MXPA03007367A - Derivados de 3-(4-amidopirrol-2-ilmetilideno)-2-indolinona como inhibidores de proteina cinasa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a compuestos de 2-indolinona sustituidos con pirrol y sus sales farmaceuticamente aceptables que modulan la actividad de proteina cinasas y por lo tanto se espera que sean utiles en la prevencion y tratamiento de trastornos celulares relacionados con proteina cinasa tales como cancer.

Description

DERIVADOS DE 3-(4-AMIDOPIRROL-2-ILMETILIDENO)-2-INDOLlNONA COMO INHIBIDORES DE PROTEINA CINASA Esta solicitud reivindica prioridad de las solicitudes provisionales 60/312361 , presentada el 15 de Agosto de 2001 , y 60/268683, presentada el 15 de Febrero de 2001, estando el contenido de ambas incorporando en la presente documentación a modo de referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con algunos derivados de 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona que modulan la actividad de proteincinasas ("PK"). Los compuestos de esta invención son entonces útiles para el tratamiento de enfermedades relacionadas con una actividad anormal de las PK. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, métodos para tratar enfermedades utilizando las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos y métodos para prepararlas.

ESTADO DE LA TECNICA Las PK son enzimas que catalizan la fosforilación de los grupos hidroxilo en los residuos de tirosina, serina y treonina en las proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente simple son sorprendentes; crecimiento, diferenciación y proliferación celular, es decir, virtualmente todos los aspectos de la vida de la célula dependen de uno u otro modo de la actividad de las PK. Además, se ha relacionado la actividad anormal de la PK con un conjunto de afecciones que van desde enfermedades que no afectan mayormente la vida, tales como la psoriasis, hasta enfermedades extremadamente virulentas, tales como el glioblastoma (cáncer de cerebro). Las PK pueden dividirse convenientemente en dos clases, las proteintirosincinasas (PTK) y las serin-treonincinasas (STK). Uno de los aspectos más importantes de la actividad de las PTK es su interacción con receptores de factores de crecimiento. Los receptores de factores de crecimiento son proteínas en la superficie de las células. Cuando se unen a un ligando tipo factor de crecimiento, los receptores de factores de crecimiento se convierten en una forma activa que interactúa con las proteínas en la superficie interna de la membrana celular. Esto conduce a la fosforilación de los residuos de tirosina de los receptores y de otras proteínas, y a la formación dentro de la célula de complejos con una variedad de moléculas de señalización citoplasmática que, a su vez, desencadenan numerosas respuestas de la célula, tales como la división celular (proliferación), la diferenciación celular, el crecimiento celular, la expresión de efectos metabólicos en el microambiente extracelular, etc. Para una descripción más completa, véase Schlessinger y Ullrich, Neuron, 9: 303-391 (1992) que se incorpora a modo de referencia, incluyendo cualquier dibujo, como se indica por completo en la presente documentación. Los receptores de factores de crecimiento con actividad de PTK se conocen como receptores de tirosincinasas ("RTK"). Comprenden una gran familia de receptores transmembrana con una actividad biológica diversa. En la actualidad, se han identificado al menos diecinueve (19) subfamilias diferentes de RTK. Un ejemplo de éstas es la subfamilia denominada RTK "HER", que incluye EGFR (receptor de factor de crecimiento epitelial), HER2, HER3 y HER4. Estas RTK consisten en un dominio extracelular glicosilado de unión a ligando, un dominio transmembrana y un dominio ¡ntracelular citoplasmático catalítico que puede fosforilar los residuos de tirosina en las proteínas. Otra subfamilia de RTK consiste en receptores de insulina (IR), el receptor del factor de crecimiento semejante a insulina I (IGF-1 R) y el receptor relacionado con insulina (IRR). IR e IGF-1 R ¡nteractúan con la insulina, el IGF-I y el IGF-ll para formar un heterotetrámero de dos subunidades glicosiladas completamente extracelulares y dos subunidades ß que cruzan la membrana celular y que contienen el dominio de la tirosincinasa.

Una tercera subfamilia de RTK se conoce como el grupo de los receptores de factores de crecimiento derivados de plaquetas ("PDGFR"), que incluye PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, c-kit y c-fms. Estos receptores consisten en dominios glicosilados extracelulares compuestos de cantidades variables de rizos semejantes a inmunoglobinas y un dominio intracelular, donde el dominio de la tirosincinasa está interrumpido por secuencias no relacionadas de aminoácidos. Otro grupo que, debido a su semejanza con la subfamilia PDGFR, se une a veces al grupo anterior es el de la subfamilia de receptores de cinasas hepáticas fetales ("flk"). Se cree que este grupo está compuesto por un dominio receptor insertado para cinasa hepática fetal 1 (KDR/FLK-1 , VEGF-R2), flk-1 R, flk-4 y tirosincinasa tipo fms 1 (flt-1 ). Otro miembro de la familia de receptores de factores de crecimiento de tirosincinasas es el subgrupo de los receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos ("FGF"). Este grupo consiste en cuatro receptores, FGFR1-4, y siete ligandos, FGF1-7. Si bien aún no se halla definido, este grupo parece abarcar receptores que consisten en un dominio extracelular glicosilado que contiene una cantidad variable de rizos semejantes a inmunoglobinas y un dominio intracelular, donde el dominio de la tirosincinasa está interrumpido por secuencias no relacionadas de aminoácidos. Aún otro miembro de la familia de receptores de factores de crecimiento de tirosincinasa es el subgrupo de receptores de factores de crecimiento vasculares endoteliales (VEGF). La VEGF es una glicoproteína dimérica similar a la PDGF pero tiene funciones biológicas diferentes y una especificidad distinta por células blanco ]n vivo. En particular, se cree actualmente que la VEGF tiene una función esencial en la vasculogénesis y la angiogénesis. Se describe un listado más completo de las subfamilias conocidas de RTK en Plowman et al., DN&P, 7(6): 334-339 (1994), que se incorpora a modo de referencia, incluyendo cualquier dibujo, como se indica por completo en la presente documentación. Además de las RTK, también existe una familia de PTK completamente intracelulares denominadas "tirosincinasas que no son receptores" o "tirosincinasas celulares". Esta última denominación, abreviada "CTK", es la que se usará en la presente documentación. Las CTK no contienen dominios extracelulares o dominios transmembrana. Hasta la actualidad se has descrito más de 24 CTK en 11 subfamilias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak y Ack). La subfamilia Src parece ser hasta ahora el mayor grupo de CTK e incluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, BIk, Hck, Fgr e Yrk. Para una descripción más detallada de CTK, véase Bolen, Oncogene, 8: 2025-2031 (1993), que se incorpora a modo de referencia, incluyendo cualquier dibujo, como se indica por completo en la presente documentación. Las serin/treonin cinasas, STK, como las CTK, son predominantemente intracelulares, aunque existen unos pocos receptores de cinasas tipo STK. Las STK son las cinasas citosólicas más comunes, es decir, cinasas que llevan a cabo su función en una parte del citoplasma distinta de las organelas y del citoesqueleto. El citosol es la región dentro de la célula en la cual ocurre gran parte de la actividad metabólica y biosíntetica intermedia, por ejemplo, es en el citosol que se sintetizan las proteínas en los ribosomas. Las RTK, las CTK y las STK han sido todas relacionadas con una cantidad de condiciones patogénicas que incluyen significativamente al cáncer. Otras condiciones patogénicas que se han asociado con las PTK incluyen, sin limitaciones, la psoriasis, la cirrosis hepática, ia diabetes, la angiogénesis, la restenosis, las enfermedades oculares, la artritis reumatoide y otras afecciones inflamatorias, trastornos inmunológicos tales como las enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares tales como la arteriesclerosis y una variedad de trastornos renales. Respecto al cáncer, dos de las hipótesis más importantes para explicar la proliferación celular excesiva que conduce al desarrollo de tumores se relaciona con funciones conocidas como reguladas por la PK. Es decir, se ha sugerido que el crecimiento de células malignas resulta de una ruptura en los mecanismos que controlan la división y/o la diferenciación celular. Se ha demostrado que los productos proteicos de una cantidad de proto-oncogenes están involucrados en las vías de transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular. Estos productos proteicos de protooncogenes incluyen los factores de crecimiento extracelulares, los receptores de factores de crecimiento transmembrana PTK (RTK), las PTK citoplasmáticas (CTK) y las STK citosólicas que se describieron previamente.

A la vista de la conexión aparente entre las actividades celulares relacionadas con la PK y una amplia variedad de trastornos humanos, no es sorprendente que se haga un gran esfuerzo en un intento de identificar maneras de modular la actividad de las PK. Algunos de esos esfuerzos han involucrado enfoques biomiméticos que usan grandes moléculas basadas en aquellas involucradas en los procesos celulares reales (por ejemplo, ligandos mutantes (solicitud de los E.U.A. No. 4966849); receptores y anticuerpos solubles (solicitudes No. WO 94/10202, Kendall y Thomas, Proc. Nat'l Acad. Sci., 90: 10705-09 (1994), Kim, et al., Nature. 362: 841-844 (1993)); ligandos de ARN (Jelinek, et al., Biochemistrv, 33: 10450-56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4: 358A (1993); Kinsella et al., Exp. Cell Res. 199: 56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152: 448-57) e inhibidores de la tirosincinasa (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente de los E.U.A.No. 5330992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cáncer Res., 35: 2268 (1994)). Además de los anteriores, se han hecho esfuerzos para identificar pequeñas moléculas que actúen como inhibidores de la PK. Por ejemplo, se han descripto compuestos bis-monocílicos, bicíclicos y heterocíclicos de arilo (PCT WO 92/20642), derivados de vinilenazaindol (PCT WO 94/14808) y 1-ciclopropil-4-piridilquinolonas (Patente de E.U.A. No. 5330992) como inhibidores de la tirosincinasa. Se han descrito compuestos de estirilo (patente de E.U.A. No. 5217999), compuestos de piridilo sustituidos con estirilo (patente de E.U.A. Np. 5302606), derivados de quinazolina (Solicitud EP No. 566266 A1), selenaindoles y selénidos (PCT (WO 94/03427), compuestos tricíclicos polihidroxílicos (PCT WO 92/11660) y compuestos de ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495) todos como inhibidores de la PTK útiles en el tratamiento del cáncer.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se dirige a ciertos derivados de 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolina que muestran actividad de modulación de PK y, entonces, son útiles para tratar afecciones relacionadas con la actividad anormal de la PK. Una modalidad de esta invención es un compuesto de fórmula (I) donde: R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, haloalcoxilo, cicloalquilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, -C(O)R9, -NR9R10 y -C(O)NR12R13 R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, trihalometilo, hidroxilo, alcoxilo, ciano, -NR9R 0 -NR9C(O)R10, -C(0)R8, -S(0)2NR9R1° y -S02R14 (donde R 4 es alquilo, arilo, aralquilo, heteroanlo y heteroaralquilo); R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo; Z es arilo, heteroanlo, heterociclo, o -NR15R16 donde R15 y R 6 son independientemente hidrógeno o alquilo; o R15 y R 6 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un grupo heterocicloamino R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno o alquilo; R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17 R8 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo, y ariloxilo; R9 y R10 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o R9 y R10 se combinan para formar un grupo heterocicloamino; R12 y R 3 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo y arilo; o R12 y R 3 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heteroricloamino; se seleccionan del grupo que consiste en hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; R se seleccionan del grupo que consiste en hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o una sal del mismo aceptable para el uso farmacéutico. Otra modalidad es un compuesto de fórmula I donde R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, -C(0)R8, NR9R10 Y -C(0)NR12PR13 R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, trihalometilo, hidroxilo, alcoxilo, cíano, -NR9R10, -NR9C(0)R10, -C(0)R8, -S(0)2NR9R1° Y -S02R14 (donde R 4 es alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo); R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo, Z es arilo, heteroarilo, heterociclo, o -NR15R16 donde R15 y R 6 son independientemente hidrógeno o alquilo; o R15 y R16 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un grupo heterocicloamino; R6 se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno o alquilo; R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17; R8 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo, y ariloxilo; R9 y R1Q son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o R9 y R100 se combinan para formar un grupo heterociclo; R12 y R13 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y arilo, o R12 y R13 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo; R 7 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o una sal del mismo aceptable para el uso farmacéutico. Otra modalidad es un compuesto de fórmula (la): H donde: R1, R3, R4 y R5 son hidrógeno; R2 es fluoro, y se localiza en la posición 5 del anillo de indolinona; Z es morfolin-4-ilo; R6 y R7 son metilo. Preferiblemente, la estereoquímica en *C es (S). Otra modalidad es un compuesto de fórmula (II): (II) donde: R es hidrógeno o alquilo; R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, haloalcoxilo, cicloaiquilo, heteroalicícliclo, hidroxilo, alcoxi, -C(0)R8, -NR9R10 y -C(O)NR12R13; R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, trihalometilo, hidroxilo, alcoxilo, ciano, -NR9R10, -NR9C(0)R10, S(0)2NR9R1° y -S02R14 (donde R14 es alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo); R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo; Z es arilo, heteroarilo, heterociclo, o -NR15R16 donde R15 y R 6 son independientemente hidrógeno o alquilo, o R15 y R16 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un grupo heterocicloamino; R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno o alquilo, R7 se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo, heteroarilo, y -C(0)R17; R se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo, y ariloxilo; R9 y R 0 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o R9 y R10 se combinan para formar un grupo heterocicloamino; R12 y R13 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo, arilarilo; o R12 y R13 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un hetericicloamino; R17 se selecciona del grupo qye consiste en hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o una sal del mismo aceptable para el uso farmacéutico. Otra modalidad es una composición farmacéutica que comprende un compuesto , o una sal de las fórmulas I, la o II, y un vehículo o un excipiente aceptable para uso farmacéutico. Otra modalidad es un método para la modulación de la actividad catalítica de una protein cinasa, que comprende poner en contacto la protein cinasa con un compuesto o una sal de las fórmulas I, la o II. La proteína cinasa para este método puede ser una protein cinasa receptora, una protein cinasa no receptora y una serin-treonin cinasa. Otra modalidad es un método para tratar o prevenir una afección relacionada con la protein cinasa en un organismo, que comprende administrar una cantidad efectiva para el uso terapéutico de una composición farmacéutica que comprende un compuesto o sal de las fórmulas I, la o II, y un vehículo o un excipiente aceptable para uso farmacéutico. La proteina cinasa para este método puede ser una protein cinasa receptora, una protein cinasa no receptora y una serin-treonin cinasa. La afección relacionada con la protein cinasa para este método puede ser una afección relacionada con el EGFR, una afección relacionada con el PDGFR, una afección relacionada con el IGFR y una afección relacionada con la flk. La afección relacionada con la protein cinasa puede ser también un carcinoma de células escamosa, un astrocitoma, un sarcoma de Kaposi, un glioblastoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de vejiga, un cáncer de cabeza y cuello, un melanoma, un cáncer de ovario, un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de células pulmonares pequeñas, un cáncer colorrectal, un cáncer geniotourinario y un cáncer gastrointestinal. Más aún, la afección relacionada con la protein cinasa puede también diabetes, una afección autoinmune, una afección de hiperproliferación, restenosis, fibrosis, psoriasis, enfermedad de von Heppel-Lindau, osteoartritis, artritis reumatoide, angiogénesis, una afección inflamatoria, una afección inmunologíca y una afección cardiovascular, estos métodos pueden usarse para tratar humanos. En otra modalidad, está invención se dirige a métodos para preparar compuestos de fórmula (I). Finalmente, esta invención se dirige también a identificar un compuesto químico que modula la actividad catalítica de una protein cinasa poniendo en contacto células que expresan la protein cinasa con un compuesto o una sal de la presente invención, y luego monitoreando las células en busca de un efecto.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones Salvo que se indique expresamente lo contrario, los siguientes términos usados en la memoria descriptiva y reivindicaciones, tienen los siguientes significados: "alquilo" se refiere a un radical hidrocarburo alifático saturado que incluye grupos de cadena lineal y ramificada de 1 a 20 átomos de carbono (cuando se establece un rango numérico, por ejemplo "1-20", significa que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etcétera, hasta e inclusive 20 átomos de carbono). Más preferiblemente, un grupo alquilo es un alquilo de tamaño mediano con entre 1 y 10 átomos de carbono por ejemplo, metilo, etilo, propilo, 2-propilo, n-butilo, /so-butilo, ter-butilo, pentilo, y similares. Más preferiblemente, es un alquilo inferior que tiene entre 1 y 4 átomos e carbono por ejemplo, metilo, etilo, propilo, 2-propilo, n-butilo, /so-butilo, o ter-butilo, pentilo, y similares. El grupo alquilo puede ser sustituido o insustituido, y cuando sustituido, el o los grupos sustituyentes son preferiblemente halo, hidroxilo, alcoxi inferior, arilo, ariloxilo, heteroarilo, heteroalicíclico, C(0)OR8, NH9R10 y C(0)NR9R10 "Cicloalquilo" se refiere a un anillo monocícliclo de 3 a 8 miembros con todos carbonos, un anillo fusionado de 5 miembros/6 miembros o un anillo bicíclico fusionado de 6 miembros/6 miembros de todos carbonos o un anillo multicíclico fusionado (un sistema anillo "fusionado" significa que cada anillo en el sistema comparte un par de átomos de carbono adyacentes con cada otro anillo en el sistema) donde uno o más de los anillos puede contener uno o más doble ligaduras pero ninguno de los anillos tiene un sistema de electrones pi conjugado. Los ejemplos, sin limitaciones, de grupos cicloalquilo son ciclopropano, ciclobutano, ciclopenteno, ciclohexano, ciclohexadieno, adamantano, cicloheptano, cicloheptatrieno, y similares, un grupo cicloalquilo puede ser sustituido o ¡nsustituido. Cuando es sustituido, el o los grupos sustituyentes son preferiblemente uno o más, más preferiblemente uno o dos sustituyentes, seleccionados independientemente del grupo formado por alquilo inferior, trihaloalquilo, halo, hidroxilo, alcoxilo inferior, arilo opcionalmente sustituido con uno o más, preferiblemente uno o dos grupos seleccionados independientemente entre sí entre grupos halo, hidroxilo, alquilo inferior o alcoxilo inferior, heteroarilo de 6 miembros que tiene entre 1 y 3 átomos de nitrógeno en el anillo, los carbonos en el anillo son opcionalmente sustituidos con uno o más, preferiblemente uno o dos grupos independientemente entre sí grupos halo, hidroxilo, alquilo inferior o alcoxilo inferior, heteroarilo de 5 miembros que tiene entre 1 y 3 heteroátomos seleccionados del grupo formado por nitrógeno, oxígeno y azufre, donde los átomos de carbono e hidrógeno del grupo son opcionalmente sustituidos con uno o más preferiblemente uno o dos grupos independientemente entre sí grupos halo, hidroxilo, alquilo inferior o alcoxilo inferior, grupos heteroaliicíclico de 5 ó 6 miembros que tienen entre 1 y 3 heteroátomos seleccionados del grupo formado por nitrógeno, oxígeno y azufre, los átomos de carbono y nitrógeno (si están presentes) en el grupo son opcionalmente sustituido con uno o más, preferiblemente uno o dos grupos independientemente entre sí grupos halo, hidroxilo, alquilo inferior o alcoxilo inferior, mercapto, (alquilo inferior), tiol, ariltiol opcionalmente sustituido con uno o más preferiblemente uno o dos grupos seleccionados independientemente entre sí entre grupos halo, hidroxilo, alquilo inferior o alcoxilo inferior, ciano, acilo, tioacilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R9S(0)-, R9S(0)2-, -C(0)OR9, R9C(0)0-, y -NR9R10, que son como se definió previamente. "Alquenilo" se refiere a un grupo alquilo inferior, según se lo ha definido en la presente documentación, que comprende al menos dos átomos de carbono y al menos una doble ligadura carbono-carbono. Entre los ejemplos representativos se incluye, sin limitaciones, etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-, 2-, o 3-butenilo, y similares. "Alquinilo" se refiere a un grupo alquilo inferior, según se ha definido en la presente documentación, que comprende al menos dos átomos de carbono y al menos una triple ligadura carbono-carbono. Entre los ejemplos representativos se incluye, sin limitaciones, etinilo, 1-propinilo, 2-propinilo, 1-, 2-, o 3-butinilo, y similares.

"Arilo" se refiere a un sistema fusionado monocíclico de todos carbonos o policíclico de todos carbonos (es decir, anillos que comparan pares adyacentes de átomos de carbono) grupos de 1 y 12 átomos de carbono con un sistema de electrones pi completamente conjugado. Algunos ejemplos no limitativos de arilo grupos are fenilo, naftalenilo y anthracenilo. El grupo arilo puede ser sustituido o insustituido. Cuando es sustituido, los grupos sustituidos son preferiblemente uno o más, más preferiblemente uno, dos tres, aún más preferiblemente uno o dos, seleccionados independientemente del grupo formado por alquilo inferior, trihaloalquilo, halo, alcoxilo inferior, mercapto, (alquilo inferior) tiol, ciano, acilo, tioacilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R9S(0)-, R9S(0)2-, -C(0)OR9, R9C(0)0-, y NR9R10, con R9 y R10 según se los ha definido previamente. Preferiblemente, el grupo arilo es opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo inferior, trihaloalquilo, hidroxilo, mercapto, ciano, N-amido, mono o dialquilamino, carboxilo, o N-sulfonamido. "Heteroarilo" se refiere a un grupo en anillo monocíclico o fusionado (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes ) de 5 a 12 átomos de anillo que contiene uno, o dos o tres heteroátomos de anillo seleccionados entre N, O o S, siendo C los restantes átomos del anillo, y además, que presentan un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo insustituidos son pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol. El grupo heteroarllo puede ser sustituido o ¡nsustituido. Cuando es sustituido, los grupos sustituidos son preferiblemente uno o más, más preferiblemente uno, dos o tres, y aún más preferiblemente uno o dos seleccionados independientemente del grupo formado por alquilo Inferior, trihaloalquilo, halo, hidroxilo, alcoxilo inferior, mercapto, (alquilo inferior) tiol, ciano, acilo, tioacilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R9S(0)-, R9(0)2-, - C(0)OR9, R9C(0)0-, y NR9R10, con R9 y R10 según se los han definido previamente. Preferiblemente, el grupo heteroarilo es opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo inferior , trihaloalquilo, hidroxilo, mercapto, ciano, N-amido, mono o dialquilamino, carboxilo, o N-sulfonamido. "Heteroalicíclico" se refiere a un grupo de anillo monocpiclico o fusionado que presenta en los anillo(s) de 5 a 9 átomos de anillo en los que uno o dos átomos de anillo son heteroátomos seleccionados entre N, O, o S(0)n (donde n es un número entero ewntre 0 y 2), siendo C los restantes átomos del anillo. Los anillos pueden también tener una o más doble ligaduras. Sin embargo, los anillos no representan un sistema de electrones pi completamente conjugado. Algunos ejemplos no limitativos de grupos heteroalicíclicos insustituidos son pirrolidino, piperidino, piérazino, morfolino, tiomorfolino, homopiperazino, y similares. El anillo heteroalicíclico puede ser sustituido o insustituido. Cuando es sustituido, los grupos sustituidos son preferiblemente uno o más, más preferiblemente uno, dos o tres, aún más preferiblemente uno o dos, seleccionados independientemente del grupo formado por alquilo inferior, trihaloalquilo, halo, hidroxilo, alcoxilo inferior, mercapto, (alquilo inferior) tiol, ciano, acilom tioacilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfomanido, S-sulfonamido, R9S(0)-, R9S(0)2-, -C(0)OR9, R9C(0)0-, y -NR9R10, con R9 y R10 según se los ha definido. Preferiblemente, el grupo heteroalicíclico está opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo inferior, trihaloalquilo, hidroxilo, mercapto, ciano, N-amido, mono o dialquilamino, carboxilo, o N-sulfonamido. "Heterociclo" significa un radical cíclico saturado de 3 a 8 átomos de anillo en los que uno o dos átomos de anillo son heteroátomos seleccionados entre N, O, ó S(0)n (donde n es un número entero entre 0 y 2), siendo C los restantes átomos de anillo, donde uno o dos átomos de C pueden opcionalmente ser reemplazados por un grupo carbonilo. El anillo heterociclilo puede ser opcionalmente sustituido independientemente con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre un grupo carboxilo o éster, haloalquilo, cianoalquilo, halo, nitro, ciano, hidroxilo, alcoxilo, amino, monoalquilamino, dialquilamino, aralquilo, heteroaralquilo, y -COR (donde R es allquilo). Más específicamente el término heterociclilo comprende, sin limitaciones, tetrahidropiranilo, 2,2-dimetil-1,3-dioxolano, piperidino, N-metilpiperidin-3-ilo, piperazino, N-metilpirrolidin-3-ilo, 3-pirroiidino, morfolino, tiomorfolino, tiomorfolino-1 -óxido, tiomorfolino-1 ,1 -dióxido, 4-etilcarbonilpiperazino, 3-oxopiperazino, 2-imidazolidona, 2-pirrolidinona, 2-oxohomopiperazino, tetrahidropirimid¡n-2-ona, y derivados de los mismos. Preferiblemente, el grupo heterociclo es opcionalmente sustituido con uno o dos sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo inferior, alquilo inferior sustituido con carboxilo, éster hidroxilo, mono o dialquilamino. "Heterocicloamino" significa un radical cíclico saturado de 3 a 8 átomos de anillo en el que al menos uno de los átomos del anillo es nitrógeno y opcionalmente, donde uno o dos átomos de anillo son heteroátomos seleccionados entre N, O, ó S(0)n (donde n es un número entero entre 0 y 2), siendo C los restantes átomos de anillo, donde uno o dos átomos de C pueden opcionalmente ser reemplazados por un grupo carbonilo. El anillo heterociclilo puede ser opcionalmente sustituido independientemente con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados entre un grupo carboxilo o éster, haloalquilo, cianoalquilo, halo, nitro, ciano, hidroxilo, alcoxilo.a mino, monoalquilamino, dialquilamino, aralquilo, heteroaralquilo, y -COR (donde R es alquilo). Más específicamente el término heterocicloamino incluye, sin limitaciones, pipridin-1-ilo, piperazin-1-ilo, pirrolidin-1-ilo, morfolin-4-ilo, timorfolino-1 -óxido, tiomorfolino-1 , -dióxido, 4-etiloxicarbonilpiperazin-1-ilo, 2-oxohomopiperazino, tetrahidropirimidin-2-ona, y derivados de los mismos. Preferiblemente, el grupo heterociclo es opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, alquilo inferior sustituido con carboxilo, éster hidroxilo, momo o dialquilamino. El grupo heterocicloamino es un subconjunto del grupo heterociclo definido previamente. "Hidroxilo" se refiere a un grupo -OH "Alcoxilo" se refiere tanto a un grupo -0_(alquilo) como a un grupo -O-(cicloalquilo). Entre los ejemplos representativos se incluyen, sin limitaciones, por ejemplo, metoxilo, etoxilo, propoxilo, butoxilo, ciclopropiloxilo, ciclobutiloxilo, ciclopentiloxilo, ciclohexiloxilo, y similares. "Haloalcoxilo" se refiere a un grupo -O-(haloalquilo). Los ejemplos representativos incluyen, sin limitaciones, por ejemplo, triflorometoxilo, tribromometoxilo, y semejantes. "Ariloxilo" se refiere tanto a un grupo -O-arilo como a un grupo -O- heteroarilo, según se ha definido. Entre los ejemplares representativos se incluye, sin limitaciones, fenoxilo, piridiniloxilo, furaniloxilo, tieniloxilo, pirimidiniloxilo, pirazinilooxilo, y similares, y derivados de los mismos. " ercapto" se refiere a un grupo -SH. "Alquiltiol" se refiere tanto a un grupo -S-(alquilo) como a un grupo -S- (cicloalquilo insustituido). Entre los ejemplos representativos se incluyen, sin limitaciones, por ejemplo, metiltiol, etiltiol, propiltiol, butiltiol, ciclopropiltiol, ciclobutiltiol, ciclopentiltiol, ciclohexiltiol, y similares. "Ariltiol" se refiere tanto a un grupo -S-arilo como a un grupo -S-heteroarilo, según se ha definido. Entre los ejemplos representativos se incluye, sin limitaciones, fenitol, piridiniltiol, furaniltiol, tientiltiol, pirimidiniltiol, y similares y derivados de ios mismos. "Acilo" se refiere a un grupo -C(0)-R", donde R" se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo inferior, trihalometilo, cicloaluilo insustituido, arilo opcionalmente sustituido con uno o más preferiblemente uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del grupo formado por los grupos alquilo inferior, trihalometilo, alcoxilo inferior, halo y -NR9R10, heteroarilo (unido a través de un átomo de carbono del anillo) opcionalmente sustituido con uno o más preferiblemente uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del grupo formado por lo grupos alquilo inferior, halo y — NR9R10 y heteroalicíclico (unido a través de un átomos de carbono del anillo) opcionalmente sustituido con uno o más, preferiblemente uno, dos o tres sustituyentes, alcoxilo inferior, halo y -NR9R10. Grupos acilo representativos incluyen, sin limitaciones, a acetilo, trifluoroacetilo, benzoilo, y similares. "Aldehido" se refiere a un grupo acilo en el cual R" es hidrógeno. "Tioacilo" se refiere a un grupo -C(S)-R" según se ha definido.} "Ester" se refiere a un grupo -C(0)0-R" con R" según se ha definido excepto que R" no puede ser hidrógeno. Grupo "acetilo se refiere a un grupo -C(0)CH3. Grupo "halo" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente flúor o cloro. Grupo "trihalometilo" se refiere a un grupo -CX3 donde X es un grupo halo según se ha definido.

Grupo "trihalometansulfonilo" se refiere a grupos X3CS(=0)2-con X según se los ha definido. "Ciano" se refiere a un grupo -C=N "S-sulfonamido" se refiere a un grupo -S(0)2NR9R10, con R9 y R10 según se ha definido. "N-sulfonamido" se refiere a un grupo -NR9S(0)2R10, con R9 y R10 según se ha definido. "O-carbamilo" grupo se refiere a un grupo -OC(0)NR9R10 con R9 y R10 según se ha definido. "N-carbamilo" se refiere a un grupo R9OC(0)NR10- con R9 y R10 según se ha definido. "O-tiolcarbamilo" se refiere a un grupo -OC(S)NR9R10 con R9 y R10 según se ha definido. "N-tiolcarbamilo" se refiere a un grupo R9OC(S)NR10- con R9 y R10 según se ha definido. "Amino" se refiere a un grupo -NR9R10, con R9 y R 0 son ambos hidrógeno. "C-amido" se refiere a un grupo -C(0)NR9R10 con R9 y R10 según se ha definido. "N-amido" se refiere a un grupo R9C(0)NR10- con R9 y R 0 según se ha definido. "Nitro" se refiere a un grupo -NO2.

"Haloalquilo" significa un grupo alquilo, preferiblemente alquilo inferior según se los ha definido, que es sustituido con uno o más átomos de halógeno, ¡guales o diferentes, por ejemplo, -CH2CI, -CF3, -CH2CF3, -CH2CCI3, y similares. "Hidroxialquilo" significa un grupo alquilo, preferiblemente alquilo inferior según se los ha definido, que es sustituido con uno, dos o tres grupos hidroxilo, por ejemplo, hidroximetilo, 1 o 2-hidroxietilo, 1 ,2-, 1 ,3-, o 2,3-dihidroxipropilo, y semejantes. "Aralquilo" significa alquilo sustituido, preferiblemente alquilo inferior según se los ha definido, que es sustituido con un grupo arito según se los ha definido, por ejemplo, -CH2fenilo, -(CH2)2fenilo, -(CH2)3fenilo, CH3CH(CH3)CH2fenilo, y similares, y derivados de los mismos. Grupo "heteroaralquilo" significa alquilo insustituido, preferiblemente alquilo inferior según se los ha definido, que es sustituido con un grupo heteroarilo, por ejemplo, -CH2pirid¡nilo, -(CH2)2pirimidinilo, -(CH2)3imidazolilo, y similares, y derivados de los mismos. "Monoalquilamino" significa un radical -NHR donde R es un grupo alquilo insustituido o un grupo cicloalquilo insustituido o un grupo cicloalquilo insustituido se los ha definido, por ejemplo, metilamino, (1-metiletil)amino, ciclohexilamino, y similares. "Dialquilamino" significa un radical -NRR donde cada uno de los R es independientemente un grupo alquilo insustituido o un grupo cicloalquilo insustituido según se los ha definido, por ejemplo, dimetilamino, dietilamino, (l-metiletil)-etilamino, ciclohexilmetilamino, ciclopentilmetilamino, y similares. Opcional" u "opcionalmente" significa que el suceso o circunstancia descripto subsiguientemente, pueden ocurrir pero no lo harán necesariamente, y que la descripción incluye instancias donde ocurre el evento o circunstancia e instancias en las que no lo hace. Por ejemplo, "grupo heterociclo opcionalmente sustituido con un grupo alquilo" significa que el alquilo puede estar presente pero no es necesario, y la descripción incluye situaciones donde el grupo heterociclo se encuentra sustituido con un grupo alquilo y situaciones donde el grupo heterociclo no está sustituido con el grupo alquilo. Los términos "2-indolinona", "indolin-2-ona" y '2-oxindol" aquí se usan en forma intercambiable para referirse a moléculas que tienen la estructura química: El término "pirro!" se refiere a moléculas que tienen la estructura química: Los términos "pirrol sustituido 2-indolinona" y "3-pirrolidenil-2-indolinona" aquí se usan en forma intercambiable para referirse a compuestos químicos que tienen la estructura general que se muestra en la fórmula (I). Los compuestos que tienen la misma fórmula molecular pero difieren en la naturaleza o en la secuencia de unión de sus átomos o en la disposición de sus átomos en el espacio se denominan "isómeros". Los isómeros que defieren en la disposición de sus átomos en el espacio de denominación "estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes especulares uno del otro se denominan "diasterómeros" y aquellos que no son imágenes especulares superponibles entre sí se denominan "enantiómeros". Por ejemplo, cuando un compuesto tiene un centro asimétrico que está unido a cuatro grupos diferentes, es posible un par de enantiómeros. Se puede caracterizar un enantiómero por la configuración absoluta de sus centros asimétricos que está descripta por las reglas de secuenciamiento R- y S- de Cahn y Prelog, o por la forma en que las moléculas hacen rotar el plano de la luz polarizada y se designan como dextrorrotatorias (es decir, respectivamente como isómeros (+)- ó (-)-). Un compuesto quiral puede existir ya sea como enantiómero individual o como una mezcla de los mismos. Una mezcla que contiene proporciones iguales de los enantiómeros se llama una "mezcla racémica". Los compuestos de esta invención pueden poseer uno o más centros asimétricos; por lo tanto se pueden producir compuestos con esas características como estereoisómeros (R)- ó (S)- individuales o como mezclas de los mismos. Por ejemplo, si en un compuesto de fórmula (I), el sustituyente R6 es 2-hidroxietilo, entonces el carbono al cual el grupo hoxhidrilo está unido es un centro asimétrico y por lo tanto el compuesto de fórmula (I) puede existir como un estereoisómero (R)- ó (S)-. A no ser que se indique de otra manera, la descripción o denominación de un compuesto en particular en la especificación y cláusulas incluye tanto a los enantiómeros individuales como a las mezclas, (racémicas o no), de los mismos. Los métodos para la determinación de la estereoquímica y la separación de estereoisómeros son bien conocidos en la técnica (véase la exposición en el Capít8lo 4t0 de "Advanced Organic Chemistry", 4a edición J. March, John Wiley y Sons, New York, 1992). Los compuestos de fórmula (I) pueden mostrar los fenómenos de ¡somería estructural y tauromería. Por ejemplo, los compuestos descriptos aquí pueden adoptar una configuración E o Z con respecto la doble unión que conecta la unidad 2-indolinona a la unidad pirrol o pueden ser una mezcla de E y Z. Esta invención abarca cualquier forma estructural tautomérica o isomérica y mezclas de los mismos que tenga la capacidad de modular la actividad de RTK, CTK y/o STK y no encuentra limitada a cualquier forma estructural tautomérica o isomérica. Una "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de uno o más de los compuestos aquí descriptos, o sales aceptables para el uso fisiológico/terapéutico o prodrogas de las mismas, con otros componentes químicos, tales como vehículos y excipientes aceptables para el uso fisiológico/terapéutico. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. El compuesto de fórmula (I) también puede actuar como una prodroga. Una "prodroga" se refiere aun agente que se convierte in vivo a la droga de origen. Frecuentemente las prodrogas son útiles porque, en algunas situaciones, pueden ser más fáciles de administrar que la droga de origen. Por ejemplo, pueden ser biodisponibles por administración oral mientras que la droga de origen no lo es. La prodroga también puede tener una solubilidad mejorada en composiciones farmacéuticas en comparación con la droga de origen. Un ejemplo, sin limitaciones, de una prodroga podría ser un compuesto de la presente invención que es administrado como un éter (la "prodroga") para facilitar la transmisión a través de la membrana celular donde la solubilidad en agua se opone a la movilidad, pero luego, una vez dentro de la célula, donde la solubilidad en agua es beneficiosa, es hidrolizado en forma metabólica al ácido carboxílico, es decir, la entidad activa. Un ejemplo adicional de una prodroga podría ser un polipéptido de cadena corta, por ejemplo y sin limitación, un polipéptido de entre 2 y 10 aminoácidos, unido a través de un grupo amino terminal a un grupo carboxilo de un compuesto de esta invención, donde el polipéptido es hidrolizado o metabolizado ¡n vivo para liberar las moléculas activas. Las prodrogas de un compuesto de fórmula (I) se hallan dentro del alcance de la presente invención.

Adicionalmente, se contempla que un compuesto de fórmula (I) podría ser metabolizado por enzimas en el cuerpo de un organismo tal como un ser humano para generar un metabolito que pueda modular la actividad de las proteínas cinasas. Dichos metabolitos se hallan se hallan dentro del alcance de la presente invención. Según se usa aquí, un "vehículo aceptable para el uso fisiológico/terapéutico" se refiere a un vehículo o diluyente que no causa una irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado. Un "excipiente aceptable para el uso farmacéutico" se refiere a una sustancia inerte que se agrega a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un compuesto. Algunos ejemplos de excipientes no limitantes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles. Según se usa aquí, el término "sal aceptable para el uso farmacéutico" se refiere a aquellas sales que retienen la eficiencia biológica y propiedades del compuesto de origen. Dichas sales incluyen: (i) sal de adición ácida que se obtiene por reacción de la base libre del compuesto de origen con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, y ácido perclórico y similares, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido (D) o (L) málico, ácido maleico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succinico o ácido malónico y similares, preferiblemente del ácido clorhídrico o del ácido (L)-málico, o (2) sales formadas cuando se reemplaza un protón acídico presente en el compuesto de origen ya sea con un ion metálico, por ejemplo, un ion metálico alcalino, un ion alcalinotérreo, o un ion aluminio; o se coordina con una base orgánica como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, y similares. "PK" se refiere a una proteína receptora de tirosina cinasa (RTK), no receptora o tirosina cinasa "celular" (CTK) y serina-treonina cinasas (STK). "Método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para conseguir una tarea determinada incluyendo, sin limitaciones, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos, ya sean conocidos, o fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por aquél entrenado en la técnica química, farmacéutica, biológica, bioquímica y médica. "Modulación" o "modular" se refiere a la alteración de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK. Modular se refiere, en particular, a la activación de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK, preferiblemente a la activación o inhibición de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK, dependiendo de la concentración del compuesto o sal a la cual se expone la RTK, CTK o STK o, más preferiblemente, la inhibición de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK.

"Actividad catalítica" se refiere a la proporción de fosforilación de la tirosina bajo la influencia, directa o indirecta, de las RTK y/o CTK o la fosforilación de serina y treonina bajo la influencia, directa o indirecta, de las STK. "Poner en contacto" se refiere a poner juntos un compuesto de esta invención y una PK objetivo de tal manera que el compuesto puede afectar la actividad catalítica de la PK, ya sea directamente, es decir, por interacción con la misma cinasa, o indirectamente, es decir, por interacción con otras moléculas respecto al as que la actividad catalítica de la cinasa es dependiente. Se puede conseguir dicho "poner en contacto" in vitro, es decir, en un tubo de ensayo, una cápsula de petri o similares. En un tubo de ensayo, el poner en contacto puede incluir solamente un compuesto uy una PK de interés o puede incluir células completas. También se pueden mantener o cultivar las células en discos de cultivo de células y ponerlos en contacto con un compuesto en dicho ambiente. En este contexto, se puede intentar la determinación de la capacidad de afectar un trastorno relacionado con PK de un compuesto en particular, es decir, la IC50 del compuesto, definida abajo, antes del uso in vivo de los compuestos, con organismos vivientes más complejos. Para células fuera del organismo, existen muchos métodos para poner las PK en contacto con los compuestos y son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica, incluyendo, sin limitaciones, la microinyección celular directa y mucha técnicas de vehículo transmembrana.

"In vitro" se refiere a procedimientos que se llevan a cabo en un ambiente artificial tal como por ejemplo y sin limitación, en un tubo de ensayo o en un medio de cultivo. "In vivo" se refiere a procedimientos que se llevan a cabo dentro de un organismo viviente como, sin limitaciones, un ratón, una rata o un conejo. Tanto "trastorno relacionado con PK" como "trastorno impulsado por PK" y "actividad PK anormal", se refieren todos a una condición caracterizada por una actividad catalítica PK ¡napropiada, es decir, baja, o, más comúnmente, alta, donde la PK, en particular puede ser una RTK, una CTK o una STK. La actividad catalítica inapropiada puede surgir como resultado de ya sea: (1 ) expresión de la PK en células que normalmente no expresión PK, (2) expresión aumentada de la PK que conlleva a una proliferación celular no deseada, diferenciación y/o crecimiento, o, (3) expresión disminuida de la PK que conlleva a reducciones no deseadas en la proliferación celular, diferenciación y/o crecimiento. La sobreactividad de una PK se refiere ya sea a la amplificación del gen que codifica a una PK en particular o la producción de un nivel de actividad PKK que se4 puedan correlacionar con una proliferación celular, diferenciación y/o trastorno del crecimiento (esto es, si a medida que aumenta el nivel del a PK, aumenta la severidad de uno o más de los síntomas del trastorno celular). La subactividad es, por supuesto, la inversa, donde aumenta la severidad de uno o más de los síntomas de un trastorno celular a medida que disminuye el nivel de la actividad PK. "Tratar", "tratando" y "tratamiento" se refiere a un método para aliviar o anular un trastorno celular mediado por PK y/o sus síntomas concomitantes. Con respecto en particular al cáncer, dichos términos simplemente significan que la expectativa de vida de un individuo afectado con un cáncer aumentará, o que se reducirán uno o más de los síntomas de la enfermedad. Organismo" se refiere a cualquier entidad viviente que comprende al menos una célula. Un organismo viviente puede ser tan simple como, por ejemplo, una única célula eucariota o tan complejo como un mamífero, que incluye a un ser humano. "Cantidad efectiva para el uso terapéutico" se refiere a una cantidad del compuesto que está siendo administrado que aliviará en alguna medida uno o más de los síntomas del trastorno que está siendo tratado. Con referencia al tratamiento de cáncer, una cantidad efectiva para el uso terapéutico se refiere a la cantidad que tiene el efecto de: (1 ) reducir el tamaño del tumor; (2) inhibir (es decir, hacer más lenta en alguna medida, y preferiblemente detener) la metástasis del tumor; (3) inhibir en alguna medida (es decir, hacer más lenta en alguna medida, y preferiblemente detener) el crecimiento del tumor, y/o, (4) aliviar en alguna medida (o, preferiblemente, eliminar) uno o más síntomas asociados con el cáncer. "Monitorear" significa observar o detectar el efecto de poner en contacto un compuesto con una célula que expresa una PK en particular. El efecto observado o detectado puede ser un cambio del fenotipo celular, de la actividad catalítica de una PK o un cambio en la interacción de una PK con un compañero de unión natural. Las técnicas para observar o detectar dichos efectos son bien conocidas en la técnica. El efecto al que se hace referencia previamente se selecciona de entre un cambio o una ausencia en el fenotipo celular, un cambio o ausencia de cambio en la actividad catalítica de dicha proteína cinasa o un cambio o ausencia de cambio en la interacción de dicha proteína cinasa con un compañero de unión natural, en un aspecto final de esta invención. "Fenotipo celular" se refiere a la apariencia externa de una célula o tejido o a la función biológica de la célula o tejido. Algunos ejemplos no limitantes del fenotipo celular son el tamaño, el crecimiento celular, la proliferación celular, la diferenciación celular, la supervivencia celular, la apoptosis, y la toma y uso de nutrientes. Dichas características fenotípicas se pueden medir usando técnicas bien conocidas en la técnica. "Compañeros de unión natural" se refiere a un polipéptido que une una PK en particular a una célula. Los compañeros de unión natural pueden desempeñar un papel en la propagación de una señal en un proceso de transducción de señal mediado por PK. Un cambio en la interacción del compañero de unión natural con la PK se puede manifestar en sí como una concentración aumentada o disminuida del complejo PK/compañero de unión natural y, como resultado, como un cambio observable de la capacidad de la PK para mediar la transducción de la señal. En el cuadro 1a siguiente se muestran compuestos representativos de la presente invención.

CUADRO 1a 10 5-[(Z)-[4-3-clorofenil)-2-oxo-1,2- dihiro-3H-indol-3-il¡den]metil)-N- (-hidrox¡-3-p¡rolid¡n-1-¡lpropil)- 2,4-d¡metil-1H-pirrol-3- carboxamida 11 (3Z)-3-{[4-({[3-(dimetilamino)-2- h¡droxipropil]am¡no}carbonil)-5- met¡l-3-fenil-1 H-pirrol-2- ¡l]metilen}-2-oxo-N-gen¡l-2,3- 5 dihidro-1 H-indol-5-carboxamida 12 (32)-3-{[4-({[3-(dietilam¡no)-2- hidroxipropil]am¡no}carbonil)-5- metil-3-fenil-1 H-p¡rrol-2- il]metilen}-2-oxo-2,3-dihidro-1H- ¡ndol-5-carboxamida 13 (3Z)-3-{[4-({[3-(dietilam¡no)-2- hidroxipropil]am¡no}carbonil)-5- meti!-3-fenil-1 H-pirrol-2- il]metilen}-N-(2h¡drox¡etil)-2- oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5- 10 carboxamida 14 N-[3-(d¡metilamino)-2- h id roxipropi l]-4-(4-fl uorof en¡l)-2- metil-5-{(Z)-[5-(morfolin-4- ilcarbonil)-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H- indol-3-iliden]imetil}-1 H-pirrol-3- carboxamida 15 (3Z)-3-{[4-({[3-(diet¡lamino)-2- hidroxipropil]amino}carbonil)-3- (4-fluorofenil)-5-metil-1H-pirro- 2-¡l]-metilen}-N-isopropil-2-oxo- 2,3-dihidro-1 H-indol-5- 15 carboxamida 16 (3Z)-3-{[4-({[3-(dietilamino)-2- h¡drox¡prop¡l]am¡no}carbon¡l)-3- (2,4-d¡fluorofenil)-5-metil-1 H- p¡rrol-2-¡l]met¡len}-2-oxo-N-fenil- 2,3-dihiro-1 H-indol-5- carboxamida 10 15 24 N-[2-hidroxi-3-(2-H-tetraazol-2- il)propil]-2,4-dimtil-5-{(Z)-[2-oxo- 5-tr¡fluorometoxi)-1 ,2-d¡hidro- 3H-indol-3-il¡den]metil}-1 H- pirrol-3-carboxamida 25 5-(Z)-[(5-fluoro-2-oxo-1 ,2- dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]- N-[2-hidrox¡-3-(1 H-tetraazol-1 - ¡l)propil]-2,4-dimetil-1H-p¡rrol-3- carboxamida 26 5-(Z)-[(5-fluoro-2-oxo-1 ,2- dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]- N-[2-hidrox¡-3-(1 H-tetraazol-1 - ¡l)propil]-2,4-dimet¡l-1H-pirrol-3- carboxamida 27 o r-"~¿ N-[2-hidroxi-3-(1 H-tetraazol-1 - il)prop¡l]-2,4-dimet¡l-5-(Z)-{[2- oxo-5-trifIurometox¡)-1 ,2- dihidro-3H-indol-3-iliden]metil}- 1 H-pirrol-3-carboxamida 28 N-{3-]2R,6S-dimetilmorfolin-4-il- 10 2-hidroxipropil]-5-[((Z)-5-fluoro- 2-0X0- ,2-dihidro-3H-¡ndol-3- iliden)metil]-2,4-dimetil-1 H- pirrol-3-carboxamida 29 5-[(Z)-(5-cloro-2-oxo-1 ,2- d¡hidro-3H-indol-3-¡liden)metil)- N-{3-(2R, 6S-dimet¡lmorfolin-4- il-2-h¡roxiprop¡l-2,4-dimetil-1H- pirrol-3-carboxamida 30 N-[3-[(2R,6S)-dimetilmorfol¡n-4- ¡l-2-h¡droxipropil)-2,4-dimetil-5- {5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2- 15 hidro-3H-¡ndol-3-iliden)metil)- 1 H-pirrol-3-carboxamida 31 5-[(Z)-(5-fiuoro-2-oxo-1 ,2- dihidro-3H-indol-3-¡liden)met¡I)- N-((2R)-2-hiroxi-3-(3-metil-2,5- dioxoim¡dazolidin-1-¡])propil]- 2,4-dimetil-1 H-pirrol-3- carboxamida 41 442.49 5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo- 1 ,2-dihidro-3H-indol-3- iliden)met¡l]-N-((2S)-2-hidroxi-3- morfolin-4-¡lpropil]-2,4-dimetil- 1 H-pirrol-3-carboxamida 42 442.49 5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo- 1 ,2-dihidro-3H-indol-3- iliden)metil]-N-((2R)-2-h¡droxi-3- morfolin-4-ilpropi!]-2,4-dimetil- r>oH 1 H-pirrol-3-carboxamida 43 458.95 5-[(Z)-(5-cloro-2-oxo- 1 ,2-dihidro-3H-indoI-3- iliden)metil]-N-[(2R)-2- idrox¡-3- morfolin-4-ilpropil-2,4-dimet¡I- 1 H-pirroi-3-carboxam¡da 44 4458.95 5-[(Z)-(5-cloro-2-oxo- 1 ,2-dih¡dro-3H-¡ndol-3- ¡liden)metil]-N-[(2S)-2-hidrox¡-3- morfolin-4-ilpropil-2,4-dimetil- 1 H-pirrol-3-carboxamida Otros compuestos representativos de la presente invención se muestran en el cuadro 1 b a continuación Compuesto Nro. Estructura Nombre 1 N o ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2- dihidro-indol-3-ilidenmetil)- ? ?- ? 2,4-dimetil-1 H-pirrol-3- carboxílico, (3-dietilamino-2- hidroxi-propil)-amida 2N ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2- di idro-indol-(3)-ilidenmetil[- 2,4-dimetil-1 H-pirrol-3- carboxílico, (2-hidrox¡-3- morfolin-4-il-propil)-amida 3N ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo- 1 ,2-dihidro-indol-(3)- ilidenmetil]-1 H-pirrol-3- carboxílico, (2- idroxi-3- morfolin-4-il-propil)-amida 4N ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1,2- dihidro-¡ndol-(3Z)- ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H- pirrol-3-carboxílico. (2- Yx =o hidroxi-3-morfolin-4-il- propil)-amida Compuesto Nro. Estructura Nombre 5N o ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1 ,2- d¡h¡dro-indol-ilidenmet¡l]-2,4- dimetil-1 H-pirrol-3- carboxílico, (2-h¡droxi-3- H morfoiin-4-il-prop¡l)-amida 6N O ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo- H~ _A H OH ll- 1 ,2-dihidro-indol-ilidenmeíil]- -¾¾ J' H 1 H-pirrol-3-carboxíüco, (2- hidroxi-3-[1 ,2,3]triazol-1-il- H propil)-amida 7N ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1 ,2- dihidro-indol-ilidenmetil]-2,4- dimetil-1 H-pirrol-3- carboxílico, (2-hidroxi-3- (1,2,3]triaol-1-il-propil)- amida 8N O ácido 5-[5-cioro-2-oxo-1 ,2- dihidro-indol-ilidenmetil]-2,4- H,. .X. OH N-N dimetil-1 H-pirrol-3- carboxílico, (2-hidroxi-3- [1,2,3]trizol-1-il-prop¡l)- H amida 9N ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1,2- di idro-indol-¡lidenmetil]-2,4- dimetil-m-pirrol-3- carboxíiico, (2- idroxi-3- [1,2,3]triazol-1-il-propil)- amida 11N 3-{[4-({[3-(d¡etilamino)-2- hidroxipropil]amino}carbonil) -5-metil-3-fenil-1 H-pirrol-2- il]metilen}-2-oxo-N-fenil-2,3- di diro-1 H-indol-5- carboxamida 12N 3-{[4-({[3-(dietilamino)-2- hidroxipropil]amino}carbonil) -5-metil-3-fenil-1 H-pirrol-2- i!]metilen}-N-metil-2-oxo-2,3- di idro-1 H-indoí-5- carboxamida 13N (3Z)-3-{[4-({[3-(dietilamino)- o 2- hidroxipropil]amino}carbonil) -5-metil-3-fenil-1 H-pirrol-2- il]metilen}-N-(2-hidroxieti -2- oxo-2,3-di idro-1 H-indol-5- carboxamida 14N N-[3-(dietilamino)-2- hidrox¡propil]-4-(4- fluorofertil)-2-metil-5-{[5- (morfolin-4-ilcarbonil)-2-oxo- 1 ,2-dihidro-indol-3H-oindol- 3-il¡den]imetil}-1 H-pirrol-3- carboxamida N 5-[(5-cloro-2-oxo-1 ,2-dibidro-3H'-indol- 3-iliden)metil]-N-[2-hidroxi-3-(2H- tetraazol-2-il)propil]-2,4-dimetil-1 H- pirrol-3-carboxam ida N N-[2-hidroxi-3-(2H-tetraazol-2- il)propil]-2,4-dimetil-5-{[2-oxo-5- trifluorometoxi)-1 ,2-dihidro-3H- indol-3-iIiden]metil}-1H-pirrol-3- carboxamida N 5-[(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H- indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroxi- 3-(1 H-tetraazo!-1 -il)propil]-2,4- dimetil-1 H-pirrol-3-carboxamida N 5-[(5-cloro-2-opxo-1 ,2-dihidro- 3H-indol-3-iliden)metil]-N-[2- --~ X H hidroxi-3-(1 H-tetraazol-1 - ii)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirro!-3- carboxamida N N-[2-hidroxi-3-(1 H-tetraazol-1 - il)propil]-2 ,4-d imetil-5-{[2-oxo-5- trifluorometoxi)-1,2-dihidro-3H- indol-3-iliden]metil}-1H-pirrol-3- carboxamida N N-{3-[2,6-dimetilmorfoIin-4-ili-2- hidroxipropil]-5-[(5-fluoro-2-oxo- 1,2-dihidro-3H-indol-3- iliden)metil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol- 3-carboxamida N r 0 5-[(5-cloro-2-oxo- 1 ,2-d ¡h id ro-3 H- indol-3-iliden)metil)-N-{3-(2,6- dimetilmorfolin-4-ill-2- h¡droxiprop¡l-2,4-d¡metil-1 H- pirrol-3-carboxamida N N-13[2,6-dimetimorfolin-4-HI-2- hidroxipropil)-2,4-dimetil-5-{[2- ioxo-5-(trifIuorometoxi)-1 ,2- dihidro-3H-indol-3-carboxamida N V 5-[(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-3H- indol-3-iliden)metil]-N-(2-h¡drox¡- 3-(3-metil-2,5-d¡oxo¡m¡dazol¡d¡n- 1 -il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3- carboxamida N N-[2-hidroxi-3-(3-metil-2,5- dioxoimidazolidin-1-il)propil]-2,4- dimetil-5{(Z)-[2-oxo-5- (trifluorometoxi)-1 ,2-dihidro-M- indol-3-iliden]metil}-1 H-pirrol CUADRO 1C Los compuestos presentados en los cuadros 1a-1c son ejemplares solamente y no deben constituirse solamente como limitantes en el alcance de esta invención de modo alguno.

REALIZACIONES PREFERIDAS Si bien la definición más amplia se indica en el resumen de la invención, algunos compuestos de fórmula (i) que se indican a continuación resultan preferidos. Un grupo preferidos de compuestos de fórmula (I) es aquel donde R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo, o n-butilo, más preferiblemente hidrógeno o metilo; y R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17 donde R17 es hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, y más preferiblemente R7 es hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o ter-butilo, fenilo, benzoilo, acetilo o carboxilo, aún más preferiblemente metilo, hidrógeno o fenilo. 2.- Otro grupo preferido de compuestos de fórmula (l) es aquél donde; R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo, o n-butilo, más preferiblemente hidrógeno o metilo, más preferiblemente metilo; R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17 donde R17 es hidrozilo, alquilo o arilo, y R7 es más preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o ter-butilo, fenilo, benzoilo, acetilo o carboxilo, aún más preferiblemente metilo, hidrógeno o fenilo; y R3, R4, y R5 son hidrógeno; y Z es arilo. 3. - Otro grupo preferido de compuestos de fórmula (I) es aquél donde: R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo, o n-butilo, más preferiblemente hidrógeno o metilo, más preferiblemente metilo; R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17 donde R17 es hidroxilo, alquilo o arilo, y R7 es más preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o ter-butilo, fenilo, benzoilo, acetilo o carboxilo, aún más preferiblemente metilo, hidrógeno o fenilo, más preferiblemente metilo; y R3, R4, y R5 son hidrógeno; y Z es heteroarilo, preferiblemente triazinilo, tetrazolilo, imidazolilo, piridinilo, pirimidinilo o pirazinllo. 4. - Otro grupo preferido de compuestos de fórmula (I) es aquén donde: R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo, o n-butilo, más preferiblemente hidrógeno o metilo, más preferiblemente metilo; R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17 donde R17 es hidroxilo, alquilo o arilo, y R7 es más preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o ter-butilo, fenilo, benzoilo, acetilo o carboxilo, aún más preferiblemente metilo, hidrógeno o fenilo; y R3, R4, y R5 son hidrógeno; y Z es heterociclo. 5 - Otro grupo preferido de compuestos de fórmula (I) es aquél donde: R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo, o n-butilo, más preferiblemente hidrógeno o metilo, más preferiblemente metilo; R7 es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17 donde R17 es hidroxilo, alquilo o arilo, y R7 es más preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o ter-butilo, fenilo, benzoilo, acetilo o carboxilo, aún más preferiblemente metilo, hidrógeno o fenilo, más preferiblemente metilo; y R3, R4, y R5 son hidrógeno; y Z es -NR15-R16 donde R15 y R 6 se combinan para formar un heterociclamino, preferiblemente piperidin-1-ilo, N-metilpiperidini-1-ilo, piperazin-1-ilo, N-metilp¡rrol¡din-1-ilo, pirrolid¡n-1-ilo, morfolin-4-¡lo, tiomorfolin-4-ilo, tiomorfolino-1 -óxido, tiomorfolino-1 ,1 -dióxido, 4-etiloxicarbonilmetilpiperazin-1-ilo, 3-oxopiperazin-1-ilo, ¡m¡dazolidin¡-1-¡l-2-ona, pirrolidin-1 -¡?-2-ona, 2-oxohomopiperazin-1-ilo, o tetrahidropir¡midin-1-¡l-2-ona, más preferiblemente morfolin-4-ilo. 5.- Otro grupo preferido de compuestos de fórmula (I) es aquél donde: R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo, o n-butilo, más preferiblemente hidrógeno o metilo; R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17 donde R17 es hidroxilo, alquilo o arilo, y R7 es más preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o ter-butilo, fenilo, benzoilo, acetilo o carboxilo, aún más preferiblemente metilo, hidrógeno o fenilo; y R3, R4, y R5 son hidrógeno; y Z es -NR-15R'5 donde R 5 y R16 son alquilo, preferiblemente dietilamino, dimetilamino, o etilamino. 7.- Dentro de los grupos anteriores preferidos y más preferidos (1 )-(6), un grupo de compuestos aún más preferido es aquél donde: - R1 es hidrógeno, alquilo, -C(0)NR12R13, cicloalquilo insustituido, preferiblemente hidrógeno, 3,4-dimetoxifenilaminocarbonilo, 4-metoxi-S-clorofenil-aminocarbonilo, aún más preferiblemente hidrógeno o metilo, más preferiblemente hidrógeno; y R2 es hidrógeno, ciano, halo, alcoxilo inferior, o -S(0)2NR9R1° donde R9 es hidrógeno y R10 es hidrógeno, arilo o alquilo y está en la posición 5 del anillo de oxindol, preferiblemente R2 es hidrógeno, cloro, bromo, fluoro, metoxilo, etoxilo, fenilo, dimetilaminosulfonilo, 3-clorafeniI-aminosulfonilo, carboxilo, metoxilo, aminosulfonilo, metilaminosulfonilo, fenilaminosulfonilo, piridin-3-il-aminosulfonilo, dimetilaminosulfortilo, isopropilamino-sulfonilo, más preferiblemente hidrógeno, fluoro o bromo. Más preferiblemente R2 es fluoro y se localiza en la posición 5 del anillo de indolinona. Dentro de los grupos anteriores preferidos y más preferidos, la estereoquímica en el átomo de carbono que lleva el grupo hidroxilo en la cadena -CONHCH(R3)*CR4 (OH) CR5Z y que está es indicada por un * es RS, R o S, más preferiblemente S.

Utilidad Las PK cura actividad catalítica es modulada por los compuestos de esta invención incluyen a proteínas tirosincinasas, de las cuales existen dos tipos, receptor de tirosincinasas (RTK) y tirosincinasas celulares (CTK), y serina-tirosincinasas (STK). La transduccíón de señales medida por la RTK es iniciada por una interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), seguido por la dimerización del receptor, la estimulación transitoria de la actividad intrínseca de la proteína tirosincinasa y fosforilación. Los sitios de unión se han creado para las moléculas de transducción de señales intracelulares y conducen a al formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplasmática que facilitan la respuesta celular apropiada (por ejemplo, división celular, efectos metabólicos sobre el microambiente extracelular, etcétera). Véase, Schlessinger y Ullrich, 1992. Neuron 9: 303-391. Se ha demostrado que los sitios de fosforilación de tirosina en los receptores de los factores de crecimiento funcionan como sitios d alta afinidad de unión para los dominios SH2 (homología src) de las moléculas de señal. Fantl et al., 1992, Cell 69: 413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778, y Koch et al., 1991 , Science 252: 668-678. Se han identificado algunas proteínas substrato intracelular que se asocian con las RTK. Ellas pueden ser divididas en dos grupos principales: (1 ) substratos que tienen un dominio catalítico y (2) substratos que perdieron a tal dominio pero que pueden servir como adaptadores y asociarse con moléculas catalíticamente activas. Songyang et al., 1993. Cell 72: 767-778. La especificidad de las interacciones entre los receptores y los dominios SH2 de estos substratos está determinada por los residuos de aminoácidos que circundan inmediatamente al residuo de tirosina fosforilado. Las diferencias en la afinidad de la unión entre los dominios SH2 y la secuencia de aminoácidos que rodea a los residuos fosfotirosina sobre receptores en particular son consistentes con las diferencias observadas es los perfiles de fosforilación de los substratos. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Estas observaciones sugieren que la función de cada RTK está determinada no solo por su patrón de expresión y disponibilidad del ligando sino también por la disposición río debajo de la ruta de transducción de señales que son activados por un receptor particular. Así, la fosforilación provee una importante etapa regulatoria que determina la selectividad de la ruta de señales reclutada por receptores específicos de factores de crecimiento, y también de receptores de factores de diferenciación. Las STK siendo primariamente citosólicas, afectan la bioquímica interna de la célula, frecuentemente como una respuesta bajo línea a un suceso PTK. Las STK han sido implicadas en el proceso de señales que inicia la síntesis de ADN y subsiguientemente la mitosis que conduce a la proliferación celular. Así, la señal de transducción PK resulta en, entre otras respuestas, la proliferación celular, diferenciación, crecimiento y metabolismo. Una proliferación anormal puede ser el resultado de una variedad de trastornos y enfermedades, que incluyen el desarrollo de neoplasias tales como carcinoma, sarcoma, glioblastoma y hemangioma, trastornos tales como leucemia, psoriasis, arteriesclerosis, artritis y retinopatía diabética y otros trastornos relacionados con la angiogénesis descontrolada y/o vasculogénesis. No se requiere en la función de la práctica de la presente invención una comprensión precisa del mecanismo mediante el cual los compuestos de esta invención inhiben PK. Sin embargo, mientras que por este medio no sea unida a un mecanismo particular o teoría, se cree que los compuestos interactúan con aminoácidos de la región catalítica de los PK. Las PK típicamente poseen una estructura bi lobulada en donde el ATP parece estar unido en la hendidura entre los dos lóbulos en una región donde los aminoácidos, entre las PK, están conservados. Se cree que los inhibidores de las PK se unen por interacciones no covalentes tales como uniones hidrógeno, fuerzas de van der Waals e interacciones iónicas en la misma región general donde el antedicho ATP se une a las PK. Más específicamente, se piensa que el componente 2-¡ndolinona de los compuestos de esta invención se une en el espacio general normalmente ocupado por el anillo adenina del ATP. La especificidad de una molécula particular para un particular PK puede luego surgir como el resultado de interacciones adicionales entre varios sustituyentes sobre el núcleo de la 2-indolinona y el dominio específico de aminoácidos de un PK particular. De esta forma los diferentes sustituyentes de la ¡ndolinona pueden contribuir para una unión preferencia! a un PK particular. La capacidad para seleccionar compuestos activos sobre diferentes sitios de unión a ATP (u otros nucleótidos) hace que los compuestos de esta invención sean útiles para ubicar cualquier proteína con tales sitios. Los compuestos divulgados aquí son útiles en ensayos in vitro para tales proteínas, y también muestran efectos terapéuticos in vivo a través de la interacción con tales proteínas. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención proveen una aproximación en el tratamiento de muchas clases de tumores sólidos, que incluyen, sin limitaciones, carcinomas, sarcomas que incluyen al sarcoma de Kaposi, eritroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocitoma, melanoma y mioblastoma. También se contempla en esta invención el tratamiento o prevención de tumores cancerosos no sólidos tales como leucemia. Las indicaciones pueden incluir, sin limitaciones, cánceres de cerebro, cánceres de vejiga, cánceres de ovario, cánceres gástricos, cánceres de páncreas, cánceres de colón, cánceres de la sangre, cánceres de pulmón y cánceres de huesos. Ejemplos ulteriores, sin limitaciones, de los tipos de trastornos relacionados con una actividad inapropiada de PK y que los compuestos descriptos aquí pueden ser útiles en la prevención, tratamiento y estudio, son los trastornos en la proliferación celular, trastornos fibróticos y trastornos metabólicos. Los trastornos en la proliferación celular que pueden ser prevenidos, tratados y además estudiados por la presente invención incluye cáncer, trastornos proliferativos de los vasos sanguíneos y trastornos proliferativos de las células mesangiales. Los trastornos proliferativos de los vasos sanguíneos se refieren a trastornos relacionados con una vasculogénesis (formación de vasos sanguíneos) y angiogénesis anormal (expansión de los vasos sanguíneos). La vasculogénesis y la angiogénesis juegan un importante rol en una variedad de procesos fisiológicos normales tales como el desarrollo embrionario, la formación del cuerpo lúteo, regeneración de órganos y cicatrización de heridas, ellos también cumplen un rol pivotante en el desarrollo del cáncer donde dan por resultado la formación de nuevos capilares que son necesarios para mantener vivo al tumor. Otros ejemplos de trastornos en la proliferación de los vasos sanguíneos incluyen artritis, donde los nuevos vasos sanguíneos capilares invaden las articulaciones y destruyen el cartílago, y enfermedades oculares, similares a la retinopatía diabética, donde los nuevos capilares en la retina invaden al vitreo, sangran y causan ceguera. Se han identificado dos estructuras relacionadas con las RTK que unen a VEGF con alta afinidad: el receptor simil-fms tirosina 1 (fit-l) (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5: 519-524; De Vries et al., 1992, Science, 255: 989-99 ) y el receptor KDR/FLK-1 , también conocido como VEGF-R2. Se ha publicado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un mitógeno específico de células endoteliales con una actividad que promueve el crecimiento de las células endoteliales ¡n vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161 : 851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem.. 265: 19461-19566. La información divulgada en la solicitud de los E.U.A. con No. de serie 08/193,829, 08/038596 y 07/975750, sugiere fuertemente que el VEGF no es solamente responsable de la proliferación de las células endoteliales sino también el es el primer regulador de la angiogénesis normal y patológica. Véanse en forma general, Klagsburn & Soker, 1993, Current Bioloqy, 3(10)699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem.. 267: 26031-26037. La vasculogénesis y la angiogénesis normal juega un importante rol en una variedad de procesos fisiológicos tales como el desarrollo embrionario, cicatrización de heridas, regeneración de órganos y procesos reproductivos femeninos tales como el desarrollo del folículo en el cuerpo lúteo durante la ovulación y el crecimiento de la placenta después de la preñez. Folkman & Shing, 1992, J. Bioloqical Chem., 267(16): 10931-34. La vasculogénesis y/o angiogénesis descontrolada ha sido asociada con enfermedades tales como la diabetes y también tumores sólidos malignos que dependen de la vascularización para crecer. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10): 699-702; Folkham, 1991, J. Nati. Cáncer Inst.. 82: 4-6; Weidner, et al., 1991. New Enql. J. Med.. 324: 1-5. El supuesto rol del VEGF en la proliferación de las células endoteliales y en la migración durante la angiogénesis y vasculogénesis indican un rol importante, en este proceso, para el receptor KDR/FLK-1. Las enfermedades tales como la diabetes mellitus (Folkman, 198, in Xith Congress of Thrombosis y Haemostasis (Verstraeta, et al., eds.), pp. 583-596. Leuven University Press, Leuven) y la artritis, y también el crecimiento de tumores malignos puede ser el resultado de una aniogénesis descontrolada. Véase, por ejemplo, Folkman, 1971 , N. Enql. J. Med., 285: 1182-1 186. Los receptores a los cuales el VEGF se une específicamente son un poderoso e importante blanco terapéutico para la regulación y modulación de la vasculogénesis y/o angiogénesis y para una variedad de enfermedades severas que involucran crecimiento celular anormal causado por tales procesos. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6): 334-339. Más particularmente, los receptores KDR/FLK-1 altamente específicos tiene un rol en la neovascularización haciéndolos un blanco de elección para aproximaciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades que involucran la formación descontrolada de vasos sanguíneos. De esta manera, la presente invención provee compuestos capaces de regular y/o modular las señales de transduccion de la tirosincinasa que incluyen al receptor de transducción de señales KDR/FLK-1 en función de inhibir o promover la angiogénesis y/o vasculogénesis, estos son, compuestos que inhiben, previenen o interfieren con las señales transducidas por KDR/FLK-1 cuando es activado por ligandos tales como VEGF. Aunque se cree que los compuestos de la presente invención actúan sobre un receptor u otro componente a lo largo de la ruta de transducción de señales tirosincinasa, ellos pueden también actuar directamente sobre las células tumorales que resultan de una angiogénesis descontrolada. Aunque la nomenclatura de las contrapartes murinas y humanas del receptor genérico "flk-l" difieren, ellos son, en muchos aspectos, intercambiables. El receptor murino, Flk-1 , y su contraparte humana, KDR, comparte una homología de secuencia del 93.4% entre los dominios intracelularles. Asimismo, la FLK-I murina se une al VEGF humano con la misma afinidad que el VEGF de ratón, y en consecuencia, es activada por el ligando derivado de una u otra especie. Millauer et al., 1993, Cell. 72: 835-846; Quinn et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sel. USA. 90: 7533-7537, La FLK-1 también está asociada y es subsiguientemente substrato de la RTK humana fosforilada en tirosina (por ejemplo, PLC-? o p85) cuando se co-expresan en célula 293 (fibroblastos de riñon embrionario humano). Por ende, los modelos que dependen del receptor FLK- son aplicables directamente para comprender al receptor KDR. Por ejemplo, es aplicable directamente el uso del receptor FLK-1 murino en métodos que identifican compuestos que regulan las rutas de transducción de señales murinas para la identificación de compuestos que pueden ser usados para regular las rutas de transducción de señales humanas, esto es, las que regulan la actividad relacionada con el receptor KDR. De esta manera, los compuestos químicos identificados como inhibidores de KDR/FLK-1 in vitro, pueden ser confirmados en adecuados modelos in vivo. Ambos modelos animales de ratón y rata in vivo han demostrado ser de un excelente valor para el examen del potencial clínico de los agentes que actúan sobe la inducción de la ruta KDR/FLK-1 de transducción de señales. De este modo, la presente invención provee compuestos que regulan, modulan y/o inhiben la vasculogenésis y/o angiogénesis afectando la actividad enzimática del receptor KDR/FLK-1 e interfiriendo con las señales transducidas por KDR/FLK-1. Así, la presente invención provee un acercamiento terapéutico para el tratamiento de muchas clases de tumores sólidos que incluyen, sin limitaciones, glioblastoma, melanoma y sarcoma de Kaposi, y ovario, pulmón, mama, próstata, páncreas, colón y carcinoma epidermoide. En adición, los datos sugieren que la administración de compuestos que inhiben las rutas de transducción de señales mediadas por KDR-FLK-1 pueden ser también utilizados en el tratamiento de hemangioma, restenoides y retinopatías diabéticas. Es mas, esta invención se relaciona con la inhibición de la vasculogénesis y angiogénesis de otras rutas mediadas por receptor, que incluyen las rutas que comprenden al receptor flt-l. La transducción de señales mediada por el receptor tirosincinasa es iniciada por una interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), seguido de la dimerización del receptor, estimulación transitoria de la actividad intrínseca de la proteína tirosincinasa y autofosforilación. Los sitios de unión están creados para moléculas de transducción de señales intracelulares que conducen a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señal intracitoplasmáticas que facilitan la respuesta celular apropiada, por ejemplo, división celular, y efectos metabólicos de microambiente extracelular. Véase, Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20. La cercana homología de las regiones intracelulares de KDR/FLK-1 con las del receptor PDGF-ß (homología del 50.3%) y/o con el receptor flt-l relacionado indican la inducción de rutas de transducción de señales superpuestas. Por ejemplo, se ha demostrado la unión de regiones que involucran diferentes sitios de autofosforilación en el receptor PDGF-ß, miembros de la familia de src (Twamley et al., 993, Proa Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7696-7700), fosfatid¡linosítol-3'-cinasa (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 981-990), fosfolipasa cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4: 49-51), proteína que activa a ras-GTPasa, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11: 1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 10 90: 6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol.. 14: 6715-6726), y las moléculas adaptadoras Shc y Nck (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol.. 13: 6889-6896). Ver generalidades, Claesson-Welsh, 1994, Proq. Growth Factor Res.. 5: 37-54. De esta manera, es probable que las rutas de transducción de señales activadas por KDR/FLK-1 incluyan a las rutas de ras (Rozakis et al., 1992, Nature. 360: 689-692), la PI-3'-cinasa, las rutas mediadas por src y las rutas mediadas por plcy. Cada una de estas rutas puede jugar un rol crítico en el efecto angiogénico y/o vasculogénico de KDR/FLK-1 en las células endoteliales. Consecuentemente, otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de los compuestos orgánicos descriptos aquí para modular la angiogénesis y vasculogénesis cuando tales procesos están controlados por estas rutas. A la inversa, también están implicados y pueden ser tratados o prevenidos por los métodos de esta invención los trastornos relacionados con el encogimiento, contracción o cerrado por los vasos sanguíneos, tal como la restenosis. Los trastornos fibróticos referidos a la formación anormal de matrices extracelulares. Ejemplos de trastornos fibróticos incluyen cirrosis hepática y trastornos proliferativos de células mesangiales. La cirrosis hepática está caracterizada por un incremento en los constituyentes de la matriz extracelular que resulta en la formación de una cicatriz hepática. Un incremento en la matriz extracelular que resulta en una cicatriz hepática también puede ser causado por una infección viral tal como la hepatitis. Parece que los lipocitos juegan un mayor rol en la cirrosis hepática. Otros trastornos fibróticos incluyen a la aterosclerosis. Los trastornos proliferativos de las células mesangiales se refieren a trastornos causados por una proliferación anormal de células mesangiales. Los trastornos proliferativos mesangiales incluyen a varias enfermedades renales humanas tales como glomerulonefritis, nefropatía diabética y nefrosclerosis maligna, y también trastornos tales como síndrome de microangiopatía trombótica, rechazo del trasplante, y glomerulopatías. Se ha implicado al RTK PDGFR en el mantenimiento de la proliferación de las células mesangiales. Floege er al., 1993, Kidney International 43: 47S-54S. Muchos de los cánceres son trastornos de la proliferación celular y, tal como se mostró anteriormente, las PK han sido asociadas con trastornos proliferativos de las células. Por esto, no sorprende que las PK tales como, por ejemplo, los miembros de la familia RTK, hayan sido asociados al desarrollo del cáncer. Algunos de estos receptores, simil EGFR (Tuzi et al., Br. J. Cáncer 63: 227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) y PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncoqene, 7: 627-633) están sobre expresados en muchos tumores y/o persistentemente activados por un circuito autócrino. En realidad, ha sido demostrada esta sobre expresión de los receptores en la mayoría de los cánceres comunes y severos (Akbasak y Suner-Akbasak et al., 1992, J.

Neurol. ScL, 111-119-133, Dickson et al., 1992, Cáncer Treatment Res. 61 : 249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352-1360) y en los circuitos autócrinos (Lee y Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118: 1057-1070, Korc et al., supra, Akbasak y Suner-Akbasak et al., supra). Por ejemplo, el EGFR se lo ha asociado con carcinoma de células escamosas, astrocitoma, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón y cáncer de vejiga. El HER2 ha sido asociado con cáncer de mama, ovario, gástrico, pulmón, páncreas y vejiga. Ek PDGFR ha sido asociado al glioblastoma y melanoma, y también al cáncer de pulmón, ovario y próstata. La RTK c-met ha sido también asociada con la formación de tumores malignos. Por ejemplo, el c-met ha sido asociado con, entre otros cánceres, carcinomas colorrectales, tiroides, pancreático, gástrico y hepatocelular y linfomas. Adicionalmente el c-met se lo ha ligado a la leucemia. También se ha detectado sobre expresión del gen c-met en pacientes con la enfermedad de Hodgkins y la enfermedad de Burkitts. Además, al IGF-IR se lo ha implicado en el soporte nutricional y en la diabetes tipo-I también ha sido asociado con varios tipos de cánceres. Por ejemplo, al IGF-I se lo ha implicado como un estimulador del crecimiento autócrino para ciertos tipos de tumores, por ejemplo, células de carcinoma de cáncer de mama humano (Arteaga eí al., 1989. J. Clin. Invest. 84: 14 8-1423) y tumores de pulmón de células pequeñas (Macauley et al., 1990, Cáncer Res.. 50: 2511-2517): Además, el IGF-I, está íntegramente involucrado en la diferenciación y crecimiento normal del sistema nervioso, también parece ser un estimulador autócrino de los gliomas humanos. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cáncer Res. 53: 2475-2478. La importancia de IGF-IR y sus ligandos en la proliferación celular está además sostenida por el hecho de que muchos tipos celulares en cultivo (fibroblastos, células epiteliales, células del músculo liso, linfocitos T, células mieloides, condrocitos y osteoblastos (las células troncales de la médula osea)) son estimuladas a crecer por IGF-I. Goldring y Goldring, 1991 , Eukaryotic Gene Expression, 1 : 301-326. Baserga y Coppola sugieren que el IGF-IR cumple un rol central en el mecanismo de transformación y, como tal, podría ser un blanco preferencial para intervenciones terapéuticas para un amplio espectro de malignidades humanas. Baserga, 1995, Cáncer Res., 55: 249-252, Baserga, 1994, Cell 79: 927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 4588-4595. A las STK se las ha implicado en muchos tipos de cánceres que incluyen, notablemente, cáncer de mama (Cáncer, et al., Int. J. Cáncer, 54: 571-77 (1993)). La asociación entre la actividad anormal de PK y la enfermedad no se restringe al cáncer. Por ejemplo, las RTK han sido asociadas con enfermedades tales como psoriasis, diabetes mellitus, endometriosis, angiogénesis, desarrollo de placas ateromatosas, enfermedad de Alzheimer, restenosis, enfermedad de von Hippel-Lindau, hiperproliferación epidérmica, enfermedades neurodegenerativas, degeneración macular relacionada a la edad y hemangiomas. Por ejemplo, al EGFR se lo ha indicado en la cicatrización de heridas dérmicas y de la córnea. Se indicaron defectos en insulina-R y IGF- R en diabetes mellitus tipo-ll. Una correlación más completa entre RTK específicos y sus indicaciones terapéuticas están divulgados en Plowman et al., 1994, DN&P 7: 334-339. Como se mostró previamente, no solamente las RTK sino también las CTK que incluyen, sin limitaciones, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, Ick, blk, hck, fgr y yrk (revisión de Bolen et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) están involucradas en las rutas de transducción de señales metabólicas y proliferativas, y tal como se podría esperar, y como se ha demostrado, están involucradas en muchos trastornos mediados por PTK a los cuales la presente invención está dirigida. Por ejemplo, se ha demostrado que el src mutado (c-src) es una oncoproteína (pp60v"src) en el pollo. Más aún, su homólogo celular, el proto-oncogen ??d?^0 transmite señales oncogénicas de muchos receptores. La sobre expresión de EGFR o HER2/neu en los tumores conduce a la activación constitutiva de pp60c src, que es característica de las células malignas pero que está ausente en las células normales. Por otra parte, los ratones deficientes en la expresión de c-src muestran un fenotipo osteopetrótico, indicando una participación clave del c-src en la función osteoclástica y una posible participación en los trastornos relacionados. De manera similar, al Zap70 se lo ha implicado en la señalización de las células T que puede relacionarse a los trastornos autoinmunes. Se ha asociado a las STK con trastornos inflamatorios, enfermedad autoinmune, inmunorespuestas, y trastornos de hiperproliferación tales como restenosis, fibrosis, psoriasis, osteoartritis y artritis reumatoidea.

También, las PK ha sido implicadas en implantes embrionarios. De este modo, los compuestos de esta invención pueden proveer un método efectivo para prevenir tales implantes embrionarios y de allí ser útiles como agentes de control de la natalidad. Además, los trastornos que pueden ser tratados o prevenidos utilizando los compuestos de esta invención son los trastornos Inmunológicos tales como enfermedades autoinmunes, SIDA y trastornos cardiovasulares tales como aterosclerosis. Finalmente, se sospecha actualmente que ambos, las RTK y las CTK están involucrados en los trastornos hiperinmunes. Se muestra en el cuadro 2 de más abajo ejemplos del efecto de una cantidad de compuestos de esta invención sobre varias PTK. Los compuestos y los datos presentados han sido elaborados como limitantes del alcance de esta invención en cualquiera de las maneras que estos sean.

Administración y composición farmacéutica Se puede administrar un compuesto de la presente invención o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo como tal a un paciente humano o se lo puede administrar en composiciones farmacéuticas en las que los materiales procedentes están mezclados con vehículos o excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de drogas se pueden encontrar en "Remington's Pharmacological Sciences" (Ciencias farmacológicas de Remington), Mack Publishing Co., Eadton, PA, última edición.

Según se los utiliza en el presente, los términos "administrar" o "administración" se refieren a la administración de un compuesto de la Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo o de una composición farmacéutica que contenga un compuesto de la Fórmula (I) o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo a un organismo con el objeto de prevenir o tratar un desorden relacionado con PK. Las vías de administración adecuadas pueden incluir, sin limitaciones, la administración oral, rectal, transmucosa o intestinal o inyección intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intravítrea, intraperitoneal, intranasal o. Las vías de administración preferidas son la oral y la parenteral. Como alternativa, se puede administrar el compuesto de manera local en vez de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección del compuesto directamente en un tumor sólido, a menudo en una formulación de depósito o de liberación lenta. Además, se puede administrar la droga en un sistema de administración de droga con objetivo, por ejemplo, en un liposoma revestido con un anticuerpo específico para el tumor. Los liposomas tendrán como objetivo el tumor y serán tomados por éste en forma selectiva. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar utilizando procesos bien conocidos en la técnica, por medio de procesos de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, pulverización, emulsionado, encapsulado, entrampado o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente invención se puede formular de manera convencional utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden emplear en el uso farmacéutico. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida. Para la vía inyectable, los compuestos de la presente invención se puede formular en soluciones acuosas, preferiblemente en soluciones tampón compatibles fisiológicamente tales como la solución de Hanks, la solución de Ringer, o una solución tampón salina fisiológica. Para la administración transmucosa, en la formulación se emplean sustancias penetrantes apropiadas para la barrera a traspasar. Estas sustancias penetrantes son generalmente conocidas en la técnica. Para la administración oral, los compuestos se pueden formular combinando los compuestos activos con vehículos aceptables para el uso farmacéutico bien conocido en la técnica. Estos vehículos permiten que los compuestos de la invención se puedan formular en forma de tabletas, pildoras, pastillas, gragea, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pasta aguada, suspensiones y similares, para la ingestión oral por parte del paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden hacer empleando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de agregar otros auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de tabletas o grageas. Los excipientes útiles, en particular, son los rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbltol, preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de papa y otros materiales tales como gelatina, goma tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetil celulosa sódica y/o polivinil pirrolidona (PVP). Si se desea, se puede añadir agentes desintegrantes, tales como polivinil pirrolidona de enlace cruzado, agar o ácido algínico. También se puede usar una sal como alginato de sodio. Los núcleos de grageas se proveen con revestimientos adecuados. Para este fin, se pueden emplear soluciones de azúcar concentradas que contengan, opcionalmente, goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos o mezclas de solventes orgánicos adecuados. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a los revestimientos de tabletas o grageas para su identificación o para caracterizar combinaciones diferentes de dosis del compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas de cierre a presión hechas de gelatina así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastifícante como, por ejemplo, glícerol o sorbitol. Las cápsulas pueden contener los ingredientes activos mezclados con un relleno como, por ejemplo, lactosa, un aglutinante como, por ejemplo, almidón y/o un lubricante como, por ejemplo, talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados como, por ejemplo, aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. En estas formulaciones también se pueden agregar estabilizadores. Las composiciones farmacéuticas que también se pueden usar incluyen cápsulas de gelatina rígida. Como ejemplo no limitante, la cápsula del compuesto activo para vía oral que contiene la formulación del producto droga puede presentarse en potencias de dosis de 50 y 200 mg (Códigos de formulación J-01 1248-AA-OO y J-011248-AA-01 , repectivamente). Estas dos potencias de dosis se hacen con los mismos gránulos llenado con ellos cápsulas de gelatina rígida de diferentes tamaños, tamaño 3 para las cápsulas de 50 mg y tamaño 0 para las cápsulas de 200 mg. La composición de la formulación puede ser, por ejemplo, la que se indica en el cuadro 2.

CUADRO 2 Las cápsulas se pueden envasar en frascos de vidrio o plástico marrón para proteger al compuesto activo de la luz. Los envases que contengan la formulación de la cápsula del compuesto activo se deben almacenar a temperatura ambiente controlada (15-30°C). Para la administración por inhalación, los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se administran bien en forma de aerosol, rocío utilizando un envase presurizado o un nebulizador y un propulsor adecuado, por ejemplo, sin limitaciones, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede controlar proveyendo una válvula para que se libere una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos de gelatina, por ejemplo, para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular de modo que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, como lactosa o almidón. Los compuestos también se pueden formular para su administración por vía parenteral, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases con varias dosis, con el agregado de un conservante. Las composiciones puede tomar forma tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosas, y pueden contener materiales para formulaciones tales como agentes suspensores, estabilizadores yo dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de una forma soluble en agua como, por ejemplo, sin limitaciones, una sal del compuesto activo. Además, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos en el vehículo lipófilo. Los vehículos lipófilos adecuados incluyen a los aceites grasos tales como etil oleato y triglicéridos, o materiales tales como liposomas. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, como la carboximetil celulosa sódica, el sorbitol o el dextrano. Opcionalmente, la suspensión también pueden contener estabilizadores adecuados y/o agentes que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones de alta concentración. Como alternativa, el ingrediente activo también puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, a agua estéril libre de priógenos, antes del uso,. Los compuestos también se pueden formular en composiciones para uso rectal, tales como supositorios o enemas retentivas, utilizando, por ejemplo, bases para supositorios convencionales como manteca de cacao u otros glicéridos. Además de las formulaciones descriptas anteriormente, los compuestos también se pueden formular en preparaciones de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, en forma subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Una compuesto de esta invención se puede formular para esta vía de administración con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, en una emulsión con aceite aceptable para el uso farmacéutico), con resinas de intercambio iónico, o como un derivado escasamente soluble como, por ejemplo, sin limitaciones, sal escasamente soluble. Un ejemplo no limitante de un vehículo farmacéutico para los compuestos hidrofóbicos de la Invención es un sistema cosoivente que comprende alcohol bencílico, un agente tensioactivo no polar, un polímero orgánico mezclable en agua y una fase acuosa como, por ejemplo, el sistema cosoivente VPD. El VPD consiste en una solución de 3% en peso por volumen del alcohol bencílico, 8% en peso por volumen de agente tensioactivo no polar Polisorbato 80, y 65 % en peso por volumen e polietilenglicol 300, completada hasta el volumen en etanol absoluto. El sistema cosoivente VPD (VPD: D5W) consiste de VPD diluido 1 :1 con una solución de 5% de dextrosa en agua. Este sistema cosoivente disuelve bien los compuestos hidrofóbicos, y el mismo produce baja toxicidad luego de la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de este sistema cosoivente se pueden variar considerablemente sin destruir sus características de solubilidad toxicidad. Además, se puede variar la identidad de los componentes del cosoivente: por ejemplo, se pueden usar otros agentes tensioactivos no polares de baja toxicidad en lugar de Polisorbato 80, se puede variar el tamaño de la fracción de polietilenglicol, otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, la polivinil pirrolidona, y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.

Como alternativa, se pueden emplear otros sistemas de suministro para los compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro de drogas hidrofóbicas. Además, se pueden utilizar ciertos solventes orgánicos tales como el dimetilsulfóxido, aunque a menudo a costa de una mayor toxicidad. Además, los compuestos se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación sostenida, como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan el agente terapéutico. Se han establecidos diversos materiales de liberación sostenida, los que son bien conocidos para los expertos en la técnica. Según su naturaleza química, las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar los compuestos desde durante unas pocas semanas hasta durante más de 100 días. Según la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear otras estrategias adicionales para la estabilización de proteínas. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender vehículos o excipientes de fase sólida o gel adecuados. Son ejemplos no limitativos de tales vehículos o excipientes el carbonato de calcio, el fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles. Muchos de los compuestos moduladores de la PK de la invención se pueden proporcionar en forma de sales fisiológicamente aceptables donde el compuesto reivindicado puede formar la especie con carga negativa o positiva. Son ejemplo no limitativos de sales en las que el compuesto forma la porción con carga positiva el amonio cuaternario (definido en otra parte de la presente), sales tales como clorhidrato, sulfato, carbonato, lactato, tartrato, malato, maleato, succinato, donde el átomo de nitrógeno del grupo amonio cuaternario es un nitrógeno del compuesto seleccionado de esta invención que ha reaccionado con el ácido apropiado. Las sales en las que un compuesto de esta invención forma la especie con carga negativa incluyen, sin limitaciones, las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio formadas por la reacción de un grupo ácido carboxílico en el compuesto con una base apropiada (por ejemplo, hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de calcio (Ca(OH)2), etcétera). Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen composiciones donde el contenido de ingredientes activos representa una cantidad suficiente para lograr el objetivo propuesto, por ejemplo, la modulación de la actividad de la PK o el tratamiento o la prevención de un desorden relacionado con la PK. Más específicamente, una cantidad efectiva para el uso terapéutico significa una cantidad del compuesto efectiva para prevenir, aliviar o mejorar síntomas de enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto bajo tratamiento. La determinación de una cantidad efectiva para el uso terapéutico se encuentra dentro de los conocimientos aquellos entrenados en la técnica, especialmente a la luz de la divulgación detallada que se brinda en la presente. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos de la invención, la cantidad o dosis efectiva para el uso terapéutico se puede estimar inicialmente a partir de los ensayos de cultivos de células. Luego, se puede formular la dosificación para usar en modelos animales de manera de lograr un rango de concentración circulante que incluye la IC50 determinada en el cultivo de células (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media máxima de la actividad de la PK). Luego esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles para seres humanos. La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos descriptos en la presente se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, determinando la IC5o y la LD50 (ambas fueron comentadas anteriormente en la presente) respecto de un compuesto sujeto. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivos de células y estudios sobre animales se pueden usar para formular un rango de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación, vía de administración y dosificación exactas las puede elegir cada médico individualmente teniendo en cuenta el estado del paciente (Ver, por ejemplo, Fingí y col., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics" (La base farmacológica de la terapéutica), capítulo 1 , página 1 ). La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma de la especie activa que sean suficientes para mantener los efectos moduladores de la cinasa. Estos niveles en plasmas se denominan concentraciones efectivas mínimas (MEC).

La MEC variará respecto de cada compuesto pero se la puede estimar a partir de los datos in vitro, por ejemplo la concentración necesaria para lograr un 50- 90% de inhibición de una cinasa se puede determinar utilizando los ensayos descriptos en la presente. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerá de las características individuales y la vía de administración. Se pueden usar ensayos HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones en plasma. Los intervalos de dosificación también se pueden determinar utilizando el valor de la MEC. Los compuestos se deben administrar usando un régimen que mantenga los niveles en plasma por encima de la MEC durante el 10-90% del tiempo, preferiblemente entre el 30-90% del tiempo y, más preferiblemente, entre el 50 y el 90% del tiempo. En la actualidad, las cantidades efectivas para el uso terapéutico de lo compuestos de la Fórmula (I) pueden oscilar entre aproximadamente 25 mg/m2 y 1500 mg/m2 por día; preferiblemente, aproximadamente 3 mg/m2/día.

Aún más preferiblemente 50 mg/gm qd hasta 400 mg/qd.

En casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local efectiva de la droga puede no estar relacionada con la concentración en plasma y se pueden emplear otros procedimientos conocidos en la técnica para determinar la cantidad e intervalo de dosificación correctos. La cantidad de una composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto bajo tratamiento, la gravedad de su afección, la forma de administración, el criterio del médico que la prescriba, etc. Si se desea, las composiciones se pueden presentar en un paquete o dispositivo expendedor, tal como un equipo aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contengan el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, papel metálico o plástico, como un envase tipo "blister". El paquete o dispositivo expendedor puede venir acompañado por instrucciones para la administración. El paquete o expendedor también puede venir acompañado por instrucciones para la administración. El paquete o dispositivo expendedor también puede venir acompañado de una advertencia relacionada con el envase en una forma prescripta por una agencia gubernamental que regule la fabricación el uso o venta de productos farmacéuticos, advertencia ésta que reflejará la aprobación por parte de esa agencia de la forma de las composiciones o la administración a seres humanos o uso veterinario. Esta advertencia, por ejemplo, puede ser el etiquetado aprobado por la Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos para las drogas de venta con receta o la inserción de una leyenda de producto aprobado. También se pueden preparar composiciones que comprenden un compuesto de la invención formuladas en un vehículo farmacéutico compatible, colocadas en un envase apropiado, y rotuladas para el tratamiento de un estado indicado. Los estados adecuados indicados en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un tumor, la inhibición de la angiogenesis, el tratamiento de fibrosis, diabetes y similares. La presente invención puede también administrarse con un vehículo de suspensión C, se indica a continuación en el cuadro 3 una suspensión CMC ejemplar.

CUADRO 3 * Depende de la concentración (fecha) requerida.

Un protocolo para un vehículo de suspensión de 1.0 litros de CMC es como sigue. Se calcula la cantidad apropiada de excipientes requeridos para preparar la formulación de vehículo usando el cuadro que muestra la composición de la formulación de vehículo y el tamaño del lote. Se pesa un contenedor vacío adecuado, tal como una botella limpia de vidrio de boca ancha, o una botella de polietileno. Se agregan aproximadamente 600 mi de agua al contenedor. Se pesa carboximetilcelulosa de sodio (5 g) y se transfiere al contenedor. Se agita usando una barra de agitación magnética o un agitador de laboratorio con una hélice hasta que se torna homogéneo (aproximadamente 2-3 horas). Se pesa NACI y se agrega al contenedor. Se continúa mezclando hasta que se disuelve (aproximadamente 10 minutos). Se agrega polisorbato 80. Se mezcla hasta que la solución es homogénea (aproximadamente 10 minutos). Se agrega el agua restante para llevar el peso de la solución hasta el tamaño de lote requerido, ya sea por peso o por volumen (1010 g o 100 mi, la densidad a 22°C es 1.01). Se almacena a 2-8°C (con refrigeración). La formulación de la suspensión puede fabricarse como sigue. Se muele el APT usando un mortero y un martillo para obtener un polvo de apariencia homogénea con un tamaño pequeño de partícula (sin grumos o grandes particulados -idealmente debería pasar de un filtro estándar de los EE.UU. >80, es decir, >180 pm). Se pesa la cantidad calculada de API en el contenedor. Se agrega aproximadamente 90% de la cantidad total requerida de (vehículo de suspensión CMC) en el contenedor. Se suspenden los compuestos en el vehículo usando un agitador de laboratorio con hélice o equivalente. El diámetro de las hojas de la hélice debería coincidir con el diámetro del fondo del contenedor para asegurar una mezcla eficiente. Se agita a 50 rpm por 30 minutos hasta que la droga esta bien suspendida. Se agrega la formulación vehículo "hasta completar" (se completa con agua) (calidad suficiente) el peso apropiado correspondiente al tamaño del lote. Se agita a 50 rpm por otros 30 minutos. Se alícuota la suspensión inmediatamente en un vidrio color ámbar o en un contenedor de polipropileno. Los contenedores deberían protegerse de la luz. Se agita a 2-8°C (bajo refrigeración, sin congelar). También es un aspecto de la invención que un compuesto descripto en la presente, o su sal o prodroga, se podría combinar con otros agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de las enfermedades y desórdenes comentados más arriba. Por ejemplo, se podría combinar un compuesto, sal o prodroga de esta invención con agentes alquilantes tales como el fluorouracilo (5-FU) solo combinado con luecovorina; u otros agentes alquilantes tales como, sin limitaciones, otros análogos de pirimidina, como el UFT, la capecitabina, la gemcitabina y la citarabina, los alquil-sulfonatos, por ejemplo, el busulfonato (utilizado en el tratamiento de la leucemia granulocítica crónica) el improsulfano y el piposulfano; las aziridmas, por ejemplo, la benzodepa, la carbocuona, la meturedepa y la uredepa; etileniminas y metilmelaminas, por ejemplo, la altretamina, la trietilenmelamina, la trietilenfosforamida, la trietilentiofosforamida y la trimetilolmelamina; y las mostazas de nitrógeno, por ejemplo, el clorambucilo (usado en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica, la macroglobulinemia primaria y el linfoma no Hodgkin), la ciclofosfamida (empleada en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, el mieloma múltiple, el neuroblastoma, el cáncer de mama, el cáncer ovárico, el cáncer de pulmón, el tumor de Wilm y el rabdomiosarcoma), la estramustina, la isosfamida, la novembriquina, la prednimustina y la mostaza de uracilo (utilizada en el tratamiento de la trombocitosis primaria, el linfoma no de Hodgkin, la enfermedad de Hodgkin y el cáncer ovárico); y las triazinas, por ejemplo, la decarbazina (usada en el tratamiento del sarcoma de los tejidos blandos). Se puede usar un compuesto, sal o prodroga de esta invención en combinación con otros agentes quimioterapéuticos antimetabolíticos tales como, sin limitaciones, los análogos del ácido fólico, por ejemplo, el metotrexato (usado en el tratamiento de la leucemia linfocítica aguda, el coriocarcinoma, la micosis fungioides, el cáncer de mama, el cáncer de cabeza y cuello y el sarcoma osteogénico) y la pteropterina; y los análogos de purina tales como la mercaptopurina y la tioguanina que encuentran uso en el tratamiento de las leucemias granulocitica aguda, linfocítica aguda y granulocitica crónica. Se contempla que un compuesto, sal o prodroga de esta invención también se puede usar en combinación con productos quimioterapéuticos basados en productos naturales tales como, sin limitaciones, los alcaloides de vinca, por ejemplo, la vinblastina (usada en el tratamiento del cáncer de mama y de testículos), la vincristina y la vindestina; las epipodofilotoxinas, por ejemplo, la etoposida y la teniposida, siendo las dos útiles en el tratamiento del cáncer de testículos y el sarcoma de Kaposi; los agentes quimioterapéuticos antibióticos, por ejemplo, la daunorubicina, la doxirubicina, la epirubicina, la mitomiclna (usada para tratar el cáncer de estómago, del cuello del útero, de colon, de mama, de vejiga y de páncreas), la dactinomicina, la temozolomida, la plicamicina, la bleomicina (usada en el tratamiento del cáncer de piel, esófago y del tacto genitourinario); y los agentes quimioterapéuticos enzimáticos tales como la L-asparraginasa. Además de lo antedicho, un compuesto, sal o prodroga de esta invención también se podría usar en combinación con los complejos de coordinación de platino (cisplatino, etc.); ureas sustituidas tales como hidroxiurea; derivados de metilhidrazina, por ejemplo, procarbazina; supresores adrenocorticales, por ejemplo, mitotano, aminoglutetimida, y hormonas y antagonistas hormonales tales como los adrenocorticoesteroides (por ejemplo, prednisona), progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona); estrógenos (por ejemplo, dietilestilbestrol), antiestrógenos tales como tamoxifeno; andrógenos, por ejemplo, propionato de testosterona; e inhibidores de la aromatasa tales como el anastrozol. Por último, también se contempla que la combinación de un compuesto de esta invención será efectiva en combinación con mitoxantrona, paclitaxel, inhibidores de la ciclooxigenasa-2 conocidos en la técnica, en particular Celebrex®, Paracoxib®, Vioxx®, Cox-189 de Abbott, descripto en la Publicación PCR N°WO 99/1 1605, inhibidores de la topoisomerasa tales como Camptosar®, agonistas del receptor Her-2 tales como Herceptin®, endostatina, Gleevac®, el agonista del receptor de VEGF de ImClone IMC C225® para el tratamiento de cánceres tumorales sólidos o leucemias tales como, son limitaciones, la leucemia mielogenosa aguda (no linfocítica).

PROCEDIMIENTOS GENERALES DE SÍNTESIS Se puede emplear la siguiente metodología general de síntesis para preparar los compuestos de la presente invención: El 2-oxindol apropiadamente sustituido (1 equivalente), el aldehido apropiadamente sustituido (1 , 2 equivalentes) y una base (0, 1 equivalentes) se mezclan en un solvente (1-2 ml/mmoles 2-oxindol) y la mezcla luego se calienta durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 12 horas. Después de enfriar, el precipitado que se forma se filtra, se lava con etanol o éter frío y se seca al vacío para dar el correspondiente ácido 5-(2-oxo-1 , 2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetil)-2-H-pirrol-2-carboxílico. Si no se forma un precipitado, la mezcla de reacción se concentra y el residuo se tritura con diclorometano/éter, el sólido resultante se recolecta por filtración y luego se seca. El producto opcionalmente se puede seguir purificando por cromatografía. La base puede ser una base orgánica e inorgánica. Si se utiliza una base orgánica, preferiblemente es una base nitrogenada. Entre los ejemplos de bases orgánicas nitrogenadas se incluyen, sin limitaciones, diisopropilamina, trimetilamina, trietilamina, anilina, piridina, 1 , 8-diazabicilo[5.4.1]undec-7-eno, pirrolidina y piperidina.

Entre los ejemplos de bases inorgánicas se pueden mencionar, por ejemplo, amoníaco, hidróxidos de metal alcalino o alcalino-térreo, fosfatos, carbonatos, bisulfatos y amidas. Los metales alcalinos incluyen, litio, sodio y potasio mientras que las tierras alcalinas incluyen calcio, magnesio y bario. En una modalidad actualmente preferida de esta invención, cuando el solvente es un solvente prótico, tal como agua o alcohol, la base es una base inorgánica de metal alcalino o alcalino térreo, preferiblemente, un hidróxido de metal alcalino o alcalino-térreo. Será evidente para los conocedores de la materia, en base a los principios generales de la síntesis orgánica conocidos así como en base a la presente descripción, cuál base sería la más apropiada para la reacción que se contemple. El solvente en el cual se realiza la reacción puede ser un solvente prótico o aprótico, preferiblemente es un solvente prótico. Un "solvente prótico" es un solvente que tiene un o más átomo(s) de hidrógeno átomo(s) unido en forma covalente a átomos de oxígeno o nitrógeno que hace que los átomos de hidrógeno sean apreciablemente ácidos y por lo tanto capaces de ser "compartidos" con un soluto a través de una unión de hidrógeno. Entre los ejemplos de solventes próticos se incluyen, sin limitaciones, agua y alcoholes. Un "solvente aprótico" puede ser polar o non-polar pero, en cualquiera de los casos, no contiene hidrógenos ácidos y por lo tanto no es capaz de unirse a través de hidrógeno con los solutos. Algunos ejemplos no limitativos de solventes apróticos no polares son pentano, hexano, benceno, tolueno, cloruro de metileno y tetracloruro de carbono. Ejemplos de solventes polares apróticos son cloroformo, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido y dimetilformamida. Es una modalidad actualmente preferida de esta invención, el solvente es un solvente prótico, preferiblemente agua, o un alcohol tal como etanol. La reacción se conduce a temperaturas superiores que la temperatura ambiente. La temperatura generalmente es entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 150°C, preferiblemente entre aproximadamente 80°C y aproximadamente 00°C, más preferiblemente entre aproximadamente 75°C y aproximadamente 85°C, que es aproximadamente el punto de ebullición del etanol. Por "aproximadamente" se entiende que el rango de temperatura es preferiblemente dentro de los 0 grados Celcius e la temperatura indicada, más preferiblemente dentro de los 5 grados Celcius de la temperatura indicada y, más preferiblemente, dentro de los 2 grados Celcius de la temperatura indicada. Por lo tanto, por ejemplo, por "aproximadamente 75°C" se indica 75°C + 10°C, preferiblemente 75°C ± 5°C y más preferiblemente, 75°C ± 2°C. Los 2-Oxindoles y los 3-carboxi-5-formopirroles se pueden sintetizar rápidamente usando procedimientos bien conocidos en la técnica química, usando materiales iniciales fácilmente disponibles.

La unión del ácido 5-(2-oxo-1 , 2-dihidro¡ndol-(3Z)-ilidenmetil)-2-H-pirrol-2-carboxílico con una amina de fórmula -ZCH(R5)-CR4(OH)-CHR3NH2 en un solvente orgánico tal como dimetilformamida, tetrahidrofurano y semejantes, y en presencia de un agente de unión adecuado tal como iciclohexilcarbodiimida, DEAD, EDC y HOBt brinda luego un compuesto de fóormula (I). La aminas de fórmula -ZCH(R5)-CR4(OH)-CHR3NH2 están disponibles comercialmente o pueden prepararse por métodos bien conocidos en la técnica. Algunos de tales procedimientos se describen a continuación en la presente documentación. Aquellos entrenados en la técnica apreciarán que se pueden utilizar otras vías de síntesis para formar los compuesñtos dé la invención y que los siguientes se ofrecen solamente a modo de ejemplos y no como limitación.

EJEMPLOS Las siguientes preparaciones y ejemplos se presentan para posibilitar la comprensión y puesta en práctica de la presente invención por parte de aquellos entrenados en la técnica. No deben ser considerados como una limitación de su alcance, sino meramente como ilustrativos y representativos de la misma.

EJEMPLOS DE SINTESIS EJEMPLO 1 Síntesis del ácido 5-r5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-¡lideno-metin- 2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico Paso 1 Se enfría dimetilformamida (25 mi, 3eq.)con agitación en un baño de hielo, al cual se agrega POCI3 (1.1 eq., 10.8 mi). Luego de 30 minutos, una solución del 3-5-dimetil-4-etilester pirrol (17.7 g, 105.8 mmoles) en DMA (2M, 40 mi) se agrega a la mezcla de reacción y se continúa la agitación. Luego de 2 horas, la reacción se diluye con agua (250 mi) y se hace básica a pH=11 con NaOH acuoso 1 N. El sólido blanco se elimina por filtración, se enjuaga con agua y luego hexanos y se seca para rendir éster etílico del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (19.75 g, 95%) como un sólido pardo. 1H RMN (360MHz, DMSO-d6) d 12.11 (br s, 1 H, NH), 9.59 (s, 1 H, CHO), 4.17 (q, J=6.7Hz, 2H, OCH2CH3), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.40 (s, 3H, CH3), 1.26 (d, J=6.7Hz, 3H, OCH2CH3).

Paso 2 Se agrega éster etílico del ácido 5-formil-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (2 g, 10 mmoles) a una solución de hidróxido de potasio (3g, 53 mmoles) disuelto en metanoh (3ml) y agua (10 mi). La mezcla se reflu ía durante 3 horas, se enfría a temperatura ambiente y se acidifica con ácido clorhídrico 6N hasta pH 3. El sólido se recoge por filtración, se lava con agua y se seca en un horno de vacío durante toda la noche para dar ácido 5-formil-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (1.6g, 93%). 1H RMN (300MHz, DMSO-d6) d 12.09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9.59 (s, 1 H, CHO), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.40 (s, 3H, CH3).

Paso 3 Se disuelve 5-Fluoroisatina (8.2g, 49.7 mmoles) en 50 mi de hidrato de hidracina y se refluja durante 1 hora. Luego se vierte la mezcla de reacción en agua y hielo. Luego se filtra el precipitado, se lava con agua y se seca en horno de vacío para dar 5-fluoro-2-oxindol (7.5g).

Paso 4 Se agita la mezcla de reacción de 5-florooxindol (100mg, 0.66 mmoles), ácido 5-formil-2,4-d¡metil-1 H-pirrol-3-carboxíl¡co (133mg, 0.79 mmoles), y 10 gotas de piperidina en etanol (3ml) a 60°C durante toda la noche y se filtra. El sólido se lava con solución acuosa 1M de clorhidrato, agua y se seca para rendir ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-d¡hidro-indoI-3-ilideometil)-2,4-dimet¡l-1 H-pirrol-3-carboxílico (201 mg, cuantitativo) como un sólido amarillo. MS m/z (intensidad relativa, %) 299 ((M-1 )*, 100).

EJEMPLO 2 Síntesis de (3-dietilamino-2-h¡droxi-propil)-am¡da del ácido 5-(5-fluoro-2- oxo-1 l2-dihidro-indol-3-ilideno-metil)-2,4-dimetil-1 H-pírrol-3-carboxílico Paso 1 Al 2-clorometilox¡rano (95 g, 1.03 moles) se le agrega una mezcla de agua (3.08 g, 0.17 moles) y dietilamina (106.2 mi, 1.03 moles) a 30°C. La mezcla de reacción, luego se agita a 28-35°C durante 6 horas y se enfría a 20-25°C para dar 1-cloro-3-dietilamino-propan-2-ol.

Paso 2 A una solución de hidróxldo de sodio (47.9 g, 1.2 moles) en 78 mi de agua se le agrega 1-cloro-3-dietilamino-propan-2-ol. El resultante se agita a 20-25°C durante 1 hora, se diluye con 178 mi de agua y se extrae dos veces con éter. La solución etérea combinada se seca con hidróxido de potasio sólido y se evapora para dar 135 g de producto crudo que se purifica por destilación fraccionada para dar glicidildietilamina pura (98 g, 76%) como un aceite.

Paso 3 A la solución de hidróxido de amonio enfriada con hielo (25 mi, 159 mmoles) de 25% (p/p) se agrega glicidildietilamina gota a gota (3.2 g, 24.8 mmoles) durante 10 minutos. La mezcla de reacción se agita a 0-5°C durante 1 hora y luego a temperatura ambiente durante 14 horas. Se evapora la mezcla de reacción resultante y destila (84-90°C a 500-600 mT) para rendir 1-amino-3-dietilamino-propan-2-ol (3.3 g, 92%). MS m/z 147 ([M+1]+).

Paso 4 A la solución de ácido 5-formil-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (100 mg, 0.43 mmoles), EDC (122.7 mg, 0.64 mmoles) en 1.0 mi de DMF se agrega 1-amino-3-dietilamino-propan-2-ol (93.2 mg, 0.64 mmoles). La solución de reacción resultante se agita a temperatura ambiente durante toda la noche y se evapora. El residuo se suspende en 10 mi de agua y se filtra. El sólido se lava con bicarbonato de sodio saturado y agua y se seca en un horno de alto vacío durante toda la noche para dar producto crudo que se purifica mediante cromatografía en columna eluyendo con metanol-diclorometano al 6% que contiene trietilamina (2 gotas/100 mi de 6% metanol diclorometano) para dar (3-dietilamino-2-hidroxipropil)-amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxilico (62 mg, 34% como un sólido amarillo.

H RMN (400MHz, DMSO-d6) d 13.70 (s, 1 H, NH-1 '), 10.90 (s, 1 H, NH-1 )m 7.76 (dd, J=2.38, 9.33Hz, 1 H, H-4), 7.72 (s, 1 H, vinil-H), 7.60 (m, br, 1 H, CONHCH2CH(OH)-CH2N(C2H5)2-4'), 6.93 (dt, J=2.38, 8.99Hz, 1 H, H-5), 6.85 (dd, J=4.55, 8.99Hz, 1 H, H-6), 3.83 (m, br, 1 H, OH), 3.33 (m, 4H), 2.67 (m, br, 5H), 2.46 (s, 3H, CH3), 2.44 (s, 3H, CH3), 1.04 (m, br, 6H, CH3x2). MS m/z (intensidad relativa, %) 427 ([?+1]+·, 100).

EJEMPLO 3 Síntesis de (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida del ácido 5-r5-fluoro-2- oxo-1 ,2-dihidro-indol-f3Z)-ilideno-metií1-2,4-dimet¡l-1H-pirrol-3- carboxílico Paso 1 Se agita una mezcla de morfolina (2.6 mi, 30 mmoles) y epicloroh'idrina 2.35 mi, 30 mmoles) en etanol (50 mi) a 70°C durante toda la noche. Luego de eliminar el solvente, se diluye el residuo con cloruro de metileno (50 mi). El sólido claro que precipita se recoge mediante filtración al vacío para dar 1-cloro-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (2.0 g, 37%). 1H RMN (DMSO-d6) d 3.49 (t, J=4.8Hz, 2H), 3.60 (t, J=4.6Hz, 2H), 3.75 (m, 4H, 2xCH2), 4.20 (dd, J=5.2, 12Hz, 2H), 4.54 (m, 2H), 4.62 (m, 1 H, CH), 6.64 (d, J=6.4Hz, 1 H, OH). MS m/z 180.2 (M+1 ).

Paso 2 Se trata 1-cloro-3-morfol¡n-4-¡l-propan-2-ol (2.0 g, 11 mmoles) con la solución de NH3 en metanol (25% en peso, 20 mi) a temperatura ambiente. Se burbujea nitrógeno en la mezcla de reacción para eliminar el amoniaco. La evaporación del solvente de la sal clorhidrato de 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (2.0 g, 91%). 1H R N (DMSO-d6) d 2.30 (d, J=6.0HZ, 2H), 2.36 (m, 4H, NCH2), 2.65 (dd, J=8.4, 12.8Hz, 1 H), 2.91 (dd, J=3.6, 12.8Hz, 1H), 3.52 (m, 4H, OCH2), 3.87 (m, 1H, CH), 5.32 (s, 1H, OH), 8.02 (brs., 3H, NH3+). MS m/z 161 (M+1).

Paso 3 Se condensa ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-9-carboxilico (120 mg, 0.4 mmoles) con 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (74 mg, 0.48 mmoles) para precipitar (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida del ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (65 mg, 36%). Las aguas madres se evaporan a sequedad y el residuo se purifica mediante cromatografía en flash para dar 2N adicional (70 mg, 39%). 1H RMN (DMSO-d6) d 2.28 (m, 1H), 2.32 (m, 1 H), 2.40 (m, 4H), 2.40-2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1H), 3.31 (m, 1 H), 3.55 (m, 4H), 3.78 (m, 1H), 4.73 (brs, 1H, OH), 6.82 (dd, J=4.5 8.4Hz, 1 H), 6.90 (td, 2J=2.8, 3J=10.0Hz, 1 H), 7.53 (m, 1 H), 7.70 (s, 1 H), 7.74 (dd, J=2.0 9.6Hz, 1H) (aromático y vinílico), 10.87 (s, 1 H, CONH), 13.66 (s, 1 H, NH). LC-MS (m/z) 441.4 (M-1 ).

Síntesis de cloruro de 2-h¡droxi-7-oxa-4-azoniaspiror3.51nonano Se cargan morfolina (91.5 g, 91.5 mi, 1.05 moles, 1.0 eq.) y 100 mi de etanol en un balón de 3 bocas de 1 litro, equipado con una termocupla, entrada de nitrógeno y un embudo de adiciones de 250 mi. La solución se agita rápidamente mientras se agrega epiclorohidrina (100 g, 84.5 mi, 1.08 moles, 1.03 eq.) desde la ampolla de decantación durante aproximadamente 30 minutos. Se monitorea la temperatura y cuando la temperatura del recipiente alcanza los 27°C, se enfría la reacción con un baño de agua y hielo. La solución clara se agita durante 18. horas. La reacción ensayada mediante CG (se diluyen 5 gotas de mezcla de reacción en 1 mi de etanol y se inyecta en una columna capilar de CG DB-5 de 15 m con los siguientes parámetros de corrida, inyector 250CC, detector 250°C, temperatura inicial del horno 28°C calentado hasta 250°C a 10°C por minuto). La reacción se termina con un remanente de morfolina menor del 3%. Se concentra la mezcla de reacción en el rotoevaporador a 50°C a capacidad completa de vacío hasta que no se puede condensar más destilado. El aceite resultante se almacena a temperatura ambiente durante 24-48 horas o hasta que se observa una masa significativa de cristales (la siembra acelerará el proceso). La suspensión se diluye con 250 mi de acetona y se filtra. Los sólidos se secan en el horno de vacío a 60°C durante 18-24 horas. Esto proporciona 84 g de producto cristalino. Se pueden concentrar las aguas madres y repetir el proceso de cristalización para aumentar la recuperación. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) d 6.55 (d, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.53 (m, 2H), 4.18 (m, 2H), 3.74 (m, 4H), 3.60 (m, 2H), 3.48 (m, 2H). 13C RMN (100MHz, DMSO-d6) d 70.9, 61.39, 61.04, 60.25, 58.54, 57.80.

Síntesis de 1-amino-3-(4-morfolinil)-2-propanol (Racémico) Se carga cloruro de 2-hidroxi-7-oxa-4-azoniaspiro[3.5]nonano (150 g, 835 mmoles) en un balón de 3 bocas de 1 litro equipado con una barra de agitador magnético seguido de amoniaco anhidro en metanol 23% en peso (2120 mi). Se tapona el recipiente y la solución clara resultante se agitan a 20-23°C durante 18 horas. La CG bajo las condiciones anteriormente mencionadas no muestra remanente de materia prima. Se saca el tapón y se deja que el amoniaco escape burbujeando de la solución durante 30 minutos.

Luego se transfiere el recipiente a un rotoevaporador y se concentra para dar un sólido blanco con un baño a 45°C a capacidad completa de vacío. 1H R N (400MHz, DMSO-d6) d 3.57 (dd, 2H), 3.3-3.5, (m, 6H), 2.59 (m, 2H), 2.2-2.4 (m, 6H). 13C RMN (100MHz, DMSO-d6) d 70.8, 67.1 , 60.1 , 53.8, 48.1. Siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 3 mencionado anteriormente pero sustituyendo el 2-(RS)-1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol por 2-(S)-1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol preparado según se describe a continuación se obtiene el compuesto deseado (2-(3)-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil) amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-i!idenometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico.

Síntesis de 1-amino-3-(4-morfolinil)-2-propanol (no racémico) Se cargan morfolina (91.5 g, 91.5 mi, 1.05 moles, 1.0 eq.) y 45 mi de t-butanol en un balón de 3 bocas de 1 litro, equipado con agitación mecánica, termocupla y ampolla de decantación. La solución se agita rápidamente mientras se agrega R-epiclorohidrina (100 g, 84.5 mi, 1.08 moles, 1.03 eq.) desde la ampolla de decantación durante aproximadamente 30 minutos. Se monitorea la temperatura y cuando la temperatura del recipiente alcanza los 27°C, se enfría la reacción con un baño de agua y hielo. La solución clara se agita durante 18 horas. La reacción ensayada mediante CG (se diluyen 5 gotas de mezcla de reacción en 1 mi de etanol y se inyecta en una columna capilar de CG DB-5 de 15 m con los siguientes parámetros de corrida: inyector 250°C, detector 250°C, temperatura inicial del horno 28°C y calentamiento hasta 250°C a 0°C por minuto). La reacción se termina con un remanente de morfolina menor del 3%. La solución se enfría a 10°C y se agrega gota a gota una solución de t-butóxido de potasio 20% en peso en THF (576 g) manteniendo la temperatura a menos de 15°C. La suspensión blanca resultante se agita a 10-15°C durante 2 horas y se controla mediante CG usando las condiciones mencionadas anteriormente. No se puede observar nada de la clorohidrina. La mezcla se concentra en el rotoevaporador usando un baño a 50°C y capacidad completa de vacío. La mezcla resultante se diluye con agua (500 mi) y cloruro de metileno. Las fases se separan y se lava la fase acuosa con cloruro de metileno (500 mi). Se secan las fases orgánicas combinadas sobre sulfato de sodio y se concentra para dar un aceite claro, incoloro. Esto proporciona 95 g, un rendimiento del 97% de epóxido. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) d 3.3 (dd, 4H), 3.1 (m, 1 H), 2.6 (dd, H), 2.5 (dd, 1 H), 2.4 (m, 4H), 2.2 (dd, 2H). 13C RMN (100MHz, DMSO-d6) d 65.4, 60.1 , 53.1 , 48.9, 43.4. Se carga el epóxido crudo mencionado anteriormente en un balón de una boca de 3 I con una barra de agitador magnético. Se agrega amoníaco anhidro en metanol (24% p/p 2.5 I), se tapona el recipiente y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 24 horas. La CG bajo las condiciones anteriormente mencionadas no muestra remanente de materia prima. Se saca el tapón y se deja escapar el amoníaco de la solución por burbujeo durante 30 minutos. Luego se transfiere el recipiente a un rotoevaporador y se concentra para dar un aceite claro incoloro con un baño a 45°C y capacidad completa de vacío. Esto proporciona 124 g de producto. 1H RMN (400MHz, DMSO-d6) d 3.57 (dd, 2H), 3.3-3.5 (m, 6H), 2.59 (m, 2H), 2.2-2.4 (m, 6H). 3C RMN (100MHz, DMSO-d6) d 70.8, 67.1 , 60.1 , 53.8, 48.1.

Síntesis de 1-amino-3-(4-morfolinil)-2-(S)-propanol Se cargan morfolina (91.5 g, 91.5 mi, 1.05 moles, 1.0 eq.) y 200 mi de metanol en un balón de 3 bocas de 1 litro, equipado con agitación mecánica, termocupla y ampolla de decantación. La solución se agita rápidamente mientras se agrega R-epiclorohidrina (100 g, 84.5 mi, 1.08 moles, 1.03 eq.) desde la ampolla de decantación durante aproximadamente 30 minutos. Se monitores la temperatura y cuando la temperatura del recipiente alcanza los 27°C, se enfría la reacción con un baño de agua y hielo. La solución clara se agita durante 10 horas. La reacción ensayada mediante CG (se diluyen 5 gotas de mezcla de reacción en 1 mi de etanol y se inyecta en una columna capilar de CG DB-5 de 15 m con los siguientes parámetros de corrida, inyector 250°Cm detector 250°C, temperatura inicial del horno 28°C y calentamiento hasta 250°C a 10°C por minuto). La reacción se termina con un remanente de morfolina menor del 3%. La solución se enfría a 10°C y se agrega gota a gota una solución de metóxido de sodio en metano! al 25% en peso (233 g, 1.06 moles, 247 mi) manteniendo la temperatura a menos de 15°C. La suspensión blanca resultante se agita a 10-15°C durante 2 horas y se controla mediante CG usando las condiciones mencionadas anteriormente. No se puede observar nada de la clorohidrina. La mezcla se concentra en el rotoevaporador usando un baño a 50°C y capacidad completa de vacío. La mezcla resultante se diluye con agua (500 mi) y cloruro de metileno. Se separan las fases, y la fase acuosa se lava con cloruro de metileno (500 mi). Las fases orgánicas combinadas se secan sobre sulfato de sodio y se concentran para dar un aceite claro, incoloro. Esto proporciona 145 g, 97% rendimiento de 1 ,2-epoxi-3-morfolin-4-ilpropano. H RMN (400MHz, DMSO-d6) d 3.3 (dd, 4H), 3.1 (m, 1 H), 2.6 (dd, 1 H), 2.5 (dd, 1 H), 2.4 (m, 4H), 2.2 (dd, 2H). 3C RMN (100MHz, DMSO-d6) d 65.4, 60.1 , 53.1 , 48.9, 43.4. El 1 ,2-epoxi-3-morfolin-4-ilpropano crudo mencionado anteriormente se carga en un balón de una boca de 3 I con una barra de agitador magnético. Se agrega amoniaco anhidro en metanol (24% p/p 2.5 I), se tapona el recipiente y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 24 horas. La CG bajo las condiciones anteriormente mencionadas no muestra remanente de materia prima. Se saca el tapón y se deja escapar el amoniaco de la solución por burbujeo durante 30 minutos. Luego se transfiere el recipiente a un rotoevaporador y se concentra para dar un aceite claro incoloro con un baño a 45°C y capacidad completa de vacío. Esto proporciona 124 g de 1-am¡no-3-(4-morfolinil)-2-(S)-propanol. H RMN (400MHz, DMSO-d6) d 3.57 (dd, 2H), 3.3-3.5 (m, 6H), 2.59 (m. 2H), 2.2-2.4 (m. 6H). 3C RMN (100MHz, DMSO-d6) d 70.8, 67.1 , 60.1, 53.8, 48.1.

Se mezclan imidazol amida (7.0 g, 32.3 mmoles), amina (15.0 g, 64.6 mmoles), 5-fluorooxindol (4.93 g, 32.6 mmoles), trietilamina (9.79 g, 96.9 mmoles), y THF (88 mi) y se calientan a 60°C. Se forma una solución marrón. Luego se agita durante 24 horas a 60°C, se enfría la suspensión amarilla a temp. amb. (temperatura ambiente) y se filtra. Se lava la torta con 80 mi de THF y se seca durante toda la noche a 50°C bajo campana de vacío. Se obtiene un sólido marrón (23.2 g). El sólido se suspende en 350 mi de agua durante 5 horas a temp. amb. y se filtra. Se lava la torta con 100 mi de agua y se seca a 50°C bajo campana de vacío durante toda la noche. Se obtienen 8.31 g con un rendimiento químico del 56%.

Se carga un recipiente de 0.250 I equipado con un termómetro, condensador, agitación magnética, y entrada de nitrógeno con 4.92 g de 5-fluorooxindol, 7.0 g de imidazol amida, 15.5 g de (R)-1-amino-3-(4-morfolinil)-2-propanol, 9.78 g de trietilamina y 88 mi de tetrahidrofurano. La mezcla se calienta a 60°C durante 16.5 horas. La reacción se enfría a temperatura ambiente y se filtra. Se suspenden sólidos que se obtienen tres (3) veces sucesivas en acetonitrilo a 11 ml/g, se seca al vacío para dar 3.6 g (25.25%). [HPLC, Hypersil BDS, C-18, 5µ, (6:4), acetonitriloxloruro de amonio 0.1 M. PHA-571437=4.05 min.]. H RMN (DMSO) d 10.86 (1H, bs); 7.75 (1H-d); 7.70 (1H, s); 7.50 (1 H, m); 6.88 (2H, m), 4.72 (1 H, bs); 3.78 (1 H, bs); 3.56 (4H, m); 3.32 (6H, m); 3.15 (1H, m); 2.43 (8H, bm).

EJEMPLO 4 Síntesis de (2-hidroxi-3-morfolin-4-H-propiD-amida del ácido 2,4-dimetil-5- r2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometin-1H-pirrol-3-carboxilico Se condensa ácido 5-(2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-d¡met¡l-1 H-p¡rrol-3-carboxílico (113 mg, 0.4 mmoles) con 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (74 mg, 0.48 mmoles) para precipitar (2-hidroxi-3-morfolin-4-¡l-propil)-amida del ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-1 ,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenometil]-1 H-pirrol-3-carboxílico (77 mg, 45.3%). H RMN (DMSO-d6) d 2.27 (m, 1 H), 2.32 (m, 1 H), 2.40 (m, 4H), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1 H), 3.32 (m, 1 H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1 H), 4.74 (d, J=4.8Hz, 1 H, OH), 6.86 (d, J=7.6Hz, 1 H), 6.96 (t, J=7.2Hz, 1 H), 7.10 (t, J=7.6Hz, 1 H), 7.49 (t, J=5.6Hz, 1 H), 7.61 (s, 1 H), 7.77 (d, J=8.0Hz, 1 H) (aromático y vindico), 10.88 (s, 1 H, CONH), 13.62 (s, 1 H, NH). LC-MS (m/z) 425.4 (M+1 ).

EJEMPLO 5 Síntesis de (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-prop¡l)-amida del ácido 5-r5-cloro-2- oxo-l^-dihidro-indol-tSZl-ilideno-metiD^^-dimetil-IH-pirrol-S- carboxílico Se condensa ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1 ,2-d¡hidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (126.6 mg, 0.4 mmoles) con 1- amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (74 mg, 0.48 mmoles) para precipitar (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida del ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dirnetil-1 H-pirrol-3-carboxilico (107 mg, 58%). 1H RMN (DMSO-d6) d 2.29 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.39 (m, 4H), 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.15 (s, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1 H), 4.74 (d, J=4.8Hz, 1 H, OH), 6.85 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 7.11 (dd, J=2.0, 8.0Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.6Hz, 1 H), 7.75 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0Hz, 1 H) (aromático y vinílico), 10.99 (s, 1 H, CONH), 13.62 (s, 1 H, NH). LC-MS (m/z) 457.4 (M-1). Se pueden preparar los estereoisómeros R y S según sigue.

Se mezclan imidazol amida (7.0 g 32.3 mmoles), amina (15.5 g, 96.9 mmoles), 5-clorooxindol (5.48 g, 32.6 mmoles), trietilamina (14 mi), y THF (88 mi) y se calientan a 60°C. Se forma una solución roja. Luego se agita durante 16 horas a 60°C, la suspensión amarilla se enfría a temp. amb. y se filtra. Se lava la torta con 2 x 50 mi de THF y se seca durante toda la noche a 50°C bajo campana de vacío. Se obtienen 4.36 g con rendimiento químico del 29%.

Se mezclan imidazol amida (6.9 g, 31.3 mmoles), amina (10.0 g, 62.5 mmoles), 5-clorooxindol (5.3 g, 31.6 mmoles), y THF (100 ml) y se calienta a 60°C. Se forma una solución roja. Luego se agita durante 68 horas a 68°C, se agrega trietilamina (14 ml) y se agita durante 5 horas a 60°C. La reacción no se completa. Se agregan 4.6 g de amina de ramificación lateral, y se agita durante 20 horas a 60°C. La suspensión amarilla se enfría a temp. amb. y se filtra. Se lava la torta con 2 x 50 ml de THF y se seca durante toda la noche a 50°C bajo campana de vacío. Se obtienen 5.48 g con un rendimiento químico del 38%. EJEMPLO 6 Síntesis de (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida del ácido 5-r5-bromo- 2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilideno-metill-2,4-d¡metil-1 H-pirrol-3- carboxílico Se condensa ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-il¡denometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (72.2 mg, 0.2 mmoles) con 1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (38 mg, 0.24 mmoles) para precipitar la (2- h¡drox¡-3-morfolin-4-il-prop¡l)-amida del ácido 5-[5-bromo-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-d¡metil-1 H-pirrol-3-carboxílico (55 mg, 55%). 1H RMN (DMSO-d6) d 2.27 (m, 1 H), 2.32 (m, 1 H) 2.39 (m, 4H), 2.41 , 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.13 (s, 1 H), 3.35 (m, 1 H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, H), 4.74 (d, J=4.4Hz, 1 H, OH), 6.80 (d, J=8.4Hz, 1 H), 7.24 (dd, J=2.0, 8.0Hz, H), 7.51 (t, J=5.6 Hz, 1 H), 7.76 (s, 1 H), 8.09 (d, J=2.0Hz, 1 H) (aromático y vinílico), 10.99 (s, 1 H, CONH), 13.62 (s, 1 H, NH). LC-MS (miz) 503.4 ( -1 ).

EJEMPLO 7 Síntesis de (2-hidroxi-3-r ,2,31tr¡azol-1-il-propil)-am¡da del ácido 2,4- d¡metil-5-r2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilideno-metin-1 H-pirrol-3- carboxílico Paso 1 Se agita una mezcla de 3-[1 ,2,3]triazol (2.0 g, 29 mmoles), epiclorohidrina (3.4 ml, 43.5 mmoles), ?,?-diisopropil etilamina (26 ml, 15 mmoles) en etanol (50 ml) a temperatura ambiente durante toda la noche. Luego de eliminar los solventes, se purifica el residuo mediante cromatografía en flash (CH2CI2/CH3OH=100/1 -100/2-100/4) para dar 1 -cloro-3-[1 ,2,3]triazol-2-¡lpropan-2-ol (2.1 g, 45%). 1H RMN (CDCI3) d 3.52 (m, 2H, OH y CH2), 3.60 (dd, J=5.2; 1 1.2Hz, 1 H), 4.36 (m, 1 H, CH), 4.68 (m, 2H), 7.67 (s, 2H).

MS (m/z) 162.1 (M+1) y 1-cloro-3-[1 ,2,3]triazo!-1-ilpropan-2-ol (2.3 g, 49%). 1H RMN (CDCI3) d 3.56 (s, 1 H), 3.57 (s, 1H), 4.35 (m, 1 H), 4.53 (dd, J=7.2; 14Hz, 1 H), 4.67 (dd, J=3.8; 14Hz, 1 H); 7.67 (s, 1 H), 7.71 (s, 1H). MS m/z 162.1 (M+1).

Paso 2 Se trata 1-cloro-3-[1 ,2,3]tr¡azol-1-ilpropan-2-ol (2.3 g, 13 mmoles) con una solución de NH3 en metanol (25% en peso, 20 mi) a 60°C durante toda la noche en un recipiente de reacción sellado presurizado. Luego de enfriar a temperatura ambiente, se burbujea nitrógeno en la mezcla de reacción para eliminar el amoniaco. La evaporación del solvente de la sal clorhidrato de 1-amino-3-[1,2,3]triazol-1-ilpropan-2-ol (2.57 g, 100%). H RMN (DMSO-d6) d 2.68 (dd, J=8.8, 12.8Hz, 1 ), 2.97 (dd, J=3.6; 12.8Hz, 1 H), 4.15 (m, 1 H), 4.44 (dd, J=6.4, 14Hz, 1 H), 4.57 (dd, J=4.6; 14Hz, 1 H), 5.95 (d, J=5.2Hz, 1 H, OH), 7.77 (s, 1 H), 8.01 (brs., 3H, NH3+), 8.12 (s, 1 H). MS m/z 143.1 (M+1).

Paso 3 Se condensa ácido 5-(2-oco-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (113 mg, 0.4 mmoles) con 1-amino-3-[1 ,2,3]triazol-1-il-propan-2-ol (85 mg, 0.48 mmoles) para precipitar (2-hidroxi-3- [1 ,2,3]triazol-1-il-propil)-am¡da del ácido 2,4-dimetil-5-[2-oxo-1 ,2-d¡hidro-¡ndol-(3Z)-ilidenometil]-1 H-pirrol-3-carboxíl¡co (70 mg, 41%). 1H RMN (DMSO-d6) d 2.45, 2.48 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.35 (m, 2H), 4.02 (m, 1H), 4.32 (dd, J=7.6, 14Hz, 1H), 4.53 (dd, J=3.4, 14Hz, 1 H), 5.43 (d, J=5.6Hz, 1 H, OH), 6.91 (d, J=7.6Hz, 1H), 7.01 (t, J=7.6Hz, 1 H), 7.15 (t, J=8.0Hz, 1 H), 7.66 (s, 1 H), 7.12 (t, J=5.6Hz, 1 H), 7.74 (s, 1H), 7.77 (d, J=7.6Hz, 1H), 8.11 (s, 1 H), 10.93 (s, 1 H, CONH), 13.68 (s, 1 H, NH). LC-MS (m/z) 405.4 (M-1 ).

EJEMPLO 8 Síntesis de (2-hidroxi-3-ri ,2,31triazol-1 -il-propiI)-amida del ácido 5-G5- fluoro-2-oxo-1 ,2-d¡hidro-indol-(3Z)-ilideno-metin-2,4-dimetil-1H-pirrol-3 carboxílico Se condensa ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (120 mg, 0.4 mmoles) con 1-amino-3[1.2.3]triazol-1-il-propan-2-ol (85 mg, 0.48 mmoles) para precipitar (2-hidroxi-3-(1 ,2,3]tr¡azol-1-il-propil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (100 mg, 62%). 1H RMN (DMSO-d6) d 2.42, 2.44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.98 (m, 1 H), 4.27 (dd, J=7.6, 14Hz, 1H), 4.50 (dd, J=3.4, 13.6Hz, 1H), 3.58 (d, J=5.6Hz, 1 H, OH), 6.82 (dd, J=4.4; 8.4Hz, 1 H), 6.91 (td, 2J=2.4, 3J=9.0Hz, 1H), 7.70 (m, 3H), 7.75 (dd, J=2.4, 9.2Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 10.93 (s, 1H, CONH), 13.73 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 423.4 (M-1).

EJEMPLO 9 Síntesis de (2-hidroxi-3-(1.2.31triazoM-il-propiO-arnida del ácido 5-G5- cloro^-oxo-I. -dihidro-indol-SZl-ilidenometill^^-dimetil-IH-pirrol-S- carboxílico Se condensa ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1;2-dihidro-indol-3-ilidenomet¡l)-2,4-d¡metil-1H-p¡rrol-3-carboxílico (126.6 mg, 0.4 mmoles) con 1-amino-3[1.2.3]triazol-1-il-propan-2-ol (85 mg, 0.48 mmoles) para precipitar (2-hidroxi-3-[1,2,3]triazol-1-il-prop¡l)-amida del ácido 5-(5-cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-¡ndol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (48 mg, 27%). 1H RMN (DMSO-d6) d 2.42, 2.44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.99 (m, 1H), 4.28 (dd, J=7.8; 14Hz, 1H), 4.51 (dd, J=3.2, 14Hz, 1H), 5.39 (d, J=6.0Hz, 1H, OH), 6.85 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.12 (dd, J=2.0, 8.2Hz, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.74 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 10.99 (s, 1H, CONH), 13.65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 439.4 (M-1 ).

EJEMPLO 10 Síntesis de (2-hidroxi-3-(1,2,3ltriazol-1-il-propil)-amida del ácido 5-G5- bromo-2-oxo-1 ,2-d¡hidro-indol-(3Z)-ilideno-metii1-2,4-dimetil-1H-pirrol-3- carboxílico Se condensa ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indoI-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico (144.4 mg, 0.4 mmoles) con 1-amino-3-[1.2.3]triazol-1-il-propan-2-ol (85 mg, 0.48 mmoles) para precipitar (2-hidroxi-3-[1 ,2,3]triazol-1-il-propil)-amida del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenomet¡l]-2,4-dimetil- H-p¡rrol-3-carboxílico (130 mg, 67%). 1H RMN (DMSO-d6) d 2.41 , 2.44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3.27 (m, 2H), 3.99 (m, 1 H), 4.28 (dd, J=7.6, 14Hz, 1 H), 4.50 (dd, J=3.6, 14Hz, 1H), 5.40 (d, J=5.6Hz, 1H, OH), 6.81 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.24 (dd, J=2.0; 8.0Hz, H), 7.70 (m, 2H), 7.77 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.10 (d, J=1.6Hz, 1H), 1.0 (s, 1H, CONH), 13.64 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 485.4 (M-1). Síntesis del ácido 5-(5-bromo-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1H-p¡rrol-3-carboxíl¡co. El ácido (5-cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico y el ácido 5-(2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-d¡met¡l-1 H-pirrol-3-carboxílico se describen en la solicitud de los inventores presentada concurrentemente con la presente el 14 de febrero de 2001 , titulada "PYRROLE SUSTITUTED 2-INDOLINONE-PROTEIN KINASE INHIBITORS", No. de serie 09/783.264, cuya revelación se incorpora aquí en su totalidad.

EJEMPLO 11 Síntesis de 1-amino-3-(1,l iioxo^6 iomofolin^ IVpropan-2-ol ??3,?20, 50°C A la solución de tiomorfolina (5.0 g, 48.7 mmoles) en HOCH3 (200 mi) se le agrega la solución de oxona (36.0 g, 58.5 mmoles) en H2O (100 mi). Dicha mezcla se agita bien a 40°C durante 48 horas y luego se enfría a 0°C. Se agrega NaOH acuoso gota a gota para ajustar el pH a 12. El sólido se elimina por filtración y se lava con HOCH3 (3x40 mi). El líquido condensado se combina y se purifica mediante cromatografía en flash sobre gel de sílice (CHCl3/CH3OH/NH3.H2O=3/1/0.1-2/1/0.1) para dar ,1-dióxido de tiomorfolina (6.2 g) con un rendimiento del 93%. 1H RMN (DMSO-d6) d 2.97 (m, 4H), 3.07 (m, 4H), 3.42 (brs, 1 H).

MS m/z 136 (M+1). Se agita la mezcla de 1 ,1 -dióxido de tiomorfolina (2.5 g, 18.5 mmoles) y (R)-(-)epiclorohidrina (1.55 mi, 20 mmoles) en la mezcla de solventes etanol (50 mi) y H2O (5 mi) a 25°C durante 24 horas. Luego de eliminar los solventes, el residuo se purifica mediante cromatografía en flash para dar (RJ-l-cloro-S-íl.l-dioxo- ^tiomorfolin^-i -propan^-ol (4.0 g, 96%). 1H RMN (DMSO-d6) d 2.50 (m, 2H), 2.94 (m, 4H), 3.05 (m, 4H), 3.54 (dd, J=5.8; 11.2Hz, 1H), 3.63 (dd, J=4.4; 11.2Hz, 1 H), 3.78 (m, 1H, CH 5.10 (d, J=5.2Hz, 1H, OH). MS m/z 228.2(M+1). Se trata (R)-1-cloro-3-(1 ,1-dioxo^6-tiomorfolin-4-¡l)-propan-2-ol (2.27 g, 10 mmoles) con la solución de NH3 en metanol (25% en peso, 20 mi) a 50°C durante 12 horas. Luego de la evaporación de solventes, el residuo se trata con resina de intercambio aniónico (AG1X8, forma OH) en agua para dar (S)-1-amino-3-(1 ,1-dioxo- 6-tiomorfolin-4-il)-propan-2-ol crudo (2.0 g). Está contaminada aproximadamente con un 30% de su dímero y se podría purificar ligeramente mediante cromatografía en columna. MS m/z 209.2 (M+1). La condensación de (S)-1-amino-3-(1 ,1-dioxo^6-tiomorfolin-4-il)-propan-2-ol con oxindoles de las indolinonas deseadas (rendimiento del 50-80% luego de la purificación). Í3-(1 ,1-dioxo^6-tiomorfolin-4-¡l)-2-h¡droxi-propin-amida del ácido (R)-5-(2-oxo-1 -dih¡dro-indol-3-iltá^ 1H RMN (DMS0-d6) d 2.39, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.49 (m, 1H), 2.56 (m, 1 H), 2.97 (m, 4H), 3.07 (m, 4H), 3.16 (m, 1H), 3.34 (m, 1 H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8Hz, 1 H, OH), 6.86 (d, J=7.6Hz, 1 H), 6.97 (t, J=7.4Hz, 1H), 7.11 (t, J=7.5Hz, 1 H), 7.50 (t, J=5.6Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.76 (d, J=7.6Hz, 1 H) (aromático y vinílico), 10.88 (s, 1H, CONH), 13.62 (s,1 H, NH). LC- S (m/z) 473.4 (M-1).

G3-(1 -dioxo- 6-tiomorfol¡n-4-in-2-hidroxi-propil1-amida del ácido (R 5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2.4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico H RMN (DMS0-d6) d 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.47 (m, 1H), 2.54 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.17 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.4Hz, 1H), 6.82 (t, J=4.0Hz, 1H), 6.91 (td, 2J=2.8, 3J=9.0Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.8Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.75 (dd, J=2.4; 9.2 Hz, 1H), 10.88 (s, 1H), 13.67 s, 1H). LC-MS(m/z) 491.4 (M+1).

G3-G 1 ,1-dioxo- 6-tiomorfolin-4-il)-2-hidroxi-propin-amida del ácido (R)-5(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3^ carboxílíco.

H RMN (DMSO-d6) d 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.45 (m, 1H), 2.53 (m, 1H), 2.96 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.17 (m, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.4Hz, 1H, OH), 6.85 (t, J=8.4Hz, 1H), 7.11 (dd, J=2.2; 8.2Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.5Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0Hz, 1H), 10.98 (s, 1H), 13.62 (s,1H). LC-MS (m/z) 507.2 (M+1).

G3-(1 ,1-dioxo^6-tiomorfolin-4-il)-2-hidroxi-prop¡n-amida del ácido (R)-5-(5-bromo-2-oxo-1 ,2-dih¡dro-indol-3-¡l¡denometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico. 1H RMN (DMSO-d6) d 2.41 , 2.42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2.47 (m, 1H), 2.54 (m, 1 H), 2.97 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.18 (m, 1 H), 3.30 (m, 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8Hz, 1 H), 6.81 (d, J=8.4Hz, 1 H), 7.24 (dd, J=1.8; 8.2Hz, H), 7.53 (t, J=5.8, 1 H), 7.76 (s, 1H), 8.09 (d, J=2.0Hz, 1 H), 10.98 (s, 1 H), 13.62 (s, 1 H). LC-MS (m/z) 553.6 (M+1).

EJEMPL0 12 Síntesis de (S) o (R)-1-metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol (R)S- Se agita la mezcla de morfolina (1.74 mi, 20 mmoles) y (R)-epiclorohidrina (1.56 mi, 20 mmoles) en etanol (10 mi) a temperatura ambiente durante 48 horas. Luego de eliminar el solvente, el residuo tratado con la solución de CH3NH2 en agua (40% en peso, 20 mi) a temperatura ambiente durante 14 horas. La remoción de los solventes da el (S)-1-metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol crudo, que se puede purificar mediante destilación al vacío o cromatografía en columna (2.4 g, 70%). Se hizo (R)-1-Metilamino-3-morfol¡n-4-il-propan-2-ol a partir de (S)-epiclorohidrina con un rendimiento del 76%. 1H RMN (CDI3) d 2.33 (dd, J=3.6; 12.4Hz, 1H), 2.42 (m, 1H), 2.44 (dd, J=2.5; 9.8Hz, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.53 (dd, J=7.6; 11.8Hz, 1H), 2.62 (m, 2H), 5.65 (dd, J=3.6; 12.0Hz, 1H), 3.71 (m, 4H), 3.85 (m, 1 H). 13CRMN (CDCI3) d 67.06, 65.58, 62.80, 55.87, 53.94, 36.72. MS (m/z) 175 (M+1). La condensación de (S-1-Metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol con 5-fluoroxindol rindió (2-hidroxi-3— morfolin-4-il-propil)-metil-amida del ácido (R)-5-(5-fluoro-2-oxo- ,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico H H RMN (DMS0-d6) d 2.0 (s, 3H), 2.15 (m, 6H), 2.28 (m, 2H), 2.42 (s, 1H), 2.95 (s, 1 H), 3.0 (s, 3H), 3.25 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 3.97 & 3.68 (2xbrs, 1 H), 4.80 & 4.74 (2xbrs, 1 H), 6.82 (dd, J=4.0; 8.0Hz, 1H), 6.90 (td, 2J=2.3; 3J=8.7Hz, 1 H), 7.67 (s, 1H) 7.71 (dd, J=2.2; 9.0Hz, 1H), 10.86 (s, 1 H), 13.57 (s, 1H); LC-MS (m/z) 457.2 (M+1). El (R)-1-amino-3-morfolin-4-¡l-propan-2-ol rindió (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-metil-amida del ácido (S)-5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenometil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxilico H 1H RMN (DMSO-d6) d 2.0 (m, 3H), 2.10 (m, 1 H), 2.22 (m, 6H), 2.25 (m, 2H), 2.38 (m, 1 H), 2.90 (s, 1H), 2.96 (s, 3H), 3.27 (m, 2H), 3.52 (m, H), 3.93 & 3.64 (2xbrs, 1H), 4.75 & 4.70 (2xbrs, 1H), 6.77 (dd, J=4.6; 8.2Hz, 1 H), 6.85 (td J2=2.5, 3J=8.8Hz, 1H), 7.62 (s, H), 7.67 (dd, J=2.0;9.6Hz, 1H), 10.81 (s, 1 H), 13.52 (s, 1 H); LC-MS (m/z) 457.2 (M+1).

EJEMPLO 13 Preparación de amina de ramificación lateral 3-(1-H-tetrazol 1-¡l)-2-¡droxi- 1 -cloropropano y 3-(2-H-tetrazol-2-in-2-hidroxi-1 -cloropropano Se agita 6.905g de tetrazol (100 mmoles) y 1.75 mi . de diisopropiletilamina (10 moles) y 11.73 mi de epiclorohidrina (150 mmoles) en acetonitrilo anhidro (30 mi) a 60°C durante 4 horas. Se evapora la solución que se obtiene, se seca al alto vacío y se purifica mediante una columna de sílice en cloroformo-metanol 100.8. La primera fracción proporciona 3.(2-H-tetrazol-2-il)-2-hidroxi-1 -cloropropano puro, 6.215 g (aceite incoloro, rend. Del 38%), la segunda fracción rinde 9.208 g de 3-(1-H-tetrazol-1-il)-2-hidroxil-1-cloropropano puro (goma pegajosa; rend. del 57%). 3-(1-H-Tetrazol-1-il)]-2-hidroxi-1-aminopropano. Se agitan 9.110 g de 3-(1-H-tetrazol-1-il)]-2-hidroxi-1-cloropropano, 15g de carbonato de potasio y 130 mi de amoniaco metanólico saturado durante 21 horas, luego se filtra y se evapora. El residuo se purifica mediante una columna de sílice en cloroformo-metanol-amoníaco acuoso 80:35:4. Rend.= 7.326 g de una goma blanca pegajosa (91.5% th). 3-(2-H-Tetrazol-2-il)-2-hidrox¡-1 -aminopropano se agitan 6.105g de 3-(2-H-tetrazol-2-il)-2-hidroxi-1 -cloropropano, 10 g de carbonato de potasio y 95 mi de amoníaco metanólico saturado durante 21 horas, luego se filtra y se evapora. El residuo se purifica mediante una columna de sílice en cloroformo-metanol-amoníaco acuoso 60:25:2. Rend. = 3.726 g de un sólido blanco cristalino (65.5% th). 3-í(2R, 6S)-2,6-Dimetilmorfolin-4-¡n-2-hidroxi-1 -aminopropano Se agrega 4.7 mi de epiclorohidrina (60 mmoles) a una solución enfriada con hielo de cis-2,6-dimetilmorfol¡na (4.607 g, 40 mmoles) en trifluoroetanol (5 mi). La solución se agita a 0-5°C durante 1 hora, se saca del baño refrigerante y se agita a temperatura ambiente. Durante 5 horas adicionales. La mezcla se evapora al alto vacío, el residuo aceitoso que se obtiene se disuelve en etanol anhidro (50 mi), la solución se enfría en baño de hielo, se agrega metóxido de sodio sólido (2.27 g) en dos porciones y se agita la mezcla a 0-5°C durante 2 horas. Luego se filtra la mezcla de reacción, las sales se lavan con etanol (30 mi) y los filtrados combinados se agregan a amoníaco acuoso concentrado enfriado con hielo ( 200 mi). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 12 horas, luego se evapora al alto vacío. El residuo se purifica mediante una columna de sílice en mezcla con cloroformo-metanol-amoníaco metanólico 7M 80:15:3. Rend. =5.75 g de un sólido higroscópico blanco cristalino (76.3% th). (2S)-3 3-Metil-2,5-dioxoimidazolidiri-1-il)-2-hidroxi-1-cloropropano v (2S)-3-(3-metil-2,5-dioxoimidazolidin-1 -il)-2-hidroxi-1 -aminopropano Se agitan 3.423 g de 3-metil-2,5-dioxoimidazolidina (4.423 g) y 3.60 ml de R-epiclorohidrina (-) (99% e.e.) y 0.30 mi de base de Barton (1.5 mmoles) en acetonitrilo anhidro a 60°C durante 20 horas. La solución que se obtiene se evapora al alto vacío y se purifica mediante una columna de sílice en una mezcla de cloroformo-metanol (un gradiente desde 5 hasta 20% de metanol) para obtener 5.572 g del cloro-compuesto como un sólido amorfo blanco (Rend. del 80%). El cloruro se transforma en amina según sigue. El intermediario hidroxi-cloro que se obtiene se disuelve en amoníaco metanólico (saturado con amoníaco gaseoso), se agrega carbonato de potasio se agita la mezcla en recipiente cerrado durante 2 2 días la mezcla de reacción se filtra, y los filtrados se evaporan. El residuo se purifica mediante una columna de sílice en una mezcla cloroformo-metanol-amoniáco acuoso conc. 80:15:1.5.

EJEMPLO 14 5-KZH5-fluoro-2-oxo-1.2-dihidro-3H-m^ (2H-tetraazol-2-il)propil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida (Compuesto 22) (Procedimiento general) Se agregan 72 mg de 3-(2-H-tetrazol-2-il))-2-hidroxi-1-aminopropano a la suspensión de 7.05 mg (0.25 mmoles) del éster 1-oxi-7-azabenztriazol del ácido 5-((Z)-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno)metil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico (preparado activando (3Z)-3-[(3,3-dimet¡l-4-carboxi-1-H-pirrol-2-il)metileno]-5-fluoro-1 ,3-dihidro-2H-¡ndol-2-ona (480 mg; 1.6 mmoles) con el reactivo HATU (570 mg; 1.5 mmoles) en presencia de base de Huning (3.0 moles; 0.525 mi) en DMF (5 mi) y se aisla en forma pura por precipitación con cloroformo (5 mi) y secado al alto vacío con u rendimiento del 92% (579 mg)] en dimetilacetamida anhidra (1.5 mi). Se agita la mezcla durante 30 minutos y se evapora al alto vacío. El resido se suspende en una mezcla metanol-dietilamina 20:1 (3 mi), se deja cristalizar en un refrigerador (5°C) durante 1 hora, se filtra, el precipitado se lava con metanol enfriado con hielo y se seca al alto vacío. Rend.= 106 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 15 5-r(Z)-(5-cloro-2-oxo-1,2-d¡hidro-3H-¡ndol-3-ilideno)met¡n-N-(2-h¡drox¡-3- (2H-tetraazol-2-il)propin-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida (Compuesto 23^ (Procedimiento general) Se agregan 72 mg de 3-(2-H-tetrazol-2-il))-2-hidroxi-1-aminopropano a la suspensión de 109 mg (0.25 mmoles) del éster 1-ox¡-7-azabenztriazol del ácido 5-((Z)-(5-cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxíl¡co (preparado activando (3Z)-3-[(3,3-dimetil-4-carboxi-1-H-pirrol-2-¡l)metileno]-5-cloro-1 ,3-díhidro-2H-indol-2-ona (4.520 g: 4.8 mmoles) con el reactivo HATU (1.768 g; 4.65 mmoles) en presencia de base de Huning (9.0 mmoles; 1.58 mi) en DMF (20 mi) y se aisla en forma pura por precipitación con cloroformo (20 mi) y secado al alto vacío con u rendimiento del 94% (1.907 g)] en dimetilacetamida anhidra (1.5 mi). Se agita la mezcla durante 30 minutos y se evapora al alto vacío. El resido se suspende en una mezcla metanol-dietilamina 20:1 (3 mi), se deja cristalizar en un refrigerador (5°C) durante 1 hora, se filtra, el precipitado se lava con metanol enfriado con hielo y se seca al alto vacío. Rend.= 109 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 16 N-r2-hidroxi-3-f2H-tetraazol-2-inprop¡n-2,4-dimetH-5-írZ)-r2-oxo-5- (trifluorometoxi)-l ,2-dihidro-3H-¡ndol-3-ilideno1metil>-1H-pirrol-3- carboxamida (Compuesto 24) (Procedimiento general) Se agregan 72 mg de 3-(2-H-tetrazol-2-il)]-2-h¡droxi-1-aminopropano a la suspensión de 121.5 mg (0.25 mmoles) del éster 1-oxi-7-azabenztriazol del ácido 5-((Z)-(5-trifluorometoxi-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno)metil]-2,4-dimetil-1H-p¡rrol-3-carboxílico (preparado activando (3Z)-3-[(3,3-dimetil-4-carbox¡-1H-pirrol-2-il)metileno]-5-trifluorometoxi-1 ,3-dihidro-2H-indol-2-ona (1.768 g: 4.8 mmoles) con el reactivo HATU (1.758 g; 4.8 mmoles) en presencia de base de Huning (9.0 mmoles; 1.58 mi) en DMF (25 mi) y se aisla en forma pura por evaporación y precipitación con acetonitrilo anhidro y secado al alto vacío con un rendimiento del 85.5% (1.929 g)] en dimetilacetamida anhidra (1.5 mi). Se agita la mezcla durante 30 minutos y se evapora al alto vacío. El residuo se suspende en una mezcla de metanol-dietilamina 20:1 (3 mi), se deja cristalizar en el refrigerador (5°C) durante 1 hora, se filtra, el precipitado se lava con metanol enfriado con hielo y se seca al alto vacío. Rend.= 113 mg de un sólido cristalino anaranjado EJEMPLO 17 5r(z)-(5-Fluoro-2 xo-1,2-d¡h¡dro-3H-¡ndol-3-ilideno)metíl1-N-r2-hidroxi-3- (1 H-tetraazol-1 -il)propin-2,4-d¡metil-1 H-pirrol-3-carboxamida (Compuesto 25) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 14 a partir de 72 mg de la correspondiente amina. Rend.= 3 mg de un sólido cristalino anaranjado EJEMPLO 18 5rfe)-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-8ndoi-3-ilideno)met¡n-N-r2-h¡drox¡-3- (1 H-tetraazol-1 -il)propiH-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxamida (Compuesto 26) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 15 a partir de 72 mg de la amina correspondiente. Rend.=122 mg de un sólido cristalino anaranjado EJEMPLO 19 N-r2-hidroxi-3-í1H-tetraazol-1-inpropín-2.4-d¡metil-5-r(Z)-r2-oxo-5- (tr¡fluorometoxi)-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-ilidenolmetin-1H-pirrol-3- carboxamida (Compuesto 29) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16 a partir de 72 mg de la correspondiente amina. Rend.=118 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 20 N-(3fí2R, 6S)-2.6-dimetilmorfolin-4-in-2-hidroxipropil}-5-r(Z).f5-fluoro-2- oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno)metiH-2,4-dimetií-1H-pirrol-3- carboxamida (Compuesto 29) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 14 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend.=99 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 21 5-rfZ)-f5-cloro-2-oxo-1,2-d¡hidro-3H-indol-3-¡lideno metin-N-r3-r(2R. 6S- d¡metHmorfolin^-¡n-2-h¡droxipropill-2,4-dimetíl-1 H-pirrol-3-carboxamida (Compuesto 29) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 15 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend.=101 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 22 N-{3r(2R, 6S)-2,6-D¡metilmorfolin-4-il)-2-hidroxipropil)-2,4-dimetil-5-r(Z)- r2-oxo-5-ftr¡fluorometox¡)-1.2-dihidro-3H-indol-3-ilidenoT metilMH-pirrol- 3-carbaxamida (Compuesto 30) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend.=89 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 23 5-rfZ -5-Fluoro-2-oxo-1,2-d¡hidro-3H-¡ndol-3-¡lideno)metin-N-r(2S)-2- h!droxi-3-(3-metiN2,5-dioxaim¡dazol¡din-1-ini-2,4-dimetil-1H-pírrol-3- carboxamida (Compuesto 34) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend.=109 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 24 5-r(Z)-5-Cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-ilideno)metilI-N-r(2S)-2-hidrox¡-3-(3-metil-2.5-dioxoimidazolidin-1 -il)propil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3- carboxamida (Compuesto 36) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 15 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend.=107 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 28 N-r(2S)2-Hidroxi-3(3-metil-2,5-dioxoimidazol¡d¡n-1-il)prop¡n-2,4-d¡metil-5- r(Z)-r2-oxo-5-(trífluorometoxi)-1,2-dih¡dro-3H-lndol-3-il¡deno*metin-1H- pirrol-3-carboxamida (Compuesto 35 Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend.=123 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 26 5-r(Z)-5-Fluoro-2-oxo-1.2-d!hidro-3H-indol-3-illdeno)metin-N-r(2S)-2-h¡droxi-3-(3-meti1-2.5-dioxoimidazolidin-1-il)propil)-2,4-dimetil-1H-pi carboxamida (Compuesto 31) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 14 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend.=110 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 27 5-rfZ)-5-Cloro-2-oxo-1,2-d¡hidro-3H-indoí-3-il¡deno)met!n-N-rf2R)-2-hidroxi-3-(3-metil-2,5-d¡oxoim¡dazolidin-^ carboxamida (Compuesto 32) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 15 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend. = 03 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 28 N (2R)-2-H¡droxi-3-(3-metil-2.5-dioxol^ 5 fZ) 2-oxo-5-ftrifluorometoxi .2 i¡hidro-3H-indol-3-ilideno-1-metill- 1 H-pirrol-3-carboxamida (Compuesto 33) Dicho compuesto se prepara de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Rend. =120 mg de un sólido cristalino anaranjado.

EJEMPLO 29 Ester etílico del ácido S-formil^-metii^-fenil-IH-pirrol-S-carboxílico Se enfría DMF (4 mi, 3 eq.) con agitación en un baño de hielo, al cual se agrega POCI3 (1.1 eq., 1.8 mi). Luego de 30 minutos, se agrega a la mezcla de reacción una solución de 3,5-dimetil-4-etiléster pirroL (4g, 17.4 mmoles) en DMF (2M, 9 mi) y se continúa la agitación. La mezcla de reacción solidifica luego de 10 minutos. La misma se diluye con 5 mi de DMF y se calienta en un baño de aceite a 90°C. Luego de 1 hora, la mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se diluye con agua (100 mi) y se hace básica a pH = 11 con NaOH 1 N. El producto se extrae en cloruro de metileno (3x200 mi) y las fases orgánicas se lavan con salmuera (200 mi), se secan (MqS04) y se concentra para rendir 4.3 g (95%) de éster etílico de ácido 5- formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirrol-3-carboxílico como un sólido marrón. 1H RMN (360MHz, DMSO-d6) d 12.5 (br s, 1H, NH), 9.11 (s, 1 H, CHO), 7.35 (s, 5H, ArH), 3.98 (q, J=6.8 y 7.2 Hz, 2H, OCH2CH3), 2.48 (s, 3H, CH3), 0.98 (t, J=7Hz, 3H, OCH2CH3).

Acido 5-formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirrol-3-carboxílico Se disuelve éster etílico del ácido 5-Formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirrol-3-carboxílico en agua (100 mi) y metanol (45 mi) con agitación. Se agregan KOH (2 eq. 1.9 g) y se calienta a 100°C. Luego de 2.5 horas se enfría a temperatura ambiente y se elimina el éster remanente extrayendo en acetato de etilo (200 mi), se seca y se concentra. La capa de agua se acidifica a pH=3 usando HCI 2N. El sólido blanco se elimina por filtración, se enjuaga con agua. El sólido se re-concentra a partir de tolueno, se tritura con hexanos y se seca para rendir 2g (52%) de un sólido blanco. 1H RMN (360MHz, DMSO-d6) d 12.46 (br s, 1 H, CO2H), 11.95 (s, 1 H, NH), 9.08 (s, 1H, CHO), 7.36 (s, 5H, ArH), 2.49 (s, 3H, CH3). MS m/z (intensidad relativa %, ion); Encontrado 229 (100, M+); Cale. 229.2. (3-Dietilamino-2-hidroxi-propil)-amida del ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirrol-3-carboxílico Se agita una mezcla de ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxílico (1.0 gr, 4.36 mmoles), 1-amino-3-dietilamino-2-propanol (950 mg, 6.54 mmoles), DDC (900 mg, 4.36 mmoles) y HOBt (884 mg, 6.54 mmoles) en cloroformo (60 mi) a temperatura ambiente durante 12 horas. Se vierte la mezcla de reacción en bicarbonato de sodio sat. (60 mi) y se le agrega NaOH 1 N (8 mi). Luego se extrae con EtOAc (3x100 mi), se lava con agua y salmuera, se seca y se concentra para dar 400 mg de (3-dietilamino-2-hidroxi-propil)-amina del ácido 5-formil-2-metil-4-fenil-1 H-pirrol-3-carboxílico.

EJEMPLO 30 Procedimiento para la síntesis de los compuestos 11-21 Se prepara una solución M de cada oxindol en DMSO asó como una solución 0.576 M de cada aldehido. Se mezclan 300 µ? de oxindol apropiado con 300 µ? del aldehido apropiado en presencia de 200 µ? de DMSO. Luego se agrega 40 mg de resina depuradora de dietilentriamina. Se pone la mezcla en un Bloque Robbins y el bloque se sella y se pone en un horno a 60°C donde se agita durante 18 horas. Luego de 18 horas, se saca el Bloque Robbins del horno. Se saca el sello superior del bloque y se agregan a la mezcla 800 µ? de DMSO. Luego el bloque se vuelve a sellar y se pone nuevamente en el horno a 60°C donde gira continuamente durante 1 hora. Luego se completa la hora, se saca el Bloque Robbins del horno y se deja enfriar. Se saca cuidadosamente el sello inferior del Bloque Robbins y el bloque completo se dispone dentro del dispositivo de filtración, que permite separar por filtración los compuestos recientemente sintetizados a partir de la resina.

EJEMPLOS BIOLOGICOS Los siguientes ensayos se emplean para hallar aquellos compuestos que demuestran el grado óptimo de actividad deseada.

A. Procedimientos de ensayo Pueden usarse los siguientes ensayos para determinar el nivel de actividad y el efecto de los distintos compuestos de la presente invención sobre una o más PK. Pueden diseñarse ensayos semejantes junto con las mismas líneas para cualquier PK usando procedimientos bien conocidos en la técnica.

Varios de los ensayos que se describen en la presente documentación se realizan en un formato de ELISA (Ensayo Compuesto Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas) (Voller, et al., 1980 "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Manual of Clinical Immunology, 2° edición, Friedrnan, Am. Soc. Of icrobiology, Washington, D.C., páginas 359-371). El procedimiento general es como sigue: se introduce un compuesto en células que expresan la cinasa de prueba, ya sea en forma natural o recombinante, pro un periodo seleccionado de tiempo después del cual, si la cinasa de prueba es un receptor, se agrega un ligando que sea un activador conocido del receptor. Las células se lisan y se transfiere el lisado a las cavidades de una placa de ELISA previamente cubierta con un anticuerpo específico que reconoce el sustrato de la reacción de fosforilación enzimática. Los componentes distintos del sustrato en el lisado de células se lavan y se detecta la cantidad de fosforilación del sustrato con un anticuerpo que reconozca específicamente la fosfotirosina, en comparación con las células control que no fueron puestas e contacto con el compuesto de prueba. Los protocolos presentemente preferidos para llevar a cabo los experimentos de ELISA sobre PK específicas se proveen a continuación. Sin embargo, la adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de compuestos contra otras RTK, así como contra otras CTK y STK, está dentro del alcance del conocimiento de aquellos entrenados en la técnica. Otros ensayos que se describen en la presente documentación miden la cantidad de ADN generado como respuesta a la activación de una cinasa de prueba lo cual es una medida general de una respuesta proliferativa. El procedimiento general para este ensayo es como sigue: se introduce un compuesto en células que expresan la cinasa de prueba, ya sea en forma natural o recombinante, por un período seleccionado de tiempo después del cual, si la cinasa de prueba es un receptor, se agrega un ligando que sea un activador conocido del receptor. Después de una incubación por al menos una noche, se agrega un reactivo marcador de ADN, tal como 5-bromodesoxiuridina (BrdU) o H3-timida. Se detecta la cantidad de ADN marcado con un anticuerpo antiBrdU o midiendo la reactividad, y se compara con las células control que no fueron puestas en contacto con un compuesto de prueba.

Bioensavo de GST-FLK-1 Este ensayo analiza la actividad de la tirosin cinasa de GST-Flk1 sobre péptidos poli(glu, tyr).) Materiales y reactivos: 1. Placas de ELISA Corning de 96 cavidades (N° de Catálogo Corning 5805-96). 2. Poli(glu,tyr) 4:1 , liofilizado (CatálogoSigma # P0275). 3. Preparación de placas de ensayo cubiertas con poli(glu,tyr)(pEY): se cubre con 2 ug/cavidad de poli(glu,tyr)(pEY) en 100 ul de PBS, se mantiene a temperatura ambiente por 2 horas o a 4°C por una noche. Se cubren bien las placas para evitar la evaporación. 4. Buffer PBS: para obtener 1 I, se mezclan 0.2 g de KH2 P04, 1.15 g de Na2HP04, 0.2 g de KCI y 8 g de NaCI en aproximadamente 900 mi de dH20. Cuando se han disuelto todos los reactivos, se ajusta el pH a 7.2 con HCI. Se lleva el volumen total a 1 I con dH20 5. Buffer PBST: a 1 I de buffer PBS se agrega 1.0 mi de Tween- 20. 6. Buffer de bloqueo TBB: para obtener 1 I, se mezclan 1.21 g de TRIS, 8.77 g de NaCI, 1 mi de TWEEN-20 en aproximadamente 900 mi de dH20. Se ajusta el pH a 7.2 con HCI. Se agregan 10 g de BSA, se agita para disolver. Se lleva el volumen total a 1 I con dH20. Se filtra para retirar la material particulada. 7. % de BSA en PBS: para hacer una solución de trabajo 1x, se agregan 10 g de BSA a aproximadamente 990 mi de buffer PBS, se agita para disolver. Se ajusta el volumen total a 1 L con buffer PBS, se filtra para retirar la materia particulada. 8. Hepes 50 mM pH 7.5. 9. GST-Flk1cd purificado a partir de la transformación de baculovirus recombinantes sf9 (SUGEN, Inc.). 10. DMSO al 4% en dH20. 11. ATP 10 mM en dH20. 12. - MnCI240 mM. 13. Buffer de Dilución de Cinasas (KDB): se mezclan 10 ml de Hepes (pH 7.5), 1 ml de NaCI 5 M, 40 µ? de ortovanadato de sodio 100 mM y 0.4 ml de BSA al 5% en dH2o con 88.56 ml de dH20. 14. - Placas NUNC depolipropileno de 96 cavidades con fondo en V, Catálogo Applied Scientific # AS-72092. 15. - EDTA: se mezclan 14.12 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en aproximadamente 70 ml de dH20. Se agrega NaOH 10 N hasta que se disuelve el EDTA. Se ajusta el pH a 8.0. Se ajusta el volumen total a 100 ml con dH2O. 16.- 1°Buffer de Dilución de Anticuerpos: se mezclan 10 ml de BSA al 5% en Buffer PBS con 89.5 ml de TBST. 17. Anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de rábano picante (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech). 18. - Acido 2,2 -Azinobis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS, Moss, Catálogo N° ABST). 19. - 10% de SDS.

Procedimiento: 1. Se cubren las placas de ELISA Corning de 96 cavidades con 2 µg de péptido poliEY en PBS estéril, como se describe en el paso 3 de Materiales y Reactivos. 2. Se retira el líquido no unido de las cavidades invirtiendo la placa. Se lava una vez con TBST. Se frota la placa contra una toalla de papel para retirar el líquido en exceso. 3. Se agregan 100 µ? de BSA al 1 % en PBS a cada cavidad. Se incuba, con agitación, por 1 hora a temperatura ambiente. 4. Se repite el paso 2. 5. Se lavan las cavidades con HEPES 50 m (pH 7.5 (150 µ?/cavidad). 6. Se diluye el compuesto de prueba con dH20/4% de DMSO hasta 4 veces la concentración final del ensayo en las placas de polipropileno de 96 cavidades. 7. Se agregan 25 µ? de compuesto de prueba diluido a la placa de ELISA. En las cavidades control, se colocan 25 µ? de dH20/4% de DMSO. 8. Se agregan 25 µ? de MnCI2 40 mM con 4x ATP (2 µ? a cada cavidad). 9. Se agregan 25 µ? de EDTA 0.5 M a las cavidades del control negativo. 0. Se diluye GST-Filk1 hasta 0.005 g(5 ng)/cav¡dad con KDB. 11. Se agregan 50 µ? de enzima diluida a cada cavidad. 12- Se incuba, con agitación, por 15 minutos a temperatura ambiente. 13. Se detiene la reacción agregando 50 µ? de EDTA 250 mM (pH 8.0). 14. Se lava 3X con TBST y se frota la placa contra una toalla de papel para retirar el líquido en exceso. 15. Se agregan 100 µ? por cavidad de conjugado anti-fosfotirosina HRP, se realiza una dilución 1: 5000 en buffer de dilución de anticuerpos. Se incuba, con agitación, por 90 minutos a temperatura ambiente. 16. Se lava como en el paso 14. 17. Se agregan 100 µ? de una solución de ABTS a temperatura ambiente a cada cavidad. 18. Se incuba, con agitación, por 10 a 15 minutos. Se retira cualquier burbuja. 19. Se detiene la reacción agregando 20 µ? de SDS al 10% a cada cavidad. 20. Se leen los resultados en un lector de ELISA Dynatech MR7000 con un filtro de prueba a 410 nm y un filtro de referencia a 630 nm.

Bioensavo de PYK2 Se usa este ensayo para medir la actividad de cinasa in vivo de pyk2 (FL.pyk-HA) completo marcado con epítopes HA en un ensayo de ELISA.

Materiales y reactivos: 1. Placas de ELISA Corning de 96 cavidades. 2. Anticuerpo monoclonal 12CA5 anti-HA (SUGEN, Inc.) 3. PBS (Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Catálogo Gibco#450-1300EB) 4. Buffer TBST: para obtener 1 I, se mezclan 8.766 g de NaCI, 6.057 g de TRIS y 1 mi de Tritón X-100 al 0.1% en aproximadamente 900 mi de dHaO. Se ajusta el pH a 7.2 se lleva el volumen a 1L. 5. Buffer de bloqueo: para obtener 1 I, se mezclan 100 g de BSA al 10%, 12.1g de TRIS 100 Mm, 58.44 g de NaCI 1 M y 10 mi de TWEEN-20 al 1%. 6. Usados de células FL.pyk2-HA de sf9 (SUGEN, Inc.) 7. 4% de DMSO en MilliQue H20. 8. ATP 10 mM en dH20. 9. MnC½ 1 M. 10. MgCI2 1 M. 11. Ditothreitol (DTT) 1 M. 12. Buffer de fosforilación de cinasas 10X: se mezclan 5.0 mi de Hepes 1 M (pH 7.5), 0.2 mi de MnC½ 1 M, 1.0 mi de MgCI2 1M, 1.0 mi de Tritón X-100 al 10% en 2.8 mi de dH20. Justo antes de usarlo se agregan 0.1 mi de DTT 1M. 13. Placas de polipropileno NUNC de 96 cavidades de fondo en V. 14. EDTA 500 mM en dH20. 15. Buffer de dilución de anticuerpos: para obtener 100 mi, se mezcla 1 mi de BSA AL 5%/PBS y 1 mi de Tween-20 al 10% en 88 mi de TBS. 16. Anti-Ptyr PY99 conjugado con HRP, Santa Cruz Biotech Catálogo N° SC-7020. 17. ABTS, Moss, Catálogo N° ABST-2000. 18. 10% de SDS Procedimiento: 1. Se cubren las placas Corning de ELISA de 96 cavidades con 0.5 µ9 por cavidad de anticuerpo 12AS5 anti-HA en 100 µ? de PBS. Se almacena por una noche a 4°C. 2. Se retira el anticuerpo HA no unido de las cavidades invirtiendo la placa. Se lava la placa con dH20. Se frota la placa con una toalla de papel para retirar el líquido en exceso. 3. Se agregan 150 µ? de Buffer del Bloqueo a cada cavidad. Se incuba, con agitación, por 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Se lava la placa 4x con TBS-T. 5. Se diluye él lisado en PBS (1.5 µg de lisado/100 µ? de PBS). 6. Se agregan 100 µ? de lisado diluido a cada cavidad. Se agita a temperatura ambiente por 1 hora. 7. Se lava como en el paso 4. 8. Se agregan 50 µ? de buffer cinasa 2X a la placa de ELISA que contiene la pyk2-HA capturada. 9. Se agregan 25 µ? del compuesto de prueba 400 µ en DMSO al 4% a cada cavidad. Para las cavidades control, se usa DMSO al 4% solo. 10. Se agregan 25 µ? de EDTA 0.5 M a las cavidades de control negativo. 11. Se agregan 25 µ? de ATP 20 µ? a todas las cavidades. Se incuba, con agitación, por 10 minutos. 12. Se detiene la reacción agregando 25 µ? de EDTA 500 mM (pH 8.0) a todas las cavidades. 13. Se lava como en el paso 4. 14. Se agregan 100 µ? de anti-Ptyr conjugado con HRP diluido 1 : 6000 en Buffer de Dilución de Anticuerpos a cada cavidad. Se incuba, con agitación, por 1 hora a temperatura ambiente. 15. Se lava la placa 3X con TBST y 1X con PBS. 16. Se agregan 100 µ? de solución ABST a cada cavidad. 17. Si resulta necesario, se detiene la reacción de revelado agregando 20 µ? SDS al 10% a cada cavidad. 18. Se lee la placa en un lector de ELISA con un filtro de prueba a 4 0 nm y un filtro de referencia a 630 nm.

Bioensavo de FGFR1 Este ensayo se usa para medir la actividad de cinasa in vitro de FGF1-R en un ensayo de ELISA.

Materiales y Reactivos 1. Placas de ELISA Costar de 96 cavidades (Catálogo Corning # 3369). 2. Poli(Glu-Tyr) (Catálogo Sigma # P0275). 3. PBS (Catálogo Gibco # 450-1300EB) 4. Solución Buffer Hepes 50 mM. 5. Buffer de Bloqueo (BSA al 5%/PBS) 6. GST-FGFR1 purificado (SUGEN, Inc.) 7. Buffer de Dilución de Cinasa. Se mezclan 500 µ? de Hepes 1 M (GIBCO), 20 µ? de BSA al 5%/PBS, 10 µ? de ortovanadato de sodio 100mM y 50 µ? de NaCI 5M. 8. ATP 10 mM 9. Mezcla de fosforilación ATP/MnC^: se mezclan 20 µ? de ATP, 400 µ? de MnCI2 1 M y 9.56 mi de dH2O. 10. Placas de polipropileno NUNC de 96 cavidades con fondo en V (Catálogo Applied Scientific # AS-72092). 11. EDTA 0.5 M. 12. 0.05% de TBST Se agregaron 500 µ? de TWEEN a 1 litro de TBS. 13. Suero policlonal de conejo anti-fosfotirosina (SUGEN, Inc.). 14. Conjugado anti conejo de IgG peroxidasa (Biosource, Catálogo #ALI0404). 15. Solución de ABTS. 16. Solución de ABTS/H2O2.

Procedimiento 1. Se cubren las placas de ELISA Costar de 96 cavidades con 1 µ9 por cavidad de Poli(Glu, Tyr) en 100 µ? de PBS. Se almacena por una noche a 4°C. 2. Se lavan las placas cubiertas una vez con PBS. 3. Se agregan 150 µ? de BSA al 5%/PBS Buffer de Bloqueo a cada cavidad. Se incuba, con agitación, por 1 hora a temperatura ambiente. 4. Se lava la placa 2x con PBS, luego una vez con Hepes 50 mM. Se frotan las placas contra una toalla de papel para retirar el líquido en exceso y las burbujas. 5. Se agregan 25µ? de compuesto de prueba 0.4 mM en DMSO al 4% o DMSO al 4% solo (controles) a la placa. 6. Se diluye el GST-FGFR1 purificado en Buffer de Dilución de Cinasa (5 ng de 2 cinasa/50 ul de KDB/cavidad). 7. Se agregan 50 µ? de cinasa diluida a cada cavidad. 8. Se comienza la reacción de la cinasa agregaron 25 µ?/cavidad de ATP/Mn++ preparado fresco (0.4 mi de Mncl2 1 M, 40 µ? de ATP 10 mM, 9.56 mi de dH2O, preparado fresco). 9. Esta es una primera reacción de cinasa y debe detenerse con 25 µ? de EDTA 0.5 M de una manera similar al agregado de ATP. ,10. Se lava la placa 4x con TBST fresco. 11. Se prepara el Buffer de Dilución de Anticuerpos: para obtener 50 mi: se mezclan 5 mi de BSA al 5%, 250 µ? de 5% de leche y 50 µ? de vanadato de sodio 100 mM, se lleva hasta el volumen final con 0.05% de TBST. 12. Se agregan 100 µ? por cavidad de anti-fosfotirosina (dilución 1 : 10000 en ADB). Se incuba, con agitación por 1 hora a temperatura ambiente. 13. Se lava como en el paso 10. 14. Se agregan 100 µ? por cavidad de conjugado de peroxidasa Biosource de cabra anti conejo (dilución 1 : 6000 en ADB). Se incuba, con agitación, por 1 hora a temperatura ambiente. 15. Se lava como en el paso 10 y luego con PBS para retirar las burbujas y el exceso de TWEEN. 16. Se agregan 100 µ? de solución de ABTS/H202 a cada cavidad. 17. Se incuba, con agitación, por 10 a 20 minutos. Se retira cualquier burbuja. 18. Se lee el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000: filtro de prueba a 410 nm, filtro de referencia a 630 nM.

Bioensavo de EGFR Se usa este ensayo para medir la actividad cinasa in vitro de FGF1-R en un ensayo de ELISA.

Materiales y Reactivos 1. Placas de ELISA Corning de 96 cavidades. 2. Anticuerpo SUM01 monoclonal anti-EGFR (SUGEN, Inc.). 3. PBS 4. Buffer TBST 5. Buffer de Bloqueo: para obtener 100 mi, se mezclan 5.0 g de leche Carnation Instant Non-fat Milk® con 100 mi de PBS. 6. Lisado de células A431 (SUGEN, Inc.). 7. Buffer TBS: 8. TBS + 10% de DMSO: para obtener 1 I, se mezclan 1.514 g de TRIS, 2.192 g de NaCI y 25 mi de DMSO; se lleva hasta un volumen total de 1 litro con dH20. 9. ATP (Adenosina-5'-trifosfato, de músculo de equino, Sigma, Catálogo N° A-5394), solución 1.0 mM en dH20. Este reactivo debería prepararse inmediatamente antes de usarlo y mantenerse en hielo. 10. MnCI2 .0 mM. 11. Mezcla de fosforilación ATP/MnCI2: para preparar 10 mi, se mezclan 300 µ? de ATP 1 mM, MnCI2 500 µ? y 9.2 mi de dH20. Se prepara justo antes de usarla, se mantiene en hielo. 12. Placas de polipropileno NUNC de 96 cavidades con fondo en V. 13. EDTA. 14. Suero de conejo policlonal anti-fosfotirosina (SUGEN, Inc.). 15. Conjugado anti conejo de IgG peroxidasa de cabra (Biosource, Catálogo N° ALI0404). 16. ABTS. 17. 30% de peróxido de hidrógeno. 18. ABTS/H202. 19. HCI 0.2 M.

Procedimiento 1. Se cubren las placas Corning de ELISA de 96 cavidades con 0.5 µg de SU 01 en 100 µ? PBS por cavidad, se almacena por una noche a 4°C. 2. Se retira el SUM01 no unido de las cavidades invirtiendo la placa para eliminar el líquido. Se lava 1x con dH20. Se frota la placa contra una toalla de papel para retirar el líquido en exceso. 3. Se agregan 150 µ? de Buffer de Bloqueo a cada cavidad. Se incuba, con agitación, por 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Se lava la placa 3x con agua deionizada, luego una vez con TBST. Se frotan las placas contra una toalla de papel para retirar el líquido en exceso y las burbujas. 5. Se diluye el lisado en PBS (7 µg de lisado/100 µ? de PBS). 6. Se agregan 00 µ? de lisado diluido a cada cavidad. Se agita a temperatura ambiente por 1 hora. 7. Se lavan las placas como en 4, anteriormente. 8. Se agregan 120 µ? de TBS a la placa de ELISA que contiene el EGFR capturado. 9. Se diluye el compuesto de prueba 1 : 10 en TBS, se lo coloca en la cavidad. 10. Se agregan 13.5 µ? de compuesto de prueba diluido a la placa de ELISA. A las cavidades control, se agregan 13.5 µ? de TBS en DMSO al 10%. 1. Se incuban, con agitación, por 30 minutos a temperatura ambiente. 12. Se agregan 15 µ? de buffer de fosforilación, se mezclan en todas las cavidades excepto en la cavidad de control negativo. El volumen final de las cavidades debería ser de aproximadamente 150 µ?, con una concentración final de ATP 3 µ?/????2 5 m en cada cavidad. Se incuba con agitación por 5 minutos. 13. Se detiene la reacción agregando 16.5 µ? de solución de EDTA con agitación. Se agita por otro minuto. 14. Se lava 4x con agua deionizada, 2x con TBST. 15. Se agregan 100 µ? de anti-fosfotirosina (dilución 1: 3000 en TBST) por cavidad. Se incuba, con agitación, por 30-45 minutos a temperatura ambiente. 16. Se lava como en 4, anteriormente. 17. Se agregan 100 µ? de Conjugado Biosource anti conejo de IgG peroxidasa de cabra (dilución 1 : 2000 en TBST) a cada cavidad.

Se incuba con agitación por 30 minutos a temperatura ambiente. 18. Se lava como en 4, anteriormente. 19. Se agregan 100 µ? de solución de ABTS/H202 a cada cavidad. 20. Se incuba por 5 a 10 minutos con agitación. Se retira cualquier burbuja. 21. Si resulta necesario, se detiene la reacción agregando 100 µ? de HCI 0.2 M por cavidad. 22. Se lee el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000: filtro de prueba a 410 nm, filtro de referencia a 630 nm.

Bioensavo de PDGFR Se usa este ensayo para medir la actividad de cinasa ¡n vivo de FGF1-R en un ensayo de ELISA.

Materiales y Reactivos 1. Placa de ELISA Corning de 96 cavidades 2. Anticuerpo 28D4C10 monoclonal anti-PDGFR (SUGEN, Inc.). 3. PBS. 4. Buffer TBST. 5. Buffer de Bloqueo (el mismo que para el bioensayo de EGFR). 6. Usado de células PDGFR-ß que expresa NIH 3T3 (SUGEN, Inc.). 7. BufferTBS. 8. TBS + DMSO al 10%. 9. ATP. 10. MnCI2. 1 . Mezcla de buffer de fosforilación de cinasa: para obtener 10 mi, se mezclan 250 µ? de TRIS 1 M, 200 µ? de NaCI 5M, 100 µ? de nCI2 1 M y 50 µ? de Tritón -X100 100 mM en suficiente dH20 para preparar 10 mi. 12. Placas de polipropileno NUNC de 96 cavidades con fondo en V. 13. EDTA. 14. Suero de conejo policlonal anti-fosfotirosina (SUGEN, Inc.). 15. Conjugado anti conejo de IgG peroxidasa de cabra (Biosource, Catálogo N° ALI0404). 16. ABTS. 17. Peróxido de hidrógeno, solución al 30%. 18. ABTS/H202. 19. - HCI 0.2 M.

Procedimiento 1. Se cubren las placas Corning de ELISA de 96 cavidades con 0.5 µg de 28D4C10 en 100 µ? de PBS por cavidad, se almacena por una noche a 4°C. 2. Se retira el 28D4C10 no unido de las cavidades invirtiendo la placa para eliminar el líquido. Se lava 1x con dl-feO. Se frota la placa contra una toalla de papel para retirar el líquido en exceso. 3. Se agregan 150 µ? de Buffer de Bloqueo a cada cavidad. Se incuba por 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. 4. Se lava la placa 3x con agua deionizada, luego una vez con TBST. Se frotan las placas contra una toalla de papel para retirar el líquido en exceso y las burbujas. 5. Se diluye el lisado en HNTG (10 µg de lisado/100 µ? de HNTG). 6. Se agregan 100 µ? de lisado diluido a cada cavidad. Se agita a temperatura ambiente por 60 minutos. 7. Se lava la placa como se describen en el paso 4. 8. Se agregan 80 µ? de buffer de trabajo de quinas, se mezclan en la placa de ELISA que contiene el PDGFR capturado. 9. Se diluye el compuesto de prueba 1: 10 en TBS en placas de polipropileno de 96 cavidades. 10. Se agregan 10 µ? de compuesto de prueba diluido a la placa de ELISA, A las cavidades control, se agregan 10 µ? TBS + DMSO al 10%. Se incuba con agitación por 30 minutos a temperatura ambiente. 11. Se agregan 10 µ? de ATP directamente a todas las cavidades, excepto a la cavidad de control negativo (el volumen final por cavidad debería ser de aproximadamente 100 µ? con ATP 20 µ? en cada cavidad). Se incuba por 30 minutos con agitación. 12. Se detiene la reacción agregando 10 µ? de solución de EDTA a cada cavidad. 13. Se lava 4x con agua deionizada, dos veces con TBST. 14. Se agregan 100 µ? de anti-fosfotirosina (dilución 1 :3000 en TBST) por cavidad. Se incuba con agitación por 30-45 minutos a temperatura ambiente. 15. Se lava como en el paso 4. 16. Se agregan 100 µ? Conjugado Biosource anti conejo de IgG peroxidasa de cabra (dilución 1 : 2000 en TBST) a cada cavidad. Se incuba con agitación por 30 minutos a temperatura ambiente. 17. Se lava como en el paso 4. 18. Se agregan 100 µ? de solución de ABTS/H2O2 a cada cavidad. 19. Se incuba por 10 a 30 minutos con agitación. Se retira cualquier burbuja. 20. Si resulta necesario, se detiene la reacción con el agregado de 100 µ? de HCI 0.2 M por cavidad. 21. Se lee el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000 con un filtro de prueba a 410 nm y un filtro de referencia a 630 nm.

Ensayo celular de HER-2 Cinasa Se usa este ensayo para medir la actividad de la HER-2 cinasa en células completas en un formato de ELISA. 1. DMEM (Catálogo Gibco #1 965-092). 2. Suero Fetal Bovino (FBS, Catálogo Gibco # 16000-044), inactivo con calor en un baño de agua por 30 minutos a 56°C 3. Tripsina (Catálogo Gibco # 25200-056). 4. L-Glutamina (Catálogo Gibco # 25030-081) 5. HEPES (Catálogo Gibco # 15630-080). 6. Medio de Crecimiento Se mezclan 500 mi de DMEM, 55 mi de FBS inactivado con calor, 0 mi de HEPES y 5.5 mi de L-Glutamina. 7. Medio de Hambreado Se mezclan 500 mi de DMEM, 2.5 mi de FBS inactivado con calor, 10 mi de HEPES y 5.5 mi de L-Glutamina. 8. PBS. 9. Placas de microtitulación de cultivo de tejido de 96 cavidades de fondo plano (Catálogo Corning # 25860). 10. Platos de cultivo de tejido de 15 cm (Catálogo Corning # 08757148). 1. Placas de ELISA Corning de 96 cavidades. 12. Placas de polipropileno NUNC de 96 cavidades con fondo en V. 13. Cartuchos de transferencia Costar para el Transtar 96 (Catálogo Costar # 7610). 14. Anticuerpo SUMO 1 monoclonal anti-EGFR (SUGEN, Inc.). 15. BufferTBST. 16. Buffer de Bloqueo: 5% de leche Carnation Instant Milk® en PBS. 17. Ligando EGF: EGF-201 , Shinko American, Japón. Se suspende el polvo en 100 ul de HCI 10mM. Se agregan 100 ul de NaOH 10 mM. Se agregan 800 ul de PBS y se lo transfiere a un tubo Eppendorf, se almacena a -20°C hasta que está listo para usar. 18. Buffer de Lisis HNTG Para obtener una solución madre 5X de HNTG, se mezclan 23.83 g de Hepes, 43.83 g de NaCI, 500 mi de glicerol y 100 mi de Tritón X-100 con suficiente dH20 para prepara 1 I de solución total. Para obtener HNTG 1X*, se mezclan 2 mi de HNTG, 100 µ? de Na3V040.1 M, 250 µ? de Na4P2070.2 M y 100 µ? de EDTA. 19. EDTA. 20. Na3V04. Para preparar la solución madre, se mezclan 1.84 g de Na3V04 con 90 mi de dH20. Se ajusta el pH a 10. Se hierve en un microondas por un minuto (la solución se toma clara). Se enfría hasta temperatura ambiente. Se ajusta de pH a 10. Se repite el ciclo de calentamiento/enfriamiento hasta que el pH permanece en 10. 21. Na4P2O7200 mM. 22. Antisuero policlonal de conejo específico para fosfotirosina (anticuerpo anti-Ptyr, SUGEN, Inc.). 23. Antisuero purificado por afinidad, anticuerpo de cada anti-lgG de conejo, conjugado de peroxidasa (Catálogo Biosource # ALI0404). 24. Solución de ABTS. 25. Solución de peróxido de hidrógeno al 30%. 26 ABTS/H202. 27. HCI 0.2 M.

Procedimiento 1. Se cubren las placas Corning de ELISA de 96 cavidades con SUM01 a 1.0 ug por cavidad en PBS, 100 ul de volumen final/cavidad. Se almacena por una noche a 4°C. 2. El día del uso, se retira el buffer de cobertura y se lava la placa 3 times con dH20 y una vez con Buffer TBST. Todos los lavados en este ensayo deberían hacerse de este modo, a menos que se especifique algo diferente. 3. se agregan 100 ul de Buffer de Bloqueo a cada cavidad. Se incuba la placa, con agitación, por 30 minutos a temperatura ambiente. Justo antes del uso, se lava la placa. 4. Se usa la EGFr/quimera HER-2/línea de células 3T3-C7 para este ensayo. 5. Se eligen placas que tienen una confluencia del 80 al 90%. Se colectan las células por tripsinizacion y se las centrifuga a 1000 rpm a temperatura ambiente por 5 minutos. 6. Se suspenden nuevamente las células en medio de hambreado y se las cuenta con azul tripan. Se requiere una viabilidad superior al 90%. Se siembran las células en medio de hambreado a una densidad de 2500 células por cavidad, 90 ul por cavidad, en una placa de microtitulación de 96 cavidades. Se incuban las células sembradas por una noche a 37°C bajo 5% de C02. 7. Se inicia el ensayo dos días después de sembrar. 8. Los compuestos de prueba se disuelven en D SO al 4%. Las muestras se diluyen luego adicionalmente directamente en las placas de DMEM para hambreado. Típicamente, esta dilución será de 1: 10 o mayor. Se transfieren luego todas las cavidades a la placa de células con una dilución adicional de 1: 10 (se coloca una muestra de 10 µ? en 90 µ? de medio de hambreado). La concentración final de DMSO debería ser de 1% o menor. Puede usarse también una dilución serial común. 9. Se incuba bajo 5% de CO2 a 37°C por 2 horas. 10. Se prepara el ligando EGF diluyendo la solución madre de EGF (16.5 uM) en DMEM tibio hasta 150 nM. 11. Se prepara el HNTG* fresco en cantidad suficiente para obtener 100 ul por cavidad; se lo coloca en hielo. 12. Después de incubar por 2 horas con el compuesto de prueba, se agregan los ligandos EGF preparados a las células, 50 ul por cavidad, para una concentración final de 50 nM. Las cavidades de control positivo reciben la misma cantidad de EGF. Los controles negativos no reciben EGF. Se incuba a 37°C por 10 minutos. 13. Se retira el compuesto de prueba, el EGF y el DMEM. Se lavan las células una vez con PBS. 14. Se transfiere el HNTG* a las células, 100 ul por cavidad. Se coloca en hielo por 5 minutos. Entretanto, se retira el Buffer de Bloqueo de la placa de ELISA y se lava. 15. Se separan células de la placa con una micropipeta y se homogeiniza el material celular aspirando repetidamente y dispersando el buffer de lisis HNTG*. Se transfiere el lisado a una placa de ELISA cubierta, bloqueada y lavada, o se usa un cartucho o transferencia Costar para transferir el lisado a la placa. 16. Se incuba, con agitación, a temperatura ambiente por 1 hora. 17. Se retira el lisado, se lava. Se transfiere el anticuerpo anti-Ptyr diluido fresco (1: 3000 en TBST) a la placa de ELISA, 100 ul por cavidad. 18. Se incuba, con agitación, a temperatura ambiente, por 30 minutos. 19. Se retira el anticuerpo anti-Ptyr, se lava. Se transfiere el anticuerpo BIOSOURCE diluido fresco a la placa de ELISA (1 : 8000 en TBST, 100 ul por cavidad). 20. Se incuba, con agitación, a temperatura ambiente por 30 minutos. 21. Se retira el anticuerpo BIOSOURCE, se lava. Se transfiere la solución de ABTS/H202 preparada fresca a la placa de ELISLA, 100 ul por cavidad. 22. Se incuba, con agitación, por 5-10 minutos. Se retira cualquier burbuja. 23. Se detiene la reacción con el agregado de 100 ul de HCI 0.2 por cavidad. 24. Se lee el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000. con un filtro de prueba fijado a 410 nm y un filtro de referencia a 630 nm.

Ensayo de cdk2/ciclina A Se usa este ensayo para medir la actividad ¡n vivo de serin/treonin cinasa de la cdk2/ciclina A humana en un Ensayo de Proximidad de centelleo (SPA).

Materiales y Reactivos 1. Placas de tereftalato de polietileno Wallac de 96 cavidades (flexi) (Wallac, Catálogo # 1450-401). 2. ATP Amersham Redivue |y"P] (Catálogo Amersham #AH 9968). 3. Esferas SPA Amersham de poliviniltolueno cubiertas con estreptavidina (Catálogo Amersham # RPNQ0007). Las esferas deberían reconstituirse en PBS sin magnesio o calcio, a 20 mg/ml. 4. Complejo activado de enzimas cdk2/ciclina A purificado a partir de células Sf9 (SUGEN, Inc.). 5. Péptido substratobiotinilado (Debtide). El péptido biotin-X-PKTPKKAKKL se disuelve en dH20 a una concentración de 5 mg/ml. 6. Mezcla de péptido/ATP: para obtener 10 mi, se mezclan 9.979 mi de dH2O, 0.00125 mi de ATO "frío", 0.010 mi de Debtide y 0.010 mi de ?33? ATP. La concentración final por cavidad será de 0.5 µ? de ATP "frío", 0.1 µg de Debtide y 0.2 µ?\ ?33????. 7. Buffer de Cinasa: para obtener 10 mi, se mezclan 8.85 mi de dH2O, 0.625 mi de TRIS (pH 7.4), 0.25 mi de MgCI2 1 M, 0.25 mi de NP40 al 10% y 0.025 mi de DTT 1 M, agregado fresco justo antes del uso. 8. ATP 10 mM en dH20. 9. TRIS 1 M, pH ajustado a 7.4 con HCI. 10. MgCI2 1 M. 11. DTT 1 M. 12. PBS (Catálogo Gibco # 14190-144). 13. EDTA 0.5 M. 14. Solución de Detención: Para obtener 10 mi, se mezclan 9.25 mi de PBS, 0.005 mi de ATP 100 mM, 0.1 mi de EDTA 0.5 M, 0.1 mi de 10% Tritón X-100 y 1.25 mi de 20 mg/ml de esferas SPA.

Procedimiento 1. Se preparan soluciones de compuestos de prueba a 5 veces la concentración final deseada en DMSO al 5%. Se agregan 10 ul a cada cavidad. Para los controles negativos, se usan 10 ul de DMSO al 5% solo en las cavidades. 2. Se diluyen 5 µ? de solución de cdk2/ciclina A con 2.1 mi de butter de cinasa 2x. 3. Se agregan 20 ul de enzima a cada cavidad. 4. Se agregan 10 µ? de EDTA 0.5 M a las cavidades de control negativo. 5. Para comenzar la reacción de las cinasas, se agregan 20 µ? de mezcla de péptido/ATP a cada cavidad. Se incuba por 1 hora, sin agitación. 6. Se agregan 200 µ? de solución de detención a cada cavidad. 7. Se espera al menos 10 minutos. 8. Se centrifuga la placa a aproximadamente 2300 rpm por 3-5 minutos. 9. Se cuenta la placa usando con Trilux o un lector similar.

Ensayo de met transforforilación Se usa este ensayo para medir los niveles de fosfotirosina en un substratode poli (ácido glutámico: tirosina (4:1)) como medio de identificación de agonistas/antagonistas de met transfosforilación del sustrato.

Materiales y Reactivos 1. Placas de ELISA Corning de 96 cavidades, Catálogo Corning # 25805-96. 2. Poli(glu, tyr)4: 1 , Sigma, Catálogo N° P 0275. 3. PBS, Catálogo Gibco # 450-1300EB 4. HEPES 50 mM 5. Buffer de Bloqueo: Se disuelven 25 g de Albúmina de Suero Bovino, Catálogo Sigma N° A-7888, en 500 mi de PBS, se filtra a través de un filtro de 4 µ??. 6. Proteína de fusión GST que contiene el dominio de la Met cinasa, Sugen, Inc. 7. Buffer TBST. 8. 10% de (MilliQue H20) DMSO acuoso. 9. 10 mM de (dH20) Adenosin-5 '-trifosfato acuoso, Sigma Catálogo N° A-5394. 10. Buffer de Dilución de Cinasa 2X: para obtener 100 mi, se mezclan 10 mi de Hepes 1 M a pH 7.5 con 0.4 mi de BSA al 5%/PBS, 0.2 mi de ortovanadato de sodio 0.1 M y 1 mi de cloruro de sodio 5 M en 88.4 mi de dH20. 11. Mezcla de reacción de ATP 4X: para obtener 10 mi, se mezclan 0.4 mi de cloruro de manganeso 1 M y 0.02 mi de 0.1 M ATP en 9.56 mi de dH20. 12. Mezcla de Controles Negativos 4X: para obtener 10 mi, se mezclan 0.4 mi de cloruro de manganeso 1 M en 9.6 mi de dH20. 13. Placas de polipropileno NUNC de 96 cavidades con fondo en V, Catálogo Applied Scientific # S-72092 14. EDTA 500 mM. 15. Buffer de Dilución de Anticuerpos: para obtener 100 mi, se mezclan 10 mi de BSA al 5%/PBS, 0.5 mi de 5% de leche Carnation Instant Milk® en PBS y 0.1 mi de ortovanadato de sodio 0.1 M en 88.4 mi de TBST. 16. Anticuerpo policlonal de conejo antofosfotirosina, Sugen, Inc. 17. Anticuerpo de cabra anti conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante, Biosource, Inc. 18. Solución de ABTS: para obtener 1 I, se mezclan 19.21 g de ácido cítrico, 35.49 g de Na2HP04 y 500 mg de ABTS con suficiente dH20 para preparar 1 1. 19. ABTS/H202: se mezclan 15 mi de solución de ABST con 2 µ? de H202 cinco minutos antes de usarlo.

Procedimiento 1. Se cubren las placas de ELISA con 2 µ9 de Poli(Glu-Tyr) en 100 µ! de PBS, se almacena por una noche a 4°C. 2. Se bloquea la placa con 150 µ? de BSA al 5%/PBS por 60 minutos. 3. Se lava la placa dos veces con PBS, una vez con buffer de HEPES 50 mM, pH 7.4. 4. Se agregaron 50 µ? de la cinasa diluida a todas las cavidades (Se diluye la cinasa purificada con Buffer de Dilución de Cinasa. La concentración final debería ser de 10 ng/cavidad). 5. Se agregan 25 µ? del compuesto de prueba (en DMSO al 4%) o DMSO solo (4% en dH20) a la placa, para los controles. 6. Se incuba la mezcla de cinasa/compuesto por 15 minutos. 7. Se agregan 25 µ? de MnCfe 40 mM a las cavidades de control negativo. 8. Se agregan 25 µ? de mezcla de ATP/MnCI2 a todas las otras cavidades (excepto a los controles negativos). Se incuba por 5 minutos. 9. Se agregan 25 µ? de EDTA 500 mM para detener la reacción. 10. Se lava la placa 3x con TBST. 11. Se agregan 100 µ? de anti-Ptyr policonal de conejo diluida 1: 10,000 en Buffer de Dilución de Anticuerpos a cada cavidad. Se incuba, con agitación,, a temperatura ambiente por una hora. 12. Se lava la placa 3x con TBST. 13. Se diluye el anticuerpo Biosource conjugado con HRP 1:6000 en Buffer de Dilución de Anticuerpos. Se agregan 100 µ? por cavidad y se incuba a temperatura ambiente, con agitación, por una hora. 14. Se lava la placa 1X con PBS. 15. Se agregan 100 µ? de solución de ABTS/H2O2 a cada cavidad. 16. Si resulta necesario, se detiene la reacción de revelado con el agregado de 100 µ? de HCI 0.2 M por cavidad. 17. Se lee la placa en un lector de ELISA Dynatech MR7000 con el filtro de prueba a 410 nm y el filtro de referencia a 630 nm.

Ensayo de transfosforilacion de IGF-1 Se usa este ensayo para medir el nivel de fosfotirosina en poli (ácido glutámico:tirosina) (4:1) de modo de identificar agonistas/antagonistas de la transforilación de gst-IGFG-1. 1. Placas de ELISA Corning de 96 cavidades. 2. Poli (Glu-tyr) (4:1), Sigma Catálogo N° P 0275. 3. PBS, Catálogo Gibco # 450-1300EB. 4. HEPES 50 mM 5. TBB Buffer de Bloqueo: para obtener 1 I, se mezclan 100 g de BSA, 12.1 g de TRIS (pH 7.5), 58.44 g de cloruro de sodio y 10 mi de TWEEN-20 al 1 %. 6. Proteína de fusión GST purificada que contiene el dominio IGF-1 de la cinasa (Sugen, Inc.) 7. Buffer TBST: para obtener 1 I, se mezclan 6.057 g de Tris, 8.766 g de cloro de sodio y 0.5 mi de TWEEN-20 con suficiente dH20 para prepara 1 litro. 8. DMSO al 4% en Milli-Q H20. 9. ATP 10 mM en dH20. 10. Buffer de Dilución de Cinasa 2X: para obtener 100 mi, se mezclan 10 mi de 1 M HEPES (pH 7.5), 0.4 mi de BSA al 5% en dH20, 0.2 mi de ortovanadato de sodio 0.1 M y 1 mi de cloruro de sodio 5 con suficiente dH20 para prepara 00 mi. 11. Mezcla de Reacción de ATP 4X: para obtener 10 mi, se mezclan 0.4 mi de MnCI2 1 M y 0.008 mi de ATP 0.01 M y 9.56 mi de dH20. Mezcla de Controles Negativos 12.4X: se mezclan 0.4 mi de cloruro de manganeso 1M en 9.60 mi de dH20. 13. Placas de polipropileno NUNC de 96 cavidades con fondo en V. 14. EDTA 500 mM en dH20. 15. Buffer de Dilución de Anticuerpos: para obtener 100 mi, se mezclan 10 mi de BSA al 5% en PBS, 0.5 mi de 5% leche Carnation Instant Non-fat Milk® en PBS y 0.1 ml de ortovanadato de sodio 0.1 M en 88.4 ml de TBST. 6. Anticuerpo antifosforina policional de conejo, Sugen, Inc. 17. Anticuerpo de cabra anti conejo conjugado con HRP, Biosurce. 18. Solución de ABTS. 20. ABTS/H202: se mezclan 15 ml de ABTS con 2 µ? de H202 5 minutos antes de usarlo. 21. HCI 0.2 M en dH20.

Procedimiento 1. Se cubre la placa de ELISA con 2.0 pg/cavidad de poli(Glu, Tyr) 4:1 (Sigma P0275) en 100 µ? de PBS. Se almacena la placa por una noche de 4o C. 2. Se lava la placa una vez con PBS. 3. Se agregan 10 pl de TBB Buffer de Bloqueo a cada cavidad. Se incuba la placa por 1 hora con agitación a temperatura ambiente. 4. Se lava la placa una vez con PBS, luego dos veces con buffer HEPES 50 mM, pH 7.5. 5. Se agregan 25 µ? de compuesto de prueba en DMSO al 4% (obtenido diluyendo una solución madre de compuesto de prueba 10 mM en DMSO al 100% con dH20) a la placa. 6. Se agregan 10.0 mg de gst-IGF- cinasa en 50 µ? de Buffer de Dilución de Cinasa) a todas la cavidades. 7. Se comienza la reacción de cinasa agregando 25 µ? de Mezcla de Reacción de ATP 4X a todas las cavidades de prueba y a las cavidades de control positivo. Se agregan 25 µ? de Mezcla de Controles Negativos 4X a todas las cavidades de control Negativo. Se incuba por 10 minutos con agitación a temperatura ambiente. 8. Se agregan 25 µ? de EDTA 0.5 M (pH 8.0) a todas las cavidades. 9. Se lava la placa 4x con Buffer TBST. 10. Se agrega antisuero policlonal de conejo anti-fosfotirosina a una dilución de 1 : 10000 en 100µ? de Buffer de Dilución de Anticuerpos a todas las cavidades. Se incuba, con agitación, a temperatura ambiente por 1 hora. 11. Se lava la placa como en el paso 9. 12. Se agregan 100 µ? de HRP Biosource anti conejo a una dilución de 1 : 10000 en Buffer de Dilución de Anticuerpos a todas las cavidades. Se incuba, con agitación, a temperatura ambiente por 1 hora. 13. Se lava la placa como en el paso 9, se sigue con un lavado con PBS para reducir las burbujas y el exceso de Tween-20. 14. Se revela agregando 100 µ?/cavidad de ABTS/H202 a cada cavidad. 15. Después de alrededor de 5 minutos, se lee en un lector de ELISA con un filtro de prueba de 410 nm y un filtro de referencia a 630 nm.

Ensayos de incorporación de BRDU Los siguientes ensayos usan células modificadas para que expresen un receptor seleccionado y luego evalúan el efecto de un compuesto de interés sobre la actividad de la síntesis de ADN inducida por ligando determinado la incorporación de BrdU en el ADN. Los siguientes materiales, reactivos y procedimientos son generales para cada uno de los ensayos de incorporación de BrdU. Se indican las variaciones en los ensayos específicos.

Materiales v Reativos 1. El ligando apropiado. 2. Las células modificadas apropiadas. 3. - Reactivo de marcado de BrdU: 10 mM, en PBS (pH 7.4) (Boehringer Mannheim, Alemania). 4. FixDenat: solución de fijación (lista para usar) (Boehringer Mannheim, Alemania). 5. Anti-BrdU-POD: anticuerpo de ratón conjugado con peroxidasa (Boehringer Mannheim, Alemania). 6. Solución de Sustrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB, Boehringer Mannheim, Alemania). 7. Solución de Lavado en PBS: 1X PBS, Ph 7.4. 8. Albúmina Bovina (BSA), fracción V de polvo (Sigma Chemical Co., E.U.A.).

Procedimiento General 1. Las células se siembran a razón de 8000 células/cavidad en 10% de CS, GIn 2 mM en DMEM, en una placa de 96 cavidades. Las células se incuban por una noche a 37°C e 5% de C02. 2. Después de 24 horas, las células se lavan con PBS, y luego se hambrean con suero en un medio libre de suero (0% de CS DMEM con 0.1 % de BSA) por 24 horas. 3. El día 3, el ligando apropiado y el compuesto de prueba se agregan a las células simultáneamente. Las cavidades de control negativo reciben DMEM libre de suero con 0.1 % de BSA solamente; las células de control positivo reciben el ligando pero ningún compuesto de prueba los compuestos de prueba se preparan en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 cavidades y se los diluye en forma serial para 7 concentraciones de prueba. 4. Después de 18 horas de activación de ligando, se agrega el reactivo diluido de marcado en BrdU (1 : 100 en DMEM, 0.1% BSA) y se incuban las células con BrdU (concentración final = 0µ?) por 1.5 horas. 5. Después de la incubación con reactivo de marcado, se retira el medio decantando y frotado la placa invertida en una toalla de papel. Se agrega solución FixDenat (50 µ?/cavidad) y se incuban las placas a temperatura ambiente por 45 minutos en un agitador de placas. 6. Se retira exhaustivamente la solución FixDenat decantando y frotando la placa invertida contra una toalla de papel. Se agrega leche (5% de leche deshidratada en PBS, 200 µ?/cavidad) como una solución de bloqueo y se incuba la placa por 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas. 7. - Se retira la solución de bloqueo por decantación y se lavan las cavidades una vez con PBS. Se agrega solución anti-BrdU-POD (dilución 1 :200 en PBS, 1% de BSA) (50 µ?/cavidad) y se incuba la placa por 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas. 8. Se retira exhaustivamente el conjugado de anticuerpos decantando y lavando las cavidades 5 veces con PBS, y se seca la placa por inversión y frotación contra una toalla de papel. 9. Se agrega solución de sustrato T B (100 µ?/cavidad) y se la incuba por 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas hasta que el revelado de color es suficiente para una detección forométrica. 10. Se mide la absorbancia de las muestras a 410 nm (en el modo de "doble longitud de onda" con una lectura de filtro a 490 nm como longitud de onda de referencia ) en un lector Dynatech de placas de ELISA.

Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por EGF Materiales y Reactivos 1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japón). 2. 3T3/EGFRc7.

Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por EGF conducida Materiales y Reativos 1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japón). 2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr con un dominio de cinasa Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por EGF conducida Materiales y Reativos 3. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japón). 4. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr con un dominio de cinasa Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por PDGF Materiales y Reativos 1. PDGF B/B humana (Boehringer Mannheim, Alemania). 2. - 3T3/EGFRc7.

Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por FGF Materiales v Reativos 1. FGF2/bFGF humana (Gibco BRL, E.U.A.). 2. 3T3c7/EGFr Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por IGF-1 Materiales y Reativos 1. G511 humana recombinante (Promega Corp., E.U.A.) 2. 3T3/IGF1r Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por Insulina Materiales y Reativos 1. Insulina, cristalina, bovina, Cinc (13007, Gibco BRL, E.U.A.). 2. 3T3/H25.

Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por HGF Materiales y Reativos 1. HGF humana recombinante (Catálogo No 249-HG, R&G Systems, Inc. E.U.A.). 2. Células BxPC-3 (ATCC CRL-1687).

Procedimiento 1. Se siembran las células a razón de 9000 células/cavidad en RPMI con 10% de FBS en una placa de 96 cavidades. Las células se incuban por una noche a 37° C en 5% de C02. 2. Después de 24 horas, las células se lavan con PBS, y luego se hambrean en suero en 100 pl de medio libre de suero (RPMI con 0.1% de BSA) por 24 horas. 3. El día 3, se agregan 25 µ? que contienen ligando (preparados a razón de 1 pg/ml en RPMI con 0.1% de BSA; la concentración final de HGF es de 200 ng/ml) y los compuestos de prueba a las células. Las cavidades de control negativo reciben 25 µ? de RPMI libre de suero con 0.1% de BSA solamente; las células de control positivo reciben el ligando (HGF) pero ningún compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan a 5 veces su concentración final en RPMI libre de suero con ligando en una placa de 96 cavidades, y se diluyen en forma serial para dar 7 concentraciones de prueba. Típicamente, la mayor concentración final de compuesto de prueba es de 100 µ y se usan dilusiones de 1 : 3 (es decir, un rango de concentración final de compuesto de prueba de 0.137-100 µ?). 4. Después de 18 horas de activación de ligando, se agregan 12.5 µ? de reactivo diluido de marcado con BrdU (1: 100 RPMI, 0.1% de BSA) a cada cavidad y se incuban las células con BrdU (la concentración final es de 10µ?) por hora. 5. Igual que el Procedimiento General. 6. Igual que el Procedimiento General. 7. Se retira la solución de bloqueo por decantación y se lavan las cavidades una vez con PBS. Se agrega solución anti-BrdU-POD (dilución 1 : 100 en PBS, 1% de BSA) (100 µ?/cavidad) y se incuba la placa por 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placas. 8. Igual que el Procedimiento General. 9. Igual que el Procedimiento General. 10. Igual que el Procedimiento General.

Ensayo de HUV-EC-C Se usa este ensayo para medir la actividad de un compuesto contra PDGF-R, FGR-R, VEGF, FGF o Flk-1/KDR, todos los cuales son expresados por células HUV-EC.

Día O 1. Se lavan y se tripsinizan celias HUV-EC-C (células endoteliales de la vena umbilical humana, (Colección Americana de Tipos de Cultivo, Catálogo No 1730 CRL). Se lava con solución salina tamponada de Dulbecco (D-PBS, obtenida de Gibco BRL, Catálogo No. 14190-029) 2 veces a alrededor de 1 ml/frasco de cultivo de tejido de 10 cm2. Se tripsiniza con 0.05% de tripsina-EDTA en una solución no enzimática de disociación de células (Sigma Chemical Company, Catálogo No. C- 544). La tripsina al 0.05% se prepara diluyendo 0.25% de tripsina/EDTA 1 mM (Gibco, Catálogo No. 25200-049) en la solución de disociación de células. Se tripsiniza con alrededor de 1 ml/frasco de cultivo de tejidos de 25-30 cm2 por alrededor de 5 minutos a 37° C. Después de que las células se han desprendido del frasco, se agrega un volumen igual de medio de ensayo y se lo transfiere a un tubo estéril de centrífuga de 50 mi (Fisher Scientific, Catálogo No. 05-539-6). 2. Se laven las células con alrededor de 35 mi de medio de ensayo en un tubo estéril de centrífuga de 50 mi agregando el medio de ensayo, se centrifuga por 10 minutos a aproximadamente 200 x G, se aspira el sobrenadante y se suspende nuevamente con 35 mi de D-PBS. Se repite el lavado dos veces más con D-PBS, se suspenden nuevamente las células en alrededor de 1 mi de medio de ensayo/frasco de cultivo de tejidos de 5 cm2. El medio de ensayo consiste en medio F12D (Gibco BRL, Catálogo No. 2 127-014) y 0.5% de Suero Fetal Bovino inactivado por calor. Se cuentan las células con un contador Coulter® (Coulter Electronic, Inc.) y se agrega medio de ensayo a las células para obtener una concentración de 0.8-1.0 x 105 células/ml. 3. Se agregan células a placas de 96 cavidades de fondo plano a razón de 100 µ?/cavidad o 0.8-1.0 x 104 células/cavidad, se incuba aproximadamente por 24 horas a 37° C, en 5% de CO2.

Día 1 1. Se preparan titulaciones dobles de compuesto de prueba en placas separadas de 96 cavidades, generalmente desde 50 µ? hasta ?µ?. Se usa el mismo medio de ensayo que se mencionó en el día 0, paso 2 anterior. Las titulaciones se hacen agregando 90 µ?/cavidad de compuesto de prueba a 200 µ (4X la concentración final por cavidad) a la cavidad superior de una columna particular de la placa. Como la solución madre de compuesto de prueba es comúnmente 20 mM en DMSO, la concentración de droga 200 µ? contiene 2% de DMSO. Se usa un diluyente preparado en 2% de DMSO en medio de ensayo (F12K + 0.5% de Suero Fetal Bovino) como diluyente para las titulaciones con compuesto de prueba con el fin de diluir el compuesto de prueba y mantener constante la concentración de DMSO. Se agrega este diluyente a las cavidades restantes en la columna en una cantidad de 60 µ?/cavidad. Se toman 60 µ? de los 120 µ? de la dilución 200 µ? de compuesto de prueba en la cavidad superior de la columna y se los mezcla con los 60 µ? en la segunda cavidad de la columna. Se toman 60 µ? de esta cavidad y se los mezcla con los 60 µ? en la tercera cavidad de la columna, y así hasta que se completan titulaciones dobles. Cuando se mezclan la primera y la última cavidad, se toman 60 µ? de los 120 pl en esta cavidad y se los descarta. Se deja la última cavidad con 60 µ? de DMSO/medio diluyente a modo de control que no contiene compuesto de prueba. Se hacen 9 columnas de compuesto de prueba titulado, suficiente para triplicar las cavidades, cada una por: (1) VEGF (obtenido de Pepro Tech Inc., Catálogo No. 100-200, (2) factor de crecimiento endotelial (ECGF) (también conocido como factor de crecimiento de fibroblastos ácido, o aFGF) (obtenido de Boehringer Mannheim Biochemica, Catálogo No. 1439 600), o (3) PDGF B/B humana (1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania), y medio de ensayo control. El ECGF viene como una preparación con heparina de sodio. 2. Se tranfiere 50 µ?/cavidad de las diluciones de compuesto de prueba a las placas de ensayo de 96 cavidades que contiene las 0.8-1.0x104 células/100 µ?/cavidad de las células HUV-EC-C desde el día 0 y se incuba por aproximadamente 2 horas a 37° C, bajo 5% de CO2. 3. Por triplicado, se agregan 50 µ?/cavidad de 80 µgl/ml de VEGF, 20 ng/ml de ECFG, o medio de control a cada condición de compuesto de prueba. Al igual que con los compuestos de prueba, las concentraciones de los factores de crecimiento son 4X la concentración final deseada. Se usa el medio de ensayo del día 0, paso 2 para preparar las concentraciones de factores de crecimiento. Se incuba aproximadamente por 24 horas a 37° C, bajo 5% de C02. Cada cavidad tendrá 50 µ? de dilución de compuesto de prueba, 50 µ? de factor de crecimiento o medio, y 100 µ? de células, lo que brinda un total de 200 µ?/cavidad. Así, las concentraciones 4X de compuesto de prueba y de factores de crecimiento se convierte en 1X una vez que se ha agregado todo a las cavidades.

Día 2 1. Se agrega 3H-timidina (Amersham, Catálogo N. TRK-686) a 1 pCi/cavidad (??µ?/cavidad de una solución de 100 pC /ml preparada en medio de RPMI + 10% Suero Fetal Bovino inactivado con calor) y se incuba aproximadamente por 24 horas a 37° C, en 5% de C02. El RPMI se obtiene de Gibco BRL, Catálogo No. 1 875-051.

Día 3 1. Se congelan las placas por una noche a -20° C.

Día 4 Se descongelan las placas y se coseha con un cosechador de placas de 96 cavidades (Tmtec Harvester 96®) en paneles de filtro (Wallac, Catálogo No. 1205-401 ), se leen los conteos en un contador de centelleo líquido Wallac Betaplate™. El cuadro 2 muestra los resultados de la evaluación biológica de algunos compuestos ejemplares de esta invención. Los resultados se informan en términos de IC5o, la concentración micromolar (µ?) de compuesto a evaluar que causa un cambio del 50% en la cavidad de la PKT blanco en comparación con la actividad de la PTK en un control al cual no se ha agregado compuesto de prueba. Específicamente, los resultados indican la concentración de compuesto de prueba que se necesita para causar una reducción del 50% de la actividad de la PTK blanco. Los bioensayos que se han usado o que pueden usarse para evaluar compuestos se describen en detalle a continuación. Los compuestos 1-9 fueron evaluados y se halló que eran activos en ensayos glkGST, FGFR1 y PDGF, y mostraron selectividad en estos ensayos sobre EGF.

Modelos animales in vivo Modelos animales de xenoinjerto La capacidad de los tumores humanos de crecer como xenoinjertos en ratones atímicos (por ejemplos, Balb/c, un/un) provee un modelo in vivo útil para estudiar la respuesta biológica ante terapias contra tumores humanos. Desde el primer xenotransplante exitoso de tumores humanos a ratonres atímicos, (Rygaard y Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758-760), se han transplantado muchas líneas de células tumorales humanas (por ejemplo, mamarias, pulmonares, genitourinarias, gstrointestinales, de cabeza y cuello, de glioblastoma, de hueso y de melanomas malgnos), creciendo exitosamente en ratones desnudos. Pueden usarse los siguientes ensayos para determinar el nivel de actividad, la especificidad y el efecto de los distintos compuestos de la presente invención. Existen tres tipos generales de ensayos útiles para evaluar los compuestos: celulares/catalíticos, celulares/biológicos e in vivo. El objeto de los ensayos celulares/catalíticos es determinar el efecto de un compuesto sobre la capacidad de un TK de fosforilar torisinas en un sustrato conocido en una célula. El objeto de los ensayos celulares/biológicos es determinar el efecto de un compuesto sobre la respuesta biológica estimulada por la TK en una célula. El objeto de los ensayos in vivo es determinar el efecto de un compuesto en un modelo animal de una afección particular, tal como el cáncer. Las líneas celulares adecuadas para los experimentos de xenoinjertos subcutáneos incluyen células C6 (glioma, ATCC # CCL 107), células A375 (melanoma, ATCC # CRL 1619), células A431 (carcinoma epidérmico, ATCC # CRL 1555), células Calu 6 (pulmón, ATCC # HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC # CRL 1435), células SKOV3TP5 y fibroblastos NIH 3T3 modificados genéticamente para sobreexpresar EGFR, PDGFR, IGF-1 R o cualquier otra cinasa de prueba. Puede usarse el siguiente protocolo para realizar los experimentos de xenoinjerto: Se obtienen ratones hembra atímicos (BALB/c, un/un) de Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Todos los animales se mantienen bajo condiciones de cuartos limpios en jaulas icro-isolator con lechos Alpha-dri. Reciben alimento estéril para roedores y agua ad libitum.

Se cultivan las línea de células en un medio apropiado (por ejemplo, MEM, DMEM, F10 de Ham, o F12 de Ham más 5% a 10% de Suero Fetal Bovino (FBS) y glutamina 2 mM (GLN)). Todos los medios de cultivo de células, la glutamina y el Suero Fetal Bovino se adquieren en Gibco Life Technologies (Grand Islans, NY) a menos que se indique algo diferente. Todas las células se cultivan en una atmósfera húmeda de 90-95% de aire y 5-10% de C02 a 37° C. Todas las líneas de células se subcultivan rutinariamente dos veces por semana y son negativas para microplasma, como puede determinárselo mediante el método Mycotect (Gibco). Las células se cosechan en o cerca de la confluencia con 0.05% de Tripsina-EDTA y se las precipita a 450 x g por 10 minutos. Los precipitados se suspenden nuevamente en PBS estéril (sin FBS) hasta una concentración particular, y las células se implantan en el costado posterior del ratón (8-10 ratones por grupo, 2-10 x 106 células/animal). Se mide el crecimiento de los tumores por 3 a 6 semanas usando calibres con Vernier. Se calcula el volumen de los tumores como el producto e lago x ancho x alto, a menos que se indique algo diferente. Se calculan los valores de P usando las prueba t de Student. Pueden administrase los compuestos de prueba en 50-100 µ? de excipiente (DMSO o VPDD: D5W) mediante una inyección IP a distintas concentraciones, comenzando generalmente un día después de la implantación.

Modelo de invasión de tumores se ha desarrollado el siguiente modelo de invasión de tumores y puede usárselo para la evaluación del valor terapéutico y de la eficacia de los compuestos identificados que inhiben selectivamente el receptor KDR/FLK-1.

Procedimiento Se usan ratones desnudos de 8 semanas de edad (hembras) (Simonsen Inc.) como animales experimentales. La implantación de células tumorales puede realizarse en una campana de flujo laminar. Para la anestesia, se administra un cóctel de Xilazina/Ketamina d(100 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de Xilazina) por vía intraperitoneal. Se realiza una incisión media para exponer la cavidad abdominal (de aproximadamente 1.5 cm de largo( e inyectar 107 células tumorales en un volumen de 100µ? de medio. Las células se inyectan en el lóbulo duodenal del páncreas o bajo la serosa del colon. Se cierran el peritoneo y los músculos con una sutura continua con seda 6-0 y se cierra la piel usando presillas metálicas. Los animales se observan diariamente.

Análisis Después de 2-6 semanas, dependiendo de las observaciones realizadas en los animales, se sacrifican los ratones, y se separan y analizan las metástasis de los tumores locales a varios órganos (pulmón hígado, cerebro, estómago, bazo, corazón y músculo), midiéndose el tamaño de los tumores, el grado de invasión, la inmunoquímica, realizándose determinaciones de hibridación in situ, etc.

Ensayo de C-KIT Se usa este ensayo para detectar el nivel de fosforilación de c-kit tirosina. Se hambrearon en suero células M07E (leucemia mieloide aguda humana) por una noche en 0.1 % de suero. Las células se trataron previamente con el compuesto (concurrente con el hambreado con suero), antes de la estimulación con ligando. Las células se estimularon 250 ng/ml de rh-SCF por 15 minutos. Después de la estimulación las células se lisaron y se las inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-c-kit. Se determinaron los niveles de fosftirosina y de otras proteínas mediante Western blot.

Ensayo de proliferación de MTT Se hambrearon células 07E y se las trató previamente con el compuesto, tal como se describe para los experimentos de fosforilación las células se plaquearon a aproximadamente 4 x 105 células/cavidad en una placa de 96 cavidades, en 100 µ? de RP I + 10% de suero. Se agregó rh-SFC (100 ng/ml) y se incubó la placa por 48 horas. Después de 48 horas, se agregaron 10 µ? de MTT a 5 mg/ml [bromuro de 3-(4,5-dimetitiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio] y se los dejó incubar por 4 horas. Se agregó isopropanol ácido (100µ? de HCI 0.04N en isopropanol) y se midió la densidad óptica a una longitu de onda de 550 nm.

Ensayo de apoptosis Se incubaron células M07E +/-SCF y+/-compuesto en 10% de FBS con rh-GM-CSF (10ng/ml) y rh-IL-3 (10 ng/ml). Se evaluaron las muestras a las 24 y las 48 horas. Para medir la caspasa-3 activada, las muestras se lavaron con PBS y se permeabilizaron con etanol al 70% enfriado con hielo. Las células se colorearon luego con anticuerpo anti caspasa-3 activa policlonal de conejo conjugado con PE y se las analizó por FACS. Para medir la PARP cortada, se lisaron las muestras y se las analizó por Western blot con un anticuerpo -PARP.

Ensayos adicionales Los ensayos adicionales que pueden usarse para evaluar los compuestos de esta invención, incluyen, sin limitaciones, un ensayo bio-flk-1, un ensayo de receptor EGF-receptor quimérico de HER2 en células completas, un ensayo bio-src, un ensayo bio-lck y un ensayo que mide la función de fosforilación de la raf. Pueden hallarse los protocolos para cada uno de estos ensayos en la Solicitud de los E.U.A. con número de serie 09/099842, que se incorpora a modo de referencia, incluyendo cualquier dibujo, en la presente documentación.

Medición de la Toxicidad para las células Los compuestos terapéuticos deberían ser más potentes para inhibir la actividad de receptores de tirosin cinasa que para provocar un efecto citotóxico. Puede obtenerse una medida de la efectividad y de la toxicidad celular de un compuesto determinado el índice terapéutico, es decir, IC5/LD50. IC50, la dosis requerida para lograr una inhibición del 50%, puede medirse usando técnicas comunes tales como aquellas que se describen en la presente documentación. LD50, la dosificación que resulta en una toxicidad del 50%, puede medirse también mediante técnicas comunes (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55-63), registrando la cantidad de LDH liberada (Korzeniewski y Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64: 313, Decker y Lohmann-Mattes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61), o midiendo la dosis letal en modelos animales. Los compuestos con un gran índice terapéutico son los preferidos. El índice terapéutico debería ser mayor que 2, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 50. Aquél entrenado en la técnica también comprobará fácilmente que la presente invención está bien adaptada para llevar a cabo sus objetos y obtener los fines y las ventajas mencionados, así como aquellos implícitos en ella. Los complejos moleculares y los métodos, procedimientos, tratamiento, moléculas, y compuestos, descritos en la invención, que representan ahora las realizaciones preferidas, son a modo de ejemplo, y no pretender limitar el alcance de la invención. Las modificaciones y otros usos considerados por los especialistas en la técnica, que estarán comprendidos por los principios de la invención, son definidos por el campo de las reivindicaciones. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la descripción indican los niveles de los especialistas en la técnica al cual corresponde la invención. Todas las patentes y publicaciones se incorporan en la presente por referencia, en la misma medida que si se hubiera indica específica e individualmente que cada publicación individual sea incorporada por referencia. La invención descrita a modo ilustrativo se puede implementar apropiadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, que no estén explicados específicamente en la invención. De este modo, por ejemplo, en cada caso en la invención, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de" y "que consiste en", puede ser reemplazado por cualquiera de los otros dos términos. Los términos y las expresiones que se han empleado son utilizados a modos de descripción y no son limitativos, y no se prevé que el uso de dichos términos y dichas expresiones excluya cualquier equivalente de las funciones demostradas y explicadas, o partes de las mismas, pero se admite que diversas modificaciones son posibles dentro del campo de la invención reivindicada. Entonces, se entenderá que, aunque la presente invención ha sido explicada específicamente por realizaciones preferidas y funciones opcionales, los especialistas en la técnica pueden hacer modificaciones y variaciones de los conceptos descritos en la presente, y dichas modificaciones y variaciones son consideradas como pertenecientes al campo de la presente invención, definida por las siguientes reivindicaciones. Además, cuando las funciones o los aspectos de la invención son descritos en términos de grupos de Markush, los especialistas en la técnica reconocerán que la invención también se describe en términos de cualquiera miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush. Por ejemplo, si X es descrito como seleccionado del grupo consistente en bromo, cloro y yodo, las reivindicaciones para X que es bromo y las reivindicaciones para X que es bromo y cloro son descritas completamente. Otras realizaciones son comprendidas por las siguientes reivindicaciones.

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de fórmula (I): (i) caracterizado porque: R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, haloalcoxilo, cicloalquilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, -C(0)R9, -NR9R10 y -C(0)NR 2R13; R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, trihalometilo, hidroxilo, alcoxilo, ciano, -NR9R10 — NR9C(0)R1°, - C(0)R8, -S(0)2NR9R10 y -S02R14 (donde R 4 es alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo); R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo; Z es arilo, heteroarilo, heterociclo, o -NR15R16 donde R15 y R16 son independientemente hidrógeno o alquilo; o R15 y R16 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un grupo heterocicloamino; R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno o alquilo; R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17, R8 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo, y ariloxilo; R9 y R10 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o R9 y R10 se combinan para formar un grupo heterocicloamino; R12 y R13 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo y arilo; o R12 y R13 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterocicloamino; se seleccionan del grupo que consiste en hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o una sal del mismo aceptable para el uso farmacéutico, R17 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o una sal del mismo aceptable para el uso farmacéutico. 2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, cicloalquilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, -C(0)R8, -NR9R10 y -C(0)NR12PR13, R2 se selecciona de) grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, trihalometilo, hidroxilo, alcoxilo, ciano, -NR19R10, -NR9C(0)R10, -C(0)R8, -S(0)2NR9R1° y -S02R14 (donde R14 es alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo); R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo; Z es arilo, heteroarilo, heterociclo, o -NR 5R16 donde R 5 y R 6 son independientemente hidrógeno o alquilo; o R15 y R16 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un grupo heterocicloamino; R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno o alquilo; R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y -C(0)R17; R8 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo, y ariloxilo; R9 y R10 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o R9 y R10 se combinan para formar un grupo heterociclo; R12 y R13 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo y arilo; o R12 y R13 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo; R 7 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o una sal del mismo aceptable para el uso farmacéutico. 3 - El compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste en 1N Ácido 5-(5-Fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-¡ndol-3-¡lidenmmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico, (3-dietilamino-2-hidroxi-propil)-amida 2N Ácido 5-(5-Fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenmmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol- 3-carboxílico, (3-dietilam¡no-2-h¡droxi-propil)-amida; Ácido 2,4-Dimetil-5-[2-oxo- ,2-dihidro-indol-(3)-ilidenmmetil]-1 H-pirrol-3 carboxílico, (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida Ácido 5-[5-cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida 5N Ácido 5-[5-Bromo-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-ilidenmmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidroxi-3-morfol¡n-4-¡l-propil)-amida; 6N Ácido 2,4-Dimetil-5-[2-oxo-1 ,2-d¡hidro-indol-ilidenmmetil]-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidroxi-3-[1 ,2,3]triazol-il-propil)-amida; 7N Ácido 5-[5-Fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-ilidenmmetil]-2,4-dimetiI-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidroxi-3-(1 ,2,3]triazol-1-¡l-propil)-amida; 8N H ácido 5-[5-Qloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-¡lidenmet¡l]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidrox¡-3-[1 ,2,3]triazol-1-il-prop¡l)-am¡da; 9N ácido 5-[5-Cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidroxi-3-[1 ,2,3]triazol-1-il-propil)-amida -{[4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-5-metil-3-fenil-1 H-p¡rrol- -il]metilen}-2-oxo-N-fenil-2,3-dihidro-1H-¡ndol-5-carboxamida; 12N 3-{[4-({[3-(diet¡lamino)-2-hidroxiprop¡l]am¡no}carbonil)-5-meti1-3-fenil-1H-p¡rrol-2-il]met¡ien}-N-metil-2-oxo-2,3-dih¡dro-1H-indoI-5-carboxam¡da; (3Z)-3-{[4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-5-metil-3-fenil-1H-pirrol-2-il]metilen}-N-(2-h¡droxietil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-¡ndol-5-carboxamida; 14N N-[3-(dietilamino)-2-hidrox¡propil]-4-(4-fiuorofeni1)-2-metil-5-{[5-(morfolin-4-ilcarbonil)-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-¡ndol-3-il¡den]metil}-1H-pirrol-3-carboxarriida; 15N 3-{[4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-3-(4-fluorofeniI)-5-metil- 1 H^irrol-2-il]metilen}-N-isopropil-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5-carboxamida; 16N 3-{[4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-3-(2,4-difIuorofenil)-5- metil-1 H-pirrol-2-il]metilen}-2-oxo-N-fenil-2,3-dihidro-1 H-indol-5-carboxamida; 3-{[4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-3-(2,4-difluorofenil)-5- metil-1 H-pirrol-2-il]metilen)-N-(2-hidroxietil)-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5- carboxamida; 3-{[3-(4-cianofen¡l)-4-({[3-(d¡etilam¡no)-2-hidrox¡propil]amino}am¡no}carbonil)-5-metü-1 H-p¡rrol-2-il]metilen}-N,N-dimetil-2-oxo-2,3-dih¡dro-1 H-indol-5-carboxamida; 4-(4-cianofen¡l)-N-[3-(dieti am¡no)-2-h¡drox¡propil]-2-met¡l-5-{[5-(morfolin-4-¡lcarbonil)-2-oxo-1,2-d¡hidro-3H-indol-3-il¡den]metil}- H-pirrol-3-carboxamida; 20N 3-{[3-(4-clorofenil)-4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil-5-metil- 1 H-pirrol-2-il]metilen}-

2-oo-N-fenil-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxamida; 21N

3-{[3-(4-clorofenil)-4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]aminolcarboni1)-5-metil- 1 H-pirrol-2-il]metilen}-N-isopropil-2-axa-2,3-dihidro- H-indol-5-carboxamida 22N 5-[(5-fIuoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroxi-3-(2H-tetraazol-2-il)prop¡l]-2,4-dimet¡l-1 H-p¡rrol-3-carboxamida; 23N 5-[5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H'indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroxi-3-(2H-tetraazol-2-il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxamida; 24N N-[2-hidroxi-3-(2H-tetraazol-2-il)propil]-2,4-dimetil-5-{[2-oxo-5 rifluorometoxi)-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden]metil}-1H-pirrol-3-carboxamida; 5-[(5-fluoro-2-oxo- ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroxi-3-(1H-tetraazol-1 -il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxamida; 5-[(5-cloro-2-oxo-1,2-dih¡dro-3H-¡ndol-3-¡liden)metil]-N-[2-hidroxi-3-(1^ tetraazol-1 -il)propil]-2,4-dimet¡l-1 H-pirrol-3-carboxamida 27N N-[2-hidroxi-3-(1H etraazol-1-il)propil]-2^-d¡metil-5-{[2-oxo-5 rifluorometoxi> 1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden]metil}-1H-pirrol-3-carboxamida; N-{3-[2,6-dimetilmorfolin-4-ili-2-hidroxipropil]-5-[(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-3H indol-3-il¡den)metil]-2,4-dimet¡l-1H-pirrol-3-carboxamida; 29N 5-[(5-cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-il¡den)metil)-N-{3-(2,6-dimet¡lmorfolin- 4-¡l-2-hidroxipropill-2,4-dimet¡l-1 H-p¡rrol-3-carboxamida; 30N N-IS-p.e-dimetilmorfolin^-il^-hidroxipropiO^^-dimetil-S-ÍP-oxo-S- (tri luorometoxi)-1 ,2-d¡hidro-3H-¡ndol-3-il¡den]met¡l}-1H-p¡rrol-3-carboxam¡da; 34N -[(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-(2-h¡drox¡-3-(3-metil- ,5-dioxoimidazol¡din-1-il)prop¡IJ-2,4-dimetil-1 H-p¡rrol-3-carboxam¡da; N-[2-dihidroxi-3-(3-metil-2,5-dioxoimidazo oxo-S-ítrifluorometoxiJ-l ^-dihidro-M-indol-S-ilidenlmetil}-! H-pirrol-3-carboxamida; 5[(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[2-hidroxi-3-(3-metil-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxamida; 37N N-[3-[1 ,1-dioxidotiomorfolin-4-ill-2-hidroxipropil]-2,4-dimetil-5-[(2^ dihidro-3H-indol-3-iliden]metil]-1 H-pirrol-3-carboxamida; N-[3-[1 , 1 -dioxidotiomorfolin-4-ill-2-hidroxipropil]-5-[(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden]metil]-2,4-dirnetil-1H-pirrol-3-carboxamida; 5-[(5-cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[3-(1 ,1-dioxidotiomorfolin-4-il)-2-hidroxipropil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida; 40N 5[(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-N-[3-(1 ,1-dioxidotiomorfolin-4-il)-2-hidroxipropil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxamida. 4.- El compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque se selecciona del grupo formado por: ácido 5-(5-Fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indoI-3-(3Z)-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1 H- pirrol-3-carboxílico, (3-d¡etilamino-2-hidrox¡-propil)-amida; 2S Ácido 5-(5-Fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol- 3-carboxílico, (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida; H Ácido 2,4-Dimetii-5-[2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-1 H-pirrol-3- carboxílico, (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida; ácido 5-[5-Cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol- 3-carboxílico, (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida 5S ácido 5-[5-Bromo-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirroi-3-carboxiIico, (2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-amida; 6S Ácido 2,4-Dimetil-5-[2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidroxi-3-[1 ,2,3]triazol-1-il-propil)-amida; ácido 5-[5-Fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol- 3-carboxilico, (2-hidroxi-3-[1 ,2,3]triazol-1-il-propil)-amida; 8S ácido 5-[5-Cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmet¡l]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidroxi-3-[1 ,2,3]triazol-1 -il-propil)-amida; ácido 5-[5-Bromo-2-oxo-1 ,2-dihidro-¡ndol-(3Z)-¡lidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico, (2-hidroxi-3-[1 ,2,3]triazol-1 -il-propil)-am¡da; (3Z)-3-{[4-(1[3-(dietilam¡no)-2-hidrox¡pro H-pirrol-2-il]metilen}-2-oxo-N-fenil-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxamida; (3Z)-3-1 [4-(1 [3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-5-metil-3-fenil-1 H-pirrol-2-ilidenlmetiil-N-metil-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5-carboxamida; 13S (3Z)-3 [4-({[3-(dietlamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-5-metil-3-fenil-1H-pirrol-2-il]metilen}-N-(2-hidroxietil)-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxamida 14S N-(3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]-4-(4-fluorofenil)-2-metil-5-{(Z)-[5-(morfolin-4-ilcarbonil)-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-Nidenlmetil}-1 H-pirrol-3-carboxamida 15S (3Z)-3-{[4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-3-(4-fluorofenil)-5-metil-1H-pirrol-2-il]metilen}-N-isopropil-2-oxo-2,3-dihidro-1 H-indol-5-carboxamida 16S (3Z)-3-{[4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-3-(2,4-difluorofenil)-5-metil-1 H-pirrol-2-il]metilen}-2-oxo-N-fenil-2,3-dihidro-1 H-indol-5-carboxamida (3Z)-3-{[4-({[3-(dietilamino)-2- idro 5-metil-1H-pirrol-2-il]metHen}-N-(2-h^^ carboxamida 18S (3Z)-3-{[3-(4-cianofenil)-4-({[3-(d¡et??amino)-2-4¡droxiprop??]amino}carbopil)-5-metil-1H-piYrol-2-il]metilen}-N,N-dimetil-2-oxo-2,3-dihidro-1H-indol-5-carboxamida

4-(4-cianofenil)-N-[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]-2-metil-5{(Z)-[5-(morfolin-4-ilcarbonil)-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden]metil}-1 H-pirrol-3-carboxamida (3Z)-3-1[3-(4-clorofenil)-4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-5-metil-1 H-pirrol-2-il]metnen}-2-oxo-N-fenil-2,3-dihidro-1 H-indol-5-carboxamida 21S 3Z)-3-{[3-(4-clorofenil)-4-({[3-(dietilamino)-2-hidroxipropil]amino}carbonil)-5-metil-1H-pirrol-2-¡l]met¡len}-N-isopropil-2-oxo-2,3-d¡hidro-1 H-indol-5-carboxamida 5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-d¡hidro-3H-indol-3-¡liden)met¡l]-N-[2-h¡drox¡-3-(2H-tetraazol-2-il)propil]-2,4-d¡metíl-1 H-pirrol-3-carboxam¡da S-[(Z)-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)met¡l]-N-(2-hidrox¡-3-(2H-tettaazol-2-il)propil]-2,4-d¡metil-1 H-p¡rrol-3-carboxamida N-[2-h¡drox¡-3-(2H-tetraazol-2-il)propil]-2,4-d¡metil-5-[(Z)-[2-oxo-5-tr¡fluorometoxi 1 ,2-dih¡dro-3H-¡ndol-3-¡liden]metil}-1 H-pirrol-3-carboxam¡da 5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-d¡h¡dro-3H-¡ndol-3-¡lid8n)met¡l]met¡l]-N-(2-hidrox¡-3- (1 H-tetraazol-1 -il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxamida 5-[(Z)-(5-cloro-2-oxo-1 ,2-dih¡dro-3H-indol-3-il¡den)metil]-N-[2-hidrox¡-3-(1 H-tetraazol-1 -il)propil]-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxamida N-[2-hidroxi-3-(1 H-tetraazol-1 -il)pro tr¡fIuorometoxi)-1,2-dihidro-3H-indol-3-il¡denlmet¡il-1H-pirrol-3-carboxam N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimetil-morfolin-4-il]-2-hidroxipropil]-5-{(Z)-[5-fluoro-2- 1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metiil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida S-KZJ- S-cloro^-oxo-l ^-dihidro-SH-indol-S-iliden metiilJ-N-p-^R^S)^^-dimetilmorfolin-4-il]-2-hidroxipropil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimeti!-morfolin-4-^ 5-trifluorometoxi)-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-ilidenlmetiil-1H-pirrol-3-carboxam 31S 5-[(Z)-(5-fIuoro-2-oxo-1 ,2-d¡h¡dro-3H-indol-3-iliden)metiil]-N-C-(2R)-2-hidroxi-3-(3-metil-2,5-dioxoimidazolindin-1-il]propil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida 5-{(Z)-(5-cloro-2-oxo-1,2-dih¡dro-3H-indol-3-iliden)metül]-N-[(2R)-2h¡drox¡-3-(3-metil-2,5-dioxoimidazolindin-1-il]propi1]-2,4-dimeti1- H-pirrol-3-carboxamida N-[(2R)-2-hidroxi-3-(3-metil-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)propil]-2^-dimetil-5-{(Z> [2-oxo-5-(triflurometoxi)-1,2-dihidro-3H-indol-3-ilidenlmetil}- H-pirrol-3-carboxamida 5 (Z)-(5-fIuoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-¡ndol-3-iliden)metil]-N-[(2S)-2-hidrox¡-3- (3-metil-2,5-d¡oxoimidazolidin-1-il)propil]-2,4-d¡met¡l-1 H-p¡rrol-3-carboxamtí N-[(2S)— 2-hidroxi-3(3-met¡l-2,5-d¡oxoimidazol¡din-1 -i!)propil-2,4-dimet¡l-5-{(Z)-[2-oxo-5-(trifIuorometox¡)-1 ,2-dih¡dro-3H-indol-3-¡lidenlmet¡l-1H-pirrol-3-carboxamida 5-[(Z)-5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iiiden)-met¡l]-N-[(2S)-2-hidroxi-3-(3-metil-2,5-dioxoimidazolidin-1-il)propil]-2,4-dimet¡l-1H-pirrol-3-carbo 37S N-[3-(1 ,1 -dioxidotiomorfolin-4-¡l)-2-hidrox¡propil]-2,4-dimet¡l-5-[(Z)-(2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-¡ndol-3-iliden)metil]-1 H-pirrol-3-carboxamida N-[3-(1 ,1 -dioxidotiomorfolin-4-il)-2-hidroxipropil]-5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)-metil]-1 H-pirrol-3-carboxamida N-[3-(1 , -diox¡dotiomorfolin-4-il)-2-h¡drox¡propil]-5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-¡ndol-3-iliden)-metil]-2,4-dimet¡l-1 H-pirrol-3-carboxamida 40S 5-[(Z)-(5-bromo-2-oxo-1 ,2-dih¡dro-3H-¡ndol-3-iliden)met¡l)-N-[3-(1,1-dioxidotiomorfolin-4-i1)-2-h¡drox¡prop¡l]-2,4-d¡metil-1H-pirrol-3-carboxam¡da 41S 5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil)-N-((2S)-2-hidrox!-3-morfolin-4-ilpropill-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida 5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-i!iden)metil)-N-[(2R)-2-hidroxi-3-morfolin-4-ilpropil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida 5-[(Z)-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil)-N-[(2R)-2-hidroxi-3-morfolin-4-ilpropil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida 5-[(ZH5-cloro-2-oxo-1 ,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil)-N-[(2S)-2-hidroxi-3-morfolin-4-ilpropiI-2,4-dimetiI-1H-pirrol-3-carboxamida 5.- Un compuesto de fórmula (la): caracterizado porque R1, R3, R4 y R5 son hidrógeno; R2 es fluoro, y se localiza en la posición 5 del anillo de indolinona; Z es morfolin-4-ilo; R6 y R7 son metilo; preferiblemente, la estereoquímica en *C es (S). 6.- Un compuesto de fórmula (II): caracterizado porque: R es hidrógeno o alquilo; R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, haloalcoxilo, cicloalquilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, -C(0)R8, -NR9R10 y -C(0)NR12R13; R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, halo, alquilo, trihalometilo, hidroxilo, alcoxilo, ciano -NR9R10, -NR9C(0)R10, -S(0)2NR9R ° y -S02R14 (donde R14 es alquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo y heteroaralquilo); R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo; Z es arilo, heteroarilo, heterociclo, o -NR15R16 donde R15 y R 6 son independientemente hidrógeno o alquilo, o R15 y R16 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un grupo heterocicloamino; R6 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno o alquilo, R7 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquilo, heteroarilo, y -C(0)R17; R8 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo, y ariloxilo; R9 y R10 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cianoalquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o R9 y R10 se combinan para formar un grupo heterocicloamino; R 2 y R13 son independientemente seleccionados del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo, aril arilo; o R 2 y R13 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterocicloamino; R17 se selecciona del grupo que consiste en hidroxilo, alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo; o una sal del mismo aceptable para el uso farmacéutico. 7.- El compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: 45N ácido 5-(5-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-¡lidenmetil)-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxílico(2-hidroxi-3-morfol¡n-4-il-propil)-met¡l-am¡da 45S Acido 5-((Z)-(5-fluoro-2-oxo- ,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil-2,4-dimetil-1 H-pirrol-3-carboxilico ((S)-2- idroxi-3-morfolin-4-il-propil)-metil-amida 46S

5-((Z)-5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidzo-indol-3-iiidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilico((R)-2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-metil-amida 8. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto o una sal de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, y un vehículo o un excipiente aceptable para el uso farmacéutico. 9. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto o una sal de reivindicación 5 y un vehículo o un excipiente aceptable para el uso farmacéutico. 10. - Un método para la modulación de la actividad catalítica de una protein cinasa, caracterizado porque comprende poner en contacto la protein cinasa con un compuesto o una sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3 ó 6. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicha protein cinasa se selecciona del grupo que consiste en una tirosin cinasa receptora, una tirosin cinasa no receptora y una serin-treonin cinasa. 12.- El uso de un compuesto o sal de cualquiera de las reivindicaciones .1 a 7 en combinación con un vehículo o un excipiente aceptable para el uso farmacéutico para preparar un medicamento para tratar o prevenir una afección relacionada con la proteína cinasa en un organismo. 13. - El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde dicha afección relacionada con la protein cinasa se selecciona del grupo que consiste en una afección relacionada con una tirosin cinasa receptora, una afección relacionada con una tirosin cinasa no receptora y una afección relacionada con una serin-tirosin cinasa. 14. - El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde dicha afección relacionada con la protein cinasa se selecciona del grupo que consiste en una afección relacionada con el EGFR, una afección relacionada con el PDGFR, una afección relacionada con el IGFR y una afección relacionada con la flk, 15. - El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde dicha afección relacionada con la protein cinasa se selecciona del grupo que consiste en un carcinoma de células escamosa, un astrocitoma, un sarcoma de Kaposi, un glioblastoma, un cáncer de pulmón, un cáncer de vejiga, un cáncer de cabeza y cuello, un melanoma, un cáncer de ovario, un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de células pulmonares pequeñas, un cáncer colorrectal, un cáncer geniotourinario y un cáncer gastrointestinal. 16. - El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde dicha afección relacionada con la protein cinasa se selecciona del grupo que consiste en diabetes, una afección autoinmune, una afección de hiperproliferación, restenosis, fibrosis, psoriasis, enfermedad de von Heppel-Lindau, osteoartritis, artritis reumatoide, angiogénesis, una afección inflamatoria, una afección inmunológica y una afección cardiovascular. 17. - El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde dicho organismo es un humano.