CN101405298A - 垂体腺苷酸环化酶激活肽(pacap)受体(vpac2)激动剂及其药物使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的在体内作为VPAC2受体激动剂的肽。这些胰岛素促分泌的多肽显示出当葡萄糖攻击时比对照更为降低体内的血糖。本发明的多肽在制剂中也是稳定的并且具有长的半衰期。该本发明的肽为具有降低的内源胰岛素分泌，尤其是II型糖尿病的患者提供了一种新的治疗方案。具体地，本发明是一种选自VPAC2相关多肽或其功能性等价物的特异性组的多肽。本发明也提供了治疗哺乳动物代谢疾病的方法，包括将治疗有效量的胰岛素促分泌肽给药于所述哺乳动物。本发明也公开了制备本发明多肽的方法，包括重组的和合成的两种。

Description

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)受体(VPAC2)激动剂及其药物使用方法
本申请要求享受于2002年7月12日申请的美国临时申请No.60/395,738的优先权，其内容被全部引入作为参考。
发明领域
本发明涉及新鉴定的多肽以及此多肽用于治疗目的的用途。更具体地，本发明的多肽可以以依赖于葡萄糖的方式刺激胰腺β-细胞释放胰岛素，从而为受代谢失调诸如糖尿病或削弱的葡萄糖耐量-一种前糖尿病状态的病症困扰的个体提供一种治疗的选择方案。
发明背景
糖尿病的特征是具有削弱的葡萄糖代谢作用，其在高糖尿病患者中显示为血糖水平升高。依据下述的缺陷将糖尿病分为两个主要的组：I型糖尿病，或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，当患者的胰腺缺少生产胰岛素的β-细胞时产生，以及II型糖尿病，或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)，其患者具有削弱的β-细胞功能和改变的胰岛素作用。
目前I型糖尿病患者用胰岛素来进行治疗，而大多数的II型糖尿病患者用刺激β-细胞功能的药物或增强病人对胰岛素的组织敏感性的药物进行治疗。几乎一半的II型糖尿病患者受试者随着时间丧失了对这些药物的应答，然后必须寄予胰岛素疗法。目前用于治疗II型糖尿病的药物描述在下文中。
α-葡糖苷酶抑制剂(例如Precose、VogliboseTM和Miglitol
Figure A0381664400062
)其通过延迟内脏对葡萄糖的吸收而降低餐后葡萄糖的移动。这些药物是安全的并且为轻度糖尿病患者提供了治疗。然而，文献中已经报道了对胃肠道的副作用。
胰岛素敏化剂是增强身体对胰岛素应答的药物。噻唑烷二酮类化合物诸如AvandiaTM(rosiglitazone)和ActosTM激活过氧化物酶体增殖剂-激活的受体(PPAR)γ亚型并调节尚没有被较好描述的一组基因的活性。RezulinTM(troglitazone)是此类型中的第一个药物，其因为增加了肝脏的酶水平和药物诱导的肝脏毒性而被人们所摒弃了。对肝的这些影响在使用AvandiaTM和ActosTM的患者中没有成为显著的问题。即使如此，建议在治疗的第一年每两个月进行一次肝脏酶测定且此后定期地进行。AvandiaTM和ActosTM好像与水肿和浮肿相关联。AvandiaTM不与胰岛素一起使用，因为这样会导致充血性心力衰竭。另一种可能的副作用是体重增加。
胰岛素促泌剂(例如，磺酰脲类(SFUs)及其它通过ATP-依赖型K+通道起作用的药物)是目前另一种类型用于治疗II型糖尿病的药物。SFUs是用于具有轻中度禁食糖血症的II型糖尿病患者的标准疗法。SFUs具有包括可能诱导低血糖、体重增加和高的初级和次级失败在内的局限性。10～20％的最初被治疗的患者未能显示显著的治疗效果(初级失败)。次级失败表现为另外的20-30％的患者在使用6个月后对SFU丧失了治疗效果。在治疗5-7年后具有50％SFU应答者的胰岛素疗法是人们所需要的(Scheen等，Diabetes Res.Clin.Pract.6：533-543，1989)。
GlucophageTM(metformin HCl)是一种通过减少肝葡萄糖排出量并增加外围葡萄糖吸收和利用来降低血糖的双缩胍。该药物对于降低轻度和中度受影响的受试者的血糖是有效的并且不具有体重增加或可能诱导低血糖的副作用。然而，GlucophageTM具有大量的副作用包括胃肠道紊乱和乳酸酸中毒。GlucophageTM被禁忌用于年龄超过70岁的糖尿病患者并且损伤受试者的肾的或肝的功能。最后，GlucophageTM具有与SFUs相同的初级和次级失败率。
胰岛素冶疗在餐后和锻炼后进行，并且内服不能充分地控制血糖。这些治疗具有如下的缺点，即其是可注射的，其可能产生低血糖，并且其导致体重增加。
由于目前治疗方法具有的问题，需要新的治疗II型糖尿病的治疗方法。尤其是，维持正常(依赖于葡萄糖的)胰岛素分泌的治疗方法是需要的。这些新药应该具有以下特性：依赖于葡萄糖来促进胰岛素的分泌(即，仅仅在增加血糖的情况下产生胰岛素分泌)；低的初级和次级失败率；以及保持小岛细胞功能。此处公开的开发新治疗方法的策略基于环腺苷一磷酸(cAMP)信号机制以及其对胰岛素分泌的影响。
环化AMP是胰岛素分泌过程的主要调节因子。此信号分子的增加促进了激活蛋白激酶A途径后k+通道的闭合。K+通道的闭合导致细胞去极化以及随后的Ca++通道的打开，其反过来导致胰岛素颗粒的胞吐作用。其在缺少低葡萄糖浓度的情况下对胰岛素分泌的发生基本上没有任何影响(Weinhaus等，Diabetes 47：1426-1435，1998)。促泌剂类垂体腺苷酸环化酶激活肽(“PACAP”)以及GLP-1(胰高血糖素样肽1)以依赖于葡萄糖的方式利用cAMP系统来调节胰岛素的分泌(Komatsu等，Diabetes 46：1928-1938，1997；Filipsson等，Diabetes50：1959-1969，2001；Drucker，Endocrinology 142：521-527，2001)。通过增加cAMP进行作用的胰岛素促泌剂诸如GLP-1和PACAP除了增强胰岛素释放外也能够增强胰岛素的合成(Skoglund等，Diabetes49：1156-1164，2000；Borboni等，Endocrinology 140：5530-5537，1999)。
PACAP是一种由胰腺β-细胞进行葡萄糖-依赖性胰岛素分泌的有效刺激物。三种不同的PACAP受体类型(PAC1，VPAC1和VPAC2)已被描述(Harmar等，Pharmacol.Reviews 50：265-270，1998；Vaudry等，Pharmacol.Reviews 52：269-324，2000)。PACAP没有受体选择性，三种受体具有类似的活性和效力。PAC1主要在CNS中，而VPAC1和VPAC2则更广泛地分布。VPAC1位于CNS以及肝脏、肺脏和肠中。VPAC2位于CNS、胰腺、骨骼肌、心脏、肾脏、脂肪组织、睾丸以及胃中。最近的研究表明VPAC2负责由β-细胞分泌胰岛素(Inagaki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2679-2683，1994；Tsutsumi等，Diabetes51：1453-1460，2002)。PACAP的促胰岛素作用是受CTP结合蛋白Gs调节的。胞内cAMP的累积随后激活了增加[Ca++]的β-细胞中的非选择性阳离子通道，以及促进了含有胰岛素的分泌颗粒的胞吐作用。
PACAP是那些通过cAMP-介导的信号转导途径发挥作用的新陈代谢、神经内分泌以及神经介质肽类激素的超家族的新成员(Arimura，Regul.Peptides 37：287-303，1992)。生物学活性肽由生物合成前体释放为两种分子形式，具有酰胺化的羧基末端的38-氨基酸肽(PACAP-38)和/或27-氨基酸肽(PACAP-27)(Arimura，如上文所述)。
两种形式肽的最高浓度被发现存在于脑和睾丸中(Arimura，如上文所述)。肽的较短形式PACAP-27显示出与肠血管活性肽(VIP)具有68％的结构同源性。然而，PACAP和VIP在中枢神经系统中的分布表明这些结构相关的肽具有不同的神经递质功能(Koves等，Neuroendocrinology 54：159-169，1991)。
最近的研究证明了PACAP-38的各种生物学功能，从在繁殖中的作用(McArdle，Endocrinology 135：815-817，1994)到刺激胰岛素分泌的能力(Yada等，J.Biol.Chem.269：1290-1293，1994)。此外，PACAP似乎在脂类和碳水化合物代谢的激素调节(Gray等，Mol.Endrocrinol.15：1739-47，2001)；生理节奏功能(Harmar等，Cell 109：497-508，2002)；和免疫系统、生长、能量稳态以及男性生殖功能(Asnicar等，Endrocrinol.143：3994-4006，2002)；食欲的调节(Tachibana等，Neurosci.Lett.339：203-206，2003)；以及急性的和慢性炎症性疾病、脓毒性休克和自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮)(Pozo，Trends Mol.Med.9：211-217，2003)中起作用。
血管活性肠肽(VIP)是具有28个氨基酸的肽，其首先分离自猪的上部小肠(Said和Mutt，Science 169：1217-1218，1970；美国专利No.3,879,371)。此肽属于包括毒晰皮肽、分泌素、抑生长素和胰高血糖素的结构相关的小的多肽家族。通过与胞内cAMP信号系统偶联的膜结合受体蛋白的激活调节VIP的生物学功能。这些受体最初被称为VIP-R1和VIP-R2，然而，随后发现它们是与VPAC1和VPAC2相同的受体。VIP显示出与VPAC1和VPAC2类似的活性和效力。
为了改善人肺液中VIP的稳定性，Bolin等(Biopolymers 37：57-66，1995)制备了一系列VIP变体来增强这些肽的螺旋倾向和降低蛋白水解的降解。取代集中在位置8、12、17和25-28处，这些已被证明对于受体结合是不重要的。此外，“GGT”序列被标记到VIP突变蛋白的C-末端上，期望其更有效地覆盖螺旋。最后，为了进一步稳定螺旋，合成了一些环状的变体(专利US5,677,419)。尽管这些努力没有指向受体的选择性，但是它们产生了两个具有大于100倍的VPAC2选择性的类似物(Gourlet等，Peptides 18：403-408，1997；Xia等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，281：629-633，1997)。
GLP-1是由肠L-细胞在进餐后释放的并且具有与肠胰岛素激素相同的功能(即其增强从胰腺β-细胞释放葡萄糖-诱导的胰岛素)。它是一种37-氨基酸肽，其通过依赖于组织类型的胰高血糖素基因而差异表达。关于GLP-1的支持增加β-细胞中cAMP水平的有益作用的临床资料已被收集。向缺乏调控的II型糖尿病患者注入GLP-1来使他们的空腹血糖水平正常化(Gutniak等，New Eng.J.Med.326：1316-1322，1992)并且通过持续的注入来改善β-细胞功能而达到正常受试者的水平(Harmar等，Diabetes 45：1524-1530，1996)。最近的报告表明GLP-1提高了具有削弱的葡萄糖耐量的受试者中β-细胞对葡萄糖应答的能力(Byrne等.，Diabetes 47：1259-1265，1998)。然而所有的这些作用由于肽的短的半衰期而是短暂的。
糊精药物被用Exendin 4TM(AC2993)进行III期试验，其中的Exendin 4TM(AC2993)是一种最初在毒蜥中鉴定的39个氨基酸的肽。临床研究报道证明糊精提高了用Exendin 4TM治疗的II型糖尿病患者中的改善的糖血控制。然而，恶心和呕吐的发生是显著的。
申请人在WO 01/23420中公开了在体内具有VPAC2受体激动剂作用的新的多肽，WO 01/23420的说明书在此处被整体引入，并且尤其是，申请人公开了一种确定为R3P66的VPAC2激动剂。然而其中描述的多肽，包括R3P66，并非合适的商用候选物，因为其引发的与制剂中的多肽有关的稳定性问题以及与多肽的短半衰期有关的问题。
人们需要一种具有PACAP、GLP-1或Exendin 4TM的依赖于葡萄糖的胰岛素促分泌活性，但具有较少的副作用，并且优选地在制剂中是稳定的并具有长的血浆半衰期的改进的肽。此外，严格控制血浆的葡萄糖水平可防止长期糖尿病患者的并发症。因此，新的糖尿病药物应该为患者提供改进的生活质量。
发明概述
本发明提供了新的多肽，其在体内具有VPAC2受体(下文称VPAC2)激动剂的作用并且在可通过具有VPAC2激动剂活性的药物来改善疾病和病症的治疗中是有效的。优选地，本发明的多肽是选择性的VPAC2激动剂，具有比VPAC1和PAC1更大的VPAC2效力。例如，然而并非作为对其的限制，这些多肽刺激胰岛素合成和胰腺β-细胞以葡萄糖依赖性的方式进行的释放以及随后的血浆葡萄糖减少。这些促分泌的多肽被显示降低体内血糖超过当葡萄糖攻击时的载体对照。更优选地，本发明的多肽在制剂中是稳定的，并且具有长的血浆半衰期以及当释放时在体内持续长时间的作用。
本发明的多肽对于具有例如代谢失调，诸如那些因降低的内源胰岛素分泌而产生的，尤其是II型糖尿病的患者，或对于具有削弱的葡萄糖耐量-具有轻度胰岛素分泌改变的前糖尿病状态的患者，提供了一种新的治疗方案。此外，本发明的多肽可用于预防和/或治疗I型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年人成熟期发病型糖尿病(MODY)、成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)以及相关联的糖尿病血脂紊乱及其它糖尿病并发症，以及高血糖、血胰岛素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹血糖、血脂紊乱、高甘油三酯血症、综合症X和胰岛素抗性。
本发明的多肽也可被用于预防和/或治疗肥胖症(例如，食欲和食物摄入的调节)、动脉粥样硬化疾病、高脂质血、高胆固醇血症、低HDL水平、高血压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、冠心病、冠状动脉病和高血压)、脑血管疾病和外围血管疾病；以及用于预防和/或治疗狼疮、多囊卵巢综合症、致癌作用和细胞增生、哮喘、男性生殖问题、溃疡、睡眠障碍、脂类和碳水化合物代谢的紊乱、生理节奏的机能障碍、生长障碍、能量稳态平衡的紊乱、免疫疾病包括自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮)，以及急性和慢性炎症性疾病、脓毒性休克及其它此处确定的病症，或其它在下面描述的功能。
具体地，本发明的一个方面为多肽，其选自SEQ ID NOs：1至152，以及其显示至少一种生物学功能与列举的SEQ ID NOs基本上相同的片段、衍生物和变体(总称，“本发明的多肽”)，包括其功能等价物。本发明的一个优选的实施方案为一种多肽，其选自SEQ ID NOs：1至38和SEQ ID NOs：115至152，以及其显示出至少一种生物学功能与列举的SEQ ID NOs基本上相同的片段、衍生物和变体。本发明的一个更优选的实施方案为选自SEQ ID NOs：1至5和SEQ ID NOs：115至119，以及其显示出至少一种生物学功能与列举的SEQ ID NOs基本上相同的片段、衍生物和变体的多肽。本发明的一个更为优选的实施方案为选自SEQ ID NOs：1、2、115和116以及显示出至少一种生物学功能与列举的SEQ ID NOs基本上相同的片段、衍生物和变体的组的多肽。
本发明的另一个实施方案为一种编码本发明的多肽、重组表达本发明多肽所必需的载体和宿主细胞。这些多核苷酸序列包括SEQ IDNOs：154-264。
本发明也提供了那些选择性地结合本发明多肽的抗体和抗体片段。这些抗体在本发明多肽的检测中是有用的，并且可通过本领域公知的方法来鉴定和制备。一种多克隆的N-末端IgG抗体和一种单克隆的C-末端Fab抗体已被制备，其识别本发明的多肽。
本发明的另一个目的是提供治疗哺乳动物中的糖尿病、与糖尿病-相关的紊乱疾病和/或其它受本发明的多肽影响，优选地受本发明多肽的VPAC2激动剂功能作用的疾病或病症的方法，包括将治疗有效量的任意的本发明的多肽或在VPAC2诸如SEQ ID NOs：1至152处具有活性的任意多肽给药所述哺乳动物。
本发明也公开了制备本发明的多肽，包括重组的和合成的多肽的方法。
附图的简要说明
图1a-1d描述了SEQ ID NOs：1至152的多肽的氨基酸序列。SEQID NOs：115-152为通过顺丁烯二酰亚胺键在C-末端半胱氨酸处加入了聚乙二醇的肽。PEG可以是22kD的线性PEG或43kD的分支PEG。
图2描述了克隆到pGEX-6P-1中产生SEQ ID NO：1氨基酸序列的DNA序列(SEQ ID NO：153)。加下划线的限制性酶位点BamHI和Xho I允许框内克隆到pGEX-6P-1表达载体中。编码Factor Xa识别位点的12mer DNA序列和两个终止密码子被用粗体突出标注。中间的非突出标注的序列编码SEQ ID NO：1(氨基酸序列)。来自VIP的突变密码子用小写核苷酸表述。
图3a-3h描述了核酸序列SEQ ID NOs：154至264。这些核酸序列编码本发明的多肽。
图4是说明分散的大鼠胰岛细胞在暴露于本发明的聚乙二醇化的肽之后胰岛素分泌的直方图。
图5是显示通过皮下给药途径给药本发明的聚乙二醇化的肽的大鼠的增强的葡萄糖处理的直方图。
图6描述了三种VPAC2类似物(P5、P7和对照R3P66)在1mg/mL含有150mM NaCl和20mM磷酸盐的水溶液中在pH 8.0，40℃温育过程中的稳定性倾向。通过毛细管电泳分析来测定样品中肽的纯度。用最初的百分比纯度校正在2-和4-周时间点时的纯度。
图7描述了三种VPAC2类似物(P7、P8和对照R3P66)在2mg/mL二甲基亚砜(DMSO)于40℃温育过程中的稳定性倾向。通过毛细管电泳分析测定样品中肽的纯度。通过最初的百分比纯度校正在2-和4-周时间点时的纯度。
图8说明了全长的聚乙二醇化的肽对在N-末端具有单个氨基酸缺失的类似的聚乙二醇化的肽的选择性识别。
发明详述
本发明提供了新的多肽，及其与附图1a-ID(总称为本发明的多肽)的多肽显示出具有至少一个基本上相同的生物学功能的片段、衍生物和变体。本发明的多肽在体内起VPAC2激动剂的作用或在这些疾病或病症如糖尿病包括I型和II型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年人成熟期发病型成人糖尿病(MODY)(Herman等，Diabetes 43：40，1994)；成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)(Zimmet等，DiabetesMed.11：299，1994)；以及相关联的糖尿病血脂紊乱及其它糖尿病并发症，以及高血糖、血胰岛素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹血糖、血脂紊乱、高甘油三酯血症、综合症X和胰岛素抗性的预防和/或治疗中起作用。
此外，本发明的多肽也可用于预防和/或治疗肥胖症(例如食欲和食物摄入的调节)、动脉粥样硬化疾病、高脂质血、高胆固醇血症、低HDL水平、高血压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、冠心病、冠状动脉病和高血压)、脑血管疾病和外围血管疾病；以及用于预防和/或治疗狼疮、多囊卵巢综合症、致癌作用和超常增生、哮喘、男性生殖问题包括人精子活力、溃疡、睡眠障碍及其它此处确定的病症，或具有其它在下文描述的功能。
优选地，本发明的多肽以葡萄糖-依赖性的方式刺激胰腺β-细胞的胰岛素释放。更优选地，本发明的多肽在含水的和无水的两种制剂中是稳定的并且具有大于一个小时的血浆半衰期。
本发明的多肽为VPAC2激动剂。优选地，它们是选择性的VPAC2激动剂，相对于VPAC1和/或PAC1对VPAC2具有至少10倍的选择性。更优选地，它们是相对于VPAC1和/或PAC1对VPAC2具有至少100倍的选择性的选择性VPAC2激动剂。最优选地，它们以葡萄糖-依赖性的方式刺激胰岛素释放到血浆中，而不诱导对例如II型糖尿病的治疗起相反作用的血浆葡萄糖水平的郁积或增加。另外，本发明多肽优选地是VPAC2受体的选择性激动剂，由此当选择性地抵抗其它产生不愉快或危险的副作用如胃肠道水分保留和/或有害的心血管作用诸如增加心率的受体时，导致例如释放到血浆中的胰岛素的增加。
本发明的多肽在含水和无水的制剂中也是稳定的。优选地，本发明的多肽当溶于水(pH值在7-8之间)或无水的有机溶剂时，于37-40℃在一周的时间内具有小于10％的降解。更优选地，本发明的多肽当溶于水(pH值在7-8之间)或无水的有机溶剂时，在37-40℃一周的时间内具有小于5％的降解。此外，本发明的组合物和制剂可包括本发明的多肽和大约2％到大约30％的DMSO。在本发明的另一个实施方案中，组合物和制剂可选择性地包括大约0.2％到大约3％(w/v)的其它溶剂诸如丙二醇、二甲基甲酰胺、碳酸亚丙基酯、聚乙二醇和甘油三酯。
最后，优选地，本发明的衍生化多肽在静脉注射后的大鼠中具有至少一个小时的血浆半衰期；更优选的，血浆半衰期为至少两个小时，并且进一步优选地，血浆半衰期为至少3个小时。
本发明的多肽为具有降低的内源胰岛素分泌或削弱的葡萄糖耐量，尤其是II型糖尿病的患者提供了一种新的治疗方案。也就是说，本发明的多肽是长效的VPAC2激动剂，可被用于维持、提高和修复葡萄糖-刺激的胰岛素分泌。此外，一种VPAC2受体的选择性肽激动剂能增强胰腺中的葡萄糖-依赖性胰岛素分泌，而不引起与另一PACAP受体的非选择性激活有关的副作用。
现在定义本说明书中的特定的术语，并且其它的将被定义为如同所引用的。特定氨基酸的单字母缩写、其相应的氨基酸以及三字母缩写如下：A，丙氨酸(ala)；C，半胱氨酸(cys)；D，天冬氨酸(asp)；E，谷氨酸(glu)；F，苯丙氨酸(phe)；G，甘氨酸(gly)；H，组氨酸(his)；I，异亮氨酸(ile)；K，赖氨酸(lys)；L，亮氨酸(leu)；M，甲硫氨酸(met)；N，天冬酰胺(asn)；P，脯氨酸(pro)；Q谷氨酰胺(gln)；R，精氨酸(arg)；S，丝氨酸(ser)；T，苏氨酸(thr)；V，缬氨酸(val)；W，色氨酸(trp)；Y，酪氨酸(tyr)。
术语“编码多肽的多核苷酸”包括其仅仅包含多肽的编码序列的多核苷酸，以及其包括其它的编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明进一步涉及了与上文所述的序列杂交的多核苷酸，这些序列之间具有至少大约70％，优选至少具有大约90％，并且更优选地至少具有大约95％的同一性。本发明尤其涉及了在严格条件下与上述多核苷酸杂交的编码多肽的多核苷酸。此处所用的“严格条件”是指“严格的杂交条件”。优选地，杂交仅在至少具有大约90％，并且优选地具有大约95％至97％同一性的序列之间发生。在一个优选的实施方案中，与上述所述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保留与cDNAs编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
“功能性等价物”与“基本上相同的生物学功能或活性”各自是指生物活性的程度在大约30％到大约100％以内，或该多肽显示的生物活性当与通过相同方法测定的各多肽的生物活性比较时更多。例如，图1多肽的功能性等价物当通过实施例7的环化AMP(cAMP)闪烁亲近检测进行测定时，其在表达人VPAC2受体的CHO细胞系中显示出cAMP的累积。
本发明的多肽也即VPAC2激动剂是一种当在实施例7的方案中测定时显示出30％到大约100％或更多的最大PACAP-27VPAC2激动剂活性的多肽。本发明优选的多肽，即相对于PACAP、VPAC1和PAC1受体的VPAC2的选择性激动剂为那些多肽，其显示VPAC2激动剂活性与VPAC1活性的比率为大约10∶1或更大，并且更优选地，大约100∶1或更大，和/或显示出VPAC2激动剂活性与PAC1受体活性的比率为大约10∶1或更大，并且更优选地，当在实施例7的方案中利用表达合适的受体的细胞测定该多肽时该比率为大约100∶1或更大。
“严格的杂交条件”是指两个多核苷酸(或片段)在42℃在溶液中过夜温育杂交，该溶液包括50％甲酰胺、5xSSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯、和20μg/mL变性的、剪切的鲑精DNA，然后在大约65℃在0.1x SSC中洗涤过滤器。
术语“片段“，“衍生物”和“变体”，当涉及图1的多肽时，是指维持与这些多肽基本上相同生物学功能或活性的多肽的片段、衍生物和变体，如下所述。
类似物包括含有本发明多肽的氨基酸序列在内的前-多肽。本发明的活性多肽可通过天然的、体内作用或通过本领域公知的方法诸如通过酶切或化学裂解技术裂解自完全的前多肽分子的其它氨基酸。例如，28-氨基酸的天然肽VIP被天然表达为大量较大的多肽，其然后被体内加工来释放28-氨基酸的活性的成熟肽。
片段是多肽的一部分，其保留基本上类似的功能性活性，如此处公开的体内模型所述的。
衍生物包括所有对多肽的修饰，其基本上保持此处公开的功能并且包含其它的结构和伴随的功能(例如，具有较大半衰期的聚乙二醇化多肽)，赋予了靶特异性或其它的活性诸如对预定目标的毒性的融合多肽，如下文所述。
本发明的多肽可以是重组的多肽、天然纯化的多肽或合成的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或变体可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非-保守的氨基酸残基取代(优选地为保守的氨基酸残基)，并且此取代的氨基酸残基可以是或可以不是通过遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)其中氨基酸残基的一个或多个包括取代基的，或(iii)其中成熟多肽与另一个化合物，诸如一种增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)熔合的，或(iv)一种其中其它的氨基酸被融合到成熟多肽上的，诸如前导或分泌的序列或被用于成熟多肽的纯化的序列或前多肽序列，或(v)一种其多肽序列与较大的多肽熔合的(例如，人白蛋白、抗体或Fc，用于增加作用持续时间)。本领域的技术人员从此处的教导可以理解这些片段、衍生物和变体以及类似物在本发明的范围内。
优选地，本发明的衍生物将在一或多个推定的，优选非必需氨基酸残基处含有保守的氨基酸取代(在下面定义的)。“非必需氨基酸”残基是一种可改变自蛋白质的野生型序列而没有改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需要的。“保守的氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被用具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在现有技术中已被定义。本家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸色氨酸)、β-分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。非-保守取代不能用于保守的氨基酸残基或用于保守的蛋白功能区内的氨基酸残基，诸如残基19和27，其中这些残基是蛋白质活性诸如VPAC2活性和/或VPAC2选择性所必不可少的。片段或生物学活性部分包括适于用作药物来产生抗体，以及用作研究试剂等的多肽片段。片段包括含有充分类似于或来源于本发明多肽氨基酸序列的氨基酸序列并且具有那些多肽的至少一种活性，但其包含比此处公开的全长多肽更少的氨基酸的肽。典型地，生物学活性部分包括具有多肽的至少一种活性的功能区或基序。多肽的生物学活性部分可以是例如五个或更多氨基酸长的肽。这些生物学活性部分可以合成或通过重组技术来制备，并且可以通过此处公开的和/或本领域公知的方法来评价本发明多肽的一或多种功能性活性。
此外，本发明优选的衍生物包含已经与另一个化合物熔合的成熟多肽，诸如一种增加多肽半衰期和/或减少多肽的潜在免疫原性的化合物(例如，聚乙二醇，“PEG”)。就聚乙二醇化而言，可通过本领域技术人员公知的任意方法来进行多肽与PEG的融合。例如，聚乙二醇化可通过首先引入一个半胱氨酸突变到多肽中来提供一个接头来连接PEG，然后与PEG-马来酰亚胺进行位点特异性的衍生作用。半胱氨酸可被添加到肽的C-末端，并且其中C-末端是本发明中优选的位点。(参见，例如，Tsutsumi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(15)：8548-53，2000；Veronese，Biomaterials 22：405-417，2001；Goodsoon&Katre，Bio/Technology 8：343-346，1990)。本发明多肽的变体包括具有充分类似于图1中SEQ ID NOs氨基酸序列的氨基酸序列的多肽或其功能区。术语“充分地相似“是指第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列含有足够的或最小数目的相同或等价的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有一个共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，含有至少大约45％，优选大约75％至98％同一性的共同结构域的氨基酸序列在此处被定义为充分地相似。优选地，变体应充分类似于本发明的优选多肽的氨基酸序列。变体包括由与本发明的多核苷酸杂交或其在严格条件下互补的多核苷酸编码的多肽的变体。这些变体通常保持本发明多肽的功能活性。多核苷酸片段的文库可用于产生用于筛选和随后选择的多样化群体。例如，片段的文库可通过在其中每一分子仅仅发生大约一次切口的条件下用核酸酶处理多核苷酸的双链PCR片段，退火双链DNA，复性DNA来从不同的切口产物形成包括正义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理除去重组双链体的单链部分，以及将产生的片段文库连接到表达载体中而产生。通过此方法，可以获得编码本发明多肽的N-末端以及不同大小的内部片段。
变体包括由于突变而导致的氨基酸序列不同的多肽。用作VPAC2激动剂的变体可通过筛选突变体的组合文库而被鉴定，例如用于VPAC2激动剂活性的本发明多肽的平截突变体。
在一个实施方案中，类似物的多样化文库通过在核酸水平上组合的突变来产生并且被多样化的基因文库所编码。变体的多样化文库可通过，例如将合成的寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中，使得潜在变体氨基酸序列的简并组被表达为单独的多肽，或可选择地，被表达为其中含有该序列组的更大的融合蛋白组(例如，用于噬菌体展示)。有许多方法可用于从简并寡核苷酸序列产生可能变体的文库。可在DNA自动合成仪中进行简并基因序列的化学合成，并且然后将合成基因连接到合适的表达载体中。基因简并组的使用使得有可能在一种混合物中提供编码可能的变体序列的目的组的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见，例如，Narang，Tetrahedron39：3，1983；Itakura，等，Annu.Rev.Biochem.53：323，1984；Itakura等，Science 198：1056，1984；Ike等，Nucleic Acid Res.11：477，1983)。
筛选组合文库的基因产物的一些技术是本领域公知的，其中组合文库是通过点突变或平截产生的并且用于筛选具有选择特性的基因产物cDNA文库。这些技术适用于通过R-激动剂多肽的组合突变来对产生的基因文库进行快速筛选。最广泛使用的技术，其用于筛选大基因文库的高通量分析典型地包括克隆基因文库到可复制的表达载体中，用产生的载体的文库转化合适的细胞并在检测目的活性促进编码其产物被检测的基因载体分离的条件下表达组合基因。递推集团突变形成(REM)，一种增强文库中功能性突变频率的技术，可用于与筛选试验组合来鉴定目的变体。
本发明也提供了嵌合的或融合的多肽。设计目的序列来用于定位传递多肽到胰腺来使可能的副作用最小化。本发明的多肽可由彼此通过肽键或修饰的肽键连接的氨基酸组成(即，肽的电子等排物)，并且可含有除了20个基因-编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽可通过自然过程，诸如转译后的作用，或者通过本领域公知的化学修饰技术被修饰。这些修饰被广泛描述在基本的教科书中和更具体的专著中，以及在长篇的研究文献中。修饰可发生在多肽的任意位置，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以理解相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定的多肽的一些位点处。同样地，给定的多肽可含有很多类型的修饰。多肽可以是分支的，例如，作为遍在蛋白化的结果，并且它们可以是环状的，有或者没有分支。环状的、分支的和分支环状的多肽可产生于转译后的自然过程或通过合成方法来产生。修饰包括乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化作用、二硫键形成、脱甲基作用、共价交连的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化作用、γ-羧基化、糖基化作用、GPI锚形成、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、十四碳酰化、氧化、聚乙醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋作用、硒酰化、酸酯化作用、转运RNA介导的氨基酸添加到蛋白质上，诸如精氨酰化、以及遍在蛋白化(参见，例如，Proteins，Structure and Molecular Properties，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，纽约(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，ed.，学院出版社，纽约，pgs.1-12(1983)；Seifter，等.，Meth.Enzymol 182：626-646，1990；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992)。
本发明的多肽包括图1的多肽(SEQ ID NOs：1至152)，以及那些在序列上具有非实质变化的序列。“非实质性变化”包括实质上保持本发明多肽的至少一个生物学功能的任意的序列添加、取代或缺失的变体，优选的生物学功能为VPAC2激动剂活性，并且更优选地为选择性的VPAC2激动剂活性，并且最优选地，为在此处显示的胰岛素分泌活性。这些功能性等价物可优选地包括与图1的多肽具有至少大约90％同一性的多肽，并且更优选地至少与图1的多肽具有95％同一性，并且更优选地与图1的多肽具有至少97％的同一性，也包括这些具有大体上相同生物活性的多肽。然而，在此处进一步描述的来自图1多肽在氨基酸序列中具有非实质性变化的显示出功能性等价的任意多肽被包含在本发明的描述中。
本领域公知的两个多肽之间的“相似性”被通过氨基酸序列及其多肽的保守氨基酸取代物与第二多肽的序列之间的比较来测定。这些保守的取代包括如上所述的和Dayhoff所描述的(The Atlas ofProteinSequence and Structure 5，1978)，和Argos所述的(EMBO J.8：779-785，1989)。例如，属于下组之一的氨基酸表示保守的变化：
-丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；
-半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸；
-缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；
-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；
-苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸；和
-天冬氨酸、谷氨酸。
本发明同样涉及编码本发明多肽的多核苷酸以及包含这些多核苷酸的载体、用本发明载体遗传改造的宿主细胞，以及通过重组技术产生本发明多肽的方法。
可用本发明的载体进行遗传改造对宿主细胞(传导、转化或转染)，其中载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是，例如质粒、病毒粒子、噬菌体的形式等。工程改造的宿主细胞可培养在被改变成适于激活启动子或选择转化体的常规培养基中。培养条件，诸如温度、pH值等，为以前选择用于表达的宿主细胞所使用的，并且对于普通的技术人员是显而易见的。本发明的多核苷酸可用于通过重组技术来产生多肽。因此，例如，多核苷酸序列可包含在各种任意的表达载体中，尤其是用于表达多肽的载体或质粒中。这些载体包括染色体的、非染色体的以及合成的DNA序列(例如，SV40的衍生物)；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；获自质粒和噬菌体的DNA组合的载体；病毒DNA诸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒以及伪狂犬病病毒。然而，任意其它的载体或质粒可被使用，只要它们在宿主中是可复制的和有活力的。
可通过各种方法将合适的DNA序列插入到载体中。通常，通过本领域已知的方法将DNA序列插入到合适的限制性核酸内切酶位点中。认为这些以及其它的方法在本领域技术人员的知识范围内。表达载体中的DNA序列可操作地连接于合适的表达调控序列(启动子)来直接合成mRNA。这些启动子的典型实例包括但不限于，LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp、噬菌体λPL启动子，及其它已知调控基因在原核或真核细胞或他们的病毒中表达的启动子。表达载体也可含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体也可包括用于扩增表达的合适的序列。此外，表达载体优选地含有一种基因来提供用于选择转化的宿主细胞的表型特性，诸如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或诸如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。含有在此处描述的合适DNA序列，以及合适启动子或调控序列的载体可被利用来转化合适的宿主来允许宿主表达蛋白质。合适宿主的典型实例包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、链霉菌属；真菌细胞，诸如酵母；昆虫细胞，诸如果蝇S2和Spodoptera Sf9；动物细胞诸如CHO、COS或Bowes黑色素瘤；腺病毒；植物细胞等。本领域的技术人员从此处的教导可以理解如何进行合适宿主的选择。
本发明也包括含有一个或多个如上所述的序列的重组构建体。构建体包括一个载体，诸如质粒或病毒载体，其中以正向或反向插入了本发明的序列。在这些实施方案的一个优选的方面，构建体进一步含有调节序列，包括，例如与该序列可操作地相连的启动子。大量的合适的载体和启动子是本领域的普通技术人员所公知的，并且是市售的。下面的载体以实例的方式来提供。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH 16a、pNH18a、pNH46a、pTRC99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和PRIT5。真核生物的：pWLneo、pSV2cat、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和PSVL。然而，任意其它的载体或载体可被使用，只要它们在宿主中是可复制和有活力的。启动子区域可选自任意的使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择性标记的载体的目的基因。两个合适的载体为pkk232-8和pCM7。特定命名的细菌启动子包括laci、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核细胞的启动子包括CMV的立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆病毒的LTRs和老鼠金属硫蛋白-I。对合适载体和启动子的选择在本领域普通技术人员可理解的范围内。
本发明也涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等的真核细胞，诸如哺乳动物细胞或低等的真核细胞，诸如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞。将构建体导入到宿主细胞中可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔法(Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，1986)来进行。宿主细胞中的构建体可通过常规的方式用于产生由重组序列编码的基因产物。可选择地，本发明的多肽可以通过常规的肽合成仪来合成制备。
成熟的蛋白可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中合适启动子的调控下表达。也可以使用无细胞翻译系统利用获自本发明DNA构建体的RNAs来产生这些蛋白质。用于原核生物和真核生物宿主的合适克隆和表达载体被Sambrook等描述于Molecular Cloning：实验室指南，第二版，(Cold Spring Harbor，N.Y，1989)，其内容通过引用在此作为参考。
由更高等的真核生物编码本发明多肽的DNA转录被通过插入一个增强子到序列中而增强。增强子为DNA的顺式作用元件，通常为从大约10到大约300bp，其作用于启动子来增强其转录。实例包括在复制起点的晚期一侧的SV40增强子(bp 100到270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点晚期一侧的多形瘤增强子以及腺病毒增强子。通常，重组表达载体包括允许宿主细胞转化的复制起点以及选择性标记(例如，大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因或啤酒八叠球菌(S.cerevisiae)TRP1基因)，以及指导下游结构序列转录的获自高度表达基因的启动子。这些启动子可获自编码糖酵解酶诸如3磷酸甘油酸激酶(PGK)、α因子、酸性磷酸酶或热激蛋白等的操纵子。异源的结构序列在合适的阶段被装配了翻译、起始和终止序列，以及优选地，装配了能够指导分泌翻译的蛋白到周质间隙或胞外介质中的前导序列。选择性地，异源序列可编码包括赋予目的特性(例如，表达的重组产物的稳定化或简单化的纯化)的N-末端鉴定肽的融合蛋白。
用于细菌的有益表达载体可以通过插入一个编码目的蛋白的结构DNA序列以及在可操作的阅读阶段插入合适的翻译、起始以及终止信号与功能性的启动子来构建。载体可包括一个或多个表型的选择性标记以及一个复制起点来确保载体的维持以及如果希望，在宿主内提供扩增。用于转化的合适的原核生物宿主包括，例如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的不同的种，尽管其它的也可被使用作为一种选择。用于细菌的有益表达载体可包括获自含有众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件的市售质粒的选择性标记和细菌复制起点。这些商用载体包括例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden和GEM1(Promega，Madison，Wis.，USA)。这些pBR322“主链”部分可与合适的启动子和结构序列相结合而被表达。
在合适的宿主菌株的转化和宿主菌株生长到合适的细胞密度后，将选择的启动子通过适当手段去阻遏(例如，温度变化或化学诱导)并且将细胞培养另外一段时间。典型地通过离心收集细胞，通过物理的或化学的方法裂解，并且保留产生的粗提物用于进一步的纯化。用于蛋白质表达的微生物细胞可通过任意方便的方法来破坏，包括冻融循环、超声波处理、机械破坏或使用细胞裂解试剂。
不同的哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的实例包括猴肾脏成纤维细胞的COS-7细胞系，描述于Gluzman，Cell 23：175，1981)，及其它能够表达相容性载体的细胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包括一个复制起点、一个合适的启动子和增强子，以及任意必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧接非转录序列。获自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、接头和聚腺苷酸化位点可被用来提供需要的非转录遗传元件。
本发明的多肽可被回收并通过目前使用的方法从重组的细胞培养物中纯化，包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素色谱层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素色谱层析。可根据需要在完成成熟蛋白的构型中使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以将高效液相色谱(HPLC)用于最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是化学合成方法的产物，或由原核生物或真核生物宿主(例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)通过重组技术来生产。取决于在重组生产方法中使用的宿主，本发明的多肽可以用哺乳动物或其它真核生物的碳水化合物糖基化或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括最初的甲硫氨酸氨基酸残基。本发明的分离或纯化的多肽或其生物学活性部分，当通过重组技术产生时大体上不含有其它的细胞物质或培养基，或当化学合成时大体上不含有化学前体或其它化合物。优选地，本发明的分离多肽大体上不含有细胞物质并且具有小于大约30％(干重)的非多肽或污染物质。当本发明的多肽或其生物学活性部分被重组产生时，优选地培养基占多肽制品的30％以下的体积。当本发明通过化学合成生产时，优选地该制品含有小于大约30％干重的化合物前体或非发明的化合物。
本发明的多肽可通过下面所述的特定的实施例被很方便地分离。纯化的多肽制品为至少大约70％纯；优选地，该制品为大约85％至大约99％纯。本制品的纯度可通过本领域已知的任意方法进行评估，诸如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱/液相色谱。
可以利用本领域众所周知的化学方法完全地或部分地合成编码本发明多肽的多核苷酸序列(参见，例如，Caruthers等，Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223，1980；Horn等，Nucl Acids Res.Symp.Ser.225-232，1980)。然后可以将编码多肽的多核苷酸克隆到表达载体中来表达多肽。
本领域的技术人员应能理解，产生具有非天然存在的密码子的编码多肽的核苷酸序列也许是有益的。例如，可选择特定的原核生物或真核生物宿主的优选的密码子来增加多肽表达的速率或来产生具有目的特性的RNA转录本，诸如比由天然存在的序列产生的转录本的半衰期更长的半衰期。
由于种种原因，可以利用本领域已知的常规方法对此处公开的核苷酸序列进行改造来改变多编码肽的序列，包括但不限于修饰多肽或mRNA产物的封闭、加工和/或表达的改变。可通过随机断裂来重组DNA和基因片段以及合成寡核苷酸的PCR重装配来改造核苷酸序列。例如，定点诱变可被用来插入新的限制性位点，改变糖基化模式，改变密码子偏爱性，产生接头变体，引入突变等。
也提供在本领域的技术人员可以理解的范围内的相关的化合物，诸如化学模拟物、有机模拟物或肽模拟物。此处使用的术语“模拟物”、“肽模拟物”、“多肽模拟物”、“有机模拟物”和“化学模拟物”包括肽衍生物、肽类似物以及与本发明的肽等价的在三维方向具有原子排列的化合物。可以理解此处所用的术语“等价于”是指包含在所述肽中的具有特定原子或化学部分的取代的化合物，具有键长，键角，并且在产生相同的或充分类似的所述原子和部分排列或方向模拟物化合物的排列，从而具有本发明肽的生物学功能。在本发明的肽模拟物中，化学组分的三维排列在结构和/或功能上等价于肽主链和肽的组分氨基酸侧链的三维排列，使得本发明肽的这些肽模拟物，有机模拟物和化学模拟物具有实质上的生物活性。这些术语被依照本领域的理解来使用，例如，Fauchere(Adv.Drug Res.15：29，1986)；Veber&Freidinger，(TINS p.392，1985)；和Evans等，(J.Med.Chem.30：1229，1987)所详细阐述的，在此引作参考。
可以理解本发明的各种肽存在生物活性的药效基团。在本领域中药效基团被理解为包括生物活性所需的理想化的，三维的结构定义。肽模拟物、有机模拟物和化学模拟物可被设计来适合各自的药效基团与当前的计算机模拟软件(计算机辅助药物设计)。所述模拟物可通过结构-功能分析，基于本发明肽中取代基原子的位置信息来产生。
本发明提供的肽可通过本领域任意已知的化学合成技术，尤其是固相合成技术方便地合成，例如，利用商业-获得的自动肽合成仪。本发明的模拟物可通过通常用于肽合成的固相或液相方法来合成。(参见，例如，Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85：2149-54，1963；Carpino，Acc.Chem.Res.6：191-98，1973；Birr，Aspects of the Merrifield PeptideSynthesis，Springer-Verlag：Heidelberg，1978；The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Vols.1，2，3，和5，(Gross&Meinhofer，eds.)，学院出版社：纽约，1979；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chem.Co.：Rockford，Ill.，1984；Kent，Ann.Rev.Biochem.57：957-89，1988；和Gregg等，Int.J.Peptide Protein Res.55：161-214，1990，其在此全部引入作为参考)。
优选使用固相方法。简要地，N-保护的C-末端氨基酸残基被连接于不溶解的载体诸如二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺树脂、硅藻土/聚酰胺(pepsyn K)、可控的微孔玻璃、纤维素、聚丙烯膜、丙烯酸-涂层的聚乙烯棒，等。去保护、中和和相继的保护性氨基酸衍生物的偶联的循环被用于从C-末端依照氨基酸序列来连接氨基酸。对一些合成肽而言，可以使用利用酸敏感性树脂的FMOC策略。优选的固相载体为二乙烯基苯交联的聚苯乙烯树脂，其是以各种功能化的形式市售的，包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、对乙酰胺基甲基树脂、二苯甲基胺(BHA)树脂、4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂、肟树脂、4-烷氧基苯甲醇树脂(Wang树脂)、4-(2’，4’-二甲氧基苯基氨基甲基(MBHA)树脂-苯氧基甲基树脂、2，4-二甲氧基二苯甲基-胺树脂和4-(2’，4’-二甲氧基苯基-FMOC-氨基-甲基)-苯氧基乙酰胺基正亮氨酰基MBHA树脂(Rink酰胺MBHA树脂)。此外，酸-敏感的树脂也提供了C-末端酸类，如果希望的话。尤其优选的α-氨基酸的保护基是碱不稳定的9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)。
本领域众所周知的是，氨基酸侧链功能团的合适保护基在化学上与BOC(叔-丁氧基羰基)和FMOC基团是相容的。当利用FMOC化学作用时，下列的保护性氨基酸衍生物是优选的：FMOC-Cys(Trit)、FMOC-Ser(But)、FMOC-Asn(Trit)、FMOC-Leu、FMOC-Thr(Trit)、FMOC-Val、FMOC-Gly、FMOC-Lys(Boc)、FMOC-Gln(Trit)、FMOC-Glu(OBut)、FMOC-His(Trit)、FMOC-Tyr(But)、FMOC-Arg(PMC(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基))、FMOC-Arg(BOC)2、FMOC-Pro和FMOC-Trp(BOC)。氨基酸残基可通过利用各种偶联剂和本领域已知的化学作用被偶联，诸如直接与DIC(二异丙基-碳二亚胺)、DCC(二环己基碳二亚胺)、BOP(苯并三唑基-N-氧基三(二甲氨基)膦鎓六氟磷酸)、PyBOP(苯并三唑-1-基-羟基-三-吡咯烷基膦六氟-磷酸酯)、PyBrOP(溴代-三-吡咯烷基膦鎓六氟磷酸酯偶联；通过对称的酸酐偶联；通过活性酯诸如五氯苯基酯偶联；或通过进行的HOBt(1-羟基苯并三唑)活性酯或通过利用FMOC-氨基酸氟化物和氯化物或通过利用FMOC-氨基酸-N-羧基酐偶联。在HOBt或HOAt(7-氮杂羟基苯并三唑)存在下用HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)、1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯)或HATU(2-(1H-7-氮杂-苯并三唑-1-基)、1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯)激活是优选的。
尽管优选在市售的肽合成仪(例如，Applied Biosystems 431A等；Applied Biosystems，Foster City，CA)上自动合成，但固相方法可以人工进行。在一个代表性的合成方案中，第一个(C-末端)氨基酸被加载到氯代三苯甲基树脂上。依照ABI FastMoc方案(AppliedBiosystems)的相继的去保护(用20％哌啶/NMP(N-甲基吡咯烷酮))和偶联循环可用于产生序列。通过用乙酸酐加帽的双倍和三倍偶联，也可被使用。
可以从树脂上裂解合成的模拟肽并通过用含有合适净化剂的TFA(三氟乙酸)去保护。许多这样的裂解试剂，诸如试剂K(0.75g结晶酚、0.25mL乙硫醇、0.5mL苯甲硫醚、0.5mL去离子水、10mL TFA)以及其它可以被使用。通过过滤从树脂中分离肽并通过醚沉淀进行分离。通过传统的方法，诸如凝胶过滤和反相HPLC(高效液相色谱)进行进一步的纯化。本发明合成的模拟物可以是药用盐的形式，特别是碱加成盐包括有机碱和无机碱的盐。依照本领域技术人员公知的方法，通过用合适的碱或无机碱处理肽来制备酸性氨基酸残基的碱加成盐，或可通过冷冻干燥合适的碱而直接获得目的盐。
通常，本领域的技术人员可以理解可通过各种化学技术修饰此处所述的肽来产生与未修饰的肽具有基本上相同活性，并且选择性地具有其它的目的特性的肽。例如，肽的羧酸基团可以是以药学上可接受的阳离子的盐形式来提供。肽内的氨基可以是药学上可接受的酸加成盐的形式，诸如HCl、HBr、醋酸、安息香酸、甲苯磺酸基、马来酸、酒石酸的盐及其它的有机盐，或可被转变为酰胺。通过任一大量的熟知的保护基诸如乙酰胺基团来保护硫醇。本领域的技术人员也将能够确定引入环状结构到本发明肽中使得天然结合构象进一步几乎接近的方法。例如，羧基末端或氨基末端半胱氨酸残基可被添加到肽上，使得当氧化肽时将含有一个二硫键，由此产生一个环肽。其它的肽环化方法包括硫醚和羧基-和氨基-末端酰胺和酯的形成。
特定地，各种不同的方法被有效地用于构建具有与相应的肽化合物相同的或类似的目的生物活性的肽衍生物和类似物，所述的肽衍生物和类似物具有更有利的关于溶解性、稳定性和对水解和蛋白酶解的敏感性的活性。此类衍生物和类似物包括在N-末端氨基、C-末端羧基修饰，和/或改变肽中的一个或多个酰胺键为非-酰胺键的肽。可以理解两种或多种这样的修饰可偶合在一种肽模拟物结构中(例如，在C-末端羧基上进行修饰并且在肽的两个氨基酸之间包含-CH2-氨基甲酸酯键)。
氨基末端修饰包括烷基化、乙酰化、加入一个羧苯甲酰，以及形成一个琥珀酰亚胺基团。特定地，可使N-末端氨基反应来形式一个通式RC(O)NH--的酰胺基，其中R是烷基，优选为低级烷基，并且通过与酰卤、RC(O)Cl或酸酐反应而被加入。典型地，反应可通过在惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中使大约当量克分子的或过量(例如，大约5当量)的卤化酰基与肽接触来进行，优选地惰性稀释剂含有过量(例如，大约10当量)的叔胺，诸如二异丙基乙胺，来清除反应过程中产生的酸。反应条件是常规的(例如，室温30分钟)。使末端氨基烷基化来提供低级烷基的N-取代，然后如上所述与酰卤反应将提供通式RC(O)NR-的N-烷基酰胺基团。可选择地，氨基末端可通过与琥珀酸酐反应而共价连接于琥珀酰亚胺基团上。使用大约当量克分子的量或过量的琥珀酸酐(例如，大约5当量)且末端氨基通过本领域公知的方法在合适的惰性溶剂(例如，二氯甲烷)中被转变为叔胺，描述在Wollenberg等(美国专利No.4,612,132)中，其全部引入作为参考。可以理解琥珀酸基团可用例如，C2-至C6-烷基或--SR取代基取代，其被以常规的方式制备来提供肽N-末端的取代的琥珀酰亚胺。此烷基取代基可通过低级烯烃(C2-至C6-烷基)与马来酐以Wollenberg等如上文所述的方式反应来制备，并且--SR取代基可通过使RSH与马来酐反应来制备，其中R如上述所定义。在另一个有益的实施方案中，氨基末端可被衍生化来形成苄氧基羰基-NH--或取代的苄氧基羰基-NH--基团。此衍生物可通过与大约一当量的或过量的苄氧基羰基氯化物(CBZ-Cl)或取代的CBZ-Cl在合适的惰性稀释剂(例如，二氯甲烷)中反应来制备，惰性稀释剂优选地含有叔胺来清除反应过程中产生的酸。在另一个衍生物中，通过与当量数或过量(例如5当量)的R--S(O)2Cl在合适的惰性稀释剂(二氯甲烷)中反应来将末端胺转变为氨磺酰使得N-末端包括一个氨磺酰基团，其中R是烷基并且优选地为低级烷基。优选地，惰性稀释液含有过量叔胺(例如，10当量)，诸如二异丙基乙胺来清除反应过程中产生的酸。反应条件是常规的(例如，室温30分钟)。通过与一当量或过量(例如5当量)的R--OC(O)Cl或R--OC(O)OC6H4--p--NO2在合适的惰性稀释液(例如，二氯甲烷)中反应来将末端胺转变为氨基甲酸酯，使得在N-末端产生氨基甲酸酯基团，其中R是烷基，优选地为低级烷基。优选地，惰性稀释液含有过量叔胺(例如，10当量)，诸如二异丙基乙胺来清除反应过程中产生的任意酸。反应条件是常规的(例如，室温30分钟)。通过与一当量数或过量(例如5当量)的R--N＝C＝O在合适的惰性稀释液(例如，二氯甲烷)中反应将末端胺转变为脲(即，RNHC(O)NH--)基团，使得在N-末端形成脲基团，其中R如上文所定义的。优选地，惰性稀释液含有过量叔胺(例如，10当量)，诸如二异丙基乙胺。反应条件是常规的(例如，室温30分钟)。
在肽模拟物的制备中，其中C-末端羧基可被酯替代(例如，--C(O)OR，其中R是烷基，优选地为低级烷基)，使用用于制备肽酸的树脂，并且侧链保护的肽可用碱基和合适的醇(例如，甲醇)裂解。以常规方式通过用氟化氢处理除去侧链保护基来获得目的酯。在制备肽模拟物中，其中C-末端羧基被酰胺--C(O)NR3R4替代，二苯甲基胺树脂被用作肽合成的固相载体。当合成完成时，用氟化氢处理来从载体肽释放肽，直接产生游离的肽酰胺(即，C末端为--C(O)NH2)。可选择地，在肽合成过程中，将氯甲基化树脂的使用与氨反应偶合来由载体裂解侧链保护肽而产生游离的肽酰胺，并且与烷基胺或二烃基胺反应来产生侧链保护的烷基酰胺或二烷基酰胺(即，C-末端为--C(O)NRR1，其中R和R1是烷基，优选地为低级烷基)。以常规方式用氟化氢处理除去侧链保护来产生游离的酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。
在另一个可选择的实施方案中，通过分别用N-末端氨基分别置换羧基或酯的--OH或酯--OR)来诱导C-末端羧基或C-末端酯环化而形成环肽。例如，合成和裂解产生肽酸后，通过合适的羧基活化剂诸如二环己基碳二亚胺(DCC)在溶液中，例如，在二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中将游离酸转变为激活的酯。然后用N-末端胺置换激活的酯而形成环肽。环化作用，而不是聚合作用，可通过使用合适的稀释溶液依照本领域公知的方法被增强。
可以理解，本发明提供的肽模拟物在结构上类似于本发明的肽，但具有一或多个选择性地被选自下组的键替代的肽键：--CH2NH--，--CH2S--，--CH2CH2--，--CH＝CH-(在顺式和反式构象异构体中)，--COCH2--，--CH(OH)CH2--，和--CH2SO--，通过本领域已知的和在下面参考文献中进一步描述的方法进行：Spatola，Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，(Weinstein，ed.)，Marcel Dekker：纽约，p.267，1983；Spatola，Peptide BackboneModifications 1：3，1983；Morley，Trends Pharm.Sci.pp.463-468，1980；Hudson等，Int.J.Pept.Prot.Res.14：177-185，1979；Spatola等，Life Sci.38：1243-1249，1986；Hann，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 307-314，1982；Almquist等，J.Med.Chem.23：1392-1398，1980；Jennings-White，等，Tetrahedron Lett.23：2533，1982；Szelke等，EP045665A；Holladay等，Tetrahedron Lett.24：4401-4404，1983；和Hruby，Life Sci.31：189-199，1982；分别在此引入作为参考。此种肽模拟物与多肽实施方案相比具有显著的优点，包括例如，生产更经济，具有更大的化学稳定性或增强的药理学特性(诸如半衰期、吸收、效力、效果等)，降低的抗原性，及其它特性。
本发明肽的模拟类似物也可利用常规的或合理的药物设计的原则来获得(参见，例如，Andrews等，Proc.Alfred Benzon Symp.28：145-165，1990；McPherson，Eur.J.Biochem.189：1-24，1990；Hol等，in Molecular Recognition：Chemical and Biochemical Problems，(Roberts，ed.)：Royal Society of Chemistry，pp.84-93，1989a；Hol，Arzneim-Forsch.39：1016-1018，1989b；Hol，Agnew Chem.Int.Ed.Engl.25：767-778，1986；其内容在此引入作为参考)。
根据常规的药物设计方法，通过随机测定分子而获得目的模拟物分子，其结构具有与“天然的”肽相同的结构特征。由结合分子的特定基团的改变产生的定量的作用可通过测定推断的模拟物与肽活性比较的生物活性来测定。在一个优选的合理药物设计的实施方案中，模拟物被设计成共有肽的最稳定的三位构象的特征。因此，例如，模拟物可被设计成以类似于本发明肽具有的足以引起离子的、疏水性的、或范德华相互作用的方式具有化学基团，如此处公开的。
优选的设计合理模拟物的方法采用能够形成肽三维结构的模型的计算机系统，诸如Hol 1989a；Hol，1989b；和Hol，1986例证的那些。本发明肽的肽-、有机-和化学-模拟物的分子结构可利用市售的计算机辅助设计程序来产生。此程序的实例包括sybyl 6.5
Figure A0381664400301
，hqsarTM，和alchemy 2000TM(Tripos)；galaxyTM和am 2000TM(AM Technologies，Inc.，San Antonio，TX)；catalystTM和ceriusTM(Molecular Simulations，Inc.，San Diego，CA)；cACHE PRODUCTSTM，TSARTM，AMBERTM，以及CHEM-XTM(Oxford Molecular Products，Oxford，CA)和CHEMBUILDER3DTM(Interactive Simulations，Inc.，San Diego，CA)。
利用例如人工-识别的分子模型建立程序以及利用此处公开的肽通过常规的化学合成技术来制备产生的肽-、有机-和化学-模拟物，最优选地设计成能适应高通量筛选，包括组合的化学作用方法。对产生本发明的肽-，有机-和化学-模拟物有用的组合方法包括噬菌体展示阵列、固相合成和组合的化学阵列，可提供，例如通过SIDDCO(Tuscon，Arizona)；Tripos，Inc.；Calbiochem/Novabiochem(San Diego，CA)；Symyx Technologies，Inc.(Santa Clara，CA)；Medichem Research，Inc.(Lemont，IL)；Pharm-Eco Laboratories，Inc.(Bethlehem，PA)；或N.V.Organon(Oss，Netherlands)提供。本发明的肽-，有机-和化学-模拟物的组合化学生产可依照本领域已知的方法来进行，包括但不限于，公开于Terrett，(Combinatorial Chemistry，Oxford UniversityPress，London，1998)；Gallop等，J.Med.Chem.37：1233-51，1994；Gordon等，J.Med.Chem.37：1385-1401，1994；Look等，Bioorg.Med.Chem.Lett.6：707-12，1996；Ruhland等，J.Amer.Chem.Soc.118：253-4，1996；Gordon等，Acc.Chem.Res.29：144-54，1996；Thompson&Ellman，Chem.Rev.96：555-600，1996；Fruchtel&Jung，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：17-42，1996；Pavia，“The Chemical Generation ofMolecular Diversity”，Network Scienee Center，www.netsci.org，1995；Adnan等，“Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discoveryand SAR Optimization，”Id.，1995；Davies和Briant，“CombinatorialChemistry Library Design using Pharmacophore Diversity，”Id.，1995；Pavia，“Chemically Generated Screening Libraries：Present andFuture，”Id.，1996；以及专利U.S.Nos.5,880,972；5,463,564；5,331573；和5,573,905中。
通过初步的高效液相色谱法大体上纯化新合成的多肽(参见，例如，Creighton，Proteins：Structures And Molecular Principles，WHFreeman和Co.，纽约，N.Y.，1983)。本发明的合成多肽的组成可通过氨基酸分析或通过，例如，Edman降解法(Creighton，如上文所述)测序来证实。另外，可在直接合成中和/或利用化学方法与来自其它蛋白的序列结合来改变多肽氨基酸序列的任意部分而产生变体多肽或融合多肽。
也可根据本发明通过此多肽的体内表达来使用本发明的多肽，其通常被称为“基因治疗”。因此，例如，可用一个编码先体外后体内的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)来改造细胞，改造的细胞被提供给患者来用多肽进行治疗。这样的方法是本领域公知的。例如，细胞可被通过本领域已知的方法利用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒进行改造。
利用基因治疗的胰岛素促泌剂的局部输送可将治疗剂提供到目的区域(例如，胰腺)。例如胰腺-特异性启动子被用来产生β-细胞胰腺肿瘤小鼠模型(Hanahan，Nature 315(6015)：115-22，1985)。
体外和体内两种基因治疗方法被关注。一些将潜在的治疗基因转运到细胞群体的方法是已知的(参见，例如，Mulligan，Science260：926-31，1993)。这些方法包括，例如：
1)直接的基因传递(参见，例如，Wolff等，Science 247：1465-68，1990)；
2)脂质体-介导的DNA传递(参见，例如，Caplen等，Nature Med.3：39-46，1995；Crystal，Nature Med.1：15-17，1995；Gao和Huang，Biochem.Biophys.Res.Comm.179：280-851991)；
3)逆转录酶病毒-介导的DNA传递(参见，例如Kay等，Science262：117-19，1993；Anderson，Science 256：808-13，1992)。
4)DNA病毒-介导的DNA传递。此类DNA病毒包括，例如，腺病毒(优选地基于载体的Ad-2或Ad-5)、疱疹病毒(优选地基于单纯疱疹病毒的载体)和细小病毒(优选地基于“缺陷的”或非-自主的细小病毒的载体，更优选地为基于与腺病毒相关的病毒的载体，最优选地为基于AAV-2的载体)(参见，例如，Ali等，Gene Therapy 1：367-84，1994；美国专利No.4,797,368；美国专利No.5,139,941；在此引入作为参考。
传递目的基因的特定载体系统的选择取决于各种因素。一个重要的因素是靶细胞群体的特性。尽管逆转录病毒载体已被广泛地研究并使用在大量的基因治疗应用中，但是该载体通常不适合于侵染非分裂的细胞。此外，逆转录酶病毒具有致癌的可能。然而，有关豆病毒载体方面的最新进展可绕过这样的一些局限性(参见，例如，Naldini等，Science 272：263-67，1996)。
可从中获得逆转录病毒质粒载体的逆转录酶病毒包括但不限于，莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录酶病毒诸如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病毒、人类免疫缺陷性病毒、腺病毒、骨髓及外骨髓增殖的肉瘤病毒、以及乳腺瘤病毒。
腺病毒具有下列优点，它们具有广泛的宿主范围，可侵染静止的或在末端分化的细胞，诸如神经元或肝细胞并且基本上呈现非致瘤性(参见，例如，Ali等，1994)。腺病毒看来似乎没有被整合到宿主基因组中。因为它们存在于染色体外，插入突变的危险被大大地降低了。Ali等，1994。
与腺病毒相关的病毒具有类似的优点，如基于腺病毒的载体。然而，AAVs显示出位点特异性整合在人的染色体19上(参见，例如，Ali等，1994)。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的多肽胰岛素促泌剂的DNA被用于疾病诸如糖尿病和与糖尿病-相关的疾病的基因治疗中。
依照这些实施方案，用编码本发明的多肽胰岛素促泌剂或突变蛋白的DNA进行的基因治疗在诊断的同时或诊断后立即被提供给有需求的患者。
技术人员应能理解任意合适的含有多肽胰岛素促泌剂、DNA或DNA片段、衍生物、或多肽胰岛素促泌剂的变体的基因治疗载体可根据此实施方案来使用。构建此载体的技术是本领域公知的(参见，例如，Anderson，Nature 392：25-30，1998；Verma等，Nature 389：239-242，1998)。可利用已知的技术完成将含有多肽胰岛素促泌剂DNA的载体导入到目的位点。
载体可包括一或多个启动子。合适的启动子包括但不限于，逆转录病毒LTR，SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV)启动子(Miller等，Biotechniques 7(9)：980-990，1989)，或任意其它的启动子(例如，细胞启动子，诸如真核生物的细胞启动子包括但不限于组蛋白、pol III和(-肌动蛋白启动子)。其它可被使用的病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。合适启动子的选择对于本领域的技术人员结合此处的教导而言是显而易见的。
编码本发明多肽的核酸序列处于合适的启动子的调控下。合适的启动子包括但不限于，启动子诸如腺病毒主要晚期启动子；或异源的启动子诸如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子诸如MMT(金属硫蛋白)启动子；热激启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子诸如单纯性疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括在上文描述的修饰的逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。启动子也可以是天然的调控编码多肽的基因的启动子。
逆转录病毒质粒载体可被用于传导包装细胞系而形成生产细胞系。可被转染的包装细胞的实例包括但不限于，PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-、ψ-CRE、ψ-CRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN细胞系如描述在Miller(Hum.Gene Ther.1：5-14，1990)，其整体引入在此作为参考。通过本领域已知的任意方法，载体可传导包装细胞。这样的方法包括但不限于，电穿孔法、脂质体的使用和CaPO4沉淀。可替代地，逆转录病毒质粒载体可被装入到脂质体中或与脂类偶合，然后给药于宿主。生产细胞系产生传染性的包括编码多肽的核酸序列的逆转录病毒载体粒子。此逆转录病毒载体粒子然后可用于在体外或体内传导真核细胞。传导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可被传导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎的恶性肿瘤细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、内皮细胞和支气管的上皮细胞。
与基因治疗不同的方法为“转有核细胞治疗”，其中在再导入到患者之后在体内胞外处理患者的细胞来诱导静止的染色体基因而产生目的蛋白。转有核细胞治疗假定个体具有激活所必需的正常的基因互补。转有核细胞治疗涉及引入一个启动子或其它能够激活新生基因的外源调节序列，到患者细胞的来自体内的染色体DNA中，培养物和筛选产生活性蛋白的细胞，然后再将激活的细胞导入到患者中来意欲使得它们变得完全地接受。“基因激活的”细胞然后持续特定的一段时间产生目的蛋白，也许持续至患者的生命之久(参见，例如，美国专利Nos.5,641,670和5,733,761且通过引入在此作为参考)。
本发明也包括那些选择性地结合本发明多肽的抗体和抗体片段。本领域已知的任意类型的抗体可利用本领域众所周知的方法来产生。例如，抗体可被产生来特异性地结合到本发明多肽的抗原表位上。此处使用的“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子及其片段，诸如Fab、F(ab’)2和Fv，其能够结合本发明多肽的抗原表位。典型地，抗原表位的形成要求至少6、8、10或12个连续的氨基酸。然而，涉及非-连续氨基酸的抗原表位可以需要更多的氨基酸，例如至少15、25或50个氨基酸。
特异性地结合于本发明多肽的抗原表位的抗体可被应用在治疗以及在免疫化学试验中，诸如Western印迹、酶联免疫吸附，放射免疫测定，免疫组织化学测定，免疫沉淀反应，或其它的本领域已知的免疫化学试验中。不同的免疫测定可用于鉴定具有目的特异性的抗体。许多的竞争性结合或免疫放射测定的方案是本领域公知的。这样的免疫测定典型地涉及免疫原和特异性地结合于该免疫原的抗体之间形成复合物的测定。
典型地，当应用免疫化学测定时，特异性地结合于本发明多肽的抗体形成了比其它蛋白质产生的检测信号至少高5-、10-或20倍的检测信号。优选地，在免疫化学测定中，特异性地结合于本发明多肽的抗体没有检测到其它的蛋白质并且可从溶液中免疫沉淀本发明的多肽。
本发明的多肽可被用来免疫哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴或人，来产生多克隆的抗体。如果希望，本发明的多肽可共轭结合于载体蛋白，诸如牛血清清蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔血兰素上。取决于宿主种类，不同的助剂可用于增强免疫学的应答。这样的助剂包括但不限于，Freund’s佐剂、矿物胶(例如，氢氧化铝)和表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、复合多元醇、多聚阴离子、肽油乳化液、钥孔血兰素和二硝基苯酚)。在应用的助剂中，BCG(卡介苗)和小棒状杆菌是特别有用的。
可利用产生抗体分子的任意技术，通过在培养物中连续传代细胞系来制备特异性地结合于本发明多肽的单克隆抗体。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术(Kohler等，Nature 256：495-97，1985；Kozbor等，J.Immunol.Methods81：3142，1985；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.80：2026-30，1983；Cole等，Mol.Cell Biol.62：109-20，1984)。
此外，对此技术进行了改进来产生“嵌合的抗体”，可拼接小鼠抗体基因与人抗体基因来获得具有合适的抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-55，1984；Neuberger等，Nature 312：604-08，1984；Takeda等，Nature 314：452-54，1985)。单克隆及其它抗体也可被“人源化”来防止当患者被治疗时设置免疫应答抵抗抗体。这样的抗体可充分地类似于直接在治疗中使用的人抗体的序列或可能需要改变一些关键残基。啮齿动物抗体和人序列之间的序列差异可通过个体残基的位点定向诱变或通过对全部互补测定区域进行评分来置换那些不同于人序列的残基而被最小化。可选择地，利用重组方法来产生人源化抗体(参见，例如，GB2188638B)。特异性地结合于本发明多肽的抗体可含有部分或完全人源化的抗原结合部位，如美国专利No.5,565,332所公开的。
可选择地，利用本领域已知的方法改进单链抗体产生的技术来产生特异性结合于本发明多肽的单链抗体。具有相关特异性的抗体，除了具有显著独特型成的抗体外，可通过链重整由随机组合的免疫球蛋白文库来产生(Burton，Proc.Natl.Acad.Sci.88：11120-23，1991)。
也可利用DNA扩增方法对单-链抗体进行构建，诸如PCR，利用杂交瘤cDNA作为模板(Thirion等，Eur.J.Cancer Prev.5：507-11，1996)。单链抗体可以是单-或双特异性的，并且可是二价的或四价的。四价的双特异性的单链抗体被教导在，例如，Coloma&Morrison(Nat.Biotechnol.15：159-63，1997)。二价的双特异性的单链抗体的构建被教导在Mallender&Voss(J.Biol.Chem.269：199-206，1994)中。
如下所述，利用手工的或自动的核苷酸合成来构建编码单链抗体的核苷酸序列，通过标准的重组DNA方法克隆到表达构建体中，并导入到细胞中来表达编码序列。可选择地，可以直接利用例如丝状噬菌体技术来产生单-链抗体(Verhaar等，Int.J.Cancer 61：497-501，1995；Nicholls等，J.Immunol.Meth.165：81-91，1993)。
通过在淋巴细胞群体中活体内诱导产生，或通过筛选免疫球蛋白文库或在文献中公开的高度特异性结合试剂的组来产生特异性结合于本发明多肽的抗体(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.86：38333-37，1989；Winter等，Nature 349：293-99，1991)。
其它类型的抗体可被构建和治疗性地使用在本发明的方法中。例如，嵌合抗体的构建如WO 93/03151所公开的。获自免疫球蛋白并且其是多价的和多特异性的结合蛋白，诸如“二价的二聚抗体”也可被制备(参见，例如WO 94/13804)。
具有结合于本发明多肽的能力的人抗体也可由MorphoSysHuCAL
Figure A0381664400371
文库鉴定如下。本发明的多肽可被涂敷在微量滴定板上并与MorphoSys HuCAL
Figure A0381664400372
Fab噬菌体文库一起温育。那些不结合于本发明多肽的噬菌体-连接的Fabs可从平板上被冲洗掉，仅留下紧紧结合于本发明的多肽上的噬菌体。结合的噬菌体可被洗脱，例如通过改变pH值或通过与大肠杆菌一起洗脱并通过大肠杆菌宿主的转染被扩增。这些处理过程可重复一次或两次来富集紧紧地结合于本发明多肽上的抗体群体。来自富集池的Fabs然后被表达，纯化，并通过ELISA测定进行筛选。
可通过本领域众所周知的方法来纯化本发明的抗体。例如，可通过让抗体流经本发明的多肽将被结合的柱而进行亲合性纯化。可因此利用具有高盐浓度的缓冲液从柱上洗脱结合的抗体。
本发明的多肽由于具有刺激郎格罕氏岛细胞体外分泌胰岛素的能力，并引起体内血糖的下降，可被用于治疗糖尿病，包括I型糖尿病和II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)两种。此治疗也可延迟糖尿病和糖尿病并发症的发病。多肽可被用来防止具有削弱的葡萄糖耐量的受试者发展为II型糖尿病。可在本发明方法中利用本发明的化合物治疗或预防的其它疾病和病症包括：青年人成熟期发病型糖尿病(MODY)(Herman等，Diabetes 43：40，1994)；潜在的成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA)(Zimmet等，Diabetes Med.11：299，1994)；削弱的葡萄糖耐量(IGT)(Expert Committee on Classification ofDiabetes Mellitus，Diabetes Care 22(增刊1)：S5，1999；削弱的空腹葡萄糖(IFG)(Charles等，Diabetes 40：796，1991)；妊娠期糖尿病(Metzger，Diabetes，40：197，1991)；以及新陈代谢综合症X。
本发明的多肽也可用于肥胖症、动脉粥样硬化疾病、高脂质血、高胆固醇血症、低HDL水平、高血压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、冠心病、冠状动脉病和高血压)、脑血管疾病和外围血管疾病的治疗中；以及用于狼疮、多囊卵巢综合症、致癌作用和细胞增生、哮喘、男性生殖问题、溃疡、睡眠障碍、脂类和碳水化合物代谢的紊乱、生理节奏的机能障碍、生长障碍、能量动态平衡的紊乱、包括自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼疮)的免疫疾病，以及急性和慢性炎症性疾病、脓毒性休克的治疗中也是有效的。
本发明的化合物也可用于治疗与生理失调相关的，例如，生产脂类累积细胞的细胞分化、胰岛素敏感性和血糖水平的调节，其涉及，例如异常的胰腺β-细胞功能、胰岛素分泌肿瘤和/或由于胰岛素的自身抗体、胰岛素受体的自身抗体或自身抗体，也即刺激胰腺β-细胞的而产生的自身免疫低血糖，导致动脉粥样硬化噬斑形成的巨噬细胞分化、炎症性应答、致癌作用、细胞增生、脂肪细胞基因表达、脂肪细胞分化、胰腺β-细胞量的减少、胰岛素分泌、对胰岛素的组织敏感性、脂肪肉瘤细胞发育、多囊卵巢疾病、慢性排卵停止、雄激素过多症、黄体酮产生、类固醇生成、细胞中的氧化还原电势和氧化压力、氧化氮合酶(NOS)产生、增加的γ-谷氨酰基转肽酶、过氧化氢酶、血浆甘油三酯、HDL以及LDL胆固醇水平等。
本发明的化合物也可用于本发明的方法中来治疗糖尿病的次级起因(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus，DiabetesCare 22(增刊1)：S5，1999)。这样的次级起因包括糖皮质激素过量、生长激素过量、肾上腺髓质瘤和药物诱导的糖尿病。可诱导糖尿病的药物包括但不限于扑鼠脲、烟酸、糖皮质激素、二苯乙内酰脲、甲状腺激素、β-肾上腺素试剂、α-干扰素和用于治疗HIV传染病的药物。
此外，本发明的多肽可用于治疗哮喘(Bolin等，Biopolymer37：57-66，1995；美国专利No.5,677,419；表明多肽R3P0在松驰的豚鼠气管平滑肌中是活化的)；血压过低诱导(VIP诱导血压过低，心动过速，以及哮喘患者的面部潮红(Morice等，Peptides 7：279-280，1986；Morice等，Lancet 2：1225-1227，1983)；男性生殖问题(Siow等，Arch.Androl.43(1)：67-71，1999)；作为抗细胞程序死亡/神经保护药物(Brenneman等，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：207-12，1998)；缺血期间的心脏保护(Kalfin等，J.Pharmacol.Exp.Ther.1268(2)：952-8，1994；Das等，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：297-308，1998，控制昼夜节律钟及其关联的紊乱(Hamar等，Cell 109：497-508，2002；Shen等，Proc.Natl.Acad.Sci.97：11575-80，2000)，最后作为抗溃疡药物(Tuncel等，Ann.N.Y.Acad.Sci.865：309-22，1998)。
本发明的多肽可单独使用或与其它本领域技术人员公知的治疗和/或化合物组合应用于糖尿病和相关失调的治疗中。可选择地，此处描述的方法和化合物可被部分或完全地应用于组合治疗中。
本发明的多肽也可与其它已知的治疗组合共同给药用于糖尿病的治疗，包括PPAR激动剂、磺酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素和抗肥胖症药物。此治疗可以是在本发明的多肽给药之前、同时或之后给药。胰岛素包括长的和短的两种作用形式和胰岛素的制剂。PPAR激动剂可包括任意PPAR亚基或其组合的激动剂。例如，PPAR激动剂可包括PPAR-α、PPAR-γ、PPAR-δ或两个或三个PPAR亚基的组合。PPAR激动剂包括，例如，rosiglitazone和pioglitazone。磺酰脲类药物包括，例如，优降糖、格列美脲、氯磺丙脲和格列甲嗪。当与本发明的多肽一起给药时对治疗糖尿病有用的α-葡糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖。对治疗糖尿病有用的胰岛素敏化剂包括噻唑烷二酮和非-噻唑烷二酮。当与本发明多肽一起给药对糖尿病治疗有用的降低肝葡萄糖排出量化合物包括二甲双胍，诸如Glucophage和Glucophage XR。当与本发明多肽一起对治疗糖尿病有用的胰岛素促泌剂包括磺酰脲和非-磺酰脲药物：GLP-1、GIP、分泌素、nateglinide、meglitinide、repaglinide、优降糖、glimepiride、氯磺丙脲、格列甲嗪。GLP-1包括具有比天然的GLP-1更长半衰期的GLP-1的衍生物，诸如，例如，脂肪酸衍生化的GLP-1和exendin。在本发明的一个实施方案中，本发明的多肽与胰岛素促泌剂结合使用来增强胰腺β-细胞对胰岛素促分泌素的敏感性。
本发明的多肽也可与抗肥胖症药物结合用于本发明的方法中。抗肥胖症药物包括β-3激动剂、CB-1拮抗剂、食欲抑制剂，诸如，例如，sibutramine(Meridia)，和脂肪酶抑制剂，诸如，例如，orlistat(Xenical)。
本发明的多肽可与通常用于治疗糖尿病病人的脂类紊乱的药物结合用于本发明的方法中。此类药物包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂、烟酸、胆汁酸螯合剂和纤维酸衍生物。本发明的多肽也可与抗高血压的药物结合使用，诸如，例如，β-阻断剂和ACE抑制剂。
此种共-治疗可以以两种或多种药物(例如，本发明的化合物与胰岛素敏化剂和抗肥胖症药物结合)的任意组合给药。此种共-治疗可以以如上所述药物组合物的形式给药。
此处使用的不同的术语定义如下。
当介绍本发明或其优选的实施方案的元件时，冠词“一个”“一种”“该”和“所述的”是指有一个或多个元素。术语“包含”、“包括”和“具有”是指包括在内的，除了所列元素之外可能还有其它元素。
此处使用的术语“受试者”包括哺乳动物(例如，人和动物)。
术语“治疗”包括提供以直接或间接地改善受试者病症为目的医疗救护，或减缓受试者的病症或紊乱的任意方法、作用、应用、治疗等，其中受试者包括人。
术语“组合治疗”或“共-治疗”是指给药两种或多种治疗药物来治疗糖尿病病症和/或紊乱。此种给药包括两种或多种治疗药物以大体上同时的方式共同-给药，诸如在具有固定比率的活性成分的单个胶囊中或在多个分离的各个抑制剂药物的胶囊中。此外，这样的给药包括以连续的方式使用每种类型的治疗药物。
术语“治疗有效的”是指每种药物的给药量，它将达到改善糖尿病病症或紊乱严重程度的目标，而避免或最小化与所用治疗方法相关联的不良副作用。
术语“药学上可接受的”是指受试项目适于用在药物产品中。
基于公知的测定方法来测定哺乳动物中病症的治疗效果，并且比较这些结果与用于治疗这些病症的已知药物的结果，本发明多肽的有效剂量可容易地被测定来用于每一目的适应症的治疗。在这些病症之一的治疗中给药活性成分(例如，多肽)的量可根据特定化合物的因素和所使用的剂量单位、给药的方式、疗程、被治疗患者的年龄且性别、以及治疗的病症的特性和程度而在很大程度上进行变化。
给药活性成分的总量通常可在大约0.0001mg/kg到大约200mg/kg的范围，并且优选地为0.01mg/kg到大约200mg/kg体重每天。单位剂量可包含从大约0.05mg到大约1500毫克的活性成分，可以每天给药一或多次。通过注射，包括静脉注射、肌内注射、皮下注射和非肠道注射以及使用输注技术给药的每日剂量可以是从大约0.01到大约200mg/kg。每天直肠给药方案可以是从0.01到200mg/kg总体重。透过皮肤起作用的浓度可被要求保持日剂量从0.01到200mg/kg。
当然，每一患者的特异性的最初和连续的给药方案依据诊断医生确定的病症的特性和严重程度、所用特异性多肽的活性、患者的年龄、患者的饮食、给药的时间、给药途径、药物的排泄速度、药物组合等进行变化。本领域的技术人员可利用常规处理测试来确定所要的本发明多肽的治疗方式和剂量。
本发明多肽可以在适当配制的药物组合物中通过给药于需要的患者而实现所希望的药理学作用。为了实现本发明的目的，患者为需要进行特定的病症或疾病治疗的哺乳动物，包括人。因此，本发明包括包含药学上可接受的载体和治疗有效量的多肽的药物组合物。药学上可接受的载体是在活性成分的有效活性的浓度对患者相对无毒和无害的，使得载体的任何副作用不损害活性成分的有益作用的任意载体。多肽的治疗有效量是对特定被治疗的病症产生效果或影响的量。此处描述的可与药学上可接受的载体一起给药的多肽可被利用任何有效的常规剂量单位形式给药，包括，例如，立即释放和定时释放制剂、口服、非肠道、局部地等等。
为了用于口服，多肽可被配制到固体或液体制剂中诸如，例如，胶囊、药丸、片剂、锭剂、糖锭、熔化物、粉末、溶液、悬浮液或乳浊液中，并且可按照本领域公知的生产药物组合物的方法进行制备。固体单位剂型可以是胶囊，其可以是普通的硬壳的或软壳的凝胶类型包括，例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填料诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。
在另一个实施方案中，本发明的多肽可以是具有常规片剂基质诸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉，与粘合剂诸如金合欢胶、玉米淀粉或凝胶结合的片剂；在给药后用于辅助片剂破裂和溶解的崩解剂诸如马铃薯淀粉、藻酸、玉米淀粉和瓜耳豆胶；意欲提高片剂颗粒流动性和防止片剂物质粘着到片剂塑模和压力机表面的润滑剂，例如，滑石粉、硬脂酸或镁、钙或硬脂酸锌；色素；着色剂；和意欲增强片剂美感特性使得它们更为患者接受的增味剂。用于口服液体剂型的合适的赋形剂，包括稀释剂诸如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，添加或者不添加药学上可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。不同的其它物质可以作为涂层或修饰剂量单元的外观而存在。例如片剂、丸剂或胶囊可以涂有虫胶、糖或两者。
可分散性粉剂和颗粒适用于水悬浮液的制备。它们在混合物中提供了活性成分与扩展剂或润湿剂、悬浮剂和一或多种防腐剂。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂已在上文中举例说明。也可存在其它的赋形剂，例如，那些如上所述的甜味剂、调味品和着色剂。
本发明的药物组合物也可为水包油乳化剂的形式。油相可以是有机油，诸如液体石蜡或有机油的混合物。合适的乳化剂可以是(1)天然存在的树胶，诸如阿拉伯树胶和黄蓍树胶，(2)天然存在的磷脂，诸如大豆和卵磷脂，(3)获自脂肪酸和己糖醇酸酐的酯或偏酯，例如，单油酸山梨醇酐酯，和(4)所述偏酯与环氧乙烷，例如，聚环氧乙烷单油酸山梨醇酐酯的缩合物。乳浊液也包括甜味剂和调味剂。
含油的悬浮液可以通过在植物油诸如，例如诸如，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中或在矿物油，诸如液体石蜡中悬浮活性成分来配制。含油的悬浮液可包括增稠剂诸如，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。悬浮液也可包括一或多种防腐剂，例如，乙基或正-丙基对羟基苯甲酸盐；一或多种着色剂；一或多种调味剂；和一或多种甜味剂诸如蔗糖或糖精。
糖浆和酏剂可以与甜味剂诸如，例如丙三醇、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖一起配制。这样的制剂也可以包括缓和剂、防腐剂、调味剂和着色剂。
本发明的多肽也可以以非肠道方式给药，也即皮下地、静脉内、肌内注射或腹腔内，作为在生理可接受的稀释液中化合物的可注射制剂带有一种药物载体，其可以是无菌液体或液体诸如水、盐、含水葡萄糖和相关糖液的混合物；醇诸如乙醇、异丙醇或十六醇；二醇诸如丙二醇或聚乙二醇；甘醇缩酮，诸如2，2-二甲基-1，1-二氧戊环-4-甲醇，醚诸如聚(乙二醇)400；油；脂肪酸；脂肪酸酯或甘油酯；或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或者没有添加药学上可接受的表面活性剂诸如皂或去垢剂、悬浮剂，诸如果胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素或乳化剂及其它的药物助剂。
可用于本发明的非肠道制剂的油类的实例为石油，动物的、植物或合成来源的，例如，花生油、豆油、芝麻油、棉子油、玉米油、橄榄油、矿脂矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。合适的脂肪酸酯为，例如油酸乙酯和十四碳烷酸异丙酯。合适的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，合适的洗涤剂包括阳离子的洗涤剂，例如，二甲基二烃基铵基卤化物、烷基吡啶卤化物和烷基胺乙酸盐；阴离子的洗涤剂，例如，烷基、芳基和烯属磺酸酯，烷基、烯烃、醚和单酸甘油酯硫酸盐和己酯；非离子的洗涤剂，例如，脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺，和聚环氧乙烷聚丙烯共聚物；以及两性的洗涤剂，例如，烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基咪唑啉季胺盐，以及混合物。
本发明的非肠道组合物典型地可包括在溶液中的按重量计从大约0.5％到大约25％的活性成分。防腐剂和缓冲液也可被方便地使用。为了减少或消除对注射位点的刺激，此组合物可包括一种具有从大约12到大约17的亲水亲油平衡(HLB)非离子型表面活性剂。此制剂中的表面活性剂的量按重量计为从大约5％到大约15％的范围。表面活性剂可以是具有上述HLB的单一组分或可以是两种或多种具有目的HLB的组分的混合物。
在非肠道制剂中使用的表面活性剂的实例为聚乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如，单油酸山梨醇酐酯和环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加合物，通过环氧丙烷与丙二醇缩合来形成。
药物组合物可以是可注射的无菌的含水悬浮液的形式。此悬浮液可以按照已知的方法配制，利用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂诸如，例如，羧甲基纤维素钠、甲纤维素、羟丙基甲基-纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，其可以是天然存在的磷脂，诸如卵磷脂、烯化氧与脂肪酸的缩合物，例如，聚环氧乙烷硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂族醇的缩合物，例如，十七亚乙基氧基十六碳烷醇、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合物，诸如聚环氧乙烷山梨糖醇一油酸，或环氧乙烷与获自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合物，例如聚环氧乙烷单油酸山梨醇酐酯。
无菌的注射制剂也可以是一种在无毒的非肠道可接受的稀释液或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。可以使用的稀释剂和溶剂为，例如，水、Ringer’s溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为了实现这些目的，任何温和的、不挥发油可以被使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可以使用在注射的制剂中。
本发明的组合物也可以用药物直肠给药的栓剂形式给药。这些组合物可以通过混合药物(例如，多肽)与合适的非刺激赋形剂来制备，其中的赋形剂在一般温度下是固体，但在直肠温度时是液体，并且因此在直肠中融化来释放药物。此类物质是，例如，可可脂和聚乙二醇。
另一种用于本发明方法的制剂利用透过皮肤输送装置(“贴”)，此种透过皮肤的贴可被用来以可控制的量提供持续的或不连续的本发明化合物的浸入。用于输送药物的透过皮肤的贴的构建和使用是本领域公知的(参见，例如，美国专利No.5,023,252，引入在此作为参考)。此贴可以被构建来持续地、脉动地或在需要时输送药物。
通过机械输送装置将药物组合物输入给患者是希望的或必需的。输送药物的机械输送装置的构建和使用是本领域公知的。例如，直接给药药物到脑的直接技术通常涉及放置施药导管到患者的脑室系统来绕过血脑屏障。这样的植入输送系统，用于输送药物到身体的特异性解剖学区域，被描述在美国专利No.5,011,472中，引入在此作为参考。
根据需要或目的，本发明的组合物可包括其它常规的药学上可接受的配料成分，通常指载体或稀释剂。本发明的任意组合物可通过添加抗氧化剂，诸如抗坏血酸或通过其它合适的防腐剂来防腐。以合适的剂型制备此类组合物的常规方法可以被使用。
通常使用的可依据给药途径配制组合物药物的组分包括：酸化剂，例如但不限于，乙酸、柠檬酸、延胡索酸、盐酸、硝酸；和碱化剂诸如，但不限于，氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三羟乙基胺、三乙醇胺。
其它的药物组分包括，例如但不限于，吸附剂(例如，粉末状的纤维素和活性炭)；气雾剂推进剂(例如，二氧化碳、CCl2F2、F2ClC-CClF2和CClF3)；空气置换剂(例如，氮气和氩气)；抗真菌的防腐剂(例如，苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠)；抗菌的防腐剂(例如，杀藻铵、氯化苄乙氧铵、苯甲醇、氯化十六烷吡啶、氯代丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、抗坏血酰棕榈酸酯、丁羟基大茴香醚、2，6-二叔丁基对甲苯酚、次磷酸、单2-硫基乙醇、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠)；粘结材料(例如，嵌段聚合物、天然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚氨酯、硅树脂和苯乙烯-丁二烯共聚物)；缓冲剂(例如偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、无水柠檬酸钠和柠檬酸钠二水合物)；载体(例如，阿拉伯胶糖浆、芳香族糖浆、芳香酏剂、樱桃糖浆、可可粉糖浆、橙皮糖浆、糖浆、玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、抑菌的氯化钠注射液和抑菌的注射用水)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸二钠盐和乙二胺四乙酸)；着色剂(例如，FD&C RedNo.3，FD&C Red No.20，FD&C Yellow No.6，FD&C Blue No.2，D&C Green No.5，D&C Orange No.5，D&C Red No.8，焦糖和氧化铁红)；澄清剂(例如，膨润土)；乳化剂(但不限于，阿拉伯胶、cetomacrogol、十六烷醇、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单油酸山梨醇酐酯、聚乙烯50硬脂酸酯)；包被剂(例如，凝胶和邻苯二甲酸醋酸纤维素)；香料(例如，茴香油、肉桂油、可可粉、薄荷醇、橙油、薄荷油和香草醛)；润湿剂(例如，甘油、丙二醇和山梨糖醇)；研磨剂(例如，矿物油和甘油)；油类(例如，花生油、矿物油、橄榄油、花生油、芝麻油和植物油)；软膏基质(例如，羊毛脂、亲水性软膏、聚乙二醇油膏、矿脂、亲水性的矿脂、白色油膏、黄色油膏和玫瑰水油膏)；穿透增强剂(透过皮肤的输送)(例如，一羟基或多羟基醇、饱和或不饱和的脂肪醇、饱和或不饱和的脂肪酸酯、饱和或不饱和的二羧基的酸类、基本的油类、磷脂酰基衍生物、脑磷脂、萜烯、酰胺、醚、酮和脲)；增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯和甘油)；溶剂(例如，醇、玉米油、棉子油、甘油、异丙醇、矿物油、油酸、花生油、净化水、注射用水、无菌注射水和用于冲洗的无菌水)；增稠剂(例如，十六烷醇、十六烷基酯蜡、微晶石蜡、石蜡、十八烷醇、白蜡；栓剂基质(例如，可可脂和聚乙二醇(混合物))；表面活性剂(例如，杀藻铵，nonoxynol 10、oxtoxynol 9、聚山梨酸酯80、十二烷基硫酸钠和聚山梨糖甘油一棕榈酸酯)；悬浮剂(例如，琼脂、膨润土、carbomers、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、高岭土、甲基纤维素、黄蓍胶和veegum)；甜味剂(例如，天冬甜素、葡萄糖、甘油、甘露糖醇、丙二醇、糖精钠、山梨糖醇和蔗糖)；片剂防粘剂(例如，硬脂酸镁和滑石粉)；片剂粘合剂(例如，阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素钠、可压缩的糖、乙基纤维素、凝胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮和预胶凝的淀粉)；片剂和胶囊稀释剂(例如，二元的磷酸钙、高岭土、乳糖、甘露糖醇、微晶纤维素、粉末状的纤维素，碳酸钙沉淀、碳酸钠、磷酸钠、山梨糖醇和淀粉)；片剂包被剂(例如，液体状葡萄糖、羟乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、苯二甲酸醋酸纤维素和虫胶)；片剂定向受压赋形剂(例如，二元的磷酸钙)；片剂崩解剂(例如，海藻酸、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、polacrillin potassium、海藻酸钠、淀粉乙醇酸钠和淀粉)；片剂助流剂(例如，胶态氧化硅、玉米淀粉和滑石粉)；片剂润滑剂(例如，硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂酸锌)；片剂/胶囊不透明剂(例如，二氧化钛)；片剂抛光剂(例如，carnuba wax和白蜡)；增稠剂(例如，蜂蜡、十六烷醇和石蜡)；渗透剂(例如，葡萄糖和氯化钠)；增粘剂(例如，海藻酸、膨润土、carbomers、羧甲基纤维素钠、甲纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、海藻酸钠和黄蓍胶)；以及润湿剂(例如，十七亚乙基氧基十六碳烷醇、卵磷脂、聚乙烯山梨糖醇一油酸、聚环氧乙烷山梨糖醇一油酸和聚环氧乙烷硬脂酸酯)。
此处描述的多肽可以作为单一药物或与一或多种其它的药物组合给药，其中组合用药没有产生不能接受的副作用。例如，本发明的多肽可以与已知的抗肥胖症药或已知的抗糖尿病药或其它的指示剂等以及其混合物和组合组合。
此处所述的多肽也可以以游离碱形式或含在组合物中应用在研究和诊断中，或作为分析参照的标准等。因此，本发明包括由惰性载体和有效量的通过在此描述的方法鉴定的化合物或其盐或酯组成的组合物。惰性载体是不与化合物相互作用的传送和提供载体、运送方式、主体、示踪物质等到欲传送的化合物的任何物质。化合物的有效量是对进行的特定方法产生效果或影响的量。
已知多肽在含水的和无水环境中发生水解、脱酰胺作用、氧化作用、外消旋作用和异构化。降解诸如水解、脱酰胺作用或氧化作用可通过毛细管电泳容易地检测。尽管有酶催降解，但是具有延长的血浆半衰期或生物学驻留时间的多肽在水溶液中最少应该是稳定的。在体温时，一天时间内显示出小于10％降解的多肽是必需的。在体温时，一天时间内显示出小于5％降解的多肽是更优选的。由于在慢性糖尿病患者中的治疗寿命，大量优选的这些药物适宜于给药，此外很少通过非肠道路径。在体温时的一周期间内的稳定性(即小于较低的降解百分比)将允许较少地频繁给药。在冷冻温度时的在几年中的稳定性将允许制造商提供液体制剂，因此避免重建的麻烦。另外，在有机溶剂中的稳定性将提供把多肽配制到新的剂型诸如植入物中。
制剂适于皮下注射、静脉注射、肌内注射等；合适的药物载体；并且用于配制和给药的技术是本领域公知的可用于制备的任意方法(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCo.，Easton Pa.，第20版，2000)。
本发明将通过下文实施例进行进一步的说明，但其不应被理解为以任何方式对本发明范围的限制。
胶囊配方
胶囊制剂由下述物质制备而成：
本发明的多肽    10mg
淀粉            109mg
硬脂酸镁        1mg
将组分混合，通过合适的网筛，并填充到硬的胶囊中。
片剂配方
片剂由下述物质制备而成：
本发明的多肽    25mg
微晶纤维素      200mg
胶体二氧化硅    10mg
硬脂酸          5.0mg
将组分混合并压缩来形成片剂。可使用合适的含水和无水涂层以增强适口性，提高雅洁性和稳定性或延迟吸收。
无菌的静脲内注射溶液
利用无菌的注射水制备本发明目的化合物的mg/mL溶液，并且如果需要则调整pH值。将溶液用无菌的5％葡萄糖稀释用于给药，并且作为静脉内注入给药。
肌内注射悬浮液
制备下列的肌内注射悬浮液：
本发明的多肽    50μg/mL
羧甲基纤维素钠  5mg/mL
TWEEN 80        4mg/mL
氯化钠          9mg/mL
苯甲醇          9mg/mL
悬浮液通过肌内注射给药。
硬壳胶囊
通过用150mg乳糖、50mg的纤维素和6mg的硬脂酸镁的各种粉末状的活性成分填充标准的上下两件的硬甘氨酸菌素胶囊来制备大量的单位胶囊。
软胶囊
制备活性成分在可吸收的油诸如豆油、棉子油或橄榄油中的混合物并通过正置换泵注射到熔化物凝胶中来形成包含活性成分的软胶囊。将胶囊洗涤并干燥。可将活性成分溶于聚乙二醇、甘油和山梨糖醇的混合物来制备水溶性的医用混合物。
立即释放的片剂/胶囊
这些是通过常规的和新的方法制备的固体口服剂型。这些单位被口服而不需水以用于药物的快速溶解和输送。将活性成分混合在包含组分诸如糖、凝胶、果胶和甜味剂的液体中。通过冷冻干燥和固态提取技术将这些液体固化为固体片剂或锭剂。可以用粘弹性的和热弹性的糖和聚合物或发泡组分压缩将药物化合物来产生用于快速释放而不需水的多孔介质。
可以理解对本发明进行不脱离此处所述的本发明的精神或范围的改变和修饰对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例
为了使本发明能够被更好地理解，下面对实施例进行了描述。这些实施例仅仅用于解释的目的，不应被理解为以任何方式对本发明范围进行限制。所有提及的出版物被整体引入作为参考。
实施例1.肽合成方法
设计本发明的多肽来提高这些肽的稳定性和延长其半衰期。特定地，这些肽的非突变形式(参见，例如，WO 01/23420，整体引入在此)在水中和无水环境中显示出N-末端水解、脱酰胺作用以及二聚化和三聚化。为了提高稳定性和最小化水解作用、脱酰胺作用和二聚化/三聚化，将天冬酰胺残基(位置9和28)突变为谷氨酰胺残基。此外，位置17处的缬氨酸、位置19处的丙氨酸、位置29处的赖氨酸、位置30处的精氨酸、位置31处的酪氨酸也被突变。此外，如下所述，本发明的多肽也被聚乙二醇化来延长半衰期。
下列的常规方法被用于合成本发明的一些多肽：
通过FMOC/叔丁基策略，在连续流动条件下利用Rapp-PolymerePEG-聚苯乙烯树脂(Rapp-Polymere，Tubingen，Germany)进行肽的合成(Pennington&Dunn，Peptide Synthesis Protocols，Volume35，1994)。在合成完成后，从树脂裂解肽并利用TFA/DTT/H2O/三异丙基硅烷(88/5/5/2)去保护。利用冷的二乙醚从裂解的混合物中沉淀肽。将沉淀物用冷的醚冲洗三次，然后在冷冻干燥之前溶于5％的乙酸。通过反相色谱法在YMC-Pack ODS-AQ柱(YMC，Inc.，Wilmington，NC)上，利用具有3％TFA的水/乙腈作为从0％到100％乙腈的梯度，和通过MALDI质谱法在VOYAGER DE(MALDI质谱仪，(5-2386-00型，PerSeptive BioSystems，Framingham，MA)来校验肽。以1/1比例将肽样品被添加至基质缓冲液(具有3％TFA的50/50dH2O/乙腈)中。通过反相色谱法在Waters Delta Prep 4000HPLC系统(Waters Corporation，Milford，MA)上纯化不满足＞95％的纯度标准的肽。
实施例2.肽聚乙二醇化
可通过将聚乙二醇(PEG)部分连接于肽由此降低肽被肾清除以及减少肽的蛋白酶降解来增强肽在体内的半衰期。VPAC2受体激动剂的应用受其非常短的体内半衰期的严重限制；然而，连接PEG部分与肽(聚乙二醇化)延长了肽的半衰期，使其充分地允许一天一次至一周一次的治疗。
聚乙二醇化可通过本领域公知的任何方法来进行。然而，在此实施例中，通过将唯一的半胱氨酸突变引入到肽中，然后通过肽的巯基和甲氧基-PEG-马来酰亚胺试剂(Nektar(Inhale/Shearwater)，SanCarlos，CA)的巯基之间的稳定的硫醚键将半胱氨酸聚乙二醇化来聚乙二醇化。优选地，在肽的C-末端导入唯一的半胱氨酸来最小化通过聚乙二醇化导致的活性可能的减少。
特定地，将两倍摩尔的过量mPEG mal(MW 22kD和43kD)试剂添加给1毫克的肽(例如，在肽的C-末端具有半胱氨酸突变的SEQ IDNO：1)并在pH6溶于反应缓冲液中(0.1M磷酸钠/0.1M NaCl/0.1MEDTA)。在室温下0.5小时后，将反应用2倍摩尔的过量DTT对mPEG-mal进行终止反应。肽-PEG-mal反应混合物被用于阳离子交换柱来除去残余的PEG试剂，然后通过凝胶过滤柱来除去残余的游离肽。通过SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱法测定聚乙二醇化位点的纯度、质量和数目。当22kD PEG附着于本发明的肽时，有效的VPAC2受体激活被保持。此外，VPAC2对VPAC1和PAC1的受体激活选择性也被保留。用较小PEG(例如，线性22kD PEG)聚乙二醇化较小地降低肽的活性是可能的，而大的PEG(例如，分支的43kD PEG)将更可能地降低活性。然而，较大的PEG将进一步增强血浆半衰期，使得一周一次的注射是可能的(Harris等，Clin.Pharmacokinet.40：539-551，2001)。
实施例3.肽的克隆
为了重组表达这些肽，将编码肽的DNA序列在C-末端克隆到具有分离单体的肽和GST的单因子Xa识别位点的谷胱甘肽S-转移酶(GST)。通过杂交包含Bam HI或Xho I限制性酶位点的两个重叠的单链DNA片段(70-90mers)来合成编码融合到肽的DNA序列的因子Xa识别位点的基因，随后克隆基因DNA序列的5’，然后通过DNA聚合酶I(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的大片段DNA合成相对的链。基于设计的各肽氨基酸序列的反向翻译选择各基因的DNA序列。在一些情况下，通过对上述方法制备的基因进行PCR突变来产生编码肽的基因(Picard等，Nucleic Acids Res 22：2587-91，1994；Sambrook等，Molecular Cloning：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约，1989)。然后通过Bam HI和Xho I降解双链产物并连接到也已用Bam HI和Xho I降解的pGEX-6P-1(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。例如，为了表达作为与GST的熔合物的SEQ ID NO：1，将设计的DNA序列(图2)克隆到pGEX-6P-1中。
实施例4.肽的重组表达和纯化
在37℃培养用含质粒的GST-肽熔合物转化的BL21细胞(Stratagene，La Jolla，CA)直至OD600达到0.6至1.0，然后细胞用1mM IPTG(Life Technologies，Carlsbad，CA)在37℃温育两小时。在7700g离心细胞(2L)15分钟，称重，并储存在-20℃至少3小时。将冷冻的细胞丸被重新悬浮在100mL含有250μL蛋白酶抑制剂混合物(Sigma Chemical，St.Louis，MO)/克细胞的冰冷PBS中，在3x下超声处理1分钟15秒。然后在10,000g离心细胞20分钟。将上清液与2mL的50％谷胱甘肽琼脂糖4B树脂(Pharmacia)混合，在4℃振荡器上过夜。在1,500g下离心上清液/树脂15分钟，填充到空的聚制备性层析柱(Bio-Rad，Hercules，CA)中，用30mL PBS，然后用10mL因子Xa缓冲液(1mM CaCl2，100mM NaCl，和50mM Tris-HCl，pH 8.0)冲洗。通过加入60单位的在1mL因子Xa缓冲液中的因子Xa(Pharmacia)从柱裂解肽，在4℃温育过夜，并通过C18HPLC(Beckman System Gold)分离，利用2mL环和2mL/分钟的流速进行下列的程序：10分钟的缓冲液A(0.1％TFA/H20)，30分钟的缓冲液B(0.1％TFA/ACN)的梯度，10分钟的缓冲液A，10分钟的梯度，和10分钟的缓冲液A。收集峰组分(每个1mL)并通过10-20％Tricine-SDS凝胶电泳筛选。收集含有图1的肽的组分并干燥。典型的产量为几百微克的游离肽/升大肠杆菌培养物。重组肽显示与其合成形式具有相同的活性。
实施例5.从分散的大鼠小岛细胞分泌胰岛素
根据如下步骤测定由本发明的大量肽介导的分散的大鼠胰岛的胰岛素分泌。利用胶原酶降解从SD大鼠(200-250g)分离的胰岛。用胰蛋白酶处理分散的胰岛细胞，接种到96孔V形底平板中，并进行粒状沉淀。然后在含有或者不含有本发明肽的培养基中过夜培养。对培养基抽气并在37℃用含有3mM葡萄糖的Krebs-Ringer-HEPES缓冲液预培养细胞。除去预温育缓冲液，并在37℃将细胞培养在含有或者不含肽的合适葡萄糖浓度(例如，8mM)的Krebs-Ringer-HEPES缓冲液中达适当的时间。在某些研究中，也包括合适浓度的GLP-1。除去一部分上清液并通过SPA测定其胰岛素含量。结果用“对照的倍数”(FOC)来表示。在300nM浓度时，具有SEQ ID NO：1+cys+PEG(43kD)的氨基酸序列的多肽使分散的胰岛细胞的胰岛素分泌增加了大约1.7倍(附图3)。
在该分析中，分散的大鼠胰岛细胞分泌的胰岛素被确定为增加了至少1.4倍。本发明多肽的VPAC2受体激动剂组分使分散的胰岛细胞分泌的胰岛素增加了至少1.4倍到约1.7倍。
实施例6.聚乙二醇化肽对大鼠腹膜内葡萄糖耐量的作用
通过对大鼠皮下给药检测本发明的聚乙二醇化肽的体内活性。给禁食过夜的大鼠皮下注射对照或聚乙二醇化肽(1-100μg/kg)。3小时后，测定基础血糖，并对大鼠腹膜内施用2g/kg的葡萄糖。15、30和60分钟后再次测定血糖。根据IPGTT(腹膜内葡萄糖耐量试验)，本发明的代表性聚乙二醇化肽相对于介质显著地降低了血糖水平，葡萄糖AUC减少了17％-28％(附图4)。这表明聚乙二醇化肽具有体内延长的降低葡萄糖的活性。本发明的聚乙二醇化肽除了具有降低葡萄糖的活性外，它也显示出延长肽在体内的半衰期的活性。PACAP-27具有非常短的体内半衰期(10分钟)。在肽给药后3小时，本发明的聚乙二醇化肽降低血糖的能力是在此时间点上在循环中存在所述肽的明显标志并且由此相对于PACAP-27，具有延长的半衰期。
实施例7.cAMP SPA
将表达VPAC2肽的CHO细胞以8×104细胞/孔的浓度在96-孔平板中涂板，并在37℃于αMEM、核苷、谷氨酰胺(Gibco/BRL，Rockville，MD)、5％FBS、100(g/mL Pen/Strep，0.4mg/mL潮霉素和1.5mg/mL的遗传霉素(Gibco/BRL)中生长24小时。除去培养基，并用PBS清洗平板。用肽(于10mM Hepes，150mM NaCl，5mM KCl，2.5mM CaCl2，1.2mM KH2PO4，1.2mM MgSO4，25mM NaHCO3(pH7.4)，1％BSA和100μM IBMX)在37℃温育细胞15分钟。利用cAMPSPA直接筛选分析系统(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)测定细胞提取物中cAMP的量。按照试剂盒提供的说明书确定裂解物中cAMP的量。利用Prizm软件通过非线性回归标绘每个肽浓度产生的cAMP的量，并进行分析以确定每种肽的EC50。
基于VIP设计本发明的多肽已经显示出缺少在PAC1处的活性(Vaudry等，Pharmacol.Rev.52：269-324，2000)。因此，人们相信本发明的多肽在PAC1处不具有明显的活性。
对本发明的代表性多肽的分析结果显示于下表1中。确定为P5、P7、P8、P12和P12+PEG的肽都是VPAC2受体的有效激动剂，通过内源肽PACAP-27激活受体来实现受体激活达到100％的最高水平。此外，确定为P5、P7、P8、P12和P12+PEG的肽是选择性的VPAC2受体拮抗剂，具有对VPAC1非常弱的拮抗剂活性。PACAP-27是VPAC1的有效拮抗剂。
表1
  肽   SEQ ID NO.   VPAC2EC50(nM)   VPAC1EC50(nM)
  PACAP-27   SEQ ID NO：116   0.09   0.35
  P5   SEQ ID NO：1   0.33   232.5
  P7   SEQ ID NO：5   7.81   ＞1000
  P8   SEQ ID NO：2   0.19   130.5
  P12   SEQ ID NO：1+C-末端的Cys   0.38   ＞1000
  P12   加22kDPEG   1.32   ＞1000
  P12   加43kDPEG   4.19   ＞1000
实施例8.药物组合物-IV和SC制剂
利用本领域公知的任一生产方法，用4mg的SEQ ID NO：1的多肽或具有4mg多肽含量的当量的衍生的多肽和1L无菌盐水制备无菌IV注射制剂。高浓度的多肽可用于制备SC制剂。对于确定为SEQ ID NO：1的多肽或衍生的多肽而言，将4mg的所述多肽溶于100mL盐水或DMSO中，并在无菌小瓶无菌过滤后填充所述组合物。
实施例9.包括本发明肽的制剂的稳定性
将实施例8描述的制剂放置于恒定稳定性小室中。定期取出样品通过毛细管电泳进行分析，所述毛细管电泳是检测这些制剂中多肽降解的最灵敏的方法。对多个峰面积求和，并用亲本多肽的峰区域除以峰面积总数(附图5和6)。比值是纯度％。因为新鲜多肽中存在杂质，通过用不同时间点的纯度除以初始纯度来将纯度改变标准化。
实施例10.生成肽特异性抗体并通过ELISA测定肽
通过利用ABI 433A肽合成仪合成本发明多肽的特异性片段而产生本发明多肽的多克隆特异性抗体。然后从树脂裂解肽，并在BeckmanSystem Gold的分析和并制备性的HPLC体系上进行纯化。透视MALDI质谱分光光度计系统用来鉴定正确的产物。利用冷冻干燥器干燥肽。然后将肽(2mg)通过Cys上的游离疏基基团结合到钥孔血兰素(KLH)上。
在第0、14、35、56和77天免疫雌性新西兰白兔。在第0天用250mg肽和完全的Feund佐剂皮下注射每只兔子。随后每只兔子使用125mg肽进行免疫。在第21天开始取血并在此后每隔21天连续取血。通过将粗血清流过特异性肽亲和纯化柱进行抗肽抗体的纯化。通过ELISA测定抗体滴度。
用特异于本发明肽的C-末端Morphosys F(ab)抗体包被96-孔Immulon 4HBX平板并在4℃温育过夜。然后封闭平板防止非特异性结合。然后将肽标准样品(2500ng/mL-160pg/mL)稀释在33％的血浆中，并将样品以1∶3稀释在缓冲液中，随后在室温下温育1.5小时。清洗后，将特异于本发明肽的多克隆N-末端抗体在平板上温育1小时。随后添加辣根过氧化酶(HRP)-驴抗兔抗体，并将样品和标准样品温育1小时。用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液温育后评估检测并在OD450处读取平板(附图7)。
可以通过本领域公知的体外、离体和体内分析完成本发明多肽的活性检测。例如，为了证明药剂对治疗糖尿病和相关紊乱，诸如X综合症、葡萄糖耐量削弱、禁食葡萄糖减少和血胰岛素增多；动脉粥样硬化病和相关紊乱，诸如高甘油三酯血症；以及肥胖症的效力，可以使用下列分析。
测定血糖水平的方法
对db/db小鼠(获自Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)放血(通过眼或者尾静脉放血)并根据当量平均血糖水平进行分组。用试验多肽每日口服给药(通过药用载体用填喂法)一次，共14天。此时，通过眼或尾角静脉再次对动物放血并确定血糖水平。在所有情况下，用Glucometer Elite XL(Bayer Corporation，Elkhart，IN)测定葡萄糖水平。
甘油三酯水平的测定方法
对hApoA1小鼠(获自Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)取血(通过眼或者尾静脉取血)并根据当量平均血清甘油三酯水平进行分组。用试验多肽每日口服给药(通过药用载体用填喂法)一次，共8天。然后经眼或尾角静脉再次对动物取血并确定血清甘油三酯的水平。在所有情况下，利用Technicon Axon Autoanalyzer(BayerCorporation，Tarrytown，NY)测定甘油三酯的水平。
高密度脂蛋白胆固醇含量的测定方法
为了确定血浆HDL-胆固醇含量，对hApoA1小鼠取血并根据当量平均血浆HDL-胆固醇含量进行分组。给小鼠每日口服载体或试验多肽，每日一次，共7天，然后在第8天再次取血。利用Synchron ClinicalSystem(CX4)(Beckman Coulter，Fullerton，CA)分析血浆的HDL-胆固醇。
总胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯以及葡萄糖水平的测定方法
在另一体内分析中，对肥胖猴取血，然后每日一次口服载体或试验多肽，历时4周，然后再次取血。利用Synchron Clinical System(CX4)(Beckman Coulter，Fullerton，CA)分析血清的总胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯以及葡萄糖。通过Oliver等，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：5306-5311，2001)描述的核磁共振谱学分析脂蛋白亚类。
对心血管参数的影响的测定方法
也进行心血管参数(例如，心率以及血压)的评估。给SHR大鼠每日一次口服载体或试验多肽，历时2周。利用Grinsell等，(Am.J.Hypertens.13：370-375，2000)描述的尾-套箍方法测定血压和心率。如Shen等(J.Pharmacol.Exp.Therap.278：1435-1443，1996)所述监控猴的血压和心率。
评估化合物对瘦弱过夜禁食的大鼠食物摄入减少(抑制食欲)的效果
空腹-再喂养急性喂料分析
本方案的目的是测定单剂量的未知化合物对瘦弱的过夜空腹大鼠食物消耗的影响。空腹-再喂养大鼠模型常常用于肥胖症领域以鉴定可能具有厌食作用的化合物。此动物模型已被成功用于鉴定和表征正在或者已被用于控制肥胖人体重的化合物的效果分布图(参见，例如Balvet等，Gen.Pharmacol.13：293-297，1982；Grignaschi等，Br.J.Pharmacol.127：1190-1194，1999；McTavish和Heel，Drug 43：713-733，1992；Rowland等，Life Sci.36：2295-2300，1985)。
典型的研究包括平均体重约为280g的60-80只雄性大鼠(n＝10/试验组)。将大鼠关在控制温度和湿度以及12/12光暗循环的标准动物房内。将大鼠单独饲养在具有网孔底板的悬挂笼中。连续给水和食物，除非是研究空腹动物时。
载体试验：基于载体试验中大鼠的表现进行分组。在效果试验前的2和7天之间进行载体试验。黑暗期间(总共约16-18小时)对大鼠过夜禁食。给动物0.5mL的去离子水。给药后1小时，将预称重的食物瓶放回动物笼。允许大鼠进食1小时。1小时后，将洒落的物质放回食物缸以确定消耗的食物量。将大鼠分配成组，使得1小时食物消耗的平均值和平均值的标准误差在组之间类似。
效果试验：在黑暗阶段(总共约16-18小时)将大鼠禁食过夜。用指定剂量的多肽处理动物。给药后1小时，将预称重的食物放回笼内。返回食物后在30、60、90、180和240分钟时记录食物摄入量。测定每个时间点的食物消耗量，将洒落的物质放回食物瓶，然后对食物瓶称重。测定每个时间点的食物消耗量。利用合适的统计分析确定处理组之间的差异。
评估化合物对肥胖Zucker fa/fa大鼠体重减少以及食物和耗水量的效果
长期喂料分析
此方案的目的是测定未知化合物的长期给药对肥胖Zucker fa/fa大鼠体重以及食物和水耗量的影响。肥胖Zucker fa/fa大鼠常常用于测定化合物在体重减少中的效果。这个动物模型已经成功地用于鉴定和表征正在或已经用于控制肥胖人体重的化合物效果分布图(参见，例如，Al-Barazanji等，Obes Res.8：317-323，2000；Assimacopoulos-Jeannet等，Am.J.Physiol.260(2Pt 2)：R278-283，1991；Dryden等，Horm.Metab.Res.31：363-366，1999；Edwards和Stevens，Pharmacol.Biochem.Behav.47：865-872，1994；Grinker等，Pharmacol.Biochem.Behav.12：265-275，1980)。
典型的研究包括平均体重约550g的60-80只雄性Zucker fa/fa(n＝10/试验组)。将大鼠关在控制温度和湿度以及12/12光暗循环的标准动物房内。连续进水和食物。将大鼠单独饲养在具有格形地面的大的大鼠鞋盒中。在记录两天体重的基线测定值和24-小时的食物和水耗量前，使动物适应格形地面和用研究载体模仿剂量至少4天。基于基线上他们的体重将大鼠归于6-8个试验组中的一个。设立分组使得平均体重的平均值和平均值的标准差类似。
在LD/周期的黑暗阶段前，每日通过填喂法给动物口服指定剂量的多肽达预确定的天数(一般6-14天)。在这时候测定体重、食物和水耗量。在最后一天，通过吸入CO2处死动物，并测定体重。
可以通过利用这种长期的喂料分析来测定本发明的多肽对减轻或控制体重的效果。
所有上述说明书中提及的出版物和专利都在此处引作参考。对本发明所述的组合物和方法的各种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的，只要不离开本发明的范围和精神。虽然已经连同具体的优选实施方案对本发明进行了描述，但是应该理解要求保护的所述的本发明不应该受限于这种具体的实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域技术人员而言显而易见的实施本发明的上述方案的各种修饰应在所附的权利要求的范围之内。本领域技术人员仅仅利用常规实验就应该认识到或能够确定本发明所述的具体实施方案的许多等价物。这种等价物应该包括在下列权利要求中。
序列表
<110>Bayer Pharmaceuticals Corporation
      FROLAND，Wayne
KELNER，Drew
DUMAS，Michael
PAN，Clark
WHELAN，James
WANG，John
WANG，Wei
<120>垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)受体(VPAC2)激动剂及其药物使用方法
<130>MSB-7295
<150>US 60/395,738
<151>2002-07-12
<160>264
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>1
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>Ac为乙酰基
<400>2
Ac-Hi s Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1                   5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>3
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>3
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>4
<211>29
<212>PRT
<213>人
<400>4
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys
            20                  25
<210>5
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>5
His Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>6
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>6
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10              15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Gln Asp Ile Lys Gln Gly Gly Thr
            20                  25              30
<210>7
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>7
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>8
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>8
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>9
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>9
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>10
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>10
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala His Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>11
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>11
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
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Met Ala Ala Lys His Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>12
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>12
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>13
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>13
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>14
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>14
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Arg Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
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<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>15
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>16
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>16
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>17
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>17
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Gln Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>18
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>18
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>19
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>19
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Arg
            20                  25                  30
<210>20
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>20
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ala
            20                  25                  30
<210>21
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>21
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Phe
            20                  25                  30
<210>22
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>22
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys His
            20                  25                  30
<210>23
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>23
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ile
            20                  25                  30
<210>24
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>24
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Lys
            20                  25                  30
<210>25
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>25
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Leu
            20                  25                  30
<210>26
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>26
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Met
            20                  25                  30
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<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>27
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Pro
            20                  25                  30
<210>28
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>28
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Gln
            20                  25                  30
<210>29
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>29
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ser
            20                  25                  30
<210>30
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>30
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Thr
            20                  25                  30
<210>31
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<212>PRT
<213>人
<400>31
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Val
            20                  25                  30
<210>32
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>32
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Trp
            20                  25                  30
<210>33
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>33
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Tyr
            20                  25                  30
<210>34
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>34
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>35
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>35
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>36
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>36
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>37
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>37
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>38
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>38
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>39
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>39
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>40
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>Ac为乙酰基
<400>40
Ac-His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
    1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
                20                  25                  30
<210>41
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>41
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>42
<211>29
<212>PRT
<213>人
<400>42
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys
            20                  25
<210>43
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>43
His Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>44
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>44
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Gln Asp Ile Lys Gln Gly Gly Thr
            20                  25                  30
<210>45
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>45
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>46
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>46
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>47
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>47
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>48
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>48
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala His Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>49
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>49
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys His Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>50
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>50
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>51
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>51
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>52
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>52
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Arg Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>53
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>53
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>54
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>54
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>55
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>55
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Gln Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>56
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>56
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Lys Arg
            20                  25                  30
<210>57
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>57
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Arg
            20                  25                  30
<210>58
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>58
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ala
            20                  25                  30
<210>59
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>59
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Phe
            20                  25                  30
<210>60
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>60
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys His
            20                  25                  30
<210>61
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>61
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ile
            20                  25                  30
<210>62
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>62
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Lys
            20                  25                  30
<210>63
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>63
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Leu
            20                  25                  30
<210>64
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>64
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Met
            20                  25                  30
<210>65
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>65
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Pro
            20                  25                  30
<210>66
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>66
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Gln
            20                  25                  30
<210>67
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>67
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ser
            20                  25                  30
<210>68
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>68
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Thr
            20                  25                  30
<210>69
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>69
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Val
            20                  25                  30
<210>70
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>70
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Trp
            20                  25                  30
<210>71
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>71
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Tyr
            20                  25                  30
<210>72
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>72
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>73
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>73
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>74
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>74
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>75
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>75
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>76
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>76
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Arg Ile
            20                  25                  30
<210>77
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>77
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>78
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>Ac为乙酰基
<400>78
Ac-His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
    1               5                  10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg Tyr
                20                  25                  30
<210>79
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>79
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln SerIle Lys Asn Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>80
<211>29
<212>PRT
<213>人
<400>80
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys
            20                  25
<210>81
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>81
His Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>82
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>82
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Gln Asp Ile Lys Asn Gly Gly Thr
            20                  25                  30
<210>83
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>83
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg
            20                  25                  30
<210>84
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>84
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Asn Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>85
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>85
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Asn Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>86
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>86
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala His Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>87
<211>31
<212>PRT
<213>人
<400>87
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys His Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg Tyr
            20                  25                  30
<210>88
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>88
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg
            20                  25                  30
<210>89
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>89
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg
            20                  25                  30
<210>90
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>90
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Arg Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg
            20                  25                  30
<210>91
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>91
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg
            20                  25                  30
<210>92
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>92
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Asn Lys Arg
            20                  25                  30
<210>93
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>93
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Gln Asn Lys Arg
            20                  25                  30
<210>94
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>94
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Asn Lys Arg
            20                  25                  30
<210>95
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>95
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Arg Arg
            20                  25                  30
<210>96
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>96
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Ala
            20                  25                  30
<210>97
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>97
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Phe
            20                  25                  30
<210>98
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>98
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys His
            20                  25                  30
<210>99
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>99
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Ile
            20                  25                  30
<210>100
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>100
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Lys
            20                  25                  30
<210>101
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>101
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Leu
            20                  25                  30
<210>102
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>102
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Met
            20                  25                  30
<210>103
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>103
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Pro
            20                  25                  30
<210>104
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>104
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Gln
            20                  25                  30
<210>105
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>105
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Ser
            20                  25                  30
<210>106
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>106
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Thr
            20                  25                  30
<210>107
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>107
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Val
            20                  25                  30
<210>108
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>108
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Trp
            20                  25                  30
<210>109
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>109
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Tyr
            20                  25                  30
<210>110
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>110
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                  10                  15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Arg Ile
            20                  25                  30
<210>111
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>111
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Arg Ile
            20                  25                  30
<210>112
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>112
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Arg Ile
            20                  25                  30
<210>113
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>113
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Asn Arg Ile
            20                  25                  30
<210>114
<211>30
<212>PRT
<213>人
<400>114
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Asn Arg Ile
            20                  25                  30
<210>115
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>115
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>116
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>Ac为乙酰基；PEG是聚乙二醇
<400>116
Ac-His Thr Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
    1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>117
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>117
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                  10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>118
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(30)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>118
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>119
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>119
His Thr Glu Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>120
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>120
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Leu Ala Val Lys Lys Tyr Leu Gln Asp Ile Lys Gln Gly Gly Thr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>121
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>121
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>122
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>122
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Leu Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>123
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>123
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Thr Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG
         20                  25                  30
<210>124
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>124
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala His Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>125
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(32)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>125
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys His Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Tyr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>126
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>126
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>127
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>127
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>128
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>128
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Arg Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>129
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>129
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>130
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>130
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Lys Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>131
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>131
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Gln Gln Lys Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>132
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>132
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Lys Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>133
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>133
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Arg Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>134
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>134
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ala Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>135
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>135
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Phe Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>136
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>136
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys His Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>137
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>137
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ile Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>138
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>138
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr ThrArg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Lys Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>139
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>139
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Leu Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>140
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>140
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Met Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>141
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>141
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Pro Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>142
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>142
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Gln Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>143
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>143
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Ser Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>144
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>144
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Thr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>145
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>145
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Val Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>146
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>146
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Trp Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>147
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>147
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Lys Tyr Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>148
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>148
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Gly Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>149
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>149
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Lys Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>150
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>150
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Gln Arg Ile Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>151
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>151
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Ile Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>152
<211>31
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>混杂的特征
<222>(1)..(31)
<223>PEG是聚乙二醇
<400>152
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Gln Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln
1               5                   10                  15
Met Ala Ser Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Arg Gln Arg Ile Cys-PEG
            20                  25                  30
<210>153
<211>123
<212>DNA
<213>人
<400>153
ggatccatcg aaggtcgtca ctccgacgct gttttcaccg accagtacac gcgtctgcgt     60
aaacaggttg ctgcaaagaa atacctgcag tccatcaagc agaagcgtta ctaatgactc    120
gag                                                                  123
<210>154
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>154
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
<210>155
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>155
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
<210>156
<211>87
<212>DNA
<213>人
<400>156
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaag                                        87
<210>157
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>157
cacaccgaag ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
<210>158
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>158
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagct ggctgttaag    60
aaatacctgc aggacatcaa gcagggcggt acc                                 93
<210>159
<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>159
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt                                     90
<210>160
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>160
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagct ggctgcaaag    60
aaatacctgc agaccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
<210>161
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>161
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agaccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
<210>162
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>162
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcacac    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
<210>163
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>163
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
cactacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
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<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>164
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctggcaag   60
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<211>90
<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctaaaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt                                     90
<210>166
<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>166
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctcgtaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt                                     90
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<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>167
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt                                     90
<210>168
<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>168
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<211>90
<212>DNA
<213>人
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<212>DNA
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<211>90
<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<211>90
<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<211>90
<212>DNA
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<211>90
<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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<210>176
<211>90
<212>DNA
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<211>90
<212>DNA
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<211>90
<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
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<211>90
<212>DNA
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<211>90
<212>DNA
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<210>189
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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cacaccgaag ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag    60
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<213>人
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agaccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
<210>199
<211>93
<212>DNA
<213>人
<400>199
cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcacac    60
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<210>200
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<213>人
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<211>93
<212>DNA
<213>人
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cactacctgc agtccatcaa gcagaagcgt tac                                 93
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<213>人
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aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt                                     90
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcgt                                     90
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<213>人
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aaatacctgc agtccatcaa gcagaaggca                                     90
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagatc                                     90
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagatg                                     90
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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<400>217
cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagcag                                     90
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gcagaagtcc                                     90
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctaaaaag    60
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<211>90
<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag    60
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgacaactac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag    60
aaatacctgc agtccatccg tcagcgtatc                                     90
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cacaccgaag ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacaggt tgctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagct ggctgttaag    60
aaatacctgc aggacatcaa gaacggcggt acc                                 93
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaa tacctgc agtccatcaa gaacaagcgt                                    90
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<212>DNA
<213>人
<400>234
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagct ggctgcaaag    60
aaatacctgc agaccatcaa gaacaagcgt tac                                 93
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agaccatcaa gaacaagcgt tac                                 93
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcacac    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
cactacctgc agtccatcaa gaacaagcgt tac                                 93
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<212>DNA
<213>人
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<212>DNA
<213>人
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<212>DNA
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctcgtaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gaacaagcgt                                    90
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gaacaagcgt                                     90
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<212>DNA
<213>人
<400>242
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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<212>DNA
<213>人
<400>244
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatccg taacaagcgt                                     90
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<212>DNA
<213>人
<400>245
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gaaccgtcgt                                     90
<210>246
<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>246
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gaacaaggca                                     90
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<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>247
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>248
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gaacaagcac                                     90
<210>249
<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>249
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
<400>250
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
aaatacctgc agtccatcaa gaacaagaag                                     90
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<212>DNA
<213>人
<400>251
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>254
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<211>90
<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<210>256
<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>256
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<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>257
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggctgcaaag    60
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<212>DNA
<213>人
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<211>90
<212>DNA
<213>人
<400>264
cactccgacg ctgttttcac cgaccagtac acgcgtctgc gtaaacagat ggcttccaag    60
aaatacctgc agtccatccg taaccgtatc                                     90

Claims (53)

1.一种选自SEQ ID NOs：1至152及其功能性等价片段、衍生物和变体的多肽。
2.编码权利要求1的多肽序列的多核苷酸或其简并变体。
3.一种含有权利要求2的多核苷酸的载体。
4.一种含有权利要求3的载体的宿主细胞。
5.一种产生多肽的方法，包括：
a)在适于所述多肽表达的条件下培养权利要求4的宿主细胞；和
b)从该宿主细胞培养物中回收所述的多肽。
6.一种纯化的抗体，其特异性与权利要求1的多肽结合。
7.根据权利要求1的多肽，其中所述的多肽选自SEQ ID NOs：1、2、3、4和5。
8.根据权利要求1的多肽，其中所述的多肽选自SEQ IDNOs：115、116、117、118和119。
9.一种选自SEQ ID NOs：154至264的多核苷酸。
10.一种药物组合物，其包括治疗有效量的权利要求1的多肽或其功能性等价物片段、衍生物和变体以及药学上可接受的载体。
11.根据权利要求10的药物组合物，其中所述的组合物包括大约2％到大约30％的DMSO和任选的选自丙二醇、二甲基甲酰胺、碳酸亚丙基酯、聚乙二醇和甘油三酯的溶剂。
12.根据权利要求10的药物组合物，其中所述的多肽选自SEQ IDNOs：1、2、3、4、5、115、116、117、118和119。
13.一种药物组合物，其包括治疗有效量的权利要求1的多肽或其功能性等价物片段、衍生物和变体以及药学上可接受的载体和一或多种药物。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中所述的药物选自PPAR激动剂、磺酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素、抗肥胖症药物、HMG辅酶A还原酶抑制剂、烟酸、胆汁酸螯合剂、纤维酸衍生物以及抗高血压的药物。
15.一种包括治疗有效量的权利要求1的多肽或其功能性等价物片段、衍生物和变体以及与其结合的惰性载体的组合物。
16.一种治疗糖尿病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
17.根据权利要求16的方法，其中所述的糖尿病选自I型糖尿病、II型糖尿病、青年人成熟期发病型糖尿病、成人隐匿性自身免疫糖尿病以及妊娠期糖尿病。
18.一种治疗综合症X的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
19.一种治疗与糖尿病相关的疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
20.根据权利要求19的方法，其中所述的与糖尿病-相关的疾病选自高血糖、血胰岛素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、血脂紊乱、高甘油三酯血症和胰岛素抗性。
21.一种治疗糖尿病的方法，包括给需要治疗的受试者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
22.根据权利要求21的方法，其中所述的药物选自PPAR激动剂、磺酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素和抗肥胖症药物。
23.根据权利要求22的方法，其中所述的糖尿病选自I型糖尿病、II型糖尿病、青年人成熟期发病型糖尿病、成人隐匿性自身免疫糖尿病以及妊娠期糖尿病。
24.一种治疗综合症X的方法，包括给需要治疗的受试者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
25.根据权利要求24的方法，其中所述的药物选自PPAR激动剂、磺酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素和抗肥胖症药物。
26.一种治疗与糖尿病相关的疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
27.根据权利要求26的方法，其中所述的与糖尿病相关的疾病选自高血糖、血胰岛素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、血脂紊乱、高甘油三酯血症和胰岛素抗性。
28.根据要求27的方法，其中所述的药物选自PPAR激动剂、磺酰脲药物、非磺酰脲促泌剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素和抗肥胖症药物。
29.一种治疗糖尿病、综合症X或与糖尿病相关的疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤，其中药物选自HMG辅酶A还原酶抑制剂、烟酸、胆汁酸螯合剂、纤维酸衍生物和抗高血压的药物。
30.根据权利要求29的方法，其中所述的与糖尿病相关的疾病选自高血糖、血胰岛素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、血脂紊乱、高甘油三酯血症和胰岛素抗性。
31.根据权利要求21到30中任意一项的方法，其中将权利要求1的多肽和一种或多种药物作为单药物剂量制剂给药。
32.一种治疗或预防糖尿病的次级起因的方法，包括给需要治疗或预防的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
33.根据权利要求32的方法，其中所述的次级起因选自糖皮质激素过量、生长激素过量、嗜铬细胞瘤和药物诱导的糖尿病。
34.一种治疗或预防糖尿病的次级起因的方法，包括给需要的治疗或预防受试者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
35.根据要求34的方法，其中所述的药物选自PPAR激动剂、磺酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、α-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素和抗肥胖症药物。
36.一种治疗呼吸道疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
37.一种治疗肥胖症的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
38.一种调节食欲的方法，包括给需要调节食欲的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
39.一种治疗心血管疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
40.一种治疗或预防脂质和碳水化合物代谢疾病的方法，包括给需要治疗或预防的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
41.一种治疗睡眠障碍的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
42.一种治疗男性生殖疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
43.一种治疗生长疾病或能量稳态紊乱的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
44.一种治疗免疫疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
45.一种治疗自身免疫疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
46.一种治疗急性和慢性炎症性疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
47.一种治疗脓毒性休克的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
48.一种通过给受试者给药权利要求1的多肽而以葡萄糖依赖性的方式在受试者中刺激胰岛素释放的方法。
49.一种基因治疗组合物，它包括与治疗有效量的基因治疗载体组合的权利要求2的多核苷酸。
50.用于治疗和/或预防糖尿病和与糖尿病-相关的疾病的权利要求1的多肽。
51.含有至少一种权利要求1的多肽以及至少一种药学上可接受的、药学上安全的载体或赋形剂的药物。
52根据权利要求1的多肽在生产用于治疗和/或预防糖尿病和与糖尿病-相关的疾病的药物中的应用。
53.用于治疗和/或预防糖尿病的权利要求51的药物。
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