ES2251580T3 - Derivados de 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de proteinquinasa. - Google Patents
Derivados de 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de proteinquinasa.Info
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Abstract
Un Compuesto de **Fórmula** en donde: R1 es seleccionado del grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo C1-C10, haloalcoxi C1-C4, cicloalquilo monocíclico C3-C8, [5, 6]- o [6, 6]-cicloalquilo bicíclico fusionado, adamantil, un grupo heteroalicíclico de 5-9 miembros con 1 ó 2 heteroátomos seleccionados entre N, O ó -S(O)n donde n = 0-2, hidroxi, alcoxi C1-C10, cicloalcoxi C3-C8 no sustituido, -C(O)-R8, -NR9R10 y -C(O) NR12R13; R2 es seleccionado del grupo compuesto por hidrógeno, halo, alquilo C1-C10, trihalometilo, hidroxi, alcoxi C1- C10, cicloalcoxi C3-C8 no sustituido, ciano, -NR9R10, - NR9C(O)R10, -C(O)R8, -S(O)2NR9R10 y -SO2R14 (donde R14 es un alquilo C1-C10, arilo C6-C12, alquilo C1-C4 sustituido con arilo C6-C12, un heteroarilo de 5-12 miembros que contiene 1-4 heteroátomos anulares seleccionados del grupo de N, O ó S, y alquilo C1-C4 sustituido con un heteroarilo de 5-12 miembros que contiene 1-4 heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S; R3, R4 y R5 son independientemente hidrógeno o alquilo C1-C10.
Description
Derivados de
3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona
como inhibidores de protein quinasa.
La presente invención está relacionada con
ciertos derivados de la
3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona
que modulan la actividad de las protein quinasas ("PK"). Los
compuestos de esta invención son, por lo tanto, útiles en el
tratamiento de trastornos relacionados con una actividad PK anormal.
Se describen también las composiciones farmacéuticas que comprenden
estos compuestos, el uso de las composiciones farmacéuticas,
incluyendo aquellos compuestos para la fabricación de un medicamento
para tratar y prevenir enfermedades, y los métodos de preparación
de estos compuestos.
Las PK son enzimas que catalizan la fosforilación
de los grupos hidroxi en los residuos de tirosina, serina y treonina
de las proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente
simple son asombrosas: crecimiento celular, proliferación y
diferenciación, esto es, virtualmente todos los aspectos de la vida
celular de una forma u otra dependen de la actividad PK. Además, la
actividad anormal de la PK se ha relacionado con una gran cantidad
de trastornos, desde enfermedades que no amenazan a la vida
relativamente como la soriasis hasta enfermedades extremadamente
virulentas como el glioblastoma (cáncer de cerebro).
Las PK pueden separarse en dos grupos
convenientemente, las proteínas tirosin quinasa (PTK) y las
serina-treonina quinasa (STK).
Uno de los aspectos básicos de la actividad PTK
es su relación con los receptores del factor de crecimiento. Los
receptores del factor de crecimiento son proteínas de la superficie
celular. Cuando se unen mediante un ligando del factor de
crecimiento, los receptores del factor de crecimiento se convierten
a una forma activa que interactúa con proteínas en la superficie
interna de la membrana celular. Esto provoca la fosforilación de los
residuos de tirosina del receptor y otras proteínas y la formación
dentro de la célula de complejos con una gran variedad de moléculas
de señalización citoplasmáticas que, a su vez, tienen efecto sobre
varias respuestas celulares, como la división celular
(proliferación), la diferenciación celular, el crecimiento celular,
la expresión de los efectos metabólicos en el microentorno
extracelular, etc. Para una explicación más completa, ver
Schlessinger y Ullrich, Neuron, 9:303-391
(1992) que se incorpora por referencia, incluyendo cualquier figura,
como si se expusiera por completo aquí.
Los receptores del factor de crecimiento con
actividad PTK se conocen como receptores tirosin quinasa
("RTK"). Comprenden una gran familia de receptores
transmembrana con diferentes actividades biológicas. Actualmente, se
ha identificado al menos diecinueve (19) subfamilias distintas de
RTK. Un ejemplo de esto es la subfamilia llamada los RTK "HER",
que incluye el EGFR (receptor del factor de crecimiento epitelial),
HER2, HER3 y HER4. Estos RTK contienen un dominio de unión del
ligando glicosilado extracelular, un dominio transmembrana y un
dominio catalítico citoplasmático intracelular que puede fosforilar
los residuos de tirosina en las proteínas.
Otra subfamilia RTK consta de un receptor de
insulina (IR), un receptor del factor de crecimiento I similar a la
insulina (IGF-1R) y un receptor relacionado con el
receptor de insulina (IRR). IR e IGF-1R interactúan
con la insulina, IGF-I e IGF-II para
formar un heterotetrámero de dos subunidades \alpha glicosiladas
enteramente extracelulares y dos subunidades \beta que cruzan la
membrana celular y que contienen el dominio de tirosin quinasa.
Una tercera subfamilia RTK es llamado el grupo de
receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas
("PDGFR"), que incluye el PDGFR-\alpha,
PDGFR-\beta, CSFIR, c-kit y
c-fms. Estos receptores contienen dominios
extracelulares glicosilados compuestos por un número variable de
bucles similares a la inmunoglobina y un dominio intracelular donde
el dominio de la tirosin quinasa se interrumpe por secuencias de
aminoácidos no relacio-
nadas.
nadas.
Otro grupo que, debido a su parecido con la
subfamilia PDGFR, es a veces subsumido en el último grupo es el de
la subfamilia de receptores de quinasa de hígado fetal ("flk").
Se cree que este grupo está formado por el receptor con dominio
inserto-quinasa/quinasa de hígado
fetal-1 (KDR/FLK-1,
VEGF-R2), flk-1R,
flk-4 y tirosin quinasa 1 similar a fms
(flt-1).
Otro miembro de la familia de receptores del
factor de crecimiento tirosin quinasa es el subgrupo receptor del
factor de crecimiento de fibroblastos ("FGF"). Este grupo
consta de cuatro receptores, FGFR1-4, y siete
ligandos, FGF1-7. A pesar de que no están totalmente
definidos, parece que los receptores contienen un dominio
extracelular glicosilado compuesto por un número variable de bucles
similares a inmunoglobina y un dominio intracelular en el que la
secuencia de tirosin quinasa se interrumpe por regiones de
secuencias aminoacídicas no relacionadas.
Aún otro miembro de la familia de receptores del
factor de crecimiento tirosin quinasa es el subgrupo de receptores
para el factor de crecimiento vascular endotelial ("VEGF").
VEGF es una glicoproteína dimérica parecida a PDGF pero tiene
funciones biológicas distintas, así como una diferente especificidad
de células diana in vivo. En concreto, actualmente se cree
que VEGF juega un papel esencial en la vasculogénesis y la
angiogénesis.
Se describe una lista más completa de las
subfamilias RTK conocidas en Plowman et al., DN&P,
7(6):334-339 (1994) que se incorpora por
referencia, incluyendo cualquier figura como si se expusiera por
completo aquí.
Además de las RTK, también existe una familia de
PTK completamente intracelular llamada "tirosin quinasas no
receptoras" o "tirosin quinasas celulares". Esta última
designación, abreviada como "CTK" es la que utilizaremos aquí.
Las CTK no contienen dominios extracelulares y transmembrana.
Actualmente, se ha identificado más de 24 CTK en 11 subfamilias
(Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak y Ack).
La subfamilia Src parece ser el grupo más grande
de CTK e incluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. Para
una discusión más detallada sobre las CTK ver Bolen,
Oncogene, 8:202-2031 (993), que se incorpora
por referencia, incluyendo cualquier figura, como si se expusiera
por completo aquí.
Las serina-treonina quinasas, TK,
como las CTK, son predominantemente intracelulares, aunque existen
algunas quinasas receptoras del tipo STK. Las STK son las quinasas
citosólicas más comunes, esto es, quinasas que realizan su función
en aquella parte del citoplasma distinta a los orgánulos
citoplasmáticos y el citoesqueleto. El citosol es la región dentro
de la célula donde la mayoría de la actividad metabólica
intermediaria de la célula y la actividad biosintética tiene lugar,
por ejemplo, es en el citosol donde las proteínas se sintetizan en
los ribosomas.
Las RTK, las CTK y las STK han sido implicadas en
una gran cantidad de condiciones patogénicas, incluyendo, de forma
significativa, el cáncer. Otras condiciones patogénicas que se han
asociado a las PTK incluyen, pero no exclusivamente, soriasis,
cirrosis hepática, diabetes, angiogénesis, restenosis, enfermedades
oculares, artritis reumatoide y otros trastornos inflamatorios,
trastornos inmunológicos como las enfermedades autoinmunes,
enfermedades cardiovasculares como la aterosclerosis y una gran
variedad de trastornos renales.
En referencia al cáncer, dos de las mayores
hipótesis avanzadas para explicar la proliferación celular excesiva
que deriva del desarrollo tumoral están relacionadas con las
funciones que se sabe que regulan las PK. Esto es, se ha sugerido
que el crecimiento celular maligno resulta de un colapso en los
mecanismos que controlan la división y/o la diferenciación celular.
Se ha observado que los productos proteicos de varios
proto-oncogenes están relacionados con las vías de
transducción de señal que regulan la diferenciación y el crecimiento
celular. Estos productos proteicos de
proto-oncogenes incluyen los factores de crecimiento
extracelulares, los receptores PTK del factor de crecimiento
transmembrana (RTK), los PTK citoplasmáticos (CTK) y los STK
citosólicos, antes explicados.
A la vista de la conexión aparente entre las
actividades celulares relacionadas con la PK y la gran variedad de
trastornos humanos, no sorprende que una gran cantidad de esfuerzos
se gasten en un intento para identificar las vías para modular la
actividad PK. Parte de este esfuerzo ha incluido enfoques
biomiméticos que utilizan grandes moléculas tomando como patrón
aquéllas relacionadas con los procesos celulares reales (p.ej.,
ligandos mutantes (Solicitud Estadiunidense. nº 4.966.849);
anticuerpos y receptores solubles (Solicitud nº WO 94/10202,
Kendall y Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci.,
90:10705-09 (194), Kim et al., Nature,
362:841-844 (1993)), ligandos de RNA (Jelinek et
al., Biochemistry, 33:10450-56); Takano
et al., Mol. Bio.Cell 4:358ª (1993); Kinsella et
al., Exp. Cell Res. 199:56-2 (1992);
Wright et al., J. Cellular Phys.,
12:448-57) y con los inhibidores de tirosin quinasa
(WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente
Estadounidense nº 5.330.992; Mariano et al., Proc. Am.
Assoc. Cancer Res., 35:2268 (1994)).
Además de lo citado, también se ha intentado
identificar pequeñas moléculas que actúan como inhibidores de PK.
Por ejemplo, los compuestos bis-monocíclicos,
bicíclicos y heterocíclicos de arilo (PCT WO 92/20642), derivados de
la vinilenazaindol (PCT WO 94/14808) y
1-ciclopropil-4-piridilquinolonas
(Patente estadounidense nº 5,330,992) han sido descritos como
inhibidores de tirosin quinasa. Los compuestos de estirilo (patente
estadounidense nº 5.217.999), los compuestos de piridilo sustituidos
con estirilo (patente estadounidense nº 5.302.606), derivados de
quinazolina (Patente europea nº 0 566 266 A1), selenindoles y
selenuros (PCT WO 94/0342), compuestos polihidroxílicos tricíclicos
(PCT WO 92/21660) y compuestos de ácido bencilfosfónico (PCT WO
91/15495) han sido todos descritos como inhibidores de PTK útiles en
el tratamiento del cáncer. Además, los
4,5-azoloxondinoles tricíclicos se han descrito como
inhibidores de las quinasas dependientes de ciclina (PCT WO
00/035920).
Se describió las
indolin-2-onas
3-sustituidas como un clase nueva de inhibidores de
tirosin quinasa que muestran selectividad para diferentes tirosin
quinasas receptoras y eso las propuso como los principales
compuestos químicos específicos para el desarrollo de fármacos
específicos de RTK con gran aplicación para el tratamiento de
enfermedades humanas (Sun et al., J. Med. Chem. 4114):
2588-2603) (1998)).
La presente invención está dirigida a ciertos
derivados de la
3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona
que muestran capacidad de modulación de PK y son por lo tanto útiles
en el tratamiento de enfermedades relacionadas con una actividad PK
anormal.
\newpage
Una realización de esta invención es un compuesto
de Fórmula (I):
en
donde:
R^{1} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{10},
haloalcoxi C_{1}-C_{4},
C_{3}-C_{8} cicloalquilo monocíclico,
cicloalquilos bicíclicos [5,6]- o [6,6]-fusionados,
adamantil, un grupo heteroalicíclico de 5-9 miembros
conteniendo 1 ó 2 heteroátomos seleccionados entre N, O ó
-S(O)_{n}, donde n = 0-2, hidroxi,
alcoxi C_{1}-C_{10}, cicloalcoxi
C_{2}-C_{8} no sustituido,
-C(O)-R^{8}, -NR^{9}R^{10} y
-C(O)NR^{12}NR^{13};
R^{2} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{10},
trihalometilo, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{10},
cicloalcoxi C_{3}-C_{8} no sustituido, ciano,
-NR^{9}R^{10}, -NR^{9}C(O)R^{10},
-C(O)R^{8},
-S(O)_{2}NR^{9}R^{10} y SO_{2}R^{14} (donde
R^{14} es un alquilo C_{1}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alquilo
C_{1}-C_{4} sustituido con arilo
C_{6}-C_{12}, un heteroarilo de
5-12 miembros con 1-4 heteroátomos
anulares seleccionados del grupo compuesto por N, O ó S, y alquilo
C_{1}-C_{4} sustituido con un heteroarilo de
5-12 miembros con 1-4 heteroátomos
anulares seleccionados entre N, O ó S, y alquilo
C_{1}-C_{4} sustituido con un heteroarilo de
5-12 miembros conteniendo 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S);
R^{3}, R^{4} y R^{5} son independientemente
hidrógeno, o alquilo C_{1}-C_{10};
Z es un arilo C_{6}-C_{12},
un heteroarilo de 5-12 miembros con
1-4 heteroátomos anulares seleccionados de N, O ó S,
un heterociclilo de 3-8 miembros saturado con 1 ó 2
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O, ó
S(O)_{n} donde n = 0-2, y
-NR^{15}R^{16} donde R^{15} y R^{16} son independientemente
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{10}; o R^{15} y
R^{16} junto con el átomo de nitrógeno al que van unidos forman un
grupo heterocicloamino de 3-8 miembros que
opcionalmente contiene 1 ó 2 heteroátomos anulares adicionales
seleccionados entre N, O, ó S(O)_{n} donde n =
0-2;
R^{6} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{10};
R^{7} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo de
5-12 miembros con 1-4 heteroátomos
anulares seleccionados entre N, O, ó S y -C(O)R^{17}
tal como se definirá;
R^{8} es seleccionado el grupo compuesto por
hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{10}, cicloalcoxi
C_{3}-C_{8} no sustituido, ariloxi
C_{6}-C_{12} y un heteroariloxi de
5-12 miembros con 1-4 heteroátomos
anulares seleccionados entre N, O ó S;
R^{9} y R^{10} son seleccionados
independientemente del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, cianoalquilo
C_{1}-C_{10}, cicloalquilo monocíclico
C_{3}-C_{8}, cicloalquilo bicíclico fusionado
[5,6] o [6,6], adamantil, arilo C_{6}-C_{12} y
un heteroarilo de 5-12 miembros conteniendo
1-4 heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó
S; o R^{9} y R^{10} combinados para formar un grupo
heterocicloamino de 3-8 miembros conteniendo
opcionalmente 1 ó 2 heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó
S(O)_{n} donde n = 0-2;
R^{12} y R^{13} son independientemente
seleccionados entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{10}, y arilo
C_{6}-C_{12}; o R^{12} y R^{13} junto con el
átomo de nitrógeno al que van unidos forman un grupo
heterocicloamino de 3-8 miembros que opcionalmente
contiene 1 ó 2 heteroátomos anulares adicionales seleccionados entre
N, O ó S(O)_{n} donde n = 0-2;
R^{17} es seleccionado del grupo compuesto por
alquilo C_{1}-C_{10}, cicloalquilo monocíclico
C_{3}-C_{8}, cicloalquilo bicíclico fusionado
[5,6] o [6,6], adamantil, arilo C_{6}-C_{12},
hidroxi y heteroarilo de 5-12 miembros conteniendo
1-4 heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó
S;
o una sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos;
\newpage
siempre y cuando el compuesto no sea
y en
donde
el alquilo C_{1}-C_{10} sea
sustituido o no sustituido, y cuando sea sustituido, el grupo o
grupos sustituyente(s) sea seleccionado entre halo, hidroxi,
alcoxi C_{1}-C_{4}, arilo
C_{6}-C_{12}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, un heteroarilo de
5-12 miembros conteniendo 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S, un grupo
heteroalicíclico de 5-9 miembros que contenga 1 ó 2
heteroátomos seleccionados entre N, O ó -S(O)_{n}
donde n = 0-2, -C (O) R^{8}, -NR^{9}R^{10} y
-C (O) NR^{9}R^{10};
C_{3}-C_{8} cicloalquilo
monocíclico, cicloalquilo bicíclico fusionado [5,6] o [6,6], y
adamantil pueden estar sustituidos o no sustituidos, y cuando están
sustituidos, el grupo o grupos sustituyente(s) es uno o dos
grupos independientemente seleccionados entre el alquilo
C_{1}-C_{4}, el trihaloalquilo
C_{1}-C_{4}, halo, hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{4}, arilo
C_{6}-C_{12}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, un heteroarilo de 6 miembros con
1-3 átomos de nitrógeno anulares, heteroarilo de 5
miembros con 1-3 heteroátomos seleccionados entre N,
O ó S, un grupo heteroalicíclico de 5-6 miembros con
1-3 heteroátomos seleccionados entre N, O ó S,
mercapto, S-alquilo C_{1}-C_{4},
S-arilo C_{6}-C_{12}, ciano,
-C(O)-R'', -C(S)-R'',
-OC(O)NR^{12}R^{13}, R^{9}OC (O) NR^{10}-, -OC
(S) NR^{12}R^{13}, R^{9}OC (S) NR^{10}-,
-C(O)NR^{9}R^{10},
R^{9}C(O)NR^{10}-, nitro,
NR^{9}S(O)_{2}R^{10},
-S(O)_{2}NR^{9}R^{10}, R^{9}S(O)-,
R^{9}S(O)_{2}-, C(O)OR^{9},
R^{9}C(O)O-, y -NR^{9}R^{10};
El arilo C_{6}-C_{12} puede
ser sustituido o insustituido, y cuando es sustituido, el grupo o
grupos sustituyentes son seleccionados independientemente del halo,
alquilo C_{1}-C_{4}, trihaloalquilo
C_{1}-C_{4}, hidroxi, mercapto, ciano, carboxi,
NR^{9}S(O)_{2}R^{10},
R^{9}C(O)NR^{10}-, -NHR o -NRR donde R es un
alquilo C_{1}-C_{4}, un cicloalquilo monocíclico
C_{3}-C_{8}, un cicloalquilo bicíclico fusionado
[5,6] ó [6,6], o adamantil;
Un heteroarilo de 5-12 miembros
puede estar sustituido o no sustituido, y cuando está sustituido, el
grupo o grupos sustituyente(s) se definen como para el arilo
C6-C12 anterior;
Un heteroalicíclico de 5-9
miembros puede estar sustituido o no sustituido, y cuando está
sustituido, el grupo o grupos sustituyente(s) se define como
para el arilo C6-C12 anterior;
Un heterociclilo saturado de 3-8
miembros puede estar sustituido o no sustituido, y cuando está
sustituido, el grupo o grupos sustituyente(s) es uno o dos
grupos independientemente seleccionados entre = O (como un
C-sustituyente para formar un grupo carbonilo),
halo, un alquilo C1-C4, un alquilo
C1-C4 sustituido con carboxi o -C (O)
O-R'' con R'' tal como se describe aquí, excepto
porque R'' no puede ser hidrógeno, hidroxi y -NHR ó -NRR, donde R es
un alquilo C_{1}-C_{4}, o un cicloalquilo
monocíclico C3-C8, un cicloalquilo bicíclico
fusionado [5,6] ó [6, 6], o adamantil.
Un heterocicloamino puede estar sustituido o no
sustituido, y cuando está sustituido, el grupo o grupos
sustituyen-
te(s) se define como para el heterociclilo saturado de 3-8 miembros antes mencionado;
te(s) se define como para el heterociclilo saturado de 3-8 miembros antes mencionado;
El alcoxi C_{1}-C_{10} puede
estar sustituido o no sustituido, y cuando está sustituido, el grupo
o grupos sustituyente(s) se define como para el alquilo
C_{1}-C_{10} anterior;
El ariloxi C_{6}-C_{2} y el
heteroariloxi de 5-2 miembros puede estar sustituido
o no sustituido, y cuando está sustituido, el grupo o grupos
sustituyente(s) se define como para el arilo
C_{6}-C_{12} anterior;
R'' se selecciona del grupo compuesto por
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, trihalometilo,
cicloalquilo monocíclico C_{3}-C_{8}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo de
5-12 miembros con 1-4 heteroátomos
anulares seleccionados entre N, O ó S, y un grupo heteroalicíclico
de 5-9 miembros conteniendo 1 ó 2 heteroátomos
seleccionados entre N, O ó -S(O)_{n} donde n =
0-2.
Otra realización es un compuesto de Fórmula I en
donde
R^{1} se selecciona a partir del grupo
compuesto por hidrógeno, halo, alquilo C1-C10,
cicloalquilo monocíclico C3-C8, cicloalquilo
bicíclico fusionado [5,6] ó [6,6], adamantil, un grupo
heteroalicíclico de 5-9 miembros conteniendo 1 ó 2
heteroátomos seleccionados entre N, O ó -S(O)_{n}
donde n = 0-2, hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{10}, cicloalcoxi C3-C8
insustituido, -C(O)-R^{8},
-NR^{9}R^{10} y -C(O)NR^{12}R^{13};
R^{2}, R^{14}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, Z,
R^{15}, R^{16}, R^{6}, R^{7}, R^{8}, R^{9}, R^{10} son
como se define en la reivindicación 1;
R^{12} y R^{13} son independientemente
seleccionados a partir del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, y arilo
C_{6}-C_{12}, o R^{12} y R^{13} junto con el
átomo de nitrógeno al que van unidos forman un grupo
heterocicloamino de 3-8 miembros que opcionalmente
contiene 1 ó 2 heteroátomos anulares adicionales seleccionados entre
N, O ó S(O)_{n} donde n = 0-2;
R^{17} es como se define en la reivindicación
1;
o una sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos.
Otra realización es el compuesto de Fórmula
(Ia):
en
donde:
R^{1}, R^{3}, R^{4}, y R^{5} son
hidrógeno;
R^{2} es fluoro y está situado en la posición 5
del anillo de indolinona;
Z es
morfolin-4-ilo;
R^{6} y R^{7} son metilo.
Preferiblemente, la estereoquímica en el *C es
(S).
Otra realización es una composición farmacéutica
que comprende un compuesto o sal de Fórmula I ó Ia y un
transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otra realización es un método para la modulación
de la actividad catalítica de una protein quinasa in Vitro,
incluyendo la puesta en contacto de la protein quinasa con un
compuesto o sal de Fórmula I o Ia. La protein quinasa para este
método puede ser una tirosin quinasa del receptor, una tirosin
quinasa que no pertenezca al receptor y una
serina-treonina quinasa.
Otra realización es el uso de una composición
farmacéutica, incluyendo un compuesto o sal de Fórmula I ó Ia y un
excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable para la
fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno
relacionado con una protein quinasa en un organismo. El trastorno
relacionado con la protein quinasa puede ser un trastorno
relacionado con la tirosin quinasa del receptor, un trastorno
relacionado con la tirosin quinasa no perteneciente a un receptor y
un trastorno relacionado con la serina-treonina
quinasa. El trastorno relacionado con una protein quinasa puede ser
un trastorno relacionado con EGFR, un trastorno relacionado con
PDGFR, un trastorno relacionado con IGFR y un trastorno relacionado
con flk. El trastorno de protein quinasa puede también ser un
carcinoma celular escamoso, un astrocitoma, un sarcoma de Kaposi, un
glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y
cuello, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de
mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, glioma, cáncer
colorectal, cáncer genitourinario y cáncer gastrointestinal. Además,
el trastorno de la protein quinasa puede también ser diabetes, un
trastorno autoinmune, un trastorno hiperproliferativo, restenosis,
fibrosis, soriasis, enfermedad de von Heppel-Lindau,
osteoartritis, artritis reumatoide, angiogénesis, un trastorno
inflamatorio, un tras-
torno inmunológico, un trastorno cardiovascular. En una realización, el organismo antes mencionado es un ser humano.
torno inmunológico, un trastorno cardiovascular. En una realización, el organismo antes mencionado es un ser humano.
En otra realización, esta invención va dirigida a
los métodos de preparación de compuestos de Fórmula (I).
Por último, esta invención está también dirigida
a identificar un compuesto químico que modula la actividad
catalítica de una protein quinasa al poner en contacto las células
que expresan la protein quinasa con un compuesto o sal de la
presente invención y luego monitorizando las células en busca de
efectos.
A menos que se especifique lo contrario, los
siguientes términos utilizados en la especificación y las
reivindicaciones tienen los siguientes significados:
"Alquilo" se refiere a un hidrocarburo
alifático saturado radical que incluye grupos de cadena ramificada y
no ramificada de 1 a 20 átomos de carbono (cuando se especifique un
rango numérico, p.ej. "1-20", eso significa que
el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 átomo de
carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc. hasta 20
átomos de carbono incluido). Preferentemente, es un alquilo de
tamaño medio con de 1 a 10 átomos de carbono, p.ej. metilo, etilo,
propilo, 2-propilo, n-butilo,
iso-butilo, terc-butilo, pentilo, y
similares. Idóneamente, es un alquil inferior que contiene de 1 a 4
átomos de carbono, p.ej. metilo, etilo, propilo,
2-propilo, n-butilo,
iso-butilo, o terc-butilo, y
similares. El alquilo puede estar sustituido o insustituido, y
cuando está sustituido, el grupo o grupos sustituyente(s) es
preferiblemente halo, hidroxi, alcoxi inferior, arilo, ariloxi,
heteroarilo, heteroalicíclico, C(O)R^{8},
NR^{9}R^{10}, y C(O) NR^{9}R^{10}.
"Cicloalquilo" se refiere a un anillo
monocíclico de 3 a 8 miembros todos de carbono, un anillo bicíclico
fusionado todo de carbono de 5 miembros/6 miembros o de 6 miembros/6
miembros, o un grupo de anillos fusionados multicíclico (un sistema
de anillo "fusionado" significa que cada anillo en el sistema
comparte un par de átomos adyacentes de carbono con otro anillo en
el sistema) donde uno o más anillos tiene un sistema
pi-electrón completamente conjugado. Entre los
ejemplos, pero no de forma exclusiva, de grupos cicloalquilo están
el ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno,
cicloheano, ciclohexadieno, adamantano, cicloheptano,
cicloheptatrieno, y similares. Un grupo cicloalquilo puede estar
sustituido o no. Cuando está sustituido el grupo o grupos
sustituyente(s) es preferiblemente uno o más, preferentemente
uno o dos sustituyentes, independientemente seleccionados entre el
grupo compuesto por alquilo inferior, trihaloalquilo, halo, hidroxi,
alcoxi inferior, arilo opcionalmente sustituido con uno o más,
preferiblemente uno o dos grupos independientemente de cada uno de
halo, hidroxi, grupos alquilo inferior o alcoxi inferior,
heteroarilo de 6 miembros conteniendo de 1 a 3 átomos de nitrógeno
en el anillo, siendo los carbonos del anillo opcionalmente
sustituidos con uno o más, preferiblemente uno o dos grupos
independientemente entre ellos con halo, hidroxi, grupos
alquiloinferior o alcoxi inferior, heteroarilo de 5 miembros con de
1 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo compuesto por
nitrógeno, oxígeno y azufre. En este caso, los átomos de carbono y
nitrógeno del grupo están opcionalmente sustituidos con uno o más,
preferiblemente uno o dos grupos independientemente entre ellos de
halo, hidroxi, grupos alquilo inferior o alcoxi inferior, grupos
heteroalicíclicos de 5 ó 6 miembros con de 1 a 3 heteroátomos
seleccionados entre el grupo compuesto por nitrógeno, oxígeno y
azufre. Los átomos de carbono y nitrógeno (en caso de estar
presente) en el grupo están opcionalmente sustituidos con uno o más,
preferiblemente uno o dos grupos independientemente entre ellos, de
halo, hidroxi, grupos alquilo inferior o alcoxi inferior, mercapto,
(alquilo inferior) tio, ariltio opcionalmente sustituido con uno o
más, preferiblemente uno o dos grupos independientemente entre
ellos, de halo, hidroxi, grupos alquilo inferior o alcoxi inferior,
ciano, acilo, tioacilo, O-carbamilo,
N-carbamilo, O-tiocarbamilo,
N-tiocarbamio, C-amido,
N-amido, nitro, N-sulfonamido,
S-sulfonamido, R^{9}S (O)-,
R^{9}S(O)2-, -C(O)OR^{9},
R^{9}C(O)O-, y -NR^{9}R^{10} son como se ha
definido anteriormente.
"Alquenilo" se refiere a un grupo alquilo,
como se ha descrito, que consta de por lo menos dos átomos de
carbono y al menos un enlace doble carbono-carbono.
Algunos ejemplos representativos incluyen, pero no exclusivamente,
etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo,
1-, 2-, ó 3-butenilo, y similares.
"Alquinilo" se refiere a un grupo alquilo,
como se ha definido aquí, que consta de por lo menos dos átomos de
carbono y al menos un enlace triple carbono-carbono.
Algunos ejemplos representativos incluyen, pero no exclusivamente,
etinilo, 1-propinilo, 2-propinilo,
1-, 2-, ó 3-butinilo, y similares.
"Arilo" se refiere a un grupo monocíclico
todo de carbono o un grupo policíclico de anillos fusionados (esto
es, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) de
1 a 12 átomos de carbono con sistemas pi-electrón
completamente conjugados. Entre los ejemplos de grupo arilo se
incluye, pero no exclusivamente, fenilo, naftalenilo y antracenilo.
El grupo arilo puede estar sustituido o no. Cuando está sustituido,
el grupo o grupos sustituidos es preferiblemente uno o más,
preferentemente uno, dos o tres, e idóneamente uno o dos,
independientemente seleccionados del grupo compuesto por el alquilo
inferior, trihaloalquilo, halo, hidroxi, alcoxi inferior, mercapto,
(alquilo inferior) tio, ciano, acilo, tioacilo,
O-carbamilo, N-carbamilo,
O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo,
C-amido, N-amido, nitro,
N-sulfonamido, S-sulfonamido,
R^{9}S(O)-, R^{9}S(O)_{2}-, -C(O)
OR^{9}, R^{9}C (O) O-, y - -NR^{9}R^{10}, con R^{9}
y R^{10} como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, el
grupo arilo está opcionalmente sustituido con uno o dos
sustituyentes independientemente seleccionados de halo, alquilo
inferior, trihaloalquilo, hidroxi, mercapto, ciano,
N-amido, mono o dialquilamino, carboxi, o
N-sulfonamido.
"Heteroarilo" se refiere a un anillo
monocíclico o grupo de anillos fusionados (esto es, anillos que
comparten un par adyacente de átomos) de 5 a 12 átomos anulares que
contienen uno, dos, tres o cuatro heteroátomos anulares
seleccionados entre N, O ó S, siendo el resto de átomos anulares C,
y, además, teniendo un sistema pi-electrón
totalmente conjugado. Ejemplos, pero no exclusivamente, de grupos
heteroarilo insustituidos son el pirrolo, furano, tiofeno, imidazol,
oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina,
isouinolina, purina, tetrazol, triazina, y carbazol. El grupo
heteroarilo puede estar sustituido o no. Cuando está sustituido, el
grupo o grupos sustituidos es preferiblemente uno o más,
preferentemente uno, dos o tres, e idóneamente uno o dos,
independientemente seleccionados a partir del grupo compuesto por
alquilo inferior, trihaloalquilo, halo, hidroxi, alcoxi inferior,
mercapto, (alquilo inferior) tio, ciano, acilo, tioacilo,
O-carbamilo, N-carbamilo,
O-tiocarcamilo, N-tiocarbamilo,
C-amido, N-amido, nitro,
N-sulfonamido, S-sulfonamido
R^{9}S(O)-, R^{9}(O)_{2}-,
-C(O)OR^{9}, R^{9}C(O)O-, y
-NR^{9}R^{10}, con R^{9} y R^{10} como se ha definido
anteriormente. Preferiblemente, el grupo heteroarilo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes
independientemente seleccionados entre halo, alquilo inferior,
trihaloalquilo, hidroxi, mercapto, ciano, N-amido,
mono o dialquilamino, carboxi, o N-sulfonamido.
"Heteroalicíclico" se refiere a un grupo de
anillos fusionados o monocíclico que tiene en el anillo o anillos de
5 a 9 átomos anulares en los que uno o dos átomos anulares son
heteroátomos seleccionados entre N, O ó S(O)_{n}
(donde n es un número entero entre 0 y 2), siendo el resto de átomos
C. Los anillos también pueden tener uno o más enlaces dobles. Sin
embargo, los anillos no tienen un sistema
pi-electrón completamente conjugado Algunos
ejemplos, pero no exclusivamente, de grupos heteroalicíclicos no
sustituidos son el pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino,
tiomorfolino, homopiperazino, y similares. El anillo
heteroalicíclico puede ser sustituido o no. Cuando está sustituido,
el grupo o grupos sustituidos es preferiblemente uno o más,
preferentemente uno, dos o tres, e idóneamente uno o dos
independientemente seleccionados a partir de grupo compuesto por
alquilo inferior, trihaloalquilo, halo, hidroxi, alcoxi inferior,
mercapto, (alquilo inferior) tio, ciano, acilo, tioacilo,
O-carbamilo, N-carbamilo,
O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo,
C-amino, N-amido, nitro,
N-sulfonamido, S-sulfonamido,
R^{9}S (O) -, R^{9}S(O)_{2}-,
-C(O)OR^{9}, R^{9}C(O)O-, y
-NR^{9}R^{10}, con R^{9} y R^{10} como se han definido
anteriormente. Preferiblemente, el grupo heteroalicíclico está
opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes
independientemente seleccionados entre el halo, un alquilo inferior,
trihaloalquilo, hidroxi, mercapto, ciano, N-amido,
mono o dialquilamino, carboxi, o N-sulfonamido.
"Heterociclo" significa un radical cíclico
saturado de 3 a 8 átomos anulares en el que uno o dos átomos
anulares son heteroátomos seleccionados entre N, O ó
S(O)_{n} (donde n es un número entero entre 0 y 2),
los átomos anulares restantes son C, donde uno o dos átomos de C
pueden opcionalmente ser reemplazados por un grupo carbonilo. El
anillo heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido
independientemente con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados
entre alquilos inferiores opcionalmente sustituidos con uno o dos
sustituyentes independientemente seleccionados entre el grupo
carboxi o éster, haloalquilos, cianoalquilos, halos, nitros, cianos,
hidroxis, alcoxis, aminos, monoalquilaminos, dialquilaminos,
aralquilos, heteroaralquilos, y -COR (donde R es alquilo). Más
concretamente, el término heterociclilo incluye, pero no
exclusivamente, tetrahidropiranilo,
2,2-dimetil-1,3-dioxolano,
piperidino,
N-metilpeperidin-3-il,
piperazino,
N-metilpirrolidin-3-il,
pirrolidino, morfolino, tiomorfolino,
tiomorfolino-1-óxido,
tiomorfolino-1,1-dióxido,
4-etiloxicarboilpiperazino, 3oxopiperazino,
2-imidazolidona, 2-pirrolidinona,
2-oxohomopiperazino,
tetrahidropirimidin-2-ona, y los
derivados de los mismos. Preferiblemente, el grupo heterociclo está
opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes
independientemente seleccionados entre halo, alquilo inferior,
alquilo inferior sustituido con carboxi, hidroxi éster, o mono o
dialquilamino.
"Heterocicloamino" significa un radical
cíclico saturado de 3 a 8 átomos anulares en el que por lo menos uno
de los átomos anulares es nitrógeno y opcionalmente donde uno o dos
átomos anulares adicionales son heteroátomos seleccionados entre N,
O ó S(O)_{n} (donde n es un número entero entre 0 y
2), siendo el resto de átomos anulares C, donde uno o dos átomos de
C pueden ser opcionalmente reemplazados por un grupo carbonilo. El
anillo heterocicloamino puede estar opcionalmente sustituido
independientemente con no, dos o tres sustituyentes seleccionados a
partir de alquilos inferiores opcionalmente sustituidos con uno o
dos sustituyentes independientemente seleccionados entre los grupos
carboxi o éster, haloalquilo, cianoalquilo, halo, nitro, ciano,
hidroxi, alcoxi, amino, monoalquilamino, dialquilamino, aralquilo,
heteroaralquilo, y -COR (donde R es alquilo. Más específicamente el
término heterocicloamino incluye, pero no exclusivamente,
piperidin-1-ilo,
piperazin-2-ilo,
pirrolidin-1-ilo,
morfolin-4-ilo,
tiomorfolin-4-ilo,
tiomorfolino-1-óxido,
tiomorfolino-1,1-dióxido,
4-etiloxicarbonilpiperazin-1-ilo,
3-oxopiperazin-1-ilo,
2-imidazolidon-1-ilo,
2-pirrolidinon-1-ilo,
2-oxohomopiperazino,
tetrahidropirimidin-2-ona, y sus
derivados. Preferiblemente, el grupo heterociclo está opcionalmente
sustituido con uno o dos sustituyentes independientemente
seleccionados entre halo, alquilo inferior, alquilo inferior
sustituido con carboxi o éster, hidroxi, o mono o dialquilamino. El
grupo heterocicloamino es un subconjunto del grupo heterociclo antes
definido.
"Hidroxi" se refiere a un grupo -OH.
"Alcoxi" se refiere tanto a un grupo
-O-(alquilo) como a un -O-(cicloalquilo no sustituido). Algunos
ejemplos representativos incluyen, pero no exclusivamente, metoxi,
etoxi, propoxi, butoxi, ciclopropiloxi, ciclobutiloxi,
ciclopentiloxi, ciclohexiloxi y similares.
"Haloalcoxi" se refiere a un grupo
-O-(haloalquilo). Los ejemplos representativos incluyen, pero no
exclusivamente, trifluorometoxi, tribromometoxi, y similares.
"Ariloxi" se refiere tanto a un grupo
-O-arilo como a un -O-heteroarilo,
como se ha definido aquí. Los ejemplos representativos incluyen,
pero no exclusivamente, fenoxi, piridiniloxi, furaniloxi, tieniloxi,
pirimidiniloxi, piraciniloxi, y similares, así como sus
derivados.
"Mercapto" se refiere a un grupo -SH.
"Alquiltio" se refiere tanto a un grupo
-S-(alquilo) como a un -S-(alquilo no sustituido). Algunos ejemplos
representativos, pero no exclusivos, son, metilito, etiltio,
propiltio, butiltio, ciclopropiltio, ciclobutiltio, ciclopentiltio,
cicloheiltio, y similares.
"Ariltio" se refiere tanto a un grupo
-S-arilo como a un grupo
-S-heteroarilo, como se ha definido aquí. Algunos
ejemplos representativos incluyen, pero no exclusivamente, feniltio,
piridiniltio, furaniltio, tieniltio, pirimidiniltio, y similares y
sus derivados.
"Acilo" se refiere a un grupo
-C(O)-R'', donde R'' es seleccionado a partir
del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo inferior, trihalometilo,
cicloalquilo no sustituido, arilo opcionalmente sustituido con uno o
más, preferiblemente uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del
grupo compuesto por alquilos inferiores, trihalometilos, alcoxi
inferiores, halos y grupos -NR^{9}R^{10}, heteroarilos (unidos
mediante un carbono anular) opcionalmente sustituidos con uno o más,
preferiblemente uno, dos o tres sustituyentes seleccionados del
grupo compuesto por alquilos inferiores, trihalolquilos, alcoxi
inferiores, halos y grupos -NR^{9}R^{10} y heteroalicíclicos
(unidos mediante un carbono anular) opcionalmente sustituidos con
uno o más, preferiblemente uno, dos o tres sustituyentes
seleccionados del grupo compuesto por alquilos inferiores,
trihaloalquilos, alcoxi inferiores, halos y grupos
-NR^{9}R^{10}. Entre los grupos acilo representativos se
encuentran, pero no exclusivamente, el acetilo, trifluoroacetilo,
benzoilo y similares.
"Aldehído" se refiere a un grupo acilo donde
R'' es hidrógeno.
"Tioacilo" se refiere a un grupo
-C(S)-R'', con R'' tal y como se define
aquí.
"Éster" se refiere a un grupo
-C(O)O-R'' con R'' definido aquí
excepto por el hecho de que R'' no puede ser hidrógeno.
El grupo "acetilo" se refiere a un grupo
-C(O)CH_{3}.
El grupo "halo" se refiere a fluorina,
clorina, bromita o yodina, preferiblemente fluorina o clorina.
El grupo "trihalometilo" se refiere a un
grupo CX_{3} donde X es un halo como se ha definido antes.
El grupo "trihalometanosulfonilo" se refiere
a los grupos X_{3}C_{S}(=O)_{2}- con X como se ha
definido antes.
"Ciano" se refiere a un grupo -C=N.
"S-sulfonamido" se refiere a
un grupo -S(O)_{2}NR^{9}R^{10}, con R^{9} y
R^{10} tal como se ha definido antes.
"N-sulfonamido" se refiere a
un grupo -NR^{9}S(O)_{2}R^{10} con R^{9} y
R^{10} tal como se define aquí.
El grupo "O-carbamilo" se
refiere a un grupo -OC(O)NR^{12}R^{13} con
R^{12} y R^{13} como se ha definido aquí.
"N-carbamilo" se refiere a
un grupo R^{9}OC(O)NR^{10}-, con R^{9} y
R^{10} como se han definido aquí.
"O-tiocarbamilo" se refiere
a un grupo -OC(S)NR^{12}R^{13} con R^{12} y
R^{13} como se ha definido aquí.
"N-tiocarbamilo" se refiere
a un grupo R^{9}OC(S)NR^{10}-, con R^{9} y
R^{10} como se ha definido aquí.
"Amino" se refiere a un grupo
-NR^{9}R^{10}, donde R^{9} y R^{10} son ambos hidrógeno.
"C-amido" se refiere a un
grupo -C(O)NR^{9}R^{10} con R^{9} y R^{10}
como se ha definido aquí.
"N-amido" se refiere a un
grupo R^{9}C(O)NR^{10}-, con R^{9} y R^{10}
como se ha definido aquí.
"Nitro" se refiere a un grupo -NO_{2}.
"Haloalquilo" significa un alquilo,
preferiblemente un alquilo inferior, como se ha definido
anteriormente, que está sustituido con uno o más átomos de halo
iguales o diferentes, p.ej. -CH_{2}Cl, -CF_{3},
-CH_{2}CF_{3}, -CH_{2}CCl_{3}, y similares.
"Hidroxialquilo" significa un alquilo,
preferiblemente un alquilo inferior, como se ha definido
anteriormente, que está sustituido con uno, dos o tres grupos
hidroxi, p.ej., hidroximetilo, 1 ó 2-hidroxietilo,
1,2-, 1,3-, ó 2,3-dihidroxipropilo, y similares.
"Aralquilo" significa un alquilo,
preferiblemente un alquilo inferior como se ha definido
anteriormente que está sustituido con un grupo arilo como se ha
descrito antes, p.ej., -CH_{2}fenilo,
-(CH_{2})_{2}fenilo, -(CH_{2})_{3}fenilo,
CH_{3}CH(CH_{3})CH_{2}fenilo, y los similares,
así como sus derivados.
El grupo "heteroaralquilo" se refiere a un
alquilo, preferiblemente un alquilo inferior como se ha definido
antes, que está sustituido con un grupo heteroarilo, p.ej.,
-CH_{2}piridinilo, -(CH_{2})_{2}pirimidinilo,
-(CH_{2})_{3}imidazolilo, y los similares, así como sus
derivados.
"Monoalquilamino" significa un radical -NHR
donde R es un alquilo o un grupo cicloalquilo no sustituido, como se
ha definido anteriormente, p.ej., metilamino,
(1-metiletil)amino, ciclohexilamino, y los
similares.
"Dialquilamino" significa un radical -NRR
donde cada R es independientemente un alquilo o un grupo
cicloalquilo no sustituido como se ha definido anteriormente, p.ej.,
dimetilamino, dietilamino,
(1-metiletil)-etilamino,
ciclohexilmetilamino, ciclopentilmetilamino, y similares.
"Opcional" u "opcionalmente" significa
que el evento o circunstancia subsiguiente puede ocurrir, pero no
necesariamente, y que la descripción incluye ejemplos donde el
evento o circunstancia tiene lugar y ejemplos donde no. Por ejemplo,
"grupo heterociclo opcionalmente sustituido con un grupo
alquilo" significa que el alquilo puede estar presente, pero no
necesariamente, y la descripción incluye situaciones donde el grupo
heterociclo está sustituido con un grupo alquilo y situaciones donde
el grupo heterociclo no está sustituido con el grupo alquilo.
Los términos "2-indolinona",
"indolin-2-ona" y
"2-oxindol" se usan de forma intercambiable
aquí para referirse a una molécula con la siguiente estructura
química:
El término "pirrolo" se refiere a una
molécula con la siguiente estructura química:
Los compuestos que tienen la misma fórmula
molecular pero difieren en la naturaleza o secuencia de los enlaces
entre sus átomos o la organización de los átomos en el espacio
reciben el nombre de "isómeros". Los isómeros que difieren en
la organización de sus átomos en el espacio reciben el nombre de
"estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes
especulares entre sí se llaman "diastereómeros" y aquéllos que
son imágenes especulares no-superponibles entre sí
se llaman "enantiómeros". Cuando un compuesto tiene un centro
asimétrico, por ejemplo, está unido a cuatro grupos diferentes, un
par de enantiómeros es posible. Un enantiómero puede caracterizarse
por la configuración absoluta de su centro asimétrico y se describe
por las reglas de nomenclatura R- y S- de Cahn y Prelog, o por la
forma en la que la molécula rota el plano de la luz polarizada y se
designan como dextrogiras o levogiras (es decir, como isómeros (+) o
(-), respectivamente). Un compuesto quiral puede existir como un
enantiómero individual o como una mezcla de los mismos. Una mezcla
que contenga las mismas proporciones de los enantiómeros recibe el
nombre de "mezcla racémica".
Los compuestos de esta invención pueden contener
uno o más centros asimétricos. Tales compuestos pueden por lo tanto
producirse como estereoisómeros (R)- o
(S)-individuales o como mezclas de los mismos. Por
ejemplo, el átomo de carbono que tiene un grupo hidrógeno en
-CONHCHR^{3}-CR^{4}(OH)CR^{5}Z
en un compuesto de fórmula (I) es un centro asimétrico y por lo
tanto el compuesto de Fórmula (I) puede existir como un
estereoisómero (R)- o (S)-. A menos que se indique lo contrario, la
descripción o mención de un compuesto concreto en las
especificaciones y reivindicaciones pretende incluir tanto los
enantiómeros individuales como las mezclas, recémicas o no, de los
mismos. Los métodos para la determinación de esteroquímica y la
separación de estereoisómeros son bien conocidos en la materia (ver
explica-
ción en el capítulo 4 de "Advanced Organic Chemistry", 4ª edición J. March, John Wiley e Hijos, New York, 1992).
ción en el capítulo 4 de "Advanced Organic Chemistry", 4ª edición J. March, John Wiley e Hijos, New York, 1992).
Los compuestos de Fórmula (I) pueden mostrar el
fenómeno de tautomerismo e isomerismo estructural. Por ejemplo, los
compuestos descritos aquí pueden adoptar una configuración E o Z
sobre el enlace doble que conecta la fracción
2-indolinona con la fracción pirrolo, o pueden ser
una mezcla de E y Z. Esta invención contempla cualquier forma
tautomérica o isómero estructural y las mezclas de las mismas que
tengan la capacidad de modular la actividad RTK, CTK y/o STK y no se
limita a ninguna única forma tautomérica o isómero estructural.
Una "composición farmacéutica" se refiere a
la mezcla de uno o más de los compuestos descritos aquí, o las sales
fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables o profármaco de los
mismos, con otros componentes químicos, como vehículos
fisiológicamente/farmacéuticamente aceptables y excipientes. La
intención de una composición farmacéutica es la de facilitar la
administración de un compuesto en el organismo.
El compuesto de Fórmula (I) puede también actuar
como un profármaco. Un "profármaco" es un agente que se
convierte en el fármaco progenitor in vivo. Los profármacos
son a menudo útiles porque, en algunas situaciones, pueden ser más
fáciles de administrar que la droga progenitora. Por ejemplo, pero
no limitante, de un profármaco podría ser un compuesto de la
presente invención que se administre como un éster (el
"profármaco") para facilitar la transmisión a través de la
membrana celular donde la solubilidad acuosa es perjudicial para la
movilidad pero luego es hidrolizado metabólicamente al ácido
carboxílico, la entidad activa, una vez dentro de la célula, donde
la solubilidad acuosa es beneficiosa.
Otro ejemplo de un profármaco puede ser un
polipéptido corto, por ejemplo, sin ser limitante, un polipéptido de
2-10 aminoácidos, unido mediante el grupo amino
terminal a un grupo carboxi de un compuesto de esta invención donde
el polipéptido es hidrolizado o metabolizado in vivo para
liberar la molécula activa. Los profármacos de un compuesto de
Fórmula (I) están dentro del ámbito de esta invención.
Adicionalmente, se contempla que un compuesto de
Fórmula (I) sea metabolizado por enzimas en el cuerpo del organismo,
como un ser humano, para generar un metabolito que pueda modular la
actividad de las protein quinasas. Tales metabolitos están dentro
del ámbito de la presente invención.
Tal y como se usa aquí, un "transportador
fisiológicamente/farmacéuticamente aceptable" se refiere a un
vehículo o diluyente que no provoca irritación significativa a un
organismo y que no anule las propiedades y la actividad biológica
del compuesto administrado.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable"
se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición
farmacéutica para facilitar más la administración de un compuesto.
Algunos ejemplos, pero no exclusivamente, de excipientes incluyen el
carbonato de calcio, el fosfato de calcio, varios azúcares y tipos
de almidón, derivados de la celulosa, gelatina, aceites vegetales y
polietilenglicoles.
Tal como se usa aquí, el término "sal
farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que
retienen la efectividad y propiedades biológicas del compuesto
progenitor. Tales sales incluyen:
(i) sal de adición ácida que se obtiene por
reacción de una base libre del compuesto progenitor con ácidos
inorgánicos como el ácido hidroclórico, el ácido hidrobrómico, el
ácido nítrico, el ácido fosfórico, el ácido sulfúrico, y el ácido
perclórico y similares, o con ácidos orgánicos como el ácido
acético, el ácido oxálico, el ácido málico (D) o (L), el ácido
maleico, el ácido metanosulfónico, el ácido etanosulfónico, el ácido
p-toluenosulfónico, el ácido salicílico, el ácido
tartárico, el ácido cítrico, el ácido succínico o el ácido malónico
y los similares, preferiblemente ácido hidroclórico o
(L)-málico; o
(ii) sales formadas cuando un protón acídico
presente en el compuesto progenitor son reemplazadas por un ión
metálico, p.ej., un ión metálico alcali un ión alcalinotérreo, o un
ión de aluminio, o cuando se coordina con una base orgánica como la
etanolamina, la dietanolamina, trietanolamina, trometamina,
-metilglucamina, y similares.
"PK" se refiere a un receptor protein
tirosin quinasa (RTK), la tirosin quinasa no receptora o
"celular" y serina-treonina quinasas (STK).
El "método" se refiere a la forma, los
utensilios, las técnicas y los procedimientos para conseguir una
tarea concreta incluyendo, pero no de forma exclusiva, aquellas
maneras, utensilios, técnicas y procedimientos y sean conocidas o ya
desarrolladas a partir de maneras, utensilios, técnicas y
procedimientos conocidas por los expertos en la materia química,
farmacéutica, biológica, bioquímica y médica.
"Modulación" o "modulante" se refiere a
la alteración de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK.
Concretamente, modulante se refiere a la activación de la actividad
catalítica de las RTK, CTK y STK, preferiblemente la activación o
inhibición de la actividad catalítica de las RTK, CTK y STK, en
función de la concentración del compuesto o sal a la que la RTK, CTK
o STK se expone, o preferentemente, la inhibición de la actividad
catalítica de las RTK, CTK y STK.
"Actividad catalítica" se refiere al índice
de fosforilación de la tirosina bajo la influencia, directa o
indirecta, de las RTK y/o CTK o la fosforilación de la serina y
treonina bajo la influencia, directa o indirecta, de las STK.
"Poner en contacto" se refiere a unir un
compuesto de esta invención y un PK diana de forma que el compuesto
pueda afectar a la actividad catalítica de la PK, ya sea
directamente, p.ej. interactuando con la propia quinasa, o
indirectamente, p.ej., interactuando con otra molécula de la cual
dependa la actividad catalítica de la quinasa. Tal "contacto"
puede realizarse "in vitro", es decir, en un tubo de
ensayo, una placa de petri o similares. En un tubo de ensayo, la
puesta en contacto puede incluir sólo un compuesto y una PK de
interés o puede incluir células enteras. Las células pueden
mantenerse o hacer crecer en placas de cultivo celular y ponerse en
contacto con un compuesto en ese entorno. En este contexto, la
capacidad de un compuesto concreto para afectar a un trastorno
relacionado con la PK, p.ej., la IC_{50} del compuesto, definida
más tarde, puede determinarse antes de que se intente la utilización
de los compuestos in vivo con organismos vivos más complejos.
Para células fuera del organismo existen varios métodos y son bien
conocidos por aquéllos expertos en la materia, para conseguir poner
en contacto las PK con los compuestos inclu-
yendo, pero no de forma exclusiva, la microinyección celular directa y varias técnicas de transporte transmembrana.
yendo, pero no de forma exclusiva, la microinyección celular directa y varias técnicas de transporte transmembrana.
"In vitro" se refiere a los
procedimientos llevados a cabo en un entorno artificial, como,
p.ej., pero no exclusivamente, en un tubo de ensayo o un medio de
cultivo.
"In vivo" se refiere a los
procedimientos llevados a cabo dentro de un organismo vivo, como,
pero no exclusivamente, un ratón, una rata o un conejo.
"Trastorno relacionado con la PK",
"trastorno causado por la PK" y "actividad PK anormal" se
refieren todas a una condición caracterizada por una actividad
inapropiada, esto es, por defecto o más comúnmente por exceso de
actividad catalítica, donde la PK concreta puede ser una RTK, una
CTK o una STK. La actividad catalítica inapropiada puede surgir como
el resultado de: (1) expresión de PK en células que normalmente no
expresan PK, (2) expresión de PK aumentada que lleva a una
proliferación celular, diferenciación y/o crecimiento celular no
deseados, o (3) descenso de la expresión PK que lleva a reducciones
no deseadas de la proliferación, diferenciación y/o crecimiento
celulares. La sobreactividad de una PK se refiere o bien a la
amplificación del gen que codifica para una PK concreta o la
producción de un nivel de actividad PK que puede correlacionarse con
un trastorno de proliferación, diferenciación y/o crecimiento
celular (esto es, a medida que el nivel de PK aumenta, la gravedad
de uno o más de los síntomas del trastorno celular también aumenta).
Una actividad menor de la deseada es, obviamente, lo contrario,
donde la gravedad de uno o más de los síntomas de un trastorno
celular aumenta conforme el nivel de la actividad PK disminuye.
"Tratar", "tratando" y
"tratamiento" se refieren a un método de aliviar o anular un
trastorno celular mediado por una PK y/o sus síntomas asociados. De
acuerdo con concretamente el cáncer, estos términos significan
simplemente que la esperanza de vida de un individuo afectado de
cáncer puede aumentarse o que uno o más de los síntomas de la
enfermedad puede ser reducido.
"Organismo" se refiere a cualquier entidad
viva compuesta por al menos una célula. Un organismo vivo puede
ser
tan simple como, por ejemplo, una única célula eucariota o tan compleja como un mamífero, incluyendo
tan simple como, por ejemplo, una única célula eucariota o tan compleja como un mamífero, incluyendo
\hbox{el ser
humano.}
"Cantidad terapéuticamente efectiva" se
refiere a la cantidad del compuesto que se administra que aliviará
en cierta medida uno o más de los síntomas del trastorno que se está
tratando. En referencia al tratamiento de cáncer, una cantidad
terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad que tiene el
efecto de:
- (1)
- reducir el tamaño del tumor;
- (2)
- inhibir (es decir, hacer más lento hasta cierta medida, preferiblemente parar) la metástasis tumoral;
- (3)
- inhibir hasta cierto punto (es decir, hacer más lento en cierta medida, preferiblemente parar) el crecimiento tumoral, y/o,
- (4)
- aliviar hasta cierto punto (o, preferiblemente eliminar) uno o más síntomas asociados con el cáncer.
"Monitorizar" significa observar o detectar
el efecto de poner en contacto un compuesto con una célula que
exprese una PK concreta. El efecto observado o detectado puede ser
un cambio en el fenotipo celular, en la actividad catalítica de una
PK o un cambio en la interacción de una PK con una pareja de unión
natural. Las técnicas para observar o detectar tales efectos son
conocidas en la materia.
El efecto antes nombrado es seleccionado entre un
cambio o una ausencia de cambio en un fenotipo celular, un cambio o
ausencia de cambio en la actividad catalítica de dicha protein
quinasa o un cambio o ausencia de cambio en la interacción de dicha
protein quinasa con una pareja de unión natural en un aspecto final
de esta invención.
"Fenotipo celular" se refiere a la
apariencia externa de una célula o tejido o la función biológica de
la célula o tejido. Ejemplos, pero no limitantes, de un fenotipo
celular son el tamaño celular, el crecimiento celular, la
proliferación, diferenciación y supervivencia celular, la apoptosis
la ingestión de nutrientes y el uso. Tales características
fenotípicas pueden medirse con técnicas conocidas en la materia.
"Pareja de unión natural" se refiere a un
polipéptido que se une a una PK concreta en una célula. Las parejas
de unión natural pueden jugar un papel en la propagación de la señal
en un proceso de transducción de señal mediada por PK. Un cambio en
la interacción de la pareja de unión natural con la PK puede
manifestarse como un aumento o descenso de la concentración del
complejo de la PK/pareja de unión natural y, como resultado, en un
cambio observable en la capacidad de la PK para mediar la
transducción de señal.
Algunos compuestos representativos de la presente
invención se muestran en siguiente la Tabla 1a.
\newpage
Otros compuestos representativos de la presente
invención se muestran en la siguiente Tabla 1b.
Los compuestos presentados en las Tablas
1a-1b son sólo ejemplos y en ningún caso se deben
entender como limitantes del alcance de esta invención.
Mientras que la definición más amplia se
especifica en el Resumen de la invención, ciertos compuestos de
Fórmula (I) que se establecen a continuación son preferidos.
Un grupo preferido de compuestos de Fórmula (I)
es aquél donde:
R^{6} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, terc-butilo, isobutilo, o
n-butilo, preferentemente hidrógeno o metilo; y
R^{7} es seleccionado del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo,
arilo, heteroarilo, y -C(O)R^{17} donde R^{17} es
hidroxi, alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo, y
preferentemente R^{7} es hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-,
iso- o terc-butilo, fenilo, benzoilo, acetilo o
carboxi, e idóneamente metilo, hidrógeno o fenilo.
2. Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula
(I) es aquél donde:
R^{6} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, terc-butilo, isobutilo, o
n-butilo, preferentemente hidrógeno o metilo, e
idóneamente metilo;
R^{7} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y
-C(O)R^{17} donde R^{17} es hidroxi, alquilo o
arilo, y R^{7} es preferentemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, n-, iso o terc-butilo, fenilo, benzoilo,
acetilo o carboxi, e idóneamente metilo, hidrógeno o fenilo; y
R^{3}, R^{4}, y R^{5} son hidrógeno; y
Z es arilo.
2. Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula
(I) es aquél donde:
R^{6} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, terc-butilo, isobutilo, o
n-butilo, preferentemente hidrógeno o metilo, e
idóneamente metilo;
R^{7} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y
-C(O)R^{17} donde R^{17} es hidroxi, alquilo o
arilo, y R^{7} es preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, n-, iso o tert-butilo, fenilo, benzoilo,
acetilo o carboxi, preferentemente metilo, hidrógeno o fenilo, e
idóneamente metilo; y
R^{3}, R^{4}, y R^{5} son hidrógeno; y
Z es heteroarilo, preferiblemente triazinilo,
tetrazolilo, imidazolilo, piridinilo, pirimidinilo o pirazinilo.
4. Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula
(I) es aquél donde:
R^{6} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, tert-butilo, isobutilo, o
n-butilo, preferentemente hidrógeno o metilo, e
idóneamente metilo;
R^{7} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo, y
-C(O)R^{17} donde R^{17} es hidroxi, alquilo o
arilo, y R^{7} preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, n-, iso o terc-butilo, fenilo, benzoilo,
acetilo, o carboxi, preferentemente metilo, hidrógeno o fenilo;
y
R^{3}, R^{4}, y R^{5} son hidrógeno; y
Z es un heterociclo.
5. Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula
(I) es aquél donde:
R^{6} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, terc-butilo, isobutilo, o
n-butilo, preferentemente hidrógeno o metilo, e
idóneamente metilo;
R^{7} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, alquilo, arilo, heteroarilo y -C(O)R^{17}
donde R^{17} es hidroxi, alquilo o arilo, y R^{7} es
preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o
terc-butilo, fenilo, benzoilo, acetilo o carboxi,
preferentemente metoxi, hidrógeno o fenilo, e idóneamente metilo;
y
R^{3}, R^{4}, y R^{5} son hidrógeno; y
Z es -NR^{15}R^{16} donde R^{15} y R^{16}
se combinan para formar un heterocicloamino, preferiblemente
piperidin-1-ilo,
N-metilpiperidin-1-ilo,
piperacin-1-ilo,
N-metilpirrolidin-1-ilo,
pirrolidin-1-ilo,
morfolin-4-ilo,
tiomorfolin-4-ilo,
tiomorfolin-1-óxido,
tiomorfolin-1,1-dióxido,
4-etiloxicrbonilmetilpiperacin-1-ilo,
3-oxopiperacin-1-ilo,
imidazolidin-1-il-2-ona,
pirrolidin-1-il-2-ona,
2-oxohomopiperacin-1-ilo,
o
tetrahidropirimidin-1-il-2-ona,
preferiblemente morfolin-4-ilo.
6. Otro grupo preferido de compuestos de Fórmula
(I) es aquél donde:
R^{6} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, y alquilo, preferiblemente hidrógeno, metilo, etilo,
isopropilo, tert-butilo, isobutilo, o
n-butilo, preferentemente hidrógeno o metilo;
R^{7} es seleccionado del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo,
arilo, heteroarilo, y -C(O)R^{17} donde ^{R17} es
hidroxi, alquilo, o arilo, y R^{7} es preferiblemente hidrógeno,
metilo, etilo, isopropilo, n-, iso o terc-butilo,
fenilo, benzoilo, acetilo o carboxi, preferentemente metilo,
hidrógeno o fenilo; y
R^{3}, R^{4}, y R^{5} son hidrógeno; y
Z es -NR^{15}R^{16} donde R^{15} y R^{16}
son alquilo, preferiblemente dietilamino, dimetilamino o
etilamina.
7. Dentro de los grupos anteriores preferidos y
preferentes de los puntos (1)-(6), un grupo todavía más preferido es
aquél donde:
R^{1} es hidrógeno, alquilo,
-C(O)NR^{12}R^{13}, cicloalquilo no sustituido,
preferiblemente hidrógeno,
3,4-dimetoxifenilaminocarbonilo,
4-metoxi-3-clorofenil-aminocarbonilo,
preferentemente hidrógeno o metilo, e idóneamente hidrógeno; y
R^{2} es hidrógeno, ciano, halo, alcoxi
inferior, o -S(O)_{2}NR^{9}R^{10} donde R^{9}
es hidrógeno y R^{10} es hidrógeno, arilo o alquilo y está en la
posición 5 del anillo de oxindol, preferiblemente R^{2} es
hidrógeno, cloro, bromo, fluoro, metoxi, etoxi, fenilo,
dimetilaminosulfonilo,
3-clorofenil-aminosulfonilo,
carboxi, metoxi, aminosulfonilo, metilaminosulfonilo,
fenilaminosulfonilo,
piridin-3-il-aminosulfonilo,
dimetilaminosulfonilo, isopropilamino-sulfonilo,
preferentemente hidrógeno, fluoro o bromo. Preferentemente R^{2}
es fluoro y está localizado en la posición 5 del anillo de
indolinona.
En los citados compuestos preferidos, preferentes
e idóneos, la esteroquímica del átomo de carbono que contiene el
grupo hidroxi en la cadena
-CONHCH(R^{3})*CR^{4}(OH)CR^{5}Z, que
está indicado con un * es tanto RS, R, como S, preferiblemente
S.
Las PK cuya actividad catalítica está modulada
por los compuestos de esta invención incluyen protein tirosin
quinasas, de las cuales hay dos tipos, los receptores tirosin
quinasa (RTK) y tirosin quinasas celulares (CTK), y las
serina-treonina quinasas (STK). La transducción de
señal mediada por RTK se inicia por interacción extracelular con un
factor de crecimiento específico (ligando), seguida de un
dimerización del receptor, una estimulación transitoria de la
actividad protein tirosin quinasa intrínseca y fosforilación. Los
sitios de unión se crean así para las moléculas de transducción de
señal intracelular y lleva a la formación de complejos con el
espectro de moléculas de señalización citoplasmáticas que facilita
la respuesta celular adecuada (p.ej., división celular, efectos
metabólicos sobre el microentorno extracelular, etc.). Ver
Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron
9:303-391.
Se ha demostrado que los sitios de fosforilación
de la tirosina en los receptores del factor de crecimiento funcionan
como sitios de unión de alta afinidad para los dominios SH2 (src
homología) de las moléculas de señalización. Fanal et al.,
1992, Cell 69:413-423, Songyang et
al., 1994, Mol. Cell. Biol.
14:2777-2785), Songyang et al., 1993,
Cell 72:767-778, y Koch et al., 1991,
Science 252:668-678. Se ha identificado
varias proteínas del sustrato intracelular que se asocian a las RTK.
Pueden dividirse en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen
un dominio catalítico, y (2) sustratos que carecen de tal dominio
pero que sirven como adaptadores y se asocian a moléculas
catalíticamente activas. Songyang et al., 1993, Cell
72:767-778. La especificidad de las interacciones
entre receptores y dominios SH2 de sus sustratos se determina por
los residuos de aminoácidos inmediatamente contiguos al residuo de
tirosina fosforilado. Las diferencias en las afinidades de unión
entre los dominios SH2 y las secuencias aminoacídicas contiguos a
los residuos de fosfotirosina de ciertos receptores son coherentes
con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación del
sustrato. Songyang et al., 1993, Cell
72:767-778. Estas observaciones sugieren que la
función de cada RTK viene determinada no sólo por su patrón de
expresión y la disponibilidad del ligando, sino también por la
selección de las vías de transducción de señal corriente abajo que
se activan por un receptor concreto. De esta manera, la
fosforilación proporciona un paso de regulación importante que
determina la selectividad de las vías de señalización utilizadas por
los receptores del factor de crecimiento concretos, así como los
receptores del factor de diferenciación.
Las STK, principalmente citosólicas, afectan la
bioquímica celular, a menudo como una respuesta asociada a un evento
PTK. Las STK se han relacionado con el proceso de señalización que
inicia la síntesis de DNA y la subsiguiente mitosis que lleva a la
proliferación celular.
Así, la transducción de señal PK tiene como
resultado, entre otras respuestas, la proliferación, diferenciación,
crecimiento y metabolismo celulares. Una proliferación celular
anormal puede provocar una cantidad de trastornos y enfermedades,
incluyendo el desarrollo de neoplasia como el carcinoma, sarcoma,
gliobastoma y hemangioma, trastornos como la leucemia, soriasis,
arteriosclerosis, retinopatía diabética y artritis, y otros
trastornos relacionados con angiogénesis y/o vasculogénesis no
controladas.
La comprensión precisa del mecanismo mediante el
cual los compuestos de esta invención inhiben las PK no es necesaria
para poner en práctica la presente invención. Sin embargo, mientras
que no está unido a ningún mecanismo o teoría particular, se cree
que los compuestos interactúan con los aminoácidos en la región
catalítica de las PK. Las PK típicamente poseen una estructura
bilobulada donde el ATP parece unirse en la hendidura entre los dos
lóbulos en una región donde los aminoácidos se conservan entre las
PK. Los inhibidores de PK se cree que se unen mediante interacciones
no covalentes como los puentes de hidrógeno, las fuerzas de van der
waals y las interacciones iónicas en la misma región general donde
los ATP mencionados se unen a las PK. Más concretamente, se cree que
el componente 2-indolinona de los compuestos de esta
invención de une en el espacio general normalmente ocupado por el
anillo de adenina de ATP. La especificidad de una molécula concreta
para una PK en particular puede surgir como resultado de las
interacciones adicionales entre los varios sustituyentes en el
núcleo de 2-indolinona y los dominios de aminoácidos
específicos para las PK concretas. De esta manera, diferentes
sustituyentes de indolinona pueden contribuir a la unión
preferencial a ciertas PK. La capacidad para seleccionar compuestos
activa en diferentes sitios de unión de ATP (u otros nucleótidos)
hace que los compuestos de esta invención sean útiles para tener
como objetivo cualquier proteína con tal sitio. Los compuestos
explicados aquí tienen por tanto utilidad en ensayos in Vitro
para tales proteínas, a la vez que muestran efectos terapéuticos
in vivo mediante la interacción con tales proteínas.
Adicionalmente, los compuestos de la presente
invención proporcionan un enfoque terapéutico al tratamiento de
varios tipos de tumores sólidos, entre otros, pero no
exclusivamente, carcinomas, sarcomas incluyendo el sarcoma de
Kaposi, eritroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocitoma,
melanoma y mioblastoma. El uso de dicho compuesto en una composición
farmacéutica para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento o prevención de cánceres con tumores no sólidos, como la
leucemia también se contemplan en esta invención. Las indicciones
pueden incluir, pero no exclusivamente, cánceres de cerebro,
cánceres de vejiga, de ovario, gástricos, de páncreas, de colon,
sanguíneos, de pulmón y óseos.
Otros ejemplos, no limitantes, de los tipos de
trastornos relacionados con una actividad PK inapropiada para los
que los compuestos descritos aquí pueden ser útiles en la
prevención, tratamiento y estudio, son los trastornos proliferativos
celulares, trastornos fibróticos y metabólicos.
Los trastornos proliferativos celulares, que
pueden prevenirse, tratarse o estudiarse mediante el uso de los
compuestos de la presente invención para la fabricación de un
medicamento dirigido contra dichos trastornos incluyen el cáncer,
trastornos proliferativos de los vasos sanguíneos y trastornos
proliferativos de las células mesangiales.
Los trastornos proliferativos de los vasos
sanguíneos se refieren a trastornos relacionados con una
vasculogénesis anormal (formación de vasos sanguíneos) y
angiogénesis (extensión de los vasos sanguíneos). Mientras que la
vasculogénesis y la angiogénesis juegan papeles importantes en
varios procesos fisiológicos normales como el desarrollo
embrionario, la formación del cuerpo luteo, la cicatrización de
heridas y la regeneración de órganos, también juegan un papel
crucial en el desarrollo del cáncer, donde provocan la formación de
nuevos capilares necesarios para mantener el tumor vivo. Otros
ejemplos de trastornos proliferativos de vasos sanguíneos incluyen
la artritis, donde los nuevos vasos sanguíneos capilares invaden la
articulación y destruyen el cartílago, y trastornos oculares, como
la retinopatía diabética, donde los nuevos capilares en la retina
invaden el vítreo, sangran y causan ceguera.
Se ha identificado que dos RTK relacionadas
estructuralmente se unen a VEGF con gran afinidad: el receptor de
tirosina 1 similar a fms (flt-1) (Shibuya et
al., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries
et al., 1992, Science, 255:989-991) y
el receptor KDR/FLK-1, también conocido como
VEGF-R2. Se ha informado de que el factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un mitógeno específico de
células endoteliales con actividad promotora del crecimiento celular
endotelial in Vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein.
Biophys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et
al., 1990, J. Biol. Chem.,
265:19461-19566. La información que se encuentra en
las solicitudes estadounidenses con los números de serie 08/193,829,
08/038,596 y 07/975,750, sugieren con fuerza que el VEGF no sólo es
responsable de la proliferación celular endotelial, sino que también
es el regulador principal de la angiogénesis normal y patológica.
Ver en general,
Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.
Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.
La vasculogénesis y angiogénesis normales juegan
un papel importante en gran cantidad de procesos fisiológicos como
el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la
regeneración de órganos y los procesos reproductivos femeninos, como
el desarrollo de folículos en el corpus luteo durante la ovulación y
el crecimiento placentario tras el embarazo. Folkman & Shing,
1992, J. Biological Chem.,
267(16):10931-34. La vasculogénesis y/o
angiogénesis descontrolada se ha asociado a enfermedades como la
diabetes, así como con tumores sólidos malignos que requieren de la
vascularización para crecer. Klagsburn & Soker, 1993, Current
Biology, 3(10):699-702; Folkham, 1991,
J. Natl. Cancer Inst., 82:4-6; Weidner, et
al., 1991, New Engl. J. Med.,
324:1-5.
El papel que se supone que tiene el VEGF en la
proliferación celular endotelial y la migración durante la
angiogénesis y vasculogénesis indica un papel importante del
receptor KDR/FLK-1 en esos procesos. Las
enfermedades como la diabetes mellitus (Folkman, 198, en
Xl^{th} Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta,
et al., eds.), pp. 583-596, Leuven University
Press, Leuven) y artritis, así como el crecimiento de tumores
malignos puede resultar de una angiogénesis no controlada. Ver,
p.ej., Folkman, 1971, N. Engl. J. Med.,
285:1182-1186. Los receptores a los que se une el
VEGF específicamente son una diana terapéutica importante y poderosa
para la regulación y modulación de la vasculogénesis y/o
angiogénesis y varias enfermedades que están relacionadas con un
crecimiento celular anormal provocado por tales procesos. Plowman,
et al., 1994, DN&P,
7(6):334-339. Más concretamente, el papel
altamente específico del receptor KDR/FLK1 en la neovascularización
le convierte en un posible objetivo para enfoques terapéuticos al
tratamiento del cáncer y otras enfermedades que implican una
formación descontrolada de vasos sanguíneos.
De esta manera, la presente invención proporciona
compuestos capaces de regular y/o modular la transducción de señal
de la tirosin quinasa incluyendo la transducción de señal del
receptor KDR/FLK-1 para inhibir o promover la
angiogénesis y/o vasculogénesis, es decir, compuestos que inhiben,
previenen, o interfieren con la señal transducida por
KDR/FLK-1 cuando son activados por ligandos como el
VEGF. Aunque se cree que los compuestos de la presente invención
actúan sobre un receptor u otro componente a lo largo de la vía de
transducción de señal de la tirosin quinasa, también pueden actuar
directamente sobre las células tumorales que son el resultado de una
angiogénesis descontrolada.
Aunque la nomenclatura de los homólogos humano y
murino del receptor "flk-I" genérico difieren,
son, en muchos aspectos, intercambiables. El receptor murino,
Flk-I, y su homólogo humano, KDR comparten una
homología de secuencias de 93,4% dentro del dominio intracelular. De
la misma manera, el FLK-I murino se une al VEGF
humano con la misma afinidad que al VEGF de ratón, y por
consiguiente, se activa con el ligando derivado de cualquiera de las
especies. Millauer et al., 1993, Cell,
72:835-846; Quinn et al., 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537. El
FLK-1 también se asocial y subsiguientemente la
tirosina fosforila los sustratos de RTK humana (p.ej.
PLC-\gamma P85) cuando se
co-expresa en 293 células (fibroblastos de renales
embrionarios humanos).
Los modelos que se basan en el receptor
FLK-1 son por lo tanto aplicables directamente para
entender el receptor KDR. Por ejemplo, el uso del receptor
FLK-1 murino en métodos que identifican compuestos
que regulan la vía de transducción de señal murina son directamente
aplicables a la identificación de compuestos que pueden usarse para
regular la vía de transducción de señal humana, esto es, que regula
la actividad relacionada con el receptor KDR. Así, los compuestos
químicos identificados como inhibidores de KDR/FLK-1
in Vitro pueden confirmarse en modelos in vivo
adecuados. Tanto los modelos de animal de ratón como de rata in
vivo han demostrado ser de excelente valor para el examen del
potencial clínico de agentes que actúen sobre la vía de transducción
de señal inducida por el KDR/FLK-1.
De esta manera, la presente invención proporciona
compuestos que regulan, modulan y/o inhiben la vasculogénesis y/o
angiogénesis afectando la actividad enzimática del receptor
KDR/FLK-1 e interfiriendo con la señal transducida
por KDR/FLK-1. Así, la presente invención
proporciona el uso de composiciones que contienen los compuestos de
la invención para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de varios tipos de tumores sólidos incluyendo, pero no
exclusivamente, glioblastoma, melanoma, y sarcoma de Kaposi, y
carcinoma de ovario, pulmón, mama, próstata, páncreas, colon y
epidérmico. Además, los datos sugieren que el uso de compuestos que
inhiben la vía de transducción de señal mediada por
KDR/Flk-1 para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento de hemangioma, restenosis y retinopatía
diabética.
Además, esta invención está relacionada con la
inhibición de la vasculogénesis y angiogénesis mediante otras vías
mediadas por receptores, incluyendo la vía que comprende el receptor
flt-1.
La transducción de señal mediada por el receptor
de tirosin quinasa se inicia por interacción extracelular con un
factor de crecimiento específico (ligando), seguido por una
dimerización del receptor, una estimulación transitoria de la
actividad protein tirosin quinasa intrínseca y autofosforilación.
Los sitios de unión son así creados para moléculas de transducción
de señal intracelular que lleva a la formación de complejos con el
espectro de moléculas de señalización citoplasmática que facilita la
respuesta celular apropiada, p.ej. división celular y efectos
metabólicos en el microentorno extracelular. Ver, Schlessinger y
Ulirich, 1992, Neuron, 9:1-20.
La estrecha homología de las regiones
intracelulares de KDR/FLK-1 con las del receptor
PDGF-\beta (50,3% de homología) y/o el receptor
flt-1 relacionado indica la inducción de vías de
transducción de señal solapadas. Por ejemplo, para el receptor
PDGF-\beta, los miembros de la familia src
(Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:7696-7700),
fosfatidilinositol-3'-quinasa (Hu
et al., 1992, Mol. Cell. Biol.,
l12:981-990), fosfolipasa cy (Kashishian &
Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51),
proteína activadora de ras-GTPasa, (Kashishian et
al., 1992, EMBO J., 11:1373-1382),
PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 10 90:6939-6943), Grb2
(Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol.,
14:6715-6726), y las moléculas adaptadoras Shc y Nck
(Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol.,
13:6889-6896), han demostrado unirse a regiones que
contienen diferentes sitios de autofosforilación. Ver, en general,
Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor
Res., 5:37-54. De esta manera, es posible que
las vías de transducción de señal activadas por el
KDR/FLK-1 incluyan la vía ras (Rozakis et
al., 1992, Nature, 360:689-692), la
PI-3'-quinasa, las vías mediadas por
src y por plc\gamma. Cada una de estas vías puede jugar un papel
crítico en el efecto angiogénico y/o vasculogénico del
KDR/FLK-1 en las células endoteliales.
Consecuentemente, otro aspecto de esta invención está relacionado
con el uso de compuestos orgánicos descritos aquí para la
fabricación de un medicamento que modula la angiogénesis y
vasculogénesis puesto que tales procesos están controlados por estas
vías.
En cambio, los trastornos relacionados con la
contracción u oclusión de los vasos sanguíneos, como la restenosis,
están también implicados y pueden ser tratados o prevenidos mediante
el uso de los compuestos de esta invención ara la fabricación de un
medicamento para este propósito.
Los trastornos fibróticos se refieren a la
formación anormal de matrices extracelulares. Entre los ejemplos de
trastornos fibróticos se incluye la cirrosis hepática y los
trastornos proliferativos de células mesangiales. La cirrosis
hepática se caracteriza por el aumento en los constituyentes de la
matriz extracelular provocando la formación de una cicatriz
hepática. Una matriz extracelular incrementada que provoca una
cicatriz hepática pede también estar causada por una infección viral
como la hepatitis. Los lipocitos parecen jugar un papel importante
en la cirrosis hepática. Otros trastornos fibróticos implicados
incluyen la aterosclerosis.
Los trastornos proliferativos celulares
mesangiales se refieren a trastornos provocados por una
proliferación anormal de células mesangiales. Los trastornos
proliferativos mesangiales incluyen varias enfermedades renales
humanas como la glomerulonefritis, la neuropatía diabética y la
nefroslerosis maligna, así como trastornos tales como síndromes de
microangiopatía trombótica, rechazo a trasplantes, y
glomerulopatías. La RTK PDGFR se ha implicado en el mantenimiento de
la proliferación celular mesangial. Floege et al., 1993,
Kidney International 43:47S-54S.
Muchos cánceres son trastornos proliferativos
celulares y, como se ha indicado anteriormente, las PK se han
asociado con los trastornos proliferativos. Así, no es sorprendente
que las PK, como por ejemplo, los miembros de la familia de RTK se
hayan asociado con el desarrollo de cáncer. Algunos de estos
receptores, como el EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J.
Cancer 63:227-233, Torp et al., 1992,
APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et
al., 1989, Science 244:707-712) y
PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene,
7:627-633) están sobreexpresados en muchos tumores
y/o bucles autocrinos persistentemente activados. De hecho, en los
cánceres más comunes y graves, estas sobreexpresiones de receptores
(Akbasak y Suner-Akbasak et al., 1992, J.
Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson et
al., 1992, Cancer Treatment Res.
61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin.
Invest. 90:1352-1360) y bucles autocrinos (Lee y
Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.,
l18:1057-1070, Korc et al., supra, Akbasak y
Suner-Akbasak et al., supra) se han
demostrado. Por ejemplo, se ha asociado el EGFR con el carcinoma
celular escamoso, el astrocitoma, glioblastoma, cáncer de cabeza y
cuello, de pulmón y de vejiga. HER2 se ha asociado con cáncer de
mama, ovario, gástrico, de pulmón, pancreático y de vejiga. El PDGFR
se ha asociado con glioblastoma y melanoma así como con cáncer de
pulmón, ovario y próstata. La RTK c-met se ha
asociado también con la formación de tumores malignos. Por ejemplo,
c-met se ha asociado, entre otros cánceres, el
carcinoma colorectal, tiroideo, pancreático, gástrico y
hepatocelular, y linfomas. Adicionalmente, el c-met
se ha asociado a la leucemia. La sobreexpresión del gen
c-met se ha detectad también en pacientes con la
enfermedad de Hodgkins y la enfermedad de Burkitts.
El IGF-IR, además de estar
implicado en el apoyo nutricional y en diabetes de tipo II, se ha
asociado también con varios tipos de cáncer. Por ejemplo, el
IGF-I se ha implicado en un estimulador del
crecimiento autocrino para varios tipos de tumor, p.ej. las células
de carcinoma de cáncer de mama humano (Arteaga et al., 1989,
J. Clin. Invest. 84:1418-1423) y células
tumorales de pulmón pequeñas (Macauley et al., 1990,
Cancer Res., 50:2511-2517). Además, el
IGF-I, mientras está íntegramente relacionado con el
crecimiento y la diferenciación normal del sistema nervioso, también
parece ser un estimulador autocrino de los gliomas humanos.
Sandberg-Nordgvist et al., 1993, Cancer
Res. 53:2475-2478. La importancia del
IGF-IR y sus ligandos en la proliferación celular
está también apoyada por el hecho de que muchos tipos de células en
cultivo (fibroblastos, células epiteliales, células de músculo liso,
linfocitos T, células mieloides, condrocitos y osteoblastos (las
células madre de la médula ósea)) están estimuladas para crecer por
el IGF-I. Goldring y Goldring, 1991, Eukaryotic
Gene Expression, 1:301-326. Baserga y Coppola
sugieren que el IGF-IR juega un papel central en el
mecanismo de transformación, y como tal, podría ser una Diana
preferida para intervenciones terapéuticas para un amplio espectro
de malignidades. Baserga, 1995, Cancer Res.,
55:249-252, Baserga, 1994, Cell
79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol.
Cell. Biol.; 14:4588-4595.
Las STK se han implicado en varios tipos de
cáncer, incluyendo, de forma notable, el cáncer de mama (Cance,
et al., Int. J. Cancer, 54:571-77
(1993)).
La asociación entre la actividad de las PK
anormal y la enfermedad no está restringida al cáncer. Por ejemplo,
as RTK se han asociado con enfermedades como la soriasis, diabetes
mellitus, endometriosis, angiogénesis, desarrollo de placa de
ateroma, enfermedad de Alzheimer, restenosis, enfermedad de von
Hippel-Lindau, hiperproliferación epidérmica,
enfermedades neurodegenerativas, degeneración macular relacionada
con la edad y hemangiomas. Por ejemplo, el EGFR se ha indicado en la
curación de heridas en la córnea y la epidermis. Los defectos en la
insulina-R y en IGF-1R están
indicados en la diabetes de tipo II. Una correlación más completa
entre las RTK específicas y sus indicaciones terapéuticas puede
encontrarse en Plowman et al., 1994, DN&P
7:334-339.
Tal como se ha comentado anteriormente, no sólo
las RTK, sino que también las CTK, incluyendo, pero no
exclusivamente, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr y
yrk (examinado en Balen et al., 1992, FASEB J.,
6:3403-3409) están relacionadas con las vías de
transducción de señal metabólicas y proliferativas y por lo tanto
puede esperarse, y se ha observado, que están relacionadas en varios
trastornos mediados por las PTK hacia los cuales va dirigida la
presente invención. Por ejemplo, se ha observado que la src mutada
(v-src) es una oncoproteína
(pp60^{v-src}) en pollos. Además, su homóloga
celular, el protoncogen pp60^{c-src} transmite
señales oncogénicas de muchos receptores. La sobreexpresión de EGFR
o HER2/neu en tumores lleva la activación constitutiva de
pp60^{c-src}, que es característica de células
malignas, pero ausente en las células normales. Por otro lado, los
ratones deficientes en la expresión de c-src
muestran un fenotipo osteopetrótico, lo que indica una participación
clave del c-src en la función del osteoclasto y una
posible implicación en los trastornos relacionados.
De forma similar, el Zap70 se ha implicado en la
señalización de las células T, que puede relacionarse con trastornos
autoinmunes.
Se ha asociado las STK con inflamaciones,
enfermedades autoinmunes, inmunorespuestas, y trastornos
hiperproliferativos, como la restenosis, fibrosis, soriasis,
osteoartritis y artritis reumatoide.
Las PK también se han implicado en la
implantación embrionaria. Así, los compuestos de esta invención
pueden proporcionar un método efectivo para prevenir la implantación
embrionaria, y así pueden ser útiles como agentes de control de
natalidad. Los trastornos adiciones que se puede tratar o prevenir
usando los compuestos de esta invención son trastornos inmunológicos
como las enfermedades autoinmunes, SIDA y trastornos
cardiovasculares como la aterosclerosis.
Por último, actualmente se sospecha que tanto las
RTK como las CTK están implicadas en los trastornos
hiperinmunes.
Un compuesto de la presente invención o una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo puede administrarse como tal a
un paciente humano o puede administrarse en composiciones
farmacéuticas en las que los materiales anteriores están mezclados
con transportadores o excipiente(s) adecuados. Las técnicas
para la formulación y la administración de fármacos pueden
encontrarse en "Remington's Pharmacological Sciences", Mack
Publishing Co. Easton, PA., última edición.
Tal como se usa aquí, "administrar" o
"administración" se refiere a proporciona un compuesto de
Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una
composición farmacéutica que contenga el compuesto de Fórmula (I) o
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de esta invención a un
organismo con la intención de prevenir o tratar un trastorno
relacionado con las PK.
Las vías adecuadas de administración pueden
incluir, sin limitación, la oral, rectal, transmucosal o
administración intestinal o intramuscular, inyección subcutánea,
intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa,
intravitreal, intraperitoneal, intranasal o interocular. Las vías
preferidas de administración son la oral y la
parente-
ral.
ral.
Alternativamente, uno puede administrar el
compuesto de forma local en lugar de sistémica, por ejemplo,
mediante una inyección del compuesto directamente en un tumor
sólido, a menudo en una formulación de liberación sostenida o en un
depósito.
Además, uno puede administrar el fármaco mediante
un sistema de liberación de fármaco dirigida, por ejemplo, en un
liposoma recubierto con un anticuerpo específico para un tumor. Los
liposomas serán el objetivo y se escogerán selectivamente por el
tumor.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden fabricarse mediante procesos conocidos en la
materia, p.ej., mediante una mezcla convencional, con procesos de
disolución, granulado, grageas, levigando, emulsionando,
encapsulando, inmovilizando o liofilizando.
Las composiciones farmacéuticas para usar de
cuerdo con la presente invención pueden formularse de forma
convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables
incluyendo excipientes y auxiliares que facilitan el procesado de
los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse
farmacéuticamente. La formulación correcta depende de la vía de
administración escogida.
Para inyección, los compuestos de la invención
pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones
compatibles fisiológicamente como la solución de Hank, la solución
Ringer o un tampón salino fisiológico. Para administración
transmucosal, se usan en la formulación penetrantes adecuados a la
barrera que hay que permear. Tales penetrantes son generalmente
conocidos en la materia.
Para administración oral, los compuestos pueden
formularse combinando los compuestos activos con transportadores
farmacéuticamente aceptables conocidos en la materia. Tales
transportadores hacen posible que los compuestos de la invención
sean formulados como pastillas, píldoras, comprimidos, grageas,
cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y similares, para
ingestión oral por parte del paciente. Las preparaciones
farmacéuticas para el uso oral pueden hacerse usando un excipiente
sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando la
mezcla de gránulos, tras añadir otros auxiliares adecuados si se
desea, para obtener pastillas o núcleos de grageas. Los excipientes
útiles, concretamente, rellenos como azúcares, incluyendo la
lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa
como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de
arroz y almidón de patata y otros materiales como la gelatina, la
goma tragacantos, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa,
carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinil porrolidona (PVP). Si
se desea, se puede añadir agentes desintegrantes, como
polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico. También
puede usarse una sal como el alginato de sodio.
Los núcleos de gragea se proporcionan con
cubiertas adecuadas. Para este propósito, se puede usar soluciones
de azúcar concentradas que pueden contener opcionalmente goma
arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel carbopol,
polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y
solventes orgánicos o mezclas de solventes adecuados. Se puede
añadir colorantes o pigmentos a las cubiertas de las pastillas o
grageas para identificarlas o caracterizar diferentes combinaciones
de dosis de compuesto activo.
Las composiciones farmacéuticas que se puede usar
oralmente incluyen las cápsulas de ajuste a presión hechas de
gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y
un plastificante, como el glicerol o sorbitol. Las cápsulas de
ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos en una
mezcla con un relleno como la lactosa, un aglutinante como el
almidón y/o un lubricante como el talco o el estearato de magnesio
y, opcionalmente estabilizantes. En el caso de las cápsulas blandas,
los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos
adecuados, como aceites grasos, parafina líquida, o polietilen
glicoles líquidos. Los estabilizantes pueden también añadirse en
estas formulaciones.
Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse
también incluyen cápsulas de gelatina duras. Como ejemplo no
limitante, la formulación del producto del fármaco oral en cápsula
del compuesto activo puede ser con cargas de dosis de 50 y 200 mg.
Las dos dosis se hacen con los mismos gránulos rellenando cápsulas
de gelatina duras de diferentes tamaños, tamaño 3 para la cápsula de
50 mg y tamaño 0 para la cápsula de 200 mg. La composición de la
formulación puede ser, por ejemplo, como se indica en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Nombre/grado del | Concentración en | Cantidad en cápsula | Cantidad en cápsula |
| ingrediente | granulación (% p/p) | de 50 mg (mg) | de 200 mg (mg) |
| Compuesto activo NF | 65,0 | 50,0 | 200,0 |
| Manitol NF | 23,5 | 18,1 | 72,4 |
| Croscarmelosa de sodio NF | 6,0 | 4,6 | 18,4 |
| Povidona K30 NF | 5,0 | 3,8 | 15,2 |
| Estearato de magnesio NF | 0,5 | 0,38 | 1,52 |
| Cápsula, amarillo sueco NF | Tamaño 3 | Tamaño 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Las cápsulas pueden ir empaquetadas en vidrio
marrón o botellas de plástico para proteger el compuesto activo de
la luz. Los contenedores que llevan la formulación en cápsulas de
compuesto activo deben guardarse a una temperatura ambiente
controlada (15-30ºC)
Para la administración por inhalación, los
compuestos para usar de acuerdo con la presente invención son
convenientemente liberados en la forma de un aerosol utilizando un
paquete presurizado o un nebulizador y un propulsor, p.ej., pero sin
limitación, el diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetra-fluoroetano o dióxido de carbono. En el
caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis puede controlarse
proporcionando una válvula para liberar una cantidad dosificada. Las
cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para usar en un
inhalador o un insuflador pueden formulares conteniendo una mezcla
de polvos del compuesto y una base de polvo adecuada como la lactosa
o el almidón.
Los compuestos pueden también formularse para
administración parenteral, p.ej., en una inyección en bolo o
infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden
presentarse en forma de dosis única, p.ej. en ampollas o
contenedores multi-dosis, con un conservante
añadido. Las composiciones pueden tomar formas como suspensiones,
soluciones o emulsiones en vehículos acuosos u oleosos, y pueden
contener materiales de formulación como agentes de suspensión,
estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones farmacéuticas para
administración parenteral incluyen soluciones acuosas de una forma
soluble en agua, como por ejemplo, pero no exclusivamente, una sal
del compuesto activo. Adicionalmente, las suspensiones de los
compuestos activos pueden prepararse en un vehículo lipofílico. Los
vehículos adecuados lipofílicos incluyen los ácidos grasos como el
aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos como el oleato
de etilo y triglicéridos, o materiales como liposomas. Las
suspensiones en inyección acuosa pueden contener sustancias que
aumentan la viscosidad de la suspensión, como la
carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente,
la suspensión puede también contener estabilizantes adecuados y/o
agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir
la preparación de soluciones de concentraciones elevadas.
De forma alternativa, el principio activo puede
estar en forma de polvos para su constitución con un vehículo
adecuado, p.ej. agua estéril libre de pirógenos, antes de su
uso.
Los compuestos pueden también formularse en
composiciones rectales como supositorios o enemas de retención,
utilizando, p.ej., bases de supositorio convencionales como la
manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
previamente, los compuestos pueden también formularse como
preparaciones de depósito. Tales formulaciones de larga actividad
pueden administrarse por implantación (por ejemplo, subcutáneamente
o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Un compuesto de
esta invención puede formularse para esta vía de administración con
materiales hidrofóbicos o poliméricos por ejemplo, en una emulsión
con un aceite farmacológicamente aceptable), con resinas de
intercambio de iones, o con derivados ligeramente solubles como,
sin limitación, las sales ligeramente solubles.
Un ejemplo no limitante de vehículo farmacéutico
para los compuestos hidrofóbicos de la invención es un sistema
cosolvente que contiene alcohol bencílico, un tensoactivo no polar,
un polímero orgánico miscible en agua y una fase acuosa como el
sistema de co-solvente VPD. VPD es una solución del
3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del Polisorbato 80 tensoactivo
no polar, y un 65% p/v de polietilenglicor 300, alcanzando el
volumen deseado en etanol absoluto. El sistema
co-solvente VPD (VPD:D5W) consta de VPD diluido 1:1
con una dextrosa al 5% en solución acuosa. Este sistema
co-solvente disuelve bien compuestos hidrofóbicos, y
por sí mismo produce una toxicidad baja en administración sistémica.
Naturalmente, las proporciones de tal sistema
co-solvente pueden variarse considerablemente sin
destruir sus características de solubilidad toxicidad. Además, la
identidad de los componentes del co-solvente puede
variarse: por ejemplo, otros tensoactivos no polares de baja
toxicidad pueden usarse en lugar del Polisorbato 80, el tamaño de la
fracción de polietilenglicol puede variarse, otros polímeros
biocompatibles pueden reemplazar el polietilenglicol, p.ej., la
polivinil pirrolidona, y otros azúcares y polisacáridos pueden
sustituir a la dextrosa.
De forma alternativa, puede usarse otros sistemas
de liberación para compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los
liposomas y las emulsiones son ejemplos conocidos de vehículos o
transportadores de liberación para fármacos hidrofóbicos. Además,
ciertos solventes orgánicos como el dimetilsulfóxido pueden usarse,
aunque a menudo a costa de una toxicidad mayor.
Adicionalmente, los compuestos pueden
administrarse usando un sistema de liberación sostenida, como
matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que
contienen el agente terapéutico. Varios materiales de liberación
sostenida se han establecido y son conocidos por aquéllos expertos
en la materia. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, en
función de su naturaleza química, liberar los compuestos durante
pocas semanas hasta más de 100 días. En función de la naturaleza
química y de la estabilidad biológica del reactivo terapéutico,
puede usarse estrategias adicionales para la estabilización de
proteínas.
Las composiciones farmacéuticas presentes también
pueden incluir vehículos en fase sólida o gel o excipientes.
Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero no
exclusivamente, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios
azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros
como los polietilenglicoles.
Muchos de los compuestos moduladores de las PK de
la invención pueden proporcionarse como sales fisiológicamente
aceptables donde el compuesto reivindicado puede formar las especies
cargadas negativamente y positivamente. Los ejemplos de sales donde
el compuesto forma la fracción cargada positivamente incluyen, sin
limitación, amonio cuaternario (definido aquí en otro apartado),
sales como el hidrocloruro, sulfato, carbonato, lactato, tartrato,
malato, maleato, succinato, donde el átomo de nitrógeno del grupo de
amonio cuaternario es un nitrógeno del compuesto seleccionado de
esta invención que ha reaccionado con el ácido apropiado. Las sales
en las que el compuesto de esta invención forma las especies
cargadas negativamente incluye, sin limitación, las sales de sodio,
potasio, calcio y magnesio formadas por la reacción de un grupo
ácido carboxílico en el compuesto con una base adecuada (p.ej.
hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de
calcio (Ca(OH)_{2}), etc.).
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su
uso en la presente invención incluyen composiciones donde los
ingredientes activos están contenidos en una cantidad suficiente
para conseguir el propósito deseado, p.ej., la modulación de la
actividad de la PK o el tratamiento o prevención de un trastorno
relacionado con la PK.
Más específicamente, una cantidad
terapéuticamente efectiva significa una cantidad de compuesto
efectivo para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de
enfermedades o prolongar la supervivencia del sujeto que se
trata.
La determinación de la cantidad terapéuticamente
efectiva está dentro de la capacidad de aquéllos expertos en la
materia, especialmente a la luz de las explicaciones detalladas
proporcionadas aquí.
Para cualquier compuesto usando en los métodos de
la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva o dosis puede
estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares.
Luego la dosificación puede formularse para su uso en modelos
animales para conseguir un rango de concentración en circulación que
incluya la IC_{50} como se haya determinado en el cultivo celular
(es decir, la concentración del compuesto de prueba que consiga una
inhibición de la mitad del máximo de la actividad de la PK). Tal
información puede luego usarse para determinar más exactamente las
dosis útiles en humanos.
La eficacia terapéutica y la toxicidad de los
compuestos descritos aquí puede determinarse por procedimientos
farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales
experimentales, p.ej., determinando la IC_{50} y la LD_{50}
(ambas explicadas aquí en otro apartado) para un compuesto concreto.
Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivos celulares
y estudios animales pueden usarse para formular un rango de dosis de
uso en humanos. La dosificación puede variar en función de la forma
de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La
formulación exacta la vía de administración y la dosificación pueden
escogerse por el médico individual en función de las condiciones
del paciente. (Ver p.ej., Fing, et al., 1975, en "The
Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1, p. 1).
La cantidad de dosis y el intervalo puede
ajustarse individualmente para proporcionar niveles de plasma de las
especies activas que sean suficientes para mantener los efectos
moduladores de la quinasa. Estos niveles de plasma son llamados
concentraciones efectivas mínimas (MEC, del inglés minimal
effective concentrations). Las MEC variarán para cada compuesto
pero pueden estimarse a partir de datos in Vitro, p.ej., la
concentración necesaria para conseguir una inhibición del
50-90% de una quinasa puede establecerse usando
ensayos aquí descritos. Las dosis necesarias para conseguir las MEC
dependerán de características individuales y de la vía de
administración. Los ensayos o bioensayos HPLC pueden usarse para
determinar las concentraciones en plasma.
Los intervalos de dosis pueden también
determinarse usando valores de las MEC. Los compuestos deberían
administrarse usando un régimen que mantiene los niveles de plasma
por encima de la MEC durante un 10-95% del tiempo,
preferiblemente entre 30-90% del tiempo y
preferentemente entre 50-90%.
En el presente, las cantidades terapéuticamente
efectivas de compuestos de las Fórmulas I, Ia, o II pueden variar
entre aproximadamente 25 mg/m^{2} y 1500 mg/m^{2} por día;
preferiblemente entre 3 mg/m^{2}/día. Y preferentemente sobre 50
mg/qm qd hasta 400 mg/qd.
En casos de administración local o ingestión
selectiva, la concentración local efectiva del fármaco puede no
estar relacionada con la concentración en plasma y otros
procedimientos conocidos en la materia pueden utilizarse para
determinar la cantidad de dosis correcta y el intervalo.
La cantidad de la composición administrada será,
por supuesto, dependiente del sujeto que va a ser tratado, la
gravedad del mal, la forma de administración, el juicio del médico
que prescribe, etc.
Las composiciones pueden, si se desea, ser
presentadas en un paquete o dispositivo dispensador, como el kit
aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosis
unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede
contener, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico, como un
paquete de blisteres. El paquete o dispositivo dispensador puede ir
acompañado de instrucciones para su administración. El paquete o
dispensador puede también ir acompañado de una declaración asociada
al contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental
que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos.
Tal declaración refleja la aprobación por parte de la agencia de la
forma de las composiciones o de la administración veterinaria o a
humanos. Esta declaración, por ejemplo, puede ser de etiquetaje
aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) de EEUU para la
prescripción de fármacos o de la inserción de un producto aprobado.
Las composiciones que contienen un compuesto de la invención
formulado en un vehículo farmacéuticamente compatible pueden también
prepararse, colocarse en un contenedor apropiado, y etiquetado para
el tratamiento de una condición indicada. Las condiciones indicadas
adecuadas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un tumor,
la inhibición de angiogénesis, tratamiento de fibrosis, diabetes, y
similares.
La presente invención puede administrarse con un
vehículo de suspensión CMC. Una suspensión CMC ejemplar se muestra
seguidamente en la Tabla 3.
| Componente | Concentración % (p/v) |
| API | * |
| Carboximetilcelulosa de sodio, USP (grado medio) | 0,5 |
| Cloruro de sodio, USP/NF | 0,9 |
| Polisorbato 80, NF | 0,4 |
| Bencil alcohol, NF | 0,9 |
| Agua desionizada | cs. 100 ml |
| * En función de la concentración (fecha) requerida. |
Un protocolo para 1,0 litros de vehículo de
suspensión CMC es el siguiente. Calcular la cantidad adecuada de
excipientes necesarios para hacer la formulación del vehículo usado
la tabla que muestra la composición de la formulación del vehículo y
el tamaño de la partida. Pesar un contenedor vacío adecuado, como
una botella de cristal de cuello largo, o una botella de
polietileno. Añadir aproximadamente 600 ml de agua al contenedor.
Pesar la carboximetilcelulosa de sodio (5 g) y transferir al
contenedor. Remover usando una barra de remover magnética o un
dispositivo para remover de laboratorio con una hélice hasta que
esté homogéneo (alrededor de 2-3 horas). Pesar NaCl
y añadir al contenedor. Continuar mezclando hasta que se disuelva
(aproximadamente 10 min). Añadir polisorbato 80. Mezclar hasta que
la solución sea homogénea (aproximadamente 20 min). Añadir bencil
alcohol. Mezclar hasta que la solución sea homogénea
(aproximadamente 10 min). Añadir el agua restante para alcanzar el
peso de la solución hasta la cantidad requerida para la partida ya
sea por peso o volumen (1010 g ó 1000 ml, la densidad a 22ºC es
1,01). Guardar a 2-8ºC (con refrigeración).
La formulación para suspensión puede fabricarse
de la manera siguiente. Pulverizar el API usando mano y mortero para
obtener un polvo de aspecto homogéneo con partículas de tamaño
pequeño (sin fragmentos o grandes partículas - idealmente debería
asar a través de un colador estándar americano de >80, es decir,
tamaño <180 \mum). Pesar y calcular la cantidad de API del
contenedor. Añadir alrededor del 90% de la cantidad requerida total
del vehículo de suspensión CMC al contenedor. Suspender los
compuestos en el vehículo usando un agitador de laboratorio con
hélice o equivalente. El diámetro de las aspas de la hélice debería
ser el mismo que el diámetro del fondo del contenedor para asegurar
una mezcla eficiente. Agitar a 50 rpm durante 30 min o hasta que el
fármaco se haya suspendido correctamente. Añadir la formulación
vehículo hasta "cs" (utilizado en agua) (cantidad suficiente)
hasta el peso adecuado correspondiente a la mezcla de la partida.
Agitar a 50 rpm durante 30 minutos adicionales. Hacer alícuotas de
la suspensión inmediatamente en cristal de color ámbar o
contenedores de polipropileno. Tales contenedores sirven para
proteger de la luz. Agitar a 2-8ºC (con
refrigeración, no congelar).
También es un aspecto de la invención que un
compuesto aquí descrito, o su sal o profármaco, se combinado con
otros agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de trastornos y
enfermedades antes comentadas. Por ejemplo, un compuesto, sal o
profármaco de esa invención puede combinarse con agentes alquilantes
como el fluorouracil (5-FU) sólo o también combinado
con leucovorín; u otros agentes alquilantes como, sin limitación,
otros análogos de pirimidina como UFT, capecitabina, gemcitabina y
citarabina, los sulfonatos de alquilo, p.ej., busulfán (usado en el
tratamiento de leucemia granulocítica crónica), improsulfán y
piposulfán; aziridinas, p.ej., benzodepa, carbocuona, meturedepa y
uredepa; etileniminas y metilmelaminas, p.ej., altretamina,
trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y
trimetilolmelamina; y las mostazas nitrogenadas, p.ej., clorambucil
(usado en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica,
macroglobulinemia primaria y linfoma que no sea de Hodgkin),
ciclofosfamida (usada en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin,
el mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, de ovario, de
pulmón, tumor de Wilm y radbomiosarcoma), estrmustina, ifosfamida,
novembrichín, prednimustina y mostazas de uracil (usadas en el
tratamiento de trombocitosis primaria, linfomas que no sean de
Hodgkin, enfermedad de Hodgkin y cáncer de ovario; y triazinas,
p.ej., dacarbazina (usada en el tratamiento de sarcomas del tejido
blando).
Un compuesto, sal o profármaco de esta invención
puede también usarse en combinación con otros agentes
quimioterapéuticos antimetabolitos, como, sin limitación análogos de
ácido fólico, p.ej., metotrexato (usado en el tratamiento de
leucemia linfocítica aguda, coriocarcinoma, cáncer de mama con
micosis fungoides, cáncer de cuello y cabeza y sarcoma osteogénico)
y teropterina; y los análogos de la purina como la mercaptopurina y
tioguanina que tienen uso en el tratamiento de leucemias
granulocíticas agudas, linfocíticas agudas y granulocíticas
crónicas.
Se contempla que un compuesto, sal o profármaco
de esta invención sea también usado en combinación con agentes
terapéuticos basados en productos naturales, como, sin limitación,
los alcaloides de la vinca, p.ej., vinblastín (usado en el
trtamiento de cáncer de mama y testicular, vincristina y vindesina;
las epipodofilotoxinas, p.ej., etoposida y tenoposida, ambas útiles
en el tratamiento de cáncer testicular y sarcoma de Kaposi; los
agentes antibióticos quimioterapéuticos, p.ej., daunorubicina,
doxorubicina, epirubicina, mitomicina (usado para tratar cáncer de
estómago, cérvix, colon, mama, vejiga y páncreas), datinomicina,
temozolomida, plicamicina, bleomicina (usado en el tratamiento de
cáncer de piel, esófago y del tracto genitourinario); y los agentes
quimioterapéuticos enzimáticos como la
L-asparaginasa.
Además de lo anterior, un compuesto, sal o
profármaco de esta invención puede también ser usado en combinación
con los complejos de coordinación de platino (cisplatín, etc.);
ureas sustituidas como la hidroxiurea; derivados de metilhidrazina,
p.ej., procarbazina, supresores adrenocorticales, p.ej., mitotano,
aminoglutetimida; y hormonas y antagonistas de hormonas como los
adrenocorticosteroides (p.ej., prednisona), progestinas (p.ej.,
caproato de hidroxiprogestorna); estrógenos (p.ej.,
dietilestilbesterol); antiestrógenos como el tamoxifén; andrógenos,
p.ej., propionato de testosterona; e inhibidores de aromatasa como
el anastrozol.
Finalmente, también se contempla que la
combinación de un compuesto de esta invención sea efectiva en
combinación con mitoxanrona, paclitaxel, inhibidores de
ciclooxigenasa-2 conocidos en la materia,
concretamente Celebrex®, Paracoxib®, Vioxx®, Abbot's
Cox-189 expuesto en el nº de publicación PCT WO
99/11605, inhibidores de topoisomerasa como Camptosar®, antagonista
del receptor Her-2 como Herceptin®, endostatín,
Gleevac®, antagonista del receptor VEGF ImClone IMC C225® para el
tratamiento de cánceres con tumores sólidos o leucemias como, sin
carácter limitante, leucemia (no linfocítica) milogenosa aguda.
La siguiente metodología general puede usarse
para preparar los compuestos de esta invención:
El 2-oxindol (1 equiv.)
adecuadamente sustituido, el
3-carboxi-5-formilpirol
(1,2 equiv.) adecuadamente sustituido y una base (0,1 equiv) se
mezclan en un solvente (1-2 ml/mmol de
2-oxindol) y la mezcla se calienta de 2 a,
aproximadamente, 12 horas. Tras enfriar, el precipitado que se forma
se filtra, se lava con etanol frío o éter, y se aspira para
obtenerle correspondiente ácido
5-(2-oxo-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico.
Si el precipitado no se forma, la mezcla de reacción se concentra y
el residuo se tritura con diclorometano/éter, el sólido resultante
se recoge por filtración y se seca. El producto puede purificarse
más por cromatografía.
La base puede ser una base orgánica o inorgánica.
Si se usa una base orgánica, ésta es preferiblemente una base
nitrogenada. Ejemplos de bases nitrogenadas son, pero no
exclusivamente, diisopropilmina, trimetilamina, trietilamina,
anilina, piridina,
1,8-diazabiciclo[5.4.1]undec-7-eno,
pirrolidina y piperidina.
Ejemplos de bases inorgánicas son, pero no
exclusivamente, amonio, hidróxidos de metales alcalinos o
alcalinotérreos, fosfatos, carbonatos, bicarbonatos, bisulfatos y
amidas. Los metales alcalinos incluyen el litio, sodio y potasio,
mientras que los alcalinotérreos incluyen calcio, magnesio y
bario.
En una realización preferida presente de esta
invención, cuando el solvente es un solvente prótico, como el agua o
alcohol, la base es una base inorgánica de un metal alcalino o
alcalinotérreo, preferiblemente un hidróxido de un metal alcalino o
un alcalinotérreo.
Aquellos expertos en la materia, basándose tanto
en principios generales conocidos de síntesis orgánica como en las
cuestiones aquí expuestas, verán claro qué base será la más
apropiada para la reacción contemplada.
El solvente en el que la reacción se lleva a cabo
puede ser un solvente prótico o aprótico, preferiblemente prótico.
Un "solvente prótico" es un solvente que contiene
átomo(s) de hidrógeno covalentemente unidos a átomos de
nitrógeno u oxígeno que vuelve los átomos de hidrógeno
apreciablemente acídicos y por lo tanto capaces de ser
"compartidos" con un soluto mediante puentes de hidrógeno. Los
ejemplos de solventes próticos incluyen, pero no exclusivamente,
agua y alcoholes.
Un "solvente aprótico" puede ser polar o no
polar, pero, en cualquier caso, no contiene hidrógenos acídicos, y
por lo tanto no es capaz de formar puentes de hidrógeno con el
soluto. Algunos ejemplos, pero sin limitación, de solventes
apróticos no polares son el pentano, hexano, benceno, tolueno,
cloruro de metileno y tetracloruro de carbono. Algunos ejemplos de
solventes apróticos polares son el cloroformo, tetrahidrofurano,
dimetilsulfóxido y dimetilformamida.
En una realización preferida presente de esta
invención, el solvente es un solvente prótico, preferiblemente agua
o un alcohol como el etanol.
La reacción se lleva a cabo a temperaturas más
elevadas que la temperatura ambiente. La temperatura oscila
generalmente entre y hasta alrededor de 150ºC, preferiblemente entre
80ºC y alrededor de 100ºC, preferentemente entre 60ºC y alrededor de
85ºC, que es aproximadamente el punto de ebullición del etanol. Por
"alrededor de" se entiende que el rango de temperatura es
preferiblemente está en un margen de 10ºC, preferiblemente 5ºC de la
temperatura indicada, preferentemente 2ºC respecto a la temperatura
indicada. Así, por ejemplo, mediante "alrededor de 75ºC" se
entiende 75ºC \pm 10ºC, preferiblemente 75ºC \pm 5ºC y
preferentemente, 75ºC \pm 2ºC.
Se puede sintetizar fácilmente los
2-oxindoles y
3-carboxi-5-formilpirrolo
utilizando técnicas conocidas en las materias químicas usando
materiales de partida fácilmente disponibles.
La unión del ácido
5-(2-oxo-1,2-dihidroindol-(3Z)-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-carboxílico
con una amina de fórmula
ZCH(R)^{5}-CR^{4}(OH)-CHR^{3}NH_{2}
en un solvente orgánico como la dimetilformamida, tetrahidrofuano y
similares en presencia de un agente de unión como la
diciclohexilcarbodiimida, DEAD, EDC y HOBt proporciona luego un
compuesto de Fórmula (I). Las aminas de fórmula
ZCH(R)^{5}-CR^{4}(OH)-CHR^{3}NH_{2}
están comercialmente disponibles o pueden prepararse mediante
métodos conocidos en la materia. Tales procedimientos están en
adelante
descritos.
descritos.
Aquellos expertos en la materia observarán que
hay disponibles otras vías sintéticas para formar los compuestos de
la invención y que las siguientes se ofrecen a modo de ejemplo no
limitante.
Las siguientes preparaciones y ejemplos se
facilitan para hacer posible a aquellos expertos en la materia el
entendimiento y la práctica de la presente invención de una forma
más clara. No deben considerarse como limitantes del alcance de la
invención, sino como meras ilustraciones y representaciones de la
misma.
Paso
1
Se enfrió dimetilformamida (25 ml, 3 eq.) con
agitación en un baño de hielo. A esto se añadió POCl_{3} (1,1 eq.,
10,8 ml). Tras 30 minutos, se añadió una solución del pyrrolo
3,5-dimetil-4-etilester
(17,7 g, 105,8 mmol) en DMF (2 M, 40 ml) a la reacción y se continuó
con la agitación. Después de dos horas, la reacción se diluyó con
agua (250 ml) y se basificó a pH = 11 con NaOH acuoso 1N. El sólido
blanco se eliminó por filtración, enjuagando con agua y luego con
hexanos y se secó para obtener
5-formil-2,4-dimetil-1H-pyrrol-3-carboxilato
de etilo (19,75 g, 95%) en forma de sólido color canela. ^{1}H
RMN (360 MHz, DMSO-d_{6} ) \delta 12,11 (br s,
1H, NH), 9,59 (s, 1H, CHO), 4,17 (q, J = 6,7Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{3}), 2,44 (s, 3H, CH_{3}), 2,40 (s, 3H, CH_{3}),
1,26 (d, J = 6,7Hz, 3H, OCH_{2}CH_{3}).
Paso
2
Se añadió
5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilato
de etilo (2 g, 10 mmol) a un solvente de hidróxido de potasio (3 g,
53 mmol) disuelto en metanol (3 ml) y agua (10 ml). La mezcla se
sometió a reflujo durante 3 horas, se enfrió a temperatura ambiente
y se acidificó con ácido hidroclórico 6N hasta pH = 3. El sólido se
recogió por filtración, se lavó con agua y se secó en un horno al
vacío durante la noche para obtener ácido
5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(1,6 g, 93%). ^{1}H RMN (300 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 12,09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44
(s, 3H, CH_{3}), 2,40 (s, 3H, CH_{3}).
Paso
3
Se disolvió 5-Fluoroisatina (8,2
g, 49,7 mmol) en 50 ml de hidrato de hidrozina y se sometió a
reflujo durante 1 hora. Las mezclas de reacción se vertieron luego
en agua helada. El precipitado se filtró, se lavó con agua y se
secó bajo horno al vacío para obtener
5-fluoro-2-oxindol
(7,5 g).
Paso
4
Se agitó a 60ºC durante la noche y se filtró la
mezcla de reacción de 5-fluoroxindol (100 mg, 0,66
mmol), ácido
5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(133 mg, 0,79 mmol), y diez gotas de piperidina en etanol (3 ml).
El sólido se lavó con una solución de hidrocloruro acuoso 1 M, agua
y se secó para obtener ácido
5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(201 mg, cuantitativo) en forma de sólido amarillo. MS m/z
(intensidad relativa, %) 299 ([M-1]^{+},
100).
\newpage
Paso
1
A 2-clorometiloxirano (95 g, 1,03
mole) se añadió una mezcla de (3,08 g, 0,17 mole) y dietilamina
(106,2 ml, 1,03 mole) a 30ºC. La mezcla de reacción se agitó luego a
28-35ºC durante 6 h y se enfrió a
20-5ºC para obtener
1-cloro-3-dietilamino-propan-2-ol.
Paso
2
A una solución de hidróxido de sodio (47,9 g, 1,2
mole) en 78 ml de agua se añadió
1-cloro-3-dietilamino-propan-2-ol.
Se agitó lo resultante a 20-25ºC durante 1 hora, se
diluyó en 178 ml de agua y se extrajo con éter dos veces. La
solución de éter combinada se secó con hiróxido de potasio y se
evaporó para dar 135 g de producto crudo que se purificó por
destilación fraccionada para obtener glicidildietilamina pura (98 g,
76%) en forma de aceite.
Paso
3
A la solución fría de hidróxido de amonio (25 ml,
159 mmole) de 25% (p/p) se añadió en gotas glicidildietilamina (3,2
g, 24,8 mmol) durante 10 minutos. La mezcla de reacción se agitó a
0-5°C durante 1 hora y luego a temperatura ambiente
durante 14 horas. La mezcla de reacción resultante se evaporó y se
destiló (84-90°C a 500-600 mT) para
obtener
1-amino-3-dietilamino-propan-2-ol
(3,3 g, 92%). MS m/z 147 ([M+1]^{+}).
Paso
4
A la solución de ácido
5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(100 mg, 0,43 mmol), EDC (122,7 mg, 0,64 mmol) y HOBt (86,5 mg, 0,64
mmol) en 1,0 ml de DMF se añadió
1-amino-3-dietilamino-propan-2-ol
(93,2 mg, 0,64 mmol). La solución de reacción resultante se agitó a
temperatura ambiente durante la noche y se evaporó. El sólido se
lavó con bicarbonato de sodio saturado y agua y se secó en un horno
al vacío elevado durante la noche para obtener un producto crudo que
se purificó por cromatografía de columna eluído con
metanol-diclormetano 6% que contenía trietilamina (2
gotas/100 ml de metanoldiclorometano al 6%) para obtener
(3-dietilamino-2-hidroxi-propil)-5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-iliden-metil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida(62
mg, 34%) en forma de sólido amarillo. ^{1}H RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 13,70 (s, 1H,
NH-1'), 10,90 (s, 1H, NH-1), 7,76
(dd, J = 2,38, 9,33Hz, 1H, H-4), 7,72 (s, 1H,
vinil-H), 7,60 (m, br., 1H,
CONHCH_{2}CH(OH)-CH_{2}N(C_{2}H_{5})_{2}-4'),
6,93 (dt, J = 2,38, 8,99Hz, 1H, H-5), 6,85
(dd, J = 4,55, 8,99Hz, 1H, H-6), 3,83 (m, br,
1H, OH), 3,33 (m, 4H), 2,67 (m, br, 5H), 2,46 (s, 3H, CH_{3}),
2,44 (s, 3H, CH_{3}), 1,04 (m, br, 6H, CH_{3}x2). MS m/z
(intensidad relativa, %) 427 ([M+1]^{+} 100).
Paso
1
Se agitó durante la noche a 70ºC una mezcla de
morfolina (2,6 ml, 30 mmol) y epiclorohidrina (2,35 ml, 30 mmol) en
etanol (50 m). Tras eliminar el solvente, el residuo se diluyó con
cloruro de metileno (50 ml). El sólido claro precipitó y se recogió
por filtración al vacío para
1-cloro-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
(2,0 g, 37%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
3,49 (t, J = 4,8Hz, 2H), 3,60 (t, J = 4,6Hz, 2H), 3,75 (m, 4H,
2xCH_{2}), 4,20 (dd, J = 5,2, 12Hz, 2H), 4,54 (m, 2H), 4,62 (m,
1H, CH), 6,64 (d, J = 6,4Hz, 1H, OH). MS (m/z) 180,2 (M+1).
Paso
2
Se trató
1-cloro-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
(2,0 g, 11 mmol) con la solución de NH_{3} a temperatura ambiente.
Se burbujeó nitrógeno en la mezcla de reacción para eliminar el
amoniaco. La evaporación el solvente dio la sal de cloruro
1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
(2,0 g, 91%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,30 (d, J = 6,0Hz, 2H), 2,36 (m, 4H, NCH_{2}), 2,65 (dd, J = 8,4,
12,8Hz, 1H), 2,91 (dd, J = 3,6, 12,8Hz, 1H), 3,52 (m, 4H,
OCH_{2}), 3,87 (m, 1H, CH), 5,32 (s, 1H, OH), 8,02 (brs., 3H,
NH_{3}^{+}). MS (m/z) 161,1 (M+1).
Paso
3
Se condensó ácido
5-(5-Fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(120 mg, 0,4 mmol) con
1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
(74 mg, 0,48 mmol) para
(2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida
(65 mg, 36%). El líquido madre se concentró por evaporación y el
residuo se purificó por cromatografía rápida para obtener 2N
adicional (70 mg, 39%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 2,28 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2,40, 2,42 (2xs,
6H, 2xCH_{3}), 3,15 (s, 1H), 3,31 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,78 (m,
1H), 4,73 (brs, 1H, OH), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,4Hz, 1H), 6,90 (td,
^{2}J = 2,8, ^{3}J = 10,0Hz, 1H), 7,53 (m, 1H), 7,70 (s, 1H),
7,74 (dd, J = 2,0, 9,6Hz, 1N) (aromático y vinilo), 10,87 (s, 1H,
CONH), 13,66 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 441,4
(M-1).
En un frasco de fondo redondo de tres cuellos de
1l, ajustado a un par termoeléctrico, una entrada de nitrógeno y un
embudo de adición de 250 ml, se cargó morfolina (91,5 g, 91,5 ml,
1,05 moles, 1,0 eq.) y 100 ml de etanol. La solución se agitó
rápidamente mientras se añadía epiclorohidrina (100 g, 84,5 ml, 1,08
mole, 1,03 eq.) a través del embudo de adición durante 30 minutos.
La temperatura se monitorizó y cuando la temperatura del recipiente
alcanzó lo 27ºC se enfrió la reacción con un baño de agua helada. La
solución transparente se agitó durante 18 horas. Se ensayó la
reacción por GC (dilución de 5 gotas de mezcla de reacción en 1 ml
de etanol e inyección en una columna GC capilar
DB-5 de 15 m con los siguientes parámetros: inyector
0ºC, detector 250ºC, temperatura inicial del horno 28ºC que se
calienta hasta 25ºC a 10ºC por minuto). La reacción se completó con
menos del 3% de morfolina restante. La reacción se concentró en el
rotoevaporador a 50ºC al vacío total hasta que no se podía condensar
más destilado. El aceite resultante se guardó a temperatura ambiente
durante 24-48 horas o hasta que se observó una masa
significativa de cristales (un sembrado acelera el proceso). La
suspensión se diluyó con 250 ml de acetona y se filtró. Se secó los
sólidos en el horno al vacío a 60ºC durante 18-24
horas. Esto proporcionó 84 g de producto cristalino. La solución
madre pudo concentrarse y el proceso de cristalización se repitió
aumentando la recuperación. ^{1}H RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 6,55 (d, 1 H), 4,64 (m, 1 H),
4,53 (m, 2 H), 4,18 (m, 2 H), 3,74 (m, 4 H), 3,60 (m, 2 H), 3,48 (m,
2 H).
^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6}) b 70,9, 61,39, 61,04, 60,25, 58,54, 57,80.
^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6}) b 70,9, 61,39, 61,04, 60,25, 58,54, 57,80.
A un frasco de fondo redondo de 1 cuello de 3l
con una barra de agitación magnética se cargó cloruro de
2-hidroxi-7-oxa-4-azoniaspiro[3.5]nonano
(150 g, 835 mmoles) seguido por amoniaco anhídrico en metanol a 23%
en peso (2120 ml). Se tapó el frasco y la solución transparente
resultante se agitó a 20-23ºC durante 18 horas. GC
bajo las condiciones antes mencionadas no mostró material de
partida restante. El tapón se retiró y se dejó que el amoniaco
burbujeara a fuera de la solución durante 30 minutos. El frasco se
transfirió luego a un rotoevaporador y se concentró en un sólido
blanco con un baño a 45ºC y un vacío total. ^{1}H RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 3,57 (dd, 2H),
3,3-3,5 (m, 6 H), 2,59 (m, 2 H),
2,2-2.4 (m, 6 H); ^{13}C RMN (100 MHz
DMSO-d_{6}) \delta 70,8, 67,1, 60,1, 53,8,
48,1.
Siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo
3 anterior, pero sustituyendo
2-(RS)-1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
por
2-(S)-1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
preparado como se describe a continuación, se obtuvo el compuesto
deseado
(2-(S)-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil-5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida.
A un frasco de fondo redondo de 3 cuellos de 1 l,
ajustado al agitador mecánico, al par termoeléctrico y al embudo de
adición, se cargó morfolina (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 moles, 1,0 eq.) y
45 ml de t-butanol. Se agitó rápidamente la solución
mientras se añadía R-epiclorhidrina (100 g, 84,5 ml,
1,08 moles. 1,03 eq.) por el embudo de adición durante
aproximadamente 30 minutos. La temperatura se monitorizó y cuando la
temperatura del recipiente alcanzó los 27ºC, la reacción se enfrió
con un baño de agua helada. La solución transparente se agitó
durante 18 horas. Se ensayó la reacción por GC (dilución de 5 gotas
de mezcla de reacción en 1 m de etanol e inyección en una columna
GC capilar DB-5 de 15 m con los siguientes
parámetros: inyector 250°C, detector 250°C, temperatura inicial del
horno 28°C y se calienta hasta 250°C a 10°C por minuto). La reacción
se completó con menos de un 3% de morfolina restante. Se enfrió la
solución a 10ºC y se añadió a goteo una solución al 20% en peso de
t-butoxida de potasio en THF (576 g) conservando la
temperatura a menos de 15°C. La suspensión blanca resultante se
agitó a 10-15°C durante 2 horas y se comprobó por GC
usando las condiciones antes indicadas. No se observó clorhidrina.
La mezcla se concentró en el rotoevaporador usando un baño de 50ºC y
al vacío total. La mezcla resultante se diluyó con agua (500 ml) y
cloruro de metileno. Las fases se separaron y la fase acuosa se lavó
con cloruro de metileno (500 ml). Las capas orgánicas combinadas se
secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron en un aceite
incoloro transparente. Esto proporcionó 145 g, a un rendimiento del
97% del epóxido. ^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 3,3 (dd, 4 H), 3,1 (m, 1 H), 2,6 (dd, 1 H), 2,5 (dd, 1 H),
2,4 (m, 4 H), 2,2 (dd, 2 H); ^{13}C RMN (100 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 65,4, 60,1, 53,1, 48,9,
43,4.
El epóxido crudo anterior se cargó en un frasco
de tres cuellos de fondo redondo de 3l con una barra de agitación
magnética. Se añadió amoniaco anhidro en metanol (24 p/p 2,5l), se
tapó el frasco y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante
24 horas. El GC en las condiciones antes indicadas no mostró
material de partida. Se quitó el tapón y se dejó burbujear al
amoniaco fuera de la solución durante 30 minutos. El frasco se
transfirió luego a un rotoevaporador y se concentró en un aceite
incoloro transparente con un baño a 45ºC y al vacío. Esto
proporcionó 124 g de producto. ^{1}H RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 3,57 (dd, 2H),
3,3-3,5 (m, 6 H), 2,59 (m, 2 H),
2,2-2,4 (m, 6 H); ^{13}C RMN (100 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 70,8, 67,1, 60,1, 53,8,
48,1.
A un frasco de fondo redondo de 3 cuellos de 1
litro se ajustó un agitador mecánico, un par termoeléctrico y un
embudo de adición. Se cargó con morfolina (91,5 g, 91,5 ml, 1,05
moles, 1,0 eq.) y 200 ml de metanol. La solución se agitó
rápidamente mientras se añadía R-epiclorhidrina (100
g, 84,5 ml, 1,08 moles, 1,03 eq.) por el embudo de adición durante
aproximadamente 30 minutos. Se monitorizó la temperatura y cuando la
temperatura del frasco alcanzó los 27ºC, se enfrió la reacción con
un baño de agua helada. La solución transparente se agitó durante 18
horas. La reacción se ensayó por GC (dilución de 5 gotas de la
mezcla de reacción en 1 ml de etanol e inyección en una columna GC
capilar DB-5 de 15 m con los siguientes parámetros:
inyector 250°C, detector 250°C, temperatura inicial del horno 28°C y
se calienta hasta 250°C a 10°C por minuto). La reacción se complete
con menos del 3% de morfolina restante. Se enfrió la solución a 10ºC
se añadió a goteo una solución a 25% en peso de metóxido de sodio en
metanol (233 g, 1,08 mole, 247 ml) conservando la temperatura a
menos de 15ºC. La suspensión blanca resultante se agitó a
10-15°C durante 2 horas y se comprobó por GC usando
las condiciones antes indicadas. No se observó clorhidrina. La
mezcla se concentró en el rotoevaporador usando un baño a 50ºC y al
vacío total. La mezcla resultante se diluyó con agua (500 ml) y
cloruro de metileno. Las fases se separaron y se lavó la fase acuosa
con cloruro de metileno (500 ml). Las capas orgánicas combinadas se
secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron en un aceite
incoloro transparente. Esto proporcionó 145 g, a un rendimiento del
97% de
1,2-epoxi-3-morfolin-4-ilpropano.
^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 3,3
(dd, 4 H), 3,1 (m, 1 H), 2,6 (dd, 1 H), 2,5 (dd, 1 H), 2,4 (m, 4 H),
2,2 (dd, 2 H); ^{13}C RMN (100 MHz, DMSO-d_{6})
\delta 65,4, 60,1, 53,1, 48,9, 43,4.
El crudo anterior
1,2-epoxi-3-morfolin-4-ilpropano
se cargó en un frasco de 3 l de 1 cuello con fondo redondeado con
una barra de agitación magnética. Se añadió amoniaco (24% p/p 2,5l),
se tapó el frasco y se agitó la mezcla a temperatura ambiente
durante 24 horas. En el GC en las condiciones antes indicadas no se
observó material de partida. El tapón se sacó y se dejó burbujear el
nitrógeno fuera de la solución durante 30 minutos. El frasco se
transfirió luego a un rotoevaporador y se concentró en un aceite
incoloro transparente con un baño a 5ºC y al vacío total. Esto
proporcionó 124 g de
1-amino-3-(4-morfolinil)-2-(S)-propanol.
^{1}H RMN (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 3,57
(dd, 2H), 3,3-3,5 (m, 6 H), 2,59 (m, 2 H),
2,2-2,4 (m, 6 H); ^{13}C RMN (100 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 70,8, 67,1, 60,1, 53,8,
48,1.
Se mezcló imidazolamida (7,0 g, 32,3 mmol), amina
(15,0 g, 64,6 mmol), 5-fluoroxindol (4,93 g, 32,6
mmol), trietilamina (9,79 g, 96,9 mmol), y THF (88 ml) y se calentó
a 60°C. Se formó una solución marrón. Tras agitar durante 24 horas a
60ºC, se enfrió una suspensión amarilla a ta (temperatura ambiente)
y se filtró. El filtrado se lavó con 80 ml de THF y se secó durante
la noche a 50ºC al vacío. Se obtuvo un sólido marrón (23,2 g). El
sólido se suspendió en 350 ml de agua durante 5 h a ta y se filtró.
El filtrado se lavó con 100 ml de agua y se secó a 50ºC al vacío
durante la noche. Se obtuvo 8,31 g con un rendimiento químico del
56%.
Un frasco de 0,25 l ajustado a un termómetro, un
condensador, un agitador magnético y una entrada de nitrógeno se
cargó con 4,29 g de 5-fluoroxindol, 7,0 g de
imidazol amida, 15,5 g de
(R)-1-amino-3-(4-morfolin)-2-propanol,
9,78 g de trietilamina y 88 ml de tetrahidrofurano. La mezcla se
calentó a 60ºC durante 16,5 horas. La reacción se enfrió a
temperatura ambiente y se filtró. Los sólidos obtenidos se
suspendieron tres (3) veces sucesivas en acetonilo 11 ml/g, se
secaron al vacío para obtener 3,6 g (25,25%). [HPLC, Hipersil BDS,
C-18, 5 \mu, (6:4), Acetonitrilo: Cloruro de
amonio 0,1 M, PHA-571437 = 4,05 min.]
H^{1} RMN (DMSO): \delta 10,86 (1H, bs); 7,75
(1H, d); 7,70 (1H, s); 7,50 (1H, m); 6,88 (2H, m); 4,72 (1H, bs);
3,78 (1H, bs); 3,56 (4H, m); 3,32 (6H, m); 3,15 (1H, m); 2,43 (8H,
bm).
Se condensó ácido
(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3carboxílico
(113 mg, 0,4 mmol) con
1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
(74 mg, 0,48 mmol) para precipitar
(2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-1H-pirrol-3-carboxamida
(77 mg, 45,3%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,27 (m, 1R), 2,32 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2,40, 2,42 (2xs, 6H,
2xCH_{3}), 3,15 (s, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H),
4,74 (d, J = 4,8Hz, 1H, OH), 6,86 (d, J = 7,6Hz, 1H), 6,96 (t, J =
7,2Hz, 1H), 7,10 (t, J = 7,6Hz, 1H), 7,49 (t, J = 5,6Hz, 1H), 7,61
(s, 1H), 7,77 (d, J = 8,0Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,88 (s, 1H,
CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 425,4
(M+1).
Se condensó ácido
5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenemetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(126,6 mg, 0,4 mmol) con
1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
(74 mg, 4,48 mmol) para precipitar
(2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)-5-[5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida
(107 mg, 58%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,29 (m, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,39(m, 4H), 2,40, 2,42 (2xs, 6H,
2xCH3), 3,15 (s, 1H), 3,37 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74
(d, J = 4,8Hz, 1H, OH), 6,85 (d, J = 8,4Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0,
8,0Hz, 1H), 7,53 (t, J = 5, 6Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,97 (d, J =
2.0Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H,
NH). LC-MS (m/z) 457,4 (M-1).
Los estereoisómeros R y S pueden prepararse de la
siguiente manera.
Se mezcló imidazolamida (7,0 g, 32,3 mmol), amina
(15,5 g, 96,9 mmol), 5-cloroxindol (5,48 g, 32,6
mmol), trietilamina (14 ml), y THF (88 ml) y se calentaron a 60ºC.
Se formó una solución roja. Tras agitar durante 16 h a 60ºC, la
suspensión amarilla se enfrió a ta y se filtró. El filtrado se lavó
con 2 x 50 ml de THF y se secó durante la noche a 50ºC al vacío. Se
obtuvo 4,36 g con un rendimiento químico del 29%.
Se mezcló imidazolamida (6,8 g, 31,3 mmol), amina
(10,0 g, 62,5 mmol), 5-cloroxindol (5,3 g, 31,6
mmol), y THF (100 ml) y se calentó a 60ºC. Se formó una solución
roja. Tras agitar durante 68 horas a 60ºC, se añadió trietilamina
(14 ml) y se agitó durante 5 h a 60ºC. La reacción no estaba
completa. Se añadió 4, g de cadena lateral de amina y se agitó
durante 20 h a 60ºC. La suspensión amarilla se enfrió a ta y se
filtró. El filtrado se lavó con 2 x 50 ml de THF y se secó durante
la noche a 50ºC al vacío. Se obtuvo 5,48 g con un rendimiento
químico del 38%.
Se condensó ácido
5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenemetil)-2,4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico
(72,2 mg, 0,2 mmol) con
1-amino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
(38 mg, 0,24 mmol) para precipitar
(2-hidroxi-3-morfolin-4-il-propil)5-[5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida
(55 mg, 55%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,27 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,39(m, 4H), 2,41, 2,42 (2xs, 6H,
2xCH_{3}), 3,13 (s, 1H), 3,35 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H),
4,74 (d, J = 4,4Hz, 1H, OH), 6,80 (d, J = 8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J =
2,0, 8,0Hz, 1H), 7,51 (t, J = 5,6Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J =
2,0Hz, 1H) (aromático y vinilo), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H,
NH). LC-MS (m/z) 503,4 (M-1).
Paso
1
Se agitó una mezcla de 3-[1,2,3]triazol
(2,0 g, 29 mmol), epiclorhidrina (3,4 ml, 43,5 mmol) y
N,N-diisopropil-etilamina (2,6 ml,
15 mmol) en etanol (50 ml) a temperatura ambiente durante la noche.
Tras eliminar los solventes, el residuo se purificó por
cromatografía rápida (CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH =
100/1-100/2-100/4) para obtener
1-cloro-3-(1,2,3)-triazol-2-ilpropan-2-ol
(2,1 g, 45%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,52 (m, 2H, OH y
CH_{2}), 3,60 (dd, J = 5,2, 11,2Hz, 1H), 4,36 (m, 1H, CH), 4,68
(m, 2H), 7,67 (s, 2H). MS (m/z) 162,1 (M+1) y
1-cloro-3-(1,2,3)triazol-1-ilpropan-2-ol
(2,3 g, 49%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 3,56 (s, 1H),
3,57 (s, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,53 (dd, J = 7,2, 14Hz, 1H), 4,67 (dd,
J = 3,8, 14Hz, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,71 (s, 1H). MS (m/z) 162,1
(M+l).
Paso
2
Se trató
1-Cloro-3(1,2,3)triazol-1-ilpropan-2-ol
(2,3 g, 13 mmol) con la solución NH_{3} en metanol (25% en peso,
20 ml) a 60ºC durante la noche y en un recipiente sellado a
presión. Tras enfriar a temperatura ambiente, se burbujeó nitrógeno
dentro de la mezcla de reacción para eliminar el amoniaco. La
evaporación del solvente dio la sal de cloruro de hidrógeno de
1-amino-3-(1,2,3)triazol-1-ilpropan-2-ol
(2,57 g, 100%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,68 (dd, J = 8,8, 12,8Hz, 1H), 2,97 (dd, J = 3,6, 12,8Hz, 1H), 4,15
(m, 1H), 4,44 (dd, J = 6,4, 14Hz, 1H), 4,57 (dd, J = 4,6, 14Hz, 1H),
5,95 (d, J = 5,2Hz, 1H, OH), 7,77 (s, 1H), 8,01. (brs., 3H,
NH_{3}^{+}), 8,12 (s, 1H). MS (m/z) 143,1 (M+1).
Paso
3
Se condensó ácido
5-(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(113 mg, 0,4 mmol) con
1-amino-3(1,2,3)triazol-1-il-propan-2-ol
85 mg, 0,48 mmol) para precipitar
(2-hidroxi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-2,4-dimetil-5-[2-oxo-1,2dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-1H-pirrol-3-carboxamida
(70 mg, 41%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,45, 2,48 (2xs, 6H, 2xCH_{3}), 3,35 (m, 2H), 4,02 (m, 1H), 4,32
(dd, J = 7,6, 14Hz,1H), 4,53 (dd, J = 3,4, 14Hz,1H), 5,43 (d, J =
5,6Hz, 1H, OH), 6,91 (d, J = 7,6Hz, 1H), 7,01 (t, J = 7,6Hz, 1H),
7,15 (t, J = 8,0Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,12 (t, J = 5,6Hz, 1H), 7,74
(s, 1H), 7,77 (d, J = 7,6Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 10,93 (s, 1H, CONH),
13,68 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 405,4
(M-1).
Se condensó ácido
5-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenemetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida
(120 mg, 0,4 mmol con
1-amino-3(1,2,3)triazol-1-il-propan-2-ol
(85 mg, 0,48 mmol) para precipitar
(2-hidroxi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenemetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida
(100 mg, 62%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,42, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH_{3}), 3,27 (m, 2H), 3,98 (m, 1H), 4,27
(dd, J = 7,6, 14Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 3,4, 13,6Hz,1H), 5,38 (d, J =
5,6Hz, 1H, OH), 6,82 (dd, J = 4,4, 8,4Hz, 1H), 6,91 (td, ^{2}J =
2,4, ^{3}J = 9,0Hz, 1H), 7,70 (m, 3H), 7,75 (dd, J = 2,4, 9,2Hz,
1H), 8,11 (s. 1H), 10,93 (s, 1H, CONH), 13,73 (s, 1H, NH),
LC-MS (m/z) 423,4 (M-1).
Se condensó ácido
5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(126,6 mg, 0,4 mmol) con
1-amino-3(1,2,3)triazol-1-il-propan-2-ol
(85 mg, 0,48 mmol) para precipitar
(2-hidroxi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-5-[5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenmetil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida
(48 mg, 27%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,42, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH_{3}), 3,27 (m, 2H), 3,99 (m, 1H), 4,28
(dd, J = 7,8, 14Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 3,2, 14Hz, 1H), 5,39 (d, J =
6,0Hz, 1H, OH), 6,85 (d, J = 8,4Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 2,0, 8,2Hz,
1H), 7,70 (m, 2H), 7,74 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0Hz, 1H), 8,07 (s,
1I), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH), LC-MS
(m/z) 439,4 (M-1).
Se condensó ácido
5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
(144,4 mg, 0,4 mmol) con
1-amino-3(1,2,3)triazol-1-il-propan-2-ol
(85 mg, 0,48 mmol) para precipitar
(2-hidroxi-3-[1,2,3]triazol-1-il-propil)-5-[5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxamida
(130 mg, 67%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,41, 2,44 (2xs, 6H, 2xCH_{3}), 3,27 (m, 2H), 3,99 (m, 1H), 4,28
(dd, J = 7,6, 14Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 3,6, 14Hz, 1H), 5,40 (d, J =
5,6Hz, 1H, OH), 6,81 (d, J = 8,4Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 2,0, 8,0Hz,
1H), 7,70 (m, 2H), 7,77 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,10 (d, J = 1,6Hz,
1H), 11,0 (s, 1H, CONH), 13,64 (s, 1H, NH), LCMS (m/z) 485,4
(M-1).
La síntesis del ácido
5-(5-bromo-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenemetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico,
del ácido
5-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico,
y del ácido
5-(2-oxo-1,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico
está descrita en la Solicitud actualmente archivado con la presente
solicitud el 14 de Febrero de 2001, titulada "PIRROLE SUBSTITUTED
2-INDOLINONE - -PROTEIN KINASE INHIBITORS",
Nº de serie 09/783,264, cuya exposición se incorpora aquí en su
totalidad.
A la solución de tiomorfolina (5,0 g, 48,7 mmol)
en HOCH_{3} (200 ml) se añadió la solución de ozono (36,0 g, 58,5
mmol) en H_{2}O (100 ml). Se agitó bien la mezcla a 40ºC durante
48 h y luego se enfrió a 0ºC. Se añadió a goteo NaOH acuoso para
ajustar el pH = 12. Se filtró el sólido y se lavó con HOCH_{3} (3
x 40 ml). El líquido combinado se condensó y purificó por
cromatografía rápida en gel de sílice
(CHCl_{3}/CH_{3}OH/NH_{3}.H_{2}O =
3/1/0,1-2/1/0,1) para obtener
1,1-dióxido de tiomorfolina (6,2 g) con un
rendimiento del 93%. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 2,97 (m, 4H), 3,07 (m, 4H), 3,42 (brs, 1H), MS (m/z) 136
(M+1).
La mezcla de 1,1-dióxido de
tiomorfolina (2,5 g, 18,5 mmol) y (R)-(-)epiclorhidrina (1,55 ml, 20
mmol)en los solventes de mezcla de etanol (50 ml) y H_{2}O
(5 ml) se agitó a 25ºC durante 24 h. Tras eliminar el solvente se
purificó el residuo por cromatografía rápida para obtener
(R)-1-cloro-3-(1,1-dioxo-\lambda^{6}-thiomorfolin-4-il)-propan-2-ol
(4,0 g, 96%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta
2,50 (m, 2H), 2,94 (m, 4H), 305 (m, 4H), 3,54 (dd, J = 5,8, 11,2Hz,
1H), 3,63 (dd, J = 4,4, 11,2Hz, 1H), 3,78 (m, 'H, CH), 5,10 (d, J =
5,2Hz, 1H, OH), MS (m/z) 228,2 (M+1).
Se trató el
(R)-1-cloro-3-(1,1-dioxo-\lambda^{6}-tiomorfolin-4-il)-propan-2-ol
(2,27 g, 10 mmol) con la solución de NH_{3} en metanol (25% en
peso, 20 ml) a 50ºC durante 12 h. Tras la evaporación de los
solventes, se trató el residuo con resina de intercambio de aniones
(AG1x8, forma OH) en agua para dar
(S)-1-amino-3-(1,1-dioxo-\lambda^{6}-tiomorfolin-4-il),
propan-2-ol crudo (2.0 g). Se
contaminó con aproximadamente 30% de sus dímeros y se pudo purificar
con dificultad por cromatografía de columna. MS (m/z) 209,2 (M+1).
La condensación de
(S)-1-amino-3-(1,1-dioxo-\lambda^{6}-tiomorfolin-4-il)-propan-2-ol
con oxindoles dio las indolinonas deseadas (con un rendimiento del
50-80% tras la purificación).
^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 2,39, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH_{3}), 2,49 (m, 1H), 2,56 (m,
1H), 2,97 (m, 4H), 3,07 (m, 4H), 3,16 (m, 1H), 3,34 (m, 1H), 3,74
(m, 1H), 4,83 (d, J = 4,8Hz, 1H, OH), 6,86 (d, J = 7,6Hz, 1H), 6,97
(t, J = 7,4Hz, 1H), 7,11 (t, J = 7,5Hz, 1H), 7,50 (t, J = 5,6Hz,
1H), 7,61 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,6Hz, 1H) (aromático y vinilo),
10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z)
473,4 (M+1).
^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH_{3}), 2,47(m, 1H), 2,54
(m, 1H), 2,97 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,17 (m, 1H), 3,30 (m, 1H),
3,74 (m, 1H), 4,83 (d, J = 4,4Hz, 1H), 6,82 (t, J = 4,0Hz, 1H) 6,91
(td, ^{2}J = 2,8, ^{3}J = 9,0Hz, 1H), 7,53 (t, J = 5,8Hz, 1H),
7,70 (s, 1H) 7,75 (dd, J = 2,4, 9,2Hz, 1H), 10,88 (s, 1H), 13,67 (s,
1H), LC-MS (m/z) 491,4 (M+1).
^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 2,40, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH_{3}), 2,45 (m, 1H), 2,53 (m,
1H), 2,96 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,17 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 3,75
(m, 1H), 4,83 (d, J = 4,4Hz, 1H, OH), 6,85 (t, J = 8,4Hz, 1H), 7,11
(dd, J = 2,2, 8,2Hz, 1H), 7,53 (t, J = 5,5Hz, 1H), 7,75 (s, 1H),
7,97 (d, J = 2,0Hz, 1H), 10,98 (s, 1H), 13,62 (s, 1H),
LC-MS (m/z) 507,2 (M+1).
^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 2,41, 2,42 (2xs, 6H, 2xCH_{3}), 2,47 (m, 1H), 2,54 (m,
1H), 2,97 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,18 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,74
(m, 1H), 4,83 (d, J = 4,8Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,4Hz, 1H), 7,24 (dd,
J = 1,8, 8,2Hz, 1H), 7,53 (t, J = 5,8, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J
= 2,0Hz, 1H), 10,98 (s, 1H) 13,62 (s, 1H), LC-MS
(m/z) 553,6 (M+1).
La mezcla de morfolina (1,74 ml, 20 mmol) y
(R)-epiclorhidrina (1,56 ml, 20 nnmol) en etanol (10
ml) se agitó a ta durante 48 h. Tras eliminar el solvente, el
residuo se trató con la solución de CH_{3}NH_{2} en agua (40% en
peso, 20 ml) a ta durante 14 h. La eliminación de los solventes dio
(S)-1-metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
crudo, que se podía purificar por destilación al vacío o por
cromatografía (2,4 g, 70%). El
(R)-1-metilamino-3-morfolin-4-il-propan-2-ol
se hizo a partir de (S)-epiclorhidrina dando 76% de
rendimiento. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 2,33 (dd, J = 3,6,
12,4Hz, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,44 (dd, J = 2,8, 9,8Hz, 2H), 2,45 (s,
3H), 2,53 (dd, J = 7,6, 11,8Hz, 1H), 2,62 (m, 2H), 2,65 (dd, J =
3,6, 12,0Hz, 1H), 3,71, (m, 4H), 3,85 (m, 1H), ^{13}CRMN
(CDCl_{3}) \delta 67,06, 65,58, 62,80, 55,87, 53,94, 36,72, MS
(m/z) 175 (M+1).
^{1}H RMN (DMSC-d_{6})
\delta 2,0 (s, 3H), 2,15 (m, 1H), 2,25 (m, 6H), 2,28 (m, 2H), 2,42
(s, 1H), 2,95 (s, 1H), 3,0 (s, 3H), 3,25 (m, 2H), 3,57 (m, 2H),
3,97, 3,68 (2xbrs, 1H), 4,80, 4,74 (2xbrs, 1H), 6,82 (dd, J = 4,0,
8,0Hz, 1H), 6,90 (td, ^{2}J = 2,3, ^{3}J = 8,7Hz, 1H), 7,67 (s,
1H), 7,71 (dd, J = 2,2, 9,0Hz, 1H), 10,86 (s, 1H), 13,57 (s, 1H),
LC-MS (m/z) 457,2 (M+1).
^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
\delta 2,0 (m, 3H), 2,10 (m, 1H), 2,22 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 2,38
(m, 1H), 2,90 (s, 1H), 2,96 (s, 3H), 3,27 (m, 2H), 3,52 (m, 2H),
3,93, 3,64 (2xbrs, 1H), 4,75, 4,70 (2xbrs, 1H), 6,77 (dd, J = 4,6,
8,2Hz, 1H), 6,85 (td, ^{2}J = 2,5, ^{3}J = 8,8Hz, 1H), 7,62 (s,
1H), 767 (dd, J = 2,0, 9,6Hz, 1H), 10,81 (s, 1H) 13,52 (s, 1H),
LC-MS (m/z) 457,2 (M+1).
6,905 g de tetrazol (100 mmol) 1,75 ml de
diisopropiletilamina (10 mmol) y 11,73 ml de epiclorhidrina (150
mmol) en acetonitrilo anhidro (30 ml) fueron agitados a 60ºC durante
4 horas. La solución obtenida se evaporó, se secó al vacío elevado y
se purificó en una columna de sílice en
cloroformo-metanol 100:8. La primera fracción
proporcionó
3-(2H-tetrazol-2-il)-2-hidroxi-1-cloropropano
puro, 6,215 g (aceite incoloro, 38%Y), la segunda fracción
proporcionó 9,208 g
3-(1H-tetrazol-1-il)]-2-hidroxil-1-cloropropano
puro (goma pegajosa; 57%Y).
Se agitó 9,110 g de
3-(1H-tetrazol-1-il)]-2-hidroxi-1-cloropropano,
15 g de carbonato de potasio y 130 ml de amoniaco metabólico
saturado durante 21 horas, luego se filtró y evaporó. El residuo se
purificó en una columna de sílice en
cloroformo-metanol-amoniaco acuoso
80:35:4. Y = 7,326 g de una goma blanca pegajosa (91,5% th).
Se agitó 6,105 g de
3-(2H-tetrazol-2-il)]-2-hidroxi-1-cloropropano,
10 g de carbonato de potasio y 95 ml de amoniaco metabólico saturado
durante 21 horas, luego se filtró y evaporó. El residuo se purificó
en una columna de sílice en
cloroformo-metanol-amoniaco acuoso
60:25:2. Y = 3,726 g de un sólido blanco cristalino (69,5% th).
Se añadió 4,7 ml de epiclorhidrina (60 mmol) a
una solución enfriada con hielo de
cis-2,6-dimetilmorfolina (4,607 g,
40 mmol) en trifluoroetanol (5 ml). La solución se agitó a
0-5ºC durante 1 hora, se sacó el baño de frío y se
agitó a ta durante 5 horas adicionales. Se evaporó la mezcla al
vacío. Se disolvió el residuo oleoso obtenido en etanol anhidro (50
ml), la solución se enfrió en baño de hielo, se añadió metóxido de
sodio sólido (2,27 g) en dos porciones y la mezcla se agitó a
0-5ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se
filtró después, se lavó las sales con etanol (30 ml) y los filtrados
combinados se añadieron a amoniaco acuoso concentrado (200 ml)
enfriado al hielo. La mezcla se agitó a ta durante 12 horas, y luego
se evaporó al vacío. El residuo se purificó en una columna de sílice
en mezcla con cloformo-metanol-7M
amoniaco metabólico 80:15:3. Y = 5,75 g de un sólido higroscópico
cristalino blanco (76,3% th).
Se agitó 3,423 g de
3-metil-2,5- -dioxoimidazolidina
(3,423 g) y 3,60 ml de R epiclorhidrina (-) (99%e.e.) y 0,30 ml de
base de Barton (1,5 mmol) en acetonitrilo anhidro a 60ºC durante 20
horas. La solución obtenida se evaporó al vacío y se purificó en una
columna de sílice en una mezcla de
cloroformo-metanol (un gradiente de 5 a 20% de
metanol) para obtener 5,572 g del cloro-compuesto
como un sólido amorfo blanco (90% Y). El cloruro se transformó en
amina de la siguiente manera. El intermedio
hidroxi-cloro obtenido se disolvió en amoniaco
metabólico (saturado con gas de amoniaco), se añadió carbonato de
potasio y la mezcla se agitó en un frasco cerrado durante 2 días y
medio. Se filtró la mezcla de reacción y se evaporó los filtrados.
El residuo se purificó en una columna de sílice en una mezcla de
cloroformo-metanol-amoniaco acuoso
conc. 80:15:1,5.
Se añadió 72 mg de
3-(2H-tetrazol-2-il)-2-hidroxi-1-aminopropano
a la suspensión de 105 mg (0,25 mmol) de
5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilato
de
1-oxi-7-azabenzotriazol
[preparado al activar
(3Z)-3-({3,3-dimetil-4-carboxi-1H-pirrol-2-il}mutilen)-5-fluoro-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona
(480 mg; 1,6 mmol) con el reactivo HATU (570 mg; 1,5 mmol) en
presencia de la base de Hunig (3,0 mol; 0,525 ml) en DMF (5 ml) y
aislado en forma pura por precipitación con cloroformo (5 ml) y
secándolo al vacío obteniendo un rendimiento del 92% (579 mg)] en
dimetilacetamida anhidra (1,5 ml). La mezcla se agitó durante 30 min
y se evaporó al vacío. El residuo se suspendió en una mezcla de
metanol-dietilamina 20:1 (3 ml), y se dejó
cristalizar en el refrigerador (5ºC) durante 1 hora. Luego se filtró
y se lavó el precipitado con metanol muy frío y se secó al vacío. Y
= 106 mg de un sólido cristalino de color naranja.
Se añadió 72 mg de
3-(2H-tetrazol-2-il)-2-hidroxi-1-aminopropano
a la suspensión de 109 mg (0,25 mmol) de
5-[(Z)-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrole-3-carboxilato
de
1-oxi-7-azabenzotriazol
[preparado por activación de
(3Z)-3-([3,3-dimetil-4-carboxi-1H-pirrol-2-il)metilen)-5-cloro-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona
(1,520 g; 4,8 mmol) con el reactivo HATU (1,768 g; 4,65 mmol) en
presencia de la base de Hunig (9,0 mmol; 1,58 ml) en DMF (20 ml) y
se aisló en forma pura al precipitarlo con cloroformo (20 ml) y se
secó al vacío obteniendo un rendimiento de 94% (1,907 g)] en
dimetilacetamida anhidra (1,5 ml). La mezcla se agitó durante 30 min
y se evaporó al vacío. El residuo se suspendió en una mezcla de
metanol-dietilamina 20:1 (3 ml). Luego se dejó
cristalizar en el refrigerador (5ºC) durante 1 hora, se filtró, el
precipitado se lavó con metanol muy frío y se secó al vacío. Y = 109
mg de un sólido cristalino de color naranja.
Se añadió 72 mg de
3-(2H-tetrazol-2-il)-2-hidroxi-1-aminopropano
a la suspensión de 121,5 mg (0,25 mmol) de
5-[(Z)-(5-trifluorometoxi-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilato
de
1-oxi-7-azabenzotriazol
[preparado por activación de
(3Z)-3-((3,3-dimetil-4-carboxi-1H-pirrol-2-il)metilen)-5trifluorometoxi-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona
(1,768 g; 4,8 mmol) con el reactivo HATU (l,758 g; 4,8 mmol) en
presencia de la base de Hunig (9,0 mmol; 1,58 ml) en DMF (25 ml) y
se aisló en forma pura por evaporación y precipitación con
cetonitrilo anhidro y se secó al vacío obteniendo un rendimiento del
85,5% (1,929 g) en dimetilacetamida anhidra (1,5 ml). La mezcla se
agitó durante 30 min y se evaporó al vacío. El residuo se suspendió
en una mezcla de metanol-dietilamina 20:1 (3 ml), y
se dejó cristalizar en el refrigerador (5ºC) durante 1 hora, se
filtró y el precipitado se lavó con metanol muy frío y se secó al
vacío. Y = 113 mg de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 14 a partir de 72 mg de la amina correspondiente. Y = 113 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 15 a partir de 72 mg de la amina correspondiente. Y = 122 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 16 a partir de 72 mg de la amina correspondiente. Y = 118 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 14 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 99 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 15 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 101 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 16 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 89 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 14 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 109 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 15 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 107 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 16 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 123 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 14 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 110 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 15 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 103 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 16 a partir de 95 mg de la amina correspondiente. Y = 120 mg
de un sólido cristalino de color naranja.
Se enfrió DMF (4 ml, 3 eq) con agitación en un
baño de hielo. A esto se le añadió POCL_{3} (1,1 eq., 1,8 ml).
Después de 30 minutos, se añadió una solución de
2,5-dimetil-4-etilester
pirrolo (4 g, 17,4 mmol) en DMF (2 M, 9 ml) y continuó en
agitación. Tras 10 min, la mezcla de reacción solidificó. Ésta se
diluyó con 5 ml de DMF y se calentó en baño de aceite a 90ºC. Tras 1
h, la reacción se enfrió a ta y se diluyó con agua (100 ml) y se
basificó hasta pH = 11 con NaOH 1N. El producto se extrajo en
cloruro de metileno (3 x 200 ml) y las capas orgánicas se lavaron
con salmuera (200 ml), se secaron (MgSO_{4}) y se concentró para
dar 4,3 g (95%) de
5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxilato
de etilo en forma de sólido marrón. ^{1}H RMN (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,5 (br s, 1H, NH), 9,11 (s,
1H, CHO), 7,35 (s, 5H, ArH), 3,98 (q, J = 6,8 y 7,2Hz, 2H,
OCH_{2}CH_{3}), 2,48 (s, 3H, CH_{3}), 0,98 (t, J = 7Hz, 3H,
OCH_{2}CH_{3}).
Se disolvió
5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxilato
de etilo en agua (100 ml) y metanol (45 ml) con agitación. Se añadió
KOH (2 eq. 1,9 g) y se calentó a 100ºC. Tras 2,5 h, se enfrió a
temperatura ambiente y el éster restante se eliminó extrayéndolo con
acetato de etilo (200 ml), se secó y se concentró. La capa acuosa se
acidificó hasta pH = 3 utilizando HCl 2N. El sólido blanco se
eliminó por filtración, aclarando con agua. El sólido se volvió a
concentrar con tolueno, se trituró con hexanos y se secó para
obtener 2 g (52%) de un sólido color hueso. ^{1}H RMN (360 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 12,46 (br s, 1H, CO_{2}H),
11,95 (s, 1H, NH), 9,08 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H, ArH), 2,49 (s,
3H, CH_{3}), MS m/z (intensidad relativa %, ión) encontrado 229
(100, M^{+}); calc. 229,2.
Una mezcla de ácido
5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3carboxílico
(1,0 g, 4,36 mmol),
1-amino-3-dietilamino-2-propanol
(950 mg, 6,54 mmol), DDC (900 mg, 4,36 mmol) y HOBt (884 mg, 6,54
mmol) en cloroformo (60 ml) se agitó a ta durante 12 horas. La
reacción se vertió en bicarbonato de sodio sat. (60 ml) y a eso se
añadió NaOH 1N (8 ml). Luego se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml), se
lavó con agua y salmuera, se secó y se concentró para obtener 400 g
de
(3-dietilamino-2-hidroxi-propil)-5-formil-2-metil-4-fenil-1H-pirrol-3-carboxamida.
Se prepare una solución a 0,36 M de cada oxindole
en DMSO, así como una solución a 0,576 M de cada aldehído. Se mezcla
300 \mul del oxindol adecuado con 300 \mul del aldehído adecuado
en presencia de 200 \mul de DMSO. Luego se añadió 40 mg de la
resina limpiadora dietilentriamina. La mezcla se colocó en un Block
de Robbins y se selló y block. Luego se puso en un horno a 60ºC
donde se agitó durante 18 horas.
Tras las 18 horas, el Block de Robbins se sacó
del horno. El sellado superior del block se eliminó y se añadió 800
\mul de DMSOa la mezcla. Luego el block se volvió a sellar y se
colocó de nuevo en el horno a 60ºC donde rotó continuamente durante
1 hora.
Después de completarse esa hora, el Block de
Robbins se sacó del horno y se dejó que se enfriara. El sello
inferior del Block de Robbins se extrajo cuidadosamente y el block
entero se ajustó al dispositivo de filtración, que permite filtrar
los compuestos recién sintetizados a parte de la resina.
Se agitó 4,083 g de
1-hidroxi-7-azabenztriazol
(30 mmol) y 0,53 ml de diisopropilamina (3 mmol) y 4,70 ml de
epiclorhidrina en cloroformo anhidro a 60°C durante 2 horas. La
mezcla de reacción se vertió en una columna de sílice y se eluyó con
una mezcla de cloroformo-metanol 100:3. El
intermedio hidroxi-cloro obtenido (4,83 g, aceite de
color Amarillo pálido, 70%Y) se disolvió en amoniaco metanólico (100
ml, se saturó con gas amoniaco, se añadió 8,3 g de carbonato de
potasio y la mezcla se agitó en un frasco cerrado durante 2 días y
medio. La mezcla de reacción se filtró, y los filtrados se
evaporaron. El residuo se purificó en una columna de sílice en una
mezcla de
amoniacocloroformo-metanol-conc.
amoniaco 80:15:1,5 Y = 2,793 g de un sólido cristalino blanco (63%
th. del cloruro)
Se agitó 12,162 g de hidroxiazabenztriazol (90
mmol), 1,59 ml de diisopropiletilamina (9 mmol) y 14,1 ml de
epiclorhidrina (180 ml) en cloroformo anhidro a 55ºC durante 2
horas. La mezcla de reacción se evaporó, el residuo se secó al
vacío, y luego se purificó en una columna de sílice en una mezcla de
cloroformo-metanol 100:5. Las primeras fracciones
dieron
3-[1H-(benzotriazolil)-oxi]-2-hidroxi-1-cloropropano
10,570 g (color Amarillo miel pálido; 51,5%Y), seguido por la
fracción de
3-[1H-(benzotriazolil-3-N-óxido)]-2-hidroxi-1-cloropropano
9,990 g (sólido blanco cristalino, 48,5% Y)
Se preparó por aminolisis de
3-[1H-(benzotriazolil-3-N-óxido)]-2-hidroxi-1-cloropropano
en análogos a la síntesis de
3-[1H-(7-azabenzotriazolil)-oxi]-2-hidroxi-1-aminopropano
Se añadió 105 mg de
3-[1H-(7-azabenzotriazolil)-oxi]-2-hidroxi-aminopropano
a la suspensión de 105 mg (0,25 mmol) de
5-[(Z)-(5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilato
de
1-oxi-7-azabenzotriazol
[preparado por activación de la
(3Z)-3-({3,3-dimetil-4-carboxi-1H-pirrol-2-il}metilen)-5-fluoro-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona
(480 mg; 1,6 mmol) 0,525 ml) en DMF (5 ml) y se aisló en forma pura
por precipitación con cloroformo (5 ml). Se secó al vacío para dar
un rendimiento del 92% (579 mg)] en dimetilacetamida anhidra (1,5
ml). La mezcla se agitó durante 30 minutos y se evaporó al vacío. El
residuo se suspendió en una mezcla de
metanol-dietilamina 20:1 (3 ml), y se dejó
cristalizar en el refrigerador (5ºC) durante 1 hora. Se filtró y se
lavó el precipitado con metanol muy frío y se secó al vacío. Y = 121
mg de un sólido cristalino de color naranja.
Se añadió 105 mg de
3-[1H-(7-azabenzotriazolil)-oxi]-2-hidroxi-1-aminopropano
a la suspensión de 109 mg (0,25 mmol) de
5-[(Z)-(5-cloro-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilato
de
1-oxi-7-azabenzotriazol
[preparado por activación de la
(3Z)-3-({3,3-dimetil-4-carboxi-1H-pirrol-2-il}metilen)-5-cloro-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona
(1,520 mg; 4,8 mmol) con del reactivo HATU (1,168 g; 4,65 mmol), en
presencia de la base de Hunig (9,0 mmol; 1,58 ml) en DMF (20 ml) y
se aisló en forma pura por precipitación con cloroformo (20 ml). Se
secó al vacío para dar un rendimiento del 94% (1,907 g)] en
dimetilacetamida anhidra (1,5 ml). La mezcla se agitó durante 30
minutos y se evaporó al vacío. El residuo se suspendió en una mezcla
de metanol-dietilamina 20:1 (3 ml), y se dejó
cristalizar en el refrigerador (5ºC) durante 1 hora. Se filtró y se
lavó el precipitado con metanol muy frío y se secó al vacío. Y = 130
mg de un sólido cristalino de color naranja.
Se añadió 105 mg de
3-[1H-(7-azabenzotriazolil)-oxi]-2-hidroxi-1-aminopropano
a la suspensión de 121,5 mg (0,25 mmol) de
5-[(Z)-(5-trifluorometoxi-2-oxo-1,2-dihidro-3H-indol-3-iliden)metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxilato
de
1-oxi-7-azabenzotriazol
[preparado por activación de la
(3Z)-3({3,3-dimetil-4-carboxi-1H-pirrol-2-il}meti-
len)-5-trifluorometoxi-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (1,768 g; 4,8 mmol) con reactivo HATU (1,7588; 4,8 mmol) en presencia de la base de Hunig (9,0 mmol; 1,58 ml) en DMF (25 ml) y se aisló en forma pura por precipitación con acetonitrilo anhidro. Se secó al vacío para dar un rendimiento del 85,5% (1,929 g)] en dimetilacetamida anhidra (1,5 ml). La mezcla se agitó durante 30 minutos y se evaporó al vacío. El residuo se suspendió en una mezcla de metanol-dietilamina 20:1 (3 ml), y se dejó cristalizar en el refrigerador (5ºC) durante 1 hora. Se filtró y se lavó el precipitado con metanol muy frío y se secó al vacío. Y = 142 mg de un sólido cristalino de color naranja.
len)-5-trifluorometoxi-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (1,768 g; 4,8 mmol) con reactivo HATU (1,7588; 4,8 mmol) en presencia de la base de Hunig (9,0 mmol; 1,58 ml) en DMF (25 ml) y se aisló en forma pura por precipitación con acetonitrilo anhidro. Se secó al vacío para dar un rendimiento del 85,5% (1,929 g)] en dimetilacetamida anhidra (1,5 ml). La mezcla se agitó durante 30 minutos y se evaporó al vacío. El residuo se suspendió en una mezcla de metanol-dietilamina 20:1 (3 ml), y se dejó cristalizar en el refrigerador (5ºC) durante 1 hora. Se filtró y se lavó el precipitado con metanol muy frío y se secó al vacío. Y = 142 mg de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 32 a partir de 105 mg de la amina correspondiente. Y = 120
mg de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 13 a partir de 105 mg de la amina correspondiente. Y = 127
mg de un sólido cristalino de color naranja.
Se preparó de acuerdo con el procedimiento del
Ejemplo 34 a partir de 105 mg de la amina correspondiente. Y = 141
mg de un sólido cristalino de color naranja.
Los siguientes ejemplos se usan para encontrar
aquellos compuestos que demuestren el grado óptimo de actividad
deseada.
Los siguientes ensayos pueden usarse para
determinar el nivel de actividad y efecto de los diferentes
compuestos de la presente invención en una o más de las PK. Se puede
diseñar ensayos similares a lo largo de las líneas para cualquier PK
usando técnicas conocidas en la materia.
Muchos de los ensayos descritos aquí se realizan
en un formato ELISA (ensayo sandwich inmunosorbente ligado a
enzimas) (Voller, et al., 1980,
"Enzime-Linked Immunosorbent Assay", Manual
of Clinical Immunology, 2ª ed., Rose y Friedman, Am. Soc. of
Microbiology, Washington, D.C., pp. 359-371). El
procedimiento general es el siguiente: se introduce un compuesto
general en células que expresan la quinasa de la prueba, ya sea de
forma natural o recombinante, durante un periodo de tiempo
seleccionado. Tras este tiempo, si la quinasa de la prueba es un
receptor, se añade el ligando que se sabe que activa el receptor.
Las células se lisan y el lisado se transfiere a los pocillos de una
placa ELISA previamente cubierta con un anticuerpo específico que
reconoce el sustrato de la reacción de fosforilación encimática. Los
componentes que no pertenecen al sustrato del lisado celular se
lavan y la cantidad de fosforilación del sustrato se detecta con un
anticuerpo que reconoce específicamente la fosfotirosina en
comparación con células de control que no estaban en contacto con un
compuesto de prueba.
Los protocolos preferidos presentes para llevar a
cabo los experimentos ELISA para PK específicas se proporciona a
continuación. Sin embargo, la adaptación de estos protocolos para la
determinación de la actividad de compuestos contra otras RTK, así
como para CTK Y STK, está dentro del ámbito de conocimiento de
aquéllos expertos en la materia. Otros ensayos descritos aquí miden
la cantidad de DNA producido en respuesta a la activación de la
quinasa de la prueba, que es una forma de medida general de una
respuesta proliferativa. El procedimiento general para este ensayo
es el siguiente: se introduce un compuesto en células que expresan
la quinasa de la prueba, ya sea de forma natural o recombinante,
durante un periodo de tiempo seleccionado, tras el cual, si la
quinasa de la prueba es un receptor, se añade un ligando que se sabe
que activa el receptor. Tras incubar por lo menos durante una noche,
se añade un reactivo que etiquete DNA como la
5-bromodeoxiuridina (BrdU) o
H^{3}-timidina. La cantidad de DNA etiquetado se
detecta o bien con un anticuerpo anti-BrdU o mdiendo
la radiactividad y se compara con las células de control que no
están en contacto con el compuesto de la prueba.
Este ensayo analiza la actividad tirosin quinasa
de GST-Flk-1 en péptidos
poli(glu,tyr).
1. Placas de ELISA de Corning de 96 pocillos
(Catálogo Corning nº 5805-96).
2. Poli(glu,tyr) 4:1, liofilizado
(Catálogo Sigma nº P0275).
3. Preparación de placas de ensayo recubiertas de
poli(glu,tyr) (pEY): Cubrir 2 \mug/pocillo de
poli(glu,tyr) (pEY) en 100 \mul de PBS, mantener a ta
durante 2 horas o a 4ºC durante la noche. Cubrir las placas para
evitar que se evapore.
4. Tampón PBS: para 1l, mezclar 0,2 g de
KH_{2}PO_{4}, 1,15 g Na_{2}HPO_{4}, 0,2 g de KCl y 8 g de
NaCl en aprox. 900 ml de dH_{2}O. Cuando todos los reactivos se
hayan disuelto, ajustar el pH a 7,2 con HCl. Llevar a un volumen
total de 1 litro con H_{2}Od.
5. Tampón PBST: para 1 litro de tampón PBS, hay
que añadir 1,0 ml de Tween-20.
6. Tampón bloqueante de TBB: para 1 litro,
mezclar 1,21 g de TRIS, 8,77 g de NaCl, 1 ml de
TWEEN-20 en aproximadamente 900 ml de dH_{2}O.
Ajustar el pH a 7,2 con HCl. Añadir 10 g de BSA, y agitar para
disolver. Llevar a un volumen total de 1 litro con de dH_{2}O.
Filtrar para eliminar la materia en forma de partículas.
7. BSA 1% en PBS: Para hacer 1x de solución de
trabajo, añadir 10 g de BSA a aproximadamente 990 ml de tampón PBS,
y agitar para disolver. Ajustar a volumen total de 1 litro con
tampón PBS, y filtrar para eliminar la materia en forma de
partículas.
8. Hepes 50 mM pH 7,5.
9. GST-Flklcd purificado a partir
de transformación de baculovirus recombinante sf9 (SUGEN, Inc.).
10. DMSO 4% en H_{2}Od.
11. ATP 10 mM en H_{2}Od.
12. MnCl_{2} 40 mM
13. Tampón de dilución quinasa (KDB): mezclar 10
ml de Hepes (pH 7,5), 1 ml de NaCl 5 M, 40 \mul de ortovanadato
de sodio 100 mM y 0,4 ml de BSA 5% en H_{2}Od con 88,56 ml de
H_{2}Od.
14. Placas de propileno NUNC de 96 pocillos y
fondo en forma de V, Catálogo Applied Scientific nº
AS-72092
15. EDTA: mezclar 14,12 g de ácido
etilendiamintetraacético (EDTA) con aprox. 70 ml de dH_{2}O.
Añadir NaOH 10N hasta que el EDTA se disuelva. Ajustar el pH a 8,0.
Ajustar el volumen total a 100 ml con H_{2}Od.
16. Tampón de dilución de anticuerpos 1^{0}:
mezclar 10 ml de BSA 5% en tampón PBS con 89,5 ml de TBST.
17. Conjugado de anticuerpo monoclonal
anti-fosfotirosina a peroxidasa de rábano picante
(PY99 HRP; Santa Cruz Biotech).
18. Ácido
2,2'-Azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sulfónico
(ABTS, Moss, Cat. nº ABTS).
19. SDS 10%.
1. Cubrir las placas ELISA de 96 pocillos de
Corning con 2 \mug de péptido poliEY en PBS estéril como se ha
descrito en el paso 3 de Materiales y reactivos.
2. Eliminar el líquido no ligado de las placas
invirtiéndolas. Lavar una vez con TBST. Golpear suavemente la placa
sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.
3. Añadir 100 \mul de BSA 1% en PBS a cada
pocillo. Incubar con agitación, durante 1 hora a temperatura
ambiente.
4. Repetir el paso 2.
5. Mojar los pocillos con HEPES 50Mm (pH7,5) (150
\mul/pocillo).
6. Diluir el compuesto de prueba con
dH_{2}O/DMSO 4% hasta 4 veces la concentración final del ensayo
deseada en las placas de poliprolieno de 96 pocillos.
7. Añadir 25 \mul del compuesto de prueba
diluido a la placa ELISA. En los pocillos de control, colocar 25
\mul de dH_{2}O/DMSO 4%.
8. Añadir 25 \mul de MnCl_{2} 40 mM con ATP
4x (2 \muM) a cada pocillo.
9. Añadir 25 \mul de EDTA 0,5 M a los pocillos
de control negativo.
10. Diluir GST-Flk1 a 0,005
\mug (5 ng)/pocillo con KDB.
11. Añadir 50 \mul del enzima diluido a cada
pocillo.
12. Incubar, con agitación, durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
13. Parar la reacción añadiendo 50 \mul de EDTA
250 mM (pH 8,0).
14. Lavar 3 veces con TBST y golpear suavemente
la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de
líquido.
15. Añadir 100 \mul por pocillo de conjugado
HRP anti-fosfotirosina, a dilución 1:5.000 con
tampón de dilución de anticuerpo. Incubar, con agitación, durante 90
min. a temperatura ambiente.
16. Lavar como en el paso 14.
17. Añadir 100 \mul de ABTS a temperatura
ambiente en cada pocillo.
18. Incubar, con agitación, durante
10-15 minutos. Eliminar cualquier burbuja.
19. Parar la reacción añadiendo 20 \mul de SDS
10% a cada pocillo.
20. Leer los resultados en un elector ELISA
Dynatech MR7000 con un filtro de prueba a 410 nM y un filtro de
referencia a 630 nM.
Este ensayo se utilizó para medir la actividad
quinasa in vitro de pyk2 de longitud total marcado con
epítopos HA (FL.pyk2-HA) en un ensayo ELISA.
1. Placas ELISA de Corning de 96 pocillos.
2. Anticuerpos anti HA monoclonales 12CA5 (SUGEN,
Inc.)
3. PBS (Solución salina tamponada con fosfato de
Dulbecco (Catálogo Gibco nº 450-1300EB)
4. Tampón TBST: para 1 litro, mezclar 8,766 g de
NaCl, 6,057 g de TRIS y 1 ml de 0,1 Triton X-100 en
aprox. 900 ml de dH_{2}O. Ajustar el pH a 7,2 llevando el volumen
a 1 litro.
5. Tampón de bloqueo: para 1 litro, mezclar 100 g
de BSA 10%, 12,1 g de TRIS 100 mM, 58,44 g NaCl 1 M y 10 ml de
TWEEN-20 1%.
6. Lisados FL.pyk2-HA a partir de
lisados celulares sf9 (SUGEN, Inc.).
7. DMSO 4% en H_{2}O MilliQue.
8. ATP 10 mM en dH_{2}O.
9. MnCl_{2} 1 M.
10. MgCl_{2} 1 M.
11. Ditiotreitol (DTT) 1 M.
12. Fosforilación de tampón quinasa 10X: mezclar
5,0 ml de Hepes 1 M (pH 7,5), 0,2 ml MnCl_{2} 1 M, 1,0 ml
MgCl_{2} 1 M, 1,0 ml de Triton X-100 a 10% en 2,8
ml de dH_{2}O. Justo antes de usar, añadir 0,1 ml de DTT 1 M.
13. Placas de poliprolieno en fondo de V de 96
pocillos NUNC.
14. EDTA 500 mM en dH_{2}O
15. Tampón de dilución de anticuerpo: para 100
ml, 1 ml de BSA/PBS 5% y 1 ml de Tween-20 10% en 88
ml de TBS.
16. Anti-Ptyr PY99 conjugado a
HRP, Santa Cruz Biotech Cat. nº SC-7020.
17. ABTS, Moss, Cat. nº
ABTS-2000.
18. SDS 10%.
1. Cubrir las placas ELISA de 96 pocillos de
Corning con 0,5 \mug por pocillo de anticuerpo
anti-HA 12CA5 en 100 \mul de PBS. Guardar durante
la noche a 4ºC.
2. Eliminar el anticuerpo HA no ligado de los
pocillos invirtiendo la placa. Lavar la placa con dH_{2}O. Golpear
suavemente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el
exceso de líquido.
3. Añadir 150 \mul de tampón de bloqueo a cada
pocillo. Incubar con agitación, durante 30 min. a temperatura
ambiente.
4. Lavar la placa 4x con
TBS-T
5. Diluir el lisado en PBS (1,5 \mug de
lisado/100 \mul PBS).
6. Añadir 100 \mul de lisado diluido a cada
pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 1 hora.
7. Lavar como en el paso 4.
8. Añadir 30 \mul de tampón quinasa 2X a la
placa de ELISA que contiene pyk2-HA capturado.
9. Añadir 25 \mul de compuesto de prueba 400
\muM en DMSO 4% a cada pocillo. Para los pocillos de control usar
sólo DMSO 4%.
10. Añadir 25 \mul de EDTA 0,5 M a los pocillos
de control negativo.
11. Añadir 25 \mul de ATP 20 \muM a todos los
pocillos. Incubar con agitación durante 10 minutos.
12. Parar la reacción añadiendo 25 \mul de EDTA
500 mM (pH 8,0) a todos los pocillos.
13. Lavar como en el paso 4.
14. Añadir 100 \mul de
anti-Ptyr conjugado a HRP diluido a 1:6000 en tampón
de dilución de anticuerpo en cada pocillo. Incubar, con agitación,
durante 1 hora a temperatura ambiente.
15. Lavar la placa tres veces con TBST y una vez
con PBS.
16. Añadir 100 \mul de solución ABTS a cada
pocillo
17. En caso necesario, parar la reacción de
desarrollo añadiendo 20 ml de SDS 10% a cada pocillo.
18. Leer la placa en un lector ELISA con un
filtro de prueba a 410 nM y el filtro de referencia a 630 nM.
Este ensayo se usó para medir la actividad
quinasa in vitro de FgF1-R en un ensayo
ELISA.
1. Placas ELISA de 96 pocillos Costar (Catálogo
Corning nº 3369).
2. Poli(Glu-Tyr) (Catálogo
Sigma nº P0275).
3. PBS (Catálogo Gibco nº
450-1300E3)
4. Solución de tampón Hepes 50 mM.
5. Tampón de bloqueo (5% BSA/PBS).
6. GST-FGFR1 purificado (SUDEN,
Inc.)
7. Tampón de dilución quinasa. Mezclar 500
\mul de Hepes 1 M (GIBCO), 20 \mul de BSA/PBS 5%, 10 \mul de
ortovanadato de sodio 100 mM y 50 \mul de NaCl 5 M.
8. ATP 10 mM
9. Mezcla de fosforilación ATP/MnCl_{2}:
mezclar 20 \mul de ATP, 400 \mul MnC1_{2} 1 M y 9,56 ml de
dH_{2}O.
10. Placas de polipropileno con fondo en forma de
V de 96 pocillos NUNC (Catálogo de Applied Scientific nº
AS-72092).
11. EDTA 0,5 M.
12. TBST 0,05%.
Añadir 500 \mul de TWEEN hasta 1 litro de
TBS.
13. Suero anti-fosfotirosina
policlonal de conejo (SUDEN, Inc.).
14. Conjugado peroxidasa de IgG
anti-conejo de cabra (Biosource, Catálogo nº
ALI0404).
15. Solución ABTS.
16. Solución de ABTS/H_{2}O_{2}.
1. Cubrir las placas ELISA de 96 pocillos Costar
con 1 \mug por pocillo de Poli(Glu,Tyr) en 100 \mul de
PBS. Guardar durante la noche a 4ºC.
2. Lavar las placas cubiertas una vez con
PBS.
3. Añadir 150 \mul de tampón de bloqueo BSA/PBS
5% a cada pocillo. Incubar, con agitación, durante 1 hora a
temperatura ambiente.
4. Lavar la placa 2x con PBS, luego una vez con
Hepes 50 mM. Golpear suavemente las placas sobre una toalla de papel
para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.
5. Añadir 25 \mul de compuesto de la prueba 0,4
mM en DMSO 4% o DMSO 4% sólo (controles) a la placa.
6. Diluir el GST-FGFR1 purificado
en tampón de dilución de quinasa (5 ng quinasa/50 \mul de
KDB/pocillo).
7. Añadir 50 \mul de quinasa diluida a cada
pocillo.
8. Iniciar la reacción de quinasa añadiendo 25
\mul/pocillo de ATP/Mn++ recién preparado (0,4 ml MnC12 1 M, 40
\mul de ATP 10 mM, 956 ml de dH_{2}O), recién preparado).
9. Esta es una reacción de quinasa rápida y debe
pararse con 25 \mul de EDTA 0,5 M de forma similar a la adición de
ATP.
10. Lavar la placa cuatro veces con TBST
fresco.
11. Fabricar un tampón de dilución de
anticuerpos: Para 50 ml: mezclar 5 ml de BSA 5%, 250 \mul de leche
5% y 50 \mul de vanadato de sodio 100 mM, llevar a volumen final
con TBST 0,05%.
12. Añadir 100 \mul por pocillo de
anti-fosfotirosina (dilución 1:10000 en ADB).
Incubar con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente.
13. Lavar como en el paso 10.
14. Añadir 100 \mul por pocillo de conjugado de
peroxidasa IgG anti-conejo de cabra Biosource
(dilución en ADB 1:6000). Incubar con agitación durante 1 hora a
temperatura ambiente.
15. Lavar como en el paso 10 y luego con PBS para
eliminar las burbujas y el exceso de TWEEN.
16. Añadir 100 \mul de solución de
ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
17. Incubar con agitación durante
10-20 minutos. Eliminar cualquier burbuja.
18. Leer el ensayo con el lector ELISA MR7000
Dynatech: filtro de prueba a 410 nM, filtro de referencia a 630
mM.
Este ensayo se usa en el ensayo de la actividad
quinasa in Vitro de FGF1-R en un ensayo
ELISA.
1. Placas ELISA de 96 pocillos de Corning.
2. Anticuerpo anti-EGFR
monoclonal SUMO1 (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. Tampón de la prueba.
5. Tampón de bloqueo: para 100 ml, mezclar 5,0 g
de leche en polvo Carnation Instantánea desnatada® con 100 ml de
PBS.
6. Lisado celular A431 (SUGEN, Inc.).
7. Tampón TBS.
8. TBS + DMSO 10%: Para 1 litro, mezclar 1,514 g
de TRIS, 2,192 g de NaCl y 25 ml de DMSO. Llevar a un volumen total
de 1 litro con dH_{2}O.
9. ATP
(Adenosine-5'-trifosfato, de músculo
equino, Cat. Sigma nº A-5394), solución 1,0 mM en
dH_{2}O. Este reactivo debería prepararse justo antes de usar y
guardarse en hielo.
10. MnCl_{2} 1,0 mM.
11. Mezcla de fosforilación ATP/MnCl_{2}: para
hacer 10 ml, mezclar 300 \mul de ATP 1 mM, 500 \mul de
MnCl_{2} y 9,2 ml de dH_{2}O. Preparar justo antes de usar,
guardar en hielo.
12. Placas de polipropileno con fondo en forma de
V de 96 pocillos NUNc.
13. EDTA.
14. Suero anti-fosfotirosina
policlonal de conejo (SUGEN, Inc.).
15. Conjugado de peroxidasa IgG
anti-conejo de cabra (Cat. Biosource nº
ALI0404).
16. ABTS.
17. Peróxido de hidrógeno al 30%.
18. ABTS/H_{2}O_{2}
19. HCl 0,2 M.
1. Cubrir las placas ELISA de 96 pocillos Corning
con 0,5 \mug de SUMO1 en 100 \mul de PBS por pocillo. Guardar
durante la noche a 4ºC.
2. Eliminar el SUMO1 no ligado de los pocillos
invirtiendo la placa para eliminar el líquido. Lavar una vez con
dH_{2}O. Golpear suavemente la placa sobre una toalla de papel
para eliminar el exceso de líquido.
3. Añadir 150 \mul de tampón de bloqueo a cada
pocillo. Incubar, con agitación, durante 30 minutos a temperatura
ambiente.
4. Lavar la placa 3x con agua desionizada, luego
una vez con TBST. Golpear suavemente la placa sobre una toalla de
papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.
5. Diluir el lisado en PBS (7 \mug de
lisado/100 \mul de PBS).
6. Añadir 100 \mul de lisado diluido a cada
pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 1 hora.
7. Lavar las placas como en el punto 4
anterior.
8. Añadir 120 \mul de TBS al a placa ELISA que
contiene EGFR capturado.
9. Diluir el compuesto de la prueba en TBS 1:10,
colocar en el pocillo.
10. Añadir 13,5 \mul de compuesto del test a la
placa ELISA. A los pocillos de control, añadir 13,5 \mul de TBS en
DMSO 10%.
11. Incubar, con agitación, durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
12. Añadir 15 \mul de mezcla de fosforilación a
todos los pocillos excepto los controles negativos. El volumen final
del pocillo debería ser de aproximadamente 150 \mul con una
concentración final de ATP 3 \muM /MnCl_{2} 5 mM en cada
pocillo. Incubar con agitación durante 5 minutos.
13. Parar la reacción añadiendo 16,5 \mul de
solución EDTA mientras se agita. Agitar durante 1 minuto
adicional.
14. Lavar cuatro veces con agua desionizada, y
dos veces con TBST.
15. Añadir 100 \mul de
anti-fosfotirosina (dilución de 1:3000 de TBST) por
pocillo. Incubar, con agitación, durante 30-45
minutos a temperatura ambiente.
16. Lavar como en el punto 4 anterior.
17. Añadir 100 \mul de conjugado de peroxidasa
IgG anti-conejo de cabra Biosource (dilución 1:2000
en TBST) a cada pocillo. Incubar con agitación durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
18. Lavar como en el paso 4 anterior.
19. Añadir 100 \mul de solución
ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
20. Incubar de 5 a 10 minutos con agitación.
Eliminar cualquier burbuja.
21. En caso necesario, parar la reacción
añadiendo 100 \mul de HCl 0,2 M por pocillo.
22. Leer el ensayo en el lector ELISA MR7000
Dynatech: filtro de prueba a 410 mM, filtro de referencia a 630
nM.
Este ensayo se usa para la actividad quinasa
in vitro de FGF1-R en un ensayo ELISA.
1. Placas Elisa de 96 pocillos Corning
2. Anticuerpo anti-PDGFR
monoclonal 28D4C10 (SUGEN, Inc.).
3. PBS.
4. Tampón TBST.
5. Tampón de bloqueo (el mismo que el del
bioensayo EGFR).
6. Lisado Celular NIH 3T3 que expresa
PDGFR-\beta (SUGEN, Inc.).
7. Tampón TBS.
8. TBS + DMSO 10%.
9. ATP.
10. MnCl_{2}.
11. Mezcla de fosforilación de tampón quinasa:
para 10 ml, mezclar 250 \mul de TRIS 1 M, 200 \mul de NaCl 5 M,
100 \mul de MnCl_{2}, y 50 \mul de Triton
X-100 100 mM en suficiente dH_{2}2º como para
hacer 10 ml.
12. Placas de polipropileno con fondo en forma de
V de 96 pocillos NUNC. 13. EDTA.
14. Suero anti-fosfotirosina
policlonal de conejo (SUGEN, Inc.).
15. Conjugado de peroxidasa IgG
anti-conejo de cabra (Cat Biosource nº ALI0404).
16. ABTS.
17. Peróxido de hidrógeno, solución al 30%. 18.
ABTS/H_{2}O_{2}.
19. HCl 0,2 M.
1. Cubrir las placas ELISA de 96 pocillos Corning
con 0,5 \mug de 28D4C10 en 100 \mul de PBS por pocillo. Guardar
durante la noche a 4ºC.
2. Eliminar el 28D4C10 no ligado de los pocillos
invirtiendo las placas para eliminar el líquido. Lavar una vez con
dH_{2}O. Golpear suavemente la placa sobre una toalla de papel
para eliminar el exceso de líquido.
3. Añadir 150 \mul de tampón de bloqueo a cada
pocillo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con
agitación.
4. Lavar la placa tres veces con agua
desionizada, luego una vez con TBST. Golpear suavemente la placa
sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las
burbujas.
5. Diluir el lisado en HNTG (10 \mug de
lisado/10 \mul de HNTG).
6. Añadir 100 \mul de lisado diluido a cada
pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 60 minutos.
7. Lavar las placas como se ha descrito en el
paso 4.
8. Añadir 80 \mul de mezcla de tampón quinasa
de trabajo a la placa ELISA que contiene PDGFR capturado.
9. Diluir el compuesto de prueba 1:10 en TBS en
las placas de polipropileno de 96 pocillos.
10. Añadir 10 \mul del compuesto de prueba
diluido a la placa ELISA. A los pocillos de control, añadir 10
\mul de TBS + DMSO 10%. Incubar con agitación durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
11. Añadir 10 \mul de ATP directamente a todos
los pocillos excepto los de control negativo (el volumen final de
los pocillos debería ser de aproximadamente 100 \mul con ATP 20
\muM en cada pocillo). Incubar con agitación durante 30
minutos.
12. Parar la reacción añadiendo 10 \mul de
solución EDTA a cada pocillo.
13. Lavar 4x con agua desionizada y dos veces con
TBST.
14. Añadir 100 \mul de
anti-fosfotirosina (en dilución 1:3000 en TBST) por
pocillo. Incubar con agitación durante 30-45 minutos
a temperatura ambiente.
15. Lavar como en el paso 4.
16. Añadir 100 \mul de conjugado de peroxidasa
IgG anti-conejo de cabra Biosource (dilución 1:2000
en TBST) a cada pocillo. Incubar con agitación durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
17. Lavar como en el paso 4.
18. Añadir 100 \mul de solución de
ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
19. Incubar entre 10 y 30 minutos con agitación.
Eliminar cualquier burbuja.
20. En caso necesario, parar la reacción
añadiendo 100 \mul de HCl 0,2 M por pocillo.
21. Leer el ensayo en un lector ELISA MR7000
Dynatech con el filtro de prueba a 410 nM y el filtro de referencia
a 630 nM.
Este ensayo se usó para medir la actividad
quinasa HER-2 en células completas en un formato
ELISA.
1. DMEM (Catálogo GIBCO nº
11965-092).
2. Suero bovino fetal (FBS, Catálogo GIBCO nº
16000-044), activado por calor en un baño de agua
durante 30 minutos a 56ºC.
3. Tripsina (Catálogo GIBCO nº
25200-056).
4. L-Glutamine (GIBCO Catálogo
nº25030-081)
5. HEPES (GIBCO Catálogo
nº15630-080).
6. Medio de crecimiento
Mezclar 500 ml de DMEM, 55 ml de FBS activado por
calor, 10 ml de HEPES y 5,5 ml de L-glutamina.
7. Medio libre de suero
Mezclar 500 ml de DMEM, 2,5 ml de FBS inactivado
por calor, 10 ml de HEPES y 5,5 ml de
L-glutamina.
8. PBS.
9. Placas microtituladas de cultivo de tejidos de
96 pocillos de fondo plano (Catálogo Corning nº 25860).
10. Placas de cultivo de tejidos de 15cm
(Catálogo Corning nº08757148).
11. Placas ELISA de 96 pocillos Corning.
12. Placas de polipropileno con fondo en forma de
V de 96 pocillos NUNC.
13. Cartuchos de transferencia Costar para el
Transtar 96 (Catálogo Costar nº 7610).
14. SUMO 1: Anticuerpo anti-EGFR
monoclonal (SUGEN, Inc.).
15. Tampón TBST.
16. Tampón de bloqueo: leche instantánea
Carnation® EN pbs.
17. Ligando EGF: EGF-201, Shinko
American, Japón.
Suspender el polvo en 100 \mul de HCl 10 mM.
Añadir 100 \mul de NaOH 10 mM. Añadir 800 \mul de PBS y
transferir a un tubo Eppendorf. Guardar a -20ºC hasta el momento de
usarlo.
18. Tampón de lisado HNTG
Para una solución stock de HNTG 5X, mezclar 23,83
g de Hepes, 43,83 g de NaCl, 500 ml de glicerol y 100 ml de Triton
X-100, y suficiente dH_{2}O para hacer 1 litro de
solución total.
Para HNTG* 1X, mezclar 2 ml de HNTG, 100 \mul
de Na_{3}VO_{4} 0,1 M, 250 \mul de Na_{4}P_{2}O_{7} 0,2
M y 100 \mul de EDTA.
19. EDTA.
20. Na_{3}VO_{4}. Para hacer una solución
stock, mezclar 1,84 g de Na_{3}VO_{4} con 90 ml de dH_{2}O.
Ajustar el pH a 10. Hervir en microondas durante un minuto (la
solución se vuelve transparente). Enfriar a temperatura ambiente.
Ajustar el pH a 10. Repetir el ciclo de calentar/enfriar hasta que
el pH se mantiene en 10.
21. Na_{4}P_{2}O_{7} 200 mM.
22. Antisuero policlonal de conejo específico
para fosfotirosina (anticuerpo anti-Ptyr, SUGEN,
Inc.).
23. Antisuero de afinidad purificada, anticuerpo
IgG anti-conejo de cabra, conjugado de peroxidasa
(Cat Biosource nº ALI0404).
24. Solución ABTS.
25. Solución de peróxido de hidrógeno al 30%.
26. ABTS/H_{2}O_{2}.
27. HCl 0,2 M.
1. Cubrir las placas ELISA de 96 pocillos de
Corning con SUMO1 a 1,0 \mug por pocillo en PBS, siendo el volumen
final 100 \mul/pocillo. Guardar durante la noche a 4ºC.
2. En el día de uso, eliminar el tampón de
cubierta y lavar la placa 3 veces con dH_{2}O y una vez con tampón
TBST. Todas las veces que se lava en este ensayo se deben realizar
de esta manera, a menos que se especifique lo contrario.
3. Añadir 100 \mul de tampón de bloqueo a cada
pocillo. Incubar la placa, con agitación, durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
4. Utilizar la línea celular
EGFr/HER-2 chimera/3T3-C7 para este
ensayo.
5. Escoger las placas con una confluencia del
80-90%. Recoger células por tripsinización y
centrifugar a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos.
6. Resuspender las células en medio libre de
suero y contar con azul de tripano. Es necesaria una viabilidad por
encima del 90%. Las células sembradas en medio libre de suero a una
densidad de 2.500 células por pocillo, 90 \mul por pocillo, en una
placa de microtiter de 96 pocillos. Incubar las células sembradas
durante la noche a 37ºC bajo CO_{2} 5%.
7. Iniciar el ensayo dos días después del
sembrado.
8. Los compuestos de la prueba se disuelven en
DMSO al 4%. Las muestras son luego diluidas directamente en placas
libres de medio-DMEM. Típicamente, esta dilución
será de 1:10 o mayor. Todos los pocillos son luego transferidos a la
placa celular a una dilución de 1:10 (10 \mul de muestra y medio
en 10 \mul de medio libre de suero. La concentración final de DMSO
debería ser de 1% o menor. También puede usarse una dilución en
serie estándar.
9. Incubar bajo CO_{2} al 5% a 37ºC durante 2
horas.
10. Preparar el ligando EGF por dilución de la
solución stock de EGF (16,5 \muM) en DMEM templado a 150 nM.
11. Preparar HNTG* fresco suficiente para 100
\mul por pocillo. Colocar sobre hielo.
12. Tras 2 horas de incubación con el compuesto
de prueba, añadir el ligando EGF preparado a las células, 50 \mul
por pocillo, para una concentración final de 50 nM. Los pocillos de
control positivo reciben la misma cantidad de EGF. Los controles
negativos no reciben EGF. Se incuba a 37ºC durante 10 minutos.
13. Eliminar el compuesto de la prueba, EGF, y
DMEM. Lavas las células una vez con PBS.
14. Transferir HNTG* a las células, 100 \mul
por pocillo. Colocar sobre hielo durante 5 minutos. Mientras tanto,
eliminar el tampón de bloqueo de la placa ELISA y lavar.
15. Raspar células de la placa con una
micropipeta y homogenizar el material celular aspirando
repetidamente y dispensando el tampón de lisado HNTG*. Transferir el
lisado a una placa ELISA lavada, bloqueada y cubierta. O utilizar un
cartucho de transferencia Costar para transferir lisado a la
placa.
16. Incubar, con agitación, a temperatura
ambiente durante 1 hora.
17. Eliminar el lisado, lavar. Transferir el
anticuerpo anti-Ptyr recién diluido (1:3000 en TBST)
a la placa ELISA, 100 \mul por pocillo.
18. Incubar, con agitación, a temperatura
ambiente, durante 30 minutos.
19. Eliminar el anticuerpo
anti-Ptyr, lavar. Transferir anticuerpo BIOSOURCE
recién diluido (1:8000 en TBST) a una placa ELISA, 100 \mul por
pocillo.
20. Incubar, con agitación, a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
21. Eliminar el anticuerpo BIOSOURCE, lavar.
Transferir solución de ABTS/H_{2}O_{2} recién preparada a la
placa ELISA, 100 \mul por pocillo.
22. Incubar, con agitación, durante
5-10 minutos. Eliminar cualquier burbuja.
23. Parar la reacción con la adición de 100
\mul de HCl 0,2 M por pocillo.
24. Leer el ensayo en el lector ELISA MR7000
Dynatech con el filtro de prueba ajustado a 410 nM y el filtro de
referencia en 630 nM.
Este ensayo se usa para medir la actividad
seronina/treonina quinasa in Vitro en cdk2/ciclina A humana
en un ensayo de centelleo por proximidad (SPA).
1. Placas de tereftalato de polietileno (flexi)
de 96 pocillos de Wallac (Catálogo Wallac nº
1450-401).
2. ATP Redivue Amersham [\gamma^{33}P]
(Catálogo Amersham nº AH 9968).
3. Cuentas de SPA de poliviniltolueno de Amersham
recubiertas con estreptavidina (Catálogo Amersham nº RPNQ0007). Las
cuentas deberían reconstituirse en PBS sin magnesio ni calcio, a 20
mg/ml.
4. Complejo enzimático activado cdk2/ciclina A
purificado de células sf9 (SUGEN, Inc.).
5. Substrato péptido biotinilado (Debtide). El
péptido biotin-X-PKTPKKAKKL se
disuelve en dH_{2}O a una concentración de 5 mg/ml.
6. Mezcla de Péptido/ATP: para 10 ml, mezclar
9,979 ml de dH_{2}O, 0,00125 ml de ATP "frío", 0,010 de
Debtide y 0.010 ml de ATP \gamma^{33}P. La concentración final por
pocillo será de ATP "frío" a 0,5 \muM, 0,1 \mug de Debtide
y 0,2 \muCi de ATP \gamma^{33}P.
7. Tampón quinasa: para 10 ml, mezclar 8,85 ml de
dH_{2}O, 0,625 ml de TRIS (pH 7,4), 0,25 ml de MgCl_{2} 1 M,
0,25 ml de NP40 al 10%, y 0,025 ml de DTT 1 M, añadido fresco justo
antes de ser usado.
8. ATP 10 mM en dH_{2}O.
9. Tris 1 M, pH ajustado a 7,4 con HCl.
10. MgCl_{2} 1 M.
11. DTT 1 M.
12. PBS (Catálogo Gibco nº
14190-144).
13. EDTA 0,5 M.
14. Solución de paraad: para 10 ml, mezclar 9,25
ml de PBS, 0,005 ml de ATP 100 mM, 0,1 ml de EDTA 0,5 M, 0,1 ml de
Triton X-100 al 10% y 1,25 ml de cuentas de SPA de
10 mg/ml.
1. Preparar las soluciones de los compuestos de
la prueba a 5 veces más de la concentración final deseada en DMSO al
5%. Añadir 10 \mul a cada pocillo. Para los controles negativos,
usar solamente 10 \mul de DMSO al 5% en los pocillos.
2. Diluir 5 \mul de solución de cdk2/cilina A
con 2,1 ml 2x de tampón quinasa.
3. Añadir 20 \mul de enzima a cada pocillo.
4. Añadir 10 \mul de EDTA 0,5 M a los pocillos
de control negativo.
5. Para iniciar la reacción quinasa, añadir 10
\mul de mezcla de péptido/ATP a cada pocillo. Incubar durante 1
hora sin agitación.
6. Añadir 200 \mul de solución de parada a cada
pocillo.
7. Mantener por lo menos 10 minutos.
8. Centrifugar la placa a aproximadamente 2300
rpm durante 3-5 minutos.
9. Contar la placa usando el lector Trilux u otro
similar.
Este ensayo se usa para medir los niveles de
fosfotirosina en un sustrato poli(ácido glutámico:tirosina (4:1))
como medio para identificar los agonistas/antagonistas de la
transfosforilación met del sustrato.
1. Placas ELISA de 96 pocillos Corning, Catálogo
Corning nº 25805-96.
2. Poli(glu,tyr) 4:1, Catálogo Sigma nº P
0275.
3. PBS, Catálogo Gibco nº
450-1300EB.
4. HEPES 50 mM.
5. Tampón de bloqueo: disolver 25 g de albúmina
de suero bovino, catálogo sigma nº A-7888, en 5000
ml de PBS, filtrar a través de un filtro de 4 \mum.
6. Proteína de fusión GST purificada que contiene
el dominio Met de la quinasa, Sugen, Inc.
7. Tampón TBST.
8. DMSO 10% acuoso (MilliQue H_{2}O).
9.
Adenosin-5'-trifosfato acuoso 10 M
(dH_{2}O, catálogo Sigma nº A-5394.
10. Tampón de dilución quinasa 2X: para 100 ml,
mezclar 10 ml de HEPES 1 m A Ph 7,5 CON 0,4 ML DE bsa/pbs 5%, 0,2 ml
de ortovanadato de sodio 0,1 M y 1 ml de cloruro de sodio 5 M en
99,4 ml de dH_{2}O.
11. Mezcla de reacción ATP 4X: para 10 ml,
mezclar 0,4 ml de cloruro de manganeso 1 M y 0,02 ml de ATP 0,1 M en
9,56 ml de dH_{2}O.
12. Mezcla de controles negativos 4X: para 10 ml,
mezclar 0,4 ml de cloruro de manganeso 1 M en 9,6 ml de
dH_{2}O.
13. Placas de polipropileno de fondo en forma de
V de 96 pocillos NUNC, Catálogo de Applied Scientific nº
S-72092.
14. EDTA 500 mM.
15. Tampón de dilución de anticuerpo: para 100
ml, mezclar 10 ml de BSA/PBS 5%, 0,5 ml de leche instantánea
Carnation® 5% en PBS y 0,1 ml de ortovanadato de sodio 0,1 M en 88,4
ml de TBST.
16. Anticuerpo antifosfotirosina policlonal de
conejo, Sugen, Inc.
17. Anticuerpo conjugado de peroxidasa de rábano
picante anti conejo de cabra, Biosource, Inc.
18. Solución ABTS: para 1l, mezclar 19,21 g de
ácido cítrico, 35,46 g de Na_{2}HPO_{4} y 500 mg de ABTS con
suficiente dH_{2}O para hacer 1 litro.
19. ABTS/H_{2}O_{2}: mezclar 15 ml de
solución ABTS con 2 \mul de H_{2}O_{2} cinco minutos antes de
su uso.
20. HCl 0,2 M.
1. Cubrir la placa ELISA con 2 \mug de
Poli(Glu-Tyr) en 100 \mul de PBS. Guardar
durante la noche a 4ºC.
2. Bloquear la placa con 150 \mul de BSA/PBS 5%
durante 60 minutos.
3. Lavar la placa dos veces con PBS, una con
tampón Hepes 50 mM pH 7,4.
4. Añadir 50 \mul de la quinasa diluida a todos
los pocillos
(la quinasa purificada se diluye con tampón de
dilución de quinasa. La concentración final debería ser de 10
ng/pocillo).
5. Añadir 25 \mul del compuesto del ensayo (en
DMSO 4%) o DMSO sólo (4% en dH_{2}O) para los controles a la
placa.
6. Incubar la mezcla de quinasa/compuesto durante
15 minutos.
7. Añadir 25 \mul de MnCl_{2} 40 mM a los
pocillos de control negativo.
8. Añadir 25 \mul de mezcla de ATP/MnCl_{2} a
todos los demás pocillos (todos menos los controles negativos).
Incubar durante 5 minutos.
9. Añadir 25 \mul de EDTA 500 mM para parar la
reacción.
10. Lavar la placa 3x con TBST.
11. Añadir 100 \mul de
anti-Ptyr policlonal de conejo diluido 1:10000 en
tampón de dilución de anticuerpo a cada pocillo. Incubar, con
agitación, a temperatura ambiente durante una hora.
12. Lavar la placa 3x con TBST.
13. Diluir el anticuerpo
anti-conejo conjugado HRP Biosource 1:6000 en tampón
de dilución de anticuerpo. Añadir 100 \mul por pocillo e incubar a
temperatura ambiente, con agitación, durante una hora.
14. Lavar la placa 1x con PBS.
15. Añadir 100 \mul de solución
ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
16. En caso necesario, parar el desarrollo de la
reacción añadiendo 100 \mul de HCl 0,2 M por pocillo.
17. Leer la placa en el lector ELISA MR7000
Dynatech con el filtro de prueba a 410 nM y el filtro de referencia
a 630 nM.
Este ensayo se usa para medir el nivel de
fosfotirosina en poli(ácido glutámico:tirosina) (4:1) para la
identificación de agonistas/antagonistas de
gst-IGF-1 transfosforilación de un
sustrato.
1. Placas ELIsa de 96 pocillos Corning.
2. Poli(Glu-tyr) (4:1),
Catálogo Sigma nº P 0275.
3. PBS, catálogo Gibco nº
450-1300EB.
4. HEPES 50 mM.
5. Tampón de bloqueo TBB: para 1 litro, mezclar
100 g de BSA, 12,1 g de TRIS (pH 7,5), 58,44 g de cloruro de sodio y
10 ml de TWEEN-20 1%.
6. Proteína de fusión GST purificada que contiene
el dominio quinasa IGF-1 (Sugen, Inc.).
7. Tampón TBST: para1 litro, mezclar 6,057 g de
Tris, 8,766 g de cloruro de sodio y 0,5 ml de
TWEEN-20 con suficiente dH_{2}O para hacer 1
litro.
8. DMSO 4% en Milli-Q
H_{2}O.
9. ATP 10 mM en dH_{2}O.
10. Tampón de dilución quinasa 2x: para 100 ml,
mezclar 10 ml de HEPES 1 M (pH 7,5), 0,4 ml de BSA 5% en dH_{2}O,
0,2 ml de ortovanadato de sodio 0,1 M y 1 ml de cloruro de sodio 5 M
con suficiente dH_{2}O para hacer 100 ml.
11. Mezcla de reacción ATP 4X: para 10 ml,
mezclar 0,4 ml de MnCl_{2} 1 M y 0,008 ml de ATP 0,01 M y 9,56 ml
de dH_{2}O.
12. Mezcla de controles negativos 4X: mezclar 0,4
ml de cloruro de manganeso 1 M en 9,60 ml de dH_{2}O.
13. Placas de polipropileno de fondo en forma de
V de 96 pocillos NUNC.
14. EDTA 500 mM en dH_{2}O.
15. Tampón de dilución de anticuerpo: para 100
ml, mezclar 10 ml de BSA en PBS 5%, 0,5 ml de leche desnatada
instantánea Carnation® 5% en PBS y 0,1 ml de ortovanadato de sodio
0,1 M en 88,4 ml de TBST.
16. Anticupero antifosfotirosina policlonal de
conejo, Sugen, Inc.
17. Anticuerpo conjugado HRP
anti-conejo de cabra, Biosource.
18. Solución ABTS.
19. ABTS/H_{2}O_{2}: mezclar 15 ml de ABTS
con 2 \mul de H_{2}O_{2} 5 minutos antes de ser usada.
20. HCl 0,2 M en dH_{2}O.
1. Cubrir las placas ELISA con 1,0 \mug/pocillo
de Poli(Glu, Tyr) 4:1 (Sigma P0275) en 100 \mul de PBS.
Guardar la placa durante la noche a 4ºC.
2. Lavar la placa una vez con PBS.
3. Añadir 100 \mul de tampón bloqueador de TBB
a cada pocillo. Incubar la placa durante 1 hora con agitación a
temperatura ambiente.
4. Lavar la placa una vez con PBS, luego dos
veces con tampón Hepes 50 mM pH 7,5.
5. añadir 25 \mul de compuesto de la prueba en
DMSO 4% (obtenido diluyendo una solución stock de compuesto de la
prueba 10 mM en DMSO 100% con dH_{2}O) a la placa.
6. Añadir 10,0 ng de
gst-IGF-1 quinasa en 50 \mul de
tampón de dilución de quinasa en todos los pocillos.
7. Iniciar la reacción de quinasa añadiendo 25
\mul de mezcla de reacción ATP 4X a todos los pocillos y también a
los de control positivo. Añadir 25 \mul de mezcla de controles
negativos 4X a todos los pocillos de control negativo. Incubar
durante 10 minutos con agitación a temperatura ambiente.
8. Añadir 25 \mul de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a
todos los pocillos.
9. Lavar la placa 4x con tampón TBST.
10. Añadir anticuero
anti-fosfotirosina policlonal de conejo a una
dilución de 1:10000 en 100 \mul de tampón de dilución de
anticuerpo a todos los pocillos. Incubar, con agitación, a
temperatura ambiente durante 1 hora.
11. Lavar la placa como en el paso 9.
12. Añadir 100 \mul de HRP
anti-conejo Biosource a una dilución de 1:10000 en
tampón de dilución de anticuerpo a todos los pocillos. Incubar, con
agitación, a temperatura ambiente durante 1 hora.
13. Lavar la placa como en el paso 9. Seguir con
un lavado con PBS para reducir las burbujas y el exceso de
Tween-20.
14. Desarrollar añadiendo 100 \mul/pocillo de
ABTS/H_{2}O_{2} a cada pocillo.
15. Tras 5 minutos, leer en un lector ELISA con
el filtro de prueba a 410 nm y el filtro de referencia a 630 nm.
Los siguientes ensayos usan células diseñadas
para expresar un receptor seleccionado y luego evaluar el efecto de
un compuesto de interés sobre la actividad de la síntesis de DNA
inducida por ligando determinando la incorporación de BrdU en el
DNA.
Los siguientes materiales, reactivos y
procedimiento son generales para cada uno de los ensayos de
incorporación de BrdU siguientes. Las variaciones en los ensayos
específicos están marcadas.
1. El ligando apropiado.
2. Las células creadas apropiadas.
3. Reactivo de marcación BrdU: 10 mM, en PBS (pH
7,4) (Boehringer Mannheim, Alemania).
4. FixDenat: solución de fijación (preparada para
usar) (Boehringer Mannheim, Alemania).
5. Anti-BrdU-POD:
anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa Boehringer
Mannheim, Alemania).
6. Solución de sustrato TMB: tetrametilbencidina
(TMB, Boehringer Mannheim, Alemania)
7. Solución de lavado PBS: 1X PBS, pH 7,5.
8. Albúmina bovina (BSA), fracción V polvo (Sigma
Chemical Co., EEUU).
1. Las células se siembran a 800 células/pocillo
en CS 10%, Gln 2 mM en DMEM, en una placa de 96 pocillos. Se incuba
las células durante la noche a 37ºC en CO_{2} 5%.
2. Tras 24 horas, las células se lavan con PBS, y
luego se las deja sin suero en un medio libre de suero (CS DMEM 0%
con BSA 0,1%) durante 24 horas.
3. El día 3, se añade el ligando apropiado y el
compuesto de la prueba a las células simultáneamente. Los pocillos
de control negativo reciben DMEM libre de suero con sólo BSA 0,1%;
las células de control positivo reciben el ligando pero no el
compuesto de la prueba. Los compuestos de la prueba se preparan en
DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pocillos, y se
hace una dilución seriada para 7 concentraciones de prueba.
4. Tras 18 horas desde la activación del ligando,
el reactivo marcador de BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA 0,1%) se
añade y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10
\muM) durante 1,5 horas.
5. Después de la incubación con el reactivo de
marcación, se elimina el medio por decantación y se golpea
suavemente la placa invertida sobre una toalla de papel. Se añade la
solución FixDenat (50 \mul/pocillo) y se incuba las placas a
temperatura ambiente durante 45 minutos en un agitador de
placas.
6. La solución FixDenat se elimina completamente
por decantación y golpeando suavemente la placa invertida sobre una
toalla de papel. Se añade la leche (leche deshidratada 5% en PBS,
200 \mul/pocillo) como solución de bloqueo y la placa se incuba
durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
7. La solución de bloqueo se elimina por
decantación y se lava los pocillos una vez con PBS. Se añade la
solución anti-BrdU-POD (dilución de
1:200 en PBS, BSA 1%) (50 \mul/pocillo) y se incuba la placa
durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
8. El conjugado anticuerpo se elimina
completamente por decantación y lavando los pocillos 5 veces con
PBS. Luego se seca la placa invirtiéndola y golpeándola suavemente
sobre una toalla de papel.
9. Se añade la solución de sustrato TMB (100
\mul/pocillo) y se incuba durante 10 minutos a temperatura
ambiente en un agitador de placas hasta que el desarrollo del color
es suficiente como para detección fotométrica.
10. Se mide la absorbancia de las muestras a 410
nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a
490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector de placas
ELISA Dynatech.
1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd.,
Japón).
2. 3T3/EGFRc7.
1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd.,
Japón).
2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr con dominio quinasa
Her-2).
1. EGF de ratón, 201 (Toyobo Co., Ltd.,
Japón).
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr con dominio quinasa
Her-4).
1. PDGF B/B humano (Boehringer Mannheim,
Alemania).
2. 3T3/EGFRc7.
1. FGF2/bFGF humano (Gibco BRL, EEUU).
2. 3T3c7/EGFr.
1. Humano recombinante (G511, Promega Corp.,
EEUU).
2. 3T3/IGF1r.
1. Insulina, cristalino, bovino, Zinc (13007,
Gibco BRL, EEUU).
2. 3T3/H25.
1. HGF humano recombinante (Cat. nº
249-HG, R&D Systems, Inc. USA).
2. Células BxPC-3 (ATCC
CRL-1687).
1. Se siembra células a 9000 células/pocillo en
RPMI 10% FBS en una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron
durante la noche a 37ºC en CO_{2} 5%.
2. Tras 24 horas, las células se lavaron con PBS,
y luego se dejaron en 100 \mul de medio libre de suero (RPMI con
BSA 0,1%) durante 24 horas.
3. El día 3, 25 \mul que contenían ligando
(preparado a 1 \mug/ml en RPMI con BSA 0,1%; la concentración
final de HGF es 200 ng/ml) y los compuestos de la prueba se
añadieron a las células. Los pocillos de control negativos
recibieron 25 \mul de RPMI libre de suero con sólo BSA 0,1%. Las
células de control positivo recibieron el ligando 8HGF) pero no el
compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se prepararon a 5
veces su concentración final en RPMI libre de suero con ligando en
una placa de 96 pocillos, y se diluyó en serie para obtener 7
concentraciones de prueba. Típicamente, la concentración final más
alta de compuesto de prueba es 100 \muM, y las diluciones 1:3 se
usan (es decir, las concentraciones finales de los compuestos de la
prueba oscilan entre 0,137-100 \muM).
4. 18 horas después de la activación del ligando,
12,5 \mul de reactivo de marcación BrdU diluido (1:100 en RPMI,
BSA 0,1%) se añadió a cada pocillo y las células se incubaron con
BrdU (la concentración final es de 10 \muM) durante 1 hora.
5. Lo mismo que en el procedimiento general.
6. Lo mismo que en el procedimiento general.
7. La solución de bloqueo se elimina por
decantación y se lava los pocillos una vez con PBS. Se añade
solución anti-BrdU-POD (dilución
1:100 en PBS, BSA 1%) (100 \mul/pocillo) y la placa se incuba
durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de
placas.
8. Lo mismo que en el procedimiento general.
9. Lo mismo que en el procedimiento general.
10. Lo mismo que en el procedimiento general.
Este ensayo se usa para medir la actividad de un
compuesto contra PDGF-R, FGF-R,
VEGF, aFGF o Flk-1/KDR, todos expresados
naturalmente por células HUV-EC.
Día
0
1. Lavar y tripsinizar las células
HUV-EC-C (células endoteliales de la
vena umbilical humana, (American Type Culture Collection, catálogo
nº 1730 CRL). Lavar con solución salina tamponada con fosfato de
Dulbecco (D-PBS, obtenida de Gibco BRL, catálogo nº
14190-029) 2 veces a aproximadamente 1 ml/10
cm^{2} de frasco de cultivo tisular. Tripsinizar con
tripsina-EDTA 0,05% en solución de disociación
celular no enzimática (Sigma Chemical Company, catálogo nº
C-1544). La tripsina 0,05% se fabrica diluyendo
0,25% tripsina/EDTA 1 M (Gibco, catálogo nº
25200-049) en la solución de disociación celular.
Tripsinizar con aproximadamente 1 ml/25-30 cm^{2}
de frasco de cultivo tisular durante alrededor de 5 minutos a 37ºC.
Después de que las células se hayan despegado del frasco, añadir un
volumen igual de medio de ensayo y transferir a un tubo de
centrifugación estéril de 50 ml (Fisher Scientific, catálogo nº
05-539-6).
2. Lavar las células con aproximadamente 35 ml de
medio de ensayo en el tubo de centrifugación estéril de 50 ml
añadiendo el medio de ensayo, centrifugar durante 10 minutos a
aproximadamente 200x g, aspirar el sobrante, y resuspender con 35 ml
de D-PBS. Repetir el lavado dos veces más con
D-PBS. Resuspender las células en aproximadamente 1
ml de medio de ensayo/15 cm^{2} de frasco de cultivo tisular. El
medio de ensayo está compuesto por medio F12K (Gibco BRL, catálogo
nº 21127-014) y suero bovino fetal inactivado por
calor al 0,5%. Contar las células con un contador Coulter Counter®
(Coulter Electronics, Inc.) y añadir medio de ensayo a las células
para obtener una concentración de 0,8-1,0 x 10^{5}
células/ml.
3. Añadir células a las placas de 96 pocillos de
fondo plano a 100 \mul/pocillo ó 0,8-1,0 x
10^{4} células/pocillo. Incubar alrededor de 24 horas a 37ºC,
CO_{2} 5%.
Día
1
1. Realizar titulaciones dobladas del compuesto
de prueba en placas de 96 pocillos separadas, generalmente desde 50
\muM hasta 0 \muM. Utilizar el mismo medio de ensayo que el del
día 0, paso 2 anterior. Las titulaciones se realizan añadiendo 90
\mul/pocillo del compuesto de prueba a 200 \muM (4X la
concentración final del pocillo) al pocillo superior de una columna
de la placa en concreto. Puesto que el compuesto de prueba en stock
está normalmente a 20 mM en DMSO, la concentración de fármaco 200
\muM contiene DMSO al 2%.
Un diluyente fabricado para DMSO 2% en medio de
ensayo (F12K + suero fetal bovino 0,5%) se usa como diluyente para
las titulaciones del compuesto de prueba y así diluir el compuesto
de prueba pero mantener la concentración de DMSO constante. Añadir
este diluyente a los pocillos restantes en la columna a 60
\mul/pocillo. Coger 60 \mul de los 120 \mul de la dilución del
compuesto de la prueba a 200 \muM en el pocillo superior de la
columna y mezclar con los 60 \mul del segundo pocillo de la
columna. Tomar 60 \mul de este pocillo y mezclarlos con 60 \mul
del tercer pocillo de la columna, y así hasta que se ha completado
las titulaciones dobladas. Cuando el "siguiente al último"
pocillo está mezclado, tomar 60 \mul de los 120 \mu de este
pocillo y eliminarlo. Dejar el último pocillo con 60 \mul de
DMSO/medio diluyente como control que no contiene compuesto de
prueba. Hacer 9 columnas de compuesto de prueba titulado, suficiente
para pocillos triplicados, cada uno para: (1) VEGF (obtenido de
Pepro Tech Inc., catálogo nº 100-200, (2) factor de
crecimiento celular endotelial (ECGF) (también conocido como factor
de crecimiento fibroblástico ácido, o aFGF) (obtenido de Boehringer
Mannheim Biochemica, catálogo nº 1439 600), o, (3) PDGF B/B humano
(1276-956, Boehringer
Mannheim, Alemania) y control de medio de ensayo. El ECGF viene como una preparación con heparina de sodio.
Mannheim, Alemania) y control de medio de ensayo. El ECGF viene como una preparación con heparina de sodio.
2. Transferir 50 \mul/pocillo de las diluciones
del compuesto de la prueba a las placas de ensayo de 96 pocillos que
contienen 0,8-1,0x10^{4} células/100
\mul/pocillo de células HUV EC-C del día 0 y se
incuba durante alrededor de 2 horas a 37ºC, CO_{2} 5%.
3. Por triplicado, añadir 50 \mul/pocillo de
VEGF 80 \mug/ml, 20 ng/ml de ECGF, o medio de control a cada
condición de compuesto de prueba. Como en los compuestos de prueba,
las concentraciones del factor de crecimiento son 4X de la
concentración final deseada. Utilizar el medio de ensayo del día 0
paso 2 para hacer las concentraciones de los factores de
crecimiento. Incubar aproximadamente 24 horas a 37ºC, CO_{2} 5%.
Cada pocillo tendrá 50 \mul de dilución del compuesto de prueba,
50 \mul de medio o factor de crecimiento, y 100 \mu de células,
lo que hace un total de 200 \mul/pocillo. De esta manera, las
concentraciones 4X de compuesto de prueba y factores de crecimiento
se vuelven 1X una vez que se ha añadido todo a los pocillos.
Día
2
a. Añadir ^{3}H-timidina
(Amersham, catálogo nº TRK-686) a 1 \muCi/pocillo
(10 \mul/pocillo de 100 \muCi/ml de solución fabricada en medio
RPMI + suero bovino fetal inactivado por calor 10%) e incubar
alrededor de 24 horas a 37ºC, CO_{2} 5%. El RPMI se obtiene de
Gibco BRL, nº catálogo 11875-051.
Día
3
1. Congelar las placas durante la noche a
-20ºC.
Día
4
Descongelar las placas y sembrar con el sembrador
de placas de 96 pocillos (Tomtec Harvester 96®) en filtros (Wallac,
catálogo nº 1205-401), leer las cuentas en un
contador de centelleo líquido Wallac Betaplate^{TM}.
Los bioensayos que se han llevado a cabo o se
puede llevar a cabo para evaluar los compuestos se describen en
adelante en detalle. Los compuestos 1-9 fueron
evaluados y se encontró que eran activos en los ensayos flkGST,
FGFR1 y PDGF.
La capacidad de los tumores humanos para crecer
como injertos heterólogos en ratones atímicos (p.ej., Balb/c, nu/nu)
proporciona un modelo in vivo muy útil para estudiar la
respuesta biológica a terapias para los tumores humanos. Desde el
primer xenotransplante exitoso de tumores humanos en ratones
atímicos, (Rygaard y Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial.
Scand. 77:758-760) se han trasplantado y han
crecido con éxito en ratones desnudo varias líneas de células
tumorales humanas diferentes (p.ej., melanomas malignos, mamarios,
de pulmón, genitourinarios, gastrointestinales, de cabeza y cuello,
glioblastoma y huesos). Los siguientes ensayos pueden usarse para
determinar el nivel de actividad, especificidad y efecto de los
diferentes compuestos de la presente invención. Hay tres tipos
generales de ensayo útiles para evaluar compuestos:
celular/catalítico, celular/biológico e in vivo. El objeto
del ensayo celular/catalítico es el de determinar el efecto de un
compuesto sobre la capacidad de una TK para fosforilar tirosinas en
un sustrato conocido en una célula. El objeto del ensayo
celular/biológico es el de determinar el efecto de un compuesto en
la respuesta biológica estimulada por una TK en una célula. El
objeto del ensayo in vivo es el de determinar el efecto de un
compuesto en un modelo animal de un trastorno concreto como el
cáncer.
Entre las líneas celulares adecuadas para
experimentos de injertos heterólogos subcutáneos se encuentran las
células C6 (glioma, ATCC nº CCL 107), células A375 (melanoma, ATCC
nº CRL 1619), células A431 (carcinoma epidérmico, ATCC nº CRL 1555),
células Calu 6 (pulmón, ATCC nº HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC
nº CRL 1435), células SKOV3TP5 y fibroblastos NIH 3T3 diseñados
genéticamente para sobreexpresar EGFR, PDGFR, IGF-1R
o cualquier otra quinasa de prueba. El siguiente protocolo puede
usarse para realizar experimentos de injerto heterólogo:
Se obtuvo hembras de ratón atímico (BALB/c,
nu/nu) de Simonsen Laboratorios (Gilroy, CA). Todos los animales se
mantienen en condiciones de limpieza en sus jaulas con jaulas
Micro-aislantes con fondos
Alpha-dri. Reciben comida para roedores y agua ad
limitum.
Se hace crecer las líneas celulares en medio
adecuado (por ejemplo, MEM, DMEM, suero bovino fetal F10 de Ham ó
F12 plus de Ham 5%-10% (FBS) y glutamina (GLN) 2 mM). Todos los
medios de cultivo, glutamina, y suero bovino fetal se compran a
Gibco Life Technologies (Gran Island, NY) a menos que se especifique
lo contrario. Todas las células crecen en una atmósfera húmeda de
90-95% de aire y CO_{2} 5-10% a
37ºC. Todas las líneas celulares son subcultivadas dos veces a la
semana rutinariamente y son negativas para micoplasma como se
determinó por método Mycotect (Gibco).
Las células se sembraron a confluencia o
aproximadamente a confluencia con Tripsina-EDTA al
0,05% y se pelleteó a 450x g durante 10 minutos. Los pellets se
resuspendieron en PBS estéril o medio (sin FBS) a una concentración
concreta y las células se implantan en la ijada posterior del ratón
(8-10 ratones por grupo, 2-10 x
10^{6} células/animal). El crecimiento tumoral se mide después de
3 a 6 semanas usando pinzas de calibraje. Los volúmenes tumorales se
calcularon como un producto de longitud x anchura x peso a menos que
se indique lo contrario. Los valores P se calculan usando el
test-t de Student. Los compuestos de prueba en un
excipiente de 50 \mul-100 \mul (DMSO, o VPD:D5W)
pueden ser liberados por inyección IP a diferentes concentraciones
generalmente empezando en el día uno tras la implantación.
El siguiente modelo de invasión tumoral se ha
desarrollado y puede usarse par ala evaluación del valor terapéutico
y la eficacia de los compuestos identificados para inhibir
selectivamente el receptor KDR/FLK-1.
Se usan ratones (hembra) desnudos de 8 semanas de
edad (Simonsen Inc.) como animales del experimento. La implantación
de células tumorales puede realizarse en una campana de flujo
laminar. Para la anestesia se administró intraperitonealmente un
cóctel de xilazina/quetamina (100 mg/kg de quetamina y 5 mg/kg de
xilazina). Se realiza una incisión en la línea del medio para
exponer la cavidad abdominal (aproximadamente de 1,5 cm de longitud)
para inyectar 10^{7} células tumorales en un volumen de 100 \mul
de medio. Las células se inyectan o bien dentro del lóbulo duodenal
del páncreas o bajo la capa serosa del colon. El peritoneo y los
músculos se cierran con una sutura continua de seda
6-0 y se cierra la piel usando grapas de herida. Se
observa a los animales a diario.
Tras 2-6 semanas, en función de
las observaciones a grandes rasgos de los animales, se sacrificó a
los ratones, y se hizo una escisión de las metástasis de los tumores
locales a varios órganos (pulmón, hígado, cerebro, estómago, bazo,
corazón, músculo) y se analizó (medición del tamaño del tumor, grado
de invasión, inmunoquímica, determinación de la hibridación in
situ, etc.).
Este ensayo se usó para detectar el nivel de
fosforilación de tirosina c-kit.
Se mantiene células MO7E (leucemia mieloide aguda
humana) en medio libre de suero durante la noche 0,1%. Las células
se pretrataron con el compuesto (concurrente con medio libre de
suero), antes de la estimulación del ligando. Las células se
estimulan con 250 ng/ml de rh SCF durante 15 minutos. Después de la
estimulación, se lisó las células y se inmunoprecipitó con un
anticuerpo anti-c-kit. Los niveles
de fosfotirosina y proteína se determinaron por Western blot.
Se mantiene las células MO7E en medio libre de
suero y se pretratan con compuestos como se ha descrito para los
experimentos de fosforilación. Las células se colocan a 4x10^{5}
células/pocillo en una placa de 96 pocillos en 100 \mul de RPMI +
suero al 10%. Se añade rh-SCF (100 ng/ml) y la placa
se incuba durante 48 horas. Tras 48 horas, 10 \mul de MTT bromuro
de
[3-(4,5-dimetilhitiazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazolio) 5 mg/ml y se deja incubar durante 4 horas. Se añade
ácido isopropanol (100 \mul de HCl 0,04N en isopropanol) y se mide
la densidad óptica a una longitud de onda de 550 nm.
Las células se incuban en compuesto +/- SCF y +/-
en FBS 10% con rh-GM-CSF (10 ng/ml)
y rg-IL-3 (10 ng/ml). Las muestras
se estudian a las 24 y 48 horas. Para medir la
caspasa-3 activada, se lava las muestras con PBS y
se permeabilizan con etanol muy frío al 70%. Las células se tiñen
luego con caspasa-3 anti-activa de
conejo policlonal PE-conjugado y se analizan por
FACS. Para medir el PARP desprendido, se lisan las muestras y se
analizan por western blot con un anticuerpo
anti-PARP.
\newpage
Los ensayos adicionales que pueden usarse para
evaluar los compuestos de esta invención incluyen, pero no
exclusivamente, un ensayo bio-flk-1,
un ensayo de receptor quimérico receptor -Her2 EGF en células
enteras, un ensayo bio-src, un ensayo
bio-lck y un ensayo que mida la función de
fosforilación de raf. Los protocolos para cada uno de estos ensayos
pueden encontrarse en la solicitud estadounidense con nº de serie
09/099,842, que se incorpora aquí por referencia, incluyendo
cualquier figura.
Los compuestos terapéuticos deberían ser más
potentes para inhibir la actividad tirosin quinasa receptora que en
ejercer un efecto citotóxico. Una medición de la efectividad y la
toxicidad celular de un compuesto puede obtenerse determinando el
índice terapéutico, esto es, IC_{50}/LD_{50}. IC_{50}, la
dosis requerida para conseguir un 50% de inhibición, puede medirse
usando técnicas estándar como las aquí descritas. LD_{50}, la
dosis que resulta en un 50% de toxicidad, puede también medirse por
técnicas estándar (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods,
65:55-63), midiendo la cantidad de LDH liberada
(Korzeniewski y Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods,
64:313, Decker y Lohmann-Matches, 1988, J.
Immunol. Methods, 115:61), o midiendo la dosis letal en modelos
animales. Los compuestos con un índice terapéutico elevado son los
preferidos. El índice terapéutico debería ser mayor que 2,
preferiblemente al menos 10, preferentemente al menos 50.
Claims (14)
1. Un Compuesto de Fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde:
R^{1} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{10},
haloalcoxi C_{1}-C_{4}, cicloalquilo monocíclico
C_{3}-C_{8}, [5,6]- o
[6,6]-cicloalquilo bicíclico fusionado, adamantil,
un grupo heteroalicíclico de 5-9 miembros con 1 ó 2
heteroátomos seleccionados entre N, O ó -S(O)_{n}
donde n = 0-2, hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{10}, cicloalcoxi
C_{3}-C_{8} no sustituido,
-C(O)-R^{8}, -NR^{9}R^{10} y
-C(O) NR^{12}R^{13};
R^{2} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{10},
trihalometilo, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{10},
cicloalcoxi C_{3}-C_{8} no sustituido, ciano,
-NR^{9}R^{10}, -NR^{9}C(O)R^{10},
-C(O)R^{8},
-S(O)_{2}NR^{9}R^{10} y -SO_{2}R^{14} (donde
R^{14} es un alquilo C_{1}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alquilo
C_{1}-C_{4} sustituido con arilo
C_{6}-C_{12}, un heteroarilo de
5-12 miembros que contiene 1-4
heteroátomos anulares seleccionados del grupo de N, O ó S, y alquilo
C_{1}-C_{4} sustituido con un heteroarilo de
5-12 miembros que contiene 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S;
R^{3}, R^{4} y R^{5} son independientemente
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{10};
Z es un arilo C_{6}-C_{12},
heteroarilo de 5-12 miembros que contiene
1-4 heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó
S, un heterociclilo saturado de 3-8 miembros que
contiene 1 ó 2 heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó
S(O)_{n} donde n = 0-2, y
-NR^{15}R^{16} donde R^{15} y R^{16} son independientemente
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{10}; o R^{15} y
R^{16} junto con el átomo de nitrógeno al que van unidos forman un
grupo heterocicloamino de 3-8 miembros que contiene
opcionalmente 1 ó 2 heteroátomos anulares adicionales seleccionados
entre N, O ó S(O)_{n} donde n =
0-2;
R^{6} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{10};
R^{7} es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, un heteroarilo de
5-12 miembros que contiene 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S, y
-C(O)R^{17} como se define más adelante;
R^{8} es seleccionado del grupo compuesto por
hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{10}, cicloalcoxi
C_{3}-C_{8} no sustituido, ariloxi
C_{6}-C_{12}, y heteroariloxi de
5-12 miembros que contiene 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S;
R^{9} y R^{10} son independientemente
seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, cianoalquilo
C_{1}-C_{10}, cicloalquilo monocíclico
C_{3}-C_{8}, [5,6]- ó
[6,6]-cicloalquilo bicíclico fusionado, adamantil,
arilo C_{6}-C_{12} y un heteroarilo de
5-12 miembros que contenga 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S; o R^{9} y
R^{10} se combinan para formar un grupo heterocicloamino de
3-8 miembros que opcionalmente contiene 1 ó 2
heteroátomos anulares adicionales seleccionados entre N, O ó
S(O)_{n} donde n = 0-2;
R^{12} y R^{13} son independientemente
seleccionados del grupo compuesto por hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{10}, y arilo
C_{6}-C_{12}; o R^{12} y R^{13} junto con el
átomo de nitrógeno al que van unidos forman un grupo
heterocicloamino de 3-8 miembros que opcionalmente
contiene 1 ó 2 heteroátomos anulares adicionales seleccionados entre
N, O ó S(O)_{n} donde n = 0-2;
R^{17} es seleccionado del grupo compuesto por
alquilo C_{1}-C_{10}, cicloalquilo monocíclico
C_{3}-C_{8}, [5,6]- ó
[6,6]-cicloalquilo bicíclico fusionado, adamantil,
arilo C_{6}-C_{12}, hidroxi y un heteroarilo de
5-12 miembros que contiene 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S;
o una sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos;
Siempre que el compuesto no sea
y en
donde
El alquilo C_{1}-C_{10} puede
estar sustituido o no, y cuando está sustituido, el grupo o grupos
sustituyente(s) es seleccionado entre halo, hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{4}, arilo
C_{6}-C_{12}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, un heteroarilo de
5-12 miembros que contenga 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S, un grupo
heteroalicíclico de 5-9 miembros que contenga 1 ó 2
heteroátomos seleccionados entre N, O ó -S(O)_{n}
donde n = 0-2, -C(O)R^{8},
-NR^{9}R^{10} y -C(O)NR^{9}R^{10};
El cicloalquilo monocíclico
C_{3}-C_{8}, el [5,6]- ó
[6,6]-cicloalquilo bicíclico fusionado, y el
adamantil pueden estar sustituidos o no, y cuando están sustituidos,
el grupo o grupos sustituyente(s) es uno o dos grupos
independientemente seleccionados entre alquilo
C_{1}-C_{4}, trihaloalquilo
C_{1}-C_{4}, halo, hidroxi, alcoxi
C_{1}-C_{9}, arilo
C_{6}-C_{12}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, un heteroarilo de 6 miembros que
contenga 1-3 átomos de nitrógeno anulares, un
heteroarilo de 5 miembros que contenga 1-3
heteroátomos seleccionados entre N, O ó S, un grupo heteroalicíclico
de 5 ó 6 miembros que contenga 1-3 heteroátomos
seleccionados entre N, O ó S, mercapto, S-alquilo
C_{1}-C_{4}, S-arilo
C_{6}-C_{12}, ciano,
-C(O)-R'',
-C(S)-R'',-OC(O)NR^{12}R^{13},
R^{9}OC(O)NR^{10}-,
-OC(S)NR^{12}R^{13},
R^{9}OC(S)NR^{10}-,
-C(O)NR^{9}R^{10},
R^{9}C(O)NR^{10}-, nitro,
NR^{9}S(O)_{2}R^{10},
-S(O)_{2}
NR^{9}R^{10}, R^{9}S(O)-, R^{9}S(O)_{2}-, C(O)OR^{9}, R^{9}C(O)O-, y -NR^{9}R^{10};
NR^{9}R^{10}, R^{9}S(O)-, R^{9}S(O)_{2}-, C(O)OR^{9}, R^{9}C(O)O-, y -NR^{9}R^{10};
El arilo C_{6}-C_{12} puede
estar sustituido o no, y cuando está sustituido, el grupo o grupos
sustituyente(s) es uno o dos grupos independientemente
seleccionados entre halo, alquilo C_{1}-C_{4},
trihaloalquilo C_{1}-C_{4}, hidroxi, mercapto,
ciano, carboxi, NR^{9}S(O)_{2}R^{10},
R^{9}C(O)NR^{10}-,-NHR o -NRR donde R es un
alquilo C_{1}-C_{4}, un cicloalquilo
monocíclico C_{3}-C_{8}; [5,6]- o
[6,6]-cicloalquilo bicíclico fusionado, o
adamantil;
El heteroarilo de 5-12 miembros
puede estar sustituido o no, y cuando está sustituido, el grupo o
grupos sustituyen-
te(s) se define como para el arilo C_{6}-C_{12} anterior;
te(s) se define como para el arilo C_{6}-C_{12} anterior;
El heteroalicíclico de 5-9
miembros puede estar sustituido o no, y cuando está sustituido, el
grupo o grupos sustituyente(s) se define como para el arilo
C_{6}-C_{12} anterior;
El heterociclilo saturado de 3-8
miembros puede estar sustituido o no, y cuando está sustituido, el
grupo o grupos sustituyente(s) es uno o dos grupos
independientemente seleccionados entre = O (como un
sustituyente-C para formar un grupo carbonilo),
halo, alquilo C_{1}-C_{4}, alquilo
C_{1}-C_{4} sustituido con carboxi ó
-C(O)O-R'' con R'' tal como se ha
definido aquí excepto porque R'' no puede ser hidrógeno, hidroxi, ni
-NHR o -NRR donde R es alquilo C_{1}-C_{4} o
cicloalquilo monocíclico C_{3}-C_{8}, [5,6]- o
[6,6]-cicloalquilo bicíclico fusionado, o
adamantil;
El heterocicloamino de 3-8
miembros puede estar sustituido o no, y cuando está sustituido, el
grupo o grupos sustituyente(s) se define como para el
heterociclilo saturado de 3-8 miembros anterior;
El alcoxi C_{1}-C_{10} puede
estar sustituido o no, y cuando está sustituido, el grupo o grupos
sustituyente(s) es definido igual que para el alquilo
C_{1}-C_{10} anterior;
El ariloxi C_{6}-C_{12} y el
heteroariloxi de 5-12 miembros puede estar
sustituido o no, y cuando está sustituido, el grupo o grupos
sustituyente(s) se define como para el arilo
C_{6}-C_{12} anterior;
R'' es seleccionado del grupo compuesto por
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, trihalometilo,
cicloalquilo monocíclico C_{3}-C_{8}, arilo
C_{6}-C_{12}, un heteroarilo de
5-12 miembros que contenga 1-4
heteroátomos anulares seleccionados entre N, O ó S, y un grupo
heteroalicíclico que contenga 1 ó 2 heteroátomos seleccionados entre
N, O ó -S(O)_{n} donde n = 0-2.
2. El compuesto de la reivindicación 1,
donde:
R^{1} es seleccionado entre el grupo compuesto
por hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{10},
cicloalquilo monocíclico C_{3}-C_{8}, [5,6]- o
[6,6]-cicloalquilo bicíclico fusionado, adamantil,
un grupo heteroalicíclico de 5-9 miembros que
contenga 1 ó 2 heteroátomos seleccionados entre N, O ó
-S(O)_{n} donde n = 0-2, hidroxi,
alcoxi C_{1}-C_{10}, cicloalcoxi
C_{3}-C_{8} no sustituido,
-C(O)-R^{8}, -NR^{9}R^{10} y -C
O)NR^{12}R^{13};
R^{2}, R^{14}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, Z,
R^{15}, R^{16}, R^{6}, R^{7}, R^{8}, R^{9}, R^{10} son
como se ha definido para la reivindicación 1;
R^{12} y R^{13} son independientemente
seleccionados entre el grupo compuesto por hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, y arilo
C_{6}-C_{12}; o R^{12} y R^{13} junto con el
átomo de nitrógeno al que van unidos forman un grupo
heterocicloamino de 3-8 miembros que opcionalmente
contiene 1 ó 2 heteroátomos anulares adicionales seleccionados entre
N, O, ó S(O)_{n} donde n = 0-2;
R^{17} es como se ha definido para la
reivindicación 1;
o una sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos.
3. El compuesto o sal de la reivindicación 1 o
reivindicación 2, donde el compuesto es seleccionado entre el grupo
compuesto por:
4. El compuesto o sal de la reivindicación 1 ó la
reivindicación 2, donde el compuesto es seleccionado entre el grupo
compuesto por:
5. El compuesto o sal de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde el compuesto tiene la Fórmula (Ia):
en
donde:
R^{1}, R^{3}, R^{4}, y R^{5} son
hidrógeno;
R^{2} es fluoro y está localizado en la
posición 5 del anillo de indolinona; y
Z es
morfolin-4-ilo;
R^{6} y R^{7} son metilo; y
la esterioquímica en el *C es (S).
6. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto o sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5 y un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
7. Un método para la modulación de la actividad
catalítica de una protein quinasa in vitro, comprendiendo la
puesta en contacto de dicha protein quinasa con un compuesto o sal
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 5.
8. El método de la reivindicación 7, donde dicha
proteína es seleccionada del grupo compuesto por un receptor tirosin
quinasa, una tirosin quinasa no receptora y una
serina-treonina quinasa.
9. El uso de una composición farmacéutica que
comprende un compuesto o sal de cualquiera de las reivindicaciones 1
a la 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable o excipiente en la
fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno
relacionado con la protein quinasa en un organismo.
10. El uso de la reivindicación 9, donde dicho
trastorno relacionado con la protein quinasa es seleccionado entre
el grupo compuesto por un trastorno relacionado con el receptor
tirosin quinasa, un trastorno relacionado con la tirosin quinasa no
receptora y un trastorno relacionado con la
serina-treonina quinasa.
11. El uso de la reivindicación 9 ó 10, donde
dicho trastorno relacionado con la protein quinasa es seleccionado
entre el grupo compuesto por un trastorno relacionado con EGFR, un
trastorno relacionado con PDGFR, un trastorno relacionado con IGFR y
un trastorno relacionado con flk.
12. El uso de las reivindicaciones 9 a la 11,
donde dicho trastorno relacionado con la protein quinasa es un
cáncer seleccionado entre el grupo compuesto por carcinoma celular
escamoso, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cáncer de
pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, melanoma,
cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de
pulmón de células pequeñas, glioma, cáncer colorectal, cáncer
genitourinario y cáncer gastrointestinal.
13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
9 a la 11, donde dicho trastorno relacionado con la protein quinasa
es seleccionado entre el grupo compuesto por diabetes, un trastorno
autoinmune, un trastorno hiperproliferativo, restenosis, fibrosis,
soriasis, enfermedad de von Heppel-Lindau,
osteoartritis, artritis reumatoide, angiogénesis, un trastorno
inflamatorio, una enfermedad inmunológica y un trastorno
cardiovascular.
14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
9 a la 13, donde dicho organismo es un ser humano.
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