BG108098A

BG108098A - 3-(4-амидопирол-2-илметлиден)-2-индолинонови производни като инхибитори на протеин киназа

Info

Publication number: BG108098A
Application number: BG108098A
Authority: BG
Inventors: Huiping Guan; Congxin Liang; Li Sun; Peng Tang; Chung Wei; Michael Mauragis; Tomas Vojkovsky; Qingwu Jin; Paul Herrington
Original assignee: Sugen, Inc; Pharmacia & Upjohn Company
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2003-08-15
Publication date: 2005-12-30
Also published as: US20070027149A1; HUP0303146A2; CN1529704A; MA26997A1; NZ527572A; IL157418A; SK11332003A3; RS51026B; JP3677501B2; IL157418A0; HRP20030657A2; BR0207494A; SI1370554T1; IS6913A; US20080045709A1; IS2411B; KR100884858B1; WO2002066463A1; ATE307128T1; ZA200405615B

Abstract

Изобретението се отнася до пиролзаместени 2-индолинонови съединения с формула@и до техни фармацевтично приемливи соли, които модулират активността на протеин кинази. Те се прилагат за предпазване и лечение на клетъчни нарушения, свързани с протеин киназа, по-специално рак.

Description

Настоящата заявка претендира за приоритета на временни заявки 60/312,361, подадена 15 август 2001 год. и 60/268,683, подадена на 15 февруари 2001 год. чието цялостно съдържание е включено тук реферативно.

Област на техниката

Изобретението се отнася до някои 3-(4-амидопирол-2-илметилиден)2-инодлинонови производни, които модулират активността на протеин кинази (“PKs”). Съединенията от изобретението са поради това полезни при лечение на нарушения свързани с анормална РК активност. Описани са също фармацевтични състави включващи тези съединения, методи за лечение на заболявания при използване на фармацевтични състави включващи тези съединения и методи за получаването им.

Предшестващо състояние на техниката

PKs са ензими, които катализират фосфорилирането на хидрокси групи на тирозинови, серинови и треонинови остатъци на протеини. Последиците на тази изглеждаща проста активност са смайващи; клетъчен растеж, диференциация и пролиферация, т.е. практически всички аспекти на клетъчния живот зависят по един или друг начин от РК активността. Нещо повече, анормална РК активност е била свързана към приемник на нарушения, в границите от относително незастрашаващи живота заболявания като псориаза до изключително вирулентни болести като глиобластома (рак на мозъка).

За удобство PKs могат да бъдат разделени на два класа, протеин тирозин кинази (PTKs) и серин-треонин кинази (STKs).

Един от първите аспекти на РТК активността е тяхното участие с рецепторите на растежните фактори. Растежнофакторните рецептори са клетъчни повърхностни протеини. Когато са свързани с растежнофакторен лиганд, растежнофакторните рецептори се превръщат в активна форма, която взаимодейства с протеини на вътрешната повърхност на клетъчната мембрана. Това води до фосфорилиране на тирозиновите остатъци на рецептора и на други протеини и до образуване вътре в клетките на комплекси с различни цитоплазмени сигнализиращи молекули, които от своя страна повлияват на множество клетъчни реакции като делене на клетките (пролиферация), клетъчно диференциране, клетъчен растеж, експресиране на метаболитни ефекти към екстрацелуларната микросреда и т.н. За попълна информация виж Schlessinger and Ullrich, Neuron, 9 : 303 - 391 (1992), включен тук за справка, включително фигурите към нея.

Растежните факторни рецептори с РТК активност са известни като рецепторни тирозин кинази (“RTKs”). Те включват голяма фамилия трансмембранни рецептори с различни биологична активност. Понастоящем са идентифицирани най-малко деветнадесет (19) различни подфамилии на RTKs. Пример на това е подфамилията означена “HER” RTKs, която включва EGFR (епителен растежнофакторен рецептор), HER2, HER3 и HER4. Тези RTKs се състоят от екстрацелуларен глюкозилиран лигандно свързващ домен, трансмембранен домен и интрацелуларен цитоплазмен каталитичен домен, който може да фосфорилира тирозиновите остатъци на протеините.

Друга RTK подфамилия се състои от инсулинов рецептор (IR), инсулино-подобен растежнофакторен 1 рецептор (IGF-1R) и инсулин рецепторно сроден рецептор (IRR). IR и IGF-1R взаимодействат с инсулин, IGF-I и IGF-II за да образуват хетеротетрамер на две напълно екстрацелуларни глюкозилирани α-подединици и две β-подединици, които пресичат клетъчната мембрана и които съдържат тирозин киназния домен.

Една трета RTK подфамилия се определя като тромбоцитно производна растежнофакторна рецепторна (“PDGFR”) група, която включва PDGFRa, PDGFRP, CSFIR, c-kit и c-fms. Тези рецептори се състоят от глюкозилирани екстрацелуларни домени съставени от променлив брой имуноглобулиноподобни бримки и един интрацелуларен домен, при което тирозин киназния домен е прекъснат от несродни аминокиселинни секвенции.

Друга група която, поради своято сходност с PDGFR подфамилията, е понякога причислена към последната група, е зародишната чернодробна киназна (“fik”) рецепторна подфамилия. Тази група се смята, че е направена от киназно включена доменна рецепторна зародишна чернодробна киназа-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2, flk-lR, flk-4 и fms-подобна тирозин киназа 1 (flt-1).

Друг член от тирозин киназната растежнофакторна рецепторна фамилия е фибробластната растежнофакторна (“FGF”) рецепторна подгрупа. Тази група се състои от четири рецептора FGFR1-4 и седем лиганда FGF1-7. При все че все още не са добре дефинирани, изглежда, че рецепторите се състоят от глюкозилиран екстрацелуларен домен, съдържащ различен брой имуноглобулиноподобни бримки и един интрацелуларен домен в който тирозинкиназната секвенция е прекъсната от региони на несродни аминокиселинни секвенции.

Още един друг член на фамилията на тирозин киназния растежнофакторен рецептор е васкуларната ендотелна растежнофакторна (“VEGF”) рецепторна подгрупа. VEGF е димерен глюкопротеин, подобен на

PDGF, но има различни биологични функции и целева клетъчна специфичност in vivo. По специално, понастоящем се смята, че VEGF играе съществена роля при васкулогенезата и ангиогенезата.

По пълно изброяване на известните РТК подфамилии се описано от Plowman et al., DN&P, 7 (6): 334 - 339 (1994), включен тук реферативно, включително и фигурите към нея.

В допълнение към RTKs, съществува също фамилия от напълно интрацелуларни RTKs неречени “не-рецепторни тирозин кинази” или “клетъчни тирозин кинази”. Това последно определение, съкратено “СТК” се използва по-нататък. CTKs не съдържат екстрацелуларни и трансмембранни домени. Понастоящем са идентифицирани над 24 CTKs в 11 подфамилии (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak и Ack). За сега, подфамилията Src изглежда да е най-голяма група от CTKs и включва Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hck, Fgr и Yrk. По-подробно описание на CTKs е дадено от Bolen, Oncogene, 8: 2025 - 2031 (1993), включено тук за справка в своята цялост.

Серин /треонин киназите STKs, подобно на CTKs, са предимно интрацелуларни, въпреки че има малко рецепторни кинази от типа на STK. STKs са най-простите от цитозоличните кинази, т.е. кинази, които проявяват тяхната функция в частта на цитоплазмата различна от цитоплазмените органели и цитоскелета. Цитозолът е регион в клетката, където се осъществява по-голямата от клетъчната иинтермедиална метаболична и биосинтезна активност, например тя е в цитозола, където протеини се синтезират върху рибозоми.

RTKs, CTKs STKs те всички са включени в приемник на патогенни състояния включително карцином. Други патогенни състояния, които са били свързани с PTKs са, без да е ограничаващо, псориаза, хепатична целоза, диабет, ангиогенеза, рестеноза, окулярни заболявания, ревматоиден артрит и други възпалителни нарушения, имунологични нарушения като автоимунно заболяване, сърдечносъдово заболяване като атеросклероза и различни бъбречни нарушения.

С оглед на рак, две от главните напреднали хипотези обясняват изключителната клетъчна пролиферация, която направлява развитието на тумора, като свързана с функцията известна като регулирана от РК. Това ще рече, че се предполага, че злокачествения клетъчен растеж е в резултат на сриване на механизма, който контролира клетъчното деление и/или диференциране. Показано бе, че протеиновите продукти на множество прото-онкогени са включени в сигналните трансдукционни пътища, които регулират клетъчния растеж и диференциация. Тези протеинови продукти на прото-онкогени включват описаните по-горе екстрацелуларни растежни фактори, трансмембранните растежнофакторни РТК рецептори (RTKs), цитоплазмените PTKs (CTKs) и цитозолните STKs, описани по-горе.

С оглед на явната връзка между RH-сродните клетъчни активности и широкото разнообразие от човешки смущения, не е изненада, че голяма част от усилията са насочени към опит за идентифициране на пътища за модулиране на РК активността. Някои от тези усилия включват биомиметични подходи при използване на голями молекули върху тези включени в актуалните клетъчни процеси (например мутантни лиганди (U.S. App. No. 4 966 849); разтворими рецептори и антитела (App. No. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proc. Nat’l Acad. Sci., 90: 10705 - 09 (1994), Kim et al., Nature, 362: 841 - 844 (1993)); RNA лиганди (Jelinek, et al., Biochemistry, 33 :10450 - 56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4 :358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res., 199 : 56 - 62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152: 448-57) и тирозин киназни инхибитори (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; U. S. Pat., No. 5 330 992; Mariani et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).

В допълнение към горното, правени са опити за идентифициране на малки молекули, които действат като РК инхибитори. Например, бис моноциклични, бициклични и хетероциклични арилови съединения (РСТ WO 92/20642), виниленазаиндолни производни (РСТ WO 94/14808) и 1циклопропил-4-пиридилхинолони (U. S. Pat., No. 5 330 992) са описани като тирозин киназни инхибитори. Стирилови съединения (U. S. Pat. No. 5 217 999), стирил-заместени пиридилови съединения (U. S. Pat., No. 5 302 606) хиназолинови производни (ЕР Арр. № 0 566 266 А1), селенаиндоли и селениди (РСТ WO 92/21660) и съединения на бензилфосфонова киселина (РСТ WO 91/15495) всички те са описани като РТК инхибитори, полезни при лечението на рак.

Техническа същност на изобретението

Изобретението е насочено към някои 3-(4-амидопирол-2илметилиден)-2-индолинонови производни, които проявяват РК модулираща способност и поради това са полезни при лечението на нарушения, свързани с анормална РК активност.

Едно изпълнение на изобретението е съединение с формула (I):

в която:

R¹ е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, халогеналкокси, циклоалкил, хетероалицикличен радикал, хидрокси, алкокси, -С(О) R⁸, -NR⁹R¹⁰ и -C(O)NR¹²R¹³,

R² е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, трихалогенметил, хидрокси, алкокси, циано, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸,

-S(O)₂R⁹R¹⁰ и -SO₂R¹⁴ (в която R¹⁴ е алкил, арил, аралкил, хетероарил и хетероарилалкил);

R³, R⁴ и R⁵ са независимо водород или алкил;

Z означава арил, хетероарил, хетероцикъл или -NR¹⁵R¹⁶, в която R¹⁵ и R¹⁶ са независимо един от друг водород или алкил; или R¹⁵ и R¹⁶ заедно с азотния атом към който са свързани образуват хетероциклоамино група;

R⁶ е подбран от група състояща се от водород или алкил;

R⁷ е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -С(О) R¹⁷;

η

R е подбран от група състояща се от хидрокси, алкокси и арилокси;

R⁹ и R¹⁰ са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил, цианоалкил, циклоалкил, арил и хетероарил или

R⁹ и R¹⁰ са комбинирани за да образват хетероциклоамино група;

1Ц

R и R са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил, хидроксиалкил и арил или R¹² и R¹³ заедно с азотния атом към който са прикрепени образуват хетероциклоамино група;

R¹⁷ е подбран от група състояща се от хидрокси, алкил, циклоалкил, арил и хетероарил;

или тяхни фармацевтично приемливи соли.

Друго изпълнение е съединение с формула I в която

R¹ е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, циклоалкил, хетероалицикличен радикал, хидрокси, алкокси, -C(O)R , NR⁹R¹⁰ и -C(O)NR¹²R¹³,

R² е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, трихалогенметил, хидрокси, алкокси, циано, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)2R⁹R¹⁰ и -SO2R¹⁴ (в която R¹⁴ е алкил, арил, аралкил, хетероарил и хетероарилалкил);

R³, R⁴ и R⁵ са независимо водород или алкил;

R⁸ е подбран от група състояща се от хидрокси, алкокси и арилокси;

R⁹ и R¹⁰ са комбинирани за да образват хетероцикло група;

7 1 Q

R и R са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил и арил или R¹² и R¹³ заедно с азотния атом към който са прикрепени образуват хетероцикъл;

или тяхни фармацевтично приемливи соли.

Друго изпалнение е съединение с формула (1а):

в която:

R¹, R³, R⁴ и R⁵ означават водород;

R² е флуоро и е поместен в 5-та позиция на индолиноновия пръстен;

Z означава морфолин-4-ил;

R⁶ и R⁷ са метил.

За предпочитане стереохимията при *С е (S).

Друго изпълнение е съединение с формула (II):

R означава водород или алкил;

R³, R⁴ и R⁵ са независимо водород или алкил;

Q

13

R^IZ и R са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил, хидроксиалкил и арил или R¹² и R¹³ заедно с азотния атом към който са прикрепени образуват хетероциклоамино група;

R е подбран от група състояща се от хидрокси, алкил, циклоалкил, арил и хетероарил;

или тяхни фармацевтично приемливи соли.

Друго изпълнение е фармацевтичен състав, включващ съединение или сол с формули I, 1а или II и фармацевтично приемлив носител или пълнител.

Друго изпълнение е метод за модулиране на каталитичната активност на протеин киназата, включващ поставяне в контакт на протеин киназата със съединение или сол с формули 1,1а или II. При този метод протеин киназата може да е рецепторна тирозин киназа, нерецепторна тирозин киназа и серинтреонин киназа.

Друго изпълнение е метод за лечение или предпазване от свързано с протеин киназа нарушение в организъм, включващ прилагане на лечебноефективно количество от фармацевтичен състав включващ съединение или сол с формули I, 1а или II и фармацевтично приемлив носител или пълнител към организма. Протеин киназата за този метод може да бъде рецепторна тирозин киназа, нерецепторна тирозин киназа и серинтреонин киназа. Свързаните с протеин киназата нарушения могат да бъдат свързано с EGFR смущение, смущение свързано с PDGFR, свързано с IGFR смущение и flk свързано смущение. Протеин киназните нарушения могат също да са сквамозен (люспест) клетъчен карцином, астроцитома, Kaposti саркома, глиобластома, белодробен рак, рак на пикочния мехур, рак на главата и врата, дребноклетъчен белодробен рак, глиома, колоректален рак, генитопикочен рак и стомашночревен рак. Нещо повече, протеин киназно нарушение може също да бъде диабет, автоимунно нарушение, хиперпролиферативно нарушение, рестеноза, фиброза, псориаза, заболяване на von Heppel-Lindau, остеоартрит, ревматоиден артрит, ангиогенеза, възпалително нарушение, имунологичнонарушение и сърдечносъдово нарушение. Тези методи могат да се използват за лечение на хора.

Съгласно друго изпълнение, настоящето изобретение е насочено към методи за получаване на съединения с формула (I).

Накрая, изобретението е също насочено към идентифициране на химическо съединение, което модулира каталитичната активност на протеин киназа чрез противодействие на експресиращи протеин киназата клетки със съединение или сол от настоящето изобретение и след това проследавяне на клетките за ефекта.

Дефиниции:

Освен ако е казано друго, следните термини използвани в описанието и претенциите имат описаните по-долу значения:

“Алкил” се отнася до наситен алифатен въглеводороден радикал включват правоверижни или с разклонени вериги групи, съдържащи 1 до 20 въглеродни атоми (когато е дадена цифрова граница като например “1-20”, както тук, означава, че групата в този случай алкиловата група, може да съдържа 1 въглероден атом, 2 въглеродни атома, 3 въглеродни атома и т.н. до включително 20 въглеродни атома). По-предпочитани са алкилови радикали със средни размери, притежаващи 1 до 10 въглеродни атома, например метил, етил, пропил, 2-пропил, н-бутил, изо-бутил, трет.-бутил, пентил и подобни. Най-предпочитани са нисшите алкилови групи притежаващи от 1 до 4 въглеродни атоми, например метил, етил, пропил, 2пропил, н-бутил, изо-бутил или трет.-бутил и подобни. Алкилът може да е заместен или незаместен и когато е заместен заместващата група(и) е с предпочитание халоген, хетероалициклична група, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ и C(O)NR⁹R¹⁰.

“Циклоалкил” се отнася до 3 до 8 членен само въглероден моноцикличен пръстен, само въглероден 5 членен/6-членен или 6-членен/6членен кондензиран бицикличен пръстен или многоциклична кондензирана пръстенова (“кондензирана” пръстенова система означава, че всеки пръстен в системата споделя съседен чифт въглеродни атоми с всеки друг пръстен в системата) група, при което един или повече от пръстените могат да съдържат една или повече двойни връзки, но никои от пръстените няма напълно конюгирана пи-електронна система. Примери, без да се ограничава до тях, на циклоалкилови групи са циклопропан, циклобутан, циклопентан, циклопентен, циклохексан, циклохексадиен, адамантан, циклохептан, циклохептатриен и подобни. Когат са заместени, заместващата група(и) е с предпочитание една или повече, по-предпочитано един или два заместители, независимо подбрани от групата състояща се от нисш алкил, трихалогеналкил, халоген, хидрокси, нисш алкокси, арил евентуално заместен с един или повече, за предпочитане една или две групи, независимо една от друга халоген, хидрокси, нисша алкилова или нисша алкокси група, арилокси евентуално заместен с една или повече, за предпочитане една или две група, независимо подбрани една от друга от халоген, хидрокси, нисша алкилова или нисша алкокси група, 6-членен хетероарил, притежаващ от 1 до 3 азотни атоми в пръстена, въглеродите в пръстена могат евентуално да са заместени с една или повече, за предпочитане една или две групи независимо една от друга халоген, хидрокси, нисша алкилова или нисша алкокси група, 5-членен хетероарил притежаващ от 1 до 3 хетероатоми подбрани от група състояща се от азот, кислород и сяра, въглеродните и азотни атоми на групата могат евентуално да са заместени с една или повече, с предпочитание една или две групи, независимо една от друга халоген, хидрокси, нисша алкилова или нисша алкокси група, 5- или 6-членна хетероалициклична група, притежаваща от 1 до 3 хетероатоми подбрани от група състояща се от азот, кислород и сяра, въглеродът и азотът (ако има наличен) в групите може евентуално да са заместени с една или повече, с предпочитание една или две групи независимо една от друга халоген, хидрокси, нисша алкилова или нисша алкокси група, меркапто, (нисш алкил)тио, арилтио, евентуално заместен с една или повече, с предпочитание една или две групи, независимо една от друга халоген, хидрокси, нисша алкилова или нисша алкокси група, циано, ацил, тиоацил, О-карбамил, Nкарбамил, О-тиокарбамил, N-тиокарбамил, С-амидо, N-амидо, нитро, Nсулфонамидо, S-сулфонамидо, R⁹-S(O)-, R⁹-S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- и nr⁹r¹⁰ съгласно дефиниците по-горе.

“Алкенил” се отнася до алкилова група, съгласно определението тук, състояща се от най-малко два въглеродни атоми и най-малко една въглерод въглерод двойна връзка. Представителни примери включват, без да се ограничава до тях, етенил, 1-пропенил, 2-пропенил, 1-, 2- или 3-бутенил и подобни.

“Алкинил” се отнася до алкилова група, съгласно определението тук, състояща се от най-малко два въглеродни атома и най-малко една въглерод въглерод тройна връзка. Представителни примери включват, без да се ограничава до тях, етинил, 1-пропинил, 2-пропинил, 1-, 2- или 3-бутинил и подобни.

“Арил “ се отнася до само въглероден моноцикъл или кондензирани пръстенови полициклични групи (т.е. пръстени, които споделят съседни двойки въглеродни атоми) с 1 до 12 въглеродни атоми, притежаващи напълно конюгирани пи-електронни системи. Примери, без да са ограничаващи, на арилови групи са фенил, нафталенил и антраценил. Ариловата група може за бъде заместена или незаместена. Когато е заместена, заместващата група(и) е с предпочитание една или повече, за предпочитане една, две или три, дори по-предпочитано една или две, независимо подбрани от групата състояща се от нисш алкил, трихалогеналкил, халоген, хидрокси, нисш алкокси, меркапто, (нисша алкил)тио, циано, ацилова, тиоацилова, О-карбамилова, N-карбамилова, 0тиокарбамилова, N-тиокарбамилова, С-амидо, N-амидо, нитро, Nсулфонамидо, S-сулфонамидо, R⁹-S(O)-, R⁹-S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- и NR⁹R¹⁰, в които R⁹ и R¹⁰ имат дадените по-горе определение. С предпочитание, ариловата група е евентуално заместена с един или два заместителя, независимо подбранио от халоген, нисш алкил, трихалогеналкил, хидрокси, меркапто, циано, N-амидо, моно- или диалкиламино, карбокси или N-сулфонамидо.

“Хетероарил” се отнася до моноциклична или кондензирана пръстенова (т.е. пръстени, които споделят съседна двойка атоми) група с 5 до 12 пръстенови атоми съдържащи един, два, три или четирипръстенови атоми подбрани от Ν, О или S, като останалите пръстенни атоми са С, и в допълнение, притежават напълно конюгирана пи-електронна система. Примери, без да са ограничаващи, на незаместени хетероарилови групи са пирол, фуран, тиофен, имидазол, оксазол, тиазол, пиразол, пиридин, пиримидин, хинолин, изохинолин, пурин, тетразол, триазин и карбазол. Хетероариловата група може да бъде заместена или незаместена. Когато е заместена, заместващите групи са с предпочитание една или повече, с предпочитание една, две или три, дори по-предпочитано една или две, независимо подбрани от нисш алкил, трихалогеналкил, халоген, хидрокси, нисш алкокси, меркапто, (нисша алкил)тио, циано, ацилова, тиоацилова, Окарбамилова, N-карбамилова, О-тиокарбамилова, N-тиокарбамилова, Самидо, N-амидо, нитро, N-сулфонамидо, S-сулфонамидо, R⁹-S(O)-, R⁹-S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- и -NR⁹R¹⁰, в които R⁹ и R¹⁰ имат дадените по-горе определение. С предпочитание, хетероариловата група е евентуално заместена с един или два заместителя, независимо подбранио от халоген, нисш алкил, трихалогеналкил, хидрокси, меркапто, циано, N-амидо, моноили диалкиламино, карбокси или N-сулфонамидо.

“Хетероалицикличен” се отнася до моноциклична или кондензирана пръстенова система, притежаващи в пръстена (пръстените) от 5 до 9 пръстенови атоми в които един или два пръстенови атоми са хетероатоми подбрани от Ν, О или S(O)_n, (където η е цяло число от 0 до 2), като останалите пръстенни атоми са С. Пръстените могат да имат една или повече двойни връзки. Пръстените обаче нямат напълно конюгирана пи-електронна система. Примери, без да са ограничаващи, на незаместени хетероалициклични групи са пиролидино, пиперидино, пиперазино, морфолино, тиоморфолино, хомопиперазино и подобни. Хетероалицикличният пръстен може да бъде заместен или незаместен. Когато е заместен, заместващите групи са с предпочитание една или повече, по-предпочитано една, две или три, дори по-предпочитано една или две, независимо подбрани от нисш алкил, трихалогеналкил, халоген, хидрокси, нисш алкокси, меркапто, (нисша алкил)тио, циано, ацилова, тиоацилова, Окарбамилова, N-карбамилова, О-тиокарбамилова, N-тиокарбамилова, Самидо, N-амидо, нитро, N-сулфонамидо, S-сулфонамидо, R⁹-S(O)-, R⁹-S(O)2-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- и -NR⁹R¹⁰, в които R⁹ и R¹⁰ имат дадените по-горе определение. С предпочитание, хетероалицикличната група е евентуално заместена с един или два заместителя, независимо подбранио от халоген, нисш алкил, трихалогеналкил, хидрокси, меркапто, циано, N-амидо, моноили диалкиламино, карбокси или N-сулфонамидо.

“Хетероцикличен” се отнася до наситен цикличен радикал с 3 до 8 пръстенови атоми в който един или два атома са хетероатоми подбрани от N, О или S(O)_n, (където η е цяло число от 0 до 2), като останалите пръстенни атоми са С. Един или два С атоми могат евентуално да са заместени от карбонилна група. Хетероцикличният пръстен може евентуално да бъде заместен независимо с един, два или три заместители подбрани от нисш алкил, евентуално заместен с един или два заместители независимо подбрани от карбокси или естерна група, халогеналкил, цианоалкил, халоген, нитро, циано, хидрокси, алкокси, амино, моноалкиламино, диалкиламино, аралкил, хетероаралкил и -COR (където R е алкил). Поконкретно терминът хетероциклил включва, без да се ограничава до това, тетрахидропиранил, 2,2-диметил-1,3- диоксолан, пиперидино, Nметилпиперидин-3-ил, пиперазино, N-метилпиролидин-З-ил, пиролидино, морфолино, тиоморфолино, тиоморфолино-1-оксид, тиоморфолино-1,1диоксид, 4-етилоксикарбонилпиперазино, 3-оксопиперазино, 2имидазолидон, 2-пиролидинон, 2-оксохомопиперазино, тетрахидропиримидин-2-он и тяхни производни. С предпочитание, хетероцикличната група е евентуално заместена с един или два заместителя независимо подбрани от халоген, нисш алкил, нисш алкил заместен с карбокси, естер хидрокси или моно или диалкиламино.

“Хетероциклоамино” означава наситен цикличен радикал с 3 до 8 пръстенови атоми в които най-малко един от пръстенните атоми е азот и евентуално където един или два допълнителни пръстенови атоми са хетероатоми подбрани от от Ν, О или S(O)_n, (където η е цяло число от 0 до 2), като останалите пръстенни атоми са С и където един или два С атоми могат евентуално да са заместени от карбонилна група. Хетероциклоаминовият пръстен може евентуално да бъде заместен независимо с един, два или три заместители подбрани от нисш алкил, евентуално заместен с един или два заместители независимо подбрани от карбокси или естерна група, халогеналкил, цианоалкил, халоген, нитро, циано, хидрокси, алкокси, амино, моноалкиламино, диалкиламино, аралкил, хетероаралкил и -COR (където R е алкил). По-конкретно терминът хетероциклил включва, без да се ограничава до това, пиперидин-1-ил, пиперазин-1-ил, пиролидин-1-ил, морфолин-4-ил, тиоморфолин-4-ил, тиоморфолино-1-оксид, тиоморфолино-1,1-диоксид, 4етилоксикарбонилпиперазин-1 -ил, 3-оксопиперазин-1 -ил, 2-имидазолидон-1 ил, 2-пиролидинон-Пил, 2-оксохомопиперазино, тетрахидропиримидин-2-он и тяхни производни. С предпочитание, хетероцикличната група е евентуално заместена с един или два заместителя, независимо подбрани от халоген, нисш алкил, нисш алкил заместен с карбокси или естер, хидрокси или моноили диалкиламино група. Хетероциклоамино групата е производна на хетероцикличната група определена по-горе.

“Хидрокси” се отнася до -ОН група.

“Алкокси” се отнася до -О-(алкилова) и -О-(незаместена циклоалкилова) група. Представителни примери включват, без да се ограничава до тях, например метокси, етокси, пропокси, бутокси, циклопропилокси, циклобутилокси, циклопентилокси, циклохексилокси и подобни.

’’Халогеналкокси” се отнася до -О-(халогеналкилова) група. Представителни примери включват, без да се ограничава до тях, например трифлуорометокси, трибромометокси и подобни.

“Арилокси” се отнася до -О-арилова и -О-хетероарилова група, съгласно определението тук. Представителни примери включват, без да се ограничава до тях, фенокси, пиридинилокси, фуранилокси, тиенилокси, пиримидинилокси, пиразинилокси и подобни и тяхни производни.

“Меркапто” се отнася до -SH група.

“Алкилтио” се отнася до -З-(алкилова) и -8-(незаместена циклоалкилова) група. Представителни примери включват, без да се ограничава до тях, например метилтио, етилтио, пропилтио, бутилтио, циклопропилтио, циклобутилтио, циклопентилтио, циклохексилтио и подобни.

“Арилтио” се отнася до -S-арилова и -S-хетероарилова група, съгласно определенията тук. Представителни примери включват, без да се ограничава до тях, например фенилтио, пиридинилтио, фуранилтио, тиенилтио, пиримидинилтио и подобни и тяхни производни.

“Ацил” се отнася до -C(O)R” (където R” е подбран от водород, нисш алкил, трихалогенметил, незаместен циклоалкил, арил евентуално заместен с един или повече, с предпочитание един, два или три заместителя подбрани от нисш алкил, трихалогенметил, нисш алкокси, халоген и -NR⁹R¹⁰, хетероарил (свързан чрез пръстенен въглерод) евентуално заместен с един или повече, по-предпочитано с един, два или три заместителя подбрани от нисш алкил, трихалогенал, нисш алкокси, халоген и -NR⁹R¹⁰ група. Представителни ацилови групи са, без да се ограничава до тях, ацетил, трифлуороацетил, бензоил и подобни.

“Алдехид” се отнася до ацилова група в която R” е водород.

“Тиоацил” се отнася до -C(S)-R” група, в която R” има дадените тук значения.

“Естер” се отнася до -C(O)O-R” група, в която R” има дадените тук значения с изключение на това, че R” не може да бъде водород.

“Ацетилна” група означава -С(О)СН₃ група.

“Халоген” означава флуор, хлор, бром или йод, с предпочитание флуор или хлор.

“Трихалогенметилова” група означава -СХ₃ група, в която X е халоген, съгласно определението по-горе.

“Трихалогенметансулфонилова” група се отнася одо X₃CS(=O)₂групи в които X има дадените по-горе определения.

“Циано” означава -ON група.

“S-сулфонамидо” се отнася до -S(O)2-NR⁹R¹⁰, в която R⁹ и R¹⁰ имат дадените по-горе определения.

“N-сулфонамидо” се отнася до NR⁹(O)2R¹⁰, в която R⁹ и R¹⁰ имат дадените по-горе определения.

“О-карбамилова” група се отнася до -OC(O)NR¹²R¹³, в която R¹² и R¹³имат дадените по-горе определения.

“N-карбамилова” група се отнася до R⁹OC(O)NR¹⁰, в която R⁹ и R¹⁰имат дадените по-горе определения.

“О-тиокарбамилова” група се отнася до -OC(S)NR R , в която R и R¹³ имат дадените по-горе определения.

“N-тиокарбамилова” група се отнася до R⁹OC(S)NR¹⁰, в която R⁹ и R¹⁰имат дадените по-горе определения.

“Амино” се отнася до -NR⁹R¹⁰ група, в която R⁹ и R¹⁰ и двата са водород.

“С-амидо” се отнася до -C(O)NR⁹R¹⁰ група, в която R⁹ и R¹⁰ и двата са водород.

“N-амидо” се отнася до R⁹C(O)NR¹⁰, в която R⁹ и R¹⁰ имат дадените по-горе определения.

“Нитро” се отнася до NO₂ група.

“Халогеналкил” означава алкил, с предпочитание нисш алкил съгласно определението по-горе, който е заместен с един или повече еднакви или различни халогенни атоми, например -СН₂С1, -CF₃, -CH₂CF₃, -СН₂СС1₃ и подобни.

“Хидроксиалкил” означава алкил, с предпочитание нисш алкил съгласно определението по-горе, който е заместен с един, два или три хидроксилни групи, например хидроксиметил, 1- или 2-хидроксиетил, 1,2-,

1,3- или 2,3-дихидроксипропил и подобни.

“Аралкил” означава алкил, с предпочитание нисш алкил съгласно дефиницията по-горе, който е заместен с арилова група, съгласно определението по-горе, например -СН₂фенил, -(СН₂)₂фенил, -(СН₂)₃ фенил, СН₃СН(СН₃)СН₂ фенил и подобни и тяхни производни.

“Хетероаралкил” означава алкил, с предпочитание нисш алкил съгласно определението по-горе, който е заместен с хетероарилова група, например -СН₂пиридинил, -(СН₂)₂пиримидинил, -(СН₂)зИмидазолил и подобни и тяхни производни.

“Моноалкиламино” означава радикала -NHR, в който R е алкил или незаместена циклоалкилова група, съгласно определенията от по-горе, например метиламино, (1-метилетил)амино, циклохексиламино и подобни.

“Диалкиламино” означава радикала -NRR, в който всеки R е независимо алкилова или незаместена циклоалкилова група съгласно определенията от по-горе, например диметиламино, диетиламино, (1метилетил)-етиламино, циклохексилметиламино, циклопентилметиламино и подобни.

“Евентуално” означава, че след това описаното може да се случи и да не се случи, и че описанието включва случаи, при които се обхващат и двете алтернативи. Например, “хетероциклична група, евентуално заместена с алкилова група” означава че алкилът може, но не е необходимо, да присъства и че в описанието са включени ситуации при които хетероцикличната група е заместена с алкилова група и ситуации, при които хетероцикличната група не е заместена с алкилова група.

Термините “2-индолинон”, “индолин-2-он” и “2-оксиндол” се използват взаимнозаменяемо тук и се отнасят до молекула, притежаваща химическата структура:

Терминът “пирол” се отнася до молекула с химическата структура:

Съединения, които имат същата молекулна формула, но се различават по начина или последователността на свързване на тяхните атоми или подреждането на тяхните атоми в пространството, се назовават “изомери”.

Изомерите, които се различават по подреждането на тяхните атоми в пространството се назовават “стереоизомери”. Стереоизомерите, които не са огледални изображения един на друг се назовават “диастереомери” и тези които не са суперналагащи се огледални изображения един към друг се назовават “енантиомери”. Когато дадено съединение има асиметричен център, например, той е свързан с четири различни групи, е възможен чифт от енантиомери. Енантиомерът може да се характеризира чрез абсолютната конфигурация на неговия асиметричен център или е описан чрез R- и Sправила на Cahn and Prelog, или по начина по който молекулата върти плоскостта на поляризованата светлина и се определят като дясновъртящи или лявовъртящи (т.е. като (+) или съответно (-) изомери). Хирално съединение може да съществува или като индивидуален енантиомер или като смес от тях. Смес, съдържаща равни съотношения от енантиомерите, се нарича “рацемична смес”.

Съединенията от изобретението могат да притежават един или повече асиметрични центрове; такива съединения могат поради това да се получат като отделни (R )- или (S)- стереоизомери или като смеси от тях. Например, въглеродният атом носещ хидрокси групата в -CHNHCHR³-CR⁴(OH)CR⁵Z в съединение с формула (I), е асиметричен центер и поради това съединението с формула (I) може да съществува като (R )- или (S)- стереоизомер. Освен ако е казано друго, описанието или наименоването на конкретно съединение в описанието и претенциите е предвидено да обхваща и двата отделни енантиомера и смеси, рацемични и по друг начин. Методите за определяне на стереохимията и разделянето на стереоизомерите са добре известни в областта (виж описанието в раздел 4 на “Advanced Organic Chemistry”, 4^thedition J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).

Съединенията c формула (I) могат да проявяват феномена на тавтомерия и структурна изомерия. Например, описаните тук съединения могат да придобият Е или Z конфигурация около двойната връзка свързваща

2-индолиноновата част към пироловата част или те могат да са смес от Е и Z. Настоящето изобретение обхваща всякаква тавтомерия и структурно изомерна форма и смеси от тях, които притежават способността да модулират RTK, СТК и/или STK активността и не се ограничава до която и да е тавтомерна или структурно изомерни форми.

“Фармацевтичен състав” се отнася до смес от едно или повече съединения описани тук, или тяхни физиологично/ фармацевтично приемливи соли или пролекарства, с други химически съставки, като физиологично/ фармацевтично приемливи носители и пълнители. Целта на фармацевтичните състави е да улеснят приложението на съединението към организма.

Съединението с формула (I) може също да действа като пролекарство. “Пролекарство” означава средство, което се превръща in vivo в основното съединение. Често пролекарствата са полезни поради това, че в някои положения, те могат по-лесно да се прилагат отколкото основното съединение. Те могат примерно да са биодостъпни чрез орално приложение, докато основното съединение не е. Пролекарството може също да има подобрена разтворимост във фармацевтичните състави по отношение на основното лекарство. Пример за това, без да е ограничаващ, за пролекарство е съединение от настоящето изобретение, което се прилага като естер (’’пролекарството”) за да се улесни преминаването през клетъчната мембрана, където водната разтворимост е вредна за подвижността, но след това се метаболитно хидролизира до карбоксилна киселина, активната единица, след като навлезе в клетката, където водната разтворимост оказва благоприятно влияние.

Друг пример на пролекарство може да бъде къс полипептид, например, без да е ограничаващо, 2 до 10 аминокиселинен полипептид, свързан чрез крайна аминогрупа към карбоксилна група на съединение от настоящето изобретение, при което полипептида се хидролизира или метаболизира in vivo за да се освободи активната молекула. Пролекарствата на съединение с формула (I) се в обхвата на настоящето изобретение.

В допълнение е обсъдено, че съединение с формула (I) ще се метаболизира от ензими в телото на организма като човек при което ще се получи метаболит, който може да модулира активността на протеин киназите. Такива метаболити са в обхвата на настоящето изобретение.

Както се използва тук “физиологично/ фармацевтично приемливи носители” се отнасят до носител или разредител, който не причинява съществено дразнене на организма и не намалява биологическата активност и свойствата на приложеното съединение.

“Фармацевтично приемлив пълнител” се отнася до инертно вещество, което се прибавя във фармацевтичния състав за по-нататъшно улесняване на приложението на съединението. Примери, без да са ограничаващи, на пълнители са калциев карбонат, калциев фосфат, различни захари и типове нишесте, целулозни производни, желатин, растителни масла и полиетиленгликоли.

Както се използва тук, терминът “фармацевтично приемлива сол” се отнася до соли, които запазват биологическата ефективност и свойствата на изходното съединение. Такива соли са:

(1) киселинна присъединителна сол, която се получава чрез взаимодействие на свободната база на изходното съединение с неорганични киселини като хлороводородна киселина, бромоводородна киселина, азотна киселина, фосфорна киселина, сярна киселина и перхлорна киселина и подобни или с органични киселини като оцетна, оксалова, (D) или (L) ябълчена киселина, малеинова, метансулфонова, етансулфонова, ртолуенсулфонова, салицилова, винена, лимонена, янтарна или малонова киселина и подобни, за предпочитане хлороводородна или (L) ябълчена киселина; или (2) соли, образувани когато наличната киселинна част в основното съединение се замества или с метален йон, например алкалнометален йон, алкалоземен йон или алуминиев йон или се координира с органична база като етаноламин, диетаноламин, триетаноламин, трометамин, Nметилглюкамин и подобни.

“РК” се отнася до рецепторна протеин тирозин киназа (RTKs), до нерецепторна или “целуларна” тирозин киназа (CTKs) и до серин-треонин кинази (STKs).

“Метод” се отнася до начини, средства, техники и процедури за извършване на дадена задача, включително, без да се ограничава до това, такива начини, средства, техники и процедури били те известни или лесно разработващи се от известни такива от специалистите в химическата, фармацевтичната, биологичната, биохимичната и медицинската области.

“Модулация” или “модулиране” се отнася до промена в каталитичната активност на RTKs, CTKs и STKs. По-специално, модулиране се отнася до активирането на каталитичната активност на RTKs, CTKs и STKs, с предпочитание активирането или инхибирането на каталитичната активност на RTKs, CTKs и STKs, в зависимост от концентрацията на съединението или солта на която RTKs, CTKs и STKs са изложени или, по-за предпочитане, инхибирането на каталитичната активност на RTKs, CTKs и STKs.

“Каталитична активност” означава скоростта на фосфорилиране на тирозина под влиянието, директно или индиректно, на RTKs и/или CTKs или фосфорилирането на серин и треонин под влиянието, директно или индиректно, на STKs.

“Контактуване” се отнася до свързването заедно на съединение от настоящето изобретение и целева РК по такъв начин, че съединението може да повлияе на каталитичната активност на РК, било директно, т.е. чрез взаимодействие с друга молекула от която каталитичната активност на киназата е зависеща. Такова “контактуване” може да се осъществои “in vitro” т.е. в опитна епруветка, в петриева паничка и подобни. В опитна епруветка, контактуването може да включва само едно съединение с една РК представляваща интерес или може да нключва цялостни клетки. Клетки могат също да бъдат поддържани или култивирани в клетъчни културални панички и да се поставят в контакт със съединение в тази среда. В този контекст, способността на конкретно съединение да повлиява свързаните с РК нарушения, т.е. IC50 на съединението, дефинирана по-долу, може да се определи преди използването на съединенията in vivo с повече комплексни живи организми. За клетки извън организма, съществуват множество методи, и те са добре известни на специалистите от областта, за поставяне на PKs в контакт със съединенията, включително, без да се ограничава до тях, директно клетъчно микроинжектиране и множество трансмембранни пренасящи техники.

“In vitro” означава процедури, които се провеждат в изкуствена среда като например, без да се ограничава до тях, в опитна епруветка или културална среда.

“In vivo” означава процедури, които се провеждат в живия организъм като например, без да се ограничава до тях, в мишка, плъх или заек.

“Свързани с РК нарушения”, “направлявани от РК нарушения” и анормална РК активност” всички те се отнасят до състояние, характеризиращо се с неподходяща, т.е. поради по-малка, по-често поради по-висока РК каталитична активност, където конкретния РК може да бъде RTK, СТК или STK. Неподходяща каталитична активност може да възникне в резултат или на: 1) РК експресиране в клетки, които нормално не експресират PKs, (2) повишено РК експресиране водещо до неочаквана клетъчна пролиферация, диференциация и/или растеж или (3) повишено РК експресиране, водещо до неочаквани редукции в клетъчната пролиферация, диференциация и/или растеж. Свръх-активността на РК се отнася било до амплифициране на гена кодиращ конкретен РК или получаване на ниво на рК активност, което може да корелира с клетъчна пролиферация, диференциация и/или растежни нарушения (т.е., след като нивото на РК се увеличава, сериозността на един или повече от симптомите на клетъчното нарушение се увеличава). По-ниска активност естествено е обратното, при което сериозността на един или повече симптоми на клетъчното нарушение се увеличава с намаляване на нивото на РК активността.

“Лекуване” или “лечение” се отнасят до метод за облекчаване или премахване на клетъчно нарушение с посреник РК и/или неговите _w съпътстващи симптоми. С оглед конкретно на рак, тези термини просто означават, че очакването за живот на пациент засегнат от рак ще се увеличат или един или повече от симптомите на заболяването ще се намалят.

“Организъм” се отнася до всяко живо същество, включващо наймалко една клетка. Живият организъм може да бъде толкова прост като например единична еукариотна клетка или да е комплексен като бозайник, включително човешко същество.

“Лечебноефективно количество” се отнася до такова приложено количество от съединението, което ще облекчи до известна степен или повече симптомите на заболяването, което се лекува. По отношение на рака, лечебноефективно количество е това, което количество има ефект върху:

1) намаляване размера на тумора;

2) инхибиране (това ще рече забавяне до известна степен, с предпочитание спиране) туморните метастази;

3) инхибиране до известна степен (т.е. забавяне да известна степен, с предпочитание спиране) растежа на тумора и/или

4) облекчаване до известна степен (или с предпочитание елиминиране) на един или повече свързани с рака симптоми.

“Наблюдаване” означава отчитане и проследяване на ефекта на контакт на съединение с експресираща конкретен РК клетка. Наблюдаването или проследяването на ефекта може да бъде промяна в клетъчния фенотип, в каталитичната активност на РК или промяна във взаимодействието на РК с естествено свързващ партньор. Техники за наблюдаване или проследяване на такива ефекти са добре известни в областта.

Гореспоменатият ефект е подбран от промяната или отсъствието на клетъчен фенотип, промяна или отсъствието на промяна в каталитичната активност на споменатата протеин киназа или промяна или отсъствие на промяна във взаимодействието на този протеин с естествения свързващ партньор в крайния аспект на настоящето изобретение.

“Клетъчен фенотип” означава външния вид на клетка или тъкан или биологичната функция на клетката или тъканта. Примери, без да са ограничаващи, на клетъчен фенотип са размера на клетката, растежа на клетката, клетъчната пролиферация, клетъчната диференциация, преживяемостта на клетката, апоптозата и поеманате на храна и използването й. Такива фенотипни характеристики са измерваеми чрез добре известни в областта техники.

“Естествени свързващи партньори” се отнасят до полипептид, който свързва към конкретен РК в клетка. Естествени свързващи партньори могат да играят роля в предаването на сигнал в сигнално-трансдуциращ процес с посредник РК. Промяна във взаимодействието на естествения свързващ партньор с РК може да се прояви като намалена или увеличена концентрация на комплекса РК/ естествено свързващия партньор и в резултат в осезаема промяна в способността на РК до посредничи на сигналната трансдукция.

Представителни съединения от настоящето изобретение са показани на таблица 1а по-долу.

*Си»·

ТАБЛИЦА la

Съед No.	Структура	Наименование	MS m/z
1	/+¼ ο» k F Д СНз N	(3 - Диетиламино-2хидрокси-пропил)-амид на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3илиденметил)-2,4-диметил1Н-пирол-3-карбоксилна киселина	427[М+1]
2	H₃CL X Х^Й^СИз ^он О н	(2-Хидрокси-З-морфолин- 4-ил-пропил)-амид на 5-[5флуоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-(37)илиденметил] -2,4-диметил1Я-пирол-3-карбоксилна киселина	441 [М-1]
3	н₃<\ X ZkjO^O ^он \/° II	(2-Хидрокси-З-морфолин- 4-ил-пропил)-амид на 2,4диметил-5-[2-оксо-1,2дихидро-индол-(37)илиденметил]- 177-пирол-Зкарбоксилна киселина	423 [М-1]
4	Гй ^СН3 ^ОН \/° н	(2-Хидрокси-З -морфолин4-ил-пропил)-амид на 5-[5хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(37)-илиденметил]2,4-диметил- 1Я-пирол-3карбоксилна киселина	457 [М-1]
5	н₃о. J Хк^^о _в /ii ^снз ^ОН N	(2-Хидрокси-З-морфолин4-ил-пропил)-амид на 5-[5бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(37)-илиденметил] 2,4-диметил- Ш-пирол-3карбоксилна киселина	501[М-1] 503 [М-1]

X*w-·

6	^Нзс\ JL πύυυ) OH N N Η	(2-Хидрокси-З- [ 1,2,3]1риазол-1 -илпропил)-амид на 2,4диметил-5 - [2-оксо-1,2дихидро-индол-(37)илиденметил]-1Я-пирол-3карбоксилна киселина	405[М-1]
7	^Нз<\ JL χνΠΎ> OH N=N H	(2-Хидрокси-З[ 1,2,3]триазол-1 -илпропил)-амид на 5-[5флуоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-(37)илиденметил ] -2,4-диметилШ-пирол-З-карбоксилна киселина	423 [М-1]
8	^нз<\ X OH N N ^cl\ N	(2-Хидрокси-З[1,2,3]триазол-1-илпропил)-амид на 5-[5хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(37)-илиденметил]2,4-диметил- 1/7-пирол-Зкарбоксилна киселина	439[М-1]
9	^нз<\ X VcYY>% Z^N-'^CHj OH N N N	(2-Хидрокси-З- [ 1,2,3]триазол-1 -илпропил)-амид на 5-[5бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(ЗХ)-илиденметил]2,4-диметил- 17/-пирол-3карбоксилна киселина	483 [М-1] 485[М-1]

5- {(Z)- [4-(3 -хлорофенил)-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} Х-(2-хидрокси-3-пиролидин-1 илпропил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-3 карбоксамид

(3Z)-3-{ [4-( {[3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5мети л-3 -фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен}-2-оксо-1Ч-фенил-2,3дихидро- 1Н-индол-5-карбоксамид (3Z)-3- {[4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-3 -фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен} -Ь[-метил-2-оксо-2,3дихидро-1 Н-индол-5-карбоксамид (3Z)-3- {[4-( {[3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-3 - фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен} -М-(2-хидроксиетил)-2оксо-2,3-дихидро- 1Н-ИНДОЛ-5карбоксамид

М-[3-(диетиламино)-2хидроксипропил]-4-(4-флуорофенил)2-метил-5- {(Z)- [5-(морфолин-4илкарбонил)-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1 Н-пирол-3 карбоксамид

(3Z)-3-{[4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил ] амино} карбонил)-3 (4-флуорофенил)-5-метил-1Н-пирол-2ил]метилен} -№-изопропил-2-оксо-2,3дихидро-1 Н-индол-5 -карбоксамид (3Z)-3- {[4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3(2,4-дифлуорофенил)-5-метил-1Нпирол-2-ил]метилен} -2-оксо-1М-фенил2,3-дихидро-1 Н-индол-5-карбоксамид

(3Z)-3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3(2,4-дифлуорофенил)-5-метил-1Нпирол-2-ил]метилен}-Ь[-(2хидроксиетил)-2-оксо-2,3-дихидро-1Ниндол-5-карбоксамид

(3Z)-3-{[3-(4-цианофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино }карбонил)-5метил - 1Н-пирол-2-ил]метилен} -Ν,Νдиметил-2-оксо-2,3-дихидро- 1Ниндол-5 -карбоксамид н

4-(4-цианофенил)-М-[3-(диетиламино)2-хидроксипропил] -2-метил-5- {(Z)- [5 (морфолин-4-илкарбонил)-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1 Н-пирол-З-карбоксамид

(3Z)-3-{ [3-(4-хлорофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-1 Н-пирол-2-ил]метилен} -2оксо-М-фенил-2,3-дихидро-1Н-индол5-карбоксамид

(3Z)-3-{ [3-(4-хлорофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил- 1Н-пирол-2-ил] метален} -Nизопропил-2-оксо-2,3-дихидро-1Ниндол-5-карбоксамид

5-[(г)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-№-[2хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксамид н

5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-Ь1-[2хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-3карбоксамид

М-[2-хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-5- {(Z)- [2оксо-5-(трифлуорометокси)-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1 Н-пирол-3 -карбоксамид

5-[^)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]->1-[2хидрокси-3 -(1 Н-тетраазол-1 ил)пропил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксамид

5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-№-[2хидрокси-3-( 1 Н-тетраазол-1 ил)пропил ] -2,4-диметил-1 Н-пирол-3 карбоксамид

N- [2-хидрокси-3-( Ш-тетраазол-1 ил )пропил]-2,4-диметил-5-{(Z)-[2оксо-5 -(трифлуорометокси)-1,2дихидро-ЗН-индол-З-илиден] метил} 1 Н-пирол-З-карбоксамид

Н-{3-[(2К,68)-2,6-диметилморфолин4-ил]-2-хидроксипропил}-5-[(г)-(5флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол3 -или ден)метил] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

- [(Z)-(5-xnopo-2-OKco-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-М- {3[(2К,68)-2,6-диметилморфолин-4-ил]2-хидроксипропил} -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

М-{3-[(2К,68)-2,6-диметилморфолин4-ил]-2-хидроксипропил }-2,4диметил-5-{(7)-[2-оксо-5(трифлоурометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил}-1Н-пирол-3карбоксамид

5- [(7)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-1\[-[(2К)-2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимид азол идин-1 -ил)пропил ] -

2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид

5- [(Z)-(5-xnopo-2-OKCo-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-Ь1-[(2К)-2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил] -

2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид

N-[(2R)-2-xmjpoKCH-3-(3-MeTHn-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил] -

2,4-диметил-5-{ (Z)-[2-okco-5(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1 Н-пирол-3карбоксамид

5-[(г)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-№-[(28)-2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил] -

2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид

н

М-[(28)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил ] 2,4-диметил-5-{ (Z)-[2-okco-5(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3 -илиден]метил} -1 Н-пирол-3 карбоксамид

5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-14-[(28)-2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазол идин-1 -ил )пропил ] 2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид

N-[3-( 1,1 -диоксидотиоморфолин-4ил)-2-хидроксипропил]-2,4-диметил-5[(г)-(2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3илиден)метил] -1 Н-пирол-3карбоксамид

N-[3-( 1,1 -диоксидотиоморфолин-4ил)-2-хидроксипропил ]-5 - [(Z)-(5флоуро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол3-илиден)метил]-2,4-диметил-1Нпирол-3 -карбоксамид

- [(Z)-(5 -хлоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-З -илиден)метил] -N- [3 -(1,1 диоксидотиоморфолин-4-ил)-2хидроксипропил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

5- [(Z)-(5-6pomo-2-okco- 1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]->1-[3-(1,1 диоксидотиоморфолин-4-ил)-2хидроксипропил] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид <**-

442.49 5-[(Ζ)-(5-φπγορο-2-οκϋο-1,2дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил]-М-[(28)-2хидрокси-3 -морфолин-4илпропил ] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

442.49 5-[(7)-(5-флуоро-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил]-М-[(2И.)-2хидрокси-3 -морфолин-4илпропил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

458.95 5-[^)-(5-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил]-Ь1-[(2К)-2хи дрокси-3 -морфо лин-4илпропил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

458.95 5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил]-М-[(28)-2хидрокси-3 -морфолин-4илпропил] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид [2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3 -илокси)-пропил] - амид на 5-(5-(г)-флоуро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

[2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 5-(5-(г)-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

[2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 2,4-(7)-диметил-5-(2-оксо-5трифлуорометокси-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 5-(5-(7)-флоуро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил]-амид на 5-(5-(Ζ)-χπορο-2-οκοο-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 2,4-(7)-диметил-5-(2-оксо-5трифлуорометокси-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна киселина

Други представителни съединения на изобретението са дадени в Таблица lb.

Таблица lb

Наименование

Съед Структура

No.

3N

(З-Диетиламино-2-хидрокси-пропил)амид на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-3 -карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-флуоро-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-(3 )-илиденметил] -

2,4-диметил-Ш-пирол-З-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидро-индол-(3)илиденметил]- Ш-пирол-3карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-хлоро-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-(37)илиденметил]-2,4-диметил-1Я-пирол

3-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-бромо-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-илиденметил]-2,4 диметил- 1Я-пирол-3-карбоксилна киселина

5N (2-Хидрокси-З - [ 1,2,3 ]триазол-1 -илпропил)-амид на 2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидро-индолилиденметил]-1//-пирол-3карбоксилна киселина

(2-Хидрокси-З- [ 1,2,3 ]1риазол-1 -илпропил)-амид на 5-[5-флуоро-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-илиденметил] -2,4диметил- Ш-пирол-З-карбоксилна киселина

(2-Хидрокси-З- [ 1,2,3 ]триазол-1 -илпропил)-амид на 5-[5-хлоро-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-илиденметил]-2,4диметил-1 Я-пирол-3 -карбоксилна киселина

(2-Хидрокси-3-[1,2,3]триазол-1-илпропил)-амид на 5-[5-бромо-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-илиденметил]-2,4диметил-1 /7-пирол-З -карбоксилна киселина

3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил]амино}карбонил)-5 метил-3-фенил-1Н-пирол-2ил]метилен}-2-оксо-М-фенил-2,3дихидро-1 Н-индол-5-карбоксамид

12N

(3-{ [4-( {[3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5 метил-3-фенил-1Н-пирол-2ил]метилен}-1Ч-метил-2-оксо-2,3дихидро- Ш-индол-5-карбоксамид

Чщм»¹

13N

14N

(3Z)-3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5 метил-3-фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен} -ЬГ-(2-хидроксиетил)-2оксо-2,3 -дихидро-1 Н-индол-5 карбоксамид

Ь[-[3-(диетиламино)-2хидроксипропил]-4-(4-флуорофенил)2-метил-5-{ [5-(морфолин-4илкарбонил)-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1 Н-пирол-3карбоксамид

3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3 (4-флу орофенил)-5-метил-1 Н-пирол-2ил]метилен} ->1-изопропил-2-оксо-2,3 дихидро-1 Н-индол-5-карбоксамид

15N

3-{[4-({[3-(диетиламино)-2хидроксипропил]амино}карбонил)-3(2,4-дифлуорофенил)-5-метил- 1Нпирол-2-ил]метилен} -2-оксо-1Ч-фенил2,3 -дихидро-1 Н-индол-5-карбоксамид

3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3(2,4-дифлуорофенил)-5-метил-1Нпирол-2-ил]метилен} -N-(2хидроксиетил)-2-оксо-2,3-дихидро-1Н индол-5-карбоксамид

3-{ [3-(4-цианофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5 метил - 1Н-пирол-2-ил]метилен} -Ν,Νдиметил-2-оксо-2,3 -дихидро-1Ниндол-5-карбоксамид

4-(4-цианофенил)-М-[3-(диетиламино)-

2-хидроксипропил]-2-метил-5-{ [5(морфолин-4-илкарбонил)-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1Н-пирол-3-карбоксамид

3-{ [3-(4-хлорофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил- 1Н-пирол-2-ил] метален}-2оксо-М-фенил-2,3-дихидро-1Н-индол-

5-карбоксамид

3-{ [3-(4-хлорофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-1 Н-пирол-2-ил] метален} -Nизопропил-2-оксо-2,3-дихидро-1Ниндол-5-карбоксамид

23N

5-[(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]->[-[2хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксамид

- [5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-№-[2хидрокси-3-(2Н-те1раазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксамид

1Ч-[2-хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-5-{[2-оксо-5трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метал} - 1Н-пирол-3карбоксамид

24N '4^'

Г^\

5-[(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-Ь[-[2хидрокси-3-( 1 Н-тетраазол-1 ил)пропил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-3карбоксамид

5- [(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-М-[2хидрокси-3-( 1 Н-тетраазол-1 ил)пропил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксамид ]\[-[2-хидрокси-3-(1Н-тетраазол-1ил)пропил]-2,4-диметил-5- {[2-оксо-5трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} - 1Н-пирол-3карбоксамид

М-{3-[2,6-диметилморфолин-4-ил]-2хидроксипропил} -5- [(5 -флуоро-2оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3илиден)метил] -2,4-диметил-1 Н-пирол3-карбоксамид

5-[(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3 -илиден)метил] -N- {3- [2,6диметилморфолин-4-ил] -2хидроксипропил} -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

н

N- {3-[2,6-диметилморфолин-4-ил]-2хидроксипропил} -2,4-диметил-5- {[2оксо-5-(трифлоурометокси)-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1 Н-пирол-З-карбоксамид

5-[(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-Ь[-[2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил ] 2,4-диметил-1 Н-пирол-3 -карбоксамид ’’Ййй*'

N- [2-хидрокси-З -(З-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил ] -

2.4- диметил-5-{ (Z)-[2-okco-5(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1 Н-пирол-3карбоксамид

5- [(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-Г4-[2хидрокси-3 -(3 -метил-2,5 диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил ] -

2.4- диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид

N- [3-(1,1 -диоксид отиоморфолин-4ил)-2-хидроксипропил]-2,4-диметил-5[(2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-Зили ден)метил ] -1 Н-пирол- 3 карбоксамид

1\[-[3-(1,1-диоксидотиоморфолин-4ил)-2-хидроксипропил]-5-[(5-флоуро-

2- оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил] -2,4-диметил-1 Н-пирол-

3- карбоксамид

5- [(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-Г4- [3-( 1,1диоксидотиоморфолин-4-ил)-2хидроксипропил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

40N

47N

5- [(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-З -илиден)метил] -N- [3 (1,1 - диоксид отиоморфолин-4-ил)-2хидроксипропил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид [2-хидрокси-3-([1,2,3]1риазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 5-(5-флоуро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 5-(5-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3 -илокси)-пропил] - амид на 2,4-диметил-5-(2-оксо-5трифлуорометокси-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 5-(5-флоуро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензозриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 5-(5-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

[2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 2,4-диметил-5-(2-оксо-5трифлуорометокси-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна киселина

Други представителни съединения на изобретението са дадени в Таблица 1с по-долу.

Таблица1с

Съед Структура

Наименование (2-хидрокси-З -морфолин-4-илпропил)-метил-амид на 5-(5-флуоро-2оксо-1,2-дихидро-индол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол3-карбоксилна киселина ((8)-2-хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-метил-амид на 5-((Z)-5флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол3-карбоксилна киселина ((К)-2-хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-метил-амид на 5-((Z)-5флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол3-карбоксилна киселина

Съединенията представени в Таблици 1а-1с са само примерни и не трябва да се разглеждат като ограничаващи обхвата на изобретението по какъвто и да е начин.

Въпреки че в описанието на изобретението е дадена най-широка дефиниция на съединенията с формула (I), някои от тези съединения са предпочитани.

Предпочитана група от съединения с формула (I) са тези при които:

R⁶ е подбран от група състояща се от водород и алкил, с предпочитание водород, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, изобутил или н-бутил, по за предпочитане водород или метил и

R⁷ е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, алкил, циклоалкил, арил или хетероарил и R⁷ е по за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н-, изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси, но най-вече метил, водород или фенил.

2. Друга предпочитана група от съединения с формула (I) е таки при която:

R⁶ е подбран от група състояща се от водород и алкил, с предпочитание водород, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, изобутил или н-бутил, по за предпочитане водород или метил;

R е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, алкил или арил и R⁷ е по за 'W предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н-, изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси, по най-вече метил, водород или фенил и

R³, R⁴ и R⁵ са водород и

Z означава арил.

3. Друга предпочитана група от съединения с формула (I) се тази при която:

R⁶ е подбран от група състояща се от водород и алкил, с предпочитание водород, метил, етил, изопропил, трет.-бутил, изобутил или н-бутил, по за предпочитане водород и най-вече метил;

η

R е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, алкил или арил и R⁷ е по за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н-, изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси, по най-вече метил, водород или фенил, особено метил и

R³, R⁴ и R⁵ са водород и

Z означава хетероарил, с предпочитание триазинил, тетразолил, имидазолил, пиридинил, пиримидинил или пиразинил.

4. Друга предпочитана група от съединения с формула (I) се тази при която:

«7

R е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, алкил или арил и R⁷ е по за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н-, изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси, по най-вече метил, водород или фенил и

R³, R⁴ и R⁵ са водород и

Z означава хетероцикъл.

5. Друга предпочитана група от съединения с формула (I) се тази при която:

R е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R¹⁷, където R¹⁷ е хидрокси, алкил или арил и R⁷ е по за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н-, изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси, по най-вече метил, водород или фенил и особено метил и

R³, R⁴ и R⁵ са водород и

Z означава -NR¹⁵R¹⁶, в която R¹⁵ и R¹⁶ комбинирано образуват хетероцикламино, с предпочитание пиперидин-Пил, N-метилпиперидин-!ил, пиперазин-1-ил, К[-метилпиролидин-1-ил, пиролидин-1-ил, морфолин-4ил, тиоморфолин-4-ил, тиоморфолино-1-оксид, тиоморфолино-1,1-диоксид, 4-етилоксикарбонилметилпиперазин-1 -ил, 3-оксопиперазин-1 -ил, имидазолидин-1 -ил-2-он, пиролидин-1 -ил-2-он, 2-оксохомопиперазин-1 -ил W или тетрахидропиеримидин-1-ил-2-он, по-предпочитано морфолин-4-ил.

6. Друга предпочитана група от съединения с формула (I) се тази при която:

R е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -C(O)R , където R е хидрокси, алкил или арил и R е по за предпочитане водород, метил, етил, изопропил, н-, изо- или трет.-бутил, фенил, бензоил, ацетил или карбокси, по най-вече метил, водород или фенил и

R³, R⁴ и R⁵ са водород и

Z означава -NR¹⁵R¹⁶, в която R¹⁵ и R¹⁶ са алкил, с предпочитание диетиламино, диметиламино или етиламино.

7. Между горните предпочитани и по-предпочитани групи 1-6, дори още по-предпочитана група съединения е тази в която:

R¹ означава водород, алкил, -C(O)NR¹²R¹³, незаместен циклоалкил, с предпочитание водород, 3,4-диметоксифениламинокарбонил, 4-метокси-Зхлорофенил-аминокарбонил, дори още по-предпочитано водород или метил, и най-добре водород и

R² е водород, циано, халоген, нисш алкокси или -S(O)₂R⁹R¹⁰ в която R⁹ е водород и R¹⁰ е водород, арил или алкил и е в 5-та позиция на оксиндоловия пръстен, с предпочитание, R² е водород, хлор, бром, флуор, метокси, етокси, фенил, диметиламиносулфонил, 3-хлорофениламиносулфонил, карбокси, метокси, аминосулфонил, метиламиносулфонил, фениламиносулфонил, пиридин-3-ил-аминосулфонил, диметиламиносулфонил, изопропиламино-сулфонил, по-предпочитано водород, флуор или бром. Най-предпочитано R е флуор и той е в 5-та позиция на индолиноновия пръстен.

При горните предпочитани, по-предпочитани и дори найпредпочитани съединения стереохимията при въглеродния атом носещ хидроксилната група в -CONHCH(R³)*CR⁴(OH)CR⁵Z веригата и показана с * е RS, R или S, по-предпочитано S.

Полезност

PKs, чиято каталитична активност се модулира от съединенията от настоящето изобретение, включва протеин тирозин кинази от които има два типа, рецепторни тирозин кинази (RTKs) и клетъчнии тирозин кинази (CTKs) и серин-треонин кинази (STKs). RTK медиираната сигнална трансудция се инициира от екстрацелуларни взаимодействия със специфичен растежен фактор (лиганд), последвано от рацепторно димеризиране, временно стимулиране на присъщата протеин тирозин киназна активност и фосфорилиране. При това се създават местата на свързване за интрацелуларните сигнални трансдукционни молекули и това води до образуване на комплекси със спектър от цитоплазмени сигнални молекули, които улесняват подходящия клетъчен отговор (например клетъчно делене, метаболитни ефекти върху екстрацелуларната околна микросреда и т.н.). Виж Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9: 303 - 391.

Показано бе, че тирозин фосфорилиращите места върху растежнофакторните рецептори функционират като високо-афинитетно свързващи места за SH2 (src хомология) домени на сигналните молекули. Fantl et al., 1992, Cell 69 : 413 - 423, Songyang et al., 1993, Cell 72 : 767 - 778 и Koch et al., 1991, Science 252 : 668 - 678.

Идентифицирани са няколко интрацелуларни субстратни протеини, който се свързват с PKs. Те могат да се разделят на две принципни групи: (1) субстрати, които имат каталитичен домен и (2) субстрати на които липсва такъв домен, но които служат като адаптери и се свързват с каталитично активни молекули. Songyang et al., 1993, Cell 72 : 767 - 778. Специфичността на взаимодействията между рецептори и SH2 домени на тяхните субстрати се определя чрез аминокиселинни остатъци, веднага заобикалящи фосфорилираните тирозинови остатъци. Различия в свързващите афинитета между SH2 домените и аминокиселинните секвенции, заобикалящи фосфотирозиновите остатъци на отделни рецептори, съвпадат с наблюдаваните различия в тяхните субстратни фосфорилиращи профили. Songyang et al., 1993, Cell 72 : 767 - 778. Тези наблюдения подсказват, че функцията на всеки RTK се определя не само по неговата характеристика на експресиране и лигандна достъпност, но също така и по реда на сигнала надолу на пътищата на трансдукция, които се активират чрез специфичен рецептор. Така, фосфорилирането осигурява важен регулаторен етап, който определя селективността на сигналните пътища, подсилени от специфичните растежнофакторни рецептори, както и като диференциращи факторни рецептори.

STKs, които първоначално са цитозолични, засягат вътрешната биохимия на клетката, често като отговор надолу по линията на РТК случай. STKs участват в сигналния процес, който инициира ДНК синтезата и последваща митоза, която води до клетъчна пролиферация.

Така, РК сигнална трансдукция води, между другите реакции, до клетъчна пролиферация, диференциация, растеж и метаболизъм. Анормална клетъчна пролиферация може да доведе до множество нарушения и заболявания, включително развиването на неоплазия като карцинома, саркома, глиобластома и хемангиома, нарушения като левкемия, псориаза, атеросклероза, артрит и диабетична ретинопатия и други нарушения свързани с неконтролирана ангиогенеза и/или васкулогенеза.

За използване на настоящето изобретение не се изисква точно разбиране на механизма по който съединенията от изобретението инхибират PKs. Обаче, без да се обвързваме до конкретен механизъм или теория, смята се, че съединенията взаимодействат с аминокиселините в каталитичния регион на PKs. Типично PKs притежават структура от два лоба, в която АТР _w изглежда че се свързва в цепнатината между двата лоба в регион, в който аминокиселините са запазени между PKs. Смята се, че инхибиторите на PKs се свързват чрез нековалентни взаимодействия като водородно свързване, Ван дер Валсови сили и йонни взаимодействия, в същия общ регион, където по-горе споменатите АТР се свързват към PKs. По-конкретно, смята се, че 2индолиноновата съставка на съединенията от настоящето изобретение се свързва в общото пространство нормално заето от адениновия пръстен на АТР. За конкретна молекула, за конкретен РК може тогава да възникне в резултат на допълнителни взаимодействия между различните заместители на

2-индолиноновата сърцевина и аминокиселинните домени специфичност към конкретни PKs. Така, различни индолинонови заместители могат да допринесат за преференциално свързване към конкретни PKs. Способността да се подберат съединения активни при различни АТР (или други нуклеотидни) места на свързване, прави съединенията от настоящето изобретение полезни за уцелване на всеки протеин с такова място. Описаните тук съединения имат поради това приложимост да проявяват при in vitro изпитания приложимост към такива протеини, както и да проявяват in vivo лечебни ефекти чрез взаимодействия с такива протеини.

В допълнение, съединенията от настоящето изобретение осигуряват лечебно приложение при много видове твърди тумори, включително, без да е ограничително, при карциноми, саркоми включително Kaposti’s sarcoma, еритробластома, глиобластома, менингиома, астроцитома, меланома и миобластома. В изобретението се имат предвид и лечението и предпазването от нетвърди туморни ракове като левкемия. Такива могат да бъдат, без да се ограничава до тях, ракове на мозъка, ракове на пикочния мехур, на яйчниците, стомашни видове рак, ракове на панкреаса, на дебелото черво, на кръвта, на белия дроб и ракове на костите.

Други примери, без да са ограничаващи, от видове нарушения свързани с неподходяща РК активност, при които описаните тук съединения могат да бъдет полезни и да действат за предпазване и лекуване, са клетъчни пролиферативни нарушения, фибротични нарушения и метаболитни смущения. Клетъчните пролиферативни смущения, които могат да бъдат предотвратени, лекувани или по-нататък изследвани от настоящето изобретение включват рак, пролиферативни смущения на кръвоносните съдове и мезенгиални клетъчно пролиферативни смущения.

Кръвоносносъдовите пролиферативни смущения се отнася до нарушения смързани с анормална васкулогенеза (образуване на кръвоносни съдове) и ангиогенеза (разпространението на кръвоносни съдове). Докато васкулогенезата и ангиогенезата играят важни роли в разнообразието на нормални физиологични процеси като ембрионалното развитие, образуването на corpus luteum, заздравяването на рани и регенерирането на органи, те също играят централна роля при образуването на рак в резултат на което се образуват нови капиляри, необходими за поддържането на тумора жив. Други примери за нарушения на пролиферацията на кръвоносните съдове включват артрит, където нови капилярни кръвоносни съдове инвазират ставата и разрушават хрущяла и очни заболявания, като диабетична ретинопатия, където нови капиляри в ретината инвазират стъкловидното тяло, кървят и причиняват слепота.

Идентифицирани са две структурно сродни PKs, свързващи се с голям афинитет с VEGF: fms- (flt-1) (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5: 519 524; De Vries et al., 1992, Science, 255: 989 - 991) и KDR/FLK-1 рецептор, известен също като VEGF-R2. Съдовият ендотелен растежен фактор (VEGF) е докладвано, че е ендотелен клетъчен специфичен митоген с in vitro ендотелна клетъчна растежпромовираща активност. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161 : 851 - 858 ; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265 : 19461 - 19566. Информация дадена в U.S. заявки c Nos. 08/193 829, 08/038 596 и 07/975 750, настояват, че VEGF е не само отговорен за ендотелната клетъчна пролиферация, но също така е главния регулатор на нормалната и патологична ангиогенеза. Виж. Klagsbum & Soker, 1993, Current Biology, 3(10) 699 - 702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267 : 26031 - 26037.

Нормалните васкулогенеза и ангиогенеза играят съществена роля в различни физиологични процеси като ембрионалното развитие, заздравяването на рани, регенерирането на органи и женските репродуктивни процеси като развитието на фоликули в жълтото тяло при овулация и растежа на плацентата след забременяване. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16); 10931 - 34. Неконтролирана васкулогенеза и/или ангиогенеза е била свързана със заболявания като диабет както и с злокачествени твърди тумори, които разчитат на васкуларизиране за растежа си. Klagsbum & Soker, 1993, Current Biology, 3(10) 699 - 702; Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82 : 4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324 : 1-5.

Предположената роля на VEGF в ендотелната клетъчна пролиферация и миграция при ангиогенезата и васкулогенезата показва важна роля за KDR/FLK-1 рецептора при тези процеси. Заболявания като diabetes mellitus (Folkman, 198, XI^th Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al., eds.), pp. 583 - 596, Leuven University Press, Leuven) и артрит, както и растеж на злокачестени тумори може да е в резултат на неконтролирана ангиогенеза. Виж например Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285: 1182 - 1186. Рецепторите, към които VEGF се свързва специфично, са важни и мощни лечебни цели за регулиране и модулиране на васкулогенезата и/или ангиогенезата и на различни тежки заболявания, които включват анормален клетъчен растеж, причинен от такива процеси. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7 (6): 334 - 339. По-конкретно, KDR/FLK-1 рецепторната много специфична роля в неоваскуларизирането я правят цел за лечебно въздействие при лечението на рак и други заболявания, които включват неконтролирано образуване на кръвоносни съдове.

Така настоящето изобретение осигурява съединения способни да регулират и/или модулират тирозин киназното сигнално провеждане, включително KDR/FLK-1 рецепторното сигнално провеждане с оглед да се инхибира или промовира ангиогенеза и/или васкулогенеза, т.е. съединения, които инхибират, предпазват или интерферират със сигналното провеждане чрез KDR/FLK-1 когато се активират от лиганди като VEGF. Въпреки че се смята, че съединенията от настоящето изобретение действат върху рецептор или друг компонент по пътя на тирозин киназното сигнално провеждане, те могат също да действат директно върху туморните клетки, произлизащи от неконтролираната ангиогенеза.

Въпреки че номенкратурата на човешките и миши противочасти на генеричния “flk-I” рецептор се различават, те в много отношения са взаимнозаменяеми. Мишият рецептор, FLK-1, и неговата човешка противочаст, KDR, споделят секветна хомология от 93.4 % в интрацелуларния домен. По подобен начин, миши FLK-1 свързва човешки VEGF със същия афинитет както мишия VEGF и съответно се активира от лиганда получен от който и да е от видовете. Millauer et al., 1993, Cell, 72 : 835 - 846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 7533 - 7537. FLK-1 също се свързва и след това тирозин фосфорилира човешки RTK субстрати (например PLC-γ или р85) когато са коекспресирани в 293 клетки (човешки ембрионални бъбречни фибробласти).

Модели, които разчитат на FLK-1 рецептора, са поради това директно приложими за проучване на KDR рецептора. Например, използването на миши FLK-1 рецептор в методи, които идентифицират съединения които регулират мишия сигнален трансдукционен път, са директно приложими за идентифициране на съединения, които могат да се използват за регулиране на човешкия сигнален трансдукционен път, т.е. който регулира активността към KDR рецептора. Така, химическа съединения, идентифицирани като w инхибитори на KDR/FLK-1 in vitro, могат да потвърдят приложимостта си в модели in vivo. В in vivo миши и на плъх животински модели е демонстрирано, че имат отлична стойност за изследване на клиничния потенциал на средства, действащи върху KDR/FLK-1 индуциран сигнален трансдукционен път.

Така настоящето изобретение осигурява съединения, които регулират, модулират и/или инхибират васкулогенезата и/или ангиогенезата чрез повлияване на ензимната активност на KDR/FLK-1 рецептора и интерферират със сигнала трансдуциран от KDR/FLK-1. Така настоящето изобретение осигурява лечебно средство за третиране на много видове твърди тумори, включително, без да се ограничава до тях, глиобластома, меланома, Kaposti’s sarcoma и карцином на яйчниците, на белите дробове, на гърдите, на простатата, на панкреаса, дебелото черво и епидермиса. В допълнение, данните подсказват, че прилагането на съединенията, които инхибират пътя на сигналната трансдукция с посредник KDR/FLK-1, може също да се използват при лечението на хемангиома, рестеноза и диабетична ретинопатия.

Нещо повече, изобретението се отнася до инхибиране на васкулогенезата и ангиогенезата при други с посредник рецептори пътища, включително пътища включващи flt-1 рецептор.

Сигнална трансудкция с посредник рецепторна тирозин киназа се инициира чрез екстрацелуларни взаимодействия със специфичен растежен фактор (лиганд), последвано от рецепторна димеризация, временно стимулиране на присъсщата протеин киназна активност и автофосфорилиране. При това се създават места на свързване за интрацелуларни сигнални трансдукционни молекули, което води до образуването на комплекси със спектър на цитоплазмени сигнализиращи молекули, което улеснява подходящата целуларна реакция, например клетъчното делене и метаболитните ефекти към извънклетъчната околна среда. Виж, Schlessinger and Ullrichq 1992, Neutron, 9: 1 - 20.)

Близката хомология на интрацелуларните региони на KDR/FLK-1 с тази на PDGF-β рецептора (50.3 % хомоложност) и/или свързания flt-1 рецептор, показва индуцирането на препокриващи се сигнални индукционни пътища. Например, за PDGF-β рецептора, член на scr фамалията (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7696 - 7700), фосфатидилинозитол3’- киназа (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 981 - 990), фосфолипаза cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4: 49 - 51), ras-GTPaseактивиращ протеин, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11:1373 - 1382), PTPID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90: 6939 - 6043), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14 : 6715 - 6726), и адаптерни молекули She и Nek (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13 : 6889 - 6896) e показано, че свързват към региони имащи различни автофосфорилиращи места. Виж предимно Cleasson - Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5: 37 — 54. Така, въжможно е, сигналните трансдукционни пътища, активирани от KDR/FLK-1, да включват ras пътя (Rozakis et al., 1992, Nature, 360: 689 692), киназата PI-3’, c посредници sre и plcy пътища. Всеки от тези пътища може да играе критична роля в ангиогенния и/или васкулогенния ефект на KDR/FLK-1 в ендотелните клетки. Следователно, друг аспект на настоящето изобретение се отнася до използването на органичните съединения, описани тук, за модулиране на ангиогенезата и васкулогенезата, тъй като такива процеси се контролират от тези пътища.

Обратното, нарушения свързани със свиване, контрактиране или затваряне на кръвоносните съдове, като рестеноза, също се имат предвид, тъй като те могат да бъдат лекувани или от тях може да се предпазим чрез методите от изобретението.

Фабриотични нарушения се отнасят до анормално образуване на екстрацелуларни матрици. Примери на фабриотични нарушения включват хепатитна цероза и мезенгиални клетъчни пролиферативни нарушения, w Хепатитна цироза се характеризира чрез увеличаване на екстрацелуларните матрични съставки в резултат на което се образува хепатичен цикатрикс. Увеличена екстрацелуларна матрица водеща до хепатитен цикатрикс може да се причини също от вирусна инфекция като хепатит. Липоцитите изглежда че играят съществена роля в хепатитната цироза. Други фибротични нарушения са атеросклерозата.

Нарушенията, свързани с мезенгиална клетъчна пролиферация, се отнасят до нарушения, получаващи се чрез анормално пролифериране на мезенгиалните клетки. Мезенгиални пролиферативни нарушения включват различни човешки бъбречни заболявания като гломерулонефрит, диабетична нефропатия и злокачествена нефросклероза, както и такива нарушения като тромботични микроангиопатични синдроми, отхвърляне на трансплантат и гломерулопатии. RTK PDGFR участва в поддържането на мезенгиална клетъчна пролиферация. Floge et al., 1993, Kidney International 43 : 47S - 54S.

Много ракови заболявания са клетъчни пролиферативни нарушения и, както по-горе бе казано, PKs са свързани с клетъчните пролиферативни нарушения. Така, не е изненадващо, че такива PKs като например членове на RTK фамилията, са свързани с развитието на рак. Някои от тези рецептори, като EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227 - 233, Torp et al., 1992, APMIS 100: 713 - 719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707 - 712) и PDGF-R (Kumbe et al., 1992, Oncogene, 7: 627 - 633) са свръхекспресирани в много тумори и/или или упорито активирани чрез автокринни примки. Фактически, при най-простите и тежки ракове е било демострирано това рецепторно свръхекспресиране (Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J.Neurol. Sci., Ill: 119 - 133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res., 61: 249 - 273, Kokc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90 : 1352 - 1360) както и автокринни примки (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118: 1057 - 1070, Kokc et al., supra, Akbasak and Suner-Akbasak et al., supra). Например, EGFR e свързван c люспест клетъчен карцином, астроцитома, глиобластома, рак на w главата и врата, белодробен рак и рак на пикочния мехур. HER2 се свързва с рак на гърдата, на яйчниците, на стомаха, на белия дроб, на панкреаса и на пикочния мехур. PDGFR е свързан с глиобрастома и меланома, както и с рак на гърдата, на яйчниците и на простата. RTK c-met е също свързан с образуването на злокачестени тумори. Например, c-met е свързан между другите видове рак с рак на дебелото черво, на тироидната жлеза, на панкреаса, на стомаха и хепатоцелуларен карцином и лимфоми. В допълнение, c-met е свързан и с левкемия. Свръхекспресиране на c-met гена е било също проследено в пациенти на заболяването на Hodgkin и на Burkitt.

IGF-IR, в допълнение на участието му в хранителни доставки и тип-П ’'W диабет, е свързан също с няколко типа рак. Например, IGF-I участва като автокринен растежен стимулатор за няколко туморни видове, например ракови клетки при рак на гърдата при човек (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418 - 1423) и дребноклетъчни туморни клетки (Macauley et al., 1990, Cancer Res., 50: 2511 - 2517). В допълнение, при все че IGF-I е неразделно свързан в нормалния растеж и диференциация на нервната система, изглежда че е автокринен стимулатор на човешки глиоми. Sandberg - Nordqvist et al., 1993, Cancer Res., 53 : 2475 - 2478. Важността на IGF-IR и неговите лиганди в клетъчната пролиферация е по-нататък подкрепена от факта, че много клетъчни видове в култура (фибробласти, епителни клетки, клетки на гладката мускулатура, Т-лимфоцити, милеоидни клетки, хондроцити и остеобласти (стволови клетки на костния мозък)) се стимулират към растеж от IGF-I. Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1: 3-1 - 326. Baserga и Coppola предполагат, че IGF-IR играят централна роля в механизма на трансформиране и, като така, могат да са предпочетена цел за лечебни интервенции при широк спектър от човешки злокачествени заболявания. Baserga, 1995, Cancer Res., 55: 249 - 252, Baserga, 1994, Cell 79: 927 - 930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14 : 4588 - 4595.

STKs участват в много типове рак, включително, за отбелязване, рак на гърдата (Cance et al., Int. J. Cancer, 54 : 571 - 77 (1993)).

Връзката между анормална РК активност и заболяване не се ограничава до рак. Например PKs са свързани със заболявания като псориаза, diabetes mellitus, ендометриоза, ангиогенеза, атероматозно развиване на плаки, болестта на Alzheimer, рестеноза, болестта на Hippel Lindau, епидермална хиперпролиферация, невродегенеративно заболяване, свързано с възрастта макуларно дегенериране и хемангиоми. Например, EGFR участва в заздравяването на рани в корнеата и по кожата. Дефекти в инсулин-R и IGFF-1R е показано в тип-П diabetes mellitus. По-пълно корелиране между специфични RTKs и тяхните лечебни индикации е дадено от Plowman et al., 1994, DN&P 7: 334 - 339.

Както по-рано бе отбелязано, не само RTKs, но включително и CTKs, без да се ограничава до тях, scr, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr и yrk (според прегледа на Bolen et al., 1992, FASEB J., 6: 3403 - 34-09) участват в пролиферацията и метаболичния сигнален транедукционен път и така може да се очаква, и е показано, че участват в много нарушения с посредник РТК, към които е насочено настоящето изобретение. Например, мутирал sre (v-src) е показано, че е онкопротеин (ррбО ^v'^src) при пилета. Нещо повече, неговият клетъчен хомолог, прото-онкогена pp60^c_src предава онкогенни сигнали на много рецептори. Свръх-експресиране на EGFR или HER2/neu в тумори води до основно активиране на pp60^{c src}, който е характерен за злокачествени клетки, но отсъства в нормални клетки. От друга страна, мишки, които са дефицитни в експресирането на c-src, проявяват остеопетротичен фенотип, показващо ключово участие на c-src в остеокластната функция и възможно участие в сродни нарушения.

По подобен начин, Zap70 участва в Т-клетъчното сигнализиране, което може да се дължи на автоимунни нарушения.

STKs са свързани с възпалителни, автоимунни заболявания, нарушения свързани на имунната реакция и хиперпролиферацията като рестеноза, фиброза, псориаза, остеоартрит и ревматоиден артрит.

PKs участват също в имплантирането на ембрио. Така, съединенията от настоящето изобретение могат да осигурят ефективен метод за предпазване от такова ембрионално имплантиране и с това да са полезни като средства за контролиране на раждаемостта. Допълнителни нарушения, които могат да се лекуват или които могат да се предпазят при използването на съединенията от изобретението, са имунологични нарушения като автоимунно заболяване, СПИН и сърдечносъдови нарушения като атеросклероза.

Накрая, както RTKs, така и CTKs понастоящем се подозират като взимащи участи при хиперимунни нарушения.

Съединенията и показаните данни не трябва да се приемат като ограничаващи обхвата на изобретението по какъвто и да е начин.

Прилагане на фармацевтичните състави

Съединение от настоящето изобретение или негова фармацевтично приемлива сол могат да се прилагат като такива към човек - пациент или могат да се прилагат във фармацевтични състави, в които горните вещества са в смес с подходящи насители или пълнител(и). Техники за формулиране и прилагане на лекаства може да се намерят в “Remington’s Farmacological Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA., последно издания.

Както се използва тук, “прилагане” или “приложение” се отнася до отдаването на съединение с формула (I) или негова фармацевтично приемлива сол или на фармацевтичен състав съдържащ съединение с формула (I) или негова фармацевтично приемлива сол от настоящето изобретение в организъм с цел на предпазване или лечение от свързано с РКнарушение.

Подходящи пътища за приложение могат да бъдат, без да са ограничаващи, орален, ректален, през лигавицата или интестинално приложение или мускулно, подкожно, интрамедуларно, интратекално, w директно интравентикуларно, интравенозно, интравитреално, интраперитонеално, интраназално или интраокулярно инжектиране. Предпочитани пътища на приложение са орален и парентерален.

Алтернативно, съединението може по-скоро да се приложи по локален отколкото по системен начин, например чрез инжектиране на съединението директно в твърдия тумор, често като депо- формулировка или формулировка със забавено отдаване на активното вещество.

Нещо повече, лекарството може да се приложи в насочена лекарство отдаваща система, например, в липозом покрит с тумор-специфично антитело. Липозомите ще са насочени към и ще бъдат поети селективно от тумора.

Фармацевтични състави от настоящето изобретение могат да се произвеждат по методи, добре известни в областта, например чрез средства за конвенционално смесване, разтваряне, гранулиране, получаване на дражета, стриване, емулгиране, капсулиране, включване или методи на лиофилизиране.

Фармацевтичните състави за използване в съответствие с настоящето изобретение могат да се формулират по обичаен начин като се използват един или повече физиологично приемливи носители, включващи пълнители и добавъчни средства, които улесняват обработването на активните съединения в препарати, които могат да се използват фармацевтично. Подходящата формулировка зависи от избрания път на приложение.

За инжектиране, съединенията от изобретението могат да се формулират във водни разтвори, с предпочитание във физиологично съвместими буфери като разтвора на Hank, разтворът на Ringer или физиологичен солев разтвор. За приложение през лигавицата във формулировката се използват пенетранти проникващи през бариерата. Такива пенетратни най-общо се известни в областта.

За орално приложение, съединенията могат да се формулират чрез

V комбиниране на активните съединения с фармацевтично приемливи носители, известни в областта. Такива носители дават възможност на съединенията от изобретението да бъдат формулирани като таблети, пилюли, лозенджи, дражета, капсули, течности, гелове, сиропи, пасти, суспенсии и подобни за поглъщане през устата от пациента. Фармацевтични препарати за използване през устата могат да се получат като се използва твърд пълнител, евентуално смилане на получената смес и обработване на сместа в гранули при желаниеу, след като се прибавят други подходящи добавки, за да се получат таблетки или сърцевини за дражета. Полезни пълнители са, по-специално, манитол или сорбитол, целулозни продукти като например царевично нишесте, пшеничено нишесте, оризово нишесте и картофено нишесте и други вещества като желатин, гума трагаканта, метилцелулоза, хидроксипропилметилцелулоза, натриева карбоксиметилцелулоза и/или поливинил-пиролидон (PVP). При желание могат да се прибавят дезинтегриращи средства като напречно свързан поливинил пиролидон, агар или алгинова киселина. Може да се използва също и сол като натриев алгинат. Сърцевините на дражетата се покриват с подходящи покрития. За целта може да се използват концентрирани захарни разтвори, които могат да съдържат евентуално гума арабика, талк, поливинилпиролидон, карбопол гел, полиетиленгликол и/или титанов диоксид, лакови разтвори и подходящи органични разтворители или смеси от разтворители. Могат да се примавят багрещи вещества или пигменти към таблетките или покритията на дражетата за идентифициране или за охарактеризиране на различните комбинации от дози на активното съединение.

Фармацевтични състави, които могат да се използват орално, включват пълнени желатинови капсули, както и меки запечатани капсули от желатин и пластификатор като глицерол или сорбитол. В капсулите активните съставки могат да са в смес с пълнител като лактоза, свързващо вещество като нишесте и/или смазващо вещество като талк или магнезиев стеарат и евентуално стабилизатори. В меките капсули, активните съединения могат да са разтворени или суспендирани в подходящи течности като масла, течен парафин или течни полиетиленгликоли. В тези формулировки могат да се прибавят също и стабилизатори.

Фармацевтични състави, които също могат да се използват са твърди желатинови капсули. Като неограничаващ пример, активното съединение, съдържащо се в капсула за орално приложение, може да съдържа доза от 50 и 200 мг. Двете дози се правят от един и същи гранули чрез запълване на твърди желатинови капсули с различни размери, размер 3 за 50 мг-овите капсули и размер 0 за 200 мг-овите капсули. Съставите от формулировката могат да бъдат например катто е показано в таблица 2.

Съставка Наименование/чистота	Концентрация в гранулите (% т/т)	Количество в 50 мг капсула (мг)	Количество в 200 мг капсула (мг)
Активно съединение NF	65.0	50.0	200.0
Манитол NF	23.5	18.1	72.4
Натриева кроскармелоза NF	6.0	4.6	18.4

Съставка Наименование/чистота	Концентрация в гранулите (% т/т)	Количество в 50 мг капсула (мг)	Количество в 200 мг капсула (мг)
Повидон К 30 NF	5.0	3.8	15.2
Магнезиев стеарат NF	0.5	0.38	1.52
Капсула, шведско жълто NF		размер 3	размер 0

Капсулите могат да се опаковат в кафяви стъкла или пластмасови банки за защита на активното съединение от светлина. Опаковките съдържащи капсулната формулировка на активното съединение се съхраняват при контролирана стайна температура (15 -30° С).

За прилагане чрез инхалиране, съединенията използвани съгласно настоящето изобретение за удобство се отдават под формата на аерозолен спрей като се използват опаковки под налягане или небулизатор и подходящо летливо вещество, например, без да се ограничава до тях, дихлородифлуорометан, трихлорофлуорометан, дихлоротетра-флуороетан или въглероден диоксид. В случай на аерозол под налягане, дозиращата единица може да се контролира чрез осигуряване на клапа за отдаване на премерена доза. Капсули и патронажи, примерно от желатин за използване в инхалатор или инсуфлатор, могат да се формулират като съдържат прахова смес на съединението с подходяща прахова база като лактоза или нишесте.

Съединенията могат също да са формулирани за парентерално приложение, например чрез болусни инжекции или непрекъсната инфузия. Формулировките за инжектиране могат да присъстват в единична дозираща форма, например в ампули или в мулти-дозиращи контейнери с прибавени консерванти. Съставите могат да бъдат под формите на суспензии, разтвори или емулсии в маслен или воден носител и могат да съдържат формулиращи материали като суспендиращи, стабилизиращи и/или диспергиращи средства.

Фармацевтичните състави за парентерално приложение включват водни разтвори на водноразтворима форма, като например, без да се ограничава до тях, сол на активното съединение. В допълнение, суспензии на активното съединение могат да се получат в липофилен носител. Подходящи липофилни носители включват масла като сусамено, синтетични естери на мастни киселини като етилолеат и триглицериди или материали като липозоми. Водните инжекционни суспензии могат да съдържат вещества, които повишават вискозитета на суспензията като натриева карбоксиметилцелулоза, сорбитол или декстран. Суспензията може да съдържа евентуално също и подходящи стабилизатори и/или средства, които увеличават разтворимостта на съединенията за да позволят получаването на много концентрирани разтвори. Алтернативно, активната съставка може да е под формата на прах за да се разтвори преди употреба в подходящ носител, например стерилна, свободна от пироген вода.

Съединената могат също да се формулират в ректални състави като супозитории или клизми със забавено действие като се използвато примерно обичайни основи за супозитории като какаово масло или други глицериди.

В допълнение, към описаните вече формулировки, съединенията могат също да се формулират като депо-препарати. Такива продължително действащи формулировки могат да се прилагат чрез имплантиране (например подкожно или в мускула) или чрез инжектиране в мускула. Съединение от изобретението може да се формулира за този начин на приложение с подходящи полимерни или хидрофобни материали (например в емулсия с фармакологично приемливо масло), с йонообменни смоли или като слаборазтворимо производно например трудно разтворима сол, без да се ограничава до нея.

Неограничаващ пример на фармацевтичен носител за хидрофобните съединения от настоящето изобретение е система от разтворители включваща бензилов алкохол, неполярно повърхностноактивно вещество, смесим с вода органичен полимер и водна фаза като VPD съразтваряща система. VPD е разтвор на 3 % т/о бензилов алкохол, 8 % т/о от неполярното повърхностноактивно вещество полисорбат 80 и 65 % т/о полиетиленгликол 300, допълнена до обема в абсолютен етанол. VPD съразтварящата система (VPD:D5W) се състои от VPD разреден 1:1 с 5 % декстроза във воден разтвор. Тази съразтваряща система разтваря добре хидрофобните съединения и сама по себе си е малко токсична при системно приложение. Естествено, пропорциите на такава съразтваряща система могат значително да варират без да се нарушават нейните характеристики на разтворимост и токсичност. Нещо повече, съставките на съразтварящата система могат да варират: например могат да се използват други ниско-токсични неполярни повърхностноактивни вещества вместо полисорбат 80, фракционният размер на полиетиленгликола може да се променя, други биосъвместими полимери могат да заменят полиетиленгликола, например поливинил пиролидин и други захари или полизахариди могат да заместят декстрозата.

Алтернативно могат да се използват и други системи за отдаване на хидрофобните фармацевтични съединения. Липозоми и емулсии са добре известни примери като отдаващи носители или носители за хидрофобни лекарства. В допълнение, някои органични разтворители като диметилсулфоксиди могат също да се използват, въпреки че често това е за сметка на по-голяма токсичност.

В допълнение, съединенията могат да се отдават като се използва система за забавено освобождаване като полупропускливи матрици от твърди хидрофобни полимери, съдържащи лечебното средство. На специалистите от областта са известни различни материали за забавено освобождавание. Капсули със забавено освобождаване могат в зависимост от химическата си същност да освобождават съединенията за няколко седмици до повече от 100 дни. В зависимост от химическото естество и биологическата стабилност на лечебния реактив, могат да се използват допълнителни стратегии за протеиновото стабилизиране.

Фармацевтичните състави тук могат също да включват подходящи твърди или гелобразни носители или пълнители. Примери на такива носители или пълнители са, без да се ограничава до тях, калциев карбонат, калциев фосфат, различни захари, нишестета, целулозни производни, желатин и полимери като полиетилен гликоли.

w Много от модулиращите РК съединения от изобретението могат да се получат като физиологично приемливи соли, при които съединението за което се претендира образува отрицателно или положителрно натоварени частички. Примери на соли, при които съединението образува положително натоварени частички са, без да се ограничава до тях, кватернерни амониеви (дефинирани тук в описанието), соли като хидрохлоридна, сулфатна, карбонатна, лактатна, тартаратна, малеатна, сукцинатна, при които азотният атом на кватернерната амониева група е азот от подбраното съединение от изобретението, което реагира с подходящата киселина. Соли при които съединение от изобретението образува отрицателно натоварени частички включват, без да се ограничава до тях, натриева, калиева, калциева и магнезиева соли, образувани чрез взаимодействие на карбоксилна киселинна група в съединението с подходяща база (например натриев хидроксид (NaOH), калиев хидроксид (КОН), калциев хидроксид (Са(ОН)₂) и т.н.).

Фармацевтични състави, подходящи за използване в настоящето изобретение, включват състави, в които активните съставки се съдържат в количество достатъчно за да се постигне предвидената цел, например модулиране на РК активността или лечение или предпазване от свързано с РН нарушение.

По-специално, лечебноефективно количество означава количеството от съединение, което е ефективно за да предпази, да облекчи или да намали симптомите на заболяването или да удължи живота на лекувания пациент.

Определянето на лечебноефективното количество е в способностите на специалост от областта, особено в светлината на подробното описание дадено тук.

За всяко съедиение, използвано в методите от изобретението, лечебноефективното количество или доза може да се определи първоначално чрез клетъчни културални изпитания. След това дозата може да се формулира за използване в животински модели, така че да се постигне концентрация в кръвообращението в граници включващи определеното чрез клетъчната култура IC50 (т.е. концентрацията от изпитваното съединение, което постига половината от максималното инхибиране на РК активността). Такава информация може след това да се използва за по-точно определяне полезните дози за хора.

Токсичността и лечебната ефективност на съединенията описани тук могат да се определят чрез стандартни фармацевтични методи в клетъчни култури или в опитни животни, например чрез определяне на IC50 и LD50 (и двата показатели са описани в изложението) за конкретно съединение. Получените данни от тези изпитания върху клетъчни култури и от изследване на животни могат да се използват при формулирането на граница от дози за прилагане при хора. Дозите могат да варират в зависимост от използваната дозираща форма и използвания път на приложение. Точната формулировка, пътя на приложение и дозировката могат да се подберат от лекуващия лекар с оглед на състоянието на пациента. (Виж например Fingl, et al., 1975, « The Pharmacological Basis of Terapeutics », Ch. 1 p.l).

Количеството на дозата и интервалите могат да се нагласят индивидуално за да се осигурят плазмени нива на активните съединения, достатъчни за да поддържат киназните модулиращи ефекти. Тези плазмени нива се определят като минимални ефективни концентрации (MECs). МЕС ще варират за всяко съединение, но ще се установят от данните in vitro, например необходимата концентрация за постигане на 50 - 90 % инхибиране на киназата може да се подсигури като се използват описаните тук изпитания. Дозата, необходима за постигане на МЕС, ще зависи от характерностите на индивида и от пъта на приложение. Могат да се използват ВЕТХ и биоизпитания за да се определи плазмената концентрация. Дозиращите интервали могат също да се определят като се използват МЕС стойности. Съединенията трябва да се прилагат като се използва режим, който поддържа плазмените нива над МЕС за 10 - 90 % от времето, с предпочитание между 30 - 90 % и най-предпочитано между 50 90%.

Понастоящем, лечебноефективните количества на съединенията с формула I, 1а или II могат да са в границите от приблизително 25 мг/м² до 1500 мг/м дневно; с предпочитание около 3 мг/м /дневно. Дори попредпочитано 50 мг/qm qd до 400 мг/qd.

В случай на локално приложение или селективно поемане, ефективната локална концентрация от лекарството може да не е свързана с плазмената концентрация и други известни в областта методи могат да се w. използват за определяне на точното количество доза и интервала на приложение.

Количеството на приложения състав естествено ще зависи от лекувания пациент, сериозността на заболяването, начина на приложение, преценката на лекуващия специалист и т.н.

Съставът може при желание да бъде доставен като опаковка или устройство за разпръскване, като например FDA одобрено устройство, което може да съдържа една или повече единични дозиращи форми, включващи активната съставка. Такава опаковка може примерно да включва метално или пластмасово фолио, като блистерна опаковка. Опаковката и разпръскващото устройство могат да са придружени от инструкции за приложение. Опаковката или разпръскващото устройство могат също да са придружени от указание свързано към контейнера под форма на предписание от държавна агенция, регулираща производството, употребата или продажбата на фармацевтични препарати, които указания подлежат на одобрение от агенцията за формата на състава или за хуманно или ветеринарно приложение. Такова указание, например, може да бъде на етикета, одобрен от U.S. Food and Drug Administration за разрешените лекарства или за самия продукт. Състави, включващи съединение от изобретението формулирано със съвместим фармацевтичен носител, могат също да се получат, поставени в подходящ контейнер и етикиран за лечение на означено състояние. Подходящи състояния, означени на етикета, включват лечение на тумор, инхибиране на ангиогенеза, лечение на фиброза, диабет и подобни.

Настоящето изобретение може да се прилага със СМС суспензионен носител. Примерна СМС суспензия е дадена по-долу на таблица 3:

Таблица 3

Съставка	Концентрация % (т/о)
AFI	*
Натриева карбоксиметилцелулоза, USP (средно качество)	0.5
Натриев хлорид, USP/NF	0.9
Полисорбат 80, NF	0.4
Бензилов алкохол, NF	0.9
Вода, деионизирана	q.s. до 100 мл

* в зависимост от желаната концентрация.

Начинът на работа за получаване на 1.0 л СМС суспензионен носител е както следва: Изчислява се подходящото количество пълнители, необходими за получаването на носещата формулировка, като се използва таблицата показваща състава на носещата формулировка и размера на партидата. Претегля се празния контейнер като чист широкогърлена стъклена банка или полиетиленов буркан. Прибавят се около 600 мл вода в контейнера. Претегля се натриевата карбоксиметилцелулоза (5 г) и се прехвърля в контейнера. Бърка се като се използва магнитна бъркалка или лабораторна пропелерна бъркалка до хомогенизиране (около 2-3 часа). Претегля се натриевия хлорид и се прибавя в контейнера. Бъркането продължава до пълно разтваряне (около 10 мин). Прибавя се полисорбат-80. Смесва се до получаването на хомогенен разтвор (около 20 мин). Прибавя се бензилов алкохол. Бърка се докато се хомогенизира разтвора (около 10 мин). Останалата вода се прибавя за да се достигне теглото на разтвора до изисканото количество на партидата било тегловно или обемно (1010 г или 1000 мл, плътността при 22° С е 1.01). Съхранява се при 2 - 8° С (при охлаждане).

Суспензионната формулиовка може да се получи както следва: Стрива се API като се използва хаван и пестик за да се получи хомогенно изглеждащ прах с малък размер на частичките (да няма бучки или голями частички - идеалното е да се прекара през U. S. стандартно сито > 80 т.е. < 180 мкм размер на частичките). Изчисленото количество API се претегля в контейнера. Прибавя се около 90 % от общото изискващо се количество от (СМС суспензионен носител) в контейнера. Съединението се суспендира в носителя като се използва лабораторна пропелерна бъркалка или равностойна на нея. Диаметърът на лопатките на пропелера трябва да съответства на диаметъра на дъното на контейнера за да се осигури ефективно смесване. Бърка се при 50 об/мин 30 минути до пълното суспендиране на лекарството. Прибавя се формулировката на носителя и се долива с вода (с достатъчна чистота) до “qs” (достатъчно количество) до необходимото тегло отговарящо на размера на партидата. Бърка се при 50 об/мин допълнителни 30 минути. Суспензията се разпределя в кехлибарено оцветени стъклени или полипропиленови контейнери. Контейнерите трябва да са защитени от светлина. Бърка се при 2 - 8° С (при охлаждане, без да се замразява).

Аспект също така на изобретението е описано тук съединение или негова сол или пролекарство в комбинация с други химотерапевтични средства за лечение на заболяванията и нарушенията описани по-горе. Например, съединение, сол или пролекарство от изобретението може да се комбинира с алкилиращо средство като флуороурацил (5-FU) самостоятелно _w или с допълнително комбиниране с левковорин или други алкилиращи средства като, без да се ограничава до тях, други пиримидинови аналози като UFT, капецитабин, гемцитабин и цитарабин; с алкилсулфонати, например бисулфанизползван при лечение на хронична гранулоцитозна левкемия), импросулфан и пипосулфан; с азиридини, например бензодепа, карбохин, метуредепа и уредепа; с етиленимини и метилмелаамини, например алтретамин, триетиленмеламин, триетиленфосфорамид, триетилентиофосфорамид и триметиленолмеламин; и с азотни изотиоцианати, например хлорамбуцил (използван при лечението на хронична лимфоцитна левкемия, първична микроглобулинемия и неHodgkin-сова лимфома), циклофосфамид (използван при лечението на болестта на Hodgkin, мултиплена миелома, невробластома, рак на гърдата, рак на яйчниците, рак на белия дроб, тумор на Wilm и рабдомиосаркома), естрамустин, ифосфамид, новембрицин, преднимустин и урацил изотиоцианат (използван при лечението на първични тромбоцитози, неHodgkin-сова лимфома, болестта на Hodgkin и рак на яйчниците) и триазини например дакарбазив (използван при лечението на рак на меките тъкани).

Съединение, сол или пролекарство на настоящето изобретение може също да се използва в комбинация с други антиметаболитни хемотерапевтични средства като, без да се ограничава до тях, аналози на фолиева киселина, например метотраксат (използван при лечението на акутна лимфоцитна левкемия, хориосаркома, микозен фунгиозен рак на гърдата, рак на главата и врата и остеогенна саркома) и птероптерин и пуринови аналози като меркаптопурин и тиогуанин, който намира приложение при лечението на акутна гранулоцитна, акутна лимфоцитна и хронична гранулоцитна левкемии.

Разглежда се и използването на съединение, сол или пролекарство от изобретението в комбинация с химотерапевтични средства на базата на природни продукти като например, без да се ограничава до тях, винка алкалоидои, например винбластин (използван при лечението на рак на гърдата и на тестикулите) винкристин и виндезин; епиподофилотоксини, например етопозид итенипозид, и двата са приложими при лечението на рак на тестикулите и Kaposi’s саркома; антибиотични хемотерапевтични средства, например даунорубицин, доксорубицин, епирубицин, митомицин, използван при лечението на рак на стомаха, на цервикса, на дебелото черво, на гърдата, на пикочния мехур и на панкреаса), дактиномицин, темозоломид, пликамицин, блеомицин (използван при лечението на рак на кожата, езофагуса и половопикочния път); и ензимните хемотерапевтични средства като L-аспарагиназа.

В допълнение към горното, съединение, сол или пролекарство от настоящето изобретение може също да се използва в комбинация с платинни координационни комплекси (цисплатин и т.н.); заместени уреи като хидроксиуреа; метилхидразинови производни, например прокарбазин, адренокортикални потискащи средства, например митотан, аминоглутетимид и хормони и хормонални антагонисти като адренокартикостероиди (например преднизон), прогестин (например хидроксипрогестерон капроат); естрогени (например диетилстилбестерол); антиестрогени като тамоксифен; андрогени, например тестостерон пропионат; и ароматазни инхибитори като анастрозол.

Накрая, има се предвид съединение на изобретението да дава ефективна комбинацията с митоксантрон, паклитаксел, циклооксигеназа-2 инхибитори, известни в областта, по-специално целебрекс ®, паракоксиб®, оиокс®, абботтс кокс-189, описани в РСТ публикация с No WO 99/11605, топоизомеразни инхибитори като камптозар®, хеп-2®, рецепторни антагонисти като херцептин®, ендостатин, гливак®, IMClone VEGFF рецепторен антагонист IMC С225®, за лечение на твърди туморни ракове или левкемии като, без да са ограничаващи, акутна миелогенн (нелимфоцитна) левкемия.

Общи синтетични методи

Могат да се използват следните методики за получаването на съединенията от изобретението:

Подходящо заместен 2-оксиндол (1 екв.), подходящо заместен 3карбокси-5-формилпирол (1.2 екв.) и база (0.1 екв.) се смесват в разтворител (1-2 мл/ммола 2-оксиндол) и сместа се нагрява след това за около 2 до около 12 часа. След охлаждане, образуваната утайка се отфилтрува, промива се със студен етанол или етер и се суши под вакуум за да даде съответната 5-(2оксо-1,2-дихидроиндол-(37)-илиденметил)-1 -Н-пирол-З-карбоксилна киселина. Ако не се образува утайка, реакционната смес се концентрира и остатъкът се стрива с дихлорометан/етер, полученото твърдо вещество се отделя чрез филтруване и след това се суши. Продуктът може евентуално допълнително да се пречисти чрез хроматографиране.

Базата може да е органична или неорганична. Ако се използва органична база, то с предпочитание тя е азотна база. Примери на органични азотни бази включват, без да се ограничава до тях, диизопропиламин, триметиламин, триетиламин, анилин, пиридин, 1,8диазабицикло[5.4.1]ундец-7-ен, пиролидин и пиперидин.

Примери на неорганични бази са, без да се ограничава до тях, хидроксиди на алкални метали или на алкалоземни метали, фосфати, карбонати, бикарбонати, бисулфати и амиди. Алкалните метали включват литий, натрий и калий, докато алколоземните метали включват калции, магнезий и барий.

Съгласно предпочитано изпълнение на изобретението, когато разтворителят е протонен разтворител като вода или алкохол, базата е алкалнометална или алкалоземна метална неорганична база, с предпочитание хидроксид на алкален или алкалоземен метал.

Ясно е за специалист от областта, въз основа на общите принципи на органичен синтез и на описаното тук, коя база ще е най-подходяща за дадена реакция.

Разтворителят, в който се провежда реакцията, може да бъде протенен или апротонен разтворител, с предпочитание е протонен разтворител. “Протонен разтворител” е разтворител, който има водороден атом(и) ковалентно свързани към кислород или азотни атоми, което предава на водородните атоми значителна киселинност и с това способност за “споделяне” с разтвореното вещество водородно свързване. Примери на протонни разтворители са, без ограничение до тях, вода и алкохоли.

“Апротонен разтворител” може да бъде полярен или неполярен, но и в двата случая не съдържа киселинни водороди и поради това не е способен на водородно свързване с разтворените вещества. Пример, без да са ограничителни, на неполярни разтворители са пентан, хексан, бензен, толуен, метиленхлорид и въглероден тетрахлорид. Примери на полярни апротонни разтворител са хлороформ, тетрахидрофуран, диметилсулфоксид и диметилформамид.

Съгласно предпочитано изпълнение на изобретението, разтворителят е протонен разтворител, с предпочитание вода или алкохол като етанол.

Реакцията се провежда при температури по-високи от стайна. Обикновено температурата е между около 30° С и около 150° С, с предпочитание около 80° С до около 100° С, най-предпочитано около 60° С до около 85° С, което е около температурата на кипене на етанола. “Около” означава, че температурната граница е с предпочитание в 10 градуса по Целзий на показаната, по-предпочитано в 5 градуса по Целзий на показаната и най-добре в 2 градуса по Целзий на показаната температура. Така например, при “около 75° С” се има предвид 75° С ± 10° С, с предпочитание 75° С ± 5° С и най-предпочитано 75° С ± 2° С.

2-оксиндоли и З-карбокси-5-формилпироли могат лесно да се синтезират като се използват добре познати методи в химията и леснодостъпни изходни вещества.

Свързването на 5-(2-оксо-1,2-дихидроиндол-(Зг)-илиденметил)-1-Нч.. пирол-3-карбоксилна киселина с амин с формула ZCH(R⁵)-CR⁴(OH)CHR³NH2 става в органичен разтворител като диметилформамид, тетрахидрофуран и подобни и в присъствието на подходящо свързващо средство като дициклохексилкарбодиимид, DEAD, EDC и HOBt след това се получава съединението с формула (I). Амини с формула ZCH(R⁵)-CR⁴(OH)CHR³NH2 са търговски достъпни или темогат да се получат по добре известни методи в областта. Някои такива методи са описани по-долу.

От специалистите в областта трябва да се подразбира, че са достъпни и други синтетични начини за получаване на съединенията от изобретението и тези по-долу са дадени само като примерни, не и като ограничаващи.

Примери за изпълнение на изобретението

Следващите методи за получаване на междинни съединения и примери за крайни съединения са дадени за по-пълно и ясно разбиране от специалистите на практиката на настоящето изобретение. Те не трябва да се приемат като ограничаващи, а само за илюстрация и като представителни.

Синтетични примери

Пример 1

Синтез на 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол- (37)-илиден78 метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

Етап 1

Диметилформамид (25 мл, 3 екв.) се охлажда при бъркане в ледена баня. Към него се прибавя РОС1₃ (1.1 екв., 10.8 мл). След 30 минути се прибавя разтвор на 3,5-диметил-4-етилов естер на пирол (17.7 г, 105.8 ммола) в диметилформамид и бъркането продължава. След 2 часа реакционната смес се разрежда с вода (250 мл) и се алкализира до pH = 11 с 1N воден разтвор на NaOH. Бялата утайка се отстранява чрез филтруване, промива се с вода и след това с хексани и се суши за да даде етилов естер на 5-формил-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (19.75 г, 95 %) като светлокафяво твърдо вещество.

Ή ЯМР (360 MKz, DMSO-d6) δ 12.11 (br s, 1H, NH), 9.59 (s, 1H, CHO), 4.17 (q, J=6.7 Hz, 2H, OCH₂CH₃).

Етап 2

Етилов естер на 5-формил-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (2 г, 10 ммола) се прибавя към разтвор на калиев хидроксид (3 г, 53 ммола) разтворен в метанол (3 мл) и вода (10 мл). Сместа се кипи 3 часа, охлажда се до стайна температура и се подкислява с 6 N хлороводородна киселина до pH 3. Утайката се отделя чрез филтруване, промива се с вода и се суши под вакуум една нощ за да даде 5-формил-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксилна киселина (1.6 г, 93 %).

*Н ЯМР (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.09 (s, br, 2H, NH& СООН), 9.59 (s, 1H, CHO),2.44 (s, 3H, CH₃), 2.40 (s, 2H, CH₃).

Етап 3

5-Фруороизатин (8.2 г, 49.7 ммола) се разтварят в 50 мл хидразинхидрат и се кипят 1 час. Реакционната смес след това се излива в ледена вода. Утайката се отфилтрува, промива се с вода и се суши на вакуумна сушилня за да даде 5-флуоро-2-оксиндол (7.5 г).

Етап 4

Реакционната смес на 5-флуорооксиндол (100 мг, 0.66 ммола), 5формил-2,4-диметил-1Н-пирол-3- карбоксилна киселина (133 мг, 0.79 ммола) и 10 капки пиперидин в етанол (3 мл) се бърка при 60° С една нощ и се филтрува. Твърдата фаза се промива с 1 М воден разтвор на хлороводородна киселина, с вода и се суши за да даде 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-

3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (201 мг, количествен добив) като жълто твърдо вещество.

MS m/z (относителен интензитет, %) 299 ([М-1]⁺, 100)

Пример 2

Синтез на (3-диетиламино-2-хидрокси-пропил)-амид на 5-(5-флуоро2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксилна киселина

Етап 1

Към 2-хлорометилоксиран (95 г, 1.03 мола) се прибавя смес от вода (3.08 г, 0.17 мола) и диетиламин (1-6.2 мл, 1.03 мола) при 30° С. Реакционната смес след това се бърка при 28 - 35° С 6 часа и се охлажда до 20 - 25° С за да даде 1-хлоро-3-диетиламино-пропан-2-ол.

Етап 2

Разтвор на натриев хидроксид (47.9 г, 1.2 мола) в 78 мл вода се прибавя 1-хлоро-3-диетиламино-пропан-2-ол. Получената смес се бърка при 20 - 25° С 1 час, разрежда се с 178 мл вода и се екстрахира два пъти с етер. Събраните етерни разтвори се сушат с твърд калиев хидроксид и се изпаряват за да дадат 135 г суров продукт, който се пречиства чрез фракционна дестилация за да даде чист глицидилдиетиламин (98 г, 76 %) като масло.

Етап 3

Към леденоохладен разтвор на амониев хидроксид (25 мл, 159 ммола) 25 % (т/т) се прибавя глицидилдиетиламин на капки (3.2 г, 24.8 ммола) в продължение на 10 минути. Реакционната смес се бърка при 0 - 5° С 1 час и след това при стайна температура 14 часа. Получената реакционна смес се изпарява и се дестилира (84 -90° С при 500 - 600 мТ) за да даде 1-амино-Здиетиламино-пропан-2-ол (3.5 г, 92 %).

MS m/z 147 ([М+1 ]⁺)

Етап 4

Към разтвор на 5-формил-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (100 мг, 0.43 ммола), EDC (122.7 мг, 0.64 ммола) и HOBt (86.5 мг, 0.64 ммола) в 1.0 мл диметилформамид се прибавя 1-амино-З-диетиламинопропан-2-ол (93.2 мг, 0.64 ммола). Получената реакционна смес се бърка при стайна температура една нощ и се изпарява. Остатъкът се суспендира в 10 мл вода и се филтрува. Твърдото вещество се промива с наситен разтвор на натриев бикарбонат и с вода и се суши под висок вакуум една нощ за да даде суровия продукт, който се пречиства чрез колонна хроматография като се елуира с 6 % метанол-дихлорометан, съдържащ триетиламин (2 капки/100 мл от 6 % метанол-дихлорометан) за да се получи (З-диетиламино-2хидрокси-пропил)-амид на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (62 мг, 34 %) като жълто твърдо вещество.

*Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.70 (s, 1H, NH-l’)q 10.90 (s, 1H, NH-1), 7.76 (dd, J=2.38, 9.33 Hz, 1H, H-4), 7.72 (s, 1H, винил-Н), 7.60 (m, br., 1H, CONHCH₂CH(OH)-CH₂N(C₂H₅)₂-4’), 6.93 (dt, J=2.38, 8.99 Hz, 1H, H-5),

6.85 (dd, J=4.55, 8.99 Hz, 1H, H-6), 3,83 (m, br, 1H, OH), 3.33 (m, 4H), 2.67 (m, br, 5H), 2.46 (s, 3H, CH₃), 2.44 (s, 3H, CH₃), 1.04 (m, br, 6H, CH₃x2).

MS m/z (относителен интензитет, %) 427 ([M-l]⁺, 100)

Пример 3

Синтез на (2-хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-амид на 5-[5флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4-диметил1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

Етап 1

Смес от морфолин (2.6 мл, 30 ммола) и епихлорохидрин (2.35 мл, 30 ммола) в етанол (50 мл) се бърка при 70° С една нощ. След отстраняване на разтворителя, остатъкът се разрежда с метиленхлорид (50 мл). Получената утайка се отделя чрез филтруване под вакуум за да даде 1-хлоро-Зморфолин-4-ил-пропан-2-ол (2.0 г, 37 %).

Ή ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.49 (t, J=4.8 Hz, 2H), 3.60 (t, J=4.6 Hz, 2H), 3.75 (m, 4H, 2xCH₂), 4.20 (dd, J=5.2, 12 Hz, 2H), 4.54 (m, 2H), 4.62 (m, 1H, CH), 6.64 (d, J=6.4 Hz, 1H, OH).

MS m/z 180.2 [М+1].

+- Етап 2

1-хлоро-3-морфолин-4-ил-пропан-2-ол (2.0 г, 11 ммола) се третират с разтвор на NH₃ в метанол (25 % тегловно, 20 мл) при стайна температура. Барботира се азот в реакционната смес за да се отстрани амоняка. След изпаряване на разтворителя се получава хлороводородната сол на 1-амино-Зморфолин-4-ил-пропан-2-ол (2.0 г, 91 %).

*Н ЯМР (DMSO-d6) δ 2.30 (d, J=6.0 Hz, 2H), 2.36 (m, 4H, NCH₂) 2.65 (dd, J=8.4, 12.8 Hz, 1H), 2.91 (dd, J=3.5, 12.8 Hz, 1H), 3.52 (m, 4H, CH₂), 3.87 (m, 1H, CH), 5.32 (s, 1H, OH), 8.02 (brs., 3H, NH₃ ⁺). MS m/z 161.1 [М+1].

Етап 3 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4-диметил1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (120 мг, 0.4 ммола) се кондензират с 1амино-3-морфолин-4-ил-пропан-2-ол (74 мг, 0.48 ммола) за да се утаи (2хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-амид на 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (65 мг, 36 %). Матерната луга се изпарява до сухо и остатъкът се пречиства чрез мигновенна хроматография за да даде допълнително съединението обозначено 2N (70 мг, 39 %).

¹Н ЯМР (DMSO-d6) δ 2.28 (m, 1Н), 2.32 (m, 1H), 2.40 (m, 4H), 2.40,

2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3.15 (s, 1H), 3.31 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.78 (m, 1H),

4.73 (brs, Ш, OH), 6.82 (dd, >4.5, 8.4 Hz, 1H), 6.90 (td, ²>2.8,³J=10.0Hz, 1H), 7.53 (m, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.74 (dd, J=2.0, 9.6 Hz, 1H),(ароматен и винилов), 10.87 (s, 1H, CONH), 13.66 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 441.4 (M-l).

Синтез на 2-хидрокси-7-окса-4-азаниаспиро[3.5]нонан хлорид

1)етанол

2) ацетон

Къв 3 литрова облодънна колба, снабдена с термодвойка, вход за азот и 250 мл-ова делителна фуния се зарежда морфолин (91.5 г, 91.5 мл, 1.05 мола, 1.0 екв.) и 100 мл етанол. Разтворът се бърка бързо докато се прибавя епихлорохидрин (100 г, 84.5 мл, 1.08 мола, 1.03 екв.) от делителната фуния в продължение на около 30 минути. Температурата се проследява и когато температурата на банята достигне 27° С, реакционната смес се охлажда в баня от лед и вода. Бистрият разтвор се бърка 18 часа. Реакцията се проверява чрез газова хроматография (разреждат се 5 капки от реакционната смес в 1 мл етанол и се инжектира в 15 m DB-5 капилярна газово хроматографска колона със следните параметри на протичане: инжектор 250° С, детектор 250° С начална температура на пещта 28°С, затопляне до 250° С при 10° за минута). Реакцията приключва при по-малко от 3 % остатъчен морфолин. Реакционната смес се концентрира върху ротационен изпарител при 50° С при пълен вакуум докато не се получава повече кондензат. Полученото масло се съхранява при стайна температура 24 - 48 часа или докато се наблюдава значителна маса кристали (при поставяне на зародиши се ускорява процеса). Кашата се разрежда с 250 мл ацетон и се филтрува. Твърдата маса се суши във вакуумна сушилня при 60° С 18-24 часа. Такасе получават 84 г кристален продукт. За да се повиши добива матерната луга може да се концентрира и да се повтори процеса на кристализация.

^!Н ЯМР (DMSO-d6) δ 6.55 (d, 1 Η), 4.64 (m, 1H), 4.53 (m, 2H), 4.18 (m,

2H), 3.74 (m, 4H), 3.60 (m, 2H), 3.48 (m, 2H).

¹³С ЯМР (100 MHz, DMSO-d6) δ 70.9, 61.39, 61.04, 60.25, 58.54, 57.80. Синтез на 1-амино-3-(4-морфолинил)-2-пропанол (рацемат)

Към 3 литрова облодънна колба с едно гърло, снабдена с магнитна бъркалка се прибавя 2-хидрокси-7-окса-4-азониаспиро[3.5]нонан хлорид (150 г, 835 ммола) последвано от 23 тегловни % безводен амоняк в метанол (2120 мл). Колбата се запушва и полученият бистър разтвор се бърка при 20 -23° С 18 часа. Газова хроматография при горните условия не показва остатъчни количества от изходните вещества. Запушалката се отстранява и амоняка се оставя да барботира навън от разтвора в продължение на 30 минути. След това колбата се пренася на ротационен изпарител и се концентрира до бяло твърдо вещество при 45° на банята и вакуум.

*Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.57 (dd, 2H), 3.3 - 3.5 (m, 6H), 2.59 (m, 2H), 2.2-2.4 (m, 6H);

¹³C ЯМР (100 MHz, DMSO-d6) δ 70.8, 67.1, 60.1, 53.8,48.1.

Като се следва метода на работа описан в пример 3 по-горе и се замести 2-(К8)-1-амино-3-морфолин-4-ил-пропан-2-ол с 2-(8)-1-амино-3морфолин-4-ил-пропан-2-ол, получен съгласно описанието по-долу, се получава желаното съединение (2-(8)-хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)амид на 5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиден-метил]-2,4диметил- 1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

Синтез на 1-амино-3-(4-морфолинил)-2-пропанол (не-рацемат)

Към 3 гърлена облодънна колба от 1 л, снабдена с механична бъркалка, термодвойка и допълнителна фуния се прибавя морфолин (91.5 г,

91.5 мл, 1.05 мола, 1.0 екв.) и 45 мл трет.-бутанол. Разтворът се бърка бързо при прибавяне на R- епихлорохидрин (100 г, 84.5 мл, 1.08 мола, 1.03 екв.) от допълнителната фуния в продължение на около 30 минути. Температурата се проследява и когато температурата на банята достигне 27° С, реакционната смес се охлажда в баня от лед и вода. Бистрият разтвор се бърка 18 часа.

Реакцията се проверява чрез газова хроматография (разреждат се 5 капки от реакционната смес в 1 мл етанол и се инжектира в 15 m DB-5 капилярна газово-хроматографска колона със следните параметри на протичане: инжектор 250° С, детектор 250° С начална температура на пещта 28°С, затопляне до 250° С при 10° за минута). Реакцията приключва при по-малко от 3 % остатъчен морфолин. Реакционната смес се охлажда до 10° С и се накапва 20 % тегл. разтвор на калиев трет.-бутоксид в тетрахидрофуран (576 г) като при това температерата се поддържа под 15°С. Получената бяла каша се бърка при 10 - 15° С 2 часа и се проверява чрез газова хроматография при използване на горните условия. Не се наблюдава хлорохидрин. Сместа се концентрира чрез ротационно изпаряване при 50° С на банята и вакуум. Получената смес се разрежда с вода (500 мл) и с метиленхлорид. Фазите се разделят и водната фаза се промива с метиленхлорид (500 мл). Събраните органични екстракти се сушат над натриев сулфат и се концентрират до бистро, безцветно масло.

Ή ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.3 (dd, 4H), 3.1 (m, 1H), 2.6 (dd, 1H),

2.5 (dd, 1H), 2.4 (m, 4H), 2.4 (m, 4H), 2.2 (dd, 2H);

¹³C ЯМР (100 MHz, DMSO-d6) δ 65.4, 60.1, 53.1,48.9,43,4.

Горният суров епоксид се зарежда в 3 л 1-гърлена колба с обло дъно, снабеда с магнитна бъркалка. Прибавя се безводен амоняк в метанол (24 % о/о 2.5 л), колбата се запушва и сместа се бърка при стайна температура 24 часа. Газова хроматография при горните условия показва липса на остатъчни изходни вещества. Запушалката се отстранява и амоняка се оставя да се изпари от разтвора за 30 минути. Колбата след това се прехвърля в ротационен изпарител и се концентрира до бистро безцветно масло при 45° на банята и вакуум. Получават се 124 г продукт.

Ή ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.57 (dd, 2H), 3.3 - 3.5 (m, 6H), 2.59 (m, 2H), 2.2 - 2.4 (m, 6H);

¹³C ЯМР (100 MHz, DMSO-d6) δ 70.8,67.1, 60.1, 53.8,48.1.

Синтез на 1-амино-3-(4-морфолинил)-2-(8)-пропанол

Към 1 литрова тригърлена колба, снабдена с механична бъркалка, термодвойка и допълнителна фуния, се поставят морфолин (91.5 г, 91.5 мл, 1.05 мола, 1.0 екв.) и 200 мл метанол. Разтворът се бърка бързо докато се прибавя R-епихлорохидрин (100 г, 84.5 мл, 1.08 мола, 1.03 екв.) от допълнителната фуния в продължение на 30 минути. Температурата се проследява и когато температурата на банята стигне 27° С, реакционната смес се охлажда в баня от лед и вода. Бистрият разтвор се бърка 18 часа. Реакцията се проверява чрез газова хроматография (разреждат се 5 капки от реакционната смес в 1 мл етанол и се инжектира в 15 m ПВ-5капилярна газово-хроматографска колона със следните параметри на протичане: инжектор 250° С, детектор 250° С, начална температура на пещта 28°С, затопляне до 250° С при 10° за минута). Реакцията приключва при по-малко от 3 % остатъчен морфолин. Реакционната смес се охлажда до 10° С и се накапва 25 % тегл. разтвор на натриев метоксид в метанол (233 г, 1.08 мола,

247 мл) като при това температерата се поддържа под 15°С. Получената бяла каша се бърка при 10 - 15° С 2 часа и се проверява чрез газова хроматография при използване на горните условия. Не се наблюдава хлорохидрин. Сместа се концентрира чрез ротационно изпаряване при 50° С на банята и пълен вакуум. Получената смес се разрежда с вода (500 мл) и с метиленхлорид. Фазите се разделят и водната фаза се промива с метиленхлорид (500 мл). Събраните органични екстракти се сушат над натриев сулфат и се концентрират до бистро, безцветно масло. Получава се 145 г, 97 % добив от 1,2-епокси-3-морфолин-4-илпропан.

‘Н ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.3 (dd, 4H), 3.1 (m, 1H), 2.6 (dd, 1H),

2.5 (dd, 1H), 2.4 (m, 4H), 2.2 (dd, 2H);

¹³C ЯМР (100 MHz, DMSO-d6) δ 65.4,60.1, 53.1,48.9,43,4.

Горният суров 1,2-епокси-3-морфолин-4-илпропан се зарежда в 3 литрова 1-гърлена облодънна колба, снабдена с магнитна бъркалка. Прибавя се безводен амоняк в метанол (24 % т/т 2.5 л), колбата се запушва и сместа се бърка при стайна температура 24 часа. Газова хроматография при горните условия показва липса на остатъчни изходни вещества. Запушалката се отстранява и амоняка се оставя да се изпари от разтвора за 30 минути. Колбата след това се прехвърля в ротационен изпарител и се концентрира до бистро безцветно масло при 45° на банята и вакуум. Получават се 124 г 1амино-3-(4-морфолинил)-2-(5)-пропанол.

Ή ЯМР (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.57 (dd, 2H), 3.3 - 3.5 (m, 6H), 2.59 (m,2H), 2.2-2.4 (m, 6H);

¹³C ЯМР (100 MHz, DMSO-d6) δ 70.8, 67.1, 60.1, 53.8, 48.1.

Имидазол амид (7.0 г, 32.3 ммола), амин (15.0 г, 64.6 ммол), 5флуорокисиндол (4.93 г, 32.6 ммола), триетиламин (9.79 г, 96.9 ммола) и тетрахидрофуран (88 мл) се смесват и нагряват при 60° С. Получава се кафяв разтвор. След като се бърка 24 часа при 60° С жълтата каша се охлажда до стайна температура и се филтрува. Утайката се промива с 80 мл тетрахидрофуран и се суши една нощ при 50° С под вакуум. Получава се w кафяво твърдо вещество (23.2 г). Утайката се суспендира в 350 мл вода за 5 часа при стайна температура и се филтрува. Утайката се промива с 100 мл вода и се суши при 50° С под вакуум една нощ. Получават се 8.31 г 56 % добив.

В колба снабдена с термометър, хладник, магнитна бъркалка и вход за азот се поставят 4.92 г 5-флуороксиндол, 7.0 г имидазол амид, 15.5 г ( R)-

1-амино-3-(4-морфолинил)-2-пропанол, 9.78 г триетиламин и 88 мл тетрахидрофуран. Сместа се нагрява до 60° С 16.5 часа. Реакционната смес се охлажда до стайна температура и се филтрува. Получената утайка се суспендира (3) три последователни пъти в ацетонитрил при 11 мл/г, суши се под вакуум 3.6 часа (25.25 % добив). [ВЕТХ, Hypersil BDS, С-18, 5 мкм, (6:4), ацетонитрил: 0.1 М амониев хлорид, РНА-571437 = 4.05 мин].

*Н ЯМР (DMSO-d6) δ 10.86 (1Н, bs); 7.75 (1H, d), 7.70 (IK, s); 7.50 (1H, m), 6.88 (2H, m), 4.72 (1H, bs); 3.78 (1H, bs), 3.56 (4H, m), 3.32 (6H, m),

3.15 (lH,m), 2.43 (8H, bm).

Пример 4

Синтез на (2-хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-амид на 2,4диметил-5-[2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиденметил]- 1Н-пирол-

3-карбоксилна киселина

5-(2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4-диметил- 1Н-пирол-

3-карбоксилна киселина (113 мг, 0.4 ммола) се кондензират с 1-амино-Зморфолин-4-ил-пропан-2-ол (74 мг, 0.48 ммола) за да се утаи (2-хидрокси-Зморфолин-4-ил-пропил)-амид на 2,4-диметил-5-[2-оксо-1,2-дихидро-индол(Зг)-илиденметил]-1Н-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (77 мг, 45.3 %).

Ή ЯМР (DMSO-d6) δ 2.27 (m, 1Н), 2.32 (m, 1H), 2.40 (m, 4H), 2.40 ,

2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3.15 (s, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H),

4.74 (d, J=7.2 Hz, 1H), 6.86 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.96 (t, J=7.2 Hz, 1H), 7.10 (t, >7.6 Hz, 1H), 7.49 (t, >5.6 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.77 (d, J=8.0 Hz, 1H) (ароматен и винилов) 10.88 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, ΝΉ). LC-MS (m/z) 425.4 (M+l).

Пример 5

Синтез на (2-хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-амид на 2,4диметил-5-[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиден-метил]-

2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4-диметил1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (126.6 мг, 0.4 ммола) се кондензират с 1амино-3-морфолин-4-ил-пропан-2-ол (74 мг, 0.48 ммола) за да се утаи (2хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-амид на 2,4-диметил-5-[5-хлоро-2-оксо1,2-дихидро-индол-(32)-илиден-метил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина (107 мг, 58 %).

*Н ЯМР (DMSO-d6) δ 2.29 (m, 1Н), 2.33 (m, 1H), 2.39 (m, 4H), 2.40 ,

2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3.15 (s, 1H), 3.37 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H),

4.74 (d, >4.8 Hz, 1H), 6.85 (d, >8.4 Hz, 1H), 7.11 (dd, >2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.53 (t, >5.6 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.97 (d, >2.0 Hz, 1H), (ароматен и винилов), 10.99 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 457.4 (M+l).

R и S изомерите могат да са получат както следва:

5-хлорооксиндол

Et₃N, THF

Имидазол амид (7.0 г, 32.3 ммола), амин (15.5 г, 96.9 ммол), 5 хлорооксиндол (5.48 г, 32.6 ммола), триетиламин (14 мл) и тетрахидрофуран (88 мл) се смесват и нагряват при 60° С. Получава се червен разтвор. След като се бърка 16 часа при 60° С жълтата каша се охлажда до стайна температура и се филтрува. Утайката се промива с 2x50 мл тетрахидрофуран и се суши една нощ при 50° С под вакуум. Получават се 4.36 г = на 29 % добив.

5-хлорооксиндол

Et₃N, THF

Имидазол амид (6.8 г, 31.3 ммола), амин (10.0 г, 62.5 ммол), 5хлороокисиндол (5.3 г, 31.6 ммола) и тетрахидрофуран (100 мл) се смесват и нагряват при 60° С. Получава се червен разтвор. След като се бърка 68 часа при 60° С се прибавя триетиламин (14 мл) и се бърка 5 часа при 60° С. Реакцията не е протекла напълно. Прибавят се 4.6 г амин странична верига и се бърка 20 часа при 60° С. Жълтата каша се охлажда до стайна температура и се филтрува. Утайката се промива с 2 х 50 мл тетрахидрофуран и се суши една нощ при 50° С под вакуум. Получават се 5.48 г, което е 38 % добив.

Пример 6

Синтез на (2-хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-амид на 5-[5-бромо-

2- оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксилна киселина

5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4-диметил1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (72.2 мг, 0.2 ммола) се кондензират с 1амино-3-морфолин-4-ил-пропан-2-ол (38 мг, 0.24 ммола) за да се утаи (2хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-амид на 5-[5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроиндол-(Зг)-илиден-метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (55 мг, 55 %).

Ή ЯМР (DMSO-d6) δ 2.27 (m, 1Н), 2.32 (m, 1H), 2.39 (m, 4H), 2.41 ,

2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 3.13 (s, 1H), 3.35 (m, 1H), 3.55 (m, 4H), 3.77 (m, 1H),

4.74 (d, J=4.4 Hz, 1H), 6.80 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J=2.0, 8.0 Hz, 1H), 7.51 (t, =5.6 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 8.09 (d, J=2.0 Hz, 1H), (ароматен и винилов), 10.99 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 503.4 (M-l).

Пример 7

Синтез на (2-хидрокси-3-[1,2,3]-триазол-1-ил-пропил)-амид на 2,4диметил-5-[2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]- 1Н-пирол-

3- карбоксилна киселина

Етап 1

Смес от 3-[1,2,3]-триазол (2.0 г, 29 ммола), епихлорохидрин (3.4 мл,

43.5 ммола) и Ν,Ν-диизопропил-етиламин (2.6 мл, 15 ммола) в етанол (50 мл) се бърка при стайна температура една нощ. След като се отстранят разтворителите, остатъкът се пречиства чрез мигновенна хроматография (метиленхлорид /метанол = 100/2-100/4) за да се получи 1-хлоро-3-[1,2,3]~ триазол-2-илпропан-2-ол (2.1 г, 45 %).

Ή ЯМР (CDC1₃) δ 3.56 (s, 1H), 3.57 (s, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.53 (dd, J=7.2, 14 Hz, 1H), 4.67 (dd, J=3.8, 14 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.71 (s, 1H). MS (m/z) 162.1 (M+l).

Етап 2

1-хлоро-3-[1,2,3]-триазол-2-илпропан-2-ол (2.3 г, 13 ммола) се третира с разтвор на амоняк в метанол (24 тегловни %, 20 мл) при 60° С за една нощ в запечатен съд под налягане. След охлаждане до стайна температура, се барботира азот в реакционната смес за да се отстрани амоняка. След изпаряване на разтворителя се получава хлороводородната ·*- сол на 1-амино-3-[1,2,3]-триазол-2-илпропан-2-ол (2.57 г, 100 %).

Ή ЯМР (DMSO-d6) δ 2.68 (dd, J=8.8,12.8 Hz, 1H), 2.97 (dd, J=3.6,12.8 Hz, 1H), 4.15 (m,lH), 4.44 (dd, J=6.4, 14Hz, 1H), 4.57 (dd, J=4.6, 14 Hz, 1H),

5.95 (d, J=5.2Hz, 1H, OH), 7.77 (s, 1H), 8.01 (brs., 3H, NH₃ ⁺). 8.12 (s, 1H). :S (m/z) 143.1 (M+l).

Етап 3

5-[2-оксо-1,2-дихидро-индол-(32)-илиден-метил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксилна киселина (113 мг, 0.4 ммола) се кондензира с 1-амино-

3-(1,2,3)-триазол-2-илпропан-2-ол (85 мг, 0.4 ммола) за да се утаи (2хидрокси-3-[1,2,3]-триазол-1-ил-пропил)-амид на 2,4-диметил-5-[2-оксо-1,2дихидро-индол-(3г)-илиден-метил]-1 Н-пирол-3-карбоксилна киселина (70 мг, 41 %).

*Н ЯМР (DMSO-d6) δ 2.45, 2.48 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 3.35 (m, 2Н), 4.02 (m, 1Н), 4.32 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.53 (dd, J=3.4, 14 Hz, 1H), 5.43 (d, J=5.6 Hz, 1H, OH), 6.91 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.01 (t, J=7.6 Hz, 1H), 7.15 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.12 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.77 (d, J=7.6 Hz, 1H), 8.11 (s, 1H), 10.93 (s, 1H, CONH), 13.68 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 405.4 (M-l).

Пример 8

Синтез на (2-хидрокси-3-[1,2,3]-триазол-1-ил-пропил)-амид на 5-[5флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4-диметил93

Чйй*·1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

5-[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(Зг)-илиден-метил]-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (120 мг, 0.4 ммола) се кондензират с 1-амино-3-(1,2,3)-триазол-2-ил-пропан-2-ол (85 мг, 0.48 ммола) за да се утаи (2-хидрокси-3-[1,2,3]-триазол-1-ил-пропил)-амид на 5[5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксилна киселина (100 мг, 62 %).

*Н ЯМР (DMSO-66) δ 2.42, 2.44 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 3.27 (m, 2Н), 3.98 (т, 1Н), 4.27 (dd, J=7.6,14 Hz, 1Н), 4.50 (dd, J=3.4,13.6 Hz, 1H), 5.38 (d, J=5.6 Hz, 1H, OH), 6.82 (d, J=4.4, 8.4 Hz, 1H), 6.91 (td, ²J=2.4,³J=9.0 Hz, 1H), 7.70 (m, 3H), 7.75 (dd, J-2.4, 9.2Hz, 1H), 8.11 (s,lH), 10.93 (s, 1H, CONH), 13.73 (s, ΙΗ,ΝΗ). LC-MS (m/z) 423.4 (M-l).

Пример 9

Синтез на (2-хидрокси-3-[1,2,3]-триазол-1-ил-пропил)-амид на 5-[5хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4-диметил1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

5-[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (126.6 мг, 0.4 ммола) се кондензират с 1-амино-3-(1,2,3)-триазол-2-ил-пропан-2-ол (85 мг, 0.48 ммола) за да се утаи (2-хидрокси-3-[1,2,3]-триазол-1-ил-пропил)-амид на 5[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксилна киселина (48 мг, 27 %).

Ή ЯМР (DMSO-d6) δ 2.42, 2.44 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 3.27 (m, 2Н), 3.99 (m, 1Н), 4.28 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.51 (dd, J=3.2, 14 Hz, 1H), 5.39 (d, J=6.0 Hz, 1H, OH), 6.85 (d, J=4.4, 8.4 Hz, 1H), 7.12 (dd, J=2.0, 8.2Hz, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.74 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 10.99 (s, 1H), CONH),

13.65 (s, ΙΗ,ΝΗ). LC-MS (m/z) 439.4 (M-l).

Пример 10

Синтез на (2-хидрокси-3-[1,2,3]-триазол-1-ил-пропил)-амид на 5-[5 бромо-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4-диметилШ-пирол-З-карбоксилна киселина 5-[5-бромо-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(37)-илиден-метил]-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (144.4 мг, 0.4 ммола) се кондензират с 1-амино-3-(1,2,3)-триазол-2-ил-пропан-2-ол (85 мг, 0.48 ммола) за да се утаи (2-хидрокси-3-[1,2,3]-триазол-1-ил-пропил)-амид на 5[5-бромо-2-оксо-1,2-дихидро-индол-(Зг)-илиден-метил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксилна киселина (130 мг, 67 %).

Ή ЯМР (DMSO-d6) δ 2.41, 2.44 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 3.27 (m, 2Н), 3.99 (m, 1Н), 4.28 (dd, J=7.6, 14 Hz, 1H), 4.50 (dd, J=3.6, 14 Hz, 1H), 5.40 (d, J=5.6 Hz, 1H, OH), 6.81 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J=2.0, 8.2 Hz, 1H), 7.70 (m, 2H),

7.77 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.10 (d,J=1.6 Hz, 1H), 11.0 (s, 1H, CONH), 13.64 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 485.4 (M-l).

Синтез на 5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина, 5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3 -илиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол-3 -карбоксилна киселина, 5 - (2оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксилна киселина е описана в заявка на заявителя, подадена с настоящата заявка на 14 февруари 2001 год. със заглавие “Пиролови заместени 2-индолинон протеин киназни инхибитори” със сериен № 09/783 264, чието описание е включено тук в своята цялост.

Пример 11

Синтез на 1 -амино-3-( 1,1 -диоксо-Х⁶-тиоморфолин-4-ил)-пропан-2-ол

Към разтвор на тиоморфолин (5.0 г, 48.7 ммола) в метанол (200 мл) се прибавя разтвор на оксон (36.0 г, 58.5 ммола) във вода (100 мл). Сместа се бърка енергично при 40° С 48 часа и след това се охлажда до 0° С. На капки се прибавя воден натриев хидроксид за да се нагласи pH = 12. Утайката се отфилтрва и се промива с метанол (3 х 40мл). Събраната течност се изпарява и пречиства чрез мигновенна хроматография върху силикагел (хлороформ/ метанол /амоняк.вода = 3/1/0.1-2/1/0.1) за да се получи тиоморфолин 1,1диоксид (6.2 г) с 93 % добив.

^!Н ЯМР (DMSO-d6) δ 2.97 (m, 4Н), 3.07 (m, 4Н), 3.42 (brs, 1Н), MS (m/z) 136 (M+l).

Смес от тиоморфолин 1,1-диоксид (2л5 г, 18.5 ммола) и ( R)-(-)епихлорохидрид (1.55 мл, 20 ммола) в смес от разтворители етанол (50 мл) и вода (5 мл) се бърка при 25° С 24 часа. След отстраняването на разтворителите, остатъкът се пречиства чрез мигновенна хроматография за да даде ( К)-1-хлоро-3-(1,1-диоксоА⁶-тиоморфолин-4-ил)-пропан-2-ол (4.0 г, 96 %).

’н ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.50 (m, 2Н), 2.94 (m, 4Н), 3.05 (m, 4Н), 3.54 (dd, J=5.8, 11.2 Hz, 1H), 3,63 (dd, J=4.4, 11.2 Hz, 1H), 3.78 (m, H, CH), 5.10 (d, J=5.2 Hz, 1H, OH); MS (m/z) 228.2 (M+l).

( R)-l-xлopo-3-(l,l-диoκco-λ^б-τиoмopφoлин-4-ил)-πpoπaн-2-oл (2.27 r, 10 мола) се третира c разтвор на амоняк в метанол (25 % тегловно, 20 мл) при 50° С за 12 часа. След изпаряване на разтворителите, остатъкът се обработва с йонообменна смола (AGlx8, ОН форма) във вода за да се получи суровия (S)-1 -амино-3 -(1,1 -диоксо-Х⁶-тиоморфолин-4-ил)-пропан-2-ол (2.0 г). Той е замръсен с около 30 % от неговия димер и може да се пречисти чрез колонна хроматография. MS (m/z) 209.2 (М+1).

Кондензиране на (8)-1-амино-3-(1,1-диоксо-Х⁶-тиоморфолин-4-ил)пропан-2-ол с оксиндоли дава желаните индолинони (добив 50 - 80 % след пречистване).

[3-(1,1-диоксо-Х⁶-тиоморфолин-4-ил)-2-хидрокси-пропил]-амид на ( R)-5-(2-okco- 1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4-диметил- 1Нпирол-3-карбоксилна киселина

Ή ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.39, 2.42 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 2.49 (m, 1Н), 2.56 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.07 (m, 4H), 3.16 (m, 1H), 3.34 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8 Hz, 1H, OH), 6.86 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.97 (t, J=7.4 Hz, 1H), 7.11 (t, J=7.5 Hz, 1H), 7.50 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.76 (d,J=7.6 Hz, 1H) (ароматен и винилов), 10.88 (s, 1H, CONH), 13.62 (s, 1H, NH); MS (m/z) 473.4 (M+l).

[3-(1,1 -диоксо-Х⁶-тиоморфолин-4-ил)-2-хидрокси-пропил]-амид на (R)-5-(5^nyopo-2-OKco-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил- 1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

Ή ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.40, 2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 2.47 (m, 1Н), 2.54 (m,

1H), 2.97 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.17 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8 Hz, 1H, OH), 6.82 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.91 (td, ²J=2.8,³J=9.0 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.8 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.75 (dd, J=2.4, 9.2 Hz, 1H), 10.88 (s, 1H), 13.67 (s, 1H); LC-MS (m/z) 491.4 (M+l).

[3-(1,1 -диоксо-Х⁶-тиоморфолин-4-ил)-2-хидрокси-пропил]-амид на (Я)-5-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-3 -карбоксилна киселина

Ή ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.40, 2.42 (2xs, 6Н, 2хСН₃), 2.45 (m, 1Н), 2.53 (m, 1H), 2.96 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.17 (m, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.4 Hz, 1H, OH), 6.85 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.11 (dd, J=2.2, 8.2 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.5 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.97 (d, J=2.0 Hz, 1H), 10.98 (s, 1H), 13.62 (s, 1H); LC-MS (m/z) 507.2 (M+l).

[3-(1,1 -диоксо-Х⁶-тиоморфолин-4-ил)-2-хидрокси-пропил]-амид на (К)-5-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил- 1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

‘Н ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.41,2.42 (2xs, 6H, 2xCH₃), 2.47 (m, 1Н), 2.54 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.06 (m, 4H), 3.18 (m, 1H), 3.30 (m, 1H), 3.74 (m, 1H), 4.83 (d, J=4.8 Hz, 1H), 6.81 (t, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (dd, J=1.8, 8.2 Hz, 1H), 7.53 (t, J=5.8 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 8.09 (d, J=2.0 Hz, 1H), 10.98 (s, 1H), 13.62 (s, 1H); LC-MS (m/z) 553.6 (M+l).

Пример 12

Синтезна (S)- или (К)-1-метиламино-3-морфолин-4-ил-пропан-2-ол

Смес от морфолин (1.74 мл, 20 мл) и (1<)-епихлорохидрид (1.56 мл, 20 ммола) в етанол (10 мл) се бърка при стайна температура 48 часа. След отстраняване на разтворителя, остатъкът се третира с разтвор на CH₃NH₂ във вода (40 % тегловно, 20 мл) при стайна температура 14 часа. Отстраняване на разтворителите дава суровия (8)-1-метиламино-3-морфолин-4-ил-пропан-

2-ол, който може да се пречисти чрез вакуумно дестилиране или колонно хроматографиране (2.4 г, 70 %). ( К)-1-метиламино-3-морфолин-4-илпропан-2-ол се получава от (8)-епихлорохидрид с 76 % добив.

‘н ЯМР (CDCI₃) δ 2.33 (dd, J=3.6, 12.4 Hz, 1H), 2.42 (m, 1H), 2.44 (dd, J=2.8, 9.8 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.53 (dd, 7.6, 11.8Hz, 1H), 2.62 (m, 2H), 2.65 (dd, J=3.6,12.0 Hz, 1H), 3.71 (m, 4H), 3.85 (m, 1H), ¹³C ЯМР (CDCI3) δ 67.06,65.58, 62.80, 55.87, 53.94, 36.72,

MS (m/z) 175 (M+l).

(8)-1-метиламино-3-морфолин-4-ил-пропан-2-ол кондензиран c 5флуороксиндол дава (2-хидрокси-3-морфолин-4-ил-пропил)-метил амид на ( R)- 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4-диметил1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

¹Н ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.0 (s, ЗН), 2.15 (m, 1Н), 2.25 (m, 6H), 2.28 (m, 2H), 2.42 (s, 1H), 2.95 (s, 1H), 3.0 (s, 3H), 3.25 (m, 2H), 3.57 (m, 2H), 3.97 & 3.68 (2xbrs, 1H), 4.80 & 4.74 (2xbrs, 1H), 6.82 (dd, J=4.0, 8.0 Hz, 1H), 6.91 (td, ²J=2.3,³J=8.7 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.71 (dd, J=2.2, 9.0 Hz, 1H), 10.86 (s, 1H), 13.57 (s, 1H); LC-MS (m/z) 457.2 (M+l).

( R)-l-aминo-3-мopφoлин-4-ил-πpoπaн-2-oл дава (2-хидрокси-Зморфолин-4-ил-пропил)-метил амид на (8)-5-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

N Н

100

Ή ЯМР (DMSO-d₆) δ 2.0 (s, ЗН), 2.10 (m, Ш), 2.22 (m, 6H), 2.25 (m, 2H), 2.38 (m, 1H), 2.90 (s, 1H), 2.96 (s, 3H), 3.27 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.93 & 3.64 (2xbrs, 1H), 4.75 & 4.70 (2xbrs, 1H), 6.77 (dd, J=4.6, 8.2 Hz, 1H), 6.85 (td, ²J=2.5,³J=8.8 Hz, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.67 (dd, J=2.0, 9.6 Hz, 1H), 10.81 (s, 1H), 13.52 (s, 1H); LC-MS (m/z) 457.2 (M+l).

Пример 13

Получаване на аминна странична верига

3-(1-Н-тетразол-1-ил)-2-хидрокси-1-хлоропропан и 3-(2-Н-тетразол-2ил-2-хидрокси-1 -хлоропропан

6.905 г тетрозол (100 ммола) и 1.75 мл диизопропилетиламин (10 ммола) и 11.73 мл епихлорохидрид (150 ммола) в безводен ацетонитрил (30 мл) се бърка при 60° за 4 часа. Полученият разтворсе изпарява, суши се под вакуум и се пречиства върху колона със силикагел като се елуира с хлороформ : метанол 100:8. Първата фракция дава чист 3-(2-Н-тетразол-2ил-2-хидрокси-1-хлоропропан 6.215 г (безцветно масло, 38 % добив), втората фракция дава 9.208 г чист 3-(1-Н-тетразол-1-ил)-2-хидрокси-1-хлоропропан (леплива смола; 57 %).

-(1 -Н-тетразол-1 -ил)-2-хидрокси-1 -аминопропан

9.110 г 3-(1Н-тетразол-1-ил)-2-хидрокси-1-хлоропропан, 15 г калиев карбонат и 130 мл наситен амонячен разтвор в метанол се бърка 21 часа, след това се филтрува и изпарява. Остатъкът се пречиства върху колона със силикагел и се елуира с хлороформ - метанол - воден амоняк 80:35:4. Добив = 7.326 г бяла леплива смола (91.5 % от теорията).

3-(2-Н-тетразол-2-ил)-2-хидрокси-1-аминопропан

6.105 г 3-(2Н-тетразол-2-ил)-2-хидрокси-1-хлоропропан, 10 г калиев карбонат и 95 мл наситен амонячен разтвор в метанол се бърка 21 часа, след това се филтрува и изпарява. Остатъкът се пречиства върху колона със силикагел и се елуира с хлороформ - метанол - воден амоняк 60:25:2. Добив = 3.726 г бяли кристали (69.5 % от теорията).

101

3-[(2К,68)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-2-хидрокси-1-аминопропан

4.7 мл епихлорохидрин (60 ммола) се прибавят към ледено охладен разтвор на цис-2,6-диметилморфолин (4.607 г, 40ммола) в трифлуороетанол (5 мл). Разтворът се бърка при 0 - 5° С 1 час, охладителната баня се отстранява и бъркането продължава при стайна температура още 5 часа. Сместа се изпарява под вакуум за да се получи маслообразен остатък, който се разтваря в безводен етано (50 мл), разтворът се охлажда на ледена баня, прибавя се твърд натриев метоксид (2.27 г) на две порции и сместа се бърка 0 - 5° С 2 часа. След това реакционната смес се филтрува, солите се w промиват с етанол (30 мл) и събраните филтрати се прибавят към ледено охладен концентриран водноамонячен разтвор (200 мл). Сместа се бърка при стайна температура 12 часа и се изпарява под вакуум. Остатъкът се пречиства върху колона върху силикагел в смес от хлороформ - метанол 7М метанолен амоняк 80:15:3. Добив 5.75 бяло кристално хигроскопично вещества (76.3 % от теоретичния).

(28)-3-(3-метил-2,5-диоксоимидазолидин-1 -ил)-2-хидрокси-1 хлоропропан и (28)-3-(3-метил-2,5-диоксоимидазолидин-1-ил)-2хидрокси-1 -аминопропан

3.423 г З-метил-2,5-диоксоимидазолидин (3.423 г) и 3.60 мл ( R)епихлорохидрин (-) (99 % е.е.) и 0.30 мл Barton база (1.5 ммола) в безводен ацетонитрил се бърка при 60° С за 20 часа. Полученият разтвор се изпарява под вакуум и се пречиства върху колона със силикагел със смес от хлороформ - метанол (градиентно 5 до 20 % метанол) за да се получат 5.572 г хлорно съединение като бяло аморфно твърдо вещество (90 % добив). Хлоридът се трансформира в амин както следва. Полученото хидроксихлоро междинно съединение се разтваря в метанолен амоняк (наситен с амонячен газ), прибавя се калиев карбонат и сместа се бърка в затворена колба 2 и половина дни. Реакционната смес се филтрува, филтратът се

102 изпарява. Остатъкът се пречиства върху силикагел със смес от хлороформ метанол - конц. воден амоняк 80:15:1.5.

5-[^)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-1Ч-[2хидрокси-3-(2Н-тетразол-2-ил)пропил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксамид (съединение 22) (общ метод) мг от 3-(2-Н-тетразол-2-ил)-2-хидрокси-1-аминопропан се прибавя към гъста суспензия от 105 мг (0.25 ммола) 1-окси-7-азабензтриазолов естер на 5-[^)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина [получен чрез активиране на (Зг)-3-({3,3-диметил-4-карбокси-1-Н-пирол-2-ил}метилен)-5-флуоро-1,3дихидро-2Н-индол-2-он (480 мг, 1.6 ммола) с HATU реактив (570 мг, 1.5 ммола) в присъствието на Hunig база (3.0 мола, 0.525 мл) в диметилформамид (5 мл) и се изолира в чиста форма чрез утаяване с хлороформ (5 мл) и сушене под вакуум, получен с 92 % добив (579 мг) в безводен диметилацетамид (1.5 мл)]. Сместа се бърка 30 минути и се изпарява под вакуум. Остатъкът се суспендира в смес от метанол диетиламин 20 : 1 (3 мл), оставя се да изкристализира в хладилник (5° С) за 1 час, филтрува се и утайката се промива с леденостуден метанол и се суши под вакуум. Добив 106 мг оранжеви кристали.

Пример 15

5-[(7)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-Ь[-[2хидрокси-3-(2Н-тетразол-2-ил)пропил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксамид (съединение 23) (общ метод) мг от 3-(2-Н-тетразол-2-ил)-2-хидрокси-1-аминопропан се прибавя към гъста суспензия от 109 мг (0.25 ммола) 1-окси-7-азабензтриазолов естер на 5-[(г)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина [получен чрез активиране на (3Z)-3-( {3,3-диметил-4-карбокси-1 -Н-пирол-2-ил} метилен)-5-хлоро-1,3дихидро-2Н-индол-2-он (480 мг, 1.6 ммола) с HATU реактив (1.768 г, 4.65

103 ммола) в присъствието на Hunig база (9.0 мола, 1.58 мл) в диметилформамид (20 мл) и се изолира в чиста форма чрез утаяване с хлороформ (20 мл) и сушене под вакуум, получава се с 94 % добив (1.907) в безводен диметилацетамид (1.5 мл)]. Сместа се бърка 30 минути и се изпарява под вакуум. Остатъкът се суспендира в смес от метанол - диетиламин 20 : 1 (3 мл), оставя се да изкристализира в хладилник (5° С) за 1 час, филтрува се и утайката се промива с леденостуден метанол и се суши под вакуум. Добив 109 мг оранжеви кристали.

Пример 16 w М-[2-хидрокси-3-(2Н-тетразол-2-ил)пропил]-2,4-диметил-5-[(7)-[2оксо-5-(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илидин]метил)1 Н-пирол-З-карбоксамид (съединение 24) (общ метод) мг от 3-(2-Н-тетразол-2-ил)-2-хидрокси-1-аминопропан се прибавя към гъста суспензия от 121.5 мг (0.25 ммола) 1-окси-7-азабензтриазолов естер на 5-[(7)-(5-трифлуорометокси-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина [получен чрез активиране на (37)-3-({3,3-диметил-4-карбокси-1-Н-пирол-2-ил}метилен)-5трифлуорометокси-1,3-дихидро-2Н-индол-2-он (1.768 г, 4.8 ммола) с HATU реактив (1.758 г, 4.8 ммола) в присъствието на Hunig база (9.0 мола, 1.58 мл) в диметилформамид (25 мл) и се изолира в чиста форма чрез утаяване с ацетонитрил и сушене под вакуум, получава се с 85.5 % добив (1.929) в безводен диметилацетамид (1.5 мл)]. Сместа се бърка 30 минути и се изпарява под вакуум. Остатъкът се суспендира в смес от метанол диетиламин 20 : 1 (3 мл), оставя се да изкристализира в хладилник (5° С) за 1 час, филтрува се и утайката се промива с леденостуден метанол и се суши под вакуум. Добив 113 мг оранжеви кристали.

Пример 17

- [(Z)- (5 -ф луоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индо л-3 -илиден)метил] -N[2-хидрокси-3-(1Н-тетразол-1 -ил)пропил]-2,4-диметил- 1Н-пирол-3104 карбоксамид (съединение 25)

То се получава съгласно метода от пример 14 от 72 мг от съответния амин. Добив = 113 мг оранжеви кристали.

Пример 18

5-[(2)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-Ь1[2-хидрокси-З - (1 Н-тетразо л-1 -ил)пропил] -2,4-диметил-1 Н-пирол-3 карбоксамид (съединение 26)

То се получава съгласно метода от пример 15 от 72 мг от съответния амин. Добив = 122 мг оранжеви кристали.

Пример 19

N - [2-хидрокси-З -(1 Н-тетразол-1 -ил)пропил] -2,4-диметил-5 - [(Z)- [2оксо-5-(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илидин]метил)1 Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 27) (общ метод)

То се получава съгласно метода от пример 16 от 72 мг от съответния амин. Добив = 118 мг оранжеви кристали.

Пример 20

1Ч-[3-[(2К,68)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-2-хидроксипропил)- 5-[(Z)(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-2,4диметил-1 Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 28)

То се получава съгласно метода от пример 14 от 95 мг от съответния амин. Добив = 99 мг оранжеви кристали.

Пример 21

5-[(7)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-1Ч-[3[(2К,68)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-2-хидроксипропил)-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид (съединение 29)

То се получава съгласно метода от пример 15 от 95 мг от съответния амин. Добив = 101 мг оранжеви кристали.

Пример 22

Л-[3-[(2К,68)-2,6-диметилморфолин-4-ил]-2-хидроксипропил)- 2,4105 диметил- 5-[(7)-[2-оксо-5-(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил]-1Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 30) То се получава съгласно метода от пример 16 от 95 мг от съответния амин. Добив = 89 мг оранжеви кристали.

Пример 23

5-[(2)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-М[(28)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5-диоксоимидазолидин-1-ил)]-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 34)

То се получава съгласно метода от пример 14 от 95 мг от съответния амин. Добив = 109 мг оранжеви кристали.

Пример 24

5-[(2)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-М[(28)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5-диоксоимидазолидин-1-ил)пропил]-

2.4- диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 36)

То се получава съгласно метода от пример 15 от 95 мг от съответния амин. Добив = 107 мг оранжеви кристали.

Пример 25

Т4-[(28)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5-диоксоимидазолидин-1-л)пропил]-

2.4- диметил-5- {(г)-[2-оксо-5-(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил}-1Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 35)

То се получава съгласно метода от пример 16 от 95 мг от съответния амин. Добив = 123 мг оранжеви кристали.

Пример 26

5-[(2)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-М[(2К)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5-диоксоимидазолидин-1-ил)пропил]-

2.4- диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 31)

То се получава съгласно метода от пример 14 от 95 мг от съответния амин. Добив = 110 мг оранжеви кристали.

Пример 27

106

5-[(7)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-М[(2К)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5-диоксоимидазолидин-1-ил)пропил]-

2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 32)

То се получава съгласно метода от пример 15 от 95 мг от съответния амин. Добив = 103 мг оранжеви кристали.

Пример 28

Ь1-[(2К)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5-диоксоимидазолидин-1 ил)пропил]-2,4-диметил-5- {(7)-[2-оксо-5-(трифлуорометокси)-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} - 1Н-пирол-3-карбоксамид (съединение 33)

То се получава съгласно метода от пример 16 от 95 мг от съответния амин. Добив = 120 мг оранжеви кристали.

Пример 29

Етилов естер на 5-формил-2-метил-4-фенил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

Н

Диметилформамид (4 мл, 3 екв.) се охлажда при бъркане в ледена баня. Към това се прибавя РОС1₃ (1.1 екв., 1.8 мл). След 30 мин към реакционната смес се прибавя разтвор на пиролов 3,5-диметил-4-етилов естер (4 г, 17.4 ммола) в диметилформамид (2М, 9 мл) и бъркането продължава. След 10 минути реакционната смес се втвърдява. Разрежда се с 5 мл диметилформамид и се нагрява в маслена баня с 90° С. След 1 час, реакционната смес се охлажда до стайна температура и се разрежда с вода (100 мл) и се алкализира до pH = 11 с IN NaOH. Продуктът се екстрахира с метиленхлорид (3 х 200 мл) и органичните слоеве се промиват със солев

107 разтвор (200 мл), сушат се над магнезиев сулфат и се концентрират за да дадат 4.3 г (95 %) етилов естер на 5-формил-2-метил-4-фенил-1Н-пирол-3карбоксилна киселина като кафяво твърдо вещество.

Ъ ЯМР (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12.5 (br s, 1H, NH), 9.11 (s, 1H, CHO),

7.35 (s, 5H, и ArH), 3.98 (q, J=6.8 7.2 Hz, 2H, OCH₂CH₃), 2.48 (s, 3H, CH₃), 0.98 (t, J=7 Hz, 3H, OCH₂CH₃).

5-формил-2-метил-4-фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

Етилов естер на 5-формил-2-метил-4-фенил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина се разтваря във вода (100 мл) и метанол (45 мл) при бъркане. Прибавя се КОН (2 екв. 1.9 г) и се нагрява при 100° С. След 2.5 часа се охлажда до стайна температура и остатъчният естер се отстранява чрез екстрахиране с етилацетат (200 мл), суши се и се концентрира. Водният слой се подкислява до рН=3 при използване на 2N НС1. Бялото твърдо вещество се отделя чрез филтруване и промиване с вода. Твърдото вещество се получава чрез концентриране от толуен, стриване с хексани и сушене за да се получат 2 г (52 %) белезникавобяло твърдо вещество.

¹Н ЯМР (360 MHz, DMSO-de) δ 12.46 (br s, 1H, CO₂H), 11.95 (s, 1H, NH), 9.08 (s, 1H, CHO), 7.36 (s, 5H, и ArH), 2.49 (s, 3H, CH₃). MS m/z (относителен интензитет %, йон) намерено 229 (100, М⁺); изчислено 229.2.

3-диетиламино-2-хидрокси-пропил)-амид на 5-формил-2-метил-4фенил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

108

Смес от 5-формил-2-метил-4-фенил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (1.0 г, 4.36 ммола), 1-амино-3-диетиламино-2-пропанол (950 мг, 6.54 ммола), DDC (900 мг, 4.36 ммола) и HOBt (884 мг, 6.54 ммола) в хлороформ (60 мл) се бърка при стайна температура 12 часа. Реакционната смес се излива върху лед. Прибавя се натриев бикарбонат (60 мл) и след това IN NaOH (8 мл). Екстрахира се с етилацетат (3 х 100 мл), промива се с вода и със солев разтвор, суши се и се концентрира за да даде 400 мг 3диетиламино-2-хидрокси-пропил)-амид на 5-формил-2-метил-4-фенил- 1Нпирол-3-карбоксилна киселина.

Пример 30

Метод за синтезиране на съединенията 11-21

0.36 М разтор от всеки оксиндол се получава в DMSO като 0.576 М разтвор от всеки алдехид. 300 мкл от съответния оксиндол се смесва с 300 мкл от съответния алдехид в присъствието на 200 мкл DMSO. След това се прибавя 40 мг от диетилентриамин пречистваща смола. Сместа се поставя в блок на Robbin и блокът се запечатва и поставя в пещ с температура 60° С, където се клати 18 часа.

След 18 часа блокът на Robbin се отстранява от пещта. Отстранява се капака на горната част и към сместа се поставят 800 мкл DMSO. След това блокът отново се запечатва и отново се поставя в пещ с температура 60° С, където се върти непрекъснато 1 час.

След 1 час блокът на Robbin се отстранява от пещта и се оставя да се охлади. Затворът на дъното на блока внимателно се отстранява и целият

109 блок се поставя в устройство за филтруване, което дава възможност на новосинтезираното съединение да се отфилтрува от смолата.

Пример 31

3- [ 1 -Н-(7-азабензтриазолил)-окси]-2-хидрокси-1 -аминопропан

4.-83 г 1-хидрокси-7-азабензотриазол (30 ммола) и 0.53 мл диизопропиламин (3 ммола) и 4.70 мл епихлорохидрин в безводен хлороформ се бърка при 60° С 2 часа. Реакционната смес се излива върху колона със силикагел и се елуира със смес от хлороформ - метанол 100:3. Полученото хидрокси-хлоро междинно съединение (4.83 г, бледожълто масло, 70 % добив) се разтваря в метанолен амоняк (100 мл, наситен с амоняк газ), прибавя се 8.3 г калиев карбонат и сместа се бърка в затворена колба 2 и половина дни. Реакционната смес се филтрува, филтратите се изпаряват. Остатъкът се пречиства върху силикагел в колона като се елуира със смес от хлороформ - метанол- конц.воден амоняк 80:15:1.5 добив = 2.793 г от бяло кристално вещество (63 от % теоретичния от хлорида).

3-[1-Н-(бензотриазолил)-окси]-2-хидрокси-1-хлоропропан и

3-[1-Н-(бензотриазолил-3-Ь[-оксидо)]-2-хидрокси-1-хлоропропан 12.162 г хидроксиазабензотриазол (90 ммола), 1.59 мл диизопропиламин (9 ммола) и 14.1 мл епихлорохидрин (180 ммола) в безводен хлороформ се бърка при 55° С 2 часа. Реакционната смес се изпарява, остатъкът се суши във вакуум и се пречиства върху колона със силикагел със смес от хлороформ - метанол 100:5. Първите фракции дават 3[1-Н-(бензотриазолил)-окси]-2-хидрокси-1-хлоропропан 10.570 г (бледожълто медообразно вещество; 51.5 % добив), последвано от фракции с 3 - [ 1 -Н- (бензотриазолил-3 -N-оксидо)] -2-хидрокси-1 -хлоропропан 9.990 г (бяло кристално вещество, 48.5 % от теоретичния).

3-[1-Н-(бензотриазолил-3-М-оксидо)]-2-хидрокси-1-аминопропан

110

Получава се чрез аминолиза на 3-[1-Н-(бензотриазолил-3-М-оксидо)]-

2-хидрокси-1-хлоропропан аналогично на синтезата на 3-[1-Н-(7азабензтриазолил)-окси]-2-хидрокси-1 -аминопропан.

Пример 32

5-[(/)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-К[2-хидрокси-3-(ЗН-[1,2,3]триазоло[4,5-Ь]пиридин-3-илокси)пропил]-

2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид (общ метод)

105 мг 3-[1-Н-(7-азабензтриазолил)-окси]-2-хидрокси-1 -аминопропан се прибавя към гъста суспензия от 105 мг (0.25 ммола) 1-окси-7w азабензтриазолов естер на 5-[(7)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3илиден)метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина [получен чрез активиране на (3Z)-3-({3,3-диметил-4-карбокси-1 -Н-пирол-2-ил}метилен)-5флуоро-1,3-дихидро-2Н-индол-2-он (480 мг, 1.6 ммола, 0.525 мл) в диметилформамид (5 мл) и се изолира в чиста форма чрез утаяване с хлороформ (5 мл) и сушене под вакуум, получава се с 92 % добив (579 мг)] в безводен диметилацетамид (1.5 мл). Сместа се бърка 30 минути и се изпарява под вакуум. Остатъкът се суспендира в смес от метанол диетиламин 20 : 1 (3 мл), оставя се да изкристализира в хладилник (5° С) за 1 час, филтрува се и утайката се промива с леденостуден метанол и се суши под вакуум. Добив 121 мг оранжеви кристали.

Пример 33

5-[(7)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-М[2-хидрокси-3-(ЗН-[1,2,3]триазоло[4,5-Ь]пиридин-3-илокси)пропил]-

2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид (общ метод)

105 мг 3-[1-Н-(7-азабензтриазолил)-окси]-2-хидрокси-1-аминопропан се прибавя към гъста суспензия от 105 мг (0.25 ммола) 1-окси-7азабензтриазолов естер на 5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3илиден)метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина [получен чрез активиране на (3Z)-3-({3,3-диметил-4-карбокси-1 -Н-пирол-2-ил}метилен)-5

Ill хлоро-1,3-дихидро-2Н-индол-2-он (1.520 г; 4.8 ммола) с HATU реактив (1.768 г, 4.65 ммола) в присъствието на Hunig база (9.0 мола, 1.58 мл) в диметилформамид (20 мл) и се изолира в чиста форма чрез утаяване с хлороформ (20 мл) и сушене под вакуум, получава се с 94 % добив (1.907 г) в безводен диметилацетамид (1.5 мл)]. Сместа се бърка 30 минути и се изпарява под вакуум. Остатъкът се суспендира в смес от метанол диетиламин 20 : 1 (3 мл), оставя се да изкристализира в хладилник (5° С) за 1 час, филтрува се и утайката се промива с леденостуден метанол и се суши под вакуум. Добив 130 мг оранжеви кристали.

w Пример 34

5-[(7)-(5-трифлуорометокси-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3илиден)метил]-М-[2-хидрокси-3-(ЗН-[1,2,3]триазоло[4,5-Ь]пиридин-3илокси)пропил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид (общ метод)

105 мг 3-[1-Н-(7-азабензтриазолил)-окси]-2-хидрокси-1-аминопропан се прибавя към гъста суспензия от 121.5 мг (0.25 ммола) 1-окси-7азабензтриазолов естер на 5-[(Z)-(5- трифлуорометокси-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина [получен чрез активиране на (Зг)-3-([3,3-диметил-4-карбокси-1-Н-пирол-2ил}метилен)-5-трифлуорометокси-1,3-дихидро-2Н-индол-2-он (1.768 г; 4.8 ммола) с HATU реактив (1.758 г, 4.8 ммола) в присъствието на Hunig база (9.0 мола, 1.58 мл) в диметилформамид (25 мл) и се изолира в чиста форма чрез изпаряване и утаяване с хлороформ (20 мл) и сушене под вакуум, получава се с 85.5 % добив (1.929 г) в безводен диметилацетамид (1.5 мл) ]. Сместа се бърка 30 минути и се изпарява под вакуум. Остатъкът се суспендира в смес от метанол - диетиламин 20 : 1 (3 мл), оставя се да изкристализира в хладилник (5° С) за 1 час, филтрува се и утайката се промива с леденостуден метанол и се суши под вакуум. Добив 142 мг оранжеви кристали.

Пример 35

112

5-[(2)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-М[2-хидрокси-3-(3-оксидо-1Н-1,2,3-бензотриазол-1 -ил)пропил]-

2,4-диметил-1 Н-пирол-3 -карбоксамид

Получава се съгласно метода от пример 32 от 105 мг от съответния амин. Добив = 120 мг оранжево кристално вещество.

Пример 36

5-[(7)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3-илиден)метил]-ЬГ[2-хидрокси-3-(3-оксидо-1Н-1,2,3-бензотриазол-1-ил)пропил]-

2,4-диметил-1 Н-пирол-3 -карбоксамид

Получава се съгласно метода от пример 33 от 105 мг от съответния амин. Добив = 127 мг оранжево кристално вещество.

Пример 37

М-[2-хидрокси-3-(3-оксидо-1Н-1,2,3-бензотриазол-1-ил)пропил]- 2,4диметил-5- { (Z)-[2-okco-5-(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3 -илиден] метил} -1 Н-пирол-3 -карбоксамид

Получава се съгласно метода от пример 34 от 105 мг от съответния амин. Добив = 141 мг оранжево кристално вещество.

Биологични изпитания

Използват се следните питания за да се намерят съединенията, проявяващи оптимална степен на желаната активност.

А. Методи на изпитания

Използват се следните изпитания за определяне нивото на активност и ефекта на различните съединения от изобретението върху един или повече PKs. Подобни изпитания могат да се дадат за всеки от РК като се използват добре известни в областта техники.

Няколко от изпитанията описани тук се провеждат в ELISA (EnsymeLinked Immunosorbent Sandwich Assay) формат (Voller, et al., 1980, “EnsymeLinked Immunosorbent Assay”, Manual of Clinical Immunology, 2^nd ed., Rose

113 and Friedman, Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C., pp. 359 - 371). Общият метод е както следва: въвежда се съединение в клетки експресиращи изпитваната киназа, било естествено или рекомбинантно, за подбран период от време след който, ако изпитваната киназа е рецептор, се прибавя лиганд известен че активира рецептора. Клетките се лизират и лизатът се пренася в кладенчета на ELISA плака, предварително покрити със специфично антитело, разпознаващо субстрата на ензимната фосфорилираща реакция. Не-субстратните съставки на клетъчния лизат се отмиват и се проследява количеството на фосфорилиране върху субстрата с антитело, което С специфично разпознава фосфотирозин в сравнение с контролни клетки, които не са били в контакт с изпитваното съединение.

Понастоящем предпочитаните начини на работа за провеждане на ELISA експериментите за специфични PKs са дадени по-долу. Обаче, адаптирането на тези начини на работа за определяне на активността на съединения срещу други RTKs е също в обхвата на познанията на специалистите от областта. Други описани тук изпитания измерват количеството на ДНК получена в отговор на активирането на изпитваната киназа, което е обща мярка на пролиферативна реакция. Общата методика за това изпитание е както следва: съединение се въвежда в клетки експесиращи опитната киназа, било природно или рекомбинантно, за подбран период от време след което, ако опитната киназа е рецептор, се прибавя лиганд известен че активира рецептора. След като се инкубира най-малко една нощ, се прибавя ДНК бележещ реактив като 5-бромодеоксиуридин (BrdU) или Н³тимидин. Количеството белязана ДНК се проследява било с анти- BrdU или чрез измерване на радиоактивността и се сравнява с контролни клетки, които не са били в контакт с изпитваното съединение.

Тови изпитание анализира тирозин киназната активност на GST-Flkl върху полипи,tyr) пептиди.

Материали и реактиви:

114

Corning-ови 96-кладенчеви ELISA плаки (Catalog No. 5805 - 96). nonn(glu,tyr) 4:1, лиофилизат (Sigma Catalog # P0275).

получаване на полипи,tyr) (pEY) покрити изпитателни плаки: покритие 2 мкг/кладенче nojin(glu,tyr) (pEY) в 100 мкл PBS, държи се при стайна температура 2 часа или при 4° С една нощ. Кладенчетата се покриват добре за да се предпазят от изпарение.

PBS буфер: за 1 л се смесват 0.2 г КН₂РО₄,1.15 г Na₂HPO₄, 0.2 г KCI и 8 г NaCl в приблизително 900 мл dH₂O. След разтварянето на всички реактиви, pH се нагласява на 7.2 с HCI. Общият обем се долива до 1 л с dH₂O.

PBST буфер: към 1 л PBS буфер се прибавя 1.0 мл Tween-20.

ТВВ - блокиращ буфер: за 1 л се смесват 1.21 г TRIS, 8.77 г NaCl, 1 мл Tween-20 и приблизително 900 мл dH₂O. pH се нагласява на 7.2 с HCI. Прибавят се 10 г BSA, бърка се за да се разтвори. Долива се до 1 л с dH₂O. Филтрува се за отстраняване на отделни частички.

% BSA: За получаването на 1 х работен разтвор, прибавят се 10 г BSA към приблизително 990 мл PBS буфер, бърка се за да се разтвори. Нагласява се обема до 1 л с PBS буфер, филтрува се за да се отстранят частичките.

мМ Hepes pH 7.5.

GST-Flklcd пречистени от sf9 рекомбинантна бакуловирусна трансформация (SUGEN, Inc).

% DMSO в dH₂O.

мМ ATP в dH₂O мМ МпС1₂

Киназен разреждащ буфер (KDB): смесват се 10 мл Hepes (pH 7.5), 1 мл 5М NaCl, 40 мкл 100 мМ натриев ортованадат и 0.4 мл 5% BSA в dH₂O с 88.56 мл dH₂O.

115

NUNC 96-кладенчени V дънни полипропиленови плаки, Applied Scientific Catalog # AS-72092

EDTA: смесват се 14.12 г етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA) с приблизително 70 мл dH₂O. Прибавят се 10 N NaOH до разтварянето на EDTA. Нагласява се на pH 8.0. Долива се общия обем до 100 мл с dH₂O.

1° разреждат буфер за антитела: смесват се 10 мл 5 % BSA в PBS буфер с 89.5 мл TBST.

Анти-фосфотирозиново моноклонално антитело конюгирано към V хрянова пероксидаза на (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech).

2,2’-азинобис (З-етилбензтиазолин-6-сулфонова киселина (ABTS, Moss, Cat. No ABST).

10%SDS.

Начин на работа:

Покриват се Corning-ови 96-кладенчеви ELISA плаки с 2 мкл ποπηΕΥ пептид в стерилен PBS, както е описано в етап 3 на материали и реактиви.

Несвързаната течност се отстранява от кладенчетата чрез обръщане на плаката. Промива се еднократно с ТВ ST. Излишната течност се отстранява чрез попиване върху книжна кърпа.

Прибавят се 100 мкл 1 % BSA в PBS към всеко от кладенчетата. Инкубира се при клатене за 1 час при стайна температура.

Повтаря се етап 2.

Кладенчетата се накисват с 50 мМ Hepes (pH 7.5) (150 мкл/кладенче). Опитните съединения се разреждат с dH₂O/4 % DMSO към 4 кратно от желаната крайна изпитвана концентрация в 96-кладенчеви полипропиленови плаки.

Прибавят се 25 мкл от разредени съединения за изпитване към ELISA плаките.

116

Прибавят се 25 мкл от 40 мМ МпС1₂ с 4 х АТР (2 мкМ) към всяко кладенче.

Прибавят се 25 мкл от 0.5 М EDTA към отрицателните контролни кладенчета.

Разрежда се GST-Flki до 0.005 мкг (5 нг)/кладенче с KDB.

Прибавят се 50 мкл от разредения ензим към всяко кладенче. Инкубира се чрез разклащане 15 минути при стайна температура.

Реакцията се прекъсва чрез прибавяне на 50 мкл 250 мМ EDTA (pH 8.01).

w Промива се 3 х с TBST и плаките се попиват върху книжна кърпа за да се отстрани излишната течност.

Прибавят се 100 мкл за кладенче анти-фосфотирозин HRP конюгат. Инкубира се при клатене в продължение на 90 минути при стайна температура.

Промива се както в етап 14.

Прибавят се 100 мкл ABTS разтвор към всяко от кладенчетата.

Инкубира се при разклащане за 10 до 15 минути. Мехурчетата се отстраняват.

Реакцията се прекъсва чрез прибавяне на 20 мкл 10 % SDS към всяко кладенче.

20. Резултатите се отчитат на Dynatech MR7000 ELISA reader с опитен филтър при 410 нМ и сравнителен филтър при 630 нМ.

PYK2 биоизпитания

Това изпитание се използва за измерване in vitro киназната активност на НА епитоп-прикачении с пълна дължина pyk2 (FL.pyk2-HA) при ELISA изпитания.

Материали и реактиви:

1. Coming-ови 96-кладенчеви ELISA плаки

117

2. 12СА5 моноклонални анти-НА антитела (SUGEN, Inc.)

3. PBS (Dulbecco’s Phosphate-буфериран солев разтвор (Gibco Catalog # 450-1300ЕВ)

4. TBST буфер: за 1 л се смесват 8.766 г натриев хлорид, 6.057 г TRIS, и 1 мл 0.1 % Triton Х-100 в приблизително 900 мл dH₂O. Нагласява се pH на 7.2 и обемът се добива до 1 л.

5. Блокиращ буфер: за 1 л се смесват 100 г 10 % BSA, 12.1 г 100 мМ TRIS, 58.44 г 1М натриев хлорид и 10 мл 1 % Tween-20.

6. FL.pyk2-HA от sf9 клетъчни лизати (SUGEN, Inc.)

С 7. 4 % DMSO в MilliQue Н₂О.

8. 10 мМ АТР в dH₂O.

9. 1 М MnCL₂

10. 1 MMnCL₂

11. 1 М дитиотреитол (DDT).

12. 10 х киназен буфер за форфорилиранто: смесват се 5.0 мл 1М Hepes (pH 7.5), 0.2 мл 1М МпС1₂, 1.0 мл 1 М MgCl₂ 1.0 мл Triton Х-100 и се прибавя 0.1 мл IM DTT.

13. NUNC 96-кладенчеви V дънни полипропиленови плаки.

14. 500 мМ EDTA в dH₂O.

15. Буфер за разреждане на антителата: за 100 мл се взимат 1 мл 5 % BSA/PBS и 1 мл 10 % Tween-20 в 88 мл TBS.

16. HRP-конюгиран анти- Ptyr (PY99), Santa Cruz Biotech Cat. No. SFC-7020.

17. ABTS, Moss, Cat. No. ABST-2000.

18. 10%SDS

Начин на работа:

1. Покриват се Corning-ови 96-кладенчеви ELISA плаки с 0.5 мкл за кладенче 12СА5 анти-НА антитела в 100 мкл PBS. Съхраняват се една нощ при 4° С.

118

2. Отстранява се несвързаното НА антитело от кладенчетата

чрез обръщане на плаките. Плаките се промиват с йНгО. Излишната течност се отстранява чрез поливане върху книжна кърпа.

3. Прибавят се 150 мкл блокиращ буфер към всяко от кладенчетата. Инкубира се чрез разклащане 30 минути при стайна температура.

4. Плаката се промива с 4 х TBS-T.

5. Лизатът се разрежда в PBS (1.5 мкг лизат/100 мкл PBS).

6. Прибавят се 100 мкл от разредения лизат към всяко кладенче. Разклаща се при стайна температура 1 час.

7. Промива се както в етап 4.

8. Прибавят се 50 мкл от 2 х киназен буфер към ELISA плаката, съдържаща хванатите рук2-НА.

9. Прибавят се 25 мкл от 400 лкМ изпитвани съединения в 4 % DMSO към всяко от кладенчетата. При контролните кладенчета се използва само 4 % DMSO.

10. Прибавят се 25 мкл 0.5 М EDTA към отрицателните контролни кладенчета.

11. Прибавят се 25 мкл от 20 мкМ АТР към всички кладенчета.

Инкубира се чрез разклащане за 10 минути.

12. Реакцията се спира чрез прибавяне на 25 мкл 500 мМ EDTA (pH 8.0) към всички кладенчета.

13. Промива се както в етап 4.

14. Прибавят се 100 мкл анти- Ptyr разреден 1:6000 в антитела разреждащ буфер към всеко от кладенчетата. Инкубира се при разклащане за 1 час при стайна температура.

15. Плаката се промива 3 х с TBST и 1 х с PBS.

16. Прибавят се по 100 мкл ABST разтвор към всяко кладенче.

17. Ако е необходимо, протичащата реакция се спира чрез прибавяне на 20 мкл 10% SDS към всяко от кладенчетата.

119

18. Резултатите се отчитат на Dynatech MR7000 ELISA reader с опитен филтър при 410 нМ и сравнителен филтър при 630 нМ.

FGFR1 биоизпитание

Това изпитание се използва за измерване in vitro киназната активност HaFGFl-RnpH ELISA изпитания.

Материали и реактиви:

1. Costar-ови 96-кладенчеви ELISA плаки (Coming Catalog # 3369).

2. поли (Glu-Tyr) (Sigma Catalog # PO275).

3. PBS (Gibco Catalog # 450- 1300EB)

4. 50 mM Hepes буферен разтвор.

5. блокиращ буфер (5% BSA/PBS).

6. пречистена GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.)

7. киназен разреждащ буфер:

смесват се 500 мкл IM Hepes (Gibco), 20 мкл 5% BSA/PBS, 10 мкл 100 мМ натриев ортованадат и 50 мкл 5 М NaCl.

8. IOmMATP

9. АТР/МпСЬ форсфорилираща смес: смесват се 20 мкл АТР, 400 мкл 1 М МпСЬ и 9.56 мл бНгО.

10. NUNC 96 кладенчеви V-дънни полипропиленови плаки (Applied Scientific Catalog # 72092).

11.O.5MEDTA

12. 0.05%TBST

13. Заешки поликлонален анти-фосфотирозинов серум (SUGEN, Inc.)

14. Кози анти-заешки Ing пероксидазен конюгат (Biosource, Catalog # AL10404).

15. ABTS TBS.

16. ABTS/H₂O₂ разтвор.

Начин на работа:

120

1. Покриват се Costar-ови 96-кладенчеви ELISA плаки с 1 мкг за кладенче поли (Glu-Tyr) в 100 мкл PBS. Съхранява се една нощ при 4°С.

2. Покритите плаки се промиват веднаж с PBS.

3. Прибавят се 150 мкл блокиращ буфер 5% BSA/PBS към всяко от кладенчетата. Инкубира се при разклащане 1 час при стайна температура.

4. Плаката се промива 2 х с PBS и един път с 50 мМ Hepes. Плаките се попиват върху книжна кърпа за да се отстрани излишъка от течността и мехурчетата.

5. Прибавят се 25 мкл 0.4 мМ от изпитваното съединение в 4 % DMSO или само 4 % DMSO (за контрола) към плаката.

6. Пречистената GST-FGFR1 се разрежда в киназен разреждащ буфер (5 нг киназа/50 мкл KDB/кладенче).

7. Към всяко кладенче се прибавя по 40 мкл разредена киназа.

8. Стартира се киназната реакция чрез прибавяне на 25 мкл/кладенче прясно приготвен ΑΤΡ/ΜιΓ⁺ (0.4 мл 1 М МпС1₂, 40 мкл 10 мМ АТР, 9.56 мл dH₂O прясно притовени).

9. Това е бърза киназна реакция и трябва да се прекъсне с 25 мкл 0.5 М EDTA по начин подобен на прибавянето на АТР.

10. Плаката се промива 4 х с пресен ТВ ST.

11. Прави се разреждащ буфер за антитела: за 50 мл се смесват 5 мл BSA, 250 мкл 5 % мляко и 50 мкл 100 мМ разтвор на натриев ванадат, долива се до краен обем с 0.05 % TBST.

12. Прибавят се 100 мкл за кладенче анти-фосфотирозин (1:10000 разреждане в ADB). Инкубира се при разклащане 1 час при стайна температура.

13. Промива се както в етап 10.

14. Прибавят се 100 мкл за кладенче от кози анти-заешки Ing пероксидазен конюгат (Biosource, Catalog # AL10404) (1: 6000 разреждане в ADB). Инкубира се при разклащане 1 час при стайна температура.

121

15. Промива се както в етап 10 и след това с PBS за да се отстранят мехурчетата и излишъка от TWEEN.

16. Прибавят се 100 мкл ABTS/H2O2 разтвор към всяко от кладенчетата.

17. Инкубира се при разклащане за 10 до 20 минути. Мехурчетата се отстраняват.

18. Изпитанието се отчита на Dynatech MR7000 ELISA reader с опитен филтър при 410 нМ и сравнителен филтър при 630 нМ.

Чг EGFR биоизпитание

Това изпитание се използва за измерване in vitro киназната активност на FGF1-R при ELISA изпитание.

Материали и реактиви:

1. Coming-ови 96-кладенчеви ELISA плаки

2. SUMO1 моноклонални анти-EGFR антитела (SUGEN, Inc.)

3. PBS

4. TBST буфер

5. Блокиращ буфер: за 100 мл, смесват се 5.0 г Carnation Instant Nonfat Milk ® с 100 мл PBS

6. А431 клетъчен лизат (SUGEN, Inc.)

7. PBS буфер

8. PBS + 10 % DMSO: за 1 л се смесват 1.514 г TRIS, 2.192 г NaCl и 25 мл DMSO, долива се до 1 л общ обем с dH₂O.

9. АТР (аденозин -5’ Equine Sigma Cat. No. D-5394),

10. 1.0 мМ MnCl₂.

11. ATP/MnCh форсфорилираща смес: за получаване на 10 мл се смесват 300 мкл 1 мМ АТР, 500 мкл 1 М МпС1₂ и 9.2 мл dH₂O. Приготвя се непосредствено преди употреба и се държи върху лед.

12. NUNC 96 кладенчеви V-дънни полипропиленови плаки.

122

13. EDTA

14. Заешки поликлонален анти-фосфотирозинов серум (SUGEN, Inc.)

15. Кози анти-заешки Ing пероксидазен конюгат (Biosource, Catalog # AL 10404).

16. ABTS.

17. 30 % H₂O₂ разтвор.

18. ABTS/H₂O₂

19. 0.2 М HCI.

Начин на работа:

1. Покриват се Coming-ови 96-кладенчеви ELISA плаки с 1 мкг за кладенче SUMO1 в 100 мкл PBS. Съхранява се една нощ при 4°С.

2. Отстранява се насвързания SUMO1 от кладенчетата чрез обръщане на плаката за да се отстрани течността. Промива се 1 х с dH₂O. Плаките се попиват върху книжна кърпа за да се отстрани излишъка от течността.

3. Прибавят се 150 мкл блокиращ буфер към всяко от кладенчетата. Инкубира се при разклащане за 30 мин при стайна температура.

4. Плаката се промива 3 х с деионизирана вода, след това един път с ТВ ST. Плаките се попиват върху книжна кърпа за да се отстрани излишъка от течността и мехурчетата.

5. Лизатът се разрежда в PBS (7 мкг лизат/100 мкл PBS).

6. Прибавят се по 100 мкл от разредения лизат към всеко кладенче. Разклаща се при стайна температура 1 ч.

7. Плаките се промиват както в етап 4 по-горе.

8. Прибавят се 120 мкл GFR към ELISA плака съдържаща хванат EGFR.

9. Изпитваното съединение се разрежда 1:10 в TBS, поставя се в кладенче.

123

10. Прибавят се 13.5 мкл разредено изпитвано съединение към ELISA плаката. За контролиране на кладенчетата се прибавят 13.5 мкл TBS в 10 % DMSO.

11. Инкубира се чрез разклащане в продължение на 30 минути при стайна температура.

12. Прибавят се 15 мкл фосфорилираща смес към всички кладенчета с изключение на тези, сужещи за отрицателна контрола. Крайният обем в кладенче трябва да бъде приблизително 150 мкл с 3 мкМ АТР/5 мМ МпС1₂крайна концентрация във всяко кладенче. Инкубира се чрез разклащане за 5 минути.

13. Реакцията се прекъсва чрез прибавяне при разклащане на 16.5 мкл разтвор на EDTA. Допълнително се разклаща още 1 минута.

14. Промива се 4 х с дейонизирана вода, 2 х с TBST.

15. Прибавят се 100 мкл анти-фосфотирозин (1:3000 разреждане в TBST за кладенче. Инкубира се при разклащане 30 - 45 минути при стайна температура.

16. Промива се както в етап 4 по-горе.

17. Прибавят се към всяко кладенче по 100 мкл Biosource кози антизаешки Ing пероксидазен конюгат (1:2000 разреден в TBST). Инкубира се при разклащане 30 минути при стайна температура.

18. Промива се както в етап 4 по-горе.

19. Прибавя се към всяко кладенче по 100 мкл ABTS/ Н₂О₂ разтвор.

20. Инкубира се 5 до 10 минути с разклащане. Отстраняват се всички мехурчета.

21. Ако е необходимо, реакцията се прекъсва чрез прибавяне на 100 мкл 0.2 М HCI за кладенче.

22. Изпитанието се отчита на Dynatech MR7000 ELISA reader с опитен филтър при 410 нМ и сравнителен филтър при 630 нМ.

124

PDGFR биоизпитание

Материали и реактиви:

1. Coming-ови 96-кладенчеви ELISA плаки

2. 28D4C10 моноклонални анти- PDGFR антитела (SUGEN, Inc.)

3. PBS

4. TBST буфер

5. Блокиращ буфер: същият както при EGFR биоизпитанията.

6. PDGFR-β експресиращ NIH ТЗТ клетъчен лизат (SUGEN, Inc.)

7. PBS буфер

8. PBS + 10% DMSO.

9. ATP

10. MnCl₂.

11. Киназна буферна фосфорилираща смес: за 10 мл се смесват 250 мкл IM TRIS, 200 мкл 5 М NaCl, 100 мкл 1М МпС1₂, 50 мкл 100 мМ Triton Х-100 и достатъчно dH₂O за да се долее до обем 10 мл.

13. EDTA

15. Кози анти-заешки Ing пероксидазен конюгат (Biosource, Catalog # AL10404).

16. ABTS.

17. 30 % Н₂О₂ разтвор.

18. ABTS/H₂O₂

19. 0.2 М HCI.

Начин на работа:

1. Покриват се Corning-ови 96-кладенчеви ELISA плаки с 0.5 мкг за кладенче 28D4C10 в 100 мкл PBS и се съхранява една нощ при 4° С.

125

2. Отстранява се несвързания 28D4C10 от кладенчетата чрез обръщане на плаката за отстраняване на течността. Промива се 1 х с dH₂O. Плаката се попива върху филтърна кърпа за да се отстрани излишната течност.

3. Прибавят се 150 мкл блокиращ буфер към всяко от кладенчетата. Инкубира се при разклащане 30 мин при стайна температура.

4. Плаката се промива 3 х с деионизирана вода, след това един път с TBST. Плаките се попиват върху книжна кърпа за да се отстрани излишъка от течността и мехурчетата.

5. Лизатът се разрежда в HNTG (10 мкг лизат/100 мкл HNTG).

6. Прибавят се 100 мкл от разредения лизат към всяко от кладенчетата. Разклаща се при стайна температура 60 минути.

7. Плаката се промива както е описано в етап 4.

8. Прибавят се 80 мкл работна киназна буферна смес към ELISA плаката съдържаща хванат PDGFR.

9. Разрежда се изпитваното съединение 1: 10 в ТВ S в 96-кладенчеви пропиленови плаки.

10. Прибавят се 10 мкл от разреденото изпитвано съединение към ELISA плаката. За контролиране на кладенчетата се прибавят 10 мкл TBS и 10 % DMSO. Инкубира се чрез разклащане в продължение на 30 минути при стайна температура.

11. Прибавят се 10 мкл АТР директно към всички кладенчета освен към тези, сужещи за отрицателна контрола. Крайният обем в кладенче трябва да бъде приблизително 100 мкл с 20 мкМ АТР във всеко кладенче. Инкубира се чрез разклащане 30 минути.

12. Реакцията се прекъсва чрез прибавяне на 10 мкл разтвор на EDTA към всяко кладенче.

13. Промива се 4 х с дейонизирана вода и два пъти с TBST.

126

14. Прибавят се 100 мкл анти-фосфотирозин (1:3000 разреждане в TBST) за кладенче. Инкубира се при разклащане 30 - 45 минути при стайна температура.

15. Промива се както в етап 4 по-горе.

16. Прибавят се към всяко кладенче по 100 мкл Biosource кози антизаешки Ing пероксидазен конюгат (1:2000 разреден в TBST). Инкубира се при разклащане 30 минути при стайна температура.

17. Промива се както в етап 4 по-горе.

18. Прибавя се към всяко кладенче по 100 мкл ABTS/ Н₂О₂ разтвор.

19. Инкубира се 10 до 30 минути с разклащане. Отстраняват се всички мехурчета.

20. Ако е необходимо, реакцията се прекъсва чрез прибавяне на 100 мкл 0.2 М HCI на кладенче.

21. Изпитанието се отчита на Dynatech MR7000 ELISA reader с опитен филтър при 410 нМ и сравнителен филтър при 630 нМ.

Клетъчно HER-2 киназно изпитание

Това изпитание се използва за измерване HER-2 киназната активност в цели клетки в ELISA формат.

Материали и реактиви:

1. DMEM (Gibco Catalog # 11965-092)

2. Зародишен говежди серум (FBS, Gibco Catalog #16000-044), топлинно инактивиран във водна баня 30 минути при 56° С.

3. Трипсин (Gibco Catalog #25200 - 056).

4. L-глутамин (Gibco Catalog # 25200 - 056)

5. Hepes (Gibco Catalog # 15630 - 080).

6. Растежна среда

Смесват се 500 мл DMEM, 55 мл топлинно инактивиран FBS, 10 мл HEPES и 5.5 мл L-глутамин.

127

7. Изгладняваща среда

Смесват се 500 мл DMEM, 2.5 мл топлинно инактивиран FBS, 10 мл HEPES и 5.5 мл L-глутамин.

8. PBS

9. Плоско дънен 96-кладенчев Tissue Culture Micro Titer (Corning Ctalog # 25860).

10. 15 см-ови Tissue Culture Dishes (Corning Ctalog #08757148).

11. Coming-ови 96-кладенчеви ELISA плаки.

12. NUNC 96- кладенчеви V-дънни полипропиленови плаки.

13. Costar Transfer Cartridges за Transtar 96 (Costar Catalog #7610).

14. SUMO 1: моноклонални анти-EGFR антитела (SUDGEN, Inc.).

15. TBST буфер

16. Блокиращ буфер: 5 % Carnation Instant Milk ® в PBS.

17. EGF лиганд: EGF-201, Shinko American, Japan. NaOH. Суспендиран прах в 100 мкл 10 мМ HCI. Прибавят се 100 мкл 10 мМ натриева основа. Прибавят се 800 мкл PBS и се пренася в Eppendorf епруветка, съхранява се при -20° С докато се употреби.

18. HNTG лизатен буфер

За основен разтвор 5х HNTG се смесват 23.83 г Hepes, 43.83 г NaCl, 500 мл глицерол и 100 мл Triton Х-100 и достатъчно dH₂O за да се получи общо 1 л разтвор.

За lx HNTG* се смесват 2 мл HNTG, 100 мкл 0.1М ИазУОд,250 мкл 0.2 М Na4P₂C>7 и 100 мкл EDTA.

19. EDTA.

20. Na^VCh: За да се получи основен разтвор се смесват 1.04 г №зУО.₍с 90 мл dH₂O. pH се нагласява на 10. Кипи се в микромълнова пещ една минута (разтворът става прозрачен). Охлажда се до стайна температура. Нагласява се pH на 10. Повтаря се цикъла нагряване/охлаждане докато pH се задържа на 10.

128

21. 200 мМ Na4P₂O7.

22. Заешки поликлонален антисерум специфичен за фосфотирозин (анти-Ptyr антитело, SUGEN, Imc.).

23. Афинитетен пречистен антисерум, кози анти-заешки Ing антитело, пероксидазен конюгат (Biosource, Catalog # AL10404).

24. ABTS разтвор.

25. 30 % Н₂О₂ разтвор.

26. ABTS/ Н₂О₂

27. 0.2MHCI.

Начин на работа:

1. Покриват се Corning-ови 96-кладенчеви ELISA плаки с 1.0 мкг за кладенче SUMO1 в 100 мкл краен обем/кладенче. Съхранява се една нощ при 4°С.

2. След един ден използване, покриващият буфер се отстранява и плаките се промиват 3 пъти с dH₂O и един път с ТВ ST буфер. Всички промивания при това изпитание трябва да се правят по този начин, освен ако е казано друго.

3. Прибавят се 100 мкл блокиращ буфер към всяко от кладенчетата. Инкубира се плаката при разклащане в продължение на 30 мин при стайна температура. Точно преди използване плаката се промива.

4. За това изпитание се използва EGFRr/HER-2 chimera/3T3-C7 клетъчна линия.

5. Подбират се плаки притежаващи 80 - 90 % конфлюентност. Чрез триптинизиране се събират клетки и се центрофугират при 1000 об/мин при стайна температура 5 минути.

6. Клетките се суспендират отново в изгладняваща среда и се преброяват с трипаново синьо. Изисква се приживяемост над 90 %. Посаждат се клетки в изгладняваща среда при плътност 2500 клетки за

129

кладенче, 90 мкл за кладенче, в 96- кладенчева микротитърна плака. Посаданети клетки се инкубират една нощ при 37° и 5 % СО₂.

7. Изпитанието се започва два дни след посаждането.

8. Изпитваните съединения се разтварят в 4 % DMSO. Пробите след това се разреждат допълнително директно върху плаките с изгладняваща DMEM. Обикновено това разреждане е 1:10 или по-голямо. Всички кладенчета се пренасят към клетъчната плака при по-нататъшно 1:10 разреждане (10 мкл проба и следа в 90 мкл изгладняваща среда. Крайната DMSO концентрация трябва да бъде 1 % или по-ниска от 1 %. Може също да се използва стандартно серийно разреждане.

9. Инкубира се под 5 % СО₂ при 37° за 2 часа.

10. Приготвя се EGF лиганд чрез разреждане на основния EGF (16.5 мкМ) в топъл DMEM до 150 нМ.

11. Приготвя се пресен HNTG* достатъчен за 100 мкл за кладенче; поставя се върху лед.

12. След 2 часа инкубиране с изпитваното съединение, се прибавя приготвения EGF лиганд към клетките, 50 мкл на кладенче, за крайна концентрация 50 нМ. Положителните контролни кладенчета получават същото количество EGF. Отрицателните контроли не получават EGF. Инкубира се при 37° в продължение на 10 минути.

13. Изпитваното съединение, EGF и DMEM се отстраняват. Клетките се промиват еднократно с PBS.

14. HNTG* се пренася в клетките, 100 мкл за кладенче. Поставят се върху лед за 5 минути. Междувременно блокиращият буфер се отстранява от ELISA плаката и се промива.

15. Клетките се остъргват от плаката с микропипета и клетъчният материал се хомогенизира чрез повторно аспириране и диспергиране в HNTG* лизатен буфер. Пренася се лизата към покрита, блокирана, промита

130

ELISA плака или се използва Costar трансфериращ патронаж за пренасяне лизата до плаката.

16. Инкубира се чрез разклащане при стайна температура 1 час.

17. Лизатът се отстранява, промива се. В ELISA плаката се поставя пресно разредено анти-Ptyr антитело (1:3000 в TBST) по 100 мкл за кладенче.

18. Инкубира се чрез разклащане при стайна температура 30 минути.

19. Отстранява се анти-Ptyr антителото, промива се. Пренася се пресно разреден BIOSOURCE антитело в ELISA плаката (1:8000 в TBST) по 100 мкл за кладенче.

20. Инкубира се чрез разклащане при стайна температура 30 минути.

21.Отстранява се BIOSOURCE антителото, промива се. Пренася се пресно приготвен ABTS/ Н2О2 разтвор в ELISA плаката, 100 мкл за кладенче.

22. Инкубира се при разклащане за 65 - 10 минути. Отстраняват се всички мехурчета.

23. Реакцията се спира чрез прибавяне на 100 мкл 0.2 М HCI за кладенче.

24. Изпитанието се отчита на Dynatech MR7000 ELISA reader с опитен филтър при 410 нМ и сравнителен филтър при 630 нМ.

СОК2/циклин А изпитание

Това изпитание се използва за измерване на in vitro серин/треонин киназната активност в човешки сбк2/циклин А в сцинтилиращо проксимално изпитание (SPA).

Материали и реактиви:

1. Wallac 96-кладенчеви полиетилен терефталатни (flexi) плаки (Wallac Catalog # 1450 - 401).

2. Amersham Redivue [γ³³Ρ] ATP (Amersham Catalog #AM 9968).

131 ч»»·

3. Amersham стрептавидин покрити поливинилтолуен SPA перли (Amersham Catalog &RPNQ0007). Перлите трябва да са реконструирани в PBS без магнезий или калций при 20 мг/мл.

4. Активиран С0к2/циклин А ензимен комплекс, пречистен от Sf9 клетки (SUGEN, Inc.).

5. Биотинилиран пептиден субстрат (Debtide). Пептиден биотин-ХPKTPKKAKKL се разтваря в dH₂O в концентрация 5 мг/мл.

6. Пептидна/АТРсмес: за 10 мл се смесват 9.979 мл dH₂O., 0.00125 мл “студен” АТР, 0.010 мл Debtide и 0.010 мл γ³³Ρ ATP. Крайната концентрация за кладенче ще е 0.5 мкМ “студен” АТР, 0.1 мкг Debtide и 0.2 мкС1 γ³³Ρ АТР.

7. Киназен буфер: зо 10 мл се смесват 8.85 мл dH₂O, 0.625 мл TRIS (pH 7.4), 0.25 мл IM MgCl₂, 0.25 мл 10 % NP40 и 0.025 мл IM DTT , прибавен пресен непосредствено преди употреба.

8. 10 мМ АТР в dH₂O.

9. IM Tris, pH нагласено на 7.4 с HCI.

10. lMMgCl₂,

11. 1 MDDT.

12. PBS (Gibco Catalog # 14190 - 144).

13. 0.5MEDTA.

14. Разтвор за спиране на реакцията: за 10 мл се смесват 9.25 мл PBS, 0.005 мл 100 мМ АТР, 0.1 мл 0.5 М EDTA, 0.1 мл 10 % Triton-Х-ЮО и 1.25 мл 20 мг/мл SPA перли.

Начин на работа:

1. Изготвят се разтвори от изпитваното съединение в концентрация 5 х от крайната в 5 % DMSO. Към всяко кладенче се прибавят по 10 мкл. За отрицателните контроли се използват 10 мкл 5 % DMSO за кладенче.

2. Разреждат се 5 мкл от сбк2/циклин А разтвор с 2.1 мл 2 х киназен буфер.

3. Прибавят се към всяко кладенче по 20 мкл от ензима.

132

4. Към отрицателните контролни кладенчета се прибавя по 10 мкл 0.5 М EDTA.

5. За започване на киназната реакция се прибавят по 20 мкл пептид/АТР сместа към всяко от кладенчетата. Инкубира се 1 час без да се разклаща.

6. Прибавят се 200 мкл спиращ реакцията разтвор към всяко кладенче.

7. Поддържа се най-малко 10 минути.

8. Плаката се центрофугира приблизително при 2300 об/мин за 3 - 5 минути.

9. Плаката се отчита при използване на Trilux или подобно отчитащо устройство.

MET трансфосфорилиращо изпитание

Това изпитание се използва за измерване фосфотирозиновите нива на поли(глутаминова киселина : тирозин (4:1)) субстрат като средство за идентифициране на агонисти/антагонисти на met трансфосфорилирането на субстрата.

Материали и реактиви:

1. Coming-ови 96-кладенчеви ELISA плаки Corning Catalog # 2585-96.

2. Полини, tyr) 4:1 Sigma, Cat. No ; P 0275.

3. PBS, Gibco Catalog # 450 - 1300EB

4. 50 mM HEPES

5. Блокиращ буфер: разтварят се 25 г говежди серумен албумин, Sigma Cat. No А-7888, в 500 мл PBS, филтрува се през 4 мкм филтър.

6. Пречистен GST слят протеин съдържащ Met киназния домен, Sugen, Inc.

7. TBST буфер.

8. 10 % воден (MilliQue Н₂О) DMSO.

133

9. 10 мМ воден (dH₂O) аденозин-5’- трифосфат, Sigma Cat. No D-5394.

10. 2 x киназно разреден буфер: за 100 мл се смесват 10 мл IM HEPES при pH 7.5 с 0.4 мл 5 % BSA/PBS, 0.2 мл 0.1 М натриев ортованадат и 1 мл 5 М ватриев хлорид в 88.4 мл dH₂O.

11. 4 х АТР реакционна смес: за 10 мл се смесват 0.4 мл 1 М манганов хлорид и 0.02 мл 0.1 М АТР в 9.56 мл dH₂O

12. 4 х отрицатална контролна смес: за 10 мл се смесват 0.4 мл 1М манганов хлорид в 9.6 мл dH₂O.

13. NUNC 96-кладенчеви V дънни полипропиленови плаки, Applied Scientific Catalog # S-72092.

14. 500 мМ EDTA

15. Разреждащ буфер за антитела: за 100 мл се смесват 10 мл 5 % BSA/PBS, 0.5 мл Carnation Instant Milk® в PBS и 0.1 мл 0.1 М натриев ортованадат в 88.4 мл TEST.

16. Заешки поликлонален антофосфотирозиново антителоо, Sugen, Inc.

17. Кози анти-заешко хряново пероксидазно конюгирано антитело, Biosource, Inc.

18. ABST разтвор: за 1 л се смесват 19.21 г лимонена киселина, 35.49 г Na₂HPO₄ и 500 мг ABTS с достатъчно dH₂O за да се получи 1 л.

19. ABTS/H₂O₂: смесват се 15 мл ABTS разтвор с 2 мкл Н₂О₂ 5 минути преди употреба.

20. 0.2MHCI.

Начин на работа:

1. Покриват се Corning-ови ELISA плаки с 2 мкг полипи, tyr) в 100 мкл PBS. Съхранява се една нощ при 4°С.

2. Плаката се блокира с 150 мкл 5 % BSA/PBS за 60 минути.

3. Плаката се промива два пъти с PBS, веднаж с 50 мМ HEPES буфер при pH 7.4.

134

4. Прибавят се 50 мкл от разредената киназа към всички кладенчета. (Пречистената киназа се разрежда с киназен разреждащ разтвор. Крайната концентрация трябва да бъде 10 нг/кладенче.)

5. Прибавят се 25 мкл от изпитваното съединение (в 4 % DMSO) или DMSO самостоятелно (4 % в dH₂O) за контролната плака.

6. Инкубира се сместа киназа/съединение 15 минути.

7. Прибавят се 25 мкл 40 мМ МпС1₂ към отрицателните контролни кладенчета.

8. Прибавят се по 25 мкл АТР/МпС1₂ смес към всички други w кладенчета с изключение на отрицателните контроли. Инкубира се 5 минути.

9. Прибавят се 25 мкл мМ EDTA за спиране на реакцията.

10. Плаката се промива 3 х с TBST.

11. Прибавят се 100 мкл заешки поликлонален анти-Ptyr разреден 1:10 000 в разреждащ буфер за антитела към всеко от кладенчетата. Инкубира се чрез разклащане при стайна температура за един час.

12. Плаката се промива 3 х с ТВ ST.

13. Разрежда се Biosource хряново пероксидазно конюгирано антизаешко антитело 1: 6 000 в разреждащ буфер за антитела. Прибавят се 100 мкл на кладенче и се инкубира при стайна температура при разклащане за един час.

14. Плаката се промива 1 х с PBS.

15. Прибавят се 100 мкл АВТ8/Н₂О₂разтвор към всяко кладенче.

16. Ако е необходимо, спира се развитието на реакцията чрез прибавяне на 100 мкл 0.2 М HCI за кладенче.

17. Плаката се отчита на Dynatech MR7000 ELISA reader с опитен филтър при 410 нМ и сравнителен филтър при 630 нМ.

IGF-1 трансфосфорилиращо изпитание

135

Това изпитание се използва за измерване на фосфортирозиновото ниво в полу(глутаминова коиселина : тирозин) (4:1) за идентифициране на агонисти/антагонисти на gst-IGF-lτpaнcφocφopилиpaнe на субстрат.

Материали и реактиви:

1. Coming-ови 96-кладенчеви ELISA плаки

2. Полини, tyr) 4:1 Sigma, Cat. No ; P 0275.

3. PBS, Gibco Catalog # 450 - 1300EB

4. 50 мМ HEPES

5. TBB блокиращ буфер: за 1 л се смесват 100 г BSA, 12.1 г TRIS (pH 7.5), 58.44 г натриев хлорид и 10 мл 1 % TWEEN-20.

6. Пречистен GST слят протеин съдържащ IGF-1 киназен домен (Sugen, Inc.)

7. TBST буфер: за 1 л се смесват 6.057 г TRIS, 8.766 г натриев хлорид и 0.5 мл TWEEN-20 с достатъчно dH₂O за да се получи 1 л.

8. DMSO в Milli-Que Н₂О.

9. 10 мМ АТР в dH₂O

10. 2 х киназен разреждащ буфер: за 100 мл се смесват 10 мл 1М HEPES (pH 7.5), 0.4 мл 5 % Tris, разтварят се 25 г говежди серумен албумин, γ Sigma Cat. No А-7888, в 500 мл PBS, филтрува се през 4 мкм филтър.

11. 4хАТР реакционна смес: за 10 мл се смесват 0.4 мл 1 М манганов хлорид и 0.02 мл 0.1 М АТР в 9.56 мл dH₂O

12. 4х отрицатална контролна смес: за 10 мл се смесват 0.4 мл 1М манганов хлорид в 9.60 мл dH₂O.

13. NUNC 96-кладенчеви V дънни полипропиленови плаки,

14. 500 мМ EDTA в dH₂O.

15. разреждащ буфер за антитела: за 100 мл се смесват 10 мл 5 % BSA в PBS, 0.5 мл 5 % Carnation Instant обезмаслено Milk® в PBS и 0.1 мл 0.1 М натриев ортованадат в 88.4 мл TBST.

136

18. AB ST разтвор

19. ABTS/H2O2: смесват се 15 мл ABTS разтвор с 2 мкл Н₂О₂ 5 минути преди употреба.

20. 0.2 М HCI.

Начин на работа:

w 1. Покриват се Corning-ови ELISA плаки с 2 мкг полипи, tyr) 4:1 (Sigma РО275) в 100 мкл PBS. Съхранява се една нощ при 4°С.

2. Плаката се промива един път с PBS.

3. Прибавят се 100 мкл от ТВВ брокиращ буфер към всеко кладенче. Плаката се инкубира за 1 час при разклащане при стайна температура.

4. Плаката се промива веднаж с PBS и след това два пъти с 50 мМ HEPES буфер pH 7.5.

5. Прибавят се 25 мкл от изпитваното съединение в 4 % DMSO (получено чрез разреждане на основен разтвор от 10 мМ изпитвано съединение в 100 % DMSO с dH₂O) към плаката.

6. Прибавят се 10.0 нг GST-IGF-1 киназа в 50 мкл киназен разреждащ буфер) към всеко от кладенчетата.

7. Стартира се киназната реакция чрез прибавяне на 25 мкл 4х АТР реакционна смес към всички опитни кладенчета и положителни контролни кладенчета. Прибавят се 25 мкл 4 х отрицателна контролна смес към всички отрицателни контролни кладенчета. Инкубира се 10 минути при разклащане при стайна температура.

8. Прибавят се 25 мкл 0.5 EDTA (pH 8.0) към всички кладенчета.

9. Плаката се промива 4 х с TBST.

137

10. Прибавя заешки поликлонален анти-фосфотирозинов антисерум при разреждане 1:10 000 в 100 мкл разреждащ буфер за антитела към всеко от кладенчетата. Инкубира се чрез разклащане при стайна температура за един час.

11. Плаката се промива както в етап 9.

12. Прибавя се Biosource анти-заешко HRP при разреждане 1:10 000 в разреждащ буфер за антитела на всяко кладенче. Инкубира се при стайна температура и разклащане за един час.

13. Плаката се промива както в етап 9, последвано от една промивка с PBS за да се намалят мехурчетата и излишъкът от TWEEN-20.

14. Проявява се чрез прибавяне на 100 мкл/кладенче ABTS/H₂O2pa3TBop.

15. След около 5 минути се отчита на ELISA reader с опитен филтър при 410 нМ и сравнителен филтър при 630 нМ.

BRDU инкорпориращо изпитание

Следните изпитания използват клетки, обработени да експресират подбран рецептор и след това се отчита ефекта от представляващото интерес съединение върху активността на лиганд-индуцирана ДНК синтеза чрез определяне BRDU инкорпорирането в ДНК.

Следните материали, реактиви и процедури са общи за всяко от следните BrdU инкорпориращи изпитания. Вариантите при отделните изпитания са отбелязани.

Материали и реактиви:

1. Подходящ лиганд

2. Подходящи обработени клетки.

3. BrdU бележещ реактив: 10 мМ в PBS 9рН 7.4) (Boehringer Mannheim, Germany).

138

4. FixDenat: фиксиращ разтвор (готов за употреба) (Boehringer Mannheim, Germany).

5. Анти-BrdU-POD: мишо моноклонално антитело конюгирано с пероксидаза (Boehringer Mannheim, Germany).

6. ТМВ субстратен разтвор: тетраметилбензидин (ТМВ, Boehringer Mannheim, Germany).

7. PBS промиващ разтвор: 1 х PBS, pH 7.4

8. Албумин, говежди (BSA), фракция V прах (Sigma Chemical Co., USA).

Обща методика:

1. Клетките се засаждат при 8000 клетки/кладенче в 10 % CS, 2 мМ Gin в DMEM в 96 кладенчева плака. Клетките се инкубират една нощ при 37° С в 5 % СО₂.

2. След 24 часа, клетките се промиват с PBS и след това се оставят да изгладняват в среда свободна от серум (0 % CS DMEM с 0.1 % BSA) в продължение на 24 часа.

3. На 3-тия ден, се прибавят подходящия лиганд и изпитваното съединение едновременно. Отрицателните контролни кладенчета получават свободен от серум DMEM само с 0.1 % BSA; положителните контролни клетки получават лиганда, но не и изпитвано съединение. Изпитваните съединения се получават в свободен от серум DMEM с лиганд в 96 кладенчева плака и при серийно разреждане за 7 опитни концентрации.

4. След 18 часа лигандно активиране, се прибавя разреден BrdU бележещ реактив (1:100 в DMEM, 0.1 % BSA) и клетките се инкубират с BrdU (крайна концентрация =10 мкМ) за 1.5 часа.

5. След инкубиране с бележещ реактив, средата се отстранява чрез отдекантирване и поливане на обърнатата плака върху книжна кърпа. Прибавя се разтвор на FixDenat (50 мкл/кладенче) и плаките се инкубират при стайна температура 45 минути върху клатачна машина за плаки.

139

6. Разтворът на FixDenat се отстранява цялостно чрез отдекантирване и попиване на обърнатата плака върху книжна кърпа. Прибавя се мляко (5 % дехидратирано мляко в PBS, 200мкл/кладенче) като блокиращ разтвор и плаката се инкубира 30 минути при стайна температура върху клатачна машина за плаки.

7. Блокиращият разтвор се отстранява чрез отдекантирване и кладенчетата се промиват веднаж с PBS. Анти-BrdU-POD разтвор (1:200 разреден в PBS, 1 % BSA) се прибавя (50 мкл/кладенче) и плаката се инкубира 90 минути при стайна температура върху клатачна машина за плаки.

8. Конюгата с антитела се отстранява напълно чрез отдекантирване и промиване на кладенчетата 5 пъти с PBS и плаката се подсушава чрез обръщане и попиване върху книжна кърпа.

9. ТМВ субстратния разтвор се прибавя (100 мкл/кладенче) и се инкубира 20 минути при стайна температура върху клатачна машина за плаки докато оцветяването е достатъчно за фотометрично проследяване.

10. Абсорбиранто от примерите се измерва при 410 нм (по начин “двойна дължина на вълната” с филтър отчитащ при 490 нм и сравнителна дължина на вълната) на Dynatech MR7000 ELISA reader.

EGF- индуцирано BrdU инкорпориращо изпитание

Материали и реактиви:

1. Миши EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3J3/EGFRc7.

ECF-индуцирано Her-2-водено BrdU инкорпориращо изпитание

Материали и реактиви:

1. Миши EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr c Her-2 киназен домен)

ECF-индуцирано Нег-4-водено BrdU инкорпориращо изпитание

140

Материали и реактиви:

1. Миши EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).

2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr c Her-4 киназен домен).

PDGF-индуцирано BrdU инкорпориращо изпитание

Материали и реактиви:

1. Човешки PDGF В/В (Boehringer Mannheim, Germany)

2. 3T3/EGFRc7.

FGF-индуцирано BrdU инкорпориращо изпитание

Материали и реактиви:

1. Човешки FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).

2. 3T3c7/EGFr.

IGF1- индуцирано BrdU инкорпориращо изпитание

Материали и реактиви:

1. Човешки, рекомбинантен (G511, Promega Corp., USA)

2. ЗТЗ/IGFlr.

Инсулин-индуцирано BrdU инкорпориращо изпитание

Материали и реактиви:

1. Инсулин, кристален, говежди, цинк (13007, Gibco BRL,USA).

2. ЗТЗ/Н25.

HGF-индуцирано BrdU инкорпориращо изпитание

Материали и реактиви:

1. Рекомбинантен човешки HGF (Cat. No. 249-HG, R&D Systems, Imc., USA).

2. BxPC-3 клетки (АТСС CRL-1687).

Начин на работа:

1. Клетките се посяват при 9000 клетки/кладенче в RPMI 10 % FBS в кладенчева плака. Клетките се инкубират една нощ при 37° С в 5 % СО₂.

2. След 24 часа клетките се промиват с PBS и се оставят на серумен глад в 100 мкл свободна от серум среда (RPMI с 0.1 % BSA) за 24 часа.

141

3. На ден 3-ти, се прибавят към клетките 25 мкл съдържащ лиганд (приготвен при 1 мкг/мл RPMI с 0.1 % BSA; крайна коанентрация на HGF е 200 нг/мл) и се прибавят изпитваните съединения към клетките. Отрицателните контролни кладенчета получават 25 мкл свободен от серум RPMI само с 0.1 % BSA; положителните контролни клетки получават лиганда (HGF), но не и изпитвани съединения. Изпитваните съединения се приготвят 5 кратно по-концентрирани от крайната им концентрация в свободен от серум RPMI с лиганд в 96-клраденчева плака и се разреждат серийно за да се получат 7 изпитвани концентрации. Обикновено, найвисоката крайна концентрация от изпитвано съединение е 100 мМ и се използват 1:3 разреждания (т.е. крайната изпитвана концентрация е в границите 0.137- 100 нМ).

4. След 18 часа на лигандно активиране, към кладенчетата се прибавят по 12.5 мкл от разредения BrdU бележещ реактив (1:100 в RPMI с 0.1 % BSA) и клетките се инкубират с BrdU (крайната концентрация е 10 мкМ) за 1 час.

5. Същото както в общата методика.

6. Същото както в общата методика.

7. Блокиращият разтвор се отстранява чрез отдекантирване и кладенчетата се промиват веднаж с PBS. Анти-BrdU-POD разтвор (1:100 разреден в PBS, 1 % BSA) се прибавя (100 мкл/кладенче) и плаката се инкубира 90 минути при стайна температура върху клатачна машина за плаки.

8. Същото както в общата методика.

9. Същото както в общата методика.

10. Същото както в общата методика.

HUV-EC-C- изпитание

142

J*⁴

Чй»*

Това изпитание се използва за измерване на активността на съединенията срещу PDGF-R, FGF-R, VEGF, afFGF или Flk-1/KDR, всички те естествено експресирани от HUV-EC клетки.

Ден 0

1. Промиват се трипсинирани HUV-EC-C клетки (човешки умбиликални венозни ендотелни клетки, American Type Culture Collection, Catalogue No. 1730 CRL). Промива се c Dulbecco’s фосфат-буфериран солев разтвор (D-PBS, получен от Gibco BRL, Catalogue No. 14190-029) два пъти при около 1 мл/10 см тъканна културална колба. Трипсинира се с 0.05 % трипсин - EDTA в не-ензимен клетъчен дисоцииращ разтвор (Sigma Chemical Company, Catalogue No. C-1544). 0.05 % трипсин се получава чрез разреждане 0.25 % трипсин/1 мМ EDTA (Gibco, Catalogue No. 25200 - 049) в клетъчния дисоцииращ разтвор. Трипсинира се с около 1 мл/25 - 30 см тъканна културална колба за около 5 минути при 37° С. След като клетките се отделят от колбата се прибавя равен обем от изпитваната среда и се пренасят в 50 мл стерилна центрофугална епруветка (Fisher Scientific, Catalogue No. 05-539-6).

2. Клетките се промиват с около 35 мл изпитателна среда в 50 мл стерилна центрофугална епруветка чрез прибавяне на изпитателна среда, центрофугира се 10 минути при приблизително 200 х г, аспирира се супернатантата и отново се суспендира с 35 мл D-PBS. Промиването се повтаря още два пъти с D-PBS, клетките отново се суспендират в около 1 мл изпитателна среда/15 см тъканна културална колба. Изпитателната среда се състои от 0.5 % топлинно инактивиран зародишен говежди серум. Клетките се преброяват с Coulter Couter® (Coulter Electronics, Inc.) и се прибавя изпитателна среда към клетките за да се получи концентрация от 0.8 - 1.0 х 10⁵ клетки/мл.

143

3. Клетките се прибавят към 96-кладенчеви плаки с плоско дъно при 100 мкл/кладенче или 0.8 - 1.0 х 10⁴ клетки/кладенче, инкубират се около 24 часа при 37° С, 5 % СО₂.

Ден 1

1. Правят се двукратни разреждания в отделни 96-кладенчеви плаки, обикновено 50 мкМ надолу до 0 мкМ. Използва се същата изпитателна среда както тази в ден 0, етап 2 от по-горе. Разрежданията се правят чрез прибавяне на 90 мкл/кладенче от изпитваното съединение при 200 мкМ (4 х крайната кладенчева концентрация) до най-горното кладенче на определена колонка на плаката. Тъй като основното изпитвано съединение е обикновено 20 мМ в DMSO, 200 мкМ лекарствена концентрация съдържа 2 % DMSO.

Разредителят, с който се долива до 2 % DMSO, е изпитателна среда (F12K + 0.5 % зародишен говежди серум) се използва като разтворител за разрежданията на изпитваното съединение с оглед да се разреди изпитваното съединение, но да се запази концентрацията на DMSO постоянна. Този разредител се прибавя към останалите кладенчета в колоната при 60 мкл/кладенче. Взимат се 60 мкл от 120-те мкл на 200 мкМ разреждане на изпитваното съединение в най-горното кладенче на колонката и се смесва с 60 мкл от второто кладенче на колонката. Взимат се 60 мкл от това кладенче и се смесват с 60 мкл от третото кладенче на колонката и така докато се приключи двукратното разреждане (титруване). Когато следващото до последното кладенче се смесят, взимат се 60 мкл от 120-те мкл на това кладенче и се изхварлят. Последното кладенче се оставя с 60 мкл DMSO/разреждаща среда като контрола, в която не се съдържа от изпитваното съединение. Правят се 9 колонки от титрувани изпитвани съединения, достатъчно за трикратните кладенчета за всяко от: (1) VEGF (получен от Pepro Tech Inc., Catalogue No. 100 - 200, (2) ендотелен клетъчен растежен фактор (ECGF) (известен също като киселинен фибробластен растежен фактор или aFGF) (получен от Boehringer Mannheim Biochemica,

144

Catalogue No. 1439 600) или (3) човешки PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Germany) и изпитателна среда за контрола. ECGF се получава като препарат с натриев хепарин.

2. Пренасят се 50 мкл/кладенче от разрежданията на изпитваното съединение в 96-кладенчевите изпитателни плаки съдържащи 0.8 - 1.0 х 10⁴клетки/100 мкл/кладенче от HUV-EC-C клетките от ден 0 и се инкубират около 2 часа при 37° С, 5 % СО2.

3. В крикратното повторение се прибавят 50 мкл/кладенче от 80 мкг/кладенче VEGF, 20 нг/мл ECGF или контролна среда към всяко от изпитваните съединения. Както при изпитваните съединения, концентрациите на растежния фактор са 4 х желаната крайна концентрация. Използва се изпитателната среда от ден 0, етап 2 за да се направят концентрациите на растежните фактори. Инкубира се приблизително 24 часа при 37° С, 5 % СО2. Всяко кладенче ще съдържа 50 мкл от разрежданията на изпитваното съединение, 50 мкл растежен фактор или среда и 100 мкл клетки, което прави общо 200 мкл/кладенче. Така 4 х концентрации на изпитвано съединение и растежните фактори стават 1 х всичко прибавено към кладенчетата.

Ден 2

1. Прибавят се ³Н-тимидин (Amersham, Catalogue TRK-686) при 1 мкС1/ кладенче (10 мкл/кладенче от 100 мкС1/мл разтвор получен в RPMI среда + 10 % топлинно инактивиран зародишен говежди серум) и се инкубира приблизително 24 часа при 37° С, 5 % СО₂. RPMI се получава от Gibco BRL, Catalogue No. 11875-051.

ДенЗ

Плаките за замразяват за една нощ при -20° С.

Ден 4

Плаките се размразяват и се реколтират с 96-кладенчев Tomtec Harvester 96® върху филтърни подложки (Wallac, Catalogue No. 1205-401),

145 прочитат се бройките с помощта на Wallac Betaplate ™ течен сцинтилационен преброител.

Биоизпитанията бяха използвани или могат да се използват за оценяване на съединенията, които са описани подробно по-долу. Съединенията 1 - 9 са изпитани и са намерени за активни при flkGST, FGFR1 и PDGF изпитанията.

IN VIVO животински модели

Ксенографтски животински модели

Способността на човешки тумори за растат като ксенографти при атимични мишки (например Balb/c, nu/nu) осигурява полезен in vivo модел за изследване на биологичната реакция към лечения на човешки тумори. След първата успешна ксенотрансплантация на човешки тумори върху атимични мишки (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758 760) много различни човешки туморни клетъчни линии (например на гърдата, на белия дроб, генитопикочни, стомашночревни-интестинални, на главата и врата, глиобластома, на костите и злокачествени меланоми) са трансплантирани и растат успешно в голи мишки. Използвани са следните изпитания за определяне нивото на активност, специфичността и ефекта на различните съединения от настоящето изобретение. Три главни типа изпитания са приложими за оценяване на съединенията: клетъчно/каталитично, клетъчно/биологично и in vivo. Обект на клетъчно/каталитични изпитания е да се определи ефекта на съединението върху способността на ТК да фосфорилира тирозините върху известен субстрат в клетката. Предмет на клетъчно/биологичното изпитание е да се определи ефекта на съединението върху биологичната реакция стимулирана от ТК в клетката. Обект на in vivo изпитанието е да се определи ефекта на съединението в животински модел с конкретно нарушение като рак.

Подходящи клетъчни линии за подкожни ксенографтски експерименти включват С6 клетки (glioma, ATCC # CCL, 107), А375 клетки

146 (Melanoma, АТСС # CRL 1619), A431 клетки (епидермален карцином, АТСС # CRL 1555), Calu 6 клетки (белодробни, АТСС # НТВ 56), РСЗ клетки (простатни, АТСС # CRL 1435), SKOV3TP5 клетки и NIH ЗТЗ фибробласти, генетично обработени да свръхекспресират EGFR, PDGFR, IGF-1R или всяка друга опитна киназа. Може да се използва следния начин на работа за провеждането на ксенографтски експерименти:

Женски атимични мишки (BALB/c, nu/nu) се получават от Simonsen Laboratories (Gilroy, СА). Всички животни се държат при условия на чисто помещение в микроизолирани кафези с Alpha-dri постелка. Те получава стерилна храна за гризачи и вода по желание.

Клетъчните линии се отглеждат в подходяща среда (например МЕМ, DMEM, Ham’s F10 или Ham’s Fl2 плюс 5% - 10 % зародишен говежди серум (FBS) и 2 мМ глутамин (GLN). Всички клетъчни култрални среди, глутамина и зародишния говежди серум се закупуват от Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), освен ако е казано друго. Всички клетки растат във влажна атмосфера на 90 - 95 % въздух и 5 - 10 % СО₂ при 37°С. Всички клетъчни линии рутинно се субкултивират два пъти седмично и са негативни за микоплазма, както се определя чрез Mycotect метода (Gibco).

Клетките се реколтират при или близко до конфлюентност с 0.05 % трипсин-EDTA и се пелетират при 450 х г за 10 мин. Пелетите се суспендират отново в стерилен PBS или в среда (без FBS) до определена концентрация и клетките се имплантират в задния хълбок на мишките (8-10 мишки в група, 2 - 10 х 10⁶ клетки/животно). Измерва се туморния растеж в продължение на 3 до 6 седмици като се използва шублер. Обемите на туморите се изчисляват от дължината х ширината и х височината, освен ако е казано друго. Р стойностите се изчисляват като се използва t-теста на Student. Изпитваните съединения в 50 - 100 мкл пълнител (DMSO или VPD:D5W) могат да се доставят чрез интраперитонеално инжектиране при

147 различни концентрации, обикновено като се започне в ден първи след инплантирането.

Тумор инвазивен модел

Следният тумор инвазивен модел е разработен и може да се използва за оценяване на лечебната стойност и ефективност на съединенията, идентифицирани като селективно инхибиращи KDR/FLK-1 рецептора.

Начин на работа:

Голи мишки на възраст 8 седмици (женски) (Simonsen Inc.) се използват като експериментални животни. Имплантирането на туморните V. клетки може да се осъществи чрез ламинарно вливане. За упойко се прилага интраперитонеално смес от ксилазин/кетамин (100 мг/кг кетамин и 5 мг/кг ксилазин). Прави се разрез по средната линия за да се изложи абдоминалната кухина (приблизително 1.5 см по дължина) за инжектиране на 10 туморни клетки в 100 мкл среда. Клетките се инжектират или в дуоденалния лоб на панкреаса или под серозата на дебелото черво. Перитонеумът и мускулите са затварят с 6-0 копринен непрекъснат шев и кожата се затваря чрез използване на щипки за рана. Животните се наблюдават ежедневно.

Анализ

След 2-6 седмици, в зависимост от общия вид на животните, мишките се убиват и туморните метастази към различни органи (бял дроб, черен дроб, мозък, стомах, далак, сърце, мускули) се изрязват и анализират (измерват се размера на тумора, степента на инвазиране, имунохимияна, определя се in situ хибридизацията и т.н.).

С-KIT изпитание

Това изпитание се използва за проследяване нивото на c-kit тирозиновото фосфорилиране.

МО7Е (човешка акутна миелоидна левкемия) клетки се оставят на серумен глад една нощ в 0.1 % серум. Клетките са пре-третирани със съединението (конкурентно на серумното гладуване), преди да се лигандно

148 стимулират. Клетките се стимулират с 250 нг/мл rh-SCF за 15 минути. След стимулирането, клетките се лизират и имунопреципитират с анти- c-kit антитело. Фосфотирозинови и протеинови нива се определят чрез Western blotting.

МТТ пролиферативно изпитание

МО7Е клетки се остават на серумен глад и се пре-третират със съединение, както е описано при експериментите за фосфорилиране. Клетките се посаждат 4 х 10⁵ клетки/кладенче в 96 кладенчева паничка в 100 мкл RPMI + 10 % серум. rh-SCF (100 нг/мл) се прибавя и паничката се инкубира 48 часа. След 48 часа се прибавя 10 мкл 5 мг/мл МТТ (3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолов бромид) и се остава да се инкубира 4 часа. Кисел изопропанол (100 мкл 0.04N HCI в изопропанол) се прибавя и се измерва оптичната плътност при дължина на вълната 550 нм.

Апоптозисно изпитание

МО7Е клетки се инкубират +/- SCF и +/- съединение в 10 % FBS с rhGM-CSF (10 нг/мл) и rh-IL-3 (10 нг/мл). За измерване на активираната каспаза-3, пробите се промиват с PBS и се правят пропускливи с леденостуден 70 % етанол. След това клетките се оцветяват с РЕ-конюгирана поликлонална заешка анти-активна каспаза-3 и се анализират чрез FACS. За измервание на отцепената PARP, пробите се лизират и анализират чрез Western blotting с анти- PARP антитело.

Допълнителни изпитания

Допълнителни изпитания, които могат да се използват за оценяване на съединенията от настоящето изобретение, без ограничения, са bio-flk-1 изпитание, EGF рецепторно - HER2 химерично рецепторно изпитание в цялостни клетки, bio-scrc изпитание, bio-lck изпитание и изпитание за измерванена фосфорилиращата функция на raf. Начините на работа при всички тези изпитания могат да се намерят в U. S. Application Ser. No. 09/099,842, включено тук за справка, включително и графиките към него.

149

Измерване на клетъчната токсичност

Лечебните съединения трябва да бъдат по-силни в активността си да инхибират рецепторната тирозин киназа отколкото в проявяването на цитотоксичен ефект. Мярка за ефективността и клетъчната токсичност на дадено съединение може да се получи чрез определяне на лечебния индекс, т.е. IC50/LD50. IC50 е необходимата доза за постигане на 50 % инхибиране и може да се измери при използването на стандартни техники като тези описани тук. LD₅₀ е дозата, която дава 50 % токсичност и може да се определи по стандартни техники както и съгласно Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55 - 63), чрез измерване на освободеното количеството LDH (Korziewski and Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64: 313, Decker and Lohmann - Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61) или чрез измерване на леталната доза при животински модели. Предпочитат се съединения с голям лечебен индекс. Лечебният индекс трябва да бъде поголям от 2, за предпочитане най-малко 10, по-предпочетено най-малко 50.

Специалист от областта лесно ще приеме, че настоящето изобретение е добре адаптирано за провеждане на предметите и за постигане на цитираните цели и предимства. Молекулните комплекси и методите, процедурите, леченията, конкретни съединения, описани тук са дадени само като представителни и като предпочитани изпълнения, без да ограничават обхвата на изобретението. Промени в него и други приложения ще са възможне за специалистите от областта и те също са включени в духа на изобретението съгласно обхвата на претенциите.

Също така е видно за специалистите от областта, че вариране на заместителите и модификации могат да се направят в описаното тук изобретение, без да се излиза извън обхвата му.

Всички патенти и публикации споменати тук дават указания на специалистите от областта за нивото на изобретението, към което то принадлежи. Всички патенти и публикации са включени реферативно.

150

Описаното тук илюстративно изобретение може да се практикува в отсъствието на всякакъв елемент или елементи, ограничение или ограничения, които не са конкретно описани тук. Така например във всеки момент тук всеки от термините “включващ” “състоящ се предимно от” може да се замени с един от двата термина. Термините и изразите използвани тук, са използвани с описателна цел, а не ограничаващо, и всякакви модификации са възможни в обхвата на претендираното изобретение. Така трябва да се подразбира, че въпреки че настоящето изобретение е конкретно описано с предпочитани изпълнения и евентуални характеристики, могат да се правят различни вариации на концепциите тук, които се смятат, че са в обхвата на изобретението, съгласно определенията в приложените претенции.

В допълнение, където са описани характеристики или аспекти на изобретението в термините на Markush групите, специалистите ще знаят, че изобретението е с това описано с термини на всеки отделен член или подгрупа от членове на Markush групата. Например, ако X е описан като подбран от група състояща се от бром, хлор и йод, претенциите за X като бром и претенциите за X като бром и хлор са напълно описани.

Други изпълнения са в следващите претенции.

Claims

Патентни претенции

1. Съединение с формула (I):

в която:

R¹ е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, халогеналкокси, циклоалкил, хетероалицикличен радикал, хидрокси, алкокси, -С(О) R⁸, -NR⁹R¹⁰ и -C(O)NR¹²R¹³,

R е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, трихалогенметил, хидрокси, алкокси, циано, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -С(О) R⁸, -S(O)2R⁹R¹⁰ и -SO2R¹⁴ (в която R¹⁴ е алкил, арил, аралкил, хетероарил и хетероарилалкил);

R³, R⁴ и R⁵ са независимо водород или алкил;

Z означава арил, хетероарил, хетероцикъл или -NR¹⁵R¹⁶, в която R¹⁵ и R¹⁶ са независимо един от друг водород или алкил; или R¹⁵ и R¹⁶ заедно с азотния атом към който са свързани образуват хетероциклоамино група;

R⁶ е подбран от група състояща се от водород или алкил;

R⁷ е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -С(О) R¹⁷ съгласно определението по-долу;

R⁸ е подбран от група състояща се от хидрокси, алкокси и арилокси;

R⁹ и R¹⁰ са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил, цианоалкил, циклоалкил, арил и хетероарил или

R⁹ и R¹⁰ са комбинирани за да образват хетероциклоамино група;

R¹² и R¹³ са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил, хидроксиалкил и арил или R¹² и R¹³ заедно с азотния атом към който са прикрепени образуват хетероциклоамино група;

152

R е подбран от група състояща се от алкил, циклоалкил, арил, хидрокси и хетероарил;

или тяхни фармацевтично приемливи соли.
2. Съединение съгласно претенция 1, в което:

R¹ е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, циклоалкил, хетероалицикличен радикал, хидрокси, алкокси, -C(O)R⁸, NR⁹R¹⁰ и -C(O)NR¹²R¹³,

R е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, трихалогенметил, хидрокси, алкокси, циано, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)2R⁹R¹⁰ и -SO2R¹⁴ (в която R¹⁴ е алкил, арил, аралкил, хетероарил и хетероарилалкил);

R³, R⁴ и R⁵ са независимо водород или алкил;

Z означава арил, хетероарил, хетероцикъл или -NR¹⁵R¹⁶, в която R¹⁵ и R¹⁶ са независимо един от друг водород или алкил; или R¹⁵ и R¹⁶ заедно с азотния атом към който са свързани образуват хетероциклоамино група;

R⁶ е подбран от група състояща се от водород или алкил;

R е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -С(О) R съгласно определението по-долу;

о

R е подбран от група състояща се от хидрокси, алкокси и арилокси;

R⁹ и R¹⁰ са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил, цианоалкил, циклоалкил, арил и хетероарил или

R⁹ и R¹⁰ са комбинирани за да образват хетероциклоамино група;

12 13

R и R са независимо подбрани от група състояща се от водород,

12 13

R и R са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил, хидроксиалкил и арил или R¹² и R¹³ заедно с азотния атом към който са прикрепени образуват хетероциклоамино група;

R е подбран от група състояща се от алкил, циклоалкил, арил, хидрокси и хетероарил;

или тяхни фармацевтично приемливи соли.

153
3. Съединение или сол съгласно претенция 1, където съединението е подбрано от група състояща се от:

Съед Структура

No.

Наименование (З-Диетиламино-2-хидрокси-пропил) амид на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3 -илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-3 -карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-флуоро-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-(3 )-илиденметил] -

2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидро-индол-(3)илиденметил]- 1Н-пирол-3карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-хлоро-2-оксо-

1.2- дихидро-индол-(37)илиденметил] -2,4-диметил-1 Н-пирол-

З-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-бромо-2-оксо-

1.2- дихидро-индол-илиденметил] -2,4диметил-1 Н-пирол-3-карбоксилна киселина

154 (2-Хидрокси-3-[ 1,2,3]триазол-1 -илпропил)-амид на 2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидро-индолилиденметил]- 1Я-пирол-3карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-[1,2,3]триазол-1-илпропил)-амид на 5-[5-флуоро-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-илиденметил ] -2,4диметил- 1Я-пирол-3-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-[ 1,2,3]1риазол-1 -илпропил)-амид на 5-[5-хлоро-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-илиденметил] -2,4диметил- 1Я-пирол-3-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-[ 1,2,3]триазол-1 -илпропил)-амид на 5-[5-бромо-2-оксо-

1,2-дихидро-индол-илиденметил]-2,4диметил- 1Я-пирол-3 -карбоксилна киселина

3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5 метил-3 -фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен}-2-оксо-Г4-фенил-2,3дихидро-1 Н-индол-5 -карбоксамид н

155 (3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-3-фенил-1Н-пирол-2ил]метилен}-М-метил-2-оксо-2,3дихидро-1 Н-индол-5 -карбоксамид и

(3Z)-3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5 метил-3 -фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен} -1Ч-(2-хидроксиетил)-2оксо-2,3-дихидро- 1Н-ИНДОЛ-5карбоксамид

1Ч-[3-(диетиламино)-2хидроксипропил]-4-(4-флуорофенил)2-метил-5-{ [5-(морфолин-4илкарбонил)-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1 Н-пирол-3карбоксамид

3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3(4-флуорофенил)-5-метил-1 Н-пирол-2 ил]метилен}-1Ч-изопропил-2-оксо-2,3дихидро-1 Н-индол-5-карбоксамид н

156

19N

16N

17N

18N

3-{ [4-( {[3-(диетиламино)-2хидроксипропил ] амино} карбонил)-3 (2,4-дифлуорофенил)-5-метил-1Нпирол-2-ил] метилен} -2-оксо-М-фенил-

2,3-дихидро-1Н-индол-5-карбоксамид

3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3(2,4-дифлуорофенил)-5-метил-1Нпирол-2-ил]метилен} -N-(2хидроксиетил)-2-оксо-2,3-дихидро-1Ниндол-5-карбоксамид

3-{ [3-(4-цианофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил -1 Н-пирол-2-ил]метилен} -Ν,Νдиметил-2-оксо-2,3-дихидро- 1Ниндол-5-карбоксамид
4-(4-цианофенил)-И-[3-(диетиламино)-

2-хидроксипропил]-2-метил-5-{[5(морфолин-4-илкарбонил)-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1Н-пирол-3-карбоксамид

157

20N

21N

22N

23N

3-{ [3-(4-хлорофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-1 Н-пирол-2-ил]метилен} -2оксо-14-фенил-2,3-дихидро-1Н-индол-
5-карбоксамид

3-{ [3-(4-хлорофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-1 Н-пирол-2-ил]метилен} -Nизопропил-2-оксо-2,3 - дихидро-1Ниндол-5-карбоксамид

5- [(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-1Ч-[2хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-3карбоксамид

5-[5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3 -илиден)метил] -N-[2хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил ] -2,4-диметил-1 Н-пирол-3 карбоксамид

Ь1-[2-хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-5-{[2-оксо-5трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1Н-пирол-3карбоксамид

24N

158

5-[(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН индол-3 -илиден)метил] -N-[2хидрокси-3-(1Н-тетраазол-1ил)пропил] -2,4-диметил-1 Н-пирол-Зкарбоксамид

5-[(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3 -илиден)метил] -N- [2хидрокси-3-( 1 Н-тетраазол-1 ил)пропил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-3 карбоксамид

27N

N- [2-хидрокси-З -(1 Н-тетраазол-1 ил)пропил]-2,4-диметил-5-[[2-оксо-5трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} - 1Н-пирол-3карбоксамид

N- {3- [2,6-диметилморфолин-4-ил ] -2хидроксипропил} -5-[(5-флуоро-2оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил] -2,4-диметил-1 Н-пиролЗ-карбоксамид

5- [(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-Ь[-{3-[2,6диметилморфолин-4-ил] -2хидроксипропил} -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

159

Ν-{3-[2,6-диметилморфолин-4-ил]-2 хидроксипропил} -2,4-диметил-5- {[2· оксо-5-(трифлоурометокси)-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1Н-пирол-3-карбоксамид

5-[(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-Г4-[2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил] -

2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксамид

И-[2-хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил ] -

2,4-диметил-5-{(7)-[2-оксо-5(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} - 1Н-пирол-3карбоксамид

5- [(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-1Ч-[2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил] -

2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид

37Ν он

Ν-[3-(1,1 -диоксид отиоморфолин-4ил)-2-хидроксипропил]-2,4-диметил-5jo I (2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-3илиден)метил]-1 Н-пирол-Зкарбоксамид

160 ο

39Ν

Ν-[3-(1,1 -диоксидотиоморфолин-4ил)-2-хидроксипропил]-5-[(5-флоуро-

2- оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил] -2,4-диметил-1 Н-пирол-

3- карбоксамид

5-[(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден)метил]-М-[3-( 1,1диоксидотиоморфолин-4-ил)-2хидроксипропил] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

40Ν ^Вг\_ Н ΛΧ “1 7 ^н N

5-[(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-1Я-[3-(1,1 диоксидотиоморфолин-4-ил)-2хидроксипропил ] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид [2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 5-(5-флоуро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 5-(5-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 2,4-диметил-5-(2-оксо-5трифлуорометокси-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол-Зкарбоксилна киселина

161 [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 5-(5-флоуро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол- 3 -карбоксилна киселина н

[2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил ] -амид на 5-(5-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол- 3 -карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 2,4-диметил-5-(2-оксо-5трифлуорометокси-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)- 1Н-пирол-3карбоксилна киселина

4. Съединение или сол съгласно претенция 3, при което съединението е подбрано от група състояща се от:

Съед Структура

No.

Наименование (З-Диетиламино-2-хидрокси-пропил)амид на 5-(5-флуоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил- 1Н-пирол-3-карбоксилна киселина

162 (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-флуоро-2-оксо1,2-дихидро-индол-(37)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидро-индол-(37)илиденметил] -1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-(37)-илиденметил]-2,4диметил- 1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-амид на 5-[5-бромо-2-оксо1,2-дихидро-индол-(37)-илиденметил]2,4-диметил-1 Н-пиро л- 3 -карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-[1,2,3]триазол-1-илпропил)-амид на 2,4-диметил-5-[2оксо-1,2-дихидро-индол-(37)илиденметил] -1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

163 (2-Хидрокси-3-[1,2,3]триазол-1-илпропил)-амид на 5-[5-флуоро-2-оксо1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-

2.4- диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3-[1,2,3]триазол- 1-илпропил)-амид на 5-[5-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-(Зг)-илиденметил]-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина (2-Хидрокси-3“[1,2,3]триазол-1-илпропил)-амид на 5-[5-бромо-2-оксо1,2-дихидро-индол-(32)-илиденметил]-

2.4- диметил-1Я-пирол-3-карбоксилна киселина (3Z)-3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-3 -фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен}-2-оксо-1М-фенил-2,3дихидро-1 Н-индол-5 -карбоксамид

12S н

(3Z)-3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-3 -фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен} -М-метил-2-оксо-2,3дихидро-1 Н-индол-5 -карбоксамид

164

13S

14S (3Z)-3-{ [4-( {[3-(диетиламино)-2хидроксипропил ] амино} карбони л) -5 метил-3-фенил-1 Н-пирол-2ил]метилен} -М-(2-хидроксиетил)-2оксо-2,3-дихидро- 1Н-ИНД0Л-5карбоксамид

1М-[3-(диетиламино)-2хидроксипропил]-4-(4-флуорофенил)2-метил-5-{(7)-[5-(морфолин-4илкарбонил)-2-оксо-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1 Н-пирол-3 карбоксамид н

(3Z)-3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3(4-флу орофенил)-5-метил-1 Н-пирол-2ил]метилен}-1Ч-изопропил-2-оксо-2,3дихидро-1 Н-индол-5-карбоксамид (3Z)-3-{ [4-({ [3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3(2,4-дифлуорофенил)-5-метил- 1Нпирол-2-ил]метилен} -2-оксо-№-фенил2,3-дихидро-1Н-индол-5-карбоксамид

165

17S

18S

19S (3Ζ)-3-{ [4-( {[3-(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-3(2,4-дифлуорофенил)-5-метил- 1Нпирол-2-ил]метилен} -N-(2хидроксиетил)-2-оксо-2,3-дихидро-1Ниндол-5-карбоксамид (3Z)-3-{ [3-(4-цианофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил )-5 метил -1 Н-пирол-2-ил]метилен} -Ν,Νдиметил-2-оксо-2,3-дихидро-1Ниндол-5-карбоксамид

4-(4-цианофенил)-1Ч-[3-(диетиламино)-

2-хидроксипропил]-2-метил-5- {(Ζ)- [5(морфолин-4-илкарбонил)-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1Н-пирол-3-карбоксамид

20S (3Ζ)-3-{ [3-(4-хлорофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил )-5 метил-1 Н-пирол-2-ил]метилен} -2оксо-М-фенил-2,3-дихидро-1 Н-индол-

5-карбоксамид

166 (3Z)-3-{ [3-(4-хлорофенил)-4-({ [3(диетиламино)-2хидроксипропил] амино} карбонил)-5метил-1 Н-пирол-2-ил] метилен} -Nизопропил-2-оксо-2,3-дихидро-1Нин дол-5 -карбоксамид

5-[(г)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]->1-[2хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил] -2,4-диметил-1 Н-пирол-3 карбоксамид

5 - [(Z)-(5 -хлоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-1Ч-[2хидрокси-3 -(2Н-тетраазол-2ил)пропил]-2,4-диметил-1 Н-пирол-3карбоксамид

М-[2-хидрокси-3-(2Н-тетраазол-2ил)пропил] -2,4-диметил-5- {(Z)- [2оксо-5-(трифлуорометокси)-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1 Н-пирол-3-карбоксамид

5-[(г)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-М-[2хидрокси-3 -(1 Н-тетраазол-1 ил)пропил] -2,4-диметил-1 Н-пиро л-3 карбоксамид

167

5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-Ь1-[2хидрокси-3-( 1 Н-тетраазол-1 ил)пропил]-2,4-диметил-1Н-пирол-3карбоксамид

N- [2-хидрокси-3-( 1Н-тетраазол-1 ил)пропил] -2,4-диметил-5- {(Z)- [2оксо-5-(трифлуорометокси)-1,2дихидро-ЗН-индол-3-илиден]метил} 1 Н-пирол-3 -карбоксамид

Ь1-{3-[(2В.,68)-2,6-диметилморфолин-

4-ил ] -2-хидроксипропил} -5- [(Z)-(5 флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол3 -илиден)метил ] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-

ЗН-индол-3-илиден)метил]-М- {3[(2К^)-2,6-диметилморфолин-4-ил]2-хидроксипропил} -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

М-{3-[(2К,68)-2,6-диметилморфолин-

4-ил]-2-хидроксипропил} -2,4диметил-5 - {(Z)- [2-оксо-5 (трифлоурометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1 Н-пирол-3 карбоксамид

168

5-[(Ζ)-(5-φπγορο-2-οκϋο-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-?4-[(2Р)-2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил]2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксамид

5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидро-

ЗН-индол-3-илиден)метил]-М-[(2К)-2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазол идин-1 -ил )пропил ] -

2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид

М-[(2К)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимид азолидин-1 -ил )пропил ] -

2,4-диметил-5-{ (Z)-[2-okco-5(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3-илиден]метил} -1 Н-пирол-Зкарбоксамид

5-[^)-(5-флуоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-Ь1-[(28)-2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазолидин-1 -ил)пропил ] -

2,4-диметил-1 Н-пирол-З-карбоксамид

ЬГ-[(28)-2-хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоимидазол идин-1 -ил )пропил ] -

2,4-диметил-5-{ (Z)-[2-okco-5(трифлуорометокси)-1,2-дихидро-ЗНиндол-3 -илиден]метил} -1 Н-пирол-3 карбоксамид

169

5 - [(Z)-(5 -хлоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-Ь[-[(28)-2хидрокси-3-(3-метил-2,5диоксоими дазол и дин-1 -ил )пропил ] 2,4-диметил-1Н-пирол-3-карбоксамид

N- [3-( 1,1 -диоксидотиоморфолин-4ил)-2-хидроксипропил]-2,4-диметил-5[(Z)-(2-okco- 1,2-дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил]-1 Н-пирол-3карбоксамид

N- [3 -(1,1 -диоксидотиоморфолин-4ил)-2-хидроксипропил] -5- [ (Z) - (5 флоуро-2-оксо-1,2-дихидро-ЗН-индол3-илиден)метил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

5-[(г)-(5-хлоро-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-№-[3-(1,1 диоксидотиоморфолин-4-ил)-2хидроксипропил] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

5-[(г)-(5-бромо-2-оксо-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-№-[3-(1,1диоксидотиоморфолин-4-ил)-2хидроксипропил] -2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид

41S н

5 - [ (Z) - (5 -флуоро-2-оксо-1,2дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил] -N- [(28)-2-хидрокси-3 морфолин-4-илпропил]-2,4-диметил1 Н-пирол-З-карбоксамид

170

5 - [(7)-(5-флуоро-2-оксо-1,2дихидро-3 Н-индол-3 -илиден)метил] N- [(2R)-2-xh дрокси-3 -морфолин-4илпропил] -2,4-диметил-1 Н-пирол-3 карбоксамид

5-[(Ζ)-(5-χπορο-2-οκοο-1,2-дихидроЗН-индол-3-илиден)метил]-Г4-[ДО)-2хидрокси-З-морфолин-4-илпропил]-

2,4-диметил-1 Н-пирол- 3 -карбоксамид

5-[(Z)-(5-xnopo-2-OKco-l,2дихидро-ЗН-индол-Зилиден)метил]-№-[(28)-2хидрокси-З-морфолин-4илпропил]-2,4-диметил-1Нпирол-3-карбоксамид [2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 5-(5-(г)-флоуро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 5-(5-(Ζ)-χπορο-2-οκοο-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина

171 н

Η

5. Съединение с формула (1а):

[2-хидрокси-3-([1,2,3]триазоло[4,5Ь]пиридин-3-илокси)-пропил]- амид на 2,4-(7)-диметил-5-(2-оксо-5трифлуорометокси-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1 Н-пирол-3карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 5-(5-(7)-флоуро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1Н-пирол-3-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил] -амид на 5-(5-(7)-хлоро-2-оксо-1,2дихидро-индол-3-илиденметил)-2,4диметил-1 Н-пирол-З-карбоксилна киселина [2-хидрокси-3-(3-оксибензотриазол-1 -ил)-пропил]-амид на 2,4-(г)-диметил-5-(2-оксо-5трифлуорометокси-1,2-дихидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пирол-3карбоксилна киселина

172 в която:

R¹, R³, R⁴ и R⁵ означават водород;

R е флуоро и е поместен в 5-та позиция на индолиноновия пръстен и

Z означава морфолин-4-ил;

Z·

R и R са метил и стереохимията при *С е (S).
6. Съединение с формула (II):

в която:

R означава водород или алкил;

R¹ е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, халогеналкокси, циклоалкил, хетероалицикличен радикал, хидрокси, алкокси, С(О) R⁸, -NR⁹R¹⁰ и -C(O)NR¹²R¹³,

R² е подбран от група състояща се от водород, халоген, алкил, трихалогенметил, хидрокси, алкокси, циано, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, S(O)2R⁹R¹⁰ и -SO₂R¹⁴ (в която R¹⁴ е алкил, арил, аралкил, хетероарил и хетероарилалкил);

R³, R⁴ и R⁵ са независимо водород или алкил;

Z означава арил, хетероарил, хетероцикъл или -NR¹⁵R¹⁶, в която R¹⁵ и R¹⁶ са независимо един от друг водород или алкил; или R¹⁵ и R¹⁶ заедно с азотния атом към който са свързани образуват хетероциклоамино група;

173

R⁶ е подбран от група състояща се от водород или алкил;

R е подбран от група състояща се от водород, алкил, арил, хетероарил и -С(О) R¹⁷;

R⁸ е подбран от група състояща се от хидрокси, алкокси и арилокси;

R⁹ и R¹⁰ са независимо подбрани от група състояща се от водород, алкил, цианоалкил, циклоалкил, арил и хетероарил или

R⁹ и R¹⁰ са комбинирани за да образват хетероциклоамино група;

R¹² и R¹³ са независимо подбрани от група състояща се от водород, ^Λ * 17 13 w алкил, хидроксиалкил и арил или R и R заедно с азотния атом към който са прикрепени образуват хетероциклоамино група;

R¹⁷ е подбран от група състояща се от хидрокси, алкил, циклоалкил, арил и хетероарил;

или тяхни фармацевтично приемливи соли.
7. Съединение или сол съгласно претенция 6, при които съединението е подбрано от група състояща се от:

Структура

Съед н

Наименование (2-хидрокси-З -морфолин-4-илпропил)-метил-амид на 5-(5-флуоро-2оксо-1,2-дихидро-индол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пиролЗ-карбоксилна киселина ((8)-2-хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-метил-амид на 5-((Ζ)-5флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пиролЗ-карбоксилна киселина

174

Наименование

Структура

Съед No.

((К)-2-хидрокси-3-морфолин-4-илпропил)-метил-амид на 5-((Z)-5флуоро-2-оксо-1,2-дихидро-индол-Зилиденметил)-2,4-диметил-1 Н-пирол 3-карбоксилна киселина
8. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва съединение или сол съгласно претенции 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 и фармацевтично приемлив носител или пълнител.
9. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва съединение или сол съгласно претенции 5 и фармацевтично приемлив носител или пълнител.
10. Метод за модулиране на каталитичната активност на протеин киназа, включващ контактуване на тази протеин киназа със съединение или сол съгласно всяка от преитенциите 1, 3 или 6.
11. Използване съгласно претенция 10, при което протеин киназата е подбрана от група състояща се от рецепторна тирозин киназа, нерецепторна тирозин киназа и серин треонин киназа
12. Използване на съединение или сол съгласно всяка от претенциите 1 до 7 в комбинация с фармацевтично приемлив носител или пълнител за получаване на медикамент за лечение или предпазване от свързано с протеин киназа нарушение в организма.

175
13. Използване съгласно претенция 12, при което нарушението свързано с протеин киназата е подбрано от група състояща се от нарушения свързани с рецепторна тирозин киназа, нарушения свързани с не-рецепторна тирозин киназа и нарушение свързано със серин-треонин киназа.
14. Използване съгласно претенция 12, при което нарушението свързано с протеин киназата е подбрано от група състояща се от EGFR свързано нарушение, PDGFR свързано нарушение, IGFR свързано нарушение и свързано с flk нарушение.
15. Използване съгласно претенция 12, при което нарушението, свързано с протеин киназата е рак подбран от групата люспест клетъчен карцином, астроцитом, саркома на Kaposti, глиобластома, белодробен рак, рак на пикочния мехур, на главата и на врата, меланома, на яйчниците, на простатата, на гърдата, дребноклетъчен белодробен рак, глиома, колоректален рак, генитопикочен рак и стомашночревен рак.
16. Използване съгласно претенция 12, при което нарушението, свързано ’ί с протеин киназата е подбрано от групата състояща се от диабет, автоимунни нарушения, хиперпролиферативно нарушение, рестеноза, фиброза, псориаза, болестта на Heppel-Lindau, остеоартрит, ревматоиден артрит, ангиогенеза, възпалително нарушение, имунологично нарушение и сърдечносъдово нарушение.
17. Използване съгласно претенция 12, при което организма е човешки.