JP5362563B2 - αVβ6に対する抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、アルファVベータ6インテグリン(αVβ6)に対するモノクローナル抗体および上記抗体の使用に関するものである。ある態様において、本発明は、αVβ6に対する完全ヒトモノクローナル抗体に関するものである。上記抗体は、診断法として、およびαVβ6の活性および/または過剰産生に伴う疾患の処置に有用である。
インテグリンスーパーファミリーは、18個のアルファ鎖および8個のベータ鎖を利用するヘテロ二量体から成る少なくとも24個のファミリーメンバーを含む(Hynes, (2002) Cell 110: 673-87)。この受容体のファミリーは、細胞表面で発現され、細胞の生存、増殖、移動および分化並びに腫瘍浸潤および転移を調節する細胞−細胞および細胞−細胞外マトリックスの相互作用を伝達する(ffrench-Constantおよび Colognato, (2004) Trends Cell Biol. 14: 678-86)。インテグリンは、他の細胞受容体、成長因子および細胞外マトリックスタンパク質と結合し、その多くのファミリーメンバーは、特定タンパク質について重複する結合特異性を共有している。この重複性により、特定のインテグリンが存在しなくても重要な機能の継続は確保され得る(Koivisto et al., (2000) Exp. Cell Res. 255: 10-17)。しかしながら、特異性は類似していても個々のインテグリンの発現には時間的および空間的な制限があることも報告されており、それによりリガンド結合に対する細胞性応答も改変され得る(Yokosaki et al., (1996) J. Biol. Chem. 271: 24144-50; Kemperman et al., (1997) Exp. Cell Res. 234: 156-64; Thomas et al., (2006) J. Oral Pathol. Med. 35: 1-10)。
本発明は、概してαVβ6に結合する標的結合剤(targeted binding agent)に関するものである。本発明の態様は、αVβ6に特異的に結合することにより、αVβ6へのリガンドの結合を阻害する完全ヒト標的結合剤に関するものである。また、標的結合剤は、腫瘍細胞接着も阻害する。さらに、標的結合剤は、腫瘍の成長を低下させるのに有用である。これが達成され得る機構は、限定されるわけではないが、リガンドのその受容体αVβ6への結合阻害、TGFβ−LAPなどのリガンドとの相互作用の排除による、αVβ6の有効濃度の低減化を含み得る。
さらに別の例では、αVβ6関連疾患は、TGF−β調節障害に伴うもので、癌および結合組織(線維症性)疾患がある。
本発明の態様は、αVβ6インテグリン(αVβ6)と結合する標的結合剤に関するものである。態様によっては、結合剤がαVβ6に結合し、αVβ6へのリガンドの結合を阻害する場合もある。一態様では、標的結合剤はモノクローナル抗体またはその結合性フラグメントである。別の態様では、抗体はβ6鎖にのみ結合するが、αVβ6へのリガンドの結合を阻害することはできる。
さらに別の例では、αVβ6関連疾患は、TGF−β調節障害に伴うもので、癌および結合組織(線維症性)疾患がある。
i)β6単独;
ii)αVβ6;または
iii)αVβ6/リガンド複合体
またはこれらの組合わせと結合し得る。一態様において、抗体は、インビトロおよびインビボでαVβ6の生物活性と拮抗することができる。抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体、例えばsc264RAD、sc264RAD/ADY、sc188SDM、sc133、sc133TMT、sc133WDS、sc133TMT/WDS、sc188、sc254、sc264またはsc298またはその変異型から選択され得る。
本発明の態様は、下記表1に列挙した特異的抗αVβ6抗体を含む。この表は、各抗αVβ6抗体の識別番号を、対応する重鎖および軽鎖遺伝子の可変ドメインの配列番号と一緒に記録している。各抗体には、「sc」という文字に次いで番号を含む識別番号が与えられている。
特に断らなければ、本明細書で使用している科学および技術用語は、一般的に当業者により理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈上特に要求されなければ、単数形の用語は複数の場合も包含し、複数形の用語は、単数の場合も含むものとする。一般的に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、およびタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関して利用される命名法およびそれらの技術は、公知であり、当業界で常用されているものである。
「αVβ6」の語は、αV鎖およびβ6鎖から成るヘテロ二量体インテグリン分子をいう。
「mAb」の語は、モノクローナル抗体を指す。
「患者」の語は、ヒトおよび獣医学的対象を包含する。
ヒト抗体を用いると、マウスまたはラット可変および/または定常領域を有する抗体に伴う問題が一部回避される。かかるマウスまたはラット誘導タンパク質の存在は、抗体の急速なクリアランスを招き得るか、または患者による抗体に対する免疫応答の発生を誘導し得る。マウスまたはラット由来の抗体の利用を回避するために、げっ歯動物、他の哺乳類または動物へ機能性ヒト抗体遺伝子座を導入して、げっ歯動物、他の哺乳類または動物に完全ヒト抗体を生産させることにより、完全ヒト抗体を生成させ得る。
ここに記載の抗体は、下記のXenoMouse(登録商標)技術の使用により調製された。したがって、上記マウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を生産し得、マウス免疫グロブリンおよび抗体の生産性を欠いている。これを達成するのに利用される技術は、本明細書の発明の背景の項に開示された特許、出願および参考文献で開示されている。しかしながら、特に、トランスジェニックマウスの生産およびそこからの抗体産生の好ましい態様は、1996年12月3日出願の米国特許出願第08/759620号および1998年6月11日公開の国際特許出願第WO98/24893号および2000年12月21日公開の同第00/76310号に開示されており、これらの開示については出典明示で援用する。また、Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)参照、これらの開示については出典明示で援用する。
本発明の態様は、病気の治療薬として有用な抗αVβ6抗体の滅菌医薬製剤を含む。上記製剤は、αVβ6インテグリンへのリガンドの結合を阻害することにより、例えば組織αVβ6が異常に高い病理学的状態を効果的に処置する。抗αVβ6抗体は、好ましくはαVβ6活性を強力に阻害するのに十分な親和力を有し、好ましくはヒトに頻繁に投薬する必要のない程度に十分な作用持続時間を有する。作用持続時間の延長により、代替的非経口経路、例えば皮下または筋肉内注射による投薬スケジュールは少ない頻度でより便利なものになり得る。
本発明にしたがって、またαVβ6に関して本発明で産生および特性確認された抗体の活性に基づくと、抗体部分の範囲を超えた他の治療モダリティーの設計が容易になる。上記モダリティーには、制限するわけではないが、進歩した抗体治療薬、例えば二重特異性抗体、免疫毒素、および放射性標識治療薬、単ドメイン抗体、ペプチド治療薬の生成、新規スキャフォールドにおけるαVβ6結合性ドメイン、遺伝子療法、特に細胞内発現抗体、アンチセンス治療薬および小分子がある。
本明細書で説明されている抗腫瘍処置は、単独治療として適用され得るか、または本発明化合物に加えて、慣用的手術または放射線治療または化学療法を含み得る。上記化学療法は、抗腫瘍剤の以下のカテゴリーの1つまたはそれ以上を含み得る:
免疫化および力価測定
免疫化
可溶性αVβ6および細胞結合αVβ6(細胞表面でヒトαVβ6を発現するCHOトランスフェクタント)をそれぞれ用いて免疫化を実施した。CHOトランスフェクタントを作製するため、ヒト完全長αVβ6 cDNAを、pcDNA3発現ベクターに挿入した。CHO細胞を、電気穿孔により一時的にトランスフェクションした。免疫原目的に適切なレベルでの細胞表面におけるヒトαVβ6の発現を、蛍光活性化細胞分取(FACS)分析により確認した。キャンペーン1についての10μg/マウスの可溶性タンパク質、およびキャンペーン2についての3×106細胞/マウスのトランスフェクションCHO細胞を、1996年12月3日出願の米国特許出願第08/759620号および1998年6月11日公開の国際特許出願第WO98/24893号、および2000年12月21日公開の同第WO01/76310号(これらについては、出典明示で援用する)に開示された方法に従ってXenoMouse(登録商標)での初回免疫化に使用した。初回免疫後、5μg/マウスの13追加促進薬量による免疫強化を群1および2(可溶性抗原)に施し、1.5×106細胞/マウスの9追加促進薬量による免疫強化を群3および4(細胞結合抗原)に施した。免疫化プログラムを表2に要約する。
ヒトαVβ6に対する抗体の力価を、可溶性抗原で免疫化したマウスについてELISA検定法により試験した。天然(細胞結合)抗原で免疫化したマウスについての抗体の力価をFACSにより試験した。ELISAおよびFACS分析は、αVβ6に特異的であると思われるマウスもいることを示した。したがって、免疫化プログラムの最後に、実施例2の記載に従って、20匹のマウスを採取用に選択し、リンパ球を免疫化マウスの脾臓およびリンパ節から単離した。
リンパ球の回収およびB細胞単離
免疫化マウスを頸部脱臼により殺し、排出するリンパ節を採取し、各コーホートからプールした。リンパ系細胞をDMEM中で粉砕することにより解離し、組織から細胞を放出させ、細胞をDMEMに懸濁した。B細胞をIgMでの負の選択およびIgGでの正の選択により濃厚化した。細胞を培養することにより、B細胞を拡大させ、抗体分泌性形質細胞に分化させ得た。
抗体分泌性形質細胞を、選択培地において常用手順で増殖させた。抗ヒトαVβ6抗体を産生する可能性がある細胞から集めた余すところのない上清を、下記実施例で詳述している後続のスクリーニング検定法にかけた。
細胞結合αVβ6への結合
αVβ6への分泌された抗体の結合を評価した。下記要領で、FMATマクロ共焦点スキャナーを用いて、細胞結合αVβ6への結合を評価し、可溶性αVβ6への結合をELISAにより分析した。
採取した細胞から集めた上清を試験することにより、αVβ6を安定して過剰発現するHEK293細胞への分泌抗体の結合を評価した。親293F細胞株を陰性対照として使用した。フリースタイル(Freestyle)培地(Invitrogen)中の細胞を、安定したトランスフェクタントについては2500細胞/ウェルの密度、および親細胞については22500細胞/ウェルの密度で、50μL/ウェルの容量での384ウェルFMATプレートへ播種し、細胞を一晩37℃でインキュベーションした。次いで、10μL/ウェルの上清を加え、プレートを約1時間4℃でインキュベーションした後、10μL/ウェルの抗ヒトIgG−Cy5二次抗体を2.8μg/mlの濃度(400ng/ml最終濃度)で加えた。次いで、プレートを1時間4℃でインキュベーションし、FMATマクロ共焦点スキャナー(Applied Biosystems)を用いて蛍光を読み取った。11抗体に関するFMATの結果を表3に要約する。
細胞接着の阻害
種々の抗体含有上清の相対効力を測定するため、αVβ6陽性HT29細胞のTGFβLAP介在的接着に対する阻害能について抗体を評価した。プレートを10μg/mlのTGFβLAPにより一晩コーティングし、検定前の1時間3%BSA/PBSにより予め遮断した。次いで、細胞を沈降させ、HBBSで2回洗浄した後、細胞を適切な濃度でHBSSに再懸濁した。細胞を、4℃で30分間V底プレートにおいて適切な抗体の存在下でインキュベーションした。抗原コーティング溶液を除去し、プレートを室温で1時間100μLの3%BSAにより遮断した。プレートをPBSまたはHBSSで2回洗浄し、細胞−抗体混合物をコーティングしたプレートに移し、プレートを37℃で30分間インキュベーションした。次いで、コーティングしたプレートにおける細胞を温HBSS中で4回洗浄し、その後細胞を−80℃で1時間冷凍した。細胞を室温で1時間解凍し、次いで、100μLのCyQuant染料/溶解緩衝液(Molecular Probes)を、製造業者の使用説明書に従って各ウェルに加えた。蛍光を485nmの励起波長および530nmの放射波長で読み取った。12抗体に関する結果を表4に要約する。示されているそれらの抗体は、検定法で得られる最大および最小接着値を表すのに使用されるプレート上のコーティングおよび非コーティング対照ウェルに対して阻害率が62%から100%を超える効力範囲であった。
マカークαVβ6およびヒトαVへの交差反応性
マカークαVβ6への抗体含有上清の交差反応性を、カニクイザルαVおよびカニクイザルβ6で一時的にトランスフェクションしたHEK−293細胞におけるFACS分析を用いて上清で試験した。
ヒトαVへの交差反応性についても試験した。この検定法の場合、αVβ6ではなくαVβ3およびαVβ5を発現する親A375M細胞についてのFACS分析を用いて、交差反応性を上清で試験した。このスクリーンは、抗体がβ6鎖またはαVと組み合わせたβ6鎖を特異的に認識していることを示すように設計された。ヒトαV検定法を、マカークαVβ6交差反応性スクリーンと同時に実施した。
HEK−293細胞を、カニクイザルαVおよびカニクイザルβ6で一時的にトランスフェクションした。48時間後、細胞を集め、FACS緩衝液に再懸濁し、100μL中約50000細胞の最終濃度とした。
αVβ6特異的溶血プラーク検定法
抗体分泌性形質細胞を、組換え抗体生産用に各採取物から選択した。次いで、蛍光プラーク検定法を用いて、αVβ6に対する抗体を発現する単形質細胞を同定した。次いで、単細胞を逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応にかけることにより、実施例7に記載した最初の抗体特異性をコード化する可変重鎖および可変軽鎖をレスキューおよび増幅した。αVβ6特異的溶血プラーク検定法の実施に必要とされる多くの特殊試薬および材料の調製を以下に記載する。
組換えタンパク質単離
実施例4からの目的単形質細胞の単離後、mRNAを抽出し、逆転写酵素PCRを実施することにより、各細胞により分泌される抗体の可変重および軽鎖をコード化するcDNAを生成した。ヒト可変重鎖cDNAを、PCR中に添加した制限酵素により消化し、この反応産物を、クローニングに適合し得る突出部をもつIgG2発現ベクターへクローン化した。このベクターは、pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen、バーリントン、オンタリオ、カナダ)の多重クローニング部位へヒトIgG2の定常ドメインをクローン化することにより作製された。ヒト可変軽鎖cDNAを、PCR反応中に添加した制限酵素で消化し、この反応産物を、クローニングに適合し得る突出部をもつIgKappaまたはIgLamda発現ベクターへクローン化した。このベクターは、ヒトIgKまたはIgLの定常ドメインをpcDNA3.1+/Neo(Invitrogen)の多重クローニング部位へクローン化することにより作製された。
組換え抗体の精製
抗αVβ6抗体を大規模製造するため、重および軽鎖発現ベクター(各鎖2.5μg/皿)を、HEK293細胞による70%密集度である10枚の100mm皿へリポフェクションした。トランスフェクションした細胞を、37℃で4日間インキュベーションし、上清(6mL)を採取し、6mLの新しい培地と交換した。7日目、上清を除去し、初回採取物と共にプールした(10プレートから合計120mL)。プロテインAセファロース(Amersham Biosciences、ピスキャタウェイ、ニュージャージー)アフィニティークロマトグラフィー(1mL)を用いて、抗体を上清から精製した。抗体を、500μLの0.1Mグリシン、pH2.5によりプロテインAカラムから溶離した。溶出液をPBS、pH7.4中で透析し、滅菌濾過した。抗体を非還元的SDS−PAGEで分析することにより、純度および収率を評価した。280nmでの光学密度を測定することにより、タンパク質濃度を測定した。
αVβ6抗体の構造分析
抗体の可変重鎖および可変軽鎖をシークエンサーにかけることにより、それらのDNA配列を決定した。抗αVβ6抗体に関する完全な配列情報は、各ガンマおよびカッパ/ラムダ鎖の組合わせに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む配列リストで提供されている。可変重鎖配列を解析することにより、VHファミリー、D領域配列およびJ領域配列を決定した。次いで、配列を翻訳することにより、一次アミノ酸配列を決定し、生殖系列VH、DおよびJ領域配列と比較し、体細胞高頻度突然変異を評価した。
αVβ6抗体の効力測定
TGFβLAPへのHT29細胞の接着を阻止する能力に基づいて抗体を区別するため、以下の接着検定法を実施した。
Nunc MaxiSorp(Nunc)プレートを、一晩50μLの10μg/mlのTGFベータ1 LAP(TGFβLAP)でコーティングし、検定前に1時間3%BSA/PBSで予め遮断した。次いで、最適密度まで増殖させたHT29細胞を、沈降させ、HBBS(1%BSA含有およびMn2+不含有)中で2回洗浄した後、細胞を1ウェル当たり30000細胞でHBSSに再懸濁した。コーティング液をプレートから除去し、次いで室温で1時間、100μLの3%BSAで遮断した後、PBSで2回洗浄した。
競合検定法
抗体が可溶性TGFβLAPへのαVβ6インテグリン結合を特異的に遮断し得ることを立証するため、競争検定法を精製抗体で実施することにより、それらがαVβ6へ結合する能力およびGST−LAPペプチドへのその結合を遮断する能力を測定した。
中程度の結合性96ウェルプレート(Costar、カタログ#3368)を、PBSおよび0.05%アジ化ナトリウム中10μg/mlのGST−LAP50μL/ウェルによりコーティングし、4℃で一晩インキュベーションした。次いで、300μL/ウェルの検定希釈剤(TBS(50mMのトリス、50mMのNaCl、1mMのMgCl2および1mMのCaCl2、pH6.9)中1%ミルク)を用いてプレートを3回洗浄した後、300μL/ウェルのTBS中5%ミルクを用いてプレートを遮断し、室温で30分間インキュベーションした。mAb(10μg/ml〜0.01μg/mlの範囲の1:3系列希釈液中)を、αVβ6(0.05%アジ化ナトリウムを含む検定希釈剤中250ng/ml)と一晩インキュベーションした。翌日、50μL/ウェルのプレインキュベーションした一次抗体を、GST−LAPペプチドコーティングプレートに移し入れ、室温で1時間インキュベーションした。次いで、300μL/ウェルの検定希釈剤を用いてウェルを3回洗浄した。次いで、プレートに結合したαVβ6の量を検出するため、mAb2075(Chemicon)を検定希釈剤(50μL/ウェル)中1μg/mlの濃度で加え、室温で1時間インキュベーションした。次いで、300μL/ウェルの検定希釈剤を用いてウェルを3回洗浄し、検定希釈剤(50μL/ウェル)中400ng/mlのヤギ抗マウスIgG Fc−ペルオキシダーゼと室温で1時間インキュベーションした。次いで、300μL/ウェルの検定希釈剤を用いてウェルを3回洗浄し、50μL/ウェルの総容量で1段階TMB(Neogen)を用いて発色させた。15分後、発色反応を50μL/ウェルの1N塩酸でクエンチングした。プレートを450nmで読み取り、抗体の5つについての結果を図1に要約する。図1は、抗体がGST−LAPへのαVβ6結合を阻害し得たことを示している。
αVβ3またはαVβ5インテグリンとの交差反応性
抗体が、αVβ3またはαVβ5インテグリンではなく、αVβ6インテグリンに対してのみ機能的であることを立証するため、以下の検定を実施することにより、オステオポンチンペプチドへのA375細胞の接着に対する抗体の阻害能を試験した。
検定プレートをオステオポンチンペプチドでコーティングした。オステオポンチンの2種のフラグメント:OPN17−168およびOPN17−314を使用した。検定プレートを、検定前に1時間3%BSA/PBSで予め遮断した。A375細胞を培養フラスコから除去し、沈降させ、1%BSAおよび1mMのCa2+および1mMのMg2+を含むHBSSで2回洗浄した。次いで、細胞を、1ウェル当たり30000細胞の濃度でHBSSに再懸濁した。オステオポンチンフラグメントを含むコーティング液を除去し、プレートを室温で1時間3%BSA100μLにより遮断した。コーティングしたプレートを1%BSA含有HBSSにより2回洗浄した。抗体力価測定液を、30μLの最終容量での1:4系列希釈液および2回にわたって最終濃度で調製した。再懸濁した細胞を、V底プレートにおける力価測定抗体を含むウェルに添加し、細胞および抗体を4℃で40分間共インキュベーションした。次いで、細胞抗体混合物を、コーティングプレートに移し入れ、その後プレートを37℃で40分間インキュベーションした。次に、コーティングプレート上の細胞を、温HBSS中で4回洗浄し、次いで、プレート中の細胞を−80℃で15分間冷凍した。細胞を室温で解凍し、次いで100μLのCyQuant 染料/溶解緩衝液(Molecular Probes)を製造業者の使用説明書に従って各ウェルに加えた。蛍光を485nmの励起波長および530nmの放射波長で読み取った。
α4β1インテグリンへの交差反応性
抗体が、α4β1インテグリンではなく、αVβ6インテグリンに対してのみ機能的であることを立証するため、検定を実施することにより、フィブロネクチンのCS−1ペプチドへのJ6.77細胞の接着に対する抗体の阻害能を試験した。上記実施例12記載の要領で本検定法を実施したが、ただし、J6.77細胞を結合に使用し、フィブロネクチンのCS−1ペプチドを検定プレートのコーティングに使用した。
11抗体に関する結果を表16に要約する。市販されているβ1インテグリン特異抗体を、本検定法での陽性対照として用いたところ、97%の接着阻害を呈した。市販されているαVβ6特異抗体を、α4β1への接着に関する本検定法での陰性対照として使用した。全抗体を5μg/mlで使用したところ、試験抗体の中でα4β1インテグリンへの接着を遮断し得たものは無かった。
α5β1インテグリンへの交差反応性
抗体が、α5β1インテグリンではなく、αVβ6インテグリンに対してのみ機能的であることを立証するため、接着検定法を実施することにより、フィブロネクチンへのK562細胞の接着に対する抗体の阻害能を試験した。
検定プレートを、12.5μg/mLの濃度のフィブロネクチンのFN9−10ペプチドでコーティングした。検定プレートを、検定前に1時間3%BSA/PBSで予め遮断した。K562細胞を培養フラスコから取り出し、沈降させ、1%BSAおよび1mMのMn2+を含むHBSSで2回洗浄した。次いで、細胞を1ウェル当たり30000細胞の濃度でHBSSに再懸濁した。オステオポンチンフラグメントを含むコーティング液を除去し、プレートを室温で1時間3%BSA100μLにより遮断した。コーティングしたプレートを1%BSA含有HBSSにより2回洗浄した。抗体力価測定液を、30μLの最終容量での1:4系列希釈液および2回にわたって最終濃度で調製した。再懸濁した細胞を、V底プレートにおける力価測定抗体を含むウェルに添加し、細胞および抗体を4℃で60分間共インキュベーションした。次いで、細胞抗体混合物を、コーティングプレートに移し入れ、その後37℃で40分間インキュベーションした。次に、コーティングプレート上の細胞を、温HBSS中で4回洗浄し、次いで、プレート中の細胞を−80℃で15分間冷凍した。細胞を室温で解凍し、次いで100μLのCyQuant 染料/溶解緩衝液(Molecular Probes)を製造業者の使用説明書に従って各ウェルに加えた。蛍光を485nmの励起波長および530nmの放射波長で読み取った。
マウスおよびカニクイザルαVβ6インテグリンへの交差反応性
抗体がマウスαVβ6またはカニクイザルαVβ6に対し交差反応性を呈するか否かを測定するため、以下の検定法を実施した。
マカークおよびマウスαVβ6へのmAbの交差反応性を、カニクイザルまたはマウスαV、β6またはαVβ6で一時的にトランスフェクションしたHEK−293細胞でのFACS分析を用いて精製mAbにおいて試験した。トランスフェクションの約48時間後、細胞を集め、FACS緩衝液に再懸濁して、100μL中約50000細胞の最終濃度に到達させた。
内在化検定法
安定してヒトαVβ6を発現するK562細胞株を用いて、抗体の内在化を試験した。精製抗体の内在化を、この検定法では内在化されていない市販のαVβ6抗体と比較した。
結果を表19に要約する。
高分解能ビアコア(BIACORE)解析
可溶性αVβ6タンパク質を用いてCM5チップに固定した抗体と結合させる高分解能ビアコア(Biacore)解析を、5種のαVβ6抗体について実施することにより可溶性抗原に対するそれらの親和力を評価した。
ビアコア解析を次の要領で実施した。2つのCM5ビアコアチップ全面にわたる高密度ヤギαヒトIgG抗体表面を、常用のアミンカップリング法を用いて調製した。100μg/mlのBSA、1mMのMgCl2および1mMのCaCl2を含む脱気したHBS−P泳動用緩衝液で各mAbを約1μg/mLの濃度に希釈した。より正確には、mAb sc133を0.98μg/mLに希釈し、mAb sc188を0.96μg/mLに希釈し、mAb sc264を0.94μg/mLに希釈し、mAb sc254.2を0.87μg/mLに希釈し、mAb sc298を1.6μg/mLに希釈した。次いで、上記で列挙した濃度、流速10μL/分で別々のフローセルで各mAbを捕捉することにより、捕捉レベルプロトコルを各mAbについて展開した。mAb sc133、sc298およびsc254.2を30秒間捕捉し、mAb sc188およびsc264を1分間捕捉した。50μL/分での4分洗浄工程の後、mAbベースラインを安定させた。
FACSを用いた結合親和力分析
また、ビアコア(Biacore)に代わる方法として、FACS解析法を用いることにより、ヒトαVβ6抗原を安定して発現するK562細胞に対する抗体の一つの結合親和力を評価した。抗原の量を力価測定することにより、結合曲線を作成し、抗原への結合親和力を評価した。
CDC検定法
上記実施例記載の精製抗体は、IgG1イソ型に属し、エフェクター機能を有し得る。これらの抗体が補体依存的細胞傷害性(CDC)を伝達する能力を測定するため、αVβ6を安定して発現する293細胞(293−10A11)および親細胞(293F)を用いて以下の検定法を実施した。
細胞をカルセイン染色するため、HT29、293−10A11および293F細胞のそれぞれ約25X10e6のアリコートを、血清不含有RPMI培地3mlに個々に再懸濁した。次いで、1mMのカルセイン45μLを、細胞の各3ml試料に加え、試料を37℃で45分間インキュベーションした。細胞を1200xRPMで3分間遠心分離にかけ、上清を廃棄し、細胞を各細胞株の培養培地に再懸濁した。遠心分離工程を反復し、細胞を再懸濁して、50μL培地中約100000細胞の最終濃度とした。
結果を図3A〜3Eに要約しており、試験された各精製抗体が、αVβ6インテグリンを安定して発現する293細胞においてCDCを伝達し得ることが証明される。
位置指定突然変異導入
免疫化(実施例1)から調製された抗体の一つ(sc264)は、TGFβLAP結合阻害検定法(実施例4参照)においてインビトロで強い機能的遮断活性を示したが、非αVβ6発現細胞株との交差反応性結合を呈した(実施例15参照)。この抗体、sc264は、CDR3領域にRGD配列を有しており、これが交差反応性結合に関与すると推測される。したがって、位置指定突然変異導入を用いて、RGDにおけるグリシン残基をアラニンにより置換した(sc264RAD)。
第二抗体(sc188)は、FR3領域内にグリコシル化部位を有する。この部位は、NLTからKLTへの置換による位置指定突然変異導入を通して排除された(sc188SDM)。次いで、これら2種の抗体の突然変異体を、実施例7および8記載の要領で発現させ、精製し、精製抗体を以下の実施例に記載した要領で分析した。
突然変異体抗体の交差反応性結合を試験する結合検定法
実施例15で観察された交差反応性結合がsc264の位置指定突然変異導入により低減化されるか否かを試験するため、結合検定法を実施した。抗体の結合を293Tおよび293F細胞株で分析することにより、RGD部位をsc264から除去することによりもとの抗体と比べて結合性が減少するか否かを試験した。
293Tおよび293F細胞を収集後回転により沈降させ、1%BSAおよび1mMのCaCl2および1mMのMgCl2を含むHBSS(洗浄緩衝液)に再懸濁することにより、少なくとも150000の細胞を各反応で使用した。細胞をV底96ウェルプレート(Sarstedt)における反応間に分け、プレート中の細胞を3分間1500rpmで沈降させた後、HBSS上清を除去した。一次抗体を50μLの容量において表19に示した濃度で加え、細胞を再懸濁した後、氷上で60分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を3分間1500rpmでの遠心分離により沈降させ、100μLの洗浄緩衝液に再懸濁し、次いで再び沈降させた。次いで、細胞を、10μg/mlの7AADと共に2μg/mlで適切な二次抗体に再懸濁し、氷上で7分間染色した後、150μLの洗浄緩衝液を加え、細胞を3分間1500rpmで沈降させ、次いで100μLの1%BSA含有HBSSに再懸濁した。HTS連結装置を取り付けたFACS機で試料を読み取り、Cell Quest Pro ソフトウェアを用いてデータを解析した。結果を表22に要約しており、データは任意単位での幾何平均シフト値として表わされている。これらのデータは、試験した全濃度で、sc264 RADが、もとのmAb sc264よりも親293T細胞への結合性が著しく低かったことを立証している。
突然変異抗体の効力分析
HT−29細胞のTGFβLAP介在的接着を阻害するのに必要とされる突然変異体αVβ6抗体の濃度(IC50)を測定するため、次の検定法を実施した。
Nunc MaxiSorp(Nunc)プレートを、一晩50μLの10μg/mlのTGFベータ1 LAP(TGFβLAP)でコーティングし、検定前に1時間3%BSA/PBSで予め遮断した。次いで、最適密度まで増殖させたHT29細胞を、沈降させ、HBBS(1%BSA含有および1mMのCa2+および1mMのMn2+含有)中で2回洗浄した後、細胞を1ウェル当たり30000細胞でHBSSに再懸濁した。コーティング液をプレートから除去し、次いで室温で1時間、100μLの3%BSAで遮断した後、PBSで2回洗浄した。
α4β1インテグリンとの突然変異抗体の交差反応性
突然変異抗体が、α4β1インテグリンではなく、αVβ6インテグリンに対してのみ機能的であることを立証するため、検定を実施することにより、フィブロネクチンのCS−1ペプチドへのJ6.77細胞の接着に対する抗体の阻害能を試験した。下記記載の要領で検定法を実施した。
α5β1インテグリンとの突然変異抗体の交差反応性
突然変異抗体が、α5β1インテグリンではなく、αVβ6インテグリンに対してのみ機能的であることを立証するため、検定を実施することにより、フィブロネクチンへのK562細胞の接着に対する抗体の阻害能を試験した。上記実施例14記載の要領で本検定法を実施した。結果を表25に要約しており、試験抗体の中でα5β1への接着を遮断し得るものは無かったことを立証している。
マウスおよびカニクイザルαVβ6インテグリンとの突然変異抗体の交差反応性
突然変異体αVβ6特異抗体がマウスαVβ6またはカニクイザルαVβ6との交差反応性を呈するか否かを測定するため、次の検定法を実施した。
K562親細胞、またはカニクイザルまたはマウスαVβ6を発現するK562細胞を収集後回転により沈降させ、1%BSAおよび1mMのCaCl2および1mMのMgCl2を含むHBSS(洗浄緩衝液)に再懸濁することにより、少なくとも150000の細胞を各反応で使用した。細胞をV底96ウェルプレート(Sarstedt)における反応間に分け、プレート中の細胞を3分間1500rpmで沈降させた後、HBSS上清を除去した。一次抗体を50μLの容量で加え、細胞を再懸濁した後、氷上で60分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を3分間1500rpmでの遠心分離により沈降させ、100μLの洗浄緩衝液に再懸濁し、次いで再び沈降させた。次いで、細胞を、10μg/mlの7AADと共に2μg/mlで適切な二次抗体に再懸濁し、氷上で7分間染色した後、150μLの洗浄緩衝液を加え、細胞を3分間1500rpmで沈降させ、次いで100μLの1%BSA含有HBSSに再懸濁した。HTS連結装置を取り付けたFACS機で試料を読み取り、Cell Quest Pro ソフトウェアを用いてデータを解析した。結果を表26に要約しており、データは任意単位での幾何平均シフト値として表わされている。これらのデータは、試験した濃度で、sc264RADおよびsc188SDMが、マウスおよびカニクイザルαVβ6との交差反応性を呈することを立証している。
内在化検定法
ヒトαVβ6を安定して発現するK562細胞株を用いて、突然変異抗体の内在化を試験した。実施例15記載の要領で本検定法を実施した。精製抗体の内在化を、この検定法では内在化されていない市販のαVβ6抗体と比較した。
結果を表27に要約しており、sc264RAD突然変異抗体の内在化が、非突然変異sc264の場合より著しく低いことを立証している。
FACSを用いたsc264RADの結合親和力分析
sc264RAD抗体のαVβ6への結合親和力を、実施例18記載の要領で実施した。この検定法の結果を表28に要約しており、sc264RAD抗体が50pMより低い親和力を有することを立証している。
sc264RADとsc264RAD/ADYの活性の比較
sc264RAD抗体および264RADの生殖系列(GL)バージョン(軽鎖に突然変異A84Dを含む)、264RAD/ADYの活性を、デトロイト(Detroit)−562接着検定法で比較した。
プレートを一晩4℃で0.5μg/mlのGST−TGF−b LAP融合タンパク質によりコーティングし、翌朝、洗浄し、次いで3%BSA/PBSにより1時間遮断した。次いで、Detroit-562細胞(1ウェル当たり25000細胞)を、2mMのMgCl2を含むHBSS中37℃で45分間プレートに接着させた。45分後、プレートをPBS中で3回洗浄し、次いでエタノールに固定した。Hoeschtで染色することにより、細胞を視覚化し、Cellomics Arrayscan IIにおいて1ウェル当たりに結合した細胞数を数えることにより定量した。図5に示したデータは、sc264RADおよびsc264RAD/ADYが両方とも類似した活性を有すること、およびαVβ6機能の遮断能は修飾抗体でも維持されていることを示している。
成長試験
抗体264RAD、133および188SDMがインビボでavb6機能を遮断することを立証するため、αVβ6陽性腫瘍異種移植片の成長に対する阻害能についてそれぞれ試験した。かかる一モデルは、Detroit−562鼻咽頭(nasophayngeal)細胞株であり、これはαVβ6を発現し、また皮下腫瘍異種移植片として成長する。
Detroit 562細胞を、EarleのBSSおよび2mMのL−Glu+1.0mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMのNEAA+1.5g/L重炭酸ナトリウム+10%FBSを含むEMEM中で培養した。細胞を採取し、50%PBS+50%マトリゲルに再懸濁した。次いで、懸濁液を、右脇腹内に0.1mlの容量でマウス1匹あたり5x10−6の濃度で内植した。動物は6〜8週齢のNCR雌ヌードマウスであった。腫瘍が0.1cm3に達したとき、投薬を開始し、試験の持続期間中週1回20mg/kgの用量で投与した。3抗体は全て、腫瘍の成長を阻害した(図4参照)。264RADが最も有効であり、次いで133および188であった。このデータは、抗体264RAD、133および188がインビボで活性を示し、成長に関するαVβ6シグナリングに依存的な腫瘍の成長を抑制し得ることを立証している。
特許、特許出願、研究論文、教科書などを含む本明細書で引用している全参考文献、およびそこに引用されている参考文献については、それらが既存していない範囲まで、全ての目的に関してそのまま出典明示で援用する。
上記の明細書は、当業者が本発明を実践するのに十分な内容であると考えられる。上述の記載内容および実施例は、本発明の好ましい態様を詳述しており、本発明者らが最善であるとみなす方法を記載している。しかしながら、いかに本明細書で詳述されておろうと、本発明は多くの方法で実践され得るものとし、本発明は添付の請求の範囲およびその均等内容事項に従って解釈されるべきである。
Claims (12)
- 抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体はαVβ6インテグリンに特異的に結合し、
(i)アミノ酸配列VATGRADYHFYAMDVを含む重鎖可変領域CDR3配列;
(ii)アミノ酸配列YIYYSGRTYNNPSLKSを含む重鎖可変領域CDR2配列;
(iii)アミノ酸配列GGSISSGGYYWSを含む重鎖可変領域CDR1配列;
(iv)アミノ酸配列YSAADNNLVを含む軽鎖可変領域CDR3配列;
(v)アミノ酸配列KDSERPSを含む軽鎖可変領域CDR2配列;
(vi)アミノ酸配列SGDVLAKKSARを含む軽鎖可変領域CDR1配列
を含むものである、抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 請求項1に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、重鎖ポリペプチドが配列番号75により定義されるアミノ酸配列を含み、かつ/または軽鎖ポリペプチドが配列番号77により定義されるアミノ酸配列を含むものである、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 請求項1または2に記載の単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗体が一以上の以下の特性:
リガンドのαVβ6への結合を阻害する;
HT29細胞のTGFβ−LAP介在的接着の99%を超える割合を阻害する;
0.070μg/ml未満のIC50でHT29細胞のTGFβ−LAP介在的接着を阻害する;および
35ナノモル(nM)未満のKdでαVβ6に結合する、
を有するものである、抗体またはその抗原結合性フラグメント。 - 請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該抗原結合性フラグメントが、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb、および1本鎖抗体(scFvまたは二重特異性1本鎖Fv二量体)からなる群から選択されるものである、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび医薬上許容される担体を含む、組成物。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする、核酸分子。
- 請求項6に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項8に記載の宿主細胞を適した条件下で培養すること、および抗体またはその抗原結合性フラグメントを回収することを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを製造する方法。
- 悪性腫瘍の処置における使用のための、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または請求項5に記載の組成物。
- 請求項10に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、該悪性腫瘍が、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞(肝臓)癌、甲状腺腫瘍、胃(腹部)癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮体癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌、頭部および頸部癌、中皮腫、肉腫、胆管(胆管癌)、小腸腺癌、小児悪性疾患および類表皮癌から成る群から選択される、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
- 炎症の処置における使用のための、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、または請求項5に記載の組成物。
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