MXPA04012305A - Agonistas del receptor (vpac2) del peptido activamente de la adenilato ciclasa hipofisaria (pacap) y sus metodos de uso farmacologicos. - Google Patents

Abstract

Esta invencion provee nuevos peptidos que funcionan in vivo como agonistas del receptor VPAC2. Se demuestra que estos polipeptidos secretagogos de la insulina reducen mas la glucosa sanguinea in vivo que los controles luego de la provocacion con glucosa. Los polipeptidos de esta invencion tambien son estables en la formulacion y tienen vidas media prolongadas. Los peptidos de la presente invencion proveen una nueva terapia para pacientes con secrecion reducida de insulina endogena, en particular los diabeticos del tipo 2. En particular, la invencion es un polipeptido seleccionado de un grupo especifico de polipeptidos relacionados con VPAC2, o sus equivalentes funcionales. La invencion se refiere, ademas, a un metodo de tratamiento de una enfermedad metabolica en un mamifero que comprende administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de los peptidos secretagogos de la insulina a dicho mamifero. Se describen, ademas, metodos para preparar los peptidos, tanto recombinantes como sinteticos.

Description

AGONISTAS DEL RECEPTOR (VPAC2) DEL PEPTIDO ACTIVANTE DE LA ADENILATO CICLASA HIPOFISARIA (PACAP) Y SUS MÉTODOS DE USO FARMACOLÓGICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a polipéptidos recientemente identificados y al uso de tales polipéptidos para fines terapéuticos. Más particularmente, los polipéptidos de la presente invención son útiles en la estimulación de la liberación de insulina de las células ß pancreáticas de manera glucosa-dependiente, brindando por ello una opción de tratamiento para aquellos individuos afectados por trastornos metabólicos tales como diabetes o intolerancia a la glucosa, un estado prediabético.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diabetes se caracteriza por un deterioro del metabolismo de la glucosa que se manifiesta, entre otras cosas, por un elevado nivel de glucosa en sangre en el paciente diabético. Las deficiencias subyacentes conducen a una clasificación de la diabetes en dos grupos principales: diabetes tipo 1 , o diabetes mellitus insulino-dependiente (IDDM), que surge cuyo los pacientes carecen de células ß productoras de insulina en sus glándulas pancreáticas, y diabetes tipo 2, o diabetes mellitus no insulino-dependiante (NIDDM), que ocurre en pacientes con una función deteriorada de las células ß y alteraciones en la acción de la insulina.

Los pacientes diabéticos Tipo 1 se trata n habitualmente con insulina, mientras que la mayoría de los pacientes diabéticos tipo 2 se tratan con agentes que estimulan la función de las células ß o con agentes que refuerzan la sensibilidad de los tejidos de los pacientes hacia la insulina. Con el tiempo casi la mitad de los sujetos diabéticos tipo 2 pierden su respuesta a estos agentes y entonces deben colocarse bajo terapia insulínica. Los fármacos utilizados actualmente para tratar la diabetes tipo 2 se describen a continuación. Los inhibidores de la alfa-glucosidasa (por ejemplo, Precose®, Voglibose™ y Miglitol®) reducen el traslado de la glucosa postprandial demorando la absorción de glucosa del intestino. Estos fármacos son seguros y brindan tratamiento para sujetos diabéticos afectados entre leve y moderadamente. Sin embargo, se han informado en la literatura efectos colaterales gastrointestinales. Los sensibilizantes insulínicos son fármacos que aumentan la respuesta del organismo a la insulina. Tiozolidinadionas tales como Avandia™ (rosiglitazona) y Actos™ activan el receptor de peroxisomas activado por proliferadores (PPAR) subtipo gamma y modulan la actividad de un conjunto de genes que no han sido bien descriptos. Rezulin™ (troglitazona), el primer fármaco de esta clase, se abandonó debido a los elevados niveles de enzimas hepáticas y a la hepatotoxicidad inducida por fármacos. Estos efectos hepáticos no parecen ser un problema significativo en pacientes que utilizan Avandia™ y Actos™. Aún así, se recomienda el control de las enzimas hepáticas cada 2 meses en el primer año de terapia y periódicamente con posterioridad. Avandia™ y Actos™ parecen estar relacionadas con la retención de fluidos y el edema. Avandia™ no está indicada para su uso con insulina debido a la preocupación por la insuficiencia cardíaca congestiva. Otro efecto colateral potencial es el aumento de peso. Los secretagogos insulínicos (por ejemplo, sulfonilureas (SFUs) y otros agentes que actúan a través del canal de K+ ATP-depend iente) son otro tipo de fármaco utilizado actualmente para tratar la diabetes tipo 2. Las SFUs son una terapia estándar para diabéticos tipo 2 que tienen glucemia entre leve y moderada en ayunas. Las SFUs tienen limitaciones que incluyen un potencial para inducir la hipoglucemia, aumento de peso, y elevados índices de fracaso primario y secundario. Del diez al 20% de los pacientes inicialmente tratados no llegan a demostrar un efecto, de tratamiento significativo (fracaso primario). El fracaso secundario se demuestra por una pérdida adicional del 20-30% en el efecto del tratamiento después de seis meses de SFU. El tratamiento con Insulina se requiere en el 50% de los que responden a las SFU después de 5-7 años de terapia (Scheen, et al., Diabetes Res. Clin. Pract. 6:533-543, 1989). El Glucophage™ (metformina clorhidrato) es una biguanidina que reduce la glucosa sanguínea by disminuyendo la producción de glucosa hepática y aumentando la captación y utilización de la glucosa. El fármaco es efectivo en la disminución de la glucosa sanguínea en sujetos afectados entre leve y moderadamente y no tiene los efectos colaterales de aumento de peso o el potencial de inducir la hipoglucemia. Sin embargo, Glucophage™ tiene una cantidad de efectos colaterales que incluyen alteraciones gastrointestinales y acidosis láctica. Glucophage™ está contraindicado en diabéticos por encima de 70 años de edad y en sujetos con insuficiencia de la función renal o hepática. Finalmente, Glucophage™ tiene los mismos índices de fracaso primario y secundario que las SFUs. El tratamiento con insulina se establece después que la dieta, el ejercicio y las medicaciones orales han fracasado en el control adecuado de la glucosa sanguínea. Este tratamiento tiene las¿desventajas de que es inyectable, de que puede producir hipoglucemia y de que causa aumento de peso. Debido a los problemas con los tratamientos actuales, terapias para tratar la diabetes tipo 2. En particular, se necesitan nuevos tratamientos para retener la secreción normal (glucosa-dependiente) de insulina. Dichos nuevos fármacos deben tener las siguientes características: dependientes de la glucosa para promover la secreción de la insulina (es decir, producir secreción de insulina sólo en presencia de elevada glucosa sanguínea); bajos índices de fracaso primario y secundario; y preservar la función de las células de los islotes. La estrategia para desarrollar la nueva terapia expuesta en la presente se basa en el mecanismo de señalización del adenosina monofosfato cíclico (cAMP) y sus efectos sobre la secreción insulínica. El AMP cíclico es un regulador principal del proceso de secreción de la insulina. La elevación de esta molécula señalizadora promueve el cierre de los canales de K+ que sigue a la activación de la vía de la proteína quinasa A. El cierre de los canales de K+ provoca la despolarización de la célula y la posterior apertura de los canales de Ca++, lo que a su vez conduce a la exocitosis de gránulos de insulina. Poco o ningún efecto sobre la secreción de la insulina se produce en ausencia de bajas concentraciones de glucosa (Weinhaus, et al., Diabetes 47:1426-1435, 1998). Secretagogos como el péptido activante de la adenilato ciclasa hipofisaria ("PACAP") y el GLP-1 (péptido semejante al glucagón 1 ) utilizan el sistema del cAMP para regular la secreción de insulina de manera glucosa-dependiente (Komatsu, et al., Diabetes 46:1928-1938, 1997; Filipsson, et al., Diabetes 50:1959-1969, 2001; Drucker, Endocrinology 142:521-527, 2001). Los secretagogos de la insulina que trabajan mediante la elevación del cAMP, tales como el GLP-1 y el PACAP, también son capaces de aumentar la síntesis de insulina además de la liberación de la insulina (Skoglund, et al., Diabetes 49:1156-1164, 2000; Borboni, et al., Endocrinology 140:5530-5537, 1999). El PACAP es un potente estimulante de la secreción glucosa-dependiente de la insulina de las células pancreáticas ß. Se han descripto tres tipos diferentes de receptores PACAP (PAC1 , VPAC1 , y VPAC2) (Harmar, et al., Pharmacol. Revie s 50:265-270, 1998; Vaudry, et al., Pharmacol. Reviews 52:269-324, 2000).

El PACAP no exhibe ninguna selectividad por los receptores, teniendo actividades y potencias comparables en los tres receptores. PAC1 está localizado predominantemente en SNC, mientras que VPAC1 y VPAC2 están distribuidos más ampliamente. VPAC1 está localizado en SNC como así también en hígado, pulmones e intestino. VPAC2 está localizado en SNC, páncreas, músculo esquelético, corazón, riñon, tejido adiposo, testículos y estómago. Trabajos recientes argumentan que el VPAC2 es responsable de la secreción de insulina de las células ß (Inagaki, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :2679-2683, 1994; Tsutsumi, et al., Diabetes 51 :1453-1460, 2002). Esta acción insulinotrópica de PACAP está mediada por la proteína de unión a GTP, Gs. La acumulación de cAMP intracelular a su vez activa los canales catiónicos no selectivos en las células ß aumentando [Ca++], y promueve la exocitosis de los granulos secretores que contienen insulina. PACAP es miembro más reciente de la superfamilia de hormonas peptídicas metabólicas, neuroendocrinas, y neurotransmisoras que ejercen su acción a través de la vía de transducción de señales mediada por cAMP (Arimura, Regul. Peptides 37:287-303, 1992). Los péptidos biológicamente activos se liberan de su precursor biosintético en dos formas moleculares, ya sea como péptido de 38 aminoácidos (PACAP-38) y/o como péptido de 27 aminoácidos (PACAP-27) con un extremo carboxilo terminal convertido en amida (Arimura, supra). Las mayores concentraciones dé las dos formas del péptido se encuentran en el cerebro y testículos (Arimura, supra). La forma más corta del péptido, PACAP-27, muestra una homología estructural del 68% respecto del polipéptido vasoactivo intestinal (VIP). Sin embargo, la distribución de PACAP y VIP en el sistema nervioso central sugiere que estos péptidos estructuralmente relacionados tienen distintas funciones neurotransmisoras (Koves, et al., Neuroendocrinology 54:159-169, 1991). Estudios recientes han demostrado diversos efectos biológicos de PACAP- 38, desde un papel en la reproducción ( cArdle, Endocrinology 135:815-817, 1994) hasta una capacidad para estimular la secreción de insulina (Yada, et al., J. Biol. Chem. 269:1290-1293, 1994). Además, PACAP parece desempeñar un papel en la regulación hormonal del metabolismo de lípidos y carbohidratos (Gray, et al., Mol. Endrocrinol. 15:1739-47, 2001); la función circadiana (Harmar, et al., Cell 109: 497-508, 2002); y el sistema inmune, el crecimiento, la homeostasis de la energía, y la función reproductiva masculina (Asnicar, et al., Endrocrinol. 143:3994-4006, 2002) ; la regulación del apetito (Tachibana, et al., Neurosci. Lett. 339:203-206, 2003) ; como así también enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, el shock séptico y las enfermedades autoinmunes (por ejemplo el lupus eritematoso sistémico) (Pozo, Trends Mol. Med. 9:211-217, 2003). El péptido vasoactivo intestinal (VIP) es un péptido de 28 aminoácidos que se aisló por primera vez del intestino delgado superior del cerdo (Said y Mutt, Science 169:1217-1218, 1970; Patente Norteamericana No. 3.879.371 ). Este péptido pertenece a una familia de pequeños polipéptidos estructuralmente relacionados que incluye a la helodermina, secretina, las somatostatinas, y el glucagón. Los efectos biológicos del VIP son mediados por la activación de proteínas receptoras unidas a membrana que están acopladas al sistema de señalización del cAMP intracelular. Estos receptores se conocieron originalmente como VIP-R1 y VIP-R2; sin embargo, se descubrió después que eran los mismos receptores que VPAC1 y VPAC2. VIP exhibe actividades y potencias comparables a VPAC1 y VPAC2.

Para mejorar la estabilidad de VIP en el fluido pulmonar humano, Bolín, et al., (Biopolymers 37:57-66, 1995) hicieron una serie de variantes VIP diseñadas para aumentar la tendencia helicoidal de este péptido y reducir la degradación proteolítica. Las sustituciones se focalizaron en las posiciones 8, 12, 17, y 25-28, las cuales se reconocían por no ser importantes para la unión a receptores. Es más, la secuencia "GGT" se agregó al extremo C-terminal de las muteínas de VIP con la esperanza de producir "capping" en la hélice más eficientemente. Finalmente, para estabilizar más la hélice, se sintetizaron varias variantes cíclicas (Patente Norteamericana No. 5.677.419). Aunque estos efectos no se dirigieron a la selectividad de los receptores, produjeron dos análogos que tienen una selectividad más de 00 veces mayor que la de VPAC2 (Gourlet, et al., Peptides 18:403-408, 1997; Xia, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 281 :629-633, 1997). GLP-1 se libera de la célula L intestinal después de una ingesta y funciona como una hormona ¡ncretina (es decir, potencia la liberación de la insulina glucosa-inducida de la célula ß pancreática). Es un péptido de 37 aminoácidos que es expresado en forma diferencial por el gen del glucagón, dependiendo del tipo de tejido. Los datos clínicos que sustentan el efecto beneficioso de elevar los niveles de cAMP en células ß se han recolectado con GLP-1. Las infusiones de GLP-1 en diabéticos tipo 2 escasamente controlados normalizaron sus niveles de glucosa sanguínea en ayunas (Gutniak, et al., New Eng. J. Med. 326:1316-1322, 1992) y con infusiones más prolongadas mejoraron la función de las células ß a nivel de la de sujetos normales (Rachman, et al., Diabetes 45:1524-1530, 1996). Un informe reciente ha demostrado que GLP-1 mejora la capacidad de las células ß de responder a la glucosa en sujetos con intolerancia a la glucosa (Byrne, et al., Diabetes 47:1259-1265, 1998). Todos estos efectos, sin embargo, son de poca duración debido a la corta vida media del péptido.

Amylin Pharmaceuticals está realizando ensayos de Fase III con Exendin 4™ (AC2993), un péptido de 39 aminoácidos originalmente identificado en Gila Monster. Amylin ha informado que los estudios clínicos demostraron un control glucémico mejorado en pacientes diabéticos tipo 2 tratados con Exendin 4™. Sin embargo, la incidencia de náuseas y vómitos fue significativa. Los solicitantes describieron polipéptidos novedosos que funcionan in vivo como agonistas del receptor VPAC2 en WO 01/23420, cuya memoria descriptiva se incorpora a la presente en su totalidad, y, en particular, los solicitantes describieron un agonista de VPAC2 identificado como R3P66. Los polipéptidos descriptos en la misma, incluyendo el R3P66, sin embargo, no son candidatos comerciales adecuados dados los aspectos de estabilidad asociados con los polipéptidos en formulación, como así también aspectos relacionados con la corta vida media de los polipéptidos. Existe la necesidad de péptidos mejorados que tengan la actividad secretagoga de insulina glucosa-dependiente de PACAP, GLP-1 o Exendin 4™, pero con menos efectos colaterales, y con preferencia que sean estables en formulación y tengan largas vidas medias plasmáticas. Asimismo, el control más estricto de los niveles de glucosa plasmática puede prevenir las complicaciones diabéticas a largo plazo. De este modo, los nuevos fármacos para diabéticos deben brindar una mejor calidad de vida para los pacientes. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención provee polipéptidos novedosos que funcionan in vivo como agonistas del receptor VPAC2 (de aquí en más, VPAC2) y son efectivos en el tratamiento de enfermedades y condiciones que pueden ser aliviadas por agentes que tengan actividad VPAC2. Con preferencia, los polipéptidos de esta invención son agonistas selectivos de VPAC2, teniendo mayor potencia en VPAC2 que en VPAC1 y PAC1. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, estos poiipéptidos estimulan la síntesis de insulina y la liberación de las células ß pancreáticas de una manera glucosa-dependiente y la posterior reducción de la glucosa plasmática. Se demuestra que estos poiipéptidos secretagogos disminuyen la glucosa sanguínea in vivo más que el vehículo control ante una provocación con glucosa. Con mayor preferencia aún, los poiipéptidos de esta invención son estables en formulación y tienen largas vidas medias y larga duración de acción in vivo cuando se derivatizan. Los poiipéptidos de la presente invención proporcionan una nueva terapia para pacientes con, por ejemplo, trastornos metabólicos tales como los que resultan de la secreción endógena de insulina disminuida, en particular los diabéticos tipo 2, o para pacientes con intolerancia a la glucosa, un estado prediabético que tiene una leve alteración en la secreción de insulina. Además, los poiipéptidos de la presente invención pueden ser útiles en la prevención y/o tratamiento de la diabetes tipo 1 , diabetes gestacional, diabetes de inicio en la madurez (MODY), diabetes autoinmune latente del adulto (LADA), y dislipidemia diabética asociada y otras complicaciones diabéticas, como así también hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, intolerancia a la glucosa en ayunas, dislipidemia, hipertrigliceridemia, Síndrome X y resistencia a la insulina. Los poiipéptidos de la presenten invención también pueden utilizarse en la prevención y/o tratamiento de la obesidad (por ejemplo, regulación del apetito e ingesta de alimentos), enfermedad aterosclerótica, hiperlipidemia, hipercolesteremia, bajos niveles de HDL, hipertensión, enfermedad cardiovascular (incluyendo aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad arterial coronaria e hipertensión), enfermedad cerebrovascular y enfermedad de vasos periféricos; y para la prevención y/o tratamiento del lupus, síndrome poliquístico de ovario, carcinogénesis e hiperplasia, asma, problemas de reproducción masculina, úlceras, trastornos del sueño, trastornos del metabolismo de los lípidos y los carbohidratos, disfunción circadiana, trastornos del crecimiento, trastornos de homeostasis de la energía, enfermedades inmunes incluyendo enfermedades autoinmunes (por ejemplo, el lupus eritematoso sistémico), como así también enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, shock séptico y otras condiciones identificadas en la presente, o funcionan de otro modo como se describe más adelante en la presente. En particular, un aspecto de la invención es un polipéptido seleccionado del grupo integrado por SEC ID NOs: 1 a 152, y fragmentos, derivados, y variantes del mismo que demuestren al menos una función biológica que sea sustancialmente igual que la de los polipéptidos de las SEC ID NOs. que se enumeran (colectivamente "polipéptidos de esta invención"), incluyendo equivalentes funcionales de los mismos. Una realización preferida de esta invención es un polipéptido seleccionado del grupo integrado por SEC ID NOs: 1 a 38 y SEC ID NOs: 115 a 152, y fragmentos, derivados y variantes del mismo que demuestren al menos una función biológica que sea sustancialmente igual que la de los polipéptidos de las SEC ID NOs. que se enumeran. Una realización más preferida de esta invención es un polipéptido seleccionado grupo integrado por SEC ID NOs: 1 a 5 y SEC ID NOs: 115 a 1 ísB, y fragmentos, derivados y variantes del mismo que demuestren al menos una función biológica que sea sustancialmente igual que la de los polipéptidos de las SEC ID NOs. que se enumeran. Una realización sobre todo preferida de esta invención es un polipéptido seleccionado del grupo integrado por SEC ID NOs: 1, 2, 115 y 116 y fragmentos, derivados y variantes del mismo que demuestren al menos una función biológica que sea sustancialmente igual que la de los polipéptidos de las SEC ID NOs. que se enumeran. Otra realización de la invención es un polipéptido que codifica los polipéptidos de la presente invención, y los vectores participantes y células huésped necesarias para expresar en forma recombinante los polipéptidos de esta invención. Estas secuencias polinucleotídicas incluyen SEC ID NOs: 154-264. También se proveen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen selectivamente a los polipéptidos de esta invención. Dichos anticuerpos son útiles en la detección de los polipéptidos de esta invención, y pueden identificarse y prepararse por procedimientos bien conocidos en el arte. Se han generado un anticuerpo IgG N-terminal policlonal y un anticuerpo Fab C-terminal monoclonal que reconocen polipéptidos de esta invención. La invención también se refiere a un método para el tratamiento de la diabetes, trastornos relacionados con la diabetes y/u otras enfermedades o condiciones afectados por los polipéptidos de esta invención, con preferencia afectados por la función agonista de VPAC2 de los polipéptidos de esta invención, en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los polipéptidos de la presente invención o cualquier polipéptido activo en VPAC2 tal como SEC ID NOs: 1 a 152, a dicho mamífero. También se describen métodos de obtención de los polipéptidos de esta invención, tanto recombinantes como sintéticos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1a-1d representan las secuencias de los aminoácidos de los polipéptidos de SEC ID NOs: 1 a 152. Las SEC ID NOs: 115-152 se refieren a péptidos que están pegilados en la cisteína del C-terminal por medio de un enlace maleimida. El PEG puede ser un PEG lineal de 22 kD o un PEG ramificado de 43 kD. La Figura 2 representa una secuencia de ADN (SEC ID NO: 153) clonada en pGEX-6P-1 para producir la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1. Los sitios BamHI y Xho I subrayados de las enzimas de restricción permiten la clonación dentro del marco en el vector de expresión pGEX-6P-1. La secuencia del dodecámero del ADN que codifica el sitio de reconocimiento del Factor Xa y los 2 codones de stop se destacan en negrita. La secuencia no destacada central codifica la SEC ID NO: 1 (secuencia de aminoácidos). Los codones mutados de VIP se representan mediante nucleótidos de cap (extremo inicial de una molécula de mARN) pequeño. Las Figuras 3a-3h representan las secuencias SEC ID NOs: 154 a 264. Estas secuencias de ácidos nucleicos codifican los polipéptidos de la presente invención. La Figura 4 es un gráfico de barras que ilustra la secreción insulínica de células de islotes de rata dispersas luego de ser expuestas a un péptido PEGilado de la presente invención. La Figura 5 es un gráfico de barras que demuestra la disponibilidad aumentada de glucosa en la rata por la vía subcutánea (SC) de administración de un péptido PEGilado de esta invención. La Figura 6 representa las tendencias de la estabilidad de tres análogos de VPAC2 (P5, P7 y el control, R3P66) a razón de 1 mg/ml en una solución acuosa que contiene NaCI 150 mM y fosfato 20 mM a pH 8,0 durante la incubación a 40°C. Las muestras se analizaron por electroforesis capilar para determinar la pureza del péptido. La pureza para los tiempos de 2 y 4 semanas se normalizó por la pureza porcentual al inicio.

La Figura 7 representa las tendencias de la estabilidad de tres análogos de VPAC2 (P5, P7 y el control, R3P66) a razón de 2 mg/ml en dimetiisulfóxido (DMSO) durante la ¦ incubación a 40°C. Las muestras se analizaron por electroforesis capilar para determinar la pureza del péptido. La pureza para los tiempos de 2 y 4 semanas se normalizó por la pureza porcentual al inicio. La Figura 8 ilustra el reconocimiento selectivo de un péptido PEGilado de extensión completa respecto de un péptido similar PEGilado en el cual existe una única deleción de aminoácido en el extremo N-terminal. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención provee polipéptidos novedosos, y fragmentos, derivados y variantes de los mismos que demuestran al menos una función biológica que es sustancialmente la misma que la de los polipéptidos de la Figura 1a-1d (colectivamente, polipéptidos de esta invención). Los polipéptidos de esta invención funcionan in vivo como agonistas de VPAC2 o de otro modo en la prevención y/o tratamiento de enfermedades o condiciones tales como la diabetes, incluyendo tanto la diabetes de tipo 1 y tipo 2, la diabetes gestacional, diabetes de inicio en la madurez (MODY) (Hermán, et al., Diabetes 43:40, 1994); la diabetes autoinmune latente del adulto (LADA) (Zimmet, et al., Diabetes Med. 11 :299, 994) y la dislipidemia diabética asociada y otras complicaciones diabéticas, como así también hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, intolerancia a la glucosa en ayunas, dislipidemia, hipeiijagliceridemia, Síndrome X y resistencia a la insulina. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden utilizarse también en la prevención y/o tratamiento de la obesidad (por ejemplo, regulación del apetito e ingesta de alimentos), enfermedad aterosclerótica, hiperlipidemia, hipercolesteremia, bajos niveles de HDL, hipertensión, enfermedad cardiovascular (incluyendo aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria, enfermedad arterial coronaria e hipertensión), enfermedad cerebrovascular y enfermedad de vasos periféricos; y para la prevención y/o tratamiento del lupus, síndrome poliquístico de ovario, carcinogénesis e hiperplasia, asma, problemas de reproducción masculina, úlceras, trastornos del sueño, trastornos del metabolismo de los lípídos y los carbohidratos, disfunción circadiana, trastornos del crecimiento, trastornos de homeostasis de la energía, enfermedades inmunes incluyendo enfermedades autoinmunes (por ejemplo, el lupus eritematoso sistémico), como así también enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, shock séptico y otras condiciones identificadas en la presente, o funcionan de otro modo como se describe más adelante en la presente. Con preferencia, los polipéptidos de esta invención estimularán la liberación de insulina de células pancreáticas ß de una manera glucosa-dependiente. Con mayor preferencia aún, los polipéptidos de esta invención son estables tanto en formulaciones acuosas como no acuosas y exhiben una vida media plasmática mayor de una hora. Los polipéptidos de esta invención son agonistas de VPAC2. Con preferencia, son agonistas selectivos de VPAC2 con una selectividad por VPAC2 al menos 10 veces mayor que por VPAC1 y/o PAC1. Con mayor preferencia, son agonistas selectivos de VPAC2 con una selectividad por VPAC2 al menos 100 veces mayor que por VPAC1 y/o PACI. Por sobre todo, con mayor preferencia, estimulan la liberación de insulina al plasma de manera glucosa-dependiente sin inducir estasis o incremento en el nivel de glucosa plasmática que es contraproducente para el tratamiento de, por ejemplo, la diabetes tipo 2. Además, es preferible que los polipéptidos de esta invención sean agonistas selectivos del receptor VPAC2, provocando por ello, por ejemplo, un aumento de la liberación de insulina al plasma, siendo al mismo tiempo selectivos frente a otros receptores que son responsables de efectos colaterales tan desagradables o peligrosos como la retención gastrointestinal de agua, y/o efectos cardiovasculares indeseables tales como el ritmo cardíaco aumentado. Los polipéptidos de esta invención son también estables en formulaciones acuosas y no acuosas. Con preferencia, los polipéptidos de esta invención exhibirán menos de un 10% de degradación a 37-40°C en un periodo de una semana, al disolverse en agua (a pH entre 7-8) o un solvente orgánico no acuoso. Con mayor preferencia aún, los polipéptidos de esta invención exhibirán menos de un 5% de degradación a 37-40°C en un período de una semana, al disolverse en agua (a pH entre 7-8) o un solvente orgánico no acuoso. Asimismo, las composiciones y formulaciones de la presente invención pueden comprender polipéptidos de la presente invención y entre aproximadamente 2% y aproximadamente 30% de DIVISO. En otra realización de la presente invención, las composiciones y formulaciones pueden incluir opcionalmente entre aproximadamente 0,2% y aproximadamente 3% (p/v) de solventes adicionales tales como propilenglicol, dimetilformamida, carbonato de propileno, polietilenglicol y triglicéridos. Finalmente, es preferible que los polipéptidos derivatizados de esta invención exhiban una vida media plasmática de al menos una hora en ratas después de una inyección IV, más preferible que la vida media plasmática sea de al menos 2 horas, y aún más preferible que la vida media plasmática sea de al menos 3 horas. Los polipéptidos de esta invención proveen una nueva terapia para pacientes con secreción endógena de insulina disminuida o intolerancia a la glucosa, en particular diabetes tipo 2. Es decir que los polipéptidos de la presente invención son agonistas de VPAC2 de acción prolongada que pueden utilizarse para mantener, mejorar y restaurar la secreción de insulina glucosa-estimulada. Más aún, un agonista peptídico selectivo del receptor VPAC2 aumentará la secreción de insulina glucosa-dependiente en el páncreas sin provocar los efectos colaterales asociados con la activación no selectiva de los otros receptores de PACAP. Se definirán ahora ciertos términos utilizados a lo largo de esta memoria descriptiva y otros serán definidos al introducirse. La abreviatura de una sola letra para un aminoácido particular, su correspondiente aminoácido y la abreviatura de tres letras, son como sigue: A, alanina (ala); C, cisteína (cys); D, ácido aspártico (asp); E, ácido glutámico (glu); F, fenilalanina (phe); G, glicina (gly); H, histidina (his); I, isoleucina (ile); K, Usina (lys); L, leucina (leu); M, metionina (met); N, asparagina (asn); P, prolina (pro); Q, glutamina (gln); R, arginina (arg); S, serina (ser); T, treonina (thr); V, valina (val); W, triptofano (trp); Y, tirosina (tyr). El término "polinucleótido que codifica un polipéptido" abarca a un polinucleótido que incluye sólo la secuencia codificadora para el polipéptido, como así también a un polinucleótido que incluye a una secuencia adicional codificadora o no codificadora. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que se hibridizan a las secuencias descriptas más arriba si hay al menos aproximadamente un 70%, con preferencia al menos aproximadamente un 90%, y con mayor preferencia al menos aproximadamente 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención particularmente se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos que se hibridizan en condiciones rigurosas a los polinucleótidos arriba descriptos. Según se emplea en la presente, el término "condiciones rigurosas" significa "condiciones rigurosas de hibridización". Con preferencia, la hibridización ocurrirá sólo si hay al menos aproximadamente un 90% y con preferencia aproximadamente un 95% a 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridizan a los polinucleótidos arriba descriptos en una realización preferida codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por los cADNs. "Equivalente funcional" y "sustancialmente la misma función o actividad biológica" significa, cada uno, aquel grado de actividad biológica que está entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 100% o más de aquella actividad biológica demostrada por el polipéptido al cual se está comparando cuando la actividad biológica de cada polipéptido se determina por el mismo procedimiento. Por ejemplo, un polipéptido que es funcionalmente equivalente a un polipéptido de la Figura 1 es uno que, cuando se prueba en el ensayo de proximidad por centelleo del AMP cíclico (cAMP) del Ejemplo 7, demuestra acumulación de cAMP en la línea celular CHO que expresa al receptor humano VPAC2. Un polipéptido de esta invención que es un agonista de VPAC2 es uno que demuestra entre aproximadamente un 30% y aproximadamente un 100% o más de la máxima actividad agonista PACAP-27 VPAC2 cuando se ensaya en el protocolo del Ejemplo 7. Los polipéptidos preferidos de esta invención que son agonistas selectivos para VPAC2 en comparación con los receptores PACAP, VPAC1 y PAC1 son aquellos polipéptidos que exhiben una relación de actividad agonista de VPAC2 respecto de la actividad de VPAC1 de aproximadamente 10:1 o mayor, y con mayor preferencia aproximadamente 100:1 o mayor, y/o exhiben una relación de actividad agonista de VPAC2 respecto de la actividad del receptor PAC1 de aproximadamente 10:1 o mayor, y con mayor preferencia aproximadamente 100:1 o mayor, cuando el polipéptido se ensaya en el protocolo del Ejemplo 7, usando células que expresen los receptores apropiados.

"Condiciones de hibridización rigurosas" se refiere a una incubación hasta el día siguiente de los dos polinucleótidos (o fragmentos) a hibridizar a 42°C en una solución que comprende formamida al 50%, 5x SSC (NaCI 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, dextran sulfato al 10% y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado sometido a agitación violenta, seguido de lavado de los filtros en 0,lx SSC a alrededor de 65°C. Los términos "fragmento," "derivado," y "variante," cuando se refieren a los polipéptidos de la Figura 1, significan fragmentos, derivados, y variantes de los polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que dichos polipéptidos, según se describe más abajo. Un análogo incluye un pro-polipéptido que incluye dentro de sí la secuencia de aminoácidos del polipéptido de esta invención. El polipéptido activo de esta invención puede escindirse de los aminoácidos adicionales que completan la molécula del pro-polipéptido mediante procesos naturales ¡n vivo o mediante procedimientos bien, conocidos en el arte, tales como ruptura enzimática o química.. Por ejemplo, el péptido VIP nativo de 28 aminoácidos se expresa naturalmente como un polipéptido mucho más grande que luego se procesa in vivo para liberar el péptido activo maduro activo de 28 aminoácidos. Un fragmento es una porción del polipéptido que retiene una actividad funcional sustancialmente similar, co¾no se describe en los modelos in vivo expuestos en la presente. Un derivado incluye todas las modificaciones al polipéptido que preservan sustancialmente las funciones expuestas en la presente e incluyen estructura adicional y función concomitante (por ejemplo, polipéptidos PEGilados que tienen mayor vida media), polipéptidos de fusión que confieren especificidad de búsqueda o una actividad adicional tal como toxicidad para un determinado blanco, según se describe más abajo. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales purificados o polipéptidos sintéticos. El fragmento, derivado o variante de los polipéptidos de la presente invención puede ser (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos se sustituyen con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (con preferencia un residuo de aminoácido conservado) y dicho residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de propolipéptido, o (v) uno en el cual la secuencia del polipéptido se fusiona con un polipéptido más grande (por ejemplo, albúmina humana, un anticuerpo o Fe, para duración mayor del efecto). Dichos fragmentos, derivados y variantes y análogos se consideran dentro del alcance de aquellos con experiencia en el arte a partir de las enseñanzas de la presente. Con preferencia, los derivados de la presente invención contendrán sustituciones de aminoácidos conservativas (definidas más abajo) realizadas en uno o más residuos de aminoácidos programados con preferencia no esenciales. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse a partir de la secuencia de tipo salvaje de una proteína sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acídicas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). No se realizarían sustituciones no conservativas para residuos de aminoácidos conservados o para residuos de aminoácidos presentes dentro de un dominio de proteína conservado, tal como los residuos 19 y 27, en donde dichos residuos son esenciales para la actividad de la proteína, tal como la actividad de VPAC2 y/o la selectividad de VPAC2. Los fragmentos o porciones biológicamente activas incluyen fragmentos de polipéptido adecuados para usar como medicamento, para generar anticuerpos, como reactivo para investigación y similares. Los fragmentos incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente similares a o derivadas de las secuencias de aminoácidos de un polipéptido de esta invención y que exhiben al menoéiuna actividad de ese polipéptido, pero que incluyen menos aminoácidos que los polipéptidos de extensión completa expuestos en la presente. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad del polipéptido. Una porción biológicamente activa de un polipéptido puede ser un péptido que tenga una longitud de, por ejemplo, cinco o más aminoácidos. Dichas porciones biológicamente activas pueden prepararse en forma sintética o mediante técnicas recombinantes y pueden evaluarse respecto de una o más de las actividades funcionales de un polipéptido de esta invención por medios expuestos en la presente y/o bien conocidos en el arte. Más aún, los derivados preferidos de la presente invención incluyen polipéptidos maduros que se han fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido y/o reducir la potencial inmunogenicidad del polipéptido (por ejemplo polietilenglicol, "PEG"). En el caso de la PEGilación, la fusión del polipéptido al PEG puede lograrse por cualquier medio conocido por un experto en el arte. Por ejemplo, la PEGilación puede efectuarse introduciendo primero una mutación de cisteína en el polipéptido para dotarlo de un grupo vinculante con el cual unirse al PEG, seguido de derivatización sitio-específica con PEG-maleimida. La cisteína puede agregarse al extremo C-terminal de los péptidos y es el sitio preferido en esta invención, (ver, por ejemplo, Tsutsumi, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97(15):8548-53, 2000; Veronese, Biomaterials 22:405-417, 2001 ; Goodsoon & Katre, Bio/Technology 8:343-346, 1990). Las variantes de los polipéptidos de esta invención incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos de Jas SEC ID NOs de la Figura 1 o un dominio de las mismas. El término "suficientemente similar" significa una primera secuencia de aminoácidos que contiene un número suficiente o naínimo de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos de modo que la primera y segunda secuencias de aminoácidos tengan un dominio estructural común y/o actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que es al menos aproximadamente 45%, con preferencia aproximadamente 75% a 98%, idéntico se definen en la presente como suficientemente similares. Con preferencia, las variantes serán suficientemente similares a la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos preferidos de esta invención. Las variantes incluyen variantes de polipéptidos codificados por un polinucleótido que se hibridiza a un polinucleótido de esta invención o un complemento del mismo en condiciones rigurosas. Dichas variantes generalmente retienen la actividad funcional de los polipéptidos de esta invención. Pueden usarse bibliotecas de fragmentos de los polinucleótidos para generar una población variegata de fragmentos para la detección y posterior selección. Por ejemplo, puede generarse una biblioteca de fragmentos tratando un fragmento de PCR de doble hebra de un polinucleótido con una nucleasa en condiciones en las cuales el mellado ocurre sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de doble hebra, renaturalizando el ADN para obtener ADN de doble hebra que puede incluir pares con sentido/antisentido de diferentes productos mellados, eliminando porciones de una hebra de los dúplexes reformados por tratamiento con S1 nucleasa, y ligando la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifique fragmentos N-terminales e internos de varios tamaños del polipéptido de esta invención. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a mutagénesis. Las variantes que funcionan como agonistas de VPAC2 pueden identificarse rastreando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes de truncamiento, de los polipéptidos de esta invención para detectar actividad agonista de VPAC2. En una realización, se genera una biblioteca variegata de análogos por mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico y es codificada por una biblioteca génica variegata. Puede producirse una biblioteca variegata de variantes, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos para dar secuencias génicas tales que un conjunto degenerado de secuencias de aminoácido de variantes potenciales sea expresable como polipéptidos individuales o, alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo para despliegue de fagos) que contenga el conjunto de secuencias en las mismas. Existe una variedad de métodos que pueden utilizarse para producir bibliotecas de variantes potenciales a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador de ADN automático, y el gen sintético ligarse luego en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias de variantes potenciales. Se conocen en el arte métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados (ver, por ejemplo, Narang, Tetrahedron 39:3, 1983; Itakura, et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; Itakura, et al., Science 198:1056, 1984; Ike, et al., Nucleic Acid Res. 11 :477, 1983). Se conocen en el arte varias técnicas para rastrear productos génicos de bibliotecas combinatorias preparados por mutaciones puntuales o truncamiento y para rastrear bibliotecas de cADN en busca de productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para el rastreo rápido de las bibliotecas génicas generadas por la mutagénesis combinatoria de polipéptidos R-agonistas. Las técnicas más ampliamente utilizadas, que se prestan para el análisis de alto rendimiento para rastrear grandes bibliotecas génicas típicamente incluyen clonar la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores y expresar los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilite el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de ensamble recursivo (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede usarse en combinación con los ensayos de rastreo para identificar las variantes deseadas.. La invención también provee polipéptidos quiméricos o de fusión. La secuencia de reconocimiento se diseña para localizar el envío del polipéptido al páncreas para minimizar potenciales efectos colaterales. Los polipéptidos de esta invención pueden estar compuestos por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o por enlaces peptídicos modificados (es decir, isósteros de péptidos), y pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos del código genético. Los polipéptidos pueden modificarse ya sea por procesos naturales, tales como el procesamiento post-traduccional, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en el arte. Dichas modificaciones están bien descriptas en textos básicos y en monografías más detalladas, como así también en una abundante literatura de investigación. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminales. Podrá apreciarse que el mismo tipo de modificación puede estar presente en grados iguales o variables en varios sitios de un dado polipéptido. También, un dado polipéptido puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ser ramificados, por ejemplo, como consecuencia de la ubiquitinacion, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados, y cíclicos ramificados pueden provenir de procesos de post-traducción naturales o pueden obtenerse por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen la acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un grupo hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosf atid il inositol , entrecruzamiento, delación, formación de uniones disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formulación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de un ancla de GPI, hidroxilación, iodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, premiación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por el ARN de transferencia, tal como la arginilación, y ubiquitinación (ver, por ejemplo, Proteins, Structure and Molecular Properties, 2da. ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic Press, New York, páginas. 1-12 (1983); Seifter, et al., Meth. Enzymol 182:626-646, 1990; Rattan, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62, 1992). Los polipéptidos de la presente invención incluyen a los polipéptidos de la Figura 1 (SEC ID NOs: 1 a 152), como así también aquellas secuencias que tienen variaciones no sustanciales en la secuencia a partir de ellos. Una "variación no sustancial" incluiría cualquier variante por adición, sustitución o deleción de una secuencia que mantenga sustancialmente al menos una función biológica de los polipéptidos de esta invención, con preferencia la actividad agonista de VPAC2, y con mayor preferencia la actividad agonista selectiva de VPAC2 y, por sobre todo con mayor preferencia, la actividad secretora de insulina demostrada en la presente. Estos equivalentes funcionales pueden incluir con preferencia polipéptidos que tienen al menos aproximadamente un 90% de identidad con los polipéptidos de la Figura 1 , y con mayor preferencia al menos un 95% de identidad con los polipéptidos de la Figura 1 , y aún con mayor preferencia al menos aproximadamente un 97% de identidad con los polipéptidos de la Figura 1 , y también incluyen porciones de dichos polipéptidos que tienen sustanciaimente la misma actividad biológica. Sin embargo, cualquier polipéptido que tenga una variación no sustancial en la secuencia de aminoácidos respectó de los polipéptidos de la Figura 1 que demuestre equivalencia funcional según se describe más adelante en la presente se incluye en la memoria descriptiva de la presente invención. Como es conocido en el arte, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Dichas sustituciones conservativas incluyen las descriptas más arriba y por Dayhoff (The Atlas of Protein Secuence and Structure 5, 1978), y por Argos (E BO J. 8:779-785, 1989). Por ejemplo, los aminoácidos pertenecientes a uno de los siguientes grupos representan cambios conservativos: - ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; - cys, ser, tyr, thr; - val, ile, leu, met, ala, phe; - lys, arg, his; - phe, tyr, trp, his; y - asp, glu. La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos de esta invención, como así también a los vectores que incluyen estos polinucleótidos, células huésped que se modifican mediante ingeniería genética con vectores de la invención, y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Las células huésped pueden modificarse mediante ingeniería genética (transducidas, transformadas o transfectadas) con los vectores de esta invención, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, in forma de plásmido, de partícula viral, de fago, etc. Las células modificadas por ingeniería genética pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados según corresponda para activar promotores o seleccionar transformantes. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y será evidentes para el artesano con experiencia común. El polinucleótido de la presente invención puede emplearse para producir un polipéptido por técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, la secuencia del polinucleótido puede incluirse en cualquiera de una variedad de vehículos de expresión, en particular vectores o plásmidos para expresar un polipéptido. Dichos vectores incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no-cromosómicas y sintéticas (por ejemplo, derivadas de SV40); plásmidos bacterianos; ADN fagos; plásmidos de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fagos; ADN virales tales como el de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela del pollo y pseudo rabia. Sin embargo, cualquier otro vector o plásmido puede utilizarse siempre que sean replicables y viables en el huésped. La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado mediante procedimientos conocidos en el arte. Dichos procedimientos y otros se consideran dentro del alcance de aquellos con experiencia en el arte. La secuencia de ADN del vector de expresión está operativamente unida a una secuencia(s) de control de expresión apropiada (promotor) para dirigir la síntesis del mARN. Ejemplos representativos de tales promotores incluyen, pero sin ser limitativos, el promotor LTR o SV40, el lac o trp de E. coli, el promotor lambda PL de fago y otros promotores de los que se sabe controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción, y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión con preferencia contienen un gen para conferir un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas tal como la dihidrofolato reductasa o la resistencia a la neomicina para el cultivo de células eucariotas, o tal como la resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli. El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se describió más arriba en la presente, como así también una secuencia promotora o de control apropiada, puede emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese la proteína. Ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero sin ser limitativos, células bacterianas, tales como E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces; células fúngicas, tales como levadura; células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como la de CHO, COS, o de melanoma de Bowes; adenovirus; células de plantas, etc. La selección de un huésped apropiado se considera dentro del alcance de aquellos con experiencia en el arte a partir de las enseñanzas de la presente. La presente invención también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más de las secuencias descriptas ampliamente más arriba. Los constructos comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, dentro del cual se ha insertado una secuencia de la invención, con orientación hacia adelante o invertida. En un aspecto preferido de esta realización, el constructo comprende además secuencias regulatorias, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operativamente unido a la secuencia. Un gran número de vectores y promotores adecuados son conocidos por aquellos con experiencia en el arte y se adquieren en el comercio. Se proveen los siguientes vectores a modo de ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9, pBS, fagoscript, psiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a, pTRC99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, y PRIT5. Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG, y PSVL. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sean replicables y viables en el huésped. Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado usando vectores CAT(cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionares. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos con nombres particulares incluyen a laci, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucariotas incluyen al promotor temprano inmediato de CMV, al de la timidina quinasa de HSV, al SV40 temprano y tardío, a los LTRs de retrovirus, y a la metalotioneína-l de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está dentro del nivel de la capacidad ordinaria del arte. La presente invención también se refiere a células huésped que contienen el constructo arriba descripto. La célula huésped puede ser una célula eucariota superior tal como una célula de mamífero o una célula eucariota inferior tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariota tal como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped puede efectuarse por transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano o electroporación (Davis, et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986). Los constructos de las células huésped pueden utilizarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. En forma alternativa, los polipéptidos de la invención pueden producirse en forma sintética mediante sintetizadores de péptidos convencionales. Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias, u otras células bajo el control de promotores apropiados. Pueden emplearse también sistemas de traducción libres de células para producir dichas proteínas utilizando ARNs derivados de los constructos de ADN de la presente invención. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para utilizar con huéspedes procariotas y eucariotas en Sambrook, et a!., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), cuya descripción se incorpora por la presente a modo de referencia. La transcripción de un ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa insertando una secuencia exaltadora en el vector. Los exaltadores son elementos que actúan en cis respecto del ADN, habitualmente de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 300 pb, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen al exaltador dei lado tardío del origen de replicación (pb 10Ü a 270), un exalíador del promotor temprano del ciíomegaiovirus, un exaltador de polioma del lado fardío del origen de replicación, y exalíadores de adenovirus. Generálmenle, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de la replicación y marcadores seieccionables que permiíen ia transformación de la célula huésped (por ejemplo, el gen de la resistencia a la ampicilina de E. coli o el gen TRP1 de S. eerevisiae), y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abaje. Dichos promotores pueden derivar de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como la 3~fosfoglicerato quinasa (PGK), el factor ot, la fosfaíása ácida, o las proíeínas dé choque íérmico, eníre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase apropiada con secuencias de traducción, iniciación y terminación, y, con preferencia, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida al interior del espacio periplásmico o al medio extraceíular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que inclúye un péptido de identificación N-terminal que imparte las características deseadas (por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado). Pueden construirse vectores de expresión útiles para uso bacteriano insertando una secuencia de ADN estructural que codifique una proteína deseada junto con señales adecuadas de traducción, iniciación y terminación en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector puede comprender uno o más marcadores seleccionares fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si se desea, proveer amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procariotas adecuados adecuados para la transformación incluyen, por ejemplo, a E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros según la elección. Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionare y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmidos de origen comercial que comprenden elementos genéticos del bien conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, a pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega, Madison, Wis., USA). Estas secciones de "cadena principal" de pBR322 pueden combinarse con un promotor apropiado y la secuencia estructural a ser expresada.

Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y del crecimiento de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se desreprime por medios adecuados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan por un período adicional. Las células se cosechan típicamente por centrifugación, se someten a disrupción por medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se retiene para una purificación ulterior. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden someterse a disrupción por cualquier método conveniente, incluyendo los ciclos congelación-descongelación, la sonicación, la disrupción mecánica o el uso de agentes para el lisado celular. Pueden emplearse también diversos sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar proteínas recombinantes. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen a las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono descriptas por Gluzman, (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, como por ejemplo las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender un origen de replicación, un promotor y exaltador adecuados y también cualesquiera sitios de unión a ribosomas, sitio de poliadenilación, sitios de dador y aceptor de empalme, secuencias de terminación transcripcional y secuencias no transcriptas de flanqueado en 5' que sean necesarios. Las secuencias de ADN derivadas del gen ma viral SV40, por ejemplo la de origen de SV40, la promotora temprana, exaltadora, de empalme y los sitios de poliadenilación, pueden usarse para suministrar los elementos genéticos no transcriptos requeridos. Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes por métodos utilizados hasta ahora, incluyendo la precipitación con sulfato de amonio o etanol, la extracción con ácidos, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía sobre fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía de afinidad, la cromatografía sobre hidroxiapatita, y la cromatografía de lectinas. Pueden usarse los pasos de replegamiento de proteínas, de ser necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para los pasos finales de purificación. Los polipéptidos de esta invención pueden ser producto de procedimientos de síntesis o producirse por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota o eucariota (por ejemplo células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos). Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de esta invención pueden ser glicosilados con carbohidratos de mamíferos u otros eucariotas, o pueden ser no glicosilados. Los polipéptidos de esta invención pueden incluir también un residuo inicial del aminoácido metionina. Un polipéptido aislado o purificado de esta invención, o porción biológicamente activa del mismo, está sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por medio de técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores u otras sustancias químicas cuando se lo sintetiza químicamente. Con preferencia, un polipéptido aislado de «esta invención está sustancialmente libre de material celular y tiene menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de no-polipéptido, o material contaminante. Cuando el polipéptido de esta invención o una porción biológicamente activa del mismo se produce en forma recombinante, con preferencia el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 30% del volumen de la preparación del polipéptido. Cuando esta invención se produce por síntesis química, con preferencia las preparaciones contienen menos de aproximadamente el 30% en peso seco de precursores químicos o de sustancias químicas ajenas a la invención. Los polipéptidos de esta invención pueden aislarse convenientemente según se describe en los ejemplos específicos más adelante. Una preparación de polipéptido purificado tiene una pureza de por lo menos aproximadamente el 70%; con preferencia, las preparaciones tienen una pureza de entre aproximadamente 85% y aproximadamente 99%. La pureza de las preparaciones puede evaluarse por cualquier medio conocido en el arte, tal como electroforesis en gel de SDS- poliacrilamida y Espectroscopia de Masa/Cromatografía Líquida. Las secuencias de polinucleótido que codifican un polipéptido de esta invención pueden sintetizarse, total o parcialmente, usando métodos químicos bien conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Caruthers, et al., Nucí. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn, et al., Nucí. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980). El polinucleótido que codifica el polipéptido puede luego clonarse en un vector de expresión para expresar el polipéptido. Como comprenderán aquellos con experiencia en el arte, puede resultar ventajoso producir secuencias del nucleótido codificador del polipéptido que posean codones de existencia no natural. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped particular procariota o eucariota pueden seleccionarse para aumentar la velocidad de expresión del polipéptido o para producir un transcripto de ARN y propiedades tales como una vida media que es más larga que la de un transcripto generado a partir de la secuencia natural. Las secuencias nucleotídicas descriptas en la presente pueden someterse a ingeniería genética utilizando métodos generalmente conocidos en el arte para alterar las secuencias codificadoras del polipéptido por una variedad de razones, incluyendo, pero sin ser limitativos, alteraciones que modifiquen el cierre, el procesamiento y/o la expresión del polipéptido o del mARN producto. La transposición de secuencias (en inglés, shuffling) del ADN por fragmentación aleatoria y reensamblado por PCR de fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos puede utilizarse para obtener por ingeniería genética las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, puede usarse la mutagénesis sitio-dirigida para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de empalme, introducir mutaciones, etcétera. También se proveen compuestos, dentro del conocimiento de aquellos con experiencia en el arte, tales como miméticos químicos, organomiméticos o peptidomiméticos. Según se emplean en la presente, los términos "mimético", "péptido mimético" "peptidomimético" "organomimético" y "mimético químico" pretenden abarcar a derivados de péptidos, análogos de péptidos y compuestos químicos que tienen una disposición de átomos en una orientación tridimensional que es equivalente a la de un péptido de la presente invención. Se comprenderá que la frase "equivalente a", según se emplea en la presente, pretende abarcar compuestos que tienen sustitución (sustituciones) de ciertos átomos, o restos químicos en dicho péptido, que tienen longitudes de enlace, ángulos de enlace y disposiciones en el compuesto mimético que producen la misma o suficientemente similar disposición u orientación de dichos átomos y restos como para tener la función biológica de los péptidos de la invención. En los péptidos miméticos de la invención, la disposición tridimensional de los constituyentes químicos es estructural y/o funcionalmente equivalente a la disposición tridimensional de la cadena principal del péptido de las cadenas laterales de los aminoácidos componentes del péptido, determinando que dichos peptidomiméticos, organomiméticos, y miméticos químicos de los péptidos de la invención tengan una actividad biológica sustancial. Estos términos se utilizan de conformidad con el conocimiento del arte, según se ilustra, por ejemplo, en Fauchere, (Adv. Drug Res. 15:29, 1986); Veber & Freidinger, (TINS p.392, 1985); y Evans, et al., (J. ed. Chem. 30:1229, 1987), incorporados a la presente a modo de referencia. Se comprende que existe un farmacóforo para la actividad biológica de cada péptido de la invención. Se entiende en el arte que un farmacóforo comprende una definición idealizada, tridimensional de los requerimientos estructurales para la actividad biológica. Los peptidomiméticos, organomiméticos, y miméticos químicos pueden diseñarse para corresponderse con cada farmacóforo, con software de computadora de modelado común (diseño de fármacos asistido por computadora). Dichos miméticos pueden producirse por análisis de estructura-función, en base a la información posicional de los átomos sustituyentes de los péptidos de la invención. Los péptidos provistos por la invención pueden sintetizarse en forma ventajosa por cualquiera de las técnicas de síntesis químicas conocidas en el arte, particularmente técnicas de síntesis en fase sólida, por ejemplo utilizando sintetizadores de péptidos automáticos disponibles en el comercio. Los miméticos de la presente invención pueden sintetizarse por métodos en fase sólida o en fase solución utilizados convencionalmente para la síntesis de péptidos (ver, por ejemplo, Merrifield, J. Amer. Chem. S c. 85:2149-54, 1963; Carpino, Acc. Chem. Res. 6:191-98, 1973; Birr, Aspects of the Merrifield Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Heidelberg, 1978; The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vols. 1 , 2, 3, y 5, (Gross & Meinhofer, eds.), Academic Press: New York, 1979; Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, III., 1984; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957-89, 1988; y Gregg, et al., Int. J. Peptide Protein Res. 55:161-214, 1990, los cuales se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad). Se prefiere el uso de una metodología en fase sólida. Resumidamente, se une un residuo de aminoácido C-terminal N-protegido a un soporte insoluble tal como poliestireno entrecruzado con divinilbenceno, resina de poliacrilamida, Kieselguhr/poliamida (pepsina K), vidrio de poro controlado, celulosa, membranas de polipropileno, barras de polietileno recubiertas de ácido acrílico o similares. Se utilizan ciclos de desprotección, neutralización y acoplamiento de los sucesivos derivados de aminoácidos protegidos para unirlos aminoácidos del extremo C- terminal de acuerdo a la secuencia de aminoácidos. Para algunos péptidos sintéticos, puede usarse una estrategia de FMOC utilizando una resina sensible a los ácidos. Los soportes sólidos preferidos a este respecto son las resinas de poliestireno entrecruzado con divinilbenceno, que se adquieren en el comercio en una variedad de formas funcionalizadas, incluidas la resina clorometilada, resina hidroximetilada, resina paraacetamidometilada, benzhidrilamino resina (BHA), 4-metilbenzhidrilamino resina (MBHA), resina con grupos oxima, resina derivada del alcohol 4-alcoxibencílico (resina de Wang), resina de 4-(2',4'-dimetoxifenilaminometil)-fenoximetilo, resina de 2,4-dimetoxibenzhidril-amina y resina de 4-(2',4,-dimetoxifenil-FMOC-amino-metil)-fenoxiacetamidonorleucil-MBHA (resina amida MBHA de Rink). Además, las resinas sensibles a los ácidos proveen ácidos C-terminales, si se ¿lesea. Un grupo protector particularmente preferido para alfa aminoácidos es el 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC) sensible a las bases. Son bien conocidos en el arte los grupos protectores adecuados para las funciones de las cadenas laterales de los aminoácidos químicamente compatibles con los grupos BOC (t-butiloxicarbonilo) y FMOC. Cuando se utiliza la química basada en FMOC, se prefieren los siguientes derivados de aminoácidos protegidos: F OC-Cys(Trit), F OC-Ser(But), FMOC-Asn(Trit), FMOC-Leu, FMOC-Thr(Trit), FMOC-Val, FMOC-Gly, FMOC-Lys(Boc), FMOC-Gln(Trit), FMOC- Glu(OBut), FMOC-His(Trit), FMOC-Tyr(But), FMOC-Arg(PMC (2,2,5,7,8- pentametilcroman-6-sulfonil)), FMOC-Arg(BOC)2, FMOC-Pro y FMOC-Trp(BOC). Los residuos de aminoácidos pueden acoplarse usando una variedad de agentes de acoplamiento y procedimientos químicos conocidos en el arte, tales como acoplamiento directo con DIC (düsopropil-carbodiimida), DCC (diciclohexil- carbodiimida), BOP (hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetil- aminofosfonio), PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino- fosfonio), PyBrOP (hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfonio); por medio de anhídridos simétricos preparados; por medio de ésteres activos tales como ésteres de pentafluorofenilo; o por medio de ésteres activos de HOBt (1-hidroxibenzotriazol) preparados o utilizando fluoruro y cloruros de FMOC-aminoácidos o utilizando anhídridos de N-carboxi-FMOC-aminoácidos. Se prefiere la activación con HBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il),1 ,1,3,3-tetrametiluronio) o HATU (hexafluorofosfato de 2-(1H-7-aza-benzotriazol-1-il),1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio) en presencia de HOBt o HOAt (7-azahidroxi-benzotriazol). El método en fase sólida puede llevarse a cabo en forma manual, aunque se prefiere la síntesis automatizada üen un sintetizador de péptidos disponible comercialmente (por ejemplo Applied Biosystems 431 A o similar; Applied Biosystems, Foster City, CA). En una síntesis típica, el primer aminoácido (C-terminal) se carga en la resina clorotritilada. Pueden usarse la sucesiva desprotección (con piperidina/NMP (N-metilpirrolidona) 20%) y ciclos de acoplamiento de acuerdo a los protocolos de ABI FastMoc (Applied Biosystems) para generar la secuencia del péptido. Pueden usarse también el acoplamiento doble y triple, con capping por medio de anhídrido acético. El péptido mimético sintético puede escindirse de la resina y desprotegerse por tratamiento con TFA (ácido trifluoroacético) conteniendo secuestrantes apropiados. Pueden utilizarse muchos de los mencionados reactivos de escisión, tales como el Reactivo K (0,75 g de fenol cristalino, 0,25 mi de etanoditiol, 0,5 mi de tioanisol, 0,5 mi de agua deionizada, 10 mi de TFA) y otros. El péptido se separa de la resina por filtración y se aisla por precipitación con éter. La purificación adicional puede lograrse por métodos convencionales, tales como filtración con gel y HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) de fase reversa. Los miméticos sintéticos de acuerdo con la presente invención pueden estar en forma de sales aceptables para uso farmacéutico, en especial sales de adición con bases que incluyen sales de bases orgánicas e inorgánicas. Las sales de adición con bases de los residuos de aminoácidos acídicos se preparan por tratamiento del péptido con la base orgánica o inorgánica apropiada, de acuerdo con procedimientos bien conocidos por aquellos con experiencia en el arte, o la sal deseada puede obtenerse directamente por liofilización de la base apropiada. En general, aquellos con experiencia en el arte reconocerán que los péptidos descriptos en la presente pueden modificarse por una variedad de técnicas químicas para producir péptidos que tengan esencialmente la misma actividad que el péptido no modificado, y que tengan opcionalmente otras propiedades deseables. Por ejemplo, los grupos ácido carboxílico del péptido pueden suministrarse en forma de sal de un catión aceptable para uso farmacéutico. Los grupos amino dentro del péptido pueden estar en forma de sal de adición aceptable para uso farmacéutico, tal como el clorhidrato, bromhidrato, acetato, benzoato, toluen sulfonato, maleato, tartrato y otras sales orgánicas, o pueden convertirse en una amida. Los tioles pueden protegerse con cualquiera de una serie de grupos protectores bien reconocidos, tales como los grupos acetamida. Aquellos con experiencia en el arte también reconocerán métodos para introducir estructuras cíclicas dentro de los péptidos de esta invención de modo que la configuración de unión nativa se aproximará más cercanamente. Por ejemplo, un residuo de cisteína carboxilo terminal o amino terminal puede agregarse al péptido de modo que cuando se oxide, el péptido contendrá un enlace disulfuro, generando por ello un péptido cíclico. Otros métodos de delación de péptidos incluyen la formación tioéteres y amidas y ésteres carboxilo- y amino- terminales. Específicamente, se dispone de una variedad de técnicas para construir derivados y análogos de péptidos con la misma o similar actividad biológica deseada que el correspondiente compuesto peptídico pero con una actividad más favorable que el péptido con respecto a la solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a la hidrólisis y proteólisis. Dichos derivados y análogos incluyen péptidos modificados en el grupo amino N-terminal, en el grupo carboxilo C-terminal, y/o cambiar uno o más de los enlaces amida del péptido por un enlace no amídico. Se comprenderá que dos o más de tales modificaciones pueden acoplarse en una estructura de péptido mimético (por ejemplo modificación en el grupo carboxilo C-terminal e inclusión de un enlace -CH2- carbamato entre dos aminoácidos del péptido). .¡i. Las modificaciones del amino terminal incluyen la alquilación, acetilación, adición de un grupo carbobenzoílo y la formación de un grupo succinimida. Específicamente, el grupo amino N-terminal se puede hacer reaccionar para dar un grupo amida de fórmula RC(0)NH — en donde R es alquilo, con preferencia alquilo inferior, y se adiciona por reacción con un halogenuro de ácido, RC(0)CI o un anhídrido de ácido. Típicamente, la reacción puede llevarse adelante poniendo en contacto cantidades aproximadamente equimolares o en exceso (por ejemplo aproximadamente 5 equivalentes) de un halogenuro de ácido con el péptido en un diluyente inerte (por ejemplo, diclorometano) conteniendo con preferencia un exceso (por ejemplo aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria tal como diisopropiletilamina, para captar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son en otro orden convencionales (por ejemplo temperatura ambiente durante 30 minutos). La alquilación del amino terminal para dar una N-sustitución con alquilo inferior seguida de reacción con un halogenuro de ácido según se describió más arriba dará un grupo N-alquil amida de fórmula RC(0)NR-. Como alternativa, el amino terminal puede unirse covalentemente a un grupo succinimida por reacción con anhídrido succínico. Se utiliza una cantidad aproximadamente equimolar o un exceso de anhídrido succínico (por ejemplo aproximadamente 5 equivalentes) y el grupo amino terminal se convierte en la succinimida por métodos bien conocidos en el arte, incluyendo el uso de un exceso (por ejemplo 10 equivalentes) de una amina terciaria tal como diisopropiletilamina en un solvente inerte adecuado (por ejemplo diclorometano), según se describe en Wollenberg, et al., (Patente Norteamericana No. 4.612.132), y se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad. Se entenderá también que el grupo succínico puede estar sustituido con, por ejemplo, un alquilo de C2- a C6- o sustituyentes --SR, quekse preparan de manera convencional para dar succinimida sustituida en el extremo N-terminal del péptido. Dichos sustituyentes alquilo pueden prepararse por reacción de una olefina inferior (alquilo de C2- a C6-) con anhídrido maleico de la manera descripta por Wollenberg, et al., supra., y los sustituyentes --SR pueden prepararse por reacción de RSH con anhídrido maleico, donde R es lo definido más arriba. En otra realización ventajosa, el amino terminal puede derivatizarse para formar un grupo benciloxicarbonil-NH-- o un benciloxicarbonil-NH-- sustituido. Este derivado puede producirse por reacción con aproximadamente una cantidad equivalente o un exceso de cloruro de benciloxicarbonilo (CBZ-CI), o un CBZ-CI sustituido en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo diclorometano) conteniendo con preferencia una amina terciaria para captar el ácido generado durante la reacción. En otro derivado más, el extremo N-terminal comprende un grupo sulfonamida por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo 5 equivalentes) de R~S(0)2CI en un diluyente inerte adecuado (diclorometano) para convertir el amino terminal en una sulfonamida, en donde R es alquilo y con preferencia alquilo inferior. Con preferencia, el diluyente inerte contiene una amina terciaria en exceso (por ejemplo 10 equivalentes) tal como diisopropiletilamina, para captar el ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son en otro orden convencionales (por ejemplo temperatura ambiente durante 30 minutos). Pueden producirse grupos carbamato en el amino terminal por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo 5 equivalentes) de R-OC(0)CI o R-OC(0)OC6H4-p-N02 en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo diclorometano) para convertir el amino terminal en un carbamato, en donde R es alquilo, con preferencia alquilo inferior. Con preferencia, el diluyente inerte contiene un exceso (por ejemplo aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, tal como diisopropiletilamirta, para captar cualquier ácido generado durante la reacción. Las condiciones de reacción son en otro orden convencionales (por ejemplo temperatura ambiente durante 30 minutos). Pueden formarse grupos urea en el amino terminal por reacción con una cantidad equivalente o un exceso (por ejemplo 5 equivalentes) de R-N=C=0 en un diluyente inerte adecuado (por ejemplo diclorometano) para convertir el amino terminal en un grupo urea (es decir, RNHC(O)NH-) en donde R es lo definido más arriba. Con preferencia, el diluyente inerte contiene un exceso (por ejemplo aproximadamente 1? equivalentes) de una amina terciaria tal como diisopropiletilamina. Las condiciones de reacción son en otro orden convencionales (por ejemplo temperatura ambiente durante 30 minutos). En la preparación de los péptido miméticos en los cuales el grupo carboxilo C-terminal puede reemplazarse por un éster (por ejemplo --C(0)OR en donde R es alquilo y con preferencia alquilo inferior), pueden emplearse las resinas usadas para preparar los ácidos peptídicos, y el péptido con la cadena lateral protegida puede escindirse con una base y el alcohol apropiado (por ejemplo metanol). Los grupos protectores de cadena lateral pueden eliminarse de la manera habitual por tratamiento con fluoruro de hidrógeno para obtener el éster deseado. En la preparación de los péptido miméticos en los cuales el grupo carboxilo C-terminal se reemplaza por la amida -C(0)NR3R4, se utiliza una resina de benzhidrilamina como soporte sólido para la síntesis de péptidos. Al completarse la síntesis, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno para liberar el péptido del soporte da lugar directamente a la amida libre del péptido (es decir, el extremo C-terminal es -C(0)NH2). Como alternativa, el uso de la resina clorometilada durante la síntesis del péptido acoplada con reacción con amoníaco para escindir el péptido con la cadena lateral protegida del soporte da la amida libre del péptido, y la reacción con una alquilamina o una dialquilamina tia una alquilamida o dialquilamida con la cadena lateral protegida (es decir, el extremo C-terminal es -C(0)NRRi, en donde R y Ri son alquilo y con preferencia alquilo inferior). La protección de la cadena lateral luego se elimina de la manera habitual por tratamiento con fluoruro de hidrógeno para dar las amidas, alquilamidas o dialquilamidas libres.

En otra realización alternativa, el grupo carboxilo C-terminal o un éster C- terminal pueden ser inducidos a ciclarse por desplazamiento del -OH o del éster (- -OR) del grupo carboxilo o éster, respectivamente, con el grupo amino N-terminal para formar un péptido cíclico. Por ejemplo, después de la síntesis y escisión para dar el ácido del péptido, el ácido libre se convierte en solución en un éster activado mediante un activante de grupos carboxilo apropiado tal como la diciclohexilcarbodiimida (DCC), por ejemplo, en cloruro de metileno (CH2CI2), dimetil formamida (DMF) o mezclas de los mismos. Luego el péptido cíclico se obtiene por desplazamiento del éster activado con la amina N-terminal. La ciclación, más que la polimerización, puede priorizarse por el uso de soluciones muy diluidas de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. Los péptido miméticos como se los conoce en el arte y los provistos por la invención son estructu raímente similares al péptido de la invención, pero tienen uno o más enlaces peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo integrado por: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2~, -CH=CH- (en ambos confórmeros cis y trans), --COCH2--, -CH(OH)CH2- y CH2SO-, por métodos conocidos en el arte y descriptos más extensamente en las siguientes referencias: Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, (Weinstein, ed.), Marcel Dekker: New York, p. 267, 1983; Spatola, Peptide Backbone Modifications 1 :3, 1983; orley, Trends Pharm. Sci. pp. 463-468, 1980; Hudson, et al., lk. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185, 1979; Spatola, et al., Life Sci. 38:1243-1249, 1986; Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314, 1982; Almquist, et al., J. ed. Chem. 23:1392-1398, 1980; Jennings-White, et al., Tetrahedron Lett. 23:2533, 1982; Szelke, et al., EP045665A; Holladay, et al., Tetrahedron Lett. 24:4401-4404, 1983; y Hruby, Life Sci. 31 :189-199, 1982; cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia. Dichos péptidos miméticos pueden tener significativas ventajas sobre las realizaciones de los polipéptidos, incluyendo, por ejemplo, ser más económicos para producir, tener mayor estabilidad química o propiedades farmacológicas mejoradas (tales como vida media, absorción, potencia, eficacia, etc.), antigenicidad reducida y otras propiedades. Los miméticos análogos de los péptidos de la invención también pueden obtenerse utilizando los principios del diseño de fármacos convencionales o racionales (ver, por ejemplo, Yrews, et al., Proc. Alfred Benzon Symp. 28:145-165, 1990; cPherson, Eur. J. Blochem. 189:1-24, 1990; Hol, et al., in Molecular Recognition: Chemical and Blochemical Problems, (Roberts, ed.); Royal Society of Chemistry; pp. 84-93, 1989a; Hol, Arzneim-Forsch. 39:1016-1018, 1989b; Hol, Agnew Chem. Int. Ed. Engl. 25:767-778, 1986; cuyas descripciones se incorporan a la presente a modo de referencia). De acuerdo con los métodos del diseño de fármacos convencional, las moléculas miméticas deseadas se pueden obtener ensayando en forma aleatoria las moléculas cuyas estructuras tienen un atributo en común con la estructura de un péptido "nativo". La contribución cuantitativa que resulta de un cambio en un grupo particular de una molécula de unión puede determinarse midiendo la actividad biológica del mimético putativo en comparación con la actividad del péptido. En una realización preferida de diseño racional de fármacos, el mimético se diseña para compartir un atributo de la conformación tridimensional más estable del péptido. Así, por ejemplo, el mimético puede diseñarse para poseer grupos químicos que se orienten de una manera suficiente como para producir interacciones iónicas, hidrofóbicas, o de van der Waals que sean similares a las exhibidas por los péptidos de la invención, según se describe en la presente.

El método preferido para realizar el diseño racional de miméticos emplea un sistema de computación capaz de formar una representación de la estructura tridimensional del péptido, tal como los ejemplificados por Hol, 1989a; Hol, 1989b; y Hol, 1986. Pueden producirse estructuras moleculares de los péptido-, órgano-, y químico-miméticos de los péptidos de la invención usando programas de diseño asistidos por computadora disponibles comercialmente en el arte. Ejemplos de dichos programas incluyen a SYBYL 6.5®, HQSAR™, y ALCHEMY 2000™ (Tripos); GALAXY™ y AM2000™ (AM Technologies, Inc., San Antonio, TX); CATALYST™ y CERIUS™ (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA); CACHE PRODUCTS™, TSAR™, AMBER™, y CHEM-X™ (Oxford Molecular Products, Oxford, CA) y CHEMBUILDER3D™ (Interactive Simulations, Inc., San Diego, CA).

Los péptido-, órgano- y químico-miméticos producidos utilizando los péptidos descriptos en la presente utilizando, por ejemplo, programas de modelado molecular reconocidos en el arte, pueden producirse usando técnicas de síntesis química convencionales, diseñadas sobre todo con preferencia para facilitar el rastreo de alto rendimiento, incluyendo los métodos químicos combinatorios. Los métodos combinatorios útiles en la producción de los péptido-, órgano- y químico-miméticos de la invención incluyen arreglos de despliegue de fagos, síntesis en fase sólida y arreglos químicos combinatorios, provistos, por ejemplo, por SIDDCO (Tuscon, Arizona); Tripos, Inc.; Calbiochem/Novabiochem (San Diego, CA); Symyx Technologies, Inc. (Santa Clara, CA); Medichem Research, Inc. (Lemont, IL); Pharm-Eco Laboratories, Inc. (Bethlehem, PA); o N.V. Organon (Oss, Holanda). La producción química combinatoria de los péptido-, órgano- y químico-miméticos de la invención puede producirse de acuerdo con métodos conocidos en el arte, incluyendo, pero sin ser limitativos, las técnicas descriptas en Terrett, (Combinatorial Chemistry, Oxford University Press, London, 1998); Gallop, et al., J. Med. Chem. 37:1233-51 , 1994; Gordon, et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401 , 1994; Look, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:707-12, 1996; Ruhly, et al., J: Amer. Chem. Soc. 118: 253-4, 1996; Gordon, et al., Acc. Chem. Res. 29:144-54, 1996; Thompson & Ellman, Chem. Rev. 96:555-600, 1996; Fruchtel & Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:17-42, 1996; Pavía, "The Chemical Generation of Molecular Diversity", Network Science Center, wvwv.netsci.org, 1995; AADNn, et al., "Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization," Id., 1995; Davies y Briant, "Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity," Id., 1995; Pavia, "Chemically Generated Screening Librarles: Present and Future," Id., 1996; y las Patentes Norteamericanas Nos. 5.880.972; 5.463.564; 5.331.573; y 5.573.905. Los polipéptidos recién sintetizados pueden purificarse en forma sustancial mediante cromatografía líquida preparativa de alta resolución (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures And Molecular Principies, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983). La composición de un polipéptido sintético de la presente invención puede confirmarse por análisis de aminoácidos o secuenciación, por ejemplo, mediante el procedimiento de degradación de Edman (Creighton, supra). Además, cualquier porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse usando métodos químicos con secuencias de otras proteínas para producir una variante de polipéptido o un polipéptido de fusión. Un polipéptido de la invención también puede emplearse de acuerdo con la presente invención por expresión de dicho polipéptido in vivo, la cual se denomina a menudo "terapia génica." Así, por ejemplo, se pueden modificar células por ingeniería genética con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica para el polipéptido ex vivo, las células así tratadas pueden entonces suministrarse a un paciente para ser tratado con el polipéptido. Dichos métodos son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, se pueden modificar células por ingeniería genética mediante procedimientos conocidos en el arte por el uso de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica el polipéptido de la presente invención. La administración local de los secretagogos de insulina utilizando terapia génica puede proveer el agente terapéutico al área blanco (por ejemplo el páncreas). Por ejemplo, se utilizó un promotor páncreas-específico para crear un modelo de tumor de células ß pancreáticas en ratones (Hanahan, Nature 315(6015): 115-22, 1985). Las metodologías de terapia génica tanto ¡n vitro como in vivo están consideradas. Se conocen diversos métodos para transferir genes potencialmente terapéuticos a poblaciones celulares definidas (ver, por ejemplo, Mulligan, Science 260:926-31 , 1993). Estos métodos incluyen, por ejemplo: 1 ) Transferencia directa de genes (ver, por ejemplo, Wolff, et al., Science 247:1465-68, 1990); 2) Transferencia de ADN mediada por liposomas (ver, por ejemplo, Caplen, et al., Nature Med. 3:39-46, 1995; Crystal, Nature Med. 1 :15-17, 1995; Gao y Huang, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-85 1991 ); 3) Transferencia de ADN mediada por retrovirus (ver, por ejemplo, Kay, et al., Science 262: 117-19, 1993; Yerson, Science 256:808-13, 1992). 4) Transferencia de ADN mediada por virus de ADN. Dichos virus de ADN incluyen, por ejemplo, los adenovirus (con preferencia vectores basados en Ad-2 o Ad-5), virus del herpes (con preferencia vectores basados en virus herpes simplex) y parvovirus (con preferencia vectores basados en parvovirus "defectuosos" o no-autónomos, con mayor preferencia vectores basados en virus adeno-asociados, por sobre todo con preferencia vectores basados en AAV-2) (ver, por ejemplo, Ali, et al., Gene Therapy 1 :367-84, 1994; Patente Norteamericana No. 4.797.368; Patente Norteamericana No. 5.139.941 ; incorporadas a la presente a modo de referencia. La selección de un sistema vector particular para transferir el gen de interés dependerá de una variedad de factores. Un factor importante es la naturaleza del objetivo de población de células. Aunque los vectores retrovirales han sido extensamente estudiados y usados en un número de aplicaciones y terapias génicas, estos vectores son en general inadecuados para infectar células que no se dividen. Además, los retrovirus tienen potencial para oncogenicidad. Sin embargo, desarrollos recientes en el campo de los vectores lentivirales pueden sortear algunas de estas limitaciones (véase, por ejemplo, Naldini, et al., Science 272:263-67, 1996). Los retrovirus de los que se pueden derivar vectores retrovirales plasmidios incluyen a, pero sin ser limitativos, virus de oloney de leucemia de múridos, virus de necrosis del bazo, retrovirus tales como virus de sarcoma de Rous, virus de sarcoma de Harvey, virus de leucosis de aves, virus de leucemia de monos gibón, virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, virus de sarcoma mieloproliferativo y virus de tumor mamario. Los adenovirus tienen la ventaja de tener un ámbito amplio de huéspedes, pueden infectar células quiescentes o diferenciadas en forma terminal, tales como neuronas o hepatocitos, y parecen esencialmente no oncogénicos (véase, por ejemplo, Ali, et al., 1994). Los adenovirus no parecen integrarse en el genoma huésped. Debido a que ellos existen en forma extra-cromosómica, el riesgo de mutagénesis de inserción se reduce enormemente. Ali, et al., 1994. Los virus adeno asociados exhiben ventajas similares como vectores basados en adenovirus. Sin embargo, los AAV exhiben integración específica de emplazamiento por integración sobre el cromosoma 19 humano (véase, por ejemplo, Ali, et al., 1994). En una realización preferida, el ADN que codifica el polipéptido secretagogo de insulina de esta invención se usa en terapia génica para trastornos tales como diabetes y trastornos relacionados con la diabetes. De acuerdo con esta realización, la terapia génica con polipéptidos secretagogos de insulina o muteínas que codifican ADN de esta invención, se suministra a un paciente que la necesita, en forma concurrente con, o inmediatamente después del diagnóstico. El artesano experto apreciará que cualquier vector de terapia génica que contenga secretagogos de polipéptido de insulina, fragmentos de ADN o derivados de ADN, o variantes de secretagogos de polipéptido de insulina, se pueden usar de acuerdo con esta realización. Las técnicas para construir tales vectores son bien conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Yerson, Nature 392:25-30, 1998; Verma, et al., Nature 389:239-242, 1998). La introducción de vectores que contienen ADN secretagogos de polipéptido de insulina en el sitio objetivo, se puede llevar a cabo usando técnicas conocidas. El vector puede incluir uno o más promotores. Los promotores adecuados que se pueden emplear incluyen, pero no están limitados a, el LTR retroviral, el promotor SV40; y el promotor del citomegalovirus humano (CMV) (Miller, et al., Biotechniques 7(9):980-990, 1989), o. cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como promotores de células eucariotas incluyendo, pero no limitados a, los promotores de histona, pol III, y ß-actina). Otros promotores virales que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK) y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente a los expertos en el arte a partir de las enseñanzas contenidas aquí. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido de la presente invención están bajo el control de un promotor adecuado. Promotores adecuados que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovirales tales como el promotor adenoviral mayor final o promotores heterológicos, tales como el promotor citomegalovirus (CMV); el promotor respiratorio de virus sincitial (RSV); promotores inducibles tales como el promotor MMT (metalotioneina); promotor de choque (shock) térmico; el promotor de albúmina; el promotor de ApoAl; el promotor de globina humana; promotores virales de timidina quinasa, tales como el promotor de timidina quinasa de Herpes Simplex; los LTR retrovirales (incluyendo el retroviral LTR modificado descrito aquí más arriba); el promotor ß-actina; y el promotor humano de crecimiento hormonal. El promotor puede ser también el promotor nativo que controla el gen que codifica el polipéptido. El vector retroviral plasmídico se puede emplear para transducir líneas de células de empaquetamiento para formar líneas de células productoras.. Ejemplos de células de empaquetamiento que se pueden transfectar incluyen, pero no se limitan a, líneas de células del PE501, PA317, ?-2, ?-??, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, vj/CRE, CRIP, GP+E-86, GP+envAm12, y DAN, tales como se describen en Miller (Hum. Gene Ther. 1:5-14, 199Q), que se incorpora aquí como referencia en forma completa. El vector puede transducir las células de empaquetamiento a través de medios conocidos en el arte. Tales medios, incluyen pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación con CaP0 . En una alternativa, el vector retroviral plasmídico se puede encapsular dentro de un liposoma, o ser acoplado a un lípido y luego administrado a un huésped. La línea de célula productora genera partículas vectores retrovirales infecciosos que incluyen la(s) Secuencia(s) del ácido nucleico que codifican los polipéptidos. Tales partículas de vector retroviral se pueden luego emplear, para transducir células eucarióticas, ya sea in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresarán la Secuencia(s) del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Las células eucarióticas que se pueden transducir incluyen, pero no se limitan a, células embrionarias troncales, células embrionarias de carcinoma, así como células hematopoyéticas troncales, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células bronquiales epiteliales. Una aproximación diferente a la terapia génica es la "terapia transcariótica" en la cual las células del paciente se tratan ex vivo para inducir los genes dormidos cromosómicos para producir la proteína de interés después de reintroducción al paciente. La terapia transcariótica asume que el individuo tiene un normal complemento de genes necesarios para la activación. La terapia transcariótica involucra introducir un promotor u otra Secuencia exógena regulatoria capaz de activar los genes nacientes, en las células cromosómicas de ADN de los pacientes ex vivo, cultivando y seleccionando células productoras de proteína, y luego reintroduciendo las células activadas en el paciente con la intención de que se vuelvan totalmente establecidas. Las células "activadas por gen", luego producen las proteínas de interés durante algún lapso de tiempo significativo, quizás durante tanto como toda la vida del paciente (véase, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5.641.670 y 5.733.761 y que se incorporan aquí como referencia en su totalidad). También se incluyen en esta invención anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que ligan selectivamente los polipéptidos de esta invención. Cualquier tipo de anticuerpo conocido en el arte se puede generar usando los métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede generar un anticuerpo para ligarse específicamente a un epítopo de un polipéptido de esta invención. "Anticuerpo" como se usa aquí incluye moléculas intactas de inmunoglobulina, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, y Fv, que son capaces de ligarse a un epítopo de un polipéptido de esta invención. Típicamente, al menos se requieren 6, 8, 10 o 12 amino ácidos contiguos para formar un epítopo. Sin embargo, los epítopos que involucran amino ácidos no contiguos pueden requerir más amino ácidos, por ejemplo, al menos 5, 25, ó 50 amino ácidos. Un anticuerpo que se liga específicamente a un epítopo de un polipéptido de esta invención se puede usar en forma terapéutica, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como manchas Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmmunoquímicos conocidos en el arte. Se pueden usar varios ¡nmunoensayos para identificar anticuerpos que tienen la especificidad adecuada. Son bien conocidos en el arte numerosos protocolos para ligadura competitiva o ensayos inmunoradiométricos. Tales ¡nmunoensayos típicamente involucran la medición de formación de complejos entre un inmunógeno y un anticuerpo que se ligue específicamente a un immunógeno. Típicamente, un anticuerpo que se ligue específicamente a un polipéptido de esta invención provee una señal de detección de al menos 5, 10, o 20 veces mayor que la señal de detección provista con otras proteínas cuando se usan en un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que se ligan específicamente a un polipéptido de esta invención rio detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar un polipéptido de esta invención a partir de la solución.

Los polipéptidos de esta invención se pueden usar para inmunizar a mamíferos, tales como ratón, rata, conejo, cerdo de guinea, mono, o humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, un polipéptido de esta invención se puede conjugar a una proteína vehículo, tales como albúmina de suero bovino, tiroglobulina y hemocianina extraída de lapa californiana (KLH). Dependiendo de las especies huésped, se pueden usar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y substancias con actividad de superficie (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polioles, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina extraída de lapa californiana y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en humanos, son especialmente útiles: BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales que se ligan específicamente a un polipéptido de esta invención se pueden preparado usando cualquier técnica que provea la producción de moléculas de anticuerpos por líneas de células continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma EBVe (Kohier, et al., Nature 256:495-97, 1985; Kozbor, et al., J. Immunol. Methods 81:3142, 1985; Cote, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 80:2026-30, 1983; Colé, et al., Mol. Cell Biol. 62:109-20, 1984). Además, se pueden usar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el empalme de genes anticuerpo de ratones a genes anticuerpos humanos para obtener una molécula con apropiadas especificidad antígena y actividad biológica, (Morrison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 81:6851-55, 1984; Neuberger, et al., Nature 312:604-08, 1984; Takeda, et al., Nature 314:452-54, 1985). Anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos se pueden también "humanizar" para prevenir que un paciente desarrolle una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando se usa en forma terapéutica. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en Secuencia a anticuerpos humanos para ser usados directamente en terapia o pueden requerir alteración de unos pocos residuos biológicos clave. Las diferencias de Secuencia entre anticuerpos de roedores y Secuencias humanas se pueden hacer mínimas reemplazando residuos que difieren de los que están en las Secuencias humanas por sitios dirigidos a mutagénesis de residuos individuales o por rallado de las regiones enteras que determinan la complementaridad. Alternativamente, los anticuerpos humanizados se pueden producir usando métodos recombinantes (véase, por ejemplo, GB2188638B). Los anticuerpos que se ligan específicamente a un polipéptido de esta invención pueden contener sitios de ligadura antigénica que pueden ser ya sea parcialmente o totalmente humanizados, como se revela en la Patente Norteamericana No. 5.565.332. Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadenas simples se pueden adaptar usando métodos conocidos en el arte para producir anticuerpos de cadenas simples que se liguen específicamente a un polipéptido de esta invención. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero con composición idiotípica distinta se pueden generar por desordenación de la cadena a partir de bibliotecas de inmunoglobulina combinatoria aleatoria (Burton, Proc. Nati. Acad. Sci. 88:11120-23, 199 ). Los anticuerpos de cadena simple se pueden también construir usando métodos de amplificación de ADN, tales como PCR, usando el hibridoma de cADN como patrón (Thirion, et al., Eur. J. Cáncer Prev. 5:507- , 1996). Los anticuerpos de cadena simple pueden ser mono o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos tetravalentes, biespecíficos de cadena simple se enseña, por ejemplo, en Coloma & Morrison (Nat. Biotechnol. 15:159-63, 1997). La construcción de anticuerpos bivalentes, biespecíficos de cadena simple se enseña en Mallender & Voss (J. Biol. Chem. 269:199-206, 1994). Una Secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo de cadena simple se puede construir usando síntesis de nucleótido manual o automática, clonado en una expresión construida usando métodos estándar de ADN recombinante e introducido en céíulas para expresar la Secuencia de codificación, como se describe más abajo. Alternativamente, los anticuerpo de cadena simple se pueden producir directamente usando, por ejemplo, tecnología de fagos filamentosos (Verhaar, et al., Int. J. Cáncer 61 :497-501 , 1995; Nicholls, et al., J. Immunol. Meth. 165:81-91, 1993). Los anticuerpos que se ligan específicamente a un polipéptido de esta invención se pueden también producir induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o por selección de archivos de inmunoglobulina o paneles de reactivos ligantes de alta especificidad como se revela en la literatura (Orlyi, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 86:38333-37, 1989; Winter, et al., Nature 349:293-99, 1991 ). Otros tipos de anticuerpos se pueden construir y usar en forma terapéutica en métodos de esta invención. Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos quiméricos como se revela en WO 93/03151. Se pueden también preparar las proteínas ligantes que se derivan de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, tales como los "diacuerpos" (véase, por ejemplo, WO 94/13804,).

Los anticuerpos humanos con la habilidad de ligarse a los polipéptidos de esta invención se pueden también identificar a partir del archivo de MorphoSys HuCAL® como sigue. Un polipéptido de esta invención se puede recubrir en una plaqueta de microtitulación e incubar con el archivo de MorphoSys HuCAL® Fab fago. Aquellos Fabs unidos a fagos que no se ligan al polipéptido de esta invención se pueden" sacar por lavado de la plaqueta, dejando solo el fago que está firmemente ligado al polipéptido de esta invención. El fago ligado se puede eluir, por ejemplo, por cambio en el pH o por elusión con E. coli y amplificado por infección de huéspedes de E. coli. Este proceso de separación se puede repetir una vez o dos veces para enriquecer para una a población de anticuerpos que se liguen fuertemente al polipéptido de esta invención. Los Fabs a partir de la combinación enriquecida luego se expresan, se purifican y se seleccionan en un ensayo de ELISA. Los anticuerpos de acuerdo a esta invención, se pueden purificar por métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por pasaje sobre una columna en la que está ligado un polipéptido de esta invención. Los anticuerpos ligados se pueden luego eluir de la columna usando un buffer con una alta concentración de sales. Los polipéptidos de la presente invención, como resultado de la habilidad de estimular la secreción de insulina de células de los islotes pancreáticos in vitro, y causando una disminución en la glucosa en sangre in vivo, se pueden emplear en el tratamiento de la diabetes, incluyendo ambos tipos 1 y tipo 2 de diabetes (diabetes mellitus, no dependiente a insulina). Tal tratamiento puede también demorar la aparición de diabetes y complicaciones diabéticas. Los polipéptidos se pueden usar para prevenir que sujetos con tolerancia disminuida a la glucosa procedan a desarrollar diabetes tipo 2. Otras enfermedades y condiciones que se pueden tratar o prevenir usando compuestos de esta invención en métodos de esta invención incluyen: diabetes de los jóvenes de aparición en la madurez (MODY) (Hermán, et al., Diabetes 43:40, 1994); diabetes latente autoinmune de adultos (LADA) (Zimmet, et al., Diabetes Med. 11 :299, 1994); tolerancia disminuida a la glucosa (IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1 ):S5, 1999); glucosa disminuida en el ayuno (IFG) (Charles, et al., Diabetes 40:796, 1991 ); diabetes gestacional (Metzger, Diabetes, 40:197, 1991); y síndrome X metabólico. Los poiipéptidos de la presente invención pueden también ser efectivos en trastornos tales como la obesidad y en el tratamiento de la enfermedad aterosclerótica, hiperlipidemia, hipercolesteremia, bajos niveles de HDL, hipertensión, enfermedad cardiovascular (incluyendo aterosclerosis, enfermedad coronaria del corazón, enfermedad coronaria arterial y hipertensión), enfermedad cerebrovascular y enfermedad periférica de los vasos y para el tratamiento de lupus, síndrome poliquístico ovárico, carcinogénesis e hiperplasia, asma, problemas de reproducción del hombre, úlceras, trastornos del sueño, trastornos de los lípidos y del metabolismo de carbohidratos, disfunción circadiana, trastornos del crecimiento, trastornos de homeostasis energética, enfermedades inmune incluyendo enfermedades autoinmune (por ejemplo, lupus sistémico, lupus eritemaíoso, así como enfermedades inflamatorias agudas y crónicas y shock séptico. Los compuestos de la presente invención también pueden ser útiles para tratar trastornos fisiológicos relacionados a, por ejemplo, diferenciación celular para producir células que acumulan .ípidos, regulación de la sensibilidad a la insulina y niveles de glucosa en sangre, que están involucradas en, por ejemplo, la función anormal pancreática de células ß, tumores de secreción de insulina y/o hipoglucemia autoinmune debida a autoanticuerpos de insulina, autoanticuerpos de receptor de insulina o autoanticuerpos que son estimulantes de células pancreáticas ß, diferenciación de macrófagos que conducen a la formación de placas ateroscleróticas, respuesta inflamatoria, carcinogénesis, hiperplasia, expresión de gen de adipocito, diferenciación de adipocito, reducción en la masa pancreática de células ß, secreción de insulina, sensibilidad de los tejidos a la insulina, crecimiento de células de liposarcoma, enfermedad poliquística ovárica, anovulación crónica, hiperirogenismo, producción de progesterona, esteroidogénesis, estrés en células de potencial redox y oxidativo, generación de síntesis de óxido nítrico (NOS), aumento de gamma glutamil transpeptidasa, catalasa, tríglicéridos plasmáticos y niveles de colesterol LDL y similares. Compuestos de esta invención se pueden usar también en métodos de esta invención para tratar causas secundarias de la diabetes (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Supp. 1):S5, 1999). Tales causas secundarias incluyen exceso de glucocorticoide, exceso de hormona, feocromocitoma y diabetes inducidas por drogas. Las drogas que pueden inducir diabetes incluyen, pero no se limitan a, piriminil, ácido nicotínico, glucocorticoides, fenitoina, hormona tiroidea, agentes ß-adrenérgicos, a-interferón y drogas usadas para tratar la infección de HIV. Además, los polipéptidos de esta invención se pueden usar para tratamiento de asma (Bolin, et al., Biopolymer 37:57-66, 1995; Patente Norteamericana No. 5.677.419; que muestra que los polipéptidos R3P0 es activo para relajar el músculo blando traqueal del cerdo de guinea); inducción de hipotensión (VIP hipotensión inducida por VIP, taquicardia y rubor facial en pacientes asmáticos (Morice, et al., Peptides 7:279-280, 1986; Morice, et al., Lancet 2:1225-1227, 1983); problemas de reproducción masculina (Siow, et al., Arch. Yrol. 43(1 ):67-71 , 1999); como agente anti-apoptosis / neuroprotector (Brenneman, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:207-12, 1998); cardioprotección durante sucesos isquémicos ( Kalfin, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1268(2):952- 8, 1994; Das, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:297-308, 1998), manipulación del reloj circadiano y sus trastornos asociados (Hamar, et al., Cell 109:497-508, 2002; Shen, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 97:1 1575-80, 2000), y finalmente como agente anti úlcera (Tuncel, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:309-22, 1998). Los polipéptidos de la presente invención se pueden usar solos o en combinación con terapias adicionales y/o compuestos conocidos para los expertos en el arte en el tratamiento de diabetes y trastornos relacionados. Alternativamente, los métodos y compuestos descritos aquí se pueden usar, parcialmente o completamente, en terapias de combinación. Los polipéptidos de la presente invención se pueden también administrar en combinación con otras terapias conocidas para el tratamiento de diabetes, incluyendo agonistas PPAR, drogas de sulfonilurea, secretagogos de no sulfonilurea, inhibidores de a-glucosidasa, sensibilizadores de insulina, secretagogos de insulina, compuestos que bajan la producción de glucosa hepática, drogas insulínicas y anti-obesidad. Tales terapias se pueden administrar antes de o en forma concurrente con o después de la administración de los polipéptidos de esta invención. La insulina incluye tanto a las formas de acción corta como larga y formulaciones de insulina. Los agonistas PPAR pueden incluir agonistas de cualquier subunidad PPAR o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los agonistas PPAR pueden incluir agonistas de PPAR-a, PPAR-?, PPAR-d o cualquier combinación de dos o tres de las subunidades de PPAR. Los agonistas PPAR incluyen, por ejemplo, rosiglitazona y pioglitazona. Las drogas de sulfonilurea incluyen, por ejemplo, gliburida, glimepirida, clorpropamida, y glipizida. Los inhibidores de a-glucosidasa que pueden ser útiles para tratar cuando se administran con un polipéptido de esta invenció incluyen acarbosa, miglitol y voglibosa. Los sensibilizantes de insulina que pueden ser útiles para tratar diabetes incluyen tiazolidindionas y no tiazolidíndionas. Los compuestos que bajan la producción de glucosa hepática que pueden útiles para tratar diabetes cuando se administran con un polipéptido de esta invención incluyen metformina, tales como Glucofago y Glucofago XR. Los secretagogos de Insulina pueden ser útiles para tratar diabetes cuando se administran con un polipéptido de esta invención incluyen drogas de sulfonilurea y no sulfonilurea. GLP-1 , GIP, secretina, nateglinida, meglitinida, repaglinida, glibenclamida, glimepirida, clorpropamida, glipizida. El GLP-1 incluye derivados de GLP-1 con mayor vida media que el GLP- 1 nativo, tal como por ejemplo, GLP-1 derivado de ácidos grasos en una realización de la presente invención, polipéptidos de la presente invención se usan en combinación con secretagogos de insulina para aumentar la sensibilidad de células pancreáticas ß al secretagogo de insulina. Los polipéptidos de la presente invención se pueden también usar en métodos de la presente invención en combinación con drogas anti-obesidad. Las drogas anti-obesidad incluyen agonistas ß-3, antagonistas CB-1 , supresores de apetito, tales como, por ejemplo, sibutramina (Meridia) e inhibidores de lipasa, tal como, por ejemplo, orlistat (Xenical). Los polipéptidos de la presente invención se pueden también usar en métodos de la presente invención en combinación con drogas comúnmente usadas para tratar trastornos lípidos en pacientes diabéticos. Tales drogas incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de reductasa HMG-CoA, ácido nicotínico, secuestrantes de ácidos biliares, y derivados de ácido fíbrico. Los polipéptidos de la presente invención se pueden usar también en combinación con drogas anti hipertensivas, tales como, por ejemplo, bloqueantes ß e inhibidores ACE.

Tales co-terapias se pueden administrar en cualquier combinación de dos o más drogas (por ejemplo, un compuesto de la presente invención en combinación con un sensibilizador de insulina y una droga anti-obesidad). Tales coterapias se pueden administrar en forma de composiciones farmacéuticas, tales como las descritas más arriba. Varios términos se definen más abajo, tal como se usan aquí. Cuando se introducen elementos de la presente invención o de realizaciones preferidas de los mismos los términos "un," "el," y "dichos" tienen la intención de significar que hay uno o más elementos. Los términos "comprendiendo" "incluyendo" y "teniendo" tienen la intención de significar que puede haber elementos adicionales además de los elementos listados. El término "sujeto" como se usa aquí incluye mamíferos (por ejemplo, humanos y animales). El término "tratamiento" incluye cualquier proceso, acción, aplicación, terapia, o similares donde a un sujeto, incluyendo a un ser humano, se le provee ayuda médica con el objeto de mejorar la condición del sujeto, directamente o indirectamente o se hace más lenta la progresión de una condición o trastorno en el sujeto. El término "terapia de combinación" o "co-terapia" significa la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una condición y/o trastorno diabéticos. Tal administración engloba co-administración de dos o más agentes terapéuticos de una manera substancialmente simultánea, tales como en a cápsula única que tenga una relación fija de ingredientes activos o en cápsulas múltiples separadas, para cada agente inhibido. Además, tal administración incluye el uso de cada tipo de agentes terapéuticos en una manera secuencial.

La frase "terapéuticamente efectivo" significa que se administra la cantidad de cada agente que alcance la meta de mejorar en una condición diabética en la severidad de un trastorno, mientras se evita o hace mínimos los efectos laterales adversos asociados con un dado tratamiento terapéutico. El término "aceptable para uso farmacéutico" significa que el elemento es apropiado para uso en un producto farmacéutico. Basado en bien conocido ensayo usado para determinar la eficacia del tratamiento de trastornos identificados arriba en mamíferos y por comparación de estos resultados con los resultados de medicamentos conocidos que se usan para tratar esos trastornos, las dosis efectivas de los polipéptidos de esta invención se pueden determinar para el tratamiento de cada indicación deseada. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, polipéptidos) a ser administrado en el tratamiento de uno de estos trastornos puede variar ampliamente de acuerdo con tales consideraciones como el compuesto particular y la unidad de dosis empleada el modo de administración, el período de tratamiento, la edad y el sexo del paciente tratado y la naturaleza y extensión del trastorno tratado. La cantidad total del ingrediente activo a ser administrado puede generalmente variar entre aproximadamente 0,0001 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg, y preferiblemente desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal por día. Una unidad de dosis puede contener desde aproximadamente 0,05 mg hasta aproximadamente 1500 mg de ingrediente activo y puede se administrada una o más veces por día. La dosis diaria para administración por inyección, incluyendo inyecciones intramuscular, subcutánea y parenteral y el uso de técnicas de infusión puede ser desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 200 mg/kg. El régimen de dosis diaria rectal puede ser desde 0,01 hasta 200 mg/kg de peso corporal total. La concentración transdérmica puede la requerida para mantener una dosis diaria desde 0,01 hasta 200 mg/kg. Por supuesto, el régimen de dosis específica inicial y continuada para cada paciente será variable de acuerdo a la naturaleza y severidad de la condición como se determine por el que lo atienda para diagnosticar, la actividad del polipéptido específico empleado, la edad del paciente, la dieta del paciente, el tiempo de administración, la vía de administración, la velocidad de excreción de la droga, las combinaciones de drogas y similares. El modo de tratamiento deseado y el número de dosis de un polipéptido de la presente invención puede ser confirmado por los expertos en el arte, usando ensayos de tratamiento convencionales. Los polipéptidos de esta invención se pueden utilizar para alcanzar el efecto farmacológico deseado por administración a un paciente que lo necesite en una composición farmacéutica formulada adecuadamente. Un paciente, para los propósitos de esta invención, es un mamífero, incluyendo un humano, que necesite el tratamiento para un particular trastorno o enfermedad. Por lo tanto, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo aceptable para uso farmacéutico y una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido. Un vehículo aceptable para uso farmacéutico es cualquier vehículo que es relativamente no tóxico e inocuo para el paciente a concentraciones consistentes con la Actividad efectiva del ingrediente activo de manera que cualquier efecto lateral asignable al vehículo no perjudique los efectos benéficos del ingrediente activo. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido es la cantidad que produce un resultado o ejerce una influencia sobre el trastorno particular que está siendo tratado. Los polipéptidos descritos aquí se pueden administrar con un vehículo aceptable para uso farmacéutico usando cualquier forma de unidad de dosis efectiva convencional incluyendo por ejemplo, preparaciones inmediatas y de liberación retardada, en forma oral, parenteral, tópica o similar. Para administración oral, los polipéptidos se pueden formular en preparaciones sólidas tales como, por ejemplo, cápsulas, pildoras, tabletas, tabillas, caramelos, licuables, polvos, soluciones, suspensiones, o emulsiones y se pueden preparar de acuerdo a los métodos conocidos en el arte para la manufactura de composiciones farmacéuticas. Las formas de dosificación sólidas pueden ser una cápsula que puede ser del tipo común de envoltura dura o blanda de gelatina que contenga, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y rellenos inertes tales como lactosa, sucrosa, fosfato de calcio y almidón de maíz. En otra realización, los polipéptidos de esta invención se pueden tabletear con bases convencionales de tabletas tales como lactosa, sucrosa, y almidón de maíz e combinación con aglutinantes como acacia, almidón de maíz o gelatina; agentes desintegrantes se destinan a ayudar a la rotura y disolución de la tableta, después de su administración tales como almidón de papa (patata), ácido algínico, almidón de maíz y goma guar; los lubricantes se destinan a mejorar el flujo de la granulación de la tableta y para prevenir la adhesión del material de la tableta a la superficie de los moldes y matrices de tableta, por ejemplo, talco, ácido esteárico o estearato de magnesio, calcio o zinc; pigmentos, agentes colorantes y agentes saborizantes destinados a resaltar las cualidades estéticas de las tabletas y hacerlas más aceptables para el paciente. Los excipientes adecuados para uso en formas de dosificación líquida oral incluyen diluyentes tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico, y alcoholes de polietileno, ya sea con o sin la adición de un tensioactivo, agentes de suspensión o agentes emulsionantes aceptables para uso farmacéutico. Varios otros materiales se pueden presentar como cobertura o para modificar de otra manera las formas físicas de la unidad de dosificación de las coberturas. Por ejemplo, se pueden recubrir tabletas, pildoras o cápsulas con shellac, azucar o ambas. Los polvos dispersables y gránulos son adecuados para la preparación de suspensiones acuosas orales. Proveen el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante y uno o más conservantes. Agentes dispersantes o humectantes adecuados se ejemplifican con los ya mencionados más arriba. También pueden estar presentes excipientes adicionales por ejemplo, aquellos agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes descritos más arriba,. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden estar en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser aceite vegetal, parafina líquida o una mezcla de aceites vegetales. Agentes emulsionantes adecuados pueden ser (1) gomas tales como goma acacia y goma tragacanto, (2) fosfátidos existentes en la naturaleza tales como semilla de soja y lecitina, (3) ésteres o ésteres parcialmente derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán y (4) productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y saborizantes. Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, tal cornos por ejemplo, aceite de araquis, aceite de oliva, aceite de sésamo, o aceite de coco o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante tal como, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura, o alcohol cetílico. Las suspensiones pueden también contener uno o más conservantes, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo; uno o más agentes colorantes; uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes tales como sucrosa o sacarina. Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes tales como, por ejemplo, glicerol, propilenglicol, sorbitol, o sacarosa. Tales formulaciones pueden contener agentes demulcente y conservante, saborizantes y colorantes. Los polipéptidos de esta invención se pueden también administrar en forma parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, o intraperitoneal, como dosis inyectable del compuesto en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo aceptable para uso farmacéutico que puede ser un líquido estéril o una mezcla de líquidos tales como agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas; un alcohol tal como etanol, isopropanol, o alcohol hexadecílico, glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol; glicerol; cetales tales como 2,2-dimetil-1 ,1-dioxolan-4-metanol, éteres tales como poli(etilenglicol) 400; un aceite; a ácido graso; un éster de ácido graso o un glicérido; o un ácido graso acetilado; glicérido de ácido graso con o sin el agregado de un tensioactivo aceptable para uso farmacéutico, tales como un jabón o un detergente, agente de suspensión tales como pectina, carbomeros, meticelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa o agente emulsionante y otros coadyuvantes farmacéuticos. Como ilustración de aceites que se pueden usar en formulaciones parenterales de esta invención se encuentran aquellos de origen de petróleo animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de maní, aceite de semilla de soja, aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de oliva, petrolato y aceite mineral. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido oleico ácido esteárico y ácido isoesteárico. Esteres de ácidos grasos adecuados son, por ejemplo, etil oleato y isopropil miristato. Jabones adecuados incluyen sales de ácidos grasos y metal alcalino, amonio y trietanolamina y detergentes adecuados incluyen detergentes, catiónicos, por ejemplo, haluros de dimetil dialquilamonio, haluros de alquil piridinio, y acetatos de alquilamina; detergentes aniónicos, por ejemplo, alqgil, aril y olefin sulfonatos, alquil, olefin, éter, y monogliceril sulfatas y sulfosuccinatos; detergentes no iónicos, por ejemplo, óxidos de amina grasas, alcanolamidas de ácidos grasos, copolímeros de polioxietilenpolipropileno y detergentes anfóteros, por ejemplo, alquil-beta-aminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquilmidazolina, así como mezclas. Las composiciones parenterales de esta invención pueden contener típicamente desde aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente 25% en peso del ingrediente activo en solución. Los conservantes y buffers se pueden también usar en forma ventajosa. A fin de minimizar o eliminar la irritación en el lugar de la inyección, tales composiciones pueden contener un tensioactivo no iónico que tenga un balance hidrófilo-lipófilo (HLB) desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones varía desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 15% en peso. El tensioactivo puede ser un componente simple que tenga el HLB arriba indicado o puede ser una mezcla de dos o más componentes que tengan le HLB deseado. Son ilustrativos de surfactantes usados en formulaciones parenterales la clase de ésteres de ácido graso . olietilen sorbitán, por ejemplo, sorbitán monooleato y los aducios de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrofóbica, formada por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de suspensiones acuosas estériles inyectables. Tales suspensiones se pueden formular de acuerdo a métodos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-ceilulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma acacia; agentes dispersantes o humectantes que pueden ser fosfátidos que están en la naturaleza tales como lecitina, un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso, por ejemplo, polioxietilen estearato, un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol, un producto de condensación de óxido de etileno con una forma de éster parcial derivado de ácido graso y hexitol, tales como polioxietilen sorbitol monooleato o el producto de condensación de un óxido de etileno con una forma de éster parcial derivado de ácido graso y anhídrido de hexitol, tales como, por ejemplo monooleato de polioxietilén sorbitán. La preparación inyectable estéril puede ser, además, una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico aceptable para uso parenteral. Los diluyentes y solventes que pueden emplearse son, por ejemplo, agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, comúnmente se emplean aceites fijos estériles como solventes o medios de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite suave, fijo, entre los que se incluyen los mono- o diglicéridos sintéticos. Pueden usarse ácidos grasos como ácido oleico en la preparación de inyectables. Una composición de la invención puede administrarse, además, en forma de supositorios para administración rectal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco (por ej., polipéptido) con un excipiente apropiado no irritante que es sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y por consiguiente se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales son manteca de cacao y polietilenglicol.

Otra formulación empleada en los métodos de la presente invención emplea dispositivos de administración transdérmica ("parches"). Dichos parches transdérmicos pueden utilizarse para proveer una infusión continua o discontinua de los compuestos de la presente invención en cantidades controladas. La construcción y el uso de los parches transdérmicos para administración de agentes farmacéuticos son conocidos en el arte {ver, por ej., la Patente de los Estados Unidos No. 5.023.252, que se incorpora aquí a modo de referencia). Dichos parches pueden construirse para administración continua, pulsátil o a demanda de los agentes farmacéuticos. Puede resultar deseable o necesario introducir la composición farmacéutica al paciente, a través de un dispositivo de administración mecánica. La construcción y el uso de los dispositivos de administración mecánica de agentes farmacéuticos son conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas directas para administrar un fármaco directamente al cerebro usualmente incluyen la colocación de un catéter para administración de fármacos en el sistema ventricular del paciente para atravesar la barrera sangre-cerebro. Uno de dichos sistemas de administración implantables, usados para el transporte de agentes a regiones anatómicas específicas, se describe en La Patente de los Estados Unidos No. 5.011.472, que se incorpora aquí a modo de referencia. Las composiciones de la invención pueden contener, además, otros ingredientes para formar compuestos ^convencionales en el campo farmacéutico, denominados en general vehículos o diluyentes, según se necesiten o se desee. Cualesquiera de las composiciones de esta invención pueden preservarse a través del agregado de un antioxidante como ácido ascórbico o a través del uso de otros preservantes apropiados. Pueden utilizarse procedimientos convencionales para preparar dichas composiciones en formas de dosificación apropiadas.

Los ingredientes comúnmente utilizados que pueden utilizarse como apropiados para formular esta composición para su vía pretendida de administración incluyen: agentes acidulantes, por ejemplo, sin carácter limitativo, ácido acético, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido clorhídrico, ácido nítrico; y agentes que brindan alcalinidad como, sin carácter limitativo, solución de amoníaco, carbonato de amoníaco, dietanolamina, monoetanolamina, hidróxido de potasio, borato de sodio, carbonato de sodio, hidróxido de sodio, trietanolamina, trolamina. Otros ingredientes farmacéuticos incluyen, por ejemplo, sin carácter limitativo, adsorbentes (por ej., celulosa en polvo y carbón activado); propelentes en aerosol (por ej., dióxido de carbono, CCI2F2, F2CIC-CCIF2 y CCIF3); agentes de desplazamiento del aire (por ej., nitrógeno y argón); preservantes anti-fúngicos (por ej., ácido benzoico, butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio); preservantes antimicrobianos (por ej., cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorbutanol, fenol, alcohol feniletiletílico, nitrato fenilmercúrico y timerosal); antioxidantes (por ej., ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosfórico, monotioglicerol, propil galato, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, formaldehído sulfoxilato sódico, metabisulfito de sodio); materiales aglutinantes (por ej., polímeros de bloqueo, caucho sintético y natural, poliacrilatos, poliuretanos, siliconas, y copolímeros de estireno-butadieno); agentes buffer (por ej., metafosfato de potasio, fosfato de potasio monobásico, acetato de sodio, citrato de sodio anhidro y citrato de sodio dihidrato); agentes vehículo (por ej., jarabe de acacia, jarabe aromático, elixir aromático, jarabe de cerezas, jarabe de cacao, jarabe de naranja, jarabe, aceite de maíz, aceite mineral, aceite de maní, aceite de sésamo, inyección bacíeriostática de cloruro de sodio y agua bacteriostática para inyección); agentes quelantes (por ej., edetato de disodio y ácido edético); colorantes (por ej., FD&C Red No. 3, FD&C Red No. 20, FD&C Yellow No. 6, FD&C Blue No. 2, D&C Green No. 5, D&C Orange No. 5, D&C Red No. 8, caramelo y óxido rojo de hierro); agentes clarificantes (por ej., bentonita); agentes emulsionantes (sin carácter limitativo acacia, cetomacrogol, alcohol cetílico, monoesterato de glicerilo, lecitina, monooleato de sorbitán, estearato de polietileno 50); agentes encapsulantes (por ej., gelatina y acetato ftalato de celulosa); saborizantes (por ej., aceite de anís, aceite de canela, cacao, mentol, aceite de naranja, aceite de menta, y vainillina); humectantes (por ej., glicerina, propilenglicol y sorbitol); agentes para pulverización (por ej., aceite mineral y glicerina); aceites (por ej., aceite de arachis, aceite mineral, aceite de oliva, aceite de maní, aceite de sésamo y aceite vegetal); bases para ungüento (por ej., lanolina, ungüento hidrofílico, ungüento de políetilenglicol, vaselina, vaselina hidrofílica, ungüento blanco, ungüento amarillo, y ungüento de agua de rosa); potenciadores de penetración (administración transdérmica) (por ej., monohidroxi- o polihidroxialcoholes, alcoholes grasos saturados o insaturados, ésteres grasos saturados o insaturados, ácidos dicarboxílicos saturados o insaturados, aceites esenciales, derivados de fosfatidilo, cefalina, terpenos, amidas, éteres, cetonas y ureas); plastificantes (por ej., ftalato de dietilo y glicerina); solventes (por ej., alcohol, aceite de maní, aceite de semilla de algodón, glicerina, alcohol isopropílico, aceite mineral, ácido oleico, aceite de maní, agua purificada, agua para inyección, agua estéril para inyección y agua estéril para irrigación); agentes que brindan rigidez (por ej., alcohol cetílico, cera de ésteres cetílicos, cera microcristalina, parafina, alcohol estearílico, cera blanca y cera amarilla); bases para supositorios (por ej., manteca de cacao y polietilenglicoles (mezcla)); tensioactivos (por ej., cloruro de benzalconio, nonoxinol 10, oxtoxinol 9, polisorbato 80, lauril sulfato de sodio y monopalmitato sorbitan); agentes de suspensión (por ej., agar, bentonita, carbómeros, carboximetilcelulosa · de sodio, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, caolín, metilcelulosa, tragacanto y veegum (silicato de aluminio y magnesio)); edulcorantes por ej., aspartamo, dextrosa, glicerina, manitol, propilenglicol, sacarina de sodio, sorbitol y sucrosa); anti-adherentes para comprimidos (por ej., estearato de magnesio); aglutinantes para comprimidos (por ej., acacia, ácido algínico, carboximetilcelulosa de sodio, azúcar comprimible, etilcelulosa, gelatina, glucosa líquida, metilcelulosa, povidona y almidón pregelatinizado); diluyentes para comprimidos y cápsulas (por ej., fosfato de calcio dibásico, caolín, lactosa, manitol, celulosa microcristalina, celulosa en polvo, carbonato de calcio precipitado, carbonate de sodio, fosfato de sodio, sorbitol y almidón); agentes de recubrimiento de comprimidos (por ej., glucosa líquida, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, ftalato acetato de celulosa y laca en escamas); excipientes para compresión directa de comprimidos (por ej., fosfato de calcio dibásico); desintegradores para comprimidos (por ej., ácido algínico, carboximetilcelulosa de calcio, célulosa microcristalina, polacrilina de potasio, alginato de sodio, almidón glicolato de sodio y almidón); deslizantes para comprimidos (por ej., sílice coloidal, almidón de maíz y talco); lubricantes para comprimidos (por ej., estearato de calcio, estearato de magnesio, ac0jte mineral, ácido esteárico y estearato de zinc); opacantes para comprimidos/ cápsulas (por ej., dióxido de titanio); agentes de lustre para comprimidos (por ej., cera carnuba y cera blanca); agentes espesantes (por ej., cera de abejas, alcohol cetílico y parafina); agentes que brindan tonicidad (por ej., dextrosa y cloruro de sodio); agentes que aumentan la viscosidad (por ej., ácido algínico, bentonita, carbómeros, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, povidona, alginato de sodio y tragacanto); y agentes humectantes (por ej., heptadecaetileno oxicetanol, lecitinas, monooleato de polietilen sorbitol, monooleato de polioxietileno sorbitol y estearato de polioxietileno). Los polipéptidos descritos aquí pueden administrarse, además, como agente farmacéutico único o combinado con uno o más e otros agentes farmacéuticos siempre que la combinación no provoque efectos adversos no aceptables. Por ejemplo, los polipéptidos de esta invención pueden combinarse con agentes anti-obesidad conocidos, o con agentes antidiabéticos conocidos o agentes para otras indicaciones, y similares, como también con sus mezclas y combinaciones. Los polipéptidos descritos aquí pueden utilizarse, además, en forma de base libre o en composiciones, en investigación y diagnóstico, o como estándares de referencia analítica, y similares. Por consiguiente, la presente invención incluye composiciones que están formadas por un vehículo inerte y una cantidad efectiva de un compuesto identificado a través de los métodos descritos aquí, o una de sus sales o uno de sus ésteres. Un vehículo inerte es cualquier material que no interactúa con el compuesto que se transportará y que le brinda soporte, medio de transporte, masa, material de rastreo, y similares al compuesto que se transportará. Una cantidad efectiva de compuesto es aquella cantidad que produce un resultado o ejerce una, ¿.influencia en el procedimiento particular realizado. Los polipéptidos son conocidos por someterse a hidrólisis, eliminación de aminas, oxidación, racemización e isomerización en ambiente acuoso o no acuoso. La degradación como la hidrólisis, eliminación de aminas u oxidación pueden detectarse fácilmente por electroforesis capilar. No obstante la / degradación enzimática, los polipéptidos que tienen vida media plasmática prolongada, o tiempo de residencia biológica, deben, como mínimo, ser estables en solución acuosa. .Es esencial que el polipéptido exhiba menos de un 10% de degradación durante un período de un día a temperatura corporal. Se prefiere aún más que el polipéptido exhiba menos del 5% de degradación durante un período de un día a la temperatura corporal. Debido al tratamiento de por vida en los pacientes con diabetes crónica, con mucha preferencia estos agentes terapéuticos son de administración conveniente, aún más es infrecuente que se los administre por vía parenteral. La estabilidad (es decir, menos de un escaso porcentaje de degradación) durante un período de semanas a la temperatura corporal permitirá una dosificación menos frecuente. La estabilidad en la magnitud de los años a temperatura de refrigeración permitirá que el fabricante presente una formulación líquida, y así evite la inconveniencia de la reconstitución. En forma adicional, la estabilidad en solventes orgánicos proveería un polipéptido formulado en nuevas formas de dosificación como un implante. Las formulaciones apropiadas para aplicación subcutánea, intravenosa, intramuscular, y similares; los vehículos farmacéuticos apropiados; y las técnicas de formulación y administración pueden prepararse a través de cualesquiera de los métodos conocidos en el arte (ver, por ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20th edition, 2000). Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la invención descrita aquí, pero no deben considerarse como límite del alcance de la invención bajo ningún concepto. Formulación de las cápsulas La fórmula de una cápsula se prepara con: Polipéptido de esta invención 10 mg Almidón 109 mg Estearato de magnesio 1 mg Los componentes se .mezclan, se pasan a través de un tamiz de malla apropiada, y se llenan en cápsulas de gelatina dura. Formulación de los Comprimidos Se prepara un comprimido con: Polipéptido de esta invención 25 mg Celulosa microcristalina 200 mg Dióxido de silicio coloidal 10 mg Ácido esteárico 5.0 mg Los ingredientes se mezclan y se comprimen para formar los comprimidos. Pueden aplicarse recubrimientos acuosos y no acuosos para aumentar el buen sabor, mejorar la elegancia y la estabilidad o para demorar la absorción. Solución IV Estéril Una solución en mg/ml del compuesto deseado de esta invención se realiza usando agua inyectable estéril, y se ajusta el pH si es necesario. La solución se diluye para administración con dextrosa estéril al 5% y se administra como infusión IV. Suspensión intramuscular Se prepara la siguiente suspensión intramuscular: Polipéptido de esta invención Carboximetilcelulosa de sodio TWEEN 80 Cloruro de sodio Alcohol bencílico La suspensión se administra por vía intramuscular.

Cápsulas Duras de Gelatina Un gran número de cápsulas unitarias se prepara llenando cápsulas duras de gelatina estándares de dos partes, cada una con ingrediente activo en polvo, 150 mg de lactosa, 50 mg de celulosa, y 6 mg de estearato de magnesio. Cápsulas Blandas de Gelatina Una mezcla de ingrediente activo en un aceite comestible como aceite de soja, aceite de semilla de algodón, o aceite de oliva se prepara y se inyecta por medio de un bombeador de desplazamiento positivo en gelatina fundida para formar cápsulas blandas de gelatina que contienen el ingrediente activo. Las cápsulas se lavan y se secan. El ingrediente activo puede disolverse en una mezcla de polietilenglicol, glicerina y sorbitol para preparar una mezcla medicinal miscible en agua. Cápsulas/ Comprimidos de Liberación Inmediata Estas son formas de dosificación oral realizadas por procesos nuevos y convencionales. Estas unidades se toman por vía oral sin agua para la inmediata disolución y administración de la medicación. El ingrediente activo se mezcla en un ingrediente que contiene líquido como azúcar, gelatina, pectina y edulcorantes. Estos líquidos se solidifican en comprimidos o pastillas sólidas por secado por congelamiento y técnicas de extracción en estado sólido. Los compuestos farmacológicos pueden comprimirse con azúcares viscoelásticas y termoelásticas y polímeros o componentes efervescentes para producir matrices porosas destinadas a la liberación inmediata, sin la necesidad de agua. Debe resultar obvio para una persona experta en el arte que pueden realizarse cambios y modificaciones a esta invención sin alejarse del espíritu o el alcance de la invención como se la especifica aquí. EJEMPLOS Para poder comprender esta invención mejor, se presentan los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son sólo para fines ilustrativos, y no se consideran limitantes del alcance de la invención bajo ningún concepto. Todas las publicaciones mencionadas aquí se incorporan en su totalidad a modo de referencia. Ejemplo 1. Metodología de Síntesis del Péptido Los polipéptidos de la presente invención se diseñaron para mejorar la estabilidad y prolongar la vida media de estos péptidos. Específicamente, la forma no mutada de estos péptidos (ver, por ej., WO 01/23420, incorporada aquí en su totalidad como referencia) demostró hidrólisis N-terminal, eliminación de aminas, como también dimerización y trimerización en ambientes acuosos y no acuosos. Para mejorar la estabilidad y minimizar la hidrólisis, la eliminación de aminas, y dimerización/trimerización, los residuos de asparagina (posiciones 9 y 28) se mutaron con residuos de glutamina. Además, la valina en la posición 17, la alanina en la posición 19, la lisina en la posición 29, la arginina en la posición 30, y la tirosina en la posición 31 también se mutaron. En forma adicional, como se describe a continuación, los polipéptidos de la presente invención también fueron PEGilados para prolongar la vida media. Se siguió el siguiente procedimiento general para sintetizar algunos de los polipéptidos de la invención: La síntesis del péptido se llevó, a acabo por la estrategia de FMOC/t-Butilo (Pennington & Dunn, Péptido Synthesis Protocols, Volumen 35, 1994) bajo condiciones de flujo continuo usando resinas PEG-Poliestireno de Rapp-Polymere (Rapp-Polymere, Tubingen, Alamania). Al finalizar la síntesis, los péptidos se disocian de la resina y se desprotegen usando TFA/DTT/H207Tr¡isopropil silano (88/5/5/2). Los péptidos se precipitan a partir del cóctel de disociación usando éter dietílico frío. El precipitado se lavó tres veces con éter frío, y luego se disolvió en ácido acético al 5% antes de la liofilización. Los péptidos se chequearon por cromatografía de fase reversa en una columna YMC-Pack ODS-AQ (YMC, Inc., Wilmington, NC) en un sistema Waters ALLIANCE® (Waters Corporation, Milford, MA) usando agua/acetonitrilo con 3% de TFA como gradiente desde 0% a 100% de acetonitrilo, y por espectrometría de masa MALDI en un VOYAGER DE™ MAL DI Mass Spectrometer, (Modelo 5-2386-00, PerSeptive BioSystems, Framingham, MA). La muestra del péptido se agregó al buffer Matrix (50/50 dH20/acetonitrilo con 3% de TFA) en una relación de 1/1. Aquellos péptidos que no cumplen con los criterios de pureza de >95% se purifican por cromatografía de fase reversa en un Waters Delta Prep 4000 HPLC System (Waters Corporation, Milford, MA). Ejemplo 2. PEGilación del Péptido La vida media de un péptido in vivo puede aumentarse a través de la unión de un resto de polietilenglicol (PEG) al péptido, reduciendo así el clearance (depuración) del péptido por el riñon y reduciendo la degradación del péptido con proteasa. El uso de un péptido agonista del receptor VPAC2 está severamente limitado por su vida media extremadamente corta in vivo; sin embargo, la unión de un resto PEG al péptido (PEGilación) prolongó la vida media del péptido lo suficiente para permitir el tratamiento de una vez por día a una vez por semana. La PEGilación puede realizarse través de cualquier método conocido por los expertos en el arte. Sin embargo, en este ejemplo, la PEGilación se realizó introduciendo una mutación única de cisteína en el péptido seguido de PEGilación de la cisteína a través de una ligadura de tioéter estable entre el sulfhidrilo del péptido y el grupo maleimida del reactivo metoxi-PEG-maleimida (Nektar (Inhale/Shearagua), San Carlos, CA). Es preferible introducir la única cisteína en el Extremo C-terminal del péptido para minimizar la reducción potencial de la actividad por PEGilación. Específicamente, se agregó un exceso de hasta dos veces de reactivo de mPEG-mal (MW 22kD y 43kD) a 1 mg de péptido (por ej., SEQ ID NO:1 que tiene una mutación de cisteína en el Extremo C-terminal del péptido) y se disolvió en buffer a un pH 6 (fosfato de Na 0,1 M / NaCI 0,1 M / EDTA 0, M). Luego de 05, horas a temperatura ambiente, la reacción se terminó con exceso de hasta el doble molar de DTT a mPEG-mal. La mezcla de reacción péptido-PEG-mal se aplicó a una columna de intercambio catiónico para eliminar los reactivos PEG residuales seguido de columna por filtración con gel para eliminar el péptido libre residual. La pureza, la masa, y el número de sitios PEGilados se determinaron por SDS-PAGE y espectrometría de masa con MALDI-TOF. Cuando un PEG de 22 kD se unió a los péptidos de la presente invención, se mantuvo una potente activación del receptor VPAC2. Además, la selectividad de VPAC2 versus VPAC1 y PAC1 de la activación del receptor también se mantuvo. Es posible que la PEGilación con un PEG menor (por ej., un PEG lineal de 22 kD) reduzca probablemente menos la actividad del péptido, en tanto que un PEG más grande (por ej., un PEG de 43kD ramificado) probablemente reducirá la actividad. Sin embargo, el PEG más grande aumentará la vida media plasmática en forma adicional de tal modo que puede ser posible una inyección una vez por semana (Harris, et al., Clin. Pharmacokinet. 40:5¾9-551, 2001). Ejemplo 3. Clonación del Péptido Para expresar estos péptidos en forma recombinante, la secuencia de ADN que codifica un péptido se clonó C-terminal a la glutationa S-transferasa (GST) con un sitio único de reconocimiento del Factor Xa que separa el péptido monomérico y GST. El gen que codifica el sitio de reconocimiento del Factor Xa monomérico y GST. El gen que codifica el sitio de reconocimiento del Factor Xa fusionado a una secuencia de ADN del péptido que se debe producir se sintetizó hibridando dos fragmentos de ADN superpuestos de una sola hebra (70-90meros) que contienen un sitio de restricción Bam Hl o Xho I inmediatamente en la región 5' vecina a la secuencia de ADN del gen que debe clonarse, seguido de la síntesis de ADN de las hebras opuestas a través de un fragmento más grande de ADN polimerasa I (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). La secuencia de ADN elegida para cada gen se basó en la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos diseñada de cada péptido. En algunos casos, el gen que codifica el péptido se generó por mutagénesis por PCR (Picard, et al., Nucleic Acids Res 22:2587-91 , 1994; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) de un gen ya hecho a través del método descrito con anterioridad. El producto de hebra doble se digirió luego por Bam Hl y Xho I y se ligó en pGEX-6P-1 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ ) que también se digirió con Bam Hl y Xho I. Por ejemplo, para expresar la SEC ID NO:1 como una fusión con GST, una secuencia de ADN designada (Figura 2) se clonó en pGEX-6P-1. Ejemplo 4. Expresión y Purificación del Péptido Recombinante Se cultivaron células BL21 (Stratagene, La Jolla, CA), transformadas con los plásmidos que contienen el péptido de fusión de GST, 37°C hasta que la OD6oo alcanzó 0,6 a 1 ,0, y entonces las células se incubaron con 1 mM IPTG (Life Technologies, Carlsbad, CA) durante 2 horas a 37°C. Las células (2 I) se centrifugaron a 7.700 g durante 15 min., se pesaron y se almacenaron a -20°C durante por lo menos 3 horas. El pellet de células congeladas se suspendió nuevamente en 100 mi de PBS frío con hielo que contenía 250 µ? de cóctail de inhibidor de proteasa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) por gramo de células, se sónico a 3x durante 1 min. con cortes de 15 segundos. Las células se centrifugaron luego a 10.000 g durante 20 min. El sobrenadante se mezcló con 2 mi de resina Glutathione Sepharose 4B al 50% (Pharmacia) en un agitador toda la noche a 4°C. El sobrenadante/resina se centrifugó a 1 ,500 g durante 15 min., se envasó en Columnas para Cromatografía Poly-Prep vacías (Bío-Rad, Hercules, CA), se lavó con 30 mi de PBS seguido de 10 mi de buffer de Factor Xa (1 mM CaCI2, 100 mM NaCI, y 50 mM Tris-HCI, pH 8,0). Los péptidos se disociaron de la columna agregando 60 unidades de Factor Xa (Pharmacia) en 1 mi de buffer Factor Xa, incubado toda la noche a 4°C, y se separaron por HPLC C18 (Beckman System Gold), usando un bucle de 2 mi velocidad de flujo de 2 ml/min con el siguiente programa: 10 min. de Buffer A (0,1% de TFA H20), 30 min. de gradiente para el Buffer B (0,1 % de TFA/ACN), 10 min. de Buffer A, 10 min. de gradiente, y 10 min. de Buffer A. Se recolectaron las fracciones pico (1 mi cada una) se seleccionaron por 10-20% de electroforesis con gel de Tricine-SDS. Las fracciones que contenían los péptidos de la Figura 1 se reunieron y se secaron. Los rendimientos típicos fueron de varios cientos de microgramos de péptidos libres por litro de cultivo de E. coli. Los péptidos recombinantes demostraron tener las mismas actividades que sus versiones sintéticas. Ejemplo 5. Secreción de Insulina de Células de Islotes Dispersas de Ratas La secreción de insulina de islotes dispersos de ratas mediados por un número de péptidos de la presente invención se midió de la siguiente manera. Se digirieron islotes de Langerhans, aislados de ratas SD (200-250 g), usando colagenasa. Las células de islotes dispersas se trataron con tripsina, se sembraron en placas de base en V de 96 receptáculos, y se formaron pellets. Las células se cultivaron luego toda la noche en medio con o sin los péptidos de esta invención. El medio se aspiró, y las células se pre-incubaron con buffer de Krebs- Ringer-HEPES que contenía 3 mM glucosa durante 30 minutos a 37°C. El buffer de pre-incubación se eliminó, y las células se incubaron a 37°C con buffer de Krebs-Ringer-HEPES que contenía la concentración de glucosa apropiada (por ej., 8 mM) con o sin péptidos durante un tiempo apropiado. En algunos estudios, se incluyó, además, una concentración apropiada de GLP-1. Una porción del sobrenadante se eliminó y su contenido de insulina se midió por SPA. Los resultados se expresaron como "control en veces" (FOC). A una concentración de 300 nM, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID NO:1+cys+PEG(43 kD), aumentó la secreción de insulina de células de islotes dispersas en aproximadamente 1 ,7 veces (Figura 3). En este ensayo, un aumento de la secreción de insulina de las células de islotes dispersas de las ratas se definió como un aumento de por lo menos 1 ,4 veces. El agonista del receptor VPAC2 componente de los polipéptidos de esta invención produjo un aumento en la secreción de insulina de las células de islotes dispersas en por lo menos 1 ,4 veces hasta aproximadamente 1 ,7 veces. Ejemplo 6. Efecto de ios Péptidos PEGilados en Ja Tolerancia a la Glucosa Intraperitoneana en Ratas La actividad in vivo los péptidos PEGilados de esta invención cuando se administran por vía subcutánea se examinó en ratas. A ratas con ayuno toda la noche se les administró una inyección subcutánea de control o péptido PEGilado (1-100 pg/kg). Tres horas después, Se midió la glucosa basal en sangre, y las ratas recibieron 2 g/kg de glucosa por vía intraperitoneana. Se midió nuevamente la glucosa en sangre después de 15, 30, y 60 min. El péptido PEGilado representativo de esta invención redujo en forma significativa los niveles de glucosa relativos al vehículo siguiendo la IPGTT (Intraperitoneal Glucose Tolerance Test), con 17%-28% de reducción en el AUC (área bajo la curva) de glucosa (Figura 4). Esto demuestra que el péptido PEGilado ha prolongado la actividad de reducción de la glucosa in vivo. Además de la actividad de reducción de la glucosa de los péptidos PEGilados de la presente invención, esto también indica una prolongada vida media del péptido in vivo. PACAP-27 tiene una vida media muy corta in vivo (< 10 min.). La capacidad de los péptidos PEGilados de la invención en reducir la glucosa en sangre 3 horas después de la administración del péptido es una clara indicación de que el péptido está presente en la circulación en este momento y por consiguiente, tiene una vida media prolongada relativa a PACAP-27. Ejemplo 7. AMP SPA Cíclico Se colocaron en placas células CHO que expresan el péptido VPAC2 en placas de 96 receptáculos a 8 x 104 células/receptáculo y se cultivaron a 37° durante 24 horas en ocMEM, nucleósidos, glutamina (Gibco/BRL, Rockville, MD), 5% de FBS, 100 µg/m\ de Pen/Strep, 0,4 de mg/ml de higromicina, y 1 ,5 mg/ml de Geneticin (Gibco/BRL). El medio se eliminó y las placas se lavaron con PBS. Las células se incubaron con un péptido (en 10 mM Hepes, 150 mM NaCI, 5 mM KCI, 2,5 mM CaCI2> 1 ,2 mM KH2P04, 1 ,2 mM MgS04, 25 mM NaHC03 (pH 7,4) con 1 % BSA y 100 µ? IBMX) durante 15 min. a 37°C. El AMP cíclico en los extractos celulares se cuantificó usando el sistema de ensayo de selección directa cAMP SPA (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ,). La cantidad de cAMP presente en los lisatos se determinó siguiendo las instrucciones provistas con este kit. La cantidad de cAMP (en pmol) producida a cada concentración de péptido se transportó a un gráfico y se analizó por regresión no lineal usando el software Prizm para determinar la EC50 para cada péptido. Los polipéptidos de esta invención se designan en base a VIP, que, según se demostró, carece de actividad en PAC1 (Vaudry, et al., Pharmacol. Rev. 52:269-324, 2000). Por consiguiente, se considera que los polipéptidos de esta invención no poseen actividad apreciable en PAC1. Los resultados de este ensayo con los polipéptidos representativos de esta invención se muestran en la Tabla 1 a continuación. Los péptidos identificados como P5, P7, P8, P12, y P12 + PEG son todos potentes agonistas del receptor VPAC2, activando el receptor al 100% del nivel máximo de activación del receptor lograda por el péptido endógeno, PACAP-27. Además, los péptidos identificados como P5, P7, P8, P12, y P12 + PEG son agonistas selectivos del receptor VPAC2, y poseen una actividad muy débil como agonista sobre VPAC1. PACAP-27 es un potente agonista de VPAC1. TABLA 1 Ejemplo 8. Composición Farmacéutica - Formulaciones para administración IV y SC Una formulación IV estéril se prepara con 4 mg de un polipéptido de SEC ID NO: 1 , o un polipéptido derivado que tiene el equivalente a 4 mg de contenido de polipéptido, y 1 L de solución salina estéril, usando cualquier proceso de fabricación conocido en el arte. Pueden usarse concentraciones más elevadas de polipéptido para la formulación SC. En el caso del polipéptido identificado como SEC ID NO: 1 , o un polipéptido derivado, se disuelven 4 mg en 100 mi de solución salina o DMSO y los vials estériles después de la filtración aséptica se llenan con la composición. Ejemplo 9. Estabilidad de las Formulaciones que Comprenden los Péptidos de esta invención Las formulaciones descritas en el Ejemplo 8 se colocaron en la cámara de estabilidad constante. Se extrajeron muestras periódicamente para análisis por electroforesis capilar, que es el método más sensible para detectar la degradación de poiipéptidos en estas formulaciones. El área de varios picos se sumó y el área para el pico del polipéptido de origen se dividió por el área pico total (Figura 5 y 6). El cociente es el % de pureza. Debido a las impurezas presentes en el polipéptido fresco, el cambio en la pureza se normaliza dividiendo la pureza en un momento diferente por la pureza inicial. Ejemplo 10. Generación de Anticuerpos Específicos del Péptido y Medición de los Péptidos por ELISA Se generaron anticuerpos policlonales específicos para los poiipéptidos de la presente invención mediante la síntesis de un fragmento específico de un polipéptido de esta invención usando ¾n sintetizador de péptidos ABI 433A. El péptido se disoció luego de la resina, y se purificó en un sistema Beckman System Gold Analytical y de HPLC preparativa. Se usó un sistema de espectrofotómetro de masa Perspective MALDI para identificar el producto correcto. El péptido se secó usando un liofilizador. El péptido (2 mg) se conjugó luego con hemocianina extraída de lapa californiana (en inglés, keyhole limpet hemocyanin, KLH) a través del grupo sulfhidrilo libre en la Cys. Se inmunizaron conejos Blancos de Nueva Zelanda Hembras el Día 0, 14, 35, 56, y 77. El día 0, cada conejo recibió una inyección subcutánea con 250 pg de péptido y adyuvante completo de Freund. Las inmunizaciones posteriores utilizaron 125 ig de péptido por conejo. Se comenzó con los desangrados el día 21 y se continuó en intervalos de 21 días a partir de ese momento. La purificación de los anticuerpos anti-péptido se realizó pasando el suero en bruto sobre una columna específica del péptido de purificación por afinidad. El título del anticuerpo se determinó por ELISA. Una placa de 96 receptáculos Immulon 4HBX se recubrió con un anticuerpo Morphosys F(ab) C-terminal, específico de los péptidos de la presente invención, y se lo dejó incubar toda la noche a 4°C. La placa se bloqueó luego para evitar la unión no específica. Luego se diluyeron estándares del péptido (2500 ng/ml-160 pg/ml) en 33% de plasma y las muestras se diluyeron a 1 :3 en buffer seguido de incubación durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Luego de lavar, un anticuerpo N-terminal policlonal específico de los péptidos de esta invención se incubó en la placa durante una hora. A esto le siguió el agregado de peroxidasa de rábano picante (HRP)-anticuerpo de burro-anti-conejo y las muestras y los estándares se incubaron durante una hora adicional. La detección se evaluó luego de la incubación con solución e 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y la placa se lee a OD450 (Figura 7). La demostración de la actividad de los polipéptidos de la presente invención puede lograrse a través de ensayos in vitro, ex vivo, e in vivo que son conocidos en el arte. Por ejemplo, para demostrar la eficacia de un agente farmacéutico para el tratamiento de la diabetes y trastornos relacionados como el Síndrome X, la tolerancia deficiente . a la glucosa, la deficiencia de glucosa en ayunas, y la hiperinsulinemia; la enfermedad ateroesclerótica y trastornos relacionados como la hipertrigliceridemia y la hipercolesteremia; y la obesidad, pueden usarse los siguientes ensayos. Método para medirlos niveles de Glucosa Sanguínea Se desangraron ratones db/db (obtenidos de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) (ya sea por la vena del ojo o de la cola) y se agrupan de acuerdo con los niveles equivalentes de glucosa en sangre promedio. Reciben una dosis oral (por gavage en un vehículo aceptable para uso farmacéutico) con el polipéptido de prueba una vez por día durante 14 días. En este momento, los animales se desangran nuevamente por la vena del ojo o de la cola y se determinan los niveles de glucosa en sangre. En cada caso, los niveles de glucosa se miden con un Glucometer Elite XL (Bayer Corporation, Elkhart, IN). Método para medir los Niveles de Triglicéridos Se desangran ratones hApoAl (obtenidos de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) (ya sea por la vena del ojo o la vena de la cola) y se agrupan de acuerdo con los niveles promedio equivalentes de triglicéridos en el suero. Reciben una dosis oral (por gavage en un vehículo aceptable para uso farmacéutico) con el polipéptido de prueba una vez por día durante 8 días. Los animales se desangran nuevamente por la vena del ojo o la vena de la cola, y se determinan los niveles de triglicéridos½n suero. En cada caso, los niveles de triglicéridos en suero se miden usando un Technicon Axon Autoanalyzer (Bayer Corporation, Tarrytown, NY). Método para medir los Niveles de Colesterol HDL Para determinar los niveles de colesterol HDL en el plasma, se desangran ratones hApoAl y se agrupan con niveles promedio equivalentes de colesterol HDL. Los ratones reciben una dosis oral por día con vehículo o polipéptido de prueba durante 7 días, y luego se los desangra nuevamente el día 8. Se analiza el plasma para evaluar el colesterol HDL usando el Synchron Clinical System (CX4) (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Método para medir los Niveles de Colesterol Total, Colesterol HDL, Trigiicéridos y Glucosa En otro ensayo in vivo, se desangran monos obesos, luego se les administra una dosis oral una vez por día con vehículo o polipéptido de prueba durante 4 semanas, y luego se los desangra nuevamente. Se analiza el suero para evaluar el colesterol total, el colesterol HDL, los trigiicéridos, y la glucosa en sangre usando el Synchron Clinical System (CX4) (Beckman Coulter, Fullerton, CA). El análisis de la subclase de lipoproteínas se realiza por espectroscopia por R N como se describe en Oliver, et al., (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:5306- 531 1 , 2001 ). Método para medir un Efecto en los Parámetros Cardiovasculares Se evalúan, además, los parámetros cardiovasculares (por ej., la frecuencia cardiaca y la presión sanguínea). Se administra una dosis oral una vez por día a ratas SHR con vehículo o polipéptido de prueba durante 2 semanas. Se determinan la presión sanguínea y la frecuencia cardiaca usando un método de manguito en la cola como se describe en Grinsell, et al., (Am. J. Hypertens. 13:370-375, 2000). En los monos, la fcresión sanguínea y la frecuencia cardiaca se monitorean como se describe en Shen, et al., (J. Pharmacol. Exp. Therap. 278:1435-1443, 1996). Evaluación de la Eficacia del Compuesto en la Reducción de la Ingesta de Alimento (Supresión del Apetito) en Ratas con Ayuno Magro toda la Noche Ensayo de Alimentación Aguda de Ayuno-Alimento La finalidad de este protocolo es determinar el efecto de una dosis única de un compuesto desconocido en el consumo de alimentos de ratas con ayuno magro durante la noche. Con frecuencia se usa el modelo de rata con ayuno-alimento en el campo de la obesidad para identificar los compuestos con potenciales efectos anoréxicos. Este modelo de animales se ha utilizado con éxito en la identificación y la caracterización del perfil de eficacia de los compuestos que se usan o se han usado en el manejo del peso corporal en humanos obesos (ver, por ej., Balvet, et al., Gen. Pharmacol. 13:293-297, 1982; Grignaschi, et al., Br. J. Pharmacol. 127:1190-1 194, 1999; McTavish y Heel, Drug 43:713-733, 1992; Rowland, et al., Life Sci. 36:2295-2300, 1985). Un estudio típico incluye 60-80 ratas macho (n=10/grupo de tratamiento) con un peso corporal promedio de aproximadamente 280 g. Las ratas se mantienen en habitaciones estándar para animales con temperatura y humedad controladas y un ciclo de luz oscuridad de 12/12. Las ratas se colocan por separado en jaulas suspendidas con un piso de malla. Se provee agua y alimento a voluntad a menos que los animales estén en ayunas para el estudio. La prueba con vehículo: Las ratas se agrupan en base a su rendimiento con una prueba con vehículo. La prueba con vehículo se realiza entre los 2 y 7 días antes de la prueba de eficacia. Las ratas se someten a ayuno toda la noche durante la fase de oscuridad (total de aprox. 16-18 hrs). El animal recibe una dosis de 0,5 mi de agua desmineralizada. Luego de una hora de la dosis, se devuelven las jarras previamente pesadas con alimento a la jaula hogar del animal. Las ratas reciben una hora para alimentarse. Luego de 1 hora, se coloca nuevamente en la jarra de alimento la comida derramada y se determina la cantidad de alimento consumido. Se asignan las ratas a grupos de tal modo que el error promedio y estándar del promedio de consumo de alimentos de 1-hora sean similares entre los grupos. La prueba de eficacia: Se somete a las ratas a ayuno toda la noche durante la fase de oscuridad (total de aprox. 16-18 hr). El animal se trata con una dosis asignada de polipéptido. Una hora después de la dosis, se devuelven a la jaula jarras previamente pesadas con alimento. Se registra la ingesta de alimento 30, 60, 90, 180, y 240 minutos después de devolver el alimento. En cada momento, se devuelve lo derramado a la jarra de alimentos y luego se pesa el alimento de las jarras. La cantidad de alimento consumido se determina para cada momento. La diferencia entre grupos de tratamiento se determina usando el método estadístico apropiado. Evaluación de ¡a Eficacia del Compuesto en la Reducción del Peso Corporal y el Consumo de Agua y Alimentos en Ratas fa/fa Zucker obesas Ensayo de Alimentación Crónica La finalidad de este protocolo es determinar el efecto de la administración crónica de un compuesto desconocido sobre el peso corporal y el consumo de agua y alimento en ratas fa/fa Zucker obesas. Con frecuencia se usan ratas fa/fa Zucker obesas en la determinación de la eficacia de un compuesto en la reducción del peso corporal. Este modelo de animales se ha utilizado con éxito en la identificación y la caracterización del perfil de eficacia de los compuestos que son o que han sido utilizados en el manejo iel peso corporal en humanos obesos (ver, por ej., Al-Barazanji, et al., Obes Res. 8:317-323, 2000; Assimacopoulos-Jeannet, et al., Am. J. Physiol. 260(2 Pt 2):R278-283, 1991 ; Dryden, et al., Horm. Metab. Res. 31 :363-366, 1999; Edwards y Stevens, Pharmacol. Biochem. Behav. 47:865-872, 1994; Grinker, et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 12:265-275, 1980).

Un estudio típico incluye 60-80 ratas Zucker fa/fa macho (n =1 O/grupo de tratamiento) con un peso corporal promedio de aproximadamente 550 g. Las ratas se mantienen en habitáculos estándar con humedad y temperatura controladas y un ciclo de luz oscuridad de 12/12. Continuamente tienen disponibilidad de agua y alimento. Se coloca a las ratas en forma individual en cajas de zapato grandes para ratas que contienen piso enrejado. Se adaptan los animales a los pisos enrejados y se administra una dosis falsa de vehículo del estudio durante por lo menos cuatro días antes de registrar la medición basal de dos días del peso corporal y el consumo de agua y alimento en 24 horas. Se asigna a las ratas a uno de 6-8 grupos de tratamiento en base a su peso corporal en el momento basal. Se fijan los grupos de modo tal que el error estándar y promedio del promedio de pesos corporales fueran similares. Se administra la dosis asignada de polipéptido por gavage oral diario antes de la fase de oscuridad del ciclo de L/O durante un número predeterminado de días (normalmente 6-14 días). En este momento, se miden el peso corporal, el consumo de agua y alimento. El día final, se sacrifican los animales por inhalación de CO2, y se mide el peso corporal. La eficacia de los polipéptidos de esta invención en la reducción o el control del peso corporal puede determinarse con el uso de este ensayo de alimentación crónica. Todas las publicaciones y las. patentes mencionadas en la memoria descriptiva que antecede se incorporan aquí a modo de referencia. Varias modificaciones y variaciones de las composiciones y los métodos de la invención descritos resultarán obvios para aquellos expertos en el arte sin alejarse del alcance y el espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones específicas, se debe comprender que la invención como se la reivindica no debe limitarse indebidamente a dichas realizaciones específicas. Nuevamente, varias modificaciones de los modos anteriormente descritos de llevar a cabo la invención que son obvios para aquellos expertos en el campo de la biología molecular o campos relacionados, se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen. Aquellos expertos en el arte reconocerán, o serán capaces de asegurar sin mayor uso que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención que se describe aquí. Dichos equivalentes se incluyen en las reivindicaciones que se anexan.

LISTADO DE SECUENCIAS <130> MSB-7295 <150> US 60/395.738 <151> 2002-07-12 <160> 264 <170> Patentln versión 3.2 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> Ac es acetilo <400> 2 Ac-His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 ' 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 4 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys 20 25 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Gln Asp lie Lys Gln Gly Gly Thr 20 25 30 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 His Ser Asp Ala Val 1 5 10 15 Met Ala Ala His Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <4O0> 11 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys His Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 12 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys A.rg 20 25 30 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 .15 Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg 20 25 .' 30 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Arg Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 His Ser Asp Ala Val 1 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys 20 25 30 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 His Ser ' Asp Ala Val 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys 20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 His Ser Asp Ala Val 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Gln Gln Lys Arg 20 25 30 <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Homo <400> 18 His Ser Asp 1 10 15 Met Ala Ala 20 25 30 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Homo <400> 19 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gl 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Arg Arg 20 25 30 <210> 20 <211> 30 <212> PRT <213> Homo <400> 20 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gl 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Ala 20 25 30 <210> 21 <211> 30 <212> PRT <213> Homo <400> 21 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gl Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Phe 20 25 30 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys His 20 25 30 <210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys 20 25 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg 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(31) <223> Ac es acetilo <400> 40 -His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gl 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 His Ser Asp Ala Val 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 42 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 ..10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys 20 25 <210> 43 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 His Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 44 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 His Ser Asp Ala Val 1 5 10 15 Leu Ala Val Lys Lys 20 25 30 <210> 45 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln 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Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Asn Lys Tyr 20 25 30 <210> 110 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 His Ser Asp Ala Val i 5 10 15 Met Ala Gly Lys Lys 20 25 30 <210> 111 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 His Ser ' Asp Ala Val 1 5 10 15 Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Asn Arg lie 20 25,'jv 30 <210> 112 <211> 30 <212> PRT <213> Homo <400> 112 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1. 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys 20 25 30 <210> 113 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 His Ser Asp Ala Val 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Pro Asn Arg 20 25 <210> 114 <211> 30 <212> PRT <213> Homo <400> 114 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Arg Asn Arg lie 20 25 30 <210> 115 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATÜRE <222> (1)..(32) <223> PEG is polyethylene glycol <400> 115 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG 20 25 30 <210> 116 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (32) <223> Ac es acetilo; PEG es polietilenglicol <400> 116 Ac-His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG 20 25 30 <210> 117 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(32) <223> PEG es polietilenglicol <400> 117 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG 20 25 30 <210> 118 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATÜRE <222> (1)..(30) <223> PEG es polietilenglicol <400> 118 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Cys-PEG 20 25 30 <210> 119 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> ISC_FEATURE <222> (1)..(32) <223> PEG es polietilenglicol <400> 119 His Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG 20 25 30 <210> 120 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..{32) <223> PEG es polietilenglicol <400> 120 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Gln Asp lie Lys Gln Gly Gly Thr Cys-PEG 20 25 30 <210> 121 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATU E <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 121 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 122 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(32) <223> PEG es polietilenglicol <400> 122 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr lie Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG 20 25 30 <210> 123 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(32) <223> PEG es polietilenglicol <400> 123 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr lie Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG 20 " 25 30 <210> 124 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (32) <223> PEG es polietilenglicol <400> 124 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala His Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG 20 25 30 <210> 125 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATÜRE <222> (1) .. (32) <223> PEG es polietilenglicol <400> 125 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys His Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG 20 25 30 <210> 126 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1)..(31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 126 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 127 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 127 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 128 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 128 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Arg Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 129 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 129 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 130 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATÜRE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 130 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Pro Gln Lys Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 131 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 131 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Gln Gln Lys Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 132 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATORE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 132 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Arg Gln Lys Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 133 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 133 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Arg Arg Cys-PEG 20 25 30 <210> 134 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 134 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Ala Cys-PEG 20 25 30 <210> 135 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 135 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Phe Cys-PEG 20 25 30 <210> 136 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE ·=·. <222> (1)..(31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 136 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys His Cys-PEG 20 25 30 <210> 137 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 137 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 - 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys lie Cys-PEG 20 25 30 <210> 138 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 138 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Lys Cys-PEG 20 25 30 <210> 139 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 139 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Leu Cys-PEG 20 25 30 <210> 140 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..{31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 140 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Met Cys-PEG 20 25 30 <210> 141 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 141 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Pro Cys-PEG 20 25 30 <210> 142 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE> <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 142 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gl 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Gln Cys-PEG 20 25 30 <210> 143 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> ISC_FEATORE <222> (1)..(31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 143 Kis Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Ser Cys-PEG 20 25 30 <210> 144 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 144 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Thr Cys-PEG 20 25 30 <210> 145 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATORE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 145 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Val Cys-PEG 20 25 30 <210> 146 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 146 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr. rg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 - Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Trp Cys-PEG 20 25 30 <210> 147 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 147 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Lys Tyr Cys-PEG 20 25 30 <210> 148 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 148 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Arg lie Cys-PtG 20 25 30 <210> 149 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) ,¿ <223> PEG es polietilenglicol <400> 149 Hi3 Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Arg lie Cys-PEG 20 25 30 <210> 150 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISCJFEATURE <222> (1)..{31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 150 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Lys Gln Arg lie Cys-PEG 20 25 30 <210> 151 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 151 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser lie Pro Gln Arg lie Cys-PEG 20 25 30 <210> 152 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (31) <223> PEG es polietilenglicol <400> 152 His Ser Asp Ala Val. Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Ser Lys Lys -Tyr Leu Gln Ser lie Arg Gln Arg lie Cys-PEG 20 25 30 <210> 153 <211> 123 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 153 ggatccatcg aaggtcgtca ctccgacgct gttttcaccg accagtacac gcgtctgcgt aaacaggttg ctgcaaagaa atacctgcag tccatcaagc agaagcgtta ctaatgactc gag <210> 154 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 154 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac <210> 155 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 155 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac <210> 156 <211> 87 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 156 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag aaatacctgc agtccatcaa gcagaag <210> 157 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 157 cacaccgaag ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac 93 <210> 158 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 158 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagct ggctgttaag 60 aaatacctgc aggacatcaa gcagggcggt acc 93 <210> 159 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 159 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt 90 <210> 160 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 160. cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagct ggctgcaaag 60 aaatacctgc agaccatcaa gcagaagcgt tac 93 <210> 161 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 161 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agaccatcaa gcagaagcgt tac 93 <210> 162 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 162 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcacac 60 aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac 93 <210> 163 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 163 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 cactacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac 93 <210> 164 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 164 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctggcaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt 90 <210> 165 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 165 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctaaaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt 90 <210> 166 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 166 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctcgtaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt 90 <210> 167 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 167 cactccgacg 'ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt 90 <210> 168 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 168 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatccc ccagaagcgt 90 <210> 169 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 169 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcca gcagaagcgt 90 <210> 170 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 170 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90 <210> 251 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 251 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaagctg 90 <210> 252 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 252 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaagatg 90 <210> 253 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 253 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaagccc 90 <210> 254 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 254 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaagcag 90 <210> 255 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 255 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaagtcc 90 <210> 256 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 256 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaagacc 90 <210> 257 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 257 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaaggtt 90 <210> 258 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 258 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaagtgg 90 <210> 259 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 259 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaacaagtac 90 <210> 260 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 260 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctggtaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaaccgtatc 90 <210> 261 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 261 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctaaaaag 60 aaatacctgc agtccatcaa gaaccgtatc 90 <210> 262 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 262 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag aaatacctgc agtccatcaa gaaccgtatc <210> 263 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 263 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag aaatacctgc agtccatccc caaccgtatc <210> 264 <211> 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 264 cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag aaatacctgc agtccatccg taaccgtatc

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo. 1 . Un polipéptido seleccionado del grupo formado por la SEC ID NOs: 1 hasta 152, y sus fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes. 2. Un polinucleótido que codifica una secuencia de polipéptido de la reivindicación 1 , o una de sus variantes degeneradas. 3. Un vector que comprende un polinucleótido de la reivindicación 2. 4. Una célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 3. 5. Un método para producir un polipéptido que comprende: a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 4 en condiciones apropiadas para la expresión de dicho polipéptido; y b) recuperar el polipéptido del cultivo de la célula huésped. 6. Un anticuerpo purificado que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 1. 7. El polipéptido de la reivindicación 1 , en el cual dicho polipéptido se selecciona del grupo formado por las SEC ID NOs: 1 , 2, 3, 4 y 5. 8. El polipéptido de la reivindicación 1 , en el cual dicho polipéptido se selecciona del grupo formado por las SEC ID NOs: 115, 116, 117, 1 18 y 1 19. 9. Un polinucleótido seleccionado del grupo formado por las SEC ID NOs: 154 hasta 264. 10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 , o sus fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes, en combinación con un vehículo aceptable para uso farmacéutico. 1 1. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la cual dicha composición comprende aproximadamente 2% hasta aproximadamente 30% de DIVISO y en forma opcional, un solvente seleccionado del grupo formado por propilenglicol, dimetil formamida, carbonato de propileno, polietilenglicol y triglicéridos. 12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, en la cual dicho polipéptido se selecciona del grupo formado por las SEC ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 1 15, 116, 117, 118 y 1 19. 13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 , o sus fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes, en combinación con un vehículo aceptable para uso farmacéutico y uno o más agentes farmacéuticos. 14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en la cual dicho agente farmacéutico se selecciona del grupo formado por agonistas de PPAR, fármacos de sulfonilurea, secretagogos que no contienen sulfonilurea, inhibidores de a-glucosidasa, sensibilizadores a la insulina, secretagogos de insulina, compuestos reductores de la producción de glucosa hepática, insulina, agentes anti-obesidad, inhibidores de la HMG CoA reductasa, ácido nicotínico, secuestrantes de ácidos biliares, derivados del ácido fíbrico y agentes contra la hipertensión. 15. Una composición que comprende una cantidad efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1, o sus fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes, en combinación con un vehículo inerte. 16. Un método de tratamiento de la diabetes que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un pplipéptido de la reivindicación 1. 17. El método de la reivindicación 16, en el cual dicha diabetes se selecciona del grupo formado por diabetes del tipo 1, diabetes del tipo 2, diabetes de inicio en la madurez, diabetes latente en adultos autoinmunes y diabetes gestacional. 18. Un método de tratamiento del Síndrome X que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. 19. Un método de tratamiento de los trastornos relacionados con la diabetes que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. 20. El método de la reivindicación 19, en el cual dicho trastorno relacionado con la diabetes se selecciona del grupo formado por hiperglucemia, la hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, intolerancia a la glucosa en ayunas, dislipidemia, hipertrigliceridemia, y resistencia a la insulina. 21. Un método de tratamiento de la diabetes que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 en combinación con uno o más agentes farmacéuticos. 22. El método de la reivindicación 21 , en ei cual dicho agente farmacéutico se selecciona del grupo formado ¿por agonistas de PPAR, fármacos de sulfonilurea, secretagogos que no contienen sulfonilurea, inhibidores de a- glucosidasa, sensibilizadores a la insulina, secretagogos de insulina, compuestos reductores de la producción de glucosa hepática, insulina y agentes anti-obesidad. 23. El método de la reivindicación 22, en el cual dicha diabetes se selecciona del grupo formado por diabetes del tipo 1 , diabetes del tipo 2, diabetes de inicio en la madurez, diabetes latente en adultos autoinmunes y diabetes gestacional. 24. Un método de tratamiento del Síndrome X que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 en combinación con uno o más agentes farmacéuticos. 25. El método de la reivindicación 24, en el cual dicho agente farmacéutico se selecciona del grupo formado por agonistas de PPAR, fármacos de sulfonilurea, secretagogos que no contienen sulfonilurea, inhibidores de a- glucosidasa, sensibilizadores a la insulina, secretagogos de insulina, compuestos reductores de la producción de glucosa hepática, insulina y agentes anti-obesidad. 26. Un método de tratamiento de los trastornos relacionados con la diabetes que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 en combinación con uno o más agentes farmacéuticos. 27. El método de la reivindicación 26, en el cual dicho trastorno relacionado con la diabetes se selecciona del grupo formado por hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, intolerancia a la glucosa en ayunas, dislipidemia, hipertrigliceridemia y resistencia a la insulina. 28. El método de la reivindicación 27, en el cual dicho agente farmacéutico se selecciona del grupo formado por agonistas de PPAR, fármacos de sulfonilurea, secretagogos que no contienen sulfonilurea, inhibidores de a- glucosidasa, sensibilizadores a la insulina, secretagogos de insulina, compuestos reductores de la producción de glucosa hepática, insulina y agentes anti-obesidad. 29. Un método de tratamiento de la diabetes, Síndrome X, o trastornos relacionados con la diabetes que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 en combinación con uno o más agentes seleccionados del grupo formado por inhibidores de la HMG CoA reductasa, ácido nicotínico, secuestrantes de ácidos biliares, derivados del ácido fíbrico y agentes contra la hipertensión. 30. El método de la reivindicación 29, en el cual dicho trastorno relacionado con la diabetes se selecciona del grupo formado por hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, intolerancia a la glucosa en ayunas, dislipidemia, hipertrigliceridemia y resistencia a la insulina. 31. El método de cualquiera de las reivindicaciones 21 hasta 30, en el cual el polipéptido de la reivindicación 1 y uno o más agentes farmacéuticos se administran como formulación de dosificación farmacéutica única. 32. Un método de tratamiento o prevención de causas secundarias de la diabetes que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. 33. El método de la reivindicación 32, en el cual dicha causa secundaria se selecciona del grupo formado por exceso de glucocorticoides, exceso de hormona del crecimiento, feocromocitoma y diabetes inducida por fármacos. 34. Un método de tratamiento o prevención de causas secundarias de la diabetes que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 en combinación con uno o más agentes farmacéuticos. 35. El método de la reivindicación 34, en el cual dicho agente farmacéutico se selecciona del grupo formado por agonistas de PPAR, fármacos de sulfonilurea, secretagogos que no contienen sulfonilurea, inhibidores de a- glucosidasa, sensibilizadores a la insulina, secretagogos de insulina, compuestos reductores de la producción de glucosa hepática, insulina y agentes anti-obesidad. 36. Un método de tratamiento de una enfermedad respiratoria que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 . 37. Un método de tratamiento de la obesidad que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. 38. Un método para regular el apetito que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. 39. Un método de tratamiento de una enfermedad cardiovascular que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. 40. Un método de tratamiento de trastornos del metabolismo de los lípidos y los carbohidratos que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. 41. Un método de tratamiento de trastornos del sueño que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. 42. Un método de tratamiento de trastornos de reproducción masculina que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. Un método de tratamiento de trastornos del crecimiento o trastornos de la homeostasis de la energía que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. Un método de tratamiento de enfermedades inmunológicas que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. Un método de tratamiento de enfermedades autoinmunes que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. Un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias agudas y crónicas que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. Un método de tratamiento del shock séptico que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1. Un método de estimular la liberación de insulina de un modo glucosa-dependiente en un sujeto que lo necesita a través de la administración a dicho sujeto de un polipéptido de la reivindicación 1. Una composición para terapia géjnica que comprende un polinucleótido de la reivindicación 2 en combinación con un vector para terapia génica terapéuticamente efectivo. Los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1 para el tratamiento y/o la profilaxis de la diabetes y trastornos relacionados con la diabetes. 51 . Un medicamento que contiene por lo menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 en combinación con por lo menos un vehículo o excipiente seguro para uso farmacéutico, aceptable para uso farmacéutico. 52. El uso de los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de la diabetes y trastornos relacionados con la diabetes. 53. El medicamento de acuerdo con la reivindicación 51 para el tratamiento y/o la profilaxis de la diabetes.