動 石粦酷化位置之區域。一般參見Claesson-Welsh, 1994，Prog. Growth -53- 本纸浪尺度適用中國國家操準(CNS) A4規格(.210 X 297公釐）
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線 1324155 A7 ___B7_ 五、發明説明（49 )
Factor Res., 5:37-54。因此，似乎藉KDR/FL K-1活化之訊號傳 導路徑包含 ras路徑（Rozakis 等人，1992, Nature. 360:689-692) ' PI-3二激酶' src -調節及pier -調節之路徑。各該等路徑在内 皮細胞中KDR/FLK-1之血管形成及/或脈管形成效果中扮 演主要角色。結果，本發明又另一目的係有關一種所述有 機化合物用以調節血管形成及脈管形成之用途，因此過程 可受該等路徑條控制。 相反地，與血管收縮、攣縮或閉塞之失調如再阻塞亦有 關聯且可藉本發明方法治療或預防。 纖維變性失調代表胞外母質異常形成。纖維變性失調實 例包含肝硬化及腎小球細胞増殖失調。肝硬化特徵為導致 肝瘢形成之胞外母質構成分増加。導致肝瘢形成之胞外母 質增加亦可藉病毒感然而引起如肝炎》脂細胞在肝硬化中 似乎扮演主要角色。其他有關之纖維變性失調包含動脈硬 化。 腎小球細胞增殖失調代表腎小球細胞異常增殖之失調。 腎小球增殖失調包含各種人類腎疾病如絲球體腎炎'糖尿 病腎疾病及惡性腎硬化以及如栓塞小血管徵候群、移植排 斥及絲球體腎炎之失調。該RTK PDGFR與維持腎小球細胞增 殖有關聯。Floege 等人，1993, Kidney International 41:47S-54S。 許多腫瘤為細胞增殖失調且如前述，PKs與細胞增殖失調 有關。因此，PKs例如RTK家族成員與癌症發展有關並不 意外。有些該等受體如EGFR (Tuzi等人，1991, Br. J. . Cancer 63:227-233, T〇rp 等人，1992. APMIS 100:713-719)、HER2/neu(Slamon -54- 本紙張尺度適用中國國家槺準(CNS) A4規格（21〇x 297公釐）
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五、發明説明（5〇 ) 等人，1989，科學 244:707-712)及 PDGF-R (Kumabe 等人，1992 Oncogene, 7:627-633)於許多腫瘤中過度表現及/或自體作用迴 路持續活化。事實上，大部分普通及嚴重癌症中，已證實 該等受體過度表現（Akbasak及Suner-AJkbasak等人，1992, J Neurol §£Ϊ·，111:119-133 ’ Dickson 等人，1992，Cancer Treatment 61.249 273，Korc 等人，1992. J. Clin. Invest. 90:1352-1360)及自體作用迴路 (Lee 及Donoghue，1992, J. Cell. Biol.. 118:1057-1070, Korc 等人，同前 文獻，Akbasak及Suner-Akbasak等人，同上文獻）。例如， EGFR與鱗狀細胞癌瘤、星細胞瘤、神經膠母細胞瘤、頭類 癌、肺癌及膀胱癌有關。HER2與乳房 '卵巢、胃、肺、騰 及膀胱癌有關。PDGFR與神經膠母細胞瘤及黑色瘤以及 肺、卵巢及前列腺癌有關。R T K c - m e t亦與惡性腫瘤形成 有關。例如’ c - m e t與其他癌、結腸、胸、胰、冒及肝細胞 癌瘤及淋巴瘤有關。兵他c-met與白血癌有關聯。c-met基 因過度表現亦可於患有亨丁頓疾病及布奇特（Burkitts)疾病之 病患中偵測。 IGF-IR除了與營養受體及π-型糖尿病有關以外，亦與數 種癌症有關。例如，IGF-I可作為數種腫瘤型如人類乳癌癌 瘤細胞（Arteaga 等人，1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423 )及小肺腫 瘤細胞（Macauley 等人，1990, Cancer Res. 50:2511-2517)之自體作 用生長刺激劑。此外，IGF-I雖然整體涉及神經系統之正常 生長及分化，亦似乎為人類神經膠瘤之自體作用刺激劑。 Sandberg-Nordqvist 等人，1993, Cancer Res.. 53:2475-2478 0 IGF-IR 及其配位基於細胞分化中之重要性進一步藉許多型細胞（纖 -55· 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格（21〇x 297公嫠） 1324155 A7 B7 五、發明説明（5l ) 維母細胞、表皮細胞、平滑肌細胞、T -淋巴細胞、骨髓細 胞、軟骨細胞及骨母細胞（骨髓之'幹細胞））於培養基中受 IG F -1刺激而生長之事實加以支持。Goldring及Goldring，1991, Eukaryotic Gene Expression. 1:301-326。Baserga 及 Coppola 提示 IG F-IR在轉形機制中扮演主要角色且就此可為廣範圍人類惡性 瘤之治療仲介之較佳標的。Baserga, 1995，Cancer Res.. 55:249-252 ’ Baserga, 1994, Cell 79:927-930，Coppola 等人，1994, Mol. Cell. Biol.. 14:4588-4595。 STKs與許多癌症有關主要包含乳癌（Cance等人，Int. J. Cancer. 54:571-77(1993)) » 異常P K活性及疾病間之關聯並未限於癌症。例如， RTKs與如牛皮癬、糖尿病、子宮内膜異味、血管形成、粥 瘤癒發展、阿海默氏疾病、再阻塞、von Hippel-Lindau疾 病、表皮過度增殖、神經退化疾病、年齡相關斑點退化及 血管瘤等疾病有關。例如，EGFR已適應於角膜及真皮受傷 疾癒· °騰島素-R及IGF-1R之缺陷適應於H -型糖尿病，特 異RTKs及其治療適應症之更完全關聯述於pi〇wman等人 1994, DN&P 7:334-339。 如前述’不僅RTKs且CTKs[包含（但不限於）src、abl、 fps、yes、fyn、lyn ' lck、blk、hck、fgr及yrk(回顧於 Bolen 等人，1992，FASEB J·，6 : 3 403 - 3 40 9)]涉及增殖 及代謝訊號傳導路徑且因此預期且已顯示與本發明所指之 多種ρτκ-調節失調有關。例如’突變Src(v-src)已顯示為 雞中之瘤蛋白質（pp6〇v-src)。再者’其細胞同原性 '該致 -56 - 本纸張尺度適用中目S家標準(CNS)以規格(21G X 297公釐〉 ~ ' 1324155 A7 B7___ 五、發明説明（52 ) 癌基因原pp60c_src傳遞許多受體之致癌基因訊號。EGFR 或HER2/neii於腫瘤中過度表現引起PP6〇c sr質體活化’ 其特徵為惡性細胞但不存在於正常細胞。另一方面’小鼠c -src表現不全呈現骨質石化表型’包含c-src於破骨細胞功能 中之主要參與及可能涉及相關失調。 類似地，Zap70與T -細胞發訊有關，其與自動免疫失調 有關。 STKs與發炎、自動免疫疾病、免疫反應及過度增殖失調 如再阻塞、纖維變性、牛皮癬、骨關節炎及風濕性關節炎 有關。 PKs亦與胚胎移植有關。因此，本發明化合物可提供有效 預防此胚胎移植之方法且因此可用於生育控制劑。使用本 發明化合物可治療或預防之其他失調為免疫學失調如自動 免疫疾病、A fD S及心.血管失調如動脈硬化。 最後，RTKs及CTKs兩者目前懷疑與過度免疫失調有 關。 本發明數種例舉化合物對數種P T K s之效果示於下表2。 所提出之化合物及數據並非為以任何方式用以限制本發明 範圍。 投藥及醫藥组合物 本發明化合物或其醫藥可接受性鹽可就此對人類病患投 藥或可以醫藥組合物投藥其中前述物質與適當載體或賦型 劑混合。調配及投與藥物之技術見於“雷明頓氏藥理科 學”’ Mack出版社’ Easton，PA，末代版。 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155
本文所述“投與”或“投藥，，代表輸送式⑴化合物或其醫藥 可接受性鹽或含本發明式⑴化合物或其醫藥可接受性鹽之 醫藥組合物至有機體而提供預防或治療ρκ•相關失調之目 的0 投藥適當路徑可包含（但不限於）口服'直腸、經黏膜或腸 内投藥或肌肉β '皮下、髓内、鞘内、直接靜脈内、靜脈 内、玻璃體内'腹膜内、鼻内或眼内注射。較佳投藥路徑 為口服及非經腸道。 另外，可局部㈣化合物而非全身性方<，例如將化合 物直接注入腫瘤，經常呈儲器或持續釋出調配物。 裝 再者，可以標的藥物輸送系統投與例如以腫瘤特異之抗 體包覆之脂質體。脂質體將標的至腫瘤且由腫瘤選擇性吸 收。 訂
線 本發明之醫藥組合物可藉本技藝已知技術製造，例如藉 習知混合'溶解、造粒、包糖衣、磨粉、乳化、包囊、包 埋（entrapping )及凍乾製程製造。 本發明所用之醫藥组合物可以習知方式使用一或多種生 理可接觉性載體（包括可促進活性化合物滲透入可醫藥使用 之製劑中之賦型劑或佐劑）調配。適當調配物随選用之投藥 路徑而定。 就注射而言，本發明化合物可調配為水溶液，較好於生 理可相谷緩衝液中如漢氏溶液、林格氏溶液或生理食鹽緩 衝液。就經黏膜投藥而T ’於調配物中使用適於欲渗透障 壁之滲透劑。此參透劑為本技藝已知。 -58- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X 297公釐） 1324155 A7 ______B7 五、發明説明（54 ) 就口服投藥而言’化合物可藉組合活性化合物與本技藝 悉知之醫藥可接受性載體而調配。此載體可使本發明化合 物調配為錠劑、丸劑、扁藥劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝 膠、糖漿、漿液、懸浮液等，供病患經口消化。口服用之 醫藥製劑可使用固體賦型劑，視情沉研磨所得混合物及加 工該混合物之顆粒’隨後若需要添加其他適當佐劑而獲得 錠劑或糖衣錠核心。可用之賦型劑尤其為填充劑如糖包含 乳糖、蔗糖、甘露糖醇、或山梨糖醇，纖維素製劑如玉米 澱粉、小麥澱粉、稻米澱粉及馬铃薯澱粉及其他物質如明 膠、黃耆膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素'羧甲基纖 維素鈉、及/或聚乙烯基吡咯烷酮（PVP)。若需要，可添加 崩解劑如交聯聚乙缔基11比嘻坑•酮、洋菜或褐漢酸。亦可使 用鹽如褐藻酸鈉。 糖衣錠核心設有適·當包衣9就此目的，可使用糖濃溶 液，其可視情況含有阿拉伯膠、滑石、聚乙埽基吡咯烷 酮、卡波醇膠、聚乙二醇及/或二氧化鈦、塗漆溶液及適宜 有機溶劑或溶劑混合物。可於錠劑或糖衣錠包衣中添加染 料及顏料供分辨或標示不同活性化合物劑量之組合物。 可口服使用之醫藥組合物包含由明膠製得之推裝（push-fit) 膠囊以 及由明 膠及塑 化劑如 甘油或 山梨糖 醇製得 之軟密 封膠囊。該推裝膠囊含有活性成分與填充劑如乳糖、黏合 劑如殿粉 '及/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂及視情況之安定 劑之混合物。軟膠囊中’活性化合物可溶於或懸浮於適當 液體如脂肪油、液體石蠟、或液體聚乙二醇中。安定劑亦 -59- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公爱） 1324155 A7 B7 五、發明説明（55 ) 可添加於該等調配物中。 亦可使用之醫藥組合物包含硬明膠膠囊。至於非限制性 實例，該活性化合物膠囊口服產品調配物可為5 0及2 0 0毫克 劑量濃度。該兩劑量濃度係由相同顆粒藉填入不同大小之 硬膠囊中製備，50毫克膠囊為3號大小及200毫克膠囊為0 號大小。調配物組合物可為例如表2所示。 表2 成分 名稱/等級 粒化濃度 (%w/w) 50毫克膠囊中 之量(毫克） 200毫克膠囊 中之量(毫克） 活性化合物NF 65.0 50.0 200.0 甘露糖醇NF 23.5 18.1 72.4 交聯竣甲基纖 維素鈉NF 6.0 4.6 18.4 聚乙烯p比洛燒 酮K 30 NF 5.0 3.8 15.2 硬脂酸鎂NF 0.5 0.38 1.52 膠囊，瑞典黃NF Size 3 Size 0 該膠囊可包裝入棕色玻璃或塑膠瓶中以使活性化合物避 光。含活性化合物膠囊調配物之容器可儲存於經控制之室 溫（1 5 - 3 0。(：）。 藉吸入投藥，本發明所用之化合物可以氣溶膠噴霧使用 加壓包裝或噴霧器及適當推進劑形式輸送，如（不限於）二氣 二氟甲院、三氣氟甲垸、二氣四氟乙垸或二氧化破。加壓 氣溶膠之例中，劑量單位可藉提供輸送計量量之閥而控 制。例如使用於吸入器或吹入器之明膠之膠囊及匣可調配 為含本化合物及適當粉末基劑如乳糖或澱粉之粉末混合 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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線 1324155 五、發明説明（ 56 A7 B7 物。 4化口物亦可調配供非經腸道投藥如藉丸劑注射或連績 灌注° >王射調配物可為單位劑型如於安瓿中或多劑量容 器’並添加保存劑。該组合物可製成於油性或水性載劑中 之懸斤液、容液或乳液且可含有調配物質如懸浮劑、安定 劑及/或分散劑。 非經腸道投藥之醫藥組合物包含水可溶鈦之水溶液如（未 限於）活性化合物之鹽。此外，活性化合物之懸浮液可於親 水性載劑中製備。適當親水性載劑包含脂肪油如芝麻油、 合成脂肪酸酯如油酸乙酯及三酸甘油酯，或如脂質體之物 質。水性注射懸浮亦可含有可增加懸浮液黏度之物質，如 叛甲基纖維素鈉、山梨糖醇或糊精。視情況，懸浮液亦可 含有適當安定劑及/或増加化合物溶解度而可製備高濃度溶 液之藥劑。 另外’活性成分可為粉末態供使用前以適當載劑如無菌 無熱源水復原。 該化合物亦可調配為直腸組合物如栓劑或流滯灌腸劑， 使用例如習知栓劑基劑如可可奶油或其他甘油酯。 除了前述調配物以外，該化合物亦可調配為儲器製劑。 此長效調配物可藉植入（例如皮下或肌肉内）或藉肌肉内注射 投藥。本發明化合物可以適當聚合或疏水性物質調配成供 此路徑投藥（例如與藥理可接受性油之乳液），以離子交換樹 脂或以難溶衍生物如（未限制）難溶鹽調配》 本發明疏水性化合物之醫藥載體之非限制實例為包括芊 -61 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格（210 X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（S7 ) 醇、非極性界面活性劑、水可溶混有機聚合物及水性如 VPD輔溶劑系統之輔溶劑系統。VPD為3%w/v芊醇、 8 °/〇 w/v非極性界面活性劑聚山梨糖醇酯8 0及6 5 % w/v聚乙 二醇300之溶液’以絕對乙醇構成所需體積。該vPD輔溶劑 系統（VP D : D 5 W)由乙5 %葡萄糖之水溶液以1: i稀釋之VP D 所構成。此輔溶劑系統充分溶解疏水性化合物及在全身性 投藥後本身產生低毒性。自然，此輔溶劑系統之比例可相 當地變化而不損及其溶解度及毒性特徵^再者，輔溶劑成 分確認可改變：例如’可使用其他低毒性非極性界面活性 劑替代聚山梨糖醇酯80 ’聚乙二醇之溶離份大小可改變， 其他生物可相容聚合物可置換聚乙二醇如聚乙浠基吡咯烷 酮及其他糖或多糖可替代葡萄糖。 另外，可利用疏水性醫藥化合物之其他輸送系統。脂質 體及乳液為疏水性藥物之輸送載劑或載體之悉知實例。此 外，可利用某些有機溶劑如二〒基亞碱，但經常有較大毒 性。 此外，化合物可使用持續釋出系統輸送如含治療劑之固 體疏水性聚合物之半透性基質。各種持續釋出物質以建立 且為本技藝悉知。持續釋出之膠囊隨其化學性質而定可釋 出化合物達數週至超過⑽天。隨化學性質及治療劑之生物 安定性而異，可使用其他蛋白質安定化之標的。 本文之I藥组合物亦可包括適當固體或凝膠相載體或賦 型劑。此載體或賦型劑實例包含（但不限於）硬_、鱗酸 齊、各種糖、戰粉、纖維素衍生物、明膠、及聚合物如聚 -62- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（58 ) 乙二醇。 本發明許多PK調節化合物可提供為生理可接受性鹽其 中所請化合物可形成負或正電荷物種。其中化合物形成正 電荷基團之鹽實例包含（但不限於）四級銨（本文他處定義）、 鹽如鹽酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽'酒石酸鹽、蘋果 酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽其中四級銨基之氮原子為與適 當酸反應之本發明經選擇化合物之氮原子。其令本發明化 合物形成負電荷物種之鹽包含（但不限於）藉化合物中羧基與 適當鹼（如氫氧化鈉（NaOH)、氫氧化鉀（KOH)、氫氧化鈣 (Ca(OH)2)寺）反應所形成之鋼、卸、妈及鎂鹽β 適用於本發明之醫藥組合物包含活性成分含量足以達成 所需目的之組合物，如可調節ΡΚ活性或治療或預防ρκ_相 關失調。 更詳言之，治療有效量代表化合物有效預防、舒緩或減 緩疾病病徵或延長欲治療個體壽命之量。 投與治療有效量為本技藝悉知者，尤其見於本文之詳細 揭示。 就本發明所用任何化合物而言，治療有效量或劑量最出 可自細胞培養物分析評估。接著，劑量可調配成用於動物 模型因而達成循環濃度範圍，包含於細胞培養物所測定之 1C 5〇(亦即達成ΡΚ活性一半最高抑制作用之測試化合物濃 度）。此資訊接著可用於更精確測定人類之有用劑量。 本文化合物之毒性及治療效果可藉標準醫藥程序於細胞 培養物或實驗動物中測定’如藉測定化合物之IC5〇及 -63- 本纸張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格（210X297公楚〉
裝 訂 線 1324155 A7 B7 五、發明説明（59 ) ld5〇(兩者均述於後文）。自該等細胞培養物分析及動物研 究所得之數據可用於調配人類所用之劑量範圍。該劑量可 隨所用劑型及投藥路徑而異。確實調配物 '投藥路徑及劑 量可由個別醫師由病患病況加以選擇》(參見例如Fingl等 人，1975，“治療醫藥基礎”第1章第1頁）》 劑量及間隔可個別調整以提供足以維持激酶調節效果之 活性物種血漿量。該等血漿量代表動物有效濃度（MECs)。 該MEC將對各化合物而異但可自體外數據評估，如使用本 文所述分析可探究達到激酶50-90%抑制作用所需之濃度。 達到MEC所需劑量將視個別特徵及投藥路徑而定。hplc 分析或生物分析可用以測定血漿濃度。 劑里間隔亦可使用Μ E C值而測定。化合物需使用可在1 〇 _ 90%時間内維持血漿量高於MEC之方式決定，較好在3〇_ 9 0 %之間及更好5 〇 - 9 0 %之間。 目如’式I、la或II化合物之治療有效量可在每天約25毫 克/m2至1500毫克/m2之範圍；較好約3毫克/m2/天，甚至 更好5 0毫克/qm qd至400毫克/qd。 局部投藥或選擇性攝取之例中’有效局部濃度<藥物未 必與血漿濃度相關及本技藝已知之其他程序可用以決定正 確劑量及間隔。 當然投藥之组合物量將隨欲治療個體、罹患嚴重性、投 藥方式、臨床醫師判斷等而定。 該組合物若需要可為包裝或分散裝置，如fda認可之套 組’其可含有-或多種含活性成分之單位劑型。該包裝例 -64 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 裝 訂
線 1324155 A7 B7 五、發明説明（60 ) 如可包括金屬或塑膠箔，如發泡包裝。該包裝或分散裝置 可伴有投藥指示。該包裝或分散物亦可伴有警告事項，其 以政府當局規範製造商、醫藥使用或銷售之處方藥形式置 於容器中，該警告事項反應當局對人類或獸醫投藥之組合 物型態之認可。例如此警告事項可由美國食品藥物管理局 對處方藥之認可標籤或為認可之產品傳單。亦可製備包括 本發明化合物調配於可相容醫藥載體中之組合物，置於適 當容器中及標記處理適應病沉。標籤上所示之適宜病況可 包含治療腫瘤、抑制血管形成、治療纖維變性' 糖尿病 等。 本發明可以C MC懸浮載劑投藥。例舉之C M C懸浮液列示 於下表3。 表3 成分 濃度％ (w / V ) API 本 羧甲基纖維素鈉,USP(中度等級） 0.5 氣化鈉，USP/NF 0.9 聚山梨糖醇酯80, NF 0.4 芊醇，NF 0.9 去離子水 適量至100毫升 *視所需濃度（數據）而定 1.0升C M C懸浮載劑議定書如下。計算使用顯示載劑調配 物之組合物及批次量之表製造載劑調配物所需之賦型劑適 當量。秤取適宜空容器，如乾淨寬嘴玻璃瓶或聚乙缔瓶。 -65 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 -------------B7___ 五、發明~~) 添加約600毫升水至容器中。秤取羧甲基纖維素鈉（5克）及 移至容器中。使用磁攪拌棒或實驗器攪拌器以適當槳攪拌 直至均勻（約2·3小時）。秤取NaCl及添加至容器中。繼續攪 掉直至落解（約1 0分鐘）。添加聚山梨糖醇酯8 0。混合直至 溶液均勻（約20分鐘）^添加芊醇。混合直至溶液均勻（約1〇 分鐘）。添加剩餘水以使溶液重量達所需批次量（重量或體積 (10 10克或1000毫升，在22°C密度為1.0 1))。在2-8 X：儲存 (於冰箱）。 该懸浮液調配物可如下製造。使用研練及杵研磨獲得 小粒&之均質粉末（無厚塊或大顆粒-理想需通過uS標準網 篩>80，亦即<180微米大小）。秤取計算量之Αρι至容器 中。添加約90%總需要量之（CM(：懸浮載劑）至容器中。化 合物使用具槳或均等物之實驗室攪拌器懸浮於載劑中。槳 板直徑需符合容器底部直徑以確使有效混合。在5〇 rpm攪 拌3 0分鐘或直至藥物充分懸浮。添加載劑調配物至“適 量”（添加水）（族量）至符合批次量之適當重量。在5〇 rpm再 攪拌30分鐘。整份懸浮液立即放入褐色玻璃或聚乙烯容器 中。容器可避免照光。在2-8°C儲存（在冰箱中但未冷凍）^ 亦為本發明目的者為本文化合物或其鹽或前藥可與治療 上述疾病及失調之其他化學治療劑組合。例如，本發明化 合物、其鹽或前藥可與烷化劑如氟尿素（5_FlJ)單獨或再與 白細胞素（leukovorin)組合；或其他烷化劑如（但未限於）其他 嘧啶類似物如UFT、卡配希塔濱（capecitabine)、間希塔演 (gemcitabine)及希塔濱（cytarabine)，烷基磺酸鹽如布舒番 -66- 本纸張尺度適用中S @家標準(CNS) A4規格(21G X 297公费)' -------- 1324155 A7 B7 五、發明説明（62 ) (busulfan)(用以治療慢性腺細胞白血癌）、衣普舒番 (improsulfan).及派普舒番（piposulfan);奇利淀（aziridines)如苯代 巴（benzodepa)、碳_ 自昆（carboquone)、美 土代巴（meturdepa)及尿 代巴（uredepa);伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，如阿催胺 (altretamine)、三乙基三聚氰胺、三伸乙基鱗酿胺、三伸乙基 硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；及氮芥如氯拉布希 (chlorambucil)(用於治療慢性淋巴細胞白血癌、主要大球蛋白 血症及非亨丁頓淋巴癌）、環磷醯胺（用於治療亨丁頓疾病、 多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、威 耳母腫瘤及橫紋肌肉瘤）、衣斯托母;丁（ estramustine)、愛發麥 (ifosfamide)、語凡濱青（novembrichin)、潑尼母（丁（ prednimustine) 及脲嘧啶芥（用以治療主要血小板增多症、非亨丁頓淋巴 癌、亨丁頓疾病及卵巢癌）；及三畊類如大卡班哜 (dacarbazine)(用於治療軟性組織肉瘤）。 本發明化合物或其鹽或前藥亦可與其他抗代謝化學治療 劑組合使用，例如（但不限於）葉酸類似物如甲喋呤（用於治 療急性淋巴細胞白血癌、絨毛膜癌、黴真菌乳癌、頭頸癌 及成骨肉瘤）及配托寧（pteropterin);及嗓呤類似物如氫硫基 嘌呤及硫鳥嘌呤，其發現用以治療急性腺細胞、急性淋巴 細胞及慢性腺細胞白血癌。 期望本發明化合物、其鹽或前藥亦可用於與天然產物為 主之化學治療劑組合，如（但不限於）蔓長春生物鹼如長春鹼 (用於治療乳癌及睪丸癌）、長春新驗及長春芬（vindesine); 表鬼臼脂素如托普塞（etoposide)及田尼普塞（teniposide)，兩者 -67- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格（210X 297公釐）
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線 1324155 A7 _R7_ 五、發明説明（63 ) 均可用以治療睪丸癌及卡波希氏肉瘤；及抗生素化學治療 劑如代諾函.濱（daunombicin )、多索鹵濱（doxorubicin )、衣普鹵 濱（epirubicin)、絲裂徽素（用以治療胃、頸、結腸、乳房、膀 胱及胰癌）、大慶黴素（dactinomycin)、鐵默羅麥 (temozolomide)、皮肯黴素（plicamycin)、布列徽素 (bleomycin)(用於治療皮膚、食道及生殖泌尿道癌）；及酵素 化學治療劑如L-天門冬胺酸酶。 除了上述以外，本發明化合物、其鹽或前藥亦可與鉑配 位複合物（順氯胺鉑等）組合使用；經取代尿素如羥基尿素； 甲基聯胺衍生物如普卡巴°井（procarbazine);腎上腺皮質抑制 劑如米按坦（mitotane )、胺基苯乙旅咬酮（aminoglutethimide ); 及激素及激素拮抗劑如腎上腺皮質類固醇（如潑尼松 (prednisone ))'孕酮素（progestins )(如經基孕銅己酸鹽）；雌激 素（如二乙基己晞雌齡);抗雌激素如泰默希吩（tamoxifen); 雄性激素如丙酸睪丸素；及芳酶抑制劑如安納掩吐 (anastrozole) ° 最後，亦期望本發明化合物之組合將可有效與米托山酮 (mitoxantrone )、帕利塔森（paditaxel)、本技藝已知之環氧酶-2 抑制劑，尤其是PCT公報W0 99/11605揭示之Celebrex®、 Paracoxib®、Vioxx®、Abbott’s Cox-189、拓樸異構酶抑制劑如肯 技沙（Camptosar®) 、H.er-2受體结抗劑如赫瑟汁 (Herceptin®)、胺多斯達汁（endos+tatin)、革利瓦（Gleevac®)、因 隆VEGF受體拮抗劑IMC C225®用以治療實心腫瘤癌或白血 癌如（未限於）急性脊髓（非淋巴細胞）白血癌。 -68- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐）
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線 1324155 A7 ___R7 _ 五、發明説明（64 ) 一般合成程序 下列一般方法可用以製備本發明化合物： 適當取代之2-氧吲哚（1當量）、適當取代之3-羧基-5-曱 醯基吡咯（1.2當量）及鹼（0.1當量）於溶劑（1-2毫升/毫莫耳 2 -氧吲哚）中混合及混合物接著加熱約2至約1 2小時。冷卻 後，過濾所形成之沉澱，以冷卻乙醇或乙醚洗滌及真空乾 燥獲得對應5-(2 -氧代-1,2 -二氫吲哚-(3Z) -亞基甲基）-1-H-吡咯-3-羧酸。若無沉澱形成，則反應混合物濃縮及殘留 物以二氯甲烷/乙醚分散，過濾收集所得固體及乾燥。產物 視情況再藉層析純化。 鹼可為有機或無機鹼。若使用有機鹼，則較好為氮鹼。 有機氮鹼實例包含（但不限於）二異丙胺、三甲胺、三乙胺、 苯胺、吡啶、1，8-二氮雙環[5.4.1]十一碳-7-烯、吡咯啶及 旅咬。 無機鹼實例為（但不限於）氨、鹼金屬或鹼土金屬氫氧化 物、磷酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽及醯胺。鹼金 屬包含鋰、鈉及鉀而鹼土金屬包含鈣、鎂及鋇。 本發明提出之較佳具體例中，當溶劑為極性溶劑如水或 醇時，該鹼為鹼金屬或鹼土金屬無機鹼’較好為鹼金屬或 驗土金屬氫氧化物。 基於有機合成一般已知理論及本文之揭示對熟知本技藝 者將可明瞭本反應所需之最適當鹼。 進行反應之溶劑可為質子或非質子溶劑，較好為質子溶 劑。“質子溶劑’’為具有氫原子共價鍵結至氧或氮原子之= •69· 本紙張&度適用中S S家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公爱)~*------- A7 B7 發明説明（65 劑而賦予氫原子可感之酸性且因此可經 早”。質子溶劑實例包含（但不限於）水及醇。…” 1非質子溶劑，，可為^非極性但於㈣例 =且二無法與溶質氣鍵結。非極性溶劑實例(未_)為 .凡‘/〇苯、甲苯、二氣甲烷及四氣化碳。極性非質 子落劑為氣仿、四氫咬喃、二甲基亞歧二甲基甲酶胺。 於本發明較佳具體例中，溶劑為質子溶劑，較好 醇如乙醇。 π 〜 。反應在向於罜溫之溫度進行。溫度一般自約30。。至約⑴ C，較好約8〇°C至約loot：，最好約6〇χ：至約85艺，其約 為乙醇之沸點。“約”意指溫度範圍較好在所示溫度之⑺攝 氏度以内，更好在所示溫度之5攝氏度以内，及最好在所示 皿度之2攝氏度以内。因此，例如“約7 5。匸”意指7 5乞±丄〇 °C ’ 較好 75°C 土 5eC ’ 及最好 75。〇±2。(：。 2 -氧吲哚及3 -羧基-5 -甲醯基比洛可使用化學技藝已知技 術使用易提供之起始物而合成。 5-(2-氧代-l，2-二氫吲哚·（3Ζ)·亞基甲基吡咯_3· 幾酸與式ZCH(R3)-CR4(OH)-CHR3NH2i胺於有機溶劑 如二1f基甲醯胺、四氫呋喃等及於適當偶合劑如二環己基 碳二醯亞胺、DEAD、EDC及HOBt存在下偶合，獲得式（I) 化合物。式ZCH(R5)-CR4(OH)-CHR3NH2之胺為市售或 可藉本技藝已知方法製備。有些此程序如下文所述。 熟知本技藝者將可知下列舉例方式提供形成本發明化合 物之其他合成路徑但並不限制》 -70- 本紙張尺度適用t國躅家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 装 訂 線 1324155 A7 ________B7_ 五、發明説明（66 ~^- 實例 下列製備及實例可使本技藝者更可了解並操作本發明。 其並不視為限制本發明之範圍，而僅為說明及代表例。 合成實例 實例1 5-[5 -氟·2_氧代-i，2_二氫·吲哚_(3Ζ)·亞基-甲基卜2 4·二 甲基-1Η-吡咯·3-羧酸之合成 步騾1 二甲基甲醯胺（25毫升’ 3當量）於冰浴中授拌冷卻。於其 中添加P0C13(1.1當量，ι〇·8毫升）。30分鐘後，於反應中 添加3,5 -二甲基-4-乙基酯吡咯（17.7克，105.8毫莫耳）之 DMF(2M，40毫升）溶液並繼續攪拌。2小時後，反應以水 (250毫升）稀釋及以in NaOH水溶液鹼化至PH=11。過濾 移除白色固體，以水洗滌接著以己烷洗滌及乾燥獲得褐色 固體之5 -甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯（19,75 克，9 5 %) » 4 NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12.11 (br s，1H，NH)，9.59 (s, 1H, CHO), 4.17 (q, J=6.7 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.40 (s, 3H，QL), 1.26 (d, J=6.7 Hz, 3H, OCH2CH3)。 步騾2 5 -甲醯基-2,4 -二甲基-1H·吡咯-3-羧酸乙酯（2克’ 10毫 莫耳）添加至溶於甲醇（3毫升）及水（10毫升）之氫氧化鉀（3 克，5 3毫莫耳）溶液中。混合物回流3小時，冷卻至室溫及 以6 Ν鹽酸酸化至pH 3。過濾收集固體，以水洗滌及於真芏 烘箱中乾燥隔夜獲得5 -甲醯基-2,4-二甲基-1H-11比洛·3’·幾 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(21〇 χ的7公寶) 1324155 A7 B7 五、發明説明（67 ) 酸（1.6 克，9 3 %)。4 NMR (300 MHz，DMS0-d6) δ 12.09 (s，br，2H， NH & COOH), 9.59 (s, 1H, CHO), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.40 (s, 3H, CH3)-步騾3 5-氟靛紅烷（8.2克，49.7毫莫耳）溶於50毫升聯胺水合物 中及回流1小時。反應混合物接薯倒入冰水中。過濾沉澱， 以水洗滌及在真空烘箱中乾燥獲得5 -氟-2 -氧哬哚（7.5克）。 步騾4 5 -氟氧β卜朵（1〇〇毫克，0.66毫莫耳）、5 -甲醯基-2,4 -二 甲基-1Η-吡咯-3-羧酸（133毫克，0.79毫莫耳）及1〇滴哌啶 之乙醇（3毫升）混合物在6(TC攪拌隔夜及過濾。固體以1 Μ 鹽酸水溶液、水洗滌及乾燥獲得黃色固體之5-[5-氟-2-氧 代-1,2 -二氮-»?丨嗓-3 -亞基甲基]-2,4 -二甲基-1H-11比洛-3-叛 酸（201毫克，定量）。MS m/z(相對強度，％) 299 ([M-l]+， 100)。 實例2 5-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-吲哚-3-亞基-甲基）-2,4-二甲基 -1H-吡咯-3-羧酸（3-二乙胺基-2-羥基-丙基）-醯胺之合成 步驟1 於2,氯甲基環氧乙烷（95克，1.03莫耳）中在30°C添加至 水（3.08克，0.17莫耳）及二乙胺（106.2毫升，1.03莫耳）之 混合物。反應混合物接著在28-3 5 °C攪拌6小時及冷卻至20-25 C獲得1-氣-3-二乙胺基丙院-2 -醉。 步騾2 氫氧化鈉（4 7.9克，1.2莫耳）之78毫升水溶液中添加卜 •72· 本紙張尺度&用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) '' 1324155 A7 B7 五、發明説明（68 氯-3-二乙胺基丙烷_2_醇。所得物在20-25。(：攪拌1小時， 以178毫升水稀釋及以乙醚萃取2次。合併之乙醚溶液固體 氫氧化鉀乾燥及蒸發獲得135克粗產物，其藉分餾純化獲得 油狀縮水甘油基二乙胺（9 8克，76%)。 步驟3 於氫氧化按之25%(w/w)冰冷卻溶液（25毫升，159毫莫 耳）中於10分鐘内滴加縮水甘油基二乙胺（32克，248毫莫 耳）。反應混合物在0-5。(：攪拌1小時及在室溫攪拌14小時。 所得反應混合物蒸發及蒸餾（84-90 °C在500-600 mT)獲得 1-胺基-3-二乙胺基丙烷·2_醇（33克，92%)，MS m/z 147([M+1] + )。 步驟4 於5 -甲醯基-2,4 -二甲基-1H -吡咯-3-羧酸（100毫克， 0.43毫莫耳）' EDC(122.7毫克，0.64毫莫耳）及 H〇Bt(86.5毫克，0.64毫莫耳）之1.〇毫升DMF溶液中添加 1-胺基-3-二乙胺基丙-2·醇（93.2毫克，0.64毫莫耳）。所 得反應溶液在室溫攪拌隔夜及蒸發。殘留物懸浮於10毫升 水中及過濾。固體以飽和碳酸氫鈉及水洗滌及於高真空烘 箱中乾燥隔夜獲得粗產物，其以管柱層析以含三乙胺之6 〇/〇 f醇-二氣甲烷（2滴/1〇〇毫升6%甲醇-二氯甲烷）溶離純化獲 得黃色固體之5-(5-氟-2-氧代-1,2-二氫-峭哚-3-亞基甲 基）-2,4 -二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（3 -二乙胺基-2-羥基-丙 基）醯胺（6 2 毫克，3 4 %。巾 NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.70 (s， 1Η, ΝΗ-Γ), 10.90 (s, 1H, NH-1), 7.76 (dd, J=2.38, 9.33 Hz, 1H, H-4), 7.72 -73- 本紙張尺度適用中國固家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（69 ) (s，1H，vinyl-H)，7.60 (m，br.，1H，CONHCH2CH(OH)-CH2N(C2H5)2-4')， 6.93 (dt, J=2.38, 8.99 Hz, 1H, H-5), 6.85 (dd, 1=4.55, 8.99 Hz, 1H, H-6), 3.83 (m, br, 1H, OH), 3.33 (m, 4H), 2.67 (m, br, 5H), 2.46 (s, 3H, CH3), 2.44 (s, 3H，CH3), 1.04 (m，br, 6H, CH3x2)。MS m/z (相對強度，％) 427 ([M+l]+，100)。 實例3 5~[5 -氟-2 -氧代-1，2 -二氫-吲哚-(3Z)-亞基-甲基]-2,4-二 甲基-1H -吡咯-3-叛酸（2 -羥基-3-嗎琳-4-基-丙基）-醯胺之 合成 步騾1 嗎啉（2.6毫升，30毫莫耳）及表氯醇（2.35毫升，30毫莫 耳）之乙醇（50毫升）混合物在70 °C擾拌隔夜。移除溶劑後， 殘留物以二氯甲烷（50毫升）稀釋。透明固體沉澱以真空過 遽收集獲得1·氣-3-嗎琳-4-基-丙燒-2-醇（2.0克，37%)。 'H NMR (DMSO-de) δ 3.49 (t, J=4.8 Hz, 2H), 3.60 (t, J=4.6 Hz, 2H), 3.75 (m, 4H, 2xCH2), 4.20 (dd, J=5.2, 12 Hz, 2H), 4.54 (m, 2H), 4.62 (m, 1H, CH), 6_64 (d, J=6.4 Hz，1H, OH)。MS (m/z) 180.2 (M十 1)。 步騾2 1-氯-3-嗎琳-4-基-丙坑-2-醇（2.0克，11毫莫耳）以NH3 之甲醇溶液（25 %重量’ 20毫升）在室溫處理。氮氣通入反 應混合物中以移除氨。蒸發溶劑獲得^氯」-嗎啉_4•基-丙 燒-2 -醇之鹽酸鹽（2.〇 克，91%)。〖H NMR (DMSO-de) δ 2.30 (d， J=6.0 HZ，2H)，2.36 (m，4H，NCH2)，2_65 (dd，J=8.4, 12.8 Hz，1H)，2·91 (dd， J=3.6, 12.8 Hz, 1H), 3.52 (m, 4H, OCH2), 3.87 (m, 1H, CH), 5.32 (s, 1H, •74- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱·>
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線 1324155 A7 B7 五、發明説明（70 ) OH), 8.02 (brs., 3H, NH3+) ° MS (m/z) 161.1 (M+l) <> 步騾3 5_(5·氟_2-氧代-1，2-二氫-啕哚-3-亞基甲基）-2,4-二甲 基-1H-吡咯-3-羧酸（120毫克，0.4毫莫耳）與1-胺基-3-嗎 啉_4 -基-丙烷-2-醇（74毫克，0.48毫莫耳）縮合沉澱出5-[5 -氟-2 -氧代-1,2 -二氫-Μ丨哚-(3Z) -亞基甲基]-2,4•二甲 基-1Η-吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基）-醯胺（65 毫克，36%)。母液蒸發至乾及殘留物藉快速層析純化獲得 額外之2Ν(70 毫克，39%)。咕 NMR (DMSOO δ 2·28 (叫 1Η)， 2.32 (m, 1H), 2.40 (m, 4H), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1H), 3.31 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.78 (m, 1H), 4.73 (brs, IH, OH), 6.82 (dd, J=4.5, 8.4 Hz, 1H), 6.90 (td, 2J=2.8, 3J=10.0 Hz, 1H), 7.53 (m, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.74 (dd, J=2.0, 9.6 Hz, 1H)(芳族及乙烯基）’ 10.87 (s，1H, CONH), 13.66 (s, 1H, NH)。LC-MS (m/z) 441.4 (M-l)。 氯化2-羥基-7-氧雜-4-氮雜螺[3,5]壬烷之合成 α 广？ 1 乙—醇· ^γ>ΌΗ 於配備溫度計、氮氣入口及25 0毫升添加漏斗之1升3-頸 圓底瓶中饋入嗎啉（91.5克，91.5毫升，1.05莫耳，1.0當 量）及100毫升乙醇。溶液快速攪拌及於30分鐘内自添加漏 斗添加表氯醇（100克，84.5毫升，1.08莫耳’ 1.03當 量）。追蹤溫度及當瓶溫度達2 7。(：時，反應以冰浴冷卻。透 明溶液攪拌18小時》反應藉GC(稀釋5滴反應混合物至1毫 升乙醇中及注入下列進行參數之15m DB-5毛細GC管柱 -75- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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A BCD 穴、申請專利範7圍 中：注射溫度25(TC ’偵測器250°C、最初烘箱溫度28t以 每分鐘10 °C溫至250°C)分析。反應完成而留有小於3%之嗎 啉。反應在旋轉蒸發器中在50 °C與全室真空度濃縮直至不 再縮合出蒸館物。所得油在室溫儲存2 4 - 4 8小時或直至觀察 到明顯量之結晶（可添加晶種使製程結晶）。漿液以2 5 0毫升 丙酮稀釋及過濾。固體於真空烘箱中在60。(：乾燥18-24小 時。獲得8 4克結晶產物。母液可濃縮及結晶製程重複而増 加回收率。1H NMR (400 MHz，DMSO-dg) δ 6.55 (屯 1 H)，4_64 (叫 1 H), 4.53 (m，2 Η)，4.18 (m, 2 Η), 3.74 (m, 4 Η), 3.60 (m，2 Η), 3.48 (m, 2 Η)。 13C NMR (100 MHz, DMSO-dfi) δ 70.9, 61.39, 61.04, 60.25, 58.54, 57.80。 1-胺基-3-(4-嗎啉基）-2-丙醇（消旋物）之合成 cr
Qf>0H nh3,m8〇H ^ C?飞； 於配備有磁攪拌棒之3升1-頸圓底瓶中饋入氣化2 -羥基 -7-氧雜-4-氮雜螺[3.5】壬烷（150克，83 5毫莫耳）接著添加 23 wt%無水氨之甲醇（2120毫升）。瓶蓋住及所得透明溶液 在20-23 °C攪拌18小時。上述條件下之GC顯示無殘留起始 物。移除蓋子及使氨逸出溶液30分鐘。瓶接著移至旋轉蒸 發器中及在45 °C浴溫及全室真空度濃縮得白色固體。1Η NMR (400 MHz, DMSO-^) δ 3.57 (dd, 2Η), 3.3-3.5 (m, 6 Η), 2.59 (m, 2 Η), 2.2-2.4 (m, 6 Η) ; 13C NMR (100 MHz，DMSO-A) δ 70.8, 67.1，60.1，53.8, 48.1。 依循上述實例3之程序’但以下述製備之2-(S)-l-胺基-3 -嗎 -76- 本纸張尺度適用中國国家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) rl324155 A7 B7 五、發明説明（72 ) 啉-4-基-丙烷-2-醇替代2-(RS)-l-胺基-3-嗎啉-4-基-丙烷-2-醇，獲得所需化合物5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氫哚-(3Z)-亞基甲基]_2,4-二甲基-111-吡咯-3-羧酸（2-(5)-羥基-3-嗎 〇林-4-基-丙基）-酿胺。 1-胺基-3-(4-嗎啉基）-2-丙醇（非消旋物）之合成 〇H ^ 於配備機械攪拌器、溫度計及添加漏斗之1升3-頸圓底瓶 中饋入嗎啉（91 _5克，91.5毫升，1_ 05莫耳，1.0當量）及 45毫升第三丁醇。溶液快速攪拌及於約30分鐘内由添加漏 斗添加R-表氣醇（100克，84.5毫升，1.08莫耳，1.03當 量）。追蹤溫度及當瓶溫達2 7 °C時，反應以冰水浴冷卻。透 明溶液攪拌18小時。反應藉GC(稀釋5滴反應混合物至1毫 升乙醇中及注入下列進行參數之15m DB-5毛細GC管柱 中：注射溫度250°C，偵測器250°C、最初烘箱溫度28°C以 每分鐘10°C溫至250°C)分析。反應完成而留有小於3%之嗎 啉。溶液冷卻至10°C及溫度維持低於15°C下滴加20 wt°/〇第 三丁醇鉀之THF溶液（576克）。所得白色漿液在l〇-15°C攪 拌2小時及藉上述條件之GC檢視。未觀察到表氣醇。混合 物在旋轉蒸發器中在50 °C與全室真空度濃縮。所得混合物 以水（500毫升）及二氣甲烷稀釋。分離相及水相以二氯甲烷 (500毫升）洗滌》合併之有機層以硫酸鈉脫水及濃縮得透明 無色油。獲得145克，97%產率之環氧化物。1H NMR (400 -77- 本紙張尺度適用中國國家搮準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（73 ) MHz, DMSO-d,) δ 3.3 (dd, 4 Η), 3.1 (m, 1 Η), 2.6 (dd, 1 Η), 2.5 (dd, 1 Η), 2.4 (m, 4 Η), 2.2 (dd, 2 Η) ； 13C NMR (100 MHz, DMSO-^) δ 65.4, 60.1, 53.1,48.9, 43.4。 於配備有磁擾拌棒之3升1-頸圓底瓶中饋入上述粗環氧化 物，添加無水氨之甲醇（24 % w/w ’ 2.5升）。瓶蓋住及混合 物在室溫攪拌24小時。上述條件下之GC顯示無殘留起始 物。移除蓋子及使氨逸出溶液30分鐘。瓶接著移至旋轉蒸 發器中及在4 5 °C浴溫及全室真空度濃縮得透明無色油。此 獲得 1 2 4 克產 *"1HNMR(400 MHz，DMSO-d6)5 3.57(dd,2H)，3.3- 3.5 (m, 6 Η), 2.59 (m, 2 H), 2.2-2.4 (m, 6 Η) ； 13C NMR (100 MHZ, DMSO-4)5 70.8, 67.1, 60.1, 53.8, 48.1 « 1-胺基- 3- (4_^g林基醇之合成 於配備機械攪拌器、溫度計及添加漏斗之丨升〗·頸圓底瓶 中饋入嗎啉（91.5克’ 91.5毫升，1.05莫耳，1·〇當量）及 200毫升甲醇。溶液快速攪拌及於約30分鐘内由添加漏斗添 加R-表氣醇（100克，84.5毫升，1·〇8莫耳，1.03當量）。 追蹤溫度及當瓶溫達27°C時，反應以冰水浴冷卻。透明溶 液撥拌1 8小時。反應藉G C (稀釋5滴反應混合物至1毫升乙 醇中及注入下列進行參數之15m DB-5毛細GC管柱中：注 射溫度250°C ’偵測器250°C、最初烘箱溫度28°C以每分鐘 l〇°C溫至250°C)分析。反應完成而留有小於3%之嗎啉。溶 液冷卻至10 C及溫度維持低於15 C下滴加25 wt%甲醇詞之 甲醇溶液（233克，1.08莫耳，247毫升）。所得白色漿液在 10-15 °C攪拌2小時及藉上述條件之GC檢視。未觀察到表氣 裝 訂
威 -78- 1324155 A7 B7 五、發明説明（74 醇。混合物在旋轉蒸發器中在50 °C與全室真空度濃縮。所 得混合物以水（500毫升）及二氯甲烷稀釋。分離相及水相以 二氣甲炫*(500毫升）洗蘇。合併之有機層以硫酸鋼脫水及濃 縮得透明無色油。獲得1 4 5克，9 7 %產率之1，2 -環氧基-3 -嗎啉-4 ·基丙烷。1H NMR (400 MHz, DMS0-4) δ 3.3 (dd，4 H)，3.1 (m, 1 H), 2.6 (dd, 1 H), 2.5 (dd, 1 H), 2.4 (m, 4 H), 2.2 (dd, 2 H) ； ,3C NMR (100 MHz, DMSOO δ 65.4, 60_1, 53.1，48.9, 43.4。 於配備有磁攪拌棒之3升1-頸圓底瓶中饋入上述粗1，2 -環 乳基-3-嗎淋-4-基丙燒，添加無水氨之甲醇（24 % w/w， 2.5升）。瓶蓋住及混合物在室溫擾拌24小時》上述條件下 之GC顯示無殘留起始物。移除蓋子及使氨逸出溶液3〇分 鐘。瓶接著移至旋轉蒸發器中及在45 °C浴溫及全室真空度 濃縮得透明無色油。此獲得1 2 4克1 -胺基-3 - ( 4 -嗎淋基）-2 -(S )·丙醇。NMR (400 MHz, DMSO-d^) δ 3.57 (dd，2H)，3.3-3.5 (m， 6 H)，2.59 (m，2 H)，2.2-2.4 (m, 6 H) ; 13C NMR (100 MHz，DMSO-de) δ 70.8, 67.1，60.1，53.8, 48.1。
5 -氟氧》4|_嘴私 BiFTW 一 混合咪唑醯胺（7.0克，32.3毫莫耳）、胺（15.0克，64.6 毫莫耳）、5 -氟氧4嗓（4.93克，32.6毫莫耳）、三乙胺 (9.79克，96.9毫莫耳）及丁1^(88毫升）及加熱至60°(：。形 成棕色溶液。在60 °C攪拌24小時，黃色漿液冷卻室溫及過 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（75 ) 濾。塊體以80毫升THF洗滌及在50 °C室真空中乾燥隔夜。 獲得棕色固體（23.2克固體在350毫升水中在室溫漿液化 5小時及過滤。塊體以100毫升水洗條及在50 °C室真空中乾 燥隔夜。獲得8.3 1克，56%化學產率。
裝 訂
配備溫度計、冷凝管、磁攪拌器及氮氣入口之0.25升瓶 饋入4.92克5-氟氧啕哚、7.0克咪唑醯胺、15.5克（R)-l-胺 基- 3- (4 -嗎啉基）-2 -丙醇、9.78克三乙胺及88毫升四氫呋 喃。混合物加熱至6 0 °C歷時1 6.5小時。反應冷卻至周圍溫 度及過濾。所得固體依序於乙腈中以11毫升/克成漿液3 次、真空脫水得 3.6 克（25.25%)。[1^1^，1"15^以1605，（：-18,5以，（6:4)，乙腈：0·1Μ 氯化銨，PHA-571437=4.05 分鐘]» Η*ΝΜΚ (DMSO):510.86 (1H, bs); 7.75 (1H, d); 7.70 (1H, s); 7.50 (1H, m); 6.88 (2H, m); 4.72 (1H, bs); 3.78 (1H, bs); 3.56 (4H, m); 3.32 (6H, m); 3.15 (lH，m);2.43(8H，bm) » 實例4 2,4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫哚-(3Z)-亞基甲 基]-lH-tf比鳴*-3-叛酸（2-經基-3-嗎林-4-基-丙基）-酿胺 5-(2 -氧代-1，2 -二氫-啕哚-3 -亞基甲基）-2,4-二甲基 -80- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（76 ) -1H-吡咯-3-羧酸（113毫克，0.4毫莫耳）與1_胺基·3-嗎啉 -4-基-丙烷-2-醇（74毫克，0.48毫莫耳）縮合沉澱出2,4-二 甲基- 5-[2 -氧代-1，2 -二氫-啕哚-(3Ζ)-亞基甲基]-1Η-吡 洛-3-幾酸（2-經基-3 -嗎淋-4-基-丙基）酿胺（77毫克， 45 _ 3%)。4 NMR (DMSO-A) δ 2‘27 (m，1Η)，2.32 (m, 1Η)，2.40 (m， 4H), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H), 4.74 (d, J=4.8 Hz, 1H, OH), 6.B6 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.96 (t, J=7.2 Hz, 1H), 7.10 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.49 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.77 (d，J=8.0 Hz，1H)(芳族及乙烯基)，10.88 (s, 1H，CONH)，13.62 (s， 1H, NH)，LC-MS (m/z) 425.4 (M+l)。 實例5 5-[5-氣-2-氧代-1，2-二氫-吲哚-(32)-亞基-甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3·羧酸（2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙 基）-醯胺之合成 5-(5 -氣-2-氧代-1,2 -二氫-吲哚-3-亞基甲基）-2,4 -二甲 基-1H -吡咯-3-羧酸（126.6毫克，0.4毫莫耳）與1-胺基- 3-嗎啉-4-基-丙烷-2-醇（74毫克，0.48毫莫耳）縮合沉澱出5· [5 -氣-2 -氧代-1,2 -二氫-吲哚- (3Z) -亞基甲基]-2,4 -二曱 基-1H-吡咯-3-羧酸（2·羥基-3-嗎啉-4-基-丙基醯胺（107 毫克，5 8%)。4 NMR (DMSO-de) δ 2.29 (m，1H)，2.33 (m，1H)，2‘39 (m, 4H), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H), 4.74 (d, J=4.8 Hz, 1H, OH), 6.85 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.11(dd, J=2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.97 (d, J=2_0 Hz, 1H)(芳族及乙烯基)，10.99 (s, 1H, CONH)，13.62 (s, 1H， -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐〉 1324155 A7 B7 五、發明説明（77 NH)。LC-MS (m/z) 457.4 (M-1)。 如下製備R及S立體異構物。
混合咪唑醯胺（7.0克，32.3毫莫耳）、胺（15.5克，96.9 毫莫耳）、5-氯氧啕哚（5.48克，32.6毫莫耳）、三乙胺（14 毫升）及THF(88毫升）及加熱至60°C »形成紅色溶液。在60 °C攪拌16小時後，黃色漿液冷卻室溫及過濾。塊體以2x50 毫升THF洗滌及在50 °C室真空中乾燥隔夜。獲得4.36克， 29%化學產率。
混合咪唑醯胺（6·8克，31.3毫莫耳）、胺（1〇.〇克，62.5 毫莫耳）、5 -氯氧吲嗓（5.3克，31.6毫莫耳）及THF(l〇〇毫 升）及加熱至60°C。形成紅色溶液。在60°C攪拌68小時後， 添加三乙胺（14毫升）及在60°C攪拌5小時。反應未完全。添 加4.6克胺側鏈及在60°C攪拌20小時。黃色漿液冷卻室溫及 過濾。塊體以2x50毫升THF洗滌及在50°C室真空中乾燥隔 夜。獲得5.4 8克，3 8 %化學產率。 實例6 本纸張尺度適用中國國家標準(CMS) A4规格(210X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（78 ) 5-[5-溴-2-氧代-1,2-二氫·"?丨哚-(3Z)-亞基-甲基] -2,4-二甲基-1Η-吡咯-3-羧酸（2-羥基 -3-嗎林-4-基-丙基）-酿胺之合成 5-(5-溴-2-氧代-1，2-二氫-吲哚-3-亞基甲基）·2,4-二甲 基-1Η-吡咯-3-羧酸（72·2毫克，0.2毫莫耳）與1-胺基-3-嗎 »林-4-基-丙垸-2-醇（38毫克’ 0.24毫莫耳）縮合沉殿出5-[5 -溴-2 -氧代-1,2 -二氫-啕哚-(3Ζ) -亞基甲基]-2,4 -二甲 基-1Η -吡咯-3-叛酸（2 -經基-3-嗎淋-4-基-丙基）-醯胺（55 毫克，5 5 %)。巾 NMR (DMSO-A) δ 2_27 (m，1Η)，2.32 (m，1Η)，2.39 (m, 4H), 2.41, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.13 (s, 1H), 3.35 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H), 4.74 (d, J=4.4 Hz, 1H, OH), 6.80 (d, 1=8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J=2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.51 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 8.09 (d, J=2.0 Hz, 1H)(芳族及乙烯基)，10.99(5，1氏（：〇1^),13.62(5，出，11)。1^-MS (m/z) 503.4 (M-l) » 實例7 2,4-二甲基-5-[2-氧代-1，2-二氫-吲哚-(32)-亞基-甲 基]-1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-[l，2,3]三唑-1-基-丙基）-酿胺之合成 步騾1 3-[1，2,3]三唑（2.0克’ 29毫莫耳）' 表氯醇（3.4毫升， 43.5毫莫耳）及N，N-二異丙基-乙胺（2.6毫升，15毫莫耳） 之乙醇（50毫升）混合物在室溫攪拌隔夜。移除溶劑後，殘 留物藉快速層析（CH2C12/CH3〇H=100/1- 100/2-100/4 )純化獲得 i _ 氣-3-(1,2,3)-三吨-2-基丙燒*-2 -醇（2.1 克，45%)。*h -83- 胃本纸張尺度適用中國圉家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） --- 1324155 A7 B7 五、發明説明（79 ) NMR (CDCI3) δ 3.52 (m, 2H, OH^CH2), 3.60 (dd, J=5.2, 11.2 Hz, 1H), 4_36 (m，1H, CH)，4.68 (m, 2H), 7.67 (s, 2H)。MS (ra/z) 162.1 (M+l)及1-氣-3-(1,2,3)三唑-1-基丙烷-2·醇（2.3 克，49%)，〖H NMR (CDCI3) δ 3.56 (s, 1Η), 3.57 (s, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.53 (dd, J=7.2, 14 Hz, 1H), 4.67 (dd，J=3.8, 14 Hz，1H)，7.67 (s，1H)，7.71 (s, 1H)。MS (m/z) 162.1 (M+l) e 步騾2 1-氯-3-(l，2,3)三唑-1-基丙烷-2-醇（2.3克，13毫莫耳） 以NH3之甲醇（25%重量，20毫升）在60°C於密封壓力容器 中處理隔夜。冷卻至室溫後，通入氮氣至反應混合物中以 移除氨。蒸發溶劑獲得1 -氣-3 - (1，2，3 )三唑-1 -基丙烷-2 -醇 之鹽酸鹽（2_57 克，100%)。〖HNMRpMSO-d^SS^CddJsS.S， 12.8 Hz, 1H), 2.97 (dd, J=3.6, 12.8 Hz, 1H), 4.15 (m, 1H), 4.44 (dd, J=6.4, 14 Hz, 1H), 4.57 (dd, J=4.6, 14 Hz, 1H), 5.95 (d, J=5.2 Hz, 1H, OH), 7.77 (s, 1H，），8·01 (brs.，3H, NH3+)，8.12 (s，1H)，MS (m/z) 143.1 (M+l)。 步騾3 5-(2 -氧代-1,2 -二氫-吲哚-3-亞基甲基）-2,4 -二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（113毫克，0.4毫莫耳）與1-胺基-3(1,2,3) 二咬-1-基-丙規>-2 -醇（85¾克’ 0.48¾莫耳）縮合而沉殿出 2,4 -二甲基- 5- [2 -氧代-1,2 -二氫-吲哚- (3Z) -亞基甲基] -1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基·3-[1，2,3]三唑-1-基-丙基）-醯胺 (70 毫克，4 1 %)。巾 NMR (DMSOO δ 2_45, 2.48 (2xs，6Η，2xCH3)， 3.35 (m, 2H), 4.02 (m, 1H), 4.32 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.53 (dd, J=3.4, 14 Hz, 1H), 5.43 (d, J=5.6 Hz, 1H, OH), 6.91 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.01 (t, J=7.6 -84- 本紙張尺度適用中画画家標準(CNS) A4规格(210 x 297公釐） 1324155 A7 __B7_ 五、發明説明（80 )
Hz, 1H), 7.15 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.12 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.77 (d, J=7.6 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 10.93 (s, 1H, CONH), 13.68 (s, 1H, NH)。LC-MS (m/z) 405.4 (M-l)。 實例8 5-[5 -氟-2-氧代-1，2 -二氫吲哚-(3Z) -亞基-甲基] -2,4 -二甲基 _lH-p比洛-3-叛酸（2-#至基-3·[1，2,3] 三唑-1-基-丙基）-醯胺之合成 5-(5 -氟-2 -氧代-1，2 -二氫-钊哚-3-亞基甲基）-2,4-二甲 基-1H-吡咯-3-羧酸（120毫克，0.4毫莫耳）與1_胺基 -3(1，2,3)三唑-1-基-丙烷-2-醇（85毫克，0.48毫莫耳）縮 合而沉澱出5 - [ 5 _氟-2 -氧代-1，2 -二氫-引哚-(3 Z)-亞基甲 基]-2,4-二曱基-11^-«1比洛-3-羧酸（2-超基-3-[1，2,3]三峻 -1-基-丙基）-醯胺（1〇〇 毫克，62%)。4 NMR (DMSO-de) δ 2.42, 2.44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.98 (m, 1H), 4.27 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.50 (dd, J=3.4, 13.6 Hz, 1H), 5.38 (d, J=5.6 Hz, 1H, OH), 6.82 (dd, J=4.4, 8.4 Hz, 1H), 6.91 (td, 2J=2.4, 3J=9.0 Hz, 1H), 7.70 (m, 3H), 7.75 (dd, J=2_4, 9.2 Hz, 1H), 8.11 (s，1H), 10.93 (s, 1H, CONH), 13.73 (s, 1H, NH)。 LC-MS (m/z) 423.4 (Μ·1)。 實例9 5-[5-氯-2-氧代-1,2-二氩-A 哚-(3Z)-亞基-甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基-3·[1，2,3]三唑-1-基-丙基）-醯胺之合成 5-(5 -氣-2-氧代-1，2 -二氫-吲哚-3-亞基甲基）-2,4 -二甲 基- ΙΗ-"比哈-3-幾酸（126.6毫克，0.4毫莫耳）與1-胺基 -85- 本纸張又度通财關家標準(CNS)人4規格(210 X 297公爱) 1324155 A7 ___B7_ 五、發明説明（81 ) -3(1，2,3)三唑-1-基-丙烷-2-醇（85毫克，0.48毫莫耳）縮 合而沉澱出5-[5-氯-2-氧代-1，2-二氫哚-(3Z)-亞基甲基] -2,4-二甲基-1只-吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-[1，2,3]三唑-1-基-丙基）-醯胺（48 毫克，27%)。iHNMRpMSO-d^SZW, 2_44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 4.28 (dd, J=7.8, 14 Hz, 1H), 4.51 (dd, J=3.2, 14 Hz, 1H), 5.39 (d, J=6.0 Hz, 1H, OH), 6.85 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.12 (dd, J=2.0, 8.2 Hz, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.74 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 10.99 (s，1H, CONH), 13.65 (s，1H，NH)。LC-MS (m/z) 439.4 (M-l)。 實例1 0 5-[5-溴-2-氧代-1，2-二氫丨哚-(3Z)-亞基-曱基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-[l，2,3]三唑-1-基-丙基醯胺之合成 5-(5 -溴-2 -氧代-1,2-二氫-啕哚-3-亞基甲基）-2,4-二甲 基-1H -吡咯-3-羧酸（144,4毫克，0.4毫莫耳）與1-胺基 -3(1，2,3)三唑-1-基-丙烷-2-醇（85毫克，0.48毫莫耳）縮 合而沉澱出5 - [ 5 -溴-2 -氧代-1，2 -二氫-4哚-(3 Z)-亞基甲基] -2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-[1，2,3]三唑-1-基-丙基）醯胺（130 毫克，67%)。 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 4.28 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.50 (dd, J=3.6, 14 Hz, 1H), 5.40 (d, J=5.6 Hz, 1H, OH), 6.81 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, 3=2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.70 (m, 2H), Ί.11 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.10 (d，J=l_6 Hz, 1H)，11.0 (s，1H, CONH), 13.64 (s，1H, NH)。LC-MS (m/z) 485.4 (M-l)。 -86- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐〉 U24155 A7 B7 五、發明說明（82 M5-溴-2-氧代-1，2-二氫·吲哚、3_亞基甲基）·2 *二甲 基-1Η.,比咯·3-羧酸、5.(5_氣_2.氧代-12•二氫叫丨嗓—·3_ 亞基甲基)-2,4_二甲基·1Η•吡咯_3，酸、5_(2_氧代」 二氫斗朵·3-亞基曱基）-2,二甲基酸之人 成述於本申請人於200 1年2月14日提出申請之標題“,比洛取 代之2-二氬喇哚酮-蛋白激酶抑制劑，，編號〇9/783 264令， 其揭示併於本文供參考。 實例1 1 -4-基）-丙烷-2-醇之合成 1 -胺基-3 - ( 1, 1 -二氧代-λ 6 -硫嗎琳
於硫嗎啉（5.0克’ 48.7毫莫耳）之h〇CH3(200毫升）溶液 中添加oxone(36.0克，58·5毫莫耳）之h2O(100毫升）溶 液。混合物在40°C攪拌48小時接著冷卻至〇°c。滴加NaOH 水溶液以調整pH=12。濾除固體及以h〇CH3(3x40毫升）洗 滌。合併之濾液濃縮及藉矽膠快速層析 (CHa3/CH3O_H3.H2O=3/l/0.1-2/1/0.1)純化，獲得硫嗎啉 1，卜二 氧化物（6.2 克）’ 9 3 % 產率。W NMR (DMSO-dfi) δ 2_97 (m，4H), 3.07 (m，4H), 3.42 (brs, 1H)，MS (m/z) 136 (M+1)。 -87- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（83 ) 硫嗎啉1，1-二氧化物（2.5克，18.5毫莫耳）及（R)-(-)表 氣醇（1.55毫升，20毫莫耳）於混合物溶劑乙醇（50毫升）及 H20(5毫升）之混合物在25°C攪拌24小時。移除溶劑後，殘 留物藉快速層析純化獲得（R)-l-氯-3-(1，1-二氧化-λ 6-硫 嗎啉-4 -基）-丙烷-2 醇（4 _ 0 克，96 %)。W NMR (DMSO-de) δ 2.50 (m, 2H), 2.94 (m, 4H), 3.05 (m, 4H), 3.54 (dd, J=5.8, 11.2 Hz, 1H), 3.63 (dd, J=4.4, 11.2 Hz, 1H), 3.78 (m, H, CH), 5.10 (d, J=5.2 Hz, 1H, OH), MS (ra/z) 228.2 (M+l)。 (R)-l-氯-3-( 1,1·二氧化-λ6-硫嗎啉-4-基）丙烷-2-醇 (2.27克，10毫莫耳）以ΝΗ3之Τ醇（25%重量，20毫升）溶 液在5 0 °C處理1 2小時。蒸發溶劑後，殘留物以陰離子交換 樹脂（AGlx8，OH態）於水中處理獲得粗製（S)-l-胺基-3-(1，1 -二氧化-λ6 -硫嗎啉-4 -基）丙烷-2 -醇（2 · 0克）。其受約 3 0%其二聚物污染且不得不藉管柱層析純化。MS (m/z) 209.2 (M+1)。（S)-l·胺基-3-(1,1-二氧化-又6-硫嗎啉-4· 基）丙烷-2 -醇與氧吲哚縮合獲得所需二氫啕哚酮（純化後產 率 5 0-8 0%)。 (R)-5-(2-氧代-1,2-二氫-吲哚-3-亞基甲基）-2,4-二甲 基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1, 1-二氧化-λ 6-硫嗎啉-4-基）-2-羥基-丙基]-醯胺
線
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(2i〇x 297公爱) 1324155 A7 B7 五、發明説明（84 ) !H NMR (DMSO-de) δ 2.39, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.49 (m, 1H), 2.56 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.07 (m, 4H), 3.16 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8 Hz, 1H, OH), 6.86 (d, =7.6 Hz, 1H), 6.97 (t, J=7.4 Hz, 1H), 7.11 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.50 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.76 (d, J=7.6 Hz, 1H)(芳族及乙缔基），10.88 (s，1H, CONH)，13.62 (s, 1H，NH), LC-MS (m/z) 473.4 (M+l)- (R)-5-(5 -氟-2-氧代-1，2·二氫丨哚-3-亞基甲基）-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸[3-(1, 1-二氧化-λ 6-硫嗎啉-4-基） -2-羥基-丙基]-醯胺
裝 'H NMR (DMSO-c^) δ 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.45 (m, 1H), 2.53 (m, 1H), 2.96 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.17 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.4 Hz, 1H), 6.82 (t, J=4.0 Hz, 1H), 6.91 (td, 2J=2.8, 3J=9.0 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.8 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.75 (dd, J=2.4, 9.2 Hz, 1H), 10.88 (s, 1H), 13.67 (s，1H)，LC-MS (m/z) 491.4 (M+l)。 (R)-5-(5-氣-2-氧代-1，2-二氫-啕哚-3-亞基甲基）-2,4-二甲基-1H-吡咯-3·羧酸[3-(1,1-二氧化-λ 6-硫嗎啉-4-基）-2-羥基-丙基]-醯胺 訂
線
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（85 *H NMR (DMSO-de) δ 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.45 (m, 1H), 2.53 (m, 1H), 2.96 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.17 (m, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.4 Hz, 1H, OH), 6.85 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.11 (dd, J=2.2, 8.2 Hz, 1H)，7.53 (t, J=5.5 Hz, 1H), 7.75 (s，1H), 7.97 (d, J=2.0 Hz, 1H)，10.98 (s, 1H)，13.62 (s, 1H)，LC-MS (m/z) 507.2 (M+l)。 (R)-5-(5-溴-2-氧代-1,2 -二氫-峭哚-3-亞基甲基）_2,4-二甲基-1 Η -吡咯-3 -羧酸[3 - ( 1，1 -二氧化-λ 6 -硫嗎琳-4 -基） -2-羥基-丙基]-醯胺 Μ lH NMR (DMSO-de) δ 2.41, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.47 (m, 1H), 2.54 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.18 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8 Hz, 1H), 6.81 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J=1.8, 8.2 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.8, 1H), 7.76 (s, 1H), 8.09 (d, J=2.0 Hz, 1H), 10.98 (s, 1H), 13.62 (s, 1H), LC-MS (m/z) 553.6 (M+l)。 實例1 2 (S)或（R)-l -甲基胺基-3-嗎淋-4-基-丙垸-2-醇之合成
裝 訂
線
-90- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 x 297公釐〉
1324155 A7 ___ B7_ 五、發明説明（86 ) 硫嗎啉（1.74毫升，20毫莫耳）及（R)·表氣醇（156毫升， 20¾莫耳）之乙醇（10毫升）混合物在室溫攪拌48小時。移除 落劑後’殘留物以C Η3 N Η2之水（4 0 %重量，2 0毫升）溶液 在室溫處理1 4小時。移除溶劑獲得粗製（s ) _丨·甲基胺基_ 3 -嗎琳-4-基-丙燒-2-醇，其藉真空蒸餾或管柱層析純化（2 4 克’ 70。/〇) °自（S) -表氣醇以76%產率製備（11)-1-甲基胺 基 _ 3 -嗎啉-4 -基丙烷-2 -醇。1H NMR (CDC13) δ 2.33 ((1山 J=3.6, 12.4 Hz, 1H)，2.42 (m，1H), 2.44 (dd，J=2.8, 9.8 Hz，2H)，2.45 (s，3H)，2.53 (dd, J=7.6, 11.8 Hz, 1H), 2.62 (m, 2H)} 2.65 (dd, J=3.6, 12.0 Hz, 1H), 3.71 (m, 4H), 3.85 (m, 1H), 13C NMR (CDC13) δ 67.06, 65.58, 62.80, 55.87, 53.94, 36.72, MS (m/z) 175 (M+l) 0 (S)-l -甲基胺基-3-嗎啉-4-基-丙烷-2-醇與5-氟氧吲哚縮 合獲得（R)-5-(5 -氟-2-氧代-1，2-二氫哚-3-亞基甲基） -2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（2-羥基-3-嗎啉-4-基-丙基）- 甲基-醯胺。 <rC〇 'Η NMR (DMSO-de) δ 2.0 (s, 3H), 2.15 (m, 1H), 2.25 (m, 6H), 2.28 (m, 2H), 2.42 (s, 1H), 2.95 (s, 1H), 3.0 (s, 3H), 3.25 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 2.97 & 3.68 (2xbrs, 1H), 4.80 & 4.74 (2xbrs, 1H), 6.82 (dd, J=4.0, 8.0 Hz, 1H), 6.90 (td, 2J=2.3, 3J=8.7 Hz，1H), 7_67 (s, 1H)，7.71 (dd, J=2.2, 9.0 Hz, 1H)，10.86 (s，1H)，13.57 (s，1H)，LC-MS (m/z) 457.2 (M+l)。 -91 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
裝 訂
線 1324155 A7 B7 五、發明説明（87 ) (R)-l -胺基·3·嗎〇林-4-基丙fe-2 -醇獲得（$)-5-(5 -氟- 2· 氧代-1，2-二氫吲哚-3-亞基甲基）-2,4-二甲基_1H-吡哈-3-羧酸（2 -羥基-3-嗎啉-4-基丙基）甲基醯胺。
lU NMR (DMSO-^) δ 2.0 (m, 3H), 2.10 (m, 1H), 2.22 (m, 6H), 2.25 (m, 2H), 2.38 (m, 1H), 2.90 (s, 1H), 2.96 (s, 3H), 3.27 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.93 & 3.64 (2xbrs, 1H), 4.75 & 4.70 (2xbrs, 1H), 6.77 (dd, J=4.6, 8.2 Hz, 1H), 6.85 (td, 2J=2.5,3J=8.8 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.67 (dd, J=2.0, 9.6 Hz, 1H)，10.81 (s，1H)，13.52 (s，1H), LC-MS (m/z) 457.2 (M+l)。 實例1 3 胺側鏈製備 3-(1-Η -四唑-1-基）-2 -羥基-1-氣丙烷及3-(2·Η-四唑-2-基）-2·羥基-1-氣丙烷 6.905克四唑（100毫莫耳）及1.75毫升二異丙基乙胺（1〇 毫莫耳）及11.73毫升表氯醇（150毫莫耳）之無水乙腈（30毫 升）在60°C攪拌4小時。所得溶液蒸發，以高真空乾燥及在 矽膠管柱上層析以氯仿-甲醇1 〇 〇 : 8純化。第一溶離份獲得 3-(2-H -四唑-2-基）-2-羥基-1-氣丙烷6.215克（無色油， 38%產率）’第二溶離份獲得9.208克純3-(1-Η-四唑-1-基）-2 -羥基-1·氯丙烷（黏稠膠，57 %產率）。 3-(1-Η-四唑-1-基）-2-羥基-1-胺基丙烷 -92- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
9.1 10 克 3-d_H , ^ Η四唑_1-基）-2-羥基-丨-氣丙烷、15克碳 酸鉀及13〇毫井始上 跑和甲醇氨攪拌21小時，接著過濾及蒸發。 殘留物在矽膠管枯 曰 狂上層析以氯仿-甲醇-氨水8 0 : 3 5 : 4純化。 產里―7 3 26克之白色黏稠膠（9 1.5%理論值）。 h(2-H·四唑-2-基）-2-羥基-1-胺基丙烷 仏 克（2'H•四唑_2·基）-2 -痠基-1-氣丙烷' 1〇克碳 酸4甲及95毫升飽和甲醇氨授拌^小時，接著過滤及蒸發。 殘田物在矽膠管柱上層析以氣仿-甲醇-氨水60:25:2純化。 產里= 3.726克之白色結晶固體（69 5%理論值）。 J_[(2R’6S)-2,6-二甲基嗎啉-4-基]-2-羥基-1·胺基丙烷 4.7¾升表氣醇（6〇毫莫耳）添加至順式-2,6-二甲基嗎啉 (4.607克，40毫莫耳）之三氟乙醇（5毫升）冰冷卻溶液中。 浴液在0-5 C攪拌丨小時，移開冷卻浴及在RT再攪拌5小 時。混合物在向真空蒸發，所得油狀殘留物溶於無水乙醇 (:> 0毫升），落液於冰浴上冷卻，以兩部分添加甲醇鈉固體 (2.27克）及混合物在〇_5°c攪拌2小時。反應混合物接著過 濾，以乙醇（30毫升）洗滌鹽及合併之濾液添加至冰冷卻之 濃氨水（20 0毫升）中。混合物在rt攪拌12小時，接著在高 真空蒸發。殘留物在矽膠管柱上以混合物氯仿-甲醇·7M甲 醇氨80 :15:3純化’獲得產量5.75克之白色結晶吸濕固體 (76.3%理論值）。 (2S)-3-(3 -甲基-2,5-二氧代咪也咬-1-基）-2-||基_1 氯丙燒及（2S)-3-(3 -甲基-2,5-二氧代咪吨咬-1_基）_2 羥基-1-胺基丙烷 -93- 本纸張尺度通用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 B7
五、發明説明（89 3_423克3 -甲基-2,5 -二氧代咪唑啶（3.423克）及3.60毫升 R表氣醇（-)(99 % e_e，）及〇.30毫升Barton鹼（1 · 5毫莫耳）之無 水乙腈在6 0 °C攪拌2 0小時。所得溶液在高真空蒸發及在石夕 膠管柱上以氯仿-甲醇（5-2 0%甲醇之梯度）純化，獲得 5.572克白色非晶型固體之氯化合物（90%產率）。氣化物如 下轉化成胺基。所得羥基-氣中間物溶於甲醇氨（以氨氣飽 和）’添加碳酸钟及混合物於密閉瓶中攪拌2.5天。過遽反 應混合物’蒸發濾液。殘留物在矽膠管柱上以混合物氯仿_ 甲醇·濃氨水80: 15: 1.5純化。 實例1 4 5-[(Z)-(5 -氟-2-氧代-1，2 -二氫- 3H-4嗓-3-亞基） 甲基]-N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2-基）丙基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧醯胺（化合物22)(—般方法） 72毫克3·(2-Η-四唑-2-基）-2-羥基-卜胺基丙烷添加至 105 毫克（〇_25 毫莫耳）5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3H- 吲哚-3-亞基）甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸1-氧基 -7 -氮雜苯并三唑酯[使（3Z)-3-({3,3-二甲基-4-羧基-1-H-峨咯-2-基}亞甲基）-5 -氟-1,3 -二氫- 2H-啕哚-2-酮（480毫 克；1.6毫莫耳）藉HATU試劑（570毫克，1_5毫莫耳）於 Hunig鹼（3.0莫耳，0.525毫升）存在下於DMF(5毫升）中活 化及藉以氣仿（5毫升）沉澱單離純態及在高真空乾燥以9 2 % 產率獲得（579毫克）]之無水二甲基乙醯胺（丨5毫升）之漿液 中’混合物攪拌30分鐘及高真空蒸發。殘留物懸浮於混合 物甲醇-二乙胺20:1(3毫升）中，接著於冰箱（5»c)中結晶1 -94- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
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線 1324155 A7 B7 五、發明説明（9〇 ) 小時’過遽，沉澱以冰冷甲醇洗條及高真空乾燥。產量1 〇 6 宅克之橘巴結晶固體。 實例1 5 5-[(Ζ)-(5·氣-2-氧代-1，2 -二氫- 3H-e?卜朵·3_ 亞基） 甲基]-Ν-[2-羥基-3-(2Η-四唑_2·基）丙基]_2,4_ 二甲基-1 Η -吡咯-3 -羧醯胺（化合物2 3 )(—般方法） 72毫克3-(2-Η-四唑-2 -基）·2-羥基-1-胺基丙烷添加至 109毫克（0.25毫莫耳）5-[(2)-(5-氯-2-氧代-1，2-二氫-31 4哚_3_亞基）甲基]-2,4-二甲基-111-吡咯-3-羧酸1-氧基 -7 -氮雜苯并三吃酯[使（3Ζ)-3-({3,3 -二甲基-4-竣基-1-Η-叶匕洛-2-基}亞甲基）-5 -氯-1，3-二氫- 2H-"?卜朵-2-酮（1.520 克，4.8¾莫耳）藉HATU試劑（1.768克，4.65毫莫耳）於 Hunig驗（9.0毫莫耳，1.58毫升）存在下於DMF(20毫升）中 活化及藉以氣仿（20毫升）沉澱單離純態及在高真空乾燥以 94%產率獲得（1.907克）]之無水二甲基乙醯胺（15毫升）之 漿液中，混合物攪拌30分鐘及高真空蒸發。殘留物懸浮於 混合物甲醇-二乙胺20: 1(3毫升）中，接著於冰箱（5。〇)中結 晶1小時，過濾，沉澱以冰冷甲醇洗滌及高真空乾燥。產量 109毫克之橘色結晶固體。 實例1 6 N-[2-羥基-3-(2H -四唑-2 -基）丙基]_2,4-二甲基5 [(Z)-[2 -氧代- 5- (三氟甲氧基）-i，2 -二氩- 3H -岣哚-3.亞基] 甲基]-lH-σ比洛-3-叛酿胺（化合物24)(—般方法） 72¾克3-(2-Η -四唑-2-基）-2-羥基·ι_胺基丙烷添知 -95- 本紙張尺度適用中國®家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） 1324155
12 1.5宅克（0.25毫莫耳）5_[(z)_(5_三氟甲氧基_2氧代 -1，2 -一氫- jH_吲哚·3_亞基）甲基]_24_二甲基·ιΗ_吡咯 -3-羧酸1·氧基·7-氮雜苯幷三唑酯[使（3Ζ)_3·((33•二甲 基-4-羧基-1-Η-吡咯_2_基）亞甲基）·5_三氟甲氧基_13_二 氫-2Η-吲哚-2-酮（1.768克；4 8毫莫耳）藉HATU試劑 (1.758克，4.8毫莫耳）於1^1111^鹼（9〇毫莫耳，158毫升）存 在下於D M F ( 2 5毫升）中活化及藉以無水乙腈沉澱單離純態 及在高真空乾燥以85_5。/。產率獲得（1.929克）]之無水二甲 基乙醯胺（1.5毫升）之漿液中，混合物攪拌3〇分鐘及高真空 蒸發。殘留物懸浮於混合物甲醇-二乙胺2〇:ι(3毫升）中， 接著於冰箱（5 C )中結晶1小時，過滤，沉殿以冰冷甲醇洗 務及向真芏乾燥。產量113毫克之橘色結晶固體。 實例1 7 5-[(Ζ)-(5-氟-2-氧代-1,2-二氫-3 Η-令朵-3-亞基）甲基] -Ν-[2 -羥基- 3- (1Η -四唑-1-基）丙基]_2,4_二甲基-1Η -吡 哈-3-叛酿胺（化合物25) 依據實例14之程序自72毫克對應胺製備。產量113毫克 橘色結晶固體。 實例1 8 5-[(Ζ)-(5-氯-2-氧代-1,2-二氫-3 Η-峭哚-3-亞基）甲基] -Ν-[2-羥基-3-(1Η-四唑-1-基）丙基]-2,4-二甲基-1士吡 咯-3-羧醯胺（化合物26) 依據實例15之程序自72毫克對應胺製備。產量122毫克 橘色結晶固體® -96- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 _____B7 五、發明説明（92 ) 實例1 9 『[2-羥基-3-(111-四唑-1-基）丙基]-2,4-二甲基-5· [(Z)-[ 2-氧代-5-(三氟甲氧基）+2-二氫-3H-吲哚-3·亞基] 甲基]-1H -吡咯-3-羧醯胺（化合物27) 依據實例16之程序自72毫克對應胺製備。產量118毫克 橘色結晶固體。 實例2 0 >^-[3-[(211，65)-2,6-二甲基嗎淋-4-基]-2-羥基丙基]5-[(2)-(5-氟-2-氧代-1，2-二氫-3只-»弓卜朵-3-亞基）甲基]_2,4-一甲基比洛-3-叛酿胺（化合物28) 依據實例14之程序自95毫克對應胺製備。產量99毫克橘 色結晶固體。 實例2 1 5-[(Ζ)-(5 -氯-2-氧代-1，2 -二氫- 卜朵·3 -亞基） 甲基]-N-[3-[(2R，6S)-2,6-二甲基嗎啉_4-基]-2-獲基丙基]-2,4-二甲基-lH-吨洛-3-幾δi胺（化合物29) 依據實例15之程序自95毫克對應胺製備。產量1〇ι毫克 橘色結晶固體。 實例2 2 N-[3-[(2R，6S)-2,6-二甲基嗎琳-4-基]-2-#至基丙 基]-2,4-二甲基-5-[(2)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基）_12· 二氫卜朵-3 -亞基]甲基]-1H。比哈-3-竣臨胺（化合物3〇) 依據實例16之程序自95毫克對應胺製備。產量89毫克橘 色結晶固體。 -97- "本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 ：< 297公釐) ' 1324155 A7 B7 五、發明説明（93 ) 實例2 3 5-[(Z)-(5 -氟-2-氧代-1，2 -二氫- 3H·喇哚-3-亞基）甲 基]-N-[(2S)-2 -羥基- 3- (3 -甲基- 2,5-二氧代咪唑啶-l_ 基）]-2,4-二甲基-lH-吡咯-3-羧醯胺（化合物34) 依據實例14之程序自95毫克對應胺製備。產量1〇9毫克 橘色結晶固體。 實例2 4 5-[(z)-(5 -氯-2-氧代-1,2 -二氫- 3H-B?h朵-3-亞基）甲 基]-N-[(2S)-2-羥基-3·(3 -甲基-2,5-二氧代咪唑啶_l-基）丙基]-2,4-二甲基-lH-吡咯-3-竣醯胺（化合物36) 依據實例15之程序自95毫克對應胺製備。產量1〇7毫克 橘色結晶固體。 實例2 5 N-[(2S)-2-#至基- 3- (3 -甲基-2,5-二氧代咪嗅咬-1_基）丙 基]-2,4-二甲基-5-[(2)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基）_1,2_二 氩-3 Η - Θ丨哚-3 -亞基]甲基]-1 Η -吡洛-3 -幾醯胺（化合物3 5 ) 依據實例16之程序自95毫克對應胺製備。產量123毫克 橘色結晶固體。 實例2 6 5-[(Ζ)-(5 -氟-2-氧代-1,2 -二氫- SH-I丨嗓-3-亞基）甲基] -N-[(2R)-2-羥基-3-(3 -甲基-2,5-二氧代咪唑啶q-基） 丙基]-2,4 -二甲基-lH-p比洛-3-幾臨胺（化合物3 1) 依據實例14之程序自95毫克對應胺製備。產量110毫克 橘色結晶固體。 -98- 本紙浪尺度適用中固國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（94 ) 實例2 7 5-[(Z)-(5 -氯-2·氧代-1,2 -二氫·3Η-Μ|^_3 -亞基）甲基] -N-[(2R)-2-^基- 3- (3 -甲基-2,5-二氧代咪竣咬-卜基）丙 基]-2,4-二甲基-11€-吡咯-3_羧醯胺（化合物32) 依據實例15之程序自95毫克對應胺製備。產量103毫克 福色結晶固體。 實例2 8 >|-[(2尺）-2-羥基-3-(3-甲基-2,5-二氧代咪唑啶-1_基）丙 基]-2，4-二甲基-5-[(Z)-[2-氧代-5-(三氟甲氧基二 氫- 3H -峭哚-3-亞基]甲基]-ΙΗ-ρ比洛-3-幾醯胺（化合物33) 依據實例16之程序自95毫克對應胺製備。產量12〇毫克 橘色結晶固體。 實例2 9 5 -甲酿基-2-甲基-4-苯基-1H -11比洛-3-敌酸乙醋
DMF(4毫升，3當量）攪拌下於冰浴中冷卻。於其中添加 P0C13(1.1當量，1.8毫升）。30分鐘後，於反應中添加 3,5-二甲基-4-乙酯吡咯（4克。17.4毫莫耳）之DMF溶液 (2M，9毫升）及繼續攪拌。10分鐘後，反應混合物過濾。 以5毫升D M F稀釋及於9 0 °C油浴中加熱。1小時後，反應冷 卻至室溫及以水（100毫升）稀釋及以IN NaOH銓化至 -99 - 本纸浪尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（95 ) pH=ll。產物萃取至二氣甲烷（3x20毫升）中及有機層以食 鹽水（2 0 0毫升）洗滌’脫水（MgS〇4)及濃縮獲得4.3克（9 5 %) 棕色固體之5 -甲醯基-2·甲基-4 -苯基-1H·吡咯-3-羧酸乙 酯。1H NMR (360 MHz，DMS0-d6) δ 12.5 (br s，1H，NH)，9.11 (s，1H， CHO), 7.35 (s, 5H, ArH), 3.98 (q, J=6.8A7.2 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.48 (s, 3H，CHa), 0.98 (t, J=7 Hz，3H, OCH2CH3)。 5 -甲醯基-2-甲基-4-苯基-1H -吡咯-3-羧酸
5 -甲醯基-2-甲基-4 -苯基-1 Η-吡咯-3 -羧酸乙酯溶於水 (100毫升）及甲醇（4 5毫升）中及攪拌。添加ΚΟΗ(2當量， I. 9克）及於1〇〇 °C加熱。2.5小時後，冷卻至室溫及藉萃取 至乙酸乙酯（2 0 0毫升）中而移除剩餘酯，脫水及濃縮。水層 使用2N HC1酸化至pH = 3。過濾移除白色固體，以水清 洗。固體自甲苯再濃縮，以己烷分散及乾燥獲得2克（52%) 灰白色固體。NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12.46 (br s，1H，C02H)， II. 95 (s, 1H, NH), 9.08 (s, 2H, CHO), 7.36 (s, 5H, ArH), 2.49 (s, 3H, CH3)。MS m/z (相對強度％，線子）實測值229 (100, M+);計算值 229.2。 5 -甲醯基-2 -甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸（3-二乙胺基 -2 -超基-丙基）_酿胺 -100- 本纸張尺度適用中國國家標準((；;1^3) A4規格(210X 297公爱·) 1324155 A7 ____ B7 五、發明説明（96 )
OH + 〜 ΟΗ ' 5 -甲醯基-2 -甲基-4-笨某-1Η-吡咯-3-教酸（1.0克，4.3 6 毫莫耳）、1-胺基-3-二乙胺基-2-丙醇（950毫克，6.54毫莫 耳）' DDC(900毫克，4_36毫莫耳）及HOBt(884毫克， 6.54毫莫耳）之氯仿（60毫升）混合物在RT攪拌12小時。反 應倒入飽和碳酸氫鈉（60毫升）中及於其中添加lNNaOH( 8 毫升）。接著以EtOAc(3x100毫升）萃取，以水及食鹽水洗 滌，脫水及濃縮獲得400毫克5-甲醯基-2-甲基-4-苯基-1H-吡咯-3-羧酸（3 -二乙胺基-2-羥基-丙基）-醯胺。 實例3 0 合成化合物11-21之程序 於DMS0中製備各氧吲哚之0.36 Μ溶液及各醛之0.576 Μ溶液。300微升適當氧4哚與300微升適當醛在200微升 DM S 0存在下混合。接著添加4 0毫克二伸乙三胺清除劑樹 脂。混合物置於Robbins板上及該板密封及置入60 °C烘箱中 於該處搖晃1 8小時。 1 8小時後，自烘箱移開Robbins板及於混合物中添加800微 升DMSO。接著在密封該板及再度置入60 X：烘箱中於該處 繼續旋轉1小時。 1小時後完成，自烘箱移開Robbins板及冷卻。Robbins板底 部密封處小心移開及整塊板配置入過濾裝置中，使新合成 -101 - 本纸乐尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1324155
之化合物自樹脂過濾除。 生物實例 使用下列實例發現該等化合物證明具有最適程度之所需 活性。 A.分析程序 ， 下列刀析用以測足本發明不同化合物對一或多種pKs之活 性程度及效果。使用本技藝已知技術，類似分析可沿著相 同株對任何PK設計。 本文所述數種分析於ELIS A(酵素鍵聯免疫吸附三明治分 析）格式中進行（Voller等人，1980, “酵素鍵聯免疫吸附分 析，臨床免疫學手冊，第2版，Rose及Friedman，美國微升物 協會，華盛頓D.C.，第359-371頁）。一般程序如下：化合 物導入表現該測試激酶（天然或重組）之細胞中，一段選擇時 間後，方測試激酶為笑體，則添加已知可活化該受體之配 位基。細胞溶胞及溶胞物移至預先以辨識酵素磷醯化反應 之受貧之特異抗體塗覆之E LIS A盤洞中。細胞溶胞物之非 受質成分洗除及以辨識填驢酶胺酸之抗體偵測受質上磷酿 化量，及與未與測試化合物接觸之對照組細胞比較。 下列提供對特定PKs進行ELISA之目前較佳方法。然 而，採用該等方式測定化合物對其他RT K s之活性以及對 CTKs及STKs之活性亦在熟知本技藝悉知範圍内。本文所 述其他分析測量對測試激酶活化作用反應之Dn A量，其為 增殖性反應之一般指標。此分析之一般指標如下：化合物 導入表現測試激酶之細胞（天然或重組），一段選擇期間後， -102- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7
若測試激酶為受體，則添加已知可活化該受體之配位基。 培θ至少隔夜後，添加DNA標記試劑如5溴去氧尿苷 (BrdU)或H3·胸：y：。以抗Brdl^^體偵測標記之DNA量或藉 測量放射活性測定及與未與測試化合物接觸之對照組細胞 比較。 GST-FLK-1生物分析 此分析法分析GST-Flkl對聚（giu，tyr)肽之酪胺酸激酶活 性。 材料及結.森丨： 1· Corning 96-洞 ELISA 盤（Corning 目錄編號 5805- 96) 〇 2.聚（glu，tyr) 4:1 ’ 凍乾物（Sigma 目錄編號#卩〇275)。 3_聚（glu，tyr)(pEY)包覆之分析盤製備：以2微克/凍塗 佈聚（gU，tyr) (pEY)之100微升PBS，在室溫維持2小時或 在4 °C維持隔夜。充分蓋住盤以避免蒸發。 4· PBS緩衝液：對1升混合〇.2克KH2P〇4、1. 15克 Na2HP〇4、0.2 克 KC1 及 8 克NaCl 於約 900 毫升 dH20。當 所有試劑溶解，以HC1調整pH至7.2。以dH20使總容積為1 升。 5· PBST緩衝液：於1升PBS緩衝液中添加1.0毫升 Tween-20 〇 6.丁38-阻斷緩衝液：對1升混合1.21克丁1115、8.77克 NaCl ' 1毫升TWEEN-20於約900毫升dH20中。以HC1調 整pH至7.2。添加10克BSA ’攪拌至溶解。以dH20使總容 -103- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（99 ) 積為1升。過濾移除顆粒物。 7. 1% BSA之PBS .為了製造一次操作溶液，添加1〇克 BSA至約990毫升PBS緩衝液中，攪拌至溶解。以pBS緩衝 液調整總容積至1升，過濾移除顆粒物。 8. 50 mM Hepes ρΗ7·5。 9. 自sf9重組样病毒轉型體（suGEN公司）純化GST-Flk1cd 。 10. 4% DMSO 於 dH20。 1 1. 10 mM ATP之dH20。 12. 40 mM MnCl2 β 13. 激酶稀釋緩衝液（KDB):混合1〇毫升Hepes(pH 7·5)、 l¾升5MNaCl、40微升100m^I原飢酸麵及0.4毫升含5o/o BSA 之 dH20 以及 88.56 毫升 dH20。 14. NUNC 96-洞V型底聚丙烯盤，Applied科學公司目 錄#八5-72092 ° 15. EDTA:混合14‘12克乙二胺四乙酸（£〇丁八）至約70 毫升dH20中。添加10 N NaOH直至EDTA溶解。調整pH 至8.0。以dH20調整總容積為1〇〇毫升。 16. 1級抗體稀釋緩衝液：混合10毫升含5% BSA之PBS 緩衝液及89.5毫升丁63丁。 17. 抗鱗醯酪胺酸單株抗禮共輛至辣根過氧酶（ργ99 HRP ’ Santa Cruz 生技公司）。 18. 2,2’-氮雜雙（3-乙基苯并噻唑啉）_6-磺酸（ABTS， Moss目錄編號ABST)。 -104- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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線 1324155 A7 B7 五、發明説明（100 ) 19. 10% SDS。 程序： 1，如材料及試劑之步驟3所述，以2微克polyEY肽之無 菌 PBS 塗佈 Corning 96-洞 ELISA盤。 2 .藉翻轉盤移除未結合之配位基。以TB S T洗滌一次。 於紙巾上輕拍該盤以移除過量液體。 3. 於各洞中添加100微升i〇/0 BSA之PBS。在室溫搖晃 培育1小時。 4. 重複步驟2。 5·以50 mM HEPES(pH 7_5)浸洗洞（150 微升 /洞）。 6.以dH20/4% DMS0稀釋測試化合物至為96-洞聚丙缔 盤中所需暴終分析濃度之4倍。 7 .於E LIS A盤中添加2 5微升稀釋測試化合物。於對照洞 中’放置25微升dH20/4% DMSO。 8. 添加25微升含4χ ΑΤΡ(2μΜ)之40 mM MnCh至各 洞中。 9. 添加25微升0.5 M EDTA至負對照洞中。 10. 以KDB稀釋GST-Flkl至0.005微克（5奈克）/洞。 11. 於各洞中添加50微升稀釋酵素。 12. 在室溫搖晃培育15分鐘》 13. 添加50微升250 mM EDTA(pH 8.0)停止反應。 1 4 ·以T B S T洗滌3次及在紙巾上輕拍盤以移除過量液 體。 15.每洞添加1〇〇微升抗碌酿酷胺酸hrp共軛物， -105- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1324155 A7
l:5,〇〇G稀釋度稀釋於㈣稀釋緩衝液中。在室溫搖晃培育 9 0分鐘。 1 6 .如步驟1 4洗滌。 17·在室溫於各洞中添加100微升ABTS溶液。 18. 搖晃培育1〇至15分鐘’移除任何氣泡。 19. 添加20微升i〇% SDS於各洞中而停止反應。 2〇_以測試濾光柵在41〇 11„1及參考濾光柵在63〇
Dynatech MR7000 ELISA讀取機上讀取結果。 PYK2生物分析 此分析用以測量HA抗原決定基標記之全長pyk2 (FL.pyk2-HA)於ELISA分析中之體外激酶活性。 材料及試劑： 1 · Corning 96-洞 ELISA盤。 2. 12CA5單株抗-HA抗體（SUGEN公司）。 3. PBS(杜貝克氏轉酸鹽緩衝之食鹽水（Gibco目錄編號 #450-1300EB)) » 4. 丁85丁緩衝液：對1升混合8.766克心(：1、6.057克 TRIS 及 1 毫升 0_1% Triton X-100 於約 900 毫升 dH2〇 中。 調整pH至7.2，使容積為1升》 5 .阻斷緩衝液：對1升混合1 0 0克1 0 °/。B S A、1 2 . 1克 100mMTRIS、58.44克lMNaCl及10毫升l%TWEEN-20。 6. FL_pyk2-HA得自sf9細胞溶胞物（SUGEN公司）。 7. 4% DMSO於MilliQue H20。 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）
裝 訂
線 1324155 A7 _B7 五、發明説明（102 ) 8. 10 mM ATP之dH20。 9. 1M MnCl2。 10. 1M MgCl2。 11. 1M二硫蘇糖醇（DTT)。 12. 10X激酶緩衝磷醯化：混合5.0毫升1M Hepes (pH 7.5)、0.2 毫升 1M MnCl2、1.0 毫升 1M MgCl2、1_0 毫升 10% Triton X-100於2_8毫升dH20。使用前天加0.1毫升 1M DTT。 13. NUNC 96-洞V型底聚丙烯盤。 14. 500 mM EDTA之dH20。 15. 抗體稀釋緩衝液：對100毫升，1毫升5% BSA/PBS 及1毫升10% Tween-20於88毫升TBS中。 16. HRP-共輛之抗-Ptyr PY99，Santa Cruz 生技公司 目錄編號SC-7020。 17. ABTS，Moss 目錄編號ABST-2000。 18. 10% SDS。 程序： 1. 以每洞0.5微克於Corning 96洞盤中塗佈12CA5抗體 之100微升PBS。在4°C儲存隔夜。 2. 藉翻轉盤移除未結合之HA抗體。以dH20洗滌盤。於 紙巾上輕拍該盤以移除過量液體。 3. 於各洞中添加150微升阻斷緩衝液。在室溫搖晃培育 30分鐘。 4. 以TBS-T洗滌盤4次。 -107- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1324155 A7 _— B7 五、發明説明（103 ) 5.溶胞物稀釋於PBS(1.5微克溶胞物/100微升PBS)。 6 _於各洞中添加1 〇〇微升稀釋溶胞物。在室溫搖晃1小 時。 7. 如步騾4洗滌。 · 8. 添加50微升2X激酶緩衝抑制含捕捉之pyk2-HA之 ELISA 盤。 9 .於各洞中添加2 5微升4 0 0 # Μ測試化合物之4% D M S Ο。對照洞僅使用4 % D M S Ο。 1 〇 ·添加2 5微升0.5 Μ E D Τ Α至負對照洞。 11. 於所有洞中添加25微升20/zM ATP »搖晃培育1〇分 鐘。 12. 添加25微升500 mM EDTA (pH 8.0)至所有洞中以 停止反應。 13. 如步騾4洗滌。 14. 添加1〇〇微升H RP共軛之抗-Ptyr稀釋1:6000倍於抗 體稀釋緩衝異於各洞中。在室溫搖晃培育1小時。 1 5 .以T B S T洗務盤三次及以P B S洗務一次。 16. 於各洞天加1〇〇微升ABST溶液。 17. 若需要，藉添加20微升10 % SDS於各洞中而停止發 展之反應。 1 8 _以測試遽光柵在4 1 0 n m及參考濾光柵在6 3 0 n m在 ELISA讀取機上讀取盤。 PGFR1生物分析 此分析用以測量F G F 1 - R於E LIS A分析中體外激酶活性。 -108- 本纸浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 ___B7_ 五、發明説明（104 ) 材料及試劑： 1. Costar 96-洞 ELISA盤（Corning 目錄編號3369)。 2. 聚（Glu,Tyr)(Sigma 目錄編號#卩0275)。 3. PBS(Gibco 目錄編號#450-1300EB)。 4. 50 mM Hepes缓衝溶液。 5. 阻斷溶液（5% BSA/PBS)。 6. 純化之 GST-FGFR1(SUGEN 公司）。 7. 激酶稀釋缓衝液。混合500微升1M Hepes (GIBCO)、20 微升 5% BSA/PBS、10 微升 100 mM 原釩酸 鈉及50微升5M NaCl。 8. 10 mM ATP。 9. ATP/MnCl2磷醯化混合物：混合20微升ATP、400微 升 1M MnCl2 及 9.56 毫升 dH20。 10. NUNC 96-洞V型底聚丙烯盤（Applied科學公司目 ^:#AS-72092) » 1 1 · 0 · 5 % E D T A。
12. 0.05% TBST。添加 500 微升 TWEEN 至 1 升 TBS 中。 13 .兔子多株抗-磷醯酪胺酸血清（SUGEN公司）。 14. 羊抗-兔子IgG過氧化酶共輛物（Biosource目錄編號 ALI0404)。 15. ABTS溶液。 16. ABTS/H202 溶液。 程序: -109- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 ____ B7 五、發明説明（105 ) 1. 以每洞 1 微克 Poly (Glu，Tyr)之 PBS 塗佈 Costar 96-洞ELISA盤，在4°C儲存隔夜。 2. 以PBS洗滌該塗覆之盤一次。 3 .添加1 5 0微升5 % B S A/PB S阻斷緩衝物至各洞中。在 室溫搖晃培育1小時。 4 .以P B S洗務2次接著以5 0 m Μ H e p e s洗務一次。於紙 巾上輕拍該盤以移除過量液體。 5. 於盤中添加25微升0.4 mM測試化合物之4% DMS0或 僅4 % D M S 0 (對照組）。 6. 於激酶稀釋緩衝液中稀釋純化之GST-FGFR1(5奈克激 酶/50微升KDB/洞）。 7. 於各洞中添加50微升稀釋激酶。 8. 藉添加25微升/洞新製備之ATP/Mn + + (0.4毫升1M 河11(：12、40微升1〇111]^八丁？、9.56毫升(11120，新製備） 而起始激酶反應。 9 .此為快速激酶反應且須以類似添加a T P之方式以2 5微 升0.5M EDTA停止。 10.以新鮮TBST洗滌盤4次。 1 1.補足抗體稀釋緩衝液：每50毫升：混合5毫升5。/。 BSA、250微升5 %牛奶及50微升1〇〇 mM釩酸鈉，以 0.05% TBST達終容積。 12.每洞添加1〇〇微升抗-磷醯酪胺酸（於adB之ΐ··ι〇〇〇〇 稀釋度）。在室溫榣晃培育i小時。 1 3 .如步驟1 〇洗滌。 -110- 本紙浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公茇) 1324155 A7 B7
1 4 .每洞添加1 〇 〇微升Biosource羊抗·兔子IgG過氧化酶共 辆物（於ADB之1:6000稀釋度）。在室溫搖晃培育1小時。 1 5 .如步驟1 0洗滌接著以PB S洗滌以移除氣泡及過量 TWEEN。 16. 於各洞中添加1〇〇微升abts/h2o2溶液。 17. 搖晃培育10至20分鐘。移除任何氣泡》 18. 以測試濾光柵在410 nm及參考濾光柵在630 nm在 Dynatech MR7000 ELISA讀取機上讀取分析。 EGFR生物分析 此分析用以測量FGF1-R於ELIS A分析中體外激酶活性。 材料及試劑： 1 · Corning 96-洞 ELISA 盤。 ， 2. SUM01單株抗-EGFR抗體（SUGEN公司）。 3. PBS。 4. TBST緩衝液。 5. 阻斷緩衝液：對100毫升，混合5.克Carnation即溶脫脂 奶粉®及100毫升PBS。 6· A431細胞溶胞物（SUGEN公司）。 7. TBS緩衝液。 8. TBS+10% DMSO :對 1 升，混合 1.514 克 TRIS、 2.192克NaC丨及25毫升DMS0;以£iH20使總容積為l升。 9. ATP(腺苷-5’-三磷酸酯，得自馬肌肉，Sigma目錄編 號A-5 3 94)，1.0 mM於dH20。此試劑需在使用前立即製 備且保持在冰上。 111 - 本纸浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐〉 1324155 A7 _____R7 五、發明説明（1〇7 ) 10. 1.0 mM MnCl2。 11. ATP/MnCl2磷醯化混合物：為製得10毫升，混合 300 微升 1 mM ATP、500 微升 MnCl2 及 9.2 毫升 dH20。使 用前製備，維持於冰上。 12. NUNC 96-洞V型底聚丙缔盤。 13. EDTA。 14_兔子多株抗-磷醯化血清（suGEN公司）。 15. 羊-抗兔子IgG過氧化酶共軛物（Bi osource目錄編號 ALI0404)。 16. ABTS。 17. 30%過氧化氫。 18. ABTS/H202 〇 19. 0.2 M HCi。 程序： 1.以每洞0.5微克SUM01之100微升PBS塗佈Corning 96-洞ELISA盤，在4〇C儲存隔夜。 2 ·藉翻轉盤自洞中移除未結合之sUM0 1以移除液體。 以dH2 0洗滌一次。於紙巾上輕拍該盤以移除過量液體。 3.於各洞中添加150微升阻斷缓衝液。在室溫搖晃培育 30分鐘。 4 .以去離子水洗務盤3次接著以T B S T洗條一次。於纟氏巾 上輕拍該盤以移除過量液體及氣泡。 5. 溶胞物稀釋於PBS(7微克溶胞物/100微升PBS)。 6. 於各洞添加100微升稀釋溶胞物。在室溫搖晃1小時。 -112 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（108 7. 如上述4洗滌盤。 8. 於含捕捉之EGFR之ELISA盤中添加120微升TBS。 9. 於TBS中以1:10稀釋測試化合物，置入洞中。 10. 添加13·5微升稀釋測試化合物至el ISA盤中。於對 照洞中’添加1 3.5微升含T B S之1 〇 % D M S Ο。 Π.在室溫搖晃培育30分鐘。
1 2 .除了負對照洞以外，於所有洞中添加i 5微升磷醯化 混合物。最終洞容積需為各洞中約丨5 〇微升之終濃度3 V M ATP/5 mM MnCl2。搖晃培育5分鐘。 13.藉添加16.5微升EDTA溶液搖晃下停止反應。再搖晃 1分鐘。 1 4 ·以去離子水洗滌4次及以τ B S T洗滌2次。 15. 每洞添加1〇〇微升抗-磷醯酪胺酸（於TBST之1:3000 稀釋度）。室溫搖晃培育30-45分鐘。 16. 如上述4洗滌。 17. 於各洞中添加100微升Biosource羊-抗兔子IgG過氧 化酶共軛物（於TBST之1:2000稀釋度）。室溫搖晃培育30 分鐘。 1 8 .如上述4洗務。 19. 於各洞添加1〇〇微升ABTS/H202溶液。 20. 搖晃培育5至10分鐘。移除任何氣泡。 21. 若需要，藉每洞添加100微升0.2 M HC1而停止反 應。 22. 以測試濾光柵在4 10 nm及參考濾光柵在630 nm在 -113- 本紙張尺度適用中國画家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) -- 1324155 A7 _____B7 五、發明説明（l〇9 )
Dynatech MR7000 ELISA讀取機上讀取分析。 PDGFR生物分析 此分析用以測量F G F 1 - R於E LIS A分析中體外激酶活性。 材料及試劑· 1. Corning 96-洞 ELISA盤。 2. 28D4C10 單株抗-PDGFR 抗體（SUGEN 公司）。 3. PBS。 4. TBST緩衝液。 5. 阻斷緩衝液（與EGFR生物分析相同）。 6. PDGFR-0表現NIH 3T3細胞溶胞物（SUGEN公 司）。 7. TBS缓衝液。 8. TBS+10% DMSO 0 9. ATP。 1 0 · Μ n C12 〇 1 1 _激酶缓衝液磷醯化混合物：對1 〇毫升，混合2 5 0微升 1Μ TRIS、200 微升 5Μ NaCl、100 微升 1M MnCl2 及 50 微升100 mM Triton X-100於足量dH20補足10毫升。 12. NUNC 96-洞V型底聚丙埽盤。 13. EDTA。 14. 兔子多株抗-磷醯化血清（SUGEN公司）。 15. 羊-抗兔子igG過氧化酶共輛物（Biosource目錄編號 ALI0404)。 16. ABTS。 -114 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7
17. 30%過氧化氫。 18. ABTS/H202。 19. 0.2 M HC1。 程序· 1.以每洞0.5微克28D4Cl〇t100微升PBS塗佈c〇rn 96 -洞ELISA盤，在4°C儲存隔夜。 2_藉翻轉盤自洞中移除未結合之28D4(：胸移除液體。 以dHaO洗滌一次。於紙巾上輕拍該盤以移除過量液體。 3.於各洞中添加150微升阻斷緩衝液。在室溫搖晃培育 30分鐘。 4·以去離子水洗滌盤3次接著以TBST洗滌一次。於紙巾 上輕拍該盤以移除過量液體及氣泡β 5. 溶胞物稀釋於HNTG(10微克溶胞物/10〇微升 HNTG)。 6. 於各洞添加1〇〇微升稀釋溶胞物。在室溫搖晃6〇分 鐘。 7·如上述步驟4洗務盤。 8.於含捕捉之PDGFR之ELISA盤中添加80微升操作之 激酶緩衝混合物。 9 ·於T B S中以1 : 1 〇稀釋測試化合物，置入9 6 -洞聚丙缔 盤中。 10.添加10微升稀釋測試化合物至ELISA盤中。於對照 洞中’添加10微升TBS + 10% DMSO。在室溫搖晃培育3〇 分鐘。 -115- 本纸張尺度適用中固國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（m ) 1 1 ·除了負對照洞以外，於所有洞中直接添加丨〇微升 A Τ P (最終洞容積需為各洞中約j 〇 〇微升之終濃度2 〇以M ATP)。搖晃培育30分鐘。 12_藉於各洞中添加1〇微升EDTA溶液以停止反應。 1 3 .以去離子水洗條4次及以T B S Τ洗滌2次。 14. 每洞添加1〇〇微升抗-磷醯酪胺酸（於ΤΒ5τ<1:3〇〇〇 稀釋度）。室溫搖晃培育30-45分鐘。 15. 如上述步驟4洗滌。 16. 於各洞中添加1〇〇微升8丨050111(：6羊_抗兔子igG過氧 化酶共軛物（於TBST之1:2000稀釋度）。室溫搖晃培育3〇 分鐘。 17. 如上述步驟4洗滌。 18_於各洞添加1〇〇微升ABTS/H202溶液。 19. 搖晃培育1〇至3_〇分鐘。移除任何氣泡》 20. 若需要，藉每洞添加1〇〇微升〇·2 M HC1而停止反 應。 2 1·以測試遽光栅在410 nm及參考遽光柵在6 30 nm在 Dynatech MR7000 ELISA讀取機上讀取分析。 細胞HER-2激酶分析 此分析用以測量於ELISA分析中於全細胞中之HER-2激 酶活性》 材料及試劑： 1. DMEM(GIBCO 目錄編號#11965-092)。 2. 胎牛血清（FBS，GIBCO目錄編號#16000-044)，於 -116- 本纸張尺度適用中國圉家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（丨12 5 6 °C水浴中加熱去活化3 0分鐘》 3. 胰蛋白酶（GIBCO目錄編號#25200-056)» 4. L-榖胺醯胺（GIBCO目錄編號#2503 0-08 1)。 5. HEPES(GIBCO 目錄編號# 1 5630-080)。 6·生長培養基：混合500毫升D MEM、55毫升熱去活化 之FBS、10毫升HEPES及5.5毫升L-榖胺醯胺。 7_貧乏培養基 混合500毫升DMEM、2.5毫升熱去活化之FBS、10 毫升HEPES及5.5毫升L-榖胺醯胺。 8. PBS。 9. 平底96-洞組織培養微滴定盤（Corning目錄編號 #25860)。 10. 15公分組織培養jm(Corning目錄編號#0875148) β 11. Corning 96-洞 ELISA 盤。 12. NUNC 96-洞V型底聚丙缔盤。 13. 對Transfer 96為Costar移轉匣（Costar目錄編號 #7610)。 14. SUMO 1 :單株抗-EGFR 抗體（SUGEN 公司）。 15. TBST緩衝液。 16. 阻斷緩衝液：5%Carnation即溶奶B®iPBS。 17. EGF配位基：EGF-201日本之美國Shinko公司。粉 末懸浮於100微升10 mM HC1。添加100微升10 mM NaOH。添加800微升PBS及移至Eppendorf管中，使用前 儲存在-2 0°C。 -117 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
裝 訂 線 1324155 A7 ______Β7 五、發明説明（U3 ) 1 8 . Η N T G溶胞緩衝液 對儲料5Χ HNTG而言，混合23.83克Hepes、 43.83 克NaCl、500 毫升甘油及l00毫升τritOnX-100及 足量dH20補足1升總溶液。 對IX HNTG*而言，混合2毫升HNTG、100微升0.1M Na3V04、250微升0.2 M Na4P2〇7及 100微升EDTA。 19. EDTA。 20. Na3V04。為了製得儲料溶液，混合1 84克Na3V04 及90毫升dH20。調整pH至10。於微波爐中煮沸1分鐘（溶 液變澄清）。冷卻至室溫。調整pH至10 »重複加熱/冷卻循 環直至pH維持在10。 2 1, 200 mM Na4P207。 22. 對磷醯酪胺酸特異之兔子多株抗血清（抗_Ptyr抗體， SUGEN公司）。 23. 親和性純化之血清，羊抗-兔子IgG抗體過氧化酶共 概物（Biosource目錄編號#八1^10404)。 2 4. ABTS 溶液。 25. 30%過氧化氫溶液。 26. ABTS/H202 β 27. 0.2 M HC1。 程序: 1.以每洞1.0微克SUM01之PBS塗佈Corning 96-洞 ELISA盤，100微升終容積/洞，在4〇C儲存隔夜。 2 ·使用當天，移除塗佈緩衝液及以dH 2 〇洗務盤3次及以 -118- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 1324155 Α7 Β7 五、發明説明（1Η T B S Τ緩衝液洗滌1次。此分析之所有洗液需以相同方式進 行，除非另有說明。 3. 於各洞中添加100微升阻斷緩衝液。在室溫搖晃培育 3 0分鐘。恰在使用前洗務盤。 4. 此分析使用 EGFr/HER-2 chimera/3T3-C7 細胞株。 5. 選擇去有80-90 %共融之皿。藉胰蛋白酶化及在1〇〇〇 rpm於室溫離心5分鐘而收集細胞。 6. 細胞懸浮於貧乏培養機中及以色蒽藍（trypan blue)計 數。需要高於90%存活性。於貧乏培養基中以每洞2,5 00細 胞之密度，每洞90微升於96洞微滴定盤中接種細胞。在5〇/0 C02及37°C培育接種之細胞隔夜。 7. 接種後開始分析兩天。 8. 測試化合物溶於4% DMSO。樣品接著在直接於盤上 以貧乏-DMEM稀釋。典型上，此稀釋將為ι:ι〇或更大。所 有洞接著再以1:1〇稀釋度（10微升樣品及培養基至9〇微升貧 乏培養基）移至細胞盤中最終DMSO濃度需為1%或更低。 亦可使用標準連續稀釋。 9 ·在5 % C Ο 2及3 7。(：培育2小時。 10. 藉稀釋儲料EGF(16.5vM)於溫DMEM中至150 ηΜ 而製備EGF配位基。 11. 對每洞製備1〇〇微升足用之新鮮HNTG* ;置於冰 上。 1 2 .以測試化合物培育2小時後，於細胞中添加製備之 E G F配位基，每洞5 〇微升，終濃度5 〇 η Μ。正對照洞接受 -119-
1324155 A7 B7 五、發明説明（115 相同量之EGF。負對照洞不接受EGF。在3 7 °C培育1 0分 鐘。 13.移除測試化合物、EGF及DMEM。以PBS洗滌細胞 一次。 14_ HNTG1移至細胞中，每洞100微升。放置冰上5分 鐘。同時，自ELIS A盤移除阻斷緩衝液及洗滌。 1 5 ·以微滴管自盤刮除細胞及藉重複吸取及分散該 HNTG1溶胞緩衝液使細胞物質均質化。溶胞物移至塗佈、 阻斷、洗滌之ELISA盤，或使用Costar轉移匣將溶胞物移 至盤中。 1 6 .在室溫搖晃培育丨小時。 17. 移除溶胞物、洗滌。將新鮮稀釋之抗-Ptyr抗體（於 TBST中之1:3000稀釋度）移至ELISA盤，每洞100微升。 18. 室溫搖晃培育3.0分鐘。 19. 移除抗-ptyr抗體，洗滌。將新鮮稀釋之 BI0S0URCE抗體（於TBST中之1:8000稀釋度，每洞10〇 微升）移至ELISA盤。 20. 室溫搖晃培育30分鐘。 21，移除BI0S0URCE抗體、洗滌。將新鮮稀釋之 ABTS/H202溶液移至ELISA盤，每洞1〇〇微升。 22.搖晃培育5-10分鐘’移除任何氣泡。 23_每洞添加100微升0.2M HC1而停止反應。 24.以測試濾光柵在4i〇 nm'參考濾光柵在63〇 nmS Dynatech MR7000 ELISA讀取機上讀取分析。 1 120- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（116 ) CDK2/胞轉蛋白A分析 此分析用以測量人類Cdk2/胞轉蛋白A閃爍鄰近分析（SPA) 中之體外絲胺酸/蘇胺酸激酶活性。 材料及試劑： 1· Wallac 96-洞聚對苯二甲酸乙二醇酯（撓性）盤 (Wallac 目錄編號#1450-401)。 2. Amersham Redivue[7*33P] ATP(Amersham 目錄編 &#AH 9968)。 3. Amer sham鏈黴肽塗佈之聚乙烯基甲苯SPA珠粒 (Amersham目錄編號#RPNQ0007)。珠粒需於PBS中復原 而無鎂或鈣，20毫克/毫升。 4 .活化c dk2 /胞轉蛋白A酵素複合物，純化自s f9細胞 (SUGEN公司）。 5. 生物素化之肽受質（Debtide)。肽生物素-X-PKTPKKAKKL以5毫克/毫升之濃度溶於dH20。 6. 肽/八丁？混合物：對1〇毫升，混合9.979毫升(^20' 0.00 125 毫升“冷” ATP ' 0.010 毫升 Debtide 及 0.010 毫升 7 33P ATP。每洞最終濃度將為0.5 y Μ“冷”ATP ' 〇.1微 克 Debtide 及 0.2#Ci r33P ΑΤΡ。 7. 激酶緩衝液：對10毫升，混合8.85毫升dH2〇、0.625 毫升 TRIS (pH 7.4)、0.25 毫升 1M MgCl2、0.25 毫升 10% NP40及0.025毫升1M DTT，使用前新鮮添加, 8. 1 mM ATP於dH20。 - 9. 1M Tris，以 HC1 調整 pH 至 7.4。 -121 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝 訂
線 1324155 A7 B7 五、發明説明（117 10. 1M MgCl2。 1 1. 1M DTT。 12. PBS(Gibco 目錄編號#1419〇_144)。 13. 〇_5 M EDTA。 14. 停止溶液：對ίο毫升，混合9_25毫升PBS、〇 〇〇5毫 升 100 mM ATP、0.1 毫升 〇_5 M ED丁A、〇」毫升 Trit〇n X-100及1 _25毫升20毫克/毫升SPA珠粒。 程序： 1. 製備測試化合物於5 °/。D M S Ο之5倍所需終濃度之溶 液。於各洞中添加1 0微升。對負對照洞，僅使用丨〇微升5 % DMSO。 2. 以2.1毫升2x激酶緩衝液稀釋5微升cdk2/胞轉蛋白a 溶液。 3·於各洞中添加2 0微升酵素。 4 .於負對照洞中添加1 〇微升〇. 5 μ E D T A。 5.為了起始激酶反應，添加2〇微升肽/ATP混合物至各 洞中。未搖晃下培育1小時。 6 .於各洞中添加2 0 0微升停止溶液。 7 ·維持至少1 0分鐘。 8. 盤在約2300 rpm旋轉約3-5分鐘。 9. 使用Trilux或類似讀取機計數盤。 MET轉碌醯化分析 此分析用以測量對聚（榖胺酸：酪胺酸（4 : 1))受質上之磷醯 酶胺酸量’作為鑑定受質之met轉磷醯化之促效劑/拮抗劑 -122- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐〉 1324155 A7 B7 五、發明説明（118 ) 之手段。 杜料及詖濟丨： 1 ‘ Coming 96-洞 E LIS A 盤，Coming 目錄編號#25805-96。 2·聚（glu，tyr)4:l，Sigma 目錄編號P 0275。 3. PBS，Gibco 目錄編號“50-1300EB。 4. 50 mM HEPES。 5. 阻斷緩衝液：溶解25克胎牛血清白蛋白（Sigma目錄編 號A-7888)於500毫升PBS，經4微米濾紙過濾。 6. 純化含Met激酶區域之GST融合蛋白質（sugen公 司）。 7. TBST緩衝液。 8. 10°/。DMSO 水溶液（MilliQue H20)。 9. 10 mM腺苷-5’-三磷酸酯水溶液（dH20)，Sigma目錄 編號A-5394。
10. 2X激酶稀釋緩衝液：對100毫升，混合1〇毫升丄M HEPES(pH 7.5)與 0·4 毫升 5% BSA/PBS、0.2 毫升 〇·ι Μ 原釩酸鈉及1毫升5 Μ氯化鈉於8 8.4毫升dH2〇中。 11. 4Χ ATP反應混合物：對10毫升，混合〇·4毫升1 μ 氣化錳及0.02毫升0.1 Μ ATP於9.56毫升dH2〇。 12. 4X負對照混合物：對10毫升，混合0.4毫升i M氣化 錳於9.6毫升dH20。 13. NUNC 96-洞V型底聚丙烯盤，Applied科學公司目綠 #S-72092 0 14. 500 mM EDTA。 -123- 本纸張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
裝 訂
線 1324155 A7 B7 五、發明説明（119 1 5 _抗體稀釋緩衝液··對丨〇 〇毫升，混合丨〇毫升5 0/〇 BSA/PBS、0.5毫升5% Carnation即溶奶粉⑧之卩以及0_1毫 升0.1 Μ原飢酸鈉於88.4毫升TBST。 16_兔子多株抗鱗酿路胺酸抗體，sUgen&g。 17.羊抗-兔子辣根過氧化酶共軛之抗體，Biosource公司。 18_ ABTS溶液：，混合192ι克檸檬酸、3549克 Na2HPO4&500毫克ABTS及足量dH20製成1升。 19· ABTS/H2〇2 :使用前使15毫升ABST溶液與2微升 H2〇2混合5分鐘。 20. 0_2 M HC1。 程序： 1.以2微克聚（Glu-Tyr)之100微升PBS塗佈ELISA盤。 在4 °C儲存隔夜。 2·以150微升5%BSA/PBS阻斷盤60分鐘。 3.以PBS洗務盤2次，以50 mM Hepes緩衝液（pH 7.4) 洗務1次β 4·於所有洞中添加5〇微升稀釋激酶（以激酶稀釋緩衝液稀 釋純化激酶，終濃度需為10奈克/洞）。 5. 於盤中添加25微升測試化合物（於4% DMSO)或僅 DMSO(4% 於 dH20)對照組。 6. 激酶/化合物混合物培育15分鐘。 7. 於負對照洞中添加25微升40 mM MnCl2。 8. 於所有其他洞（除負對照組以外）添加25微升 ATP/MnCl2混合物。培育5分鐘。 -124- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(2l〇x 297公爱） 1324155 A7 B7 五、發明説明（120 9. 添加25微升500 mM EDTA以停止反應。 10. 以TBST洗滌盤3次。 1 1.於各洞中添加以1: 10,000稀釋於抗體稀釋緩衝液中 之100微升兔子多株抗-Ptyr。室溫搖晃培育1小時。 12.以TBST洗滌盤3次。 1 3 _使Biosource HRP共概之抗-兔子抗體以1:6〇〇〇稀釋 於抗體稀釋緩衝液中。每洞添加100微升及在室溫搖晃下培 育1小時。 1 4 ·以P B S洗滌盤1次。 15_於各洞中添加1〇〇微升ABTS/H202溶液。 16_若需要’每洞添加1〇〇微升〇_2M HC1以終止反應發 展。 17.以測試濾光柵在410 nm及參考濾光柵在630 nm在 Dynatech MR7000 elisa讀取機上讀取分析。 IGF-1轉磷醯化分析 此分析用以測量對聚（榖胺酸：酪胺酸（4 : 1))中之磷醯酪胺 酸量’作為鑑定受質之gst-IGF-Ι轉罐醯化之促效劑/拮抗 劑。 被料及詖劑： 1. Corning 96 -洞 Elisa盤。 2. 聚（glu，tyr)(4:l)，Sigma 目錄編號P 0275。 3. PBS，Gibco 目綠編號“50-1300EB。 4. 50 mM HEPES。 5· TBB阻斷緩衝液：對1升，混合1〇〇克bsA ' 12.1克 -125- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 裝 訂
線 1324155 A7 B7 五、發明説明（121 丁尺15(卩117_5)、5 8.44 克氣化鈉及10毫升1%丁\^££1^-20 ° 6. 純化含IGF-1激酶區域之GST融合蛋白質（Sugen公 司）。 7. 丁851'緩衝液：對1升，混合6.057克1'1^' 8.766克 氣化鈉及0.5毫升TWEEN-20及足量dH20製成1升。 8. 4% DMSO於 MiUi-Q H20。 9. 10 mM ATP於dH20。 10. 2X激酶稀釋緩衝液：對100毫升，混合10毫升1 Μ HEPES(pH 7.5)與 0.4 毫升 5% BSA 之 dH20、0.2 毫升 0.1 Μ原鈒酸鈉及1毫升5 Μ氣化鈉於足量dH20中製成1〇〇毫 升。 11. 4X ATP反應混合物：對10毫升，混合0.4毫升1 Μ MnCl2 及 0.08 毫升 0.01 Μ ATP 於 9.56毫升(1只20。 12. 4X負對照混合物：混合〇.4毫升1 Μ氯化錳於9_60毫 升dH20 。 13 _ NUNC 96,洞V型底聚丙烯盤。 14. 500 mM EDTA於dH20。 1 5 ·抗體稀釋緩衝液：對1 〇 〇毫升，混合1 〇毫升5 % B s A 之PBS、0.5毫升5% Carnation即溶脫脂奶粉®2PBS及0.1 毫升0.1 Μ原釩酸鈉於88.4毫升TBST。 16. 兔子多株抗磷醢酪胺酸抗體，Sugen公司。 17. 羊抗·兔子HRP共軛之抗體，Biosource公司。 1 8 . A B T S 溶液。 -126- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（122 ) 19. ABTS/H2〇2 :使用前使15毫升ABTS溶液與2微升 H2〇2混合5分鐘。 20. 0.2 M HC1 於dH20。 程序： 1. 以每洞 2.0 微克聚（Glu，Tyr) 4:l(Sigma P0275)之 100微升PBS塗佈ELISA盤。在4°C儲存隔夜。 2. 以PBS洗滌盤1次。 3. 於各洞添加100微升TBB阻斷緩衝液。盤在室溫搖晃 培育1小時。 4. 以PBS洗滌盤1次’以50 mM Hepes緩衝液（pH 7.5) 洗滌2次。 5. 於盤中添加25微升測試化合物之4% DMSO(以dH20 稀釋1 0 m Μ測試化合物之1 0 0 % D M S Ο之儲料溶液所得）。 6. 添加10.0奈克gst-IGF-Ι激酶之50微升激酶稀釋緩衝 液於所有洞中。 7 .藉添加2 5微升4 X A T P反應混合物至所有測試洞及正 對照洞中起始激酶反應。於所有負對照洞中添加25微升4X 負對照混合物。室溫搖晃培育10分鐘。 8. 於所有洞中添加25微升〇·5Μ EDTA(pH 8.0)。 9. 以TBST缓衝液洗滌盤4次。 10. 於各洞中添加以1:10, 〇〇〇稀釋於100微升抗體稀釋 緩衝液中之兔子多株抗-鱗醯基酪胺酸抗血清。室溫搖晃培 育1小時。 1 1 .如步驟9洗滌盤。 -127- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 裝 訂
線 1324155 A7 B7 五、發明説明（123 ) 1 2 .於各洞中添加以1 : 1 0,0 0 0稀釋於抗體稀釋緩衝液中 之1 00微升Biosource抗-兔子HRP。室溫搖晃培育1小時。 1 3 .如步騾9洗滌盤，接著以P B S洗滌1次以減少氣泡及 過量Tween-20。 14.於各洞中添加100微升/洞ABTS/H2〇2展色。 1 5 .約5分鐘後，以測試濾光柵在4 1 0 nm及參考濾光柵 在630 nm在ELISA讀取機上讀取ELISA分析。 BRDU併入分析 下列分析使用基因工程至表現經選擇之受體之細胞且接 著藉測定B rdU併入DN A而評估有用化合物對配位基誘發之 D N A合成活性之效果。 下列材料、試劑及程序對各下列B r dU併入分析均通用。 注意特定分析之變數。 材料及試劑： 1. 適當配位基。 2. 適當基因工程細胞。 3. BrdU標記試劑：10 mM 於 PBS (pH 7.4)( Boehringer Mannheim，德國）。 4. FixDenat:固定溶液（已可使用）（Boehringer Mannheim， 德國）。 5. 抗-BrdU-POD :與過氧化酶共軛之小鼠單株抗體 (Boehringer Mannheim，德國）。 6. TMB受質溶液：四甲基苄啶（TMB，Boehringer Mannheim，德國）。 -128- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1324155 A7 B7 五、發明説明（l24 ) 7. PBS 洗滌溶液：IX PBS，pH 7.4。 8. 胎牛白蛋白（BSA)，溶離份V粉末（Sigma化學公司， USA)。 一般程序: 1.細胞以8000細胞/洞接種於10% CS、2 mM Gin之 DMEM於96-洞盤中。細胞在37°C及5% C02培育隔夜。 2 . 2 4小時後，細胞以P B S洗滌，接著於不含血清之培養 基（含0.1% BSA之0% CS DMEM)中血清匱乏24小時。 3 ·第3天，同時於細胞中添加適當配位基及測試化合物。 負對照洞僅接受含0 · 1 % B S A之無血清D Μ E Μ ;正對照洞 接受配位基但無測試化合物。測試化合物於9 6洞盤中以配 位基於不含血清之DMEM中製備及連續稀釋7個測試濃度。 4. 配位基活化1 8小時後，添加稀釋之BrdU標記試劑 (1:100於DMEM，0.1% BSA)及細胞與BrdU培育（終濃度 = 10yM)1.5小時。 5. 以標記試劑培育後，藉傾析及於紙巾上輕敲翻轉之盤 移除培養基。添加FixDenat溶液（50微升/洞）及盤在室溫於 盤搖晃機上培育45分鐘。 6. 藉傾析及於紙巾上輕敲翻轉之盤移除FixDenat溶液。 添加奶粉（5%脫水奶粉於PBS中，200微升/洞）作為阻斷溶 液及盤在室溫於盤搖晃機上培育30分鐘。 7 _藉傾析移除阻斷溶液及洞以p b s洗滌1次》添加抗_ BrdU-POD 溶液（於 PBS 之 1:200 稀釋度，1% BSA)(5(m 升/洞）及盤在室溫於盤搖晃機上培育9〇分鐘。 -129- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) -- 1324155 A7 B7 五、發明説明（125 ) 8. 抗體共軛物藉傾析充分移除及以PBS清洗洞5次，及盤 藉反轉及在紙巾上輕敲而乾燥。 9. 添加受質溶液（100微升/洞）及在室溫於盤搖晃機上培 育2 0分鐘直至展色足以供光譜偵測。 10. 在Dynatech ELISA盤讀取機上於410 nm測量樣品 吸收度（“雙波長”模式中以490 nm濾光柵讀取作為參考波 長）。 EGF-誘發之BrdU併入分析 材料及試劑： 1. 小鼠EGF，201( Toyobo股份有限公司，日本）。 2. 3T3/EGFRc7。 EGF-誘發之Her-2-驅動之BrdU併入分析 材料及試劑： 1. 小鼠EGF，201 (.Toyobo股份有限公司，日本）。 2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr(含Her-2 激酶區域之EGFr)。 EGF-誘發之Her-4-驅動之BrdU併入分析 材料及試劑： 1. 小鼠EGF，201(Toyobo股扮有限公司，曰本）。 2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr(含 Her-4 激酶區域之 EGFr) » PDGF-誘發之BrdU併入分析 材料及試杳丨： 1. 人類PDGF B/B(Boehringer Mannheim，德國）。 2. 3T3/EGFRC7。 FGF·誘發之BrdU併入分析 -130- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 一____B7_ 五、發明説明（I26 ) 材料及詁施丨: 1. 人類 FGF2/bFGF(Gibco BRL，USA)。 2. 3T3c7/EGFr。 IGF1-誘發之BrdU併入分析 材料及tr杳丨： 1·人類重組體（G511，Promega公司，USA)。 2. 3T3/IGFlr° 胰島素誘發之BrdU併入分析 材料及詖蒯: 1 ·胰島素，結晶，胎牛，鋅（13007，Gibco BRL，USA)。 2. 3T3/H25。 HGF-誘發之BrdU併入分析 材料及詖存丨: 1. 重組人類HGF(.目錄編號249-HG，R&D系統公司， USA)。 2. BxPC-3 細胞（ATCC CRL-1687)。 絲： 1. 細胞以90 00細胞/洞接種於9 6洞盤之11?1^110%?8 5 中β細胞在3 7。(：及5% C02培育隔夜。 2. 24小時後，細胞以PBS洗滌接著於1〇〇微升無血清之 培養基（含0.1% BSA之RPMI)中血清匱乏24小時。 3. 第3天，於細胞中添加25微升含配位基（在1微克/毫升 RPMI中以0.1% BSA製備，HGF終濃度為200奈克/毫升） 及測試化合物。負對照洞接受2 5微升僅含〇. 1 % B S A之無 -131 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1324155 A7 _____ B7 五、發明説明（127 ) 血清RPMI ;正對照洞接受配位基（HGF)但無測試化合物。 測試化合物在無血清之RPΜI中以配位基於9 6洞盤中製備為 其終濃度之5倍及連續稀釋獲得7個測試濃度β典型上，測 試化合物最高濃度為1 0 0 /i Μ及使用1: 3稀釋度（亦即最終測 試化合物濃度範圍為0.137-100//Μ)。 4 ·配位基活化1 8小時後，於各洞中添加丨2 · 5微升稀釋 BrdU標冗試劑（於RPMI稀釋1:1〇〇，〇1% BSA)及細胞與 BrdU(終濃度為10 μ M)培育1小時。 5 .與一般程序相同。 6 ·與一般程序相同。 7 ·藉傾析移除阻斷溶液及洞以ρβ S洗滌1次。添加抗-BrdU-POD 溶液（於PBS 中之 1:100 稀釋度，1% BSA)(100 微升/洞）及盤在室溫於盤搖晃盤上培育90分鐘。 8 .與一般程序相同.。 9. 與一般程序相同。 10. 與一般程序相同。 HUV-EC-C 分析 此分析用以測量化合物抗PDGF-R、FGF-R、VEGF、 aFGF或Flk-1/KDR之活性，各均由HUV-EC細胞自然表 現。 第0天 1.洗滌及胰蛋白化HUV-EC-C細胞（人類傘狀靜脈内皮 細胞）（美國菌種中心目錄編號1 730 CRL)。在約1毫升/1〇 cm2組織培養瓶中以杜貝克氏磷酸鹽緩衝之食鹽水（D- -132- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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線 1324155 A7 B7 五、發明説明（128 PBS ’得自Gibco BRL目錄編號14190-029)洗滌2次。於 非酵素細胞解離溶液（Sigma化學公司，目錄編號C- 1 544) 以0.0 5 %胰蛋白酶_ e D T A胰蛋白酶化。0 · 2 5 %胰蛋白酶/ i mM EDTA(Gibco目錄編號25200-049)於細胞解離溶液中 稀釋製成0.05%胰蛋白酶。以約1毫升/25 -3 0 cm2組織培養 瓶在3 7 °C胰蛋白酶化約5分鐘。自瓶脫離細胞後，添加等體 積分析培養基及移至50毫升無菌離心管（Fisher科學公司目 綠編號05-539-6)。 2. 以約35毫升分析培養基於50毫升無菌離心管中藉添加 分析培養基而洗滌細胞，在約2〇〇χ g離心1〇分鐘，吸取上 澄液及再懸浮於35毫升D-PBS。重複以D-PBS洗滌數次， 細胞再懸浮於約1毫升分析培養基/丨5 cm2組織培養瓶中。 分析培養基油F12K培養基（Gibco BRL目錄編號21127-014)及0_5〇/。熱去活化之胎牛血清所構成，以c〇uiter計數 器® (C〇u 1 ter電器公司）計數細胞及於細胞中添加分析培養 基以獲得濃度0.8-1.0 X 1〇5細胞/毫升。 3. 以100微升/洞或〇.8-1.0 X 1〇4細胞/洞將細胞添加至 96-洞平底盤中，在37。(：及5% C02培育約24小時。 第1天 1 ·於個別9 6 -洞盤中補充2倍測試化合物分散物，一般為 50yM降至O/ζΜ。使用如第〇天步騾2所用之相同分析培養 基。藉添加9 0微升/洞2 0 0 /z Μ測試化合物（4 X最終洞濃度） 至特定盤爛頂端洞而作成分散。由於倚料測試化合物一般 為20mM於DMSO中’因此200μΜ藥物濃度含有2%DMSO。 -133- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 A7 ___B7 五、發明説明（129 ) 使用於分析培養基（F 12K + 0.5%胎牛血清）中之構成2% D M S 0之稀釋劑作為測試化合物分散液以稀釋測試化合 物，但維持DMSO濃度恆定。以60微升/洞添加此稀釋劑至 該攔其餘洞中。於該欄頂端1 2 0微升2 0 0 /i Μ測試化合物稀 釋度中取出60微升及與該欄第二洞中之6〇微升混合。自此 洞取60為生病與該欄第三洞中60微升混合等等，直至完成 兩倍分散。接著混合次一洞至最後洞，取此洞中丨2 〇微升之 60微升並丟棄。留下含6〇微升DMSO/培養基稀釋劑之最後 洞作為含非測試化合物之對照組。製作9欄分散化合物（各 洞重複三次）：（1)VEGF(得自Pepro技術公司目錄編號 100-200)、（2)内皮細胞生長因子（ECGF)(亦稱為酸性纖 維母細胞生長因子或aFGF)(得自Boehringer Mannheim生化公 司目錄編號 1439 600)、或（3)人類 PDGF B/B(1276-956， Boehringer Mannheim，德國）及分析培養基對照组。EcGF作為 以肝素鈉之製劑。 2 · 5 0微克/洞之測試化合物稀釋液移至含第〇天之 0.8-1.0 X 104細胞/100微升/洞HUV-EC-C細胞之96-洞 分析盤中，及在3 7 °C及5 % C 02培育約2小時。 3 _重複3次於各測試化合物條件下添加5 〇微升/洞之8 〇微 克/毫升VEGF、20奈克/毫升ECGF或培養基對照組。置於 測試化合物，生長因子濃度為所需終濃度之4倍。使用第〇 天步驟2之分析培養基構成生長因子濃度。在37°C及5% C Ο 2培育約2 4小時。各洞將具有5 0微升測試化合物稀釋 液、50微升生長因子或培養基及1〇〇微升細胞，其計算總計 -134- 本纸張尺度適用中國國家標準(CMS) A4规格(210 X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（130 ) 為2 0 0微升/洞。因此一旦有東西加入洞中，則測試化合物 與成長因子之4X濃度變為IX。 第2天 1·以1 # Ci/洞（於RPMI培養基+ 10%熱去活化胎牛血清 中構成10微升/洞100以Ci/毫升溶液）添加3H-胸：y： (Amersham目錄編號TRK-686)及在37°C及5% C02培育約 24小時。RPMI係得自Gibco BRL目錄編號1 1 875 -05 1。 第3天 1.在-20 °C冷;東該盤隔夜。 第4天 解束盤及以9 6 -洞盤收取機（Tomtec Harvester 96® )收取至 濾紙墊上（评&11&(：目錄編號12 0 5-40 1)，在\\^11&〇861&?以6™ 液體閃爍計數器上讀取計數。 表2顯示有些本發明例舉化合物之生物測試活性。結果以 IC5◦表示，為引起標第ρκτ活性相較於未添加測試化合物 之對照组織P T K活性有5 0 %改變之測試化合物微莫耳當量 (Μ Μ )濃度。尤其，所示結果顯示測試化合物引起標的ρ τ κ 活性5 0%降低之所需濃度，已使用或可使用以評估化合物 之生物分析詳述如下。測試化合物1 _ 9並發現在f 1 k G S Τ、 FGFR1及PDGF分析中具有活性且在該等分析中對egf顯 示選擇性。 體内動物模型 異體移植動物楛形 人類腫瘤於典·胸腺小鼠（如Balb/c，nu/nu)中異體移植生 135 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS> A4規格(210X297公愛） 1324155 A7 B7 五、發明説明（131 長之能力提供研究對人類腫瘤治療之生物反應之有用體内 模型。由於第一次呈工地異體移植人類腫瘤至無胸腺小鼠 上（Rygaard 及 P〇vlsen, 1969，Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760)，許多不同人類腫瘤細胞株（如乳房、肺、泌尿 道、胃腸道、頭頸、神經膠母細胞瘤、骨骼及惡性黑色瘤） 以移植且成功地生長於無毛小鼠上。下列分析用以測定本 發明不同化合物之活性量、特異性及效果。三種一般類分 析可用以評估化合物：細胞/催化、細胞/生物及體内。細胞 /催化分析之目的係測定化合物對TK使細胞中已知受質上之 酪胺酸磷醯化之能力之影響。細胞/生物分析目的係測定化 合物對由TK在細胞内刺激之生物反應之影響。體内分析目 的係測定化合物於特定失調如癌症之動物模型中之影響。 皮下異體移植實驗之適當細胞株包含C6細胞（神經膠瘤 ATCC #CCL 107)、A3 75 細胞（黑色瘤 ATCC #CRL 1619)、A4 31 細胞（表皮樣癌瘤 ATCC #CRL 1555)、 Calu 6 細胞（肺 ATCC #HTB 56) ' PC3 細胞（前列腺 ATCC #CRL 1435)、SKOV3TP5細胞及NIH 3T3纖維母細胞基 因工程至過度表現EGFR、PDGFR、IGF-1R或任何其他測 試激酶。下列方法用以進行異體移植實驗： 雌性無胸腺小鼠（BALB/c，nu/nu)得自Simonsen實驗室 (Gilroy，CA)。所有動物於微隔絕籠中維持在乾淨室狀態有 α-dri床鋪。其接受無菌齧齒類飼料及自由飲水》 細胞株於適當培養基（例如，MEM、DMEM、Ham，s F 10或Ham’s F 12加上5%-1〇%胎牛血清（FBS)及2 mM榖 -136· 本纸張尺度適用中國國家標_(CNS) A4規格(210 x 297公釐)
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線 1324155 A7 B7 五、發明説明（132 胺醯胺（GLN))中生長。所有細胞培養基、榖胺醯胺及胎牛 血清購自Gibco生命技術公司（Grand Island, NY )，除非另有 說明。所有細胞於潮濕大氣中90-95%空氣及5-10% C02 中在3 7 °C生長。所有細胞株每週例行次培養2次及油 Mycotect方法測定（Gibco)對黴漿菌為陰性。 在或靠近融合處以0.05 %胰蛋白酶-EDTA收取細胞及在 4 5 Oxg粒片化10分鐘。粒片再懸浮於無菌PBS或培養基中 (無PBS)至特定濃度及細胞植入小鼠後腰（每組8-10隻，2-10χ10ό細胞/動物）。使用venier測徑器於3至6週測量腫瘤 生長。腫瘤體積計算為長度X寬度X高度之乘積，除非另有 說明。使用標準t -測試計算P值。於5 0 - 1 0 〇微升賦型劑 (DMSO或VPD:D5W)中之測試化合物可藉IP注射以植入當 天開始以不同濃度輸送。 腫瘤侵入模型 下列腫瘤侵入模型已發展且用以評估經鑑定可選擇性抑 制KDR/FLK-1受體之化合物之治療價值及效率。 程序 使用8週齡無毛小鼠（雌性）（Simonsen公司）作為實驗動 物。腫瘤細胞植入可於層狀流動櫥中進行。對麻醉而言， 以腹膜内投與二甲苯畊（xylazine)/肯它胺（ketamine)混合液 (100毫克/公斤肯它胺及5毫克/公斤二甲苯畊）。切開中線 以暴露腹腔（長度約1.5公分）而注入107腫瘤細胞之1〇〇微升 培養基體積。細胞注入腹之十二指腸端或結腸衆膜中β以 6-0絲線連續缝合關閉腹膜及肌肉及使用傷口夾關閉皮膚。 -137- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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k 1324155 A7 R7 五、發明説明（133 ) 每曰觀察動物。 分析 2-6週後’視動物之總體觀察而定，殺死小鼠及檢視局部 腫瘤遷移至各種器官（肺、肝、腦、胃、脾、心、肌肉）及分 析（測量腫瘤大小、侵入等級、免疫化學性、雜化測定等）。 C-KIT分析 此分析用以偵測c_kit酪胺酸磷醯化之量。 Μ 0 7 E (人類及性骨髓性白血癌）細胞於〇 · 1 %血清中經血 清匱乏隔夜。細胞進行配位基刺激前以化合物預處理（與血 清匮乏同時）。細胞以250奈克/毫升rh-SCF刺激15分鐘。 刺激後，細胞溶胞及以抗_c_kit抗體免疫沉澱。藉西方墨點 測定磷醯基酪胺酸及蛋白質量。 MIT增殖分析 M07E細胞如磷醯化實驗般，經血清匱乏及與化合物預處 理。細胞以4xl05細胞/洞舖於含1〇〇微升rpmI+10%血清 之96洞盤中。添加rh-SCF(100奈克/毫升）及盤培育48小 時。48小時後，添加10微升5毫克/毫升MTT[3-(4,5-二甲 基嘧唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鑌溴化物]及培育4小時，添 加酸異丙醇（100微升0.04N HC1之異丙醇）及在55〇 nm波 長測定光學密度。 細胞凋亡分析 M07E細胞於+ /- SCF及+ /-化合物之fbs下於含rh· GM-CSF(10奈克/毫升）及rh-IL-3(l〇奈克/毫升）中择育。 樣品在24及48小時分析。為了測量活化之卡波酶_ -138- 本纸诔尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1324155 A7 B7 五、發明説明（134 ) 3 (caspase-3)，樣品以P B S洗滌及以冰冷卻之7 0 %乙醇預滲 透。細胞接著以P E -共輛之多株兔子抗-活化卡波酶-3著色 及藉F AC S分析。為了測量斷裂之P ARP，樣品經溶胞及以 西方墨點以抗-P ARP抗體分析。 其他分析 可用以評估本發明化合物之其他分析包含（但不限於）生 物-flk-Ι分析、EGF受體- HER2嵌合受體於全細胞中分 析、生物-s r c分析、生物-1 c k分析及測量r a f鱗酿化功能之 分析。各該等分析之方式可見於USP申請號09/099,842，其 包含圖示均併於本文供參考。 細胞毒性測量 治療化合物需比既有細胞毒性劑更具有效之抑制受體酿 胺酸激酶活性。化合物之效率及細胞毒性指標寸藉測定治 療指數亦即IC5〇/LD5〇而獲得。IC5〇為達到50%抑制作用所 需之劑量，其可使用標準技術如本文所述者測量。LD50為 導致5 0%毒性之劑量，亦可藉標準技術（Mossman, 1983，L Immunol. Methods. 65:55-63 )，藉測量釋出之 LDΗ 量 (Korzeniewski 及 Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods. 64:313，Decker及Lohmann-Matthes, 1998，J. Immunol. Methods. 115:61)或藉測量動物模型中致死劑量而測得。具較大治療 指數之化合物較佳。治療指數需大於2，較好至少1 0，更好 至少5 0。 熟知本技藝者亦將了解本發明適用於進行該目的及獲得 前述及本文所述終用途及優點。本文所述該分子複合物及 -139- 本纸浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）
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k 1324155 A7
圍及精神 万法、程序、治療 '分子、特異化合物提“較佳 非用以限制本發明。其中之改變及其他用途；』 :本技„者再本發明申請專利範圍所定義之精神内為易： f。 熟知本技藝者亦將顯而易見在不達離本發明範 下可作各種取代及修飾。 說明書所述之所有專利及公報為熟知本技藝者了解本發 明之另-指標。时專利及公報均料本文供參考，若個 別公報特別且個別指出併入供參考。 本發明說明描述可在無特定描述之任何元素或限制之下 操作。因此例如各例中“包括”、“基本上由所構成，，及 “由---所構成”可彼此互換。所用之該詞及表示法僅用於描 述而非限制，且使用該詞及表示法未排除任何所示特徵及 其部分之均等物，但需了解各種修飾在本發明申請專利範 圍内。因此，需了解雖然本發明藉較佳具體例及視情況特 徵特定地揭示，但本文揭示之理論修飾及變化可由熟知本 技藝者據以了解’且此修飾及變化均視為本發明申請專利 範圍。 此外’本發明之特徵或目的係以Markush組群方式描述， 熟知本技藝者將了解本發明因此亦以Markush組群之任何個 別成員或次族群成員之名詞描述。例如，若X描述為選自由 溴、氣及碘所成組群，則完全描述主張X可為溴及主張X可 為溴及氣。 其他具體例在下列申請專利範園内。 -140- 本紙張尺度適用中國國家標竿(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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Claims (1)

1324155 第091102595號專利申請案 As 中文申請專利範圍替換本(99年2 ||
年
六、申請專利範園 1. 一種式（I)之化合物，
(I) 其中： R1係選自氫、鹵素、Cl_C6烷基、鹵Cl_c6烷氧基、 Ci-C6烷氧基、及_C(0)NR12R13所成之組群； 2 R係選自氫、鹵素、及Cl_c6烷基所成之組群； R3、R4及R5獨立為氫； z為-nr15r16其中ri、r16獨立為氫或Ci_C6院基；或 R15及R16與其所附接之氮原子一起形成雜環基胺基； R6係選自氫及C丨-C6烷基所成之組群； R7係選自氫、烷基、及未經取代或經鹵素或 氰基取代之苯基所成組群； R〗2及R13獨立選自氫、CVC6烷基、羥基C丨_C6烷基 及苯基所成組群；或R12及R13與其所附接之氮原子一 起形成雜環基胺基； 或其醫藥可接受性鹽。 2.如申請專利範圍第1項之化合物，其中： 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210X 297公釐) 申請專利範園 3 A8 B8 C8 D8 R係選自氫、鹵素、其r r> -C(0)NR-RJ3; C似、院氧基、 R2係選自氫、时、及Ci_C6絲所成組群； R3、R4及R5獨立為氫； 尸：15Rl6其中R、Rl6獨立為氫或Cl-c6烧基； R肖其所㈣之氮原子―起形成雜環基胺基； R係選自氫及Ci-C6烷基所成之組群； R係選自氫、c丨-C6烷基、及未經取代或經鹵素或 氰基取代之苯基所成組群； R及R3獨立選自氫、Ci_C6烷基及苯基所成組 群，或R12及R13與其所附接之氮原子一起形成雜環 基； ’ 或其醫藥可接受性鹽。 如申請專利範圍第1項之化合物，其中化合物係選自下 列組群：^ ο - s i yV) . 21 ；4 - Γ t 11 IN -JH·吡咯-3.-羧酸（3·二甲胺 基·2·羥基·两基）-醯胺
5·[5-氟·2·氧代-1,2-二氫-，*| 哚-(3)-亞基甲基]-2,4-二甲 2N . un 基-1H-毗咯-3-羧酸（2-¾ 基 -3-»馬淋-4-基-為基）·班胺
2,4-二甲基-5-[2-氧代，1,2· 二哚-(3)-亞基甲基] 3Ν ·1Η·吡咯-3·羧酸（2·羥基 -3 -嗎啉·4 -基-两基）_趄胺 -2- 及 或 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1324155 A BCD 申請專利範園 5N 6N 7N 8N 11N
5-[5-氟-2-氧代-1,2-二氫-啕 哚-亞基甲基]-2,4-二 曱基-1Η-吡咯-3-羧酸（2-羥 基-3-嗎11 林-4 -基丙基）¾胺 5-[5-溴-2-氧代-1,2-二氩·吨 哚亞基甲基]-2,4-二甲基-lH-.吡咯·3-羧酸（2·羥基-3·嗎啉 -4 -基-_丙基）-达胺 2，1τ 二，,甲1基-5-[2·氧代-1，2· 二氳·，5丨哚·亞基甲基]-1 Η -吡 嗲二3-羧竽（2-羥基-3-[1，2,3】 二唑-1-基-丙基）-¾胺
5 i·磬 冬代· 1，2 -二·®· -，51 ** -亞基甲基】·2,4·二甲基-1H-嵆 酸J V裡基-3 - [ 1 , 2,3 ] 二峡·1·墓丙基）_雄胺 faT [ 二2二氧代-1，2 _ 二氫-*ίΙ 亞ϊ甲基]·2,4 -二甲基 • / ,Η ·/比,f二 3二幾酸（2 ·短基-3 -[1，2,3】二唑-1-基-丙基）_醯胺
5「f」5 溴J -氧代-1,2 -二氫 朵•亞基T基】-2,4·二f |-1H -吡咯-3-羧酸（2-¾ 蠢-基3)··[ϋ，3】三峻小基. 3-{[4-({ [3-(二乙胺基）-2-羥基丙基]胺基}羰基）·5-甲 基-3-苯基-丨1^1>比‘-2-基] 亞甲基}-2-氧代-Ν-苯基-2,3-二氩-1 Η -屮哚-5 -羧醯胺 3- 1324155 A8 B8 C8 D8 申請專利範園 Κ
I 亞I 2 ψ·]3 i5-:i胺 基}-2气4^基|-叛*1}τ-2-5 -(基Η基哚 13胺 7甲Ml “基MN-H-4-丙>-?-1 {[基-3基A 3-羥基甲二 基-2胺 基甲代醯 甲亞氧羧 >基-25- -2II? 洛乙°51 ^基»-，基H-羥1 二按扫---(]«-1(2氫 3基基-二 [-JLN - 乙 ¾)基 胺羰
基[52’} 丙-{1,基 基-5^-甲 -f氧幻 -2-Ψ2-亞胺 ς-2-)·-3-醃 基)-基 胺基幾嗓* 乙苯基-5Ι-3 (-.IL4-H-S -[3iTN-4(-«二7 k A5-基-1 tl丙)-甲氫 ，基基亞二
6Ν α
)-(2-:£-5-^H-代t 胺)--1氧Ml 乙基基2-ί-(-援甲>-1Η ({5基亞· 4-基苯Η,3 {[丙氟？-2 3-基二-2基 4 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1324155 ABCD 申請專利範圍 17N
3-{丨4-({丨3-(二乙胺基）·2·羥 基丙基]胺基}羰基）-3-(2,4· 二氟苯基）-5·甲基-1H-毗咯 -2-基]亞甲基}-N-(2-羥基乙 基）-2 -氧成- 2,3 -二氣-ΙΗ-峋哚-5 “羧醯胺 18N
3·{[3-(4·«1 基苯基）-4-({【3 (二乙胺基）-2-羥基丙基I胺 基}羰基）-5·甲基-1H -吡咯 -2-基1亞甲基}-N,N-二甲基 -2 -氧代· 2,3 -二氫-1 Η -吲哚 •5-羧81胺 19Ν
4-(4-氰基苯基）-Ν-[3-(二乙 胺基）-2-羥基丙基>2·甲基 -5-{【5-(嗎啉-4·墓羰基）-2· 氧代-1 , 2 -二氫-3 Η - 〇i| 哚-3 -亞基】甲基}-1Η -吡咯-3-羧醯胺 20K
3-{【3·(4·氯苯基）-4-({[3-(二乙胺基）-2·羥基丙基]胺 基}羰基）-5·甲基-1Η-吡咯 -2-基】亞甲基}-2-氧代-Ν· 苯基-2,3 -二氩-1 Η - -5丨哚 -5-¾醯胺 -5- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 A BCD 申請專利範圍 21N
3-{[3·(4-氣苯基）-4-({【3-(二乙·胺基>-2-羥基两基】肢 基}羧基）·5·甲基-1H-吡咯 -2-基]亞甲基}-2-氧代-Ν--苯基-2,3 -二氳-1 Η -啕哚 •5-羧醯胺 22Ν
5-[(5-氟-2-氧代-1,2-二氫 哚-3-亞基）甲基]-Ν-[2-羥基-3-(2H-四唑·2_基） 丙基]-2,4-二甲基-111-吡咯 -3·羧醯胺 23Ν 24Ν
5-[(5-氣-2-氧代-1,2-二氫 -3H-，i|哚-3-亞基）甲基]-Ν-【2-羥基-3-(2H-四唑-2-基） 丙基]-2,4·二甲基-1H·吡咯 •3-羧醯胺 N-[2-羥基-3-(2H-四唑-2· 基）丙基]·2,4·二甲基-5·{【（2· 氧代-5 -三氟甲氧基）-1,2 -二氫-3 Η ·屮哚-3 -亞基】 甲基}-1Η -吡咯-3-羧醯胺 N 6N
ίιΝ-¥ 二]--吡 -$1 - 2 J-H ，甲味1 i)i-ilH-T• Y二 23--^•--34’胺 -#•51基-2殖 5-*陸1电 [(Hf 基T • 3 2 弓3 5 · Is-- 2-基 L’ 1’甲唑·· 代基-B9基vls ll-"*-3,4羧 -«1-23- [(Hj基咯 5--312丙吡 -Η 氫ΐ) 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐) 1324155 A BCD 六、申請專利範圍
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1324155 A B c D 六、申請專利範園
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1324155 A8 B8 C8 D8
六、申請專利範園 如申請專利範圍第3項之化合物，其中化合物係選自下 列組群： 名稱 化合物編號 IS 2S 35 :结構
5-(5 -氟-2-氧代-1,2 -二氳 屮哚-3 -(3Z)-亞基甲基4, 二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（3’_ -乙舍基裹基丙基）·达肢 5·[5·氟·2·氧代·1，2 -二氣-，i丨哚-(3Ζ)·亞基甲基]_2,4· 二 7 基-10-*^洛*3-邊酸（2· 控i·3 ·鳴*林·4 -基基）-班按 2,4-二甲基-5-(2-氧代-1,2· 二氳-叫哚-(3Ζ)-亞基甲基） •1Η·吡咯·3·羧酸（2-羥基 -3·鳴•林·4·基.丙基）-班胺 4S 5S 6S
5-【5·氣-2·氧代-1,2·二氳 屮哚-(3Ζ)·亞基肀基】·？，4· 二Τ基·1Η·吡咯-3-叛酸（2-藉i_3·鳴淋-4·基两基>·ί4胺 5·[5-溴-2-氧代·1,2·二氫 吟|哚-(3Ζ)-亞基甲基卜2,4-二甲基·1Η·吡咯-3·羧酸（2-裡Ϊ-3-1馬琳-4-基-¾基）-班肤 2,4·二甲基_5·【2.氧代.1 ,2· 二氩--5丨哚-(3Ζ>-亞基肀基] -1 Η ·吡咯-3 -羧酸（2 -羥基-3 【1,2,3】三唑•丨•基-丙基）-醯胺 -9 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1324155 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 7S es 9S 0
二-2酸1- ,2-¾ -1甲-3三 代基洛3] 氧亞吡2,胺 2)H1^ -zl[) 5-4 基-32 [5嗦甲基T 5--5I二羥基 二-2酸哇 7 甲-33’ 代基咯2， 氧亞吡[1胺 2)Η3 ^ -ζ!}· 氣(3£·基基 5s-卩幾丙 ί·*甲·· 5-'5'二(2基 5-[5 -溪-2-氧代·1,2 -二氩 屮哚-(3Ζ)-亞基甲基]-2,4-二甲基-1Η -吡咯·3·羧酸（2- r基丙mv]三峻小 Ο IIS Η
'·基 3·胺基 ii3-基A 4-丙-3甲二 1基亞· -{羥甲M,3 -3- ·基 2.3f )2 5 - - ® z)-)--2基醢 (3基基咯苯羧 -H .0 幾h代*-二}5氧十 胺吡 N.
胺吡 -}κ 甲 β (-基-1VH 3- 胺基-ΝΑ- ({基•基二S 4- 丙-3甲3-1 基亞2,炎 -3-:ft!! )z)2m (3基基咯-2-51
胺吡羥氩 乙羰i--i -}H2 二 二基 1-(· 3- 胺基-N2.2 5J^i\/ - ^ ({基·基代羧 4- 丙7甲氧5-U基基亞2-- •經甲j-嗓 )-34¾ z)-)--2乙 Η (3基基咯基-1 Η -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1324155 ABCD 申請專利範園 X4S 15S
i·5基哚咯 N丙基羰051吡 <*-!»· 羥 ΛίιΗ以1 基苯-(If•MiL· 按 卜Ν 乙羰ΐ}-氩 二％基-一 (i 5 VI - •胺•乏3胺 3ft)s >t fJ基12¾ -({基笨-^.^-¾T.-.f--.f- T羥4洛2嗓 -32-·吡基"51 )2 3 - J -Ζ)·)·Η 丙 Η (3基基-1異-1 16S 175 IBS
⑽緩-5T3-按 二ιϊίίί 3- (胺苯,1-¾ 氟 2>5 4- 丙.-咯ιί H’t 代Τ 3-羥(2H 氧Η )2 3 »2 m Z)-)-基>-氳 (3基基甲基二 胺•卩氧· 乙叛-5甲-S 二}5.)亞-2*-(-基基 3-胺苯4基Υ- (is^lH {ί V 2- 3-羥(2H-(.-. )-2-3--lN3k ΖΛ)-基}--2醯. (3基基甲基代幾 苯-2V-2S 基>-甲代Ϊ IL基-5亞氧f •胺01 5 ([i-}2mv4ίψ -3t 胺吡·Γ z)-(基Η·氩 (3-4丙-1-N'! 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1324155 A8 B8 C8 D8
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 ABCD 申請專利範園
本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 ABCD 申請專利範圍 29S
5-[(Z)-(5-氯-2-氧代-1,2-二氫-3 Η -屮•朵-3 -亞基）甲 *]-N-{3-[(2R,6S)-2,6-二甲基嗎啉-4-基]-2 -羥基 丙基卜2,4·二甲基-1H-响 咯-3-羧醯胺 30S
N-{3-[(2R,6S)-2,6-二甲基 嗎啉·4-基】-2-羥基丙基} -2,4-二甲基-5-{(Ζ)-[2-氧代-5-(三氟甲基）-】，2·二 氫-3H-MI·朵-3-亞基】甲 基} -1 Η -吡咯-3 ·羧瞌胺 31S
7产\’3 Η - Μ卜矣· 3 -亞i )甲筆雍基-J(3 仏级4胺二'^·1Η- 32S
5--1(气)二(5；；芩-2-氧代-1，2- 了 IL-3H·*»?»»展-3·亞 甲 基气3 (3 ί、基·>二,氧代味·^咬·1· 今）丙基】-2,4-二_基-1|^-吡咯-3-羧班胺 33S N-【（2R)-2-羥基-3-(3-甲基 ·Λ2 V5,-二氧代咪峡咬-1 -基） 汽基j'2,4-二甲基-5-{(2)-【？'氧咎·*5 ·(三氟甲氧基） t 7 氣· $ Η - *5| °朵-3 -亞 基】甲基咯- 3- ¾随胺 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1324155 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 3S3 36S 37S 3SS 39S 34S
5-氳基甲基吡 ζην 1,-(. Η L甲-3咬-1 a羥咮B--Λ2-代'一 氟-3)-氧4-胺 -哚S二，醯 •,(,5.[(25-]-2羧 S,基3- Ni-[(2S)-2 -經基- 3- (3 -甲基 •Λ' 5 二氧代咪吃读· 1 -基）丙 免Λ-5-(三氟甲氧基 二氳-3 Η - Μ丨哚-3 -亞4 J甲基} -1Κ-吡咯-3·羧醢胺J Τ Li(Z)-(5-氣-2-氧代-1,2-J 氩-3 Η - -5丨哚-3 -亞基）甲基] -N-[(2S^-2·趣基- 3- (3 -甲 基·2,5·二氧代咮唑啶-1-基） 丙基】-2,4 -二甲基·1Η -吡咯 -3 -羧S4胺 Η 4-基-3 •甲盘 啉二二. 嗎-2-H 硫,4,2-1 化-2-lfc] t胺 1-基2-基醯 £?-f:s * -z3 3 3 2(-- -1)--[哚咯 N基-5唢咄 i-2f 匕 5-iJ3-U]-二基-基2-甲咯 二丙1,>吡 1·基-]基夂 -1.2 代亞1H 3-2-J5-3基 -1)--2哚甲 :N 基氫-ΪΙ二 啉 2嗎-胺 1’甲硫Λ -)b 2 S 代基u -羧 氣亞氧I]--IT 二基-3 -2-31-丙咯 氯哚丨，基吡 --5 V · Η ·(η·(3-21 }3ί· -ζ · NS)基 5 二基-4二 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 1324155 ABC D 申請專利範圍 40S
啦- 2-:1 1)¥硫 4’胺 -}匕 Λ 代基 M-2S&--|二4] 2 3 一丙3 • - 1 ί,-溴哚丨·基咯 5--5ΙΥΊ (Ν 3 2 * ^Hf·2:!: ζ · N基 I u111·?基 5·二基·4&- 41S
z -Nl - [(氣卜-A-咯 5-二基-4吡 .啉»· 2 嗎1 1’甲： -)3^ 代基"-甲 --13 -2-32-4-氣哚)-2,胺 5-V2S]-醯 、基羧 «5- H. 42S
V2-/ • }7甲 代基基二 氧-Js.^4-胺 -2--3-2-2,2 氣哚)-]-f %2t基 7 ·(Ηί(丙洛z)-3N--,f [(氳J-TH-5.二基啉-1. 43S Q
:’甲T基 - 代；ί基二 u«4-胺 -2--3-2-2,2 .--ίιί基， 445 α
二Ν基 2-J--JS略 1,基-4吡 ilH-彳i馬1 氧基Y -2-亞-3基 L3-基甲 氣-壁二5-哚广 (峭2'4胺 z H s ]Ab- [(?(2基·# 5-盘-'丙·3 6 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公爱) 1324155 A8 B8 C8 -—-______D8 六、申請專利範園 5 ·根據申請專利範圍第1項之化合物，其係具式（la): 0
其中： R1、R3、R4 及 R5 為氫； R為氟及位於二氫吲哚酮環之5_位置； Z為嗎p林· 4 -基； R6及R7為甲基； 及*C之立體化學性為（8)。 6. —種式（II)之化合物，
-17- 本紙張尺度適用t國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公f) 1324155 A8 B8 C8 — - ____D8 六、申請專利範園 其中： R為Ci-C6院基； R1係選自氫、鹵帝n y- M. J= 图京、C丨-C6炫基、鹵c丨·c6^氧基、 CVC6烷氧基、及_c(〇)NRi2Rl3所成之組群； R2係選自氫、齒素、及。丨-。6烷基所成之組群; R3、R4及R5獨立為急. 2為咖妒其中R”及R16獨立為氫或Ci_c6炫基 R15及R16與其所附接之氮原子—起形成雜環基胺基^ R6係選自氫及C1_C6烧基所成之組群； R7係選自氫、cvc6燒基、及未經取代或㈣素或 氰基取代之苯基所成組群； R及R.獨立選自氫、Cl_C6院基、經基院基 及苯基所成組群；或Rl2&R!3與其所附接之氮原子— 起形成雜環基胺基； 或其醫藥可接受性鹽。 7.如申請專利範圍第6項之化合物，其中該化合物係選自 名稱
裝 訂
下列組群： 化合物编號 結構
5|1；($-氟-2-氧代-1，2-二氳-*?| 3-竽基甲基ρ2,4·二f基崎 二 1 被咯·3-羧酸口_羥* .t. 嗎》林· 4 -基-丙基）-甲基·想联； 5*· ((?)/ 5 -氟-2 ·氧代-1，2 -二 签-«ih朵·3·亞基甲基）-2 4-二 甲基·1_Η·»比咯- 3- ¾酸（（S) 甲基·醃胺； 1 本纸張尺度適用中s ®緖準(CNS) A4規格(21GX297公釐) —~~~~ -- 1^^4155 A8 B8 C8 申請專利範園 D8 4 6S
二((/)·5·氟-2-氧代-1，2·二氳 •1^:朵„-3-亞基甲基>-2,4-二甲 吡咯-3-羧酸（（R>-2-羥基 -3-嗎啉·4·基•丙基）·甲基 .J種調節蛋白激酶催化活性之醫藥組合物，包括如申 口月專利$巳圍第1、2、3、4、5、6或7項之化合物或其 鹽及醫藥可接受性載體或賦型劑。 9· ”請專利範圍第8項之醫藥組合物，包括如中請專利 範圍第5項之化合物或其鹽β H —種如申請專利範圍第i、3或6項任一項之化合物或其 1之用途，其係用於製造調節蛋白激酶催化活性之藥 物。 11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該蛋白激酶為受 體酪胺酸激酶、非受體酪胺酸激酶及絲胺酸_蘇胺酸激 酶〇 12. —種醫藥組合物之用途，其係用於製備治療或預防有 機體蛋白激酶相關失調之藥物，其中該醫藥組合物包 括如申請專利範圍第1、3或6項任一項之化合物或其鹽 及醫藥可接受性載體或賦型劑。 13. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該蛋白激酶相關 失調為受體路胺酸激酶相關失調、非受體酪胺酸激酶 相關失調及絲胺酸-蘇胺酸激酶相關失調。 14. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該蛋白激酶相關 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1324155 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範園 失調為EGFR相關失調、PDGFR相關失調、IGFR相關 失調及flk相關失調。 15. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該蛋白激酶相關 失調為選自squamous細胞癌瘤、星細胞瘤、卡波希氏肉 瘤、神經膠母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭頸癌、黑色 瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳癌、小細胞肺癌、神經膠 瘤、結直腸癌、泌尿道癌及胃腸癌之癌症》 16. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該蛋白激酶相關 失調係選自糖尿病、自動免疫失調、過度增殖失調、 再阻塞、纖維變性、牛皮癖、v〇n Heppel-Lindau疾病、 骨關節炎、風濕性關節炎、血管形成 '發炎失調、免 疫學失調及心血管失調。 17. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該有機體為人 類。 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)
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