JP2002524039A - ヒトアポプトシス阻害剤タンパク質ｈｉａｐ３をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、HIAP3と称する新規ヒトアポプトシス阻害剤ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドの生産方法、該ポリペプチドの発現のための発現ベクターおよび遺伝子操作された宿主細胞に関する。本発明は更に、研究、診断および療法用途における該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの利用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は一部、新たに同定されたポリヌクレオチドとポリペプチド；前記ポリ
ヌクレオチドとポリペプチドの変異体および誘導体；前記ポリヌクレオチドとポ
リペプチド並びにそれらの変異体および誘導体の製造方法；並びに前記ポリヌク
レオチド、ポリペプチド、変異体および誘導体の使用に関する。特に、上記およ
びその他の点について、本発明は、新規ヒトアポプトシス阻害剤ポリペプチドお
よびそれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

【０００２】発明の背景 プログラム細胞死としても知られるアポプトシス（アポトーシス）は、細胞お
よび組織の発達やホメオスタシスに重要な役割を果たしている遺伝的調節過程で
ある（Hengartner, M., Exp. Gerontol. 32:363-374, 1997; Hoeppner他, Bioch
em. Biophys. Acta 1242:217-220, 1996; Ellis他, Annual Rev. Cell Biol. 7:
663-698, 1991）。アポプトシスは、過剰生産されたか、不適切に発達したか、
または遺伝傷害を受けた細胞を排除できるようにし、且つ感染性ウイルスの複製
を制限するための主要な宿主防御機構を表す。一般的に細胞膜の膨潤と破壊およ
び近隣組織の炎症を伴う壊死性の細胞死とは対照的に、アポプトシスは細胞縮小
、空胞化、クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化およびアポプトシス小体の形成により
特徴付けられる（MacLellan & Schneider, Circ. Res. 81:137-144, 1997; Cohe
n, G., Biochem. J. 326(Pt 1):1-16, 1997）。アポプトシス細胞は、次いで炎
症応答を引き起こすことなく近隣のスカベンジャー細胞により貧食される（Wu &
Horvitz, Nature 392:501-504, 1998）。

【０００３】 アポプトシスの緩和が様々な病気の病因に関係があるとされている。欠陥のあ
るアポプトシスが癌（Pan他, Cancer Surv. 29:305-327, 1997; Thompson, C.,
Science 267:1456-1462, 1995）または慢性ウイルス感染（Clem他, Science 254
:1388-1390, 1991; Clem & Miller, Mol. Cell. Biol. 14:5212-5222, 1994）に
何らかの役割を果たすようだ。不適当な（または未熟な）アポプトシスは神経変
性疾患（Roy他, Cell 80:167-178, 1995; Raff他, Science 262:695-700, 1996
）または後天性免疫不全疾患（Banda, N., J. Exp. Med. 176:1099-1106, 1992
）の一因となり得る。未熟なアポプトシスは、虚血／再潅流傷害、心筋梗塞（Ma
cLellan & Schneider, Circ. Res. 81:137-144, 1997）およびうっ血性心不全（
Feuerstein, G., Trends Cardiovas. Med. 7:249-255, 1997）における筋細胞減
少の寄与因子としても認識されている。

【０００４】 アポプトシス阻害剤タンパク質（ＩＡＰ）として知られるアポプトシス阻害剤
の新規種類の存在が文献に報告されている（Liston他, Apoptosis 2:423-441, 1
997）。最初のＩＡＰはバキュロウイルスにおいて発見され（Crook他, J. Vir.
67:2166-2174, 1993）、現在はショウジョウバエ、ひな鳥、マウスおよびヒトに
おいてＩＡＰが報告されている（Hay他, Cell 83:1253-1262, 1995; Liston他、
前掲）。５つのヒトＩＡＰが同定されている:HIAP1, HIAP2, XIAP（Ｘ染色体関
連ＩＡＰ），NIAP（ニューロンＩＡＰ）およびスルビビン（Ambrosini他, Nat.
Med. 3:917-921, 1997; Duckett他, Embo J. 15:2685-2694, 1996）。

【０００５】 ＩＡＰは発生学上高度に保存されているタンパク質ファミリーであり、多数の
共通した構造上の特徴（ドメイン）を含む。その中には、BIR（バキュロイウル
スＩＡＰ反復）ドメイン（Liston他, 前掲）とも呼ばれるドメインの１または複
数の繰返しを含むＮ末端ドメイン、およびＣ末端RING亜鉛フィンガードメインが
ある。それらのドメインはＩＡＰファミリーの既知メンバーの中で異なる度合い
に存在している。HIAP1とHIAP2は３つのBIRドメインと１つのＣ末端RINGドメイ
ンを含み、一方スルビビンは１つのBIRドメインしか含まず、RINGドメインを全
く含まない。

【０００６】 ＩＡＰの生理学的役割は正確には明らかでないが、ＩＡＰファミリーの幾つか
のメンバーはアポプトシスの調節の役割を果たしているらしい。組換えＩＡＰは
細胞型によって様々に異なる刺激因子により誘発されるアポプトシスを抑制する
ことがわかった。ショウジョウバエＩＡＰ（DIAP1とDIAP2）はデカペンタプレジ
ック（Decapentaplegic；Dpp）Ｉ型レセプターと相互作用することが証明され、
このことは、それらのDIAPが通常は細胞アポプトシスに至るDpp情報伝達経路の
負の調節因子として作用しうることを示唆している。XIAP，HIAP1およびHIAP2は
、アポプトシスを調節する経路に関与している酵素である特定のキャスパーゼ（
システイン含有アスパラギン酸特異的プロテアーゼ）を直接阻害し、それによっ
てアポプトシスを抑制することができる（Thornberry, N., Br. Med. Bull. 53:
478-490, 1997）。しかしながら、NIAPはキャスパーゼを阻害しないことがわか
っており、このことは異なるＩＡＰでは作用機構が異なるかもしれないことを示
唆している。

【０００７】 プログラム細胞死の制御を手助けすることによって、ＩＡＰは生物体の様々な
細胞の生活環を適切に維持するのに重要な役割を果たしている。どうやら細胞環
境内でのＩＡＰの正常レベルからの偏り（過剰または欠損のいずれか）が様々な
病気状態に関連する生体内状況を引き起こすようだ。

【０００８】 ＩＡＰは腫瘍形成に役割を果たしているかもしれない。Ｒｅｌ／ＮＦkappaＢ
ファミリーの一員である腫瘍タンパク質v-relによって形質転換されたニワトリ
細胞において、ニワトリＩＡＰのアップレギュレーションおよび付随のアポプト
シス抑制が観察された（You他, Mol. Cell. Biol. 17:7328-7341, 1997）。同様
に、バキュロウイルスタンパク質ｐ35（バキュロウイルスＩＡＰ）は、インスリ
ン様増殖因子Ｉレセプターの存在下でマウス胚繊維芽細胞の形質転換を促進する
ことができる（Resnicoff他, J. Biol. Chem. 273:10376-10380, 1998）。

【０００９】 スルビビンは、最終的に分化した成人組織では検出不可能であるが全ての普通
のヒト癌組織では発現され、これは新形成の一般的特徴がアポプトシス阻害であ
るかもしれないことを更に示唆している（Ambrosini他, 前掲）。

【００１０】 ヒトNIAPの欠失変異は、常染色体神経変性疾患である脊髄萎縮に関係する運動
ニューロンの不適切な消耗に関連づけられている（Xu他, J. Comp. Neurol. 382
:247-259, 1997）。ラット虚血モデルにおいて、NIAPの生体内過剰発現がラット
海馬の虚血性損傷を減少させた（Roy他、前掲）。このことは、増加したレベル
のＩＡＰの存在が、虚血に特徴的な望ましくない細胞死を防止できること、そし
てこのＩＡＰのニューロンレベルを上昇させることが、発作の治療に有用である
かもしれないことを示している。

【００１１】 最後に、Stellarと彼の共同研究者らは、抗アポプトシスタンパク質ｐ35の眼
内特異的発現により、色素性網膜炎（ヒトの盲目の一因である）を示したショウ
ジョウバエにおいて網膜細胞死を阻止し且つ視覚機能を有意に保持することがで
きた（Davidson & Stellar, Nature 391:587-591, 1998）。

【００１２】 これらのデータは、抗アポプトシスタンパク質、例えばＩＡＰが、変性したア
ポプトシスによって引き起こされる病気に治療介入する際に使用される、優れた
候補であることを示唆している。

【００１３】 従って、アポプトシスに影響を及ぼすタンパク質を同定しそして特徴づける必
要がある。特に、不適当なアポプトシスに関連した機能不全または疾患を緩和ま
たは修正するために、ＩＡＰが過剰発現され得る癌や慢性ウイルス疾患；並びに
ＩＡＰ欠損が存在し得る神経変性疾患、慢性心不全および機能不全性免疫応答に
おいて使用することができる、既知ＩＡＰに類似した追加のＩＡＰを単離し特徴
づける必要性が存在する。

【００１４】発明の要約 本発明は、新規ヒトアポプトシス阻害剤タンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを提供する。HIAP3と命名されたタンパク質は、BIRドメインとRINGドメイン
のような、アポプトシス阻害剤タンパク質ファミリーに共通した構造的特徴によ
り特徴付けられる。小文字でhiap3と命名されそして図１（配列番号１）に記載
されるポリヌクレオチド配列は、HIAP3と命名されそして図２（配列番号２）に
記載されるアミノ酸配列をコードする。

【００１５】 それらのおよび他の目的に向かって、特に、図２（配列番号２）に記載のアミ
ノ酸配列と別のＩＡＰタンパク質の既知アミノ酸配列との相同性により、新規HI
AP3として同定されたポリペプチドを提供することが本発明の目的である。

【００１６】 更に、HIAP3をコードするポリヌクレオチド、特に本明細書中でHIAP3と称する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することが本発明の別の目的
である。

【００１７】 本発明のこの面によれば、ｍＲＮＡ，ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡを含む、HIAP3
をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、そして本発明のこの面の
別の態様では、生物学上、診断上、臨床上または治療上有用であるそれらの変異
体、類似体もしくは誘導体またはそれらの断片（変異体、類似体および誘導体の
断片を含む）が提供される。

【００１８】 本発明のこの面の特に好ましい態様は、hiap3ポリヌクレオチドの天然の対立
遺伝子変異体である。

【００１９】 新形成、神経変性疾患、免疫疾患、慢性ウイルス感染、または慢性心不全を治
療するために使用できるHIAP3ポリペプチドを提供することも本発明の一目的で
ある。

【００２０】 本発明のこの面によれば、本明細書中HIAP3と呼ばれるヒト起源の新規ポリペ
プチド、並びにそれの生物学上、診断上または治療上有用な断片、変異体および
誘導体、前記断片の変異体および誘導体、並びに前記のものの類似体が提供され
る。

【００２１】 本発明のこの面の特に好ましい態様の１つは、hiap3ポリヌクレオチドの天然
対立遺伝子変異体によりコードされるHIAP3変異体である。

【００２２】 本発明の別の目的は、上述のポリペプチド、ポリペプチド断片、変異体および
誘導体、前記変異体および誘導体の断片、並びに前述のものの類似体を生産する
方法を提供することである。本発明のこの面の好ましい態様では、前記HIAP3ポ
リペプチドの生産方法であって、発現可能な状態で中に外因性由来HIAP3コード
ポリヌクレオチドが取り込まれている宿主細胞を、前記宿主中でヒトHIAP3が発
現される条件下で培養し、次いで発現された前記ポリペプチドを回収することを
含んでなる方法が提供される。

【００２３】 本発明の別の目的によれば、特に研究目的、生物学目的、臨床目的および治療
目的に前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する生成物、組成物、プ
ロセスおよび方法が提供される。

【００２４】 本発明のこの面の或る好ましい態様によれば、中でも特に、HIAP3ポリペプチ
ドまたはHIAP3をコードするｍＲＮＡを測定することにより細胞中のHIAP3発現を
評価するため；hiap3遺伝子中の遺伝子変異および異常、例えば欠陥をアッセイ
するため；およびHIAP3活性レベルを変更するために生物体にHIAP3ポリペプチド
またはHIAP3をコードするポリヌクレオチドを投与するための、生成物、組成物
および方法が提供される。

【００２５】 本発明のこの面および他の面の好ましい態様によれば、hiap3配列にハイブリ
ダイズするプローブが提供される。

【００２６】 本発明のこの面の追加の好ましい態様では、HIAP3ポリペプチドに対する抗体
が提供される。この点で特に好ましい態様では、この抗体はHIAP3に対して高度
に選択的であり、アポプトシスの阻害が強すぎるような状態、例えば癌に関連づ
けられる、増加したHIAP3発現を検出するために診断利用することができる。

【００２７】 本発明の更に別の面では、試験管内の細胞に、生体外の細胞におよび生体内の
細胞に、または多細胞生物に投与するための、hiap3ポリヌクレオチドまたはHIA
P3ポリペプチドを含んでなる組成物が提供される。本発明のこの面の特に好まし
い態様では、該組成物は、病気の治療目的で宿主生物においてHIAP3ポリペプチ
ドを発現させるためにhiap3ポリヌクレオチドを含んでなる。この点で特に好ま
しいのは、HIAP3活性レベルを増加させることにより緩和される病気状態の治療
目的でのヒト患者における発現である。

【００２８】 本発明の更なる面によれば、試験管内の細胞に、生体外の細胞におよび生体内
の細胞に、または多細胞生物に投与するための、hiap3ポリヌクレオチドに相補
的なポリヌクレオチド（すなわちアンチセンスポリヌクレオチド）およびリボザ
イムが提供される。この点で特に好ましいのは、HIAP3活性レベルを減少させる
ことにより緩和される病気状態の治療目的でのヒト患者における発現である。

【００２９】 本発明の別の目的、特徴、利点および観点は、下記の記載から当業者に明白に
なるであろう。しかしながら、下記の記載および具体例は本発明の好ましい態様
を示したものであるけれども、例示目的にのみに与えられる。下記の記載を読む
ことによりまたは本開示の別の部分を読むことにより、本発明の精神および範囲
の中での様々な変更および改良が当業者に容易に明白になるだろう。

【００３０】発明の詳細な説明 定義 本明細書、図面および請求の範囲の中で使用する場合、異なって指定しない限
り、下記の用語は以下に指定する意味を有する。

【００３１】 「HIAP3」は、図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド；それの変異体、類似体、誘導体および断片、並びに前記変異体、類似体およ
び誘導体の断片を指して言う。図２（配列番号２）のポリペプチドに言及すると
きに使用する「断片」、「誘導体」および「類似体」という語は、図２（配列番
号２）のポリペプチドと本質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドを意
味する。

【００３２】 「hiap3」は、図１（配列番号１）に記載の配列を有するポリヌクレオチドお
よび図２（配列番号２）に記載のHIAP3のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド；HIAP3変異体、類似体、誘導体および断片、並び
に前記変異体、類似体および誘導体の断片をコードするポリヌクレオチドを指し
て言う。hiap3は、ＲＮＡから構成されるそのようなポリヌクレオチド、並びに
図２（配列番号２）に記載のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの
相補体であるポリヌクレオチドのことも言う。

【００３３】 「ポリヌクレオチド」とは一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドであり、これは未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修
飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであることができる。例えば、本明細書中で用い
るポリヌクレオチドは、特に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖
領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域と二
本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくは典型的には二本鎖であるかまた
は一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であることができるＤＮＡとＲＮＡとを含ん
でなるハイブリッド分子のことを言う。更に、本明細書中で用いるポリヌクレオ
チドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡを含んでなるかまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含
んでなる三重鎖領域のことも指して言う。そのような領域にある鎖は同一分子か
らのであってもよいし異なる分子からのであってもよい。その領域は１もしくは
複数の分子の全部を含んでも良いが、より典型的には該分子の一領域のみを含む
ことができる。三重らせん領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドであ
る。

【００３４】 本明細書中で用いる時、ポリヌクレオチドという語は１または複数の修飾塩基
を含む上述したようなＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。よって、安定性のためま
たは他の理由のため修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、ここで意図
するような用語「ポリヌクレオチド」である。更に、ここで二例を挙げると、異
常塩基、例えばイノシン、または修飾塩基、例えばトリチウム標識した塩基、を
含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で用いられるような用語のポリヌ
クレオチドである。

【００３５】 当業者に既知である多くの有用な目的に役立つ多種多様な修飾をＤＮＡまたは
ＲＮＡに施せることは明らかであろう。本明細書中で用いるポリヌクレオチドと
いう語は、そのようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾さ
れた形態、並びに特にウイルスおよび細胞（単細胞および多細胞を含む）に特徴
的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態も包含する。

【００３６】 本明細書中で用いる「ポリペプチド」なる語は、下記に記載するポリペプチド
全部を包含する。ポリペプチドの基本構造は周知であり、技術の現状において無
数の参考書および他の刊行物に記載されている。この点で、本明細書中では、ペ
プチド結合によって一本の直鎖状に連結された２以上のアミノ酸を含んでなる任
意のペプチドまたはタンパク質を指すためにこの用語が用いられる。本明細書中
で使用する時は、この用語は、短鎖（当業界では一般に例えばペプチド、オリゴ
ペプチドおよびオリゴマーに対して用いられる）と長鎖（当業界では一般に様々
な種類があるタンパク質に対して用いられる）の両方を指す。

【００３７】 ポリペプチドはしばしば一般に20種類の天然アミノ酸と称される20アミノ酸以
外のアミノ酸を含むことがあり、そして一定のポリペプチドにおいて、末端アミ
ノ酸を含む多くのアミノ酸が、グリコシル化や他の翻訳後修飾のような自然過程
により、または当業界で周知である化学修飾技術により、修飾可能であることは
理解されるだろう。ポリペプチド中に天然に存在する普通の修飾は数が多すぎる
のでここに全て列挙することはできないけれども、それらは基本的参考書、より
詳細な研究論文、および大部の学術文献に十分記載されており、それらは当業者
に周知である。本発明のポリペプチド中に存在することができる既知修飾のうち
、数例を挙げると、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フ
ラビンの共有結合付着、ヘム成分の共有結合付着、ポリヌクレオチドもしくはポ
リヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合付着
、ホスファチジルイノシトールの共有結合付着、架橋形成、環状化、ジスルフィ
ド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸
の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリケーション、グリコシル化、Ｇ
ＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸
化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイ
ル化、硫酸化、転移ＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加、例
えばアルギニル化およびユビキチン化がある。

【００３８】 そのような修飾は当業者に周知であり、且つ科学文献中に詳細に記載されてい
る。特に一般的な幾つかの修飾、例えばグリコシル化、脂質付着、硫酸化、グル
タミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化
は、大部分の基本参考書、例えばI.E. Creighton, Proteins-Structure and Mol
ecular Properties, 第２版, W.H. Freeman and Company, New York, 1993に記
載されている。この題材で多くの詳細な解説書が入手可能であり、例えばWold,
F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson編,
Academic Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifter他, Meth. Enzymol. 182:
626-646, 1990; および Rattan他, Protein Synthesis: Posttranslational Mod
ifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci 663:48-62, 1992により提供され
たものが入手可能である。

【００３９】 周知の通りそして上述した通り、ポリペプチドは常に完全に直鎖状であるわけ
ではないことは認識されよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果とし
て分岐していてもよく、そして自然のプロセシング現象および自然には起こらな
い人間の操作によって引き起こされる現象を包含する翻訳後現象の結果として、
分岐のあるまたは分岐のない環状ポリペプチドであってもよい。環状、分岐状お
よび分岐環状ポリペプチドは、非翻訳自然工程により合成することができ、また
完全に合成的な手法によって合成することもできる。

【００４０】 修飾は、ポリペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシ末
端をはじめとする、ポリペプチド中のいずれの場所でも起こることができる。実
際、共有結合的修飾によるポリペプチド中のアミノ基もしくはカルボキシル基ま
たはその両方のブロックは天然および合成ポリペプチドにおいて一般的であり、
そのような修飾は本発明のポリペプチド中にも同様に存在することが可能である
。例えば、Ｅ．コリ中で生産されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク
質プロセシング前は、ほとんど常にＮ−ホルミルメチオニンであろう。

【００４１】 ポリペプチド中に生じる修飾は、それがどのように生産されるかにより変化す
るものである。例えば、宿主中でクローン化遺伝子を発現させることによって生
産されたポリペプチドの場合、大部分の修飾の性質および程度は、宿主細胞の翻
訳後修飾能力とポリペプチドアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルによって決
定されるだろう。例えば、周知のように、グリコシル化はしばしばＥ．コリのよ
うな細菌宿主中では起こらない。従って、グリコシル化を所望するなら、グリコ
シル化宿主、通常は真核細胞中でポリペプチドを発現させるべきである。昆虫細
胞はしばしば哺乳類細胞と同じ翻訳後グリコシル化を行うので、この理由から、
特に生来のグリコシル化パターンを有する哺乳類タンパク質を効率的に発現させ
るために昆虫細胞系が開発されている。同様な考慮すべき点は別の修飾にも当て
はまる。

【００４２】 ある一つのポリペプチド中の複数位置に同じまたは異なる程度に同じタイプの
修飾が存在してもよいことは理解されるだろう。また、一定のポリペプチドが複
数タイプの修飾を含んでもよい。

【００４３】 一般に、本明細書中で用いるポリペプチドという語は、そのような修飾の全て
を包含し、特に宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させることによって合成さ
れたポリペプチド中に存在するものを包含する。

【００４４】 本明細書中で用いる「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本発
明のポリペプチド、特に図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するHIAP
3、をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語は、ポリペ
プチドをコードする単一連続領域または不連続領域（例えばイントロンにより中
断されたもの）と共に追加の領域を含むポリヌクレオチドを包含する。

【００４５】 「生物活性」は、天然のHIAP3の生物活性および／または免疫活性を言う。

【００４６】 「オリゴヌクレオチド」は比較的短いポリヌクレオチドを指して言う。この用
語はしばしば一本鎖デオキシリボヌクレオチドを指すが、特に一本鎖または二本
鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡにも同様
に用いることができる。オリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡプローブオリ
ゴヌクレオチドは、しばしば化学的方法、例えば自動オリゴヌクレオチド合成装
置上で実行される方法により合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは
様々な別の方法、例えば試験管内組換えＤＮＡ媒介技術により、並びに細胞や生
物体中でのＤＮＡの発現により、製造することができる。「オリゴヌクレオチド
」または「オリゴマー」またはポリヌクレオチド「断片」、「部分」もしくは「
セグメント」とは、少なくとも約10ヌクレオチドで且つ多くても約60ヌクレオチ
ド、好ましくは約15〜30ヌクレオチド、より好ましくは約20〜25ヌクレオチドの
ポリヌクレオチド配列を指して言う。

【００４７】 「天然のHIAP3」とは、遺伝子操作されていないヒト細胞により生産されるHIA
P3を指し、具体的にはポリペプチドの翻訳後修飾（非限定的にアセチル化、カル
ボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピド化およびアシル化が挙げられる）
から生じる様々なHIAP3形態を包含する。

【００４８】 本明細書中で用いるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「変異体」とは、
それぞれ参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なっているポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドである。この意味での変異体は下記および本開示中の
どこかに詳細に記載されている。

【００４９】 (1) 別の参照ポリヌクレオチドとはポリヌクレオチド配列が異なっているポリ
ヌクレオチド。一般に、その相違は、参照体と変異体のポリヌクレオチド配列が
全体的に非常に類似しており、且つ多くの領域では同一であるように限定される
。

【００５０】 後述するように、変異体のポリヌクレオチド配列中の変更はサイレントであっ
てもよい。すなわち、それらの変更はポリヌクレオチドによりコードされるアミ
ノ酸を変更しなくてもよい。変更がこの種のサイレント変異に限定される場合、
変異体は参照体と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするだろう。
同じく後述するように、変異体のポリヌクレオチド配列中の変更は、参照ポリヌ
クレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更してもよい。
後述するように、そのようなポリヌクレオチド変更は、結果として参照配列によ
りコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合および先
端の切除をもたらし得る。

【００５１】 (2) 別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なっているポリペプチド。一
般に、その相違は、参照体と変異体のアミノ酸配列が全体的に非常に類似してお
り、且つ多くの領域では同一であるように限定される。変異ポリペプチドと参照
ポリペプチドとは１または複数の置換、付加、欠失、融合および先端切除により
アミノ酸配列が異なることができ、それらは任意の組合せで存在することができ
る。それらの同一または類似ポリペプチドをコードする組換え変異体は、合成す
るかまたは遺伝暗号の「重複性」を利用して選択することができる。様々なコド
ン置換、例えば様々な制限部位を生成するサイレント変異を導入することにより
、プラスミドもしくはウイルスベクター中へのクローニング、または特定の原核
もしくは真核系における発現を最適化することができる。ポリペプチドの性質を
変更するため、リガンド結合親和力、鎖間親和力、またはポリペプチド分解速度
もしくは代謝回転速度を変更するために変異を導入することもできる。

【００５２】 「対立遺伝子変異体」とは、hiap3ポリヌクレオチドの別形態を言う。対立遺
伝子は突然変異、すなわちポリヌクレオチド配列の変化から生じ、そして一般に
構造もしくは機能が変更されているかまたは未変更である変形ｍＲＮＡまたはポ
リペプチドを生成する。与えられた遺伝子は１つも対立遺伝子形を持たないかま
たは１つもしくは複数の対立遺伝子形を有することができる。対立遺伝子をもた
らす一般的な突然変異は、ヌクレオチドの自然欠失、付加または置換に帰するこ
とができる。それらの種類の変形は各々単独でもしくは他のものと一緒に存在す
ることができ、または１つの配列中に１回もしくは複数回存在することができる
。

【００５３】 「誘導体」とは、化学的修飾、例えばユビキチン化、標識（例えば放射性核種
による標識、様々な酵素的修飾による標識）、peg化（ポリエチレングリコール
による誘導体化）、またはヒトタンパク質中に通常は存在しないオルニチンのよ
うなアミノ酸の挿入もしくは置換（またはそのようなアミノ酸をコードするヌク
レオチドの置換）により、それぞれhiap3またはHIAP3から誘導されるポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドのことを指して言う。

【００５４】 「欠失」とは、それぞれ１もしくは複数のポリヌクレオチドまたはアミノ酸残
基が欠損しているポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変更として定義される
。

【００５５】 「挿入」または［付加」とは、天然のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に
比較したとき、それぞれ１もしくは複数のポリヌクレオチドまたはアミノ酸残基
の付加を生じるようなポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変更である。

【００５６】 「置換」とは、それぞれ異なるポリヌクレオチドまたはアミノ酸による１また
は複数のポリヌクレオチドまたはアミノ酸の置換から生じる。

【００５７】 好ましくは、アミノ酸置換は、類似の構造および／または化学的性質を有する
別のアミノ酸による１アミノ酸の置換、例えばイソロイシンもしくはバリンによ
るロイシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換またはセリンによ
るスレオニンの置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果である。挿入または欠
失は典型的には約１〜５アミノ酸の範囲である。許容される変量は、組換えＤＮ
Ａ技術を使ってポリペプチド中に系統的にアミノ酸の挿入、欠失または置換を作
成し、結果として生じた組換え変異体を活性についてアッセイすることにより実
験的に決定することができる。

【００５８】 ポリペプチド「断片」、［部分」または「セグメント」は、少なくとも約５ア
ミノ酸、しばしば少なくとも約７アミノ酸、典型的には少なくとも約９〜13アミ
ノ酸、種々の態様では少なくとも約17またはそれ以上のアミノ酸のアミノ酸残基
の連続鎖である。

【００５９】 「組換え体」または「組換えＤＮＡ分子」とは、天然に存在しないか、または
別の状況では分離されている２つの配列セグメントの人工的組合せによって作製
されたポリペプチド配列のことを指して言う。「組換え生産されたもの」とは、
化学合成手段かまたはポリヌクレオチドの単離されたセグメントの人工的操作（
例えば遺伝子操作技術）のいずれかによってしばしば達成される人工的組合せを
意味する。そのような操作は、普通、同一アミノ酸または保存的アミノ酸をコー
ドする縮重コドンにより或る１コドンを置換する一方で典型的には配列認識部位
を導入または削除するために利用される。あるいは、そのような操作は、ポリヌ
クレオチドセグメントを所望の機能と結合させて普通の天然形態では認められな
い所望の機能の組合せを含んでなる単一遺伝物質を作製するために行われる。制
限酵素認識部位、調節配列、制御配列、または他の有用な特徴を設計により組み
込むことができる。「組換えＤＮＡ分子」はクローニングベクターおよび発現ベ
クターを包含する。「組換え」は、ポリペプチドをコードしており且つ組換えＤ
ＮＡ技術によって調製されるポリヌクレオチドについても用いられる。

【００６０】 「単離された」とは、それの天然状態から「人の手によって」変更されたこと
、すなわちそれが天然に存在する場合、元の環境から変更されもしくは取り出さ
れているかまたはその両方であることを意味する。例えば、それの生来の状態で
生存動物中に天然に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本
明細書中で使用する意味によれば「単離」されていないが、生来の状態では共存
している材料から分離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、
本明細書中で使用する意味によれば「単離」されている。例えば、ポリヌクレオ
チドに関しては、単離されたという用語は、それが天然に存在する染色体または
細胞から分離されていることを意味する。ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は、例えば組成物、例えば培地配合物、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを
例えば細胞に導入するための溶液、化学的または酵素的反応のための組成物また
は溶液、例えば天然の組成物ではなく、本明細書中で用いる用語の意味の範囲内
で単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドのままである組成物、の中に
存在してもよい。

【００６１】 「実質的に純粋」および「実質的に均一」という語は相互交換可能に用いられ
、そしてHIAP3ポリペプチドまたはＤＮＡ分子が天然にはそれに付随している成
分から分離されているようなHIAP3ポリペプチドもしくはその断片、またはそれ
らをコードするＤＮＡセグメントを表す。HIAP3ポリペプチドもしくはその断片
またはそれらをコードするＤＮＡセグメントは、生来の状態ではそれに付随する
生来の汚染物（夾雑物）から分離されている場合、天然関連成分（naturally-as
sociated components）を実質的に含有しないであろう。同様に、化学的に合成
されたポリヌクレオチドまたはそれが天然に得られる細胞とは異なる細胞系にお
いて合成されたポリヌクレオチドは、それの天然関連成分を実質的に含有しない
であろう。

【００６２】 ポリヌクレオチドを説明するのに使う場合の「相同」とは、最適に整列させて
比較した時に、２つのポリヌクレオチドまたはそれを称する配列が、適当なヌク
レオチド挿入または欠失を有しながらも、ヌクレオチドの少なくとも70％、普通
は約75％〜99％、より好ましくは少なくとも約98〜99％が同一であることを意味
する。

【００６３】 「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、1987年７月28日に発行の米
国特許第4,683,195号明細書中に記載されたようなＤＮＡの特定断片を増幅する
手順を指す。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインできるように、
着目のポリペプチド断片の末端からのまたはそれ以上の配列情報を利用可能にす
る必要がある。それらのプライマーは互いに向き合っており、増幅させるべき鋳
型の逆鎖の配列と配列が同一または類似しているだろう。２つのプライマーの５
′末端ヌクレオチドは増幅された材料の末端と一致するだろう。ＰＣＲは全ゲノ
ムＤＮＡ、全細胞性ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、プラスミド配列などから特
定のＤＮＡ配列を増幅させるのに用いることができる（一般的にはMullis他, Co
ld Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich編, PCR Technol
ogy, Stockton Press, NY, 1989を参照のこと）。

【００６４】 「緊縮性」は、典型的には約Ｔ_m（融解温度）−５℃（プローブのＴ_mより５℃
下）からＴ_mより約20℃〜25℃下までの範囲内で発生する。当業者が理解するよ
うに、同一のポリヌクレオチド配列を同定または検出するためか、あるいは類似
のまたは関連したポリヌクレオチド配列を同定または検出するために、緊縮性ハ
イブリダイゼーションを用いることができる。本明細書中で用いる時、「緊縮条
件」とは、配列間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性が存在
する場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。

【００６５】 本明細書中で用いる「ハイブリダイゼーション」は、「塩基対合を通してポリ
ヌクレオチド鎖が相補鎖と結合する任意の過程」（Coombs, J., Dictionary of
Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994）を含むだろう。

【００６６】 「治療的有効量」とは、病気状態の症状または状態を緩和する、ポリペプチド
もしくはその抗体、拮抗剤、阻害剤（アンチセンス分子とリボザイムを包含する
）の量を指して言う。そのような化合物の治療効力と毒性は、細胞培養または実
験動物における標準的薬学手順により、例えばＥＤ₅₀(母集団の50％に治療的有
効である用量）およびＬＤ₅₀（母集団の50％に致死的である用量）により決定す
ることができる。治療効果と毒性効果の用量比は治療指数であり、それはＥＤ₅₀ ／ＬＤ₅₀比として表すことができる。

【００６７】 本明細書中で用いる「治療」または「処置」は、ヒト患者における病気状態の
治療を包含し、ここで病気状態は不適当なアポプトシスに関連があり、患者のHI
AP3レベルの低下が必要である病気状態と、患者のHIAP3レベルの増加が必要であ
る病気状態の両方の病気状態を包含する。

【００６８】発明の具体的説明 本発明は、特に下記に詳述するような新規HIAP3ポリペプチドおよびhiap3ポリ
ヌクレオチドに関する。特に、本発明は、新規HIAP3ポリペプチドおよびそれら
のHIAP3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、特に図２（配列番
号２）に記載のアミノ酸配列を有するHIAP3および図１（配列番号１）に記載の
ポリヌクレオチド配列を有するhiap3に関する。本発明はHIAP3変異体も包含する
。好ましいHIAP3変異体は、図２（配列番号２）に示されるポリペプチド配列に
対して少なくとも70％の相同性（好ましくは少なくとも70％の同一性）、より好
ましくは図２（配列番号２）に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも90
％の相同性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）、更により好ましくは図
２（配列番号２）に示されるポリペプチド配列に対して少なくとも95％の相同性
（更により好ましくは少なくとも95％の同一性）を有するものも包含し、またそ
のようなポリペプチドの一部分も包含する。ここでそのようなポリペプチドの一
部分は、通常は少なくとも30アミノ酸、より好ましくは少なくとも50アミノ酸を
含有する。

【００６９】 HIAP3の一部分をコードするポリヌクレオチド配列は、Genetic Computer Grou
pパッケージ（Oxford Molecular Group, Campbell, CA.）のBLASTデータベース
検索プログラムとIAPのBIRドメインのポリペプチド共通配列を使ったIncyte EST
データベースの分析に基づいて、最初に226 bp EST（expressed sequence tag;
Incyte クローン #1419118）として同定された。選択されたEST配列は、57アミ
ノ酸の連続鎖を有するHIAP1のBIRドメインと42％の同一性を示した。全長ｃＤＮ
Ａは、胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリー上で３′および５′RACE（rapid amplific
ation of cDNA end）技術を使って得られた配列と最初のEST配列を集成し、次い
でGCGパッケージの集成プログラムを使うことによって得られた。データベース
検索（公開データベースとIncyteデータベースの両方）は、ポリヌクレオチド配
列の５′末端を含むIncyte EST（クローン #2953985）を同定した。このクロー
ンを入手しそして配列決定した。

【００７０】 hiap3と称するｃＤＮＡ配列（配列番号１）は1337塩基対を含む。コード領域
に隣接する５′非翻訳領域に169 bpがありそして３′非翻訳領域に274 bpがある
（図１参照）。コード領域は298アミノ酸残基の転写解読枠を有する894ヌクレオ
チドから成る。開始コドンＡＴＧはヌクレオチド位置170に位置する。GCGパッケ
ージのScanProsite 特色を使った推定ポリペプチド配列の分析は、アミノ酸位置
88〜155の単一のBIRドメインと、アミノ酸位置240〜289の単一のRING亜鉛フィン
ガードメインを明らかにする。

【００７１】 本発明は、図４および５に示すようなHIAP3とIAPタンパク質ファミリーの別メ
ンバーの間のBIRドメインとRINGドメインについての構造的相同性に一部基づい
ている。HIAP3のBIRドメインとヒトまたはマウスのIAP1またはIAP2のいずれかの
第三BIRドメインとの間には約50％の同一性がある。HIAP3とHIAP1のRINGドメイ
ンには74％の同一性がある。積み重ね（Pile up）分析は、HIAP3をコードするポ
リヌクレオチドが主に胎盤、リンパ節、胎児腎臓、腎臓癌において発現され、他
の全ての既知IAPとは異なる組織パターン分布を与えることを示した。

【００７２】 ポリヌクレオチド 本発明の一観点によれば、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するHI
AP3ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。

【００７３】 本明細書中に提供する情報、例えば図１（配列番号１）に記載のポリヌクレオ
チド配列を使って、標準クローニングおよびスクリーニング技術、例えば出発物
質としてヒト組織の細胞由来のｍＲＮＡを使ってｃＤＮＡをクローニングする技
術を利用して、HIAP3ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを得
ることができる。本発明の代表である図１（配列番号１）のポリヌクレオチド配
列は、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリーにおいて見つかった。

【００７４】 本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの形であってもよく、
またはＤＮＡ、例えばクローニングにより得られたもしくは化学合成技術により
製造されたまたはその組合せにより得られたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの形で
あってもよい。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡはセンス鎖と
しても知られるコード鎖であってもよく、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非
コード鎖であってもよい。

【００７５】 ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）に記載のポリヌ
クレオチド配列のコード配列と同一であることができる。また、遺伝暗号の重複
性（縮重）の結果として、図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする異な
る配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。

【００７６】 図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドと
しては、非限定的に、成熟ポリペプチドのコード配列それ自体；成熟ポリペプチ
ドのコード配列と追加のコード配列、例えばリーダーまたは分泌配列、例えばプ
レ−、プロ−、プレプロ−タンパク質配列をコードするもの；上述の追加のコー
ド配列を伴うかまたは伴わない成熟ポリペプチドのコード配列と、追加の非コー
ド配列、例えば非限定的にイントロン並びに非コード５′および３′配列、例え
ば転写、ｍＲＮＡプロセシング（例えばスプライシングとポリアデニル化シグナ
ルが挙げられる）、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定化に役割を果たす、転
写されるが翻訳されない配列；追加のアミノ酸、例えば追加の官能基を提供する
ものをコードする追加のコード配列、が挙げられる。例えば、ポリペプチドはマ
ーカー配列、例えば融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドに融合されても
よい。本発明のこの面で好ましい態様では、マーカー配列が例えばヘキサヒスチ
ジンペプチド（多くが市販されている）、例えば特にpcDNA3.1Myc-Hisベクター
（Invitrogen, Carlsberg, CA）中に提供された標識である。Gentz他（Proc. Na
tl Acad. Sci. USA 86:821-824, 1989）に記載されているように、ヘキサヒスチ
ジンは融合タンパク質の好都合な精製に備える。例えばWilson他（Cell 37:767,
1984）により記載されているＨＡ標識は、インフルエンザ血球凝集素タンパク
質から誘導されるエピトープに相当する。

【００７７】 本発明は更に、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド
の断片、類似体および誘導体をコードする、前記ポリヌクレオチドの変異体に関
する。該ポリペプチドの変異体は天然変異体、例えば天然の対立遺伝子変異体で
あってもよく、または天然に存在することが知られていない変異体であってもよ
い。そのようなポリヌクレオチドの非天然型変異体は、突然変異誘発技術（ポリ
ヌクレオチド、細胞または生物体に適用される技術を含む）により作製すること
ができる。

【００７８】 この点で特に挙げられる変異体は、ポリヌクレオチド置換、欠失または付加に
より前記ポリヌクレオチドとは異なっている変異体である。置換、欠失または付
加には１または複数のポリヌクレオチドが関与することができる。変異体はコー
ド領域もしくは非コード領域またはその両方において異なることができる。コー
ド領域中の変更は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加をもた
らし得る。

【００７９】 この点での本発明の特に好ましい態様は、中でも、図２（配列番号２）に記載
のHIAP3のアミノ酸配列を有するポリペプチド；それの変異体、類似体、誘導体
および断片；並びに前記変異体、類似体および誘導体の断片をコードするポリヌ
クレオチドである。

【００８０】 この点で更に特に好ましいのは、HIAP3変異体、類似体、誘導体および断片、
並びに前記断片の変異体、類似体および誘導体をコードするポリヌクレオチドで
あり、それらは数個、５〜10個、１〜５個、１〜３個、２個、１個または０個の
アミノ酸残基が任意の組合せにおいて置換、欠失または付加されている。それら
のうち特に好ましいのは、HIAP3ポリペプチドの性質と活性を変更しないサイレ
ント置換、付加または欠失である。保存的置換もこの点で特に好ましい。最も好
ましいのは、置換を含まない図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドである。

【００８１】 本発明の更に好ましい態様は、図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有
するHIAP3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも70％同一で
あるポリヌクレオチド、およびそのようなヌクレオチドに相補的であるポリヌク
レオチドである。あるいは、HIAP3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に少なくとも80％同一である領域を含んでなるポリヌクレオチド、およびそれに
相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。この点では、前記のものに少なくと
も90％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、そしてそれらの特に好まし
いポリヌクレオチドの中でも少なくとも95％を有するものが特に好ましい。更に
、少なくとも95％を有するものの中でも少なくとも97％を有するものが非常に好
ましく、そしてそれらの中でも特に少なくとも98％および少なくとも99％を有す
るものが特に非常に好ましく、少なくとも99％を有するものの方がより好ましい
。

【００８２】 この点で特に好ましい態様は、図１（配列番号１）のポリヌクレオチド配列に
よりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物活性を保持しているポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

【００８３】 本発明は更に、上述した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する
。この点で、本発明は特に、緊縮条件下で上記ポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。「緊縮条件」という語は、本明細書中で用い
る時、配列間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性があるとき
にのみ、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。

【００８４】 本明細書中で更に本発明のポリヌクレオチドに関して論じるとき、例えば上述
したような本発明のポリヌクレオチドは、HIAP3をコードする全長ｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離するため並びにhiap3遺伝子に対して高度の配列相同性
を別遺伝子のｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離するための、ｃＤＮ
ＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして用いることが
できる。そのようなプローブは通常は少なくとも15塩基を含んでなるだろう。好
ましくは、そのようなプローブは少なくとも30塩基を有し、少なくとも50塩基を
有してもよい。特に好ましいプローブは、少なくとも30塩基を有し且つ50塩基以
下を有するだろう。

【００８５】 例えば、hiap3遺伝子のコード領域は、既知ＤＮＡ配列を使ってスクリーニン
グしてオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより単離することができる
。次いで、本発明のポリペプチドの配列と相補的な配列を有する標識オリゴヌク
レオチドを使ってヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーを
スクリーニングすることにより、該ライブラリーのどの構成員に該プローブがハ
イブリダイズするかを調べることができる。

【００８６】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、特にポリヌクレオチドアッ
セイに関して本明細書中に記載するように、ヒト疾患に対する検査薬として並び
に治療および診断法の開発のための材料として使用することができる。

【００８７】 ポリヌクレオチドは成熟タンパク質と追加のアミノ末端もしくはカルボキシ末
端アミノ酸であるポリペプチド、または成熟ポリペプチドの内部のアミノ酸（例
えば成熟形態が複数のポリペプチド鎖を有する場合）であるポリペプチドをコー
ドすることができる。そのような配列は特に、前駆体形から成熟形へのタンパク
質のプロセシングにおいて役割を果たすか、タンパク質の輸送を促進するか、タ
ンパク質半減期を延長または短縮するか、またはアッセイもしくは生産のための
タンパク質の操作を容易にすることができる。通常in situでよくあることだが
、細胞性酵素によって成熟アミノ酸から追加のアミノ酸をプロセシングにより除
去することができる。

【００８８】 １または複数のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆体タ
ンパク質は、該ポリペプチドの不活性形態であるかもしれない。通常はプロ配列
が除去されると、そのような不活性前駆体は活性化される。活性化前にプロ配列
の一部分または全部が除去されてもよい。通常、そのような前駆体はプロタンパ
ク質と呼ばれる。

【００８９】 要約すると、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質
＋リーダー配列（プレタンパク質と称することができる）、プレタンパク質のリ
ーダー配列ではない１もしくは複数のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体
、またはリーダー配列と１もしくは複数のプロ配列（これらはポリペプチドの活
性成熟形態を生成するプロセシング過程の間に除去される）を有する、プロタン
パク質前駆体であるプレプロタンパク質をコードすることができる。

【００９０】 ポリペプチド 本発明は更に、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するHIAP3ポリペ
プチドに関する。

【００９１】 本発明はまた、それらのポリペプチドの断片、類似体および誘導体にも関する
。図２（配列番号２）のポリペプチドに言及する場合の断片、誘導体および類似
体という語は、そのようなポリペプチドと本質的に同じ生物活性を保持している
ポリペプチドを意味する。よって、類似体には、プロタンパク質部分の開裂によ
って活性化されて活性成熟ポリペプチドを生成しうるプロタンパク質が含まれる
。

【００９２】 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成
ポリペプチドであることができる。或る好ましい態様では、それは組換えポリペ
プチドである。

【００９３】 図２（配列番号２）のポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、(i) １ま
たは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存
的アミノ酸残基）により置換されており、そしてそのような置換アミノ酸残基が
遺伝暗号によりコードされるものであってもされなくてもよいもの、あるいは(i
i) １または複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii) 成熟ポリ
ペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例え
ばポリエチレングリコール）と融合されているもの、あるいは(iv) 追加のアミ
ノ酸、例えばリーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロ
タンパク質の精製に使われる配列が成熟ポリペプチドに融合されているもの、で
あることができる。そのような断片、誘導体および類似体は、本明細書中の技術
から当業者の範囲内にあると思われる。

【００９４】 この点で本発明の特に好ましい態様の中には、図２（配列番号２）に記載のHI
AP3のアミノ酸配列、それの変異体、類似体、誘導体および断片、並びにそれら
の断片の変異体、類似体および誘導体がある。あるいは、この点で特に好ましい
態様は、図２（配列番号２）に記載のHIAP3のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド、それの変異体、類似体、誘導体および断片、並びに前記断片の変異体。類似
体および誘導体である。

【００９５】 中でも特に好ましい変異体は、保存的アミノ酸置換により比較参照物から異な
っているものである。そのような置換は、類似した性質を有する別アミノ酸によ
ってポリペプチド中の一定アミノ酸を置換するものである。保存的置換として典
型的に観察されるのは、脂肪族アミノ酸 Ala, Val, LeuおよびIleの中での互い
の置換、SerとThrヒドロキシル残基の相互置換、酸性残基 AspとGluの置換、ア
ミド残基 AsnとGlu間の置換、塩基性残基LysとArgの置換、芳香族残基PheとTyr
の間の置換である。

【００９６】 この点で更に特に好ましいのは、数個、少数、５〜10個、１〜５個、１〜３個
、２個、１個もしくは０個のアミノ酸残基が任意の組合せにおいて置換、欠失ま
たは付加されている図２のHIAP3ポリペプチドのアミノ酸配列を有する変異体、
類似体、誘導体および断片、並びにそれらの断片の変異体、類似体および誘導体
である。それらの中で特に好ましいのは、HIAP3の性質と活性を変更しないサイ
レント置換、付加および欠失である。この点で、保存的置換も特に好ましい。最
も高度に好ましいのは、置換のない図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドである。

【００９７】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態
、好ましくは均一に精製された形態で提供される。

【００９８】 本発明のポリペプチドは、図２（配列番号２）のポリペプチド（特に成熟ポリ
ペプチド）並びに図２（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも70％の
相同性（好ましくは少なくとも70％の同一性）を有するポリペプチド、より好ま
しくは図２（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも90％の相同性（好
ましくは少なくとも90％の同一性）を有するポリペプチド、更により好ましくは
図２（配列番号２）のポリペプチドに対して少なくとも95％の相同性（好ましく
は少なくとも95％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、前記ポリペプチド
の部分も更に包含する。そのようなポリペプチドの部分は少なくとも30アミノ酸
、より好ましくは少なくとも50アミノ酸を含有する。

【００９９】 当業界で既知である通り、２つのポリペプチド間の「相同性」は、一方のポリ
ペプチドのアミノ酸配列とそれの保存的アミノ酸置換を、もう一方のポリペプチ
ドの配列と比較することにより決定される。

【０１００】 本発明のポリペプチドの断片または部分は、ペプチド合成によって対応する全
長ポリペプチドを製造するのに使用することができ；従って、それらの断片は全
長ポリペプチドを製造する際の中間体として使用することができる。本発明のポ
リヌクレオチドの断片または部分は本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するた
めに使用することができる。

【０１０１】 断片 本発明のこの面の好ましい態様は、HIAP3の断片を含んでなるポリペプチド、
最も特別には図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するHIAP3の断片、
並びに図２（配列番号２）のHIAP3の変異体および誘導体の断片である。

【０１０２】 この点で、断片は、上述のHIAP3ポリペプチドおよびそれの変異体または誘導
体のアミノ酸配列の一部であって全部ではない完全に同じであるアミノ酸配列を
有するポリペプチドである。

【０１０３】 そのような断片は「独立している」、すなわち他のアミノ酸もしくはポリペプ
チドの一部でないかまたはそれに融合しておらず、あるいはそれらが一部分もし
くは一領域を構成している更に大きなポリペプチドの中に含まれていてもよい。
更に大きなポリペプチドの中に含まれる場合、ここで論じる断片が１つの連続し
た領域を構成しているのが最も好ましい。しかしながら、複数の断片が１つの大
きなポリペプチドの中に含まれてもよい。例えば、或る好ましい態様は、HIAP3
断片のアミノ末端に融合された非相同プレもしくはプロポリペプチド領域と該断
片のカルボキシ末端に融合された追加の領域とを有する宿主中での発現用にデザ
インされた前駆体ポリペプチドの中に含まれる、HIAP3ポリペプチドの断片に関
する。従って、この中で意図する意味の一面における断片とは、HIAP3に由来す
る融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の一部分もしくは複数部分を指して言
う。

【０１０４】 本発明のポリペプチド断片の代表例として、約25〜約145アミノ酸を有するも
のを挙げることができる。

【０１０５】 この状況で「約」という語は、具体的に列挙した１または複数の範囲が、一極
端または両極端において数個、少数個、５，４，３，２または１個のアミノ酸の
分だけ大きいかまたは小さいことを意味する。例えば、このような状況での約25
〜約145アミノ酸とは、25±数アミノ酸、少数アミノ酸、５，４，３，２もしく
は１アミノ酸残基から145±数アミノ酸、少数アミノ酸、５，４，３，２もしく
は１アミノ酸残基までの範囲、すなわち25−数アミノ酸〜145＋数アミノ酸ほど
の広い範囲から、25＋数アミノ酸〜145−数アミノ酸ほどの狭い範囲までに及ぶ
、ポリペプチド断片の具体的に列挙した１または複数の範囲を包含する。

【０１０６】 この点で特に好ましいのは、指摘した一極端または両極端において、指摘の範
囲±５アミノ酸である。特に非常に好ましいのは、指摘した一極端または両極端
において、列挙した範囲±３アミノ酸である。特に非常に好ましいのは、一極端
または両極端において、付加や欠失を伴わないで列挙した範囲±１アミノ酸残基
ほどである。この点で中でも最も好ましいのは約25〜約145アミノ酸の断片であ
る。

【０１０７】 本発明の特に好ましい断片は、中でもHIAP3の尖断（truncation）変異体であ
る。尖断変異体としては、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するHIAP3ポ
リペプチド、それの変異体もしくは誘導体の変異体であって、ただし、アミノ末
端を含む一連の残基（すなわち、連続領域、部分または一部分）の欠失、または
カルボキシ末端を含む一連の残基の欠失、または二重尖断変異体の場合には、２
系列の連続残基（１つがアミノ末端を含みそしてもう１つがカルボキシ末端を含
む）の欠失を除く変異体が挙げられる。上記に列挙したサイズ範囲を有する断片
も尖断断片の好ましい態様であり、これは断片の中でも一般的に特に好ましい。

【０１０８】 本発明のこの面で同じく好ましいのは、HIAP3の構造的または機能的特性によ
り特徴付けられる断片である。最も好ましいのは、BIRおよびＣ末端RING亜鉛フ
ィンガードメインを含有する断片である。

【０１０９】 これらの点で幾つかの好ましい領域が図３に与えられ、それは非限定的に、図
２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列の分析により同定された上記種類の領域
を包含する。図３に提示したように、そのような好ましい領域としてはBIRドメ
インおよびＣ末端RING亜鉛フィンガードメインが挙げられる。

【０１１０】 この点で中でも非常に好ましい断片は、複数の構造的特徴、例えば上記に挙げ
たような特徴のうちの複数を組み合わせたHIAP3の領域を含んでなるものである
。この点で、IAPタンパク質ファミリーに特徴的である、図２（配列番号２）の
それぞれ約88〜155と約240〜289アミノ酸残基により限定されるBIRドメインとRI
NGドメインが、特に非常に好ましい領域である。そのような領域は、上述した通
り、より大きいポリペプチドの中に含まれていてもよく、またはそれ自体が本発
明の好ましい断片であってもよい。この段落で使用する用語「約」は、一般的な
断片に関して上に示した意味を有すると認識されるだろう。

【０１１１】 更に好ましい領域はHIAP3の活性を媒介するものである。この点で最も好まし
いのは、HIAP3の化学的、生物学的または他の活性を有する断片、例えば類似活
性もしくは向上した活性を有するもの、または望ましくない活性が削減されてい
るものである。この点で非常に好ましいのは、関連ポリペプチド（例えばHIAP3
を含むIAPファミリーのその他のタンパク質）の活性領域に対して配列、位置、
または配列と位置の両方が相同である領域を含む断片である。

【０１１２】 本発明は、中でも、前記断片をコードするポリヌクレオチド、前記断片をコー
ドするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、特に緊縮条件
下でハイブリダイズするもの、および前記断片をコードするポリヌクレオチドを
増幅せしめるためのポリヌクレオチド（例えばＰＣＲプライマー）にも関する。
それらの点で好ましいポリヌクレオチドは、上記で論じた好ましい断片に相当す
るものである。

【０１１３】 ベクター、宿主細胞および発現系 本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明のベクター
によって遺伝子操作されている宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリ
ペプチドの生産方法にも関する。そのような技術はSambrook他、Molecular Clon
ing, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 198
9およびAusubel, F.M.他、Current Protocols in Molecular Biology, John Wil
ey & Sons, New York, N.Y., 1989中に記載されている。

【０１１４】 宿主細胞を遺伝子操作して本発明のポリヌクレオチドを導入しそして本発明の
ポリペプチドを発現させることができる。例えば、感染、形質導入、トランスフ
ェクション、トランスベクションおよび形質転換の周知技術を使って、宿主細胞
中にポリヌクレオチドを導入することができる。本発明のポリヌクレオチドは単
独でまたは別のポリヌクレオチドと一緒に導入することができる。そのような別
のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドとは独立に導入するか、同時
に導入するか、または連結して導入することができる。

【０１１５】 例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば哺乳類細胞における同時トラン
スフェクションと選択のための標準技術を用いて、選択マーカーをコードする他
の別個のポリヌクレオチドと一緒に宿主細胞中に導入することができる。この場
合、ポリヌクレオチドは通常は宿主細胞ゲノム中に安定的に組み込まれるだろう
。

【０１１６】 あるいは、ポリヌクレオチドは宿主中での増殖のための選択マーカーを含有す
るベクターに連結されてもよい。そのようなベクター構成物は上記技術により宿
主細胞中に導入することができる。一般に、プラスミドベクターは沈澱物、例え
ばリン酸カルシウム沈澱物の形で、または帯電脂質との複合体の形でＤＮＡとし
て導入される。ポリヌクレオチドを宿主中に導入するのにエレクトロポレーショ
ン法を使ってもよい。ベクターがウイルスである場合、それを試験管内パッケー
ジングするか、またはパッケージング細胞の中に導入し、そしてパッケージング
されたウイルスを用いて細胞中に形質導入してもよい。本発明のこの面に従って
ポリヌクレオチドを生産するためおよび細胞中にポリヌクレオチドを導入するた
めの様々な技術が当業者にとって周知であり、日常的に行われている。そのよう
な技術は、それらの技術を詳述している多くの実験マニュアルの代表であるSamb
rook他（前掲）において十分に概説されている。本発明のこの面によれば、ベク
ターは、例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファージベクター、
一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターであることができる。
そういったベクターは、細胞中へのＤＮＡまたはＲＮＡ導入のための周知技術を
利用して、ポリヌクレオチドとして、好ましくはＤＮＡとして、細胞中に導入す
ることができる。ファージやウイルスベクターの場合、ベクターは、周知の感染
および形質導入技術により、パッケージングまたは封入されたウイルスとして細
胞中に導入することができ、且つまたそれが好ましい。ウイルスベクターは、コ
ンピテント複製または欠陥複製であることができる。後者の場合、通常ウイルス
増殖は欠陥を補完する宿主細胞においてのみ起こるであろう。

【０１１７】 ある態様において特に好ましいベクターは、本発明のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの発現のためのベクターである。通常、そのようなベクターは、発
現させようとするポリヌクレオチドに作用可能に連結された、宿主中での効率的
発現のためのシス作用性調節領域を含んでなる。適当なトランス作用性因子は宿
主により供給されるか、補完ベクターにより供給されるか、または宿主中への導
入時に該ベクター自身によって供給されるかのいずれかである。

【０１１８】 この点で好ましい態様では、該ベクターは特異的発現に備える。そのような特
異的発現は、誘導的発現であるか、一定の細胞タイプにおいてだけの発現である
か、または誘導的と細胞特異的の両方であることができる。中でも特に好ましい
誘導的ベクターは、操作が容易である環境要因、例えば温度や栄養素添加物によ
って発現を誘導することができるベクターである。原核および真核宿主中で使用
される構成的および誘導的発現ベクターを包含する、本発明のこの面に適した様
々なベクターが当業者に周知であり、日常的に使用されている。

【０１１９】 操作された宿主細胞は常用の普通培地中で培養することができるが、培地は特
にプロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅のために適宜変
更することができる。一般に発現のために選択した宿主細胞と共に前に使用した
培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、当業者に明確である通り、本発明のポリペ
プチドの発現にも同様に適するだろう。

【０１２０】 本発明のポリペプチドを発現させるのに多種多様な発現ベクターを使用するこ
とができる。そのようなベクターとしては、染色体、エピソームおよびウイルス
由来ベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピ
ソーム由来、酵母染色体要素由来、ウイルス由来、例えばバキュロウイルス、パ
ポバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来、並びにそれらの組合せ由来
のベクター、例えばプラスミドとバクテリオファージ遺伝要素（例えばコスミド
およびファジミド）由来のものが挙げられ、それら全てが本発明のこの面に従っ
て発現に利用することができる。一般に、宿主中での維持、繁殖、ポリヌクレオ
チドの発現によるポリペプチドの生産に適したどんなベクターでも、この局面で
の発現に利用することができる。

【０１２１】 様々な周知の慣用技術のいずれかを使って、適当なＤＮＡ配列をベクターに挿
入することができる。一般に、発現用ＤＮＡ配列は、１または複数の制限エンド
ヌクレアーゼにより該ＤＮＡ配列と発現ベクターを開裂させ、次いでＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを使って制限断片を一緒に連結することにより、発現ベクターに連結
せしめられる。この目的で利用できる制限および連結方法は当業者に周知であり
且つ日常的である。この点で適当な手順および別の技術を使った発現ベクターの
作製手順は、本明細書中のどこかに引用したSambrook他の中に詳細に記載されて
いる。

【０１２２】 発現ベクター中のＤＮＡ配列は、１または複数の適当な発現調節配列、例えば
ｍＲＮＡ転写を指令するプロモーターに作用可能に連結される。そのようなプロ
モーターの代表例として、周知プロモーターのほんの幾つかを挙げると、λファ
ージＰ_Lプロモーター、Ｅ．コリ lac, trpおよびtacプロモーター、SV40初期お
よび後期プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーターが挙げられる。列挙
しない無数のプロモーターが本発明のこの点での使用に適しており、周知であり
、そして本明細書中の説明および実施例により例示される方法で当業者が容易に
使用できることは理解されるだろう。

【０１２３】 一般に、発現構成物は、転写開始および終結のための部位、並びに転写領域中
に翻訳のためのリボソーム結合部位を含むだろう。構成物により発現される成熟
転写産物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの開始点に翻訳開始ＡＵ
Ｇコドンと終点に適当に配置された終止コドンを含むだろう。

【０１２４】 その上、該構成物は発現を制御および指令する調節領域を含んでもよい。一般
に、多くの常用プラクチスによれば、そのような領域は転写を調節することによ
り機能発揮するもの、例えば特にリプレッサー結合部位およびエンハンサーであ
ろう。

【０１２５】 増殖および発現用のベクターは通常は選択マーカーを含む。そのようなマーカ
ーは増幅にも適しているか、またはベクターが増幅のための追加のマーカーを含
んでもよい。この点で発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の
選択に備えて表現型特徴を提供する１または複数の選択マーカー遺伝子を含有す
る。好ましいマーカーとしては、真核細胞培養にはジヒドロ葉酸レダクターゼ遺
伝子またはネオマイシン耐性遺伝子、そしてＥ．コリや他の細菌の培養にはテト
ラサイクリン、テオマイシン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙
げられる。

【０１２６】 本明細書中のどこかに記載したような適当なＤＮＡ配列、並びに適当なプロモ
ーターおよび別の適当な調節配列を含有するベクターは、所望のポリペプチドの
発現に適当である様々な周知技術を使って、適当な宿主中に導入することができ
る。適当な宿主の典型例としては、細菌細胞、例えばＥ．コリ、ストレプトマイ
セス（Streptomyces）およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimu rium ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ５
２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ，ＣＯＳおよびBowe
s黒色腫細胞；並びに植物細胞が挙げられる。多種多様な発現構成物のための宿
主が周知であり、本開示により、当業者は本発明のこの面に従ってポリペプチド
を発現させるための宿主を容易に選択することが可能であろう。

【０１２７】 様々な哺乳類細胞培養系も同様に発現に使用できる。哺乳類発現系の例として
は、サル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系（Gluzman他, Cell 23:175, 1991）が挙
げられる。適合性ベクターを発現することのできる別の細胞系としては、例えば
、Ｃ127，３Ｔ３，ＣＨＯ，HeLa，ヒト腎臓293およびＢＨＫ細胞系が挙げられる
。哺乳類宿主細胞の場合、多数のウイルス由来発現系を使用できる。発現ベクタ
ーとしてアデノウイルスを使う場合、HIAP3をコードするポリヌクレオチド配列
を、後期プロモーターと三分節系リーダー配列から成るアデノウイルス転写／翻
訳複合体中に連結せしめることができる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ
３領域中への挿入が、結果として感染宿主細胞中でHIAP3を発現することのでき
る生存可能ウイルスをもたらすだろう（Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 81:3655-59, 1984）。加えて、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＶＳ）エンハンサーを使って哺乳宿主細胞中での発現を増強することが
できる。

【０１２８】 より詳しくは、本発明は上述した１または複数の配列を含んでなる組換え構成
物、例えば発現構成物に関する。該構成物は、本発明の上記配列が挿入されてい
るベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを含む。該配列は正逆い
ずれの向きで挿入されてもよい。この点で好ましい態様によれば、構成物は、該
配列に作用可能に連結された調節配列、例えばプロモーターを更に含んでなる。
多数の適当なベクターとプロモーターが当業者に周知であり、また本発明での使
用に適したベクターが多数市販されている。

【０１２９】 市販されている次のベクターを例示として与える。細菌中での使用に好ましい
ベクターはpQE70, pQE60およびpQE-9（Qiagen USA, Valencia, CAより入手可能
）；pBSベクター、Phagescript^Rベクター、Bluescrit^Rベクター、pNH8A, pNH16a
, pNH18A, pNH46A（Stratagene, LaJolla, CAより入手可能）；およびptrc99a,
pK223-3, pK233-3, pDR540, pRIT5（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJより入
手可能）である。最も好ましいのはPharmacia Biotechから入手可能なpGEX-6P-3
ベクターである。特に好ましい真核ベクターはpWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXTIお
よびpSG（Stratageneより入手可能）；PSVK3, pBPV, pMSGおよびpSVL（Pharmaci
a Biotechより入手可能）である。最も好ましいのはIntrogeneより入手可能であ
るベクターpcDNA3.1Myc-HisとpRc/CMV2である。それらのベクターは、本発明の
この面に従って当業者が利用可能である多数の市販の周知ベクターを例示するた
めにだけ列挙したものである。宿主中への本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドの導入、維持、増殖または発現に適したその他のいずれのプラスミドま
たはベクターでも本発明のこの面に使用できることは認識されよう。

【０１３０】 プロモーター領域は、プロモーター領域を欠いたレポーター転写単位、例えば
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）転写単位を含有する
ベクターを使って、候補となるプロモーター断片（すなわちプロモーターを含む
可能性がある断片）を導入するための１または複数の制限部位の下流にある所望
の遺伝子から選択することができる。周知の通り、ベクター中でcat遺伝子の上
流の制限部位のところにプロモーター含有断片を導入すると、CAT活性の発生を
引き起こし、その活性は標準CATアッセイにより検出することができる。この目
的に適したベクターは周知であり容易に入手可能である。そのような２つのベク
ターはpKK232-BとpCM7である。このように、本発明のポリヌクレオチドの発現の
ためのプロモーターは、周知で容易に入手可能なプロモーターだけでなく、レポ
ーター遺伝子を使った上記技術によって容易に得られるプロモーターも包含する
。

【０１３１】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知の細菌プロ
モーターは、特にＥ．コリ lacIプロモーターおよびlacZプロモーター、Ｔ３お
よびＴ７プロモーター、Ｔ５ tacプロモーター、ラムダＰ_RおよびＰ_Lプロモータ
ー並びにtrpプロモーターである。この点で適当である既知の真核プロモーター
は、特にＣＭＶ早期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期
および後期SV40プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例えばラ
ウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーターおよびメタロチオネインプロモータ
ー、例えばマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターである。

【０１３２】 宿主細胞中での発現に適当であるベクターおよびプロモーターの選択は周知の
手順であり、発現ベクターの作製、宿主中へのベクターの導入および発現のため
の必要技術は当業界の慣用技術である。

【０１３３】 一般に、組換え発現ベクターは、複製開始点、下流の構造配列の転写を指令す
る効率的発現遺伝子由来のプロモーター、およびベクターへの暴露後にベクター
含有細胞を単離できるようにする選択マーカーを含有する。

【０１３４】 本発明は、上記構成物を含有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は高等真核細
胞、例えば哺乳類細胞、または下等真核細胞、例えば酵母細胞であることができ
、あるいは宿主細胞は原核細胞、例えば細菌細胞であることができる。宿主細胞
中の構成物を使って、常法に従って組換え配列によりコードされる遺伝子産物を
生産させることができる。あるいは、本発明のポリペプチドは、固相技術（Stew
art他, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1
969; Merrifield, J., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963）を使った直接
ペプチド合成によって生産することもできる。試験管内タンパク質合成は手動法
または自動法を使って実施できる。自動合成は、例えば、Applied Biosystems 4
31A Peptide Synthesizer (Perin Elmer, Foster City, Calif)を使って、製造
業者により提供される指示書に従って達成することができる。HIAP3の様々な断
片を別々に化学合成し、化学法を使って組み合わせて全長分子を製造してもよい
。

【０１３５】 成熟タンパク質は哺乳類細胞、酵母、細菌または別の細胞中で適当なプロモー
ターの調節下で発現させることができる。無細胞翻訳系を使って、本発明のＤＮ
Ａ構成物から誘導されたＲＮＡを使ってそのようなタンパク質を生産させてもよ
い。適当なクローニングおよび発現ベクターはSambrook他（前掲）により記載さ
れている。

【０１３６】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ター中へのエンハンサー配列の挿入によって増強することができる。エンハンサ
ーは、与えられた宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増加させる作用
をする、通常は約10〜300 bpのシス作用性ＤＮＡ要素である。エンハンサーの例
としては、複製開始点の後方側bp 100〜270のところに置かれるSV40エンハンサ
ー、シトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後方側に
置かれるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げら
れる。

【０１３７】 本発明のポリペプチドの非相同（異種）構造配列をコードする本発明のポリヌ
クレオチドは、一般にそれが発現プロモーターに作用可能に連結されるように標
準技術を使ってベクター中に挿入されるだろう。ポリヌクレオチドは、転写開始
部位がリボソーム結合部位の５′側に適切に位置するように置かれるだろう。リ
ボソーム結合部位は、発現させようとするポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧ
コドンの５′側であろう。通常、開始コドン（通常はＡＵＧ）で始まり且つリボ
ゾーム結合部位と開始コドンＡＵＧの間にある他の転写解読枠は１つも存在しな
いだろう。また、一般に、ポリペプチドの末端には翻訳終止コドンがあり、そし
て転写領域の３′末端にはポリアデニル化シグナルと転写終止シグナルが適切に
配置されるだろう。

【０１３８】 翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔、細胞周辺腔または細胞外環境中に分泌
させるため、発現されたポリペプチド中に適当な分泌シグナルが組み込まれてい
てもよい。そのようなシグナルは、ポリペプチドに内因性であるかまたは非相同
（異種）シグナルであってもよい。ポリペプチドは修飾形態、例えば融合タンパ
ク質として発現されてもよく、そして分泌シグナルだけでなく追加の非相同機能
領域を含んでもよい。例えば、宿主細胞中、精製中またはその後の処理および貯
蔵中の安定性や持続性を改善するために、追加のアミノ酸の領域、特に荷電アミ
ノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加することができる。また、精製を容易
にするためにポリペプチドに特殊領域を付加してもよい。そのような領域はポリ
ペプチドの最終調製の前に除去することができる。特に、分泌もしくは外分泌を
引き起こすため、安定性を向上させるため、または精製を容易にするためにポリ
ペプチドにペプチド成分を付加することは、当該技術分野でよく知られており且
つ慣用される技術である。例えば、抗体の誘導のために大量のHIAP3を必要とす
る場合、容易に精製されるような融合タンパク質の高レベル発現を指令するベク
ターが望ましいだろう。そういったベクターとしては、非限定的に、多機能Ｅ．
コリクローニングおよび発現ベクター、例えばハイブリッドタンパク質が生産さ
れるように、hiap3コード配列をβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端Metとその後
方の７残基をコードする配列と枠内で連結せしめることができる、Bluescript^R
(Stratagene)；pINベクター（Va Heede & Shuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5
509, 1989）等が挙げられる。ｐGEXベクター（Promega, Madison, Wis.）を使っ
て、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST)との融合タンパク質として外来
ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性
であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着に続いて遊離グルタチオンの
存在下での溶出によって、細胞溶解物から容易に精製することができる。そのよ
うな方法で製造されるタンパク質は、着目のクローン化ポリペプチドをＧＳＴ成
分から随意に切り離すことができるようにヘパリン、トロンビンまたは第Ｘa因
子プロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインされる。

【０１３９】 適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度への宿主株の増殖後、特定のプ
ロモーターが誘導的であるなら、それを適当な手段（例えば温度変化または化学
的誘導因子への暴露）によって誘導し、そして適当な期間に渡り細胞を培養する
。

【０１４０】 次いで典型的には遠心分離により細胞を収集し、物理的または化学的手段によ
り破壊し、そして得られた粗抽出物を更なる精製のために保持しておく。

【０１４１】 タンパク質の発現に使用した微生物細胞は、任意の常法、例えば凍結−解凍の
反復、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用によって破壊することが
できる。そのような方法は当業者に周知である。

【０１４２】 HIAP3ポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、ア
ニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ
フィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーをはじめとする周知の方法により、組換え細胞培養物から回収しそして精製
することができる。最も好ましくは、精製に高性能液体クロマトグラフィー（「
HPLC」）が使われる。単離または精製中にポリペプチドが変性される場合、タン
パク質の再生のための周知技術を使用して活性コンホメーションを復元再生する
ことができる。当業界で周知である様々な他のタンパク質精製方法としては、De
utscher, M., Methods in Enzymology, Vol.182, Academic Press, San Diego,
1982；およびScopes, R., Protein Purification: Principles and Practice, S
pringer-Verlag, New York, 1982中に記載されたものが挙げられる。

【０１４３】 本発明のポリペプチドは、天然に精製された生成物、化学的合成法の生成物、
並びに例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞といった原核または
真核宿主から組換え技術により生産された生成物を包含する。組換え生産法にお
いて使用する宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化形態である
かまたは非グリコシル化形態である場合がある。その上、本発明のポリペプチド
は、場合により宿主により媒介される過程の結果として、開始の修飾メチオニン
残基を含んでいてもよい。

【０１４４】 HIAP3ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドの使用 hiap3ポリヌクレオチドおよびHIAP3ポリペプチドは、本発明に従って様々な用
途に用いることができ、特にHIAP3の化学的および生物学的性質を利用する用途
に用いることができる。追加の用途は、不適切なアポプトシスの存在に関連する
細胞、組織および生物体の病気の診断と治療に関する。それらの本発明の観点は
、下記の論述により例示され、本明細書の本文中に更に記載される。

【０１４５】 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の使用の論理的根拠は、本
明細書中に開示されるHIAP3と別のIAP分子との間の化学的および構造的相同性に
一部基づいている。HIAP3は、異常なまたは不適切なアポプトシスに関連づけら
れる状態、障害または病気の診断と治療に利用できる。それらとしては、非限定
的に、アポプトシスが不十分である癌および慢性ウイルス感染、並びに未熟なア
ポプトシスにより特徴づけられる神経変性疾患および慢性心不全が挙げられる。

【０１４６】 hiap3ポリヌクレオチド配列は染色体同定のためおよびＤＮＡプローブとして
用いることができる。 HIAP3ポリペプチドは、細胞および組織中のHIAP3をコードするポリヌクレオチ
ドのレベルを検出するための診断アッセイに有用である。

【０１４７】 HIAP3の過剰発現に関連する状態、例えば癌において、HIAP3生産を抑制し、そ
れによってHIAP3レベルを低下させることが有利であるかもしれない。HIAP3はア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムの投与によって抑制することが
できる。あるいは、HIAP3活性の原因となるHIAP3ポリペプチドの領域を特異的に
認識する抗体を投与することにより、異常なHIAP3活性に関連した病気または状
態を治療することができる。

【０１４８】 HIAP3の過小発現に関連する状態、例えば神経変性疾患では、HIAP3レベルを上
昇させることが有利であるかもしれない。HIAP3ポリペプチドをコードし発現す
るポリヌクレオチドを含有する適当な組換え分子を投与した後に患者の生体内で
HIAP3ポリペプチドの発現が起こるような遺伝子療法を使って、HIAP3を患者に供
給することができる。

【０１４９】 ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断試薬として、相補的ポリヌクレオチドを検出するための
HIAP3ポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全に関連付けられるHIAP3の変
異形の検出は、HIAP3の発現不足、発現過剰または変更発現に起因する病気（例
えば新形成および神経変性疾患）の診断または病気へのかかりやすさの診断を追
加または限定することができる診断道具を提供するだろう。

【０１５０】 HIAP3をコードする遺伝子中に突然変異を担持している個体は、様々な技術に
よりＤＮＡレベルで検出することができる。診断用のポリヌクレオチド試料は、
患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検および検死材料から得ることがで
きる。ゲノムＤＮＡをそのまま検出に使用してもよく、または分析前にＰＣＲ（
Saiki他, Nature 324:163-166, 1986）を使って酵素的に増幅させてもよい。同
じ方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用してもよい。一例として、HIAP3をコード
するポリヌクレオチド配列に相補的なＰＣＲプライマーを使って、hiap3発現と
突然変異を同定・分析することができる。例えば、欠失と挿入は、正常な遺伝子
型のものに比較した増幅生成物のサイズの変化によって検出することができる。
点変異は、放射性標識したhiap3 ＲＮＡにあるいはまた放射性標識したhiap3ア
ンチセンスＤＮＡ配列に増幅ＤＮＡをハイブリダイズさせることにより同定する
ことができる。ＲＮアーゼＡ消化によりまたは融解温度の相違により、完全に対
合した配列を不正対合（ミスマッチ）した二重鎖から区別することができる。

【０１５１】 参照遺伝子と突然変異を有する遺伝子との配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定に
より明らかにすることもできる。その上、クローン化ＤＮＡセグメントをプロー
ブとして使用して特異的ＤＮＡセグメントを検出することもできる。そのような
方法の感度は、通常、ＰＣＲまたは別の増幅法の適切な使用により大幅に増加さ
せることができる。例えば、改良ＰＣＲ法により生成された二本鎖ＰＣＲ生成物
または一本鎖鋳型分子と共に配列決定用プライマーを使用する。配列決定は、放
射性標識ポリヌクレオチドを使用する常用手順により、または蛍光標識を用いる
自動配列決定法により行われる。

【０１５２】 ＤＮＡ配列相違に基づいた遺伝子検査は、変性剤を使用してまたは使用せずに
、ゲル中でのＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより達成する
ことができる。小さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動により視覚
化することができる。異なる配列を有するＤＮＡ断片は変性ホルムアミド勾配ゲ
ル上で区別することができる。この場合、それらの固有融解温度または部分融解
温度に従って様々な位置において、異なるＤＮＡ断片の移動度が遅れる（例えば
、Myers他, Science 230:1242, 1985を参照のこと）。

【０１５３】 特定場所での配列変更は、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよ
びＳ１保護アッセイまたは化学的開裂法（例えばCatton他, Proc. Nat. Acad. S
ci. USA 85:4397-4401, 1985）によっても明らかにすることができる。

【０１５４】 よって、特定ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護
、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用〔例えば制限断片長さ
多形性（"RFLP"）およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティング〕などの方法によ
り達成することができる。

【０１５５】 より常用されるゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、突然変異はin s
itu分析により検出することもできる。

【０１５６】 染色体アッセイ 本発明のポリヌクレオチド配列は染色体の同定にも有効である。該配列を個々
のヒト染色体にターゲッティングし、そして特定の位置でハイブリダイズさせる
ことができる。更に、染色体上の特定部位を同定する必要性が現在存在している
。染色体位置をマーキングするのに現在利用できる、実際の配列データ（反復多
形性）に基づく染色体マーキング試薬はほとんどない。本発明による染色体への
ＤＮＡのマッピングは、それらの配列を病気に関係する遺伝子と関連付ける際の
重要な第一段階である。

【０１５７】 この点での好ましい態様によれば、本明細書中に開示されるｃＤＮＡはhiap3
遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするのに使われる。これは、種々様々な周
知技術および一般に市販されているライブラリーを使って行うことができる。次
いで、この目的で周知技術を使ってin situ染色体マッピングにゲノムＤＮＡを
使用する。典型的には、染色体マッピングの日常手順によると、良好なin situ
ハイブリダイゼーションシグナルを与えるゲノムＤＮＡを同定するには何回かの
試行錯誤が必要であるかもしれない。

【０１５８】 その上、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは15〜25 bp）を調製する
ことにより染色体に配列をマッピングすることができる場合がある。遺伝子の３
′非翻訳領域のコンピューター分析は、ゲノムＤＮＡ中の複数のエキソンにかか
らないプライマーを迅速に選択するのに用いられる。次いでそれらのプライマー
が個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使
用される。プライマーに相当するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅断
片を生成するだろう。

【０１５９】 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、ある特定のＤＮＡを特定の染色体
に割り当てる迅速な手法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーと本発明を
用いて、同様なやり方で特定の染色体または大きなゲノムクローンのプールから
の断片のパネルを使って、細部位置決定（sublocalization）を行うことができ
る。同様に染色体へのＤＮＡのマッピングに利用できる別のマッピング方法は、
in situハイブリダイゼーション、流動選別した標識染色体を使う予備スクリー
ニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのハイブリダ
イゼーションによる予備選択を含む。

【０１６０】 一段階で正確な染色体位置を提供するために、中期染色体へのｃＤＮＡクロー
ンの蛍光in situハイブリダイゼーション（"FISH"）法を使用することができる
。この技術は、50または60塩基ほどの短いｃＤＮＡと共に使用することができる
。この技術の概説については、Verma他, Human Chromosomes: A Manual of Basi
c Techniques, Pergamon Press, New York, 1988を参照のこと。

【０１６１】 或る配列がいったん正確な染色体位置にマッピングされたら、染色体上の該配
列の物理的位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデー
タは、例えば、Johns Hopkins University, Welch Medical Libraryからオンラ
インで利用可能であるV. McKusick, Mendelian Inhertance in Man中に見つかる
。次いで、同一染色体領域にマッピングされた遺伝子と病気の関係を、連鎖分析
（物理的に隣接した遺伝子の共同遺伝）を通して同定する。

【０１６２】 次に、罹患個体と非罹患個体の間のｃＤＮＡまたはゲノム配列中の相違を調べ
る必要がある。罹患個体の一部または全部において突然変異が観察され、非罹患
個体には観察されなかったら、その突然変異はどうやら病気の作因でありそうで
ある。

【０１６３】 物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の分解能では、病気に関
連した染色体領域に正確に局在化されたｃＤＮＡは、50〜500の潜在的原因遺伝
子のうちの１つであり得る。（これは１メガ塩基マッピング分解能と20 kbにつ
き１遺伝子を仮定する）。遺伝子地図を延長するために、染色体調製物のin sit
uハイブリダイゼーションおよび物理的マッピング技術、例えば確立された染色
体マーカーを使った連鎖分析を使うことができる。例えば、ヒトゲノムのＳＴＳ
ベース地図は、Whitehead-MIT Center for Genomic Research (Hudson他, Scien
ce 270:1945-1954, 1995）により公開されている。別の哺乳類種、例えばマウス
（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research, Genetic Map of the
Mouse, Database Release 10, 1995年４月28日）の染色体上の遺伝子の配置は
、特定のヒト染色体の番号またはアームが未知であっても、関連マーカーを明ら
かにすることができる。物理的マッピングにより新規配列を染色体アームまたは
その一部分に割り当てることができる。これは、位置クローニングまたは別の遺
伝子発見技術を使って病気遺伝子について研究する研究者に価値ある情報を提供
する。いったん病気または症候群（例えば毛細管拡張性運動失調（ＡＴ））が特
定のゲノム領域に粗く位置決定されれば、例えばＡＴが11q22-23に位置決定され
れば（Gatti他, Nature 336:577-580, 1988）、その領域にマップするどんな配
列も、更なる研究のための関連遺伝子または制御遺伝子を表すことができる。本
発明のヌクレオチド配列は、正常個体、保因個体（キャリア）または罹患個体の
間の転座または逆位などによる染色体位置の相違を検出するためにも利用するこ
とができる。

【０１６４】 ポリペプチドアッセイ 本発明は診断アッセイ、例えば細胞および組織中のHIAP3タンパク質レベル（
正常レベルと異常レベルの検出を含む）を検出するための定量および診断アッセ
イにも関する。例えば、正常な対照組織試料に比較したHIAP3タンパク質の過剰
発現を検出するための本発明の診断アッセイは、新形成、例えば腫瘍の存在を検
出するために利用することができる。宿主から誘導された試料において本発明の
HIAP3タンパク質のようなタンパク質レベルを測定するために使用できるアッセ
イ技術は、当業者に周知である。そのようなアッセイ方法としては、ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびエン
ザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ELISA）並びに蛍光標示式細胞分取
法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。それらの中でもELISAがしばしば好ましい。ELISA
アッセイは、最初にHIAP3に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調
製することを含んでなる。加えて、通常はそのモノクローナル抗体に結合するレ
ポーター抗体を調製する。レポーター抗体は、検出可能な試薬、例えば放射性、
蛍光または酵素試薬に取り付けられ、この実施例では西洋ワサビペルオキシダー
ゼ酵素に取り付けられる。

【０１６５】 ELISAアッセイを実施するために、宿主から試料を採取しそして試料中のタン
パク質を結合する固形支持体、例えばポリスチレン製皿の上で試料をインキュベ
ートする。次いで、非特異的タンパク質（例えばウシ血清アルブミン）と共にイ
ンキュベートすることにより、皿上に残った全ての遊離のタンパク質結合部位を
ブロックする。次に、その皿中でモノクローナル抗体をインキュベートし、その
間にポリスチレン皿に結合したHIAP3タンパク質にモノクローナル抗体が結合す
る。未結合のモノクローナル抗体を緩衝液で洗い流す。西洋ワサビペルオキシダ
ーゼに連結されたレポーター抗体を皿に入れ、HIAP3に結合したモノクローナル
抗体への該レポーター抗体の結合を引き起こす。次いで結合しなかったレポータ
ー抗体を洗い流す。発色性基質を含むペルオキシダーゼ活性についての試薬を皿
に添加する。一次抗体と二次抗体を通してHIAP3に結合した固定化ペルオキシダ
ーゼが、着色した反応生成物を生成する。与えられた期間で生成する色の量が、
試料中に存在するHIAP3タンパク質の量を示す。典型的には標準曲線に対する比
較により、定量的結果が得られる。

【０１６６】 競合アッセイを実施してもよく、この場合はHIAP3に特異的な抗体を固形支持
体に付着させ、そして標識HIAP3と宿主からの試料をその固形支持体上に通過さ
せ、そして固形支持体に結合した標識の検出量を試料中のHIAP3の量に相関させ
ることができる。

【０１６７】 それらおよび他のアッセイは、特にHampton他（Serological Methods, a Labo
ratory Manual, APS Press, St Paul, Minn, 1990）およびMaddox他（J. Exp. M
ed. 158:12111, 1983）に記載されている。

【０１６８】 抗体 ポリペプチド、それらの断片もしくは他の誘導体またはそれらの類似体、それ
らを発現する細胞は、それらに対する抗体を生産させるための免疫原として利用
することができる。抗体は例えばポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
であることができる。本発明は、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、並びにFab
断片またはFab発現ライブラリーの生成物も包含する。そのような抗体および断
片の生産には、当該技術分野で既知である様々な方法を利用することができる。

【０１６９】 本発明の配列に相当するポリペプチドに対して生産される抗体は、動物への該
ポリペプチドの直接注入により、または該ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒ
トに投与することにより得ることができる。こうして得られた抗体は、ポリペプ
チドそれ自体を結合するだろう。こうして、ポリペプチドの断片のみをコードす
る配列であっても生来の完全ポリペプチドを結合する抗体を生産させるのに利用
することができる。次いでそのような抗体を使って、該ポリペプチドを発現して
いる組織から該ポリペプチドを単離することができる。

【０１７０】 モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系培養物により生産される抗体を提
供するどんな技術でも使用できる。その例としては、ハイブリドーマ技術（Kohl
er & Milstein, Nature 256:495-497, 1975）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術
（Kozbor他、Immunology Today 4:72, 1983）およびヒトモノクローナル抗体を
生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole他，Monoclonal Antibodies
and Cancer, Alan R. Liss, Inc., 77-96, 1985）が挙げられる。

【０１７１】 加えて、適当な抗原特異性と生物活性を有する分子を得るためにヒト抗体遺伝
子にマウス抗体遺伝子をスプライシングする、「キメラ抗体」の生産のために開
発された技術を使うこともできる（Morrison他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1:6851-6855, 1984; Neuberger他, Nature 312:604-608, 1984; Takeda他, Natu
re 314:452-454, 1985）。あるいは、一本鎖抗体の生産のための技術（米国特許
第4,946,778号明細書）を修正してHIAP3特異的一本鎖抗体を生産させることがで
きる。

【０１７２】 抗体は、Orlandi他（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989）およ
びWinter & Milstein（Nature 349:293-299, 1991）により開示されたように、
リンパ球集団中での生体内生産を誘導することにより、または組換え免疫グロブ
リンライブラリーもしくは高特異的結合試薬のパネルをスクリーニングすること
により、生産させることもできる。

【０１７３】 HIAP3に対する特異的結合部位を含有する抗体断片を作製することもできる。
例えば、そのような抗体としては、非限定的に、抗体分子のペプシン消化により
製造できるF(ab')₂断片、およびF(ab')₂断片のジスルフィド結合を還元すること
により製造できるFab断片が挙げられる。あるいは、所望の特異性を有するモノ
クローナルFab断片の迅速且つ容易な同定を可能にするために、Fab発現ライブラ
リーを作製することができる（Huse他, Science 256:1270-1281, 1989）。

【０１７４】 上記抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによる単離および／または精
製用の固形支持体に抗体を付着させることにより、本発明のポリペプチドを発現
する抗体を単離もしくは同定するためまたは本発明のポリペプチドを精製するた
めに使用することができる。

【０１７５】 医薬組成物および投与 本発明は、単独でまたは少なくとも１つの別の剤、例えば安定化化合物と組み
合わせて、hiap3ポリヌクレオチド、HIAP3タンパク質、抗体、作用剤、拮抗剤お
よび阻害剤を含んでなることができる医薬組成物にも関する。この医薬組成物は
、任意の無菌の生適合性医薬担体、例えば非限定的に食塩水、緩衝化食塩水、ブ
ドウ糖および水に希釈して投与することができる。それらの分子のいずれも、該
分子を１もしくは複数の賦形剤または医薬上許容される担体と混合した医薬組成
物において、単独でまたは別の剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、患者
に投与することができる。本発明の一態様では、医薬上許容される担体は医薬上
不活性である。

【０１７６】 本発明は医薬組成物の投与にも関する。そのような投与は経口または非経口で
行われる。非経口投与方法としては、局所、動脈内（腫瘍に直接）、筋肉内、皮
下、骨髄内、鞘内、心室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が挙げられる。
活性成分に加えて、それらの医薬組成物は、医薬として利用できる製剤への活性
化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を包含する、医薬上許容される担
体を含んでもよい。製剤化技術および投与技術についての更なる詳細は、Reming
ton's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton, Pa.)の最新版
において見つけることができる。

【０１７７】 経口投与用の医薬組成物は、経口投与に適した用量で当該技術分野で周知の医
薬上許容される担体を使って製剤化することができる。そのような担体は、患者
による摂取のために、医薬組成物を錠剤、ピル剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲ
ル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとして製剤化できるようにする。

【０１７８】 経口用医薬製剤は、活性化合物を固形賦形剤と混合し、所望により得られた混
合物を粉砕し、そして所望により適当な補助剤を添加した後、顆粒混合物を錠剤
または糖剤コアに加工することにより得ることができる。適当な賦形剤としては
、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば糖類、例えば乳糖、ショ糖、マンニ
トールまたはソルビトール；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは他の植
物からのデンプン；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピル
メチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴム
およびトラガカント；並びにタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンであ
る。所望であれば、崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、
寒天、アルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加してもよ
い。

【０１７９】 糖剤コアには、例えば濃縮糖溶液により適当なコーティングが施される。前記
濃縮糖溶液は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲ
ル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー液、並びに
適当な有機溶剤もしくは溶剤混合物を含んでもよい。活性化合物の量（すなわち
投与量）を確認または特徴づけるために、錠剤または糖剤コーティングに色素ま
たは顔料を添加してもよい。

【０１８０】 経口使用できる医薬製剤は、ゼラチン製の押込嵌め式（push-fit）カプセル、
並びにゼラチンとグリセロールやソルビトールのようなコーティングとから作ら
れる密封軟カプセルを包含する。押込嵌め式カプセルは、乳糖やデンプンのよう
な充填剤または結合剤、タルクやステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、お
よび所望により安定剤と混合した形で活性化合物を含有することができる。軟カ
プセル中では、安定剤と共にまたは伴わずに、活性化合物を適当な液体、例えば
脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁
することができる。

【０１８１】 非経口医薬製剤としては、活性化合物の水溶液が挙げられる。注射用には、本
発明の医薬組成物を水溶液、好ましくは生理的に適合性の緩衝液、例えばハンク
ス液、リンガー液または生理的緩衝食塩水中に製剤化することができる。水性注
射用懸濁液剤は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセル
ロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含んでもよい。更に、活
性化合物の懸濁液を適当な油状注射用懸濁液剤として調製することもできる。適
当な親油性溶剤または佐剤としては、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸
エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソーム
が挙げられる。所望により、懸濁液剤は、高濃縮液剤の調製を考慮に入れて化合
物の溶解度を増加させる剤または適当な安定剤を含んでもよい。

【０１８２】 局所または経鼻投与には、浸透させようとする特定の遮断壁に適した浸透剤が
使用される。そのような浸透剤は一般に当該技術分野で知られている。

【０１８３】 キット 本発明は更に、本発明の上記組成物の１または複数の成分が充填された１また
は複数の容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。そのような容器に
は、ヒト投与用の製品の製造、使用または販売の認可を反映する、医薬品または
生物関連品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形の注
意書きを付けることができる。

【０１８４】 製造および貯蔵 本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知である方法、例えば通常の混合、
溶解、造粒、糖剤化、水簸、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥方法によっ
て製造することができる。

【０１８５】 医薬組成物は塩として提供してもよく、そして非限定的に塩酸、硫酸、酢酸、
乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などをはじめとする酸と共に塩を形成しても
よい。塩は、対応する遊離塩基形よりも一層水性溶媒または他のプロトン系溶媒
に可溶である傾向がある。別の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝液と混合さ
れる、4.5〜5.5のｐＨ域の１mM〜50mMヒスチジン、0.1％〜２％ショ糖、２％〜
７％マンニトール中の凍結乾燥粉末であることができる。

【０１８６】 適当な担体中に本発明の化合物を含んでなる医薬組成物を調製した後、それら
を適当な容器の中に入れ、そして指定条件での治療のためのラベルを貼ることが
できる。HIAP3の投与には、そのようなラベルは投与の量、頻度および方法を含
むであろう。

【０１８７】 治療的有効量 本発明での使用に適した医薬組成物としては、意図する目的、すなわち不適当
なアポプトシスにより特徴づけられる特定の病気状態の治療を達成するのに有効
な量で活性成分が含まれている組成物が挙げられる。有効量の決定は当業者の能
力の十分範囲内である。

【０１８８】 どんな化合物の場合でも、治療的有効量は、最初に細胞培養アッセイ（例えば
新形成細胞）または動物モデル（通常はマウス、ウサギ、イヌもしくはブタ）の
いずれかにおいて概算することができる。動物モデルは望ましい濃度範囲と投与
経路を得るためにも利用される。次いでそのような情報を使ってヒトにおける有
効量と投与経路を決定することができる。

【０１８９】 治療的有効量は、症状または状態を緩和するようなタンパク質またはそれの抗
体、拮抗剤もしくは阻害剤の量を指して言う。そのような化合物の治療効能およ
び毒性は、細胞培養または実験動物における標準の薬学法、例えばＥＤ₅₀(母集
団の50％において治療的有効である量）およびＬＤ₅₀(母集団の50％において致
死的である量）により決定することができる。治療効果と毒性効果の用量比が治
療指数であり、ＥＤ₅₀／ＬＤ₅₀比として表すことができる。治療指数が大きい医
薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、
ヒトへの使用に向けて用量範囲を処方するのに使用される。そのような化合物の
用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を持たないＥＤ₅₀を含む循環濃度
の範囲内にある。用量は使用する投与形態、患者の感受性および投与経路に依存
してこの範囲内で異なる。

【０１９０】 正確な用量は治療すべき患者を考慮して個々の医師により選択される。用量と
投与は、十分な活性成分レベルを提供するかまたは所望の効果を維持するように
調節される。考慮に入れるべき追加の因子としては、病気状態の重症度、例えば
腫瘍サイズおよび存在位置；患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間お
よび頻度；薬剤の組合せ、反応感度、並びに治療に対する寛容／応答が挙げられ
る。作用持続性医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応
じて、３〜４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。

【０１９１】 通常の投与量は、0.1から100,000マイクログラムまで異なることができ、投与
経路によって約１ｇの合計量にまで及ぶことができる。特定の用量および投与方
法に関する指針は文献中に与えられている。例えば米国特許第4,657,760号；同
第5,206,344号；または同第5,225,212号明細書を参照のこと。当業者は、タンパ
ク質またはそれらの阻害剤についてよりもむしろポリヌクレオチドについて異な
る処方を使用するだろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの投与
は特定の細胞、状態、位置などに特有であろう。

【０１９２】 遺伝子療法 本発明のhiap3ポリヌクレオチドおよびHIAP3ポリペプチドは、そのようなポリ
ペプチドの生体内発現により本発明に従って「遺伝子療法」としばしば呼ばれる
治療法において使用することができる。

【０１９３】 例えば、患者からの細胞を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例
えばＤＮＡまたはＲＮＡを使って生体外で操作し、次いで操作した細胞を該ポリ
ペプチドで処置しようとする患者に導入することができる。例えば、本発明のポ
リペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを
使って生体外で細胞を操作することができる。そのような方法は当該技術分野で
周知であり、本発明におけるそれらの使用はその中の教示から明白であろう。

【０１９４】 同様に、当該技術分野で周知の手順によりポリペプチドを生体内で発現させる
ために細胞を生体内で操作することもできる。例えば、上述したように、本発明
のポリヌクレオチドを複製欠陥レトロウイルスベクター中での発現に備えて操作
する。次いでレトロウイルス発現ベクターを単離し、パッケージング細胞中に導
入し、パッケージング細胞が着目の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生産する
ように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルスプラス
ミドベクターを用いて形質導入する。細胞の生体内操作と該ポリペプチドの生体
内発現のために、それらの生産者細胞を患者に投与することができる。これらの
方法およびそのような方法により本発明のポリペプチドを投与するための別法は
、本発明の教示から当業者に明らかであろう。

【０１９５】 上記に言及したレトロウイルスプラスミドベクターを誘導することができるレ
トロウイルスとしては、非限定的に、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死
ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス
、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ア
デノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられる。一
態様では、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルス
より誘導される。

【０１９６】 そのようなベクターは、ポリペプチドを発現するための１または複数のプロモ
ーターを含有するだろう。使用することができる適当なプロモーターとしては、
非限定的に、レトロウイルスＬＴＲ；SV40プロモーター；およびヒトシトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Miller他, Biotechniques 7:980-990, 1989
）または他の任意のプロモーター（例えば細胞性プロモーター、例えば真核細胞
プロモーター、例えば非限定的にヒストン、ＲＮＡポリメラーゼIII、およびβ
アクチンプロモーター）が挙げられる。使用できる別のウイルスプロモーターと
しては、非限定的に、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）
プロモーター、およびＢ19パルボウイルスプロモーターが挙げられる。適当なプ
ロモーターの選択は本明細書中に含まれる教示から当業者に明白であろう。

【０１９７】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適当なプロモーター
の調節下に置かれるだろう。使用できる適当なプロモーターとしては、非限定的
に、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター
；または異種プロモーター、例えばシトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター
；ＲＳＶ（respiratory syncytial virus）プロモーター；誘導的プロモーター
、例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター；ヒートショック
プロモーター；アルブミンプロモーター；ApoA1プロモーター；ヒトグロビンプ
ロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えば単純ヘルペスチミ
ジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（上述した変更レトロウイル
スＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモ
ーターが挙げられる。プロモーターは、ポリペプチドをコードする遺伝子を調節
する生来のプロモーターであってもよい。

【０１９８】 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞系を形質導入する
ことにより生産者細胞系を作製するために使用される。トランスフェクトするこ
とができるパッケージング細胞の例としては、非限定的に、PE5OI, PA317, Y-2,
Y-AM, PAI2, T19-14X, VT-19-17-H2, YCRE, YCRIP, GP+E-86, GP+envAmI2, お
よびMiller, A., Human Gene Therapy 1:5-14, 1990 に記載されたDAN細胞系が
挙げられる。ベクターは、当該技術分野で既知の任意手段を通してパッケージン
グ細胞系中に形質導入することができる。そのような手段としては、非限定的に
、エレクトロポレーション、リポソームの使用およびCaPO₄沈澱が挙げられる。
１つの別法では、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム中に封入する
かまたは脂質に連結せしめ、次いで宿主に投与することができる。

【０１９９】 生産者細胞系は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を
含む、感染性レトロウイルスベクター粒子を生産するだろう。次いでそのような
レトロウイルスベクター粒子を用いて生体内でまたは試験管内で真核細胞を形質
導入することができる。形質導入された真核細胞は該ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを発現するだろう。形質導入することができる真核細胞として
は、非限定的に、胎児性幹細胞、胎児性癌細胞、並びに造血幹細胞、肝細胞、繊
維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン細胞、内皮細胞および気管支上皮細胞が挙げられ
る。

【０２００】 アンチセンスベクターおよびリボザイムの療法利用 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルス由来の
発現ベクターまたは様々な細菌プラスミド由来の発現ベクターは、アンチセンス hiap3 を発現する組換えベクターの作製と伝達にも使用することができる。例え
ば、Sambrook他（前掲）およびAusubel他（前掲）に記載の技術を参照されたい
。

【０２０１】 全長ｃＤＮＡ配列および／またはそれの調節要素を含んでなるポリヌクレオチ
ドは、研究者が遺伝子機能のセンス制御（Youssoufian & Lodish, Mol. Cell. B
iol. 13:93-104, 1993）またはアンチセンス制御（Eguchi他, Annu. Rev. Bioch
em. 60:631-652, 1991）における研究道具としてhiap3ポリヌクレオチドを使用
できるようにする。そのような技術は現在当該技術分野で周知であり、コード配
列または調節領域に沿った様々な位置から、センスもしくはアンチセンスオリゴ
マーまたはより長い断片をデザインすることができる。

【０２０２】 HIAP3をコードする遺伝子は、所望のHIAP3断片を高レベルで発現する発現ベク
ターを用いて細胞または組織をトランスフェクトせしめることにより停止（turn
off）させることができる。そのような構成物は、翻訳されないセンスまたはア
ンチセンス配列で細胞を満たす（flood）ことができる。該ＤＮＡ中への組み込
みが起こらなくても、そのようなベクターは、内因性ヌクレアーゼによって全て
のコピーが無力にされるまでＲＮＡ分子を転写し続けることができる。非複製性
ベクターを用いて１ヶ月以上の間一時的発現を持続させることができ、適当な複
製要素がベクター系の一部をなすならば更に長期間持続させることができる。

【０２０３】 上述したように、hiap3の調節領域、すなわちプロモーター、エンハンサーお
よびイントロンに対するＤＮＡまたはＲＮＡアンチセンス分子をデザインするこ
とにより、遺伝子発現を変更することができる。転写開始部位、例えばリーダー
配列の−10〜＋10領域より誘導されたオリゴヌクレオチドが好ましい。転写産物
をリボソームに結合しないようにすることによってｍＲＮＡの翻訳をブロックす
るようにアンチセンス分子をデザインすることもできる。同様に、「三重らせん
」塩基対合方法論を使って阻害を達成することもできる。三重らせん対合は、ポ
リメラーゼ、転写因子または調節分子の結合に十分なほどに二重らせんが開く能
力を傷つける。三重鎖ＤＮＡを使った最近の療法上の進歩は、Gee, J.E.他,（Hu
ber & Car, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co.,
Mt. Kisco, N.Y., 1994）により概説されている。

【０２０４】 リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子
である（米国特許第4,987,071号明細書；WO 93/23057）。リボザイムの作用機序
は、リボザイム分子が相補的な標的ＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、次いで
ヌクレオチド内分解開裂（endonucleolytic cleavage）が起こることを伴う。HI
AP3をコードするＲＮＡを特異的に且つ効率的にヌクレオチド内分解開裂するこ
とができる遺伝子操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は本発明の
範囲内に含まれる。

【０２０５】 まず最初に、次の配列：ＧＵＡ，ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部
位について標的分子をスキャンすることによって、ある潜在的ＲＮＡ標的の中の
特異的リボザイム開裂部位を同定する。いったん同定されたら、その開裂部位を
含有する標的遺伝子の一領域に相当する15〜20リボヌクレオチドの短鎖ＲＮＡ配
列を、オリゴヌクレオチドを作用不能にし得る二次構造特徴について評価するこ
とができる。リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Irie他, Advance. Pharmacol. 40
:207-257, 1997）を使って、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ
ョンに対する近づきやすさ（accessibility）を試験することにより、標的候補
の安定性を評価することもできる。

【０２０６】 本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成のための当
該技術分野で既知の任意方法によって調製することができる。そのような方法と
しては、固相ホルホロアミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的
に合成する技術が挙げられる。あるいは、HIAP3をコードするＤＮＡ配列の試験
管内または生体内転写によりＲＮＡ分子を製造することができる。そのようなＤ
ＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６といった適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーター
を含む種々様々なベクター中に組み込むことができる。あるいは、アンチセンス
ＲＮＡを構成的にまたは誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物を細胞系
、細胞または組織中に導入することができる。

【０２０７】 細胞内安定性および半減期を増加させるようにＲＮＡ分子を修飾することがで
きる。可能な修飾としては、非限定的に、分子の５′および／または３′末端へ
の隣接配列の付加、または分子の主鎖中にホスホジエステル結合ではなくホスホ
ロチオエートもしくは２′Ｏ−メチル結合の使用が挙げられる。安定性の増加は
、イノシンやケオシンのような非典型的塩基の包含、並びに内因性エンドヌクレ
アーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよび
ウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−および同様な修飾形態の包含によって
達成することもできる。

【０２０８】 細胞または組織中にベクターを導入する方法としては上記で論じたものが挙げ
られ、それらは生体内、試験管内および生体外療法にも等しく適当である。生体
外療法には、ベクターは患者から採取した幹細胞中にベクターを導入し、そして
米国特許第5,399,493号および同第5,437,994号明細書（これらは参考として本明
細書中に組み込まれる）に与えられたようにクローン増殖され、同患者に自己移
植のため戻される。トランスフェクションまたはリポソームによる送達は当該技
術分野において十分に周知である。

【０２０９】実施例 本発明を次の実施例により更に説明する。これらの実施例は特定の態様への言
及によって本発明を単に例示するためにだけ与えられる。それらの例示は、本発
明の特定の観点を例示するけれども、本開示の発明の範囲の限定または制限を描
写するものではない。

【０２１０】 全ての実施例は、特に断らない限り、当業者に周知であり且つ日常的である標
準技術を使って実施した。次の実施例の慣用的な分子生物学技術は、標準実験マ
ニュアル、例えばSambrook他, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２
版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989
中に記載された通りに実施することができる。

【０２１１】１．ヒトiap3 ｃＤＮＡクローンの単離 。 ＩＡＰのBIRドメインのポリペプチド共通配列を使ってIncyte ESTデータベー
スの分析に基づいて、226 bpのＥＳＴ配列（Incyte クローン#1419118）が同定
された。そのＥＳＴ配列から推定したペプチド配列を使ったtblastnデータベー
ス（ＧＣＧパッケージ）検索は、この遺伝子産物のアミノ酸残基19から75までと
ヒトアポプトシスタンパク質１阻害剤（HIAP1）の部分的BIR領域に有意な程度の
相同性があることを明らかにした。この57アミノ酸遺伝子産物とHIAP1の部分的B
IR1，BIR2およびBIR3配列との間には42％〜47％の同一性が認められ、このこと
はこの遺伝子産物がHIAP1の相同物であることを示唆している。

【０２１２】 Ａ．５′および３′RACE（ｃDNA末端の５′および３′迅速増幅 ＥＳＴ配列から誘導したオリゴヌクレオチドプライマーを使って５′末端およ
び３′末端ｃＤＮＡをクローニングした。Clontech Inc.（South San Francisco
）からMarathon-ready ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡを購入し、鋳型として使った。RAC
E反応は製造業者（Clontech Inc.）の教示に従って実施した。

【０２１３】 ５′RACEに使ったオリゴヌクレオチドプライマーは下記のものである： 5’ CCTTCCTGGCTCCTGGGCACTTTCAGA 3’ （配列番号３） 5’ GCCCCCATAGCAGAAGAAGCACCTC 3’ （配列番号４） 5’ GACGCAACTCCTCAGAGCCCATGCC 3’ （配列番号５）

【０２１４】 ３′RACEに使ったオリゴヌクレオチドは下記のものである： 5’ GGCATGGGCTCTGAGGAGTTG 3’ （配列番号６） 5’ CAAGGTGAGGTGCTTCTTCTGCTA 3’ （配列番号７）

【０２１５】 ＰＣＲ生成物をpCRIIベクター（Invitrogen）中にクローニングした。合計12
個のクローンを配列分析した。７個のクローンがＥＳＴ配列と重複する配列を有
する。

【０２１６】 Ｂ．ＤＮＡおよびタンパク質配列分析 上記クローンとＥＳＴクローンのＤＮＡ配列をＧＣＧ集成プログラムを使って
集成した。選られた連続ＤＮＡ配列を使ってデータベースを検索した。Incyteデ
ータベース中に２つのクローンそして公開ＥＳＴデータベースから１つのクロー
ンが同定された。Incyteからの１つのクローン（2953985）を注文しそして配列
分析した。配列分析データはｃＤＮＡ配列が1337 bpを含むことを示した。この
ｃＤＮＡ配列をhiap3と命名した。コード領域に隣接する５′非翻訳領域に169 b
pがありそして３′非翻訳領域に274 bpがある〔図１（配列番号１）および図３
〕。

【０２１７】 コード領域は894 bpから成る。298アミノ酸残基の転写解読枠が同定された。
ポリヌクレオチド位置170に開始コドンＡＴＧが存在し、適当なKozak配列を有し
、ポリヌクレオチド位置110には上流終止コドンが存在する〔図１（配列番号１
）および図３〕。

【０２１８】 推定タンパク質配列〔図２（配列番号２）〕の分析は、アミノ酸位置88から15
5までに及ぶ１つのBIRドメインを明らかにした（図４）。HIAP3のBIRドメインと
ヒトまたはマウスIAP1またはIAP2のいずれかの第三BIRドメインの間には約50％
の同一性がある。Genetic Computer Group PileUP演算法を使った分析は、IAPフ
ァミリーの別メンバーと非常に高い相同性があることを示す（図４および５）。
HIAP3は、３個のシステインと１個のヒスチジンを含むBIR特徴（シグネチュア）
残基を有する。特徴システイン、ロイシンおよびヒスチジン残基を有する、アミ
ノ酸（aa）位置240〜289のペプチド配列を含むRINGドメインも同定された（図４
）。HIAP3のRINGドメインとヒトHIAP-1のRINGドメイン間には84％の同一性があ
る。PileUP分析はファミリーのメンバー内で非常に高い相同性があることを示す
（図５）。

【０２１９】２．ノーザンブロット分析 。 ５′RACEクローン〔プライマー 5’ GCCCCCATAGCAGAAGAAGCACCTC 3’（配列番
号４）を使って作製された#1-1L2〕から単離された414 bpのAva1断片を使ってノ
ーザンブロットを探査した。Boehringer Mannheimから購入した高プライム標識
キットを使って、この断片を³²Ｐ−ｄCTPで標識した。ヒト多組織ノーザンブロ
ットＩおよびII、ヒト胎児組織ブロット、ヒト免疫系組織ブロット（Clontech）
並びにヒト多腫瘍組織ブロット（Biochain）を製造業者の教示（Clontech）に従
って高緊縮性条件下で探査した。その結果は、hiap3が主に胎盤、リンパ節、胎
児腎臓および腎臓癌において発現されることを示す。第二の５′RACEクローン〔
プライマー5' CCTTCCTGGCTCCTGGGCACTTTCAGA 3'（配列番号３）を使って作製さ
れた#9-9-1〕から単離された387 bpのNarI-KpnI断片を第二のプローブとして使
って、それらの実験を確かめた。

【０２２０】 hiap3全長ｃＤＮＡ配列に関するＧＣＧパッケージからのBLAST演算法を使った
Incyteデータベースの分析は、Incyteデータベース中に合計９個のＥＳＴクロー
ン（元のＥＳＴクローンを含む）を明らかにした。それらのクローンは2953985,
1419118, 1418580, 3842242, 4589046, 1529102, 3673370, 1520835およびEST9
2646である。３個のクローンは胎児腎臓ライブラリーからであり、１個はマスト
細胞ライブラリーからであり、１個は樹状突起細胞ライブラリーからであり、１
個は臍静脈由来の単核細胞からであり、１個のクローンは胎盤からであり、１個
のクローンは膀胱癌からであり、そして１個のクローンは皮膚癌組織からである
。それらのＥＳＴクローンの分布はノーザンブロット分析において観察されたの
と同様であり、これはHIAP3が発達、造血／免疫系および腫瘍形成において重要
な役割を果たすかもしれないことを示唆している。

【０２２１】 上記明細書中に言及した全ての刊行物および特許は、参考として本明細書中に
組み込まれる。本発明をそれの特定態様に関して説明してきたけれども、本発明
の真の精神および範囲から逸脱せずに様々な変更を行うことができ且つ同等物に
より置換することができることは、当業者により理解されることであろう。その
上、特定の状況、材料、物の組成、工程、工程段階を本発明の目的、精神および
範囲に適合させるために多くの変更を行うことが可能である。そういった全ての
変更は添付の特許請求の範囲の中に含まれるものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

次の図面は本発明の一態様を描写したものである。それらは単に例示であって
、特に断らない限り本明細書中に開示される本発明を限定するものではない。

【図１】 図１はHIAP3をコードするhiap3のポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す
。

【図２】 図２は、HIAP3の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図３】 図３は、HIAP3ポリペプチド内の機能的ドメインの概略図を示す。

【図４】 図４は、HIAP3のBIRドメインとIAPタンパク質ファミリーの別メンバーのBIRド
メインとのアミノ酸整列を示す。

【図５】 図５は、HIAP3のRINGドメインとIAPタンパク質ファミリーの別メンバーのRING
ドメインとのアミノ酸整列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 9/10 ４Ｃ０８４ 48/00 25/14 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 9/04 25/28 ４Ｃ０８７ 9/10 31/12 ４Ｈ０４５ 25/14 35/00 25/28 37/02 31/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 16/18 37/02 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 16/18 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 モーサー，マイケル ジョン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94114， サンフランシスコ，サンチェス ストリー ト 746 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 CA12 CA20 DA01 DA02 DA05 DA11 DA12 EA04 GA11 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ43 QQ53 QR32 QR35 QR40 QR56 QS34 QX02 4B064 AG01 CA01 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 BA44 CA18 CA53 CA59 MA01 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA35 MA36 MA37 MA41 MA44 MA52 MA59 MA66 NA14 ZA152 ZA362 ZB072 ZB262 ZB332 ZC412 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA35 MA36 MA37 MA41 MA44 MA52 MA59 MA66 NA14 ZA15 ZA36 ZB07 ZB26 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 MA01 MA17 MA22 MA23 MA24 MA28 MA35 MA36 MA37 MA41 MA44 MA52 MA59 MA66 NA14 ZA15 ZA36 ZB07 ZB26 ZB33 ZC41 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71 FA74

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のオリゴヌクレオチド (a) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコ
   ードするポリヌクレオチド； (b) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸289までを含んでな
   るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (c) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸155までを含んでな
   るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (d) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸240からアミノ酸289までを含んでな
   るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および (e) (a), (b), (c)または(d)のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオ
   チド から成る群より選ばれたメンバーに対して少なくとも70％の同一性を有するポリ
   ヌクレオチドを含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポ
   リヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポ
   リヌクレオチド。
4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記
   載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが図２（配列番号２）に記載のアミノ
   酸１からアミノ酸298までを含んでなるポリペプチドをコードする、請求項２に
   記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドが図２（配列番号２）に記載のアミノ
   酸88からアミノ酸289までを含んでなるポリペプチドをコードする、請求項２に
   記載のポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドが図２（配列番号２）に記載のアミノ
   酸88からアミノ酸155までを含んでなるポリペプチドをコードする、請求項２に
   記載のポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 前記ポリヌクレオチドが図２（配列番号２）に記載のアミノ
   酸240からアミノ酸289までを含んでなるポリペプチドをコードする、請求項２に
   記載のポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 前記ポリヌクレオチドが図１に記載のヌクレオチド１からヌ
   クレオチド1337までの配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 前記ポリヌクレオチドが図１に記載のヌクレオチド170か
    らヌクレオチド1064までの配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチ
    ド。
11. 【請求項１１】 請求項２のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１のベクターを含んでなる宿主細胞。
13. 【請求項１３】 ポリペプチドの生産方法であって、請求項１２の宿主細胞
    からポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させることを含ん
    でなる方法。
14. 【請求項１４】 前記ポリペプチドが図２（配列番号２）に記載のアミノ酸
    １からアミノ酸298までを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記ポリペプチドが図２（配列番号２）に記載のアミノ酸
    88からアミノ酸289までを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ポリペプチドが図２（配列番号２）に記載のアミノ酸
    88からアミノ酸155までを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記ポリペプチドが図２（配列番号２）に記載のアミノ酸
    240からアミノ酸289までを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
18. 【請求項１８】 ポリペプチドの生産方法であって、前記ポリペプチドは図
    ２（配列番号２）に示される配列を含んでなり、 (a) 前記ポリペプチドが発現される条件下で請求項１２の宿主細胞を培養し；
    そして (b) 培養物から前記ポリペプチドを回収する という段階を含んでなる方法。
19. 【請求項１９】 ポリペプチドを発現する細胞の生産方法であって、請求項
    １１のベクターを使って前記細胞を遺伝子操作することを含んでなる方法。
20. 【請求項２０】 次のポリペプチド (a) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； (b) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88から289までを含んでなるポリペ
    プチド； (c) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸155までを含んでな
    るポリペプチド； (d) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸240からアミノ酸289までを含んでな
    るポリペプチド；および (e) (a), (b), (c)または(d)のポリペプチドに少なくとも70％同一であるポリ
    ペプチド から成る群より選ばれたメンバーを含んでなるポリペプチド。
21. 【請求項２１】 前記ポリペプチドが図２に記載のアミノ酸１からアミノ酸
    298までを含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。 【請求項２１】 前記ポリペプチドが図２に記載のアミノ酸88からアミノ酸
    289までを含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
22. 【請求項２２】 前記ポリペプチドが図２に記載のアミノ酸88からアミノ酸
    155までを含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
23. 【請求項２３】 前記ポリペプチドが図２に記載のアミノ酸240からアミノ
    酸289までを含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
24. 【請求項２４】 ヒト患者における病気状態の治療薬の製造のための、 (a) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； (b) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88から289までを含んでなるポリペ
    プチド； (c) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸155までを含んでな
    るポリペプチド； (d) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸240からアミノ酸289までを含んでな
    るポリペプチド；および (e) (a), (b), (c)または(d)のポリペプチドに少なくとも70％同一であるポリ
    ペプチド から成る群より選ばれたメンバーを含んでなるポリペプチドの使用であって、前
    記病気状態が不適切なアポプトシスに関連づけられ、そして前記患者が前記ポリ
    ペプチドのレベル増加を必要としており、そして前記治療が治療的有効量の前記
    ポリペプチドを前記患者に投与することを含んでなることを特徴とする使用。
25. 【請求項２５】 前記治療的有効量が、前記ポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチドを提供しそして前記ポリペプチドを生体内で発現させることにより
    患者に投与される、請求項２４に記載の使用。
26. 【請求項２６】 ヒト患者における病気状態の治療薬の製造のための、 (a) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； (b) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88から289までを含んでなるポリペ
    プチド； (c) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸155までを含んでな
    るポリペプチド； (d) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸240からアミノ酸289までを含んでな
    るポリペプチド；および (e) (a), (b), (c)または(d)のポリペプチドに少なくとも70％同一であるポリ
    ペプチド から成る群より選ばれたメンバーを含んでなるポリペプチドをコードするＲＮＡ
    を特異的に開裂させるリボザイムの使用であって、前記病気状態が不適当なアポ
    プトシスに関連づけられ、そして前記患者が前記ポリペプチドのレベル低下を必
    要としていることを特徴とする使用。
27. 【請求項２７】 ヒト患者における病気状態の治療薬の製造のための、 (a) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； (b) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88から289までを含んでなるポリペ
    プチド； (c) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸155までを含んでな
    るポリペプチド； (d) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸240からアミノ酸289までを含んでな
    るポリペプチド；および (e) (a), (b), (c)または(d)のポリペプチドに少なくとも70％同一であるポリ
    ペプチド から成る群より選ばれたメンバーを含んでなるポリペプチドをコードするポリヌ
    クレオチドに相補的であるポリヌクレオチドの使用であって、前記病気状態が不
    適当なアポプトシスに関連づけられ、そして前記患者が前記ポリペプチドのレベ
    ル低下を必要としていることを特徴とする使用。
28. 【請求項２８】 診断法であって、宿主から得られた試料中の、次の群： (a) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； (b) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88から289までを含んでなるポリペ
    プチド； (c) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸155までを含んでな
    るポリペプチド； (d) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸240からアミノ酸289までを含んでな
    るポリペプチド；および (e) (a), (b), (c)または(d)のポリペプチドに少なくとも70％相同であるポリ
    ペプチド から成る群より選ばれたメンバーを含んでなるポリペプチドの存在を分析するこ
    とを含んでなる方法。
29. 【請求項２９】 診断法であって、宿主から得られた試料中の、 (a) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチド； (b) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88から289までを含んでなるポリペ
    プチドをコードするポリヌクレオチド； (c) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸155までを含んでな
    るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (d) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸240からアミノ酸289までを含んでな
    るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および (e) (a), (b), (c)または(d)のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌ
    クレオチド から成る群より選ばれたメンバーに対して少なくとも70％の同一性を有するポリ
    ヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドの存在について分析することを含ん
    でなる診断方法。
30. 【請求項３０】 単離された抗体であって、 (a) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド； (b) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88から289までを含んでなるポリペ
    プチド； (c) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸88からアミノ酸155までを含んでな
    るポリペプチド； (d) 図２（配列番号２）に記載のアミノ酸240からアミノ酸289までを含んでな
    るポリペプチド；および (e) (a), (b), (c)または(d)のポリペプチドに少なくとも70％同一であるポリ
    ペプチド から成る群より選ばれたメンバーを含んでなるポリペプチドに特異的である、単
    離された抗体。