NO326604B1 - 3-(4-amidopyrrol-2-ylmetliden)-2-indolinonderivater, fremstilling av slike, farmasoytiske preparater inneholdende slike, metode for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro med slike forbindelser samt anvendelse av slike forbindelser for fremstilling av medikament for behandling av sykdommer hos pattedyr - Google Patents

3-(4-amidopyrrol-2-ylmetliden)-2-indolinonderivater, fremstilling av slike, farmasoytiske preparater inneholdende slike, metode for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro med slike forbindelser samt anvendelse av slike forbindelser for fremstilling av medikament for behandling av sykdommer hos pattedyr Download PDF

Info

Publication number
NO326604B1
NO326604B1 NO20033608A NO20033608A NO326604B1 NO 326604 B1 NO326604 B1 NO 326604B1 NO 20033608 A NO20033608 A NO 20033608A NO 20033608 A NO20033608 A NO 20033608A NO 326604 B1 NO326604 B1 NO 326604B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
compound
cancer
compounds
well
kinase
Prior art date
Application number
NO20033608A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20033608D0 (no
NO20033608L (no
Inventor
Peng Cho Tang
Li Sun
Chung Chen Wei
Congxin Liang
Thomas Vojkovsky
Huiping Guan
Michael A Mauragis
Jin Qingwu
Paul Herrington
Original Assignee
Sugen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sugen Inc filed Critical Sugen Inc
Publication of NO20033608D0 publication Critical patent/NO20033608D0/no
Publication of NO20033608L publication Critical patent/NO20033608L/no
Publication of NO326604B1 publication Critical patent/NO326604B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems

Description

Oppfinnelsens område.
Foreliggende oppfinnelse angår visse 3-(4-amidopyrrol-2-ylmetyliden)-2-indolinon-derivater, farmasøytiske preparater inneholdende slike, metode for å modulere den katalytsike aktiviteten til en proteinkinase in vitro med slike forbindelser samt anvendelse av slike forbindelser for fremstilling av medikament for behandling av sykdommer hos pattedyr.
Teknikkens stand
PK'er er enzymer som katalyserer fosforyleringen av hydroksygrupper på tyrosin-, serin- og treonin-rester av proteiner. Konsekvensene av denne tilsynelatende enkle aktiviteten er forbløffende; cellevekst, differensiering og proliferasjon, dvs. praktisk talt alle aspekter av celleliv avhenger på en eller måte av PK-aktivitet. Videre er unormal PK-aktivitet blitt relatert til en hærskare av lidelser, i området fra relativt ikke-livstruende sykdommer, så som psoriasis, til ekstremt virulente sykdommer, så som glioblastoma (hjernekreft).
PK'ene kan hensiktsmessig deles opp i to klasser, protein-tyrosinkinasene (PTK'er) og serin-treoninkinasene (STK'er).
Ett av de viktigste aspekter ved PTK-aktivitet er deres involvering i vekstfaktor-reseptorer. Vekstfaktor-reseptorer er celleoverflateproteiner. Når bundet av en vekstfaktor-ligand, blir vekstfaktor-reseptorer omdannet til en aktiv form som interagerer med proteiner på den indre overflaten av en cellemembran. Dette fører til fosforylering på tyrosinrester av reseptoren og andre proteiner og til dannelse inne i cellen av komplekser med en rekke cytoplasma-signalmolekyler som, i sin tur, bevirker en rekke cellulære responser, så som celledeling (proliferasjon), celledifferensiering, cellevekst, ekspresjon av metabolske effekter til det ekstracellulære mikromiljø etc. For en mer fullstendig omtale, se Schlessinger og Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992), som er innlemmet ved referanse, omfattende eventuelle tegninger, som om det var fullstendig gjengitt her.
Vekstfaktor-reseptorer med PTK-aktivitet er kjent som reseptor-tyrosinkinaser ("RTK'er"). De omfatter en stor familie av transmembran-reseptorer med diverse biologisk aktivitet. Hittil er minst nitten (19) forskjellige underfamilier av RTK'er blitt identifisert. Et eksempel på disse er underfamilien betegnet "HER"-RTK'er, som omfatter EG FR (epitelvekstfaktor-reseptor), HER2, HER3 og HER4. Disse RTK'er består av et ekstracellulært glykosylert ligandbindings-domene, et transmembran-domene og et intracellulært cytoplasma-katalytisk domene som kan fosforylere tyrosinrester på proteiner.
En annen RTK-underfamilie består av insulinreseptor (IR), insulin-lignende vekstfaktor l-reseptor (IGF-1 R) og insulinreseptor-beslektet reseptor (IRR). IR og IGF-1R interagerer med insulin, IGF-I og IGF-II, hvilket gir en heterotetramer av to fullstendig ekstracellulære, glykosylerte oc-subenheter og to p-subenheter som krysser cellemembranen og som inneholder tyrosinkinase-domenet.
En tredje RTK-underfamilie er referert til som den blodplateavledede vekstfaktorreseptor- ("PDGFR") gruppe, som omfatter PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, c-kit og c-fms. Disse reseptorer består av glykosylerte, ekstracellulære domener sammensatt av et variabelt antall av immunoglobin-lignende sløyfer og et intracellulært domene hvor tyrosinkinase-domenet er avbrutt av ubeslektede aminosyresekvenser.
En annen gruppe som noen ganger, på grunn av dens likhet med PDGFR-underfamilien blir underordnet den siste gruppen, er fosterleverkinase- ("fik") reseptor-underfamilien. Denne gruppen er antatt å utgjøres av kinase-insersjon-domene-reseptor-fosterleverkinase-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-1 R, flk-4og fms-lignende tyrosinkinase 1 (flt-1).
Et ytterligere medlem av tyrosinkinase-vekstfaktorreseptor-familien er fibroblast-vekstfaktor- ("FGF") reseptorundergruppen. Denne gruppen består av fire reseptorer, FGFR1-4 og syv ligander, FGF1-7. Selv om det ikke er veldefinert ennå, synes det som om reseptorene består av et glykosylert, ekstracellulært domene inneholdende et variabelt antall immunoglobin-lignende sløyfer og et intracellulært domene hvor tyrosinkinase-sekvensen er avbrutt av regioner av ubeslektede aminosyresekvenser.
Ytterligere et annet medlem av tyrosinkinase-vekstfaktor-reseptorfamilien er den vaskulære endotel-vekstfaktor- (VEGF") reseptor-undergruppen. VEGF er et dimert glykoprotein lignende PDGF, men har andre biologiske funksjoner og målcelle-spesifisitet in vivo. Spesielt antas VEGF for tiden å spille en essensiell rolle ved vaskulogenese og angiogenese.
En mer fullstendig liste over de kjente RTK-underfamiliene er beskrevet i Plowman et al., DN & P, 7 (6): 334-339 (1994), inntatt ved referanse, omfattende eventuelle tegninger.
I tillegg til RTK'ene, eksisterer det også en familie av fullstendig intracellulære PTK'er betegnet "ikke-reseptor-tyrosinkinaser" eller "cellulære tyrosinkinaser." Denne sistnevnte betegnelsen, forkortet "CTK", vil bli anvendt her. CTK'er inneholder ikke ekstracellulære og transmembran-domener. Hittil er over 24 CTK'er i 11 underfamilier (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak og Ack) blitt identifisert. Src-underfamilien synes hittil å være den største gruppe av
CTK'er og omfatter Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr og Yrk. For en mer detaljert omtale av CTK'er, se Bolen, Oncogene, 8: 2025-2031 (1993), inntatt ved referanse, omfattende eventuelle tegninger.
Serin/treoninkinasene, STK'ene, lik CTK'ene, er overveiende intracellulære, selv om det er noen få reseptor-kinaser av STK-typen. STK'er er de mest vanlige av cytosol-kinaser; dvs. kinaser som utøver sin funksjon i den delen av cytoplasmaet som er forskjellig fra cytoplasmaorganeller og celleskjelettet ("cytoskelton"). Cytosolen er regionen innen cellen hvor mye av cellens intermediære metabolske og biosyntetiske aktivitet skjer; for eksempel er det i cytosolen at proteiner blir syntetisert på ribosomer.
RTK'er, CTK'er og STK'er har alle vært implisert i en hærskare av patogene tilstander omfattende, spesielt, kreft. Andre patogene tilstander som er blitt forbundet med PTK'er omfatter, uten begrensning, psoriasis, hepatisk cirrhose, diabetes, angiogenese, restenose, okulære sykdommer, revmatoid artritt og andre inflammatoriske lidelser, immunologiske lidelser så som autoimmun sykdom, kardiovaskulær sykdom, så som aterosklerose, og en rekke nyrelidelser.
Med hensyn til kreft, kom to av hovedhypotesene frem til å forklare at den veldige cellulære proliferasjon som driver tumorutvikling er relatert til funksjoner kjent for å være PK-regulert. Det vil si at det er blitt foreslått at ondartet cellevekst resulterer fra en nedbrytning i mekanismene som kontrollerer celledeling og/eller differensiering. Det er blitt vist at proteinproduktene av flere proto-onkogener er involvert i signaltransduksjonsbanene som regulerer cellevekst og differensiering. Disse proteinproduktene av proto-onkogener omfatter de ekstracellulære vekstfaktorene, transmembran-vekstfaktor-PTK-reseptorer (RTK'er), cytoplasma-PTK'er (CTK'er) og cytosol-STK'er, beskrevet ovenfor.
I betraktning av den åpenbare sammenhengen mellom PK-relaterte, cellulære aktiviteter og en mengde forskjellige menneskelige sykdommer, er det
ingen overraskelse at stor anstrengelse gjøres i et forsøk på å identifisere måter å modulere PK-aktivitet på. Noe av denne anstrengelsen har involvert biomimetiske tilnærminger som benytter store molekyler etter mønster av dem som er involvert i de faktiske cellulære prosessene (for eksempel mutantligander (US-søknad nr.
4,966,849); oppløselige reseptorer og antistoffer (søknad nr. WO 94/10202, Kendall og Thomas, Proe. Nati Acad. Sei., 90: 10705-09 (1994), Kim, et al., Nature, 362: 841-844 (1993)); RNA-ligander (Jelinek, et al., Biochemistry, 33: 10450-56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4: 358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199: 56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152: 44-857) og tyrosinkinase-inhibitorer (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US-pat. nr. 5.330.992; Mariani, et al., Proe. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).
I tillegg til ovennevnte, er det gjort forsøk på å identifisere små molekyler som virker som PK-inhibitorer. For eksempel er bis-monocyliske, bicykliske og heterocykliske arylforbindelser (PCT WO 92/20642), vinylenazaindol-derivater (PCT WO 94/14808) og 1-cyklopropyl-4-pyridylkinoloner (US-pat. nr. 5.330.992) beskrevet som tyrosinkinase-inhibitorer. Styrylforbindelser (US-pat. nr. 5.217.999), styryl-substituerte pyridylforbindelser (US-pat. nr. 5.302.606), kinazolinderivater (EP-søkn. nr. 0 566 266 A1), selenaindoler og selenider (PCT WO 94/03427), tricykliske polyhydroksylforbindelser (PCT WO 92/21660) og benzylfosfonsyre-forbindelser (PCT WO 91/15495) er alle blitt beskrevet som PTK-inhibitorer som er anvendelige ved behandling av kreft.
Foreliggende oppfinnelse angår visse 3-(4-amidopyrrol-2-ylmetyliden)-2-indolinon-derivater som viser PK-modulerende evne og er derfor anvendelige for for fremstilling av medikamenter til behandling av lidelser beslektet med unormal PK-aktivitet.
Én utførelsesform av oppfinnelsen er en forbindelse med formel (I):
hvor:
R<1> er valgt fra gruppen som består av hydrogen, halogen, CrC4halogenalkoksy og C6-Ci2 aryl eventuelt substituert med en eller to halogenatomer;
R<2> er hydrogen;
R<3>, R<4> og R<5> er uavhengig hydrogen eller C1-C10 alkyl;
Z er valgt fra 1,2,3-triazolyl, tetrazolyl eller 3-oksy-benzotriazol-1-yl; eller Z kan være -NR<15>R<16> hvor R<1>5 og R1<6> sammen med nitrogenatomet som de er bundet til danner en morfolino-, en 3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl- eller en 1,1-diksotiomorfolinogruppe alle eventuelt substituert med en eller to CrC4 alkyl;
R<6> og R7 er uavhengig hydrogen eller C1-C4 alkyl;
eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
En annen utførelsesform er en forbindelse med formel (la):
hvor:
R<1>, R3, R4 og R5 er hydrogen;
R2 er fluor og er lokalisert i 5-stilling på indolinonringen;
Z er morfolin-4-yl;
R6 og R<7> er metyl.
Fortrinnsvis er stereokjemien ved <*>C (S).
En annen utførelsesform er et farmasøytisk preparat, omfattende en forbindelse eller salt med formler I eller la og en farmasøytisk akseptabel bærer eller tilsetningsmiddel.
En annen utførelsesform er en metode for modulering av den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro, omfattende å kontakte proteinkinasen med en forbindelse eller salt med formler I eller la. Proteinkinasen for denne metoden kan være en reseptor-tyrosinkinase, en ikke-reseptor-tyrosinkinase og en serin-treoninkinase.
En annen utførelsesform er anvendelse av et farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse eller salt med formler I eller la og en farmasøytisk akseptabel bærer eller tilsetningsmiddel for fremstilling av medikament for behandling eller forhindring av en proteinkinase-relatert lidelse hos en organisme. Proteinkinasen kan være en reseptor-tyrosinkinase, en ikke-reseptor-tyrosinkinase og en serin-treoninkinase. Den proteinkinase-relaterte lidelsen kan være en EGFR-relatert lidelse, en PDGFR-relatert lidelse, en IGFR-relatert lidelse og en flk-relatert lidelse. Proteinkinase-lidelsen kan også være platecellekarsinom, astrocytoma, Kaposis sarkom, glioblastoma, lungekreft, blærekreft, hode- og halskreft, melanom, eggstokk-kreft, prostatakreft, brystkreft, småcelle-lungekreft, glioma, colorektal kreft, genitourinsystem-kreft og gastrointestinal-kreft. Videre kan proteinkinaselidelsen også være diabetes, en autoimmun-sykdom, en hyperproliferasjons-lidelse, restenose, fibrose, psoriasis, von Heppel-Lindaus sykdom, osteoartritt, revmatoid artritt, angiogenese, en inflammatorisk lidelse, en immunologisk lidelse og en kardiovaskulær lidelse. Ved en annen utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for fremstilling av forbindelser med formel (I).
Til slutt er foreliggende oppfinnelse også rettet mot det å identifisere en kjemisk forbindelse som modulerer den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase, ved å kontakte celler in vitro som uttrykker proteinkinasen med en forbindelse eller et salt ifølge foreliggende oppfinnelse, og deretter overvåkning av cellene med hensyn til en effekt.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
Definisjoner
Hvis ikke annet er angitt, har de følgende betegnelser anvendt i beskrivelsen og kravene betydningene beskrevet nedenfor: "Alkyl" angir en mettet, alifatisk hydrokarbonrest omfattende lineære og forgrenede grupper med 1 til 20 karbonatomer (hver gang et numerisk område, for eksempel "1-20", er angitt her, betyr det at gruppen, i dette tilfellet alkylgruppen, kan inneholde 1 karbonatom, 2 karbonatomer, 3 karbonatomer etc, opptil og omfattende 20 karbonatomer). Mer foretrukket er det et alkyl av middels størrelse som har 1 til 10 karbonatomer, for eksempel metyl, etyl, propyl, 2-propyl, n-butyl, isobutyl, tert.butyl, pentyl og lignende. Mest foretrukket er det et lavere alkyl som har 1 til 4 karbonatomer, for eksempel metyl, etyl, propyl, 2-propyl, n-butyl, isobutyl eller tert.butyl og lignende. Alkyl kan være substituert eller usubstituert, og når det er substituert er substituentgruppen(e) fortrinnsvis halogen, hydroksy, lavere alkoksy, aryl, aryloksy, heteroaryl, heteroalicyklus, C(0)R<8>, NR<9>R10 og C(0)NR<9>R<10>.
"Aryl" angir kun-karbon, monocykliske eller kondensert-ring-polycyklisk (dvs. ringer som deler par av karbonatomer i nabostilling) grupper med 1 til 12 karbonatomer som har et fullstendig konjugert pi-elektronsystem. Eksempler på arylgrupper, er fenyl, naftalenyl og antracenyl. Arylgruppen kan være substituert eller usubstituert. Når substituert, er den substituerte gruppen(e) fortrinnsvis én eller flere, mer foretrukket én, to eller tre, enda mer foretrukket én eller to, uavhengig valgt fra gruppen bestående av lavere alkyl, trihalogenalkyl, halogen, hydroksy, lavere alkoksy, merkapto, (lavere alkyl)tio, cyano, acyl, tioacyl, O-karbamyl, N-karbamyl, O-tiokarbamyl, N-tiokarbamyl, C-amido, N-amido, nitro, N-sulfonamido, S-sulfonamido, R<9>S(0)-, R<9>S(0)2-, -C(0)OR<9>, R<9>C(0)0- og -NR<9>R10
, med R9 og R<10> som definert ovenfor. Fortrinnsvis er arylgruppene eventuelt substituert med én eller to substituenter, uavhengig valgt fra halogen, lavere alkyl, trihalogenalkyl, hydroksy, merkapto, cyano, N-amido, mono- eller dialkylamino, karboksy eller N-sulfonamido.
"Hydroksy" angir en -OH-gruppe.
"Alkoksy" angir både en -O-(alkyl)- og en -O- (usubstituert cykloalkyl) gruppe. Representative eksempler omfatter metoksy, etoksy, propoksy, butoksy, cyklopropyloksy, cyklobutyloksy, cyklopentyloksy, cykloheksyloksy og lignende.
"Halogenalkoksy" angir både en -0- (halogenalkyl) gruppe. Representative eksempler omfatter trifluormetoksy, tribrommetoksy og lignende.
"Halogen"-gruppe angir fluor, klor, brom eller jod, fortrinnsvis fluor eller klor.
"Eventuell" eller "eventuelt" betyr at den deretter beskrevne hendelse eller omstendighet kan, men ikke trenger å forekomme, og at beskrivelsen omfatter tilfeller hvor hendelsen eller omstendigheten forekommer og tilfeller hvor den ikke gjør det. For eksempel betyr "heterocyklisk gruppe eventuelt substituert med en<1 >alkylgruppe" at alkylgruppen kan, men ikke trenger å være til stede, og beskrivelsen omfatter situasjoner hvor den heterocykliske gruppen blir substituert med en alkylgruppe og situasjoner hvor heterocyklogruppen ikke blir substituert med alkylgruppen.
Betegnelsene "2-indolinon", "indolin-2-on" og "2-oksindol" blir anvendt om hverandre her, for å referere til et molekyl som har den kjemiske strukturen:
Betegnelsen "pyrrol" angir et molekyl som har den kjemiske strukturen:
Forbindelser som har samme molekylære formel, men avviker i naturen eller sekvensen av binding av deres atomer, eller arrangementet av deres atomer i rommet, er betegnet "isomerer". Isomerer som avviker i arrangement av deres atomer i rommet, er betegnet" stereoisomerer". Stereoisomerer som ikke er speilbilder av hverandre er betegnet "diastereomerer", og de som er speilbilder som ikke kan legges på hverandre, er betegnet" enantiomerer". Når en forbindelse har et asymmetrisk senter, for eksempel, er den bundet til fire forskjellige grupper, et par av enantiomerer er mulig. En enantiomer kan karakteriseres ved den absolutte konfigurasjon av dens asymmetriske senter og er beskrevet ved R- og S-sekvenseringsreglene ifølge Cahn og Prelog, eller ved måten som molekylet roterer planet til polarisert lys på, og betegnet som dekstroroterende eller levoroterende (dvs. som henholdsvis (+)- eller (-)-isomerer). En chiral forbindelse kan eksistere som en hvilken som helst individuell enantiomer, eller som en blanding derav. En blanding inneholdende like proporsjoner av enantiomerene, blir betegnet en "racemisk blanding".
Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan ha ett eller flere asymmetriske sentere; slike forbindelser kan derfor være fremstilt som individuelle (R)-eller (S)-stereoisomerer, eller som blandinger derav. For eksempel er karbonatomet som bærer hydroksygruppen i -CONHCHR<3->CR<4>(OH)CR<5>Z i en forbindelse med formel (I) et asymmetrisk senter, og derfor kan forbindelsen med formel (I) eksistere som en (R)- eller (S)-stereoisomer. Hvis ikke angitt på annen måte, er beskrivelsen eller benevnelsen av en spesiell forbindelse i beskrivelsen og kravene ment å omfatte både individuelle enantiomerer og blandinger, racemiske eller på annen måte, derav. Metodene for bestemmelsen av stereokjemi og separering av stereoisomerer er velkjent på området (se omtale i kapittel 4 i "Advanced Organic Chemistry", 4. utg., J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).
Forbindelsene med formel (I) kan oppvise fenomenene tautomerisme og strukturell isomerisme. For eksempel kan forbindelsene beskrevet her innta en E-eller Z-konfigurasjon rundt dobbeltbindingen som forbinder 2-indolinongruppen til pyrrolgruppen, eller de kan være en blanding av E og Z. Foreliggende oppfinnelse omfatter en hvilken som helst tautomer eller strukturell isomer form og blandinger derav, som har evnen til å modulere RTK-, CTK- og/eller STK-aktivitet.
Et "farmasøytisk preparat" angir en blanding av én eller flere av forbindelsene beskrevet her, eller fysiologisk/farmasøytisk akseptable salter eller promedikamenter derav, med andre kjemiske komponenter, så som fysiologisk/- farmasøytisk akseptable bærere og tilsetningsmidler. Formålet med et farmasøytisk preparat er å lette administrering av en forbindelse til en organisme.
Forbindelsen med formel (I) kan også virke som et promedikament. Et "promedikament" angir et middel som blir omdannet til stam-medikamentet in vivo. Promedikamenter er ofte anvendelige fordi de, i noen situasjoner, kan være lettere å administrere enn stam-medikamentet. De kan for eksempel være biotilgjengelige ved oral administrering, mens stam-medikamentet ikke er det. Promedikamentet kan også ha forbedret oppløselighet i farmasøytiske preparater i forhold til stam-medikamentet. Et eksempel på et promedikament, ville være en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som blir administrert som en ester ("promedikamentet") for å lette overføring over en celle-membran hvor vannoppløselighet er skadelig for mobilitet, men deretter blir metabolsk hydrolyser! til karboksylsyren, den aktive enhet, så snart den er inne i cellen, hvor vannoppløselighet er fordelaktig.
En ytterligere eksempel på et promedikament kan være et kort polypeptid, for eksempel et 2-10 aminosyres polypeptid, bundet gjennom en terminal aminogruppe til en karboksygruppe i en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse hvor polypeptidet blir hydrolysert eller metabolisert in vivo for frigjøring av det aktive molekylet. I tillegg er det antatt at en forbindelse med formel (I) ville bli metabolisert av enzymer i kroppen til organismen, så som et menneske, hvilket gir en metabolitt som kan modulere aktiviteten til proteinkinasene. Som anvendt her, angir en "fysiologisk/farmasøytisk akseptabel bærer" en bærer eller et fortynningsmiddel som ikke forårsaker betydelig irritasjon i en organisme, og opphever ikke den biologiske aktiviteten og egenskapene til den administrerte forbindelse.
Et "farmasøytisk akseptabelt tilsetningsmiddel" angir en inert substans satt til et farmasøytisk preparat for ytterligere å lette administrering av en forbindelse. Eksempler på tilsetningsmidler, omfatter kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, forskjellige sukkere og typer av stivelse, cellulosederivater, gelatin, vegetabilske oljer og polyetylenglykoler.
Som anvendt her, angir betegnelsen "farmasøytisk akseptabelt salt" de salter som beholder den biologiske effektiviteten og egenskapene til stamforbindelsen. Slike salter omfatter: (i) syreaddisjonssalt som blir oppnådd ved reaksjon av den frie basen av stamforbindelsen med uorganiske syrer, så som saltsyre, bromhydrogensyre, salpetersyre, fosforsyre, svovelsyre og perklorsyre og lignende, eller med organiske syrer så som eddiksyre, oksalsyre, (D)- eller (L)-eplesyre, maleinsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salicylsyre, vinsyre, sitronsyre, ravsyre eller malonsyre og lignende, fortrinnsvis saltsyre eller (L)-eplesyre; eller (2) salter dannet når et surt proton til stede i stamforbindelsen enten blir erstattet med et metallion, for eksempel et alkalimetallion, et jordalkalimetallion eller et aluminiumion; eller koordinerer med en organisk base så som etanolamin, dietanolamin, trietanolamin, trometamin, N-metylglukamin og lignende.
"PK" angir reseptorprotein-tyrosinkinase (RTK'er), ikke-reseptor- eller "cellulær" tyrosinkinase (CTK'er) og serin-treoninkinaser (STK'er).
"Metode" angir måter, hjelpemidler, teknikker og prosedyrer for å fullføre en gitt oppgave, omfattende de måter, hjelpemidler, teknikker og prosedyrer som enten er kjent for, eller lett utvikles fra, kjente måter, hjelpemidler, teknikker og prosedyrer, av praktiske utøvere av de kjemiske, farmasøytiske, biologiske, biokjemiske og medisinske fagområder.
"Modulering" eller "å modulere" angir endringen av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er. Spesielt angir å modulere aktivering av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er, fortrinnsvis aktiveringen eller hemningen av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTKs og STK'er, avhengig av konsentrasjonen av forbindelsen eller saltet som RTK, CTK eller STK utsettes for, eller, mer foretrukket, hemningen av den katalytiske aktiviteten til RTK'er, CTK'er og STK'er.
"Katalytisk aktivitet" angir raten av fosforylering av tyrosin under innvirkning av, direkte eller indirekte, RTK'er og/eller CTK'er, eller fosforyleringen av serin og treonin under innvirkning av, direkte eller indirekte, STK'er.
"Å kontakte" angir å bringe en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse og en mål-PK sammen på en slik måte at forbindelsen kan påvirke den katalytiske aktiviteten til PK'en, enten direkte, dvs. ved å interagere med selve kinasen, eller indirekte, dvs. ved å interagere med et annet molekyl som den katalytiske aktiviteten til kinasen er avhengig av. Slik "å kontakte" kan gjennomføres "in vitro," dvs. i et testrør, en petriskål, eller lignende. I et testrør kan det å kontakte involvere bare en forbindelse og en PK av interesse, eller det kan involvere hele celler. Celler kan også holdes eller dyrkes i cellekulturskålene og kontaktes med en forbindelse i dette miljøet. I denne sammenheng kan evnen som en spesiell forbindelse har til påvirke en PK-relatert lidelse, dvs. IC50 til forbindelsen, definert nedenfor, bestemmes før anvendelse av forbindelsene in vivo med mer komplekse levende organismer blir forsøkt. For celler utenfor organismen finnes mangfoldige metoder, og er velkjent for fagfolk på området, for å bringe PK'ene i
kontakt med forbindelsene omfattende direkte cellemikroinjeksjon og en rekke transmembran-bæreteknikker.
"In vitro" angir prosedyrer utført i et kunstig miljø, så som for eksempel i et testrør eller dyrkningsmedium.
"In vivo" angir prosedyrer utført i en levende organisme så som en mus, rotte eller kanin.
"PK-relatert lidelse", "PK-drevet lidelse" og "unormal PK-aktivitet", refererer alle til en tilstand karakterisert ved upassende, dvs. under eller, mer vanlig, over, PK-katalytisk aktivitet, hvor den spesielle PK kan være en RTK, en CTK eller en STK. Upassende katalytisk aktivitet kan oppstå som resultatet av enten: (1) PK-ekspresjon i celler som normalt ikke uttrykker PK'er, (2) øket PK-ekspresjon, hvilket fører til uønsket celleproliferasjon, differensiering og/eller vekst, eller, (3) redusert PK-ekspresjon, hvilket fører til uønskede reduksjoner i celleproliferasjon, differensiering og/eller vekst. Over-aktivitet av en PK angir enten amplifisering av genet som koder for en spesiell PK, eller produksjon av et nivå av PK-aktivitet som kan korrelere med en celleproliferasjons-, differensierings- og/eller vekstlidelse (dvs. at ettersom nivået av PK'en øker, øker alvorlighetsgraden av én eller flere av symptomene på den cellulære lidelsen). Under-aktivitet er, selvfølgelig, det motsatte, hvor alvorlighetsgraden av én eller flere symptomer på en cellulær lidelse øker ettersom nivået av PK-aktiviteten reduseres.
"Organisme" angir en hvilken som helst levende enhet omfattet av minst én celle. En levende organisme kan være så enkel som for eksempel én enkelt eukariot celle, eller så kompleks som et pattedyr, omfattende et menneske.
"Terapeutisk effektive mengde" angir den mengde av forbindelsen som blir administrert som i noen grad vil mildne ett eller flere av symptomene på lidelsen som behandles. Når det gjelder behandling av kreft, angir en terapeutisk effektiv mengde den mengde som har effekten:
(1) reduksjon av størrelsen på tumoren; (2) hemming (dvs. minskning i noen grad, fortrinnsvis stopping) av tumormetastase; (3) hemming i noen grad (dvs. minskning i noen grad, fortrinnsvis stopping) av tumorvekst og/eller, (4) mildning i noen grad (eller, fortrinnsvis, fjerning) av ett eller flere symptomer forbundet med kreften.
"Overvåkning" betyr observering eller detektering av effekten av å bringe en forbindelse i kontakt med en celle som uttrykker en spesiell PK. Den observerte eller detekterte effekt kan være en forandring i cellefenotype, i den katalytiske aktiviteten til en PK eller en forandring i interaksjonen mellom en PK og en naturlig bindingspartner. Teknikker for observering eller detektering av slike effekter er velkjente på området.
Effekten referert til ovenfor er valgt fra en forandring eller fravær av forandring i en cellefenotype, en forandring eller fravær av forandring i den katalytiske aktiviteten til nevnte proteinkinase, eller en forandring eller fravær av forandring i interaksjonen mellom nevnte proteinkinase og en naturlig bindingspartner i et endelig aspekt ved foreliggende oppfinnelse.
"Cellefenotype" angir den utvendige fremtoningen av en en celle eller vev eller den biologiske funksjonen av cellen eller vevet. Eksempler på en cellefenotype, er cellestørrelse, cellevekst, celleproliferasjon, celledifferensiering, celleoverlevelse, apoptose og næringsmiddelopptak og anvendelse. Slike fenotypiske karakteristika er målbare ved hjelp av teknikker velkjent på området.
"Naturlig bindingspartner" angir et polypeptid som binder seg til en spesiell PK i en celle. Naturlige bindingspartnere kan spille en rolle ved overføring av et signal i en PK-mediert signaltransduksjonsprosess. En forandring i interaksjonen mellom den naturlige bindingspartneren og PK'en kan manifestere seg som en øket eller redusert konsentrasjon av PK/naturlig bindingspartner-komplekset og, som et resultat, som en observerbar forandring i evnen som PK'en har til å mediere signaltransduksjon.
Representative forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i tabell 1 a nedenfor.
Andre representative forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i tabell 1 b nedenfor.
Andre representative forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i tabell 1 c nedenfor.
Forbindelsene presentert i tabeller 1a-1c er eksempler for omfanget av foreliggende oppfinnelse.
FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER
Mens den videste definisjonen er angitt oppsummeringen av oppfinnelsen, er visse forbindelser med formel (I), angitt nedenfor, foretrukket.
En foretrukket gruppe av forbindelser med formel (I), er den hvor:
R<6> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og C1-C4 alkyl, fortrinnsvis hydrogen, metyl, etyl, isopropyl, tert.butyl, isobutyl eller n-butyl, mer foretrukket hydrogen eller metyl; og R7 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og C1-C4 alkyl, og mer foretrukket er R7 hydrogen, metyl, etyl, isopropyl, n-, iso- eller tert.butyl, enda mer foretrukket metyl eller hydrogen.
En annen foretrukket gruppe av forbindelser med formel (I), er den hvor: R<6> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og C1-C4 alkyl, fortrinnsvis hydrogen, metyl, etyl, isopropyl, tert.butyl, isobutyl eller n-butyl, mer foretrukket hydrogen eller metyl, mest foretrukket metyl;
R<7> er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og C1-C4 alkyl, og R<7> er, mer foretrukket hydrogen, metyl, etyl, isopropyl, n-, iso- eller tert.butyl, enda mer foretrukket metyl eller hydrogen; og
R<3>, R4 og R5 er hydrogen; og
Z er 1,2,3-triazolyl, tetrazolyl eller 3-oksy-benzotriazol-1-yl.
En annen foretrukket gruppe av forbindelser med formel (I), er den hvor: R6 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og C1-C4 alkyl, fortrinnsvis hydrogen, metyl, etyl, isopropyl, tert.butyl, isobutyl eller n-butyl, mer foretrukket hydrogen eller metyl, mest foretrukket metyl;
R7 er valgt fra gruppen bestående av hydrogen og C1-C4 alkyl og R<7> er, mer foretrukket, hydrogen, metyl, etyl, isopropyl, n-, iso- eller tert.butyl, enda mer foretrukket metyl eller hydrogen, mest foretrukket metyl; og
R<3>, R4 og R5 er hydrogen; og
Z er -NR<15>R<16>, hvor R<1>5 og R1<6> går sammen med nitrogenatomet som de er bundet til danner en morfolino-, en 3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl- eller en 1,1-diksotiomorfolinogruppe alle eventuelt substituert med en eller to CrC4 alkyl; R6 og R7 er uavhengig hydrogen eller Ci-C4alky.
Innen de ovenfor foretrukne og mer foretrukne grupper (1)-(3), er en enda mer foretrukket gruppe av forbindelser den hvor:
R<1> er hydrogen; og
R2 er hydrogen.
I de ovenfor foretrukne, mer foretrukne og enda mer foretrukne forbindelser, er stereokjemien ved karbonatomet som bærer hydroksygruppen i -CONHCH(R<3>)<*>CR<4>(OH)CR<5>Z-kjeden og angitt ved en <*>, enten RS, R eller S, mer foretrukket S.
Anvendelighet
PK'ene, hvis katalytiske aktivitet blir modulert av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter proteintyrosinkinaser som det er to typer av, reseptor-tyrosinkinaser (RTK'er) og cellulære tyrosinkinaser (CTK'er) og serin-treonin-kinaser (STK'er). RTK-mediert signaltransduksjon blir initiert ved ekstracellulær interaksjon med en spesifikk vekstfaktor (ligand), fulgt av reseptor-dimerisering, transient stimulering av den iboende proteintyrosinkinase-aktivitet og fosforylering. Bindingsseter blir derved skapt for intracellulære signal-transduksjonsmolekyler og fører til dannelsen av komplekser med et spekter av cytoplasma-signalmolekyler som letter den passende cellulære respons (for eksempel celledeling, metabolske effekter på det ekstracellulære mikromiljø etc). Se Schlessinger og Ullrich, 1992, Neuron 9: 303-391.
Det er blitt vist at tyrosinfosforyleringsseter på vekstfaktorreseptorer tjener som høy-affinitets-bindingsseter for SH2- (src-homologi) domener på signalmolekyler. Fantl et al., 1992, Cell 69: 413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778, og Koch et al., 1991, Science 252: 668-678. Mange intracellulære substratproteiner som binder seg til ("associate with") RTK'er er blitt identifisert. De kan deles opp i to hoved-grupper: (1) substrater som har et katalytisk domene og (2) substrater som mangler slikt domene, men som tjener som adaptorer og binder seg til ("associate with") katalytisk aktive molekyler. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Spesifisiteten til interaksjonene mellom reseptorer og SH2-domener på deres substrater blir bestemt av aminosyrerestene som umiddelbart omgir det fosforylerte tyrosinresiduet. Forskjeller i bindingsaffiniteten mellom SH2-domener og aminosyresekvensene som omgir fosfotyrosinrestene på spesielle reseptorer, er i overensstemmelse med de observerte forskjellene i deres substrat-fosforyleringsprofiler. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. Disse observasjoner antyder at funksjonen til hver RTK blir bestemt ikke bare av dens ekspresjonsmønster og ligandtilgjengelighet, men også rekken av nedstrøms signaltransduksjonsbaner som blir aktivert av en spesiell reseptor. Således tilveiebringer fosforylering et viktig regulatorisk trinn som bestemmer selektiviteten av signalbaner rekruttert av spesifikke vekstfaktorreseptorer, så vel som differensieringsfaktor-reseptorer.
STK'er, som primært er cytosoliske, påvirker den indre biokjemien til cellen, ofte som en følgerespons på en PTK-hendelse. STK'er har vært implisert i signalprosessen som initierer DNA-syntese og påfølgende mitose, som fører til celleproliferasjon.
Således resulterer PK-signaltransduksjon, blant andre responser, i celleproliferasjon, differensiering, vekst og metabolisme. Unormal celleproliferasjon kan resultere i mange forskjellige lidelser og sykdommer, omfattende utviklingen av neoplasi, så som karsinom, sarkom, glioblastoma og hemangioma, lidelser så som leukemi, psoriasis, arteriosklerose, artritt og diabetisk retinopati og andre lidelser relatert til ukontrollert angiogenese og/eller vaskulogenese.
En nøyaktig forståelse av mekanismen som forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hemmer PK'er med er ikke nødvendig for å praktisere foreliggende oppfinnelse. Imidlertid er det antatt at forbindelsene interagerer med aminosyrene i den katalytiske regionen til PK'er. PK'er har typisk en tofliket struktur hvor ATP synes å binde seg i spalten mellom de to flikene i en region hvor aminosyrene finnes ("are conserved") hos PK'er. Inhibitorer av PK'er antas å binde seg ved ikke-kovalente interaksjoner, så som hydrogenbinding, van der Waals-krefter og ioniske interaksjoner i samme generelle region hvor forannevnte ATP binder seg til PK'ene. Mer spesifikt antas det at 2-indolinon-komponenten i forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse binder seg i det generelle rommet som normalt opptas av adeninringen til ATP. Spesifisitet til et spesielt molekyl for en spesiell PK kan deretter oppstå som resultatet av ytterligere interaksjoner mellom de forskjellige substituentene på 2-indolinonkjernen og aminosyre-domenene som er spesifikke for spesielle PK'er. Således kan forskjellige indolinon-substituenter bidra til preferensiell binding til spesielle PK'er. Evnen til å velge forbindelser aktive på forskjellige ATP- (eller andre nukleotid-) bindingsseter, gjør forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendelige for å velge som mål et hvilket som helst protein med et slikt sete. Forbindelsene beskrevet her er således anvendelige i in vitro-assays for slike proteiner.
I tillegg tilveiebringer forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendelse av foreliggende forbindelser til fremstilling av medikamenter til behandlingen av mange typer av faste tumorer, omfattende karsinomer, sarkomer omfattende Kaposis sarkom, erytroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocytoma, melanom og myoblastoma. Anvendelse av foreliggende forbindelser til fremstilling av medikamenter til behandling eller forebygging av kreft med ikke-faste tumorer, så som leukemi, er også omfattet av foreliggende oppfinnelse. Indikasjoner kan omfattehjernekreft, blærekreft, eggstokk-kreft, magekreft, bukspyttkjertel-kreft, tykktarmskreft, blodkreft, lungekreft og benkreft.
Ytterligere eksempler på typene av lidelser relatert til upassende PK-aktivitet som forbindelsene beskrevet her kan være anvendelige for fremstilling av medikamenter er til å forhindre, behandle og studere, er celleproliferative lidelser, fibrotiske lidelser og metabolske lidelser.
Celleproliferative lidelser, som kan forhindres, behandles eller ytterligere studeres omfatter kreft, blodkarproliferative lidelser og mesangiale celleproliferative lidelser.
Blodkarproliferative lidelser refererer til lidelser relatert til unormal vaskulogenese (blodkardannelse) og angiogenese (spredning av blodkar). Mens vaskulogenese og angiogenese spiller viktige roller ved en rekke normale, fysiologiske prosesser så som embryoutvikling, corpus luteum-dannelse, sårheling og organregenerering, spiller de også en sentral rolle ved utvikling av kreft, hvor de resulterer i dannelsen av nye kapillærer som er nødvendig for å holde en tumor i live. Andre eksempler på blodkarproliferasjonslidelser omfatter artritt, hvor nye kapillærblodkar invaderer leddet og destruerer brusk, og okulære sykdommer, så som diabetisk retinopati, hvor nye kapillærer i retina invaderer glasslegemet, blør og forårsaker blindhet.
To strukturelt beslektede RTK'er er blitt identifisert å binde VEGF med høy affinitet: den fms-lignende tyrosin 1- (flt-1) reseptoren (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5: 519-524; De Vries et al., 1992, Science, 255: 989-991) og KDR/FLK-1- reseptoren, også kjent som VEGF-R2. Vaskulær endotel-vekstfaktor (VEGF) er blitt rapportert å være et endotelcelle-spesifikt mitogen med in vitro endotelcelle-vekstfremmende aktivitet. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161: 851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 19461-19566. Informasjon gitt i US-søknader, serienr. 08/193,829,08/038,596 og 07/975,750, antyder sterkt at VEGF ikke bare er ansvarlig for endotelcelle-proliferasjon, men også er den primære regulator av normal og patologisk angiogenese. Se, generelt, Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10) 699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 26031-26037.
Normal vaskulogenese og angiogenese spiller viktige roller ved en rekke fysiologiske prosesser, så som embryo-utvikling, sårheling, organregenerering og reproduktive prosesser hos kvinner, så som follikkelutvikling i corpus luteum i løpet av eggløsning og morkakevekst etter graviditet. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16): 10931-34. Ukontrollert vaskulogenese og/eller angiogenese er forbundet med sykdommer så som diabetes, så vel som med ondartede, faste tumorer hvor vaskularisering er nødvendig for vekst. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10): 699-702; Folkham, 1991, J. Nati. Cancer Inst., 82: 4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.
Den formodede rolle til VEGF ved endotel-celleproliferasjon og migrering under angiogenese og vaskulogenese, indikerer en viktig rolle for KDR/FLK-1 - reseptoren i disse prosesser. Sykdommer så som diabetes mellitus (Folkman, 198, i Xl<th> Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al., eds.), s. 583-596, Leuven University Press, Leuven) og artritt, så vel som ondartet tumorvekst, kan resultere fra ukontrollert angiogenese. Se for eksempel Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285: 1182-1186. Reseptorene som VEGF spesifikt binder seg til, er et viktig og kraftig terapeutisk mål for reguleringen og moduleringen av vaskulogenese og/eller angiogenese og en rekke alvorlige sykdommer som involverer unormal, cellulær vekst forårsaket av slike prosesser. Plowman, et al., 1994, DN & P, 7 (6): 334-339. Mer spesielt gjør KDR/FLK-1-reseptorens meget spesifikke rolle ved neovaskularisering den til et utvalgt mål for terapeutiske tilnærminger for behandling av kreft og andre sykdommer som involverer den ukontrollerte dannelsen av blodkar.
Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse forbindelser anvendelige for fremstilling av medikamenter som er i stand til å regulere og/eller modulere tyrosinkinase-signaltransduksjon, omfattende KDR/FLK-1 -reseptor-signaltransduksjon, for å hemme eller fremme angiogenese og/eller vaskulogenese, dvs. medikamenter som hemmer, forhindrer eller griper inn i signalet transdusert av KDR/FLK-1 når aktivert av ligander så som VEGF. Selv om det er antatt at forbindelsene virker på en reseptor eller annen komponent langs tyrosinkinase-signaltransduksjonbanen, kan de også virke direkte på tumorcellene som resulterer fra ukontrollert angiogenese.
Selv om nomenklaturen til menneske- og musedyr-motstykkene av den generiske "flk-l"-reseptoren er forskjellig, er de i mange henseender gjensidig utbyttbare. Musedyr-reseptoren, Flk-1, og dens menneskelige motstykke, KDR, deler en sekvenshomologi på 93,4% innen det intracellulære domene. Likeledes binder musedyr-FLK-l menneske-VEGF med samme affinitet som muse-VEGF, og blir følgelig aktivert av liganden avledet fra en hvilken som helst av artene. Millauer et al., 1993, Cell, 72: 835-846; Quinn et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 7533-7537. FLK-1 binder seg også til og følgelig fosforylerer tyrosin RTK-substrater fra menneske (for eksempel PLC-y eller p85) når samtidig uttrykt i 293 celler (embryonale nyrefibroblaster fra menneske).
Modeller som er avhengig av FLK-1-reseptoren er derfor direkte egnet for å forstå KDR-reseptoren. For eksempel er anvendelse av FLK-1-reseptoren fra musedyri metoder som identifiserer forbindelser som regulerer musedyr-signaltransduksjonsbanen direkte egnet til identifikasjon av forbindelser som kan anvendes for å regulere menneske-signaltransduksjonsbanen, dvs. som regulerer aktivitet relatert til KDR-reseptoren. Således kan kjemiske forbindelser identifisert som inhibitorer av KDR/FLK-1 in vitro, bekreftes i egnede in vivo-modeller. Både in vivo mus- og rotte-dyremodeller er vist å være av utmerket verdi for undersøkelsen av det kliniske potensiale til midler som virker på den KDR/FLK-1-fremkalte signaltransduksjonsbanen.
Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse forbindelser egnet for fremstilling av medikmantere som regulerer, modulerer og/eller hemmer vaskulogenese og/eller angiogenese, ved å påvirke den enzymatiske aktiviteten til KDR/FLK-1-reseptoren og gripe inn i signalet transdusert av KDR/FLK-1. Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse medikamenter til behandlingen av mange typer av faste tumorer omfattendeglioblastoma, melanom og Kaposis sarkom og eggstokk-, lunge-, bryst-, prostata-, pankreas-, tykktarm- og epidermoid karsinom. I tillegg indikerer data at administreringen av forbindelser som hemmer den KDR/Flk-1 -medierte signaltransduksjonsbanen også kan anvendes til fremstilling av medikamenter ved behandling av hemangioma, "restenois" og diabetisk retinopati.
Videre angår foreliggende oppfinnelse medikamenter egnet for hemning av vaskulogenese og angiogenese ved hjelp av andre reseptormedierte baner, innbefattende banen som omfatter flt-1-reseptoren.
Reseptor-tyrosinkinasemediert signaltransduksjon blir initiert ved ekstracellulær interaksjon med en spesifikk vekstfaktor (ligand), fulgt av reseptor-dimerisering, transient stimulering av den iboende proteintyrosinkinase-aktivitet og autofosforylering. Bindingsseter er derved dannet for intracellulære signal-transduksjonsmolekyler som fører til dannelsen av komplekser med et spekter av cytoplasma-signalmolekyler som letter den passende cellulære respons, for eksempel celledeling og metabolske effekter til det ekstracellulære mikromiljø. Se Schlessinger og Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.
Den nære homologien mellom de intracellulære regioner av KDR/FLK-1 og den til PDGF-p-reseptoren (50,3% homologi) og/eller den beslektede flt-1-reseptoren, indikerer induksjon av overlappende signaltransduksjonsbaner. For eksempel for PDGF-p-reseptoren er medlemmer av src-familien (Twamley et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 7696-7700), fosfatidylinositol-3'-kinase (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 981-990), fosfolipase cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4: 49-51), ras-GTPase-aktiverende protein, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 10 90: 6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 6715-6726) og adaptormolekylene Shc og Nek (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13: 6889-6896), vist å binde seg til regioner som involverer forskjellige autofosforylerende seter. Se, generelt, Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5: 37-54. Således er det sannsynlig at signaltransduksjonsbaner aktivert av KDR/FLK-1 omfatter ras-banen (Rozakis et al., 1992, Nature, 360: 689-692), PI-3'-kinasen, de src-medierte og plcy-medierte banene. Hver av disse baner kan spiller en kritisk rolle i de angiogene og/eller vaskulogene effekter av KDR/FLK-1 i endotel-celler. Følgelig angår enda et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse anvendelse av de organiske forbindelsene beskrevet her for fremstilling av medikamenter til å modulere angiogenese og vaskulogenese, siden slike prosesser blir regulert av disse banene.
Motsatt er lidelser relatert til innsnevring, kontraksjon eller lukning av blodkar, så som restenose, også implisert, og kan behandles eller forhindres ved metodene.
Fibrotiske lidelser refererer til den unormale dannelsen av ekstracellulære matriser. Eksempler på fibrotiske lidelser omfatter hepatisk cirrhose og mesangiale celleproliferative lidelser. Hepatisk cirrhose er karakterisert ved økningen i ekstracellulære matriksbestanddeler, hvilket resulterer i dannelsen av et hepatisk arr. En øket ekstracellulær matriks som resulterer i et hepatisk arr kan også være forårsaket av en viral infeksjon, så som hepatitt. Lipocytter synes å spille en vesentlig rolle ved hepatisk cirrhose. Andre fibrotiske lidelser implisert omfatter aterosklerose.
Mesangiale celleproliferative lidelser refererer til lidelser forårsaket av unormal proliferasjon av mesangiale celler. Mesangiale proliferative lidelser omfatter forskjellige nyresykdommer hos menneske, så som glomerulonefritt, diabetisk nefropati og ondartet nefrosklerose, så vel som slike lidelser som trombotisk mikroangiopati-syndromer, transplantat-awisning og glomerulopatier. RTK PDGFR har vært implisert i opprettholdelsen av mesangial celleproliferasjon. Floege et al., 1993, Kidney International 43: 47S-54S.
Mange krefttyper er celleproliferative lidelser og, som angitt tidligere, er PK'er forbundet med celleproliferative lidelser. Således er det ikke overraskende at PK'er, så som for eksempel medlemmer av RTK-familien, er blitt forbundet med utviklingen av kreft. Noen av disse reseptorer, så som EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227233, Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719) HER2/neu
(Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) og PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7: 627-633) er overuttrykt i mange tumorer og/eller vedvarende aktivert av autokrine sløyfer. Faktisk er, i de mest vanlige og alvorlige krefttyper, disse reseptor-overekspresjoner (Akbasak og Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sei., 111: 119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249-273, Kore et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) og autokrine sløyfer (Lee og Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118:1057-1070, Kore et al., supra, Akbasak og Suner-Akbasak et al., supra) blitt vist. For eksempel er EGFR blitt forbundet med platecellekarsinom, astrocytoma, glioblastoma, hode- og halskreft, lungekreft og blærekreft. HER2 er blitt forbundet med bryst-, eggstokk-, mage-, lunge-, bukspyttkjertel- og blærekreft. PDGFR er blitt forbundet med glioblastoma og melanom, så vel som lunge-, eggstokk- og prostatakreft. RTK c-met er også blitt forbundet med ondartet tumordannelse. For eksempel er c-met blitt forbundet, blant andre krefttyper, med colorektale, tyroid-, pankreas-, mage- og hepatocellulære karsinomer og lymfomer. I tillegg er c-met blitt knyttet til leukemi. Over-ekspresjon av c-met-genet er også blitt påvist hos pasienter med Hodgkins sykdom og Burkitts sykdom.
IGF-IR er, i tillegg til å være implisert i næringstilførsel og type-ll-diabetes, også blitt forbundet med mange typer av kreft. For eksempel har IGF-I vært implisert som en autokrin vekststimulator for mange tumortyper, for eksempel menneske-brystkreftkarsinomceller (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) og små lungetumorceller (Macauley et al., 1990, Cancer Res., 50: 2511 - 2517). I tillegg synes IGF-I, idet den på integrert måte er involvert i den normale vekst og differensiering av nervesystemet, også å være en autokrin stimulator av gliomaer hos menneske. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53: 2475-2478. Betydningen av IGF-IR og dens ligander for celleproliferasjon, blir ytterligere understøttet av det faktum at mange celletyper i kultur (fibroblaster, epitelceller, glatte muskelceller, T-lymfocytter, myeloidceller, kondrocytter og osteoblaster (stamcellene i benmargen)) blir stimulert til vokse av IGF-I. Goldring og Goldring, 1991,
Eukariotic Gene Expression, 1: 301-326. Baserga og Coppola foreslår at IGF-IR spiller en sentral rolle i mekanismen ved transformasjon, og kunne, som sådan, være et foretrukket mål for terapeutiske intervensjoner for et bredt spekter av ondartede sykdommer hos mennesker. Baserga, 1995, Cancer Res., 55: 249-252, Baserga, 1994, Cell 79: 927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 4588-4595.
STK'er har vært implisert i mange typer av kreft, omfattende, spesielt, brystkreft (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54: 571-77 (1993)).
Forbindelsen mellom unormal PK-aktivitet og sykdom er ikke begrenset til kreft. For eksempel er RTK'er blitt forbundet med sykdommer så som psoriasis, diabetes mellitus, endometriose, angiogenese, ateromatøs plakk-utvikling, Alzheimers sykdom, restenose, von Hippel-Lindaus sykdom, epidermal hyperproliferasjon, neurodegenerative sykdommer, aldersrelatert makuladegenerasjon og hemangiomer. For eksempel er EGFR blitt indikert ved korneal og dermal sårheling. Defekter hos Insulin-R og IGF-1 R er indikert ved type-ll diabetes mellitus. En mer fullstendig korrelasjon mellom spesifikke RTK'er og deres terapeutiske indikasjoner er angitt i Plowman et al., 1994, DN & P 7: 334-339.
Som angitt tidligere er ikke bare RTK'er, men CTK'er omfattende, men ikke begrenset til, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr og yrk (redegjort for ("reviewed by") av Bolen et al., 1992, FASEB J., 6: 3403-3409) involvert i den proliferative og metabolske signaltransduksjonsbanen, og kunne således være forventet, og er vist, å medvirke ved mange PTK-medierte lidelser som foreliggende oppfinnelse er rettet mot. For eksempel er mutert src (v-src) vist å være et oncoprotein (pp60<v> src) i k<y>lling. Videre overfører dens cellulære homolog, proto-oncogenet pp60<c><src> onkogene signaler i mange reseptorer. Over-ekspresjon av EGFR eller HER2/neu i tumorer fører til den grunnleggende aktivering av pp60<c>'<src>, som er karakteristisk for ondartede celler, men fraværende i normale celler. På den annen side oppviser mus som har mangelfull ekspresjon av c-src en osteopetrotisk fenotype, som indikerer en nøkkeldeltagelse for c-src i osteoklastfunksjon og en mulig involvering i beslektede lidelser.
Tilsvarende har Zap70 vært implisert i T-celle-signalisering, som kan være relatert til autoimmune lidelser.
STK'er er blitt forbundet med inflammasjon, autoimmun sykdom, immunoresponser og hyperproliferasjonslidelser, så som restenose, fibrose, psoriasis, osteoartritt og revmatoid artritt.
PK'er har også vært implisert i embryo-implantasjon. Således kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes til fremstilling av medikamenter for å forhindre slik embryo-implantasjon og derved være anvendelige som fødselskontrollmidler. Ytterligere lidelser som kan behandles eller forhindres ved anvendelse av forbindelsene, er immunologiske lidelser, så som autoimmun sykdom, AIDS og kardiovasulære lidelser, så som aterosklerose.
Til slutt mistenkes både RTK'er og CTK'er for tiden for å være involvert ved hyperimmunitetslidelser.
Administrering oa farmasøytiske preparat
En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, kan administreres som sådan til en menneskepasient, eller kan administreres i farmasøytiske preparater hvor foregående materialer blir blandet med egnede bærere eller tilsetningsmiddel/midler. Teknikker for formulering og administrering av medikamenter er å finne i "Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA., siste utg.
Som anvendt her, angir "administrere" eller "administrering" å gi en forbindelse med formel (I), eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, eller et farmasøytisk preparat inneholdende en forbindelse med formel (I), eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, ifølge foreliggende oppfinnelse til en organisme, med det formål å forebygge eller behandle en PK-relatert lidelse.
Egnede administreringsmåter kan omfatte, uten begrensning, oral, rektal, transmukosal eller intestinal administrering, eller intramuskulære, subkutane, intramedullære, intratekale, direkte intraventrikulære, intravenøse, intravitreale, intraperitoneale, intranasale eller intraokulære injeksjoner. De foretrukne administreringsmåter er oralt og parenteralt.
Alternativt kan man administrere forbindelsen på en lokal fremfor en systemisk måte, for eksempel via injeksjon av forbindelsen direkte inn i en fast tumor, ofte et depot- eller vedvarende frigjøringspreparat.
Videre kan man administrere medikamentet i et målrettet medikament-leveringssystem, for eksempel i et liposom belagt med tumor-spesifikt antistoff. Liposomene vil være målrettet mot og bli tatt opp selektivt av tumoren.
Farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved prosesser velkjent på området, for eksempel ved hjelp av konvensjonell blanding, oppløsning, granulering, drasjering, finmaling ("levigating"), emulgering, innkapsling, omslutning ("entrapping") eller lyofilisering.
Farmasøytiske preparater for anvendelse i henhold til foreliggende oppfinnelse, kan formuleres på konvensjonell måte ved anvendelse av én eller flere fysiologisk akseptable bærere, omfattende tilsetningsmidler og hjelpestoffer som letter bearbeiding av de aktive forbindelser til preparater som kan anvendes farmasøytisk. Riktig formulering er avhengig av administreringsmåten valgt.
For injeksjon kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres i vandige løsninger, fortrinnsvis i fysiologisk forlikelige buffere, så som Hanks'-løsning, Ringer's-løsning eller fysiologisk saltvannsbuffer. For transmukosal administrering benyttes penetreringsmidler i preparatet som er tilpasset barrieren som skal penetreres. Slike penetreringsmidler er generelt kjent på området.
For oral administrering kan forbindelsene formuleres ved å blande de aktive forbindelsene med farmasøytisk akseptable bærere som er velkjent på området. Slike bærere gjør det mulig for forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse å bli formulert som tabletter, piller, pastiller, sukkertøy, kapsler, væsker, geler, siruper, oppslemminger, suspensjoner og lignende, for oralt inntak av en pasient. Farmasøytiske preparater for oral anvendelse kan fremstilles ved anvendelse av et faststoff-tilsetningsmiddel, eventuelt maling av den resulterende blanding og bearbeiding av blandingen av granuler, etter tilsetning av andre egnede tilsetningsmidler om ønsket, for å oppnå tabletter eller kjerner som skal drasjeres. Anvendelige tilsetningsmidler er, spesielt, fyllmidler så som sukkere, omfattende laktose, sukrose, mannitol eller sorbitol, cellulosepreparater, så som for eksempel maisstivelse, hvetestivelse, risstivelse og potetstivelse, og andre materialer så som gelatin, tragantgummi, metylcellulose, hydroksypropylmetyl-cellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon (PVP). Om ønsket kan desintegreringsmidler tilsettes, så som kryssbundet polyvinylpyrrolidon, agar eller alginsyre. Et salt, så som natriumalginat, kan også anvendes.
Drasjerte kjerner er gitt egnede belegg. For dette formål kan konsentrerte sukkerløsninger anvendes, som eventuelt kan inneholde gummi arabicum, talk, polyvinylpyrrolidon, karbopolgel, polyetylenglykol og/eller titandioksyd, lakkløsninger og egnede organiske løsningsmidler eller løsningsmiddelblandinger. Fargestoffer eller pigmenter kan tilsettes til tablettene eller drasjeringsbelegg for identifikasjon eller for å karakterisere forskjellige kombinasjoner av doser av aktiv forbindelse.
Farmasøytiske preparater som kan anvendes oralt, omfatter "push-fit"-kapsler fremstilt av gelatin, så vel som myke, forseglede kapsler fremstilt av gelatin og en mykner, så som glycerol eller sorbitol. "Push-fit"-kapslene kan inneholde de aktive bestanddelene i blanding med et fyllstoff, så som laktose, et bindemiddel så som stivelse og/eller et smøremiddel så som talk eller magnesiumstearat og, eventuelt, stabiliseringsmidler. I myke kapsler kan de aktive forbindelser oppløses eller oppslemmes i egnede væsker, så som fettoljer, flytende paraffin eller flytende polyetylenglykoler. Stabiliseringsmidler kan tilsettes i disse preparater også.
Farmasøytiske preparater som også kan anvendes, omfatter harde gelatinkapsler. Som et ikke-begrensende eksempel, kan den orale medikament-produktformulering med aktiv forbindelse i kapsel ha en dosestyrke på 50 og 200 mg. De to dosestyrkene blir fremstilt av de samme granulene ved fylling i harde gelatinkapsler med forskjellig størrelse, størrelse 3 for 50 mg-kapselen og størrelse 0 for 200 mg-kapselen. Sammensetningen av preparatet kan for eksempel være som angitt i tabell 2.
Kapslene kan pakkes i brune glass- eller plastflasker for å beskytte den aktive forbindelse mot lys. Beholderne inneholdende kapsel med preparatet med den aktive forbindelse, må lagres ved kontrollert romtemperatur (15-30°C).
For administrering ved inhalering, blir forbindelsene for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse hensiktsmessig levert i form av en aerosolspray ved anvendelse av en trykksatt pakning eller en forstøver og et egnet drivmiddel som for eksempel, uten begrensning, diklordifluormetan, triklorfluormetan, diklortetra-fluoretan eller karbondioksyd. I tilfelle av en trykksatt aerosol, kan doserings-enhetet kontrolleres ved å tilveiebringe en ventil for utlevering av en oppmålt mengde. Kapsler og patroner av for eksempel gelatin, for anvendelse i en inhalator eller insufflator, kan formuleres inneholdende en pulverblanding av forbindelsen og en egnet pulverbase, så som laktose eller stivelse.
Forbindelsene kan også formuleres for parenteral administrering, for eksempel ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig infusjon. Preparater for injeksjon kan presenteres i enhetsdoseform, for eksempel i ampuller eller i multidose-beholdere, med et tilsatt konserveringsmiddel. Preparatene kan være i form av suspensjoner, løsninger eller emulsjoner i oljeaktige eller vandige konstituenter, og kan inneholde formuleringsmaterialer så som oppslemmings-, stabiliserings-og/eller dispergeringsmidler.
Farmasøytiske preparater for parenteral administrering omfatter vandige løsninger av en vannoppløselig form, så som, uten begrensning, et salt, av den aktive forbindelse. I tillegg kan suspensjoner av de aktive forbindelser fremstilles i en lipofil konstituent. Egnede lipofile konstituenter omfatter fettoljer, så som sesamolje, syntetiske fettsyreestere så som etyloleat og triglycerider eller materialer så som liposomer. Vandige injeksjonssuspensjoner kan inneholde substanser som øker viskositeten til suspensjonen, så som natriumkarboksymetylcellulose, sorbitol eller dekstran. Eventuelt kan suspensjonen også inneholde egnede stabiliseringsmidler og/eller midler som øker oppløseligheten av forbindelsene, for å tillate fremstilling av meget konsentrerte løsninger.
Alternativt kan den aktive bestanddel være i pulverform for konstitusjonering med en egnet konstituent, for eksempel sterilt, pyrogenfritt vann, før anvendelse.
Forbindelsene kan også formuleres som rektale preparater, så som suppositorier eller retensjonsklystér, ved anvendelse av for eksempel konvensjonelle suppositoriumsbaser, så som kakaosmør eller andre glycerider.
I tillegg til formuleringene beskrevet tidligere, kan forbindelsene også formuleres som depot-preparater. Slike langtidsvirkende preparater kan administreres ved implantasjon (for eksempel subkutant eller intramuskulært) eller ved intramuskulær injeksjon. En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan formuleres for denne administreringsmåte med egnede polymere eller hydrofobe materialer (for eksempel i en emulsjon med en farmakologisk akseptabel olje), med ionebytterharpikser, eller som et vanskelig oppløselig derivat så som, uten begrensning, et vanskelig oppløselig salt.
Et eksempel på en farmasøytisk bærer for de hydrofobe forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, er et ko-løsningsmiddelsystem omfattende benzylalkohol, et ikke-polart, overflateaktivt middel, en vann-blandbar, organisk polymer og en vandig fase, så som VPD-ko-løsningsmiddelsystemet. VPD er en løsning av 3 vekt/vol.% benzylalkohol, 8 vekt/vol.% av det ikke-polare, overflateaktive middel Polysorbat 80 og 65 vekt/vol.% polyetylenglykol 300, fylt opp til ønsket volum i absolutt etanol. VPD-ko-løsningsmiddelsystemet (VPD:D5W) består av VPD fortynnet 1:1 med en 5% dekstrose-i-vann-løsning. Dette ko-løsningsmiddel-systemet oppløser hydrofobe forbindelser godt og gir i seg selv lav toksisitet ved systemisk administrering. Naturligvis kan proporsjonene i et slikt ko-løsnings-middelsystem varieres betraktelig, uten å ødelegge dets oppløselighets- og toksisitetskarakteristika. Videre kan identiteten til ko-løsningsmiddelkomponen-tene varieres: for eksempel kan andre lavtoksisitets, ikke-polare, overflateaktive midler anvendes istedenfor Polysorbat 80, fraksjonsstørrelsen av polyetylenglykol kan varieres, andre bioforlikelige polymerer kan erstatte polyetylenglykol, for eksempel polyvinylpyrrolidon, og andre sukkere eller polysakkarider kan substituere dekstrose.
Alternativt kan andre leveringssystemer for hydrofobe, farmasøytiske forbindelser anvendes. Liposomer og emulsjoner er velkjente eksempler på leveringskonstituenter eller bærere for hydrofobe medikamenter. I tillegg kan visse organiske løsningsmidler, så som dimetylsulfoksyd, også anvendes, selv om det ofte er med kostnaden større toksisitet.
I tillegg kan forbindelsene leveres ved anvendelse av et vedvarende frigjøringsystem, så som semipermeable matrikser av faste, hydrofobe polymerer inneholdende det terapeutiske middel. Forskjellige materialer med vedvarende frigjøring er etablerte og er velkjente av fagfolk på området. Kapsler med vedvarende frigjøring kan, avhengig av deres kjemiske natur, frigjøre forbindelsene i fra noen få uker opp til over 100 dager. Avhengig av den kjemiske natur og den biologiske stabiliteten til det terapeutiske reagens, kan ytterligere strategier for proteinstabilisering anvendes.
De farmasøytiske preparater heri kan også omfatte egnede faststoff- eller gelfase-bærere eller -tilsetningsmidler. Eksempler på slike bærere eller tilsetningsmidler omfatter kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat, forskjellige sukkere, stivelse, cellulosederivater, gelatin og polymerer, så som polyetylenglykoler.
Mange av de PK-modulerende forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan gis som fysiologisk akseptable salter, hvor forbindelsen som det kreves beskyttelse for kan danne de negativt eller positivt ladede typer. Eksempler på salter hvor forbindelsen danner den positivt ladede gruppe omfatter kvaternære ammonium- (definert annet sted heri), salter, så som hydroklorid, sulfat, karbonat, laktat, tartrat, malat, maleat, suksinat hvor nitrogenatomet i den kvaternære ammoniumgruppen er et nitrogen i den valgte forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som har reagert med den passende syre. Salter hvor en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse danner de negativt ladede typer omfatter, uten begrensning, natrium-, kalium-, kalsium- og magnesiumsaltene dannet ved omsetning av en karboksylsyregruppe i forbindelsen med en passende base (for eksempel natriumhydroksyd (NaOH), kaliumhydroksyd (KOH), kalsiumhydroksyd (Ca(OH)2), etc).
Farmasøytiske preparater egnet for anvendelse i foreliggende oppfinnelse, omfatter preparater hvor de aktive bestanddelene finnes i en mengde tilstrekkelig til å oppnå det tilsiktede formål, for eksempel modulering av PK-aktivitet eller behandling eller forebygging av en PK-relatert lidelse.
Mer spesifikt betyr en terapeutisk effektiv mengde en mengde av forbindelse som er effektiv til å forhindre, lindre eller forbedre symptomer på sykdom eller forlenge overlevelsen til individet som behandles.
Bestemmelse av en terapeutisk effektiv mengde ligger godt innenfor evnen til fagfolk på området, spesielt i lys av den detaljerte beskrivelse gitt her.
For en hvilken som helst forbindelse anvendt ved metodene kan den terapeutisk effektive mengde eller dose beregnes innledningsvis fra cellekultur-forsøk. Deretter kan dosen formuleres for anvendelse i dyremodeller, for å oppnå et sirkulerende konsentrasjonsområde som omfatter IC5o som bestemt i cellekultur (dvs. konsentrasjonen av testforbindelsen som oppnår en halvveis maksimal hemning av PK-aktiviteten). Slik informasjon kan deretter anvendes til mer nøyaktig å bestemme anvendelige doser hos mennesker.
Toksisitet og terapeutisk effektivitet av forbindelsene beskrevet her, kan bestemmes ved standard farmasøytiske prosedyrer i cellekulturer eller forsøksdyr, for eksempel ved å bestemme IC5o og LD50 (som begge er beskrevet annet sted heri) for vedrørende forbindelse. Dataene oppnådd fra disse cellekulturforsøkene og dyrestudiene kan anvendes til å formulere et doseområde for anvendelse i mennesker. Dosen kan variere, avhengig av doseformen anvendt og administreringsmåten anvendt. Den nøyaktige formulering, administreringsmåte og dose kan velges av den individuelle lege i lys av pasientens tilstand. (Se for eksempel
Fingl, et al., 1975, i "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kap. 1, s. 1).
Dosemengde og intervall kan reguleres individuelt for å gi plasmanivåer av de aktive typer som er tilstrekkelig til å opprettholde de kinasemodulerende effekter. Disse plasmanivåer er referert til som de minste, effektive konsentrasjoner (MECs). MEC vil variere for hver forbindelse, men kan beregnes ut fra in vitro data, for eksempel kan konsentrasjonen som er nødvendig for å oppnå 50-90% hemning av en kinase bestemmes ved anvendelse av forsøkene beskrevet her. Doser nødvendig for å oppnå MEC vil avhenge av individuelle karakteristika og administreringsmåte. HPLC-assays eller bioassays kan anvendes for å bestemme plasmakonsentrasjoner.
Doseintervaller kan også bestemmes ved anvendelse av MEC-verdi. Forbindelser bør administreres ved anvendelse av et regime som opprettholder plasmanivåer over MEC i 10-90% av tiden, fortrinnsvis mellom 30-90% og mest foretrukket mellom 50-90%.
For tiden kan de terapeutisk effektive mengdene av forbindelser med formler I, la eller II være i området fra omtrent 25 mg/m<2> til 1500 mg/m<2> pr. dag; fortrinnsvis ca. 3 mg/m<2>/dag. Enda mer foretrukket 50 mg/qm qd til 400 mg/qd.
I tilfeller med lokal administrering eller selektivt opptak, kan den effektive, lokale konsentrasjon av medikamentet ikke være relatert til plasmakonsentrasjon, og andre prosedyrer kjent på området kan anvendes for å bestemme den korrekte dosemengde og -intervall.
Mengden av et preparat administrert vil, selvfølgelig, være avhengig av individet som behandles, alvorlighetsgraden av plagen, administreringsmetoden, bedømmelsen gjort av den foreskrivende lege etc.
Preparatene kan, om ønsket, presenteres i en pakke eller dispenser-anordning, så som et FDA-godkjent sett, som kan inneholde én eller flere enhetsdoseformer inneholdende den aktive bestanddel. Pakken kan for eksempel omfatte metall eller plastfolie, så som en blærepakning. Pakken eller dispenser-anordningen kan være ledsaget av instruksjoner for administrering. Pakken eller dispenseren kan også være ledsaget av en meddelelse i tilknytning til beholderen i en form forordnet av et direktorat ("a governmental agency") som kontrollerer fremstillingen, anvendelsen eller salget av farmasøytiske midler, idet denne forordningen reflekterer godkjennelse fra direktoratet av formen av preparatet eller av administrering til mennesker eller dyr. En slik forordning kan for eksempel være en slik merking som er godkjent av U.S. Food and Drug Administration for reseptpliktige medikamenter, eller i form av et vedlegg om godkjent produkt. Preparater omfattende en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse formulert i en forlikelig, farmasøytiske bærer kan også fremstilles, plassert i en passende beholder og merket for behandling av en angitt tilstand. Egnede tilstander angitt på merkingen kan omfatte behandling av en tumor, hemning av angiogenese, behandling av fibrose, diabetes og lignende.
Foreliggende oppfinnelse kan administreres med en CMC-oppslemmingskonstituent. Et eksempel på CMC-oppslemming er listet opp nedenfor i tabell 3.
En protokoll for en 1,0 liters CMC-oppslemmingskonstituent er som følger. Beregn den passende mengde av tilsetningsmidler nødvendig for å lage konstituentformuleringen ved anvendelse av tabellen som viser sammensetningen av konstituentformuleringen og satsstørrelsen. Vei en egnet, tom beholder, så som en ren, vidmunnet glassflaske eller en polyetylenflaske. Tilsett ca. 600 ml vann til beholderen. Vei karboksymetylcellulosenatrium (5 g) og overfør til beholderen. Rør om ved anvendelse av en magnetisk rørestav eller en laboratorierøreinnretning med propell inntil homogen (omtrent 2-3 timer). Vei NaCI og tilsett til beholderen. Fortsett blanding inntil oppløst (omtrent 10 minutter). Tilstt polysorbat 80. Bland inntil løsningen er homogen (omtrent 20 minutter). Tilsett benzylalkohol. Bland inntil løsningen er homogen (omtrent 10 minutter). Tilsett det gjenværende vann for å bringe vekten til løsningen opp til den nødvendige satsstørrelse, enten etter vekt eller volum (1010 g eller 1000 ml, densitet ved 22°C er 1,01). Lagre ved 2-8°C (under kjøling).
Suspensjonsformuleringen kan fremstilles som følger. Knus API ved anvendelse av en morter og pestill for å oppnå et homogent utseende pulver med liten partikkelstørrelse (ingen klumper eller store partikler, bør ideelt sett passere gjennom en US Standard Sieve > 80, dvs. < 180 pm størrelse). Vei den beregnede mengde av API opp i beholderen. Tilsett ca. 90% av den totale, nødvendige mengde av (CMC-oppslemmingskonstituent) til beholderen. Slem opp forbindelser i konstituenten ved anvendelse av en laboratorierøreinnretning med propell eller tilsvarende. Diameteren til propellbladene bør passe til diameteren til bunnen av beholderen for å sikre effektiv blanding. Rør ved 50 rpm i 30 minutter eller inntil medikamentet er godt oppslemmet. Tilsett konstituentformuleringen til "qs" (øk vannmengden) (kvalitet tilstrekkelig) til den passende vekt svarende til satsstørrelsen. Rør ved 50 rpm i ytterligere 30 minutter. Alikvoter oppslemmingen umiddelbart i ravgult fargede glass- eller polypropylen-beholdere. Beholdere må beskyttes mot lys. Rør ved 2-8°C (under kjøling, ikke frys).
Det er også et aspekt ved foreliggende oppfinnelse at en forbindelse beskrevet her, eller dens salt eller promedikament, kan bli kombinert med andre kjemoterapeutiske midler for for fremstilling av medikamenter til behandling av sykdommene og lidelsene beskrevet ovenfor. For eksempel kan en forbindelse, eller salt ifølge foreliggende oppfinnelse bli kombinert med alkyleringsmidler, så som fluoruracil (5-FU) alene eller i ytterligere kombinasjon med leukovorin; eller andre alkyleringsmidler så som andre pyrimidinanaloger så som UFT, capecitabin, gemcitabin og cytarabin, alkylsulfonatene, for eksempel busulfan (anvendt ved behandling av kronisk granulocyttleukemi), improsulfan og piposulfan; aziridiner, for eksempel benzodepa, carboquon, meturedepa og uredepa; etyleniminer og metylmelaminer, for eksempel altretamin, trietylenmelamin, trietylenfosforamid, trietylentiofosforamid og trimetylolmelamin; og nitrogensennepene, for eksempel chlorambucil (anvendt ved behandling av kronisk lymfocyttleukemi, primær makro-globulinemi og non-Hodgkins lymfom), cyklofosfamid (anvendt ved behandling av Hodgkins sykdom, multippel-myelom, neuroblastoma, brystkreft, eggstokk-kreft, lungekreft, Wilms tumor og rhabdomyosarkom), estramustin, ifosfamid, novembrichin, prednimustin og uracil-mustard (anvendt ved behandling av primær trombocytose, non-Hodgkins lymfom, Hodgkins sykdom og eggstokk-kreft); og triaziner, for eksempel dakarbazin (anvendt ved behandling av mykvev-sarkom).
En forbindelse, et salt eller promedikament ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i kombinasjon med andre antimetabolitt-kjemoterapeutiske midler så som folinsyreanaloger, for eksempel methotrexat (anvendt ved behandling av akutt lymfocyttleukemi, choriokarsinom, mycosis fungiodes brystkreft, hode- og halskreft og osteogent sarkom) og pteropterin; og purinanalogene så som merkaptopurin og tioguanin, som finner anvendelse ved behandling av akutt granulocytt-, akutt lymfocytt- og kronisk granulocyttleukemi.
Det er ment at en forbindelse eller et salt ifølge foreliggende oppfinnelse også kan anvendes i kombinasjon med kjemoterapeutiske midler som er basert på naturlig produkt, så som, uten begrensning, vinca-alkaloidene, for eksempel vinblastin (anvendt ved behandling av bryst- og testikkelkreft), vincristin og vindesin; epipodofyllotoksinene, for eksempel etoposid og teniposid, som begge er anvendelige ved behandling av testikkelkreft og Kaposis sarkom; de antibiotiske, kjemoterapeutiske midler, for eksempel daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomycin (anvendt for å behandle mage-, cervix-, tykktarm-, bryst-, blære- og pankreaskreft), dactinomycin, temozolomid, plicamycin, bleomycin (anvendt ved behandling av hud-, spiserørs- og genitourinkanalkreft); og de enzymatiske, kjemoterapeutiske midler, så som L-asparaginase.
I tillegg til ovennevnte kunne en forbindelse eller et salt ifølge foreliggende oppfinnelse også anvendes i kombinasjon med platina-koordinasjonskompleksene (cisplatin, etc); substituerte urinstoffer, så som hydroksyurinstoff; metylhydrazin-derivater, for eksempel prokarbazin; adrenokortiko-undertrykkelsesmidler, for eksempel mitotan, aminoglutethimid; og hormon og hormon-antagonister, så som adrenokortikosteroidene (for eksempel prednison), progestiner (for eksempel hydroksyprogesteroncaproat); østrogener (for eksempel dietylstilbesterol); antiøstrogener, så som tamoxifen; androgener, for eksempel testosteron-propionat; og aromatase-inhibitorer, så som anastrozol.
Til slutt er det også ment at kombinasjonen av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse vil være effektiv i kombinasjon med mitoksantron, paclitaxel, cyklooksygenase-2-inhibitorer kjent på området, spesielt Celebrex<®>, Paracoxib<®>, Vioxx<®>, Abbotfs Cox-189 beskrevet i PCT-publ. nr. WO 99/11605, topoisomerase-inhibitorer, så som Camptosar<®>, Her-2-reseptorantagonist, så som Herceptin<®>, endostatin, Gleevac<®>, ImClone VEGF-reseptorantagonist IMC C225<® >for behandling av fast tumor-kreft eller leukemier så som, uten begrensning, akutt myelogen (ikke-lymfocytt) leukemi.
Generell svnteseprosedvre.
Den følgende, generelle metodikk kan anvendes for å fremstille forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse: Det passende substituerte 2-oksindol (1 ekv.), det passende substituerte 3-karboksy-5-formylpyrrol (1,2 ekv.) og en base (0,1 ekv.) blir blandet i et løsningsmiddel (1-2 ml/mmol 2-oksindol) og blandingen blir deretter oppvarmet i fra ca. 2 til ca. 12 timer. Etter avkjøling blir fellingen som dannes filtrert, vasket med kald etanol eller eter og vakuumtørket, hvilket gir tilsvarende 5-(2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl)-1-H-pyrrol-3-karboksylsyre. Hvis det ikke dannes noe presipitat blir reaksjonsblandingen inndampet og residuet blir utgnidd med diklormetan/eter, det resulterende, faste stoffet blir oppsamlet ved filtrering og deretter tørket. Produktet kan eventuelt bli ytterligere renset ved kromatografi.
Basen kan være en organisk eller en uorganisk base. Hvis en organisk base blir anvendt, er det fortrinnsvis en nitrogenbase. Eksempler på organiske nitrogenbaser omfatter, men er ikke begrenset til, diisopropylamin, trimetylamin, trietylamin, anilin, pyridin, 1,8-diazabicyklo[5.4.1]undec-7-en, pyrrolidin og piperidin.
Eksempler på uorganiske baser er, uten begrensning, ammoniakk, alkalimetall- eller jordalkalimetallhydroksyder, fosfater, karbonater, bikarbonater, bisulfater og amider. Alkalimetallene omfatter litium, natrium og kalium, mens jordalkalimetallene omfatter kalsium, magnesium og barium.
I en for tiden foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er basen, når løsningsmidlet er et protisk løsningsmiddel, så som vann eller alkohol, en uorganisk alkalimetall- eller jordalkalimetallbase, fortrinnsvis et alkalimetall- eller et jordalkalimetallhydroksyd.
Det vil være klart for fagfolk på området, basert både på kjente, generelle prinsipper ved organisk syntese og på det som beskrives her, hvilken base som ville være mest passende for den angitte reaksjonen.
Løsningsmidlet som reaksjonen blir utført i kan være et protisk eller et aprotisk løsningsmiddel, fortrinnsvis er det et protisk løsningsmiddel. Et "protisk løsningsmiddel" er et løsningsmiddel som har hydrogenatom(er) kovalent bundet til oksygen, eller nitrogenatomer som gjør hydrogenatomene tilstrekkelig sure og således i stand til å bli "delt" med en solut via hydrogenbinding. Eksempler på protiske løsningsmidler omfatter, uten begrensning, vann og alkoholer.
Et "aprotisk løsningsmiddel" kan være polart eller ikke-polart, men inneholder ikke i noen av tilfellene sure hydrogener, og er derfor ikke i stand til hydrogenbinding med soluter. Eksempler, uten begrensning, på ikke-polare, aprotiske løsningsmidler, er pentan, heksan, benzen, toluen, metylenklorid og karbontetraklorid. Eksempler på polare, aprotiske løsningsmidler er kloroform, tetrahydrofuran, dimetylsulfoksyd og dimetylformamid.
I en for tiden foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er løsningsmidlet et protisk løsningsmiddel, fortrinnsvis vann, eller en alkohol så som etanol.
Reaksjonen blir utført ved temperaturer høyere enn romtemperatur. Temperaturen er generelt fra ca. 30°C til ca. 150°C, fortrinnsvis ca. 80°C til ca. 100°C, mest foretrukket ca. 60°C til ca. 85°C, som er omtrent kokepunktet til etanol. Med "ca." er ment at temperaturområdet fortrinnsvis er innen 10 grader Celcius i forhold til den angitte temperatur, mer foretrukket innen 5 grader Celcius i forhold til den angitte temperatur og, mest foretrukket, innen 2 grader Celcius i forhold til den angitte temperatur. Således er det for eksempel med "ca. 75°C", ment 75°C ± 10°C, fortrinnsvis 75°C ± 5°C, og mest foretrukket, 75°C ± 2°C.
2-oksindoler og 3-karboksy-5-formylpyrrol kan lett syntetiseres ved anvendelse av teknikker som er velkjente på de kjemiske fagområder, ved anvendelse av lett tilgjengelige utgangsmaterialer.
Kobling av en 5-(2-okso-1,2-dihydroindol-(3Z)ylidenmetyl)-1-H-pyrrol-3-karboksylsyre med et amin med formel ZCH(R5)-CR4(OH)-CHR3NH2 i et organisk løsningsmiddel, så som dimetylformamid, tetrahydrofuran og lignende, og i nærvær av et egnet koblingsmiddel, så som dicykloheksylkarbodiimid, DEAD, EDC og HOBt, tilveiebringer deretter en forbindelse med formel (I). Aminer med formel ZCH (R5)-CR4(OH)-CHR3NH2 er kommersielt tilgjengelige, eller de kan fremstilles ved en metode som er velkjent på fagområdet. Noen slik prosedyrer er beskrevet her, nedenfor.
Det vil forstås av fagfolk på området at andre syntetiske måter for å danne forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse på er tilgjengelig, og at de følgende er gitt som eksempler og ikke som begrensning.
EKSEMPLER
De følgende preparater og eksempler er gitt for å gjøre fagfolk på området i stand til klarere å forstå og utføre foreliggende oppfinnelse. De skal ikke anses som begrensende for omfanget av foreliggende oppfinnelse, men bare som illustrerende og representative for denne.
Svnteseeksempler
Mellomprodukteksempel 1
Syntese av 5-[5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-
1 H-pyrrol-3-karboksylsyre.
Trinn 1
Dimetylformamid (25 ml, 3 ekv.) ble avkjølt med omrøring i et isbad. Til dette ble det tilsatt POCI3 (1,1 ekv., 10,8 ml). Etter 30 minutter ble en løsning av 3,5-dimetyl-4-etylesterpyrrolen (17,7 g, 105,8 mmol) i DMF (2M, 40 ml) satt til reaksjonen og omrøring fortsatt. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen fortynnet med vann (250 ml) og gjort basisk til pH=11 med 1N vandig NaOH. Det hvite, faste stoffet ble fjernet ved filtrering, skylling med vann og deretter heksaner og tørket, hvilket gir 5-formyl-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre-etylester (19,75 g, 95%) som et gyldenbrunt, fast stoff. <1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) 8 12,11 (br s, 1H, NH), 9,59 (s, 1H, CHO), 4,17 (q, J = 6,7Hz, 2H, OCH2CH3), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3), 1,26 (d, J = 6,7Hz, 3H, OCH2CH3).
Trinn 2
5-formyl-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre-etylester (2 g, 10 mmol) ble satt til en løsning av kaliumhydroksyd (3 g, 53 mmol) oppløst i metanol (3 ml) og vann (10 ml). Blandingen ble tilbakeløpskokt i 3 timer, avkjølt til romtemperatur og surgjort med 6 N saltsyre til pH 3. Det faste stoffet ble oppsamlet ved filtrering, vasket med vann og tørket i en vakuumovn natten over, hvilket gir 5-formyl-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre (1,6 g, 93%). <1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 8 12,09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH3), 2,40 (s, 3H, CH3).
Trinn 3
5-fluorisatin (8,2 g, 49,7 mmol) ble oppløst i 50 ml hydrazinhydrat og tilbakeløpskokt i 1 time. Reaksjonsblandingene ble deretter hellet i isvann. Fellingen ble deretter filtrert, vasket med vann og tørket under vakuumovn, hvilket gir 5-fluor-2-oksindol (7,5 g).
Trinn 4
Reaksjonsblandingen av 5-fluoroksindol (100 mg, 0,66 mmol), 5-formyl-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre (133 mg, 0,79 mmol) og 10 dråper piperidin i etanol (3 ml) ble omrørt ved 60°C natten over og filtrert. Det faste stoffet ble vasket med 1 M vandig hydrokloridløsning, vann og tørket, hvilket gir 5-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre (201 mg, kvantitativt) som et gult, fast stoff. MS m/z (relativ intensitet, %) 299 ([M-1]<+>, 100).
Eksempel 3
Syntese av 5-[5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid.
Trinn 1
En blanding av morfolin (2,6 ml, 30 mmol) og epiklorhydrin (2,35 ml, 30 mmol) i etanol (50 ml) ble omrørt ved 70°C natten over. Etter fjerning av løsningsmidlet ble residuet fortynnet med metylenklorid (50 ml). Det klare faststoffet utfelt ble oppsamlet ved vakuumfiltrering, hvilket gir 1 -klor-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol (2,0 g, 37%). <1>H NMR (DMSO-d6) 8 3,49 (t, J=4,8 Hz, 2H), 3,60 (t, J=4,6Hz, 2H), 3,75-(m, 4H, 2xCH2), 4,20 (dd, J=5,2, 12 Hz, 2H), 4,54 (m, 2H), 4,62 (m, 1H, CH), 6,64 (d, J=6,4 Hz, 1H, OH). MS (m/z) 180,2 (M+1).
Trinn 2
1-klor-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol (2,0 g, 11 mmol) ble behandlet med løsningen av NH3 i metanol (25 vekt%, 20 ml) ved romtemperatur. Nitrogen ble boblet inn i reaksjonsblandingen for å fjerne ammoniakken. Inndampning av løsningsmiddel ga hydrogenkloridsaltet av 1-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol
(2,0 g, 91%). <1>H NMR (DMSO-d6) 8 2,30 (d, J=6,0Hz, 2H), 2,36 (m, 4H, NCH2), 2,65 (dd, J=8,4, 12,8Hz, 1H), 2,91 (dd, J=3,6, 12,8Hz, 1H), 3,52 (m, 4H, OCH2), 3,87 (m, 1H, CH), 5,32 (s, 1H, OH), 8,02 (brs., 3H, NH3<+>). MS (m/z) 161,1 (M+1).
Trinn 3
5-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre (120 mg, 0,4 mmol) ble kondensert med 1 -amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol (74 mg, 0,48 mmol) for å utfelle 5-[5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid (65 mg, 36%). Modervæsken ble inndampet til tørrhet og residuet ble renset ved flash-kromatografi, hvilket gir ytterligere 2N (70 mg, 39%). <1>H NMR (DMSO-de) 8 2,28 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2,40,2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3,15 (s, 1H), 3,31 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,78 (m, 1H), 4,73 (brs, 1H, OH), 6,82 (dd, J=4,5, 8,4Hz, 1H), 6,90 (td, <2>J=2,8, <3>J=10,0Hz, 1H), 7,53 (m, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J=2,0, 9,6Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,87 (s, 1H, CONH), 13,66 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 441,4 (M-1).
Syntese av 2-hydroksy-7-oksa-4-azoniaspiro[3.5]nonanklorid.
Til en 1-liters, 3-halset rundkolbe, utstyrt med et termoelement, nitrogeninnløp og en 250 ml tilsetningstrakt, ble det tilsatt morfolin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 ekv.) og 100 ml etanol. Løsningen ble omrørt raskt mens epiklorhydrin (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol, 1,03 ekv.) ble tilsatt fra tilsetningstrakten i løpet av ca. 30 minutter. Temperaturen ble overvåket og da satstemperaturen nådde 27°C ble reaksjonsblandingen avkjølt med et isvannbad. Den klare løsningen ble omrørt i 18 timer. Reaksjonen ble målt ved hjelp av GC (fortynn 5 dråper reaksjonsblanding i 1 ml etanol og injiser i en 15m DB-5 kapillær-GC-kolonne med de følgende parametere for målingen: Injektor 250°C, detektor 250°C , innledende ovnstemperatur 28°C med oppvarming til 250°C med 10°C pr. minutt.). Reaksjonen ble fullført med mindre enn 3% morfolin gjenværende. Reaksjonsblandingen ble inndampet på rotasjonsfordamperen ved 50°C med fullt husvakuum, inntil ikke mer destillat kunne kondenseres. Den resulterende olje ble lagret ved romtemperatur i 24-48 timer, eller inntil en betydelig masse av krystaller ble observert (kimsatt vil sette fortgang i prosessen). Oppslemningen ble fortynnet med 250 ml aceton og filtrert. De faste stoffene ble tørket i vakuum-ovnen ved 60°C i 18-24 timer. Dette ga 84 g krystallinsk produkt. Modervæskene kunne bli inndampet og krystalliseringsprosessen gjentatt med økende gjenvinning. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 6,55 (d, 1 H), 4,64 (m, 1 H), 4,53 (m, 2H), 4,18 (m, 2 H), 3,74 (m, 4 H), 3,60 (m, 2 H), 3,48 (m, 2H). <13>C NMR (100 MHz, DMSO-de) 8 70,9, 61,39, 61,04, 60,25, 58,54, 57,80.
Syntese av 1-amino-3-(4-morfolinyl)-2-propanol (Racemisk).
Til en 3-liters, 1-halset rundkolbe med en magnetisk rørestav ble det satset 2-hydroksy-7-oksa-4-azoniaspiro[3.5]nonanklorid (150 g, 835 mmol), fulgt av 23 vekt% vannfri ammoniakk i metanol (2120 ml). Kolben ble plugget igjen og den resulterende, klare løsning ble omrørt ved 20-23°C i 18 timer.
GC under betingelsene ovenfor viste ikke noe gjenværende utgangsmateriale. Pluggen ble fjernet og ammoniakken fikk boble ut av løsningen i 30 minutter.
Kolben ble deretter overført til en rotasjonsfordamper og inndampet til et hvitt, fast stoff med 45°C bad og fullt husvakuum. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 3,57 (dd, 2H), 3,3-3,5 (m, 6 H), 2,59 (m, 2 H), 2,2-2,4 (m, 6 H); <13>C NMR (100 MHz DMSO-de) 8 70,8, 67,1,60,1,53,8, 48,1.
Ved å følge metoden beskrevet i eksempel 3 ovenfor, men ved å substituere 2-(RS)-1-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol med 2-(S)-1-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol fremstilt som beskrevet nedenfor, ble den ønskede forbindelse 5-[5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-(S)-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)-amid oppnådd.
Syntese av 1 -amino-3-(4-morfolinyl)-2-propanol. (Ikke-racemisk).
Til 1-liters, 3-halset rundkolbe, utstyrt med mekanisk omrøring, termoelement og tilsetningstrakt, ble det tilsatt morfolin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 ekv.) og 45 ml t-butanol. Løsningen ble omrørt raskt, med tilsetning av R-epiklorhydrin (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol. 1,03 ekv.) fra tilsetningstrakten i løpet av ca. 30 minutter. Temperaturen ble overvåket, og da satstemperaturen nådde 27°C ble reaksjonsblandingen avkjølt med et isvannbad. Den klare løsningen ble omrørt i 18 timer. Reaksjonen ble målt ved hjelp av GC (fortynn 5 dråper reaksjonsblanding i 1 ml etanol og injiser i en 15m DB-5 kapillær-GC-kolonne med de følgende parametere for målingen, injektor 250°C, detektor 250°C, innledende ovnstemperåtur 28°C med oppvarming til 250°C med 10°C pr. minutt). Reaksjonen ble fullført med mindre enn 3% morfolin gjenværende. Løsningen ble avkjølt til 10°C og en 20 vekt% løsning av kalium-t.butoksyd i TH F (576 g) ble tilsatt dråpevis mens temperaturen ble holdt lavere enn 15°C. Den resulterende, hvite oppslemning ble omrørt ved 10-15°C i 2 timer og kontrollert ved hjelp av GC ved anvendelse av betingelsene ovenfor. Ikke noe av klorhydrinet kunne observeres. Blandingen ble inndampet på rotasjonsfordamperen ved anvendelse av et 50°C bad og fullt husvakuum. Den resulterende blanding ble fortynnet med vann (500 ml) og metylenklorid. Fasene ble separert og den vandige fasen vasket med metylenklorid (500 ml). De samlede organiske lag ble tørket over natriumsulfat og inndampet til en klar, fargeløs olje. Dette ga 145 g, 97% utbytte, av epoksydet. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 3,3 (dd, 4 H), 3,1 (m, 1 H), 2,6 (dd, 1 H), 2,5 (dd, 1 H), 2,4 (m, 4 H), 2,2 (dd, 2 H); <13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5 65,4, 60,1,53,1,48,9, 43,4.
Det rå epoksydet ovenfor ble satt til en 3-liters, 1 -halset rundkolbe med en magnetisk rørestav. Vannfri ammoniakk i metanol (24 vekt% 2,5 liter) ble tilsatt, kolben ble plugget igjen og blandingen omrørt ved romtemperatur i 24 timer. GC under betingelsene ovenfor viste ikke noe gjenværende utgangsmateriale. Pluggen ble fjernet og ammoniakken fikk boble ut av løsningen i 30 minutter. Kolben ble deretter overført til en rotasjonsfordamper og inndampet til en klar, fargeløs olje med et 45°C bad og fullt husvakuum. Dette ga 124 g produkt. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 3,57 (dd, 2H), 3,3-3,5 (m, 6 H), 2,59 (m, 2 H), 2,2-2,4 (m, 6 H); <13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 70,8, 67,1, 60,1, 53,8, 48,1.
Syntese av 1-amino-3-(4-morfolinyl)-2-(S)propanol.
Til en 1-liters, 3-halset rundkolbe, utstyrt med mekanisk omrøring, termoelement og tilsetningstrakt, ble det tilsatt morfolin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 ekv.) og 200 ml metanol. Løsningen ble omrørt raskt med tilsetning av R-epiklorhydrin (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol, 1,03 ekv.) fra tilsetningstrakten i løpet av ca. 30 minutter. Temperaturen ble overvåket, og da satstemperatur nådde 27°C ble reaksjonsblandingen avkjølt med et isvannbad. Den klare løsningen ble omrørt i 18 timer. Reaksjonen ble målt ved hjelp av GC (fortynn 5 dråper reaksjonsblanding i 1 ml etanol og injiser i en 15m DB-5 kapillær-GC-kolonne med de følgende parametere for målingen: injektor 250°C, detektor 250°C, innledende ovnstemperatur 28°C, med oppvarming til 250°C med 10°C pr. minutt.). Reaksjonen ble fullført med mindre enn 3% morfolin gjenværende. Løsningen ble avkjølt til 10°C og en 25 vekt% løsning av natriummetoksyd i metanol (233 g, 1,08 mol, 247 ml) ble tilsatt dråpevis mens temperaturen ble holdt lavere enn 15°C. Den resulterende, hvite oppslemning ble omrørt ved 10-15°C i 2 timer og kontrollert ved hjelp av GC ved anvendelse av betingelsene ovenfor. Ikke noe av klorhydrinet kunne observeres. Blandingen ble inndampet på rotasjonsfordamperen ved anvendelse av et 50°C bad og fullt husvakuum. Den resulterende blanding ble fortynnet med vann (500 ml) og metylenklorid. Fasene ble separert og den vandige fasen vasket med metylenklorid (500 ml). De samlede organiske lag ble tørket over natriumsulfat og inndampet til en klar, fargeløs olje. Dette ga 145 g, 97% utbytte, av 1,2-epoksy-3-morfolin-4-ylpropan. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 3,3 (dd, 4 H), 3,1 (m, 1 H), 2,6 (dd, 1 H), 2,5 (dd, 1 H), 2,4 (m, 4 H), 2,2 (dd, 2 H); <13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 65,4, 60,1, 53,1, 48,9, 43,4.
Den rå 1,2-epoksy-3-morfolin-4-ylpropanen ovenfor ble tilsatt til en 3-liters, 1 -halset rundkolbe med en magnetisk rørestav. Vannfri ammoniakk i metanol (24 vekt% 2,5 liter) ble tilsatt, kolben ble plugget igjen og blandingen omrørt ved romtemperatur i 24 timer. GC under betingelsene ovenfor viste ikke noe gjenværende utgangsmateriale. Pluggen ble fjernet og ammoniakken fikk boble ut av løsningen i 30 minutter. Kolben ble deretter overført til en rotasjonsfordamper og inndampet til en klar, fargeløs olje med et 45°C bad og fullt husvakuum. Dette ga 124 g 1-amino-3-(4-morfolinyl)-2-(S)propanol. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 3,57 (dd, 2H), 3,3-3,5-(m, 6 H), 2,59 (m, 2 H), 2,2-2,4 (m, 6 H); <13>C NMR (100 MHz, DMSO-de) 8 70,8, 67,1, 60,1, 53,8, 48,1.
Imidazolamid (7,0 g, 32,3 mmol), amin (15,0 g, 64,6 mmol), 5-fluoroksindol (4,93 g, 32,6 mmol), trietylamin (9,79 g, 96,9 mmol) og THF (88 ml) ble blandet og oppvarmet til 60°C. En brun løsning ble dannet. Etter omrøring i 24 timer ved 60°C ble den gule oppslemning avkjølt til rt (romtemperatur) og filtrert. Kaken ble vasket med 80 ml THF og tørket natten over ved 50°C under husvakuum. Et brunt, fast stoff (23,2 g) ble oppnådd. Det faste stoffet ble oppslemmet i 350 ml vann i 5 timer ved romtemperatur og filtrert. Kaken ble vasket med 100 ml vann og tørket ved 50°C under husvakuum natten over. 8,31 g ble oppnådd med 56% kjemisk utbytte.
En 0,25-liters kolbe utstyrt med et termometer, kjøler, magnetisk omrøring og nitrogeninnløp ble tilsatt 4,92 g 5-fluoroksindol, 7,0 g imidazolamid, 15,5 g (R)-1-amino-3-(4-morfolinyl)-2-propanol, 9,78 g trietylamin og 88 ml tetrahydrofuran. Blandingen ble oppvarmet til 60°C i 16,5 timer. Reaksjonen ble avkjølt til omgivelsestemperatur og filtrert. De faste stoffene oppnådd blir oppslemmet (3) tre påfølgende ganger i acetonitril ved 11 ml/g, tørket i vakuum for 3,6 g (25,25%).
[HPLC, Hypersil BDS, C-18, 5u, (6:4), Acetonitril:0,1M ammoniumklorid, PHA-571437 = 4,05 min.] H<1>NMR (DMSO): 8 10,86 (1H, bs); 7,75 (1H, d); 7,70 (1H, s);
7,50 (1H, m); 6,88 (2H, m); 4,72 (1H, bs); 3,78 (1H, bs); 3,56 (4H, m); 3,32 (6H, m);3,15(1H, m); 2,43 (8H, bm).
Eksempel 4
Syntese av 2,4-dimetyl-5-[2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3 morfolin-4-yl-propyl)amid.
5-(2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksyl-syre (113 mg, 0,4 mmol) ble kondensert med 1-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol (74 mg, 0,48 mmol) for å utfelle 2,4-dimetyl-5-[2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)yliden-metyl]-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid (77 mg, 45,3%). <1>H NMR (DMSO-d6) 5 2,27 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3,15 (s, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J=4,8Hz, 1H, OH), 6,86 (d, J=7,6Hz, 1H), 6,96 (t, J=7,2 Hz, 1H), 7,10 (t, J=7,6Hz, 1H), 7,49 (t, J=5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,77 (d, J=8,0 Hz, 1H)
(aromatisk og vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 425,4 (M+1).
Eksempel 5
Syntese av 5-[5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid.
5-(5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre (126,6 mg, 0,4 mmol) ble kondensert med 1-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol (74 mg, 0,48 mmol) for å utfelle 5-[5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)-ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid (107 mg, 58%). <1>H NMR (DMSO-d6) 8 2,29 (m, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,39 (m, 4H), 2,40,2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3,15 (s, 1H), 3,37 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J=4,8Hz, 1H, OH), 6,85 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,0,8,0Hz, 1H), 7,53 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,97 (d, J=2,0Hz, 1H)
(aromatisk og vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 457,4 (M-1).
R- og S-stereoisomerer kan fremstilles som følger.
Imidazolamid (7,0 g, 32,3 mmol), amin (15,5 g, 96,9 mmol), 5-kloroksindol (5,48 g, 32,6 mmol), trietylamin (14 ml) og THF (88 ml) ble blandet og oppvarmet til 60°C. En rød løsning ble dannet. Etter omrøring i 16 timer ved 60°C, ble den gule oppslemning avkjølt til romtemperatur og filtrert. Kaken ble vasket med 2 x 50 ml THF og tørket natten over ved 50°C under husvakuum. 4,36 g ble oppnådd med 29% kjemisk utbytte.
Imidazolamid (6,8 g, 31,3 mmol), amin (10,0 g, 62,5 mmol), 5-kloroksindol (5,3 g, 31,6 mmol) og THF (100 ml) ble blandet og oppvarmet til 60°C. En rød løsning ble dannet. Etter omrøring i 68 timer ved 60°C, ble trietylamin (14 ml) tilsatt og omrørt i 5 timer ved 60°C. Omsetningen var ikke fullstendig. Tilsett 4,6 g aminsidekjede og omrørt i 20 timer ved 60°C. Den gule oppslemning ble avkjølt til romtemperatur og filtrert. Kaken ble vasket med 2 x 50 ml THF og tørket natten over ved 50°C under husvakuum. 5,48 g ble oppnådd med 38% kjemisk utbytte.
Eksempel 6
Syntese av 5-[5-brom-2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid.
5-(5-brom-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre (72,2 mg, 0,2 mmol) ble kondensert med 1-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol (38 mg, 0,24 mmol) for å utfelle 5-[5-brom-2-okso-1,2-dihydroindol-(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)amid (55 mg, 55%). <1>H NMR (DMSO-d6) 5 2,27 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,39 (m, 4H), 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 3,13 (s, 1H), 3,35 (m, 1H), 3,55 (m, 4H),
3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J=4,4Hz, 1H, OH), 6,80 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J=2,0, 8,0Hz, 1H), 7,51 (t, J=5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J=2,0Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 503,4 (M-1).
Eksempel 7
Syntese av 2,4-dimetyl-5-[2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)amid.
Trinn 1
En blanding av 3-[1,2,3]triazol (2,0 g, 29 mmol), epiklorhydrin (3,4 ml, 43,5 mmol) og N,N-diisopropyletylamin (2,6 ml, 15 mmol) i etanol (50 ml) ble omrørt ved romtemperatur natten over. Etter fjerning av løsningsmidlene, ble residuet renset ved flash-kromatografi (CH2CI2/CH3OH=100/1-100/2-100/4), hvilket gir 1-klor-3-(1,2,3)triazol-2-ylpropan-2-ol (2,1 g, 45%). <1>H NMR (CDCI3) 8 3,52 (m, 2H, OH og CH2), 3,60 (dd, J=5,2, 11,2 Hz, 1H), 4,36 (m, 1H, CH), 4,68 (m, 2H), 7,67 (s, 2H). MS (m/z) 162,1 (M+1) og 1-klor-3-(1,2,3) triazol-1-ylpropan-2-ol (2,3 g, 49%). <1>H NMR (CDCI3) 8 3,56 (s, 1H), 3,57 (s, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,53 (dd, J=7,2,14 Hz, 1H), 4,67 (dd, J=3,8, 14Hz, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,71 (s, 1H). MS (m/z) 162,1 (M+1).
Trinn 2
1-klor-3(1,2,3)triazol-1-ylpropan-2-ol (2,3 g, 13 mmol) ble behandlet med løsningen av NH3 i metanol (25 vekt%, 20 ml) ved 60°C natten over i et forseglet trykk-kar. Etter avkjøling til romtemperatur ble nitrogen boblet inn i reaksjonsblandingen for å fjerne ammoniakken. Inndampning av løsningsmiddel ga hydrogenkloridsaltet av 1-amino-3-(1,2,3)triazol-1-ylpropan-2-ol (2,57 g, 100%). <1>H NMR (DMSO-de) 8 2,68 (dd, J=8,8, 12,8Hz, 1H), 2,97 (dd, J=3,6, 12,8Hz, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,44 (dd, J=6,4, 14Hz, 1H), 4,57 (dd, J=4,6, 14Hz, 1H), 5,95 (d, J=5,2Hz, 1H, OH), 7,77 (s, 1H), 8,01 (brs., 3H, NH3<+>), 8,12 (s, 1H). MS (m/z) 143,1 (M+1).
Trinn 3
5-(2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1 H^ syre (113 mg, 0,4 mmol) ble kondensert med 1-amino-3-(1,2,3) triazol-1-yl-propan-2-ol (85 mg, 0,48 mmol) for å utfelle 2,4-dimetyl-5-[2-okso-1,2-dihydro-indol(3Z)ylidenmetyl]-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-[1,2,3]triazol-1 -yl-propyl)amid (70 mg, 41%). 1H NMR (DMSO-d6) 8 2,45, 2,48 (2xs, 6H, 2xCH3), 3,35 (m, 2H), 4,02 (m, 1H), 4,32 (dd, J=7,6, 14 Hz, 1H), 4,53 (dd, J=3,4, 14 Hz, 1H), 5,43 (d, J=5,6Hz, 1H, OH), 6,91 (d, J=7,6Hz, 1H), 7,01 (t, J=7,6 Hz, 1H), 7,15 (t, J=8,0Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,12 (t, J=5,6 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,77 (d, J=7,6 Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 10,93 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 405,4 (M-1).
Eksempel 8
Syntese av 5-[5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)amid.
5-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre (120 mg, 0,4 mmol) ble kondensert med 1-amino-3-(1,2,3)triazol-1-yl-propan-2-ol (85 mg, 0,48 mmol) for å utfelle 5-[5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)amid (100 mg, 62%). 1H NMR (DMSO-d6) 8 2,42, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3,27 (m, 2H), 3,98 (m, 1H), 4,27 (dd, J=7,6, 14Hz, 1H), 4,50 (dd, J=3,4, 13,6 Hz, 1H), 5,38 (d, J=5,6Hz, 1H, OH), 6,82 (dd, J=4,4, 8,4Hz, 1H), 6,91 (td, <2>J=2,4, <3>J=9,0Hz, 1H), 7,70 (m, 3H), 7,75 (dd, J=2,4, 9,2Hz, 1H), 8,11 (s. 1H), 10,93 (s, 1H, CONH), 13,73 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 423,4 (M-1).
Eksempel 9
Syntese av 5-[5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-
1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-[1,2,3]triazol-1 -yl-propyl)amid.
5-(5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre (126,6 mg, 0,4 mmol) ble kondensert med 1-amino-3-(1,2,3)triazol-1-yl-propan-2-ol (85 mg, 0,48 mmol) for å utfelle 5-[5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol-(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)amid (48 mg, 27%). 1H NMR (DMSO-d6) 8 2,42, 2,44 (2xs, 6H,
2xCH3), 3,27 (m, 2H), 3,99 (m, 1H), 4,28 (dd, J=7,8, 14 Hz, 1H), 4,51 (dd, J=3,2,14 Hz, 1H), 5,39 (d, J=6,0Hz, 1H, OH), 6,85 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,12 (dd, J=2,0, 8,2Hz, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,74 (s, 1H), 7,97 (d, J=2,0Hz, 1H), 8,07 (s, 1H), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 439,4 (M-1).
Eksempel 10
Syntese av 5-[5-brom-2-okso-1,2-dihydroindol(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-[1,2,3]triazol-1 -yl-propyl)amid.
5-(5-brom-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre (144,4 mg, 0,4 mmol) ble kondensert med 1-amino-3-(1,2,3)triazol-1-ylpropan-2-ol (85 mg, 0,48 mmol) for å utfelle 5-[5-brom-2-okso-1,2-dihydro-indol(3Z)ylidenmetyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-[1,2,3]-triazol-1-ylpropyl)amid (130 mg, 67%). <1>H NMR (DMSO-d6) 5 2,41, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH3), 3,27 (m, 2H), 3,99 (m, 1H), 4,28 (dd, J=7,6, 14 Hz, 1H), 4,50 (dd, J=3,6, 14 Hz, 1H), 5,40 (d, J=5,6Hz, 1H, OH), 6,81 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J=2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,77 (s, 1H), 8,07 (s. 1H), 8,10 (d, J=1,6Hz, 1H), 11,0 (s, 1H, CONH), 13,64 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 485,4 (M-1).
Syntese av 5-(5-brom-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-
1 H-pyrrol-3-karboksylsyre, 5-(5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre, 5-(2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre er beskrevet i den som søkeren innleverte samtidig med foreliggende søknad 14. februar 2001, med tittelen "PYRROLE
SUBSTITUTED 2-INDOLINONE-PROTEIN KINASE INHIBITORS", Ser. nr.
09/783,264, idet det som beskrives i denne er inntatt her i sin helhet.
Eksempel 11
Syntese av 1-amino-3-(1,1-diokso-A,<6->tiomorfolin-4-yl)propan-2-ol.
Til løsningen av tiomorfolin (5,0 g, 48,7 mmol) i HOCH3 (200 ml) ble løsningen av okson (36,0 g, 58,5 mmol) i H20 (100 ml) tilsatt. Blandingen ble godt omrørt ved 40°C i 48 timer og deretter avkjølt til 0°C. Vandig NaOH ble tilsatt dråpevis for å regulere pH=12. Faststoff ble filtrert fra og vasket med HOCH3 (3x 40 ml). Den samlede væske ble kondensert og renset ved flash-kromatografi på silikagel (CHCIa/CH3OH/NH3.H2O=3/1/0,1-2/1/0,1), hvilket gir tiomorfolin-1,1-dioksyd (6,2 g) i 93% utbytte. <1>H NMR (DMSO-d6) 8 2,97 (m, 4H), 3,07 (m, 4H), 3,42 (brs, 1H), MS (m/z) 136 (M+1).
Blandingen av tiomorfolin-1,1-dioksyd (2,5 g, 18,5 mmol) og (R)-(-)-epiklorhydrin (1,55 ml, 20 mmol) i etanolen i blandingsløsningsmidlene (50 ml) og H20 (5 ml) ble omrørt ved 25°C i 24 timer. Etter fjerning av løsningsmiddel ble residuet renset ved flash-kromatografi, hvilket gir (R)-1-klor-3-(1,1-diokso-A,<6>'-tiomorfolin-4-yl)propan-2-ol (4,0 g, 96%). <1>H NMR (DMSO-d6) 8 2,50 (m, 2H), 2,94 (m, 4H), 305 (m, 4H), 3,54 (dd, J=5,8, 11,2, Hz, 1H), 3,63 (dd, J=4,4, 11,2 Hz, 1H), 3,78 (m, 'H, CH), 5,10 (d, J=5,2 Hz, 1H, OH), MS (m/z) 228,2 (M+1).
(R)-1-klor-3-(1,1-diokso-X<6->tiomorfolin-4-yl)propan-2-ol (2,27 g, 10 mmol) ble behandlet med løsningen av NH3 i metanol (25 vekt%, 20 ml) ved 50°C i 12 timer. Etter inndampning av løsningsmidler ble residuet behandlet med anionebytterharpiks (AG1x8, OH-form) i vann, hvilket gir rå (S)-1-amino-3-(1,1-diokso-X,<6->tiomorfolin-4-yl), propan-2-ol (2,0 g). Den var forurenset med ca. 30% av dens dimer og kunne bare såvidt renses ved kolonnekromatografi. MS (m/z) 209,2 (M+1). Kondensering av (S)-1-amino-3-(1,1-diokso-A,<6->tiomorfolin-4-yl)propan-2-ol med oxindoler ga de ønskede indolinoner (utbytte 50-80% etter rensning).
(R)-5-(2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-py karboksylsyre[3-(1,1 -diokso-A,6-tiomorfolin-4-yl)-2-hydroksy-propyl]amid.
<1>H NMR (DMSO-de) 5 2,39, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,49 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 2,97 (m, 4H), 3,07 (m, 4H), 3,16 (m, 1H), 3,34 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 4,83 (d, J=4,8Hz, IH, OH), 6,86 (d, =7,6Hz, 1H), 6,97 (t, J=7,4Hz, 1H), 7,11 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,50 (t, J=5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,76 (d, J=7,6Hz, 1H) (aromatisk og vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 473,4 (M+1). (R)-5-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre[3-(1,1-diokso-X6-tiomorfolin-4-yl)-2-hydroksy-propyl]amid.<1>H NMR (DMSO-de) 5 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,47 (m, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,97 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,17 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 4,83 (d, J=4,4Hz, 1H), 6,82 (t, J=4,0Hz, 1H) 6,91 (td, <2>J=2,8, <3>J=9,0Hz, 1H), 7,53 (t, J=5,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H) 7,75 (dd, J=2,4, 9,2 Hz, 1H), 10,88 (s, 1H), 13,67 (s, 1H). LC-MS (m/z) 491,4 (M+1). (R)-5-(5-klor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre[3-(1,1-diokso-A,<6->tiomorfolin-4-yl)-2-hydroksy-propyl]amid.<1>H NMR (DMSO-de) 8 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,45 (m, 1H), 2,53 (m, 1H), 2,96 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,17 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 3,75 (m, 1H), 4,83 (d, J=4,4Hz, 1H, OH), 6,85 (t, J=8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J=2,2, 8,2 Hz, 1H), 7,53 (t, J=5,5Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,97 (d, J=2,0 Hz, 1H), 10,98 (s, 1H), 13,62 (s, 1H), LC-MS (m/z) 507,2 (M+1). (R)-5-(5-brom-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre[3-(1,1-diokso-A,<6->tiomorfolin-4-yl)-2-hydroksy-propyl]amid.
<1>H NMR (DMSO-de) 8 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH3), 2,47 (m, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,97 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,18 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 4,83 (d, J=4,8Hz, 1H), 6,81 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J=1,8, 8,2 Hz, 1H), 7,53 (t, J=5,8, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J=2,0 Hz, 1H), 10,98 (s, 1H) 13,62 (s, 1H), LC-MS (m/z) 553,6 (M+1).
Eksempel 12
Syntese av (S)- eller (R)-1 -metylamino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol.
Blandingen av morfolin (1,74 ml, 20 mmol) og (R)-epiklorhydrin (1,56 ml, 20 mmol) i etanol (10 ml) ble omrørt ved r.t. i 48 timer. Etter fjerning av løsningsmidlet ble residuet behandlet med løsningen av CH3NH2 i vann (40 vekt%, 20 ml) ved r.t. i 14 timer. Fjerning av løsningsmidlene ga det rå (S)-1-metylamino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol, som kunne renses ved vakuumdestillering eller kolonnekromatografi (2,4 g, 70%). (R)-1-metylamino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol ble fremstilt av (S)-epiklorhydrin i 76% utbytte. <1>H NMR (CDCI3) 5 2,33 (dd, J=3,6, 12,4Hz, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,44 (dd, J=2,8, 9,8 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,53 (dd, J=7,6, 11,8Hz, 1H), 2,62 (m, 2H), 2,65 (dd, J=3,6, 12,0 Hz, 1H), 3,71 (m, 4H), 3,85 (m, 1H), <13>C NMR (CDCI3) 8 67,06, 65,58, 62,80, 55,87, 53,94, 36,72, MS (m/z) 175-(M+1).
(S)-1-metylamino--3-morfolin-4-yl-propan-2-ol kondensert med 5-fluoroksindol ga (R)-5-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin-4-yl-propyl)metylamid.
<1>H NMR (DMSO-de) 8 2,0 (s, 3H), 2,15 (m, 1H), 2,25 (m, 6H), 2,28 (m, 2H), 2,42 (s, 1H), 2,95 (s, 1H), 3,0 (s, 3H), 3,25 (m, 2H), 3,57 (m, 2H), 3,97 & 3,68 (2xbrs, 1H), 4,80 & 4,74 (2xbrs, 1H), 6,82 (dd, J=4,0,8,0 Hz, 1H), 6,90 (td, <2>J=2,3, <3>J=8,7 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,71 (dd, J=2,2, 9,0Hz, 1H), 10,86 (s, 1H), 13,57 (s, 1H), LC-MS (m/z) 457,2 (M+1). (R)-1-amino-3-morfolin-4-yl-propan-2-ol ga (S)-5 (5-fluor-2-okso-1,2-di-hydroindol-3-ylidenmetyl)-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre(2-hydroksy-3-morfolin- 4-yl-propyl)metylamid.
<1>H NMR (DMSO-de) 5 2,0 (m, 3H), 2,10 (m, 1H), 2,22 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 2,38 (m, 1H), 2,90 (s, 1H), 2,96 (s, 3H), 3,27 (m, 2H), 3,52 (m, 2H), 3,93 & 3,64 (2xbrs, 1H), 4,75 & 4,70 (2xbrs, 1H), 6,77 (dd, J=4,6, 8,2Hz, 1H), 6,85 (td, <2>J=2,5, <3>J=8,8 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 767 (dd, J=2,0, 9,6Hz, 1H), 10,81 (s, 1H) 13,52 (s, 1H), LC-MS (m/z) 457,2 (M+1).
Eksempel 13
Aminsidekjede-fremstilling
3-(1 -H-tetrazol-1 -yl)]-2-hydroksy-1 -klorpropan og 3-(2-H-tetrazol-2-yl)-2-hydroksy-1 -klorpropan.
6,905 g tetrazol (100 mmol) og 1,75 ml diisopropyletylamin (10 mmol) og 11,73 ml epiklorhydrin (150 mmol) i vannfritt acetonitril (30 ml) ble omrørt ved 60°C i 4 timer. Den oppnådde løsning ble inndampet, tørket under høyvakuum og renset på en kolonne av silika i kloroform-metanol 100:8. Den første fraksjon ga ren 3-(2-H-tetrazol-2-yl)-2-hydroksy-1 -klorpropan, 6,215 g (fargeløs olje, 38% U), den andre fraksjon ga 9,208 g ren 3-(1-H-tetrazol-1-yl)]-2-hydroksyl-1-klorpropan (klebrig gummi; 57% U).
3-(1 -H-tetrazol-1 -yl)]-2-hydroksy-1 -aminopropan.
9,110 g 3-(1 -H-tetrazol-1 -yl)]-2-hydroksy-1 -klorpropan, 15 g kaliumkarbonat og 130 ml mettet, metanolisk ammoniakk ble omrørt i 21 time, deretter filtrert og inndampet. Residuet ble renset på en kolonne av silika i kloroform-metanol-vandig ammoniakk 80:35:4.
U=7,326 g av en hvit, klebrig gummi (91,5% th).
3-(2-H-tetrazol-2-yl)]-2-hydroksy-1 -aminopropan.
6,105 g 3-(2-H-tetrazol-2-yl)]-2-hydroksy-1-klorpropan, 10 g kaliumkarbonat og 95 ml mettet, metanolisk ammoniakk ble omrørt i 21 timer, deretter filtrert og inndampet. Residuet ble renset på en kolonne av silika i kloroform-metanol-vandig ammoniakk 60:25:2.
U=3,726 g av et hvitt, krystallinsk faststoff (69,5% th).
3-[(2R,6S)-2,6-dimetylrnorfolin-4-yl]-2-hydroksy-1 -aminopropan.
4,7 ml epiklorhydrin (60 mmol) ble satt til en isavkjølt løsning av cis-2,6-dimetylmorfolin (4,607 g, 40 mmol) i trifluoretanol (5 ml). Løsningen ble omrørt ved 0-5°C i 1 time, kjølebadet fjernet og omrørt ved RT i ytterligere 5 timer. Blandingen ble inndampet under høyvakuum, det oppnådde, oljeaktige residuet ble oppløst i vannfri etanol (50 ml), løsningen ble avkjølt på isbad, fast natriummetoksyd (2,27 g) ble tilsatt i to porsjoner og blandingen ble omrørt ved 0-5°C i 2 timer. Reaksjonsblanding ble deretter filtrert, salter vasket med etanol (30 ml) og kombinerte filtrater satt til is-avkjølt, konsentrert, vandig ammoniakk (200 ml). Blandingen ble omrørt ved RT i 12 timer, deretter inndampet under høyvakuum. Residuet ble renset på en kolonne av silika i en blanding av kloroform-metanol-7M metanolisk ammoniakk 80:15:3. U=5,75 g av et hvitt, krystallinsk, hygroskopisk faststoff (76,3% th).
(2S)-3-(3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1 -yl)-2-hydroksy-1 -klorpropan og (2S)-3-(3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl)-2-hydroksy-1-aminopropropan.
3,423 g 3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin (3,423 g) og 3,60 ml R-epiklor-phydrin (-) (99% e.e.) og 0,30 ml Barton-base (1,5 mmol) i vannfritt acetonitril, ble omrørt ved 60°C i 20 timer. Den oppnådde løsning ble inndampet under høyvakuum og renset på en kolonne av silika i en blanding av kloroform-metanol (en gradient på 5 til 20% av metanol), hvilket ga 5,572 g av klorforbindelsen som et hvitt, amorft, faststoff (90% U). Kloridet ble omdannet til amin som følger. Det oppnådde hydroksy-klor-mellomproduktet ble oppløst i metanolisk ammoniakk (mettet med ammoniakkgass), kaliumkarbonat ble tilsatt og blandingen ble omrørt i lukket kolbe i 2 1/2 dag. Reaksjonsblandingen ble filtrert, filtrater inndampet. Residuet ble renset på en silikakolonne i en blanding av kloroform-metanol-kons. vandig ammoniakk 80:15:1,5.
Eksempel 14
5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hydroksy-3-(2H-tetraazol-2-yl)propyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 22)
(generell prosedyre).
72 mg 3-(2-H-tetrazol-2-yl)]-2-hydroksy-1-aminopropan ble satt til oppslemningen av 105 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-^ azabenztriazolester [fremstilt ved å aktivere (3Z)-3-({3,3-dimetyl-4-karboksy-1-H-pyrrol-2-yl}metylen)-5-fluor-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (480 mg; 1,6 mmol) med HATU-reagenset (570 mg; 1,5 mmol) i nærvær av Hunig-base (3,0 mol; 0,525 ml) i DMF (5 ml) og isolert i ren form ved utfelling med kloroform (5 ml) og tørking under høyvakuum i 92% utbytte (579 mg)] i vannfritt dimetylacetamid (1,5 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter og inndampet under høyvakuum. Residuet ble oppslemmet i en blanding av metanol-dietylamin 20:1 (3 ml), fikk krystalliseres i kjøleskapet (5°C) i 1 time, ble filtrert, fellingen ble vasket med is-kald metanol og tørket under høyvakuum. U=106 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 15
5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hydroksy-3-(2H-tetraazol-2-yl)propyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 23)
(generell prosedyre).
72 mg 3-(2-H-tetrazol-2-yl)]-2-hydroksy-1 -aminopropan ble satt til oppslemningen av 109 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksylsyre-1 -oksy-7-azabenztriazolester [fremstilt ved å aktivere (3Z)-3-([3,3-dimetyl-4-karboksyl-H-pyrrol-2-yl)metylen)-5-klor-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (1,520 g; 4,8 mmol) med HATU-reagenset (1,768 g; 4,65 mmol) i nærvær av Hunig-base (9,0 mmol; 1,58 ml) i DMF (20 ml) og isolert i ren form ved utfelling med kloroform (20 ml) og tørking under høyvakuum med 94% utbytte (1,907 g)] i vannfritt dimetylacetamid (1,5 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter og inndampet under høyvakuum. Residuet ble oppslemmet i en blanding av metanol-dietylamin 20:1 (3 ml), fikk krystalliseres i kjøleskapet (5°C) i 1 time, ble filtrert, fellingen ble vasket med is-kald metanol og tørket under høyvakuum. U = 109 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 16
N-[2-hydroksy-3-(2H-tetraazol-2-yl)propyl]-2,4-dimetyl-5 [(Z)-[2-okso-5-(trifluormetoksy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]metyl)-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 24) (generell prosedyre).
72 mg 3-(2-H-tetraazol-2-yl)]-2-hydroksy-1-aminopropan ble satt til oppslemningen av 121,5 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-trifluormetoksy-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre-1-oksy-7-azabenztriazolester [fremstilt ved å aktivere (3Z)-3-((3, 3-dimetyl-4-karboksy-1-H-pyrrol-2-yl)metylen)-5-trifluormetoksy-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (1,768 g; 4,8 mmol) med HATU-reagenset (1,758 g; 4,8 mmol) i nærvær av Hunig-base (9,0 mmol; 1,58 ml) i DMF (25 ml) og isolert i ren form ved inndampning og utfelling med vannfritt acetonitril og tørking under høyvakuum med 85,5% utbytte (1,929
g)] i vannfritt dimetylacetamid (1,5 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter og inndampet under høyvakuum. Residuet ble oppslemmet i en blanding av
metanol-dietylamin 20:1 (3 ml), fikk krystalliseres i kjøleskapet (5°C) i 1 time, ble filtrert, fellingen ble vasket med is-kald metanol og tørket under høyvakuum. U = 113 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 17
5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hydroksy-3-(1 H-tetraazol-1 -yl)propyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 25).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 14 av 72 mg av det tilsvarende amin. U=113 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 18
5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hydroksy-3-(1 H-tetraazol-1 -yl)propyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 26).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 15 av 72 mg av det tilsvarende amin. U=122 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 19
N-[2-hydroksy-3-(1 H-tetraazoL (trifluormetoksy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]metyl]-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 27).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 16 av 72 mg av det tilsvarende amin. U=118 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 20
N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimetylmorfolin-4-yl]-2-hydroksypropyl)-5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 28).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 14 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=99 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 21
5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1, 2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimetylmorfolin-4-yl]-2-hydroksypropyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 29).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 15 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=101 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 22
N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimetylmorfolin-4-yl]-2-hydroksypropyl]-2,4-dimetyl-5-[(Z)-[2-okso-5-(trifluormetoksy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]metyl]-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 30).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 16 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=89 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 23
5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[(2S)-2-hydroksy-3-(3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl)]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3 karboksamid (forbindelse 34).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 14 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=109 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 24
5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2S)-2-hydroksy-3-(3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl)propyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 36).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 15 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=107 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 25
N-[(2S)-2-hydroksy-3-(3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl)propyl-2,4-dimetyl-5-{(Z)-[2-okso-5-(trifluormetoksy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]metyl}-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 35).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 16 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=123 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 26
5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[(2R)-2-hydroksy-3-(3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl)propyl-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 31).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 14 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=110 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 27
5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[(2R)-2-hydroksy-3-(3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl)propyl-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 32).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 15 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=103 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 28
N-[(2R)-2-hydroksy-3-(3-metyl-2,5-dioksolmidazolidin-1-yl)propyl-2,4-dimetyl-5-{(Z)-[2-okso-5-(trifluormetoksy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-ylidenelmetyl}-1H-pyrrol-3-karboksamid (forbindelse 33).
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge eksempel 16 av 95 mg av det tilsvarende amin. U=120 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 31
3-[1 -H-(benztriazolyl)oksy]-2-hydroksy-1 -klorpropan og 3[1 -H-(benztriazolyl-3-N-oksydo)]-2-hydroksy-1-klorpropan.
12,162 g hydroksyazabenztriazol (90 mmol), 1,59 ml diisopropyletylamin (9 mmol) og 14,1 ml epiklorhydrin (180 mmol) i vannfri kloroform ble omrørt ved 55°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble inndampet, residuet ble tørket under høyvakuum, deretter renset på en silikakolonne i en blanding av kloroform-metanol 100:5. De første fraksjoner ga 3-[1 -H-(benztriazolyl)oksy]-2-hydroksy-1 - klorpropan 10,570 g (blekgul honning; 51,5% U), fulgt av en fraksjon av 3-[1-H-(benztriazolyl-3-N-oksydo)]-2-hydroksy-1-klorpropan 9,990 g (hvitt, krystallinsk faststoff, 48,5% U).
3-[1 -H-(benztriazolyl-3-N-oksydo)]-2-hydroksy-1 -aminopropan.
Ble fremstilt ved aminolyse av 3-[1-H-(benztriazolyl-3-N-oksydo)]-2-hydroksy-1-klorpropan analogt med syntesen av 3-[1-H-(7-azabenztriazolyl)oksy]-2-hydroksy-1 -aminopropan.
Referanseeksempel 32
5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hy (3H-[1,2,3]triazol[4,5-b]pyridin-3-yloksy)propyl-2,4-dimenthyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (generell prosedyre).
105 mg 3-[1-H-(7-azabenztriazolyl)oksy]-2-hydroksy-1-aminopropan ble satt til oppslemningen av 105 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-dimentyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre-1-oksy-7-azabenztriazolester [fremstilt ved å aktivere (3Z)-3-({3,3-dimetyl-4-karboksy-1-H-pyrrol-2-yl}metylen)-5-fluor-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (480 mg; 1,6 mmol) mmol; 0,525 ml) i DMF (5 ml) og isolert i ren form ved utfelling med kloroform (5 ml) og tørking under høyvakuum med 92% utbytte (579 mg)] i vannfritt dimetylacetamid (1,5 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter og inndampet under høyvakuum. Residuet ble oppslemmet i en blanding av metanol-dietylamin 20:1 (3 ml), fikk krystalliseres i kjøleskapet (5°C) i 1 time, ble filtrert, fellingen ble vasket med is-kald metanol og tørket under høyvakuum. U = 121 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Referanseeksempel 33
5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hydroksy-3-(3H-[1,2,3]triazol[4,5-b]pyridin-3-yloksy)propyl-2,4-dimenthyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (generell prosedyre).
105 mg 3-[1-H-(7-azabenztriazolyl)oksy]-2-hydroksy-1-aminopropan ble satt til oppslemningen av 109 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre-1-oksy-7-azabenztriazolester [fremstilt ved å aktivere (3Z)-3-({3,3-dimetyl-4-karboksy-1-H-pyrrol-2-yl}metylen)-5-klor-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (1,520 g; 4,8 mmol) med HATU-reagenset (1,768 g; 4,65 mmol) i nærvær av Hunig-base (9,0 mmol; 1,58 ml) i DMF (20 ml) og isolert i ren form ved utfelling med kloroform (20 ml) og tørking under høyvakuum med 94% utbytte (1,907 g)] i vannfritt dimetylacetamid (1,5 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter og inndampet under høyvakuum. Residuet ble oppslemmet i en blanding av metanol-dietylamin 20:1 (3 ml), fikk krystalliseres i kjøleskapet (5°C) i 1 time, ble filtrert, fellingen ble vasket med is-
kald metanol og tørket under høyvakuum. U = 130 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Referanseeksempel 34
5-[(Z)-(5-trifluormetoksy-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hydroksy-3-(3H-[1,2,3]triazol[4,5-b]pyridin-3-yloksy)propyl]-2,4-dimentyl-1H-pyrrol-3-karboksamid (generell prosedyre).
105 mg 3-[1-H-(7-azabenztriazolyl)oksy]-2-hydroksy-1-aminopropan ble satt til oppslemningen av 121,5 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-trifluormetoksy-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-2,4-dimetyl-1H-pyrrol-3-karboksylsyre-1-oksy-7-azabenztriazolester [fremstilt ved å aktivere (3Z)-3-({3,3-dimetyl-4-karboksy-1-H-pyrrol-2-yl}metylen)-5-trifluormetoksy-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (1,768 g; 4,8 mmol) med HATU-reagenset (1,758 g; 4,8 mmol) i nærvær av Hunig-base (9,0 mmol; 1,58 ml) i DMF (25 ml) og isolert i ren form ved inndampning og utfelling med vannfritt acetonitril og tørking under høyvakuum med 85,5% utbytte (1,929
g)] i vannfritt dimetylacetamid (1,5 ml). Blandingen ble omrørt i 30 minutter og inndampet under høyvakuum. Residuet ble oppslemmet i en blanding av
metanol-dietylamin 20:1 (3 ml), fikk krystalliseres i kjøleskapet (5°C) i 1 time, ble filtrert, fellingen ble vasket med is-kald metanol og tørket under høyvakuum. U = 142 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 35
5-[(Z)-(5-fluor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hydroksy-3-(3-oksydo-1 H-1,2,3-benzotriazol-1 -yl)propyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksamid.
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge referanseeksempel 32 av 105 mg av det tilsvarende amin. U = 120 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 36
5-[(Z)-(5-klor-2-okso-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)metyl]-N-[2-hydroksy-3-(3-oksydo-1 H-1,2,3-benzotriazol-1 -yl)propyl]-2,4-dimetyl-1 H-pyrrol-3-karboksamid.
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge referanseeksempel 33 av 105 mg av det tilsvarende amin. U = 127 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Eksempel 37
N-[2-hydroksy-3-(3-oksydo-1 H-1,2,3-benzotriazol-1 -yl)propyl]-2,4-dimetyl-5-[(Z)-[2-okso-5-(trifluormetoksy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]metyl)-1H-pyrrol-3-karboksamid.
Dette ble fremstilt i henhold til metoden ifølge referanseeksempel 34 av 105 mg av det tilsvarende amin. U = 141 mg av et oransje, krystallinsk faststoff.
Biologiske eksempler.
De følgende forsøk blir anvendt for å finne de forbindelser som viser den optimale grad av den ønskede aktivitet.
A. Forsøksprosedyrer.
De følgende forsøk kan anvendes for å bestemme nivået av aktivitet og effekt av de forskjellige forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse, på én eller flere av PK'ene. Lignende forsøk kan utformes langs de samme linjer for en hvilken som helst PK, ved anvendelse av teknikker velkjent på området.
Mange av forsøkene beskrevet her blir utført i et ELISA- (Enzyme-Bound Immunosorbent Sandwich Assay) format (Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay," Manual of Clinical Immunology, 2. utg., Rose og Friedman, Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D. C, s. 359-371). Den generelle prosedyre er som følger: en forbindelse blir innført i celler som uttrykker testkinasen, enten naturlig eller rekombinant, for en valgt tidsperiode, hvoretter, hvis testkinasen er en reseptor, en ligand kjent for å aktivere reseptoren blir tilsatt. Cellene blir lyset og lysatet blir overført til brønnene på en ELISA-plate tidligere belagt med et spesifikt antistoff som gjenkjenner substratet for den enzymatiske fosforyleringsreaksjonen. Ikke-substratkomponenter i cellelysatet blir vasket bort og mengden av fosforylering på substratet blir detektert med et antistoff-spesifikt gjenkjennelses-fosfotyrosin sammenlignet med kontrollceller som ikke ble bragt i kontakt med en testforbindelse.
De for tiden foretrukne protokoller for utførelse av ELISA-forsøkene for spesifikke PK'er, er angitt nedenfor. Imidlertid ligger tilpasning av disse protokoller for å bestemme aktiviteten til forbindelser overfor andre RTK'er, så vel som for CTK'er og STK'er, godt innenfor omfanget av kunnskap for fagfolk på området. Andre forsøk beskrevet her måler mengden av DNA, dannet som respons på aktivering av en testkinase, som er en generell måling av en proliferativ respons. Den generelle prosedyre for dette forsøket er som følger: en forbindelse blir innført i celler som uttrykker testkinasen, enten naturlig eller rekombinant, for en valgt tidsperiode, hvoretter, hvis testkinasen er en reseptor, en ligand kjent for å aktivere reseptoren blir tilsatt. Etter inkubering minst natten over, blir et DNA-merkingsreagens, så som 5-bromdeoksyuridin (BrdU) eller H3-thymidin, tilsatt. Mengden av merket DNA blir detektert med enten et anti-BrdU-antistoff eller ved å måle radioaktivitet, og blir sammenlignet med kontrollceller som ikke er bragt i kontakt med en testforbindelse.
GST-FLK-1 -BIOANALYSE.
Dette forsøket analyserer tyrosinkinase-aktiviteten til GST-Flk1 på poly-(glu, tyr) peptider.
Materialer oa reagenser:
1. Corning 96-brønners ELISA-plater (Corning Catalog No. 5805-96).
2. poly (glu, tyr) 4:1, lyofilisat (Sigma Catalog # P0275).
3. Fremstilling av poly- (glu, tyr) (pEY) belagte forsøksplater: Belegg 2 Mg/brønn av poly (glu, tyr) (pEY) i 100 ul PBS, hold ved romtemperatur i 2 timer eller ved 4°C natten over. Dekk platene godt for å forhindre inndampning. 4. PBS-buffer: til 1 liter, bland 0,2 g KH2P04, 1,15 g Na2HP04, 0,2 g KCI og 8 g NaCI i ca. 900 ml dH20. Når alle reagenser er oppløst, reguler pH til 7,2 med HCI. Bring totalt volum til 1 liter med dH20.
5. PBST-buffer: til 1 liter PBS-buffer, tilsett 1,0 ml Tween 20.
6. TBB-blokkeringsbuffer: til 1 liter, bland 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCI, 1 ml TWEEN-20 i omtrent 900 ml dH20. Juster pH til 7,2 med HCI. Tilsett 10 g BSA, rør for å oppløse. Bring totalt volum til 1 liter med dH20.
Filtrer for å fjerne partikkelformig materiale.
7.1% BSA i PBS: For å danne en 1x arbeidsløsning, tilsett 10 g BSA til ca.
990 ml PBS-buffer, rør for å oppløse. Juster totalt volum til 1 liter med PBS-buffer, filtrer for å fjerne partikkelformig materiale.
8. 50 mM Hepes pH 7,5.
9. GST-Flk1cd renset fra sf9 rekombinant baculovirus-transformasjon (SUGEN, Inc.).
10. 4%DMSOidH20.
11. 10 mM ATP i dH20.
12. 40 mM MnCI2.
13. Kinasefortynningsbuffer (KDB): bland 10 ml Hepes (pH 7,5), 1 ml 5M NaCI, 40 pl 100 mM natrium-ortovanadat og 0,4 ml 5% BSA i dH20
med 88,56 ml dH20.
14. NUNC 96-brønners V-bunn-polypropylenplater, Applied Scientific
Catalog # AS-72092.
15. EDTA: bland 14,12 g etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i ca. 70 ml dH20. Tilsett 10 N NaOH inntil EDTA oppløses. Juster pH til 8,0.
Juster totalt volum til 100 ml med dH20.
16. 1 ° Antistoff-fortynningsbuffer: bland 10 ml 5% BSA i PBS-buffer med 89,5 ml TBST. 17. Anti-fosfotyrosin-monoklonall antistoff konjugert til pepperrotperoksydase (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech). 18. 2,2'-azinobis(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre (ABTS, Moss, Cat. No.
ABST).
19. 10% SDS.
Prosedyre:
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 2 ug polyEY-peptid i steril
PBS som beskrevet i trinn 3 av "materialer og reagenser".
2. Fjern ubundet væske fra brønner ved å snu platen opp ned. Vask én gang med TBST. Klapp platen på et papirhåndkle for å fjerne
overskudd av væske.
3. Tilsett 100 pl av 1% BSA i PBS til hver brønn. Inkuber, med risting, i 1 time ved romtemperatur.
4. Gjenta trinn 2.
5. Bløt brønner med 50 mM HEPES (pH 7,5) (150 pl/brønn).
6. Fortynn testforbindelse med dH20/4% DMSO til 4 ganger den ønskede, endelige forsøkskonsentrasjon i 96-brønners polypropylenplater. 7. Tilsett 25 ul fortynnet testforbindelse til ELISA-platen. I kontrollbrønner, plasser 25 pl dH20/4% DMSO.
8. Tilsett 25 pl 40 mM MnCI2 med 4x ATP (2 pM) til hver brønn.
9. Tilsett 25 pl 0,5M EDTA til negative kontrollbrønner.
10. Fortynn GST-Flk1 til 0,005 pg (5 ng)/brønn med KDB.
11. Tilsett 50 pl fortynnet enzym til hver brønn.
12. Inkuber, med risting, i 15 minutter ved romtemperatur.
13. Stopp reaksjon ved tilsetning av 50 pl 250 mM EDTA (pH 8,0). 14. Vask 3X med TBST og klapp plate på papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske. 15. Tilsett 100 pl pr. brønn av anti-fosfotyrosin-HRP-konjugat, 1:5.000 fortynning i antistoff-fortynningsbuffer. Inkuber, med risting, i 90 min. ved romtemperatur.
16. Vask som i trinn 14.
17. Tilsett 100 pl ABTS-løsning med romtemperatur til hver brønn. 18. Inkuber, med risting, i 10 til 15 minutter. Fjern eventuelle bobler. 19. Stop reaksjon ved tilsetning av 20 pl 10% SDS til hver brønn. 20. Avles resultater på Dynatech MR7000 ELISA-avleser med testfilter på 410 nM og referansefilter på 630 nM.
PYK2-BIOANALYSE
Dette forsøket blir anvendt for å måle in vitro-kinaseaktiviteten til HA-epitop-merket ("tagged") pyk2 (FL. pyk2-HA) med full lengde i et ELISA-forsøk.
Materialer oa reagenser:
1. Corning 96-brønners Elisa-plater.
2. 12CA5 monoklonalt anti-HA-antistoff (SUGEN, Inc.).
3. PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Gibco Catalog # 450-1300EB). 4. TBST-buffer: Til 1 liter, bland 8,766 g NaCI, 6,057 g TRIS og 1 ml 0,1% Triton X-100 i ca. 900 ml dH20. Juster pH til 7,2, bring volum til 1 liter. 5. Blokkeringsbuffer: Til 1 liter, bland 100 g 10% BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g 1M NaCI og 10 ml 1% TWEEN 20.
6. FL.pyk2-HA fra sf9 cellelysater (SUGEN, Inc.).
7. 4% DMSO i MilliQue H20.
8. 10 mM ATP i dH20.
9.1M MnCI2.
10. 1M MgCI2.
11. 1M Ditiotreitol (DTT).
12. 10X kinasebuffer-fosforylering: bland 5,0 ml 1M Hepes (pH 7,5), 0,2 ml 1M MnCI2,1,0 ml 1 M MgCI2, 1,0 ml 10% Triton X-100 i 2,8 ml dH20.
Like før anvendelse, tilsett 0,1 ml 1M DTT.
13. NUNC 96-brønners, V-bunnede polypropylenplater.
14. 500 mM EDTA i dH20.
15. Antistoff-fortynningsbuffer: til 100 ml, 1 ml 5% BSA/PBS og 1 ml 10%
Tween-20 i 88 ml TBS.
16. HRP-konjugert anti-Ptyr PY99), Santa Cruz Biotech Cat. No. SC-7020.
17. ABTS, Moss, Cat. No. ABST-2000.
18. 10% SDS.
Prosedyre:
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 0,5 pg pr. brønn 12CA5 anti-HA-antistoff i 100 pl PBS. Lagre natten over ved 4°C. 2. Fjern ubundet HA-antistoff fra brønner ved å snu platen opp ned. Vask plate med dH20. Klapp platen på et papirhåndkle for å fjerne
overskudd av væske.
3. Tilsett 150 pl blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber, med risting, i 30 min ved romtemperatur.
4. Vask plate 4x med TBS-T.
5. Fortynn lysat i PBS (1,5 pg lysat/100 pl PBS).
6. Tilsett 100 pl fortynnet lysat til hver brønn. Rist ved romtemperatur i 1 time.
7. Vask som i trinn 4.
8. Tilsett 50 pl 2X kinase-buffer til ELISA-plate inneholdende innfanget pyk2-HA. 9. Tilsett 25 pl 400 pM testforbindelse i 4% DMSO til hver brønn. For kontrollbrønner anvend 4% DMSO alene.
10. Tilsett 25 ul 0,5 M EDTA til negative kontrollbrønner.
11. Tilsett 25 ul 20 uM ATP til alle brønner. Inkuber, med risting, i 10 minutter. 12. Stopp reaksjon ved tilsetning av 25 pl 500 mM EDTA (pH 8,0) til alle brønner.
13. Vask som i trinn 4.
14. Tilsett 100 pl HRP-konjugert anti-Ptyr fortynnet 1:6000 i antistoff-fortynningsbuffer til hver brønn. Inkuber, med risting, i 1 time, ved romtemperatur.
15. Vask plate 3X med TBST og 1X med PBS.
16. Tilsett 100 pl ABST-løsning til hver brønn.
17. Hvis nødvendig, stopp utviklingen av reaksjonen ved tilsetning av 20 pl 10% SDS til hver brønn. 18. Avles plate på ELISA-avleser med testfilter på 410 nM og referansefilter på 630 nM.
FGFR1 BIOANALYSE
Dette forsøket blir anvendt for å måle in vitro-kinaseaktiviteten til FGF1-R i et ELISA-forsøk.
Materialer og reagenser:
1. Costar 96-brønners Elisa-plater (Corning Catalog # 3369).
2. Poly (Glu-Tyr) (Sigma Catalog # P0275).
3. PBS (Gibco Catalog # 450-1300EB).
4. 50 mM Hepes-bufferløsning.
5. Blokkeringsbuffer (5% BSA/PBS).
6. Renset GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.).
7. Kinasefortynningsbuffer.
Bland 500 pl 1M Hepes (GIBCO), 20 pl 5% BSA/PBS, 10 pl 100mM
natrium-ortovanadat og 50 pl 5M NaCI.
8. 10 mM ATP.
9. ATP/MnCI2-fosforyleringsblanding: bland 20 pl ATP, 400 pl 1M MnCI2 og 9,56 ml dH20. 10. NUNC 96-brønners, V-bunnede polypropylenplater (Applied Scientific
Catalog # AS-72092).
11. 0.5M EDTA.
12. 0,05% TBST.
Tilsett 500 pl TWEEN til 1 liter TBS.
13. Polyklonalt anti-fosfotyrosin-serum fra kanin (SUGEN, Inc.).
14. Anti-kanin IgG-peroksydase-konjugat fra geit (Biosource, Catalog #
ALI0404).
15. ABTS-løsning.
16. ABTS/H202-Iøsning.
Prosedyre:
1. Belegg Costar 96-brønners ELISA-plater med 1 pg pr. brønn av
Poly (Glu, Tyr) i 100 pl PBS. Lagre natten over ved 4°C.
2. Vask belagte plater én gang med PBS.
3. Tilsett 150 pl 5% BSA/PBS-blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber, med risting, i 1 time ved romtemperatur.
4. Vask plate 2x med PBS, deretter én gang med 50mM Hepes.
Klapp plater på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske og
bobler.
5. Tilsett 25 pl 0,4 mM testforbindelse i 4% DMSO eller 4% DMSO alene (kontroller) til plate. 6. Fortynn renset GST-FGFR1 i kinasefortynningsbuffer (5 ng kinase/50 pl
KDB/brønn).
7. Tilsett 50 pl fortynnet kinase til hver brønn.
8. Start kinasereaksjon ved tilsetning av 25 pl/brønn av nyfremstilt ATP/Mn++ (0,4 ml 1M MnCI2, 40 pl 10 mM ATP, 9,56 ml dH20),
nyfremstilt).
9. Dette er en rask kinasereaksjon og må stanses med 25 pl 0,5M EDTA på en måte lignende tilsetningen av ATP.
10. Vask plate 4x med frisk TBST.
11. Tillaging av antistoff-fortynningsbuffer: Pr. 50 ml:
Bland 5 ml 5% BSA, 250 pl 5% melk og 50 pl 100mM natriumvanadat, bring til endelig volum med 0,05% TBST. 12. Tilsett 100 ul pr. brønn av anti-fosfotyrosin (1:10000 fortynning i ADB).
Inkuber, med risting i 1 time, ved romtemperatur.
13. Vask som i trinn 10.
14. Tilsett 100 pl pr. brønn av Biosource anti-kanin IgG-peroksydase-konjugat fra geit (1: 6000 fortynning i ADB). Inkuber, med risting i 1 time, ved romtemperatur. 15. Vask som i trinn 10 og deretter med PBS for å fjerne bobler og overskudd av TWEEN.
16. Tilsett 100 pl ABTS/H202-Iøsning til hver brønn.
17. Inkuber, med risting, i 10 til 20 minutter. Fjern eventuelle bobler. 18. Avles forsøk på Dynatech MR7000 Elisa-avleser: testfilter på 410 nM, referanse filtrat 630 nM.
EGFR BIOANALYSE
Dette forsøket blir anvendt på in vitro-kinaseaktiviteten til FGF1-R i et ELISA-forsøk.
Materialer oa reagenser:
1. Corning 96-brønners Elisa-plater.
2. SUM01 monoklonalt anti-EGFR-antistoff (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. TBST-buffer.
5. Blokkeringsbuffer: til 100 ml, bland 5,0 g Carnation Instant Non-fat Milk® med 100 ml PBS.
6. A431 cellelysat (SUGEN, Inc.).
7. TBS-buffer:
8. TBS + 10% DMSO: til 1 liter, bland 1,514 g TRIS, 2,192 g NaCI og 25 ml
DMSO; bring til 1 liter totalt volum med dH20.
9. ATP (Adenosin-5-trifosfat, fra Equine-muskel, Sigma Cat. No. A-5394), 1,0 mM løsning i dH20. Dette reagens bør lages istand umiddelbart før anvendelse og holdes på is.
10. 1,0 mM MnCI2.
11. ATP/MnCI2-fosforyleringsblanding: for å fremstille 10 ml, bland 300 ul 1 mM ATP, 500 ul MnCI2 og 9,2 ml dH20. Gjør istand like før
anvendelse, holdes på is.
12. NUNC 96-brønners, V-bunnede polypropylenplater.
13. EDTA.
14. Polyklonalt anti-fosfotyrosinserum fra kanin (SUGEN, Inc.).
15. Anti-kanin IgG-peroksydasekonjugat fra geit (Biosource Cat. No.
ALI0404).
16. ABTS.
17. 30% hydrogenperoksyd.
18. ABTS/H202.
19. 0,2 M HCI.
Prosedyre:
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 0,5 pg SUM01 i 100 pl
PBS pr. brønn, lagre natten over ved 4 C.
2. Fjern ubundet SUM01 fra brønner ved å snu platen opp ned for å fjerne væske. Vask 1x med dH20. Klapp platen på et papirhåndkle for å
fjerne overskudd av væske.
3. Tilsett 150 pl blokkeringsbuffer til hver brønn.
Inkuber, med risting, i 30 min. ved romtemperatur.
4. Vask plate 3x med avionisert vann, deretter én gang med
TBST. Klapp plate på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av
væske og bobler.
5. Fortynn lysat i PBS (7 pg lysat/100 pl PBS).
6. Tilsett 100 pl fortynnet lysat til hver brønn. Rist ved romtemperatur i 1 time.
7. Vask plater som i 4, ovenfor.
8. Tilsett 120 pl TBS til ELISA-plate inneholdende innfanget EGFR.
9. Fortynnet testforbindelse 1:10 i TBS, plasser i brønn.
10. Tilsett 13,5 pl fortynnet testforbindelse til ELISA-plate. Til kontrollbrønner, tilsett 13,5 pl TBS i 10% DMSO.
11. Inkuber, med risting, i 30 minutter ved romtemperatur.
12. Tilsett 15 ul fosforyleringsblanding til alle brønner bortsett fra negativ kontrollbrønn. Endelig brønnvolum bør være omtrent 150 ul med 3 uM ATP/5 mM MnCI2 endelig konsentrasjon i hver brønn. Inkuber med risting i 5 minutter. 13. Stopp reaksjon ved tilsetning av 16,5 pl EDTA-løsning med risting. Rist i ytterligere 1 min.
14. Vask 4x med avionisert vann, 2x med TBST.
15. Tilsett 100 pl anti-fosfotyrosin (1:3000 fortynning i TBST) pr. brønn.
Inkuber, med risting, i 30-45 min. ved romtemperatur.
16. Vask som i 4, ovenfor.
17. Tilsett 100 pl Biosource anti-kanin IgG-peroksydasekonjugat fra geit (1:2000 fortynning i TBST) til hver brønn.
Inkuber med risting i 30 min. ved romtemperatur.
18. Vask som i 4, ovenfor.
19. Tilsett 100 pl ABTS/H202-Iøsning til hver brønn.
20. Inkuber 5 til 10 minutter med risting. Fjern eventuelle bobler. 21. Hvis nødvendig, stopp reaksjon ved tilsetning av 100 pl 0,2 M HCI pr. brønn. 22. Avles måling på Dynatech MR7000 ELISA-avleser: testfilter på 410 nM, referansefilter på 630 nM.
PDGFR BIOANALYSE
Dette forsøket blir anvendt på in vitro-kinaseaktiviteten til FGF1-R i et ELISA-forsøk.
Materialer oa reagenser:
1. Corning 96-brønners Elisa-plater.
2. 28D4C10 monoklonalt anti-PDGFR-antistoff (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. TBST-buffer.
5. Blokkeringsbuffer (samme som for EGFR-bioanalyse).
6. PDGFR-p som uttrykker NIH 3T3-cellelysat (SUGEN,
Inc.).
7. TBS-Buffer.
8. TBS+ 10% DMSO.
9. ATP.
10. MnCI2.
11. Kinasebuffer-fosforyleringsblanding: til 10 ml, bland 250 ul 1M TRIS, 200 pl 5M NaCI, 100 m> 1M MnCI2og 50 m> 100 mM Triton X-100 i
nok dH20 til å fremstille 10 ml.
12. NUNC 96-brønners, V-bunnede polypropylenplater.
13. EDTA.
14. Polyklonalt anti-fosfotyrosinserum fra kanin (SUGEN,Inc.).
15. Anti-kanin IgG-peroksydasekonjugat fra geit (Biosource Cat. No.
ALI0404).
16. ABTS.
17. Hydrogenperoksyd, 30% løsning.
18. ABTS/H202.
19. 0,2 M HCI.
Prosedyre:
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med 0,5 pg 28D4C10 i 100 pl
PBS pr. brønn, lagre natten over ved 4°C.
2. Fjern ubundet 28D4C10 fra brønner ved å snu platen opp ned for å fjerne væske. Vask 1x med dH20. Klapp platen på et papirhåndkle
for å fjerne overskudd av væske.
3. Tilsett 150 pl blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber i 30 min. ved romtemperatur med risting. 4. Vask plate 3x med avionisert vann, deretter én gang med TBST. Klapp platen på et papirhåndkle for å fjerne overskudd av væske og bobler.
5. Fortynn lysat i HNTG (10 pg lysat/100 pl HNTG).
6. Tilsett 100 pl fortynnet lysat til hver brønn. Rist ved romtemperatur i 60 min.
7. Vask plater som beskrevet i trinn 4.
8. Tilsett 80 pl arbeidskinasebufferblanding til ELISA-plate inneholdende innfanget PDGFR. 9. Fortynn testforbindelse 1:10 i TBS i 96-brønners polypropylenplater. 10. Tilsett 10 ul fortynnet testforbindelse til ELISA-plate. Til kontrollbrønner, tilsett 10 pl TBS + 10% DMSO. Inkuber med risting i
30 minutter ved romtemperatur.
11. Tilsett 10 pl ATP direkte til alle brønner bortsett fra negativ kontrollbrønn (endelig brønnvolum bør være omtrent 100 pl med 20 pM ATP i hver brønn.)
Inkuber 30 minutter med risting.
12. Stopp reaksjon ved tilsetning av 10 pl EDTA-løsning til hver brønn.
13. Vask 4x med avionisert vann, to ganger med TBST.
14. Tilsett 100 pl anti-fosfotyrosin (1:3000 fortynning i TBST) pr. brønn.
Inkuber med risting i 30-45 min. ved romtemperatur.
15. Vask som i trinn 4.
16. Tilsett 100 pl Biosource anti-kanin IgG-peroksydasekonjugat fra geit (1:2000 fortynning i TBST) til hver brønn.
Inkuber med risting i 30 min. ved romtemperatur.
17. Vask som i trinn 4.
18. Tilsett 100 pl ABTS/H202-Iøsning til hver brønn.
19. Inkuber 10 til 30 minutter med risting. Fjern eventuelle bobler. 20. Hvis nødvendig, stopp omsetning med tilsetning av 100 pl 0,2 M HCI pr. brønn. 21. Avles måling på Dynatech MR7000 ELISA-avleser med testfilter på 410 nM og referansefilter på 630 nM.
CELLULÆRE HER-2-KINASEFORSØK
Dette forsøket blir anvendt for å måle HER-2 kinase-aktivitet i hele celler i et ELISA-format.
Materialer oa reagenser:
1. DMEM (GIBCO Catalog #11965-092).
2. Kalvefosterserum (FBS, GIBCO Catalog #16000-044), varme-inaktivert i et vannbad i 30 min. ved 56°C.
3. Trypsin (GIBCO Catalog #25200-056).
4. L-Glutamine (GIBCO Catalog #25030-081).
5. HEPES (GIBCO Catalog #15630-080).
6. Vekstmedier
Bland 500 ml DMEM, 55 ml varme-inaktivert FBS, 10 ml
HEPES og 5,5 ml L-Glutamine.
7. Sultemedier
Bland 500 ml DMEM, 2,5 ml varme-inaktivert FBS, 10 ml HEPES og
5,5 ml L-Glutamine.
8. PBS.
9. Flat Bottom 96-well Tissue Culture Micro Titer Plates (Corning Catalog #
25860).
10.15 cm Tissue Culture Dishes (Corning Catalog #08757148).
11. Corning 96-brønners ELISA-plater.
12. NUNC 96-brønners, V-bunnede polypropylenplater.
13. Costar Transfer Cartridges for the Transtar 96 (Costar Catalog #7610). 14. SUMO 1: monoklonalt anti-EGFR-antistoff (SUGEN, Inc.).
15. TBST-buffer.
16. Blokkeringsbuffer: 5% Carnation Instant Milk<®> i PBS.
17. EGF-ligand: EGF-201, Shinko American, Japan.
Slem opp pulver i 100 pl 10 mM HCI. Tilsett 100 pl 10 mM NaOH. Tilsett 800 pl PBS og overfør til et Eppendorf-rør, lagre ved -20°C
inntil klart for anvendelse.
18. HNTG-lysingsbuffer
For stamløsning 5X HNTG, bland 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCI, 500 ml glycerol og 100 ml Triton X-100 og nok dH20 til å fremstille 1 liter total løsning.
For 1X HNTG<*>, bland 2 ml HNTG, 100 pl 0,1 M Na3V04, 250 pl 0.2M
Na4P207 og 100 pl EDTA.
19. EDTA.
20. Na3V04. For å fremstille stamløsning, bland 1,84 g Na3V04 med 90 ml dH20. Juster pH til 10. Kok i mikrobølge i ett minutt (løsning blir klar). Avkjøl til romtemperatur. Juster pH til 10. Gjenta oppvarmning/avkjølingscyklus inntil pH forblir på 10. 21.200 mM Na4P207. 22. Polyklonalt antiserum fra kanin spesifikt for fosfotyrosin (anti-Ptyr-antistoff, SUGEN, Inc.). 23. Affinitetsrenset antiserum, anti-kanin IgG-antistoff fra geit, peroksydasekonjugat (Biosource Cat. # ALI0404).
24. ABTS-løsning.
25. 30% hydrogenperoksydløsning.
26. ABTS/H202.
27 0,2 M HCI.
Prosedyre:
1. Belegg Corning 96-brønners ELISA-plater med SUM01 med 1,0 pg pr. brønn i PBS, 100 pl endelig volum/brønn. Lagre natten over ved
4°C.
2. På anvendelsesdagen, fjern belegningsbuffer og vask plate 3 ganger med dH20 og én gang med TBST-buffer. Alle vaskinger i dette
forsøket bør gjøres på denne måten, hvis ikke annet er spesifisert. 3. Tilsett 100 pl blokkeringsbuffer til hver brønn. Inkuber plate, med risting, i 30 min. ved romtemperatur. Like før anvendelse, vask plate.
4. Anvend EGFr/HER-2 chimera/3T3-C7-cellelinje for dette forsøket.
5. Velg skåler som har 80-90 % sammenflyting. Samle opp celler ved trypsinisering og sentrifuger ved 1000 rpm ved romtemperatur i 5
min.
6. Gjenoppslem celler i sultemedium og tell med trypanblått. Levedyktighet over 90% kreves. Kimsett celler i sultemedium med en densitet på 2.500 celler pr. brønn, 90 pl pr. brønn, i en 96-brønners mikrotiterplate. Inkuber kimsatte celler natten over ved 3-7° under
5% C02.
7. Start forsøket to dager etter kimsetting.
8. Testforbindelser oppløses i 4% DMSO. Prøver blir deretter ytterligere fortynnet direkte på plater med sulte-DMEM. Typisk vil denne fortynning være 1:10 eller mer. Alle brønner blir deretter overført til celleplaten i en ytterligere 1:10-fortynning (10 pl prøve og medier i 90 pl av sultemedier. Den endelige DMSO-konsentrasjon bør være 1%
eller lavere. En standard seriefortynning kan også anvendes.
9. Inkuber under 5% C02 ved 37°C i 2 timer.
10. Fremstill EGF-ligand ved å fortynne stamløsnings-EGF (16,5 uM) i varm
DMEM til 150 nM.
11. Fremstill frisk HNTG<*> tilstrekkelig for 100 pl pr. brønn; plasser på is. 12. Etter 2 timers inkubering med testforbindelse, tilsett fremstilt EGF-ligand til celler, 50 pl pr. brønn, for en endelig konsentrasjon på 50 nM. Positive kontrollbrønner får samme mengde EGF. Negative
kontroller får ikke EGF. Inkuber ved 37°C i 10 min.
13. Fjern testforbindelse, EGF og DMEM. Vask celler én gang med PBS. 14. Overfør HNTG<*> til celler, 100 pl pr. brønn. Plasser på is i 5 minutter. I mellomtiden, fjern blokkeringsbuffer fra ELISA-plate og vask. 15. Skrap celler fra plate med en mikropipetter og homogeniser cellemateriale ved gjentatte ganger å suge inn og sprøyte ut HNTG<*->lysebufferen. Overfør lysatet til en belagt, blokkert, vasket ELISA-plate. Eller anvend en Costar-overføringspatron for å overføre lysat til platen.
16. Inkuber, med risting, ved romtemperatur i 1 time.
17. Fjern lysat, vask. Overfør friskt fortynnet anti-Ptyr-antistoff (1:3000 i
TBST) til ELISA-plate, 100 pl pr. brønn.
18. Inkuber, med risting, ved romtemperatur, i 30 min.
19. Fjern anti-Ptyr-antistoff, vask. Overfør friskt fortynnet BIOSOURCE-antistoff til ELISA-plate (1:8000 i TBST, 100 pl pr. brønn).
20. Inkuber, med risting, ved romtemperatur i 30 min.
21. Fjern BIOSOURCE-antistoff, vask. Overfør nyfremstilt ABTS/H202-løsning til ELISA-plate, 100 pl pr. brønn. 22. Inkuber, med risting, i 5-10 minutter. Fjern eventuelle bobler. 23. Stopp omsetning med tilsetning av 100 pl 0,2M HCI pr. brønn. 24. Avles måling på Dynatech MR7000 ELISA-avleser med testfilter satt på 410 nM og referansefilter på 630 nM.
CDK2/CYCLIN A-FORSØK
Dette forsøket blir anvendt for å måle in vitro-serin/treoninkinase-aktiviteten til human cdk2/cyclin A i et Scintillation Proximity Assay (SPA).
Materialer oa reagenser.
1. Wallac 96-brønners polyetylentereftalat- (fleksi) plater (Wallac Catalog # 1450-401).
2. Amersham Redivue [ f3P] ATP (Amersham catalog #AH 9968).
3. Amersham streptavidin-belagte polyvinyltoluen SPA-kuler (Amersham catalog #RPNQ0007). Kulene bør rekonstitueres i PBS uten
magnesium eller kalsium, 20 mg/ml.
4. Aktivert cdk2/cyclin A-enzymkompleks renset fra Sf9-celler (SUGEN,
Inc.).
5. Biotinylert peptidsubstrat (Debtid). Peptidbiotin-X-PKTPKKAKKL blir oppløst i dH20 i en konsentrasjon på 5 mg/ml. 6. Peptid/ATP-blanding: til 10 ml, bland 9,979 ml dH20, 0,00125 ml "kald" ATP, 0,010 ml Debtid og 0,010 ml f<3>P ATP. Den endelige konsentrasjon pr. brønn vil være 0,5 pM "kald" ATP, 0,1 pg Debtid
og 0,2 pCi y^P ATP.
7. Kinasebuffer: til 10 ml, bland 8,85 ml dH20, 0,625 ml TRIS (pH 7,4), 0,25 ml 1M MgCI2, 0,25 ml 10% NP40 og 0,025 ml 1M DTT, tilsatt friskt
like før anvendelse.
8. 10 mM ATP i dH20.
9. 1M Tris, pH-regulert til 7,4 med HCI.
10. 1MMgCI2.
11. 1M DTT.
12. PBS (Gibco Catalog # 14190-144).
13. 0,5M EDTA.
14. Stoppløsning: Til 10 ml, bland 9,25 ml PBS, 0,005 ml 100 mM ATP, 0,1 ml 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10% Triton X-100 og 1,25 ml 20 mg/ml SPA-kuler.
Prosedyre:
1. Fremstill løsninger av testforbindelser med 5x den ønskede, endelige konsentrasjon i 5% DMSO. Tilsett 10 pl til hver brønn. For negative
kontroller, anvend 10 pl 5% DMSO alene i brønner.
2. Fortynn 5 pl cdk2/cyclin A-løsning med 2,1 ml 2x kinasebuffer.
3. Tilsett 20 ul enzym til hver brønn.
4. Tilsett 10 ul 0,5 M EDTA til de negative kontrollbrønnene.
5. For å starte kinasereaksjon, tilsett 20 ul peptid/ATP-blanding til hver brønn. Inkuber i 1 time uten risting.
6. Tilsett 200 pl stoppløsning til hver brønn.
7. Hold minst 10 min.
8. Sentrifuger plate ved ca. 2300 rpm i 3-5 min.
9. Tell plate ved anvendelse av Trilux eller lignende avleser.
MET-TRANSFOSFORYLERINGSFORSØK
Dette forsøket blir anvendt for å måle fosfotyrosin-nivåer på et poly-(glutaminsyre:tyrosin (4:1)) substrat som et hjelpemiddel til å identifisere agonister/antagonister til met-transfosforylering av substratet.
Materialer og reagenser:
1. Corning 96-brønners Elisa-plater, Corning Catalog #25805-96.
2. Poly (glu, tyr) 4:1, Sigma, Cat. No; P 0275.
3. PBS, Gibco Catalog # 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES.
5. Blokkeringsbuffer: Oppløs 25 g Bovine Serum Albumine, Sigma Cat. No.
A-7888, i 500 ml PBS, filtrer gjennom et 4 pm filter.
6. Renset GST-fusjonsprotein inneholdende Met-kinasedomenet, Sugen,
Inc.
7. TBST-buffer.
8. 10% vandig (MilliQue H20) DMSO.
9.10 mM vandig (dH20) Adenosin-5'-triphosphate, Sigma Cat. No. A-5394.
10. 2X kinasefortynningsbuffer: til 100 ml, bland 10 ml 1M HEPES ved pH 7.5 med 0,4 ml 5% BSA/PBS, 0,2 ml 0,1 M natrium-ortovanadat og 1 ml 5M natriumklorid i 88,4 ml dH20. 11. 4X ATP-reaksjonsblanding: til 10 ml, bland 0,4 ml 1 M manganklorid og 0,02 ml 0,1 M ATP i 9,56 ml dH20. 12. 4X negativ kontrollblanding: til 10 ml, bland 0,4 ml 1 M manganklorid i 9.6 ml dH20. 13. NUNC 96-brønners, V-bunnede polypropylenplater,. Applied Scientific
Catalog # S-72092
14. 500 mM EDTA.
15. Antistoff-fortynningsbuffer: til 100 ml, bland 10 ml 5% BSA/PBS, 0,5 ml 5% Carnation Instant Milk<®> i PBS og 0,1 ml 0,1 M natrium-ortovanadat i 88,4 ml TBST.
16. Polyklonalt antofosfotyrosin-antistoff fra kanin, Sugen, Inc.
17. Anti-kanin pepperrotperoksydase-konjugert antistoff fra geit, Biosource,
Inc.
18. ABTS-løsning: til 1 liter, bland 19,21 g sitronsyre, 35,49 g Na2HP04 og 500 mg ABTS med tilstrekkelig dH20 til å fremstille 1 liter. 19. ABTS/H202: bland 15 ml ABST-løsning med 2 pl H202 fem minutter før anvendelse.
20. 0,2 M HCI.
Prosedyre:
1. Belegg ELISA-plater med 2 pg Poly (Glu-Tyr) i 100 pl PBS, lagre natten over ved 4°C.
2. Blokker plate med 150 pl 5% BSA/PBS i 60 min.
3. Vask plate to ganger med PBS, én gang med 50 mM Hepes buffer, pH 7,4.
4. Tilsett 50 pl av den fortynnede kinasen til alle brønner.
(Renset kinase blir fortynnet med kinasefortynningsbuffer. Endelig
konsentrasjon bør være 10 ng/brønn.).
5. Tilsett 25 pl av testforbindelsen (i 4% DMSO) eller DMSO alene (4% i dH20) for kontroll til plate.
6. Inkuber kinase/forbindelsesblandingen i 15 minutter.
7. Tilsett 25 pl 40 mM MnCI2 til de negative kontrollbrønnene.
8. Tilsett 25 pl ATP/MnCI2-blanding til alle de andre brønnene (bortsett fra de negative kontrollene). Inkuber i 5 min.
9. Tilsett 25 pl 500 mM EDTA for å stoppe reaksjon.
10. Vask plate 3x med TBST.
11. Tilsett 100 pl polyklonalt anti-Ptyr fra kanin fortynnet 1:10.000 i antistoff-fortynningsbuffer til hver brønn.
Inkuber, med risting, ved romtemperatur i én time.
12. Vask plate 3x med TBST.
13. Fortynn Biosource HRP-konjugert anti-kanin-antistoff 1:6.000 i antistoff-fortynningsbuffer. Tilsett 100 pl pr. brønn og inkuber ved romtemperatur, med risting, i én time.
14. Vask plate 1X med PBS.
15. Tilsett 100 pl ABTS/H202-Iøsning til hver brønn.
16. Hvis nødvendig, stopp utviklingen av reaksjonen med tilsetning av 100 pl 0,2M HCI pr. brønn. 17. Avles plate på Dynatech MR7000 ELISA-avleser med testfilteret på 410 nM og referansefilteret på 630 nM.
IGF-1 -TRANSFOSFORYLERINGSFORSØK
Dette forsøket blir anvendt for å måle fosfotyrosin-nivået i poly (glutaminsyre:tyrosin) (4:1) for identifikasjon av agonister/antagonister til gst-IGF-1-transfosforylering av et substrat.
Materialer og reagenser.
1. Corning 96-brønners Elisa-plater.
2. Poly (Glu-tyr) (4:1), Sigma Cat. No. P 0275.
3. PBS, Gibco Catalog # 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES.
5. TBB-blokkeringsbuffer: til 1 liter, bland 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g natriumklorid og 10 ml 1% TWEEN-20. 6. Renset GST-fusjonsprotein inneholdende IGF-1-kinasedomenet (Sugen,
Inc.)
7. TBST-buffer: til 1 liter, bland 6,057 g Tris, 8,766 g natriumklorid og 0,5 ml TWEEN-20 med nok dH20 til å fremstille 1 liter.
8. 4% DMSO i Milli-Q H20.
9. 10 mM ATP i dH20.
10. 2X Kinasefortynningsbuffer: i 100 ml, bland 10 ml 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 5% BSA i dH20, 0,2 ml 0,1 M natrium-ortovanadat og 1 mol 5 M natriumklorid med nok dH20 til å fremstille 100 ml. 11. 4X ATP-reaksjonsblanding: til 10 ml, bland 0,4 ml 1 M MnCI2 og 0,008 ml 0,01 M ATP og 9,56 ml dH20. 12. 4X negativ kontroll-blanding: bland 0,4 ml 1 M manganklorid i 9,60 ml dH20.
13. NUNC 96-brønners, V-bunnede polypropylenplater.
14. 500 mM EDTA i dH20.
15. Antistoff-fortynningsbuffer: til 100 ml, bland 10 ml 5% BSA i PBS, 0,5 ml 5% Carnation Instant Non-fat Milk<®> i PBS og 0,1 ml 0,1 M natrium-ortovanadat i 88,4 ml TBST.
16. Polyklonalt antifosfotyrosin-antistoff fra kanin, Sugen, Inc.
17. Anti-kanin HRP-konjugert antistoff fra geit, Biosource.
18. ABTS-løsning.
20. ABTS/H202: bland 15 ml ABTS med 2 pl H202 5 minutter før
anvendelse.
21.0,2MHCIidH2O.
Prosedyre:
1. Belegg ELISA-plate med 2,0 pg/brønn Poly (Glu, Tyr) 4:1 (Sigma P0275) i 100 pl PBS. Lagre platen natten over ved 4°C.
2. Vask plate én gang med PBS.
3. Tilsett 100 pl TBB-blokkeringsbuffer til hver brønn.
Inkuber plate i 1 time med risting ved romtemperatur.
4. Vask plate én gang med PBS, deretter to ganger med 50 mM Hepes-buffer, pH 7,5. 5. Tilsett 25 pl testforbindelse i 4% DMSO (oppnådd ved fortynning av en stamløsning av 10 mM testforbindelse i 100% DMSO med dH20) til
plate.
6. Tilsett 10,0 ng gst-IGF-1-kinase i 50 pl kinasefortynningsbuffer) til alle brønner. 7. Start kinasereaksjon ved tilsetning av 25 pl 4X ATP-reaksjonsblanding til alle testbrønner og positive kontrollbrønner. Tilsett 25 pl 4X negativ kontrollblanding til alle negative kontrollbrønner. Inkuber i 10 minutter med risting ved romtemperatur.
8. Tilsett 25 ul 0,5M EDTA (pH 8,0) til alle brønner.
9. Vask plate 4x med TBST-buffer.
10. Tilsett polyklonalt anti-fosfotyrosin-antisera fra kanin i en fortynning på 1:10.000 i 100 pl antistoff-fortynningsbuffer til alle brønner. Inkuber, med risting, ved romtemperatur i 1 time.
11. Vask plate som i trinn 9.
12. Tilsett 100 pl Biosource anti-kanin-HRP i en fortynning på 1:10.000 i antistoff-fotrynningsbuffer til alle brønner. Inkuber, med risting, ved romtemperatur i 1 time. 13. Vask plate som i trinn 9, følg opp med én vask med PBS for å redusere bobler og overskudd av Tween-20.
14. Utvikle ved tilsetning av 100 pl/brønn ABTS/H202 til hver brønn.
15. Etter ca. 5 minutter, avles på ELISA-avleser med testfilter på 410 nm og referansefilter på 630 nm.
BRDU-INNFØRINGSFORSØK
De følgende forsøk anvender celler konstruert til å uttrykke en valgt reseptor og deretter evaluere effekten av en forbindelse av interesse på aktiviteten til ligand-fremkalt DNA-syntese ved å bestemme BrdU-innføring i DNA'et.
De følgende materialer, reagenser og prosedyre er generelle for hver av de følgende BrdU-innføringsforsøk. Variasjoner i spesifikke forsøk blir registrert.
Materialer oa reagenser:
1. Den passende ligand.
2. De passende, konstruerte celler.
3. BrdU-merkingsreagens: 10 mM, i PBS (pH 7,4) (Boehringer Mannheim,
Tyskland).
4. FixDenat: fikseringsløsning (klar til anvendelse) (Boehringer Mannheim,
Tyskland).
5. Anti-BrdU-POD: monoklonalt antistoff konjugert med peroksydase fra mus (Boehringer Mannheim, Tyskland). 6. TMB-substratløsning: tetrametylbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim,
Tyskland).
7. PBS-vaskeløsning: 1X PBS, pH 7,4.
8. Albumin, Bovint (BSA), fraksjon V-pulver (Sigma Chemical Co., USA).
Generell prosedyre:
1. Celler blir kimsatt med 8000 celler/brønn i 10% CS, 2 mM Gin i DMEM, i en 96-brønners plate. Celler blir inkubert natten over ved 37°C i 5%
C02. 2. Etter 24 timer blir cellene vasket med PBS og blir deretter serum-sultet i serumfritt medium (0% CS DMEM med 0,1% BSA) i 24 timer. 3. På dag 3 blir den passende ligand og testforbindelsen satt til cellene samtidig. De negative kontrollbrønnene får serumfri DMEM med kun 0,1% BSA; de positive kontrollcellene får liganden, men ingen testforbindelse. Testforbindelser blir fremstilt i serumfri DMEM med ligand i en 96-brønners plate og serielt fortynnet i 7
testkonsentrasjoner.
4. Etter 18 timer med ligandaktivering blir fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 i DMEM, 0,1% BSA) tilsatt og cellene blir inkubert med BrdU
(endelig konsentrasjon=10 pM) i 1,5 time.
5. Etter inkubering med merkingsreagens blir mediet fjernet ved dekantering og banking på platen som er snudd opp ned på et papirhåndkle. FixDenat-løsning blir tilsatt (50 pl/brønn) og platene
blir inkubert ved romtemperatur i 45 minutter på en plate-ryster.
6. FixDenat-løsningen blir grundig fjernet ved dekantering og banking på platen som er snudd opp ned på et papirhåndkle. Melk blir tilsatt (5% dehydratisert melk i PBS, 200 pl/brønn) som en blokkeringsløsning og platen blir inkubert i 30 minutter ved
romtemperatur på en plate-ryster.
7. Blokkeringsløsningen blir fjernet ved dekantering og brønnene blir vasket én gang med PBS. Anti-BrdU-POD-løsning (1:200-fortynning i PBS, 1% BSA) blir tilsatt (50 pl/brønn) og platen blir inkubert i 90 minutter
ved romtemperatur på en plate-ryster.
8. Antistoff-konjugatet blir grundig fjernet ved dekantering og skylling av brønnene 5 ganger med PBS og platen blir tørket ved å snu den opp ned og banke på den på et papirhåndkle. 9. TMB-substratløsning blir tilsatt (100 pl/brønn) og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur på en plate-ryster, inntil fargeutvikling er
tilstrekkelig for fotometrisk deteksjon.
10. Absorbansen til prøvene blir målt ved 410 nm (på "dobbel bølgelengde"-måte med et filter som avleser på 490 nm, som en referanse bølgelengde) på en Dynatech ELISA-plateleser.
EGF- fremkalt BrdU- innførinosforsøk.
Materialer oa reagenser:
1. Muse-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFRC7.
EGF- fremkalt Her- 2- drevet BrdU- innførinosforsøk.
Materialer og reagenser:
1. Muse-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr med et Her-2-kinasedomene).
EGF- fremkalt Her- 4- drevet BrdU- innførinosforsøk.
Materialer og reagenser:
1. Muse-EGF, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr med et Her-4-kinasedomene).
PDGF- fremkalt BrdU- innførinosforsøk.
Materialer og reagenser:
1. Human PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Tyskland).
2. 3T3/EGFRC7.
FGF- fremkalt BrdU- innføringsforsøk.
Materialer oa reagenser:
1. Human FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).
2. 3T3c7/EGFr.
IGF1 - fremkalt BrdU- innførinosforsøk.
Materialer og reagenser:
1. Humant, rekombinant (G511, Promega Corp., USA).
2. 3T3/IGF1r.
Insulin- fremkalt BrdU- innførinosforsøk.
Materialer og reagenser:
1. Insulin, krystallinsk, bovint, sink (13007, Gibco BRL, USA).
2. 3T3/H25.
HGF- fremkalt BrdU- innførinosforsøk.
Materialer og reagenser:
1. Rekombinant human HGF (Cat. No. 249-HG, R&D Systems, Inc. USA).
2. BxPC-3-celler (ATCC CRL-1687).
Prosedyre:
1. Celler blir kimsatt med 9000 celler/brønn i RPMI 10% FBS i en 96-brønners plate. Celler blir inkubert natten over ved 37°C i 5% C02. 2. Etter 24 timer blir cellene vasket med PBS og blir deretter serumsultet i 100 pl serum-fritt medium (RPMI med 0,1% BSA) i 24 timer. 3. På dag 3 blir 25 pl inneholdende ligand (fremstilt ved 1 pg/ml i RPMI med 0,1% BSA; endelig HGF-kons. er 200 ng/ml) og testforbindelser blir satt til cellene. De negative kontrollbrønnene får 25 pl serum-fri RPMI med kun 0,1% BSA; de positive kontrollcellene får liganden (HGF), men ingen testforbindelse. Testforbindelser blir fremstilt med 5 ganger deres endelig konsentrasjon i serum-fri RPMI med ligand i en 96-brønners plate og serielt fortynnet, hvilket gir 7 testkonsentrasjoner. Typisk er den høyeste endelige konsentrasjon av testforbindelse 100 pM og 1:3-fortynninger blir anvendt (dvs. endelig testforbindelses-konsentrasjonsområde er 0,137-100 pM). 4. Etter 18 timer med ligandaktivering blir 12,5 pl fortynnet BrdU-merkingsreagens (1:100 i RPMI, 0,1% BSA) tilsatt til hver brønn og cellene blir inkubert med BrdU (endelig konsentrasjon er 10 pM) i 1 time.
5. Samme som generell prosedyre.
6. Samme som generell prosedyre.
7. Blokkeringsløsningen blir fjernet ved dekantering og brønnene blir vasket én gang med PBS. Anti-BrdU-POD-løsning (1:100-fortynning i PBS, 1% BSA) blir tilsatt (100 pl/brønn) og platen blir inkubert i 90 minutter ved romtemperatur på en plate-ryster.
8. Samme som generell prosedyre.
9. Samme som generell prosedyre.
10. Samme som generell prosedyre.
HW- EC- C- forsøk.
Dette forsøket blir anvendt for å måle en forbindelses aktivitet mot PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF eller Flk-1/KDR, som alle naturlig uttrykkes av HUV-EC-celler.
DAG 0.
1. Vask og trypsiniser HUV-EC-C-celler (endotelceller fra navlevene hos menneske, (American Type Culture Collection, catalogue no. 1730 CRL). Vask med Dulbecco's fosfatbufrede saltvann (D-PBS, oppnådd fra Gibco BRL, catalogue no. 14190-029) 2 ganger med ca. 1 ml/10 cm<2> av vevskulturkolbe. Trypsiniser med 0,05% trypsin-EDTA i ikke-enzymatisk celle-dissosieringsløsning (Sigma Chemical Company, catalogue no. C-1544). 0,05%-trypsinet blir fremstilt ved fortynning av 0,25% trypsin/1 mM EDTA (Gibco, catalogue no. 25200-049) i celle-dissosieringsløsningen. Trypsiniser med ca. 1 ml/25-30 cm<2> av vevkulturkolbe i ca. 5 minutter ved 37°C. Etter at celler har løsnet fra kolben, tilsett et likt volum av forsøksmedium og overfør til et 50 ml sterilt sentrifugerør (Fisher Scientific, catalogue no. 05-539-6). 2. Vask cellene med ca. 35 ml forsøksmedium i det 50 ml sterile sentrifuge rø ret ved tilsetning av forsøksmediet, sentrifuger i 10 minutter ved omtrent 200xg, sug opp supernatanten og gjenoppslem med 35 ml D-PBS. Gjenta vaskingen to ganger til med D-PBS, gjenoppslem cellene i ca. 1 ml forsøksmedium/15 cm<2> av vevskulturkolbe. Forsøksmedium består av F12K-medium (Gibco BRL, catalogue no. 21127-014) og 0,5% varme-inaktivert kalvefosterserum. Tell cellene med et Coulter Counter<®> (Coulter Electronics, Inc.) og tilsett forsøksmedium til cellene for å oppnå en konsentrasjon på 0,8-1,0 x 10<5 >celler/ml. 3. Tilsett celler til 96-brønners, flatbunnede plater med 100 pl/brønn eller 0,8-1,0 x 104 celler/brønn, inkuber -24 timer ved 37°C, 5% C02.
DAG 1
1. Fremstill to gangers testforbindelsestitreringer i separate 96-brønners plater, generelt 50 pM og ned til 0 pM. Anvend samme forsøksmedium som nevnt i dag 0, trinn 2 ovenfor. Titreringer gjøres ved tilsetning av 90 pl/brønn av testforbindelse ved 200 pM (4X den endelige brønnkonsentrasjon) til toppbrønnen på en spesiell platekolonne. Siden stamløsnings-testforbindelsen vanligvis er 20 mM i DMSO, inneholder den 200 pM medikamentkonsentrasjon 2% DMSO.
Et fortynningsmiddel blandet opp til 2% DMSO i forsøksmedium (F12K + 0,5% kalvefosterserum) blir anvendt som fortynningsmiddel for testforbindelse-titreringene for å fortynne testforbindelsen, men holde DMSO-konsentrasjonen konstant. Tilsett dette fortynningsmiddel til de gjenværende brønner i kolonnen med 60 pl/brønn. Ta 60 pl fra de 120 pl av 200 pM testforbindelsesfortynningen i toppbrønnen på kolonnen og bland med de 60 pl i den andre brønnen på kolonnen. Ta 60 pl fra dennen brønnen og bland med de 60 pl i den tredje brønnen på kolonnen og så videre, inntil to-gangers titreringer er fullført. Når den nest siste brønnen blir blandet, ta 60 pl av de 120 pl i denne brønnen og kast det. La den siste brønnen ha 60 pl DMSO/mediafortynningsmiddel som en ikke-testforbindelses-holdig kontroll. Lag 9 kolonner med titrert testforbindelse, nok for brønner in triplo, hver for: (1) VEGF (oppnådd fra Pepro Tech Inc., catalogue no. 100-200, (2) endotelcelle-vekstfaktor (ECGF) (også kjent som sur fibroblast-vekstfaktor eller aFGF) (oppnådd fra Boehringer Mannheim Biochemica, catalogue no. 1439 600), eller, (3) humant PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Tyskland) og forsøksmediakontroll. ECGF fås som et preparat med natriumheparin. 2. Overfør 50 pl/brønn av testforbindelsesfortynningene til de 96-brønners forsøksplatene inneholdende de 0,8-1,0x10<4> cellene/100 pl/brønn av HUV-EC-C-cellene fra dag 0 og inkuber ~2 timer ved 37°C, 5% C02. 3. In triplo, tilsett 50 pl/brønn av 80 pg/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF eller mediakontroll til hver testforbindelses-betingelse. Som med testforbindelsene, er vekstfaktorkonsentrasjonene 4X den ønskede, endelige konsentrasjon. Anvend forsøksmedier fra dag 0, trinn 2, for å lage konsentrasjonene av vekstfaktorer. Inkuber omtrent 24 timer ved 37°C, 5% C02. Hver brønn vil ha 50 pl testforbindelsesfortynning, 50 pl vekstfaktor eller media og 100 pl celler, som til sammen blir 200 pl/brønn totalt. Således blir 4X-konsentrasjonene av testforbindelse og vekstfaktorer 1X så snart alt er blitt satt til brønnene.
DAG 2
1. Tilsett <3>H-thymidin (Amersham, catalogue no. TRK-686) med 1 pCi/brønn (10 pl/brønn av 100 pCi/ml løsning blandet i RPMI-media + 10% varme-inaktivert kalvefosterserum) og inkuber -24 timer ved 37°C, 5% C02. RPMI blir oppnådd fra Gibco BRL, catalogue no. 11875-051.
DAG 3
1. Frys plater natten over ved -20°C.
DAG 4
Tin plater og høst med en 96-brønners platehøster (Tomtec Harvester 96<®>) over på filtermatter (Wallac, catalogue no. 1205-401), avles tellinger på en Wallac Betaplate™ væske-scintillasjonsteller.
Bioanalyser som er blitt eller kan anvendes for å bedømme forbindelser, er beskrevet i detalj nedenfor. Forbindelser 1-9 ble testet og funnet aktive i flkGST-, FGFR1- og PDGF-forsøk.
IN VIVO- DYREMODELLER
XENOTRANSPLANTAT- DYREMODELLER
Evnen som tumorer fra menneske har til å vokse som xeno-transplantater i atymiske mus (for eksempel Balb/c, nu/nu) tilveiebringer en nyttig in vivo-modell for studering av den biologiske respons på terapier for tumorer fra menneske. Siden de første vellykkede xenotransplantasjoner av tumorer fra menneske i atymiske mus, (Rygaard og Povlsen, 1969, Acta Patol. Microbial. Scand. 77:758-760), er mange forskjellige tumorcellelinjer f ra menneske (for eksempel bryst, lunge, genitourinsystem, gastro-intestinalt, hode og hals, glioblastoma, ben og ondartede melanomer) blitt transplantert og med hell dyrket i naken-mus. De følgende forsøk kan anvendes for å bestemme nivået av aktivitet, spesifisitet og effekt til de forskjellige forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse. Tre generelle typer av forsøk er nyttige for vurdering av forbindelser: cellulære/katalytiske, cellulære/biologiske og in vivo. Formålet med det cellulære/katalytiske forsøk, er for å bestemme effekten som en forbindelse har på evnen som en TK har til å fosforylere tyrosiner på et kjent substrat i en celle. Formålet med de cellulære/biologiske forsøk, er å bestemme effekten av en forbindelse på den biologiske respons stimulert av en TK i en celle. Formålet for in vivo-forsøket er å bestemme effekten av en forbindelse i en dyremodell på en spesiell lidelse, så som kreft.
Egnede cellelinjer for subkutane xenotransplantatforsøk omfatter C6-celler (glioma, ATCC # CCL 107), A375-celler (melanom, ATCC # CRL 1619), A431-celler (epidermoid karsinom, ATCC # CRL 1555), Calu 6-celler (lunge, ATCC # HTB 56), PC3-celler (prostata, ATCC # CRL 1435), SKOV3TP5-celler og NIH 3T3-fibroblaster genetisk konstruert til overuttrykke EGFR, PDGFR, IGF-1 R eller en hvilken som helst annen test-kinase. Følgende protokoll kan anvendes for å utføre xenotransplantatforsøk: Atymiske hunnmus (BALB/c, nu/nu) blir oppnådd fra Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Alle dyr blir holdt under betingelser med rene rom i Micro-isolasjonsbur med "Alpha-dri"-underlag. De får steril gnagermat og vann ad libitum.
Cellelinjer blir dyrket i passende medium (for eksempel MEM, DMEM, Ham's F10 eller Ham's F12 pluss 5%-10% kalvefosterserum (FBS) og 2 mM glutamin (GLN)). Alle celledyrkningsmedier, glutamin og kalvefosterserum er anskaffet fra Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), hvis ikke annet er spesifisert. Alle celler blir dyrket i en fuktig atmosfære med 90-95% luft og 5-10% C02 ved 37°C. For alle cellelinjer blir det rutinemessig anlagt subkultur to ganger pr. uke og er negative mht. mykoplasma, som bestemt ifølge Mycotect-metoden (Gibco).
Celler blir høstet ved eller nær sammenflyting med 0,05% Trypsin-EDTA og pelletert ved 450 x g i 10 min. Pelletene blir gjenoppslemmet i steril PBS eller medier (uten FBS) til en spesiell konsentrasjon, og cellene blir implantert i musens bakre flanke (8-10 mus pr. gruppe, 2-10 x 10<6> celler/dyr). Tumorvekst blir målt i løpet av 3 til 6 uker ved anvendelse av "venier"-krumpassere. Tumorvolumer blir beregnet som et produkt av lengde x bredde x høyde, hvis ikke annet er angitt. P-verdier blir beregnet ved anvendelse av Students t-test. Testforbindelser i 50-100 pl tilsetningsmiddel (DMSO eller VPD:D5W) kan innføres ved IP-injeksjon i forskjellige konsentrasjoner som generelt starter på dag én etter implantasjon.
TUMORINVASJONSMODELL
Følgende tumorinvasjonsmodell er utviklet og kan anvendes for evalueringen av den terapeutiske verdi og effektivitet av forbindelsene identifisert, til selektivt å hemme KDR/FLK-1-reseptor.
Prosedyre
8 uker gamle nakenmus (hunkjønn) (Simonsen Inc.) blir anvendt som forsøksdyr. Implantasjon av tumorceller kan utføres i en laminærstrømningshette ("laminar flow hood"). For anestesi blir Xylazine/Ketamine Cocktail (100 mg/kg ketamine og 5 mg/kg Xylazine) administrert intraperitonealt. Et midtlinjesnitt blir gjort for å eksponere abdominalhulen (omtrent 1,5 cm i lengde) for å injisere 10<7 >tumorceller i et volum på 100 pl medium. Cellene blir injisert enten i duodenal-lappen på bukspyttkjertelen eller under tykktarmens serosa. Peritoneum og muskler blir lukket med en kontinuerlig 6-0 silkesutur og huden blir lukket ved anvendelse av sårklemmer. Dyr observeres daglig.
Analyse
Etter 2-6 uker, avhengig av samlede ("gross") observasjoner av dyrene, blir musen avlivet og de lokale tumormetastasene til forskjellige organer (lunge, lever, hjerne, mage, milt, hjerte, muskel) blir skåret ut og analysert (måling av tumorstørrelse, grad av invasjon, immunokjemi, in situ
hybridiseringsbestemmelse, etc).
C- SETT- FORSØK
Dette forsøket blir anvendt for å detektere nivået av c-sett-tyrosinfosforylering.
M07E- (akutt myeloid leukemi i menneske) celler blir serumsultet natten over i 0,1% serum. Celler blir forbehandlet med forbindelsen (samtidig med serumsulting), før ligandstimulering. Celler blir stimulert med 250 ng/ml rh-SCF i 15 minutter. Etter stimulering ble celler lyset og immunoutfelt med et anti-c-sett-antistoff. Fosfotyrosin- og proteinnivåer ble bestemt ved Western-blotting.
MTT- PROLIFERASJONSFORSØK
M07E-celler blir serumsultet og forbehandlet med forbindelse som beskrevet for fosforyleringsforsøkene. Celler blir platet @ 4X10<5> celler/brønn i en 96-brønners skål, i 100 pl RPMI + 10% serum. rh-SCF (100 ng/ml) blir tilsatt og
platen blir inkubert i 48 timer. Etter 48 timer blir 10 pl av 5 mg/ml MTT [3-(4,5-di-metytiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) tilsatt og får inkubere i 4 timer. Sur isopropanol (100 pl 0.04N HCI i isopropanol) blir tilsatt og den optiske densiteten ble målt ved en bølgelengde på 550 nm.
APOPTOSEFORSØK
M07E-celler blir inkubert +/- SCF og +/- forbindelse i 10% FBS med rh-GM-CSF (10 ng/ml) og rh-IL-3 (10 ng/ml). Prøver blir analysert etter 24 og 48 timer. For å måle aktivert kaspase-3, blir prøver vasket med PBS og permeabilisert med is-kald 70% etanol. Cellene blir deretter farget med PE-konjugert, polyklonal anti-aktiv kaspase-3 fra kanin og analysert ved hjelp av FACS. For å måle spaltet PARP, blir prøver lyset og analysert ved western-blotting med et anti-PARP-antistoff.
Ytterligere forsøk
Ytterligere forsøk som kan anvendes for å bedømme forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, uten begrensning, et bio-flk-1-forsøk, et EGF-reseptor-HER2-kimert reseptor-forsøk i hele celler, et bio-src-forsøk, et bio-lck-forsøk og et forsøk som måler fosforyleringsfunksjonen til raf. Protokollene for hver av disse forsøk er å finne i US-søknad, Ser. nr. 09/099,842, inntatt her ved referanse, omfattende eventuelle tegninger.
Måling av celletoksisitet
Terapeutiske forbindelser bør være mer effektive til å hemme reseptor-tyrosinkinase-aktivitet enn til å utøve en cytotoksisk effekt. Et mål for effektiviteten og celletoksisiteten til en forbindelse kan oppnås ved å bestemme den terapeutiske indeksen, dvs. IC5o/LD50. IC5o, dosen som kreves for å oppnå 50% hemning, kan måles ved anvendelse av standard teknikker, så som dem beskrevet her. LD50, dosen som resulterer i 50% toksisitet, kan også måles ved hjelp av standard teknikker (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), ved å måle mengden av LDH frigjort (Korzeniewski og Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker og Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61), eller ved å måle den dødelige dosen i dyremodeller. Forbindelser med en høy terapeutisk indeks er foretrukket. Den terapeutiske indeksen bør være høyere enn 2, fortrinnsvis minst 10, mer foretrukket minst 50.

Claims (4)

1. Forbindelse med formel (I): hvor: R<1> er valgt fra gruppen som består av hydrogen, halogen, CrC4halogenalkoksy og C6-Ci2 aryl eventuelt substituert med en eller to halogenatomer; R2 er hydrogen; R<3>, R4 og R<5> er uavhengig hydrogen eller CrCi0 alkyl; Z er valgt fra 1,2,3-triazolyl, tetrazolyl eller 3-oksy-benzotriazol-1-yl; eller Z kan være -NR<15>R<16> hvor R<15> og R<16> sammen med nitrogenatomet som de er bundet til danner en morfolino-, en 3-metyl-2,5-dioksoimidazolidin-1-yl- eller en 1,1-diksotiomorfolinogruppe alle eventuelt substituert med en eller to C1-C4 alkyl; R6 og R7 er uavhengig hydrogen eller d-C4 alkyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.
2. Forbindelsen eller salt ifølge krav 1, hvor forbindelsen er valgt fra gruppen som består av:
3. Forbindelse eller salt ifølge krav 1, hvor forbindelsen er valgt fra gruppen som består av:
4. Forbindelse eller salt ifølge krav 1, hvor forbindelsen er valgt fra gruppen som består av: 6. Forbindelse eller salt ifølge krav 1 med formel (la): hvor:R<2>, R3, R<4> og R<5> er hydrogen; R<1> er fluor og er lokalisert i 5-stilling på indolinonringen; og Z er morfolin-4-yl;R<6> og R7 er metyl; og stereokjemien ved <*>C er (S). 7. Farmasøytisk preparat, som omfatter en forbindelse eller salt ifølge hvilket som heist av kravene 1 til 6 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller tilsetningsmiddel. 8. Metode for å modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro, som omfatter å kontakte nevnte proteinkinase med en forbindelse eller salt ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6. 9. Metode ifølge krav 8, hvor nevnte proteinkinase er valgt fra gruppen som består av en reseptor-tyrosinkinase, en ikke-reseptor-tyrosinkinase og en serin-treoninkinase. 10. Anvendelse av en forbindelse eller salt ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for å behandle kreft hos et pattedyr. 11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor kreften er valgt fra gruppen som består av platecellekarsinom, astrocytoma, Kaposis sarkom, glioblastoma, lungekreft, blærekreft, hode- og halskreft, melanom, eggstokk-kreft, prostatakreft, brystkreft, småcelle-lungekreft, glioma, colorektal kreft, genitourinsystemkreft og gastrointestinal kreft. 12. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 eller et salt derav, for fremstilling av et medikament for behandling av en lidelse hos et pattedyr, hvor nevnte lidelse er valgt fra gruppen som består av diabetes, en autoimmun-sykdom, en hyperproliferasjons-lidelse, restenose, fibrose, psoriasis, von Heppel-Lindaus sykdom, osteoartritt, revmatoid artritt, angiogenese, en inflammatorisk lidelse, en immunologisk lidelse og en kardiovaskulær lidelse. 13. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 10 til 12, hvor nevnte organisme er et menneske.
NO20033608A 2001-02-15 2003-08-14 3-(4-amidopyrrol-2-ylmetliden)-2-indolinonderivater, fremstilling av slike, farmasoytiske preparater inneholdende slike, metode for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro med slike forbindelser samt anvendelse av slike forbindelser for fremstilling av medikament for behandling av sykdommer hos pattedyr NO326604B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26868301P 2001-02-15 2001-02-15
US31236101P 2001-08-15 2001-08-15
PCT/US2002/004407 WO2002066463A1 (en) 2001-02-15 2002-02-15 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethlidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20033608D0 NO20033608D0 (no) 2003-08-14
NO20033608L NO20033608L (no) 2003-10-14
NO326604B1 true NO326604B1 (no) 2009-01-19

Family

ID=26953263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20033608A NO326604B1 (no) 2001-02-15 2003-08-14 3-(4-amidopyrrol-2-ylmetliden)-2-indolinonderivater, fremstilling av slike, farmasoytiske preparater inneholdende slike, metode for a modulere den katalytiske aktiviteten til en proteinkinase in vitro med slike forbindelser samt anvendelse av slike forbindelser for fremstilling av medikament for behandling av sykdommer hos pattedyr

Country Status (41)

Country Link
US (4) US6653308B2 (no)
EP (1) EP1370554B1 (no)
JP (1) JP3677501B2 (no)
KR (1) KR100884858B1 (no)
CN (1) CN100338059C (no)
AP (1) AP1718A (no)
AR (1) AR042586A1 (no)
AT (1) ATE307128T1 (no)
AU (1) AU2002247133B2 (no)
BG (1) BG108098A (no)
BR (1) BR0207494A (no)
CA (1) CA2438314C (no)
CR (1) CR7056A (no)
CZ (1) CZ20032414A3 (no)
DE (1) DE60206736T2 (no)
DK (1) DK1370554T3 (no)
EA (1) EA007186B1 (no)
EE (1) EE200300385A (no)
ES (1) ES2251580T3 (no)
GE (1) GEP20053600B (no)
HK (1) HK1059621A1 (no)
HR (1) HRP20030657B1 (no)
HU (1) HUP0303146A3 (no)
IL (2) IL157418A0 (no)
IS (1) IS2411B (no)
MA (1) MA26997A1 (no)
MX (1) MXPA03007367A (no)
MY (1) MY126235A (no)
NO (1) NO326604B1 (no)
NZ (1) NZ527572A (no)
OA (1) OA12834A (no)
PE (1) PE20021006A1 (no)
PL (1) PL364176A1 (no)
RS (1) RS51026B (no)
SI (1) SI1370554T1 (no)
SK (1) SK11332003A3 (no)
TN (1) TNSN03055A1 (no)
TW (1) TWI324155B (no)
UA (1) UA75635C2 (no)
WO (1) WO2002066463A1 (no)
ZA (2) ZA200306335B (no)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6861442B1 (en) * 1998-12-30 2005-03-01 Sugen, Inc. PYK2 and inflammation
AR042586A1 (es) * 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
TWI259081B (en) * 2001-10-26 2006-08-01 Sugen Inc Treatment of acute myeloid leukemia with indolinone compounds
BR0307721A (pt) * 2002-02-15 2005-01-25 Upjohn Co Processo para preparação de derivados de indolinona
WO2003097854A2 (en) * 2002-05-17 2003-11-27 Sugen, Inc. Novel biomarkers of tyrosine kinase inhibitor exposure and activity in mammals
AR042042A1 (es) * 2002-11-15 2005-06-08 Sugen Inc Administracion combinada de una indolinona con un agente quimioterapeutico para trastornos de proliferacion celular
US20040209937A1 (en) * 2003-02-24 2004-10-21 Sugen, Inc. Treatment of excessive osteolysis with indolinone compounds
DE10334582A1 (de) * 2003-07-28 2005-02-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Maleinsäureanhydrid
PL1670785T3 (pl) * 2003-10-02 2010-12-31 Pharmacia & Upjohn Co Llc Sole i polimorfy podstawionego pirolem związku indolinonowego
EP1680401A2 (en) 2003-10-24 2006-07-19 Schering Aktiengesellschaft Indolinone derivatives and their use in treating disease-states such as cancer
WO2005053614A2 (en) * 2003-11-26 2005-06-16 The Scripps Research Institute Advanced indolinone based protein kinase inhibitors
WO2005111023A1 (en) 2004-05-14 2005-11-24 Pfizer Products Inc. Pyrimidine derivatives for the treatment of abnormal cell growth
US20060009510A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-12 Pharmacia & Upjohn Company Llc Method of synthesizing indolinone compounds
CN113952338A (zh) * 2005-02-03 2022-01-21 综合医院公司 治疗吉非替尼耐药性癌症的方法
RU2007135167A (ru) * 2005-03-23 2009-03-27 Пфайзер Продактс Инк. (Us) Комбинированная терапия с использованием анти-ctla4-антитела и индолинона для лечения рака
CA2604357C (en) 2005-04-26 2012-01-17 Pfizer Inc. P-cadherin antibodies
KR20080017058A (ko) * 2005-05-26 2008-02-25 더 스크립스 리서치 인스티튜트 향상된 인돌리논계 단백질 키나제 억제제
UY29783A1 (es) 2005-09-07 2007-04-30 Pfizer Anticuerpos monoclonales humanos para la quinasa-1 tipo receptor de activina
US20090012085A1 (en) * 2005-09-20 2009-01-08 Charles Michael Baum Dosage forms and methods of treatment using a tyrosine kinase inhibitor
CA2621809A1 (en) * 2005-09-22 2007-04-05 The Scripps Research Institute Alkoxy indolinone based protein kinase inhibitors
CN101389331A (zh) * 2005-12-29 2009-03-18 斯克里普斯研究学院 基于吲哚满酮的氨基酸衍生物的蛋白激酶抑制剂
RS20080525A (en) 2006-05-09 2009-09-08 Pfizer Products Inc., Cycloalkylamino acid derivatives and pharmaceutical compositions thereof
US20070282318A1 (en) * 2006-05-16 2007-12-06 Spooner Gregory J Subcutaneous thermolipolysis using radiofrequency energy
EP2061772A4 (en) * 2006-09-11 2011-06-29 Curis Inc MULTIFUNCTIONAL SMALL MOLECULES AS PROLIFERATION-ACTIVE ACTIVE SUBSTANCES
US7928136B2 (en) 2006-09-11 2011-04-19 Curis, Inc. Substituted 2-indolinone as PTK inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2008033562A2 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Xcovery, Inc. Kinase inhibitor compounds
CA2683804A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Receptor tyrosine kinase profiling
WO2008145398A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Pfizer Italia S.R.L. 4-arylpyrrole substituted 2-indoline derivatives active as protein kinase inhibitors
WO2009014941A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 Shenzen Chipscreen Bioscience, Ltd. 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethlidene)-2-indolinone derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
CL2008002793A1 (es) * 2007-09-20 2009-09-04 Cgi Pharmaceuticals Inc Compuestos derivados de amidas sustituidas, inhibidores de la actividad de btk; composicion farmaceutica que los comprende; utiles en el tratamiento del cancer, trastornos oseos, enfermedades autoinmunes, entre otras
US20100256392A1 (en) * 2007-11-21 2010-10-07 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Polymorphs of sunitinib base and processes for preparation thereof
KR20100119582A (ko) * 2008-03-31 2010-11-09 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드 수니티닙 및 이의 염을 제조하는 방법
US8158656B2 (en) * 2008-05-16 2012-04-17 Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. 2-indolinone derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
CA2725001C (en) 2008-05-23 2014-05-13 Jiangsu Chiatai Tianqing Pharmaceutical Co., Ltd. Dihydroindolone derivatives
BRPI0914942A2 (pt) * 2008-06-30 2015-08-11 Cylene Pharmaceuticals Inc Compostos de oxindol
US20100029491A1 (en) * 2008-07-11 2010-02-04 Maike Schmidt Methods and compositions for diagnostic use for tumor treatment
CA2731605A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Sunitinib and salts thereof and their polymorphs
US8211901B2 (en) 2009-05-22 2012-07-03 Shenzhen Chipscreen Biosciences Ltd. Naphthamide derivatives as multi-target protein kinase inhibitors and histone deacetylase inhibitors
CN101906076B (zh) 2009-06-04 2013-03-13 深圳微芯生物科技有限责任公司 作为蛋白激酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的萘酰胺衍生物、其制备方法及应用
KR20120106935A (ko) 2009-07-13 2012-09-27 제넨테크, 인크. 암의 치료를 위한 진단 방법 및 조성물
FR2948940B1 (fr) * 2009-08-04 2011-07-22 Servier Lab Nouveaux derives dihydroindolones, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
WO2011027249A2 (en) 2009-09-01 2011-03-10 Pfizer Inc. Benzimidazole derivatives
US20110064670A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Genentech, Inc. Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
CA2772670A1 (en) 2009-09-17 2011-03-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for diagnostics use in cancer patients
WO2011073521A1 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Petri Salven Methods for enriching adult-derived endothelial progenitor cells and uses thereof
EP2550263A4 (en) 2010-03-23 2013-07-24 Univ Johns Hopkins COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASE
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
CN103180737A (zh) 2010-07-19 2013-06-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 鉴定响应抗癌疗法的可能性升高的患者的方法
KR20130126576A (ko) 2010-07-19 2013-11-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법
WO2012012750A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Trustees Of Boston University ANTI-DEsupR INHIBITORS AS THERAPEUTICS FOR INHIBITION OF PATHOLOGICAL ANGIOGENESIS AND TUMOR CELL INVASIVENESS AND FOR MOLECULAR IMAGING AND TARGETED DELIVERY
WO2012042421A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Pfizer Inc. Method of treating abnormal cell growth
WO2012052948A1 (en) 2010-10-20 2012-04-26 Pfizer Inc. Pyridine- 2- derivatives as smoothened receptor modulators
EP2694058B1 (en) * 2011-04-08 2015-11-04 Beta Pharma, Inc. New indolinone protein kinase inhibitors
WO2012158810A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-22 Principia Biopharma Inc. Tyrosine kinase inhibitors
CA2847540C (en) 2011-09-22 2016-05-17 Pfizer Inc. Pyrrolopyrimidine and purine derivatives
LT3181567T (lt) 2012-09-10 2019-07-25 Principia Biopharma Inc. Pirazolpirimidino junginiai kaip kinazės slopikliai
CN103274986A (zh) * 2013-06-20 2013-09-04 湖南欧亚生物有限公司 一种舒尼替尼中间体的合成和精制方法
FR3008411B1 (fr) * 2013-07-12 2015-07-03 Servier Lab Nouveau sel de la 3-[(3-{[4-(4-morpholinylmethyl)-1h-pyrrol-2-yl]methylene}-2-oxo-2,3-dihydro-1h-indol-5-yl)methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione, sa preparation, et les formulations qui le contiennent
UA115388C2 (uk) 2013-11-21 2017-10-25 Пфайзер Інк. 2,6-заміщені пуринові похідні та їх застосування в лікуванні проліферативних захворювань
MX2016010754A (es) 2014-02-21 2017-03-03 Principia Biopharma Inc Sales y forma solida de un inhibidor btk.
WO2015155624A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Pfizer Inc. Dihydropyrrolopyrimidine derivatives
MX2016014143A (es) 2014-04-30 2017-02-15 Pfizer Derivados de diheterociclo enlazado a cicloalquilo.
WO2016001789A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives as pi3k inhibitors for use in the treatment of cancer
SG11201704808VA (en) 2014-12-18 2017-07-28 Principia Biopharma Inc Treatment of pemphigus
CN104592143B (zh) * 2015-01-23 2017-04-05 四川大学 一种噁唑烷酮类化合物的制备方法
TW201718572A (zh) 2015-06-24 2017-06-01 普林斯匹亞生物製藥公司 酪胺酸激酶抑制劑
WO2017009751A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives
PE20181017A1 (es) 2015-08-31 2018-06-26 Dong A Socio Holdings Co Ltd Compuestos heteroarilo y su uso como farmacos terapeuticos
CN106928114B (zh) * 2015-12-31 2020-07-28 韶远科技（上海)有限公司 含有脲基的环状手性氨基类化合物及其可放大工艺和用途
IL293621B2 (en) 2016-06-29 2023-09-01 Principia Biopharma Inc Modified release formulations of 2-[3-[4-amino-3-(2-fluoro-4-phenoxy-phenyl)pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-1-yl]piperidine-1-carbonyl]-4 -Methyl-4-[4-(oxane-3-yl)piperazine-1-yl)penta-2-ananitrile
KR20210068479A (ko) * 2018-10-05 2021-06-09 아이크노스 사이언스 에스.에이. Map4k1 억제제로서의 사용을 위한 인돌리논 화합물
WO2023081923A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Frequency Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL104796C (no) 1957-08-19
DE878539C (de) 1939-08-17 1953-06-05 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von Methinfarbstoffen
US2622960A (en) * 1948-03-16 1952-12-23 A P W Products Company Inc Glyoxal treatment of absorbent paper to improve wet strength
BE507136A (no) 1950-11-18
BE553661A (no) 1955-12-23
BE558210A (no) 1956-06-08
NL251055A (no) 1959-04-29
FR1398224A (fr) 1964-05-06 1965-05-07 Ici Ltd Procédé de teinture de matières textiles de polyacrylonitrile
US3308134A (en) 1965-10-22 1967-03-07 Mcneilab Inc Spiro(indan-2, 3'-indoline)-1, 2'-diones
US3551571A (en) 1967-05-19 1970-12-29 Endo Lab Methods for reducing pain,reducing fever and alleviating inflammatory syndromes with heteroaromatic pyrrol-3-yl ketones
US3564016A (en) 1968-03-07 1971-02-16 Endo Lab Method of decarbonylation
US4070366A (en) 1968-06-12 1978-01-24 Canadian Patents & Development Limited Alkylation process
FR1599772A (no) 1968-09-17 1970-07-20
US3922163A (en) 1970-01-30 1975-11-25 Upjohn Co Organic compounds and process
US3715364A (en) 1970-12-28 1973-02-06 Merck & Co Inc Nitroimidazole carboxamides
DE2159363A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Antimikrobielle mittel
DE2159361A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159362A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
DE2159360A1 (de) 1971-11-30 1973-06-14 Bayer Ag Nitrofuranderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
GB1384599A (en) 1972-05-04 1975-02-19 Colgate Palmolive Co Coloured detergent compositions
JPS4918256A (no) * 1972-06-09 1974-02-18
US3880871A (en) 1973-09-27 1975-04-29 Squibb & Sons Inc Isothiocyanophenyl substituted imidazoles
US4002643A (en) 1975-06-27 1977-01-11 Mcneil Laboratories, Inc. Preparation of β-acyl pyrroles
US4002749A (en) 1975-08-12 1977-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Substituted indolinones
US4053613A (en) 1975-09-17 1977-10-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones
GR73560B (no) 1979-02-24 1984-03-15 Pfizer
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4343923A (en) 1980-08-07 1982-08-10 Armstrong World Industries, Inc. Process for reducing the acid dye uptake of polyamide textile materials with N-acylimidazole compound
CH646956A5 (de) 1981-12-15 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Imidazolide.
EP0095285A1 (en) 1982-05-21 1983-11-30 Sumitomo Chemical Company, Limited N-acylimidazoles, their production and use
DE3310891A1 (de) 1983-03-25 1984-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue indolinon-(2)-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4489089A (en) 1983-04-06 1984-12-18 American Cyanamid Company Substituted N-[ω-(1H-imidazol-1-yl)alkyl]-amides
DE3480392D1 (en) 1983-04-29 1989-12-14 Ciba Geigy Ag Imidazolides and their use as curing agents for polyepoxides
DE3415138A1 (de) 1984-04-21 1985-10-31 Basf Ag, 6700 Ludwigshafen N-(azolylcarbamoyl)-hydroxylamine und diese enthaltende fungizide
DE3426419A1 (de) 1984-07-18 1986-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue oxindol-derivate, verfahren zu ihrer herstellung, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und zwischenprodukte
US4560700A (en) 1985-02-08 1985-12-24 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Pyrrole-3-carboxylate cardiotonic agents
JPH078851B2 (ja) 1985-07-29 1995-02-01 鐘淵化学工業株式会社 ３−フエニルチオメチルスチレン誘導体
US4966849A (en) 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
WO1993012786A1 (en) 1986-07-10 1993-07-08 Howard Harry R Jr Indolinone derivatives
US4853404A (en) 1986-10-13 1989-08-01 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Phenoxyacetic acid derivatives composition and use
WO1988007035A1 (en) 1987-03-11 1988-09-22 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hydroxystyrene derivatives
US5202341A (en) 1987-03-11 1993-04-13 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Hydroxystyrene compounds having tyrosine kinase inhibiting activity
US5089516A (en) 1987-03-11 1992-02-18 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha 1-phenyl-3,5-pyrazolidinedione hydroxystyrene compounds which have tyrosine kinase inhibiting activity
US5043348A (en) 1987-04-24 1991-08-27 Cassella Aktiengesellschaft Pyrrolealdehydes, their preparation and their use
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
DE3808071A1 (de) 1988-03-11 1989-09-21 Basf Ag Verfahren zur herstellung von acylierten imidazolen
US4868304A (en) 1988-05-27 1989-09-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Synthesis of nitrogen heterocycles
CA1339784C (en) 1988-06-23 1998-03-31 Shinya Inoue Pyrrolecarboxylic acid derivatives
JPH06104658B2 (ja) 1988-06-23 1994-12-21 三菱化成株式会社 ピロールカルボン酸誘導体
DE3824658A1 (de) 1988-07-15 1990-01-18 Schering Ag N-hetaryl-imidazolderivate
GB8816944D0 (en) 1988-07-15 1988-08-17 Sobio Lab Compounds
US5084280A (en) 1988-12-15 1992-01-28 Chapman Chemical Company Wood preservation composition and method
DE3902439A1 (de) 1989-01-27 1990-08-02 Basf Ag Pflanzenschuetzende mittel auf basis von 1-aryl- bzw. 1-hetarylimidazolcarbonsaeureestern
US5047554A (en) 1989-04-18 1991-09-10 Pfizer Inc. 3-substituted-2-oxindole derivatives
DE69031649T2 (de) 1989-07-25 1998-02-26 Taiho Pharmaceutical Co Ltd Oxoindolderivate
US5258357A (en) 1989-10-07 1993-11-02 Basf Aktiengesellschaft Carboxamides, their preparation and their use as herbicides
CA2032421A1 (en) 1989-12-20 1991-06-21 Mitsubishi Chemical Corporation Pyrrolealdehyde derivative
GB9004483D0 (en) 1990-02-28 1990-04-25 Erba Carlo Spa New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation
CA2012634A1 (en) 1990-03-20 1991-09-20 Hassan Salari Tyrphostins for treatment of allergic, inflammatory and cardiovascular diseases
US5196446A (en) 1990-04-16 1993-03-23 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Certain indole compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
US5302606A (en) 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
CH680293A5 (no) * 1990-06-26 1992-07-31 Lonza Ag
IT1247509B (it) 1991-04-19 1994-12-17 Univ Cagliari Composti di sintesi atti all'impiego nella terapia delle infezioni da rhinovirus
US5480883A (en) 1991-05-10 1996-01-02 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
DE69222637T2 (de) 1991-05-10 1998-02-26 Rhone Poulenc Rorer Int Bis mono- und bicyclische aryl- und heteroarylderivate mit inhibierender wirkung auf die egf und/oder pdgf-rezeptor tyrosinkinase
GB9115160D0 (en) 1991-07-12 1991-08-28 Erba Carlo Spa Methylen-oxindole derivatives and process for their preparation
US5124347A (en) 1991-07-31 1992-06-23 Warner-Lambert Co. 3-5-ditertiarybutylphenyl-4-hydroxymethylidene derivatives of 1,3-dihydro-2H-indole-2-ones as antiinflammatory agents
WO1993007751A1 (en) 1991-10-18 1993-04-29 Monsanto Company Fungicides for the control of take-all disease of plants
US5389661A (en) 1991-12-05 1995-02-14 Warner-Lambert Company Imidazole and 1,2,4-triazole derivatives with angiotensin II antagonist properties
US5322950A (en) 1991-12-05 1994-06-21 Warner-Lambert Company Imidazole with angiotensin II antagonist properties
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
FR2689397A1 (fr) 1992-04-01 1993-10-08 Adir Utilisation des dérivés de la 3-(3,5-Ditert-Butyl-4-Hydroxybenzylidenyl) Indoline-2-one pour l'obtention de médicaments.
DE4211531A1 (de) 1992-04-06 1993-10-07 Cassella Ag Verfahren zur Herstellung von Pyrrolderivaten
FR2694004B1 (fr) 1992-07-21 1994-08-26 Adir Nouvelles 3-(Hydroxybenzylidényl)-indoline-2-ones et 3-(hydroxybenzylidényl)-indoline-2-thiones, leurs procédés de préparation, et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5330992A (en) 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
GB9226855D0 (en) 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
JP3507124B2 (ja) 1993-05-26 2004-03-15 塩野義製薬株式会社 ベンジリデン誘導体の製造法
EP0632102B1 (de) 1993-06-28 1997-04-02 Bayer Ag Massefärben von Kunststoffen
US5332736A (en) 1993-11-01 1994-07-26 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-convulsant aroyl aminoacylpyrroles
US5610173A (en) 1994-01-07 1997-03-11 Sugen, Inc. Formulations for lipophilic compounds
GB9507298D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Pharmacia Spa Substituted indolylmethylene-oxindale analogues as tyrosine kinase inhibitors
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5786488A (en) 1996-11-13 1998-07-28 Sugen, Inc. Synthetic methods for the preparation of indolyquinones
JP3246712B2 (ja) 1995-11-15 2002-01-15 株式会社トクヤマ エテニルアミド化合物の製造方法
DE19602525A1 (de) * 1996-01-25 1997-08-07 Starck H C Gmbh Co Kg Sphärische Keramikformkörper, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie deren Verwendung
EP0788890A1 (en) 1996-02-06 1997-08-13 Agfa-Gevaert N.V. Dyes and dye-donor elements for thermal dye transfer recording
CA2206201A1 (en) 1996-05-29 1997-11-29 Yoshiaki Isobe Pyrazole derivatives and their pharmaceutical use
EP0923546B1 (de) 1996-08-01 2003-11-26 Merckle GmbH Acylpyrroldicarbonsäuren und acylindoldicarbonsäuren sowie ihre derivate als hemmstoffe der cytosolischen phospholipase a2
US6133305A (en) 1997-09-26 2000-10-17 Sugen, Inc. 3-(substituted)-2-indolinones compounds and use thereof as inhibitors of protein kinase activity
IL139934A (en) 1998-05-29 2007-10-31 Sugen Inc History 2 - Indulinone converted to pyrrole and pharmaceutical preparations containing them
US6462072B1 (en) 1998-09-21 2002-10-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Cyclic ester or amide derivatives
CA2354543A1 (en) 1998-12-14 2000-06-22 Cellegy Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of anorectal disorders
JP2002532492A (ja) 1998-12-17 2002-10-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー サイクリン−依存性キナーゼ、特にｃｄｋ２のインヒビターとしての４−アルケニル（及びアルキニル）オキシドール
TR200101745T2 (tr) * 1998-12-17 2002-05-21 F.Hoffmann-La Roche Ag 4,5-Azolo-oksindoller
US6284894B1 (en) 1998-12-18 2001-09-04 Nycomed Imaging As Preparation of allylic aromatic compounds
MY130363A (en) * 2000-02-15 2007-06-29 Sugen Inc "pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors"
MY128450A (en) 2000-05-24 2007-02-28 Upjohn Co 1-(pyrrolidin-1-ylmethyl)-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
AR042586A1 (es) * 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
BR0307721A (pt) * 2002-02-15 2005-01-25 Upjohn Co Processo para preparação de derivados de indolinona

Also Published As

Publication number Publication date
RS51026B (sr) 2010-10-31
JP3677501B2 (ja) 2005-08-03
ES2251580T3 (es) 2006-05-01
OA12834A (en) 2006-09-15
KR100884858B1 (ko) 2009-02-23
EP1370554B1 (en) 2005-10-19
ATE307128T1 (de) 2005-11-15
HRP20030657B1 (en) 2006-10-31
US20030092917A1 (en) 2003-05-15
IS2411B (is) 2008-10-15
IL157418A0 (en) 2004-03-28
EE200300385A (et) 2004-02-16
ZA200306335B (en) 2005-01-26
AR042586A1 (es) 2005-06-29
AP1718A (en) 2007-01-30
US20040102510A1 (en) 2004-05-27
IS6913A (is) 2003-08-14
MY126235A (en) 2006-09-29
US7256189B2 (en) 2007-08-14
DE60206736T2 (de) 2006-08-03
EA007186B1 (ru) 2006-08-25
EA200300793A1 (ru) 2004-04-29
PE20021006A1 (es) 2002-11-08
HK1059621A1 (en) 2004-07-09
US7582756B2 (en) 2009-09-01
NO20033608D0 (no) 2003-08-14
UA75635C2 (en) 2006-05-15
HRP20030657A2 (xx) 2005-10-31
MXPA03007367A (es) 2005-07-25
YU71703A (sh) 2006-05-25
CZ20032414A3 (cs) 2004-04-14
CA2438314A1 (en) 2002-08-29
US7179910B2 (en) 2007-02-20
HUP0303146A2 (hu) 2003-12-29
NO20033608L (no) 2003-10-14
CA2438314C (en) 2012-08-07
KR20030078921A (ko) 2003-10-08
DK1370554T3 (da) 2006-02-06
BG108098A (bg) 2005-12-30
HUP0303146A3 (en) 2007-08-28
US20070027149A1 (en) 2007-02-01
CR7056A (es) 2004-02-02
AP2003002836A0 (en) 2003-09-30
DE60206736D1 (en) 2006-03-02
PL364176A1 (en) 2004-12-13
EP1370554A1 (en) 2003-12-17
US20080045709A1 (en) 2008-02-21
US6653308B2 (en) 2003-11-25
SK11332003A3 (sk) 2004-04-06
NZ527572A (en) 2005-07-29
ZA200405615B (en) 2005-06-27
CN1529704A (zh) 2004-09-15
WO2002066463A1 (en) 2002-08-29
SI1370554T1 (sl) 2006-04-30
CN100338059C (zh) 2007-09-19
JP2004522776A (ja) 2004-07-29
IL157418A (en) 2011-03-31
AU2002247133B2 (en) 2007-08-30
GEP20053600B (en) 2005-08-10
TNSN03055A1 (en) 2005-12-23
TWI324155B (en) 2010-05-01
MA26997A1 (fr) 2004-12-20
BR0207494A (pt) 2004-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6653308B2 (en) 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors
EP1255752B1 (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US20040138269A1 (en) Substituted pyrroles as kinase inhibitors
AU2002247133A1 (en) 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethlidene)-2-indolinone derivatives as protein kinase inhibitors
AU2001239770A1 (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
US6797725B2 (en) Prodrugs of a 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
US20020187978A1 (en) 4-Heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
US7214700B2 (en) (2-Oxindol-3-ylidenyl) acetic acid derivatives and their use as protein kinase inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees