KR20030078921A

KR20030078921A - 단백질 키나제 억제제로서의3-(4-아미도피롤-2-일메틸리덴)-2-인돌리논 유도체

Info

Publication number: KR20030078921A
Application number: KR10-2003-7010772A
Authority: KR
Inventors: 구안휴핑; 리앙콩신; 선리; 탱펭쵸; 웨이청첸; 마우라기스마이클에이; 보코브스키토마스; 진큉우; 헤린톤폴마튜
Original assignee: 수젠, 인크.; 파마시아 앤드 업존 캄파니; 구안 휴핑
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2002-02-15
Publication date: 2003-10-08
Also published as: IL157418A0; CA2438314A1; US20080045709A1; ZA200306335B; MXPA03007367A; HRP20030657A2; AU2002247133B2; UA75635C2; ZA200405615B; DK1370554T3; EA007186B1; BR0207494A; YU71703A; AP1718A; US20070027149A1; US6653308B2; KR100884858B1; WO2002066463A1; JP3677501B2; US7256189B2

Abstract

본 발명은 단백질 키나제의 활성을 조절하여 암과 같은 단백질 키나제와 연관된 세포성 질환의 예방 및 치료에 유용할 것으로 기대되는 피롤 치환된 2-인돌리논 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.

Description

단백질 키나제 억제제로서의 3-(4-아미도피롤-2-일메틸리덴)-2-인돌리논 유도체{3-(4-AMIDOPYRROL-2-YLMETHYLIDENE)-2-INDOLINONE DERIVATIVES AS PROTEIN KINASE INHIBITORS}

본 발명은 본원에 참고로 인용되어 있는 가출원 제 60/312,361 호(2001년 8월 15일 출원) 및 제 60/268,683 호(2001년 2월 15일 출원)를 우선권으로 주장한다.

PK는 단백질의 티로신, 세린 및 트레오닌 잔기상의 하이드록시 기의 포스포릴화를 촉매하는 효소이다. 이 얼핏 보기에는 단순한 활성의 결과는 놀랍다. 세포 성장, 분화 및 증식, 즉 세포의 생애에서 본질적으로 모든 측면이 어떤 방식으로든 PK의 활성에 달려있다. 또한, 비정상적인 PK 활성은 건선과 같이 비교적 치명적이지 않은 질병부터 교아종(뇌암)과 같은 매우 치명적인 질병까지의 범위의 많은 질병들과 연관되어 있다.

PK는 통상적으로 단백질 티로신 키나제(PTK) 및 세린-트레오닌 키나제(STK)의 2가지 종류로 나누어질 수 있다.

PTK 활성의 주 양태중 하나는 성장 인자 수용체와의 연관성이다. 성장 인자 수용체는 세포-표면 단백질이다. 성장 인자 리간드에 결합되었을 때, 성장 인자 수용체는 세포막 내부 표면에 있는 단백질과 상호작용하는 활성 형으로 전환된다. 이로 인해 수용체 및 다른 단백질의 티로신 잔기가 포스포릴화되고, 세포 내에서 다양한 세포질 신호 분자와 착체를 형성하고, 이 신호 분자들은 또한 다양한 세포 반응, 예를 들면 세포 분할(증식), 세포 분화, 세포 성장, 세포외 미세환경으로 대사 효과의 발현 등을 일으킨다. 보다 자세한 내용을 알고 싶으면, 본원에 참고로 인용되어 있는 쉴레싱거(Schlessinger) 및 울리치(Ullrich)의 문헌[Neuron, 9:303-391(1992)]를 참고하시오.

PTK 활성이 있는 성장 인자 수용체는 수용체 티로신 키나제("RTK")로 알려져 있다. 이들은 다양한 생물학적 활성을 갖는 큰 족(族)의 세포막통과성 수용체를 구성한다. 현재, 최소한 19가지의 서로 다른 RTK의 아족이 확인되었다. 이들의 한 예가 "HER" RTK로 명명된 아족이고, 여기에는 EGFR(상피세포 성장 인자 수용체), HER2, HER3 및 HER4가 포함된다. 이들 RTK는 세포외 글리코실화된 리간드 결합 도메인, 세포막통과성 도메인, 및 단백질의 티로신 잔기를 포스포릴화할수 있는 세포내 세포질 촉매 도메인으로 구성된다.

다른 RTK 아족은 인슐린 수용체(IR), 인슐린형 성장 인자 I 수용체(IGF-IR) 및 인슐린 수용체와 연관된 수용체(IRR)로 구성된다. IR 및 IGF-IR은 인슐린, IGF-I 및 IGF-II와 상호작용하여 2개의 전적으로 세포외 글리코실화된 α서브유니트와, 세포막을 가로지르고 티로신 키나제 도메인을 함유하는 2개의 β 서브유니트로 구성된 이종사량체를 형성한다.

세 번째 RTK 아족은 혈소판 유래된 성장 인자 수용체("PDGFR) 군으로 불리고, 여기에는 PDGFRα, PDGFRβ, CSFIR, c-kit 및 c-fms가 포함된다. 이들 수용체는 다양한 수의 면역글로불린형 루프를 포함하는 글리코실화된 세포외 도메인과 세포내 도메인으로 구성되고, 여기서 티로신 키나제 도메인은 연관이 없는 아미노산 서열에 의해 차단된다.

PDGFR 아족과의 유사성 때문에 종종 PDGFR 아족에 포함되는 다른 군은 태아 간 키나제("flk") 수용체 아족이다. 이 군은 키나제 삽입 도메인-수용체 태아 간 키나제-1(KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-1R, flk-4 및 fms-형 티로신 키나제 1(flt-1)로 구성된 것으로 생각된다.

티로신 키나제 성장 인자 수용체 족의 추가의 일원은 섬유아세포 성장 인자("FGF") 수용체 아군이다. 이 군은 4개의 수용체인 FGFR1-4과 7개의 리간드인 FGF1-7로 구성된다. 아직까지 잘 규명되지는 않았지만, 수용체는 다양한 수의 면역 글로불린형 루프를 함유하는 글리코실화된 세포외 도메인, 및 티로신 키나제 서열이 연관이 없는 아미노산 서열 영역에 의해 차단되는 세포내 도메인으로 구성된다.

티로신 키나제 성장 인자 수용체 족의 또다른 일원은 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF) 수용체 아군이다. VEGF는 PDGF와 유사한 이량체성 당단백질이지만, 생체내에서는 이와는 다른 생물학적 기능과 목표 세포 특이성을 갖는다. 특히, VEGF는 현재 혈관생성 및 신생혈관생성에서 필수적인 역할을 하는 것으로 생각된다.

알려진 RTK 아족에 대한 보다 완전한 목록은 본원에 참고로 인용되어 있는 플로우맨(Plowman) 등의 문헌[DN&P, 7(6):334-339(1994)]에 개시되어 있다.

RTK에 추가하여, 또한 "비수용체 티로신 키나제" 또는 "세포성 티로신 키나제"라 불리는 완전히 세포내인 RTK 족이 존재한다. "CTK"라는 약자로 표현되는 이 후자의 명칭을 본원에서 사용할 것이다. CTK는 세포외 및 세포통과성 도메인을 함유하지 않는다. 현재, 11개 아족의 24개 이상의 CTK(Src, Frk, Btk, Csk, Ab1, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak 및 Ack)가 확인되었다. Src 아족이 이제까지 가장 큰 CTK 군으로 보이고, 여기에는 Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr 및 Yrk가 포함된다. CTK에 대한 보다 상세한 설명을 살펴보려면, 본원에 참고로 인용되어 있는 볼렌(Bolen)의 문헌[Oncogene, 8:2025-2031(1993)]을 참고할 수 있다.

STK 형의 몇몇 수용체 키나제가 있기는 하지만, 세린/트레오닌 키나제인 STK는 CTK와 유사하게 주로 세포내이다. STK는 가장 흔한 사이토졸 키나제이다. 즉, 세포질 기관과 세포골격이 아닌 세포질 부분에서 활성을 나타내는 키나제이다. 사이토졸은 세포의 중간적 대사작용 및 생합성 활성의 대부분이 일어나는 세포내 영역이다. 예를 들면 단백질이 리보솜상에서 합성되는 것은 사이토졸 내에서이다.

RTK, CTK 및 STK는 모두 암을 포함하는 다수의 병원성 질환에 연관되어 있다. PTK가 연관되어 있는 다른 병원성 질환에는 건선, 간경변, 당뇨병, 신생혈관형성, 재발협착증, 안과 질병, 류마티스성 관절염 및 다른 염증성 질병, 면역원성 질환, 예를 들면 자가면역 질병, 심혈관 질병, 예를 들면 죽상경화증 및 다양한 신장 질병이 포함되지만, 이로 제한되지는 않는다.

암과 관련하여, 종양을 발달시키는 과다한 세포 증식이 PK 조절되는 것으로 알려진 작용들과 연관되어 있음을 설명하는 두 가지 주된 이론이 나왔다. 즉, 악성 세포 성장은 세포 분할 및/또는 분화를 제어하는 기작이 고장난 결과이다. 다수의 원종양원(proto-oncogene)의 단백질 생성물이 세포의 성장과 분화를 조절하는 신호 전달 경로에 포함되어 있는 것으로 보인다. 원종양원의 이들 단백질 생성물에는 상기 논의된 세포외 성장 인자, 세포막통과성 성장 인자 PTK 수용체(RTK), 세포질 PTK(CTK), 사이토졸 STK가 포함된다.

PK와 연관된 세포 활성과 광범위한 인간의 질병사이의 외적인 연관성을 살펴볼 때, PK 활성을 조절하는 방법을 확인하려고 많은 노력이 소비된 점은 당연하다. 이 노력중 일부는 실제 세포 과정에 관련되는 것들을 본 딴 큰 분자를 이용한 바이오미메틱(biomimetic) 접근법(예를 들면 돌연변이 리간드(미국 특허원 제 4,966,849 호); 용해성 수용체 및 항체(제 WO 94/10202, 켄달(Kendall) 및 토마스(Thomas)의 문헌[Proc. Nat'l Acad. Sci., 90:10705-09(1994)], 킴(Kim) 등의 문헌[Nature, 362:841-844(1993)]); RNA 리간드(젤리넥(Jelinek) 등의 문헌[Biochemistry, 33:10450-56]; 다카노(Takano) 등의 문헌[Mol. Bio. Cell4:358A(1993)]; 킨셀라(Kinsella) 등의 문헌[Exp. Cell Res. 199:56-62(1992)]; 라이트(Wright) 등의 문헌[J. Cellular Phys., 152:448-57]) 및 티로신 키나제 억제제(제 WO94/03427 호, 제 WO 92/21660 호; 제 WO 91/15495 호; 제 WO 94/14808 호; 미국 특허 제 5,330,992 호; 마리아니(Mariani) 등의 문헌[Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35:2268(1994)])이 포함된다.

이에 추가하여, PK 억제제로서 작용하는 작은 분자를 확인하고자 노력하여왔다. 예를 들면, 비스-모노사이클릭, 비사이클릭 및 헤테로사이클릭 아릴 화합물(제 PCT WO 92/20642 호), 비닐렌아자인돌 유도체(제 PCT WO 94/14808 호) 및 1-사이클로프로필-4-피리딜퀴놀온(미국 특허 제 5,330,992 호)가 티로신 키나제 억제제로서 개시되어 왔다. 스티릴 화합물(미국 특허 제 5,217,999 호), 스티릴-치환된 피리딜 화합물(미국 특허 제 5,302,606 호), 퀴나졸린 유도체(유럽 특허원 제 0 566 266 A1 호), 셀레나인돌 및 셀레니드(제 PCT WO94/03427 호), 트리사이클릭 폴리하이드록시 화합물(제 PCT WO 92/21660 호) 및 벤질포스폰산 화합물(제 PCT WO 91/15495 호) 모두 암의 치료에 유용한 PTK 억제제로서 개시되어 왔다.

발명의 요약

본 발명은 PK 조절 능력을 나타내고, 따라서, 비정상적인 PK 활성과 연관된 질병의 치료에 유용한 특정한 3-(4-아미도피롤-2-일메틸리덴)-2-인돌리논 유도체에 관한 것이다.

본 발명의 한 양태는 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:

상기 식에서,

R¹은 수소, 할로, 알킬, 할로알콕시, 사이클로알킬, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰및 -C(O)NR¹²R¹³으로 이루어진 군에서 선택되고;

R²는 수소, 할로, 알킬, 트리할로메틸, 하이드록시, 알콕시, 시아노, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)₂NR⁹R¹⁰및 -SO₂R¹⁴(여기서, R¹⁴는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아르알킬이다)로 이루어진 군에서 선택되고;

R³, R⁴및 R⁵는 독립적으로 수소 또는 알킬이고;

Z는 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클 또는 -NR¹⁵R¹⁶(여기서, R¹⁵및 R¹⁶은 독립적으로 수소 또는 알킬이거나; 또는 R¹⁵와 R¹⁶은 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성한다)이고;

R⁶은 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁷은 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 -C(O)R¹⁷로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁸은 하이드록시, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁹및 R¹⁰은 독립적으로 수소, 알킬, 시아노알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는

R⁹와 R¹⁰은 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성하고;

R¹²및 R¹³은 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬 및 아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는

R¹²와 R¹³은 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클로아미노를 형성하고;

R¹⁷은 하이드록시, 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된다.

다른 양태는 R¹이 수소, 할로, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰및 -C(O)NR¹²R¹³으로 이루어진 군에서 선택되고; R²가 수소, 할로, 알킬, 트리할로메틸, 하이드록시, 알콕시, 시아노, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)₂NR⁹R¹⁰및 -SO₂R¹⁴(여기서, R¹⁴는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아르알킬이다)로 이루어진 군에서 선택되고; R³, R⁴및 R⁵가 독립적으로 수소 또는 알킬이고; Z가 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클 또는 -NR¹⁵R¹⁶(여기서, R¹⁵및 R¹⁶은 독립적으로 수소 또는 알킬이거나; 또는 R¹⁵와 R¹⁶은 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성한다)이고; R⁶이 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고; R⁷이 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 -C(O)R¹⁷로 이루어진 군에서 선택되고; R⁸이 하이드록시, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되고; R⁹및 R¹⁰이 독립적으로 수소, 알킬, 시아노알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는 R⁹와 R¹⁰이 함께 헤테로사이클로 기를 형성하고; R¹²및 R¹³이 독립적으로 수소, 알킬 및 아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는 R¹²와 R¹³이 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클을 형성하고; R¹⁷이 하이드록시, 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.

다른 양태는 하기 화학식 Ia의 화합물이다:

상기 식에서,

R¹, R³, R⁴및 R⁵는 수소이고;

R²는 플루오로이고 인돌리논 고리의 5-위치에 위치하고;

Z는 모르폴린-4-일이고;

R⁶및 R⁷은 메틸이다.

바람직하게는,^*C에서의 입체화학은 (S)이다.

다른 양태는 하기 화학식 II의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:

상기 식에서,

R은 수소 또는 알킬이고;

R³, R⁴및 R⁵는 독립적으로 수소 또는 알킬이고;

R⁶은 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁹와 R¹⁰은 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성하고;

다른 양태는 화학식 I, Ia 또는 II의 화합물 또는 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.

다른 양태는 단백질 키나제를 화학식 I, Ia 또는 II의 화합물 또는 염과 접촉시킴을 포함하는, 단백질 키나제의 촉매 활성을 조절하는 방법이다. 이 방법을 위한 단백질 키나제는 수용체 티로신 키나제, 비수용체 티로신 키나제 및 세린-트레오닌 키나제일 수 있다.

다른 양태는 화학식 I, Ia 또는 II의 화합물 또는 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 치료 효과량의 약학 조성물을 유기체에 투여함을 포함하는, 유기체에서 단백질 키나제와 연관된 질병을 치료하거나 예방하는 방법이다. 이 방법을 위한 단백질 키나제는 수용체 티로신 키나제, 비수용체 티로신 키나제 및 세린-트레오닌 키나제일 수 있다. 단백질 키나제와 연관된 질병은 EGFR 연관된 질병, PDGFR 연관된 질병, IGFR 연관된 질병 및 flk 연관된 질병일 수 있다. 단백질 키나제 질환은 또한 편평상피암, 성상세포종, 카포시(Kaposi) 육종, 교야종, 폐암, 방광암, 두부암, 목암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 신경교종, 결장직장암, 생식비뇨기암 및 위장관암일 수 있다. 또한, 단백질 키나제 질병은 당뇨병, 자가면역 질환, 과다증식 질환, 재발협착증, 섬유증, 건선, 폰 헤펠-린도(von Heppel-Lindau)병, 골관절염, 류마티스성 관절염, 신생혈관생성, 염증성 질병, 면역원성 질병 및 심혈관 질병일 수 있다. 이들 방법은 인간을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

최종적으로, 본 발명은 또한 단백질 키나제를 발현하는 세포를 본 발명의 화합물 또는 염과 접촉시킨 후 효과에 대해 세포를 모니터링함으로써 단백질 키나제의 촉매 활성을 조절하는 화학적 화합물의 확인에 관한 것이다.

본 발명은 단백질 키나제("PK")의 활성을 조절하는 특정한 3-(4-아미도피롤-2-일메틸리덴)-2-인돌리논 유도체에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 화합물은 비정상적인 PK 활성과 연관된 질병의 치료에 유용하다. 이들 화합물을 함유하는 약학 조성물, 이들 화합물을 포함하는 약학 조성물을 이용한 질병의 치료 방법, 및 이들의 제조 방법 또한 개시되어 있다.

정의

달리 정의되지 않으면, 본 발명의 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 다음의 용어들은 하기 논의되는 의미를 갖는다:

"알킬"은 탄소수 1 내지 20의 직쇄 또는 분지쇄를 포함하는 포화 지방족 탄화수소 라디칼을 의미한다(본원에서 "1-20"과 같은 수치 범위가 사용되는 경우, 이는 알킬 기인 경우, 이 기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소원자, 3개의 탄소원자 등 20개까지의 탄소 원자를 함유할 수 있음을 의미한다). 보다 바람직하게, 이는 탄소수 1 내지 10의 중간 크기 알킬이고, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸 등이다. 가장 바람직하게는 이는 1 내지 4의 탄소수를 갖는 저급 알킬, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, n-부틸, 이소-부틸 또는 tert-부틸 등이다. 알킬은 치환되거나 비치환될 수 있고, 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 할로, 하이드록시, 저급 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릭, C(O)R⁸, NR⁹R¹⁰및 C(O)NR⁹R¹⁰이다.

"사이클로알킬"은 3 내지 8원의 고리 원자가 모두 탄소인 모노사이클릭 고리이거나, 고리 원자가 모두 탄소인 5원/6원 또는 6원/6원의 축합된 비사이클릭 고리 또는 멀티사이클릭 축합된 고리("축합된" 고리 시스템은 시스템의 각각의 고리가 시스템의 서로 다른 고리와 인접한 쌍의 탄소 원자를 공유함을 의미한다)를 의미하고, 여기서 고리중 하나 이상은 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있지만, 어떤고리도 완전히 공액된 파이-전자 시스템을 갖지는 않는다. 사이클로알킬 기의 예는 사이클로프로판, 사이클로부탄, 사이클로펜탄, 사이클로펜텐, 사이클로헥산, 사이클로헥사디엔, 아다만탄, 사이클로헵탄, 사이클로헵타트리엔 등이지만, 이로 한정되지는 않는다. 사이클로알킬 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 하나 이상, 보다 바람직하게는 1 또는 2개이고, 독립적으로 저급 알킬; 트리할로알킬; 할로; 하이드록시; 저급 알콕시; 할로, 하이드록시, 저급 알킬 또는 저급 알콕시 기에서 선택된 하나 이상, 바람직하게는 1 내지 2개의 치환체로 선택적으로 치환된 아릴; 할로, 하이드록시, 저급 알킬 또는 저급 알콕시 기에서 서로 독립적으로 선택된 하나 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환된 아릴 옥시; 고리내에 1 내지 3개의 질소 원자를 갖고, 고리내의 탄소가 할로, 하이드록시, 저급 알킬 또는 저급 알콕시 기에서 서로 독립적으로 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환된 6원 헤테로아릴; 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군에서 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖고, 기의 탄소 및 질소 원자가 할로, 하이드록시, 저급 알킬 또는 저급 알콕시 기에서 독립적으로 선택된 하나 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되는 5원 헤테로아릴; 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군에서 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖고, 기의 산소 및 질소(존재하는 경우) 원자가 할로, 하이드록시, 저급 알킬 또는 저급 알콕시 기, 머캅토, (저급 알킬)티오, 아릴티오(할로, 하이드록시, 저급 알킬 또는 저급 알콕시 기에서 서로 독립적으로 선택된 하나 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환된다), 시아노, 아실,티오아실, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, 니트로, N-설폰아미도, S-설폰아미도, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- 및 -NR⁹R¹⁰(상기 정의된 바와 같음)에서 독립적으로 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 기로 선택적으로 치환되는 5- 또는 6-원 헤테로알리사이클릭 기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.

"알케닐"은 2개이상의 탄소 원자와 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합으로 구성된, 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 의미한다. 대표적인 예에는 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-, 2-, 또는 3-부테닐 등이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다.

"알키닐"은 두 개이상의 탄소 원자 및 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합으로 구성된, 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 의미한다. 대표적인 예에는 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-, 2- 또는 3-부티닐 등이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다.

"아릴"은 완전히 공액된 파이-전자 시스템을 갖는 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는, 고리 원자가 모두 탄소인 모노사이클릭 또는 축합-고리 폴리사이클릭 기(즉, 고리가 인접한 쌍의 탄소 원자를 공유한다)를 의미한다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프탈레닐 및 안트라세닐이고, 이로 제한되지는 않는다. 아릴 기는 치환되거나 치환되지 않는다. 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 하나 이상, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3개, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2개이고, 저급 알킬, 트리할로알킬, 할로, 하이드록시, 저급 알콕시, 머캅토, (저급 알킬)티오, 시아노, 아실, 티오아실, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, 니트로, N-설폰아미도, S-설폰아미도, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- 및 -NR⁹R¹⁰(이때, R⁹및 R¹⁰은 상기 정의된 바와 같다)로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 바람직하게는 아릴 기는 할로, 저급 알킬, 트리할로알킬, 하이드록시, 머캅토, 시아노, N-아미도, 모노 또는 디알킬아미노, 카복시 또는 N-설폰아미도에서 독립적으로 선택되는 1 또는 2개의 치환체로 선택적으로 치환된다.

"헤테로아릴"은 N, O 또는 S에서 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 고리 헤테로원자를 갖고, 나머지 고리 원자가 C인 5 내지 12개의 고리 원자의 모노사이클릭 또는 축합 고리(즉, 고리가 인접한 원자 쌍을 공유한다) 기를 의미한다. 비치환된 헤테로아릴 기의 예는 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 푸린, 테트라졸, 트리아진 및 카바졸이고, 이로 제한되지는 않는다. 헤테로아릴 기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 하나 이상, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3개, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2개이고, 저급 알킬, 트리할로알킬, 할로, 하이드록시, 저급 알콕시, 머캅토, (저급 알킬)티오, 시아노, 아실, 티오아실, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, 니트로, N-설폰아미도, S-설폰아미도, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- 및 -NR⁹R¹⁰(이때, R⁹및 R¹⁰은상기 정의된 바와 같다)로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 바람직하게는, 헤테로아릴 기는 할로, 저급 알킬, 트리할로알킬, 하이드록시, 머캅토, 시아노, N-아미도, 모노 또는 디알킬아미노, 카복시 또는 N-설폰아미도에서 독립적으로 선택되는 1 또는 2개의 치환체로 선택적으로 치환된다.

"헤테로알리사이클릭"은 1 또는 2개의 고리 원자가 N, O 또는 S(O)n(여기서, n은 0 내지 2의 정수이다)이고, 나머지 고리 원자가 C인 5 내지 9개의 고리 원자를 갖는 모노사이클릭 또는 축합 고리 기를 의미한다. 고리는 또한 하나 이상의 이중 결합을 가질 수 있다. 그러나, 고리는 완전히 공액된 파이-전자 시스템을 갖지는 않는다. 비치환된 헤테로알리사이클릭 기의 예는 피롤리디노, 피페리디노, 피페라지노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 호모피페라지노 등이고, 이로 제한되지 않는다. 헤테로알리사이클릭 고리는 치환되거나 비치환된다. 치환되는 경우, 치환된 기는 바람직하게는 하나 이상, 보다 바람직하게는 1, 2 또는 3개이고, 보다 더 바람직하게는 1 또는 2개이고, 저급 알킬, 트리할로알킬, 할로, 하이드록시, 저급 알콕시, 머캅토, (저급 알킬)티오, 시아노, 아실, 티오아실, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, 니트로, N-설폰아미도, S-설폰아미도, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- 및 -NR⁹R¹⁰(이때, R⁹및 R¹⁰은 상기 정의된 바와 같다)으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 바람직하게는, 헤테로알리사이클릭 기는 할로, 저급 알킬, 트리할로알킬, 하이드록시, 머캅토, 시아노, N-아미도, 모노 또는 디알킬아미노, 카복시 또는 N-설폰아미도에서 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 치환체로 선택적으로 치환된다.

"헤테로사이클"은 하나 또는 두 개의 고리 원자가 N, O 또는 S(O)_n(여기서, n은 0 내지 2의 정수이다)으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자가 C(이때, 하나 또는 두 개의 C 원자는 카보닐기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다)인 3 내지 8개 고리 원자의 포화된 환식 라디칼을 의미한다. 헤테로사이클릴 고리는 선택적으로 카복시 또는 에스테르기로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 두 개의 치환기로 선택적으로 치환된 저급 알킬, 할로알킬, 시아노알킬, 할로, 니트로, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬 아미노, 아르알킬, 헤테로아르알킬 및 -COR(여기서, R은 알킬이다)로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있다. 보다 구체적으로는, 헤테로사이클릴이라는 용어는 테트라하이드로피라닐, 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란, 피페리디노, N-메틸피페리딘-3-일, 피페라지노, N-메틸피롤리딘-3-일, 피롤리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티오모르폴리노-1-옥사이드, 티오모르폴리노-1,1-디옥사이드, 4-에틸옥시카보닐피페라지노, 3-옥소피페라지노, 2-이미다졸리돈, 2-피롤리디논, 2-옥소호모피페라지노, 테트라하이드로피리미딘-2-온 및 이들의 유도체를 포함하나 이로 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 헤테로사이클기는 할로, 저급 알킬, 카복시 또는 에스테르로 선택적으로 치환된 저급 알킬, 하이드록시 또는 모노 또는 디알킬아미노로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 두 개의 치환기로 치환된다.

"헤테로사이클로아미노"는 하나 이상의 고리 원자가 질소이고 선택적으로 하나 또는 두 개의 추가의 고리 원자가 N, O 또는 S(O)_n(여기서, n은 0 내지 2의 정수이다)으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자가 C(이때, 하나 또는 두 개의 C 원자는 카보닐기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다)인 3 내지 8개 고리 원자의 포화된 환식 라디칼을 의미한다. 헤테로사이클로아미노 고리는 선택적으로 카복시 또는 에스테르기로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 두 개의 치환기로 선택적으로 치환된 저급 알킬, 할로알킬, 시아노알킬, 할로, 니트로, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 아미노, 모노알킬아미노, 디알킬 아미노, 아르알킬, 헤테로아르알킬 및 -COR(여기서, R은 알킬이다)로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있다. 보다 구체적으로는, 헤테로사이클로아미노라는 용어는 피페리딘-1-일, 피페라진-1-일, 피롤리딘-1-일, 모르폴린-4-일, 티오모르폴린-4-일, 티오모르폴리노-1-옥사이드, 티오모르폴리노-1,1-디옥사이드, 4-에틸옥시카보닐피페라진-1-일, 3-옥소피페라진-1-일, 2-이미다졸리돈-1-일, 2-피롤리디논-1-일, 2-옥소호모피페라지노, 테트라하이드로피리미딘-2-온 및 이들의 유도체를 포함하나 이로 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 헤테로사이클기는 할로, 저급 알킬, 카복시 또는 에스테르로 선택적으로 치환된 저급 알킬, 하이드록시 또는 모노 또는 디알킬아미노로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 두 개의 치환기로 치환된다. 헤테로사이클로아미노기는 상기 정의된 헤테로사이클기의 하위집합(subset)이다.

"하이드록시"는 -OH기를 지칭한다.

"알콕시"는 -O-(알킬) 및 -O-(치환되지 않은 사이클로알킬)기를 둘다 지칭한다. 대표적인 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 사이클로프로필옥시, 사이클로부틸옥시, 사이클로펜틸옥시, 사이클로헥실옥시 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.

"할로알콕시"는 -O-(할로알킬)기를 지칭한다. 대표적인 예는 트리플루오로메톡시, 트리브로모메톡시 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.

"아릴옥시"는 본원에 정의된 바와 같은 -O-아릴 및 -O-헤테로아릴기를 둘다 지칭한다. 대표적인 예는 페녹시, 피리디닐옥시, 푸라닐옥시, 티에닐옥시, 피리미디닐옥시, 피라지닐옥시 등 및 이들의 유도체를 포함하나 이로 한정되지는 않는다.

"머캅토"는 -SH기를 지칭한다.

"알킬티오"는 -S-(알킬) 및 -S(치환되지 않은 사이클로알킬)기를 둘다 지칭한다. 대표적인 예는 메틸티오, 에틸티오, 프로필티오, 부틸티오, 사이클로프로필티오, 사이클로부틸티오, 사이클로펜틸티오, 사이클로헥실티오 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.

"아릴티오"는 본원에 정의된 바와 같은 -S-아릴 및 -S-헤테로아릴기를 둘다 지칭한다. 대표적인 예는 페닐티오, 피리디닐티오, 푸라닐티오, 티에닐티오, 피리미디닐티오 등 및 이들의 유도체를 포함하나 이로 한정되지는 않는다.

"아실"은 -C(O)-R"기를 지칭하며, 여기서 R"은 수소, 저급 알킬, 트리할로메틸, 치환되지 않은 사이클로알킬; 저급 알킬, 트리할로메틸, 저급 알콕시, 할로 및 -NR⁹R¹⁰기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 치환기로 선택적으로 치환된 아릴; 저급 알킬, 트리할로알킬, 저급 알콕시, 할로 및 -NR⁹R¹⁰기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 치환기로 선택적으로 치환된 헤테로아릴(고리 탄소를 통해 결합됨); 및 저급 알킬, 트리할로알킬, 저급 알콕시, 할로 및 -NR⁹R¹⁰기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 치환기로 선택적으로 치환된 헤테로알리사이클릭(고리 탄소를 통해 결합됨)으로 이루어진 군에서 선택된다. 대표적인 아실기는 아세틸, 트리플루오로아세틸, 벤조일 등을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.

"알데하이드"는 R"이 수소인 아실기를 지칭한다.

"티오아실"은 -C(S)-R"기(여기서, R"은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"에스테르"는 -C(O)O-R"기(여기서, R"은 수소일 수 없는 것을 제외하고는 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"아세틸"기는 -C(O)CH₃기를 지칭한다.

"할로"기는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 불소 또는 염소를 지칭한다.

"트리할로메틸"기는 -CX₃기(여기서, X는 상기 정의된 바와 같은 할로이다)를 지칭한다.

"트리할로메탄설포닐"기는 X₃CS(=O)₂-기(여기서, X는 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"시아노"는 -C≡N기를 지칭한다.

"S-설폰아미도"는 -S(O)₂NR⁹R¹⁰기(여기서, R⁹및 R¹⁰은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"N-설폰아미도"는 -NR⁹S(O)₂R¹⁰기(여기서, R⁹및 R¹⁰은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"O-카바밀"기는 -OC(O)NR¹²R¹³기(여기서, R¹²및 R¹³은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"N-카바밀"은 R⁹OC(O)NR¹⁰-기(여기서, R⁹및 R¹⁰은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"O-티오카바밀"은 -OC(S)NR¹²R¹³기(여기서, R¹²및 R¹³은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"N-티오카바밀"은 R⁹OC(S)NR¹⁰-기(여기서, R⁹및 R¹⁰은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"아미노"는 -NR⁹R¹⁰기(여기서, R⁹및 R¹⁰은 둘다 수소이다)를 지칭한다.

"C-아미도"는 -C(O)NR⁹R¹⁰기(여기서, R⁹및 R¹⁰은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"N-아미도"는 R⁹C(O)NR¹⁰-기(여기서, R⁹및 R¹⁰은 상기 정의된 바와 같다)를 지칭한다.

"니트로"는 -NO₂기를 지칭한다.

"할로알킬"은 하나 이상의 동일하거나 상이한 할로 원자로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬, 예를 들어 -CH₂Cl, -CF₃, -CH₂CF₃, -CH₂CCl₃등을 의미한다.

"하이드록시알킬"은 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬, 예를 들어 하이드록시메틸, 1 또는 2-하이드록시에틸, 1,2-, 1,3- 또는 2,3-디하이드록시프로필 등을 의미한다.

"아르알킬"은 상기 정의된 바와 같은 아릴기로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬, 예를 들어 -CH₂페닐, -(CH₂)₂페닐, -(CH₂)₃페닐, CH₃CH(CH₃)CH₂페닐 등 및 이들의 유도체를 의미한다.

"헤테로아르알킬"기는 헤테로아릴기로 치환된 상기 정의된 바와 같은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬, -CH₂피리디닐, -(CH₂)₂피리미디닐, -(CH₂)₃이미다졸릴 등 및 이들의 유도체를 의미한다.

"모노알킬아미노"는 라디칼 -NHR(여기서, R은 상기 정의된 바와 같은 알킬 또는 치환되지 않은 사이클로알킬기이다), 예를 들어 메틸아미노, (1-메틸에틸)아미노, 사이클로헥실아미노 등을 의미한다.

"디알킬아미노"는 라디칼 -NRR(여기서, R은 각각 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 알킬 또는 치환되지 않은 사이클로알킬기이다), 예를 들어 디메틸아미노, 디에틸아미노, (1-메틸에틸)-에틸아미노, 사이클로헥실메틸아미노, 사이클로펜틸메틸아미노 등을 의미한다.

"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기술되는 사건 또는 상황이 일어날 수는 있지만 반드시 일어날 필요는 없으며, 상기 사건 또는 상황이 일어나는 예 및 일어나지 않는 예를 포함함을 의미한다. 예를 들어, "알킬기로 선택적으로 치환된 헤테로사이클기"는 알킬기가 존재할 수 있지만 반드시 존재할 필요는 없음을 의미하고, 헤테로사이클기가 알킬기로 치환되는 상태 및 헤테로사이클로기가 알킬기로 치환되지 않는 상태를 포함한다.

"2-인돌리논", "인돌린-2-온" 및 "2-옥신돌"이라는 용어는 하기 화학식의 분자를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

"피롤"이라는 용어는 하기 화학식의 분자를 지칭한다.

동일한 분자식을 가지나 원자 결합 특성 또는 순서 또는 공간에서의 원자 배열이 상이한 화합물을 "이성질체"라고 한다. 공간에서의 원자 배열이 상이한 이성질체를 "입체이성질체"라고 한다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체를 "부분입체이성질체"라고 하고, 서로 포개지지 않는 거울상 이미지인 것을 "거울상이성질체"라고 한다. 화합물이 비대칭 중심을 갖는 경우, 예를 들어 화합물이 4개의 상이한 기에 결합된 경우, 한쌍의 거울상이성질체가 가능하다. 거울상이성질체는 비대칭 중심의 절대적 배치에 의해 특징지워지고, 칸 및 프렐로그(Cahn and Prelog)의 R- 및 S-배열 규칙에 의해 또는 분자가 편광 평면을 회전하는 방식에 의해 기술되며 시계방향 또는 시계반대방향(즉, 각각 (+) 또는 (-)-이성질체)으로서 명시된다. 키랄성 화합물은 개별적인 거울상이성질체 또는 이들의 혼합물로서 존재할 수 있다. 거울상이성질체를 동일한 비율로 함유하는 혼합물을 "라세믹 혼합물"이라 한다.

본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 보유할 수 있으며, 따라서 이러한 화합물은 개별적인 (R)- 또는 (S)-입체이성질체 또는 이들의 혼합물로서 생성될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물에서 -CONHCHR³-CR⁴(OH)CR⁵Z에서 하이드록시기를 가지는 탄소 원자는 비대칭 중심이며, 따라서 화학식 I의 화합물은 (R)- 또는 (S)-입체이성질체로서 존재할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 특정 화합물의 기재 또는 명명은 개별적인 거울상이성질체 및 혼합물, 라세믹 또는 그 외의 것을 모두 포함시키고자 한다. 입체화학의 결정및 입체이성질체의 분리를 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(참조: 문헌[Chapter 4 of "Advanced Organic Chemistry", 4th edition J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992]).

화학식 I의 화합물은 토토머화 및 구조 이성질화 현상을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 화합물은 2-인돌리논 잔기를 피롤 잔기에 연결시키는 이중 결합에 대해 E 또는 Z 배치를 채택할 수 있거나, E 및 Z의 혼합물일 수 있다. 본 발명은 RTK, CTK 및/또는 STK 활성을 조절하는 능력을 가지며 임의의 하나의 토토머 또는 구조 이성질체 형태로 제한되지 않는 임의의 토토머 또는 구조 이성질체 형태 및 이의 혼합을 포함한다.

"약학 조성물"은 본원에 기술되는 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적으로/약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물, 및 생리학적으로/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제와 같은 기타 화학적 성분과의 혼합물을 지칭한다. 약학 조성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.

화학식 I의 화합물은 전구약물로서 작용할 수도 있다. "전구약물"은 생체내에서 모(parent) 약물로 전환되는 제제를 지칭한다. 전구약물은 종종 일부 상황에서 모 약물보다 투여하기가 용이할 수 있으므로 유용하다. 예를 들어, 전구약물은 경구 투여에 의해 생체이용될 수 있는 반면, 모 약물은 그렇지 못하다. 전구약물은 또한 모 약물에 비해 약학 조성물에서 개선된 용해도를 갖는다. 전구약물의 예로는 수 용해도가 이동성에 불리한 경우 세포막을 가로지르는 전달이 용이하도록 에스테르("전구약물")로서 투여되나 이후 수 용해도가 이로운 경우 세포 내측에서카복실산, 즉 활성체로 1회 대사적으로 가수분해되는 본 발명의 화합물이 있으나 이로 한정되지는 않는다.

전구약물의 추가의 예는 말단 아미노기를 통해 본 발명의 화합물의 카복시기에 결합된 짧은 폴리펩티드, 예를 들어 2 내지 10 아미노산 폴리펩티드일 수 있으나 이로써 제한되지 않으며, 여기서 상기 폴리펩티드는 생체내에서 가수분해 또는 대사되어 활성 분자를 방출시킨다. 화학식 I의 화합물의 전구약물은 본 발명의 범주내에 속한다.

또한, 화학식 I의 화합물은 인간과 같은 유기체의 신체에서 효소에 의해 대사되어 단백질 키나제의 활성을 조절할 수 있는 대사물을 생성한다. 이러한 대사물은 본 발명의 범주내에 속한다.

본원에서 사용되는 "생리학적으로/약학적으로 허용가능한 담체"는 유기체에 상당한 자극을 유발시키지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다.

"약학적으로 허용가능한 부형제"는 화합물의 투여를 보다 용이하게 하도록 약학 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당 및 전분류, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나 이로 한정되지는 않는다.

본원에 사용되는 "약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 모 화합물의 생물학적 효과 및 특성을 보유하는 염을 지칭한다. 이러한 염은 하기를 포함한다:

(1) 모 화합물의 유리 염기와 염산, 브롬화수소산, 질산, 인산, 황산 및 과염소산 등과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말릭산, 말레산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산 등과 같은 유기산, 바람직하게는 염산 또는 (L)-말릭산의 반응에 의해 수득된 산 부가 염; 또는

(2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리토금속 이온 또는 알루미늄 이온에 의해 치환되거나, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등과 같은 유기 염기로 배위될 때 형성되는 염.

"PK"는 수용체 단백질 티로신 키나제(RTK), 비수용체 또는 "세포" 티로신 키나제(CTK) 및 세린-트레오닌 키나제(STK)를 지칭한다.

"방법"은 화학, 약학, 생물학, 생화학 및 의학 분야에 공지되어 있거나, 상기 분야의 숙련자들에 의해 공지된 수단, 방식, 기술 및 과정으로부터 용이하게 개발되는 방식, 수단, 기술 및 과정을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 주어진 임무를 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 과정을 지칭한다.

"조절" 또는 "조절하는"이란 RTK, CTK 및 STK의 촉매 활성의 변화를 지칭한다. 특히, "조절하는"이란 RTK, CTK 또는 STK가 노출되는 화합물 또는 염의 농도에 따라 RTK, CTK 및 STK의 촉매 활성의 활성화, 바람직하게는 RTK, CTK 및 STK의 촉매 활성의 활성화 또는 억제, 더욱 바람직하게는 RTK, CTK 및 STK의 촉매 활성의 억제를 지칭한다.

"촉매 활성"은 RTK 및/또는 CTK의 직접 또는 간접적인 영향하에서 티로신의포스포릴화 또는 STK의 직접 또는 간접적인 영향하에서 세린 및 트레오닌의 포스포릴화를 지칭한다.

"접촉"은 화합물이 직접적으로, 즉 키나제 자체와의 상호작용에 의해, 또는 간접적으로, 즉 키나제의 촉매 활성이 의존하는 다른 분자와의 상호작용에 의해 PK의 촉매 활성에 영향을 줄 수 있는 방식으로 본 발명의 화합물 및 표적 PK를 함께 가져오는 것을 지칭한다. 이러한 "접촉"은 "생체외", 즉 시험관내, 페트리 접시 등에서 성취될 수 있다. 시험관내에서, 접촉은 단지 관심있는 화합물 및 PK를 포함할 수 있거나 전체 세포를 포함할 수 있다. 세포는 또한 세포 배양 접시에서 유지 또는 성장되고 그 환경에서 화합물과 접촉될 수 있다. 여기서, PK 연관된 질병에 영향을 주는 특정 화합물의 능력, 즉 하기 정의되는 화합물의 IC₅₀은 보다 복잡한 살아있는 유기체와 함께 생체내에서 화합물의 사용이 시도되기 전에 결정될 수 있다. 유기체 외부 세포의 경우, 직접적인 세포 현미주사 및 다수의 막 횡단 담체 기술을 포함하나 이로써 제한되지 않는 PK와 화합물을 접촉시키기 위한 다수의 방법이 존재하며 이는 당해 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다.

"생체외"는 예를 들어 시험관내 또는 배지(이로써 제한되지 않음)와 같은 인공적인 환경에서 수행되는 과정을 지칭한다.

"생체내"는 마우스, 래트 또는 래빗(이로써 제한되지 않음)과 같은 살아있는 유기체내에서 수행되는 과정을 지칭한다.

"PK 연관된 질병", "PK 유도된 질병" 및 "비정상적인 PK 활성"은 모두, 특정PK가 RTK, CTK 또는 STK일 수 있는 경우, 부적절한, 즉 보다 낮은, 또는 더욱 통상적으로는 과도한 PK 촉매 활성을 특징으로 하는 상태를 지칭한다. 부적절한 촉매 활성은 하기 (1) 내지 (3)의 결과로서 발생할 수 있다: (1) 정상적으로 PK를 발현하지 않는 세포에서 PK 발현, (2) 원치않는 세포 증식, 분화 및/또는 성장을 유발시키는 증가된 PK 발현, 또는 (3) 원치않는 세포 증식, 분화 및/또는 성장의 저하를 유발시키는 감소된 PK 발현. PK의 과도한 활성은 특정 PK의 유전자 암호화의 증폭, 또는 세포 증식, 분화 및/또는 성장 장애와 관련될 수 있는 PK 활성 수준의 생성(즉, PK 수준이 증가할수록 세포 질환의 하나 이상의 증상의 심각성이 증가된다)을 지칭한다. 물론, 보다 낮은 활성은 그 반대로서, PK 활성 수준이 감소할수록 세포 질병의 하나 이상의 증상의 심각성이 증가한다.

"치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 PK 매개된 세포 질환 및/또는 그의 부수적인 증상을 경감시키거나 없애는 방법을 지칭한다. 특히 암에 대해, 상기 용어는 단순히 암으로 영향을 받는 개개인의 평균 수명을 증가시키거나 상기 질환의 하나 이상의 증상을 감소시킴을 의미한다.

"유기체"는 하나 이상의 세포로 이루어진 임의의 살아있는 개체를 지칭한다. 살아있는 유기체는 예를 들어 단일 진핵 세포만큼 단순한 것 또는 인간을 포함하는 포유류와 같이 복잡한 것일 수 있다.

"치료 효과량"은 치료할 질병의 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있는 투여되는 화합물의 양을 지칭한다. 암의 치료를 참조하면, 치료 효과량은 하기 (1) 내지 (4)의 효과를 갖는 양을 지칭한다:

(1) 종양의 크기를 감소시키는 것;

(2) 종양 전이를 억제시키는 것(즉, 어느 정도 늦추게 하는 것, 바람직하게는 정지시키는 것);

(3) 종양 성장을 어느 정도 억제시키는 것(즉, 어느 정도 늦추게 하는 것, 바람직하게는 정지시키는 것); 및/또는

(4) 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시키는 것(또는 바람직하게는 없애는 것).

"모니터링"은 특정 PK를 발현하는 세포와 화합물을 접촉시키는 효과를 관찰하거나 검출하는 것을 의미한다. 관찰되거나 검출된 효과는 세포 표현형의 변화, PK의 촉매 활성의 변화 또는 PK와 자연적인 결합 파트너의 상호작용의 변화일 수 있다. 이러한 효과를 관찰하거나 검출하는 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

전술한 효과는 세포 표현형의 변화 또는 변화 부재, 상기 단백질 키나제의 촉매 활성의 변화 또는 변화 부재, 또는 본 발명의 최종 양태에서 자연적인 결합 파트너와 상기 단백질 키나제의 상호작용의 변화 또는 변화 부재 중에서 선택된다.

"세포 표현형"은 세포 또는 조직의 외관 또는 세포 또는 조직의 생물학적 기능을 지칭한다. 세포 표현형의 예로는 세포 크기, 세포 성장, 세포 증식, 세포 분화, 세포 생존, 사멸 및 양분 섭취 및 사용이 있으나 이로 한정되지는 않는다. 이러한 표현형 특성은 당해 분야에 널리 공지된 기술에 의해 측정가능하다.

"자연적인 결합 파트너"는 세포에서 특정 PK에 결합하는 폴리펩티드를 지칭한다. 자연적인 결합 파트너는 PK 매개된 단일 형질도입(transduction) 과정에서 신호를 증폭시키는 역할을 할 수 있다. PK와 자연적인 결합 파트너의 상호작용에서의 변화는 그 자체로 PK/자연적인 결합 파트너 복합물이 증가되거나 감소된 농도로서 나타나며, 그 결과 신호 형질도입을 매개하는 PK의 능력의 관찰가능한 변화로 나타날 수 있다.

본 발명의 대표적인 화합물을 하기 표 1a에 제시한다.

본 발명의 다른 대표적인 화합물을 하기 표 1b에 제시한다.

본 발명의 다른 대표적인 화합물을 하기 표 1c에 제시한다.

상기 표 1a 내지 1c에 나타낸 화합물들은 단지 예시일 뿐이며, 본 발명의 범주를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.

바람직한 양태

발명의 요약에서 가장 광범위한 정의가 제시되었지만, 하기 제시되는 화학식I의 특정 화합물이 바람직하다.

1. 화학식 I의 화합물의 바람직한 그룹은 R⁶이 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸, 또는 n-부틸, 더욱 바람직하게는 수소 또는 메틸이고; R⁷이 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 -C(O)R¹⁷(여기서 R¹⁷은 하이드록시, 알킬, 사이클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴임)로 이루어진 군에서 선택되고, 더욱 바람직하게는 R⁷은 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-, 이소 또는 tert-부틸, 페닐, 벤조일, 아세틸 또는 카복시이고, 더욱더 바람직하게는 메틸, 수소 또는 페닐인 것이다.

2. 화학식 I의 화합물의 다른 바람직한 그룹은 R⁶이 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸, 또는 n-부틸, 더욱 바람직하게는 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 메틸이고; R⁷이 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 -C(O)R¹⁷(여기서 R¹⁷은 하이드록시, 알킬 또는 아릴임)로 이루어진 군에서 선택되고, R⁷은 더욱 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-, 이소 또는 tert-부틸, 페닐, 벤조일, 아세틸 또는 카복시이고, 더욱더 바람직하게는 메틸, 수소 또는 페닐이고; R³, R⁴및 R⁵가 수소이고; Z가 아릴인 것이다.

3. 화학식 I의 화합물의 다른 바람직한 그룹은 R⁶이 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸, 또는 n-부틸, 더욱 바람직하게는 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 메틸이고; R⁷이 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 -C(O)R¹⁷(여기서 R¹⁷은 하이드록시, 알킬 또는 아릴임)로 이루어진 군에서 선택되고, R⁷은 더욱 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-, 이소 또는 tert-부틸, 페닐, 벤조일, 아세틸 또는 카복시이고, 더욱더 바람직하게는 메틸, 수소 또는 페닐, 가장 바람직하게는 메틸이고; R³, R⁴및 R⁵가 수소이고; Z가 헤테로아릴, 바람직하게는 트리아지닐, 테트라졸릴, 이미다졸릴, 피리디닐, 피리미디닐 또는 피라지닐인 것이다.

4. 화학식 I의 화합물의 다른 바람직한 그룹은 R⁶이 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸, 또는 n-부틸, 더욱 바람직하게는 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 메틸이고; R⁷이 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 -C(O)R¹⁷(여기서 R¹⁷은 하이드록시, 알킬 또는 아릴임)로 이루어진 군에서 선택되고, R⁷은 더욱 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-, 이소 또는 tert-부틸, 페닐, 벤조일, 아세틸 또는 카복시이고, 더욱더 바람직하게는 메틸, 수소 또는 페닐이고; R³, R⁴및 R⁵가 수소이고; Z가 헤테로환인 것이다.

5. 화학식 I의 화합물의 다른 바람직한 그룹은 R⁶이 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸, 또는 n-부틸, 더욱 바람직하게는 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 메틸이고; R⁷이 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 -C(O)R¹⁷(여기서 R¹⁷은 하이드록시, 알킬 또는 아릴임)로 이루어진 군에서 선택되고, R⁷은 더욱 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-, 이소 또는 tert-부틸, 페닐, 벤조일, 아세틸 또는 카복시이고, 더욱더 바람직하게는 메틸, 수소 또는 페닐이고, 가장 바람직하게는 메틸이고; R³, R⁴및 R⁵가 수소이고; Z가 -NR¹⁵R¹⁶(여기서, R¹⁵및 R¹⁶은 조합되어 헤테로사이클아미노를 형성함), 바람직하게는 피페리딘-1-일, N-메틸피페리딘-1-일, 피페라진-1-일, N-메틸피롤리딘-1-일, 피롤리딘-1-일, 모르폴린-4-일, 티오모르폴린-4-일, 티오모르폴리노-1-옥사이드, 티오모르폴리노-1,1-디옥사이드, 4-에틸옥시카보닐메틸피페라진-1-일, 3-옥소피페라진-1-일, 이미다졸리딘-1-일-2-온, 피롤리딘-1-일-2-온, 2-옥소호모피페라진-1-일, 또는 테트라하이드로피리미딘-1-일-2-온, 더욱 바람직하게는 모르폴린-4-일인 것이다.

6. 화학식 I의 화합물의 다른 바람직한 그룹은 R⁶이 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고, 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸, 또는 n-부틸, 더욱 바람직하게는 수소 또는 메틸이고; R⁷이 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 및 -C(O)R¹⁷(여기서 R¹⁷은 하이드록시, 알킬 또는 아릴임)로 이루어진 군에서 선택되고, R⁷은 더욱 바람직하게는 수소, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-, 이소 또는 tert-부틸, 페닐, 벤조일, 아세틸 또는 카복시이고, 더욱더 바람직하게는 메틸, 수소 또는 페닐이고; R³, R⁴및 R⁵가 수소이고; Z가 -NR¹⁵R¹⁶(여기서, R¹⁵및 R¹⁶은 알킬임), 바람직하게는 디에틸아미노, 디메틸아미노, 또는 에틸아미노인 것이다.

7. 상기 바람직한 그룹 및 더욱 바람직한 그룹 (1) 내지 (6) 중에서, 화합물의 더욱더 바람직한 그룹은 R¹이 수소, 알킬, -C(O)NR¹²R¹³, 미치환된 사이클로알킬, 바람직하게는 수소, 3,4-디메톡시페닐아미노카보닐, 4-메톡시-3-클로로페닐-아미노카보닐, 더욱더 바람직하게는 수소 또는 메틸, 가장 바람직하게는 수소이고; R²가 수소, 시아노, 할로, 저급 알콕시, 또는 -S(O)₂NR⁹R¹⁰(여기서 R⁹는 수소이고 R¹⁰은 수소, 아릴 또는 알킬임)이고 옥신돌 고리의 5-부위에 있고, 바람직하게는 R²가 수소, 클로로, 브로모, 플루오로, 메톡시, 에톡시, 페닐, 디메틸아미노설포닐, 3-클로로페닐-아미노설포닐, 카복시, 메톡시, 아미노설포닐, 메틸아미노설포닐, 페닐아미노설포닐, 피리딘-3-일-아미노설포닐, 디메틸아미노설포닐, 이소프로필아미노-설포닐이고, 더욱 바람직하게는 수소, 플루오로 또는 브로모이고, 가장 바람직하게는 R²가플루오로이고 인돌리논 고리의 5-부위에 위치하는 것이다.

상기 바람직한 화합물, 더욱 바람직한 화합물 및 더욱더 바람직한 화합물에서 -CONHCH(R³)^*CR⁴(OH)CR⁵Z 쇄에서 하이드록시 그룹을 지니고^*에 의해 지시되는 탄소 원자의 입체화학은RS,R또는S이고, 더욱 바람직하게는S이다.

용도

촉매 활성이 본 발명의 화합물에 의해 조절되는 PK는 수용체 티로신 키나제(RTK) 및 세포 티로신 키나제(CTK)의 두 가지 유형이 있는 단백질 티로신 키나제, 및 세린-트레오닌 키나제(STK)를 포함한다. RTK 매개된 신호 형질도입은 특정 성장 인자(리간드)와의 세포외 상호작용에 의해 개시되고, 수용체 이량체화, 고유 단백질 티로신 키나제 활성의 일시적 자극 및 포스포릴화가 후속된다. 이로써 세포내 신호 형질도입 분자를 위한 결합 부위가 생성되고, 적절한 세포 반응(예컨대, 세포 분열, 세포외 미세환경에 대한 대사 효과 등)을 용이하게 하는 광범위한 세포질 신호 분자를 갖는 착물이 형성되게 한다. 문헌[Schlessinger and Ullrich,Neuron9:303-391, 1992] 참조.

성장 인자 수용체 상의 티로신 포스포릴화 부위가 신호 분자의 SH2(src 상동) 도메인을 위한 고친화성 결합 부위로서 기능한다는 것이 밝혀졌다. 문헌[Fantl et al., 1992,Cell69:413-423, Songyang et al., 1994,Mol. Cell. Biol.14:2777-2785), Songyang et al., 1993,Cell72:767-778, and Koch et al., 1991,Science252:668-678] 참조. RTK와 관련된 몇가지 세포내 기질 단백질이확인되었다. 이들은 2가지 주 그룹으로 분류될 수 있다: (1) 촉매 도메인을 갖는 기질 및 (2) 상기 도메인은 없으나 어댑터로서 기능하고 촉매적인 활성 분자와 관련된 기질. 문헌[Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778] 참조. 수용체와 그의 기질의 SH2 도메인 간의 상호작용의 특이성은 포스포릴화된 티로신 잔기를 즉시 둘러싸는 아미노산 잔기에 의해 결정된다. SH2 도메인과, 특정 수용체상의 포스포티로신 잔기를 둘러싸는 아미노산 서열 간의 결합 친화도의 차이는 그들의 기질 포스포릴화 프로필에서 관찰되는 차이와 일치한다. 문헌[Songyang et al., 1993,Cell72:767-778] 참조. 상기 관찰은 각 RTK의 기능이 그의 발현 패턴 및 리간드 유용성 뿐만 아니라, 특정 수용체에 의해 활성화되는 하류 신호 형질도입 경로의 배열(array)에 의해 결정됨을 시사한다. 따라서, 포스포릴화는 특정 성장 인자 수용체 뿐만 아니라 분화 인자 수용체에 의해 보충되는 신호 경로의 선택성을 결정하는 중요한 조절 단계를 제공한다.

STK는 주로 시토졸성으로, 종종 PTK 사건에 대한 하부-라인 반응으로서 세포의 내부 생화학에 영향을 미친다. STK는 DNA 합성 및 후속 간접분열을 개시시킴으로써 세포 증식을 유도하는 신호 과정에 연관되어 왔다.

따라서, PK 신호 형질도입은 다른 반응들 중에서도 세포 증식, 분화, 성장 및 대사를 유발한다. 비정상 세포 증식은 암종, 육종, 교모세포종 및 혈관종과 같은 종양의 발생, 백혈병, 건선, 동맥경화증, 관절염 및 당뇨병성 망막병증과 같은 질병 및 비제어된 혈관형성(angiogenesis) 및/또는 혈관생성(vasculogenesis)과 관련된 그밖의 질병을 포함하는 광범위한 질병 및 질환을 초래한다.

본 발명을 실시하기 위해 본 발명의 화합물의 PK 억제 기작을 정밀하게 이해할 필요는 없다. 그러나, 임의의 특정한 기작 또는 이론에 얽메이고자 하는 것은 아니지만, 상기 화합물이 PK의 촉매 영역에서 아미노산과 상호작용한다고 생각된다. PK는 전형적으로 이엽 구조를 가지며, 여기서 ATP는 아미노산이 PK들 사이에 보존되는 영역의 두 열편(lobe) 사이의 오목한 자리(cleft)에 결합되는 것으로 보인다. PK의 억제제는 상기 ATP가 PK에 결합되는 동일한 일반 영역에서 비공유성 상호작용, 예컨대 수소 결합, 반 데르 발스력 및 이온 상호작용에 의해 결합되는 것으로 생각된다. 더욱 특히, 본 발명의 화합물의 2-인돌리논 성분이 ATP의 아데닌 고리에 의해 정규적으로 점유된 일반적 공간에 결합되는 것으로 생각된다. 이후 특정 PK에 대한 특정 분자의 특이성은 2-인돌리논 코어 상의 다양한 치환체와 특정 PK에 특정한 아미노산 도메인 간의 추가의 상호작용의 결과로서 나타날 수 있다. 따라서, 상이한 인돌리논 치환체는 특정 PK에 대한 우선적인 결합에 기여할 수 있다. 상이한 ATP(또는 다른 누클레오티드) 결합 부위에서 활성인 화합물을 선택하는 능력은 본 발명의 화합물이 이러한 부위를 갖는 임의의 단백질을 표적화하는데 유용하게 한다. 본원에 개시된 화합물은 따라서 상기 단백질에 대한 생체외 검정에서 유용성을 가질 뿐만 아니라 상기 단백질과의 상호작용을 통한 생체내 치료 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 화합물은 암종, 카포시 육종을 포함하는 육종, 적모구종, 교모세포종, 수막종, 성상세포종, 흑색종 및 근모세포종을 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 종류의 충실성 종양의 치료에 대한 치료적 접근 방법을 제공한다. 백혈병을 포함하는 비충실성 종양 암의 치료 또는 예방이 또한 본 발명에 의해 고려된다. 징후는 뇌암, 방광암, 난소암, 위암, 췌장암, 결장암, 혈액암, 폐암 및 골암을 포함하나 이들로 한정되지는 않는다.

본원에 기술된 화합물이 예방, 치료 및 연구하는데 유용할 수 있는 부적절한 PK 활성과 관련된 질병 유형의 비제한적인 추가의 예는 세포 증식 장애, 섬유성(fibrotic) 장애 및 대사 장애이다.

본 발명에 의해 예방, 치료 또는 더욱 연구될 수 있는 세포 증식 장애는 암, 혈관 증식 장애 및 혈관간 세포 증식 장애를 포함한다.

혈관 증식 장애는 비정상 혈관생성(혈관 형성) 및 혈관형성(혈관의 확대)에 관련된 장애를 지칭한다. 혈관생성 및 혈관형성이 배아 발육, 황체 형성, 상처 치유 및 조직 재생과 같은 다양한 정상 생리적 과정에서 중요한 역할을 하지만, 이들은 종양의 생존을 유지시키는데 필요한 새로운 모세혈관의 형성을 초래하여 종양 발육의 중추적인 역할을 한다. 혈관 증식 장애의 다른 예는 새로운 모세 혈관이 관절을 침범하여 연골을 파괴하는 관절염, 및 망막의 새로운 모세혈관이 유리질을 침범하여 출혈되고 맹목을 유발하는 당뇨성 망막병증과 같은 안 질병을 포함한다.

두개의 구조적으로 관련된 RTK가 TEGF에 높은 친화성으로 결합되는 것으로 확인되었다: fms-유사 티로신 1(flt-1) 수용체(Shibuya et al., 1990,Oncogene, 5:519-524; DeVries et al., 1992,Science, 255:989-991) 및 KDR/FLK-1 수용체, 일명 VEGF-R2. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 생체외 내피 세포 성장 촉진 활성을 갖는 내피 세포 특정 미토겐인 것으로 보고되었다. 문헌[Ferrara & Henzel, 1989,Biochein. Biophys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et al., 1990,J. Biol. Chem., 265:19461-19566] 참조. 미국 특허출원 제08/193,829호, 제08/038,596호 및 제07/975,750호에 제시된 정보는 VEGF가 내피 세포 증식의 원인이 될 뿐만 아니라, 정상 및 병적 혈관형성의 주요 조절자라는 것을 강력하게 시사한다. 일반적으로 문헌[Klagsburn & Soker, 1993,Current Biology, 3(10) 699-702; Houck, et al., 1992,J. Biol. Chem., 267:26031-26037]을 참조한다.

정상 혈관생성 및 혈관형성은 배아 발육, 상처 치유, 조직 재생, 및 배란중 황체내 난포 발육 및 임신후 태반 성장과 같은 여성 생식 과정 등의 다양한 생리학적 과정에 중요한 역할을 한다. 문헌[Folkman & Shing, 1992,J. Biological Chem., 267(16):10931-34] 참조. 비제어된 혈관생성 및/또는 혈관형성은 당뇨병과 같은 질병뿐만 아니라 성장을 위해 혈관화에 의존하는 악성 충실성 종양과 관련되어 왔다. 문헌[Klagsburn & Soker, 1993,Current Biology, 3(10):699-702; Folkham, 1991,J. Natl. Cancer Inst., 82:46; Weidner, et al., 1991,New Engl. J. Med., 324:1-5] 참조.

혈관형성 및 혈관생성 동안의 내피 세포 증식 및 이동에서의 VEGF의 추측된 역할은 상기 과정에서 KDR/FLK-1 수용체에 대한 중요한 역할을 지시한다. 당뇨병(Folkman, 198, inXI ^th Congress of Thrombosis and Haemostasis(Verstraeta, et al., eds.), pp. 583-596, Leuven University Press, Leuven) 및 관절염뿐만 아니라 악성 종양 성장과 같은 질병은 비제어된 혈관형성에기인할 수 있다. 예컨대 문헌[Folkman, 1971,N. Engl. J. Med., 285:1182-1186]을 참조한다. VEGF가 특정하게 결합하는 수용체는 혈관생성 및/또는 혈관형성, 및 상기 과정에 기인한 비정상 세포 성장을 포함하는 다양한 심각한 질병의 조절 및 조정을 위한 중요하고 강력한 치료 표적이다. 문헌[Plowman, et al., 1994,DN&P, 7(6):334-339] 참조. 더욱 특히, KDR/FLK-1 수용체의 신혈관형성에서의 매우 특정한 역할은 암 및 혈관의 비제어된 형성을 포함하는 다른 질병의 치료를 위한 치료적 접근 방법에 대한 선택적 표적이 되도록 한다.

따라서, 본 발명은 혈관형성 및/또는 혈관생성을 억제 또는 촉진하기 위한 KDR/FLK-1 수용체 신호 형질도입을 포함하는 티로신 키나제 신호 형질도입을 조절 및/또는 조정할 수 있는 화합물, 즉 VEGF와 같은 리간드에 의해 활성화될 때 KDR/FLK-1에 의해 형질도입된 신호를 억제, 방지, 또는 방해하는 화합물을 제공한다. 본 발명의 화합물이 티로신 키나제 신호 형질도입 경로를 따른 수용체 또는 다른 성분에 작용하는 것으로 생각되지만, 이들은 또한 비제어된 혈관형성에 기인한 종양 세포에 직접 작용할 수 있다.

일반적인 "flk-I" 수용체의 인간 및 쥐 대응물의 명명법이 많은 점에서 다르지만, 상호 교환가능하다. 쥐 수용체, 즉 Flk-1 및 그의 인간 대응물인 KDR은 세포내 도메인 내에 93.4%의 서열 상사성을 공유한다. 마찬가지로, 쥐 FLK-I는 쥐 VEGF와 동일한 친화성으로 인간 VEGF와 결합하며, 따라서 두 종으로부터 유도된 리간드에 의해 활성화된다. 문헌[Millauer et al., 1993,Cell, 72:835-846; Quinn et al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537] 참조. FLK-1은 또한293 세포(인간 배아 신장 섬유아세포)중에 공-발현될 경우 인간 RTK 기질(예: PLC-γ 또는 p85)과 연관되고 따라서 이를 티로신 포스포릴화한다.

따라서 FLK-1 수용체에 의지하는 모델은 KDR 수용체를 이해하는데 직접 적용할 수 있다. 예를 들어, 쥐 신호 형질도입 경로를 조절하는 화합물을 확인하는 방법에 쥐 FLK-1 수용체를 사용하는 것은 인간 신호 형질도입 경로를 조절하는데 사용될 수 있는, 즉 KDR 수용체에 관련된 활성을 조절하는 화합물을 확인하는데 직접 적용할 수 있다. 따라서, 생체외에서 KDR/FLK-1의 억제제로서 확인된 화학적 화합물은 생체내 모델에 적합한 것으로 확인될 수 있다. 생체내 생쥐 및 쥐 동물 모델 둘다는 KDR/FLK-1 유도된 신호 형질도입 경로에 작용하는 시약의 임상적 가능성을 시험하는 탁월한 가치를 보여주었다.

따라서, 본 발명은 KDR/FLK-1 수용체의 효소 활성에 영향을 주고 KDR/FLK-1에 의해 형질도입된 신호를 방해함으로써 혈관생성 및/또는 혈관형성을 조절, 조정 및/또는 억제하는 화합물을 제공한다. 따라서 본 발명은 교모세포종, 흑색종 및 카포시 육종, 및 난소, 폐, 유방, 전립선, 췌장, 결장 및 상피 암종을 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 종류의 충실성 종양의 치료에 대한 치료적 접근 방법을 제공한다. 또한, 데이터는 KDR/Flk-1 매개된 신호 형질도입 경로를 억제하는 화합물의 투여가 또한 혈관종, 재발협착증 및 당뇨성 망막병증의 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.

또한, 본 발명은 flt-1 수용체를 포함하는 경로를 포함하는 다른 수용체-매개된 경로에 의한 혈관생성 및 혈관형성의 억제에 관한 것이다.

수용체 티로신 키나제 매개된 신호 형질도입은 특정 성장 인자(리간드)와의 세포외 상호작용에 의해 개시되고, 수용체 이량체화, 고유 단백질 티로신 키나제 활성의 일시적 자극 및 자가 포스포릴화가 후속된다. 이로써 세포외 미세환경에 대한 적절한 세포 반응, 예컨대 세포 분열 및 대사 효과를 용이하게 하는 가지각색의 세포질 신호 세포와의 착물의 형성을 유발하는 세포내 신호 형질도입 분자를 위한 결합 부위가 생성된다. 문헌[Schlessinger and Ullrich, 1992,Neuron, 9:1-20] 참조.

KDR/FLK-1의 세포내 영역과 PDGF-β 수용체(50.3% 상사성) 및/또는 관련 flt-1 수용체의 세포내 영역의 밀접한 상사성은 중첩되는 신호 형질도입 경로의 유도를 시사한다. 예를 들어, PDGF-β 수용체에 대해, src 부류의 일원들(Twamley et al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), 포스파티딜리노시톨-3'-키나제(Hu et al., 1992,Mol. Cell. Biol., 12:981-990), 포스포리파제 cγ(Kashishian & Cooper, 1993,Mol. Cell. Biol., 4:49-51), ras-GTP아제-활성화 단백질, (Kashishian et al., 1992,EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp(Kazlaukas et al., 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90:6939-6943), Grb2(Arvidsson et al., 1994,Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726), 및 어댑터 분자 Shc 및 Nck(Nishimura et al., 1993,Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896)가, 상이한 자가 포스포릴화 부위를 포함하는 영역에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 문헌[Claesson-Welsh, 1994,Prog. Growth Factor Res., 5:37-54]을 참조한다. 따라서, KDR/FLK-1에 의해 활성화되는 신호 형질도입 경로가 ras 경로(Rozakis etal., 1992, Nature, 360:689-692), PI-3'-키나제, src-매개 및 plcγ-매개된 경로를 포함할 수 있다. 상기 경로 각각은 내피 세포에서 KDR/FLK-1의 혈관형성 및/또는 혈관생성 효과에 중요한 역할을 할 수 있다. 결론적으로, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 경로에 의해 혈관형성 및 혈관생성이 제어되므로 혈관형성 및 혈관생성을 조정하기 위해 본원에 기술된 유기 화합물을 사용하는 것에 관한 것이다.

반대로, 혈관의 수축, 단축 또는 폐쇄와 관련된 장애, 예컨대 재발협착증이 또한 포함되며 본 발명의 방법에 의해 치료 또는 예방될 수 있다.

섬유성 장애란 세포외 세포간질의 비정상 형성을 지칭한다. 섬유성 장애의 예는 간 경화 및 혈관간 세포 증식 장애를 포함한다. 간 경화는 간 흉터(scar)를 초래하는 세포외 세포간질 성분의 증가로 특징지어진다. 간 흉터를 초래하는 세포외 세포간질의 증가는 또한 간염과 같은 바이러스성 감염에 의해 유발될 수 있다. 지방세포가 간 경화에 주된 역할을 하는 것으로 보인다. 포함되는 다른 섬유성 장애는 죽상경화증을 포함한다.

혈관간 세포 증식 장애는 혈관간 세포의 비정상 증식에 의해 유발된 장애를 지칭한다. 혈관간 세포 증식 장애는 사구체신염, 당뇨성 신병증 및 악성 신경화증과 같은 다양한 인간 신장 질병뿐만 아니라 혈전성 미세혈관병증 증후군, 이식거부, 및 사구체병증과 같은 장애를 포함한다. RTK PDGFR은 혈관간 세포 증식의 유지에 연관되어 왔다. 문헌[Floege et al., 1993,Kidney International 43:47S-54S] 참조.

전술한 바와 같이, 많은 암들이 세포 증식 장애이고, PK는 세포 증식 장애에관련되어 왔다. 따라서, 예를 들어 RTK 부류의 일원들과 같은 PK가 암의 발육에 연관되어 왔다는 것은 놀랍지 않다. 상기 수용체중 일부, 예컨대 EGFR(Tuzi et al., 1991,Br. J. Cancer63:227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719), HER2/neu(Slamon et al., 1989,Science244:707-712) 및 PDGF-R(Kumabe et al., 1992,Oncogene, 7:627-633)은 많은 종양에서 과발현되고/되거나 자가분비 루프에 의해 지속적으로 활성화된다. 사실, 가장 통상적이고 심한 암에서 상기 수용체 과발현(Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992,J. Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson et al., 1992,Cancer Treatment Res.61:249-273, Korc et al., 1992,J. Clin. Invest.90:1352-1360) 및 자가분비 루프(Lee and Donoghue, 1992,J. Cell. Biol., 118:1057-1070, Korc et al.,supra, Akbasak and Suner-Akbasak et al.,supra)가 실증되었다. 예를 들어, EGFR은 인상(鱗狀) 세포 암종, 성상세포종, 교모세포종, 두부 및 경부 암, 폐암 및 방광암과 관련되어 왔다. HER2는 유방, 난소, 위, 폐, 췌장 및 방광 암과 관련되어 왔다. PDGFR은 교모세포종 및 흑색종 뿐만 아니라 폐, 난소 및 전립선 암과 관련되어 왔다. RTK c-met는 또한 악성 종양 형성과 관련되어 왔다. 예를 들어, c-met는, 다른 암들 중에서, 결장직장, 갑상선, 췌장, 위 및 간세포 암종 및 림프종과 관련되어 왔다. 추가로 c-met는 백혈병과 연결되어 왔다. c-met 유전자의 과발현은 또한 호지킨(Hodgkins) 질병 및 버키트(Burkitts) 질병이 있는 환자에게서 검출되어 왔다.

IGF-IR은, 영양섭취 지지 및 2형 당뇨병과 연관될 뿐만 아니라, 또한 여러 유형의 암과 관련되어 왔다. 예를 들어, IGF-I는 몇몇 종양 유형, 예컨대 인간 유방암 암종 세포(Arteaga et al., 1989,J. Clin. Invest.84:1418-1423) 및 작은 폐 종양 세포(Macauley et al., 1990,Cancer Res., 50:2511-2517)에 대해 자가분비 성장 자극자로서 연관되어 왔다. 게다가, IGF-I는 정상 성장 및 신경계의 분화에 필수적으로 포함되지만, 또한 인간 신경교종의 자가분비 자극자인 것으로 보인다. 문헌[Sandberg-Nordqvist et al., 1993,Cancer Res.53:2475-2478] 참조. IGF-IR 및 그의 리간드의 세포 증식에서의 중요성은 배양중의 많은 세포 유형(섬유아세포, 상피 세포, 평활근 세포, T-림프구, 골수 세포, 연골세포 및 골모세포(골수의 줄기 세포))이 IGF-I에 의해 자극되어 성장한다는 사실에서 더욱 지지된다. 문헌[Goldring and Goldring, 1991,Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326] 참조. 바서가(Baserga) 및 코폴라(Coppola)는 IGF-IR이 형질전환의 기작에 중심 역할을 하고, 따라서 광범위한 인간 악성증세에 치료적 개입을 위한 바람직한 표적이 될 수 있는 것으로 제안하였다. 문헌[Barserga, 1995,Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994,Cell79:927-930, Coppola et al., 1994,Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595] 참조.

STK는 특히 유방암을 포함하는 많은 유형의 암에 연관되어 왔다(Cance, et al.,Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

비정상 PK 활성과 질병 사이의 관련은 암으로 한정되지 않는다. 예를 들어, RTK는 건선, 당뇨병, 자궁내막증, 혈관형성, 죽상 판 발육, 알츠하이머병, 재발협착증, 폰 히펠-린다우(von Hippel-Lindau)병, 상피 과증식, 신경퇴화 질병, 연령관련황반변성 및 혈관종과 같은 질병과 관련되어 왔다. 예를 들어, EGFR은 각막 및피부 상처 치유에 지시되어 왔다. 인슐린-R 및 IGF-1R의 결함은 2형 당뇨병에서 지시된다. 특정 RTK와 그의 치료적 징후의 더욱 완전한 관계는 문헌[Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339]에 제시되어 있다.

이전에 지적한 바와 같이, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr 및 yrk를 포함하나 이에 한정되지 않는 RTK뿐만 아니라 CTK는(문헌[Bolen et al., 1992,FASEB J., 6:3403-3409]에 개관됨) 증식 및 대사 신호 형질도입 경로에 연루되며, 본 발명이 지향하는 많은 PTK-매개된 장애에 연루된 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 돌연변이된 src(v-src)는 닭의 종양단백질(pp60^v-src)인 것으로 밝혀졌다. 게다가, 그의 세포 상사물인 원시-종양유전자 pp60^c-src는 많은 수용체의 종양유전자성 신호를 전달한다. 종양내 EGFR 또는 HER2/neu의 과발현은, 정상 세포에는 없지만 악성 세포의 특징부인 pp60^c-src의 구조적 활성화를 유발한다. 한편, c-src의 발현이 부족한 생쥐는 골화성 표현형을 나타내며, 이는 파골 기능에서의 c-src의 핵심 참여 및 관련 장애의 가능한 연관을 지시한다.

유사하게, Zap70은 자가면역 장애와 관련될 수 있는 T-세포 신호와 연관되어 왔다.

STK는 염증, 자가면역 질병, 면역반응, 및 재발협착증, 섬유증, 건선, 골관절염 및 류머티스성 관절염과 같은 과증식 장애와 관련되어 왔다.

PK는 또한 배아 이식에 연루되어 왔다. 따라서, 본 발명의 화합물은 상기 배아 이식을 방지하는 효과적인 방법을 제공하며 따라서 출산 조절제로서 유용하다. 본 발명의 화합물을 사용하여 치료 또는 예방될 수 있는 추가적인 장애는 자가면역 질병, AIDS와 같은 면역학적 장애 및 죽상경화증과 같은 심장혈관 질병이다.

최종적으로, RTK 및 CTK 둘다는 현재 과면역 장애와 연관된 것으로 짐작되고 있다.

제공된 화합물 및 데이터는 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니다.

투여 및 약학 조성물

본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 인간 환자에게 그대로 투여되거나, 상기 물질이 적당한 담체 또는 부형제와 혼합된 약학 조성물로 투여될 수 있다. 약물의 배합 및 투여 기법은 문헌["Remington's Pharmacological Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA., latest edition]에서 찾을 수 있다.

본원에서, "투여 행위" 또는 "투여"는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 본 발명의 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약학 조성물을 PK-관련된 장애의 예방 또는 치료 목적으로 유기체에 전달하는 것을 지칭한다.

투여의 적합한 경로는 경구, 직장, 경점막 또는 장 투여 또는 근육내, 피하, 척수내, 경막내, 직접 심실내, 정맥내, 유리체내, 복막내, 비강내, 또는 안내 주사를 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. 투여의 바람직한 경로는 경구 및 장관외이다.

다르게는, 화합물을 전신적인 방식보다는 국소적으로, 예를 들어 화합물을 종종 데포(depot) 또는 지지된 방출 배합물로 충실성 종양에 직접 주사하여 투여할 수 있다.

또한, 목적하는 약물 전달계로, 예를 들어 종양-특이적 항체로 피복된 리포솜으로 약물을 투여할 수 있다. 리포솜은 종양을 표적으로 하며 종양에 의해 선택적으로 흡수된다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예컨대 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 정제 제조, 분말화(levigating), 유화, 캡슐화, 포집(entrapping) 또는 친액성화 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 용도를 위한 약학 조성물은 활성 화합물의 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체를 사용하는 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 좌우된다.

주사의 경우, 본 발명을 화합물을 수용액에, 바람직하게는 행크스(Hanks) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리학적 염수 완충액에서 제형화할 수 있다. 점막투과 투여의 경우, 투과할 장벽에 적합한 침투제를 제형에 사용한다. 이러한 침투제는 당해 기술분야에 일반적으로 알려져 있다.

경구 투여의 경우, 본 발명의 활성 화합물을 당해 기술분야에 널리 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써 제형화할 수 있다. 이러한 담체를 사용하여 본 발명의 화합물을 환자에 의해 경구 복용되는 정제, 환제, 마름모꼴 정제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제 등으로 제형화할 수 있다. 경구용 약학적 제제는 고체 부형제를 사용하고, 생성된 혼합물을 선택적으로 분쇄하고, 필요한 경우 다른 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 제조될 수 있다. 유용한 부형제로는, 특히 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 비롯한 당, 예컨대 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 같은 셀룰로스 제조물, 및 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 같은 기타 물질이 있다. 필요한 경우, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 우무 또는 알긴산 같은 붕해제를 첨가할 수 있다. 알긴산 나트륨 같은 염도 사용될 수 있다.

당의정 코어는 적합하게 피복되어 제공된다. 이를 위해, 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화 티탄, 라커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 선택적으로 포함할 수 있는 농축 당 용액을 사용할 수 있다. 활성 화합물의 투여량의 다양한 조합을 확인하거나 특징화하기 위해 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정 피복물에 첨가할 수 있다.

경구로 이용될 수 있는 약학 조성물은 젤라틴으로 만든 끼워맞춤형(push-fit) 캡슐, 및 젤라틴, 글리세롤 또는 소르비톨 같은 가소제로 만든 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 끼워맞춤형 캡슐은 락토스 같은 충전제, 녹말 같은 결합제, 및/또는 활석 또는 스테아르산 마그네슘 같은 윤활제, 및 선택적으로 안정화제와 혼합한활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐의 경우, 활성 성분을 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁시킬 수 있다. 또한, 이들 제형에 안정화제를 첨가할 수 있다.

또한, 사용될 수 있는 약학 조성물로는 경질 젤라틴 캡슐이 포함된다. 비제한적 예로서, 활성 화합물 캡슐 경구용 약품은 50 내지 200mg 투여량 강도로 할 수 있다. 이들 두 투여량 강도는 동일한 과립을 다른 크기의 경질 젤라틴 캡슐, 즉 사이즈 3의 50mg 캡슐 및 사이즈 0의 200mg 캡슐에 충전함으로써 제조된다. 이러한 제형의 조성은, 예컨대 하기 표 2에 나타낸 바와 같을 수 있다:

성분명칭/등급	과립중 농도(%w/w)	50mg 캡슐 중의 양(mg)	200mg 캡슐 중의 양(mg)
활성 성분 NF	65.0	50.0	200.0
만니톨 NF	23.5	18.1	72.4
크로스카멜로스 나트륨 NF	6.0	4.6	18.4
포비돈 K 30 NF	5.0	3.8	15.2
스테아르산 마그네슘 NF	0.5	0.38	1.52
캡슐, 스웨덴 황색 NF		사이즈 3	사이즈 0

빛으로부터 활성 화합물을 보호하기 위하여 캡슐을 갈색 유리 또는 플라스틱 병에 넣어 포장할 수 있다. 활성 화합물 캡슐 제형을 포함하는 용기는 제어되는 실온(15 내지 30℃)에서 저장되어야 한다.

흡인에 의한 투여의 경우, 본 발명에 따른 용도를 위한 화합물을 가압 팩 또는 분무기(nebulizer), 및 적합한 추진제, 예컨대 비제한적인 예로서 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화 탄소를 사용한 에어로졸 분무기의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 구비함으로써 제어될 수 있다. 흡입기 또는 취입기(insufflator)에 사용되는, 예컨대 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토스 또는 전분 같은 적합한 분말 기재의 분말 혼합물을 포함하여 제형화될 수 있다.

또한, 이 화합물은, 예컨대 볼러스(bolus) 주입 또는 연속식 관류(infusion)에 의해 비경구로 투여되도록 제형화될 수 있다. 주사를 위한 제형은 단위 투여 형태, 예컨대 보존제가 첨가된 앰플 또는 다중 투여량 용기로 제공될 수 있다. 이 조성물은 유성 또는 수성 비히클중의 현탁액, 용액 또는 유화액 같은 형태를 가질 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제 같은 제형화 물질을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 약학 조성물은, 비제한적인 예로서 활성 화합물의 염 같은 수용성 형태의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 친지성 비히클중에서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 비히클로는 참기름 같은 지방 오일, 에틸 올리에이트 및 트리클리세라이드 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀 같은 물질이 포함된다. 수용성 주사 현탁액은, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트린 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 이 현탁액은 또는 적합한 안정화제 및/또는 고농도의 용액의 제조를 가능케 하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 포함할 수 있다.

또 다르게는, 활성 성분은, 사용전에 적합한 비히클, 예컨대 발열성 물질이제거된 멸균수로 조제되기 위한 분말 형태일 수 있다.

또한, 이 화합물은, 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드 같은 통상의 좌제 기재를 사용한, 좌제 또는 체류 관장제 같은 직장 조성물로서 제형화될 수 있다.

전술한 제형 외에, 본 화합물은 또한 저장(depot) 제제로서 제형화될 수 있다. 이러한 장기간 작용하는 제형은 이식(예컨대, 피하 또는 근육내)에 의해, 또는 근육내 주사법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예: 약리학적으로 허용가능한 오일을 이용한 유화액중)을 이용하여, 또는 이온 교환 수지를 이용하여 이러한 투여 경로용으로, 또는, 비제한적 예로서 난용성 염 같은 난용성 유도체로서 제형화될 수 있다.

본 발명의 소수성 화합물을 위한 약학적 담체의 비제한적 예로는 VPD 공용매 시스템 같은, 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 수혼화성 유기 중합체 및 수성상을 포함하는 공용매 시스템이 있다. VPD는 무수 에탄올중의, 3%w/v의 벤질 알코올, 8%w/v의 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80 및 65%w/v의 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액이다. VPD 공용매 시스템(VPD:D5W)은 수용액중 5%의 덱스트로스와 1:1로 희석된 VPD로 이루어진다. 이 공용매 시스템은 소수성 화합물을 잘 용해시키고, 그 자체가 전신 투여시 낮은 독성을 갖는다. 당연히, 이러한 공용매 시스템의 비율은 이의 용해도 및 독성 특성을 잃지 않는 한 상당히 변화될 수 있다. 더욱이, 공용매 성분의 본질(identity)이 변화될 수 있다. 즉, 예컨대, 폴리소르베이트 80 대신에 다른 저독성 비극성 계면활성제가 사용될 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜의 분할 크기가 변화될 수 있고, 다른 생체적합성 중합체, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈이 폴리에틸렌 글리콜을 대체할 수 있고, 다른 당 또는 폴리사카라이드가 덱스트로스를 대체할 수 있다.

또 다르게는, 소수성 약학적 화합물을 위한 다른 전달 시스템을 이용할 수 있다. 리포좀 및 유화액이 소수성 약물을 위한 전달 비히클 또는 담체로서 널리 알려진 예이다. 또한, 흔히 더 독성이 높을지라도 디메틸설폭사이드 같은 소정의 유기 용매를 사용할 수 있다.

또 다르게는, 본 화합물은 치료제를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 같은 지효성(sustained release) 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 다양한 지효성 물질이 정립되어 있으며 당해 기술분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 지효성 캡슐은, 그의 화학적 성질에 따라, 수주에서 100일 이상 화합물을 방출한다. 치료제의 화학적 성질 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가의 전략을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 약학 조성물은 적합한 고체 또는 겔상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는 부형제의 예로는 탄산 칼슘, 인산 칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜 같은 중합체가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 많은 PK 조절 화합물은 음으로 또는 양으로 하전된 종을 형성할 수 있는 생리학적으로 허용가능한 염으로서 제공될 수 있다. 양으로 하전된 잔기를 형성하는 염의 예로는 4급 암모늄 염(본원의 다른 부분에서 정의됨), 염산염,황산염, 탄산염, 락트산염, 타르타르산염, 말산염, 말레산염, 석신산염 같은 염이 포함되며, 이때 4급 암모늄 기의 질소 원자는 적절한 산과 반응한 본 발명의 선택된 화합물의 질소이며, 이들 예로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물이 음으로 하전된 종을 형성하는 염으로는 본 화합물의 카복실산 기의 적절한 염기(예: 수산화 나트륨(NaOH), 수산화 칼륨(KOH), 수산화 칼슘(CaOH) 등)의 반응에 의해 형성된 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 염이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용도에 적합한 약학 조성물은, 활성 성분이 의도하는 목적, 예컨대 PK 활성의 조절, 또는 PK 연관된 질병의 치료 또는 예방을 달성하는데 충분한 양으로 포함된 조성물을 포함한다.

더욱 구체적으로는, 치료 효과량은 질환의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나, 또는 치료받는 환자의 생존을 지속하는데 효과적인 화합물의 양을 의미한다.

치료 효과량은 당해 기술분야의 숙련자의 역량 내에서, 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 용이하게 결정된다.

본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료 효과량 또는 투여량은 사전에 세포 배양 검정법으로 평가될 수 있다. 이어서, 이 투여량을 세포 배양에서 결정된 IC₅₀을 포함하는 순환 농도 범위(즉, PK 활성의 최대 억제의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)를 달성하도록 동물 모델에서 사용하게 제형화할 수 있다. 이어서, 이러한 정보는 인간에게 유용한 투여량을 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다.

본원에 기재된 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양이나 실험 동물에서 표준 약학적 방법에 의해, 예컨대 당해 화합물의 IC₅₀및 LD₅₀(이들은 둘다 본원의 다른 부분에서 고찰됨)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 이들 세포 배양 검정법 및 동물 연구에서 얻은 자료를 이용하여 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위를 계산할 수 있다. 투여량은 이용하는 투여 형태 및 투여 경로에 따라 변화될 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 보고 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다(예컨대, 문헌[Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1] 참조).

키나제 조절 효과를 유지하는 데 충분한 활성 종의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 투여량 및 간격을 조정할 수 있다. 혈장 수준은 최소 유효 농도(MEC)로서 불린다. MEC는 각각의 화합물마다 다르지만 생체외 자료로부터 평가될 수 있다. 예컨대, 키나제의 50 내지 90% 억제를 달성하는 데 필요한 농도는 본원에 기술된 검정법을 이용하여 확인될 수 있다. MEC를 달성하는데 필요한 투여량은 개개의 투여 특성 및 경로에 의존한다. HPLC 분석 또는 생검법(bioassay)을 사용하여 혈장 농도를 측정할 수 있다.

또한, 투여 간격은 MEC 값을 이용하여 결정될 수 있다. 10 내지 90%, 바람직하게는 30 내지 90%, 가장 바람직하게는 50 내지 90%의 시간동안 MEC를 초과하는 혈장 수준을 유지하는 처방법을 이용하여 화합물을 투여하여야 한다.

현재, 화학식 I, Ia 또는 II의 화합물의 치료 효과량은 대략 1일 당 25 내지 1500mg/m²의 범위이고, 바람직하게는 약 3mg/m²/일일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 50 내지 400mg/m²/일이다.

국소 투여 또는 선택적 흡수(selective uptake)의 경우, 약물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있으며, 당해 기술분야에 공지된 다른 방법을 이용하여 올바른 투여량 및 간격을 결정할 수 있다.

물론, 투여되는 조성물의 양은 치료받을 환자, 증상의 심중도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 따른다.

조성물은 필요한 경우 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함하는, FDA 승인 키트 같은 팩 또는 분배 장치 내에 존재할 수 있다. 팩은, 예컨대 블리스터(blister) 팩 같은 금속 또는 플라스틱 포일을 포함한다. 팩 또는 분배 장치는 투여 지침서가 수반될 수 있다. 또한, 팩 또는 분배기는 제작을 규제하는 정부기관의 지침에 따른 형태로 용기와 관련된 고시문(notice), 약제의 용도 및 판매처가 수반될 수 있으며, 이 고시문은 정부기관의 승인, 조성물의 형태, 또는 인간 또는 동물 투여를 표시한다. 이러한 고시문은, 예컨대 미국 식품의약청(U.S. Food and Drug Administration)에 의해 처방 약물에 승인된 라벨, 또는 승인된 제품 삽입물일 수 있다. 또한, 상용성 약학 담체중에 제형화된 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제조하여 적절한 용기에 넣고 표시된 증상의 치료를 위한 라벨을 붙일 수 있다. 라벨에 표시되는 적합한 증상으로는 종양의 치료, 혈관생성의 억제, 섬유증, 당뇨병의 치료 등이 포함될 수 있다.

본 발명은 CMC 현탁 비히클을 이용하여 투여될 수 있다. 대표적인 CMC 현탁액을 하기 표 3에 열거한다:

성분	농도(%(w/v))
API	*
카복시메틸셀룰로스 나트륨, USP(중간 등급)	0.5
염화 나트륨, USP/NF	0.9
폴리소르베이트 80, NF	0.4
벤질 알코올, NF	0.9
탈염수	100ml 적량
*필요한 농도(일)에 따름.

CMC 현탁 비히클의 1.0리터에 대한 제조방법은 다음과 같다. 비히클 배합물의 조성 및 배치(batch) 크기를 보여주는 표를 이용하여 비히클 배합물을 제조하는 데 요구되는 부형제의 적절한 양을 계산한다. 적합한 빈 용기, 예컨대 깨끗한 입이 넓은 유리병 또는 폴리에틸렌 병의 무게를 잰다. 용기에 약 600ml의 물을 첨가한다. 카복시메틸셀룰로스 나트륨(5g)을 계량하여 용기로 옮긴다. 추진기를 가진 자기 교반자 또는 실험실용 교반기를 이용하여 균질해질 때까지 교반한다(약 2 내지 3시간). NaCl의 무게를 재고 용기에 첨가한다. 용해될 때까지 혼합을 계속한다(약 10분). 폴리소르베이트 80을 첨가한다. 용액이 균질해질 때까지 혼합한다(약 20분). 벤질 알코올을 첨가한다. 용액이 균질해질 때까지 혼합한다(약 10분). 무게 또는 부피(1010g 또는 1000ml, 22℃에서의 밀도는 1.01이다)중 어느 하나에 따라 남은 물을 첨가하여 요구되는 배치 크기가 되도록 용액의 무게를 맞춘다. 2내지 8℃에서 냉장한다.

현탁액 제형은 다음과 같이 제조될 수 있다. 막자사발 및 막자를 이용하여 API를 분쇄하여 균질하게 보이는 작은 미립자 크기를 갖는 분말(큰 덩어리나 거대 미립자가 없고, 이상적으로는 미국 표준체(standard sieve) >80을 통과해야 한다. 즉, 크기가 <180㎛ 이어야 한다)을 수득한다. 계산된 양의 API의 무게를 달아 용기에 넣는다. CMC 현탁 비히클의 총 요구량의 약 90%를 용기에 첨가한다. 추진기나 그 유사체를 갖는 실험실용 교반기를 이용하여 비히클에 화합물을 현탁시킨다. 추진기 날의 지름은 용기의 바닥의 지름과 맞게 하여 효율적으로 혼합이 이루어지도록 한다. 50rpm에서 30분동안 또는 약물이 잘 현탁될 때까지 교반한다. 비히클 배합물을 배치 크기에 상응하는 적절한 무게가 되도록 하는 데 충분한 양으로 첨가한다(물을 넣는다). 50rpm으로 추가로 30분동안 교반한다. 이 현탁액을 즉시 호박색 유리 또는 폴리프로필렌 용기에 취한다. 용기를 빛으로부터 차단한다. 2 내지 8℃에서 냉장한다(얼지 않게 함).

또한, 전술한 화합물, 이의 염 또는 전구약물을 전술한 질환 또는 장애의 치료를 위한 다른 화학요법제와 혼합하는 것도 본 발명의 한 양태이다. 예컨대, 본 발명의 화합물, 염 또는 전구약물을 단독으로 또는 류코보린이 추가로 혼합된 플루오로우라실(5-FU) 같은 알킬화제와 혼합하거나; 또는 UFT, 카페시타빈, 겜시타빈 및 사이타라빈 같은 다른 피리미딘 유사체, 알킬 설포네이트, 예컨대 부술판(만성 과립구성 백혈병의 치료에 사용됨), 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조데파, 카르보쿠온, 메투레데파 및 우레데파; 에틸렌이민 및 메틸멜라민, 예컨대알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤멜라민; 및 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실(만성 림프구성 백혈병, 1차 거대글로불린혈증 및 비-호지킨 림프종의 치료에 사용됨), 사이클로포스파미드(호지킨병, 다중골수종, 신경모세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 윌름(Wilm) 종양 및 횡문근육종의 치료에 사용됨), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 노벰브리킨, 프레드니무스틴 및 우라실 머스타드(1차 혈소판증가증, 비-호지킨 림프종, 호지킨병 및 난소암의 치료에 사용됨); 트리아진, 예컨대 다카르바진(연조직 육종의 치료에 사용됨) 같은 다른 알킬화제와 혼합할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화합물, 염 또는 전구약물은 엽산 유사체, 예컨대 메토트렉세이트(급성 림프구성 백혈병, 융모암, 균상 식육종(mycosis fungiodes), 유방암, 두부 및 경부 암, 및 골형성성 육종의 치료에 사용됨) 및 프테롭테린; 및 급성 과립구성, 급성 림프구성 및 만성 과립구성 백혈병의 치료에 사용되는 머캅토퓨린 및 티오구아니딘 같은 퓨린 유사체 같은 다른 항대사성 화학요법제와 혼합하여 사용될 수 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화합물, 염 또는 전구약물은 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈블라스틴(유방암 및 고환암의 치료에 사용됨), 빈크리스틴 및 빈데신; 에피포도필로톡신, 예컨대 에토포시드 및 테니포시드(이들은 둘다 고환암 및 카포시 육종의 치료에 유용함) 같은 천연물 계통의 화학요법제; 항생물질 화학요법제, 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신(위, 경부, 결장, 유방, 방광 및 췌장 암의 치료에 사용됨), 닥티노마이신, 테모졸로미드, 플리카마이신, 블레오마이신(피부, 식도 및 비뇨생식기관 암의 치료에 사용됨); 및 L-아스파라기나제 같은 효소성 화학요법제와 혼합하여 사용될 수 있으며, 이들 예로 한정되는 것은 아니다.

상기한 바 외에, 본 발명의 화합물, 염 또는 전구약물은 또한 백금 배위 착물(시스플라틴 등); 하이드록시우레아 같은 치환된 우레아; 메틸하이드라진 유도체, 예컨대 프로카르바진; 부신피질 억제제, 예컨대 미토탄, 아미노글루테티미드; 및 부신피질자극호르몬(예: 프레드니손), 프로게스틴(예: 하이드록시프로게스테론 카프로에이트) 같은 호르몬 및 호르몬 길항제; 에스트로겐(예: 디에틸스필베스테롤); 타목시펜 같은 항에스트로겐; 안드로겐, 예컨대 테스토스테론 프로피오네이트; 및 아나스트로졸 같은 아로마타제 억제제와 혼합될 수 있다.

마지막으로, 본 발명의 화합물의 혼합물은 또한 충실성 종양 암, 또는 급성 골수성(비림프구성) 백혈병(이들로 한정되는 것은 아니다) 같은 백혈병의 치료를 위한 미톡산트론, 파클리탁셀, 당해 기술분야에 공지된 사이클로옥시게나제-2 억제제, 특히 셀레브렉스(Celebrex: 등록상표), 파라콕시브(Paracoxib: 등록상표), 비옥스(Vioxx: 등록상표), 국제 특허 출원 공개 제 WO 99/11605 호에 개시된 애보트 콕스(Abbott's cox)-189, 캄프토사(Camptosar: 등록상표) 같은 토포이소머라제 억제제, 허셉틴(Herceptin: 등록상표) 같은 Her-2 수용체 길항제, 엔도스타틴, 글리백(Gleevac: 등록상표), 임클론 VEGF 수용체 길항제 IMC C225(등록상표)와 혼합되면 효과적일 수 있다.

일반적 합성 방법

하기 일반적인 방법론은 본 발명의 화합물을 제조하는 데 이용될 수 있다:

적절하게 치환된 2-옥스인돌(1당량), 적절하게 치환된 3-카복시-5-포르밀피롤(1.2당량) 및 염기(0.1당량)을 용매(1 내지 2ml/mmol 옥스인돌)중에서 혼합한 후, 이 혼합물을 약 2 내지 약 12시간동안 가열한다. 냉각후, 형성된 침전물을 여과하고 차가운 에탄올 또는 에테르로 세척하고 진공건조하여 상응하는 5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-(3Z)-일리덴메틸)-1-H-피롤-3-카복실산을 수득한다. 침전이 형성되지 않는 경우, 반응 혼합물을 농축하고 잔사를 디클로로메탄/에테르로 연화시키고 생성된 고체를 여과하여 수집한 후, 건조한다. 선택적으로 생성물을 크로마토그래피에 의해 추가 정제할 수 있다.

염기는 유기 또는 무기 염기일 수 있다. 유기 염기가 사용되면, 바람직하게는 질소 염기이다. 유기 질소 염기의 예로는 디이소프로필아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 아닐린, 피리딘, 1,8-디아자비사이클로[5.4.1]운덱-7-엔, 피롤리딘 및 피페리딘이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

무기 염기의 예로는 암모니아, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수산화물, 인산염, 탄산염, 중탄산염, 중황산염 및 아미드가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 알칼리 금속으로는 리튬, 나트륨 및 칼륨이 포함되고, 알칼리 토금속으로는 칼슘, 마그네슘 및 바륨이 포함된다.

본 발명의 현재 바람직한 양태에서, 용매가 물 또는 알코올 같은 양성자성 용매인 경우, 염기는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 무기 염기, 바람직하게는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 수산화물이다.

공지의 유기 합성의 일반적 원칙 및 본원에 개시된 내용에 기초하여 어떠한 염기가 목적하는 반응에 가장 적절한 지는 당해 기술분야의 숙련자에게 명백할 것이다.

반응이 수행되는 용매는 양성자성 또는 비양성자성 용매일 수 있고, 바람직하게는 양성자성 용매이다. "양성자성 용매"는 수소 원자를 상당히 산성으로 만듦으로써 수소 결합을 통해 용질과 "공유"될 수 있는, 산소 또는 질소 원자에 공유적으로 결합된 수소 원자를 갖는 용매이다. 양성자성 용매의 예로는 물 및 알코올이 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

"비양성자성 용매"는 극성 또는 비극성일 수 있지만, 어느 경우라도 산성 수소를 갖지 않으므로 용질과 수소 결합을 할 수 없다. 비극성 비양성자성 용매의 예로는 펜탄, 헥산, 벤젠, 톨루엔, 염화 메틸렌 및 사염화 탄소가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 극성 비양성자성 용매의 예로는 클로로포름, 테트라하이드로푸란, 디메틸설폭사이드 및 디메틸포름아미드가 있다.

본 발명의 현재 바람직한 양태에서, 용매는 양성자성 용매, 바람직하게는 물, 또는 에탄올 같은 알코올이다.

반응은 실온보다 높은 온도에서 수행된다. 일반적으로 온도는 약 30 내지 약 150℃, 바람직하게는 약 80 내지 약 100℃, 가장 바람직하게는 에탄올의 비점 부근인 약 60 내지 약 85℃이다. "약"은 온도 범위가 바람직하게는 표시된 온도의 10℃ 이내, 더욱 바람직하게는 5℃ 이내, 가장 바람직하게는 2℃ 이내임을 의미한다. 그러므로, 예컨대 "약 75℃"는 75±10℃, 바람직하게는 75±5℃, 가장 바람직하게는 75±2℃를 의미한다.

2-옥스인돌 및 3-카복시-5-포르밀피롤은 용이하게 입수할 수 있는 출발물질을 사용하여 화학 기술분야에 널리 공지된 기법을 이용하여 용이하게 합성될 수 있다.

이어서, 5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-(3Z)-일리덴메틸)-1-H-피롤-3-카복실산을 화학식 ZCH(R⁵)-CR⁴(OH)-CHR³NH₂의 아민과, 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란 등 같은 유기 용매중에서 디사이클로헥실카보디이미드, DEAE, EDC 및 HOBt 같은 적합한 커플링제의 존재하에서 커플링시켜 화학식 I의 화합물을 제공한다. 화학식 ZCH(R⁵)-CR⁴(OH)-CHR³NH₂의 아민은 시판되거나, 당해 기술분야에 널리 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 몇몇 이러한 방법은 하기 본원에 기재되어 있다.

본 발명의 화합물을 형성하기 위한 다른 합성 경로를 이용할 수 있고, 하기의 내용은 일례로서 제공되며 이들로 한정되지 않음을 당해 기술분야의 숙련자들은 인식할 수 있을 것이다.

하기 제조예 및 실시예는 당해 기술분야의 숙련자들이 본 발명을 더 명확하게 이해하고 실시할 수 있게 하기 위하여 제공된다. 이는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주해서는 안되고, 단지 예시적이고 대표적인 것으로 이해해야 한다.

합성 실시예

실시예 1

5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴-메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산의 합성

단계 1

디메틸포름아미드(25ml, 3당량)를 빙욕에서 교반하면서 냉각하였다. 여기에 POCl3(1.1당량, 10.8ml)을 첨가하였다. 30분후, DMF(2M, 40ml)중의 3,5-디메틸-4-에틸에스테르 피롤(17.7g, 105.8mmol)의 용액을 반응물에 첨가하고 교반을 계속하였다. 2시간후, 반응물을 물(250ml)로 희석하고 1N 수성 NaOH로 pH 11로 염기화하였다. 여과하여 백색 고체를 제거하고, 물과, 이어서 헥산으로 헹구고 건조하여 황갈색 고체로서 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 에틸 에스테르(19.75g, 95%)을 수득하였다.¹H NMR(360MHz, DMSO-d6) δ 12.11(br s, 1H, NH), 9.59(s, 1H, CHO), 4.17(q, J = 6.7Hz, 2H, OCH ₂CH₃), 2.44(s, 3H, CH ₃), 2.40(s, 3H, CH ₃), 1.26(d, J = 6.7Hz, 3H, OCH₂CH ₃).

단계 2

5-포르밀-2,4-디메틸-lH-피롤-3-카복실산 에틸 에스테르(2g, 10mmol)를 메탄올(3ml)에 용해시킨 수산화 칼륨((3g, 53mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 3시간동안 환류하고 실온으로 냉각하고 6N 염산으로 pH 3으로 산성화시켰다. 여과하여 고체를 수거하고 물로 세척하고 진공 오븐에서 하룻밤 건조하여 5-포르밀-2,4-디메틸-lH-피롤-3-카복실산(1.6g, 93%)을 수득하였다.¹H NMR(300 MHz, DMSO-d6) δ 12.09(s, br, 2H, NH & COOH), 9.59(s, 1H, CHO), 2.44(s, 3H, CH₃), 2.40(s, 3H, CH₃).

단계 3

5-플루오로이사틴(8.2g, 49.7mmol)을 하이드라진 수화물 50ml에 용해시키고 1시간동안 환류하였다. 이어서, 반응 혼합물을 얼음물에 부었다. 이어서, 침전물을 여과하고 물로 세척하고 진공 오븐에서 건조하여 5-플루오로-2-옥스인돌(7.5g)을 수득하였다.

단계 4

에탄올(3mL) 중의 5-플루오로옥신돌(100mg, 0.66 mmol), 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(133 mg, 0.79 mmol) 및 피페리딘 10 방울의 반응 혼합물을 60℃에서 하룻밤동안 교반하고 여과하였다. 고체를 1M의 염산 수용액, 물로 세척하고, 건조하여 황색 고체로서 5-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(201 mg, 정량적)을 수득하였다. MS m/z(상대적 강도, %) 299 ([M-1]^+., 100).

실시예 2

5-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (3-디에틸아미노-2-하이드록시-프로필)-아미드의 합성

단계 1

30℃에서 물(3.08 g, 0.17 mole) 및 디에틸아민(106.2 mL, 1.03 mole)의 혼합물을 2-클로로메틸옥시란(95 g, 1.03 mole)에 첨가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 28-35℃에서 6 시간 동안 교반하고, 20-25℃로 냉각하여 1-클로로-3-디에틸아미노-프로판-2-올을 수득하였다.

단계 2

1-클로로-3-디에틸아미노-프로판-2올을 78 mL의 물 중의 수산화 나트륨(47.9 g, 1.2 mole) 용액에 첨가하였다. 생성물을 20-25℃에서 1시간 동안 교반하고, 178 mL의 물로 희석하고, 에테르로 2회 추출하였다. 모은 에테르 용액을 고체 수산화 칼륨으로 건조시키고 증발시켜 135 g의 조질 생성물을 수득하고, 이를 분별 증류로 정제하여, 오일로서 순수한 글리시딜디에틸아민(98 g, 76%)을 수득하였다.

단계 3

10분에 걸쳐 글리시딜디에틸아민(3.2 g, 24.8 mmol)을 25%(w/w)의 수산화 암모늄(25 mL, 159 mole)의 얼음-냉각 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 0-5℃에서 1시간 동안 교반 후, 실온에서 14시간 동안 교반하였다. 생성된 반응 혼합물을 증발시키고 증류시켜(500-600 mT에서 84-90℃로) 1-아미노-3-디에틸아미노-프로판-2-올 (3.3 g, 92%)을 수득하였다. MS m/z 147 ([M+1]^+.).

단계 4

1-아미노-3-디에틸아미노-프로판-2-올(93.2 mg, 0.64 mmol)을 1.0 mL의 DMF 중의 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(100 mg, 0.43 mmol), EDC(122.7 mg, 0.64 mmol) 및 HOBt(86.5 mg, 0.64 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 실온에서 하룻밤동안 교반하고 증발시켰다. 잔류물을 10 mL의 물에 현탁시키고 여과하였다. 고체를 포화 중탄산 나트륨 및 물로 세척하고, 고진공 오븐에서 하룻밤동안 건조하여 조질 생성물을 수득하고, 이를 트리에틸아민(2 방울/ 100 mL의 6% 메탄올-디클로로메탄)을 함유하는 6%의 메탄올-디클로로메탄으로 용리하는 컬럼 크로마토그래피로 정제시켜, 황색 고체로서 5-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (3-디에틸아미노-2-하이드록시-프로필)-아미드(62 mg, 34%)을 수득하였다.

실시예 3

5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴-메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-모르폴린-4일-프로필)-아미드의 합성

단계 1

에탄올(50 mL) 중의 모르폴린(2.6 mL, 30 mmol) 및 에피클로로하이드린(2.35ml, 30 mmol)의 혼합물을 70℃에서 하룻밤동안 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 염화 메틸렌(50 mL)으로 희석하였다. 진공 여과에 의해 투명한 고체 침전물을 수집하여, 1-클로로-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올(2.0 g, 37%)을 수득하였다.

단계 2

1-클로로-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올(2.0 g, 11 mmol)을 실온에서 메탄올 중의 NH₃용액(25 중량%, 20 mL)으로 처리하였다. 질소를 반응 혼합물로 폭기시켜 암모니아를 제거하였다. 용매를 증발시켜, 1-아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올의 염화 수소염(2.0 g, 91%)을 수득하였다.

단계 3

5-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(120 mg, 0.4 mmol)을 1-아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올(74 mg, 0.48 mmol)과 축합시켜 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(2-하이드록시-3-모르폴린-4일-프로필)-아미드(65 mg, 36%)를 수득하였다. 모액을 증발 건조시키고 잔류물을 플래시 크로마토그래피로 정제시켜, 2N(70 mg, 39%)을 추가 수득하였다.

2-하이드록시-7-옥사-4-아조니아스피로[3.5]노난 클로라이드의 합성

열전쌍, 질소 주입구 및 250 ml의 첨가 깔대기가 장치된 1L 용량의 3-구 환저 플라스크에 모르폴린(91.5 g, 91.5 ml, 1.05 mole, 1.0 당량) 및 100 ml의 에탄올을 채웠다. 에피클로로하이드린(100 g, 84.5 ml, 1.08 mole, 1.03 당량)을 첨가 깔대기를 통해 약 30분에 걸쳐 첨가하면서, 용액을 빠른 속도로 교반하였다. 온도를 모니터링하면서, 포트 온도가 27℃에 도달했을 때에 반응물을 빙욕으로 냉각시켰다. 투명한 용액을 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 GC로 분석하였다(5방울의 반응 혼합물을 1 ml의 에탄올로 희석하고 하기 수행 조건을 갖는 15 m DB-5 모세관 GC 컬럼으로 주입하였다: 주입기 250℃, 검출기: 250℃, 초기 오븐 온도 28℃, 1분당 10℃씩 가열하여 250℃까지 가열.) 3% 미만의 모르폴린이 남아 있을 때반응을 완결시켰다. 반응물을 50℃에서 풀 하우스(full house) 진공으로 회전증발시켜, 더 이상의 증류액이 축합될 수 없을 때까지 농축시켰다. 생성된 오일을 실온에서 24-48시간 동안 보관하거나, 또는 상당한 양의 결정이 관찰될 때까지 보관하였다(시딩하는 경우에 공정이 가속될 것이다). 슬러리를 250 ml의 아세톤으로 희석하고 여과하였다. 진공 오븐에서 고체를 60℃에서 18-24시간 동안 건조시켜, 84 g의 결정 생성물을 수득하였다. 모액을 농축하여, 회수를 증가시키기 위해 결정화 공정을 반복하여 회수를 증가시킬 수 있다.

1-아미노-3-(4-모폴리닐)-2-프로판올(라세미체)의 합성

자기 교반 막대가 있는 3 L 용량의 1-구 환저 플라스크에 2-하이드록시-7-옥사-4-아조니아스피로[3.5]노난 클로라이드(150 g, 835 mmole)을 첨가한 후, 메탄올(2120 ml) 중의 23 중량%의 무수 암모니아를 첨가하였다. 플라스크를 마개로 막고 생성된 투명한 용액을 20-23℃에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 조건 하의 GC 수행 결과 잔존 출발 물질이 발견되지 않았다. 마개를 제거하고 용액에 암모니아를 30분간 폭기시켰다. 그 후, 플라스크를 이동하여 45℃ 욕 및 풀 하우스 진공을 이용하여 회전증발시키고 농축시켜 백색 고체를 수득하였다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 3.57 (dd, 2H), 3.3-3.5 (m, 6H), 2.59 (m, 2H), 2.2-2.4 (m, 6H);¹³C NMR (100 MHz DMSO-d ₆) δ 70.8, 67.1, 60.1, 53.8, 48.1.

2-(RS)-1-아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올을 하기한 바와 같이 제조된 2-(S)-1-아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올로 대체한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3에 기술된 방법에 따라 원하는 화합물인 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-(S)-하이드록시-3-모르폴린-4-일-프로필)-아미드를 수득하였다.

1-아미노-3-(4-모폴리닐)-2-프로판올(비라세미체)의 합성

기계적 교반기, 열전쌍 및 첨가 깔대기가 장치된 1 L 용량의 3-구 환저 플라스크에 모르폴린(91.5 g, 91.5 ml, 1.05 mole, 1.0 당량) 및 45 ml의 t-부탄올을 채웠다. R-에피클로로하이드린(100 g, 84.5 ml, 1.08 mole, 1.03 당량)을 첨가 깔대기를 통해 약 30분에 걸쳐 첨가하면서, 용액을 빠른 속도로 교반하였다. 온도를 모니터링하면서, 포트 온도가 27℃에 도달했을 때에 반응물을 빙욕으로 냉각시켰다. 투명한 용액을 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 GC로 분석하였다(5방울의 반응 혼합물을 1 ml의 에탄올로 희석하고 하기 수행 조건을 갖는 15 m DB-5 모세GC 컬럼으로 주입하였다: 주입기: 250℃, 검출기: 250℃, 초기 오븐 온도: 28℃, 1분당 10℃씩 가열하여 250℃까지 가열.) 3% 미만의 모르폴린이 남아 있을 때 반응을 완결시켰다. 용액을 10℃로 냉각시키고, 15℃ 미만의 온도를 유지하면서 THF 중의 칼륨 t-부톡사이드(576 g)의 20 중량% 용액을 적가하였다. 생성된 백색 슬러리를 10-15℃에서 2시간 교반하고, 상기 조건을 이용하여 GC로 검사하였다. 클로로하이드린이 관찰되지 않았다. 혼합물을 50℃ 욕 및 풀 하우스 진공을 이용하여 회전증발시키고 농축시켰다. 생성된 혼합물을 물(500 ml) 및 염화 메틸렌으로 희석하였다. 상을 분리하고 수성상을 염화 메틸렌(500 ml)으로 세척하였다. 모은 유기층을 황산 나트륨 상에서 건조시키고 농축시켜 투명한, 무색 오일로서, 145 g, 97% 수율의 에폭사이드를 수득하였다.

자기 교반 막대가 있는 3 L 용량의 1-구 환저 플라스크에 상기 조질 에폭사이드를 채웠다. 메탄올 중의 무수 암모니아(24% w/w 2.5L)을 첨가하고, 플라스크를 마개로 막고 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 조건 하의 GC 수행 결과 잔존 출발 물질이 발견되지 않았다. 마개를 제거하고 용액에 암모니아를 30분간 폭기시켰다. 그 후, 플라스크를 이동하여 45℃ 욕 및 풀 하우스 진공을 이용하여 회전증발시키고 농축시켜 투명한 무색 오일로서 124 g의 생성물을 수득하였다.

1-아미노-3-(4-모폴리닐)-2-(S)-프로판올의 합성

기계적 교반기, 열전쌍 및 첨가 깔대기가 장치된 1 L 용량의 3-구 환저 플라스크에 모르폴린(91.5 g, 91.5 ml, 1.05 mole, 1.0 당량) 및 200 ml의 메탄올을 채웠다. R-에피클로로하이드린(100 g, 84.5 ml, 1.08 mole, 1.03 당량)을 첨가 깔대기를 통해 약 30분에 걸쳐 첨가하면서, 용액을 빠른 속도로 교반하였다. 온도를 모니터링하면서, 포트 온도가 27℃에 도달했을 때에 반응물을 빙욕으로 냉각시켰다. 투명한 용액을 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 GC로 분석하였다(5방울의 반응 혼합물을 1 ml의 에탄올에 넣어 희석하고 하기 수행 조건을 갖는 15 m DB-5 모세 GC 컬럼으로 주입하였다: 주입기: 250℃, 검출기: 250℃, 초기 오븐 온도 28℃, 1분당 10℃씩 가열하여 250℃까지 가열.) 3% 미만의 모르폴린이 남아 있을 때 반응을 완결시켰다. 용액을 10℃로 냉각시키고, 15℃ 미만의 온도를 유지하면서 메탄올 중의 나트륨 메톡사이드의 25 중량% 용액(233 g, 1.08 mole, 247 ml)을 적가하였다. 생성된 백색 슬러리를 10-15℃에서 2시간 교반하고, 상기 조건을 이용하여 GC로 검사하였다. 클로로하이드린이 관찰되지 않았다. 혼합물을 50℃ 욕 및 풀 하우스 진공을 이용하여 회전증발시키고 농축시켰다. 생성된 혼합물을 물(500 ml) 및 염화 메틸렌으로 희석하였다. 상을 분리하고 수성상을 염화 메틸렌(500ml)으로 세척하였다. 모은 유기층을 황산 나트륨 상에서 건조시키고 농축시켜 투명한, 무색 오일로서, 145 g, 97% 수율의 1,2-에폭시-3-모르폴린-4-일프로판을 수득하였다.

자기 교반 막대가 있는 3 L 용량의 1-구 환저 플라스크에 상기 조질 1,2-에폭시-3-모르폴린-4-일프로판을 채웠다. 메탄올 중의 무수 암모니아(24% w/w 2.5L)를 첨가하고, 플라스크를 마개로 막고 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 조건 하의 GC 수행 결과 잔존 출발 물질이 발견되지 않았다. 마개를 제거하고 용액에 암모니아를 30분간 폭기시켰다. 그 후, 플라스크를 이동하여 45℃ 욕 및 풀 하우스 진공을 이용하여 회전증발시키고 농축시켜 투명한 무색 오일로서, 124 g의 1-아미노-3-(4-모폴리닐)-2-(S)-프로판올을 수득하였다.

이미다졸 아미드(7.0 g, 32.3 mmol), 아민(15.0 g, 64.6 mmol), 5-플루오로옥신돌(4.93 g, 32.6 mmol), 트리에틸아민(9.79 g, 96.9 mmol) 및 THF(88 ml)을 혼합하고 60℃로 가열하였다. 갈색 용액이 형성되었다. 60℃에서 24시간 동안 교반 후, 황색 슬러리를 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 압분체를 80 ml의 THF로 세척하고 50℃에서 하룻밤동안 하우스 진공하에서 건조시켰다. 갈색 고체(23.2 g)를 수득하였다. 그 고체를 실온에서 5시간 동안 350 ml의 물 중에서 슬러리화시키고 여과시켰다. 압분체를 100 ml의 물로 세척하고 50℃에서 하룻밤동안 하우스 진공하에서 건조시켰다. 8.31 g을 수득하였고, 화학적 수율은 56%이다.

온도계, 응축기, 자기 교반기, 및 질소 주입구가 장치된 0.25 L 용량의 플라스크에 4.92 g의 5-플루오로옥신돌, 7.0 g의 이미다졸 아미드, 15.5 g의 (R)-1-아미노-3-(4-모폴리닐)-2-프로판올, 9.78 g의 트리에틸아민 및 88ml의 테트라하이드로푸란을 채웠다. 반응 혼합물을 16.5 시간 동안 60℃로 가열하였다. 반응물을 주변 온도로 냉각시키고 여과시켰다. 수득된 고체를 11 ml/g으로 아세토니트릴 중에서 3 회 연속으로 슬러리화하고, 진공에서 건조시켜 3.6 g(25.25%)을 수득하였다. [HPLC, 하이퍼실 BDS, C-18, 5μ, (6:4), 아세토니트릴: 0.1M 염화 암모늄,PHA-571437 = 4.05 분.]

실시예 4

2,4-디메틸-5-[2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-모르폴린-4-일-프로필)-아미드의 합성

5-(2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(113 mg, 0.4 mmol)을 1-아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올(74 mg, 0.48 mmol)과 축합시켜 2,4-디메틸-5-[2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-모르폴린-4일-프로필)-아미드(77 mg, 45.3%)를 침전시켰다.

실시예 5

5-[5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴-메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-모르폴린-4일-프로필)-아미드의 합성

5-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(126.6 mg, 0.4 mmol)을 1-아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올(74 mg, 0.48 mmol)과 축합시켜 5-[5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-모르폴린-4일-프로필)-아미드(107 mg, 58%)를 침전시켰다.

R 및 S 입체이성질체를 다음과 같이 제조할 수 있다.

이미다졸 아미드(7.0 g, 32.3 mmol), 아민(15.5 g, 96.9 mmol), 5-클로로옥신돌(5.48 g, 32.6 mmol), 트리에틸아민(14 ml) 및 THF(88 ml)을 혼합하고 60℃로 가열하였다. 적색 용액이 형성되었다. 60℃에서 16시간 동안 교반 후, 황색 슬러리를 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 압분체를 50 ml의 THF로 2회 세척하고 50℃에서 하룻밤동안 하우스 진공하에서 건조시켰다. 29%의 화학적 수율로 4.36 g을 수득하였다.

이미다졸 아미드(6.8 g, 31.3 mmol), 아민(10.0 g, 62.5 mmol), 5-클로로옥신돌(5.3 g, 31.6 mmol) 및 THF(100 ml)를 혼합하고 60℃로 가열하였다. 적색 용액이 형성되었다. 60℃에서 68시간 동안 교반 후, 트리에틸아민(14ml)을 첨가하고 60℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응은 완결되지 않았다. 4.6 g의 아민 측쇄(side chain)를 첨가하고, 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 황색 슬러리를 실온으로 냉각시키고 여과하였다. 압분체를 50 ml의 THF로 2회 세척하고 50℃에서 하룻밤동안 하우스 진공하에서 건조시켰다. 38%의 화학적 수율로 5.48 g을 수득하였다.

실시예 6

5-[5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-모르폴린-4-일-프로필)-아미드의 합성

5-(5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(72.2 mg, 0.2 mmol)을 1-아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올(38 mg, 0.24 mmol)과 축합시켜 5-[5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-모르폴린-4-일-프로필)-아미드(55 mg, 55%)를 침전시켰다.

실시예 7

2,4-디메틸-5-[2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴-메틸]-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-[1,2,3]트리아졸-1-일-프로필)-아미드의 합성

단계 1

에탄올(50mL) 중의 3-[1,2,3]트리아졸(2.0 g, 29 mmol), 에피클로로하이드린(3.4 ml, 43.5 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.6 mL, 15 mmol)의 혼합물을 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 플래시 크로마토그래피(CH₂Cl₂/CH₃OH=100/1-100/2-100/4)로 정제하여 1-클로로-3-(1,2,3)트리아졸-2-일프로판-2-올(2.1 g, 45%)을 수득하였다.

단계 2

60℃에서 하룻밤동안 밀봉된 가압 용기에서 1-클로로-3-(1,2,3)트리아졸-1-일프로판-2-올(2.3 g, 13 mmol)을 메탄올 중의 NH₃용액(25 중량%, 20 mL)으로 처리하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 질소를 반응 혼합물로 폭기시켜 암모니아를 제거하였다. 용매를 증발시켜 1-아미노-3-(1,2,3)트리아졸-1-일-프로판-2-올(2.57 g, 100%)을 수득하였다.

단계 3

5-(2-옥소--1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(113 mg, 0.4 mmol)을 1-아미노-3-(1,2,3)트리아졸-1-일-프로판-2-올(85 mg, 0.48 mmol)과 축합시켜 2,4-디메틸-5-[2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-[1,2,3]트리아졸-1-일-프로필)-아미드(70 mg, 41%)를 수득하였다.

실시예 8

5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴-메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-[1,2,3]트리아졸-1-일-프로필)-아미드의 합성

5-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(120 mg, 0.4 mmol)을 1-아미노-3-(1,2,3)트리아졸-1-일-프로판-2-올(85 mg, 0.48 mmol)과 축합시켜 5-[5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-[1,2,3]트리아졸-1-일-프로필)-아미드(100 mg, 62%)를 수득하였다.

실시예 9

5-[5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-[1,2,3]트리아졸-1-일-프로필)-아미드의 합성

5-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(126.6 mg, 0.4 mmol)을 1-아미노-3-(1,2,3)트리아졸-1-일-프로판-2-올(85 mg, 0.48 mmol)과 축합시켜 5-[5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-[1,2,3]트리아졸-1-일-프로필)-아미드(48 mg, 27%)를 수득하였다.

실시예 10

5-[5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-[1,2,3]트리아졸-1-일-프로필)-아미드의 합성

5-(5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(144.4 mg, 0.4 mmol)을 1-아미노-3-(1,2,3)트리아졸-1-일-프로판-2-올(85 g, 0.48 mmol)과 축합시켜 5-[5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-(3Z)-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-[1,2,3]트리아졸-1-일-프로필)-아미드(130 mg, 67%)를 수득하였다.

5-(5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산, 5-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산, 5-(2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산의 합성의 합성은 2001년 2월 14일자 본원과 동시에 출원된 출원인의 출원 제 09/783,264 호 "PYRROLE SUBSTITUTED 2-INDOLINONE --RPOTEIN KINASE INHIBITORS"에 기술되어 있고, 이 문헌의 개시내용은 그 전체가 본원에 인용되어 있다.

실시예 11

1-아미노-3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-프로판-2-올의 합성

H₂O(100 mL) 중의 옥손(36.0 g, 58.5 mmol) 용액을 HOCH₃(200 mL) 중의 티오모르폴린(5.0 g, 48.7 mmol) 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 40℃에서 48시간 동안 교반한 후, 0℃로 냉각시켰다. 수성 NaOH를 적가하여 pH=12로 조정하였다. 고체를 여과하여 제거하고 HOCH₃(40 mL)로 3회 세척하였다. 모은 용액을 농축시키고 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피(CHCl₃/CH₃OH/NH₃.H₂O=3/1/0.1-2/1/0.1)로정제하여 티오모르폴린 1,1-디옥사이드(6.2 g)을 93%의 수율로 수득하였다.

에탄올(50㎖) 및 H₂O(5㎖)의 혼합 용매중의 티오모르폴린-1,1-디옥사이드(2.5g, 18.5mmol)와 (R)-(-)에피클로로하이드린(1.55㎖, 20mmol)의 혼합물을 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 (R)-1-클로로-3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-프로판-2-올(4.0g, 96%)을 수득하였다.

(R)-1-클로로-3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-프로판-2-올(2.27g, 10mmol)을 50℃에서 12시간 동안 메탄올(25중량%, 20㎖)중의 NH₃용액으로 처리하였다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 물중의 음이온 교환 수지(AG1×8, OH 형태)로 처리하여 조질의 (S)-1-아미노-3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-프로판-2-올(2.0g)을 수득하였다. 이는 약 30%의 이량체로 오염되었고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 거의 정제될 수 없었다(MS(m/z) 209.2(M⁺¹)).(S)-1-아미노-3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-프로판-2-올과 옥신돌을 축합시켜 목적하는 인돌리논(정제 후의 수율: 50-80%)을 수득하였다.

(R)-5-(2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 [3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-2-하이드록시-프로필]-아미드

(R)-5-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 [3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-2-하이드록시-프로필]-아미드

(R)-5-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 [3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-2-하이드록시-프로필]-아미드

(R)-5-(5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 [3-(1,1-디옥소-λ⁶-티오모르폴린-4-일)-2-하이드록시-프로필]-아미드

실시예 12

(S) 또는 (R)-1-메틸아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올의 합성

에탄올(10㎖)중의 모르폴린(1.74㎖, 20mmol)과 (R)-에피클로로하이드린(1.56㎖, 20mmol)의 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 실온에서 14시간 동안 물(40중량%, 20㎖)중의 CH₃NH₂용액으로 처리하였다. 용매를 제거하여 조질의 (S)-1-메틸아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올을 수득하였으며, 이를 진공 증류 또는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다(2.4g. 70%).(R)-1-메틸아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올은 (S)-에피클로로하이드린으로부터 76%의 수율로 제조되었다.

5-플루오로옥신돌과 축합된 (S)-1-메틸아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올은 (R)-5-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 (2-하이드록시-3-모르폴린-4-일-프로필)-메틸-아미드를 제공하였다.

(R)-1-아미노-3-모르폴린-4-일-프로판-2-올은 (S)-5-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산(2-하이드록시-3-모르폴린-4-일-프로필)-메틸-아미드를 제공하였다.

실시예 13

아민 측쇄의 제조

3-(1-H-테트라졸-1-일)]-2-하이드록시-1-클로로프로판 및 3-(2-H-테트라졸-2-일)-2-하이드록시-1-클로로프로판

무수 아세토니트릴(30㎖)중의 테트라졸(100mmol) 6.905g, 디이소프로필에틸아민(10mmol) 1.75㎖ 및 에피클로로하이드린(150mmol) 11.73㎖를 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. 수득된 용액을 증발시키고, 고진공하에 건조시키고, 실리카의 컬럼상에서 클로로포름-메탄올 100:8로 정제하였다. 제 1 분획은 순수한 3-(2-H-테트라졸-2-일)-2-하이드록시-1-클로로프로판 6.215g(무색 오일, 수율: 38%)을 제공하고, 제 2 분획은 순수한 3-(1-H-테트라졸-1-일)]-2-하이드록실-1-클로로프로판(점성 고무; 수율: 57%) 9.208g을 제공하였다.

3-(1-H-테트라졸-1-일)-2-하이드록시-1-아미노프로판

3-(1-H-테트라졸-1-일)-2-하이드록시-1-클로로프로판 9.110g, 탄산칼륨 15g 및 포화 메탄올성 암모니아 130㎖를 21시간 동안 교반하고, 이어서 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카의 컬럼상에서 클로로포름-메탄올-수성 암모니아 80:35:4로 정제하였다. 수율: 백색 점성 고무 7.326g(91.5% th).

3-(2-H-테트라졸-2-일)-2-하이드록시-1-아미노프로판

3-(2-H-테트라졸-2-일)-2-하이드록시-1-클로로프로판 6.105g, 탄산칼륨 10g 및 포화 메탄올성 암모니아 95㎖를 21시간 동안 교반하고, 이어서 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카의 컬럼상에서 클로로포름-메탄올-수성 암모니아 60:25:2로 정제하였다. 수율: 백색 결정성 고체 3.726g(69.5% th).

3-[(2R,6S)-2,6-디메틸모르폴린-4-일]-2-하이드록시-1-아미노프로판

에피클로로하이드린(60mmol) 4.7㎖를 트리플루오로에탄올(5㎖)중의 시스-2,6-디메틸모르폴린(4.607g, 40mmol)의 빙냉 용액에 가하였다. 용액을 0 내지 5℃에서 1시간 동안 교반하고, 냉각 욕을 제거하고, 실온에서 추가의 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 고진공하에 증발시키고, 수득된 오일성 잔류물을 무수 에탄올(50㎖)에 용해시키고, 용액을 빙욕에서 냉각시키고, 고체 메톡시화나트륨(2.27 g)을 2회 분량으로 가하고, 혼합물을 0 내지 5℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고, 염을 에탄올(30㎖)로 세척하고, 모은 여액을 빙냉 농축 수성 암모니아(200㎖)에 가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하고, 이어서 고진공하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카의 컬럼상에서 클로로포름-메탄올-7M 메탄올성 암모니아 80:15:3의 혼합물로 정제하였다. 수율: 백색 결정성 흡습성 고체 5.75g(76.3% th).

(2S)-3-(3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2-하이드록시-1-클로로프로판 및 (2S)-3-(3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일)-2-하이드록시-1-아미노프로판

무수 아세토니트릴중의 3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘 3.423g, R 에피클로로하이드린(-)(99% e.e.) 3.60㎖ 및 바톤 염기(1.5mmol) 0.30㎖를 60℃에서 20시간 동안 교반하였다. 수득된 용액을 고진공하에 증발시키고, 실리카의 컬럼상에서 클로로포름-메탄올(메탄올의 5 내지 20% 구배)의 혼합물로 정제하여 백색 비결정성 고체로서 클로로-화합물(수율: 90%) 5.572g을 수득하였다. 염화물을 하기와 같이 아민으로 변형시켰다. 수득된 하이드록시-클로로 중간체를 메탄올성 암모니아(암모니아 기체로 포화됨)에 용해시키고, 탄산칼륨을 가하고, 혼합물을 밀폐된 플라스크에서 2와 1/2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 증발시켰다. 잔류물을 실리카 컬럼상에서 클로로포름-메탄올-진한 수성 암모니아 80:15:1.5의 혼합물로 정제하였다.

실시예 14

5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(2H-테트라아졸-2-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 22)(일반적인 방법)

3-(2-H-테트라졸-2-일)]-2-하이드록시-1-아미노프로판 72㎎을 무수 디메틸아세트아미드(1.5㎖)중 5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 1-옥시-7-아자벤즈트리아졸 에스테르[(3Z)-3-({3,3-디메틸-4-카복시-1-H-피롤-2-일}메틸렌)-5-플루오로-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(480㎎, 1.6mmol)을 HATU 시약(570㎎, 1.5mmol)으로 DMF(5㎖)중의 휴니그(Hunig) 염기(3.0mol, 0.525㎖)의 존재하에 활성화시키고 클로로포름(5㎖)으로 침전시켜 순수한 형태로 단리하고, 고진공하에 건조시켜 92%의 수율(579㎎)로 제조함](105㎎, 0.25mmol)의 슬러리에 가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 고진공하에 증발시켰다. 잔류물을 메탄올-디에틸아민 20:1의 혼합물(3㎖)에 현탁하고, 냉장고(5℃)에서 1시간 동안 결정화시키고, 여과하고, 침전물을 빙냉 메탄올로 세척하고, 고진공하에 건조시켰다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 106㎎.

실시예 15

5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(2H-테트라아졸-2-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 23)(일반적인 방법)

3-(2-H-테트라졸-2-일)]-2-하이드록시-1-아미노프로판 72㎎을 무수 디메틸아세트아미드(1.5㎖)중 5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 1-옥시-7-아자벤즈트리아졸 에스테르[(3Z)-3-([3,3-디메틸-4-카복시-1-H-피롤-2-일)메틸렌)-5-클로로-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(1.520g, 4.8mmol)을 HATU 시약(1.768g, 4.65mmol)으로 DMF(20㎖)중의 휴니그 염기(9.0mmol, 1.58㎖)의 존재하에 활성화시키고 클로로포름(20㎖)으로 침전시켜순수한 형태로 단리하고, 고진공하에 건조시켜 94%의 수율(1.907g)로 제조함](109㎎, 0.25mmol)의 슬러리에 가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 고진공하에 증발시켰다. 잔류물을 메탄올-디에틸아민 20:1의 혼합물(3㎖)에 현탁하고, 냉장고(5℃)에서 1시간 동안 결정화시키고, 여과하고, 침전물을 빙냉 메탄올로 세척하고, 고진공하에 건조시켰다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 109㎎.

실시예 16

N-[2-하이드록시-3-(2H-테트라아졸-2-일)프로필]-2,4-디메틸-5-[(Z)-[2-옥소-5-(트리플루오로메톡시)-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴]메틸]-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 24)(일반적인 방법)

3-(2-H-테트라아졸-2-일)-2-하이드록시-1-아미노프로판 72㎎을 무수 디메틸아세트아미드(1.5㎖)중 5-[(Z)-(5-트리플루오로메톡시-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 1-옥시-7-아자벤즈트리아졸 에스테르[(3Z)-3-((3,3-디메틸-4-카복시-1-H-피롤-2-일)메틸렌)-5-트리플루오로메톡시-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(1.768g, 4.8mmol)을 HATU 시약(1.758g, 4.8mmol)으로 DMF(25㎖)중의 휴니그 염기(9.0mmol, 1.58㎖)의 존재하에 활성화시키고, 증발시키고, 무수 아세토니트릴로 침전시켜 순수한 형태로 단리하고, 고진공하에 건조시켜 85.5%의 수율(1.929g)로 제조함](121.5㎎, 0.25mmol)의 슬러리에 가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 고진공하에 증발시켰다. 잔류물을 메탄올-디에틸아민 20:1의 혼합물(3㎖)에 현탁하고, 냉장고(5℃)에서 1시간 동안 결정화시키고, 여과하고, 침전물을 빙냉 메탄올로 세척하고, 고진공하에 건조시켰다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 113㎎.

실시예 17

5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(1H-테트라아졸-1-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 25)

이는 상응하는 아민 72㎎으로부터 실시예 14의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 113㎎.

실시예 18

5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(1H-테트라아졸-1-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 26)

이는 상응하는 아민 72㎎으로부터 실시예 15의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 122㎎.

실시예 19

N-[2-하이드록시-3-(1H-테트라아졸-1-일)프로필]-2,4-디메틸-5-[(Z)-[2-옥소-5-(트리플루오로메톡시)-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴]메틸]-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 27)

이는 상응하는 아민 72㎎으로부터 실시예 16의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 118㎎.

실시예 20

N-[3-[(2R,6S)-2,6-디메틸모르폴린-4-일]-2-하이드록시프로필]-5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 28)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 14의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 99㎎.

실시예 21

5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[3-[(2R,6S)-2,6-디메틸모르폴린-4-일]-2-하이드록시프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 29)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 15의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 101㎎.

실시예 22

N-[3-[(2R,6S)-2,6-디메틸모르폴린-4-일]-2-하이드록시프로필]-2,4-디메틸-5-[(Z)-[2-옥소-5-(트리플루오로메톡시)-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴]메틸]-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 30)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 16의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 89㎎.

실시예 23

5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[(2S)-2-하이드록시-3-(3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일)]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 34)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 14의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 109㎎.

실시예 24

5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[(2S)-2-하이드록시-3-(3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 36)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 15의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 107㎎.

실시예 25

N-[(2S)-2-하이드록시-3-(3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일)프로필]-2,4-디메틸-5-{(Z)-[2-옥소-5-(트리플루오로메톡시)-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴]메틸}-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 35)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 16의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 123㎎.

실시예 26

5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[(2R)-2-하이드록시-3-(3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 31)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 14의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 110㎎.

실시예 27

5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[(2R)-2-하이드록시-3-(3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 32)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 15의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 103㎎.

실시예 28

N-[(2R)-2-하이드록시-3-(3-메틸-2,5-디옥소이미다졸리딘-1-일)프로필]-2,4-디메틸-5-{(Z)-[2-옥소-5-(트리플루오로메톡시)-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴]메틸}-1H-피롤-3-카복스아미드(화합물 33)

이는 상응하는 아민 95㎎으로부터 실시예 16의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 120㎎.

실시예 29

5-포르밀-2-메틸-4-페닐-1H-피롤-3-카복실산 에틸 에스테르

DMF(4㎖, 3당량)를 교반하면서 빙욕에서 냉각시켰다. 여기에 POCl₃(1.1당량, 1.8㎖)을 가하였다. 30분 후, DMF(2M, 9㎖)중의 3,5-디메틸-4-에틸에스테르 피롤(4g, 17.4mmol)의 용액을 반응액에 가하고, 교반을 계속하였다. 10분 후, 반응 혼합물을 고형화시켰다. 이를 DMF 5㎖로 희석하고, 90℃ 오일욕에서 가열하였다. 1시간 후, 반응액을 실온까지 냉각시키고, 물(100㎖)로 희석하고, 1N NaOH를 사용하여 pH 11로 염기화시켰다. 생성물을 염화메틸렌(3×200㎖)내로 추출하고, 유기 층을 염수(200㎖)로 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 농축하여 갈색 고체로서 5-포르밀-2-메틸-4-페닐-1H-피롤-3-카복실산 에틸 에스테르 4.3g(95%)을 수득하였다.

5-포르밀-2-메틸-4-페닐-1H-피롤-3-카복실산

5-포르밀-2-메틸-4-페닐-1H-피롤-3-카복실산 에틸 에스테르를 교반하면서 물(100㎖) 및 메탄올(45㎖)에 용해시켰다. KOH(2당량, 1.9g)을 가하고, 100℃로 가열하였다. 2.5시간 후, 실온까지 냉각시키고, 잔류 에스테르를 에틸 아세테이트(200㎖)내로 추출함으로써 제거하고, 건조시키고, 농축하였다. 수층을 2N HCl을 사용하여 pH 3으로 산성화시켰다. 백색 고체를 여과에 의해 제거하고, 물로 세정하였다. 고체를 톨루엔으로부터 다시 농축하고, 헥산으로 연화하고, 건조시켜 회백색 고체 2g(52%)을 수득하였다.

5-포르밀-2-메틸-4-페닐-1H-피롤-3-카복실산 (3-디에틸아미노-2-하이드록시-프로필)-아미드

클로로포름(60㎖)중의 5-포르밀-2-메틸-4-페닐-1H-피롤-3-카복실산(1.0㎎, 4.36mmol), 1-아미노-3-디에틸아미노-2-프로파놀(950㎎, 6.54mmol), DDC(900㎎, 4.36mmol) 및 HOBt(884㎎, 6.54mmol)의 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응액을 포화 중탄산나트륨(60㎖)에 붓고, 여기에 1N NaOH(8㎖)를 가하였다. 이어서, 이를 EtOAc(3×100㎖)로 추출하고, 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고, 농축하여 5-포르밀-2-메틸-4-페닐-1H-피롤-3-카복실산 (3-디에틸아미노-2-하이드록시-프로필)-아미드 400㎎을 수득하였다.

실시예 30

화합물 11 내지 22의 합성 방법

각각의 옥신돌 0.36M 용액뿐만 아니라 각각의 알데하이드 0.576M 용액을 DMSO에서 제조하였다. 적합한 옥신돌 300㎕를 DMSO 200㎕의 존재하에 적합한 알데하이드 300㎕와 혼합하였다. 이어서, 디에틸렌트리아민 스캐빈저 수지 40㎎을 가하였다. 혼합물을 로빈스 블록(Robbins Block)에 넣고, 블록을 봉입하고, 60℃ 오븐에 넣고 18시간 동안 진탕하였다.

18시간 후, 로빈스 블록을 오븐으로부터 제거하고, 블록의 상부 봉입을 제거하고, DMSO 800㎕를 혼합물에 가하였다. 이어서, 블록을 다시 봉입하고, 다시 60℃ 오븐에 넣고 1시간 동안 계속해서 회전시켰다.

1시간이 지난 후, 로빈스 블록을 오븐으로부터 제거하고, 냉각시켰다. 로빈스 블록의 저부 봉입을 조심스럽게 제거하고, 새로 합성된 화합물이 수지로부터 여과 제거될 수 있도록 전체 블록을 여과 장치에 장착하였다.

실시예 31

3-[1-H-(7-아자벤즈트리아졸릴)-옥시]-2-하이드록시-1-아미노프로판

무수 클로로포름중의 1-하이드록시-7-아자벤즈트리아졸(30mmol) 4.083g, 디이소프로필아민(3mmol) 0.53㎖ 및 에피클로로하이드린 4.70㎖를 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실리카의 컬럼상에 붓고, 클로로포름-메탄올 100:3의 혼합물로 용출하였다. 수득된 하이드록시-클로로 중간체(4.83g, 연황색 오일, 수율: 70%)를 메탄올성 암모니아(100㎖, 암모니아 기체로 포화됨)에 용해시키고, 탄산칼륨 8.3g을 가하고, 혼합물을 밀폐된 플라스크에서 2와 1/2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 증발시켰다. 잔류물을 실리카 컬럼상에서 클로로포름-메탄올-농축 수성 암모니아 80:15:1.5의 혼합물로 정제하였다. 수율: 백색 결정성 고체 2.793g(63% th, 염화물로부터의 얻음)

3-[1-H-(벤즈트리아졸릴)-옥시]-2-하이드록시-1-클로로프로판 및 3-[1-H-(벤즈트리아졸릴-3-N-옥시도)]-2-하이드록시-1-클로로프로판

무수 클로로포름중의 하이드록시아자벤즈트리아졸(90mmol) 12.162g, 디이소프로필에틸아민(9mmol) 1.59㎖ 및 에피클로로하이드린(180mmol) 14.1㎖를 55℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 고진공하에 건조시키고, 이어서 실리카 컬럼상에서 클로로포름-메탄올 100:5의 혼합물로 정제하였다. 제 1 분획은 3-[1-H-(벤즈트리아졸릴)-옥시]-2-하이드록시-1-클로로프로판 10.570g(연황색 당밀, 수율: 51.5%)를 제공하고, 다음 분획은 3-[1-H-(벤즈트리아졸릴-3-N-옥시도)]-2-하이드록시-1-클로로프로판 9.990g을 제공하였다. 수율: 백색 결정성 고체 48.5%.

3-[1-H-(벤즈트리아졸릴-3-N-옥시도)]-2-하이드록시-1-아미노프로판

표제 화합물을 3-[1-H-(7-아자벤즈트리아졸릴)-옥시]-2-하이드록시-1-아미노프로판의 합성과 유사하게 3-[1-H-(벤즈트리아졸릴-3-N-옥시도)]-2-하이드록시-1-클로로프로판의 아미노분해에 의해 제조하였다.

실시예 32

5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(일반적인 방법)

3-[1-H-(7-아자벤즈트리아졸릴)-옥시]-2-하이드록시-1-아미노프로판 105㎎을 무수 디메틸아세트아미드(1.5㎖)중 5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 1-옥시-7-아자벤즈트리아졸 에스테르[(3Z)-3-({3,3-디메틸-4-카복시-1-H-피롤-2-일}메틸렌)-5-플루오로-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(480㎎, 1.6mmol)을 DMF(5㎖)중에서 활성화시키고, 클로로포름(5㎖)으로 침전시켜 순수한 형태로 단리하고, 고진공하에 건조시켜 92%의 수율(579㎎)로 제조함](105㎎, 0.25mmol)의 슬러리에 가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 고진공하에 증발시켰다. 잔류물을 메탄올-디에틸아민 20:1의 혼합물(3㎖)에 현탁하고, 냉장고(5℃)에서 1시간 동안 결정화시키고, 여과하고, 침전물을 빙냉 메탄올로 세척하고, 고진공하에 건조시켰다. 수율: 오렌지색 결정성 고체 121㎎.

실시예 33

5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(일반적인 방법)

3-[1-H-(7-아자벤즈트리아졸릴)-옥시]-2-하이드록시-1-아미노프로판(105mg)을 무수 디메틸아세트아미드(1.5㎖)중 5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 1-옥시-7-아자벤즈트리아졸 에스테르[(3Z)-3-({3,3-디메틸-4-카복시-1-H-피롤-2-일}메틸렌)-5-클로로-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(1.520g, 4.8 mmol)을 HATU 시약(1.768g, 4.65 mmol)으로 DMF(20㎖)중의 휴니그 염기(9.0 mmol, 1.58㎖)의 존재하에 활성화시키고 클로로포름(20㎖)으로 침전시켜 순수한 형태로 단리하고 고진공하에 건조시켜 94%의수율(1.907g)로 제조함](109mg, 0.25 mmol)의 슬러리에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고 고진공하에 증발시켰다. 잔류물을 메탄올-디에틸아민의 혼합물(20:1, 3㎖)중에 현탁시키고 냉장고(5℃)에서 1시간 동안 결정화하고 여과하고 침전물을 빙냉 메탄올로 세척하고 고진공하에 건조시켰다. 수율: 오렌지색 결정질 고체 130mg.

실시예 34

5-[(Z)-(5-트리플루오로메톡시-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드(일반적인 방법)

3-[1-H-(7-아자벤즈트리아졸릴)-옥시]-2-하이드록시-1-아미노프로판(105mg)을 무수 디메틸아세트아미드(1.5㎖)중 5-[(Z)-(5-트리플루오로메톡시-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복실산 1-옥시-7-아자벤즈트리아졸 에스테르[(3Z)-3-({3,3-디메틸-4-카복시-1-H-피롤-2-일}메틸렌)-5-트리플루오로메톡시-1,3-디하이드로-2H-인돌-2-온(1.768g, 4.8 mmol)을 HATU 시약(1.758g, 4.8 mmol)으로 DMF(25㎖)중의 휴니그 염기(9.0 mmol, 1.58㎖)의 존재하에 활성화시키고 무수 아세토니트릴로 증발시키고 침전시켜 순수한 형태로 단리하고 고진공하에 건조시켜 85.5%의 수율(1.929g)로 건조시켜 제조함](121.5mg, 0.25 mmol)의 슬러리에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고 고진공하에 증발시켰다. 잔류물을 메탄올-디에틸아민의 혼합물(20:1, 3㎖)중에 현탁시키고 냉장고(5℃)에서 1시간 동안 결정화하고 여과하고 침전물을 빙냉 메탄올로 세척하고 고진공하에 건조시켰다. 수율: 오렌지색 결정질 고체 142mg.

실시예 35

5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(3-옥시도-1H-1,2,3-벤조트리아졸-1-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드

본 화합물은 상응하는 아민(105mg)을 출발 물질로 사용하여 실시예 32의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정질 고체 120mg.

실시예 36

5-[(Z)-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-N-[2-하이드록시-3-(3-옥시도-1H-1,2,3-벤조트리아졸-1-일)프로필]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카복스아미드

본 화합물은 상응하는 아민(105mg)을 출발 물질로 사용하여 실시예 33의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정질 고체 127mg.

실시예 37

N-[2-하이드록시-3-(3-옥시도-1H-1,2,3-벤조트리아졸-1-일)프로필]-2,4-디메틸-5-[(Z)-[2-옥소-5-(트리플루오로메톡시)-1,2-디하이드로-3H-인돌-3-일리덴]메틸)-1H-피롤-3-카복스아미드

본 화합물은 상응하는 아민(105mg)을 출발 물질로 사용하여 실시예 34의 방법에 따라 제조되었다. 수율: 오렌지색 결정질 고체 141mg.

생화학적 실시예

하기 검정법은 목적 활성의 최적 정도를 입증하는 상기 화합물들을 발견하는데 이용된다.

A. 검정 방법

하기 검정법은 하나 이상의 PK에 대한 본 발명의 다양한 화합물의 활성 및 효과의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 유사한 검정법은 당해 분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 PK에 대한 동일 계열에 따라 설계될 수 있다.

본원에 기술된 일부 검정법들은 엘리사(ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay) 형식으로 수행된다(문헌[Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Manual of Clinical Immunology, 2d ed., Rose and Friedman, Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D. C., pp. 359-371] 참조). 일반적인 방법은 다음과 같다: 시험 키나제를 자연형 또는 재조합형으로 발현하는 세포에 화합물을 소정의 시간 동안 도입한 후, 시험 키나제가 수용체인 경우 수용체를 활성화하는 것으로 공지된 리간드를 첨가한다. 세포를 용해시키고 효소적 포스포릴화 반응의 기질을 인식하는 특정 항체로 이미 피복된 엘리사 플레이트의 웰에 용해물을 옮겼다. 세포 용해물의 비-기질 성분을 세척하여 제거하고, 시험 화합물과 접촉하지 않은 대조군 세포와 비교하여 포스포티로신을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 기질에 대한 포스포릴화의 양을 측정한다.

특정 PK에 대하여 엘리사 실험을 수행하기 위한 현재 바람직한 프로토콜은 하기에 제공된다. 그러나, 기타 RTK 뿐만 아니라 CTK 및 STK에 대한 화합물의 활성을 측정하기 위한 프로토콜의 채택은 당해 분야의 숙련자의 지식의 범위 내에 있다. 본원에 기술된 기타 검정법은 시험 키나제의 활성에 대한 반응으로 만들어진 DNA의 양을 측정하며, 증식성 반응의 일반적인 측정이다. 이러한 검정에 대한 일반적인 방법은 다음과 같다: 시험 키나제를 자연형 또는 재조합형으로 발현하는 세포에 화합물을 소정의 시간 동안 도입한 후, 시험 키나제가 수용체인 경우 수용체를 활성화하는 것으로 공지된 리간드를 첨가한다. 적어도 하룻밤 동안 항온처리한 후, 5-브로모데옥시우리딘(BrdU) 또는 H³-티미딘과 같은 DNA 표지 시약을 첨가한다. 표지 DNA의 양은 BrdU 항체를 사용하거나 방사능을 측정함으로써 검출되며, 시험 화합물과 접촉하지 않은 대조군 세포와 비교된다.

GST-FLK-1 생물검정법

본 검정법은 폴리(glu, tyr) 펩타이드에 대한 gST-Flkl의 티로신 키나제 활성을 분석한다.

물질 및 시약:

1. 코닝(Corning) 96웰 엘리사 플레이트(코닝 카탈로그 제 5805-96 호).

2. 폴리(glu, tyr) 4:1, 동결 건조물(시그마(Sigma) 카탈로그 # P0275).

3. 폴리(glu, tyr)(pEY) 피복된 분석 플레이트의 제조: 폴리(glu, tyr)(pEY)(2 ㎍/웰)를 PBS(100㎕)로 피복하고, 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 하룻밤 동안 유지한다. 증발을 방지하기 위해 플레이트를 잘 피복한다.

4. PBS 완충액: 1ℓ인 경우, 0.2g KH₂PO4, 1.15g Na₂HPO4, 0.2g KCl 및 8g NaCl을 약 900㎖ dH₂O 중에 혼합한다. 모든 시약이 용해되었을 때, HCl을 사용하여 pH를7.2로 조정한다. 총 부피가 1ℓ가 되도록 물로 채운다.

5. PBST 완충액: PBS 완충액(1ℓ)에 트윈(Tween)-20(1.0㎖)을 첨가한다.

6. TBB-차단 완충액: 1ℓ인 경우, 1.21g 트리스(TRIS), 8.77g NaCl 및 1㎖ 트윈-20을 약 900㎖ dH₂O중에 혼합한다. HCl을 사용하여 pH를 7.2로 조정한다. 10g BSA를 첨가하고 교반하여 용해시킨다. 총 부피가 1ℓ가 되도록 dH₂O로 채운다. 여과하여 미립 물질을 제거한다.

7. PBS중의 1% BSA: 작업 용액을 제조하기 위해, 10g BSA를 약 990㎖ PBS 완충액에 첨가하고 교반하여 용해시킨다. 총 부피가 1ℓ가 되도록 PBS 완충액으로 조정하고 여과하여 미립 물질을 제거한다.

8. 50mM 헤페스(Hepes) pH 7.5.

9. sf9 재조합형 바큘로바이러스 형질전환으로부터 정제된 GST-Flk1cd(수젠, 인크.(SUGEN, Inc.)).

10. dH₂O중의 4% DMSO.

11. dH₂O중의 10mM ATP.

12.40mM MnCl₂.

13. 키나제 희석 완충액(KDB): 10㎖ 헤페스(pH 7.5), 1㎖ 5M NaCl, 40㎕ 100mM 나트륨 오르토바나데이트 및 0.4㎖ 5% BSA를 dH₂O중에서 88.56㎖ dH₂O와 혼합한다.

14. NUNC 96웰 V자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트, 어플라이드 사이언티픽(AppliedScientific) 카탈로그 # AS-72092.

15. EDTA: 14.12g 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 약 70㎖ dH₂O와 혼합한다. EDTA가 용해될 때까지 10N NaOH를 첨가한다. 총 부피가 100㎖가 되도록 dH₂O를 채운다.

16. 1°항체 희석 완충액: PBS 완충액중의 10㎖ 5% BSA를 89.5㎖ TBST와 혼합한다.

17. 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 항-포스포티로신 단클론 항체(PY99 HRP, 산타 크루즈 바이오테크(Santa Cruz Biotech)).

18. 2,2'-아지노비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS 모스(Moss), 카탈로그 제 ABST 호).

19.10% SDS.

방법:

1. 물질 및 시약의 단계 3에 기재된 바와 같이, 96웰 엘리사 플레이트를 멸균 PBS중의 폴리EY 펩타이드(2㎍)로 피복한다.

2. 플레이트를 뒤집어 웰로부터 떨어지는 액체를 제거한다. TBST로 한번 세척한다. 종이 타월 상에서 플레이트를 가볍게 두드려 과량의 액체를 제거한다.

3. 각각의 웰에 PBS중의 1% BSA(100㎕)를 첨가한다. 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 항온처리 한다.

4. 단계 2를 반복한다.

5. 웰을 50mM 헤페스(pH 7.5)(150 ㎕/웰)로 적신다.

6. dH₂O/4% DMSO를 사용하여 96웰 폴리프로필렌 플레이트의 목적하는 최종 분석 농도의 4배로 시험 화합물을 희석한다.

7. 희석된 시험 화합물(25㎕)을 엘리사 플레이트에 첨가한다. 대조군 웰에서, dH₂O/4% DMSO(25㎕)를 넣는다.

8. 4×ATP(2μM)를 포함하는 40mM MnCl₂(25㎕)를 각각의 웰에 첨가한다.

9. 음성 대조군 웰에 0.5M EDTA(25㎕)를 첨가한다.

10. KDB를 사용하여 GST-Flk1을 0.005㎍(5ng)/웰으로 희석한다.

11. 각각의 웰에 희석된 효소(50㎕)를 첨가한다.

12. 진탕하면서 실온에서 15분 동안 항온처리한다.

13. 250mM EDTA(pH 8.0)(50㎕)를 첨가하여 반응을 정지시킨다.

14. TBST로 3회 세척하고 종이 타월 상에서 플레이트를 가볍게 두드려 과량의 액체를 제거한다.

15. 항체 희석 완충액중 항-포스포티로신 HRP 결합체의 1: 5,000 희석물을 웰 당 100㎕로 첨가한다. 진탕시키면서 실온에서 90분 동안 항온처리한다.

16. 단계 14에 기재된 바와 같이 세척한다.

17. 각각의 웰에 실온의 ABTS 용액(100㎕)을 첨가한다.

18. 진탕시키면서 10 내지 15분 동안 항온처리한다. 기포를 제거한다.

19. 각각의 웰에 10% SDS(20㎕)를 첨가하여 반응을 정지시킨다.

20. 410nM에서 시험 필터 및 630nM에서 기준 필터를 사용하여다이나테크(Dynatech) MR7000 엘리사 판독기 상에서 결과를 판독한다.

PYK2 생물검정법

본 검정법은 엘리사 분석에서 HA 항원 결정기-표지된 전체 길이 pyk2(FL.pyk2-HA)의 생체외 키나제 활성을 측정하는데 사용된다.

물질 및 시약:

1. 코닝 96웰 엘리사 플레이트.

2. 12CA5 단클론 항-HA 항체(수젠, 인크.).

3. PBS(둘베코(Dulbecco)의 포스페이트-완충된 생리식염수(깁코(Gibco) 카탈로그 # 450-1300EB).

4. TBST 완충액: 1ℓ인 경우, 8.766g NaCl, 6.057g TRIS 및 1㎖ 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 약 900㎖ dH₂O와 혼합한다. pH를 7.2로 조정하고 부피를 1ℓ로 맞춘다.

5. 차단 완충액: 1ℓ인 경우, 100g 10% BSA, 12.1g 100mM 트리스, 58.44g 1M NaCl 및 10㎖ 1% 트윈-20을 혼합한다.

6. sf9 세포 용해물로부터의 FL.pyk2-HA(수겐 인코포레이티드).

7. 밀리큐(MilliQue) H₂O중의 4% DMSO.

8. dH₂O중의 10mM ATP.

9. 1M MnCl₂.

10. 1M MgCl₂.

11. 1M 디티오트레이톨(DTT).

12. 10× 키나제 완충액 포스포릴화: 5.0㎖ 1M 헤페스(pH 7.5), 0.2㎖ 1M MnCl₂, 1.0㎖ 1M MgCl₂및 1.0㎖ 10% 트리톤 X-100을 2.8㎖ dH₂O중에서 혼합한다. 사용하기 전에 즉시 1M DTT(0.1㎖)를 첨가한다.

13. NUNC 96웰 V자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트.

14. dH₂O중의 500mM EDTA.

15. 항체 희석 완충액: 100㎖인 경우, 88㎖ TBS중의 1㎖ 5% BSA/PBS 및 1㎖ 10% 트윈-20.

16. HRP-결합된 항-Ptyr PY99(산타 크루즈 바이오테크 카탈로그 제 SC-7020 호).

17. ABTS 모스 카탈로그 제 ABST-2000 호.

18. 10% SDS.

방법:

1. 코닝 96 웰 엘리사 플레이트를 PBS(100㎕)중의 12CA5 항-HA 항체로 웰 당 0.5㎍으로 피복한다. 4℃에서 하룻밤 동안 저장한다.

2. 플레이트를 뒤집어 웰로부터 떨어지는 HA 항체를 제거한다. 플레이트를 dH₂O로 세척한다. 종이 타월 상에서 플레이트를 가볍게 두드려 과량의 액체를 제거한다.

3. 각각의 웰에 차단 완충액(150㎕)을 첨가한다. 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 항온처리한다.

4. 플레이트를 TBS-T로 4회 세척한다.

5. 용해물을 PBS(1.5㎍ 용해물/100㎕ PBS)로 희석한다.

6. 각각의 웰에 희석된 용해물(100㎕)을 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 진탕시킨다.

7. 단계 4에 기재된 바와 같이 세척한다.

8. 포획된 pyk2-HA를 포함하는 엘리사 플레이트에 2× 키나제 완충액(50㎕)을 첨가한다.

9. 4% DMSO중의 400μM 시험 화합물(25㎕)을 각각의 웰에 첨가한다. 대조군 웰의 경우, 1% DMSO만을 사용한다.

10. 0.5M EDTA(25㎕)를 음성 대조군 웰에 첨가한다.

11. 20μM ATP(25㎕)를 모든 웰에 첨가한다.

12. 25mM EDTA(pH 8.0)(25㎕)를 모든 웰에 첨가하여 반응을 정지시킨다.

13. 단계 4에 기재된 바와 같이 세척한다.

14. 항체 희석 완충액중의 HRP 결합된 항-Ptyr의 1:6000 희석물(100㎕)을 각각의 웰에 첨가한다. 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.

15. 플레이트를 TBST로 3회 및 PBS로 1회 세척한다.

16. ABST 용액(100㎕)을 각각의 웰에 첨가한다.

17. 필요에 따라, 10% SDS(20㎕)를 각각의 웰에 첨가하여 진행 반응을 정지시킨다.

18. 410nM에서 시험 필터 및 630nM에서 기준 필터를 사용하여 엘리사 판독기 상에서 플레이트를 판독한다.

FGFR1 생물검정법

본 검정법은 엘리사 분석에서 FGF1-R의 생체외 키나제 활성을 측정하는데 사용된다.

물질 및 시약:

1. 코스타(Costar) 96웰 엘리사 플레이트(코닝 카탈로그 # 3369).

2. 폴리(Glu-Tyr)(시그마 카탈로그 # P0275).

3. PBS(깁코 카탈로그 # 450-1300EB).

4. 50mM 헤페스 완충 용액.

5. 차단 완충액(5% BSA/PBS).

6. 정제된 GST-FGFR1(수젠, 인크.).

7. 키나제 희석 완충액: 500㎕ 1M 헤페스(깁코), 20㎕ 5% BSA/PBS, 10㎕ 100mM 나트륨 오르토바나데이트 및 50㎕ 5M NaCl을 혼합한다.

8. 1OmM ATP.

9. ATP/MnCl₂포스포릴화 혼합물: 20㎕ ATP, 400㎕ 1M MnCl₂및 9.56㎖ dH₂O를 혼합한다.

10. NUNC 96웰 V자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트(어플라이드 사이언티픽 카탈로그 # AS-72092).

11. 0.5M EDTA.

12. 0.05% TBST: 트윈(500㎕)을 TBS(1ℓ)에 첨가한다.

13. 토끼 다클론 항-포스포티로신 혈청(수젠, 인크.).

14. 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 접합체(바이오소스(Biosource) 카탈로그 # ALI0404).

15. ABTS 용액.

16. ABTS/H₂O₂용액.

방법:

1. 코스타 96 웰 엘리사 플레이트를 PBS(100㎕)중의 폴리(Glu, Tyr)로 웰 당 1㎍으로 피복한다. 4℃에서 하룻밤 동안 저장한다.

2. 피복된 플레이트를 PBS로 한번 세척한다.

3. 5% BSA/PBS 차단 완충액(150㎕)을 각각의 웰에 첨가한다. 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.

4. 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, 50mM 헤페스로 한번 세척한다. 플레이트를 종이 타월 상에서 가볍게 두드려 과량의 액체 및 기포를 제거한다.

5. 4% DMSO중의 0.4mM 시험 화합물(25㎕) 또는 DMSO 단독(대조군)을 플레이트에 첨가한다.

6. 정제된 GST-FGFR1을 키나제 희석 완충액(5ng 키나제/50㎕ KDB/웰)으로 희석한다.

7. 희석된 키나제(50㎕)를 각각의 웰에 첨가한다.

8. 새로이 제조된 ATP/Mn++(0.4㎖ 1M MnCl₂, 40㎕ 10mM ATP 및 9.56㎖ dH₂O)(25㎕/웰)를 첨가하여 키나제 반응을 개시한다.

9. 이는 신속한 키나제 반응이며, ATP 첨가와 유사한 방법으로 0.5M EDTA(25㎕)으로 정지되어야 한다.

10. 플레이트를 새로운 TBST로 세척한다.

11. 항체 희석 완충액을 제조한다: 50㎖인 경우, 5㎖ 5% BSA, 250㎕ 5% 우유 및 50㎕ 100mM 나트륨 바나데이트를 혼합하고 최종 부피를 0.05% TBST로 채운다.

12. 항-포스포티로신(ADB중의 1:10000 희석물)을 웰 당 100㎕로 첨가한다. 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.

13. 단계 10에 기재된 바와 같이 세척한다.

14. 바이오소스 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 접합체(ADB중의 1:6000 희석물)를 웰 당 100㎕로 첨가한다. 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.

15. 단계 10에 기재된 바와 같이 세척한 후, PBS로 세척하여 기포 및 과량의 트윈을 제거한다.

16. ABTS/H₂O₂용액(100㎕)을 각각의 웰에 첨가한다.

17. 진탕시키면서 10 내지 20분 동안 항온처리한다. 기포를 제거한다.

18. 다이나테크 MR7000 엘리사 판독기 상에서 분석을 판독한다: 410nM에서 시험 필터 및 630nM에서 기준 필터.

EGFR 생물검정법

물질 및 시약:

1. 코닝 96웰 엘리사 플레이트.

2. SUMO 1 단클론 항-EGFR 항체(수젠, 인크.).

3. PBS.

4. TBST 완충액.

5. 차단 완충액: 100㎖인 경우, 카네이션 인스턴트 넌-패트 밀크(Carnation

Instant Non-fat Milk, 등록상표)(5.0g)를 PBS(100㎖)와 혼합한다.

6. A431 세포 용해물(수젠, 인크.).

7. TBS 온충액.

8. TBS + 10% DMSO: 1ℓ인 경우, 1.514g 트리스, 2.192g NaCl 및 25㎖ DMSO를 혼합하고 총 부피가 1ℓ가 되도록 dH₂O로 채운다.

9. ATP(말 근육으로부터의 아데노신-5'-트리포스페이트, 시그마 카탈로그 제 A-5394 호), dH₂O중의 1.0mM 용액. 이 시약은 사용하기 전에 즉시 제조되고 얼음 상에서 유지되어야 한다.

10. 1.0mM MnCl₂.

11. ATP/MnCl₂포스포릴화 혼합물: 10㎖인 경우, 300㎕ 1mM ATP, 500㎕ MnCl₂및9.2㎖ dH₂O를 혼합한다. 사용하기 전에 즉시 제조하고 얼음 상에 유지한다.

12. NUNC 96웰 V자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트.

13. EDTA.

14. 토끼 다클론 항-포스포티로신 혈청(수젠, 인크.).

15. 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 접합체(바이오소스 카탈로그 제 ALI0404 호).

16. ABTS.

17. 30% 과산화수소.

18. ABTS/H₂O₂.

19. 0.2M HCl.

방법:

1. 코닝 96웰 엘리사 플레이트를 웰 당 PBS(100㎕)중의 SUMO 1(0.5㎍)로 피복하고, 4℃에서 하룻밤 동안 저장한다.

2. 플레이트를 뒤집어 웰로부터 떨어지는 SUMO 1을 제거하여 액체를 제거한다. dH₂O로 1회 세척한다. 플레이트를 종이 타월 상에서 가볍게 두드려 과량의 액체를 제거한다.

3. 차단 완충액(150㎕)을 각각의 웰에 첨가한다. 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 항온처리한다.

4. 플레이트를 탈이온수로 3회 세척한 후 TBST로 1회 세척한다. 플레이트를 종이 타월 상에서 가볍게 두드려 과량의 액체 및 기포를 제거한다.

5. 용해물을 PBS로 희석한다(7㎍ 용해물/100㎕ PBS).

6. 희석된 용해물(100㎕)을 각각의 웰에 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 진탕시킨다.

7. 상기 4에 기재된 바와 같이 플레이트를 세척한다.

8. 포획된 EGFR을 함유하는 엘리사 플레이트에 TBS(120㎕)를 첨가한다.

9. TBS를 사용하여 시험 화합물을 1:10으로 희석하고 웰에 넣는다.

10. 희석된 시험 화합물(13.5㎕)을 엘리사 플레이트에 첨가한다. 10% DMSO중의 TBS(13.5㎕)를 대조군 웰에 첨가한다.

11. 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 항온처리한다.

12. 음성 대조군 웰을 제외하고는 모든 웰에 포스포릴화 혼합물(15㎕)을 첨가한다. 웰의 최종 부피는 각각의 웰에서 3μM ATP/5mM MnCl₂최종 농도로 약 150㎕이어야 한다. 진탕시키면서 5분 동안 항온처리한다.

13. 진탕시키면서 EDTA 용액(16.5㎕)을 첨가하여 반응을 정지시킨다. 1분 동안 추가로 진탕시킨다.

14. 탈이온수로 4회 세척한 후 TBST로 2회 세척한다.

15. 항-포스포티로신(TBST중의 1:3000 희석물)(100㎕)을 웰 당 첨가한다. 진탕시키면서 실온에서 30 내지 45분 동안 항온처리한다.

16. 상기 4에 기재된 바와 같이 세척한다.

17. 바이오소스 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 접합체(100㎕)(TBST중의 1:2000 희석물)를 각각의 웰에 첨가한다. 실온에서 30분 동안 진탕시키면서 항온처리한다.

18. 상기 4에 기재된 바와 같이 세척한다.

19. ABTS/H₂O₂용액(100㎕)을 각각의 웰에 첨가한다.

20. 진탕시키면서 4 내지 10분 동안 항온처리한다. 기포를 제거한다.

21. 필요에 따라, 웰 당 0.2M HCl(100㎕)을 첨가하여 반응을 정지시킨다.

22. 다이나테크 MR7000 엘리사 판독기 상에서 분석을 판독한다: 410nM에서 시험 필터 및 630nM에서 기준 필터.

PDGFR 생물검정법

물질 및 시약:

1. 코닝 96웰 엘리사 플레이트.

2. 28D4C10 단클론 항-PDGFR 항체(수젠, 인크.).

3. PBS.

4. TBST 완충액.

5. 차단 완충액(EGFR 생물검정법에서 기재된 바와 동일).

6. PDGFR-P 발현 NIH 3T3 세포 용해물(수젠, 인크.).

7. TBS 완충액.

8. TBS + 10% DMSO.

9. ATP.

10. MnCl₂.

11. 키나제 완충액 포스포릴화 혼합물: 10㎖인 경우, 250㎕ 1M 트리스, 200㎕ 5M NaCl, 100㎕ 1M MnCl₂및 50㎕ 100mM 트리톤 X-100을 혼합하여 총분한 dH₂O로 10㎖되도록 제조한다.

12. NUNC 96웰 V자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트.

13. EDTA.

14. 토끼 다클론 항-포스포티로신 혈청(수젠, 인크.).

16. ABTS.

17. 30% 과산화수소 용액.

18. ABTS/H₂O₂.

19. 0.2M HCl.

방법:

1. 코닝 96 웰 엘리사 플레이트를 웰 당 PBS(100㎕)중의 28D4C10(0.5㎍)으로 피복하고 4℃에서 하룻밤 동안 저장한다.

2. 플레이트를 뒤집어 웰로부터 떨어지는 28D4C10을 제거하여 액체를 제거한다. dH₂O로 1회 세척한다. 플레이트를 종이 타월 상에서 가볍게 두드려 과량의 액체를 제거한다.

5. 용해물을 HNTG로 희석한다(10㎍ 용해물/100㎕ HNTG).

6. 희석된 용해물(100㎕)을 각각의 웰에 첨가한다. 실온에서 60분 동안 진탕시킨다.

7. 단계 4에 기재된 바와 같이 플레이트를 세척한다.

8. 포획된 PDGFR을 함유하는 엘리사 플레이트에 작업 키나제 완충액 혼합물(80㎕)을 첨가한다.

9. 96웰 폴리프로필렌 플레이트에서 TBS를 사용하여 시험 화합물을 1:10으로 희석한다.

10. 희석된 시험 화합물(10㎕)을 엘리사 플레이트에 첨가한다. TBS + 10% DMSO(10㎕)를 대조군 웰에 첨가한다. 실온에서 30분 동안 진탕시키면서 항온처리한다.

11. 음성 대조군 웰을 제외하고는 ATP(10㎕)를 모든 웰에 직접 첨가한다(웰의 최종 부피가 각각의 웰에서 20μM ATP로 약 100㎕이 되어야 한다). 진탕시키면서 30분 동안 항온처리한다.

12. EDTA 용액(10㎕)을 각각의 웰에 첨가하여 반응을 정지시킨다.

13. 탈이온수로 4회 세척한 후 TBST로 2회 세척한다.

14. 웰 당 항-포스포티로신(TBST중의 1:3000 희석물)(100㎕)을 첨가한다. 실온에서 30 내지 45분 동안 진탕시키면서 항온처리한다.

15. 단계 4에 기재된 바와 같이 세척한다.

16. 바이오소스 염소 항-토끼 IgG 퍼옥시다제 접합체(TBST중의 1:2000 희석물)(100㎕)를 각각의 웰에 첨가한다. 실온에서 30분 동안 진탕시키면서 항온처리한다.

17. 단계 4에 기재된 바와 같이 세척한다.

18. ABTS/H₂O₂용액(100㎕)을 각각의 웰에 첨가한다.

19. 진탕시키면서 10 내지 30분 동안 항온처리한다. 기포를 제거한다.

20. 필요에 따라, 웰 당 0.2M HCl(100㎕)을 첨가하여 반응을 정지시킨다.

21. 410nM에서 시험 필터 및 630nM에서 기준 필터를 사용하여 다이나테크 MR7000 엘리사 판독기 상에서 검정을 판독한다.

세포 HER-2 키나제 검정법

본 검정법은 엘리사 형식에서 완전한 세포에 대한 HER-2 키나제 활성을 측정하는데 사용된다.

물질 및 시약:

1. DMEM(깁코 카탈로그 # 11965-092).

2. 56℃에서 30분 동안 수욕에서 열-비활성화된 소태아 혈청(FBS, 깁코 카탈로그 # 16000-044).

3. 트립신(깁코 카탈로그 # 25200-056).

4. L-글루타민(깁코 카탈로그 # 25030-081).

5. 헤페스(깁코 카탈로그 # 15630-080).

6. 성장 배지: 500㎖ DMEM, 55㎖ 열-비활성화된 FBS, 10㎖

헤페스 및 5.5㎖ L-글루타민을 혼합한다.

7. 스타브(starve) 배지: 500㎖ DMEM, 2.5㎖ 열-비활성화된 FBS, 10㎖

헤페스 및 5.5㎖ L-글루타민을 혼합한다.

8. PBS.

9. 평바닥 96웰 조직 배양 마이크로역가 플레이트(코닝 카탈로그 # 25860).

10. 15cm 조직 배양 접시(코닝 카탈로그 # 08757148).

11. 코닝 96웰 엘리사 플레이트.

12. NUNC 96웰 V자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트.

13. 트랜스타(Transtar) 96용 코스타 운반 카트리지(코스타 카탈로그 # 7610).

14. SUMO 1: 단클론 항-EGFR 항체(수젠, 인크.).

15. TBST 완충액.

16. 차단 완충액 : PBS중의 5% 카네이션 인스턴트 밀크(등록상표).

17. EGF 리간드: EGF-201(신코 아메리칸 제팬(Shinko American, Japan)). 분말을 1OmM HCl(100㎕)중에 현탁시킨다. 10mM NaOH(100㎕)를 첨가한다. PBS(800㎕)를 첨가하고 에펜도르프 튜브로 옮기고 사용하기 직전까지 -20℃에서 저장한다.

18. HNTG 용해 완충액. 모액 5× HNTG인 경우, 23.83g 헤페스, 43.83g NaCl, 500㎖ 글리세롤 및 100㎖ 트리톤 X-100을 혼합하고 충분한 dH₂O가 1ℓ의 총 용액을 제조한다. 1×HNTG인 경우, 2㎖ HNTG, 100㎕ O.1M Na₃VO₄, 250㎕ 0.2M Na₄P₂0₇및 100㎕ EDTA를 혼합한다.

19. EDTA.

20. Na₃VO₄. 모 용액을 제조하기 위해, Na₃VO₄(1.84g)를 dH₂O(90㎖)를 혼합한다. pH를 10으로 조정한다. 마이크로파로 1분 동안 끓인다(용액이 맑게 된다). 실온으로 냉각시킨다. pH를 10으로 조정한다. pH가 10에서 유지될 때가지 가열/냉각 주기를 반복한다.

21. 200mM Na₄P₂0₇.

22. 포스포티로신에 특이적인 토끼 다클론 항혈청(항-Ptyr 항체, 수젠, 인크.).

23. 친화성 정제된 항혈청, 염소 항-토끼 IgG 항체, 퍼옥시다제 접합체(바이오소스 카탈로그 # ALI0404).

24. ABTS 용액.

25. 30% 과산화수소 용액.

26. ABTS/H₂O₂.

27. 0.2M HCl.

방법:

1. PBS중의 SUMO 1을 사용하여 코닝 96 웰 엘리사 플레이트를 웰 당 1.0㎍로 피복하고 최종 부피가 웰 당 100㎕되도록 한다. 4℃에서 하룻밤 동안 저장한다.

2. 사용 일자에, 피복 완충액을 제거하고 플레이트를 dH₂O로 3회 세척한 후 TBST 완충액으로 1회 세척한다. 이 분석에서의 모든 세척은, 달리 지시되지 않는다면, 이 방법으로 수행되어야 한다.

3. 차단 완충액(100㎕)을 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 항온처리한다. 사용하기 전에 즉시 플레이트를 세척한다.

4. 이 분석에서는 EGFr/HER-2 키메라/3T3-C7 세포주를 사용한다.

5. 80 내지 90%의 합류율(confluence)을 갖는 접시를 선택한다. 세포를 트립신화에 의해 수집하고, 1000rpm으로 실온에서 5분 동안 원심분리한다.

6. 세포를 절식(starve) 배지에 재현탁시키고, 트립판 블루를 사용하여 계수한다. 90% 초과의 생존률이 요구된다. 세포를 96웰 마이크로역가 플레이트에서 웰당 90ul씩, 웰당 2,500개 세포의 밀도로 절식 배지에 시딩한다. 시딩된 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리한다.

7. 시딩한지 2일 후에 검정을 개시한다.

8. 시험 화합물을 4% DMSO에 용해시킨다. 이어서, 시료를 절식 DMEM에 의해 플레이트상에서 직접 추가로 희석한다. 전형적으로, 이러한 희석은 1:10 이상일 것이다. 이어서, 모든 웰을 추가로 1:10 희석하여 세포 플레이트로 옮긴다(10㎕의 시료 및 배지를 90㎕의 절식 배지로 옮김). 최종 DMSO 농도는 1% 이하이어야 한다. 표준적인 연속(serial) 희석도 또한 사용될 수 있다.

9. 5% CO₂하에 37℃에서 2시간 동안 항온처리한다.

10. 저장 EGF(16.5uM)를 따뜻한 DMEM중에서 150nM이 되도록 희석하여 EGF 리간드를 제조한다.

11. 웰당 100ul가 되기에 충분한 새로운 HNTG^*를 제조하고, 얼음상에 놓는다.

12. 시험 화합물과 함께 2시간 항온처리한 후, 제조된 EGF 리간드를 최종 농도가 50nM이 되도록 웰당 50ul씩 세포에 가한다. 양성 대조군 웰에 동일한 양의 EGF를 가한다. 음성 대조군에는 EGF를 가하지 않는다. 37℃에서 10분 동안 항온처리한다.

13. 시험 화합물, EGF 및 DMEM을 제거한다. 세포를 PBS로 1회 세척한다.

14. HNTG^*를 웰당 100ul씩 세포로 옮긴다. 얼음상에 5분 동안 놓는다. 그 동안에 엘리사 플레이트로부터 차단 완충액을 제거하고 세척한다.

15. 마이크로피펫터를 사용하여 플레이트로부터 세포를 긁어내고, HNTG^*용해 완충액을 반복적으로 흡인 및 분배시킴으로써 세포 물질을 균질화시킨다. 용해물을 피복, 차단 및 세척된 엘리사 플레이트로 옮긴다. 또는, 코스타 운반 카트리지를 사용하여 용해물을 플레이트로 옮긴다.

16. 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 항온처리한다.

17. 용해물을 제거하고 세척한다. 새로이 희석된 항-Ptyr 항체(TBST중 1:3000)를 웰당 100ul씩 엘리사 플레이트로 옮긴다.

18. 실온에서 30분 동안 진탕하면서 항온처리한다.

19. 항-Ptyr 항체를 제거하고 세척한다. 새로이 희석된 바이오소스 항체를 엘리사플레이트로 옮긴다(TBST중 1:8000, 웰당 100ul씩).

20. 실온에서 30분 동안 진탕하면서 항온처리한다.

21. 바이오소스 항체를 제거하고 세척한다. 새로이 제조된 ABTS/H₂O₂용액을 웰당 100ul씩 엘리사 플레이트로 옮긴다.

22. 5 내지 10분 동안 진탕하면서 항온처리한다. 임의의 기포를 제거한다.

23. 웰당 100ul의 0.2M HCl을 가하여 반응을 정지시킨다.

24. 410nm에서 시험 필터 세트를 사용하고 630nm에서 기준 필터를 사용하여 다이나테크(Dynatech) MR7000 엘리사 판독기상에서 검정물을 판독한다.

cdk2/사이클린 A 검정법

본 검정법은 신틸레이션 프락시미티 검정법(Scintillation Proximity Assay, SPA)으로 인간 cdk2/사이클린 A의 생체외 세린/트레오닌 키나제 활성을 측정하는데 사용된다.

물질 및 시약:

1. 월락(Wallac) 96웰 폴리에틸렌 테레프탈레이트(플렉시) 플레이트(월락 카탈로그 # 1450-401).

2. 아머샴 레디뷰(Amersham Redivue) [γ³³P] ATP(아머샴 카탈로그 # AH 9968).

3. 아머샴 스트렙타비딘 피복된 폴리비닐톨루엔 SPA 비드(아머샴 카탈로그 #RPNQ0007). 상기 비드는 마그네슘 또는 칼슘을 함유하지 않는 PBS중에서 20mg/㎖로 재구성되어야 한다.

4. sf9 세포(수젠, 인크.)로부터 정제된 활성화된 cdk2/사이클린 A 효소 복합체.

5. 바이오티닐화 펩티드 기질(뎁티드(Debtide)). 펩티드 바이오틴-X-PKTPKKAKKL을 5mg/㎖의 농도로 dH₂O에 용해시킨다.

6. 펩티드/ATP 혼합물: 10㎖의 경우, dH₂O 9.979㎖, "차가운" ATP 0.00125㎖, 뎁티드 0.010㎖ 및 γ³³P ATP 0.010㎖를 혼합한다. 웰당 최종 농도는 "차가운" ATP 0.5μM, 뎁티드 0.1㎍ 및 γ³³P ATP 0.2μCi일 것이다.

7. 키나제 완충액: 10㎖의 경우, dH₂O 8.85㎖, 트리스(pH 7.4) 0.625㎖, 1M MgCl₂0.25㎖, 10% NP4O 0.25㎖ 및 1M DTT 0.025㎖(사용 직전에 신선한 것이 가해짐)를 혼합한다.

8. dH₂O중의 10mM ATP.

9. HCl에 의해 pH가 7.4로 조절된 1M 트리스,

10. 1M MgCl₂.

11. 1M DTT.

12. PBS(깁코(Gibco) 카탈로그 # 14190-144).

13. 0.5M EDTA.

14. 중지 용액: 10㎖의 경우, PBS 9.25㎖, 100mM ATP 0.005㎖, 0.5M EDTA 0.1㎖, 10% 트리톤 X-100 0.1㎖ 및 20mg/㎖의 SPA 비드 1.25㎖.

방법:

1. 시험 화합물의 용액을 5% DMSO중에서 목적하는 최종 농도의 5배로 제조한다. 각 웰에 10ul를 가한다. 음성 대조군의 경우, 웰에 10ul의 5% DMSO만을 사용한다.

2. cdk2/사이클린 A 용액 5㎕를 2x 키나제 완충액 2.1㎖로 희석한다.

3. 각 웰에 효소 20ul를 가한다.

4. 음성 대조군 웰에 0.5M EDTA 10㎕를 가한다.

5. 키나제 반응을 개시하기 위해, 각 웰에 펩티드/ATP 혼합물 20㎕를 가한다. 진탕없이 1시간 동안 항온처리한다.

6. 각 웰에 정지 용액 20㎕를 가한다.

7. 10분 이상 유지한다.

8. 플레이트를 약 2300rpm으로 3 내지 5분 동안 회전시킨다.

9. 트릴럭스(Trilux) 또는 유사한 판독기를 사용하여 플레이트를 계수한다.

met 트랜스포스포릴화 검정법

본 검정법은 폴리(글루탐산:티로신)(4:1) 기질의 met 트랜스포스포릴화의 작용제/길항제를 동정하기 위한 수단으로서 상기 기질상의 포스포티로신 양을 측정하는데 사용된다.

물질 및 시약:

1. 코닝(Corning) 96웰 엘리사 플레이트, 코닝 카탈로그 # 25805-96.

2. 폴리(glu, tyr) 4:1, 시그마(Sigma) 카탈로그 번호 P 0275.

3. PBS, 깁코 카탈로그 # 450-1300EB.

4. 50mM 헤페스.

5. 차단 완충액: 소 혈청 알부민(시그마 카탈로그 번호 A-7888) 25g을 PBS 500㎖에 용해시키고, 4㎛ 필터를 통해 여과한다.

6. Met 키나제 도메인을 함유하는 정제된 GST 융합 단백질, 수젠, 인크.

7. TBST 완충액.

8. 10% 수성(밀리큐 H₂O) DMSO.

9. 10mM 수성(dH₂O) 아데노신-5'-트리포스페이트, 시그마 카탈로그 번호 A-5394.

10. 2X 키나제 희석 완충액: 100㎖의 경우, dH₂O 88.4㎖중의 5% BSA/PBS 0.4㎖, 0.1M 나트륨 오르토바나데이트 0.2㎖ 및 5M 염화나트륨 1㎖와 pH 7.5의 1M 헤페스 10㎖를 혼합한다.

11. 4X ATP 반응 혼합물: 10㎖의 경우, dH₂O 9.56㎖중의 1M 염화망간 0.4㎖ 및 0.1M ATP 0.02㎖를 혼합한다.

12. 4X 음성 대조군 혼합물: 10㎖의 경우, dH₂O 9.6㎖중의 1M 염화망간 0.4㎖를 혼합한다.

13. NUNC 96웰 V자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트, 어플라이드 사이언티픽(Applied Scientific) 카탈로그 # S-72092.

14. 500mM EDTA.

15. 항체 희석 용액: 100㎖의 경우, 5% BSA/PBS 10㎖, PBS중의 5% 카네이션 인스턴트 밀크(Carnation Instant Milk, 등록상표) 0.5㎖ 및 TBST 88.4㎖중의 0.1M 나트륨 오르토바나데이트 0.1㎖를 혼합한다.

16. 토끼 다클론 안티포스포티로신 항체, 수젠, 인크.

17. 염소 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항체, 바이오소스, 인코포레이티드(Biosource, Inc.).

18. ABTS 용액: 1ℓ의 경우, 시트르산 19.21g, Na₂HPO₄35.49g 및 ABTS 500mg을 충분한 dH₂O와 혼합하여 1ℓ가 되게 한다.

19. ABTS/H₂O₂: 사용하기 5분전에 ABST 용액 15㎖를 H₂O₂2㎕와 혼합한다.

20. 0.2M HCl.

방법:

1. 엘리사 플레이트를 PBS 100㎕중의 폴리(Glu-Tyr) 2㎍으로 피복하고, 4℃에서 하룻밤 동안 저장한다.

2. 플레이트를 5% BSA/PBS 150㎕로 60분 동안 차단한다.

3. 플레이트를 PBS로 2회, 50mM 헤페스 완충액(pH 7.4)으로 1회 세척한다.

4. 희석된 키나제 50㎕를 모든 웰에 가한다(정제된 키나제를 키나제 희석 완충액으로 희석한다. 최종 농도는 10ng/웰이어야 한다).

5. 시험 화합물(4% DMSO중) 25㎕ 또는 대조군의 경우 DMSO 단독(dH₂O중 4%)을 플레이트에 가한다.

6. 키나제/화합물 혼합물을 15분 동안 항온처리한다.

7. 음성 대조군 웰에 40mM MnCl₂25㎕를 가한다.

8. 모든 다른 웰(음성 대조군을 제외함)에 ATP/MnCl₂25㎕를 가한다. 5분 동안 항온처리한다.

9. 500mM EDTA 25㎕를 가하여 반응을 정지시킨다.

10. 플레이트를 TBST로 3회 세척한다.

11. 항체 희석 완충액중에 1:10,000으로 희석된 토끼 다클론 항-Ptyr 100㎕를 각 웰에 가한다. 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 항온처리한다.

12. 플레이트를 TBST로 3회 세척한다.

13. 바이오소스 HRP 접합된 항-토끼 항체를 항체 희석 완충액중에 1:6,000으로 희석한다. 웰당 100㎕를 가하고, 1시간 동안 진탕하면서 실온에서 항온처리한다.

14. 플레이트를 PBS로 1회 세척한다.

15. 각 웰에 ABTS/H₂O₂용액 100㎕를 가한다.

16. 필요한 경우, 웰당 0.2M HCl 100㎕를 가하여 전개 반응을 정지시킨다.

17. 410nm에서 시험 필터를 사용하고 630nm에서 기준 필터를 사용하여 다이나테크 MR7000 엘리사 판독기상에서 플레이트를 판독한다.

IGF-1 트랜스포스포릴화 검정법

본 검정법은 기질의 gst-IGF-1 트랜스포스포릴화의 작용제/길항제를 동정하기 위해 폴리(글루탐산:티로신)(4:1)중의 포스포티로신 양을 측정하는데 사용된다.

물질 및 시약:

1. 코닝 96웰 엘리사 플레이트.

2. 폴리(Glu-tyr)(4:1), 시그마 카탈로그 번호 P 0275.

3. PBS, 깁코 카탈로그 # 450-1300EB.

4. 50mM 헤페스.

5. TBB 차단 완충액: 1ℓ의 경우, BSA 100g, 트리스(pH 7.5) 12.1g, 염화나트륨 58.44g 및 1% 트윈(TWEEN)-20 10㎖를 혼합한다.

6. IGF-1 키나제 도메인을 함유하는 정제된 GST 융합 단백질(수젠, 인크.).

7. TBST 완충액: 1ℓ의 경우, 트리스 6.057g, 염화나트륨 8.766g 및 트윈-20 0.5㎖를 충분한 dH₂O와 혼합하여 1ℓ가 되게 한다.

8. 밀리-큐(Milli-Q) H₂O중 4% DMSO.

9. dH₂O중의 10mM ATP.

10. 2X 키나제 희석 완충액: 100㎖의 경우, 1M 헤페스(pH 7.5) 10㎖, dH₂O중의 5% BSA 0.4㎖, 0.1M 나트륨 오르토바나데이트 0.2㎖ 및 5M 염화나트륨 1㎖를 충분한 dH₂O와 혼합하여 100㎖가 되게 한다.

11. 4X ATP 반응 혼합물: 10㎖의 경우, 1M MnCl₂0.4㎖, 0.01M ATP 0.008㎖ 및 dH₂O 9.56㎖를 혼합한다.

12. 4X 음성 대조군 혼합물: dH₂O 9.60㎖중의 1M 염화망간 0.4㎖를 혼합한다.

13. NUNC 96웰 V자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트.

14. dH₂O중 500mM EDTA.

15. 항체 희석 용액: 100㎖의 경우, PBS중의 5% BSA 10㎖, PBS중의 5% 카네이션 인스턴트 넌-패트 밀크 0.5㎖ 및 TBST 88.4㎖중의 0.1M 나트륨 오르토바나데이트 0.1㎖를 혼합한다.

16. 토끼 다클론 안티포스포티로신 항체, 수젠, 인크.

17. 염소 항-토끼 HRP(horseradish peroxidase) 접합된 항체, 바이오소스.

18. ABTS 용액.

19. ABTS/H₂O₂: 사용하기 5분전에 ABST 15㎖를 H₂O₂2㎕와 혼합한다.

20. dH₂O중의 0.2M HCl.

방법:

1. 엘리사 플레이트를 PBS 100㎕중의 폴리(Glu, Tyr) 4:1(시그마 P0275) 2㎍으로 2.0㎍/웰로 피복한다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 저장한다.

2. 플레이트를 PBS로 1회 애쉬(ash)한다.

3. 각 웰에 TBB 차단 완충액 100㎕를 가한다. 플레이트를 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 항온처리한다.

4. 플레이트를 PBS로 1회, 이어서 50mM 헤페스 완충액(pH 7.5)으로 2회 세척한다.

5. 4% DMSO중의 시험 화합물 25㎕(100% DMSO중의 10mM 시험 화합물의 저장 용액을 dH₂O로 희석하여 수득됨)를 플레이트에 가한다.

6. 키나제 희석 완충액 50㎕중의 gst-IGF-1 키나제 10.0ng를 모든 웰에 가한다.

7. 4X ATP 반응 혼합물 25㎕를 모든 시험 웰 및 양성 대조군 웰에 가하여 키나제 반응을 개시시킨다. 4X 음성 대조군 혼합물 25㎕를 모든 음성 대조군 웰에 가한다. 실온에서 진탕하면서 10분 동안 항온처리한다.

8. 모든 웰에 0.5M EDTA(pH 8.0) 25㎕를 가한다.

9. 플레이트를 TBST 완충액으로 4회 세척한다.

10. 항체 희석 완충액 100㎕중에 1:10,000으로 희석된 토끼 다클론 항-포스포티로신 항혈청을 모든 웰에 가한다. 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 항온처리한다.

11. 플레이트를 단계 9에서와 같이 세척한다.

12. 항체 희석 완충액중에 1:10,000으로 희석된 바이오소스 항-토끼 HRP 100㎕를 모든 웰에 가한다. 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 항온처리한다.

13. 플레이트를 단계 9에서와 같이 세척한 후, PBS로 1회 세척하여 기포 및 과잉의 트윈-20을 감소시킨다.

14. 100㎕/웰의 ABTS/H₂O₂를 각 웰에 가하여 전개시킨다.

15. 약 5분후, 410nm에서 시험 필터를 사용하고 630nm에서 기준 필터를 사용하여 엘리사 판독기상에서 판독한다.

BrdU 혼입 검정법

하기 검정법은 선택된 수용체를 발현시킨 후, DNA내로의 BrdU 혼입을 측정함으로써 리간드-유도된 DNA 합성의 활성에 미치는 관심 대상의 화합물의 영향을 평가하도록 엔지니어링된 세포를 사용한다.

하기 재료, 시약 및 방법은 하기 BrdU 혼입 검정 각각에 대해 일반적인 것이다. 특정 검정에서의 변화는 언급되어 있다.

물질 및 시약:

1. 적절한 리간드.

2. 적절한 엔지니어링된 세포.

3. BrdU 표지화 시약: PBS(pH 7.4)중의 10mM(독일 소재의 베링거 만하임(Boehringer Mannheim).

4. FixDenat: 고정화 용액(언제든지 사용할 수 있도록 준비됨)(독일 소재의 베링거 만하임).

5. 항-BrdU-POD: 퍼옥시다제와 접합된 마우스 단클론 항체(독일 소재의 베링거 만하임).

6. TMB 기질 용액: 테트라메틸벤지딘(TMB, 독일 소재의 베링거 만하임).

7. PBS 세척 용액: 1X PBS, pH 7.4.

8. 소 알부민(BSA), 분획 V 분말(미국 소재의 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Co.)).

일반적인 방법:

1. 세포를 96웰 플레이트내의 DMEM중의 10% CS, 2mM Gln에서 8000 세포/웰로 시딩한다. 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리한다.

2. 24시간후, 세포를 BPS로 세척하고, 이어서 무혈청 배지(0.1% BSA를 갖는 0% CSDMEM)에서 24시간 동안 혈청을 고갈시킨다.

3. 3일째에, 적절한 리간드 및 시험 화합물을 동시에 세포에 가한다. 음성 대조군 웰에는 0.1% BSA만을 갖는 무혈청 DMEM을 가하고, 양성 대조군 세포에는 리간드를 가하지만 시험 화합물은 가하지 않는다. 시험 화합물은 96웰 플레이트에서 리간드를 갖는 무혈청 DMEM에서 제조하고, 7개의 시험 농축물을 위해 연속적으로 희석한다.

4. 18시간의 리간드 활성화후, 희석된 BrdU 표지화 시약(DMEM중 1:100, 0.1% BSA)을 가하고, 세포를 BrdU(최종 농도는 10μM임)와 함께 1.5시간 동안 항온처리한다.

5. 표지화 시약과 함께 항온처리한 후, 뒤집은 플레이트를 종이 타월상에 기울여 따르고 트랩핑하여 배지를 제거한다. FixDenat 용액을 가하고(50㎕/웰), 플레이트를 플레이트 진탕기상에서 실온에서 45분 동안 항온처리한다.

6. 뒤집은 플레이트를 종이 타월상에서 기울여 따르고 트랩핑하여 FixDenat 용액을 완전히 제거한다. 밀크를 차단 용액으로서 가하고(PBS중의 5% 탈수 밀크, 200㎕/웰), 플레이트를 플레이트 진탕기상에서 실온에서 30분 동안 항온처리한다.

7. 차단 용액을 기울여 따름으로써 제거하고, 웰을 PBS로 1회 세척한다. 항-BrdU-POD 용액(PBS중 1:200 희석물, 1% BSA)을 가하고(50㎕/웰), 플레이트를 플레이트 진탕기상에서 실온에서 90분 동안 항온처리한다.

8. 웰을 기울여 따르고 PBS로 5회 세정함으로써 항체 접합체를 완전히 제거하고, 플레이트를 종이 타월상에서 뒤집어 트랩핑함으로써 건조시킨다.

9. TMB 기질 용액을 가하고(100㎕/웰), 색 전개가 광도계 검출에 충분할 때까지 플레이트 진탕기상에서 실온에서 20분 동안 항온처리한다.

10. 시료의 흡광도를 다이나테크 엘리사 플레이트 판독기상에서 410nm에서 측정한다(기준 파장으로서 490nm에서 판독하는 필터를 사용한 "이중(dual) 파장" 모드로).

EGF-유도된 BrdU 혼입 검정법

물질 및 시약:

1. 마우스 EGF, 201(일본 소재의 도요보 캄파니 리미티드(Toyobo Co., Ltd.)).

2. 3T3/EGFRc7.

EGF-유도된 Her-2-유래된 BrdU 혼입 검정법

물질 및 시약:

1. 마우스 EGF, 201(일본 소재의 도요보 캄파니 리미티드).

2. 3T3/EGFr/Her2/GEFr(Her-2 키나제 도메인을 갖는 EGFr).

EGF-유도된 Her-4-유래된 BrdU 혼입 검정법

물질 및 시약:

1. 마우스 EGF, 201(일본 소재의 도요보 캄파니 리미티드).

2. 3T3/EGFr/Her4/GEFr(Her-4 키나제 도메인을 갖는 EGFr).

PDGF-유도된 BrdU 혼입 검정법

물질 및 시약:

1. 인간 PDGF B/B(독일 소재의 베링거 만하임).

2. 3T3/EGFRc7.

FGF-유도된 BrdU 혼입 검정법

물질 및 시약:

1. 인간 FGF2/bFGF(미국 소재의 깁코 BRL).

2. 3T3c7/EGFr.

IGF1-유도된 BrdU 혼입 검정법

물질 및 시약:

1. 인간 재조합물(G511, 미국 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)).

2. 3T3/IGF1r.

인슐린-유도된 BrdU 혼입 검정법

물질 및 시약:

1. 인슐린, 결정질, 소, 징크(Zinc)(13007, 미국 소재의 깁코 BRL).

2. 3T3/H25.

HGF-유도된 BrdU 혼입 검정법

물질 및 시약:

1. 재조합 인간 HGF(카탈로그 번호 249-HG, 미국 소재의 알앤디 시스템스, 인코포레이티드(R&D Systems, Inc.)).

2. BxPC-3 세포(ATCC CRL-1687).

방법:

1. 세포를 96웰 플레이트내의 RPMI 10% FBS에서 9000 세포/웰로 시딩한다. 세포를5% CO₂하에 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리한다.

2. 24시간후, 세포를 BPS로 세척하고, 이어서 무혈청 배지(0.1% BSA를 갖는 RPMI) 100㎕에서 24시간 동안 혈청을 고갈시킨다.

3. 3일째에, 리간드를 함유하는 25㎕(0.1% BSA를 갖는 RPMI중에서 1㎍/㎖로 제조됨; 최종 HGF 농도는 200ng/㎖임) 및 시험 화합물을 세포에 가한다. 음성 대조군 웰에는 0.1% BSA만을 갖는 무혈청 RPMI 25㎕를 가하고, 양성 대조군 세포에는 리간드(HGF)를 가하지만 시험 화합물은 가하지 않는다. 시험 화합물은 96웰 플레이트에서 리간드를 갖는 무혈청 DMEM중에서 그의 최종 농도의 5배로 제조하고, 연속적으로 희석하여 7개의 시험 농축물을 제공한다. 전형적으로, 시험 화합물의 최고 최종 농도는 100μM이고, 1:3 희석물이 사용된다(즉, 최종 시험 화합물 농도 범위는 0.137 내지 100μM이다).

4. 18시간의 리간드 활성화후, 희석된 BrdU 표지화 시약(RPMI중 1:100, 0.1% BSA) 12.5㎕를 각 웰에 가하고, 세포를 BrdU(최종 농도는 10μM임)와 함께 1시간 동안 항온처리한다.

5. 일반적인 방법과 동일함.

6. 일반적인 방법과 동일함.

7. 차단 용액을 기울여 따름으로써 제거하고, 웰을 PBS로 1회 세척한다. 항-BrdU-POD 용액(PBS중 1:100 희석물, 1% BSA)을 가하고(100㎕/웰), 플레이트를 플레이트 진탕기상에서 실온에서 90분 동안 항온처리한다.

8. 일반적인 방법과 동일함.

9. 일반적인 방법과 동일함.

10. 일반적인 방법과 동일함.

HUV-EC-C 검정법

본 검정법은 PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF 또는 Flk-1/KDR(이는 모두 HUV-EC 세포에 의해 자연적으로 발현됨)에 대한 화합물의 활성을 측정하기 위해 사용된다.

0일

1. HUV-EC-C 세포(human umbilical vein endothelial cell(아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(American Type Culture Collection), 카탈로그 번호 1730 CRL))를 세척하고 트립신화한다. 둘베코(Culbecco)의 인산염 완충 염수(D-PBS, 깁코 BRL로부터 입수됨, 카탈로그 번호 14190-029)를 사용하여 조직 배양 플라스크 10㎠당 약 1㎖로 2회 세척한다. 비효소적 세포 해리 용액(시그마 케미칼 캄파니, 카탈로그 번호 C-1544)중의 0.05% 트립신-EDTA에 의해 트립신화한다. 0.05% 트립신은 세포 해리 용액에 0.25% 트립신/1mM EDTA(깁코, 카탈로그 번호 25200-049)를 희석시킴으로써 제조된다. 37℃에서 약 5분 동안 조직 배양 플라스크 25 내지 30㎠당 약 1㎖로 트립신화한다. 세포가 플라스크로부터 분리된 후, 동일 부피의 검정 배지를 가하고, 50㎖ 멸균 원심분리 튜브(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 카탈로그 번호 05-539-6)로 옮긴다.

2. 50㎖ 멸균 원심분리 튜브에서 약 35㎖의 검정 배지를 가하여 상기 검정 배지로 세포를 세척하고, 약 200 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 흡입하고, D-PBS 30㎖와 함께 재현탁시킨다. D-PBS를 사용하여 세척을 2회 더 반복하고, 세포를 조직 배양 플라스크 15㎠당 검정 배지 약 1㎖로 재현탁시킨다. 검정 배지는 F12K 배지(깁코 BRL, 카탈로그 번호 21127-014) 및 0.5% 열-비활성화된 소 태아 혈청으로 이루어진다. 세포를 코울터 카운터(Coulter Counter, 등록상표)(코울터 일렉트로닉스, 인코포레이티드(Coulter Electronics, Inc.))에 의해 계수하고, 검정 배지를 0.8 내지 1.0 x 10⁵세포/㎖의 농도가 되도록 가한다.

3. 세포를 100㎕/웰 또는 0.8 내지 1.0 x 10⁴세포/웰로 96웰 평바닥 플레이트에 가하고, 5% CO₂하에 37℃에서 약 24시간 동안 항온처리한다.

1일

1. 별개의 96웰 플레이트에서 일반적으로 50μM에서 0μM까지 2배 시험 화합물 적정물을 제조한다. 상기 0일의 단계 2에서 언급된 것과 동일한 검정 배지를 사용한다. 적정물은 90㎕/웰의 시험 화합물을 특정한 플레이트 컬럼의 상부 웰에 200μM(최종 웰 농도의 4배)로 가함으로써 제조된다. 저장 시험 화합물은 일반적으로 DMSO중의 2mM이므로, 200μM의 약물 농도는 2% DMSO를 함유한다.

시험 화합물을 희석시키지만 DMSO 농도는 일정하게 유지시키기 위해, 검정 배지(F12K + 0.5% 소 태아 혈청)중 2% DMSO로 제조된 희석액을 시험 화합물 적정을 위한 희석액으로서 사용한다. 상기 희석액을 컬럼내의 나머지 웰에 60㎕/웰로 가한다. 상기 컬럼의 상부 웰내의 200μM 시험 화합물 희석물 120㎕로부터 60㎕를 취해서 상기 컬럼의 제 2 웰내의 60㎕와 혼합한다. 2배 적정이 완료될 때가지, 상기 웰로부터 60㎕를 취해서 상기 컬럼의 제 3 웰내의 60㎕와 혼합하는 등 한다. 마지막 웰로부터 두 번째의 웰을 혼합할 때, 상기 웰내의 120㎕중 60㎕를 취하고, 그것을 버린다. 시험 화합물 비함유 대조군으로서 DMSO/배지 희석액 60㎕를 마지막 웰에 남긴다. (1) VEGF(프레프로 테크 인코포레이티드(Prepro Tech Inc.), 카탈로그 번호 100-200), (2) 내피 세포 성장 인자(ECGF)(산성 섬유아세포 성장 인자 또는 aFGF로도 공지됨)(베링거 만하임 바이오케미카로부터 수득됨, 카탈로그 번호 1439 600) 또는 (3) 인간 PDGF B/B(1276-956, 독일 소재의 베링거 만하임)에 대해 각각 웰을 3벌로 하기에 충분한 9컬럼의 적정된 시험 화합물 및 검정 배지 대조군을 제조한다. ECGF는 나트륨 헤파린을 함유한 제제로서 유래된다.

2. 50㎕/웰의 시험 화합물 희석물을, 0일의 0.8 내지 1.0 x 10⁴세포/100㎕/웰의 HUV-EC-D 세포를 함유하는 96웰 검정 플레이트로 옮기고, 5% CO₂하에 37℃에서 약 2시간 동안 항온처리한다.

3. 3벌로 50㎕/웰의 80㎍/㎖ VEGF, 20ng/㎖ ECGF 또는 배지 대조군을 각각의 시험 화합물 컨디션에 가한다. 시험 화합물과 마찬가지로, 성장 인자 농도는 목적하는 최종 농도의 4배이다. 0일의 검정 배지를 사용하여 성장 인자 농축물을 제조한다. 5% CO₂하에 37℃에서 약 24시간 동안 항온처리한다. 각 웰은 총 200㎕/웰이 되는, 시험 화합물 희석물 50㎕, 성장 인자 또는 배지 50㎕ 및 세포 100㎕를 가질 것이다. 따라서, 시험 화합물 및 성장 인자의 4배 농축물은 일단 모두 웰에 가해지면 1배가 된다.

2일

1.³H-티미딘(아머샴, 카탈로그 번호 TRK-686)을 1μCi/웰(RPMI 배지 + 10% 열-비활성화된 소 태아 혈청으로 구성된 100μCi/㎖ 용액 10㎕/웰)로 가하고, 5% CO₂하에 37℃에서 약 24시간 동안 항온처리한다. RPMI는 깁코 BRL, 카탈로그 번호 11875-051로부터 입수한다.

3일

1. 플레이트를 -20℃에서 하룻밤 동안 동결시킨다.

4일

해동판은 필터 매트(월랙(Wallac) 카다로그 제 1205 -401 호)상의 96 웰 플레이트 수확기(탐테크 하비스터(Tomtec Harvester) 96, 등록상표)을 사용하여 수확하고, 월랙 베타플레이트(Wallac Betaplate, 등록상표) 액상 섬광 계수기에서 계수하였다.

화합물을 평가하는데 사용되거나 사용될 수 있는 생물학적 검정법은 하기에서 기술한 바와 같다. 화합물 1 내지 9를 시험하고, flkGST, FGFR1 및 PDGF 검정법에서 활성임을 발견하였다.

생체내 동물 모델

이종 이식 동물 모델

흉선이 없는 마우스(예를 들어, Balb/c, nu/nu)내에서의 인간 종양의 이종이식물로서의 성장능은 인간 종양을 위한 치료법에 대한 생물학적 반응을 연구하기위한 유용한 생체내 모델을 제공한다. 흉선이 없는 마우스에 인간 종양을 처음으로 성공적으로 이종이식한 이후(문헌[Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758-760] 참고), 다수의 상이한 인간 종양 세포주(예를 들어, 유방, 폐, 생식비뇨기, 위장, 머리와 목, 교모세포종, 골, 및 악성 흑색종)를 누드 마우스에 이식시키고 성공정으로 성장시켰다. 하기 분석법은 본 발명의 상이한 화합물의 활성, 특이성 및 효과 수준을 측정하기 위해서 사용될 수 있다. 3종의 일반적인 유형의 분석법인, 세포/촉매작용 분석법, 세포/생물학적 분석법 및 생체내 분석법은 화합물을 평가하는데 유용하다. 세포/촉매작용 분석법의 목적은, 세포내 공지된 기질상에 티로신을 포스포릴화하는 TK의 능력에 대한 화합물의 영향을 측정하는 것이다. 세포/생물학적 분석법의 목적은 세포내에서 TK에 의해 자극되는 생물학적 반응에 대한 화합물의 영향을 측정하는 것이다. 생체내 분석법의 목적은 암과 같은 특정 질환의 동물 모델에서의 화합물의 영향을 측정하는 것이다.

피하 이종이식 시험을 위한 적당한 세포주로는 C6 세포(교종, ATCC # CCL 107), A375 세포(흑색종, ATCC # CRL 1619), A431 세포(표피모양암종, ATCC # CRL 1555), Calu 6 세포(폐, ATCC # HTB 56), PC3 세포(전립선, ATCC # CRL 1435), SKOV3TP5 세포 및 EGFR, PDGFR, IGF-1R 또는 임의의 다른 시험용 키나제를 과대발현하도록 유전공학적으로 처리된 NIH 3T3 섬유 모세포를 들 수 있다. 하기 프로토콜은 이종이식 시험을 수행하기 위해서 사용될 수 있다.

흉선이 없은 암컷 마우스(BALB.c, nu/nu)는 시모센 래보러토리즈(Simonsen Laboratories, 미국 캘리포니아주 질로이 소재)에서 수득된다. 모든 동물은 알파-건조 베딩이 깔린 미세 분리기 우리(Micro-isolator cage)안에 깨끗한 조건하에 놓아 두었다. 이들에게 살균된 식사 및 수분을 임의로 제공하였다.

세포주는 적당한 배지(예를 들어, MEM, DMEM, Ham's F10, 또는 Ham's F12 + 5% 내지 10% 소의 태아 혈청(FBS) 및 2mM 글루타민(GLN))에서 성장시켰다. 모든 세포 배양 배지, 글루타민 및 소의 태아 혈정은, 다른 언급이 없는 한 기브코 라이프 테크놀로지(Gibco Life Technologies, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)에서 구입하였다. 모든 세포는 37℃의 온도에서 90 내지 95% 공기 및 5 내지 10% CO₂의 습한 분위기하에서 성장하였다. 모든 세포주는 일주일에 2회 일상적으로 2차 배양하고, 마이코텍크법(Mycotect method, 기브코)에 의해 측정된 바와 같이 미코플라스마에 대해서는 음성이었다.

세포는 0.05% 트립신-EDTA에 의해 융합시 또는 융합 주변에서 수확하고 10분 동안 450×g으로 펠렛화하였다. 펠렛은 살균된 PBS 또는 배지(FBS가 없음)에서 특정 농도로 재현탁시키고, 세포를 마우스의 뒷다리 측면에 이식하였다(1그룹당 8 내지 10마리의 마우스, 2 내지 10 × 10⁶세포/ 동물). 종양 성장은 베니어 캘리퍼(venier caliper)를 사용하여 3 내지 6 주 동안 측정하였다. 종양 체적은, 다른 언급이 없는 한, 길이 × 폭 × 높이의 곱으로 계산하였다. P 값은 학생용 t-시험법을 사용하여 계산하였다. 50 내지 100㎕ 첨가제(DMSO, 또는 VPD:D5W)내 시험 화합물은, 이식한 후 첫 번째 날부터 일반적으로 시작하여 상이한 농도로 IP 주사법으로 분배할 수 있다.

종양 침투 모델

하기 종양 침투 모델은, KDR/FLK-1 수용체를 선택적으로 억제하는 것으로 확인된 화합물의 치료역가 및 효율을 평가하기 위해 개발되어 사용될 수 있다.

방법

8주령 누드 마우스(암컷)(시몬슨 인코포레이티드)를 시험용 동물로서 사용하였다. 종양 세포의 이식은 층류 후드에서 수행될 수 있다. 마취를 위해, 크실라진/케타민 칵테일(100mg/kg의 케타민 및 5mg/kg의 크실라진)을 복강내 투여하였다. 100㎕ 배지의 체적내 10⁷개의 종양 세포를 주입하기 위해서 정중 절개하여 복강을 노출시켰다(약 1.5㎝의 길이). 세포를 췌장의 십이지장 돌출부 또는 결장의 장막에 주입하였다. 복막 및 근육은 6-0 견사봉합사로 봉쇄하고, 피부는 굽힘 클립(wound clip)을 사용하여 봉쇄하였다. 동물을 매일 관찰하였다.

분석

2 내지 6주후에, 동물을 전체적으로 관찰함으로써, 마우스를 죽이고, 다양한 기관(폐, 간, 뇌, 위장, 지라, 심장, 근육)에 대한 국소 종양 전이를 검사하고 분석하였다(하이브리드 형성 등을 측정하면서 동시에 종양의 크기, 침투 등급, 면역 화학에 대해 평가함).

C-키트 검정법

본 시험법은 c-키트 티로신 포스포릴화의 수준을 검출하기 위해서 사용하였다.

MO7E(인간의 급성 골수 백혈병) 세포는 0.1% 혈청에서 하룻밤 동안 수확한 혈청이다. 세포는 리간드 자극 전에 화합물으로 예비처리하였다(혈청 수확과 동시에 수행함). 세포는 15분 동안 rh-SCF 250ng/㎖로 자극하였다. 자극 후에, 세포를 라이싱하고, 안티-c-키트 항체로 면역침강시켰다. 포스포티로신 및 단백질 수준은 웨스턴 블롯팅(Westerm blotting)으로 측정하였다.

MTT 증식 검정법

MO7E 세포를 혈청 수확하고, 인산 시험법에 대해 전술한 바와 같은 화합물로 예비처리하였다. 세포는 100㎕ RPMI + 10% 혈청내 96웰 접시내에서 4×10⁵세포/웰에서 플레이팅하였다. rh-SCF(100ng/mL)를 첨가하고, 플레이트를 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 10㎕의 5mg/ml MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리늄 브로마이드)를 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 산 이소프로판올(100㎕의 이소프로판올내 0.04N HCl)를 첨가하고, 550nm에서 광학 밀도를 측정하였다.

세포자멸 검정법

MO7E 세포는, rh-GM-CSF(10ng/ml) 및 rh-IL-3(10ng/mL)를 포함하는 10% FBS내 ±SCF 및 ± 화합물에서 배양하였다. 샘플을 24시간 및 48시간 경과시에 분석하였다. 활성화 카스페이스-30를 측정하기 위해서, 샘플을 PBS로 세척하고, 냉각된 70% 에탄올에 투과시켰다. 그다음, 세포를 PE-공액된 다크론성 래빗의 항-활성 케스페이스-3으로 염색하고, FACS로 분석하였다. 절단된 PARP를 평가하기 위해서,샘플을 라이싱하고, 항-PARP 항체에 의한 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.

추가 검정법

본 발명의 화합물을 평가하기 위해서 사용될 수 있는 추가 검정법으로는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 바이오-flk-1 검정법, 전체 세포에서의 EGF 수용체-HER2 키메릭 수용체 검정법, 바이오-src 검정법, 바이오-lck 검정법, 및 raf의 포스포릴화 작용을 평가하는 검정법을 들 수 있다. 각각의 이러한 검정법에 대한 프로토콜은 도면을 비롯하여 본원에서 참고로 인용중인 미국 특허출원 제 09/099,842 호에서 발견할 수 있다.

세포 독성의 측정

치료작용의 화합물은 세포독성 영향을 발휘하기 보다는 수용체 티로신 키나제 활성을 억제하는데 보다 잠재력이 있어야 한다. 화합물의 효율 및 세포 독성의 측정은 치료 지수, 즉 IC₅₀/LD₅₀를 측정함으로써 수득될 수 있다. IC₅₀, 즉 50% 억제능을 달성하는데 필요한 투여량은 본원에서 기술하는 바와 같은 표준 기법을 사용하여 측정할 수 있다. LD₅₀, 50% 독성을 유발하는 투여량은 표준 기법(문헌[Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55-63] 참고), 방출된 LDH의 양을 측정하는 방법(문헌[Korzeniewski and Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64: 313, Decker and Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115: 61] 참고) 또는 동물 모델의 치사량을 측정함으로써 측정될 수 있다. 큰 치료 지수를 갖는 화합물이 바람직하다. 치료 지수는 2 초과, 바람직하게는 10 이상, 보다 바람직하게는 50 이상이어야 한다.

당분야의 숙련자라면, 본 발명이 목적을 달성하고, 전술한 바 뿐만 아니라 본원 고유의 목적 및 장점을 수득하기 위해서 개조될 수 있다는 것을 알 것이다. 본원에서 기술한 분자의 착체와 방법, 공정, 처리, 분자, 특정 화합물은 바람직한 양태를 대표하고, 예시하지만, 본 발명의 범주를 이로서 한정하고자 하는 것은 아니다. 본원에서의 변종 및 다른 용도가 청구의 범위의 범주로 정의된 본 발명의 진의 범위내에 포함되는 한, 당분야의 숙련자가 고려할 수 있을 것이다.

당 분야의 숙련자에게는, 본 발명의 범주 및 진의로부터 벗어나지 않은 채, 본 발명을 다양하게 치환 및 개조할 수 있음을 알 것이다.

명세서내의 모든 특허 및 공개공보는 발명이 속하는 분야의 숙련자의 수준을 지시하는 것이다. 모든 특허 및 공개공보는 각각의 개별적인 공개공보가 특이적이고 개별적으로 본원에 도입된 것으로 지적된 것과 동일한 정도로 참고를 위해 본원에서 삽입되었다.

본원에서 예시적으로 설명한 본원발명은 본원에서 구체적으로 기술하지 않은 임의의 요소(들) 또는 제한점(들) 없이도 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에서의 각각의 경우에, "포함된", "필수적으로 구성된" 및 "구성된"중 어떠한 용어도 다른 2종의 용어를 대체할 수 있다. 사용되는 용어 및 표현법은 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 용어로서 사용되었고, 이러한 용어 및 표현을 사용함으로써 공지되고 기술된 특징부의 임의의 동등물 또는 이들의 일부를 배제하고자 하는 것은 아니며, 청구된 본 발명의 범주내에서 다양한 개조가 가능하다는 것을인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 바람직한 양태 및 선택적인 특징부로 구체적으로 개시되어 있지만, 개시된 본원 발명의 개념의 개조물 및 변종은 당 분야의 숙련자에 의해 밝혀질 것이고, 이러한 개조 및 변종은 첨부된 청구의 범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범주내 포함될 것으로 고려된다.

추가로, 본 발명의 특징부 또는 양상은 마쿠쉬 그룹의 형태로 기술되어 있지만, 당 분야의 숙련자라면, 이로서 발명이 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별적인 요소 또는 하부 그룹의 형태로 기술될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, X가 브롬, 염소 및 요오드로 이루어진 군에서 선택되는 경우, X가 브롬인 경우의 청구항 및 X가 브롬 및 염소인 경우에 청구항을 모두 기술한 것이다.

다른 양태는 하기 청구의 범위에 포함된다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:

화학식 I

상기 식에서,

R¹은 수소, 할로, 알킬, 할로알콕시, 사이클로알킬, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰및 -C(O)NR¹²R¹³으로 이루어진 군에서 선택되고;

R²는 수소, 할로, 알킬, 트리할로메틸, 하이드록시, 알콕시, 시아노, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)₂NR⁹R¹⁰및 -SO₂R¹⁴(여기서, R¹⁴는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아르알킬이다)로 이루어진 군에서 선택되고;

R³, R⁴및 R⁵는 독립적으로 수소 또는 알킬이고;

Z는 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클 또는 -NR¹⁵R¹⁶(여기서, R¹⁵및 R¹⁶은 독립적으로수소 또는 알킬이거나; 또는 R¹⁵와 R¹⁶은 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성한다)이고;

R⁶은 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁷은 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 -C(O)R¹⁷로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁸은 하이드록시, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁹및 R¹⁰은 독립적으로 수소, 알킬, 시아노알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는

R⁹와 R¹⁰은 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성하고;

R¹²및 R¹³은 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬 및 아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는

R¹²와 R¹³은 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클로아미노를 형성하고;

R¹⁷은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 하이드록시 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된다.
제 1 항에 있어서,

R¹이 수소, 할로, 알킬, 사이클로알킬, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰및 -C(O)NR¹²R¹³으로 이루어진 군에서 선택되고; R²가 수소, 할로, 알킬, 트리할로메틸, 하이드록시, 알콕시, 시아노, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)₂NR⁹R¹⁰및 -SO₂R¹⁴(여기서, R¹⁴는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아르알킬이다)로 이루어진 군에서 선택되고; R³, R⁴및 R⁵가 독립적으로 수소 또는 알킬이고; Z가 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클 또는 -NR¹⁵R¹⁶(여기서, R¹⁵및 R¹⁶은 독립적으로 수소 또는 알킬이거나; 또는 R¹⁵와 R¹⁶은 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성한다)이고; R⁶이 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고; R⁷이 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 -C(O)R¹⁷로 이루어진 군에서 선택되고; R⁸이 하이드록시, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되고; R⁹및 R¹⁰이 독립적으로 수소, 알킬, 시아노알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는 R⁹와 R¹⁰이 함께 헤테로사이클로 기를 형성하고; R¹²및 R¹³이 독립적으로 수소, 알킬 및 아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는 R¹²와 R¹³이 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클을 형성하고;R¹⁷이 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 하이드록시 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
제 1 항에 있어서,

하기 화합물들로 이루어진 군에서 선택된 화합물:
제 3 항에 있어서,

하기 화합물들로 이루어진 군에서 선택된 화합물:
하기 화학식 Ia의 화합물:

화학식 Ia

상기 식에서,

R¹, R³, R⁴및 R⁵는 수소이고;

R²는 플루오로이고 인돌리논 고리의 5-위치에 위치하고;

Z는 모르폴린-4-일이고;

R⁶및 R⁷은 메틸이고;

^*C에서의 입체화학은 (S)이다.
하기 화학식 II의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:

화학식 II

상기 식에서,

R은 수소 또는 알킬이고;

R¹은 수소, 할로, 알킬, 할로알콕시, 사이클로알킬, 헤테로알리사이클릭, 하이드록시, 알콕시, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰및 -C(O)NR¹²R¹³으로 이루어진 군에서 선택되고;

R²는 수소, 할로, 알킬, 트리할로메틸, 하이드록시, 알콕시, 시아노, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)₂NR⁹R¹⁰및 -SO₂R¹⁴(여기서, R¹⁴는 알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 및 헤테로아르알킬이다)로 이루어진 군에서 선택되고;

R³, R⁴및 R⁵는 독립적으로 수소 또는 알킬이고;

Z는 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클 또는 -NR¹⁵R¹⁶(여기서, R¹⁵및 R¹⁶은 독립적으로 수소 또는 알킬이거나; 또는 R¹⁵와 R¹⁶은 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성한다)이고;

R⁶은 수소 및 알킬로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁷은 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴 및 -C(O)R¹⁷로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁸은 하이드록시, 알콕시 및 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택되고;

R⁹및 R¹⁰은 독립적으로 수소, 알킬, 시아노알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는

R⁹와 R¹⁰은 함께 헤테로사이클로아미노 기를 형성하고;

R¹²및 R¹³은 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬 및 아릴로 이루어진 군에서 선택되거나; 또는

R¹²와 R¹³은 이들에 결합되어 있는 질소 원자와 함께 헤테로사이클로아미노를 형성하고;

R¹⁷은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 하이드록시 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된다.
제 6 항에 있어서,

하기 화합물들로 이루어진 군에서 선택된 화합물:
제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항의 화합물 또는 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
제 5 항의 화합물 또는 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
단백질 키나제를 제 1 항, 제 3 항 및 제 6 항중 어느 한 항의 화합물 또는 염과 접촉시킴을 포함하는 단백질 키나제의 촉매 활성을 조절하는 방법.
제 10 항에 있어서,

단백질 키나제가 수용체 티로신 키나제, 비수용체 티로신 키나제 및 세린-트레오닌 키나제로 이루어진 군에서 선택된 방법.
제 1 항, 제 3 항 및 제 6 항중 어느 한 항의 화합물 또는 염 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 치료 효과량의 약학 조성물을 유기체에 투여함을 포함하는 유기체에서 단백질 키나제와 연관된 질병을 치료하거나 예방하는 방법.
제 12 항에 있어서,

단백질 키나제와 연관된 질병이 수용체 티로신 키나제와 연관된 질병, 비수용체 티로신 키나제와 연관된 질병 및 세린-트레오닌 키나제와 연관된 질병으로 이루어진 군에서 선택된 방법.
제 12 항에 있어서,

단백질 키나제와 연관된 질병이 EGFR 연관된 질병, PDGFR 연관된 질병, IGFR 연관된 질병 및 flk 연관된 질병으로 이루어진 군에서 선택된 방법.
제 12 항에 있어서,

단백질 키나제와 연관된 질병이 편평상피암, 성상세포종, 카포시(Kaposi) 육종, 교야종, 폐암, 방광암, 두부암, 목암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 신경교종, 결장직장암, 생식비뇨기암 및 위장관암으로 이루어진 군에서 선택된 암인 방법.
제 12 항에 있어서,

단백질 키나제와 연관된 질병이 당뇨병, 자가면역 질환, 과다증식 질환, 재발협착증, 섬유증, 건선, 폰 헤펠-린도(von Heppel-Lindau)병, 골관절염, 류마티스성 관절염, 신생혈관생성, 염증성 질병, 면역원성 질병 및 심혈관 질병으로 이루어진 군에서 선택된 방법.
제 12 항에 있어서,

유기체가 인간인 방법.