JP2002539829A - 体内の血管中に物体の移植、再配置又は摘出を行うための把持装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、成熟ＦＬＩＮＴの218位のアミノ酸がin vivoおよびin vitroでタンパク質分解に対して耐性なＦＬＩＮＴ類似体、その臨床的および治療的使用、および該類似体を含む医薬製剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 近年、多くの有力な生物学的効果を有する多くの腫瘍壊死因子レセプタータン
パク質（「TNFRタンパク質」）が単離されてきた。これらタンパク質の異常な活
性は多くの病的状態に関与してきた。 本明細書において「FASリガンド阻害タンパク質」または「ＦＬＩＮＴ」と呼
ぶあるそのようなTNFR相同体はFASリガンド(FASL)と結合することによりFAS Lと
FASの相互作用を阻害する。米国仮出願第60/112,577、60/112,933、および60/11
3,407号参照（出願日、各1998年12月17、18、および22日、これらの内容は本明
細書の一部を構成する)。

【０００２】 FAS-FASリガンドシグナルトランスダクション経路の活性化の増大は、ランナ
ウェイ（runaway）アポプトーシス(Kondo et al., Nature Medicine 3 (4): 409
-413 (1997); Galle et al., J. Exp. Med. 182: 1223-1230 (1995))、および好
中球の活性化から生じる炎症性疾患 (Miwa et al., Nature Medicine 4: 1287 (
1998))を含む多くの病的状態に関与する。 「ランナウェイアポプトーシス」とは、正常より大きなレベルのアポプトーシ
ス、または不適切な時に生じるアポプトーシスである。ランナウェイアポプトー
シスにより生じる病的状態には、例えば肝臓、腎臓、および膵臓の臓器不全が含
まれる。好中球の過剰な活性化を伴う炎症性疾患には、敗血症、ARDS、SIRSおよ
びMODSが含まれる。

【０００３】 FASのFASLレセプターとの結合、およびLIGHTのLTβRおよび／またはTR2/HVEM
レセプターとの結合を阻害するＦＬＩＮＴのような化合物は、これら結合相互作
用と関連する病気または病状を治療（処置）もしくは防止するのに用いることが
できる。ＦＬＩＮＴの治療的有用性は、修飾された薬理学的特性（例えば、有効
性の増加および／またはより長いin vivo半減期、および／またはFASLに対する
より大きな親和性）、修飾された医薬的特性（例えば、凝集および表面吸着の低
下、溶解性の増加、および製剤化が容易）および／または修飾された物理学的特
性、例えばタンパク質分解に対する感受性を有するＦＬＩＮＴ類似体により増す
かもしれない。

【０００４】 （発明の要約） ＦＬＩＮＴポリペプチドは、in vivoでタンパク質分解を受け、少なくとも２
つの主要ペプチド断片を生じる。該断片の１つは、配列番号１の残基１〜218（
あるいは配列番号3の残基１〜247）（本明細書では「ＦＬＩＮＴ代謝産物」と名
付けた）からなり、他方は配列番号１の残基219〜271（あるいは配列番号3の残
基248〜300）からなる。in vitroにおける218位の開裂は、天然のＦＬＩＮＴ (
配列番号3)または成熟ＦＬＩＮＴ(配列番号1)をトリプシン様酵素、例えばトロ
ンビン、トリプシン、または他のセリンプロテアーゼで処理することにより達成
できる。すなわち、セリンプロテアーゼはＦＬＩＮＴのin vivoにおけるタンパ
ク質分解を招くようである。ＦＬＩＮＴ代謝産物の生成は同時係属中の米国特許
出願第 号（代理人整理番号：X-12799）に記載されている（この内容は本
明細書の一部を構成する）。

【０００５】 in vitro試験は、ＦＬＩＮＴ代謝産物がＦＬＩＮＴより明らかに低い親和性で
FasLと結合することを示唆する。したがって、ＦＬＩＮＴの医薬的有用性は218
位またはその付近がタンパク質分解に耐性である類似体により増強するかもしれ
ない。本明細書に開示した本発明はそのような類似体を提供する。

【０００６】 ある態様において、本発明は、in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列
番号１の218位と219位間および／または配列番号3の247位と248位間がタンパク
質分解に耐性であるＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【０００７】 別の態様において、本発明は、in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列
番号１の218位と219位間および／または配列番号3の247位と248位間がタンパク
質分解に実質的に耐性であるＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【０００８】 別の態様において、本発明は、in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列
番号１の218位と219位間および／または配列番号3の247位と248位間がトリプシ
ン様プロテアーゼによるタンパク質分解に耐性であるＦＬＩＮＴ類似体に関する
。

【０００９】 別の態様において、本発明は、in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列
番号１の218位と219位間および／または配列番号3の247位と248位間がセリンプ
ロテアーゼ、例えばトリプシン、トロンビン、またはキモトリプシンによるタン
パク質分解に耐性であるＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【００１０】 別の態様において、本発明は、配列番号1および／または配列番号3と少なくと
も約80%同一、または少なくとも約90%同一、または少なくとも約95%同一、また
は少なくとも約96%同一、または少なくとも約97%同一、または少なくとも約98%
同一、またはさらに少なくとも約99%同一なポリペプチドを含む、配列番号１の2
18位と219位間および／または配列番号3の247位と248位間がトリプシン様プロテ
アーゼによるタンパク質分解に耐性であるＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【００１１】 別の態様において、本発明は、配列番号1の残基214〜222および／または配列
番号3の残基243〜251と少なくとも10%同一、または少なくとも20%同一、または
少なくとも30%同一、または少なくとも40%同一、または少なくとも50%同一、ま
たは少なくとも60%同一、または少なくと70%同一、または少なくとも80%同一、
またはさらに少なくとも約90%同一なポリペプチドを含む、配列番号１の218位と
219位間および／または配列番号3の247位と248位間がトリプシン様プロテアーゼ
によるタンパク質分解に耐性であるＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【００１２】 別の態様において、本発明は、配列番号1のアミノ酸214-222および／または配
列番号3のアミノ酸243-251を含む領域中に１またはそれ以上のアミノ酸の置換、
欠失、または付加を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【００１３】 別の態様において、本発明は、配列番号1のアミノ酸215-218および／または配
列番号3のアミノ酸243-251を含む領域中に１またはそれ以上のアミノ酸の置換、
欠失、または付加を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【００１４】 別の態様において、本発明は、配列番号1のアミノ酸214-222および／または配
列番号3のアミノ酸243-251を含む領域中に１またはそれ以上のアミノ酸の置換を
含むＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【００１５】 別の態様において、本発明は、下記からなる群から選ばれる、配列番号1のア
ミノ酸214〜222を含む領域にアミノ酸置換を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する： a. 215位のProがPro以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 b. 216位のThrがThr以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 c. 217位のProがPro以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 d. 218位のArgがArg以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 e. 219位のAlaがAla以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 f. 220位のGlyがGly以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 g. 221位のArgがArg以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 h. 222位のAlaがAla以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている。

【００１６】 別の態様において、本発明は、下記からなる群から選ばれる、配列番号1のア
ミノ酸214〜222を含む領域にアミノ酸置換を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する： a. 214位のGlyがGlyでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 b. 215位のProがProでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThrでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがProでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArgでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAlaでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGlyでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArgでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 i. 222位のAlaがAlaでない正に荷電したアミノ酸で置換されている。

【００１７】 別の態様において、本発明は、下記からなる群から選ばれる、配列番号1のア
ミノ酸214〜222を含む領域にアミノ酸置換を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する： a. 214位のGlyがGlyでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 b. 215位のProがProでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThrでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがProでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArgでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAlaでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGlyでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArgでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 i. 222位のAlaがAlaでない負に荷電したアミノ酸で置換されている。

【００１８】 別の態様において、本発明は、下記からなる群から選ばれる、配列番号1のア
ミノ酸214〜222を含む領域にアミノ酸置換を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する： a. 214位のGlyがGlyでない極性非荷電（polar uncharged)アミノ酸で置換されて
いる、 b. 215位のProがProでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThrでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがProでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArgでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAlaでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGlyでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArgでない極性非荷電アミノ酸で置換されている。 i. 222位のAlaがAlaでない極性非荷電アミノ酸で置換されている。

【００１９】 別の態様において、本発明は、下記からなる群から選ばれる、配列番号1のア
ミノ酸214〜222を含む領域にアミノ酸置換を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する： a. 214位のGlyがGlyでない非極性アミノ酸で置換されている、 b. 215位のProがProでない非極性アミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThrでない非極性アミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがProでない非極性アミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArgでない非極性アミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAlaでない非極性アミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGlyでない非極性アミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArgでない非極性アミノ酸で置換されている、 i. 222位のAlaがAlaでない非極性アミノ酸で置換されている。

【００２０】 別の態様において、本発明は、下記からなる群から選ばれる、配列番号1のア
ミノ酸214〜222を含む領域中にアミノ酸置換を含むＦＬＩＮＴ類似体： a. 218位のArgがGlnで置換されている、 b. 218位のArgがGluで置換されている、 c. 216位のThrがProで置換されている、 d. 218位のArgがAlaで置換されている、 e. 218位のArgがGlyで置換されている、 f. 218位のArgがSerで置換されている、 g. 218位のArgがValで置換されている、 h. 218位のArgがTyrで置換されている、 i. 217位のProがTyrで置換されている、 j. 216位のThrがProで置換され、218位のArgがGlnで置換されている。

【００２１】 別の態様において、本発明は、34位のArgがAsnで置換されており、36位のAsp
がThrで置換されており、218位のArgがGln、Glu、Ala、Gly、Ser、Val、またはT
yrで置換されている配列番号１を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【００２２】 別の態様において、本発明は、34位のArgがAsnで置換されており、36位のAsp
がThrで置換されており、194位のAspがAsnで置換されており、196位のSerがThr
で置換されており、218位のArgがGln、Glu、Ala、Gly、Ser、Val、またはTyrで
置換されている配列番号１を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する。

【００２３】 別の態様において、本発明は、34位のArgがAsnで置換されており、36位のAsp
がThrで置換されており、218位のArgが下記からなる群から選ばれるアミノ酸で
置換されている配列番号1中に１またはそれ以上のアミノ酸置換を含むＦＬＩＮ
Ｔ類似体に関する： a. Argでないあらゆる天然のアミノ酸、 b. Argでないあらゆる正に荷電したアミノ酸、 c. Argでないあらゆる負に荷電したアミノ酸、 d. Argでないあらゆる極性非荷電アミノ酸、 e. Argでないあらゆる非極性アミノ酸、および f. Glu、Gln、Ala、Gly、Ser、Val、またはTyrであるアミノ酸。

【００２４】 別の態様において、本発明は、34位のArgがAsnで置換されており、36位のAsp
がThrで置換されており、194位のAspがAsnで置換されており、196位のSerがThr
で置換されており、218位のArgが下記からなる群から選ばれるアミノ酸で置換さ
れている配列番号1内に１またはそれ以上のアミノ酸置換を含むＦＬＩＮＴ類似
体に関する： a. Argでないあらゆる天然のアミノ酸、 b. Argでないあらゆる正に荷電したアミノ酸、 c. Argでないあらゆる負に荷電したアミノ酸、 d. Argでないあらゆる極性非荷電アミノ酸、 e. Argでないあらゆる非極性アミノ酸、および f. Glu、Gln、Ala、Gly、Ser、Val、またはTyrであるアミノ酸。

【００２５】 別の態様において、本発明は、132位のSerがAsnで置換されており、218位のAr
gが下記からなる群から選ばれるアミノ酸で置換されている配列番号1内に１また
はそれ以上のアミノ酸置換を含むＦＬＩＮＴ類似体に関する： a. Argでないあらゆる天然のアミノ酸、 b. Argでないあらゆる正に荷電したアミノ酸、 c. Argでないあらゆる負に荷電したアミノ酸、 d. Argでないあらゆる極性非荷電アミノ酸、 e. Argでないあらゆる非極性アミノ酸、および f. Glu、Gln、Ala、Gly、Ser、Val、またはTyrであるアミノ酸。

【００２６】 別の態様は、本発明のプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体をコードする核酸に
関する。

【００２７】 別の態様において、本発明は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号2とハ
イブリダイズする核酸によりコードされるプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体に
関する。

【００２８】 別の態様において、本発明は高ストリンジェンシー条件下で配列番号2とハイ
ブリダイズする、プロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体をコードする核酸に関する
。

【００２９】 別の態様において、本発明は、プロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体をコードす
る核酸を含むベクターに関する。

【００３０】 別の態様において、本発明は、病気または病状を予防または治療する必要があ
る哺乳動物の病気または病状を予防または治療するためのプロテアーゼ耐性ＦＬ
ＩＮＴ類似体の治療的および臨床的使用に関する。

【００３１】 別の態様において、本発明は、急性肺傷害 (ALI)、急性呼吸困難症候群 (ARDS
)、潰瘍性大腸炎を予防または治療し、移植用の臓器保存を容易にするためのプ
ロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体の治療的および臨床的使用に関する。

【００３２】 別の態様において、本発明は、プロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体を含む医薬
組成物に関する。

【００３３】 別の態様において、本発明はＴリンパ球の活性化を阻害するためのＦＬＩＮＴ
類似体の使用に関する。

【００３４】 別の態様において、本発明は慢性閉塞性肺疾患(COPD)を予防または治療するた
めのＦＬＩＮＴ類似体の使用に関する。

【００３５】 別の態様において、本発明は肺繊維症(PF)を予防または治療するためのＦＬＩ
ＮＴ類似体の使用に関する。

【００３６】 別の態様において、本発明は、下記の配列番号1の214〜222位および／または2
14〜222位間の領域中のアミノ酸配列を変化させる工程を含む、配列番号１の218
位と219位間（あるいは配列番号3の247位と248位間）がトリプシン様プロテアー
ゼによるタンパク質分解に耐性であるプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体の製造
方法に関する。

【００３７】 （発明の詳細な説明） 配列番号1 - 成熟ヒトＦＬＩＮＴ、すなわち天然ＦＬＩＮＴからリーダー配列
を除いたもの。 配列番号2 - 成熟ヒトＦＬＩＮＴをコードする核酸/cDNA。 配列番号3 - 天然ヒトＦＬＩＮＴ。 配列番号4 - ヒトＦＬＩＮＴリーダー配列。 配列番号5 - オリゴヌクレオチドプライマーA, CF107。 配列番号6 - オリゴヌクレオチドプライマーB, CF111。 配列番号7 - オリゴヌクレオチドプライマーC, CF112。 配列番号8 - オリゴヌクレオチドプライマーD, CF110。 配列番号9 - 天然ヒトＦＬＩＮＴをコードする核酸/cDNA。

【００３８】 図1. 天然ＦＬＩＮＴおよびR218Q類似体のトロンビンによる開裂の時間的経過
。 図2. ＦＬＩＮＴ類似体R218Qは、Jurkat細胞におけるFasL誘発アポプトーシス
を阻害する。ＦＬＩＮＴ試料はAV12細胞から精製。 図3. 293 EBNA細胞から精製したＦＬＩＮＴ類似体R218QはJurkat細胞における
FasL誘発アポプトーシスを阻害する。 図4. ＦＬＩＮＴ類似体RDDSRはJurkat細胞におけるFasL誘発アポプトーシスを
阻害する。 図5. ¹²⁵I-ＦＬＩＮＴおよび¹²⁵I-ＦＬＩＮＴ (R218Q)とICRマウス血液をin v
itroでインキュベーション後の放射能のRP-HPLCプロフィール。試験物は37℃で
１時間インキュベートした。血清を作製し、RP-HPLCで分画した。データはカラ
ムに適用した分画当たりの放射能％で表した。 図6. ICRマウスにＦＬＩＮＴまたはＦＬＩＮＴ(R218Q)を静脈内投与後15分に
おける血漿中のＦＬＩＮＴの免疫応答性のRP-HPLCプロフィール。分画を回収し
、ELISAで分析した。データは動物の各個体から得た所見の代表値である。 図7. マウス急性肝不全（ALF）モデルにおけるＦＬＩＮＴおよびＦＬＩＮＴ類
似体の用量反応。

【００３９】 用語「類似体（アナログ）」または「ＦＬＩＮＴ類似体」は、好ましくはＦＬ
ＩＮＴと実質に同じ生物活性を有する、配列番号１の218位と219位（配列番号3
の247位と248位）間がタンパク質分解に耐性である変異体ＦＬＩＮＴまたはその
断片を表す。

【００４０】 用語「負に荷電した基」または「負に荷電したアミノ酸」はAspまたはGluを表
す。

【００４１】 用語「正に荷電した基」または「正に荷電したアミノ酸」はHis、Arg、または
Lysを表す。

【００４２】 用語「極性非荷電（の）（polar uncharged）」または「極性非荷電アミノ酸
」はCys、Thr、Ser、Gly、Asn、Gln、およびTyrを表す。

【００４３】 用語「非極性（の）」または「非極性アミノ酸」はAla、Pro、Met、Leu、Ile
、Val、Phe、またはTrpを表す。

【００４４】 用語「天然（の）アミノ酸」はタンパク質中に見出される20個のあらゆるＬ−
アミノ酸を表す。

【００４５】 用語「天然（の）ＦＬＩＮＴ」は配列番号3を表す。

【００４６】 用語「成熟ＦＬＩＮＴ」は配列番号1を表す。

【００４７】 用語「ＦＬＩＮＴ」は、ヒト、他の霊長類、および他の哺乳類、および非哺乳
類供給源由来の天然および成熟ＦＬＩＮＴを表す。

【００４８】 本明細書で用いている「半減期」は、あらゆる適切な方法で測定される、in v
itroおよび／またはin vivoにおいて試料中のほぼ半分のＦＬＩＮＴまたはＦＬ
ＩＮＴ類似体分子が配列番号１の218位と219位間がタンパク質分解により開裂す
るのに要する時間を表す。

【００４９】 用語「プロテアーゼ耐性」または「耐性」は、ＦＬＩＮＴまたはＦＬＩＮＴ断
片に比べて配列番号１の残基218と219間がタンパク質分解に対しより耐性である
ＦＬＩＮＴ類似体を表す。プロテアーゼ耐性類似体は、天然ＦＬＩＮＴもしくは
成熟ＦＬＩＮＴ、または他のＦＬＩＮＴ断片に比べてまたはそれらに対して１ま
たはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、逆転、付加、および／またはグリコシル
化部位またはパターンが変化することによりＦＬＩＮＴと異なる。これらの変化
は配列番号1の約214位〜222位の領域中に起きることが好ましい。

【００５０】 用語「プロテアーゼ耐性」は、完全な耐性から部分耐性までの218位のタンパ
ク質分解に対する耐性の程度も予期する。すなわち、「実質的に耐性な」類似体
は、ある程度の218位のタンパク質分解に対する耐性、適切なプロテアーゼを用
いて処理または曝露したときに例えば天然のＦＬＩＮＴより少なくとも約25%長
い半減期を有する類似体を示す。実質的に耐性なＦＬＩＮＴ類似体は天然のＦＬ
ＩＮＴより少なくとも約２倍長いプロテアーゼ耐性半減期を有することが好まし
い。

【００５１】 タンパク質分解に対する感受性は、関与する特定のタンパク質分解酵素の開裂
および／または認識部位またはその付近のアミノ酸配列のような因子、および検
討中の特定の類似体の物理的および化学的環境に依存するであろう。

【００５２】 トロンビンを含むセリンプロテアーゼの認識部位が検討されてきた。トロンビ
ンはLVPR/およびLVPR/関連部位、例えばVDPR/およびその他を含む複数の部位を
開裂させるであろう。酵素の活性部位に作用する電荷密度および立体特性は、タ
ンパク質分解が生じる程度を決定するであろう。すなわち、本発明は、配列番号
１の残基215〜218により定義したウインドー内に１またはそれ以上のアミノ酸の
置換、欠失、または付加を含むＦＬＩＮＴのプロテアーゼ耐性類似体を予期する
。そのような類似体は、当業者が既知の組換え技術を用いて容易に構築し、218
位のタンパク質分解に対する耐性をin vitroで試験することができる。すべての
そのような態様は本発明の範囲内であると解釈される。

【００５３】 本明細書において予期されるプロテアーゼ耐性とは、in vivoまたはin vitro
において218位のタンパク質分解に対するＦＬＩＮＴ類似体の感受性をいう。例
えば、トリプシン様プロテアーゼ、例えば、トロンビンもしくはトリプシン、ま
たは他のセリンプロテアーゼに対する類似体の耐性を、同じ条件下でＦＬＩＮＴ
が示す耐性と比較する。より小さい消化生成物（例えば配列番号１の断片1-218
および219-271）に対する完全長分子の相対量で測定したＦＬＩＮＴ類似体の半
減期がＦＬＩＮＴより少なくとも5%長いか、または野生型ＦＬＩＮＴより少なく
とも10%、20%、30%、40%、または50%〜100%長いことが好ましい。該相対量の定
性的および／または定量的評価を行うのに適したあらゆる方法、例えばポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いることができる。耐性類似体はＦＬＩＮＴより約
１〜２倍からＦＬＩＮＴより約100倍またはそれ以上長い半減期を有することが
最も好ましい。

【００５４】 「その断片」とは、断片が親タンパク質または核酸分子中の隣接する５または
それ以上のアミノ酸、または１０またはそれ以上のヌクレオチドを含むようなＦ
ＬＩＮＴ核酸もしくはタンパク質分子、または本発明類似体の断片、一部、また
は小領域をいう。

【００５５】 用語「融合タンパク質」は、２またはそれ以上の異なるタンパク質またはその
断片がポリペプチド１本鎖上で共有結合している翻訳的融合または酵素的融合を
含む天然にはみられないハイブリッドタンパク質分子を表す。

【００５６】 本明細書で用いている「機能的断片」または「機能的に等価な断片」とは、in
vivoおよび／またはin vitroにおいて本発明の完全長タンパク質と実質的に同
様の生物活性（すなわち、アポプトーシスを阻害する能力）をもたらすことがで
きる本発明の完全長タンパク質の領域または断片をいう。機能的断片はクローニ
ング技術によるか、または相互スプライシングメカニズムの天然の生成物として
生成することができよう。

【００５７】 「宿主細胞」とは、例えば形質転換またはトランスフェクションなどにより該
宿主細胞内に導入されるベクターに含まれるクローンされた遺伝子または核酸を
増殖および／または発現させるのに適したあらゆる真核細胞または原核細胞をい
う。

【００５８】 本明細書で用いている用語「ハイブリダイゼーション」は、１本鎖核酸分子が
ヌクレオチドの塩基対化により相補鎖と結合する過程を表す。「選択的ハイブリ
ダイゼーション」とは、高ストリンジェンシー条件下におけるハイブリダイゼー
ションをいう。ハイブリダイゼーションの程度は、相同性の程度、ハイブリダイ
ゼーションのストリンジェンシー、およびハイブリダイズする鎖の長さに依存す
る。

【００５９】 「単離された核酸化合物」とは、天然の位置と位置的に異なる、構築または合
成されたあらゆるRNAまたはDNA配列をいう。

【００６０】 用語「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション条件を表す。高スト
リンジェンシー条件は、ホモローガスでない塩基対化を退ける。低ストリンジェ
ンシー条件は反対の効果を有する。ストリンジェンシーは、例えば温度および塩
濃度により変化させることができよう。

【００６１】 「低ストリンジェンシー」条件には、例えば、約37℃またはそれ以下の温度、
約50%以下のホルムアミド濃度、および中等度〜低塩(SSC）濃度、または約50℃
またはそれ以下の温度、および中等度〜高塩(SSPE)濃度、例えば1M NaClが含ま
れる。

【００６２】 「高ストリンジェンシー条件」は当業者によく知られており、例えば約42℃ま
たはそれ以下の温度、約20%以下のホルムアミド濃度、および低塩（SSC)濃度、
または約65℃またはそれ以下の温度、および低塩（SSPE)濃度を含むことができ
る。例えば、高ストリンジェンシー条件には、0.5M NaHP0₄、7%ドデシル硫酸ナ
トリウム(SDS)、1mM EDTA中、65℃でのハイブリダイゼーションが含まれる(例え
ば、Ausubel, F. M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I
, 1989; Green Inc. New York、2.10.3参照)。

【００６３】 「SSC」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液を含む。ストック20X SSC
溶液は、3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム（pH7.0）を含む。

【００６４】 「SSPE」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液を含む。1X SSPE溶液は
、180mM NaCl、9mM Na₂HP0₄、0.9mM NaH₂PO₄、および1mM EDTA（pH7.4）を含む
。

【００６５】 ペプチドまたはタンパク質について用いている「実質的に純粋（な）」とは、
該ペプチドまたはタンパク質が他のタンパク質分子を含む全ての他の細胞性およ
び非細胞性分子の大分画から分離されることを意味する。実質的に純粋な調製物
は、約少なくとも85%純粋、好ましくは約少なくとも95%純粋であろう。例えば、
本明細書に記載の「実質的に純粋な」タンパク質は、IMACタンパク質生成方法に
より製造することができるかもしれない。

【００６６】 本明細書で用いている用語「ベクター」は、宿主細胞内に外来性もしくは内在
性DNAを導入するのに用いる核酸化合物を表す。ベクターは１またはそれ以上の
タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を含む。天然の状態または組換え
操作を受けたプラスミド、コスミッド、ウイルス、およびバクテリオファージが
通常用いるベクターの例である。

【００６７】 本明細書で用いているヌクレオチドおよびアミノ酸の略号は、当該分野および
米国特許商標庁（37 C. F. R. 1.822(b)(2)に記載）で認められたものである。 ＦＬＩＮＴおよびＦＬＩＮＴ類似体の配列番号1（成熟ＦＬＩＮＴ）の218位と
219位間のタンパク質分解に関する本明細書の記載は、247位と248位間に類似の
領域がある配列番号3（リーダーを含む天然ＦＬＩＮＴ）にも関連すると解釈す
る。

【００６８】 出願人は、ＦＬＩＮＴポリペプチドが、in vivoにおいておそらくトリプシン
様プロテアーゼにより配列番号1の218位のアルギニン残基と219位のアラニン残
基の間で開裂することを発見した。この反応の開裂生成物は、「ＦＬＩＮＴ代謝
産物」と名付けた配列番号１の残基1-218を含む。ＦＬＩＮＴ代謝産物は、in vi
troでＦＬＩＮＴポリペプチドをトリプシン様プロテアーゼ、例えばトロンビン
、トリプシン、または他のセリンプロテアーゼで処理することにより生成するこ
とができる。

【００６９】 本発明のある態様は、配列番号１の218位と219位間のタンパク質分解に耐性な
、生物活性を保持するＦＬＩＮＴポリペプチド類似体の製造方法に関する。生物
活性は、類似体のFasLおよび／またはLIGHTと結合する能力に関連し、in vivoお
よび／またはin vitroにおけるアポプトーシスの阻害を含んでいてよい。

【００７０】 本発明の別の態様は、配列番号１の218位と219位間のタンパク質分解に耐性な
、生物活性を保持するＦＬＩＮＴポリペプチド類似体に関する。生物活性は、類
似体のFasLおよび／またはLIGHTと結合する能力に関連し、in vivoおよび／また
はin vitroにおけるアポプトーシスの阻害を含んでいてよい。

【００７１】 好ましいＦＬＩＮＴ類似体は、ＦＬＩＮＴ代謝産物およびカルボキシル断片（
すなわち、配列番号１の残基219-271）を含む消化産物に対する完全長ＦＬＩＮ
Ｔの経時的比によって決定した半減期がＦＬＩＮＴより少なくとも5%、10%、20%
、30%、40%、または50%〜100%長く、最も好ましくはＦＬＩＮＴ類似体はＦＬＩ
ＮＴより少なくとも２倍〜100倍またはそれ以上の半減期を有する。

【００７２】 ＦＬＩＮＴ類似体は、配列番号１の218位と219位間のタンパク質分解を予防（
防止）し、そして／またはその速度を減少させる１またはそれ以上の一次または
二次構造変化、例えばアミノ酸の置換、欠失、逆転、付加、もしくはグリコシル
化部位またはパターンの変化、および／またはその組合せを含む。好ましくは、
これら変化は、ＦＬＩＮＴの場合はトロンビン様認識配列またはその付近（PTPR
）、最も好ましくは配列番号１の217位および218位のPRジペプチド配列またはそ
の付近に生じる。当業者が理解するように、認識部位またはその付近の残基も活
性部位の荷電環境を変化させ、そして／または活性部位領域中に立体障害による
変化を生じることにより基質タンパク質のタンパク質分解に対する感受性に影響
を及ぼすことができる。 したがって、本発明は、ＦＬＩＮＴ、好ましくは配列番号１の約214位〜222位
の領域もしくは配列番号3の類似領域にアミノ酸変化を含む、配列番号１の218位
がタンパク質分解に耐性なＦＬＩＮＴ類似体を予期する。

【００７３】 本発明は、配列番号１の残基214〜222を含む好ましいウインドーの外側に生じ
る置換、欠失、挿入、逆転、付加、またはグリコシル化部位もしくはパターンの
変化を含むプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体も予期する。当業者が理解する様
に、多くの置換および／またはタンパク質の配列または構造の他の変化は、該タ
ンパク質の生物活性に実質的な影響を及ぼすことなく行うことができる。例えば
、保存的（conservative)アミノ酸置換、またはあるアミノ酸を同じクラスのア
ミノ酸、例えば負に荷電した残基、正に荷電した残基、極性非荷電残基、および
非極性残基、もしくは当該分野で許容される他のあらゆる分類の別のアミノ酸へ
の変化は、機能に影響しないことが多い。そのような変化は本発明の範囲内であ
ると解釈する。

【００７４】 ある態様において、１個のアミノ酸の変化がこの領域内で行われるか、少なく
とも２つの変化がこの領域内で行われるか、少なくとも３つの変化がこの領域内
で行われるか、または少なくとも４つの変化がこの領域内で行われる。

【００７５】 ある態様において、本発明は、配列番号１、配列番号２、および／または配列
番号３に対する同一性類似率（percent identity similarity)により定義したＦ
ＬＩＮＴ類似体ポリペプチドおよび核酸に関する。配列の同一性とは、当該分野
でよく知られた標準的アルゴリズムを用いて２つの分子を比較することをいう。
この目的にはあらゆる適切な配列比較アルゴリズムを用いることができるが、例
示するためにこの態様を、コンパレーター（comparator)配列に対する同一パー
セントを定義するための基準配列に配列番号１を用い、よく知られたSmith-Wate
rmanアルゴリズムを参照して説明する。配列の同一性をポリペプチドに関連して
用いる場合は、完全なポリペプチドまたはその定義された小領域を比較に用いて
よい。

【００７６】 マッチ、ミスマッチ、および挿入もしくは欠失のパラメータ値の選択は任意で
ある。Smith-Watermanアルゴリズムとともに用いる好ましい値は、「最大類似部
分」アプローチに記載されている（マッチ残基については１の値を、ミスマッチ
残基については-1/3の値を用いる）。（Waterman, Bulletin of Mathematical B
iology, 46,473-500,1984参照)。 挿入および欠失（indels）、ｘは以下のごと
く計る： X_k = 1 + k/3 ［ここで、ｋは示した挿入または欠失中の残基の番号である。］。 例えば、250残基の参照タンパク質に比べて20個の置換と３個の挿入を有する
コンパレーター配列の同一性は、[(1x250)-(1/3x20)-(1+3/3)]/250 = 96%同一で
ある。

【００７７】 本発明のＦＬＩＮＴ類似体は、本明細書に記載のごとく容易に生物活性および
／またはタンパク質分解に対する感受性を試験することができる。例えば、実施
例11および12参照。生物活性は本明細書に記載のin vitro（実施例6参照）また
はin vivo（実施例9参照）モデルのいずれかを用いて評価することができる。

【００７８】 ＦＬＩＮＴ類似体はFasLおよび／またはLIGHTを結合する活性がある。TNFファ
ミリーのメンバーであるLIGHTは別の生物反応を引き起こす膜結合リガンドであ
る。LIGHTは免疫調節（modulation）に役割を果たし、ヘルペスウイルスの侵入
（entry）に関与するようである(Zhai et al., J. Clin. Invest. 102,1142-115
1,1998; Montgomery et al. Cell, 87, 427-436,1996参照)。可溶性LIGHTは種々
の腫瘍細胞の増殖を阻害し、レセプターLTβRおよびTR2（ヘルペスウイルス侵入
メディエーター、HVEMともいう）と結合するようである。LIGHTは活性化リンパ
球中に高度に発現され、造血細胞由来の免疫調節を生じる。例えば、LIGHTはIFN
γの分泌を誘導する。LIGHTはLTβRおよびTR2／HVEMレセプターを発現する腫瘍
細胞のアポプトーシスも誘導する。IFNγにより増強されたLIGHTの細胞毒性効果
は、可溶性LTβR-FcまたはTR2／HVEM-Fcを加えることによりブロックすることが
できる。

【００７９】 さらに本発明は、LIGHTと結合することによりＴ細胞の活性化を阻害するＦＬ
ＩＮＴ類似体の使用に関する。好都合には、例えば臓器移植後の拒絶の予防、自
己免疫疾患の治療、および全身性炎症反応の治療においてＴ細胞の活性化を慢性
的に抑制することができる。 LIGHTは主として活性化Ｔ細胞により産生される。LIGHTはＴ細胞表面上のHVEM
と結合し、Ｔ細胞の増殖を促す(J. A. Harrop et al. J. Biol. Chem. 273, 275
48-27556,1998)。

【００８０】 本発明のＦＬＩＮＴ類似体は組換え技術または直接化学合成により製造するこ
とができる。該類似体は、当業者によく知られた組換えDNA突然変異技術により
製造してもよい。例えば、K. Struhl,「Reverse biochemistry: Methods and ap
plications for synthesizing yeast proteins in vitro」, Meth. Enzymol. 19
4, 520-535参照。好ましい組換え法において、部位指向性突然変異を用いて配列
番号１の領域214-222または配列番号3の類似領域内に定義した変化を導入する。

【００８１】 ＦＬＩＮＴ類似体には、１またはそれ以上のポリエチレングリコール基（以降
「PEG」基という）がアミノ酸側鎖のＮ末端、またはアミン基もしくはチオール
基と結合している該アナログの修飾された誘導体も含まれる。一般に適切なPEG
基は、約5000〜20,000原子質量単位の分子量を有する。PEG化（PEGylated）ポリ
ペプチドの製造方法は、Mumtaz and Bachhawat, Indian Journal of Biochemist
ry and Biophysics 28: 346 (1991)、およびFrancis et al., International Jo
urnal of Hematology 68: 1 (1998)に開示されている（この内容は本明細書の一
部を構成する）。

【００８２】 ＦＬＩＮＴ類似体のさらに別の態様は、２またはそれ以上の修飾された、また
は非修飾ＦＬＩＮＴ類似体、例えば二量体化ＦＬＩＮＴ類似体、例えばR218Qを
含む分子である。２つの同一な類似体サブユニットを含むホモ二量体（例えばR2
18Q (2))、および２つの同一でない類似体サブユニットを含むヘテロ二量体（例
えば、R218Q/R34N、D36T、D194N、S196T、R218Q)が予期される。二量体化はEspa
t et al., Journal of Surgical Research 59: 153 (1995)に記載のPEGポリマー
鎖法、またはO'Shea et al., Science 254: 539 (1991)に記載の二量体化、例え
ばロイシンジッパーを誘導するドメインとのＣ末端融合により達成することがで
きる。EspatおよびO'Sheaの全技術は本明細書の一部を構成する。

【００８３】 本発明の別の態様は、ＦＬＩＮＴ類似体を含む融合タンパク質に関する。「融
合タンパク質」は、２またはそれ以上の異なるタンパク質またはその断片が一本
鎖ポリペプチド上で共有結合している翻訳的融合もしくは酵素的融合を含む天然
にはみられないハイブリッドタンパク質分子を表す。ヒト血清アルブミンおよび
トロンボポイエチンのＣ末端ドメインはＦＬＩＮＴ類似体と融合し得たタンパク
質の例である。融合タンパク質の製造方法は、EP394,827、Tranecker et al.、N
ature 331: 84 (1988)、およびFares, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89
: 4304 (1192)に開示されている（この内容は本明細書の一部を構成する）。

【００８４】 ＦＬＩＮＴ類似体融合タンパク質は、ペプチド結合により一緒に融合した２つ
のタンパク質断片を含む。第一のタンパク質断片は、本発明類似体の少なくとも
6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、75、100、125、150、175、
200、225、250、または275隣接アミノ酸残基からなる（すなわち、プロテアーゼ
耐性配列番号1または配列番号3)。あるいはまた、第一タンパク質は、本発明の
完全長類似体であり得、またはＮ末端またはＣ末端であり得る。

【００８５】 ＦＬＩＮＴ類似体融合タンパク質の第二タンパク質は、完全長タンパク質また
はタンパク質断片であり得る。融合タンパク質に通常用いるタンパク質には、Ｂ
−ガラクトシダーゼ、Ｂ−グルクロニダーゼ、緑蛍光タンパク質（GEP）、トロ
ンボポイエチン(TPO)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ルシフェラ
ーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、およびクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（CAT）が含まれる。ヒスチジン(His）タグ、FLAGタグ
、インフルエンザヘマグルチニン（HA）タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオ
レドキシン(thioredoxin）タグを含むエピトープタグ（tag）を、融合タンパク
質の構築に用いることができる。他の融合構築物には、マルトース結合タンパク
質、Ｓ−タグ、Lex A DNA結合ドメイン、GAL4 DNA結合ドメイン融合物、および
ヘルペスシンプレックスウイルスBP16タンパク質融合物を含むことができる。

【００８６】 本発明のＦＬＩＮＴ類似体はグリコシル化されるか、またはグリコシル化され
ていないことがある。グリコシル化ポリペプチドは１またはそれ以上の単糖類ま
たはオリゴ糖類で修飾される。単糖は、典型的にはヘミアセタール形で存在する
キラルポリヒドロキシアルカノールまたはポリヒドロキシアルカノンである。「
オリゴ糖」は通常アセタール結合で結合した約２〜約10個の単糖のポリマーであ
る。通常グリコシル化タンパク質中にみられるグリコシル基の１つはＮ−アセチ
ルノイラミン酸である。グリコシル化ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化および
／またはＯ−グリコシル化、好ましくはＮ−グリコシル化され得る。

【００８７】 用語「Ｎ−グリコシル化ポリペプチド」は、アスパラギンの側鎖アミド中の窒
素原子がグリコシル基と共有結合している１またはそれ以上のNXS/Tモチーフを
有するポリペプチドを表す。「Ｘ」は、プロリン以外のあらゆる天然のアミノ酸
残基を表す。「天然のアミノ酸」は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、リジ
ン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、
フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、およびトリプトファンである。Ｎ−
グリコシル化タンパク質は所望によりＯ−グリコシル化される。

【００８８】 用語「Ｏ−グリコシル化ポリペプチド」は、側鎖中の酸素原子がグリコシル基
と共有結合している１またはそれ以上のセリンおよび／またはトレオニンを有す
るポリペプチドを表す。Ｎ−グリコシル化タンパク質は所望によりＯ−グリコシ
ル化される。 本発明のグリコシル化ポリペプチドおよび類似体は、適切な哺乳類宿主細胞中
でポリペプチドをコードする遺伝子を発現させ、ポリペプチド表面の利用しやす
いNXT/Sモチーフにみられる側鎖アミド、および表面の利用しやすいセリンおよ
びトレオニンの側鎖アルコールのグリコシル化を生じることにより組換え的に製
造することができる。哺乳動物細胞中で遺伝子を組換え的に発現させる具体的方
法を下記に示す。グリコシル化タンパク質の他の製造方法はElliotとBurnのEP 6
40,619に開示されている（この内容は本明細書の一部を構成する）。グリコシル
化されていないポリペプチドは、適切な原核宿主細胞中でポリペプチドをコード
する遺伝子を発現させることにより組換え的に製造することができる。

【００８９】 本発明は、本発明のＦＬＩＮＴ類似体をコードする核酸、例えばcDNA、DNA、
またはRNAおよび該核酸を含むベクターにも関する。当業者は、該核酸はＦＬＩ
ＮＴをコードする核酸鋳型を突然変異させる、例えば本発明のプロテアーゼ耐性
または実質的にプロテアーゼ耐性類似体を製造するための当業者に知られた種々
の適切な突然変異技術を用いてＦＬＩＮＴをコードするcDNA中に適切な点突然変
異を導入することにより合成的に製造することができる。あるいはまた、該核酸
は遺伝子コード、および興味が持たれる配列番号１または配列番号３の特定の類
似体の知識に基づいてde novoで合成的に製造することができる。コドンの選択
は適切な核酸を設計する時に考慮してよい。

【００９０】 例えば、配列番号１の218位もしくはその付近、またはＦＬＩＮＴ配列の他の
場所における欠失、置換、および／または付加を含む本発明類似体のアミノ酸配
列は、本願の他の箇所に記載されている。当業者は、好ましいコドンの使用の知
識と組み合わせて遺伝子コードを用いることが説明に最適であり、所望のあらゆ
る特定の類似体をコードする種々の核酸を構築することができることを理解して
いる。例えば、天然ＦＬＩＮＴにおいて配列番号１の218位のアルギニンをコー
ドするコドンは「agg」である。本発明類似体のあるものはこの位置のアルギニ
ンがグルタミンに変化しているが、これはコドンを「agg」から「caa」または「
cag」に変化させることにより達成することができる。あらゆる特定のアミノ酸
に用いるコドンの選択は、好ましいコドン使用の知識に基づきそして／またはト
ライアル・アンド・エラーで類似体の発現を検討することによってよい。本発明
により予測される他の類似体は同様にして説明することができ、可能である。

【００９１】 ＦＬＩＮＴ cDNAは、常套的技術を用い、RT-PCRにより合成することができる
。例えば、ポリＡ RNAは標準的方法を用い、ＦＬＩＮＴ遺伝子を発現することが
知られている組織（例えば、ヒト肺）から製造される。第一鎖のＦＬＩＮＴ cDN
A合成はＦＬＩＮＴ配列誘導「下流（down stream)」プライマーを用いる逆転写
酵素反応により達成される。Perkin ElmerによるGENEAMPのような市販のキット
を用いてよい。次のPCRにおいて、ＦＬＩＮＴ特異的フォワード（前向き）およ
びリバース（逆向き）プライマーを用いてcDNAを増幅する。増幅された試料をア
ガロースゲル電気泳動で分析し、増幅された断片の長さを調べることができよう
。

【００９２】 このようにして生成したＦＬＩＮＴ cDNAを鋳型に用いて適切な点突然変異を
導入する（すなわち、ＦＬＩＮＴ類似体cDNAの構築）。適切なプロトコールは「
Current Protocols in Molecular Biology」、1巻、8.5.7項 (John Wiley and S
ons, Inc.出版社)に詳細に記載されている（この内容は本明細書の一部を構成す
る）。簡単には、合成オリゴヌクレオチドを、増幅された断片の１末端、例えば
配列番号１の218位に１またはそれ以上の点突然変異を組み込む様に設計する。
第一鎖PCR後、突然変異を含む増幅された断片を互いにアニールし、相互プライ
ム（mutually primed)合成により延長させる。アニーリングに次いで、完全突然
変異断片を増幅させ、５’フォワードおよび３’リバース末端プライマーを用い
る第二PCR工程を行うことにより適切なベクターにサブクローンする準備ができ
る。

【００９３】 当業者は、遺伝子コードの縮重が場合により示したアミノ酸に複数のコドンを
与えることを理解している。すべてのそのような核酸配列変異体は本発明の範囲
内にあるものと解釈する。

【００９４】 本明細書に記載の情報、例えば配列番号１もしくは配列番号３のアミノ酸配列
、または配列番号２のヌクレオチド配列もしくはその変異体を用い、よく知られ
た方法を用いてＦＬＩＮＴ類似体をコードする本発明核酸分子を得ることができ
る。

【００９５】 本発明の核酸分子は、例えばmRNA、hnRNAの形もしくは他のあらゆる形のRNAの
形、または限定されるものではないがクローニングにより得られるかもしくは合
成的に製造されるcDNAおよびゲノムDNAまたはそのあらゆる組合せを含むDNAの形
であり得る。DNAは、３本鎖、２本鎖、もしくは１本鎖、またはそのあらゆる組
合せであり得る。DNAまたはRNAの少なくとも１つの鎖のあらゆる部分が、センス
鎖としても知られるコーディング鎖であり得るか、またはアンチセンス鎖とも呼
ばれる非コーディング鎖である得る。

【００９６】 さらに本発明は、プロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体をコードし、選択的条件
下で本明細書に記載のおよび／または予期されるポリヌクレオチド、例えば配列
番号２および／またはその誘導体とハイブリダイズする単離された核酸を提供す
る。

【００９７】 さらに本発明は、本発明のポリヌクレオチドと相補的なＦＬＩＮＴ類似体ポリ
ヌクレオチドを含む単離された核酸を提供する。相補配列は、その長さ全体を通
してそのようなポリヌクレオチドと塩基対化する（すなわち、その完全長にわた
り100%の配列同一性を有する）。相補塩基は水素結合により結合し二本鎖の核酸
となる。例えば、以下の塩基対が相補的である：グアニンとシトシン、アデニン
とチミン、およびアデニンとウラシル。（例えば、Ausubel、前述、またはSambr
ook、前述参照。)

【００９８】 核酸の構築 本発明の単離された核酸は、当該分野でよく知られた(a)標準的組換え法、(b)
合成技術、(c)精製技術、またはその組合せを用いて製造することができる。 核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて好都合に配列を含んでいてよい。
例えば、ポリヌクレオチドの単離を助けるために、１またはそれ以上のエンドヌ
クレアーゼ制限部位を含む複数のクローニング部位を核酸内に挿入してよい。例
えば、ヘキサ−ヒスチジンマーカー配列は、本発明タンパク質の好都合な精製手
段を提供する。

【００９９】 組換え核酸構築法 本発明の単離された核酸組成物、例えば、RNA、cDNA、ゲノミックDNA、または
そのハイブリッドは、当業者に知られた多くのクローニング方法論を用いて生物
学的供給源から得ることができる。ある態様において、ストリンジェント条件下
で本発明のポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
プローブを用いてcDNAまたはゲノミックDNAライブラリー中の所望の配列を同定
する。RNAの単離とcDNAおよびゲノミックライブラリーの構築は当業者によく知
られている（例えば、Ausubel、前述、またはSambrook、前述参照。)

【０１００】 核酸のスクリーニングおよび単離法 cDNAまたはゲノミックライブラリーは、本明細書に開示しているような本発明
のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを用いてスクリーニングすることが
できる。プローブを用いてゲノミックDNAまたはcDNA配列とハイブリダイズさせ
ることにより同じまたは異なる生物中のホモローガスな遺伝子を単離することが
できよう。当業者は、ハイブリダイゼーションの種々の程度のストリンジェンシ
ーをこのアッセイに用いることができ、ハイブリダイゼーション媒質または洗浄
媒質のいずれかがストリンジェントであり得ることを理解するであろう。ハイブ
リダイゼーションの条件はよりストリンジェントになるので、二本鎖の形成が起
きるにはプローブと標的の相補性の程度がより大きくなければならない。ストリ
ンジェントの程度は温度、イオン強度、ｐＨ、およびホルムアミドのような部分
的に変性させる溶媒の存在により調節することができる。例えば、ハイブリダイ
ゼーションのストリンジェンシーは、反応体溶液の極性を変化、例えばホルムア
ミド濃度を0%〜50%の範囲内で操作することにより好都合に変化させる。結合を
検出するのに必要な相補性の程度（配列同一性）は、ハイブリダイゼーション媒
質および／または洗浄媒質のストリンジェンシーに従って変化するであろう。相
補性の程度は100%が最適であるが、プローブおよびプライマーの小さな配列変動
はハイブリダイゼーション媒質および／または洗浄媒質のストリンジェンシーを
低下させることにより相殺することができよう。

【０１０１】 RNAまたはDNAの増幅方法は当該分野でよく知られており、本明細書の開示およ
び手引きに基づいて過度な実験を行うことなく本発明に従って用いることができ
る。 既知のDNAまたはRNA増幅法には、限定されるものでないが、ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR）および関連増幅法（例えば、Mullisらの米国特許第4,683,195、4,683
,202、4,800,159、4,965,188号、Taborらの同第4,795,699および4,921,794号、I
nnisらの同第5,142,033号、Wilsonらの同第5,122,464号、Innisらの同第5,091,3
10号、Gyllenstenらの同第5,066,584号、Gelfandらの同第4,889,818号、Silver
らの同第4,994,370号、Biswasの同第4,766,067号、Ringoldの同第4,656,134号)
、ならびに二本鎖DNA合成の鋳型として標的配列に対するアンチセンスRNAを用い
るRNA介在増幅法が含まれる（Malekらの米国特許第5,130,238号、業者名NASBA)
（これらの内容は本明細書の一部を構成する (例えば、Ausubel、前述、またはS
ambrook、前述)。

【０１０２】 例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて本発明のポリヌクレオチド
およびゲノミックDNA、cDNAライブラリー、またはクローン化DNAもしくはRNAか
ら直接得られる関連遺伝子の配列を増幅することができる。PCRおよび他のin vi
tro増幅法は、例えば、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン
し、試料中の所望のmRNAの存在を検出するためのプローブとして用いる核酸を製
造し、核酸をシーケンシングするか、または他の目的にも有用かも知れない。in
vitro増幅法を通して当業者を指導するに十分な技術の例は、Berger、Sambrook
、およびAusubel、ならびにMullis, et al.の米国特許第4,683,202号 (1987)、I
nnis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., A
cademic Press Inc., San Diego, CA (1990)に記載されている。ゲノミックPCR
増幅用の市販キットは当該分野で知られている。例えば、Advantage-GC Genomic
PCR Kit (Clontech)参照。T4遺伝子32タンパク質(Boehringer Mannheim)を用い
て長いPCR生成物の収率を改善することができる。

【０１０３】 合成による核酸構築法 本発明の単離された核酸は、Narang, et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99 (19
79)のホスホトリエステル法、Brown, et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (19
79)のホスホジエステル法、Beaucage, et al., Tetra. Letts. 22: 1859-1862 (
1981)のジエチルホスホルアミダイト法、例えば、Needham-VanDevanter, et al.
, Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984)に記載の自動化合成装置を用いる
ようなBeaucage and Caruthers, Tetra. Letts. 22 (20): 1859-1862 (1981)に
記載の固相ホスホルアミダイトトリエステル法、および米国特許第4,458,066号
の固体支持法のような方法による直接化学合成により製造することもできる。一
般に、化学合成法は一本鎖オリゴヌクレオチドを生じ、これを、一本鎖を鋳型に
用いる相補配列とのハイブリダイゼーションによるか、DNAポリメラーゼによる
重合化により二本鎖DNAに変換することができよう。DNAの化学合成法は約100塩
基またはそれ以上の配列に限定してもよいが、より短い配列の連結によってより
長い配列を得てよいことを当業者は認識するであろう。

【０１０４】 本発明は、当該分野でよく知られた、本発明の単離された核酸分子を含むベク
ター、一般に組換えベクターを用いて操作される宿主細胞、およびＦＬＩＮＴ類
似体の製造にも関する。(例えば、Sambrook, et al., 1989; Ausubel, et al.,
1987-1998、この内容は本明細書の一部を構成する。）

【０１０５】 「ベクター」とは、宿主細胞中に外来性または内在性核酸を導入するために用
いる核酸化合物をいう。ベクターはＦＬＩＮＴ類似体またはその融合タンパク質
をコードするポリデオキシヌクレオチド配列を含む。天然の状態もしくは組換え
操作を受けたプラスミド、コスミッド、ウイルス、およびバクテリオファージは
、限定されるものではないが、少なくとも１つの所望の単離された核酸分子を含
む組換えベクターをもたらす通常用いられるベクターの例である。

【０１０６】 「宿主細胞」とは、当該分野で知られたあらゆる適切な手段（例えば形質転換
またはトランスフェクションなど）により宿主細胞中に導入されるか、または内
在性ポリデオキシ核酸を発現するために誘導される単離された核酸を増殖および
／または発現させるのに適したあらゆる真核細胞、原核細胞、または他の細胞、
または偽（pseudo）細胞、または膜含有構築物をいう。該細胞は、培養中で単離
された、またはあらゆる他の適切な形の組織もしくは生物の部分であり得る。 cDNAを含む本発明の核酸は、所望により宿主中で増殖するための選択可能なマ
ーカーを含むベクターと結合することができる。一般に、プラスミドベクターは
、沈殿物、例えば、リン酸カルシウム沈殿物中、または荷電脂質（例えば、リポ
フェクタミン）との複合体中に導入される。ベクターがウイルスである場合は、
適切なパッケージング細胞系を用いてin vitroでパーゲージし、次いで宿主細胞
中に形質導入することができる。

【０１０７】 DNA挿入物は、適切なプロモーター、例えばファージλ PLプロモーター、ファ
ージT7プロモーター、E.coli lac、trp、およびtacプロモーター、SV40初期およ
び後期プロモーター、およびレトロウイルスLTRのプロモーター、またはあらゆ
る他の適切なプロモーターと機能性に連結してよい。他の適切なプロモーターは
当業者に知られているであろう。発現構築物は、さらに転写の開始部位、終止部
位と、転写された領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含むであろう。該
構築物により発現した成熟転写物のコーディング部分は、始めに翻訳開始コドン
、および翻訳すべきmRNAの末端に適切に位置する終止コドン（例えば、UAA、UGA
、またはUAG）を含むことが好ましく、哺乳動物または真核細胞での発現にはUGA
およびUAAが好ましい。

【０１０８】 発現ベクターは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことが好ましい。
そのようなマーカーには、例えば、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸還元酵素、ネ
オマイシン、ゼオシン、ヒグロマシンＢ、またはプロマイシン耐性、E.coliおよ
び他の細菌もしくは原核生物を用いて培養するにはカナマイシンもしくはアンピ
シリン耐性遺伝子が含まれる。適切な宿主の代表例には、限定されるものではな
いが、細菌細胞、例えばE.coli、Streptomyces、Bacullus subtilis,およびSalm
onella typhimurium細胞; 酵母細胞、例えばSaccharomyces cervisiae、Sacchar
omyces pombe、またはPichia pastoris; 昆虫細胞、例えばDrosophila S2、Spod
optera Sf9細胞、もしくはSf21およびHigh Five (BTI-TN-5B1-4)細胞; 動物細胞
、例えば293、293EBNA、CHO、COS、およびCOS7、BHK、AV12、3T3、HeLa、および
Bowesメラノーマ細胞; ならびに植物細胞が含まれる。上記宿主細胞のための適
切な培養液および条件は当該分野で知られている。細菌に用いるのに好ましいベ
クターには、Novagenから入手可能なpET15およびpET30、Qiagenから入手可能なp
QE70、pQE60、およびpQE-9、Stratageneから入手可能なpBSベクター、Phagescri
ptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、およびPha
rmaciaから入手可能なptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5が含まれる
。好ましい原核性ベクターには、Stratageneから入手可能なpWLNEO、pSV2CAT、p
OG44、pXT1、およびpSG、Pharmaciaから入手可能なpSVK3、pBPV、pMSG、およびp
SVL、ならびにInvitrogenから入手可能な通常用いられるベクターpcDNA3.1が含
まれる。他の適切なベクターは当業者に容易く解るであろう。

【０１０９】 宿主細胞内へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、DEAE-デキストラン介在トランスフェクション、カチオン性脂質介在トラ
ンスフェクション、エレクトロポーレーション、形質導入、感染、または他の方
法により行うことができる。そのような方法は多くの標準的実験マニュアル、例
えばSambrook、前述、1-4および16-18章；Ausubel、前述、1,9,13,15,16章に記
載されている（これらの内容は本明細書の一部を構成する）。

【０１１０】 本発明の別の局面は、ＦＬＩＮＴ類似体を含む融合タンパク質に関する。例え
ば、さらなるアミノ酸の領域、例えばヘキサヒスチジン(His₆)タグをＦＬＩＮＴ
類似体のアミノもしくはカルボキシ末端に加えて精製を促すことができる。その
ような領域は所望により類似体の最終精製前に除去することができる。そのよう
な方法は多くの標準的実験マニュアル、例えばSambrook、前述、17.29-17.42章
および18.1-18.74章、Ausubel、前述、16、17、および18章に記載されている（
これらの内容は本明細書の一部を構成する）。

【０１１１】 宿主細胞におけるＦＬＩＮＴ類似体の発現 本発明の核酸を用い、組換え的に操作された細胞、例えば細菌、酵母、昆虫、
または哺乳動物細胞中でＦＬＩＮＴ類似体を発現させることができよう。 当業者は、本発明のＦＬＩＮＴ類似体をコードする核酸を発現させるのに利用
できる多くの発現系をよく知っている。原核生物や真核生物でタンパク質を発現
させるための種々の知られた方法を詳細に記載することは行わない。 簡単には、本発明のＦＬＩＮＴ類似体をコードする単離された核酸の発現は、
典型的には類似体をコードするDNAまたはcDNAをプロモーター（構成的または誘
導可能である）と操作可能なように連結し、次いで発現ベクター中に組み込むこ
とにより達成されよう。該ベクターは原核生物または真核生物中で複製および統
合するのに適し得る。典型的な発現ベクターは、本発明タンパク質をコードする
DNAの発現調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモ
ーターを含む。クローン化遺伝子の高レベルで発現させるには、少なくとも、転
写を誘導するプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写
／翻訳ターミネーターを含む発現ベクターを構築するのが望ましい。当業者は、
生物活性を減少させることなく本発明タンパク質を修飾することができると認識
するであろう。ある修飾は、クローニング、発現、または融合タンパク質に標的
分子を組み込むのを促すために行うことができよう。そのような修飾は当業者に
よく知られており、例えばアミノ末端にメチオニンを加えて開始部位とするか、
またはいずれかの末端にさらなるアミノ酸（例えばポリHis）を加えて好都合に
位置した制限部位もしくは終止コドン、または精製操作用配列を作製することが
含まれる。

【０１１２】 原核生物における発現 原核細胞をＦＬＩＮＴ類似体を発現させるための宿主として用いてよい。 原核生物は種々のE.coli株で代表されることが最も多いが、他の微生物株を用い
てもよい。転写開始のためのプロモーター（所望によりオペレーターを含む）お
よびリボソーム結合部位配列を含む、本明細書で定義した通常用いる原核性制御
配列には、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモ
ーター系として通常用いるプロモーター(Chang, et al., Nature 198: 1056 (19
77))、トリプトファン(trp)プロモーター系 (Goeddel, et al., Nucleic Acids
Res. 8: 4057 (1980))、T7 ファージプロモーター(Studier, F. W., Methods in
Enzymology, 185,60-89, (1990)、およびλ由来PLプロモーターおよびN-遺伝子
リボソーム結合部位(Shimatake, et al., Nature 292: 128 (1981))が含まれる
（この内容は本明細書の一部を構成する）。E.coliにトランスフェクトするDNA
ベクターに選択マーカーを含めることも有用である。そのようなマーカーの例に
はアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、またはカナマイシ
ン耐性遺伝子が含まれる。

【０１１３】 ベクターは適切な宿主細胞に導入できるように選択する。細菌ベクターは典型
的にはプラスミドまたはファージ起源である。適切な細菌細胞にファージベクタ
ー粒子を感染させるか、またはネイキッド（naked）ファージベクターDNAでトラ
ンスフェクションする。プラスミドベクターを用いる場合は、細菌細胞をプラス
ミドベクターDNAでトランスフェクションする。本発明タンパク質を発現させる
にはBacillus subtilisおよびSalmonellaを用いる発現系が利用できる(Palva, e
t al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach, et al., Nature 302: 543-545 (19
83))（この内容は本明細書の一部を構成する）。

【０１１４】 真核生物における発現 種々の真核性発現系、例えば、酵母、昆虫細胞系、植物および哺乳動物細胞が
当業者に知られている。以下に説明するように、本発明のＦＬＩＮＴ類似体をコ
ードする核酸はこれら真核生物系中で発現させることができる。 酵母におけるヘテロローガスなタンパク質の合成はよく知られている。F. She
rman, et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (
1982)（この内容は本明細書の一部を構成する）は、酵母中でタンパク質を製造
するのに利用できる種々の方法を記載したよく知られた研究である。真核性タン
パク質を製造するために広く利用される２種類の酵母は、Saccharomyces cerevi
siaeおよびPichia pastorisである。SaccharomycesおよびPichia中で発現させる
ためのベクター、株、およびプロトコールは当該分野で知られており、供給業者
（例えばInvitrogen)から入手できる。通常、適切なベクターは、所望により3-
ホスホグリセレートキナーゼまたはアルコールオキシダーゼ、および複製起点、
終止配列などを含むプロモーターのような発現制御配列を有する。 酵母中で発現した本発明ＦＬＩＮＴ類似体は標準的タンパク質単離技術により
単離することができる。精製過程のモニターは、SDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動(SDS-PAGE)、ウエスタンブロット技術もしくはラジオイムノアッセイ、ま
たは他の標準的イムノアッセイ技術、例えばELISAを用いて達成することができ
る。

【０１１５】 本発明のＦＬＩＮＴ類似体をコードする核酸配列は、例えば哺乳動物、昆虫も
しくは植物起源の細胞培養のトランスフェクションに用いるために種々の発現ベ
クターと結合させることもできる。該ペプチドの製造に有用な細胞培養の例は哺
乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は単層細胞の形であることが多いが、哺乳動
物細胞浮遊液を用いてもよい。完全タンパク質を発現することができる多くの適
切な宿主細胞系が当該分野で開発されており、これにはAV12、HEK293、BHK21、
およびCHO細胞系が含まれる。これら細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、
例えば複製起点、プロモーター(例えば、CMVプロモーター、HSV tkプロモーター
またはpgk (ホスホグリセレートキナーゼ)プロモーター)、エンハンサー(Queen,
et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)、この内容は本明細書の一部を構成する
）、およびプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス
部位、ポリアデニル化部位(例えば、ウシ成長ホルモンポリＡ付加部位）、およ
び転写ターミネーター配列を含むことができる。本発明のタンパク質の製造に有
用な他の動物細胞は、例えばAmerican Type Culture Collection Catalogue of
Cell Lines and Hybridomas (第8版、1994)から入手可能である。

【０１１６】 昆虫細胞中で本発明ＦＬＩＮＴ類似体を発現させるのに適したベクターは通常
、SF9バクロウイルス（baculovirus）から誘導される。適切な昆虫細胞系には、
蚊の幼虫、カイコ、アワヨトウの幼虫（armyworm）、蛾（moth）、およびDrosop
hila細胞系、例えばSchneider細胞系が含まれる (Schneider, J. Embryol. Exp.
Morphol. 27: 353-365 (1987)参照、この内容は本明細書の一部を構成する）。

【０１１７】 酵母と同様に、高等動物または植物宿主細胞を用いる場合は、典型的にはポリ
アデニル化または転写ターミネーター配列をベクターに組み込む。ターミネータ
ー配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写
物を正確にスプライシングするための配列を含んでもよい。スプライシング配列
の例にはSV40由来のVP1イントロンがある(Sprague, et al., J. Virol. 45: 773
-781 (1983)、この内容は本明細書の一部を構成する）。さらに、例えばウシパ
ピローマウイルス型ベクター中にみられるような、宿主細胞における複製を制御
する遺伝子配列をベクターに組み込んでよい（M. Saveria Campo, Bovine Papil
loma Virus DNA, a Eucaryotic Cloning Vector in DNA Cloning Vol. II, a Pr
actical Approach, D. M. Glover, Ed., IRL Press, Arlington, VA, pp. 213-2
38 (1985)、この内容は本明細書の一部を構成する）。

【０１１８】 タンパク質の精製 本発明ＦＬＩＮＴ類似体は、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽
出、米国特許第4,569,974号に開示の固定化金属イオンキレーティングペプチド
技術、「IMAC」（この内容は本明細書の一部を構成する）を含む陰イオンもしく
は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性
相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含むよく知られた方
法により類似体を発現する組換え細胞（例えば、E.coli、酵母、昆虫、もしくは
哺乳動物細胞培養）から回収し、精製することができる。精製には高速液体クロ
マトグラフィ（「HPLC」）を用いるのが最も好ましい。

【０１１９】 本発明類似体は、化学合成法によるか、または細菌、酵母、高等植物、昆虫、
および哺乳動物細胞を含む原核性宿主もしくは真核性宿主から組換え技術により
製造することができる。そのような方法は多くの標準的実験マニュアル、例えば
Sambrook、前述17.37-17.42章、Ausubel、前述、10、12、13、16、18、および20
章（この内容は本明細書の一部を構成する）に記載されている。用いる宿主に応
じて本発明ポリペプチドをグリコシル化または非グリコシル化してよい。さらに
、本発明ポリペプチドは、場合により宿主介在工程の結果として初期修飾メチオ
ニン残基を含んでいてもよい。

【０１２０】 治療的応用 アポプトーシス引き金（triggering）分子、FasLは、自己反応性末梢Ｔ細胞除
去の引き金を引き、細胞介在性免疫反応（すなわち、活性化誘導細胞死）を鈍ら
せる免疫系の重要な恒常性制御因子（regulator）である。FasLは、ある条件（
例えば炎症）下で非免疫細胞の重要なアポプトーシス刺激物質のようである。Fa
sLは、膜結合型と分泌型の２つの形で存在する。後者は原核性開裂から誘導され
、おそらく好中球を引きつけることにより炎症においてさらなる役割を演じる。
ＦＬＩＮＴはFasLの両型と結合し、FasLと膜結合Fasレセプター、ならびにＴ細
胞の分泌アクチベーターであり、おそらくある癌細胞をアポプトーシスにより死
滅させる引き金でもあるLIGHTとの相互作用を阻害する。ある種の組織におけるF
asLの細胞表面における構造性発現は、細胞介在性免疫が起きないかまたは弱く
しか起きないような免疫特権状態をもたらす（表面上にFasを保持する侵入免疫
細胞の絶滅による）。FasLの発現は、おそらくすべての他の組織において制御さ
れ、FasおよびFas経路インヒビター（例えばFLIP, FAIM)も高度に制御される。

【０１２１】 下記はヒトにおけるFasL発現を制御する因子および／または条件のいくつかで
ある：炎症（例えば急性肺傷害）、発癌（例えばメラノーマ、大腸癌）、ウイル
ス感染（例えば、Ｃ型肝炎、HIV）、自己免疫の引き金（例えば潰瘍性大腸炎、
橋本甲状腺炎）、および虚血／再還流（例えば脊髄損傷）。疑いなくFasL発現調
節因子（レギュレーター）は他にも多く存在し、ある種の条件下ではあらゆる組
織中でFasL発現および分泌を誘導することができるようである。

【０１２２】 ＦＬＩＮＴ類似体の臨床的有用性は実質的なものであると期待される。FasL/F
asが関与する多くの病気および／または病状は、ＦＬＩＮＴ類似体による治療に
応じやすい可能性がある。適切な病気および／または病状の例には、炎症性／自
己免疫疾患−リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、インスリン依
存性糖尿病、SIRS/敗血症/MODS、膵炎、乾癬、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、Gr
ave病、移植拒絶、SLE、自己免疫性胃炎、繊維化肺疾患が含まれる。 感染性疾患−HIV性リンパ球減少症、劇症ウイルス性B/C型肝炎、慢性肝炎／肝
硬変、H. pylori関連潰瘍形成。 虚血／再還流病状−急性冠動脈症候群、急性心筋梗塞、鬱血性心不全、アテロ
ーム性動脈硬化症、急性脳虚血／梗塞、脳／脊髄損傷、移植時の臓器保存。 その他−癌治療時の細胞保護、化学療法の補助、アルツハイマー性慢性糸球体
腎炎、骨粗鬆症、TTP/HUS、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群。急性肺損傷(AL
I）／急性呼吸困難症候群（ARDS)、潰瘍性大腸炎、およびクローン病の治療およ
び予防も興味深い。

【０１２３】 ＦＬＩＮＴ類似体は、FASとFASL、およびLIGHTとLTβRおよびTR2/HVEMレセプ
ターとの結合を阻害し、そのような結合に関連する病気および／または病状を治
療または予防するのに用いることができる。

【０１２４】 ランナウェイアポプトーシスは、本発明ＦＬＩＮＴ類似体で治療することがで
きるFAS/FASLシグナルのトランスダクション経路の過剰な活性化により生じる病
状の一例である(米国仮出願第60/112,577号、出願日1998年12月18日）、Kondo e
t al., Nature Medicine 3(4): 409-413(1997)、およびGalle et al., J. Exp.
Med. 182: 1223-1230(1995)参照、これらの内容は本明細書の一部を構成する）
。ランナウェイアポプトーシスは、臓器不全、急性肝不全（例えば、肝臓を冒す
ウイルス感染、肝臓を冒す細菌感染、肝炎、肝細胞傷害、および／または肝細胞
が大規模なアポプトーシスまたは破壊を受ける他の病状に関連する肝不全）、腎
不全、および膵臓の機能不全を含む多くの病的状態をもたらす。

【０１２５】 一般に本発明のＦＬＩＮＴ類似体は、ＦＬＩＮＴを用いて治療することができ
る疾患に臨床的および／または治療的に有用である。（米国特許出願第09/280,5
67号、およびMiwa et al., Nature Medicine 4: 1287 (1998)参照、これらの内
容は本明細書の一部を構成する）。一例として、FASL性好中球活性化により生じ
る炎症がある。好中球の活性化に関連する炎症性疾患には、敗血症、ARDS、SIRS
、およびMODSが含まれる。

【０１２６】 ＦＬＩＮＴ類似体が治療的に有用である他の疾患には、リウマチ性関節炎(Ell
iott et al., Lancet 344: 1105-10 (1994))、繊維増殖性肺疾患、繊維性肺疾患
、HIV (Dockrell et al., J. Clin. Invest. 101: 2394-2405 (1998))、虚血 (S
akurai et al. 1998 Brain Res 797: 23-28)、脳外傷／損傷(Ertel et al. 1997
J Neuroimmunol 80: 93-6)、慢性腎不全(Schelling et al. 1998 Lab Invest 7
8: 813-824)、移植片対宿主疾患(GVHD) (Hattori et al. 1998 Blood 11: 4051-
4055)、皮膚炎症 (Orteu at al. 1998 J Immunol 161: 1619-1629)、血管漏出症
候群（Vascular leak syndrome）(Rafi et al. 1998 J Immunol 161: 3077-3086
)、Helicobacter pylori感染症(Rudi et al. 1998 J Clin Invest 102: 1506-15
14)、Goiter (Tamura et al. 1998 Endocrinology 139: 3646-3653)、アテロー
ム性動脈硬化症(Sata and Walsh, 1998 J Clin Invest 102: 1682-1689)、IDDM
(Itoh et al. 1997 J Exp Med 186: 613-618)、骨粗鬆症(Jilka et al. 1998 J
Bone Min Res 13: 793-802)、クローン病(van Dullemen et al. 1995 Gastroent
erology 109: 129-35)、臓器保存および移植（移植片）拒絶(Lau et al. 1996 S
cience 273: 109-112)、敗血症(Faist and Kim. 1998 New Horizons 6: S97-102
)、膵炎(Neoptolemos et al. 1998 Gut 42: 886-91)、癌(メラノーマ、大腸、お
よび食道）(Bennett et al. 1998 J Immunol 160: 5669-5675)、自己免疫病(IBD
、乾癬、ダウン症候群 (Seidi et al., Neuroscience Lett. 260: 9 (1999)、お
よび多発性硬化症 (D'Souza et al. 1996 J Exp Med 184: 2361-70)が含まれる
。

【０１２７】 同時係属中の米国特許出願第09/280567号、発明の名称「Therapeutic Applica
tions of mFLINT Polypeptides」、出願日1999年3月30日（この内容は本明細書
の一部を構成する）は、ＦＬＩＮＴ類似体を用いて治療することができる他の疾
患を開示している。例として、アルツハイマー病、末期腎疾患(ESRD)、単球増加
症（mononulceosis）、EBV、ヘルペス、抗体依存性細胞毒性、溶血および凝固過
剰症候群、例えば血管出血、DIC (播種性血管間凝固）、子癇、HELLP (血小板減
少症、溶血、および肝機能障害に伴う子癇前症）、HITS (ヘパリン性血小板減少
症)、HUS (溶血性尿毒症症候群）、および子癇前症、造血障害、例えば再生不良
性貧血、血小板減少症(TTP)、および骨髄異形成（myelodysplasia)、ならびに例
えばE. bolaによって生じる溶血性発熱（hemolytic fever）が含まれる。

【０１２８】 例えば、回収用調製物において臓器を保存する場合は、ＦＬＩＮＴ類似体は、
臓器提供者から取り出した臓器に対する虚血再還流障害に関連するアポプトーシ
スを防ぐために予防的に有用である。本発明のこの目的のある態様において、Ｆ
ＬＩＮＴ類似体は臓器を回収する前の臓器提供者に投与される。臓器回収後、Ｆ
ＬＩＮＴ類似体を臓器を輸送／保存するために適切な媒質に加える。あるいはま
た、回収した臓器をＦＬＩＮＴ類似体含有媒質で還流し、次いで移植者（レシピ
エント）に移植する。この目的に適した媒質は知られている（例えば、EP 03563
67 A2に記載の媒質（この内容は本明細書の一部を構成する））。該方法には移
植手術の前および／または後に移植者をＦＬＩＮＴ類似体で処置することを含ん
でいてもよい。

【０１２９】 典型的な方法には、臓器回収前に臓器提供者を有効量のＦＬＩＮＴ類似体で前
処置することが含まれる。あるいはまた、もしくは続いて、回収した臓器をＦＬ
ＩＮＴ類似体含有溶液で還流するか浸漬（bath）してよい。この方法は例えば腎
臓、心臓、肺、および他の臓器および組織に用いてよい。 虚血状態下でアポプトーシスを遅らせるＦＬＩＮＴ類似体の能力は、移植用に
回収した臓器や組織を保存するのに有用である。虚血状態には、限定されるもの
ではないが、神経性虚血、手足の粉砕損傷、脊髄損傷、急性、亜急性、および慢
性後遺症を含む心筋梗塞、ならびに関連臨床症候群、鬱血性心不全が含まれる。
化学療法、放射線療法、毒性薬物、外傷、外科手術、および他のストレス時に損
傷した清浄なバイスタンダー(bystander)組織もＦＬＩＮＴ類似体で処置するこ
とができる。そのような病気の一例に、癌治療の生命を脅かす副作用となり得る
粘膜炎（mucositis）がある。

【０１３０】 したがって、別の態様において、本発明は臓器回収前に臓器提供者にＦＬＩＮ
Ｔ類似体を投与することに関する。臓器回収後、臓器を輸送および／または保存
するのに適した媒質にＦＬＩＮＴ類似体を加える。あるいはまた、回収した臓器
を、移植者に移植する前にＦＬＩＮＴ類似体含有媒質で還流する。還流に適した
媒質は知られている（例えば、EP 0356367 A2記載の媒質）。該方法には移植手
術の前および／または後にＦＬＩＮＴ類似体で移植者を処置することも含まれる
。 この目的において、臓器提供者は臓器回収前に有効量のＦＬＩＮＴ類似体で前
処置される。あるいはまた、もしくは続いて、回収した臓器をＦＬＩＮＴ類似体
含有溶液で還流するか浸漬してよい。この方法は例えば腎臓、心臓、肺、および
他の臓器および組織に用いてよい。

【０１３１】 急性肺損傷および急性呼吸困難症候群 急性肺損傷(ALI)および急性呼吸困難症候群(ARDS)は、診断時にみられる低酸
素症の重症度のみが異なる病気の実体を示す。広く受け入れられた診断パラメー
ターはPaO₂／FiO₂比であり、それによれば、ARDS患者は200mmHgに等しいかまた
はそれ以下の比を示し、一方、ALI患者は300mmHgに等しいかまたはそれ以下の比
を示す。ARDSはALIのより重篤な形を示す。好中球が顕著な役割を演じるARDS/AL
Iの病因には多くのメディエーターが関与するようである。ARDSの発現には多く
の増悪（precipitating）因子が考えられるが、直接的および間接的両方の主な
原因は、症例の約40%を占める敗血症および全身性炎症反応症候群のようである
。ARDSの死亡率は約40%と高く、そのほとんどが最初の2〜3週間以内に生じる。A
RDSのために現在利用可能な承認された薬理療法はなく、現在の治療は積極的支
持管理に限られる。

【０１３２】 ARDSにヒトの可溶性FasL/Fas相互作用が介在することがあるという証拠がある
(Matute-Bello et al., J. Immunol. 163,2217-2225,1999)。ＦＬＩＮＴ類似体
はFasLと結合することにより肺細胞（pneumocytes）および／または内皮細胞のF
asL介在性アポプトーシを阻害することにより、急性炎症性傷害からALIへの、お
よびALIからARDSへの進行を阻害または予防するかも知れない。 したがって、別の態様において、本発明は治療的有効量のＦＬＩＮＴ類似体を
それを必要とするヒトに投与することを含むALIおよび／またはARDSを阻害およ
び／または治療するためのＦＬＩＮＴ類似体の使用に関する。

【０１３３】 慢性閉塞性肺疾患 (COPD) 慢性閉塞性肺疾患 (COPD)は、米国において心臓病、癌、および脳血管疾患に
次ぐ非事故死の第四の主原因である。COPDは慢性気管支炎、気腫、気管支拡張症
、および慢性喘息を含む多様な病状を含む閉塞性気道障害である。COPDは徐々に
進行し、肺機能の非可逆的低下を生じる。慢性低酸素血症および炭酸過剰症は、
該障害の最終的結果である。COPDが肺機能を崩壊させるメカニズムにはアポプト
ーシスの調節不全（dysregulated）が関与しているようである。COPDに罹患した
患者の血漿試料には、健康コントロール対象に比べ高濃度の可溶性Fasが存在す
る(Yasuda et al. Resp. Med. 92, 993-999,1998参照)。COPD患者における可溶
性Fasレベルの増加はFas性アポプトーシスの増加を反映しているかも知れない。

【０１３４】 別の態様において、本発明は、治療的有効量のＦＬＩＮＴ類似体を投与するこ
とによりCOPDを治療および／または阻害する必要がある患者のCOPDを治療および
／または阻害するためのＦＬＩＮＴ類似体の使用に関する。

【０１３５】 肺繊維症（PF） 肺繊維症（繊維性肺疾患としても知られる）は、急性または慢性肺傷害の治癒
を試みる過程の最終結果として生じる。そのような肺傷害の病理学的メカニズム
には、最初に肺胞または周囲間質の炎症反応を引き起こし、次いで肺胞／間質性
繊維症（すなわち、修復反応）を引き起こすあらゆる種々の要因があり得る。他
の組織、例えば表皮または腹膜の繊維症は、それぞれ目に見える傷または癒着を
生じる。これに対し肺繊維症は、限定性（restrictive）肺疾患（肺容量の減少
および酸素の拡散低下）をもたらす。肺繊維症に関連する病状には、限定される
ものではないが、特発性肺繊維症、結合組織疾患（例えば狼瘡、強皮症）、薬物
性肺疾患（例えばブレオマイシン）、塵肺（例えばアスベスト肺）、サルコイド
ーシス、好酸球性肉芽腫症、過敏性肺炎、および急性肺傷害および／または急性
呼吸困難症候群を生じうる重度の肺の炎症に関連した他の疾患（例えば、外傷、
敗血症、溺死寸前（near-drowning）、胃吸引（aspiration）、ショックなど)が
含まれる。気道の繊維症もCOPDにおける慢性炎症の特徴である。 PFの病因にはFasL/Fas誘発（triggered）アポプトーシスが含まれてよい。実
際、完全なFasL/Fas系は、マウスのブレオマシン性PFの病因において必須である
(Kuwano K. et al. J. Clin. Invest. 104,13-19 (1999)参照）。

【０１３６】 別の態様において、本発明はPFを阻害および／または治療するためのＦＬＩＮ
Ｔ類似体の使用に関する。例えば、ＦＬＩＮＴ類似体を肺への炎症性傷害時（例
えばブレオマイシン処置時）に急性に投与し、PFの発生を防ぐことができる。 「対象」は治療（処置）を要する哺乳動物、好ましくはヒトであるが、獣医的
治療を要する動物、例えば家畜（domestic animals）（例えばイヌ、ネコなど）
、家畜（farm animals）（例えば乳牛、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験
動物（例えばラット、マウス、モルモットなど）でもあり得る。

【０１３７】 ＦＬＩＮＴ類似体の「有効量」は、FASとFASリガンドまたはLIGHTとLTβRおよ
び／またはTR2/HVEMとの結合が介在する１またはそれ以上の過程の充分な阻害を
もたらし、異常なFAS/FASリガンド結合および／またはLIGHT介在結合に関連した
病気または病状を有する対象において所望の治療もしくは予防効果を達成する量
である。そのような過程の１例がランナウェイアポプトーシスである。あるいは
また、ＦＬＩＮＴ類似体の「有効量」は、FASリガンド誘導好中球活性化により
生じる炎症、または異常なFASリガンド活性に関連するあらゆる他の前記疾患を
有する対象において所望の治療および／または予防効果を達成するのに充分な量
である。

【０１３８】 病気または病状を有する対象における「所望の治療および／または予防効果」
には、そのような病気に関連する症状の軽減もしくは症状の発現の遅延が含まれ
る。あるいはまた、「所望の治療および／または予防効果」には、該病気を有す
る対象の生存率の増加または寿命の増加が含まれる。 個体に投与するＦＬＩＮＴ類似体の量は、病気の種類と重症度、および個体の
特性、例えば一般健康状態、年齢、性別、体重、および薬剤に対するトレランス
に依存するであろう。該量は、病気の程度、重症度、および種類にも依存するで
あろう。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な用量を決定することが
できよう。

【０１３９】 一般的提案として非経口的に投与される、用量あたりの本発明ＦＬＩＮＴ類似
体の総医薬的有効量は、約１μg/kg（患者体重）/日〜10mg/kg/日、詳細には2mg
/kg/日〜8mg/kg/日、より詳細には詳細には2mg/kg/日〜4mg/kg/日、さらにより
詳細には2.2mg/kg/日〜3.3mg/kg/日、および最終的には2.5mg/kg/日の範囲であ
るが、前述したように、これは治療上の自由裁量に従うであろう。より好ましく
は、この用量は少なくとも0.01mg/kg/日である。連続的に与える場合は、典型的
には、本発明ＦＬＩＮＴ類似体は約１μg/kg/時〜約50μg/kg/時の投与速度で１
日に１〜４回注射するか、または例えばミニポンプを用いて連続的に皮下注入す
ることにより投与される。静脈用バッグ溶液を用いてもよい。変化を観察するの
に必要な処置の長さと反応が生じるための治療後の間隔は、所望の効果に応じて
変化するようである。

【０１４０】 本発明のＦＬＩＮＴ類似体を含む医薬組成物は、経口的、経直腸的、頭蓋内、
非経口的、槽内（intracisternally）、膣内、腹腔内、局所的（粉末剤、軟膏、
滴剤、または経皮パッチによる）、経皮的、鞘内、腔内、または経口もしくは鼻
内スプレーとして投与してよい。「医薬的に許容される担体」は、非毒性固体、
半固体、または液体充填剤、希釈剤、カプセル化（encapsulating）物質、また
はあらゆる種類の製剤助剤を意味する。本明細書で用いている用語「非経口的」
には、限定されるものではないが、ＦＬＩＮＴ類似体を含む静脈内、筋肉内、腹
腔内、イントラスターナル（intrasternal）、皮下、および動脈内注射、注入、
およびインプラントが含まれる。

【０１４１】 本発明のＦＬＩＮＴ類似体は持続放出系によっても適切に投与される。適切な
持続放出組成物の例には、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの
形の半透過性ポリマー物質を含む。持続放出マトリックスには、ポリラクチド（
米国特許第3,773.919号、EP 58,481)、L-グルタミン酸およびγ−エチル-L-グル
タメートの共重合体(Sidman, U. et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983))、
ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート）(R. Langer et al., J. Biomed. Mat
er. Res. 15: 167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (19
82))、エチレンビニルアセテート(R. Langer et al., Id.)、またはポリ-D-(-)-
3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)が含まれる。他の持続放出組成物には、リポソー
ムに吸着された（entrapped）ＦＬＩＮＴ類似体も含まれる。そのようなリポソ
ームは本質的に知られた方法により製造される：DE 3,218,121; Epstein et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 8
8,046; EDP 143,949; EP 142,641; 日本特許出願第83-118008号; 米国特許第4,4
85,045および4,544,545号；ならびにEP 102,324。通常、リポソームは、脂質含
有量が約30 mol ％コレステロールより大きい小（約200-800Å）単層型である（
選択する割合は最適なTNFRポリペプチド療法に対して調整される）。

【０１４２】 非経口投与するには、一般に、本発明のＦＬＩＮＴ類似体を所望の純度で医薬
的に許容される担体、すなわち、用いる用量および濃度でレシピエントに無毒で
あり、製剤の他の成分と適合性である担体と混合して注射可能な単位用量剤形（
溶液剤、サスペンジョン剤、またはエマルジョン剤）に製剤化される。例えば、
該製剤は酸化剤およびポリペプチドに有害であることが知られている他の化合物
を含まないことが望ましい。

【０１４３】 一般に、該製剤は本発明ＦＬＩＮＴ類似体を液体担体もしくは微細に分離した
固体担体またはその両方と均質かつ完全に接触させることにより製造される。次
いで、必要であれば該生成物を所望の製剤に成形する。該担体は、好ましくは非
経口担体であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。
そのような担体ビークルの例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびブド
ウ糖溶液が含まれる。リポソームだけでなく非水性ビークル、例えば不揮発性油
およびオレイン酸エチルも本発明において有用である。

【０１４４】 該担体は少量の添加剤、例えば等張性および化学安定性を増強する物質を適切
に含む。そのような物質は用いる用量および濃度でレシピエントに無毒性であり
、これらには緩衝液、例えばリン酸（phosphate）、クエン酸（citrate）、琥珀
酸（succinate）、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩；抗酸化剤、例えば
アルコルビン酸；低分子量(約10残基以下)ポリペプチド、例えばポリアルギニン
もしくはトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしく
は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、
例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、もしくはアルギニン；単糖類
、二糖類、および他の炭化水素（セルロースもしくはその誘導体、グルコース、
マンノース、もしくはデキストリンを含む）；キレート剤、例えばEDTA；糖アル
コール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；対イオン、例えばナトリウ
ム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート、ポロキサマ
ー(poloxamer)、またはPEGが含まれる。

【０１４５】 典型的には本発明ＦＬＩＮＴ類似体は、そのようなビークルを用いて約0.1mg/
ml〜100mg/ml、好ましくは1-10mg/ml（pH約3〜8）の濃度に製剤化される。前記
賦形剤、担体、または安定化剤のあるものを用いて本発明ＦＬＩＮＴ類似体の塩
が形成されると理解されよう。 治療的投与に用いるポリペプチドは無菌でなければならない。無菌は無菌ろ過
膜（例えば0.2ミクロン膜）でろ過することにより容易に達成される。一般的に
は治療的ポリペプチド組成物を、無菌アクセスポートを有する容器、例えば静脈
内注射用溶液バッグもしくは皮下注射針を刺し通すことができるストッパーを有
するバイアルに入れる。

【０１４６】 ＦＬＩＮＴ類似体は通常、単位用量もしくは多用量容器、例えば密封アンプル
もしくはバイアル中に水性溶液または再構成用の凍結乾燥製剤として保存されよ
う。凍結乾燥製剤の例として、10mlバイアルに本発明ＦＬＩＮＴ類似体の無菌ろ
過1%（w/v）水性溶液5mLを充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注射用静菌
水を用いて凍結乾燥ポリペプチドを再構成することにより注入用溶液を調製する
。

【０１４７】 本発明は、本発明の医薬組成物の１またはそれ以上の成分を充填した１または
それ以上の容器を含む医薬パックもしくはキットをも提供する。そのような容器
には、医薬品もしくは生物学的生成物の製造、使用もしくは販売を規制する政府
機関が規定する様式の、ヒト投与用の製造、使用もしくは販売の該機関による承
認を反映した注意書を組み合わせることができる。さらに、本発明ＦＬＩＮＴ類
似体は他の治療用化合物と組み合わせて用いてよい。 本発明を以下の実施例で例示するが、これらは本発明を何ら限定するものでは
ない。

【０１４８】 実施例1 ＦＬＩＮＴ類似体R218Qを発現させるためのベクターの製造 ＦＬＩＮＴ変異体R218Qを、野生型ＦＬＩＮＴ鋳型から出発する突然変異誘発P
CRにより構築した。例えば、Saiki R. K. et al. Science 239: 487-491 (1988)
、および「Current Protocols in Molecular Biology」, Vol 1, 8.5.7項 (John
Wiley and Sons, Inc.出版社)参照（これらの内容は本明細書の一部を構成する
）。R218Q突然変異体は、アミノ酸218のアルギニン残基がグルタミンで置換され
ている。

【０１４９】 218位のアミノ酸配列を変化させ、さらに同定用に制限酵素タグを導入するた
めに、突然変異誘発PCRプロセスでは、SOEイング（SOEing）反応（すなわち、ス
トランドオーバーラップエクステンジョン（Strand Overlap Extension)）を利
用し、天然ＦＬＩＮＴ鋳型を用いて特定の突然変異を作製した。

【０１５０】 一般に、SOEイング反応では４つのプライマー、２つは前向き（フォワード）
方向（A（配列番号5）およびC（配列番号7）と呼ぶ)、２つは逆（リバース）方
向(B（配列番号6）およびD（配列番号8）と呼ぶ)、を用いる必要がある。SOEイ
ング反応は２段階で核酸配列（例えば、遺伝子配列）を増幅する。第一段階では
A〜B反応を行って遺伝子の「半分」を増幅し、次いで別個にC〜D反応を行う。R2
18Q突然変異体の構築において、BおよびCプライマーを遺伝子の同じ領域の向か
い合った鎖にターゲット（target)した。両オリゴヌクレオチドプライマーから
のミスマッチプライミングにより突然変異を起こさせる。

【０１５１】 R218Qのクローニングに関与するプライマーは、

【化１】

【０１５２】 太字で示すヌクレオチドは野生型配列に対してなされた変化を示す。基準とし
てフォワードプライマーCを用い、太字ＧおよびＣは、AscI部位を導入するのに
必要なサイレント変化を示す。この認識部位をプライマーBおよびCに下線で示す
。太字のCAAは、アルギニン（AGG）のグルタミン（CAA）へのアミノ酸置換を示
す。

【０１５３】 R218Q突然変異を有する断片を増幅した311塩基対を5'KpnI部位(GGTACC)および
3'EcoRI部位(GAATTC)を用いてサブクローンした。天然のＦＬＩＮＴ配列は、約1
76位のアミノ酸に天然の内在KpnI部位を有する。サブクローニングのためにEcoR
I部位を導入するが、これは終止コドンの下流に位置する。これら部位をそれぞ
れプライマーAおよびDに下線で示す。311bp断片を完全長ＦＬＩＮＴ配列に組み
込んだ。これは以下の工程により達成された。 I.連結のためにPCR後に設けたアデニンオーバーハングを利用して、311bp断片を
中間ベクター、pCR2.1-TOPO中に入れた。 II. 組み込んだら、KpnI〜EcoRI消化により289bp断片を除去した(注:PCR断片の
サイズは消化により311bpから289bpに減少した)。突然変異断片を用い、指向性
（directional）連結により野生型ＦＬＩＮＴ遺伝子中の対応する断片を置換し
た。 III. ＦＬＩＮＴ/pJB03をKpnI〜EcoRIで消化して２つの断片、 断片1: 6070 bp 断片2: 289 bp を得た。 IV. ＦＬＩＮＴ遺伝子を保持する6070bp断片を単離し、pCR 2.1-TOPOベクターか
ら取り出した289bp PCR生成物と連結してR218Q/pJB03を作製した。制限消化によ
り陽性クローンを同定し、次いで配列分析により確認した。

【０１５４】 R218Q/pJB03に含まれるR218Q類似体を、NheI〜XbaI非指向性（undirected）連
結によりpIG3ベクター中に組み込んだ（shuffled）。R218Q/pJB03をNheI〜XbaI
で消化し、932および5427bp断片を得た。932bp ＦＬＩＮＴ R218Qを含有する断
片を単離した。R218Qの932bp NheIおよびXbaI断片を8510bp線状化pIG 3ベクター
と連結し、前向きおよび逆両方向のクローンを作製した。

【０１５５】 実施例2 組換えＦＬＩＮＴ類似体の原核性発現および精製 ＦＬＩＮＴ類似体R218Qをコードするオープン・リーディング・フレーム（読み
取り枠、ORF）を保持する発現ベクターを、標準的方法を用い、Novagen (Madiso
n WI)から入手できるコンピテントE.coli BL21株（DE3）（hsdS gal cIts857 in
dlSam7nin51acUV5-T7遺伝子1）に形質転換した。カナマイシン耐性で選択した多
くの形質転換体を無作為に選び、これを用いてLB/カナマイシン培地に接種した
。培養を攪拌しながら37℃で増殖させて細胞密度をOD₆₀₀= 0.8-1.0とし、この時
点で1mM IPTGを用いてＦＬＩＮＴタンパク質合成を誘導した。培養を誘導後３時
間37℃で増殖させ、次いで細胞を回収した。ベクターが保持するORFによりコー
ドされたＦＬＩＮＴ類似体生成物を細胞溶解物の不溶性分画、封入体から精製し
た。簡単には、精製は、それぞれ封入体の調製と可溶化、およびタンパク質の再
ホールディング（refolding）、次いで陽イオン交換およびサイズ排除クロマト
グラフィ法からなった。

【０１５６】 実施例 3 哺乳動物細胞におけるＦＬＩＮＴ類似体発現用ベクターpIG3の構築 哺乳動物発現ベクターpGTD (Gerlitz, B. et al., 1993, Biochemical Journa
l 295:131)中に「内在リボソームエントリー（entry）部位」／緑色蛍光増強ポ
リペプチド(IRES/eGFP)をコードするPCR断片を挿入することにより、ビシストロ
ニック（bicistronic)発現ベクターを構築した。pIG3で表すこの新規ベクターは
以下の配列ランドマークを含む：Ela反応性GBMTプロモーター(D.T.Berg et al.,
1993 BioTechniques 14:972; D.T.Berg et al., 1992 Nucleic Acids Research
20: 5485)、多クローニング部位(MCS)、脳心筋炎ウイルス(EMCV)由来IRES配列
、eGFPコード配列(Cormack, et al., 1996 Gene 173:33, Clontech)、SV40小「t
」抗原スプライス部位／ポリアデニル化配列、SV40初期プロモーター、および複
製起点、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)コード配列、ならびにpBR322由来複
製起点およびアンピシリン耐性遺伝子。

【０１５７】 ヒトＦＬＩＮＴ cDNA配列に基づき、各5'末端にBclI制限部位を有するフォワ
ードおよびリバースPCRプライマーを合成する。これらプライマーを用いてＦＬ
ＩＮＴ類似体cDNAをPCR増幅する。ヒトＦＬＩＮＴ cDNAの方向とヌクレオチド配
列を制限消化および挿入物の二本鎖シーケンシングにより確認する。ＦＬＩＮＴ
類似体PCR増幅約900塩基対をそれぞれ制限エンドヌクレアーゼNheIおよびXbaIで
消化し、NheIおよびXbaI粘着末端を有する断片を生成した。次いで、この断片を
pIG3のユニークXbaI部位と結合させ、組換えプラスミドpIG3-ＦＬＩＮＴを得た
。類似物をコードする挿入物を該類似物のC末端で修飾し、類似体の精製を促す
ための開裂できるヘキサヒスチジン(His6)カセットを導入することができる。

【０１５８】 実施例4 AV12 RGT18トランスフェクタントからの高生産性ＦＬＩＮＴ類似体クローンの単
離 ＦＬＩＮＴ遺伝子を保持する組換えプラスミドはメトトレキセートに対する耐
性をコードする。さらに、該構築物は、同じ転写物上でＦＬＩＮＴ遺伝子の3'に
接する蛍光ポリペプチドをコードする遺伝子（GFP）を含む。GFPの高レベル発現
にはＦＬＩＮＴ-GFP mRNAの高レベル発現が必要であろうから、高度に蛍光を発
するクローンは高レベルのＦＬＩＮＴを産生する可能性が高いであろう。

【０１５９】 AV12 RGT18細胞を、リン酸カルシウム法を用いてＦＬＩＮＴ類似体を含む組換
えpIG1プラスミドでトランスフェクトする。250nMメトトレキセートに耐性な細
胞を選んでプールする。耐性クローンのプールを蛍光補助セルソーティング(FAC
S)にかけ、ポピュレーションの上から5%の蛍光値を有する細胞をソートし単細胞
としてプールする。高蛍光プールを２回連続ソーティングにかける。一回および
二回目に得られたプールおよび個々のクローンのＦＬＩＮＴ類似体産生をELISA
で分析する。最高レベルにＦＬＩＮＴ類似体を発現しているプールまたはクロー
ンを用いてスケールアップさせ、ＦＬＩＮＴ類似体を精製する。

【０１６０】 実施例5 ＦＬＩＮＴ類似体の定量 ＦＬＩＮＴ類似体はトランスフェクトした細胞の粗培地中、および精製手順中
に開発したＦＬＩＮＴ ELISAにより定量することができる。ELISAには、捕捉抗
体として抗ＦＬＩＮＴポリクローナル抗体TKD-028(1494)を、また「サンドイッ
チ」アッセイの一次抗体としてビオチン化抗ＦＬＩＮＴ TKD-076Aを用いる。ELI
SAは、基質にOPDを用いストレプトアビジン化ホースラディッシュパーオキシダ
ーゼ (SA-HRP)で発色させ（develop)、490mnの吸光度をモニターする。そのよう
なELISAの有用範囲は0.2-20ng/mlである。

【０１６１】 実施例6 ＦＬＩＮＴ類似体はFasL誘導Jurkat細胞アポプトーシスを阻害する。 アポプトーシスの予防（すなわち、細胞の生存）を測定するバイオアッセイを
、哺乳動物細胞培養中で産生されたＦＬＩＮＴおよび種々のＦＬＩＮＴ類似体を
用いて行った。このために、96ウェルプレートの各ウェルにJurkat細胞25μl (5
X 10⁴細胞/ウェル)を加え、組換えヒトFasL 25μl（最終濃度150ng/ml)、およ
びＦＬＩＮＴまたはＦＬＩＮＴ類似体50μlと混合した。範囲0〜1mg/mlの連続希
釈物をアッセイを用いて試験した。細胞を37℃で一夜インキュベーションした。
MTSテトラゾリウム化合物 (Promega Corporation, Madison, WI) 20μlを各ウェ
ルに加え、37℃で2時間インキュベーションを行った。490nmの吸光度をプレート
リーダーを用いて記録した。 結果を下記表および図2-4にまとめる。218位のアルギニンをグルタミン、グル
タミン酸、アラニン、グリシン、もしくはバリンに置換した類似体はこのアッセ
イで活性を示した。生物活性は試料を調製した細胞の種類の作用ではなかった。
例えば、AV12細胞(図2)または293EDNA細胞(図3)から精製したR218Qは該アッセイ
では活性であった。 他の類似体も試験した。例えば、216位のトレオニンをプロリンに、218位のア
ルギニンをグルタミンに置換した二重突然変異類似体は該アッセイで活性であっ
た。多置換類似体[R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q]類似体はこのアッセイで
活性であった(図4)。

【０１６２】

【０１６３】 実施例7 Jurkat細胞のFasL誘導アポプトーシスを阻害するためのＦＬＩＮＴ類似体の試験 アポプトーシスの予防（すなわち、細胞の生存）を測定するバイオアッセイを
、哺乳動物細胞培養中で産生されたＦＬＩＮＴおよび種々のＦＬＩＮＴ類似体（
下記表参照）を用いて行う。 試験するＦＬＩＮＴ類似体には以下のものが含まれる： G214 (1), G214 (2), G214 (3), G214 (4), G214 (5); P215 (1), P215 (2), P215 (3), P215 (4), P215 (5); T216 (1), T216 (2), T216 (3), T216 (4), T216 (5); P217 (1), P217 (2), P217 (3), P217 (4), P217 (5); R218 (1), R218 (2), R218 (3), R218 (4), R218 (5); A219 (1), A219 (2), A219 (3), A219 (4), A219 (5); G220 (1), G220 (2), G220 (3), G220 (4), G220 (5); R221 (l), R221 (2), R221 (3), R221 (4), R221 (5); A222 (1), A222 (2), A222 (3), A222 (4), A222 (5)。括弧内の数字は下記の特定のアミノ酸サブグループを示す
（ただし、置換残基は天然ＦＬＩＮＴのそれと同じではない）： (1) あらゆる天然の20個のアミノ酸; (2) AspまたはGlu (3) His、Arg、またはLys (4) Cys、Thr、Ser、Gly、Asn、Gln、Tyr (5) Ala、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Phe、Trp。

【０１６４】 この目的において、96ウェルプレートの各ウェルにJurkat細胞 25μL (5 X 10⁴ 細胞/ウェル)を加え、次いで組換えヒトFasL 25μL（最終濃度150ng/mL）、お
よびＦＬＩＮＴもしくはＦＬＩＮＴ類似体50μLと混合する。アッセイでは0〜1m
g/mLの範囲の連続希釈を試験する。細胞を37℃で一夜インキュベーションする。
MTSテトラゾリウム化合物 (Promega Corporation, Madison, WI) 20μLを各ウェ
ルに加え、37℃で2時間インキュベーションした。490nmの吸光度をプレートリー
ダーで記録した。

【０１６５】

【０１６６】 実施例 8 大規模なＦＬＩＮＴ類似体ポリペプチド精製 ＦＬＩＮＴ類似体(6ヒスチジンタグを含む)の大規模製造を、ローラーボトル
中で安定なプールを増殖させることにより行う。コンフルエントに達した後にさ
らに細胞を無血清培地中で5〜7日間インキュベーションし、培地中に最大量のＦ
ＬＩＮＴ類似体を分泌させる。ＦＬＩＮＴ類似体を含む培地をAmicon ProFlux M
12タンジェンシャルろ過システムにて350mLに濃縮する。濃縮した培地を流速1mL
/分でIMACカラム(固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(Pharmacia, 5〜10m
Lカラム)に通す。吸光度(280nm)がベースラインに戻るまでカラムを緩衝液A (PB
S, 0.5M NaCl, pH7.4)で洗浄し、結合したポリペプチドを0.025M〜0.5Mイミダゾ
ール(緩衝液A中)の直線勾配で60分間展開して溶出する。ＦＬＩＮＴ類似体を含
む分画をプールする。この物質を流速1mL／分でベンズアミジンセファロースカ
ラム(1〜5ml)に通し、トロンビンを除去する。ＦＬＩＮＴ類似体を含むカラムの
フロースルーをウルトラフリー遠心フィルター装置（Millipore)を用いて2mLに
濃縮する。この物質をPBS、0.5M NaCl、pH7.4で平衡化した16/60 Superdex200分
粒カラム(Pharmacia)に通す。ＦＬＩＮＴ類似体含有分画をSDS-PAGEで分析し、
精製ポリペプチドのN末端配列がＦＬＩＮＴであることを確認する。

【０１６７】 実施例9 精製ＦＬＩＮＴ類似体の生物物理学的特性 ＦＬＩＮＴ類似体の構造的完全性と物理化学的安定性は以下のように特徴付け
られる。 タンパク質の構造分析は、通常、遠UV CD分析により得られる二次構造の評価
を含む。 通常、リン酸緩衝液pH7.4中の1mg/ml ＦＬＩＮＴ類似体100μLを用い、室温で
0.01cmセルを用い、バンド幅1nm、3秒間一定で240-180nmを0.5nm刻み（step）で
スキャンし、3回スキャンした平均を求める。三次構造の情報を知らせる近UV CD
スペクトルを、バンド幅1nm、5秒間一定で240-350nmを0.5nm刻みで室温にて3回
スキャンした平均を求める。

【０１６８】 内在性トリプトファンの蛍光を以下のパラメーターを用いて測定する：298nm
にて2/2nmスプリット幅で1cmパス長のセルを通して励起し、積分時間１秒で0.4c
mパス長を通し05nm刻みで305-400nmの放射を得る。「青色シフト」は、一般に芳
香族残基がタンパク質構造により深く埋没していることを示し、医薬特性の改善
を伴うことが多い。

【０１６９】 ＦＬＩＮＴ類似体の四次構造は、3mm幅セルおよび超遠心を用いて行う平衡沈
降分析により試験することができる。天然のＦＬＩＮＴと同様の平衡沈降値を有
するＦＬＩＮＴが好ましい。 物理安定性分析には、ＦＬＩＮＴ類似体の表面特性を反映する凝集傾向試験が
含まれる。物理安定性アッセイを下記段落で説明する。

【０１７０】 ダイナミック光スキャッタリングアッセイ（Dynamic Light Scattering Assay
(DLS)）: ＦＬＩＮＴ類似体溶液を、a) PBS, pH7.4もしくは b) PBS, 0.5M NaC
l、または c) PBS, pH7.4および3mg/mL m-クレゾール（タンパク質0.1〜5mg/mL
を含む）中で希釈する。pHをHCl/NaOHで7.4 (±0.05)に調整し、6 x 50mm ホウ
ケイ酸（borasilica)型-Iガラスチューブ中にろ過する。平均光スキャッター強
度加重粒子サイズを、90度の角度計、デジタルコラレーター（correlator）488n
mラインに調整したLexelモデル3500アルゴンレーザーからなるBrookhaven BI900
装置を用いて回収する。実験的に決定した自己相関関数C(t)を累積（cumulants
）法で分析し、流体力学的直径を得る。粒子サイズが有意に変化する前の時間、
すなわちラグタイムを、直線を前増殖および増殖相データポイントにあてはめる
ことにより決定する。交点（intersection)をラグタイムと定義する。同じ濃度
と温度で天然のＦＬＩＮＴと比較した類似体によるスキャッタリングした光の低
下は、一般に該類似体の凝集度が天然タンパク質より少ないことを示す。

【０１７１】 示差スキャンニング熱量測定法（Callorimetry）(DSC): 物理学的安定性はDSC
（示差スキャンニング熱量測定法）による該タンパク質の融点(Tm)にも反映され
る。通常、ＦＬＩＮＴ類似体は5-100℃をスキャン速度60℃/hおよびフィルター
リングパラメーター16秒でスキャンする。一般に、より高い融点は物理的安定性
を示す。 0.5mg/mlに希釈したＦＬＩＮＴ類似体の化学安定性を逆相HPLC(RP-HPLC)およ
びサイズ排除クロマトグラフィによる分析によりモニターする。逆相法は、40℃
でZorbax 300SB-C8カラムを用い214nmで検出するＦＬＩＮＴについて最適化した
アセトニトリル/TFA勾配系からなる。サイズ排除法は、室温でSuperdex-75 (3.2
x300mm)カラムを用いるpH7.4のPBS移動相からなる。一般に、逆相クロマトグラ
ムの変化は化学的に不安定であることを示す。

【０１７２】 実施例10 ＦＬＩＮＴ類似体のin vivo肝損傷治療試験 Tsuji H., et al, 1997, Infection and Immunity, 65 (5): 1892-1898記載の
方法を用い、in vivoでマウスモデルに肝損傷を生じさせた。マウスに低用量の
リポポリサッカライド（LPS）をチャレンジし、大規模な急性肝損傷を生じさせ
た。ＦＬＩＮＴおよびＦＬＩＮＴ類似体の急性炎症およびアポプトーシスの防御
能を検討した。簡単には、BALB/cマウス(Harlan)に、PBS (GIBCO-BRL) 100μL中
のD(+)-ガラクトサミン(Sigma, 39F-0539)6mg、およびPBS 100μL中のリポポリ
サッカライドB E.coli 026:B6 (LPS) (Difco, 3920-25-2）3μgを静脈内注射（
外側尾静脈）に投与した。LPSチャレンジ後、LPS処置4時間後に動物にＦＬＩＮ
Ｔ（1-200μg）またはＦＬＩＮＴ類似体（1-200μg）を静脈注射した。マウスの
生存率を48時間後に求めた(図7参照)。

【０１７３】 動物の生存パーセントと投与したＦＬＩＮＴまたは類似体の量に相関が見られ
た。試験群当たり動物5匹を用いたある試験では、類似体R218Q、および[R34N, D
36T, D194N, S196T, R218Q]は用量依存性に肝損傷から動物を保護した（図7参照
)。試験群あたり動物10匹を用いた第二実験では、10匹の内7匹がＦＬＩＮＴ、R2
18Qおよび[R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q]処置の20時間後に生存していた。
処置の24時間後に、10匹中7匹がＦＬＩＮＴ処置で生存し、10匹中6匹がR218Qま
たは[R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q]で生存していた。

【０１７４】 実施例11 ＦＬＩＮＴ類似体/FASリガンド結合アッセイ ＦＬＩＮＴ類似体とFasリガンドの結合を確認し、その結合特性（例えば反応
速度論、特異性、親和性、共同性、相対結合パターン）をリアルタイム生体分子
相互作用分析（以降、BIAという）を用いて測定した。生体分子の相互作用をモ
ニターするため、BIAでは光学現象表面プラズモン共鳴（optical phenomenon su
rface plasmon resonance）を用いる。結合相互作用の検出は、生体特異的イン
ターフェイスにおける高分子の質量濃度の変化に依存する。以下の物質と方法を
用いた。

【０１７５】 Biacore（登録商標）2000装置 (Biacore AB, Rapsgatan 7, S-754 50 Uppsala,
Sweden) センサーチップ CM5 (Biacore) アミンカップリングキット (Biacore) 洗浄用緩衝液: HBS-EP (Biacore) グアニジンイソチオシアネート溶液 (GibcoBRL) Fasリガンド (Kamiya Biomedical Company, 910 Industry Drive, Seattle, WA
98188) ＦＬＩＮＴ類似体 Fas/Fcキメラ (R & D Systems)

【０１７６】 固定化プロトコール: FasLまたはＦＬＩＮＴ類似体を、リジン残基上の第一級アミンを介して金表面
に結合したカルボキシメチルデキストランポリマー（センサーチップMC5）上に
固定化する。アミンカップリングキット(Biacore)を製造業者のプロトコールに
したがって用い、固定化を行う。簡単には、FasLまたはＦＬＩＮＴ類似体溶液10
0μL(酢酸ナトリウム緩衝液（20mM, pH5.0）中10-25μg/ml)を活性化CM5チップ
にロードする。カップリング後、表面上の過剰の反応基を1Mエタノールアミン・
塩酸（pH8.5）で非活性化する。次に、チップを酢酸ナトリウム緩衝液（20mM, p
H5.0）で洗浄し、非共有結合物質を除去する。

【０１７７】 相互作用分析： FasLとＦＬＩＮＴ類似体の相互作用を分析するため、ＦＬＩＮＴ類似体含有溶
液を、FasL固定化チップ上を通過させる。FasL結合ＦＬＩＮＴ類似体の量を表面
プラズモン共鳴信号（反応単位、RUで表す）を測定することにより決定する。典
型的には、HBS-ET緩衝液中の種々の濃度のＦＬＩＮＴ類似体溶液を流速5μL/分
で10分間センサーチップにロードする。次に、チップをHBS-ET緩衝液(10mM Hepe
s, pH7.4; 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005%界面活性剤P20)で流速5μL/分にて2分
間洗浄する。次に、チップの生体活性表面を0.8Mグアニジンイソチオシアネート
に流速5μL/分で2分間、次いでHBS-EP緩衝液に流速5μL/分で2分間曝露すること
により再生させる。 FasL溶液をＦＬＩＮＴ類似体固定化チップ上を通過させる逆反応を行うことも
できる。ＦＬＩＮＴ類似体と結合したFasLの量を表面プラズモン共鳴信号（反応
単位、RUで示す）を用いて決定する。

【０１７８】 親和性定数の決定： BIA評価3.0.2ソフトウエア(Biacore)を用いてデータを評価し、結合パラメー
ターを決定する。ＦＬＩＮＴとFasL、およびFasLとFasとの相互作用に対するKd
を上記プロトコールを用いて測定した。結果を以下に示す：

【０１７９】 相互作用分子： 固定化 -溶液中 Kd (nM) Fasリガンド（単量体）-ＦＬＩＮＴ 1.13x10^-7 Fasリガンド(単量体) -Fas 1.62x10^-7 ＦＬＩＮＴ類似体 -Fasリガンド(三量体) 0.63x10^-9

【０１８０】 実施例12 ＦＬＩＮＴおよびＦＬＩＮＴ類似体の分析的トロンビン消化 別個の反応チューブ中で、ＦＬＩＮＴ 1μgおよびＦＬＩＮＴ類似体、R218Q、
[R34N, D36T]、および [R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q] 1μgを、20mMトリ
ス、150mM NaCl, pH7.4もしくはPBS、0.5M NaCl、10%グリセロール、およびトロ
ンビン（トロンビン：ＦＬＩＮＴ／類似体の重量比1:100）を含む緩衝液中でイ
ンキュベーションした。反応混合物を25℃または37℃で時間を変えてインキュベ
ーションした。反応混合物の部分標本をSDS-PAGEで分析し218位の開裂を検出し
た。結果を図１に示す。予期したように、ＦＬＩＮＴはトロンビンにより消化さ
れ、ＦＬＩＮＴ代謝産物を生じた。例えば、50分までに、ＦＬＩＮＴおよびコン
トロール類似体 [R34N, D36T]のほぼ半分がタンパク質分解され、4時間で>90%が
タンパク質分解された。対照的に、218位のタンパク質分解は、4時間の時点でも
R218Qおよび[R34N, D36T, D194N, S196T, R218Q]類似体試料には検出されなかっ
た(図1)。

【０１８１】 実施例 13 ＦＬＩＮＴ類似体R218Qのin vitro代謝安定性 AV12細胞由来のＦＬＩＮＴをリン酸緩衝生理食塩水/0.5M NaCl/10%グリセロー
ル中の0.16mg/ml溶液として供給した。293 EBNA細胞由来ＦＬＩＮＴ類似体(R218
Q)をリン酸緩衝生理食塩水/0.5M NaCl/10%グリセロール中の0.12mg/ml溶液とし
て供給した。物質を用いるまで4℃で保存した。ＦＬＩＮＴおよびＦＬＩＮＴ類
似体(R218Q)をIODO-BEADSヨウ素化試薬(PIERCE)を用い¹²⁵I-NaIで放射性標識し
た。放射性標識した試験物質はトリクロロ酢酸中で>90%沈殿性であった。放射性
標識タンパク質を用いるまで-20℃で保存した。

【０１８２】 in vitro分析において、マウス血液試料を雄ICRマウス（体重35g〜45g）から
心臓穿刺により凝固用チューブ（血清チューブ、抗凝固剤なし）に収集した。そ
の直後に、¹²⁵I-ＦＬＩＮＴまたは¹²⁵I-ＦＬＩＮＴ類似体(R218Q)を血液収集チ
ューブに加えた。次に、チューブを37℃の水浴に入れ、１時間凝固させた。沈殿
により血清を調製し、逆相PHLCでアッセイした。 血清または血漿試料をVydac C4カラム(4.6 x 250mm)に直接適用した。カラム
から15-55% Bの直線勾配で40分（1ml/分）で化合物を溶出した。溶媒A = H₂O/0.
1% TFA; 溶媒B = アセトニトリル/0.08%TFA。溶出液を214nmでモニターした。カ
ラム溶出液の分画(1ml)を収集した。分画の放射活性をガンマーカウンターで直
接分析した。

【０１８３】 In vitroインキュベーション。 ICRマウス血液と1時間インキュベーションした後、¹²⁵I-ＦＬＩＮＴの約75%が
分解し、ＦＬＩＮＴ代謝産物の保持特性を有する生成物となった（すなわち、配
列番号1の残基1-218）。(図5A) 対照的に、ＦＬＩＮＴ類似体(R218Q)はタンパク
質分解に対して完全に耐性であった(図5B)。

【０１８４】 実施例14 ＦＬＩＮＴ類似体R218Qのin vivo代謝安定性 ＦＬＩＮＴ類似体のin vivoタンパク質分解消化に対する安定性および耐性を
試験するために計画した試験を雄ICRマウス（体重35g-45g)を用いて行った。Ｆ
ＬＩＮＴおよびＦＬＩＮＴ類似体(R218Q)をリン酸緩衝生理食塩水/10%グリセロ
ールで希釈し、最終濃度75μg/mlの投与溶液を得た。ＦＬＩＮＴおよびＦＬＩＮ
Ｔ類似体(R218Q)を容量0.2mLの単回静脈内ボーラスとしてICRマウス（n=2）に尾
静脈から投与した(15μg/動物)。試験物質を静脈注射して0.25時間後に、プロテ
アーゼインヒビターカクテル(0.5mM AEBSF、150nMアプロチニン、1μM E-64、1
μM ロイペプチン) 0.01mlを含むEDTAチューブに心臓穿刺により血液試料を収集
し、沈殿法により血漿を調製した。ＦＬＩＮＴまたはＦＬＩＮＴ類似体(R218Q)
の血漿中濃度をELISAで測定し、ＦＬＩＮＴ免疫応答性の代謝プロフィールを下
記のごとく逆相HPLCを用いて測定した。

【０１８５】 ＦＬＩＮＴ ELISA: 96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを精製ポリク
ローナル抗体TKD-028-1494 (5μg/ml, 0.1ml/ウェル)で一夜コートした。洗浄後
、試料を50μL/ウェルの容量で加え、室温で2時間インキュベーションした。洗
浄後、ビオチン化Ab TKD-076Aを加え(1:4000希釈、50μl/ウェル)、室温で1時間
インキュベーションした。洗浄後、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ
(Boehringer Ingleheim)(1:1000希釈、50μl/ウェル)を加え、室温で1時間イン
キュベーションした。Attophos（登録商標）基質50μl/ウェルを用いて検出を行
った。蛍光強度を、バイオルミン（Biolumin）を用い、室温で15分間隔で測定し
た。アッセイのLOQは約0.5ng/mlと測定された。

【０１８６】 ELISA分析は、静脈注射15分後に測定したとき、ＦＬＩＮＴおよびＦＬＩＮＴ
類似体(R218Q)の血漿中濃度は同等(約200-300ng/ml)であった。しかしながら、
完全長ＦＬＩＮＴと代謝性ＦＬＩＮＴ (すなわち、配列番号1の残基1-218）を区
別するためRP-HLPCを行った。収集した分画をSpeed-Vac (Savant Instruments)
を用いて濃縮・乾燥し、PBS/0.1% BSAに再懸濁し、次いでELISAでアッセイした
。 RP-HPLC分画は、ＦＬＩＮＴ代謝産物(1-218)が天然ＦＬＩＮＴの静脈内投与15
分後の循環免疫応答性の約50%に相当することを示した(図6A)。対照的に、ＦＬ
ＩＮＴ類似体(R218Q)を投与した動物の血漿中にはＦＬＩＮＴ代謝産物は見られ
なかった。実質的に全ての免疫応答性を、ＦＬＩＮＴ類似体(R218Q)のみが占め
、R218Q位がタンパク質分解に耐性であることを示唆した(図6B)。

【０１８７】 実施例15 ALI患者を治療するためのＦＬＩＮＴ類似体の使用 55歳の男性が意識不明となり救急部門に運び込まれる。患者の家族は、患者が
過去2日間外来で気管支炎の治療を受けたが、抗生物質投与にも拘わらず悪化し
たと述べている。患者には関連する病歴がなく、彼が服用していたのは第三世代
の経口用セファロスポリンのみであった。理学的検査では、低血圧、頻呼吸、お
よび頻脈であり、肺水腫に密接した両側性肺鬱血を有する、鈍い（obtunded)チ
アノーゼの男性であることがわかった。鬱血性心不全の証拠はなかった。検査は
、急性肺損傷の診断と一致した、低酸素血症（PaO2/FiO2に基づく)、および心肥
大を伴わない両側性肺浸潤を示す。病歴に基づき、肺損傷は市中感染肺炎の直接
の結果であり、患者は最後の12時間以内にALIの低酸素血症の基準を満たすと結
論された。換気の指標には、低一回換気量およびPEEPの使用が含まれる。適切な
酸素化を確認したらすぐに、ＦＬＩＮＴ類似体R218Qを用い2.5mg/kgのivボーラ
ス、次いで0.1mg/分の連続注入を行う治療をERで開始する。活発な支持対策(例
えば、陽圧（positive）換気、静脈内注射液、昇圧剤、および栄養支持物）と共
にＦＬＩＮＴ類似体をICUで4日間続け、その時点でＦＬＩＮＴ類似体を中止する
。3日後、患者は快復し始め、第8日に抜管した。患者は無事に快復し、退院後６
ヶ月間、血液ガスと肺活量測定法により肺疾患が残っている形跡はなかった。

【０１８８】 等価物 当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの等価物を日常
的実験を用いるだけで認識または確認することができるであろう。そのような等
価物は請求の範囲に含まれると解釈される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 天然ＦＬＩＮＴおよびR218Q類似体のトロンビンによる開裂の時
間経過を示す図である。

【図２】 ＦＬＩＮＴ類似体R218QによるJurkat細胞におけるFasL誘発アポ
プトーシスの阻害を示す図である。

【図３】 293 EBNA細胞から精製したＦＬＩＮＴ類似体R218QによるJurkat
細胞におけるFasL誘発アポプトーシスの阻害を示す図である。

【図４】 ＦＬＩＮＴ類似体RDDSRによるJurkat細胞におけるFasL誘発アポ
プトーシスの阻害を示す図である。

【図５Ａ】 ＦＬＩＮＴのin vitro代謝安定性を示す図である。

【図５Ｂ】 ＦＬＩＮＴ類似体R218Qのin vitro代謝安定性を示す図である
。

【図６Ａ】 ＦＬＩＮＴのin vivo代謝安定性を示す図である。

【図６Ｂ】 ＦＬＩＮＴ類似体R218Qのin vivo代謝安定性を示す図である。

【図７】 マウス急性肝不全（ALF）モデルにおけるＦＬＩＮＴおよびＦＬ
ＩＮＴ類似体の用量反応を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/08 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 9/10 11/00 １０１ 17/06 11/00 19/02 17/06 29/00 19/02 31/12 29/00 35/00 31/12 37/02 35/00 41/00 37/02 43/00 １１１ 41/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１４７，０７１ (32)優先日 平成11年８月４日(1999．8．4) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６０，５２４ (32)優先日 平成11年10月20日(1999．10．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６０，６６９ (32)優先日 平成11年10月21日(1999．10．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７２，７４４ (32)優先日 平成11年12月20日(1999．12．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７８，１８４ (32)優先日 平成12年１月26日(2000．1．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ラダクリシュナン・ラトナチャラム アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、ティス・コート3793番 (72)発明者 デリック・ライアン・ウィッチャー アメリカ合衆国46038インディアナ州フィ ッシャズ、パロット・コート10896番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 HA03 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 4B065 AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZA362 ZA392 ZA402 ZA452 ZA592 ZA662 ZA752 ZA892 ZA962 ZB072 ZB112 ZB212 ZB262 ZB332 ZB352 ZC352 ZC412 4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 BA41 CA40 DA50 EA23 EA25 FA74

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列番号1の218位
   がタンパク質分解に耐性なＦＬＩＮＴ類似体。
2. 【請求項２】 in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列番号1の218位
   がセリンプロテアーゼによるタンパク質分解に耐性なＦＬＩＮＴ類似体。
3. 【請求項３】 in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列番号1の218位
   がトリプシン、トロンビン、またはキモトリプシンによるタンパク質分解に耐性
   なＦＬＩＮＴ類似体。
4. 【請求項４】 下記からなる群から選ばれる、配列番号1のアミノ酸214〜22
   2を含む領域にアミノ酸置換を含む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性な
   ＦＬＩＮＴ類似体： a. 214位のGlyがGly以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 b. 215位のProがPro以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThr以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがPro以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArg以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAla以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGly以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArg以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 i. 222位のAlaがAla以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている。
5. 【請求項５】 下記からなる群から選ばれる、配列番号1のアミノ酸214〜22
   2を含む領域にアミノ酸置換を含む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性な
   ＦＬＩＮＴ類似体： a. 214位のGlyがGlyでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 b. 215位のProがProでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThrでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがProでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArgでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAlaでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGlyでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArgでない正に荷電したアミノ酸で置換されている、または i. 222位のAlaがAlaでない正に荷電したアミノ酸で置換されている。
6. 【請求項６】 下記からなる群から選ばれる、配列番号1のアミノ酸214〜22
   2を含む領域にアミノ酸置換を含む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性な
   ＦＬＩＮＴ類似体： a. 214位のGlyがGlyでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 b. 215位のProがProでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThrでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがProでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArgでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAlaでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGlyでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArgでない負に荷電したアミノ酸で置換されている、または i. 222位のAlaがAlaでない負に荷電したアミノ酸で置換されている。
7. 【請求項７】 下記からなる群から選ばれる、配列番号1のアミノ酸214〜22
   2を含む領域にアミノ酸置換を含む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性な
   ＦＬＩＮＴ類似体： a. 214位のGlyがGlyでない極性非荷電（polar uncharged)アミノ酸で置換されて
   いる、 b. 215位のProがProでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThrでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがProでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArgでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAlaでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGlyでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArgでない極性非荷電アミノ酸で置換されている、または i. 222位のAlaがAlaでない極性非荷電アミノ酸で置換されている。
8. 【請求項８】 下記からなる群から選ばれる、配列番号1のアミノ酸214〜22
   2を含む領域にアミノ酸置換を含む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性な
   ＦＬＩＮＴ類似体： a. 214位のGlyがGlyでない非極性アミノ酸で置換されている、 b. 215位のProがProでない非極性アミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThrでない非極性アミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがProでない非極性アミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArgでない非極性アミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAlaでない非極性アミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGlyでない非極性アミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArgでない非極性アミノ酸で置換されている、または i. 222位のAlaがAlaでない非極性アミノ酸で置換されている。
9. 【請求項９】 下記からなる群から選ばれる、配列番号1中にアミノ酸置換
   を含む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性なＦＬＩＮＴ類似体： a. 218位のArgがGlnで置換されている、 b. 218位のArgがGluで置換されている、 c. 216位のThrがProで置換されている、 d. 218位のArgがAlaで置換されている、 e. 218位のArgがGlyで置換されている、 f. 218位のArgがSerで置換されている、 g. 218位のArgがValで置換されている、 h. 218位のArgがTyrで置換されている、 i. 218位のArgがAsnで置換されている、および j. 217位のProがTyrで置換されている。
10. 【請求項１０】 34位のArgがAsnで置換されており、36位のAspがThrで置換
    されており、218位のArgが下記からなる群から選ばれるアミノ酸で置換されてい
    る配列番号1のアミノ酸配列を含む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性な
    ＦＬＩＮＴ類似体： a. Argでないあらゆる天然のアミノ酸、 b. Argでないあらゆる正に荷電したアミノ酸、 c. Argでないあらゆる負に荷電したアミノ酸、 d. Argでないあらゆる極性非荷電アミノ酸、 e. Argでないあらゆる非極性アミノ酸、および f. Glu、Gln、Asn、Ala、Gly、Ser、Val、またはTyrであるアミノ酸。
11. 【請求項１１】 34位のArgがAsnで置換されており、36位のAspがThrで置換
    されており、194位のAspがAsnで置換されており、196位のSerがThrで置換されて
    おり、218位のArgが下記からなる群から選ばれるアミノ酸で置換されている配列
    番号1のアミノ酸配列を含む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性なＦＬＩ
    ＮＴ類似体： a. Argでないあらゆる天然のアミノ酸、 b. Argでないあらゆる正に荷電したアミノ酸、 c. Argでないあらゆる負に荷電したアミノ酸、 d. Argでないあらゆる極性非荷電アミノ酸、 e. Argでないあらゆる非極性アミノ酸、および f. Glu、Gln、Ala、Gly、Ser、Val、またはTyrであるアミノ酸。
12. 【請求項１２】 132位のSerがAsnで置換されており、218位のArgが下記か
    らなる群から選ばれるアミノ酸で置換されている配列番号1のアミノ酸配列を含
    む配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性なＦＬＩＮＴ類似体： a. Argでないあらゆる天然のアミノ酸、 b. Argでないあらゆる正に荷電したアミノ酸、 c. Argでないあらゆる負に荷電したアミノ酸、 d. Argでないあらゆる極性非荷電アミノ酸、 e. Argでないあらゆる非極性アミノ酸、および f. Glu、Gln、Ala、Gly、Ser、Val、またはTyrであるアミノ酸。
13. 【請求項１３】 34位のArgがAsnで置換されており、36位のAspがThrで置換
    されており、218位のArgがGlnで置換されている配列番号1の218位がタンパク質
    分解に耐性なＦＬＩＮＴ類似体。
14. 【請求項１４】 34位のArgがAsnで置換されており、36位のAspがThrで置換
    されており、194位のAspがAsnで置換されており、196位のSerがThrで置換されて
    おり、218位のArgがGlnで置換されている、配列番号１を含む、配列番号1の218
    位がタンパク質分解に耐性なＦＬＩＮＴ類似体。
15. 【請求項１５】 216位のThrがProで置換されており、218位のArgがGlnで置
    換されている、配列番号１を含む、配列番号1の218位がタンパク質分解に耐性な
    ＦＬＩＮＴ類似体。
16. 【請求項１６】 治療的有効量のプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体を投与
    することを含む哺乳動物の病気または病状を治療（処置）もしくは予防する方法
    。
17. 【請求項１７】 該病気または病状が急性肺傷害、急性呼吸困難症候群、ま
    たは潰瘍性大腸炎である請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 活性成分としてプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体を１ま
    たはそれ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤とともに含む医
    薬製剤。
19. 【請求項１９】 ＦＬＩＮＴ類似体を含む融合タンパク質。
20. 【請求項２０】 請求項４記載のタンパク質をコードする核酸。
21. 【請求項２１】 請求項５記載のタンパク質をコードする核酸。
22. 【請求項２２】 請求項６記載のタンパク質をコードする核酸。
23. 【請求項２３】 請求項７記載のタンパク質をコードする核酸。
24. 【請求項２４】 請求項８記載のタンパク質をコードする核酸。
25. 【請求項２５】 請求項９記載のタンパク質をコードする核酸。
26. 【請求項２６】 Ｔ細胞の活性化を阻害する方法であって、それを必要とす
    る患者に有効量のプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体を投与することを含む方法
    。
27. 【請求項２７】 活性成分としてプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体を含む
    臓器移植中の虚血性傷害を阻害するのに適合した製剤。
28. 【請求項２８】 プロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体を含む、臓器に注入し
    、臓器を保存（preservation）するための液体媒質。
29. 【請求項２９】 配列番号1の残基214〜222と少なくとも約５０％同一なア
    ミノ酸配列を有するプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体。
30. 【請求項３０】 高ストリンジェンシー条件下で配列番号２とハイブリダイ
    ズする核酸によりコードされたプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体。
31. 【請求項３１】 配列番号１の214〜222位のおよび／または214〜222位間の
    領域のアミノ酸配列を変化させる工程を含む、配列番号１の218位と219位間がト
    リプシン様プロテアーゼによるタンパク質分解に耐性であるプロテアーゼ耐性Ｆ
    ＬＩＮＴ類似体の製造方法。
32. 【請求項３２】 配列番号１の214〜222位のおよび／または214〜222位間の
    領域のアミノ酸配列を変化させる工程が下記の群から選ばれる請求項31記載のプ
    ロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体の製造方法： a. 214位のGlyがGly以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 b. 215位のProがPro以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 c. 216位のThrがThr以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 d. 217位のProがPro以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 e. 218位のArgがArg以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 f. 219位のAlaがAla以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 g. 220位のGlyがGly以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 h. 221位のArgがArg以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている、 i. 222位のAlaがAla以外のあらゆる天然のアミノ酸で置換されている。
33. 【請求項３３】 in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列番号1の218
    位がタンパク質分解に対して実質的に耐性なＦＬＩＮＴ類似体。
34. 【請求項３４】 in vivoおよび／またはin vitroにおいて a. 配列番号1の218位、 b. 配列番号3の247位 からなる群から選ばれるアミノ酸位がタンパク質分解に対して実質的に耐性なＦ
    ＬＩＮＴ類似体。
35. 【請求項３５】 218位のArgが下記からなる群から選ばれるアミノ酸で置換
    されている、in vivoおよび／またはin vitroにおいて配列番号1の218位がタン
    パク質分解に対して実質的に耐性なＦＬＩＮＴ類似体： a. Argでないあらゆる天然のアミノ酸、 b. Argでないあらゆる正に荷電したアミノ酸、 c. Argでないあらゆる負に荷電したアミノ酸、 d. Argでないあらゆる極性非荷電アミノ酸、 e. Argでないあらゆる非極性アミノ酸、および f. Glu、Gln、Ala、Gly、Ser、Val、またはTyrであるアミノ酸。
36. 【請求項３６】 218位のArgがGlnで置換されている配列番号１のアミノ酸
    配列を含む配列番号１の218位がタンパク質分解に耐性なＦＬＩＮＴ類似体。
37. 【請求項３７】 配列番号１と少なくとも約９０％同一なアミノ酸配列を有
    するプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体。
38. 【請求項３８】 配列番号１の218位のArgにアミノ酸置換を含む請求項37記
    載のプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体。
39. 【請求項３９】 請求項１、２または３記載の類似体をコードする核酸。
40. 【請求項４０】 請求項10、11または12記載の類似体をコードする核酸。
41. 【請求項４１】 請求項13、14または15記載の類似体をコードする核酸。
42. 【請求項４２】 高ストリンジェンシー条件下で配列番号２とハイブリダイ
    ズする、プロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体をコードする核酸。
43. 【請求項４３】 請求項38記載のタンパク質をコードする核酸。
44. 【請求項４４】 本発明の核酸を含むベクター。
45. 【請求項４５】 請求項43記載の核酸を含むベクター。
46. 【請求項４６】 請求項44記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
47. 【請求項４７】 請求項45記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
48. 【請求項４８】 該領域が配列番号１のアミノ酸215-218を含む請求項４〜
    ８のいずれかに記載のＦＬＩＮＴ類似体。
49. 【請求項４９】 活性成分として請求項４〜８のいずれかに記載のプロテア
    ーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体を１またはそれ以上の医薬的に許容される担体、賦形
    剤、または希釈剤とともに含む医薬製剤。
50. 【請求項５０】 活性成分として請求項9〜15のいずれかに記載のプロテア
    ーゼ耐性ＦＬＩＮＴ類似体を１またはそれ以上の医薬的に許容される担体、賦形
    剤、または希釈剤とともに含む医薬製剤。
51. 【請求項５１】 活性成分として請求項36記載のプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮ
    Ｔ類似体を１またはそれ以上の医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤
    とともに含む医薬製剤。