CN1345329A - 肿瘤坏死因子受体6α和6β - Google Patents

肿瘤坏死因子受体6α和6β Download PDF

Info

Publication number
CN1345329A
CN1345329A CN00804601A CN00804601A CN1345329A CN 1345329 A CN1345329 A CN 1345329A CN 00804601 A CN00804601 A CN 00804601A CN 00804601 A CN00804601 A CN 00804601A CN 1345329 A CN1345329 A CN 1345329A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
polypeptide
tnfr
seq
residue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN00804601A
Other languages
English (en)
Inventor
赖纳·L·根茨
倪健
赖因哈德·埃布纳
余国良
史蒂文·M·鲁宾
冯平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Human Genome Sciences Inc
Original Assignee
Human Genome Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Human Genome Sciences Inc filed Critical Human Genome Sciences Inc
Publication of CN1345329A publication Critical patent/CN1345329A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

本发明涉及新的肿瘤坏死因子受体蛋白,特别是提供了编码人肿瘤坏死因子受体6α和6β蛋白的分离的核酸分子。本发明还提供了TNFR 6α和6β多肽,以及用于生产所述多肽的载体,宿主细胞和重组方法。本发明进一步涉及用于鉴定TNFR 6α和6β活性的激动剂和拮抗剂的筛选方法。本发明也提供了用于检测免疫系统相关的紊乱的诊断方法和用于治疗免疫系统相关的紊乱的治疗方法。

Description

肿瘤坏死因子受体6α和6β
发明领域
本发明涉及编码作为TNF受体家族成员的多肽的新的人基因。更为具体的是，本发明提供了编码此后有时称做“TNFR-6α，和TNFR-6β”或统称为“TNFR-多肽”的名为肿瘤坏死因子受体6α和6β的人多肽的分离的核酸分子。本发明也提供了TNFR多肽，用于生产该多肽的载体、宿主细胞和重组方法。本发明进一步涉及筛选用于鉴定TNFR多肽活性的激动剂和拮抗剂的方法。本发明也提供了应用这些组合物的诊断和治疗方法。
发明背景
许多生物学功能例如对某些刺激和自然生物学过程的应答都受因子如细胞因子的控制。许多细胞因子都是通过与受体相互作用并且产生细胞内应答而起作用的。
例如，肿瘤坏死因子α和β就是通过TNF受体起作用从而调控各种生物学过程包括抗感染和诱导休克和炎性疾病的细胞因子。TNF分子属于“TNF配体”超家族，并且与它们的受体或反配体“TNF受体超家族”一起起作用。目前为止，TNF配体超家族的9个成员和TNF受体超家族的10个成员已经被鉴定出。
配体包括TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，也称做TNF-β)、LT-β(在LT-α2-β异源三聚体复合物中发现)、FasL、CD40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、OX40L和神经生长因子(NGF)。TNF受体超家族包括p55TNF受体、p75TNF受体、TNF受体相关蛋白、FAS抗原或APO-1、CD40、CD27、CD30、4-1BB、OX40、低亲和性的p75和NGF受体(Meager，A.，生物学，22：291-295(1994))。
TNF配体超家族的许多成员都是由激活的T细胞表达的，这暗示它们是T细胞与作为细胞个体发育和功能基础的其它类型的细胞之间的相互作用所必需的(Meager，A.，Supra)。
在鉴定和产生丧失了这些蛋白质表达能力的突变体的过程中，获得了对TNF受体家族中某些成员的基本功能的深刻理解。例如，FAS抗原及其配体的天然突变导致淋巴增殖性疾病(Watanaba-Fukunaga，R.等，自然356：314(1992))。这可能反映了细胞程序性死亡的失败。CD40配体的突变导致以血浆中高水平的免疫球蛋白M和低水平的免疫球蛋白G为特征的X相关的免疫缺陷状态，表明缺陷的T细胞依赖的B细胞的激活(Allen，R.C.等，科学259：990(1993))。对低亲和性的神经生长因子进行的靶向突变导致以外周结构的缺陷的感觉更新为特征的紊乱(Lee，K.F.等，细胞69：737(1992))。
TNF和LT-α能够与两种TNF受体(55kd和75kd的TNF受体)结合。许多由TNF和LT-α通过它们的受体起作用而引发的生物学效应包括移植肿瘤的出血性坏死、细胞毒性、内毒素休克中的作用、炎症、免疫调节、增殖和抗病毒应答、以及抗电离辐射的有害效应等。TNF和LT-α与多种疾病的致病过程相关，包括内毒素休克、脑疟疾、肿瘤、自身免疫性疾病、AIDS和移植宿主排斥(Beutler，B.和Von Huffel，C.，科学264：667-668(1994))。p55受体的突变导致对微生物感染的易感性增加。
而且，据报道TNFRl(p55)和Fas的近C末端大约80个氨基酸的区段为“死亡区”，这段区域负责传导细胞程序性死亡的信号(Tartaglia等，细胞74：845(1993))。凋亡或细胞程序性死亡是多细胞器官的正常发育和稳态所必需的生理过程(H.Steller，科学267：1445-1449(1995))。凋亡受到扰乱对某些人类疾病包括癌症、神经变性紊乱以及获得性免疫缺陷综合症的致病具有促进作用(C.B.Thompson，科学267：1456-1462(1995))。最近，人们的注意力更多地集中于两种细胞表面死亡受体Fas/APO-1和TNFR-1的信号传导和生物学功能上(J.L.Cleveland，J.N.Ihle，细胞81，479-482(1995)；A.Fraser，G.Evan，细胞85，781-784(1996)；S.Nagata，P.Golstein，科学267，1449-56(1995))。它们都是TNF受体家族的成员，此家族还包括TNFR-2，低亲和性的NGFR、CD40和CD30以及其它分子(C.A.Smith等，科学248，1019-23(1990)；M.Tewari，V.M.Dixit，在M.Purton，Heldin，Carl编著的分子和细胞生物学一书的模块文本中(Chapman和Hall，伦敦，1995))。家族成员在其细胞外结构域中存在半胱氨酸丰富的重复序列，Fas/APO-1和TNFR-1还共享一个细胞外同源区，命名为“死亡区”，此区与果蝇属自杀基因reaper远缘相关(P.Golstein，D.Marguet，V.Depraetere，细胞81，185-6(1995)；K.White等，科学264：677-83(1994))。这个共享的死亡区表明这两种受体分子都与一系列相关的至今仍未阐明的信号传导分子相互作用。Fas/APO-1的激活募集了含有死亡区的衔接分子FADD/MORT1(A.M.Chinnaiyan，K.O’Rourke，M.Tewari，V.M.Dixit细胞81，505-12(1995)；M.P.Boldin等，生命的化学期刊270，7759-8(1995)；F.C.Kischkel等，EMBO 14，5579-5588(1995))，这个分子结合并且预先激活前凋亡蛋白酶ICE/CED-3家族的一个成员FLICE/MACH1(M.Muzio等，细胞85，817-827(1996)；M.P.Boldin，T.M.Goncharov，Y.V.Goltsev，D.Wallach，细胞85，803-815(1996))。Fas/APO-1的中心作用是引发细胞死亡，而TNFR-1能够向一系列不同的生物学活性传导信号，其中许多都源自其激活NF-KB的能力(L.A.Tartaglia，D.V.Goeddel，今日免疫学13，151-3(1992)。因此，TNFR-1募集多价的衔接分子TRADD，此分子与FADD一样也含有一个死亡区(H.Hsu，J.Xiong，D.V.Goeddel，细胞81，495-504(1995)；H.Hsu，H.-B.Shu，M.-P.Pan，D.V.Goeddel，细胞84，299-308(1996))。通过它与许多信号传导分子包括FADD，TRAF2和RIP相关，TRADD能够为凋亡和NF-KB激活传导信号(H.Hsu，H.-B.Shu，M.-P.Pan，D.V.Goeddel，细胞84，299-308(1996)；H.Hsu，J.Huang，H.-B.Shu，V.Baichwal，D.V.Goeddel，免疫4，381-396(1996))。
TNF家族配体和TNF家族受体的效应是不同的，并且影响到哺乳动物系统生物学过程中的许多正常的以及异常的功能。因此，现在很有必要对这些影响正常状态以及疾病状态下生物学活性的受体和配体进行鉴别和鉴定。分离和鉴定TNF受体家族的新成员尤其必要。
发明概述
本发明提供了分离的包含或由编码具有分别在SEQ ID NOS：2和4中所示的完整氨基酸序列或由ATCC保藏号为97810和97809的保藏为质粒DNA形式的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列的TNFR(即，TNFR-6α或TNFR-6β多肽)的至少一部分的多核苷酸所组成的核酸分子。对保藏的TNFR-6α或TNFR-6β克隆进行测序所测定的核苷酸序列，如图1和图2所示(SEQ ID NOS分别为1和3)，分别含有编码300个和170个氨基酸残基的全长多肽的开放读码框，其中包括分别位于SEQ ID NOS：1和3中25-27位和73-75位核苷酸的编码N末端氨基酸的起始密码子。
本发明的TNFR蛋白与其它TNF受体具有序列同源性。TNFR-6α和TNFR-6β的剪接变体与人TNFR-I和TNFR-II(图3)(SEQ IDNOS分别为5和6)mRNAs的翻译产物具有最高程度的序列同源性，后者也含有多个保守的富含半胱氨酸的区域。
TNFR-6α和TNFR-6β多肽都具有推测的30个氨基酸的前导序列，在图1和图2中31-300位氨基酸残基(SEQ ID NO：2)和31-170位氨基酸残基(SEQ ID NO：4)分别表示了推测的成熟TNFR-6α和TNFR-6β多肽的氨基酸序列。
因此，本发明一方面提供了一种分离的核酸分子，此核酸分子包含或由具有选自以下各组核苷酸序列的多核苷酸所组成：(a)编码具有SEQ ID NOS：2和4完整氨基酸序列，或如同在ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列的TNFR多肽的核苷酸片段；(b)编码具有SEQ ID NO：2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-170位氨基酸序列的成熟TNFR多肽，或如同在ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的多肽的核苷酸片段；(c)编码具有SEQ IDNO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽的可溶性胞外区的核苷酸序列，或如同在ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的多肽胞外区的核苷酸片段；(d)编码具有SEQ ID NO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽片段的核苷酸序列，或如同在ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的多肽片段，其中所述的多肽片段具有TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性；和(e)与上述(a)(b)(c)(d)或(e)中任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明另外的实施方案包括含有或由与上述(a)(b)(c)(d)和(e)中任何一种核苷酸序列具有至少90％相同性，更优选至少80％，85％，90％，92％或95％，96％，97，98％或99％相同性的多核苷酸，或在严格杂交条件下与上述(a)(b)(c)(d)或(e)中多核苷酸杂交的多核苷酸所组成的分离的核酸分子。能够杂交的多核苷酸在严格杂交条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基构成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。本发明的另外一个核酸实施方案涉及包含或由编码具有上述(a)(b)(c)或(d)氨基酸序列的TNFR多肽表位携带部分氨基酸序列的多核苷酸所组成的分离的核酸分子。
本发明也涉及包括本发明分离的核酸分子在内的重组载体、含有重组载体的宿主细胞以及生产这些载体和宿主细胞的方法和通过重组技术利用它们生产TNFR多肽或肽的方法。
本发明另外提供了包含选自下列各组的氨基酸序列的分离的TNFR多肽：(a)具有SEQ ID NOS：2或4中所示的完整氨基酸序列的或如同ATCC保藏号97810或97809中所含cDNA克隆所编码的全长TNFR多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO：2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-170位氨基酸序列，或如同ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的成熟TNFR多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-166位氨基酸序列，或如同ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的TNFR多肽的可溶性胞外区的氨基酸序列；或(d)具有SEQ ID NO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-166位氨基酸序列，或如同ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的TNFR多肽片段的氨基酸序列，其中上述片段具有TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性。
本发明的多肽也包括与上述(a)(b)(c)或(d)中所述的多肽具有至少80％氨基酸序列相同性，更优选至少85％相同性，90％，92％，95％，96％，97，98％或99％相同性的多肽，以及与上述(a)(b)(c)或(d)中所述的多肽具有至少90％氨基酸序列相似性，更优选至少80％，85％，90％，92％或95％相似性的多肽。
本发明这一方面另外的一个实施方案涉及包含具有上述(a)(b)(c)或(d)中所述的氨基酸序列的TNFR.多肽携带表位部分氨基酸序列的肽或多肽。具有本发明TNFR多肽携带表位部分氨基酸序列的肽或多肽包括至少6或7，优选至少9，更优选至少30-50个氨基酸的这些多肽的一部分，当然本发明也包括任何长度的携带表位的上述多肽，包括本发明多肽的完整氨基酸序列。
在另外一个实施方案中，本发明提供了一种能够与具有上述a)(b)(c)或(d)中所述的氨基酸序列的TNFR多肽特异性结合的分离的抗体。本发明另外提供了分离能够与具有文中所述的氨基酸序列的TNFR多肽特异性结合的抗体的方法。如下所述，这些抗体在诊断和治疗中非常有用。
已知肿瘤坏死因子(TNF)家族配体属于能够引发许多种细胞应答的最多效的细胞因子，其中包括细胞毒性、抗病毒活性以及一些基因的转录后调控。本发明也提供了含有TNFR多肽，优选人TNFR多肽的药物组合物，这些药物组合物可施用于，例如治疗传染性疾病包括HIV感染、内毒素休克、癌症、自身免疫性疾病、移植宿主排斥、急性移植排斥、慢性移植排斥、神经变性紊乱、脊髓发育不良症状、局部缺血性损伤(例如心脏局部缺血性损伤)、毒素诱导的肝脏疾病、脓毒性休克、恶病质和厌食。本发明也提供了对需要TNFR多肽的个体进行治疗的方法。
本发明另外提供了用于体外、离体或体内向细胞或多细胞器官施与包含TNFR多核苷酸或TNFR多肽的组合物。在本发明此方面的几个特别优选的实施方案中，组合物包含TNFR多核苷酸以在宿主器官中表达TNFR多肽治疗疾病。从这一点上来说，特别优选的是在病人中表达以治疗与TNFR多肽异常的内源活性相关的机能异常。
另一方面，本发明提供了激动剂以及拮抗剂的筛选方法，此方法用于测定候选组合物对TNFR多肽与TNF家族配体结合的效应。特别是，此方法涉及使TNF家族配体与TNFR多肽和侯选组合物结合，并且测定TNFR多肽与TNF家族配体的结合是否由于侯选化合物的存在而被增强或减弱。在此分析方法中，相对于标准结合而言，TNFR多肽结合的增强意味着侯选化合物是TNFR多肽结合活性的激动剂；与标准结合相比，TNFR多肽结合的减弱意味着此化合物是TNFR多肽结合活性的拮抗剂。
内皮细胞、角质细胞、正常前列腺以及前列腺肿瘤组织均表达TNFR-6α和TNFR-6β。对于大多数这些组织或细胞的异常来说，特别是免疫系统紊乱来说，与“标准的”TNFR基因表达水平，即不具有免疫系统紊乱的个体的健康组织的TNFR表达水平相比，从具有这样的异常的个体中采集的某些组织(例如癌组织)或体液(例如精液、血浆、尿液、滑液或脊髓液)中可以检测到TNFR基因表达水平的显著升高或降低。因此，本发明提供了一种在诊断这种紊乱中有用的诊断方法，此方法涉及：(a)分析个体细胞或体液中的TNFR基因表达水平；(b)将TNFR基因表达水平与标准的TNFR基因表达水平进行比较，因此与标准的表达水平相比，所分析的TNFR基因表达水平的升高或降低预示着免疫系统的紊乱。
本发明的另外一个方面涉及对需要增加体内TNFR多肽活性水平的个体进行治疗的方法，此方法包含向此个体施与一种含有治疗学有效量的本发明的TNFR多肽或其激动剂的组合物。
本发明的另外一个方面涉及对需要降低体内TNFR多肽活性水平的个体进行治疗的方法，此方法包含向此个体施与一种含有治疗学有效量的TNFR拮抗剂的组合物。本发明优选使用的拮抗剂是TNFR特异性抗体。
附图的简要描述
图1显示了TNFR-6α的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。起始的30个氨基酸(下划线)是推测的前导序列。
图2显示了TNFR-6β的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。起始的30个氨基酸(下划线)是推测的前导序列。
图3显示应用DNAstar中的Megaline程序，利用Clustal方法将TNFR-6α(TNFR-6 alpha(SEQ ID NO：2))和TNFR-6β(TNFR-6 beta(SEQ ID NO：4))的氨基酸序列与其它TNF受体如TNFR1(SEQ IDNO：5)、TNFR2(SEQ ID NO：6)、NGFR(SEQ ID NO：7)、LTbR(SEQ ID NO：8)、FAS(SEQ ID NO：9)、CD27(SEQ ID NO：10)、CD30(SEQ ID NO：11)、CD40(SEQ ID NO：12)、4-1BB(SEQ IDNO：13)、OX40(SEQ ID NO：14)、VC22(SEQ ID NO：15)和CRMB(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列进行序列比较的结果。
图4和图5分别显示了对TNFR-6α和TNFR-6β的氨基酸序列单独分析的结果。使用所述的计算机程序在缺省参数的情况下分别对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中氨基酸序列进行预测，显示了α、β、转角和卷曲区；疏水性；两亲性区；柔性区；抗原性指数和表面概率。在抗原性指数-Jameson-Wolf”图中显示了TNFR-6α和TNFR-6β的高抗原性区的位置，即获得本发明携带表位的肽的区域。TNFR-6α的抗原性区包括从大约31位的丙氨酸到大约46位的苏氨酸，从大约57位的苯丙氨酸到大约117位的苏氨酸，从大约132位的半胱氨酸到大约175位的苏氨酸，从大约185位的甘氨酸到大约194位的苏氨酸，从大约205位的缬氨酸到大约217位的天冬氨酸，从大约239位的脯氨酸到大约264位的亮氨酸，从大约283位的丙氨酸到大约298位的脯氨酸(SEQ ID NO：2)；TNFR-6β的抗原性区包括从大约31位的丙氨酸到大约46位的苏氨酸，从大约57位的苯丙氨酸到大约80位的谷氨酰胺，从大约86位的谷氨酸到大约106位的组氨酸，从大约108位的苏氨酸到大约119位的苯丙氨酸，从大约129位的组氨酸到大约138位的缬氨酸，从大约142位的甘氨酸到大约166位的脯氨酸(SEQID NO：4)。通过Jameson-Wolf抗原性指数分析已经测定出这些多肽片段含有TNFR-6α和TNFR-6β多肽的抗原性表位。
图4和图5中的数据也分别出现在表I和表II的表中。表中各栏分别标为“氨基酸残基”，“位置”以及罗马数字I-XIV。各栏标题是指出现在图4(表I)和图5(表II)中的氨基酸序列的下列特征：“残基”：SEQ ID NO：2(图1)或SEQ ID NO：4(图2)中的氨基酸残基；“位置”：SEQ ID NO：2(图1)或SEQ ID NO：4(图2)中对应的氨基酸残基的位置；I：α，Garnier-Roboson区；II：α，Chou-Fasman区；III：β，Garnier-Roboson区；VI：β，Chou-Fasman区；V：转角，Garnier-Roboson区；VI：转角，Chou-Fasman区；VII：螺旋，Garnier-Roboson区；VIII：疏水性，Kyte-Doolittle区；IX：疏水性，Hopp-Woods区；X：α，Eisenberg两亲性区；XI：β，Eisenberg两亲性区；XII：Karplus-Schulz柔性区；XIII：Jameson-Wolf抗原性指数和XIV：Eimini区的表面概率。
图6显示了与SEQ ID NOS：1和3相关的HELDIO6R(SEQ IDNO：17)和HCEOW38R(SEQ ID NO：18)的核苷酸序列。
图7A-B显示了TNFR-6α阻断Fas配体介导的细胞死亡。用Fas配体和TNFR-6αFc受体组合处理Jurkat-T细胞16小时。为了测量处理后的存活细胞水平，将细胞与10％的ALOMAR蓝染料孵育5小时后用分光光度计测量570-630纳米波长下的光密度值。所有的样品都设3个复孔。与Fas配体一样，TNFR-6αFc似乎以一种剂量依赖的方式有效地阻断Fas配体介导的Jurkat细胞的凋亡。
详细描述
本发明提供了分离的核酸分子，此核酸分子包含或由通过对克隆的cDNA进行测序而测定的，编码具有分别在SEQ ID NOS：2和4中所示的氨基酸序列的TNFR-6α或TNFR-6β多肽、统称为“TNFR多肽”的多核苷酸所组成。图1和图2(SEQ ID NOS：1和3)中所示的核苷酸序列是通过分别对HPHAE52和HTPCH84克隆测序而获得的，HPHAE52和HTPCH84于1996年11月22日被保藏在位于美国弗吉尼亚州20110-2209，Manassas市Boulevard大学大道的美国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为ATCC 97810和97809。所保藏的克隆被包含在pBluescripts SK(-)质粒中(Stratagene，La Jolla，加州)。
本发明的TNFR-6α和TNFR-6β蛋白为在各自蛋白N末端142个氨基酸残基上具有相同核苷酸序列和氨基酸序列的剪接变体。这些蛋白的氨基酸序列与人TNFR-2mRNA的翻译产物(图3)(SEQ IDNO：6)具有大约23％的相似性并且共同享有多个半胱氨酸丰富的保守区。更为重要的是，这些蛋白在包括4个重复的半胱氨酸丰富基序并且具有显著的亚单位间同源性的多肽序列上具有显著的序列相同性。据认为TNFR-2专有性地通过TNF介导人T细胞的增殖(PCTWO/94/09137)。
核酸分子
除非另做说明，所有通过对本文中DNA分子测序而测定的核苷酸序列都是应用全自动DNA测序仪(如位于加州Foser市的应用生物系统公司的373型)测定的，并且所有由本文中所测定的DNA分子编码的多肽的氨基酸序列都是通过将上述测定的DNA序列进行翻译而推测的。因此，对于任何通过自动测序方法测定的DNA序列来说，正如在本领域众所周知的，文中所测定的核苷酸序列可能含有一些错误。通过自动测序技术所测定的核苷酸序列与所测DNA分子的实际核苷酸序列具有至少90％的相同性，更典型的具有至少大约95％到至少99.9％的相同性。实际序列可以更精确地应用本领域众所周知的其它技术包括人工测序的方法而测定。也如同本领域所熟知的，与实际的序列相比，在测定的核苷酸序列中的一个单点插入或缺失将会导致核苷酸序列翻译中的读码框移动，以致于从这个插入点或缺失点开始由测定的核苷酸序列所编码的推测的氨基酸序列与由所测DNA分子的实际序列编码的氨基酸序列完全不同。
核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”用于DNA分子或多核苷酸是指脱氧核糖核苷酸的序列；如用于RNA分子或多核苷酸，是指相应的核糖核苷酸(A，G，C和U)的序列，其中在特定脱氧核糖核苷酸序列中的每一个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)都被核糖核苷酸尿嘧啶(U)替换。
利用本文中所提供的信息，例如在图1和图2(SEQ ID NOS：1和3)中所示的核苷酸序列，可以通过使用标准的克隆和筛选程序例如那些使用mRNA作为起始材料克隆cDNA的程序获得本发明编码TNFR多肽的核酸分子。举例说明本发明，在下列组织的cDNA文库中鉴别出了TNFR-6α和TNFR-6β克隆(分别见图1和图2)：内皮细胞、角质细胞、正常前列腺组织和前列腺肿瘤组织。
图1和图2(SEQ ID NOS：1和3)的TNFRcDNAs的测定的核苷酸序列含有分别编码300个和170个氨基酸残基的蛋白质的开放读码框，其起始密码子分别在图1和图2(SEQ ID NOS：1和3)中核苷酸序列的25-27位和73-75位核苷酸位置。
TNFR-6α和TNFR-6β基因的开放读码框与人TNFR-2mRNA的翻译产物共享序列同源性，包括分别见SEQ ID NO.2的大约31-283位氨基酸残基和SEQ ID NO.4的大约31-166位氨基酸残基的可溶性胞外区。
本领域技术人员应理解的是，由于存在上面所讨论的测序错误的可能性，由保藏的cDNAs所编码的包含大约300和大约170氨基酸的实际全长TNFR多肽可能会稍长或稍短一些。更普遍的是，实际的开放读码框可能位于图1和图2(SEQ ID NOS：1和3)N末端第一个推测的甲硫氨酸的±20个氨基酸范围内的任何位置，更可能位于±10个氨基酸范围内的任何位置，此甲硫氨酸位于框内，每个图中分别显示了翻译后的序列。需要进一步了解的是，根据用于鉴定不同功能区的分析标准，TNFR多肽的细胞外和跨膜区的精确“位置”可能和上面推测的位置会稍有不同。例如，根据用于限定功能域和抗原性区的标准，在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中细胞外功能区或抗原性区的精确位置可能会略有变化(例如，此位置可能会移动1-20个氨基酸残基，更可能是1-5个氨基酸残基)。在任何情况下，正如下面将要进一步讨论的，本发明另外提供了自全长多肽的N末端具有各种不同残基缺失的多肽，包括本文所描述的自细胞外功能区N末端缺少一个或多个氨基酸的多肽，这些多肽组成了TNFR-6α和TNFR-6β蛋白细胞外功能区的可溶性形式。
正如在SEQ ID NOS：2和4中所示，全长TNFR蛋白的氨基酸序列包括一段前导序列和一成熟蛋白。更为具体的是，本发明提供了编码TNFR蛋白成熟形式的核酸分子。因此，根据信号假说，一旦生长中的蛋白链自粗面内质网向外转运，由哺乳动物分泌的蛋白就具有一段从全长多肽中切割下来以产生“成熟”形式分泌蛋白的信号或分泌性前导序列。大多数的哺乳动物细胞甚至昆虫细胞同样特异地切割分泌蛋白。但是，在一些情况下，对分泌蛋白的切割并不是完全统一的，可能会导致两种或更多种成熟蛋白的产生。而且，人们早就知道分泌蛋白的切割特异性最终由此完整蛋白的一级结构决定，即，这是多肽氨基酸序列的内在特性。因此，本发明提供了一种编码具有由ATCC保藏号为97810或97809中鉴定的cDNA克隆所编码的氨基酸序列的成熟TNFR多肽的核苷酸序列。“具有如ATCC保藏号为97810或97809中保藏的质粒中所含有的cDNA克隆所编码的氨基酸序列的成熟TNFR多肽”意指保藏载体中所含的克隆的人DNA序列的开放读码框在哺乳动物细胞中(例如下面所述的COS细胞)表达产生的蛋白成熟形式。
此外，已经有方法用于推测是否一种蛋白具有分泌性前导序列，以及是否此蛋白的前导序列具有切割位点。例如.，McGeoch的方法(病毒研究，3：271-286(1985))利用从N末端一段短的带电荷的区域以及随后的全长(未切割)蛋白的不带电荷的区域中得到的信息。Von Heinje的方法(核酸研究，14：4683-4690(1986))利用从环绕在切割位点周围的氨基酸残基中得到的信息，典型的是从-13到+2残基，其中+1表示成熟蛋白的氨基酸残基。这些方法预测已知的哺乳动物分泌蛋白切割位点的准确性范围在75-80％之间(vonHeinje，supra)。但是，对于一种给定的蛋白来说，这两种方法并不总是产生相同的推测的切割位点。
在本发明中，使用“PSORT”计算机程序分析推导出全长TNFR多肽的氨基酸序列，此程序得自Kyoto大学化学研究所的Kenta Nakai博士，是一种根据氨基酸序列预测蛋白质在细胞内位置的专家系统。McGeoch和Von Heinje的方法被引入其中作为这种计算机定位预测的一部分。使用此程序对TNFR氨基酸序列的分析提供了以下结果：TNFR-6α和TNFR-6β分别编码具有SEQ ID NOS：2和4中31-300位和31-170位残基氨基酸序列的成熟多肽。
在某些优选的实施方案中，TNFR-6α和TNFR-6β分别编码具有SEQ ID NOS：2和4中31-299位和31-169位残基氨基酸序列的成熟多肽。
如上所示，本发明的核酸分子可以是RNA的形式，如mRNA，或是DNA的形式，包括例如通过克隆或合成技术产生的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链，也称为意义链，或也可以是非编码链，也称为反义链。
“分离的”核酸分子是指从其原始环境中分离出的DNA或RNA核酸分子。例如，就本发明而言，包含在载体中的重组DNA分子即被认为是“分离的”核酸分子。另外的分离的DNA分子包括在异源宿主细胞中维持的重组DNA分子或溶液中纯化的(部分或完全)的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录本。但是，包含在克隆中的作为一混合克隆文库成员(例如基因组或cDNA文库)并且未从本文库其它克隆中分离出的(例如，以含有此克隆但不包括文库中其它成员的同源溶液形式)或从一种细胞或细胞裂解中分离出的染色体不是“分离的”核酸分子。正如本文中进一步讨论的，根据本发明分离的核酸分子可以自然、重组或合成方式产生。
本发明分离的核酸分子包括含有在SEQ ID NOS：1和3所示的核苷酸序列中分别在25-27位和73-75位具有起始密码子的开放读码框的DNA分子。
本发明分离的核酸分子同时也包括含有分别在SEQ ID NOS：2和4的31-300位和31-170位所示的推测的成熟TNFR多肽序列的DNA分子。
本发明分离的核酸分子同时也包括含有分别在SEQ ID NOS：2和4的31-299位和31-169位所示的推测的成熟TNFR多肽序列的DNA分子。
此外，本发明分离的核酸分子包括含有序列与上述那些序列显著不同，但由于遗传密码的简并性仍然编码TNFR蛋白的DNA分子。当然，遗传密码和物种特异性密码子偏性是本领域众所周知的。因此，对于本领域熟练技术人员来说产生上述的简并性变体很普遍，例如，为了在特定宿主中优化密码子的表达(例如，将人mRNA中的密码子变为细菌宿主如大肠杆菌偏爱的密码子)。
另一方面，本发明提供了编码具有保藏号为ATCC97810或97809保藏的质粒中所含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列的TNFR多肽的分离的核酸分子。优选的，此核酸分子将编码由上述保藏的cDNA克隆所编码的成熟的多肽。
本发明另外提供了具有图1或图2(SEQ ID NOS：1和3)中所示核苷酸序列，或在上述保藏的克隆中所含的TNFR cDNA的核苷酸序列的核酸分子，或具有与上述序列之一互补的序列的核酸分子。这些分离的核酸分子，特别是DNA分子，是很有用的，例如，通过与基因组原位杂交用做基因图谱的探针，以及在人体组织中检测TNFR基因的表达，例如，通过核酸印迹分析。
本发明另外指向编码文中描述的部分核苷酸序列的核酸分子以及指向文中所述的分离的核酸分子的片段。特别是，本发明提供了具有代表SEQ ID NOS：1和3部分的核苷酸序列的多核苷酸，它们分别由SEQ ID NOS：1和3的25-924位和73-582位组成。本发明也指向编码缺少氨基端甲硫氨酸的TNFR多肽的多核苷酸，这样的多核苷酸具有代表SEQ ID NOS：1和3部分的核苷酸序列，它们分别由28-924位和76-582位组成。本发明也提供了这样的多核苷酸编码的多肽，这些多肽分别含有SEQ ID NOS：2和4的2-300位和2-170位的氨基酸序列。
此外，本发明提供了如下具有与SEQ ID NOS：1和3延伸部分的核苷酸序列相关的核苷酸序列的核酸分子：HELDIO6R(SEQ IDNO：17)和HCEOW38R(SEQ ID NO：18)与SEQ ID NOS：1和3都相关。优选的是SEQ ID NOS：1和3的而不是SEQ ID NO：17或18的或SEQ ID NO：17或18亚片段的多核苷酸片段。图6中显示了HELDIO6R和HCEOW38R的序列。
更普遍的是，具有保藏的cDNA的核苷酸序列或具有图1或图2(SEQ ID NOS：1和3)中所示核苷酸序列的分离的核酸分子的一个片段是长度至少为15nt，优选至少为20nt，更加优选至少为30nt，甚至更优选至少为40nt的片段。这些片段具有很多用途，包括但不局限于用做文中所讨论的诊断探针和引物。当然，本发明中更大一些的长度为50-300nt的与大多数但不是全部保藏的cDNAs的核苷酸序列或如图1或图2(SEQ ID NOS：1和3)中所示核苷酸序列对应的片段也是有用的。特别优选的是由与SEQ ID NO：1中所示的连续的500个核苷酸具有至少80％，85％，90％，92％或95％相同性的至少500个核苷酸所组成的片段。长度为至少20nt的片段，例如，是意指包括20个或更多来自保藏的cDNA核苷酸序列或来自图1或图2(SEQ ID NOS：1和3)中所示核苷酸序列的连续的碱基的片段。在此上下文中“大约”包括特定引用的大小以及在一端或两端稍大或稍小几(5，4，3，2或1)个核苷酸的大小。本发明优选的核酸片段包括编码如在图4和图5中鉴定的并在下文中详细描述的TNFR多肽的携带表位部分的核酸分子。
本发明TNFR-6α核酸片段的代表性例子包括例如包含或由SEQID NO：1的从大约第一位核苷酸到大约第25位核苷酸，从大约第26位核苷酸到大约第75位核苷酸，从大约第76位核苷酸到大约第114位核苷酸，从大约第115位核苷酸到大约第162位核苷酸，从大约第163位核苷酸到大约第216位核苷酸，从大约第217位核苷酸到大约第267位核苷酸，从大约第268位核苷酸到大约第318位核苷酸，从大约第319位核苷酸到大约第369位核苷酸，从大约第370位核苷酸到大约第420位核苷酸，从大约第421位核苷酸到大约第471位核苷酸，从大约第472位核苷酸到大约第522位核苷酸，从大约第523位核苷酸到大约第573位核苷酸，从大约第574位核苷酸到大约第625位核苷酸，从大约第626位核苷酸到大约第675位核苷酸，从大约第676位核苷酸到大约第714位核苷酸，从大约第715位核苷酸到大约第765位核苷酸，从大约第766位核苷酸到大约第816位核苷酸，从大约第817位核苷酸到大约第867位核苷酸，从大约第868位核苷酸到大约第924位核苷酸，从大约第925位核苷酸到大约第975位核苷酸序列组成的片段或其互补链，或保藏号为ATCC 97810所保藏的质粒中含有的cDNA组成。在此上下文中“大约”包括特定引用的范围以及在一端或两端稍大或稍小几(5，4，3，2或1)个核苷酸的那些范围。
在一些特别的实施方案中，本发明的核酸片段包含或由编码SEQID NO：2的第100至150位氨基酸残基，第150至200位氨基酸残基，第200至300位氨基酸残基，第220至300位氨基酸残基，第240至300位氨基酸残基，第250至300位氨基酸残基，第260至300位氨基酸残基和/或第280至300位氨基酸残基的多核苷酸序列，其互补链组成。能够与这些核苷酸序列杂交的核苷酸序列也包含在本发明的范围之内。
本发明TNFR-6β核酸片段的代表性例子包括例如包含或由SEQID NO：3的从大约第1位核苷酸到大约第36位核苷酸，从大约第37位核苷酸到大约第72位核苷酸，从大约第73位核苷酸到大约第123位核苷酸，从大约第124位核苷酸到大约第175位核苷酸，从大约第176位核苷酸到大约第216位核苷酸，从大约第217位核苷酸到大约第267位核苷酸，从大约第268位核苷酸到大约第318位核苷酸，从大约第319位核苷酸到大约第369位核苷酸，从大约第370位核苷酸到大约第420位核苷酸，从大约第421*位核苷酸到大约第471位核苷酸，从大约第472位核苷酸到大约第522位核苷酸，从大约第523位核苷酸到大约第582位核苷酸，从大约第583位核苷酸到大约第622位核苷酸，从大约第623位核苷酸到大约第682位核苷酸，从大约第683位核苷酸到大约第750位核苷酸，从大约第751位核苷酸到大约第800位核苷酸，从大约第801位核苷酸到大约第850位核苷酸，从大约第851位核苷酸到大约第900位核苷酸，从大约第901位核苷酸到大约第950位核苷酸，从大约第951位核苷酸到大约第1000位核苷酸，从大约第1001位核苷酸到大约第1050位核苷酸，从大约第1051位核苷酸到大约第1100位核苷酸，从大约第1101位核苷酸到大约第1150位核苷酸，从大约第1151位核苷酸到大约第1200位核苷酸，从大约第1201位核苷酸到大约第1250位核苷酸，从大约第1251位核苷酸到大约第1300位核苷酸，从大约第1301位核苷酸到大约第1350位核苷酸，从大约第1351位核苷酸到大约第1400位核苷酸，从大约第1401位核苷酸到大约第1450位核苷酸，从大约第1451位核苷酸到大约第1500位核苷酸，从大约第1501位核苷酸到大约第1550位核苷酸，从大约第1551位核苷酸到大约第1600位核苷酸，从大约第1601位核苷酸到大约第1667位核苷酸序列组成的片段或其互补链，或保藏号为ATCC 97809所保藏的质粒中含有的cDNA组成。在此上下文中“大约”包括特定引用的范围以及在一端或两端稍大或稍小几(5，4，3，2或1)个核苷酸的那些范围。
在一些特别的实施方案中，本发明的核酸片段包含或由编码SEQID NO：4的第50至100位氨基酸残基，第100至170位氨基酸残基，第110至170位氨基酸残基，第130至170位氨基酸残基，第140至170位氨基酸残基，第150至170位氨基酸残基和/或第160至170位氨基酸残基的多核苷酸序列，或其互补链组成。能够与这些核苷酸序列杂交的核苷酸序列也包含在本发明的范围之内。
优选的，本发明的多核苷酸片段编码一种显示TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性的多肽。显示“功能活性”的多肽意指一种多肽能够显示一种或多种已知的与完整的(全长)或成熟的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽有关的功能活性。这些功能活性包括但不局限于生物学活性(例如抑制或降低由FasL介导的凋亡，抑制或降低由AIM-II介导的凋亡)、抗原性(与抗TNFR-6α抗体和/或抗TNFR-6β抗体结合(或与TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽竞争结合)的能力)、与本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β形成聚合物的能力、与TNFR-6α和/或TNFR-6β的受体或配体结合的能力(例如，Fas配体和/或AIM-II(出版于1997年9月25日的国际申请公开号WO97/34911)。
可以通过各种不同的方法分析TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和片段、衍生变体和其类似物的功能活性。
例如，在一个分析与抗TNFR-6α抗体和/或抗TNFR-6β抗体结合或与完整的(全长)或成熟的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽竞争结合的能力的实施方案中，可以使用各种不同的本领域众所周知的免疫分析方法，包括但不局限于使用放射免疫分析技术、ELISA(酶联免疫吸附分析技术)、“夹心法”免疫分析、免疫放射性测量分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、原位免疫分析(使用胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白印迹、沉淀反应、凝集分析(例如凝胶凝集分析、血凝分析)、补体结合分析、免疫荧光分析、蛋白质A分析和免疫电泳分析等技术的竞争性以及非竞争性分析方法。在一个实施方案中，抗体结合是通过检测一抗上的标记而检测的。在另外一个实施方案中，一抗是通过检测与一抗结合的二抗或试剂而测定的。本领域中有许多已知的方法用于检测免疫分析中的结合，并且它们都在本发明的范围之内。
在另外一个实施方案中，其中对TNF配体进行了鉴定(例如Fas配体和/或AIM-II(出版于1997年9月25日的国际申请公开号WO97/34911))，或者评价了本发明的多肽片段、变体或衍生物形成聚合物的能力，也可分析结合，例如利用本领域众所周知的方法，例如浓缩以及非浓缩凝胶层析技术。见Phizicky，E等，微生物学评论59：94-123(1995)。在另外一个实施方案中，可以分析TNFR-6α和/或TNFR-6β与其底物结合的生物学相关性(信号传导)。
此外，文中所描述的方法(例如见实施例7-9)和其它本领域众所周知的方法可被常规用于或修改后用于检测TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和片段、衍生变体及其类似物引发TNFR-6α和/或TNFR-6β相关的生物学活性(例如体外或体内抑制或降低FasL介导的凋亡，体外或体内抑制或降低AIM-II介导的凋亡)的能力。
例如，可以使用表达Fas的T细胞系如Jurkat来分析本发明TNFR多肽降低或阻断FasL介导的凋亡的能力。在此分析中，用可溶性FasL处理的Jurkat细胞经历凋亡。与在不加TNFR多肽和/或TNFR激动剂的情况下相同浓度的FasL与相同浓度的Fas表达细胞相互作用观测到的结果相比，在加入FasL之前用TNFR多肽和/或TNFR激动剂预处理细胞可以保护细胞免受凋亡并且导致凋亡水平降低。另外将FasL蛋白与TNFR多肽和/或TNFR激动剂混合也会阻断FasL与Jurkat细胞结合的能力以及介导凋亡的能力(例如，见实施例9)。
相反地，本发明的TNFR拮抗剂阻断TNFR介导的对FasL介导的凋亡的抑制。因此，本发明的TNFR拮抗剂可以通过例如组合成熟的TNFR(已知可FasL)、待测的TNFR拮抗剂以及可溶性FasL，然后将此组合物与Fas表达细胞系相互作用而分析。TNFR拮抗剂降低或阻断TNFR介导的对FasL介导的凋亡的抑制。因此，当与在无TNFR拮抗剂存在的情况下将相同浓度的Fas表达细胞与相同浓度的成熟TNFR和FasL相互作用相比，Fas表达细胞与成熟的TNFR、TNFR拮抗剂和可溶性FasL相互作用表现出凋亡水平的升高。
凋亡可以通过使用例如可选择性结合凋亡细胞的Annexin染色的增加而测定。在另一个实施例中，可以使用检测活细胞数的ALOMAR蓝染色测定由于凋亡而减少的细胞数目。
其它技术是本领域技术人员所熟知的，并且在本发明的范围之内。
在另外一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码TNFR-6α和/或TNFR-6β的功能性特性。就这一点来说本发明的优选的实施方案包括含有TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的α螺旋和α螺旋形成区(α区”)、β片层和β片层形成区(“β区”)、转角和转角形成区(“转角区”)、卷曲和卷曲形成区(“卷曲区”)、亲水区、疏水区、α两亲性区、β两亲性区、柔性区、表面形成区和高抗原性指数区的片段。
就这一点而言，图4(表I)和图5(表II)中列出了某些优选区。分别在图4和图5中以及表I和表II中显示的数据几乎是相同结果的不同格式，这些结果是用DNA*STAR计算机程序在缺省参数的情况下对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的氨基酸序列进行分析而获得的。
上面所提到的在图4(表I)和图5(表II)中列出的优选区包括但不局限于前述的通过分析图1和图2中的氨基酸序列而鉴定出的各种类型的功能区。正如在图4(表I)和图5(表II)中列出的，这些优选区包括Garnier-Roboson α区、β区、转角区和卷曲区；Chou-Fasmanα区、β区和卷曲区；Kyte-Doolittle亲水区；Eisenbergα和β两亲性区；Karplus-Sculz柔性区；Emini表面形成区和Jameson-Wolf高抗原性指数区。就这一点而言，高度优选的多核苷酸是那些编码含有TNFR-6α和/或TNFR-6β的组成几种结构性特征如上面列出的几种(1，2，3或4)特征的功能区的多肽的多核苷酸。
此外，在表I和表II中VIII，IX，XIII和XIV栏中显示的数据可被常规用于确定高可能的抗原性区域。高抗原性区是利用VIII，IX，XIII和/或XIV栏中的数据通过选择代表多肽功能区的在抗原识别会导致起始免疫应答过程的环境下易于暴露至多肽表面的值而确定的。
表I残基     位置  I  II III IV  V  VI  VII  VIII  IX     X  XI  XII XIII  XIV甲硫氨酸  1    .  .  B   .      .   .    0.06  0.09   *          -0.10 0.60精氨酸    2    .  .  B   .   .  .   .    0.10  -0.34  *          0.50  0.82丙氨酸    3    .  .  B   .   .  .   .    0.28  -0.34  *          0.50  0.63亮氨酸    4    A  .  .   .   .  .   .    0.32  -0.34  *          0.50  0.99谷氨酸    5    A  .  .   .   .  .   .    -0.10 -0.53  *      F   0.95  0.50甘氨酸    6    .  .  .   .   .  T   C    0.20  0.16   *      F   0.45  0.41脯氨酸    7    .  .  .   .   T  T   .    -0.72 0.04   *      F   0.65  0.66甘氨酸    8    .  .  .   .   T  T   .    -0.94 0.04          F   0.65  0.32亮氨酸    9    A  .  .   .   .  T   .    -0.80 0.73              -0.20 0.26丝氨酸    10   A  A                      -1.61 0.87              -0.60 0.09亮氨酸    11      A  B                   -2.12 1.13              -0.60 0.08亮氨酸    12      A  B                   -2.72 1.34              -0.60 0.07半胱氨酸  13      A  B                   -2.97 1.34              -0.60 0.04亮氨酸    14      A  B                   -2.97 1.46              -0.60 0.05缬氨酸    15      A  B                   -2.88 1.46              -0.60 0.05亮氨酸    16      A  B                   -2.66 1.20              -0.60 0.15丙氨酸    17      A  B                   -2.66 1.13              -0.60 0.18亮氨酸    18      A  B                   -2.80 1.13              -0.60 0.20脯氨酸    19   A  A                      -2.20 1.17              -0.60 0.20丙氨酸    20      A  B                   -2.20 0.91              -0.60 0.31亮氨酸    21      A  B                   -1.60 1.06    *         -0.60 0.28亮氨酸    22      A  B                   -1.60 0.80              -0.60 0.28脯氨酸    23      A  B                   -1.64 0.87    *         -0.60 0.28缬氨酸    24         B                   -1.32 1.01    *         -0.40 0.25脯氨酸    25         B                   -1.08 0.33    *         -0.10 0.60丙氨酸    26         B  B                -1.12 0.07              -0.30 0.38缬氨酸    27         B  B                -0.90 0.29    *   *     -0.30 0.38精氨酸    28         B  B                -0.69 0.14    *   *     -0.30 0.25甘氨酸    29         B  B                -0.14 -0.29   *   *     0.30  0.43缬氨酸    30         B  B                -0.14 -0.30   *   *     0.30  0.83丙氨酸    31         B  B                0.13  -0.51   *   *     0.60  0.66谷氨酸    32         B                   0.74  -0.03   *   *  F  0.65  0.96苏氨酸    33         B       T           0.42  0.30    *   *  F  0.40  2.02脯氨酸    34              T  T           0.48  0.09    *   *  F  0.80  3.10苏氨酸    35              T  T           1.44  0.50    *      F  0.50  1.88酪氨酸    36                 T  C        2.03  0.50    *         0.15  2.55脯氨酸    37              T              1.44  0.01    *         0.45  2.76色氨酸    38      A             C        1.76  0.09    *         0.05  1.93精氨酸    39      A     B                1.66  -0.40   *      F  0.60  2.13天冬氨酸  40   A  A                      1.62  -0.67   *      F  0.90  1.99丙氨酸    41      A             C        1.87  -0.67   *      F  1.10  1.87谷氨酸    42      A  A                   2.19  -1.59   *   *  F  0.90  1.66苏氨酸    43      A  A                   1.67  -1.59   *      F  0.90  1.94甘氨酸    44      A         T            0.70  -0.90   *      F  1.30  1.59谷氨酸    45   A  A                      0.03  -0.76   *   *  F  0.75  0.86精氨酸    46   A  A                      0.03  -0.19   *      F  0.45  0.25亮氨酸    47   A  A                      0.03  -0.17   *         0.30  0.26缬氨酸    48      A  B                   -0.32 -0.20             0.30  0.26半胱氨酸  49      A  B                   -0.19  0.37             -0.30 0.07丙氨酸    50      A  B                   -0.40  0.80             -0.60 0.13谷氨酰胺  51      A  B                   -0.86  0.54             -0.60 0.28半胱氨酸  52      A  B                   -0.36  0.33             -0.30 0.51脯氨酸    53                T    C       -0.20  0.24          F  0.45  0.73脯氨酸    54             T  T            -0.39  0.53          F  0.35  0.36甘氨酸    55             T  T            0.20   0.77          F  0.35  0.50苏氨酸    56              T       0.31  0.60           F    -0.05  0.56苯丙氨酸  57    B  B              0.77  0.17   *       F    -0.15  0.71缬氨酸    58    B  B              0.31  0.17   *            0.19   1.12谷氨酰胺  59    B  B              0.63  0.31   *       F    0.53   0.41精氨酸    60    B         T       1.09  -0.17  *       F    1.87   0.94脯氨酸    61    B     T   T       1.40  -0.96  *       F    2.66   2.47半胱氨酸  62          T   T       1.80  -1.60  *       F    3.40   2.38精氨酸    63          T   T       2.44  -1.61  *       F    3.06   1.63精氨酸    64          T           2.13  -1.19  *       F    2.77   1.63天冬氨酸  65          T           1.71  -1.13  *       F    2.68   4.39丝氨酸    66          T   T       1.26  -1.21          F    2.79   3.24脯氨酸    67          T   T       1.58  -0.64          F    2.55   0.89苏氨酸    68          T   T       1.26  -0.21          F    2.50   0.52苏氨酸    69          T   T       0.48  0.21           F    1.65   0.61半胱氨酸  70          T           0.27  0.40           F    1.14   0.21甘氨酸    71          T   T       0.36  0.40   *   *   F    1.33   0.22脯氨酸    72          T   T       0.68  0.34   *       F    1.62   0.24半胱氨酸  73              T  C    0.96  -0.14  *       F    2.01   0.88脯氨酸    74              T  C    1.02  -0.21  *       F    2.40   1.21脯氨酸    75          T   T       1.38  0.11   *   *   F    1.76   1.23精氨酸    76          T   T       1.72  0.17   *   *   F    1.52   3.30组氨酸    77    B         T       1.23  0.00   *   *   F    0.88   3.70酪氨酸    78    B         T       1.61  0.36   *   *        0.49   2.07苏氨酸    79    B                 1.82  0.84   *            -0.25  1.11谷氨酰胺  80    B                 1.79  1.24   *   *        -0.25  1.31苯丙氨酸  81          T           0.87  1.50   *   *        0.15   1.31色氨酸    82          T           0.90  1.43   *            0.00   0.75天冬酰胺  83    A     T           1.26  0.54   *            -0.20  0.75酪氨酸    84    A     T           0.90  0.54   *   *        -0.05  1.70亮氨酸    85    A     T           1.01  0.33   *   *        0.37   0.87谷氨酸    86    A     T           1.47  -0.59  *   *        1.71   1.05精氨酸    87    A     T           1.09  -0.23      *        1.69   1.05半胱氨酸  88          T   T       1.09  -0.41      *        2.22   0.69精氨酸    89          T   T       0.48  -0.70      *        2.80   0.64酪氨酸    90          T   T       0.48  -0.06      *        2.22   0.24半胱氨酸  91              T       -0.19 0.63       *        1.04   0.37天冬酰胺  92    B  B              -0.64 0.63       *        -0.04  0.10缬氨酸    93    B  B              0.02  1.06       *        -0.32  0.06亮氨酸    94    B  B              0.02  0.30                -0.30  0.21半胱氨酸  95    B         T       0.27  -0.27               0.70   0.25甘氨酸    96              T   C   0.93  -0.67          F    1.35   0.59谷氨酸    97    A         T       0.93  -1.31          F    1.30   1.24精氨酸    98    A         T       1.20  -2.00      *   F    1.30   4.00谷氨酸    99    A  A              2.12  -2.07      *   F    0.90   4.08谷氨酸    100   A  A              2.20  -2.50      *   F    0.90   4.61谷氨酸    101   A  A              1.88  -2.00      *   F    0.90   2.38丙氨酸    102   A  A              1.84  -1.43          F    0.75   0.74精氨酸    103   A  A              1.14  -0.93               0.60   0.58丙氨酸    104   A  A              0.83  -0.43      *        0.30   0.34半胱氨酸  105   A  A              0.80  0.06       *        -0.30  0.48组氨酸    106   A  A              0.80  0.06   *   *        -0.30  0.34丙氨酸    107   A  A              1.50  0.46   *   *        -0.60  0.53苏氨酸    108   A  A              0.80  -0.04  *   *        0.45   1.95组氨酸    109      A  T           0.72  -0.11  *            1.13   1.45天冬酰胺  110      A  T           1.50  -0.04  *            1.26   0.77精氨酸    111      A  T           0.87  -0.54      *        1.99   1.04丙氨酸    112      A  T           1.57  -0.46      *        1.82   0.41半胱氨酸  113             T  T     1.57  -0.96       *       2.80  0.50精氨酸    114    B           T     1.26  -0.87  *    *       2.12  0.37半胱氨酸  115             T  T     0.56  -0.44  *    *       1.94  0.36精氨酸    116             T  T     -0.26 -0.16       *       1.66  0.58苏氨酸    117    A     B  T        -0.26 0.06        *  F    0.53  0.26甘氨酸    118    A     B  T        0.38  0.56        *       -0.20 0.49苯丙氨酸  119    A  B  B           -0.32 0.49        *       -0.60 0.34苯丙氨酸  120    A  B  B           0.00  0.99        *       -0.60 0.24丙氨酸    121  A A     B           -0.81 0.93        *       -0.60 0.24组氨酸    122  A A                 -1.17 1.29                -0.60 0.24丙氨酸    123  A A                 -1.63 1.07        *       -0.60 0.15甘氨酸    124  A A                 -0.93 0.97        *       -0.60 0.12苯丙氨酸  125  A A                 -0.27 0.47                -0.60 0.15半胱氨酸  126  A A                 -0.27 0.47        *       -0.60 0.20亮氨酸    127  A A                 -0.53 0.47                -0.60 0.21谷氨酸    128  A A           T     -0.61 0.43                -0.60 0.32组氨酸    129             T  T     -0.48 0.21                0.50  0.32丙氨酸    130             T  T     0.01  0.07                0.63  0.61丝氨酸    131             T  T     0.33  -0.19               1.36  0.54半胱氨酸  132                T  C  0.56  0.24                0.69  0.39脯氨酸    133                T  C  0.21  0.24           F    0.97  0.39脯氨酸    134             T  T     -0.61 0.17           F    1.30  0.29甘氨酸    135             T  T     -0.91 0.43           F    0.87  0.40丙氨酸    136    B        T        -1.20 0.54                0.19  0.18甘氨酸    137    B  B              -0.74 0.61                -0.34 0.12缬氨酸    138    B  B              -0.88 0.61                -0.47 0.19异亮氨酸  139    B  B              -0.98 0.61                -0.60 0.18丙氨酸    140    B  B              -0.84 0.60                -0.60 0.27脯氨酸    141    B                 -0.56 0.60           F    -0.25 0.55甘氨酸    142             T        -0.21 0.34           F    0.88  1.06苏氨酸    143                T  C  0.64  0.06           F    1.16  1.82脯氨酸    144                T  C  1.22  -0.04          F    2.04  1.89丝氨酸    145             T  T     1.81  0.01           F    1.92  2.76谷氨酰胺  146             T  T     1.36  -0.01          F    2.80  3.31天冬酰胺  147             T  T     1.70  0.07           F    1.92  1.15苏氨酸    148             T  T     1.80  0.04           F    1.64  1.48谷氨酰胺  149             T  T     1.34  0.09           F    1.36  1.32半胱氨酸  150       B        T     1.43  0.26           F    0.53  0.44谷氨酰胺  151       B              1.22  0.29           F    0.05  0.47脯氨酸    152       B              0.88  0.23        *  F    0.05  0.42半胱氨酸  153       B              0.88  0.26        *  F    0.05  0.78脯氨酸    154       B        T     0.18  0.17        *  F    0.25  0.65脯氨酸    155             T  T     0.54  0.56        *  F    0.35  0.36甘氨酸    156             T  T     -0.04 0.51        *  F    0.35  0.91苏氨酸    157       B        T     -0.13 0.44           F    -0.05 0.59苯丙氨酸  158       B              0.23  0.40           F    -0.25 0.51丝氨酸    159       B              0.14  0.36           F    0.39  0.70丙氨酸    160       B              0.06  0.31           F    0.73  0.65丝氨酸    161                T  C  0.10  0.21           F    1.72  1.00丝氨酸    162                T  C  0.41  -0.19          F    2.56  1.00丝氨酸    163             T  T     1.11  -0.57          F    3.40  1.72丝氨酸    164             T  T     0.74  -0.67          F    3.06  2.22丝氨酸    165             T        1.33  -0.49          F    2.07  0.89谷氨酸    166             T        1.42  -0.47          F    1.88  1.15谷氨酰胺  167             T        1.69  -0.43          F    1.82  1.32半胱氨酸  168             T        2.10  -0.31          F    1.76  1.34谷氨酰胺  169       B              2.40  -0.70          F    1.94  1.52脯氨酸    170                T        2.03  -0.30            F    2.32  1.41组氨酸    171                T  T     1.72  -0.13            F    2.80  1.41精氨酸    172                T  T     1.13  -0.21            F    2.52  1.18天冬酰胺  173                T  T     0.99  -0.11  *              1.94  0.77半胱氨酸  174         B         T     0.64  0.14                  0.66  0.47苏氨酸    175      A  B               0.04  0.07                  -0.02 0.24丙氨酸    176      A  B               -0.51 0.76   *              -0.60 0.12亮氨酸    177      A  B               -1.43 0.86   *              -0.60 0.23甘氨酸    178      A  B               -1.43 0.97       *          -0.60 0.13亮氨酸    179      A  B               -1.62 0.89       *          -0.60 0.21丙氨酸    180      A  B               -1.52 1.03       *          -0.60 0.19亮氨酸    181      A  B               -1.28 0.77       *          -0.60 0.29天冬酰胺  182      A  B               -0.77 0.77       *          -0.60 0.35缬氨酸    183         B         T     -0.72 0.47       *     F    -0.05 0.46脯氨酸    184                   T  C  -0.21 0.36       *     F    0.73  0.75甘氨酸    185                T  T     0.34  0.06       *     F    1.21  0.63丝氨酸    186                T  T     1.16  0.16       *     F    1.64  1.15丝氨酸    187                   T  C  0.84  -0.49            F    2.32  1.24丝氨酸    188                T  T     0.89  -0.43            F    2.80  1.81组氨酸    189         B         T     0.43  -0.17            F    2.12  1.11天冬氨酸  190                T  T     0.47  0.01             F    1.49  0.45苏氨酸    191         B               0.47  0.11             F    0.61  0.48亮氨酸    192         B               0.10  0.11                  0.18  0.47半胱氨酸  193         B         T     0.09  0.19                  0.10  0.15苏氨酸    194         B         T     -0.22 0.67                  -0.20 0.15丝氨酸    195         B         T     -0.92 0.61   *         F    -0.05 0.18半胱氨酸  196         B         T     -0.82 0.71             F    -0.05 0.29苏氨酸    197                T        -0.82 0.57             F    0.15  0.31甘氨酸    198                T        -0.46 0.77                  0.00  0.19苯丙氨酸  199         B               -0.46 0.77       *          -0.40 0.48脯氨酸    200         B               -0.04 0.69   *   *          -0.40 0.48亮氨酸    201         B               -0.23 0.20   *   *          -0.10 0.96丝氨酸    202         B               -0.13 0.41   *   *     F    0.02  0.82苏氨酸    203         B               -0.13 0.06       *     F    0.59  0.82精氨酸    204                   C     -0.02 0.06       *     F    1.06  0.99缬氨酸    205                T  C     0.19  -0.13      *     F    2.13  0.74脯氨酸    206                T  C     1.00  -0.51      *     F    2.70  0.89甘氨酸    207                T  C     0.63  -1.00      *     F    2.43  0.79丙氨酸    208   A            T        0.94  -0.43      *     F    1.66  0.57谷氨酸    209   A  A                  0.94  -1.07      *     F    1.29  0.64谷氨酸    210   A  A                  1.21  -1.50  *         F    1.17  1.26半胱氨酸  211   A  A                  0.57  -1.43  *         F    0.90  1.26谷氨酸    212   A  A                  0.02  -1.29  *   *     F    0.75  0.54精氨酸    213   A  A                  0.61  -0.60  *   *          0.60  0.22丙氨酸    214   A  A                  -0.09 -0.60  *   *          0.60  0.68缬氨酸    215   A  A                  -0.94 -0.39  *   *          0.30  0.34异亮氨酸  216   A  A                  -0.87 0.26   *   *          -0.30 0.13天冬氨酸  217   A  A                  -1.57 0.76   *   *          -0.60 0.13苯氨酸    218   A  A                  -1.68 1.04   *   *          -0.60 0.15缬氨酸    219   A  A                  -1.09 0.80                  -0.60 0.37丙氨酸    220   A  A                  -1.12 0.11                  -0.30 0.37苯丙氨酸  221   A  A                  -0.53 0.80       *          -0.60 0.30谷氨酰胺  222   A  A                  -1.42 0.40       *          -0.60 0.54天冬氨酸  223   A  A                  -0.68 0.44             F    -0.45 0.38异亮氨酸  224   A  A                  0.29  -0.06            F    0.45  0.87丝氨酸    225   A  A                  0.07  -0.84            F    0.75  0.99异亮氨酸  226   A  A                  0.77  -0.56  *         F    0.75  0.49赖氨酸    227   A A                0.88  -0.16  *    *   F    0.60  1.20精氨酸    228   A A                0.07  -0.84  *    *   F    0.90  1.76亮氨酸    229   A A                0.14  -0.54  *        F    0.90  2.07谷氨酰胺  230   A A                0.44  -0.54  *        F    0.75  0.85精氨酸    231     A  B             0.74  -0.14  *             0.30  0.76亮氨酸    232   A A                -0.11 0.36   *             -0.30 0.93亮氨酸    233     A  B             -0.22 0.36   *    *        -0.30 0.44谷氨酰胺  234     A  B             0.00  -0.04  *             0.30  0.39丙氨酸    235     A  B             -0.21 0.46   *             -0.60 0.48亮氨酸    236     A  B             -0.32 0.20   *    *        -0.30 0.89谷氨酸    237     A  B             0.14  -0.49                0.30  0.89丙氨酸    238        B     T       0.67  -0.46           F    0.85  0.88脯氨酸    239           T  T       0.32  -0.04           F    1.40  1.12谷氨酸    240           T  T       0.70  -0.30           F    1.25  0.64甘氨酸    241           T  T       1.20  0.13            F    0.65  0.98色氨酸    242           T          0.99  0.11   *        F    0.45  0.91甘氨酸    243                 C    1.69  0.11   *    *   F    0.59  0.81脯氨酸    244                 C    1.31  0.11   *    *   F    1.08  1.61苏氨酸    245              T  C    0.97  0.19   *        F    1.62  1.55脯氨酸    246              T  C    1.42  -0.30  *        F    2.56  1.55精氨酸    247           T  T       1.12  -0.73  *        F    3.40  1.96丙氨酸    248              T  C    0.88  -0.66  *        F    2.87  1.37甘氨酸    249   A A                0.28  -0.64  *    *   F    1.77  0.90精氨酸    250   A A                0.59  -0.39  *    *        0.98  0.38丙氨酸    251   A A                -0.01 0.01   *    *        0.04  0.65丙氨酸    252   A A                -0.08 0.20   *    *        -0.30 0.54亮氨酸    253   A A                -0.30 -0.23  *    *        0.30  0.55谷氨酰胺  254   A A                0.16  0.46   *             -0.60 0.45亮氨酸    255   A A                0.16  -0.04       *        0.30  0.87赖氨酸    256   A A                0.86  -0.54       *        0.75  2.07亮氨酸    257   A A                0.63  -1.23       *   F    0.90  2.34精氨酸    258   A A                1.13  -0.94  *    *   F    0.90  2.34精氨酸    259     A  B             1.13  -1.14  *    *   F    0.90  1.69精氨酸    260     A  B             1.13  -1.14  *    *   F    0.90  3.55亮氨酸    261     A  B             0.28  -1.14  *    *   F    0.90  1.49苏氨酸    262     A  B             0.74  -0.46  *    *   F    0.45  0.63谷氨酸    263     A  B             0.04  -0.03  *    *        0.30  0.32亮氨酸    264     A  B             -0.07 0.47   *             -0.60 0.39亮氨酸    265     A  B             -0.18 0.19        *        -0.30 0.47甘氨酸    266   A A                0.29  -0.30                0.30  0.45丙氨酸    267   A    T             0.01  0.13            F    0.25  0.54谷氨酰胺  268   A    T             -0.80 -0.06           F    0.85  0.66天冬氨酸  269   A    T             -0.80 -0.06           F    0.85  0.55甘氨酸    270   A    T             -0.84 0.20   *    *        0.10  0.45丙氨酸    271   A A                -0.39 0.34   *    *        -0.30 0.19亮氨酸    272     A  B             -0.61 -0.06  *    *        0.30  0.23亮氨酸    273     A  B             -1.42 0.63   *    *        -0.60 0.19缬氨酸    274   A A                -1.42 0.89   *    *        -0.60 0.15精氨酸    275   A A                -1.67 0.79   *    *        -0.60 0.32亮氨酸    276   A A                -1.89 0.60   *    *        -0.60 0.40亮氨酸    277   A A                -0.97 0.60   *    *        -0.60 0.44谷氨酰胺  278   A A                -1.01 -0.04  *    *        0.30  0.44丙氨酸    279   A A                -0.74 0.60   *    *        -0.60 0.40亮氨酸    280   A A                -0.74 0.41   *    *        -0.60 0.49精氨酸    281     A  B             -0.53 -0.27  *             0.30  0.55缬氨酸    282     A  B             0.07  -0.06  *             0.30  0.54丙氨酸    283     A  B             -0.28 -0.13  *             0.72  1.01精氨酸    284      A  B            -0.50 -0.39  *             0.84  0.51甲硫氨酸  285         B     T      0.31  0.30        *        0.91  0.57脯氨酸    286               T  C   0.31  -0.34       *   F    2.13  0.97甘氨酸    287               T  C   0.87  -0.84  *    *   F    2.70  0.97亮氨酸    288  A            T      0.60  -0.46  *    *   F    2.08  1.32谷氨酸    289  A                   0.60  -0.43  *    *   F    1.46  0.63精氨酸    290  A                   1.20  -0.86  *    *   F    1.64  1.25丝氨酸    291  A                   1.52  -1.29  *    *   F    1.37  2.62缬氨酸    292  A                   1.17  -1.97  *    *   F    1.10  2.97精氨酸    293  A                   1.17  -1.19  *    *   F    1.10  1.31谷氨酸    294  A                   0.96  -0.50  *    *   F    0.65  0.81精氨酸    295  A                   -0.01 -0.46  *    *   F    0.80  1.68苯丙氨酸  296        B             0.26  -0.46       *        0.50  0.64亮氨酸    297        B             0.72  0.04        *        -0.10 0.50脯氨酸    298  A                   0.22  0.47        *        -0.40 0.33缬氨酸    299  A                   -0.17 0.90   *             -0.40 0.48组氨酸    300  A                   -0.67 0.54                 -0.40 0.75
表II残基    位置  I  II  III  IV  V  VI  VII VIII  IX     X  XI  XII  XIII   XIV甲硫氨  1            B                   0.06  0.09   *           -0.10  0.60酸精氨酸  2            B                   0.10  -0.34  *           0.50   0.82丙氨酸  3            B                   0.28  -0.34  *           0.50   0.63亮氨酸  4            B                   0.32  -0.34              0.50   0.99谷氨酸  5            B                   -0.10 -0.53         F    0.95   0.50甘氨酸  6                        T    C  0.20  0.16   *      F    0.45   0.41脯氨酸  7                     T  T       -0.72 0.04   *      F    0.65   0.66甘氨酸  8                     T  T       -0.94 0.04          F    0.65   0.32亮氨酸  9            B           T       -0.80 0.73               -0.20  0.26丝氨酸  10       A   B                   -1.61 0.87               -0.60  0.09亮氨酸  11       A   B                   -2.12 1.13               -0.60  0.08亮氨酸  12       A   B                   -2.72 1.34               -0.60  0.07半胱氨  13       A   B                   -2.97 1.34               -0.60  0.04亮氨酸  14       A   B                   -2.97 1.46               -0.60  0.05缬氨酸  15       A   B                   -2.88 1.46               -0.60  0.05亮氨酸  16       A   B                   -2.66 1.20               -0.60  0.15丙氨酸  17       A   B                   -2.66 1.13               -0.60  0.18亮氨酸  18       A   B                   -2.80 1.13               -0.60  0.20脯氨酸  19       A   B                   -2.20 1.17               -0.60  0.20丙氨酸  20       A   B                   -2.20 0.91               -0.60  0.31亮氨酸  21       A   B                   -1.60 1.06      *        -0.60  0.28亮氨酸  22       A   B                   -1.60 0.80               -0.60  0.28脯氨酸  23       A   B                   -1.64 0.87      *        -0.60  0.28缬氨酸  24           B                   -1.32 1.01      *        -0.40  0.25脯氨酸  25           B                   -1.08 0.33               -0.10  0.60丙氨酸  26           B  B                -1.12 0.07               -0.30  0.38缬氨酸  27           B  B                -0.90 0.29   *  *        -0.30  0.38精氨酸  28           B  B                -0.69 0.14   *  *        -0.30  0.25甘氨酸  29           B  B                -0.14 -0.29  *  *        0.30   0.43缬氨酸  30           B  B                -0.14 -0.30  *  *        0.30   0.83丙氨酸  31           B  B                0.13  -0.51  *  *        0.60   0.66谷氨酸  32           B                   0.74  -0.03  *  *   F    0.65   0.96苏氨酸  33           B           T       0.42  0.30   *  *   F    0.40   2.02脯氨酸  34                    T  T       0.48  0.09   *  *   F    0.80   3.10苏氨酸  35                    T  T       1.44  0.50   *      F    0.50   1.88酪氨酸  36                       T    C  2.03  0.50   *           0.15   2.55脯氨酸  37                    T          1.44  0.01   *           0.45   2.76色氨酸  38       A                    C  1.76  0.09   *           0.05   1.93精氨酸  39       A   B                   1.66  -0.40  *      F    0.60   2.13天冬氨  40       A                    C  1.62  -0.67  *      F    1.10   1.99丙氨酸  41       A                    C  1.87  -0.67  *  *   F    1.10   1.87谷氨酸  42       A                    C  2.19  -1.59  *  *   F    1.10   1.66苏氨酸  43       A            T          1.67  -1.59  *      F    1.30   1.94甘氨酸  44       A            T          0.70  -0.90  *      F    1.30   1.59谷氨酸  45       A            T          0.03  -0.76  *  *   F    1.15   0.68精氨酸  46       A            T          0.03  -0.19  *      F    0.85   0.25亮氨酸  47       A   B                   0.03  -0.17  *           0.30   0.26缬氨酸  48       A   B                   -0.31 -0.20              0.30   0.26半胱氨  49       A   B                   -0.17 0.37               -0.30  0.07酸内氨酸  50       A   B                   -0.40 0.80               -0.60  0.13谷氨酰  51    A  B                   -0.86 0.54          -0.60 0.28胺半胱氨  52    A  B                   -0.36  0.33         -0.30 0.51酸脯氨酸  53                    T  C   -0.20 0.24       F  0.45  0.73脯氨酸  54                 T  T      -0.39 0.53       F  0.35  0.36甘氨酸  55                 T  T      0.20  0.77  *    F  0.35  0.50苏氨酸  56       B            T      0.31  0.60       F  -0.05 0.56苯丙氨  57       B  B                0.77  0.17  *    F  -0.15 0.71酸缬氨酸  58       B  B                0.31  0.17  *       0.19  1.12谷氨酰  59       B  B                0.63  0.31  *    F  0.53  0.41胺精氨酸  60       B            T      1.09  -0.17 *    F  1.87  0.94脯氨酸  61       B            T      1.40  -0.96 *    F  2.66  2.47半胱氨  62                 T  T      1.80  -1.60 *    F  3.40  2.38酸精氨酸  63                 T  T      2.44  -1.61 *    F  3.06  1.63精氨酸  64                 T         2.13  -1.19 *    F  2.77  1.63天冬氨  65                 T         1.71  -1.13 *    F  2.68  4.39酸丝氨酸  66                 T  T      1.26  -1.21      F  2.79  3.24脯氨酸  67                 T  T      1.58  -0.64      F  2.55  0.89苏氨酸  68                 T  T      1.26  -0.21      F  2.50  0.52苏氨酸  69                 T  T      0.48  0.21       F  1.65  0.61半胱氨  70                 T         0.27  0.40       F  1.14  0.21酸甘氨酸  71                 T  T      0.36  0.40       F  1.33  0.22脯氨酸  72                 T  T      0.68  0.34       F  1.62  0.24半胱氨  73                    T  C   0.96  -0.14  *   F  2.01  0.88酸脯氨酸  74                    T  C   1.02  -0.21  *   F  2.40  1.21脯氨酸  75                 T  T      1.38  0.11   *   F  1.76  1.23精氨酸  76                 T  T      1.72  0.17   *   F  1.52  3.30组氨酸  77       B            T      1.23  0.00   *   F  0.88  3.70酪氨酸  78       B            T      1.61  0.36   *      0.49  2.07苏氨酸  79       B                   1.82  0.84   *      -0.25 1.11谷氨酰  80       B                   1.79  1.24   *      -0.25 1.31胺苯丙氨  81                 T         0.87  1.50   *      0.15  1.31酸色氨酸  82                 T         0.90  1.43   *      0.00  0.75天冬酰  83    A            T         1.26  0.94   *      -0.20 0.75胺酪氨酸  84    A            T         0.90  0.54   *      -0.05 1.70亮氨酸  85    A            T         1.01  0.33   *      0.38  0.87谷氨酸  86    A            T         1.47  -0.59  *      1.71  1.05精氨酸  87    A            T         1.09  -0.23         1.69  1.05半胱氨88                   T  T      1.09  -0.41         2.22  0.69酸精氨酸  89                 T  T      0.48  -0.70         2.80  0.64酪氨酸  90                 T  T      0.48  -0.06         2.22  0.24半胱氨  91                 T  T      -0.19 0.63          1.04  0.37酸天冬酰  92       B  B                -0.64 0.63          -0.04 0.10胺缬氨酸  93       B  B                0.02  1.06          -0.02 0.06亮氨酸  94       B  B                0.02  0.30          0.30  0.21半胱氨  95         B         T      0.27  -0.27              1.60  0.25酸甘氨酸  96                   T  C   0.93  -0.67          F   2.55  0.59谷氨酸  97                   T  C   0.93  -1.31          F   3.00  1.24精氨酸  98    A              T      1.20  -2.00          F   2.50  4.00谷氨酸  99    A A                   2.12  -2.07          F   1.80  4.08谷氨酸  100   A A                   2.20  -2.50          F   1.50  4.61谷氨酸  101   A A                   1.88  -2.00          F   1.20  2.38丙氨酸  102   A A                   1.84  -1.43          F   0.75  0.74精氨酸  103   A A                   1.14  -0.93              0.60  0.58丙氨酸  104   A A                   0.83  -0.43              0.30  0.34半胱氨  105   A A                   0.80  0.06               -0.30 0.48酸组氨酸  106   A A                   0.80  0.06  *            -0.30 0.34丙氨酸  107     A        T          1.50  0.46  *            -0.20 0.53苏氨酸  108     A        T          0.80  -0.04 *            0.85  1.95组氨酸  109     A        T          0.72  -0.11 *            1.13  1.45天冬酰  110     A        T          1.50  -0.04 *            1.26  0.77胺精氨酸  111     A        T          0.87  -0.54              1.99  1.04丙氨酸  112     A        T          1.57  -0.46              1.82  0.41半胱氨  113              T  T       1.57  -0.96 *            2.80  0.50酸精氨酸  114        B        T       1.26  -0.87      *       2.2   0.37半胱氨  115              T  T       0.56  -0.44      *       1.94  0.36酸精氨酸  116              T  T       -0.26 -0.16      *       1.66  0.58苏氨酸  117     A     B  T          -0.26 0.06       *   F   0.53  0.26甘氨酸  118     A     B  T          0.38  0.56       *       -0.20 0.49苯丙氨  119     A  B  B             -0.32 0.49       *       -0.60 0.34酸苯丙氨  120    A   B  B             0.00  0.99       *       -0.60 0.24酸丙氨酸  121    A   B  B             -0.81 0.93       *       -0.60 0.24组氨酸  122    A                C   -1.17 1.29       *       -0.40 0.24丙氨酸  123    A                C   -1.63 1.07       *       -0.40 0.15甘氨酸  124    A         T          -0.93 0.97       *       -0.20 0.12苯丙氨  125    A         T          -0.27 0.47               -0.20 0.15酸半胱氨  126    A         T          -0.27 0.47       *       -0.20 0.20酸亮氨酸  127    A  B                 -0.53 0.47               -0.60 0.21谷氨酸  128    A  B      T          -0.61 0.43               -0.20 0.32组氨酸  129              T  T       -0.48 0.21               0.50  0.32丙氨酸  130              T  T       0.01  0.07               0.63  0.61丝氨酸  131              T  T       0.33  -0.19              1.36  0.54半胱氨  132                 T  C    0.56  0.24               0.69  0.39酸脯氨酸  133                 T  C    0.21  0.24          F    0.97  0.39脯氨酸  134              T  T       -0.61 0.17          F    1.30  0.29甘氨酸  135              T  T       -0.91 0.43          F    0.87  0.40丙氨酸  136       B         T       -1.20 0.54               0.19  0.18甘氨酸  137       B  B              -0.74 0.61               -0.34 0.12缬氨酸  138       B  B              -0.88 0.61               -0.47 0.19异亮氨  139       B  B              -0.67 0.61               -0.60 0.18酸丙氨酸  140       B         T       -0.62 0.11               0.10  0.32脯氨酸  141       B         T       -0.32 0.07           F   0.25  0.58甘氨酸    142                 T  C    -0.57 0.34    *    *    F    0.45  0.86谷氨酸    143                 T  C    0.40  0.16    *    *    F    0.45  0.86丝氨酸    144        B                0.94  -0.34   *    *    F    0.80  1.10氨酸      145              T          1.19  -0.34   *    *    F    1.20  1.10丙氨酸    146        B        T       0.81  -0.34   *    *    F    0.85  0.63精氨酸    147              T  T       0.94  0.16    *    *    F    0.65  0.47甘氨酸    148              T  T       1.06  0.20         *    F    0.65  0.69甘氨酸    149                 T  C    1.06  -0.71             F    1.84  0.35丙氨酸    150                    C    1.00  -0.83             F    1.83  0.92脯氨酸    151                    C    1.24  -0.40        *    F    1.87  0.92精氨酸    152              T  T       1.24  -0.40             F    2.61  0.92丝氨酸    153              T  T       1.70  -0.83   *         F    3.40  1.78甘氨酸    154              T  T       1.38  -1.33   *    *    F    3.06  2.26甘氨酸    155              T  T       1.62  -1.19   *    *    F    2.57  0.62精氨酸    156              T          1.94  -0.76   *    *    F    2.26  0.46精氨酸    157              T          1.49  -1.14   *    *    F    2.15  0.90半胱氨    158        B                1.79  -1.14   *    *    F    1.64  0.90酸甘氨酸    159              T  T       1.28  -1.17   *    *    F    2.47  0.80精氨酸    160        B        T       1.03  -0.53   *    *    F    2.30  0.30甘氨酸    161        B        T       0.58  -0.03   *    *    F    1.77  0.57谷氨酰    162        B        T       0.26  -0.17   *    *    F    1.54  0.57胺缬氨酸    163        B                0.62  -0.17        *    F    1.11  0.45丙氨酸    164        B                0.16  0.21         *    F    0.28  0.61甘氨酸    165        B        T       -0.54 0.47         *    F    -0.05 0.29脯氨酸    166        B        T       -0.41 0.57              F    -0.05 0.40丝氨酸    167                 T  C    -0.80 0.36              F    0.45  0.61亮氨酸    168        B        T       -0.33 0.29                   0.10  0.78丙氨酸    169        B                -0.13 0.29                   -0.10 0.65脯氨酸    170        B                -0.18 0.29                   -0.10 0.62
本发明另外的优选的核酸片段包括或由编码TNFR-6α和/或TNFR-6β一个或多个表位携带部分的核酸分子组成。特别是，本发明的这些核酸片段包括编码下列多肽的核酸分子：一段多肽包括或由SEQ ID NO：2中从大约第57位苯丙氨酸到大约第117位苏氨酸残基，从大约第132位半胱氨酸到大约第175位苏氨酸残基，从大约第185位甘氨酸到大约第194位苏氨酸残基，从大约第205位缬氨酸到大约第217位天冬氨酸残基，从大约第239位脯氨酸到大约第264位亮氨酸残基和/或从大约第283位丙氨酸到大约第298位脯氨酸残基。在另外的实施方案中，本发明的核酸片段包括或由编码TNFR-6β一个或多个表位携带部分的在SEQ ID NO：4中从大约第31位丙氨酸到大约第46位苏氨酸残基，从大约第57位苯丙氨酸到大约第80位谷氨酰胺残基，从大约第86位谷氨酸到大约第106位组氨酸残基，从大约第108位苏氨酸到大约第119苯丙氨酸位残基，从大约第129位组氨酸到大约第138位缬氨酸残基和/或从大约第142位甘氨酸到大约第166位脯氨酸残基的核酸分子组成。在此上下文中“大约”包括特定引用的范围以及在一端或两端稍大或稍小几(5，4，3，2或1)个氨基酸的范围。如上面图4和图5中所示，通过Jameson-Wolf抗原性指数分析已经确定这些多肽片段分别携带有TNFR-6α和TNFR-6β多肽的抗原性表位。而且，使用上述的如在图4和图5中所示的Jameson-Wolf抗原性指数分析方法本领域熟练技术人员可以很容易地确定带有TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的抗原性表位的多肽片段。下面详细描述了用于确定TNFR-6α和/或TNFR-6β其它类似的表位携带部分的方法。
在特定的实施方案中，本发明的核酸在长度上小于100000kb，50000kb，10000kb，1000kb，500kb，400kb，300kb，250kb，200kb，175kb，150kb，125kb，100kb，75kb，50kb，40kb，30kb，25kb，20kb，15kb，10kb，7.5kb或5kb。
在另外的实施方案中，本发明的核酸包括TNFR编码序列的至少15，至少30，至少50，至少100，至少250，至少500或至少1000个连续的核苷酸，但是由少于或等于1000kb，500kb，250kb，200kb，150kb，100kb，75kb，50kb，30kb，25kb，20kb，15kb，10kb或5kb的图1(SEQ ID NO：1)或图2(SEQ ID NO：3)中的编码核苷酸序列的5’或3’侧翼基因组DNA组成。在另外的实施方案中，本发明的核酸包括TNFR编码序列的至少15，至少30，至少50，至少100，至少250，至少500或至少1000个连续的核苷酸，但不包含所有或部分的任何TNFR内含子。在另外的实施方案中，本发明包含TNFR编码序列的的核酸并不包含基因组侧翼基因的编码序列(即，5’或3’端至基因组中的TNFR基因)。在另外一个实施方案中，本发明的核酸不包括多于1000，500，250，100，50，25，20，15，10，5，4，3，2或1个基因组侧翼基因的编码序列。
另一方面，本发明提供了一种包含或由在严格杂交条件下能够与上述的本发明核酸分子中的一部分核苷酸杂交的核苷酸分子组成，例如，ATCC保藏号97810或97809中保藏的质粒所包含的cDNA，或在图1和/或图2中所示的多核苷酸序列的片段。“严格的杂交条件”意指在下述组成的溶液中42℃过夜孵育：50％福尔马林，5×SSC(750mM NaCl，75mM Tris-Cl)，500mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10硫酸葡聚糖和20ug/ml变性的剪切的鲑鱼精DNA，然后在大约65℃用0.1×SSC洗涤滤液。
与多核苷酸的一“部分”杂交的多核苷酸意指与至少大约15nt，优选大约至少20nt，甚至更优选至少大约30-70(例如50)nt的参考多核苷酸杂交的多核苷酸。它们具有包括但不局限于如上所述并将要在下面详细讨论的用做诊断探针和引物的用途。
“至少大约20nt长度的”多核苷酸的部分意指来自参考核苷酸序列例如保藏的eDNA或图1或图2(SEQ ID NOS：1或3)中所示的核苷酸序列的20个或更多连续的核苷酸。在此上下文中“大约”包括特定引用的大小以及在一端或两端稍大或稍小几(5，4，3，2或1)个核苷酸的大小。当然，只与多聚A序列(例如TNFR cDNA的3”端poly(A)尾巴)杂交，或只与T(或U)残基的互补链杂交的多核苷酸不包括在本发明的用于与本发明核酸分子的一部分杂交的多核苷酸中，因为这样的多核苷酸可以与任何含有poly(A)链或其互补链的核酸分子杂交(例如，操作中任何使用寡聚dT作为引物而产生的双链cDNA克隆)。
如文中所述，本发明的编码TNFR多肽的核酸分子包括但不局限于那些自身编码成熟多肽的氨基酸序列的核酸分子；和成熟多肽的编码序列和附加序列，如那些编码大约26-35氨基酸的前导序列或分泌性序列的核酸分子，例如前，原，或前原蛋白序列；带有或不带有前述的附加编码序列的成熟多肽的编码序列。
本发明的核酸也编码那些带有附加的非编码序列的蛋白质序列，例如包括但不局限于内含子和非编码的5’和3’序列，如在转录、处理mRNA包括剪接和多聚腺苷酸化信号例如在核酶结合和稳定mRNA中起作用的转录的非翻译的序列；编码其它氨基酸例如提供额外功能的氨基酸的附加编码序列。
因此，多肽编码序列可与标记序列融合，例如一段编码一种促进融合多肽纯化的肽序列。在本发明的这一方面的某些优选的实施方案中，标记氨基酸序列是6个组氨酸肽，例如在pQE载体中所提供的标记(QIAGEN公司，加州Chatsworth市，Eton大街9259号，91311)，还有许多其它商业上有售的标记。正如在Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)中所描述的，为了方便纯化融合蛋白使用了6个组氨酸。“HA”标记是另外一种用于纯化的肽，它对应于流感血凝素蛋白来源的表位，Wilson等，细胞37：767(1984)中描述了此肽。正如下面将要讨论的，其它类似的融合蛋白包括在N端或C端与Fc融合的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽。
本发明另外涉及本发明核酸分子的变体，它们编码TNFR多肽的一部分、类似物或衍生物。突变体可以自然发生，如天然的等位基因突变体。“等位基因突变体”是指一种基因几种形式中的一种占据了有机体染色体上的给定位点。基因II，Lewin B编，John Wiley父子出版社，纽约(1985)。非天然发生的突变体可能利用本领域所熟知的诱变技术产生，此技术包括但不局限于寡核苷酸介导的诱变，alanine扫描，PCR诱变，定点诱变(见例如Carter等，核酸研究13：4331(1986)；和Zoller等，核酸研究10：6487(1982))，盒式诱变(见例如Wells等，基因34：315(1985))，限制性选择诱变(见例如Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317：415(1986))。
因此，本发明也包括具有一个或多个氨基酸缺失、添加或替换以产生更适于在选择的宿主中高水平表达的TNFR多肽的TNFR突变体(例如衍生物或类似物)。例如为了消除二硫桥，半胱氨酸残基可缺失或用另外一种氨基酸残基替换；N端糖基化位点可被改变或消除以获得例如更易于在已知N端位点超糖基化的酵母宿主中复性和纯化的同源产物的表达。为此目的，在本发明TNFR多肽的任何一个或多个糖基化识别序列的一个氨基酸位置或第一个或第三个氨基酸位置的多种替换，和/或任何一个或多个类似糖基化识别序列的第二个氨基酸位置的缺失都将阻止TNFR在修饰的三肽序列的糖基化(见例如Miyajimo等，EMBOJ 5(6)：1193-97)。此外，本发明多肽的一个或多个氨基酸残基(例如精氨酸和赖氨酸残基)可被缺失或被另外一种残基替换以消除我们所不希望的蛋白酶例如furins或kexins的处理。例如，本发明含有羧基端TNFR多肽序列的多肽可以将对应于SEQ ID NO：2中第290位和/或295位的精氨酸残基缺失或用另外一种氨基酸残基替换。
本发明的变体包括那些通过核苷酸替换、缺失或添加而产生的突变体。这些替换、缺失或添加可能涉及一个或多个核苷酸。这些突变体可能在编码区或非编码区被改变或二者都被改变。在编码区的改变可能产生保守的或非保守的氨基酸替换、缺失或添加。在这些改变中特别优选的是沉默替换、添加或缺失，它们并不改变TNFR多肽或其部分的特性和活性。就这一点而言，保守性替换也是特别优选的。
编码具有在SEQ ID NOS：2和4中所示的氨基酸序列的蛋白的核酸分子或具有ATCC保藏号97810或97809中保藏的质粒所包含的克隆所编码的成熟TNFR多肽序列的核酸分子是特别优选的。
另外的实施方案包括一种分离的核酸分子，此核酸分子包含或由具有与选自以下各组核苷酸序列中任何一种核苷酸序列具有至少90％相同性，更优选至少80％，85％，90％，92％或95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸所组成：(a)编码具有SEQ IDNOS：2和4完整氨基酸序列，或如在ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列的TNFR多肽的核苷酸片段；(b)编码具有SEQ ID NO：2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-170位氨基酸序列的成熟TNFR多肽，或如同在ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的多肽的核苷酸片段；(c)编码具有SEQ ID NO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽的可溶性胞外区的核苷酸序列的核苷酸片段；(d)编码具有SEQ IDNOS：2和4完整氨基酸序列的TNFR多肽片段的核苷酸序列，或如在ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的多肽片段，其中所述的多肽片段具有TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性；和(e)与上述(a)(b)(c)或(d)中任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列。由这些多核苷酸所编码的多肽也被包含在本发明之内。
本发明另外的实施方案包括含有或由与上述(a)(b)(c)(d)和(e)中任何一种核苷酸序列具有至少90％相同性，更优选至少80％，85％，90％，92％或95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸，或在严格杂交条件下与上述(a)(b)(c)(d)或(e)中多核苷酸杂交的多核苷酸所组成的分离的核酸分子。能够杂交的多核苷酸在严格杂交条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基构成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。本发明的另外一个核酸实施方案涉及包含或由编码具有上述(a)(b)(c)(d)或(e)氨基酸序列的TNFR多肽表位携带部分氨基酸序列的多核苷酸所组成的分离的核酸分子。
一段多核苷酸的核苷酸序列与编码TNFR多肽的参考核苷酸序列具有例如至少“95％”相同性意指除了多核苷酸序列中的编码TNFR多肽的参考核苷酸序列的每100个核苷酸可以包括最多5个点突变之外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是相同的。换句话说，要获得与参考核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，92％或95％相同性的核苷酸序列，参考核苷酸序列中最多5％的核苷酸序列可被缺失或被其它核苷酸序列所替换，或者最多相当于总参考序列5％的核苷酸可被插入到参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5’端或3’端，或两端之间的任何位置，单个散布在参考序列的核苷酸中或在参考序列的一个或多个连续的组中。这些参考序列可以是如图1(SEQ ID NOS：1和2)或图2(SEQ ID NOS：3和4)中所示的TNFR-6α和/或TNFR-6β的整个编码序列或其片段、变体、衍生物或类似物，如文中所述。
在实际操作中，任何特定的核酸分子是否与例如在图1或图2中所示的核苷酸序列，或在一个或两个保藏的cDNA克隆中所含有的核苷酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性可以很方便地用已知的计算机程序例如Bestfit程序(位于威斯康星州麦迪逊科学大道575号的大学研究园遗传计算机研究组的用于UNIX系统的威斯康星序列分析包第8版)来确定。Bestfit程序利用Smith和Waterman应用数学进展2：482-489(1981)中的局部同源性原理以寻找两种序列之间最佳的同源片段。当利用Bestfit程序或其它序列比较程序去确定是否一段特定序列与本发明的参考序列具有例如95％的相同性时，参数是这样设置的，相同性百分比是在全长参考核苷酸序列的基础上计算出的并且总核苷酸数目最多5％的不相同性是允许的。参考序列可以是如图1(SEQ ID NO：1)或图2(SEQ ID NO：3)中所示的完整的TNFR编码核苷酸序列或TNFR-6α和/或TNFR-6β的任何多核苷酸片段(例如编码文中所述的N端或C端缺失的氨基酸序列的多核苷酸)、变体、衍生物或类似物，如文中所述。
在一个特定的实施方案中，参考序列(本发明的序列)和待比较序列之间的相同性，也称做全局序列比较，是应用在Brutlag等(计算机应用生物科学6：237-245(1990))演算程序基础上的FASTDB计算机程序确定的。在FASTDB序列比较中用于计算相同性百分比的优选参数如下：Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或待比较的核苷酸序列的长度稍短些。根据这个实施方案，如果待比较的核苷酸序列由于5’或3’缺失而不是内部缺失而短于参考序列，在计算结果时考虑到FASTDB程序在计算相同性百分比时并没有把待比较的核苷酸序列5’或3’缺失的情况包括在内，因此对结果做了一个人工校正。对于相对于参考序列5’或3’缺失的待比较的核苷酸序列来说，相同性百分比是通过计算参考序列中是待比较的核苷酸序列5’或3’端的并且不相同的碱基数目作为参考序列总碱基数的百分比而校正的。确定一个核苷酸是否相配是通过FASTDB序列比较的结果而决定的。然后这个百分比减去使用上述特定参数的FASTDB程序计算出的相同性百分比，最后得到了一个最终的百分比数值。就本发明而言，此校正的数值正是所使用的数值。正如FASTDB序列比较所显示的，只有在待比较的核苷酸序列5’或3’端碱基之外的并且与参考序列不相配的碱基才被计算以调整相同性百分比数值。例如，一段90个碱基的待比较的核苷酸序列与一段100碱基的参考序列进行序列比较以确定相同性百分比。待比较的核苷酸序列的5’端发生缺失，因此，FASTDB序列比较并不显示5’端的头10个碱基的比较。这10个未配对的碱基代表参考序列的10％(5’或3’端不配对碱基/参考序列总碱基数目)，所以应从由FASTDB程序计算出的相同性百分比中减去10％。如果剩下的90个碱基都配对的话那么最终的相同性百分比应该是90％。在另外一个实施例中，一段90个碱基的待比较的核苷酸序列与一段100碱基的参考序列进行序列比较。这次是内部缺失所以在待比较的核苷酸序列的5’或3’端没有不与参考序列不配对的碱基。在这种情况下，由FASTDB程序计算出的相同性百分比未进行人工校正。再说一遍，只有待比较的核苷酸序列的5’或3’端的与参考序列不配对的碱基才被人工校正。就本实施方案而言未做其它人工校正。
本发明涉及与图1或2(SEQ ID NOS：1或3)中的核酸序列，或与保藏的cDNA中的核酸序列和/或与文中所述的其它核酸序列(例如编码具有文中所述N端C端氨基酸缺失的多肽的核酸序列，例如编码SEQ ID NO：2中第30位缬氨酸残基到第300位组氨酸残基的核酸)具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的核酸分子，而不管它们所编码的多肽是否具有TNFR功能活性。这是因为即使一段特定的核酸分子不能编码具有TNFR功能活性的多肽，本领域熟练技术人员仍然知道如何利用此核酸分子例如用做杂交探针或聚合酶链式反应引物。对本发明不能编码具有TNFR功能活性的多肽的核酸分子的应用包括，(1)从cDNA文库中分离TNFR基因或其等位基因变体；(2)与中期染色体涂片进行原位杂交(例如“FISH”)以提供TNFR基因的精确位置，如在Verma等，人类染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)中所描述的；和在特定组织中检测TNFRmRNA表达的核酸印迹。
但是，优选与图1或2(SEQ ID NOS：1或3)中的核酸序列，或与ATCC保藏号97810或97809中保藏的cDNA克隆中所含有的核酸序列和/或与文中所述的其它核酸序列(例如编码具有文中所述N端C端氨基酸缺失的多肽的核酸序列)具有至少90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的核酸分子，而它们确实编码具有TNFR(即TNFR-6α和/或TNFR-6β)功能活性的多肽。“具有TNFR功能活性的多肽”意指例如在一种特定的免疫分析或生物学分析中显示相似的但不必要等同于本发明TNFR-6α和/或TNFR-6β(例如所测定的完整的(全长)、成熟和细胞外区)的一种活性的多肽。例如，TNFR-6α和/或TNFR-6β活性可以通过测量TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽与TNFR-6α和/或TNFR-6β配体(例如Fas配体和/或AIM-II(出版于1997年9月25日的国际申请公开号WO 97/34911))结合的能力而确定。在另外一个实施例中，TNFR-6α和/或TNFR-6β功能活性是通过测量一种多肽例如游离的或暴露在细胞表面上的同源配体诱导凋亡的能力而确定的。
TNF家族配体通过与TNF家族受体结合而诱发各种不同的细胞应答，包括本发明的TNFR-6α和TNFR-6β。据认为表达TNFR蛋白的细胞可针对TNFR-1受体配体产生强大的细胞应答，这些细胞包括B淋巴细胞(CD19+)，CD4和CD8+的T淋巴细胞，单核细胞以及内皮细胞。“针对TNF家族配体的细胞应答”意指由TNF家族配体在细胞、细胞系、组织、组织培养或病人中引发的任何一种基因型、表型、和/或多形性改变。如文中所述，这样的细胞应答不仅包括对TNF家族配体的正常的生理应答，而且与增加的细胞增殖或对增加的细胞增殖的抑制例如通过抑制凋亡也包括在内。
对前述物质的筛查分析也是本领域众所周知的。这样的筛查分析涉及在一个测量由受体激活导致的细胞外酸碱度变化的系统中使用受体表达细胞(例如，转染的COS细胞)，见例如科学246：181-296(1998年10月)中所描述的。例如，可以通过将一种TNF家族配体与表达本发明受体多肽成熟形式的细胞相互作用，然后测量第二信使应答例如信号传导或酸碱度改变以确定是否TNFR多肽是有活性的。
当然，由于遗传密码子的简并性，本领域熟练技术人员将会立即认识到与ATCC保藏号97810或97809中保藏的cDNA克隆中所含有的核酸序列，与图1或2(SEQ ID NOS：1或3)中的核酸序列或其片段具有至少90％，95％，96％，97，98％或99％的相同性的许多核酸分子将编码“具有TNFR功能活性的多肽”。实际上，由于这些核酸序列的简并性变体都编码相同的多肽，即使不进行上面所述的比较分析本领域熟练技术人员也会清楚地认识到这一点。本领域还要认识到的是，对于那些不是简并性变体的核酸分子来说，相当数量的核酸分子也会编码具有TNFR蛋白功能活性的多肽。这是因为本领域熟练技术人员很清楚地认识到氨基酸的替换几乎不影响蛋白功能或影响非常小(例如，使用第二种脂肪族氨基酸替换一种脂肪族氨基酸)，如下所述。载体和宿主细胞
本发明也涉及包括本发明分离的核酸分子在内的载体、用重组载体基因工程化得到的宿主细胞，或通过重组技术生产本发明多肽、TNFR多肽或其片段的方法。
在一个实施方案中，本发明的多核苷酸连接到一个载体(例如一个克隆或表达载体)上去。此载体可以是例如一种噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体既可以是能够复制的又可以是复制缺陷的。在后一种情况下，通常病毒的繁殖只能发生在互补的宿主细胞中。通常情况下，一种质粒载体被引入到沉淀中例如磷酸钙沉淀中，或与一带电荷的脂类形成复合物。如果此载体是病毒，它可以在体外使用合适的包装细胞系被包装然后转导进入宿主细胞。
通常情况下，重组的表达载体将包括允许转化宿主细胞的复制起点和选择标记，例如大肠杆菌的青霉素抗性基因和S.cerevisiae的TRP1基因，以及来自一高表达基因以指引下游结构基因转录的启动子。这些启动子可以来自编码糖原降解酶的操纵子如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，α-因子，酸性磷酸酶，热休克蛋白等。表达构建物另外包含转录起始位点、终止位点和在转录区包含翻译的核糖体结合位点。构建物表达的转录本的编码部分优选包括开始的一个翻译起始密码子以及在被翻译的多肽的大约尾部位置的一个终止密码子(UAA，UGA或UAG)。异源结构序列在合适时期被装配带有翻译起始和终止序列，和优选的一个能够引导翻译的蛋白运送到胞浆区或细胞外培养基中的前导序列。任选的，异源序列可以编码一种包括显示我们所希望的特征例如使表达的重组产物稳定或便于纯化，的N端鉴定肽的融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的DNA与一异源调控成分(例如，启动子或增强子)可操作连接，例如λ噬菌体PL启动子，大肠杆菌lac，trp，phoA和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTRs启动子等。其它合适的启动子是本领域熟练技术人员所熟知的。
如文中所述，表达载体优选包括至少一种选择标记。这样的选择标记包括用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性基因和用于培养大肠杆菌或其它细菌的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。合适的宿主的代表性例子包括但不限于细菌细胞例如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门菌细胞；真菌细胞例如酵母细胞；昆虫细胞例如果蝇S2细胞和草地夜蛾Sf9细胞；动物细胞例如CHO、COS、293和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。合适的培养基以及培养上述细胞的条件是本领域熟练技术人员众所周知的。
宿主细胞可以是一种高等真核细胞例如哺乳动物细胞(例人源的细胞)，或低等的真核细胞例如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞例如细菌细胞。宿主细胞株可能因为其调控插入的基因序列的表达或以我们所希望的方式修饰或处理基因产物而被选择出来。某些启动子的表达在存在某些诱导子的情况下会升高；因此可以控制基因工程多肽的表达。而且，不同的宿主细胞对蛋白的翻译后和翻译前处理和修饰(例如磷酸化，切割)的特征和机制是不同的。可以选择合适的细胞系以确保对所表达的外源蛋白进行我们所希望的修饰和处理。选择用于表达的合适的载体和启动子是众所周知的方法，并且表达载体的构建、载体引入宿主细胞以及在宿主细胞中的表达是本领域中的常规技术。
通过插入一段与功能性启动子可操作连接的带有合适的翻译起始和终止信号的编码目的蛋白的结构DNA序列而构建了有用的用于细菌的表达载体。此载体包含一个或多个表型选择标记以及一个复制起始子以确保载体的维持并且，如果需要的话，在宿主内提供扩增。转化的合适宿主包括大肠杆菌，枯草杆菌，鼠伤寒沙门菌和葡萄球菌，尽管其它细菌也可作为一种选择。作为一种典型的但是非限制性的例子，细菌中有用的表达载体包含一种选择标记和来自商业上有售的包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)遗传成分的质粒的细菌复制起始点。这些商用载体包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322的骨架部分与一种合适的启动子以及待表达的结构基因连接在一起。优选的用于细菌的载体包括QIAGEN公司的pHE4-5(ATCC编号209311；及其变体)，pQE70，pQE60和pQE9；Stratagene公司的pBS载体，Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A；Pharmacia公司的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。优选的真核载体有Stratagene公司的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1；和Pharmacia公司的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL。其它合适的载体是本领域熟练技术人员所明了的。
在转化合适的宿主细胞株并且宿主细胞株生长至一合适的密度以后，使用合适的方法诱导所选择的启动子(例如温度转换或化学诱导)表达，细胞再培养一段时间。通过离心的方法收集细胞，利用物理学或化学方法破碎细胞，得到产物粗提物用于进一步纯化。
用于表达蛋白的微生物细胞可以通过任何便利的方法破碎，包括反复冻融、超声、机械破碎或使用细胞裂解试剂，这些方法是本领域熟练技术人员所熟知的。
通过向载体中插入一段增强序列可以增加高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用的成分，通常距离10到300bp作用于启动子以增加其转录。例子包括SV40复制起始点远端100至270bp的增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点晚期一侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。
各种不同的哺乳动物培养系统也可被用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子有猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，Gluzman等(细胞23：175(1981))描述了此细胞，以及其它能够表达相容载体的细胞系例如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含一个复制起始点，一个合适的启动子和增强子，还有任何必须的核酶结合位点，多聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列以及5’端侧翼非转录序列。来源自SV40的DNA剪接序列以及多聚腺苷酸化位点可能被用于提供所需要的非转录遗传成分。
将载体构建物引入宿主细胞可以通过本领域众所周知的技术实现，包括但不局限于磷酸钙转染法，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂质体介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法。这些方法在许多标准的实验室手册如Davis等，分子生物学基本方法(1986)中都有详细描述。
除了包含文中所讨论的含有载体构建物的宿主细胞以外，本发明也包括脊椎动物来源的特别是哺乳动物来源的原代、次代和永生化的宿主细胞，这些宿主细胞已经被工程化以去掉或替换内源性的遗传物质(例如TNFR编码序列)，和/或包括与本发明TNFR多核苷酸可操作连接的能够激活、改变和/或扩增内源性TNFR多核苷酸的遗传物质。例如，本领域众所周知的方法可被用于通过同源重组的方法可操作连接异源控制区(例如启动子和/或增强子)和内源性TNFR多核苷酸序列(见例如编号为5641670的美国专利，授权于1997年6月；国际申请公开号WO 96/29411，出版于1996年9月26日；国际申请公开号WO 94/12650，出版于1994年8月4日；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342：435-438(1989)，以上文献引入本文做参考)。
下文描述的宿主细胞可被以传统的方式用于生产由重组序列编码的基因产物。另外，使用来源自本发明DNA构建物的RNAs，无细胞翻译系统也可被用于生产本发明的多肽。
本发明的多肽可以以一种被修饰的形式例如融合蛋白(含有与(不同蛋白)异源蛋白序列通过肽键连接的多肽，例如CK-beta8的信号肽(1995年6月23日申请的，PCT申请号PCT/US95/09058中批露的CK-8序列的-21至-1位氨基酸残基)或司登尼亚钙蛋白的信号肽(见保藏于1994年1月25日的，ATCC保藏号75652))被表达或合成，并且可能不仅包括分泌信号，也包括额外的异源功能区。这样的融合蛋白可以利用本领域众所周知的技术，通过将本发明的多核苷酸与编码我们所希望的氨基酸序列的核酸序列连接成合适的读码框而制备，并且利用本领域众所周知的技术表达融合蛋白产物。另外，这样的融合蛋白也可通过合成技术制备，例如，通过使用多肽合成仪而制备。因此，例如额外的氨基酸区特别是带电荷的氨基酸区可被加入到多肽的N末端以增加其在宿主细胞中的稳定性和持续性以及在纯化过程中、随后处理过程中和贮存中的稳定性。肽分子也可以加入到多肽中以促进纯化。这样的区域可在最终制备多肽之前被去除。向多肽中加入肽分子以造成分泌或排出，以增加稳定性并且利于纯化，是本领域中所熟知的常规方法。
优选的融合蛋白包含一段来自免疫球蛋白的用于稳定和纯化蛋白的异源区。例如，EP-A-O 464 533(加拿大对应申请2045869)中批露了一种含有免疫球蛋白分子稳定区各种不同部分以及另外一种人蛋白或其部分的融合蛋白。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中非常有用，并且因此导致例如升高的药物动力学特征(EP-A 0233 262)。另一方面，当融合蛋白以所述的有利方式被表达、检测和纯化后，对于一些用途来说我们希望去除Fc部分。在这种情况下已经证明Fc部分的存在是对治疗和诊断的一种障碍，例如，当融合蛋白被用于免疫接种中的免疫原时。在药物发现研究中，例如人蛋白如hIL-5已经和Fc部分融合以用于高产量筛选分析中鉴定hIL-5的拮抗剂。见D.Bennett等，分子识别期刊8：52-58(1995)和K.Johanson等，生物化学期刊270：9459-9471(1995)。在另外一个实施例中，本发明优选的融合蛋白包含免疫球蛋白轻链的一部分(即，κ或λ轻链的一部分)。在特定的实施方案中本发明的融合蛋白包含κ或λ轻链稳定区的一部分。
本发明的蛋白包括：从天然原料包括无论是分离的还是培养的体液、组织和细胞中纯化的产物；化学合成程序的产物；和从一种原核或真核宿主细胞包括例如细菌、真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中通过重组技术生产的产物。根据在此重组生产程序中所用的宿主细胞，本发明的多肽可能是糖基化的也可能是非糖基化的。此外，本发明的多肽可能也包括一种原始修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况下是由于宿主细胞介导的处理的结果。
本发明的蛋白可以利用本领域众所周知的技术化学合成(例如，见Creighton，1983，蛋白质：结构和分子机理，W.H.Freeman&Co.，纽约，和Hunkapiller，M等，自然310：105-111(1984))。例如，对应于本发明完整TNFR多肽(即，TNFR-6α和/或TNFR-6β)的一个片段的肽可以通过利用多肽合成仪而合成。而且，如果希望的话，非经典的氨基酸或化学氨基酸类似物可被作为替代物引入或加入到TNFR多肽序列中。非经典的氨基酸通常包括但是不局限于普通氨基酸的D异构体，2，4-二氨基丁酸，a-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，g-Abu，e-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，同型瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯甘氨酸，环己丙氨酸，b-丙氨酸，氟氨基酸，设计者氨基酸如b-甲基氨基酸，甲基氨基酸钙，甲基氨基酸钠和氨基酸类似物。而且，氨基酸可以是D(右旋)也可以是L(左旋)。
TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白可以通过天然过程被修饰例如翻译后处理，也可通过本领域众所周知的化学修饰技术处理。需要注意的是在一个给定的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白中相同类型的修饰在几个不同位点上的程度可能相同或不同。还有在一个给定的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白中可能含有许多类型的修饰。TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白可能是分枝的例如由于无处不在，它们也可以是带有或不带有分枝的环状。环状的、分枝的以及分枝环状的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白可能是天然的翻译后处理的结果，也可能是合成方法所造成的。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价连接，血红素分子部分的共价连接，核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接，脂类或脂类衍生物的共价连接，磷脂酰肌醇的共价连接，交联，环化，二硫键形成，焦谷氨酸形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟化，甲基化，豆蔻酸化，氧化，pegylation，蛋白水解处理，磷酸化，异戊二烯化，硒酰化(selenoylation)，硫化，转运RNA介导的向蛋白质中加入氨基酸如精氨酰化和遍在蛋白化(见例如，蛋白质一结构和分子特征，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，纽约(1993)；蛋白质的翻译后共价修饰，B.C.Johnson编，学院出版社，纽约，1-12页(1983)；Seifter等，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Ratten等，Ann NY Acad Sci663：48-62(1992))。
本发明包含翻译过程中或翻译后不同修饰的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白，例如通过糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护或阻断基团衍生化，水解裂解，与一种抗体或其它细胞配体分子连接等。任何一种化学修饰都可以通过众所周知的技术实施，包括但不局限于通过溴化氰，胰蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4的特异性化学裂解，酰化，甲酰化，氧化，还原，在衣霉素存在的情况下的代谢合成等等。
其它的包括在本发明之内的翻译后修饰包括例如，N连接的或O连接的碳水化合物链，N末端或C末端的处理，化学分子部分吸附到氨基酸骨架上，N连接的或O连接的碳水化合物链的化学修饰，原核宿主细胞表达导致的N末端甲硫氨酸的添加或缺失。多肽也可以被一可检测到的标记所修饰，例如用于检测和分离蛋白的酶、荧光、同位素或亲和素标记。
本发明也提供了TNFR-6α和/或TNFR-6β的化学修饰的衍生物，它们有许多额外的优点例如可溶性、稳定性和循环时间的增加或免疫原性的降低(见美国专利4179337)。用于衍生化的化学分子部分可以选自水溶性的聚合物例如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯基醇及其类似物。多肽可在分子内部任意位点被修饰，或在分子内部预先确定的位点被修饰，并且可以包含一个、两个、三个或更多的附着的化学分子部分。
聚合物可以是任何分子量的，可以分枝也可以不分枝。对于聚乙二醇来说，为了易于处理和生产优选的分子量在大约1kDa到大约100kDa之间(术语“大约”意指在制备聚乙二醇过程中，一些分子将会比标明的分子量稍重一些，有些会稍轻一些)。其它的分子量大小也可以使用，根据我们所希望的治疗的情况而选择(例如，我们所希望的持久释放的时间、对生物学活性的效应，如果有的话、易于处理的程度、抗原性程度或无抗原性以及聚乙二醇对治疗性蛋白质或其类似物的其它已知的效应)。例如，聚乙二醇可能具有大约200，500，1000，1500，2000，2500，300，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000，10500，11000，11500，12000，12500，13000，13500，14000，14500，15000，15500，16000，16500，17000，17500，18000，18500，19000，19500，20000，25000，30000，35000，40000，50000，55000，60000，65000，70000，75000，80000，85000，90000或100000kDa的平均分子量。
如上所示，聚乙二醇可能具有分枝结构。在美国专利5643575中分枝的聚乙二醇是所希望的；Morpurgo等，应用生物化学及生物工艺学56：59-72(1996)；Vorobjev等，核苷酸18：2745-1750(1999)；和Caliceti等，Bioconjug Chem.10：638-646(1999)，以上文献引入本文做参考。
聚乙二醇分子(或其它化学分子部分)在吸附至蛋白质上时应该考虑到其对此蛋白质的功能性或抗原性区域的影响。对于本领域熟练技术人员来说，有很多吸附方法可以使用例如EP 0 401 384，在此引入本文做参考(将PEG与G-CSF偶联)，也见Malik等，Exp.Hematol.20：1028-1935(1992)(报道使用tresyl chloride对GM-CSF进行pegylation)。例如，聚乙二醇可能通过反应性基团如游离的氨基或羧基基团与氨基酸残基共价连接。反应性基团是那些可以与聚乙二醇分子结合的基团。具有游离氨基基团的氨基酸残基可能包括赖氨酸残基和N末端氨基酸残基；那些具有游离羧基基团的氨基酸残基可能包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C末端氨基酸残基。巯基基团也可被用做与聚乙二醇结合的反应性基团。就用于治疗而言，优选与氨基基团结合，例如吸附至N末端或赖氨酸残基上。
如上面所指的，聚乙二醇可以通过与许多氨基酸残基中的任何一个连接而吸附至蛋白质上去。例如，聚乙二醇可以通过与赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或半胱氨酸残基共价结合而连接至蛋白质上去。一种或多种反应化学物可被用于使聚乙二醇连接至蛋白质的特定氨基酸残基(例如赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或半胱氨酸)上去，或连接至此蛋白质的多于一种类型的氨基酸残基(例如赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、或半胱氨酸及其组合)上去。
人们可能希望蛋白质在N末端受到化学修饰。使用聚乙二醇作为现有组合物的指示剂，人们可以从各种不同的聚乙二醇分子中(通过分子量、分枝等等)，在反应混合物中聚乙二醇分子与蛋白质(多肽)分子的比例，所要实施的pegylation反应的类型，以及获得所选择的N末端pegylated蛋白的方法中选择出来。获得N末端pegylated制备物的方法(即，如果必要的话把此部分从其它pegylated的部分中分离出来的方法)可以是从大量的pegylated的蛋白质分子中纯化N末端pegylated的物质。所选择的N末端化学修饰的蛋白质可以通过利用在一种特定蛋白质衍生化过程中存在的不同类型的基本氨基酸(赖氨酸和N末端)的不同反应性的还原性碱基化而获得。在合适的反应条件下，获得了N端带有含有聚合物的羧基基团的蛋白质的选择性衍生化。
如上所述，本发明蛋白质的pegylafion可以通过许多方法中的任何一种而完成。例如，聚乙二醇既可以直接连接到蛋白质上，也可以通过一连接序列而连接到蛋白质上去。聚乙二醇连接至蛋白质上的无连接序列系统见Delgado等，Crit.Rve.Thera.Drug.Carrier Sys.9：249-304(1992)；Francis等，Intern J.of Hametol 68：1-18(1998)；美国专利4002531；美国专利5349052；WO 95/06058；WO 98/32466，以上文献引入本文做参考。
一个不使用连接序列而使聚乙二醇分子直接连接到蛋白质上的系统使用了tresylated MPEG，它是使用tresylchloride(CISO2CH2CF3)对单甲氧基聚乙二醇进行修饰而产生的。一旦蛋白质与tresylatedMPEG发生反应，聚乙二醇分子就直接连接到蛋白质分子的氨基基团上。因此，本发明包括通过将本发明的蛋白质与带有2，2，2-triflureothane sulphonyl基团的聚乙二醇反应而产生的蛋白质-聚乙二醇结合物。
聚乙二醇可以使用许多不同的连接序列而被连接到蛋白质分子上去。例如，美国专利5612460，全文引入本文做参考，批露了将聚乙二醇连接到蛋白质上去的尿烷连接序列。蛋白质-聚乙二醇结合物其中被一段连接序列连接到蛋白质上的聚乙二醇也可以通过将蛋白质与以下化合物如MPEG丁二酸琥珀酰亚胺，1，1’-羰二咪唑激活的MPEG，MPEG-2，4，5-trichloropenylcarbonate，MPEG-对硝基苯酚碳酸酯和各种不同的MPEG-丁二酸酯衍生物反应而产生。WO98/32466中详细描述了许多将聚乙二醇结合到蛋白质上去的另外的聚乙二醇衍生物和化学反应物，全文引入本文做参考。使用文中所列出的反应化学物而生产的pegylated蛋白质产物也在本发明的范围之内。
吸附到本发明每一种蛋白质上的聚乙二醇分子部分的数目(即，替换的程度)也是不同的。例如，本发明的pegylated蛋白质可以连接平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20或更多的聚乙二醇分子。相似的，平均替换程度也在范围之内例如每一个蛋白质分子中1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19，或18-20个聚乙二醇分子部分。在Delgado等，Crit.Rve.Thera.Drug.CarrierSys.9：249-304(1992)中讨论了确定替换程度的方法。
TNFR蛋白质可以通过已知的方法复性和纯化，这些方法包括但不局限于硫酸氨或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和植物凝集素层析。最优选的是，高效液相层析(“HPLC”)被实施用于纯化。TNFR蛋白质
本发明另外提供了含有由本发明多核苷酸序列所编码的多肽序列的蛋白质。
本发明的TNFR蛋白质可以是单体或多聚体(即，二聚体，三聚体，四聚体或更大一些的多聚体)。因此，本发明涉及本发明TNFR蛋白质的单体和多聚体，它们的制备以及含有它们的组合物(优选的，药物组合物)。在一个特定的实施方案中，本发明的多肽是单体、二聚体、三聚体或四聚体。在另外的实施方案中，本发明的多聚体至少是二聚体、至少是三聚体或至少是四聚体。
本发明所包含的多聚体可以是同聚物也可以是异聚物。正如文中所用的，术语同聚物是指仅含有本发明TNFR蛋白质(包括TNFR片段、突变体和融合蛋白，如文中所述)的多聚体。这些同聚物可能含有具有相同或不同多肽序列的TNFR蛋白质。在一个特定的实施方案中，本发明的同聚物是仅含有具有相同多肽序列的TNFR蛋白质的多聚体。在另外的实施方案中，本发明的同聚物是含有具有不同多肽序列的TNFR蛋白质的多聚体。在特定的实施方案中，本发明的多聚体是同源二聚体(例如，含有具有相同或不同多肽序列的TNFR蛋白质)或同源三聚体(例如，含有具有相同或不同多肽序列的TNFR蛋白质)。在另外的实施方案中，本发明的同源多聚体是至少同源二聚体，至少同源三聚体，或至少同源四聚体。
正如文中所用的，术语异聚物是指除了本发明TNFR蛋白质之外还含有异源蛋白质(即，仅含有与TNFR基因编码的多肽序列不相同的多肽序列的蛋白质)的多聚体。在特定的实施方案中，本发明的多聚体是异源二聚体，异源三聚体，或异源四聚体。在另外的实施方案中，本发明的异源多聚体是至少异源二聚体，至少异源三聚体，或至少异源四聚体。
本发明的多聚体可能是例如脂质体形成中疏水、亲水、离子和/或共价连接的结果和/或是间接连接的结果。因此，在一个实施方案中，当本发明的蛋白质在溶液中相互接触时就形成了本发明的多聚体，例如，同源二聚体或同源三聚体。在另外一个实施方案中，当本发明的蛋白质与本发明的多肽的抗体(包括针对本发明融合蛋白中异源多肽序列的抗体)在溶液中相互接触时就形成了本发明的异源多聚体，例如，异源三聚体或异源四聚体。在另外一个实施方案中，本发明的多聚体是通过与本发明的TNFR蛋白或TNFR蛋白之间共价连接而形成的。这样的共价连接可能涉及蛋白质多肽序列中所含有的一个或多个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4中的多肽序列，ATCC 97810所含有的cDNA克隆所编码的多肽序列中所含的，ATCC 97809所含有的cDNA克隆所编码的多肽序列中所含的)。一方面，此共价连接是与天然多肽(即，自然发生的)相互作用的蛋白质的多肽序列内部的半胱氨酸残基的交联。另一方面，此共价连接是化学操作或重组操作的结果。另外，这样的共价连接可能涉及TNFR融合蛋白中异源多肽序列中所含的一个或多个氨基酸残基。在一个实施例中，共价连接发生在本发明的一种融合蛋白所含的异源序列之间(见例如美国专利5478925)。在一个特定的实施例中，共价连接发生在本发明的TNFR-Fc融合蛋白所含的异源序列之间(如文中所述)。在另外一个特定的实施例中，本发明融合蛋白的共价连接是发生在来自于另外一个能够形成共价连接多聚体的TNF家族配体/受体成员的异源多肽序列之间，如osteoprotegerin(见，例如国际申请公开号WO 98/49305，内容引入本文做参考)。在另外一个实施方案中，本发明的两种或更多种TR6-alpha和/或TR6-beta多肽通过肽连接序列连接在一起。美国专利5073627(引入本文做参考)中详细描述了那些含有肽连接序列的实施例。包含多个通过肽连接序列连接在一起的分开的TR6-alpha和/或TR6-beta的蛋白质可以通过传统的重组DNA技术而生产。
另外一个制备本发明TR6-alpha和/或TR6-beta多肽多聚体的方法包括使用融合至亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列的TR6-alpha和/或TR6-beta多肽。亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链是促进它们所形成的蛋白多聚体化的多肽。亮氨酸拉链首先在几种DNA结合蛋白中鉴定出来(Landschulz等，科学240：1759(1988))，并且自此发现它存在于多种不同的蛋白质中。在已知的亮氨酸拉链中是其二聚化或三聚化的天然的肽或衍生物。适于制备可溶性TR6-alpha和/或TR6-beta多聚体蛋白的亮氨酸拉链的实施例在PCT申请WO94/10308中有详细描述，引入本文做参考。在合适的宿主细胞中表达包含与二聚化或三聚化肽融合的可溶性TR6-alpha和/或TR6-beta多肽的重组融合蛋白，然后使用本领域众所周知的技术从培养上清中提取可溶性的多聚体化的TR6-alpha和/或TR6-beta产物。
据认为蛋白TNF家族的某些成员以三聚体形式存在(Beutler和Huffel，科学264：667，1994；Banner等，细胞73：431，1993)。因此，三聚体化的TR6-alpha和/或TR6-beta可能具有增强的生物学活性。优选的亮氨酸拉链分子部分是那些优选来自三聚体的亮氨酸拉链。一个实施例是来自肺表面活性剂蛋白质D的亮氨酸拉链，如同Hoppe等(FEBS Letters 344：191(1994))和美国专利申请号08/446922中所描述的，在此引入本文做参考。其它来自天然三聚体化蛋白质的肽可被适用于制备三聚体化的TR6-alpha和/或TR6-beta。
在另外的优选的实施方案中，本发明的TR6-alpha和/或TR6-beta的多核苷酸被融合至编码一种“FLAG”多肽的多核苷酸上。因此，TR6-alpha-FLAG或TR6-beta-FLAG融合蛋白也包含在本发明的范围之内。FLAG抗原性多肽可被融合至本发明的TR6-alpha或TR6-beta多肽的任一端或羧基端和氨基端。在优选的实施方案中，TR6-alpha-FLAG或TR6-beta-FLAG融合蛋白是用pFLAG-CMV-5a或pFLAG-CMV-1表达载体表达的(位于美国圣路易斯市的Sigma公司有售)。见，Andersson，S等，生命的化学期刊264：8222-29(1989)；Thomsen，D.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8 1：659-63(1984)；和Kozak，M等，自然308：241(1984)(每一篇文献都引入本文做参考)。在另外一个优选的实施方案中，TR6-alpha-FLAG或TR6-beta-FLAG融合蛋白是通过利用抗FLAG抗体(Sigma公司也有售)而检测出的。
本发明的多聚体也可以使用本领域众所周知的化学技术生产出来。例如，我们所希望包含在本发明多聚体中的蛋白质可以使用连接分子以及本领域所熟知的连接分子长度优化技术(见，例如美国专利5478925，在此全文引入本文做参考)而化学交联。此外，本发明的多聚体也可以使用本领域众所周知的技术以在我们所希望包含在多聚体(见，例如美国专利5478925，在此全文引入本文做参考)内的蛋白质多肽序列内部的半胱氨酸残基之间形成一个或多个分子间交联。而且，本发明的蛋白质可以常规通过向蛋白质多肽序列的N末端或C末端加入半胱氨酸或生物素而被修饰，并且本领域众所周知的技术可被应用以产生含有一个或多个这样的修饰的蛋白质的多聚体(见，例如美国专利5478925，在此全文引入本文做参考)。此外，本领域众所周知的技术可被应用以产生含有希望被本发明多聚体包含在内的蛋白质成分的脂质体(也见，例如美国专利5478925，在此全文引入本文做参考)。
另外，本发明的多聚体也可以使用本领域众所周知的基因工程技术生产出来。在一个实施方案中，包含在本发明多聚体之中的蛋白质是利用文中所述的融合蛋白技术或本领域所熟知的其它技术(见，例如美国专利5478925，在此全文引入本文做参考)而重组生产的。在一个特定的实施方案中，编码本发明同源二聚体的多核苷酸是通过将编码本发明多肽序列的多核苷酸与编码连接多肽的多核苷酸连接，然后与编码多肽的翻译产物的合成的多核苷酸反向从C末端到N末端(缺少前导序列)连接(见，例如美国专利5478925，在此全文引入本文做参考)。在另外的实施方案中，文中所述的重组技术或本领域所熟知的其它技术被应用于生产本发明的重组多肽，此多肽含有跨膜区并且能够通过膜重建技术被引入到脂质体中(见，例如美国专利5478925，在此全文引入本文做参考)。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的TNFR蛋白质，此蛋白质包含或由ATCC保藏号97810中所含有的cDNA克隆编码的完整(全长)TNFR多肽的氨基酸序列，由ATCC保藏号97809中所含有的cDNA克隆编码的完整(全长)TNFR多肽的氨基酸序列，图1(SEQ ID NO：2)中所示的完整TNFR-6α多肽的氨基酸序列，图2(SEQ ID NO：4)中所示的完整TNFR-6β多肽的氨基酸序列，或上述多肽的一部分组成。
在另外一个实施方案中，本发明提供了分离的TNFR蛋白质，此蛋白质包含或由ATCC保藏号978l0中所含有的cDNA克隆编码的成熟TNFR多肽的氨基酸序列，由ATCC保藏号97809中所含有的cDNA克隆编码的成熟TNFR多肽的氨基酸序列，图1(SEQ IDNO：2)中所示的TNFR-6α序列的第31位到第300位氨基酸残基，图2(SEQ ID NO：4)中所示的TNFR-6β序列的第31位到第170位氨基酸残基，或上述多肽的一部分(即，片段)组成。
本发明的多肽片段包括下列多肽，这些多肽包括或由如下氨基酸序列组成：在SEQ ID NO：2中所含有的氨基酸序列，在SEQ IDNO：4中所含有的氨基酸序列，ATCC保藏号97810中所含有的cDNA克隆编码的氨基酸序列，ATCC保藏号97809中所含有的cDNA克隆编码的氨基酸序列，或由能够与ATCC保藏号97810或97809中所含有的核苷酸序列，或图1或图2(分别是SEQ ID NO：1和SEQID NO：3)中所示的核苷酸序列或其互补序列杂交(例如在严格杂交条件下)的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。能够与这些核苷酸片段杂交的多核苷酸也在本发明的范围之内。蛋白质片段可以是“自由的”，或者被包含在一个更大一些的多肽中，其中此片段组成了这个多肽的一部分或一个区域，最优选的是一段单一的连续区。本发明多肽片段的典型例子包括那些例如包含或由SEQ ID NO：2中从第1位到第31位氨基酸残基，从第32位到第50位氨基酸残基，从第51位到第100位氨基酸残基，从第101位到第150位氨基酸残基，从第151位到第200位氨基酸残基，从第201位到第250位氨基酸残基和/或从第251位到第300位氨基酸残基组成的片段。本发明多肽片段另外的典型例子包括那些例如包含或由SEQ ID NO：4中从第1位到第31位氨基酸残基，从第32位到第70位氨基酸残基，从第70位到第100位氨基酸残基，从第100位到第125位氨基酸残基，从第126位到第150位氨基酸残基和/或从第151位到第170位氨基酸残基组成的片段。而且，多肽片段在长度上可以至少是10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，175或200个氨基酸。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明的范围之内。
在特定的实施方案中，本发明多肽片段包含或由下列氨基酸残基组成：图1(SEQ ID NO：2)中所示的第100位到第150位，第150位到第200位，第200位到第300位，第210位到第300位，第220位到第300位，第230位到第300位，第240位到第300位，第250位到第300位，第260位到第300位，第270位到第300位，第280位到第300位和/或第290位到第300位氨基酸残基。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明的范围之内。
TNF含有两个具有不同的结构和功能特征的区域。从SEQ IDNO：2中第30位氨基酸残基到第196位氨基酸残基的氨基端区是与TNFR家族其它成员同源的，TNFR家族四个半胱氨酸残基丰富区域特征的保守性说明了这一点。在这四个区的每一个中所含有的氨基酸序列分别是SEQ ID NO：2的第34位到第70位，第73位到第113位，第115位到第150位，和第153位到第193位氨基酸残基。从SEQ ID NO：2中第197位氨基酸残基到第300位氨基酸残基的羧基端区与任何已知的序列未显示明显的同源性。与TNFR家族的许多其它成员不同，TNFR似乎绝对是一种的分泌性蛋白并且不以膜相关的形式被合成。TNFR的氨基端似乎是TNFR生物学功能所必须的，而TNFR的羧基端似乎对TNFR的多聚体化很重要。
在一个实施方案中，本发明的多肽包含或由SEQ ID NO：2的第34位到第70位，第73位到第113位，第115位到第150位，第153位到第193位和/或第30到第196位氨基酸残基所组成。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明的范围之内。
在另外的一个实施方案中，本发明的多肽包含或由SEQ ID NO：2的第197位到第240位，第241位到第270位，第271位到第300位，和/或第197到第300位氨基酸残基所组成。编码这些多肽的多核苷酸也包含在本发明的范围之内。由于这些多肽片段被认为与TNFR的多聚体化相关，具有一个或多个这样的多肽序列的蛋白质被认为会形成与单体相比具有有利特征例如增加的结合亲和性、更高的稳定性和更长的循环半衰期的二聚体、三聚体或更高一些的多聚体。在一个特定的实施方案中，本发明提供了融合蛋白，此融合蛋白包含一个或多个由上述的多肽与细胞信号分子如受体及其胞外区以及受体或其胞外区的活性片段、衍生物或类似物的异源序列形成的融合。在一个优选的实施方案中，异源序列选自TNF样受体家族。这些序列优选包括功能性细胞外配体结合区并且没有跨膜区和胞内区。这样的融合蛋白在检测可与融合的异源多肽发生反应的分子中非常有用，并且因此可鉴定潜在的新受体和配体。融合蛋白也可用于治疗多种不同的紊乱，例如与受体结合有关的紊乱。在一个实施方案中，本发明的包含TNF/TNFR和TNF受体/TNFR序列的融合蛋白被用于治疗TNF和TNF受体介导的紊乱失调，例如炎症、自身免疫性疾病、癌症和与过度或降低的凋亡有关的紊乱。
在另外的实施方案中，TNFR多肽片段包含或由本发明多肽的功能区组成，例如在图4(表I)和图5(表II)中列出的以及文中所述的Garnier-Robosonα区、β区、转角区和卷曲区；Chou-Fasmanα区、β区和卷曲区；Kyte-Doolittle亲水区；Eisenbergα和β两亲性区；Karplus-Sculz柔性区；Emini表面形成区和Jameson-Wolf高抗原性指数区。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽片段是具有抗原性的。在表I和表II中的VIII，IX，XIII和XIV栏中显示的数据可被用于常规测定TNFR高度可能抗原性的区域。高抗原性区是利用VIII，IX，XIII或XIV栏中的数据通过选择代表多肽功能区的在抗原识别会导致起始免疫应答过程的环境下易于暴露至多肽表面的值而确定的。本发明高度优选的片段是那些含有能够组合几种结构特征，例如上面列出的几(例如，1，2，3或4)种特征的TNFR区的片段。编码这些的多肽的多核苷酸也在本发明的范围之内。
本发明包括多肽，这些多肽包含或由分别具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4氨基酸序列的多肽的表位，ATCC保藏号97810或97809中所含的多核苷酸序列编码的多肽序列的表位，由能够分别与SEQ ID NOS：1和3中序列，或ATCC保藏号97810或97809中所含的多核苷酸序列的互补序列在严格杂交条件下或如在上述中所明确的低严格杂交条件下发生杂交的多核苷酸编码的表位所组成。本发明另外包含编码本发明多肽序列(例如，在SEQ ID NOS：1和/或3中显示的序列)的表位的多核苷酸序列，编码本发明表位的多核苷酸序列的互补链的多核苷酸序列，和在严格杂交条件下或如在上述中所明确的低严格杂交条件下与互补链杂交的多核苷酸序列。
术语“表位”，正如文中所用的，指在动物，优选哺乳动物，最优选人体内具有抗原性和免疫原性的多肽部分。在一个优选的实施方案中，本发明包含含有表位的多肽，以及编码此多肽的多核苷酸。“免疫原性表位”，正如文中所用的，是指能在动物体内引发抗体应答的蛋白部分，正如通过本领域任何一种众所周知的方法所测定的，例如通过下文所描述的生产抗体的方法(见，例如Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4001(1983))。术语“抗原性表位”，正如文中所用的，是指抗体能够免疫特异性地识别其抗原的蛋白部分，正如通过本领域任何一种众所周知的方法所测定的，例如通过文中所描述的免疫分析方法。免疫特异性结合排除了非特异性结合但并不一定排除了与其它抗原的交叉反应。抗原表位并不必须是免疫原性的。
能够被用于生产TNFR特异性抗体的抗原性多肽或肽的非限制性例子包括：包含或由在SEQ ID NO：2中从大约第31位丙氨酸到大约第46位苏氨酸残基，从大约第57位苯丙氨酸到大约第117位苏氨酸残基，从大约第132位半胱氨酸到大约第175位苏氨酸残基，从大约第185位甘氨酸到大约第194位苏氨酸残基，从大约第205位缬氨酸到大约第217位天冬氨酸残基，从大约第239位脯氨酸到大约第264位亮氨酸残基，和从大约第283位丙氨酸到大约第298位脯氨酸残基；和SEQ ID NO：4中从大约第31位丙氨酸到大约第46位苏氨酸残基，从大约第57位苯丙氨酸到大约第80位谷氨酰胺残基，从大约第86位谷氨酸到大约第106位组氨酸残基，从大约第108位苏氨酸到大约第119位苯丙氨酸残基，从大约第129位组氨酸到大约第138位缬氨酸残基，和从大约第142位甘氨酸到大约第166位脯氨酸残基。通过分析如图4和5中所示的Jameson-Wolf抗原性指数，已经确定这些多肽片段携带有TNFR-6α和TNFR-6β多肽的抗原性表位。
具有表位功能的片段可以用任何传统的方法生产。(见，例如，Houghten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135(1985)，另外美国专利4631211中也描述了这些方法)。
在本发明中抗原表位优选含有具有至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，更优选至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，并且最优选在大约15个至大约30个氨基酸组成的序列。优选的含有免疫原性或抗原性表位的多肽至少具有10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个氨基酸残基长度。抗原表位是很有用的，例如它可以提高与表位特异性结合的抗体水平包括单克隆抗体。抗原表位也可被用做免疫分析中的靶分子。(见，例如，Wilson等，细胞37：767-778(1984)；Sutcliffe等，科学219：660-666(1983))。
相似的，免疫原性表位可被用于，例如根据本领域众所周知的方法诱导抗体产生。(见，例如，Sutcliffe等，supra；Wilson等，supra；Chow等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：910-914；和Bittle等，普通病毒学期刊66：2347-2354(1985))。含有一个或多个免疫原性表位的多肽可被与载体蛋白如白蛋白一起呈递到动物系统(例如，大鼠或小鼠)以引发抗体应答，或者如果此多肽长度足够时(大约至少25个氨基酸)，此多肽可以不用载体单独呈递。但是，含有少至8-10个氨基酸的免疫原性表位已经被证明足以提高能够与变性的多肽中的线形表位最低程度结合的抗体水平(例如，在蛋白印迹中)。
本发明的表位携带多肽可根据本领域众所周知的方法被用于诱导抗体产生，这些方法包括但不局限于体内免疫接种、体外免疫接种以及噬菌体展示方法。见Sutcliffe等，上述；Wilson等，上述；和Bittle等，普通病毒学期刊66：2347-2354(1985)。如果使用体内免疫接种的方法，则用游离的肽免疫动物；但是，通过将肽与大分子载体如匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)或破伤风毒素偶联可以提高抗肽抗体滴度。例如，含有半胱氨酸残基的肽可以使用如马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS)的接头而偶联到载体上，而其它的肽使用普通的连接试剂如戊二醛就可以偶联到载体上去。动物例如兔子、大鼠和小鼠被免疫接种游离的或载体偶联的肽，例如，将含有大约100微克的肽或载体蛋白以及弗氏佐剂或其它任何已知可以刺激免疫应答的佐剂的乳剂通过腹膜内和/或皮下注射方式接种。可能需要几次加强接种，例如，间隔大约两周，以提供有用的可被利用使用吸附到固相表面的游离肽通过ELISA分析方法检测到的抗肽抗体滴度。免疫动物血清中抗肽抗体的滴度可以通过对抗肽抗体的选择而升高，例如根据本领域众所周知的方法将肽吸附至固相表面，然后洗脱所选择的抗体。
本领域熟练技术人员应理解的且如下面所讨论的，本发明的含有免疫原性表位或抗原性表位的多肽可被融合至其它多肽序列上去。例如，本发明的多肽可与免疫球蛋白(IgA，IgE，IgG，IgM)的稳定区，或其部分(CH1，CH2，CH3，或其任何一种组合或其部分)融合导致产生嵌合多肽。这样的融合蛋白会有利于纯化并且可能增加了其在体内的半衰期。这已经在由人CD4多肽的前两个区和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区各个不同功能区所组成的嵌合蛋白中得到了证明。见，例如EP 394827；Traunecker等，自然，331：84-86(1988)。由于IgG部分的二硫键而形成二硫桥连接的二聚体结构的IgG融合蛋白也已经被发现比其单体多肽或单独的片段具有更有效的结合和中和其它分子的能力。见Fountoulakis等，生物化学期刊270：3958-3964(1995)。编码上述多肽的核酸分子也可以与用做表位标记(例如，血凝素“HA”标记或flag标记)的目的基因重组以利于所表达的多肽的检测和纯化。例如，在Janknecht等所描述的系统中，表达在人细胞系中的非变性的融合蛋白易于纯化(Janknecht等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8971-897)。在这个系统中，目的基因被亚克隆到痘苗重组质粒中以使得此基因的开放读码框可翻译地融合至由6个组氨酸组成的氨基端标记上。标记作为融合蛋白的基质结合功能区。从重组痘苗病毒感染的细胞中获得的提取物被装载到镍柱上去，然后组氨酸标记的蛋白可用含有咪唑的缓冲液洗脱下来。
基因重排、基序重排、外显子重排和/或密码子重排技术(统称为“DNA重排”)可被用于调控TR-6α和/或TR-6β活性，以有效生产TR-6α和/或TR-6β的激动剂或拮抗剂。见美国专利5605793，5811238，5830721，5834252和5837458以及Patten，P.A.等，生物工艺学现代论点8：724-33(1997)；Harayama，S，生物工艺学趋势16(2)：76-82(1998)；Hansson，L.O.等，分子生物学期刊287：265-76(1999)；和Lorenzo，M.M.和Blasco，R，生物技术24(2)：308-13(1998)(每一项专利及文献引入本文做参考)。在一个实施方案中，可以通过DNA重排技术来改变TR-6α和/或TR-6β的核苷酸序列或相应的多肽。DNA重排涉及将两个或更多的DNA片段通过同源重组或位点特异性重组而装配到目的TR-6α和/或TR-6β分子中去。在另外一个实施方案中，可以通过错配PCR、随机核苷酸插入或重组前的其它方法造成随机诱变而改变TR-6α和/或TR-6β的核苷酸序列或相应的多肽。在另外一个实施方案中，TR-6α和/或TR-6β分子的一个或多个成分、基序、节段、部分、区、片段等可以与一个或多个异源分子的一个或多个成分、基序、节段、部分、区、片段等重组。在优选的实施方案中，异源分子是TNF-α、TNF-β、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、FAS配体、APRIL。在另外的优选的实施方案中，异源分子是TNF家族的任一成员。
此外，基因重排、基序重排、外显子重排和/或密码子重排技术(统称为“DNA重排”)可被用于调控TNFR活性，以有效生产TNFR的激动剂或拮抗剂。见美国专利5605793，5811238，5830721，5834252和5837458以及Patten等，生物工艺学现代论点8：724-33(1997)；Harayama，生物工艺学趋势16(2)：76-82(1998)；Hansson等，分子生物学期刊287：265-76(1999)；和Lorenzo和Blasco，生物技术24(2)：308-13(1998)(每一项专利及文献引入本文做参考)。在一个实施方案中，可以通过DNA重排技术来改变TNFR的核苷酸序列或相应的多肽。DNA重排涉及将两个或更多的DNA片段通过同源重组或位点特异性重组而装配到目的TNFR分子中去。在另外一个实施方案中，可以通过错配PCR、随机核苷酸插入或重组前的其它方法造成随机诱变而改变TNFR的核苷酸序列或相应的多肽。在另外一个实施方案中，TNFR分子的一个或多个成分、基序、节段、部分、区、片段等可以与一个或多个异源分子的一个或多个成分、基序、节段、部分、区、片段等重组。在优选的实施方案中，异源分子包括但不局限于TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α，也称做TNF-β)、LT-β(在LT-α2-β异源三聚体复合物中发现)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国际公开WO 96/14328)、TRAIL、AIM-II(国际公开WO 97/34911)、APRIL(实验医学期刊188(6)：1185-1190)、内因子-α(国际公开WO98/07880)、神经因子-α(国际公开WO 98/18921)、TR6-α(国际公开WO 98/30694)、OPG、OC40和神经生长因子(NGF)，以及Fas、CD30、CD27、CD40和4-1BB、TR2(国际公开WO 96/34095)、DR3(国际公开WO 97/33904)、DR4(国际公开WO 98/32856)、TR5(国际公开WO 98/30693)、TR7(国际公开WO 98/41629)、TRANK、TR9(国际公开WO 98/56892)、TR10(国际公开WO 98/54202)、312C2(国际公开WO 98/06842)、和TR12的可溶性形式，和CD154、CD70和CD153的可溶性形式。在另外的优选的实施方案中，异源分子是TNF家族的任一成员。
为了改善或改变TNFR多肽的特性，可以运用蛋白质工程技术。本领域熟练技术人员众所周知的重组DNA技术可被用于创造包括单个或多个氨基酸替换、缺失、插入或融合蛋白的新型的突变蛋白质或“突变蛋白质”。这样的修饰的多肽可以显示出例如增强的活性或增加的稳定性。此外，与相应的天然多肽相比它们可至少在某些纯化和贮存条件下以更高的产量被纯化或显示出更佳的溶解性。例如，对于许多蛋白质来说，包括膜相关蛋白的胞外区或分泌蛋白的成熟形式，本领域中众所周知N末端或C末端的一个或多个氨基酸可在不引起生物学功能的显著损失的前提下被去掉。例如，Ron等，生命的化学期刊，268：2984-2988(1993)报道即使3个、8个或27个氨基酸残基丢失的修饰的KGF蛋白仍然具有肝素钠结合活性。
在本发明中，由于本发明的蛋白质都是TNFR多肽家族的成员，所以去掉其N末端的氨基酸一直到SEQ ID NOS：2和4(TNFR-6α和TNFR-6β)的第49位半胱氨酸残基的蛋白质仍然保留一些生物学活性例如，调控细胞增殖和凋亡(例如，淋巴细胞)，与Fas配体(FasL)结合的能力，与AIM-II结合的能力。在SEQ ID NOS：2和4中具有另外的N末端缺失包括第49位半胱氨酸残基的缺失的多肽就不能再指望其仍然保留活性，这是因为众所周知TNFR相关的多肽中的这些残基是形成提供结构稳定性的二硫桥所必需的，而结构稳定是受体/配体结合和信号传导所需要的。但是，即使蛋白质的N末端去掉一个或多个氨基酸残基造成了对此蛋白质损失了一项或多项生物学功能的修饰，其它的功能活性仍然保留下来。因此，当少于主要部分的氨基酸残基被从完整TNFR、成熟TNFR或TNFR的胞外区N末端去除时，此截短的蛋白质诱导或结合识别完整TNFR、成熟TNFR或TNFR的胞外区的抗体的能力仍然保留下来。利用本文中所描述的常规方法和其它本领域众所周知的方法可以很容易地确定某个缺少完整蛋白N末端的多肽是否仍然保留这样的免疫学活性。
因此，本发明另外提供了包含或另外由一个或多个氨基酸残基从SEQ ID NOS：2和4中TNFR氨基端的去除，一直到第49位半胱氨酸残基被去除的多肽组成的多肽，以及编码这些多肽的多核苷酸。尤其是，本发明提供了TNFR多肽，此多肽包含或另外由图1(SEQ ID NO：2)中m-300残基的氨基酸序列和/或图2(SEQ ID NO：4)中n-170残基的氨基酸序列组成。其中m和n都是在1-49范围中的整数，并且49是完整TNFR-6α和TNFR-6β多肽自N末端起的第一个半胱氨酸残基位置(如SEQ ID NOS：2和4中所示)，据认为此位置对于TNFR-6α和TNFR-6β蛋白质的活性是必需的。
更特别的是，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，此多肽具有(即，包含)或另外由选自下列组的氨基酸残基组成的氨基酸序列所组成：SEQ ID NO：2的1-300，2-300，3-300，4-300，5-300，6-300，7-300，8-300，9-300，10-300，11-300，12-300，13-300，14-300，15-300，16-300，17-300，18-300，19-300，20-300，21-300，22-300，23-300，24-300，25-300，26-300，27-300，28-300，29-300，30-300，31-300，32-300，33-300，34-300，35-300，36-300，37-300，38-300，39-300，40-300，41-300，42-300，43-300，44-300，45-300，46-300，47-300，48-300，和49-300。以及SEQ ID NO：4的1-170，2-170，3-170，4-170，5-170，6-170，7-170，8-170，9-170，10-170，11-170，12-170，13-170，14-170，15-170，16-170，17-170，18-170，19-170，20-170，21-170，22-170，23-170，24-170，25-170，26-170，27-170，28-170，29-170，30-170，31-170，32-170，33-170，34-170，35-170，36-170，37-170，38-170，39-170，40-170，41-170，42-170，43-170，44-170，45-170，46-170，47-170，48-170，和49-170。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了编码包含或另外由选自下列残基组：SEQ ID NO：2的第30位缬氨酸到第300位组氨酸的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。
在其它特定的实施方案中，本发明提供了编码包含或另外由选自下列各组：SEQ ID NO：2的第23位苯丙氨酸到第300位组氨酸，和/或第34位苯丙氨酸到第300位组氨酸的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。
如上所述，即使蛋白质的N末端去掉一个或多个氨基酸残基造成了对此蛋白质损失了一项或多项生物学功能的修饰，其它的功能活性(例如，生物学活性)仍然保留下来。因此，当少于主要部分的氨基酸残基被从完整TNFR、成熟TNFR或TNFR的胞外区N末端去除时，此截短的蛋白质诱导或结合识别完整TNFR、成熟TNFR或TNFR的胞外区的抗体的能力仍然保留下来。利用本文中所描述的常规方法和其它本领域众所周知的方法可以很容易地确定某个缺少完整蛋白N末端的多肽是否仍然保留这样的免疫学活性。一带有许多N末端氨基酸缺失的TNFR突变蛋白质仍然保留一些生物学或免疫学活性不是不可能的。实际上，由少至6个TNFR氨基酸残基构成的肽即可引起免疫应答。
因此，本发明另外提供了具有如图1(即，SEQ ID NO：2)中所示的一个或多个氨基酸残基一直到第295位精氨酸残基被从TNFR-6α氨基末端去除的氨基酸序列的多肽，和编码这样的多肽的多核苷酸。尤其是，本发明提供了包含或另外由图1(SEQ ID NO：2)中n1-300残基组成的多肽，其中n1是在49-295范围之间的整数，对应于图1(SEQ ID NO：2)中氨基酸残基的位置。
更为特别的是，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，此多肽具有(即，包含)或由选自下列组的氨基酸残基组成的氨基酸序列所组成：图1(SEQ ID NO：2)中所示的TNFR-6α序列的C-49到H-300，A-50到H-300，Q-51到H-300，C-52到H-300，P-53到H-300，P-54到H-300，G-55到H-300，T-56到H-300，F-57到H-300，V-58到H-300，Q-59到H-300，R-60到H-300，P-61到H-300，C-62到H-300，R-63到H-300，R-64到H-300，D-65到H-300，S-66到H-300，P-67到H-300，T-68到H-300，T-69到H-300，C-70到H-300，G-71到H-300，P-72到H-300，C-73到H-300，P-74到H-300，P-75到H-300，R-76到H-300，H-77到H-300，Y-78到H-300，T-79到H-300，Q-80到H-300，F-81到H-300，W-82到H-300，N-83到H-300，Y-84到H-300，L-85到H-300，E-86到H-300，R-87到H-300，C-88到H-300，R-89到H-300，Y-90到H-300，C-91到H-300，N-92到H-300，V-93到H-300，L-94到H-300，C-95到H-300，G-96到H-300，E-97到H-300，R-98到H-300，E-99到H-300，E-100到H-300，E-101到H-300，A-102到H-300，R-103到H-300，A-104到H-300，C-105到H-300，H-106到H-300，A-107到H-300，T-108到H-300，H-109到H-300，N-110到H-300，R-111到H-300，A-112到H-300，C-113到H-300，R-114到H-300，C-115到H-300，R-116到H-300，T-117到H-300，G-118到H-300，F-119到H-300，F-120到H-300，A-121到H-300，H-122到H-300，A-123到H-300，G-124到H-300，F-125到H-300，C-126到H-300，L-127到H-300，E-128到H-300，H-129到H-300，A-130到H-300，S-131到H-300，C-132到H-300，P-133到H-300，P-134到H-300，G-135到H-300，A-136到H-300，G-137到H-300，V-138到H-300，I-139到H-300，A-140到H-300，P-141到H-300，G-142到H-300，T-143到H-300，P-144到H-300，S-145到H-300，Q-146到H-300，N-147到H-300，T-148到H-300，Q-149到H-300，C-150到H-300，Q-151到H-300，P-152到H-300，C-153到H-300，P-154到H-300，P-155到H-300，G-156到H-300，T-157到H-300，F-158到H-300，S-159到H-300，A-160到H-300，S-161到H-300，S-162到H-300，S-163到H-300，S-164到H-300，S-165到H-300，E-166到H-300，Q-167到H-300，C-168到H-300，Q-169到H-300，P-170到H-300，H-171到H-300，R-172到H-300，N-173到H-300，C-174到H-300，T-175到H-300，A-176到H-300，L-177到H-300，G-178到H-300，L-179到H-300，A-180到H-300，L-181到H-300，N-182到H-300，V-183到H-300，P-184到H-300，G-185到H-300，S-186到H-300，S-187到H-300，S-188到H-300，H-189到H-300，D-190到H-300，T-191到H-300，L-192到H-300，C-193到H-300，T-194到H-300，S-195到H-300，C-196到H-300，T-197到H-300，G-198到H-300，F-199到H-300，P-200到H-300，L-201到H-300，S-202到H-300，T-203到H-300，R-204到H-300，V-205到H-300，P-206到H-300，G-207到H-300，A-208到H-300，E-209到H-300，E-210到H-300，C-211到H-300，E-212到H-300，R-213到H-300，A-214到H-300，V-215到H-300，I-216到H-300，D-217到H-300，F-218到H-300，V-219到H-300，A-220到H-300，F-221到H-300，Q-222到H-300，D-223到H-300，I-224到H-300，S-225到H-300，I-226到H-300，K-227到H-300，R-228到H-300，L-229到H-300，Q-230到H-300，R-231到H-300，L-232到H-300，L-233到H-300，Q-234到H-300，A-235到H-300，L-236到H-300，E-237到H-300，A-238到H-300，P-239到H-300，E-240到H-300，G-241到H-300，W-242到H-300，G-243到H-300，P-244到H-300，T-245到H-300，P-246到H-300，R-247到H-300，A-248到H-300，G-249到H-300，R-250到H-300，A-251到H-300，A-252到H-300，L-253到H-300，Q-254到H-300，L-255到H-300，K-256到H-300，L-257到H-300，R-258到H-300，R-259到H-300，R-260到H-300，L-261到H-300，T-262到H-300，E-263到H-300，L-264到H-300，L-265到H-300，G-266到H-300，A-267到H-300，Q-268到H-300，D-269到H-300，G-270到H-300，A-271到H-300，L-272到H-300，L-273到H-300，V-274到H-300，R-275到H-300，L-276到H-300，L-277到H-300，Q-278到H-300，A-279到H-300，L-280到H-300，R-281到H-300，V-282到H-300，A-283到H-300，R-284到H-300，M-285到H-300，P-286到H-300，G-287到H-300，L-288到H-300，E-289到H-300，R-290到H-300，S-291到H-300，V-292到H-300，R-293到H-300，E-294到H-300，和R％-295到H-300。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。
相似的，已知也有许多生物学功能性C末端缺失的突变蛋白质的例子。例如，去除羧基端8-10个氨基酸残基，γ干扰素显示的活性高到10倍(Dobeli等，生物工艺学期刊7：199-216(1988))。在本发明中，由于本发明的蛋白质是TNFR多肽家族的成员，去除C末端氨基酸残基直至SEQ ID NOS：2和4的分别是第193位和第132位半胱氨酸残基，可能仍然保留一些功能性活性，例如生物学活性(例如，调控细胞增殖和凋亡(例如，淋巴细胞，与Fas配体(FasL)结合的能力，与AIM-II结合的能力。))。在SEQ ID NOS：2和4中具有另外的N末端缺失包括第193位和第132位半胱氨酸残基的缺失的多肽就不能再指望其仍然保留活性，这是因为众所周知TNFR相关的多肽中的这些残基是形成提供结构稳定性的二硫桥所必需的，而结构稳定是受体结合所需要的。
但是，即使蛋白质的C末端去掉一个或多个氨基酸残基造成了对此蛋白质损失了一项或多项生物学功能的修饰，其它的功能活性(例如，生物学活性，形成多聚体的能力，与配体(Fas配体和AIM-II)结合的能力)仍然保留下来。因此，当少于主要部分的氨基酸残基被从完整、成熟形式蛋白的C末端去除时，此截短的蛋白质诱导和/或结合识别完整、成熟形式蛋白的抗体的能力仍然保留下来。利用本文中所描述的常规方法和其它本领域众所周知的方法可以很容易地确定某个缺少完整蛋白C末端的多肽是否仍然保留这样的免疫学活性。
因此，本发明另外提供了具有如SEQ ID NOS：2和4中所示的一个或多个氨基酸残基一直到SEQ ID NOS：2和4的分别是第193位和第132位半胱氨酸残基被从TNFR-6α和TNFR-6β羧基末端去除的氨基酸序列的多肽，和编码这样的多肽的多核苷酸。尤其是，本发明提供了包含或另外分别由SEQ ID NOS：2和4中1-y和1-z残基组成的多肽，其中y是处于193-300范围之间的整数，而z是处于132-170范围之间的整数。本发明也提供了编码这些多肽的多核苷酸。
在某些优选的实施方案中，本发明提供了如下的多肽，其包含或由选自如下一组的成员的氨基酸序列组成，所述的组分别为SEQID NOS：2和4中的残基1-y′和1-z′，其中y′是193-299之间的任何整数，z是132-169之间的任何整数。还提供了编码这些多肽的多核苷酸。
在另外优选的特定的实施方案中，本发明提供了包含或由选自下列各组：SEQ ID NO：2的第23位脯氨酸到第300位组氨酸，第30位缬氨酸到第300位组氨酸，第34位脯氨酸到第300位组氨酸的氨基酸序列，和SEQ ID NO：2的第23位脯氨酸到第170位脯氨酸，第30位缬氨酸到第170位脯氨酸，第34位脯氨酸到第170位组氨酸脯氨酸的氨基酸序列组成的多肽。如文中所述，这些多肽可被融合至异源多肽序列上去。本发明也提供了编码这些多肽的多核苷酸和这些融合的多肽。
本发明也提供了一般描述为具有SEQ ID NO：2中m-y残基和SEQ ID NO：4中n-z残基的氨基端和羧基端都缺失了一个到多个氨基酸残基的多肽，其中m，n，y和z都是上面所述的整数。
也如同上面所描述的，即使蛋白质的C末端去掉一个或多个氨基酸残基造成了对此蛋白质损失了一项或多项生物学功能的修饰，其它的功能活性(例如，生物学活性，形成同源多聚体的能力，与配体(Fas配体和AIM-II)结合的能力)仍然保留下来。例如，当少于主要部分的氨基酸残基被从完整、成熟形式蛋白的C末端去除时，此截短的TNFR突变蛋白质蛋白质诱导和/或结合识别完整、成熟形式蛋白的抗体的能力仍然保留下来。利用本文中所描述的常规方法和其它本领域众所周知的方法可以很容易地确定某个缺少完整蛋白C末端的多肽是否仍然保留这样的免疫学活性。一段带有许多C末端氨基酸缺失的TNFR突变蛋白质仍然保留一些生物学或免疫学活性不是不可能的。实际上，由少到6个TNFR氨基酸残基构成的肽即可激发免疫应答。
因此，本发明另外提供了具有如图1(即，SEQ ID NO：2)中所示的一个或多个氨基酸残基一直到第6位甘氨酸残基被从TNFR多肽羧基末端去除的氨基酸序列的多肽，和编码这样的多肽的多核苷酸。尤其是，本发明提供了包含或另外由图1(即，SEQ ID NO：2)中1-m1残基组成的多肽，其中m1是在6-299范围之间的整数，对应于图1(SEQ ID NO：2)中氨基酸残基的位置。
更为特别的是，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，此多肽包含或由选自下列组的氨基酸残基组成的氨基酸序列所组成：图1(SEQID NO：2)中所示的TNFR序列的M-1到V-299，M-1到P-298，，M-1到L-297，M-1到F-296，M-1到R-295，M-1到E-294，M-1到R-293，M-1到V-292，M-1到S-291，M-1到R-290，M-1到E-289，M-1到L-288，M-1到G-287，M-1到P-286，M-1到M-285，M-1到R-284，M-1到A-283，M-1到V-282，M-1到R-281，M-1到L-280，M-1到A-279，M-1到Q-278，M-1到L-277，M-1到A-271，M-1到G-270，M-1到D-169，M-1到Q-268，M-1到A-267，M-1到G-266，M-1到L-265，M-1到L-264，M-1到E-263，M-1到T-262，M-1到L-261，M-1到R-260，M-1到R-259，M-1到R-258，M-1到L-257，M-1到K-256，M-1到L-255，M-1到Q-254，M-1到L-253，M-1到A-252，M-1到A-251，M-1到R-250，M-1到G-249，M-1到A-248，M-1到R-247，M-1到P-246，M-1到T-245，M-1到P-244，M-1到G-243，M-1到W-242，M-1到G-241，M-1到E-240，M-1到P-239，M-1到A-238，M-1到E-237，M-1到L-236，M-1到A-235，M-1到Q-234，M-1到L-233，M-1到L-232，M-1到R-231，M-1到Q-230，M-1到L-229，M-1到R-228，M-1到K-227，M-1到I-226，M-1到S-225，M-1到I-224，M-1到D-223，M-1到Q-222，M-1到F-221，M-1到A-220，M-1到V-219，M-1到F-218，M-1到D-217，M-1到I-216，M-1到V-215，M-1到A-214，M-1到R-213，M-1到E-212，M-1到C-211，M-1到E-210，M-1到E-209，M-1到A-208，M-1到G-207，M-1到P-206，M-1到V-205，M-1到R-204，M-1到T-203，M-1到S-202，M-1到L-201，M-1到P-200，M-1到F-199，M-1到G-198，M-1到T-197，M-1到C-196，M-1到S-195，M-1到T-194，M-1到C-193，M-1到L-192，M-1到T-191，M-1到D-190，M-1到H-189，M-1到S-188，M-1到S-187，M-1到S-186，M-1到G-185，M-1到P-184，M-1到V-183，M-1到N-182，M-1到L-181，M-1到A-180，M-1到L-179，M-1到G-178，M-1到L-177，M-1到A-176，M-1到T-175，M-1到C-174，M-1到N-173，M-1到R-172，M-1到H-171，M-1到P-170，M-1到Q-169，M-1到C-168，M-1到Q-167，M-1到E-166，M-1到S-165，M-1到S-164，M-1到S-163，M-1到S-162，M-1到S-161VA-160，M-1到S-159，M-1到F-158，M-1到T-157，M-1到G-156，M-1到P-155，M-1到P-154，M-1到C-153，M-1到P-152，M-1到Q-151，M-1到C-150，M-1到Q-149，M-1到T-148，M-1到N-147，M-1到Q-146，M-1到S-145，M-1到P-144，M-1到T-143，M-1到G-142，M-1到P-141，M-1到A-140，M-1到I-139，M-1到V-138，M-1到G-137，M-1到A-136，M-1到G-135，M-1到P-134，M-1到P-133，M-1到C-132，M-1到S-131，M-1到A-130，M-1到H-129，M-1到E-128，M-1到L-127，M-1到C-126，M-1到F-125，M-1到G-124，M-1到A-123，M-1到H-122，M-1到A-121，M-1到F-120，M-1到F-119，M-1到G-118，M-1到T-117，M-1到R-116，M-1到C-115，M-1到R-114，M-1到C-113，M-1到A-112，M-1到R-111，M-1到N-110，M-1到H-109，M-1到T-108，M-1到A-107，M-1到H-106，M-1到C-105，M-1到A-104，M-1到R-103，M-1到A-102，M-1到E-101，M-1到E-100，M-1到E-99，M-1到R-98，M-1到E-97，M-1到G-96，M-1到C-95，M-1到L-94，M-1到V-93，M-1到N-92，M-1到C-91，M-1到Y-90，M-1到R-89，M-1到C-88，M-1到R-87，M-1到E-86，M-1到L-85，M-1到Y-84，M-1到N-83，M-1到W-82，M-1到F-81，M-1到Q-80，M-1到T-79，M-1到Y-78，M-1到H-77，M-1到R-76，M-1到P-75，M-1到P-74，M-1到C-73，M-1到P-72，M-1到G-71，M-1到C-70，M-1到T-69，M-1到T-68，M-1到P-67，M-1到S-66，M-1到D-65，M-1到R-64，M-1到R-63，M-1到C-62，M-1到P-61，M-1到R-60，M-1到Q-59，M-1到V-58，M-1到F-57，M-1到T-56，M-1到G-55，M-1到P-54，M-1到P-53，M-1到C-52，M-1到Q-51，M-1到A-50，M-1到C-49，M-1到V-48，M-1到L-47，M-1到R-46，M-1到E-45，M-1到G-44，M-1到T-43，M-1到E-42，M-1到A-41，M-1到D-40，M-1到R-39，M-1到W-38，M-1到P-37，M-1到Y-36，M-1到T-35，M-1到P-34，M-1到T-33，M-1到E-32，M-1到A-31，M-1到V-30，M-1到G-29，M-1到R-28，M-1到V-27，M-1到A-26，M-1到P-25，M-1到V-24，M-1到P-23，M-1到L-22，M-1到L-21，M-1到A-20，M-1到P-19，M-1到L-18，M-1到A-17，M-1到L-16，M-1到V-15，M-1到L-14，M-1到C-13，M-1到L-12，M-1到L-11，M-1到S-10，M-1到L-9，M-1到G-8，M-1到P-7，和M-1到G-6。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了编码包含或另外由选自下列各组氨基酸残基：SEQ ID NO：2的M-1到A-271，M-1到Q-254和/或M-1到F-221的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。
本发明也提供了具有一个或多个氨基酸被从TNFR多肽的氨基端和羧基端去除的多肽，也被一般描述为具有如图1(即，SEQ IDNO：2)中n1-m1残基，其中n1和m1是如上所述的整数。
在另外的实施方案中，本发明提供了包含或另外由图1(即，SEQID NO：2)中30-m3残基组成的氨基酸序列的多肽，其中m3是在36-299范围之间的整数，对应于图1(SEQ ID NO：2)中氨基酸残基的位置。例如，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，此多肽包含或由选自下列组的氨基酸残基组成的氨基酸序列所组成：图1(SEQ ID NO：2)中所示的TNFR序列的V-30到V-299，V-30到P-298，V-30到L-297，V-30到F-296，V-30到R-295，V-30到E-294，V-30到R-293，V-30到V-292，V-30到S-291，V-30到R-290，V-30到E-289，V-30到L-288，V-30到G-287，V-30到P-286，V-30到M-285，V-30到R-284，V-30到A-283，V-30到V-282，V-30到R-281，V-30到L-280，V-30到A-279，V-30到0-278，V-30到L-277，V-30到A-271，V-30到G-270，V-30到D-169，V-30到Q-268，V-30到A-267，V-30到G-266，V-30到L-265，V-30到L-264，V-30到E-263，V-30到T-262，V-30到L-261，V-30到R-260，V-30到R-259，V-30到R-258，V-30到L-257，V-30到K-256，V-30到L-255，V-30到Q-254，V-30到L-253，V-30到A-252，V-30到A-251，V-30到R-250，V-30到G-249，V-30到A-248，V-30到R-247，V-30到P-246，V-30到T-245，V-30到P-244，V-30到G-243，V-30到W-242，V-30到G-241，V-30到E-240，V-30到P-239，V-30到A-238，V-30到E-237，V-30到L-236，V-30到A-235，V-30到Q-234，V-30到L-233，V-30到L-232，V-30到R-231，V-30到Q-230，V-30到L-229，V-30到R-228，V-30到K-227，V-30到I-226，V-30到S-225，V-30到I-224，V-30到D-223，V-30到Q-222，V-30到F-221，V-30到A-220，V-30到V-219，V-30到F-218，V-30到D-217，V-30到I-216，V-30到V-215，V-30到A-214，V-30到R-213，V-30到E-212，V-30到C-211，V-30到E-210，V-30到E-209，V-30到A-208，V-30到G-207，V-30到P-206，V-30到V-205，V-30到R-204，V-30到T-203，V-30到S-202，V-30到L-201，V-30到P-200，V-30到F-199，V-30到G-198，V-30到T-197，V-30到C-196，V-30到S-195，V-30到T-194，V-30到C-193，V-30到L-192，V-30到T-191，V-30到D-190，V-30到H-189，V-30到S-188，V-30到S-187，V-30到S-186，V-30到G-185，V-30到P-184，V-30到V-183，V-30到N-182，V-30到L-181，V-30到A-180，V-30到L-179，V-30到G-178，V-30到L-177，V-30到A-176，V-30到T-175，V-30到C-174，V-30到N-173，V-30到R-172，V-30到H-171，V-30到P-170，V-30到Q-169，V-30到C-168，V-30到Q-167，V-30到E-166，V-30到S-165，V-30到S-164，V-30到S-163，V-30到S-162，V-30到S-161，V-30到A-160，V-30到S-159，V-30到F-158，V-30到T-157，V-30到G-156，V-30到P-155，V-30到P-154，V-30到C-153，V-30到P-152，V-30到Q-151，V-30到C-150，V-30到Q-149，V-30到T-148，V-30到N-147，V-30到Q-146，V-30到S-145，V-30到P-144，V-30到T-143，V-30到G-142，V-30到P-141，V-30到A-140，V-30到I-139，V-30到V-138，V-30到G-137，V-30到A-136，V-30到G-135，V-30到P-134，V-30到P-133，V-30到C-132，V-30到S-131，V-30到A-130，V-30到H-129，V-30到E-128，V-30到L-127，V-30到C-126，V-30到F-125，V-30到G-124，V-30到A-123，V-30到H-122，V-30到A-121，V-30到F-120，V-30到F-119，V-30到G-118，V-30到T-117，V-30到R-116，V-30到C-115，V-30到R-114，V-30到C-113，V-30到A-112，V-30到R-111，V-30到N-110，V-30到H-109，V-30到T-108，V-30到A-107，V-30到H-106，V-30到C-105，V-30到A-104，V-30到R-103，V-30到A-102，V-30到E-101，V-30到E-100，V-30到E-99，V-30到R-98，V-30到E-97，V-30到G-96，V-30到C-95，V-30到L-94，V-30到V-93，V-30到N-92，V-30到C-91，V-30到Y-90，V-30到R-89，V-30到C-88，V-30到R-87，V-30到E-86，V-30到L-85，V-30到Y-84，V-30到N-83，V-30到W-82，V-30到F-81，V-30到Q-80，V-30到T-79，V-30到Y-78，V-30到H-77，V-30到R-76，V-30到P-75，V-30到P-74，V-30到C-73，V-30到P-72，V-30到G-71，V-30到C-70，V-30到T-69，V-30到T-68，V-30到P-67，V-30到S-66，V-30到D-65，V-30到R-64，V-30到R-63，V-30到C-62，V-30到P-61，V-30到R-60，V-30到Q-59，V-30到V-58，V-30到F-57，V-30到T-56，V-30到G-55，V-30到P-54，V-30到P-53，V-30到C-52，V-30到Q-51，V-30到A-50，V-30到C-49，V-30到V-48，V-30到L-47，V-30到R-46，V-30到E-45，V-30到G-44，V-30到T-43，V-30到E-42，V-30到A-41，V-30到D-40，V-30到R-39，V-30到W-38，V-30到P-37，和V-30到Y-36。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。在一个特定的实施方案中，本发明提供了编码包含或另外由选自下列各组氨基酸残基：SEQ ID NO：2的V-30到A-271，V-30到Q-254和/或V-30到F-221的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。本发明也指向包含或由与上面所述的多核苷酸或多肽序列分别具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸或多肽序列组成的多核苷酸或多肽。本发明也包括分别与异源多核苷酸或多肽序列融合的多核苷酸或多肽序列。
至于TNFR-6β的片段，正如上面所述的，即使蛋白质的N末端去掉一个或多个氨基酸残基造成了对此蛋白质损失了一项或多项生物学功能的修饰，其它的功能活性(例如，生物学活性，形成多聚体的能力，与配体(Fas配体和AIM-II)结合的能力)仍然保留下来。例如，当少于主要部分的氨基酸残基被从完整、成熟形式蛋白的N末端去除时，此截短的TNFR突变蛋白质蛋白质诱导和/或结合识别完整、成熟形式蛋白的抗体的能力仍然保留下来。利用本文中所描述的常规方法和其它本领域众所周知的方法可以很容易地确定某个缺少完整蛋白N末端的多肽是否仍然保留这样的免疫学活性。一段带有许多N末端氨基酸缺失的TNFR突变蛋白质仍然保留一些生物学或免疫学活性不是不可能的。实际上，由少至6个TNFR氨基酸残基构成的肽即可引起免疫应答。
因此，本发明另外提供了包含或由如图2(即，SEQ ID NO：4)中所示的一个或多个氨基酸残基一直到第165位甘氨酸残基被从TNFR-6β多肽氨基末端去除的氨基酸序列的多肽，和编码这样的多肽的多核苷酸。尤其是，本发明提供了包含或另外由图2(即，SEQ IDNO：4)中n2-170残基组成的多肽，其中n2是在2-165范围之间的整数，对应于图2(SEQ ID NO：4)中氨基酸残基的位置。
更为特别的是，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，此多肽包含或由选自下列组的氨基酸残基组成的氨基酸序列所组成：图2(SEQID NO：4)中所示的TNFR-6β序列的R-2到P-170，A-3到P-170，L-4到P-170，E-5到P-170，G-6到P-170，P-7到P-170，G-8到P-17，L-9到P-170，S-10到P-170，L-11到P-170，L-12到P-170，C-13到P-170，L-14到P-170，V-15到P-170，L-16到P-170，A-17到P-170，L-18到P-170，P-19到P-170，A-20到P-170，L-21到P-170，L-22到P-170，P-23到P-170，V-24到P-170，P-25到P-170，A-26到P-170，V-27到P-170，R-28到P-170，G-29到P-170，V-30到P-170，A-31到P-170，E-32到P-170，T-33到P-170，P-34到P-170，T-35到P-170，Y-36到P-170，P-37到P-170，W-38到P-170，R-39到P-170，D-40到P-170，A-41到P-170，E-42到P-170，T-43到P-170，G-44到P-170，E-45到P-170，R-46到P-170，L-47到P-170，V-48到P-170，C-49到P-170，A-50到P-170，Q-51到P-170，C-52到P-170，P-53到P-170，P-54到P-170，G-55到P-170，T-56到P-170，F-57到P-170，V-58到P-170，Q-59到P-170，R-60到P-170，P-61到P-170，C-62到P-170，R-63到P-170，R-64到P-170，D-65到P-170，S-66到P-170，P-67到P-170，T-68到P-170，T-69到P-170，C-70到P-170，G-71到P-170，P-72到P-170，C-73到P-170，P-74到P-170，P-75到P-170，R-76到P-170，H-77到P-170，Y-78到P-170，T-79到P-170，Q-80到P-170，F-81到P-170，W-82到P-170，N-83到P-170，Y-84到P-170，L-85到P-170，E-86到P-170，R-87到P-170，C-88到P-170，R-89到P-170，Y-90到P-170，C-91到P-170，N-92到P-170，V-93到P-170，L-94到P-170，C-95到P-170，G-96到P-170，E-97到P-170，R-98到P-170，E-99到P-170，E-100到P-170，E-101到P-170，A-102到P-170，R-103到P-170，A-104到P-170，C-105到P-170，H-106到P-170，A-107到P-170，T-108到P-170，H-109到P-170，N-110到P-170，R-111到P-170，A-112到P-170，C-113到P-170，R-114到P-170，C-115到P-170，R-116到P-170，T-117到P-170，G-118到P-170，F-119到P-170，F-120到P-170，A-121到P-170，H-122到P-170，A-123到P-170，G-124到P-170，F-125到P-170，C-126到P-170，L-127到P-170，E-128到P-170，H-129到P-170，A-130到P-170，S-131到P-170，C-132到P-170，P-133到P-170，P-134到P-170，G-135到P-170，A-136到P-170，G-137到P-170，V-138到P-170，I-139到P-170，A-140到P-170，P-141到P-170，G-142到P-170，E-143到P-170，S-144到P-170，W-145到P-170，A-146到P-170，R-147到P-170，G-148到P-170，G-149到P-170，A-150到P-170，P-151到P-170，R-152到P-170，S-153到P-170，G-154到P-170，G-155到P-170，R-156到P-170，R-157到P-170，C-158到P-170，G-159到P-170，R-160到P-170，G-161到P-170，Q-162到P-170，V-163到P-170，A-164到P-170，和G-165到P-170。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。
也如同上面所描述的，即使蛋白质的C末端去掉一个或多个氨基酸残基造成了对此蛋白质损失了一项或多项生物学功能的修饰，其它的功能活性(例如，生物学活性，形成多聚体的能力，与配体(Fas配体和AIM-II)结合的能力)仍然保留下来。例如，当少于主要部分的氨基酸残基被从完整、成熟形式蛋白的C末端去除时，此截短的TNFR-6β突变蛋白质诱导和/或结合识别完整、成熟形式蛋白的抗体的能力仍然保留下来。利用本文中所描述的常规方法和其它本领域众所周知的方法可以很容易地确定某个缺少完整蛋白C末端的多肽是否仍然保留这样的免疫学活性。一段带有许多C末端氨基酸缺失的TNFR-6β突变蛋白质仍然保留一些生物学或免疫学活性不是不可能的。实际上，由少至6个TNFR-6β氨基酸残基构成的肽即可引起免疫应答。
因此，本发明另外提供了具有如图2(即，SEQ ID NO：4)中所示的一个或多个氨基酸残基一直到第6位甘氨酸残基被从TNFR-6β多肽羧基末端去除的氨基酸序列的多肽，和编码这样的多肽的多核苷酸。尤其是，本发明提供了包含或另外由图2(即，SEQ ID NO：4)中1-m2残基组成的多肽，其中m2是在6-169范围之间的整数，对应于图2(SEQ ID NO：4)中氨基酸残基的位置。
更为特别的是，本发明提供了编码多肽的多核苷酸，此多肽包含或由选自下列各组的氨基酸残基组成的氨基酸序列所组成：图2(SEQ ID NO：4)中所示的TNFR-6β序列的M-1到A-169，M-1到L-168，M-1到S-167，M-1到P-166，M-1到G-165，M-1到A-164，M-1到V-163，M-1到Q-162，M-1到G-161，M-1到R-160，M-1到G-159，M-1到C-158，M-1到R-157，M-1到R-156，M-1到G-155，M-1到G-154，M-1到S-153，M-1到R-152，M-1到P-151，M-1到A-150，M-1到G-149，M-1到G-148，M-1到R-147，M-1到A-146，M-1到W-145，M-1到S-144，M-1到E-143，M-1到G-142，M-1到P-141，M-1到A-140，M-1到I-139，M-1到V-138，M-1到G-137，M-1到A-136，M-1到G-135，M-1到P-134，M-1到P-133，M-1到C-132，M-1到S-131，M-1到A-130，M-1到H-129，M-1到E-128，M-1到L-127，M-1到C-126，M-1到F-125，M-1到G-124，M-1到A-123，M-1到H-122，M-1到A-121，M-1到F-120，M-1到F-119，M-1到G-118，M-1到T-117，M-1到R-116，M-1到C-115，M-1到R-114，M-1到C-113，M-1到A-112，M-1到R-111，M-1到N-110，M-1到H-109，M-1到T-108，M-1到A-107，M-1到H-106，M-1到C-105，M-1到A-104，M-1到R-103，M-1到A-102，M-1到E-101，M-1到E-100，M-1到E-99，M-1到R-98，M-1到E-97，M-1到G-96，M-1到C-95，M-1到L-94，M-1到V-93，M-1到N-92，M-1到C-91，M-1到Y-90，M-1到R-89，M-1到C-88，M-1到R-87，M-1到E-86，M-1到L-85，M-1到Y-84，M-1到N-83，M-1到W-82，M-1到F-81，M-1到Q-80，M-1到T-79，M-1到Y-78，M-1到H-77，M-1到R-76，M-1到P-75，M-1到P-74，M-1到C-73，M-1到P-72，M-1到G-71，M-1到C-70，M-1到T-69，M-1到T-68，M-1到P-67，M-1到S-66，M-1到D-65，M-1到R-64，M-1到R-63，M-1到C-62，M-1到P-61，M-1到R-60，M-1到Q-59，M-1到V-58，M-1到F-57，M-1到T-56，M-1到G-55，M-1到P-54，M-1到P-53，M-1到C-52，M-1到Q-51，M-1到A-50，M-1到C-49，M-1到V-48，M-1到L-47，M-1到R-46，M-1到E-45，M-1到G-44，M-1到T-43，M-1到E-42，M-1到A-41，M-1到D-40，M-1到R-39，M-1到W-38，M-1到P-37，M-1到Y-36，M-1到T-35，M-1到P-34，M-1到T-33，M-1到E-32，M-1到A-31，M-1到V-30，M-1到G-29，M-1到R-28，M-1到V-27，M-1到A-26，M-1到P-25，M-1到V-24，M-1到P-23，M-1到L-22，M-1到L-21，M-1到A-20，M-1到P-19，M-1到L-18，M-1到A-17，M-1到L-16，M-1到V-15，M-1到L-14，M-1到C-13，M-1到L-12，M-1到L-11，M-1到S-10，M-1到L-9，M-1到G-8，和M-1到P-7。由这些多核苷酸片段编码的多肽也在本发明的范围之内。
本发明也提供了具有一个或多个氨基酸被从TNFR多肽的氨基端和羧基端去除的多肽，也被一般描述为具有如图2(即，SEQ IDNO：4)中n2-m2残基，其中n2和m2是如上所述的整数。
本发明也涉及包含或由与本文所述的编码TNFR多肽的如文中m-y、n-z、n1-m1、30-m3和/或n2-m2的多核苷酸序列分别具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成的核酸分子。在优选的实施方案中，本发明指向包含或由与上面所述的编码如文中引用的N末端或C末端具有氨基酸缺失的多肽的多核苷酸序列分别具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的多核苷酸序列组成的核酸分子。本发明也包含融合至异源多核苷酸序列的上述多核苷酸序列。由这些核酸分子和/或多核苷酸序列所编码的多肽也在本发明的范围之内。
本发明也包括编码由ATCC保藏号97810或97809中所含有的cDNA克隆编码的完整TNFR氨基酸序列的一部分组成的多肽的核苷酸序列，其中这部分不包括分别由ATCC保藏号97810和97809中所含有的cDNA克隆编码的完整TNFR氨基酸序列氨基端第1位至第49位氨基酸残基，分别由ATCC保藏号97810和97809中所含有的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列羧基端第1位至第107或58位氨基酸残基，以及分别由ATCC保藏号97810或97809中所含有的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列上述羧基端或氨基端缺失的任一组合。由以上所有多核苷酸序列所编码的多肽也在本发明的范围之内。
除了上面所讨论的蛋白质的末端缺失形式之外，本领域普通技术人员也会认识到TNFR多肽的一些氨基酸序列可在不显著影响蛋白质结构或功能的情况下做一些改变。如果设想到序列中的这些不同之处，应该记住的是在蛋白质中存在决定活性的关键区。
因此，本发明另外提供了TNFR多肽的变异，此变异显示TNFR多肽的主要功能活性(例如，免疫原性活性，生物学活性)，或TNFR蛋白的一些功能区例如下面所讨论的蛋白质部分。根据本领域众所周知的普通规则所选择的包括缺失、插入、倒置、重复和类型替换在内的这样的突变体对活性的影响很小。例如，在Bowie，J.U.等，“解读蛋白质序列中的信息：对氨基酸替换的耐受”，科学247：1306-1310(1990)中提供了关于如何制造表型沉默的氨基酸替换的指导，其中作者指出有两种主要的研究所要改变的氨基酸序列的耐受性的方法。第一种方法依赖于进化过程，其中突变或被自然选择所接受或被排斥。第二种方法是使用基因工程技术向克隆的基因的特定位置引入氨基酸改变，然后选择、筛选和鉴定维持功能的序列。正如作者所说明的，这些研究已经揭示出蛋白质对氨基酸替换具有另人惊奇地耐受。作者进一步表明在蛋白质某些位置中那些氨基酸改变是可能允许的。例如，大多数深埋在内部的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的很少几个特性是保守的。在Bowie，J.U.等，supra中描述了其它这样的表型沉默替换，参考文献引入本文做参考。典型地被视做是保守性替换的是置换，用一种脂肪族氨基酸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸置换另外一种；内部交换丝氨酸和苏氨酸的羟基，交换天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基，天冬酰胺和谷氨酰胺之间酰胺残基的替换，赖氨酸和精氨酸之间碱性残基的交换以及苯丙氨酸和色氨酸之间芳香族残基的置换。因此，SEQ ID NO：2，4或6的或由保藏的cDNA编码的多肽的衍生物、类似物或片段可以是如下一种：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选一种保守的氨基酸残基)替换，并且这个替换的氨基酸残基可能是也可能不是由遗传密码编码的；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括一个可替换基团，或(iii)其中成熟的或可溶性的细胞外多肽与另外一种化合物例如可以增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)融合，或(iv)其中另外的氨基酸(例如，IgG Fc肽融合体和/或免疫球蛋白轻链恒定区肽)被融合至文中所述的TNFR多肽上。这样的片段、衍生物和类似物被视做经过文中的教导应在本领域熟练技术人员掌握的范围之内。
因此，本发明的TNFR多肽可能包含一个或多个来自自然突变或人为操作的氨基酸替换、缺失或添加。正如文中所述，改变优选是一种次要特性，例如并不显著影响蛋白质折叠或蛋白质活性的保守性氨基酸替换(见表III)。表III保守性氨基酸替换
芳香族 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸
疏水性 亮氨酸异亮氨酸缬氨酸
极性 谷氨酰胺天冬酰胺
碱性 精氨酸赖氨酸组氨酸
酸性 天冬氨酸谷氨酸
小分子 丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸甘氨酸
本发明TNFR蛋白中功能必需的氨基酸可以通过本领域所熟知的方法鉴定出来，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，科学244：1081-1085(1989))。后一方法向分子中的每一个残基上引入丙氨酸突变。然后测定产物突变体分子的功能活性例如配体/受体(例如Fas配体和/或AIM-II)结合或体外或体内增殖活性。
我们所特别感兴趣的是用其它带电荷的或中性的氨基酸替换带电荷的氨基酸，所产生的蛋白质具有我们所希望的高度改进的特性例如减少凝集。凝集不仅降低活性而且在制备药物制剂中会产生问题，因为凝集可以导致免疫原性(Pinckard等，临床实验免疫学2：331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36：838-845(1987)；Cleland等，治疗性药物载体系统评论10：307-377(1993))。
氨基酸替换也会改变配体与细胞表面受体结合的选择性。例如，Ostade等，自然361：266-268(1993)描述了某些导致TNF-α仅与两种已知的TNF受体中的一种选择性结合的突变。对配体-受体结合很关键的位点可以通过结构分析例如晶体化、核磁共振或图象亲和标记等技术确定(Smith等，分子生物学期刊224：899-904(1992)和de Vos等，科学255：306-312(1992))。
由于TNFR-6α和TNFR-6β是TNF受体相关的蛋白质家族的成员，去调控而不是完全消除TNFR生物学活性的优选的突变是在TNF保守的胞外区的氨基酸编码序列，更优选在此功能区内TNF受体家族各成员间不保守的残基上进行的。也作为本发明一部分的是含有编码上述TNFR突变体的核酸序列的分离的多核苷酸。
本发明的多肽优选以分离的形式提供，并且优选是基本纯化的。重组生产的TNFR多肽可以通过在Smith和Johnson，基因67：31-40(1988)中所描述的一步法而进行基本纯化。本发明的天然或重组来源的多肽也可以通过蛋白质纯化领域众所周知的方法利用本发明的TNFR-6α和TNFR-6β的抗体进行纯化。
本发明另外提供了包含有选自以下一组的氨基酸序列的分离的TNFR多肽：(a)具有SEQ ID NOS：2和4中所示的，或如在ATCC保藏号为97810或97809中所包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列的全长TNFR多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO：2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-170位氨基酸序列的，或如在ATCC保藏号为97810或97809中所包含的cDNA克隆所编码的成熟TNFR多肽的氨基酸序列；(c)具有SEQ ID NO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-166位氨基酸序列的，或如在ATCC保藏号为97810或97809中所包含的cDNA克隆所编码的TNFR多肽的可溶性胞外区的氨基酸序列。
本发明另外的多肽包括与上述氨基酸序列具有至少90％相似性，更优选至少80％，85％，90％，92％或95％相似性，甚至更优选96％，97％，98％或99％相似性的多肽。本发明的多肽也包括与保藏的cDNA编码的多肽(ATCC保藏号为97810或97809)，与SEQ IDNOS：2和4中的多肽具有至少90％相似性，更优选至少80％，85％，90％，92％或95％相似性，甚至更优选96％，97％，98％或99％相似性的多肽，以及这样的多肽的具有至少30个氨基酸更优选具有至少50个氨基酸的部分。
两种多肽的“％相似性”意指使用Bestfit程序(位于威斯康星州麦迪逊科学大道575号的大学研究园遗传计算机研究组的用于UNIX系统的威斯康星序列分析包第8版)对两种多肽的氨基酸序列进行比较所得出的相似性数值，并且程序的默认设置用以测定相似性。Bestfit程序利用Smith和Waterman应用数学进展2：482-489(1981)中的局部同源性原理以寻找两种序列之间最佳的相似性片段。
与TNFR多肽的参考氨基酸序列具有，例如，至少95％“相同性”的多肽意指除了TNFR多肽参考氨基酸的每100个氨基酸中可以最多包括5个氨基酸改变之外，多肽的氨基酸序列与参考序列是相同的。换句话说，要获得与参考氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，92％或95％相同性的氨基酸序列的多肽，参考氨基酸序列中最多5％的氨基酸残基可被缺失或被其它氨基酸残基所替换，或者最多相当于总氨基酸残基5％的氨基酸可被插入到参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考氨基酸序列的氨基端或羧基端，或两端之间的任何位置，单个散布在参考序列的残基中或在参考序列的一个或多个连续的组中。
在实际操作中，任何特定的多肽分子是否与例如SEQ ID NOS：2和4中所示的氨基酸序列，或由ATCC保藏号为97810或97809的保藏的cDNA克隆中所编码的氨基酸序列，或其片段(例如，对应于TNFR N末端或C末端缺失的任何一种多肽的序列，正如文中所述(例如，具有SEQ ID NO：2中第30位至第300位氨基酸序列的多肽))具有至少80％，85％，90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性可以很方便地用已知的计算机程序例如Bestfit程序(位于威斯康星州麦迪逊科学大道575号的大学研究园遗传计算机研究组的用于UNIX系统的威斯康星序列分析包第8版)来确定。当利用Bestfit程序或其它序列比较程序去确定是否一段特定序列与本发明的参考序列具有例如95％的相同性时，参数是这样设置的，相同性百分比是在全长参考氨基酸序列的基础上计算出的并且总氨基酸残基数目不超过5％的不相同性是允许的。
在一个特定的实施方案中，参考序列(本发明的序列)和待比较序列之间的相同性，也称做全局序列比较，是应用在Brutlag等(计算机应用生物科学6：237-245(1990))演算程序基础上的FASTDB计算机程序确定的。在FASTDB氨基酸序列比较中优选的参数设置如下：Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，Mismatch Penalty＝1，JoiningPenalty＝20，Randomization Group Length＝0，Cutoff Score＝1，WindowSize＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，WindowSize＝500或稍短些的待比较的氨基酸序列的长度。根据这个实施方案，如果待比较的氨基酸序列由于N端或C端缺失而不是内部缺失而短于参考序列时，在计算结果时应该考虑到FASTDB程序在计算相同性百分比时并没有把待比较的氨基酸序列N端或C端缺失的情况包括在内，因此对结果做了一个人工校正。对于相对于参考序列N端或C端缺失的待比较的氨基酸序列来说，相同性百分比是通过计算参考序列中是待比较的氨基酸序列N端或C端的，它是与相应的待测残基不配对的，并且不相同的残基数目作为参考序列总残基数的百分比而校正的。确定一个残基是否相配是通过FASTDB序列比较的结果而决定的。然后这个百分比减去使用上述特定参数的FASTDB程序计算出的相同性百分比，最后得到了一个最终的百分比数值。就本实施方案而言，此校正的数值正是所使用的数值。只有在待比较的序列N端或C端碱基之外的并且与参考序列不相配的残基才被计算以调整相同性百分比数值。即，只有待测序列N或C最远端的残基之外的参考残基位置。例如，一段90个氨基酸残基的待比较的核苷酸序列与一段100残基的参考序列进行序列比较以确定相同性百分比。待比较的氨基酸序列的N端发生缺失，因此，FASTDB序列比较并不显示N端的头10个残基的比较。这10个未配对的残基代表序列的10％(N或C端不配对残基/参考序列总残基数目)，所以应从由FASTDB程序计算出的相同性百分比中减去10％。如果剩下的90个残基都配对的话那么最终的相同性百分比应该是90％。在另外一个实施例中，一段90个残基的待比较的氨基酸序列与一段100残基的参考序列进行序列比较。这次是内部缺失所以在待比较的氨基酸序列的N或C端没有不与参考序列不配对的残基。在这种情况下，由FASTDB程序计算出的相同性百分比未进行人工校正。再说一遍，只有待比较的氨基酸序列的N或C端的与参考序列不配对的残基才被人工校正。就本实施方案而言未做其它人工校正。
本发明的多肽具有包括但不局限于在本领域熟练技术人员众所周知的方法中如SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱中用做分子量标准的用途。正如将要在下文中详细描述的，本发明的多肽也可被用于增强单克隆抗体或多克隆抗体滴度，这些抗体在检测如下所述的TNFR蛋白表达的分析中或用做能够增强或抑制TNFR蛋白功能的激动剂或拮抗剂中非常有用。而且，这些多肽可用于酵母双杂交系统以“捕获”也可作为本发明侯选激动剂或拮抗剂的TNFR蛋白结合蛋白。在Fields和Song，自然340：245-246(1989)中描述了酵母双杂交系统。转基因
本发明的蛋白也可在转基因动物中表达。任一物种的动物包括但不局限于小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、豚鼠、猪、微型猪、山羊、绵羊、牛和非人灵长类如狒狒、猴子和猩猩可被用于生产转基因动物。在一个特定的实施方案中，本文中所描述的技术以及本领域所熟知的其它技术被用于在人体中表达本发明的多肽，作为一个治疗方法的一部分。
本领域中任何一种已知的技术都可被用于将转基因(即，本发明的多核苷酸)引入动物以产生转基因动物的建立者品系。这样的技术包括但不局限于前核微注射(Paterson等，应用微生物学和生物工艺学40：691-698(1994)；Carver等，生物工艺学(纽约)11：1263-1270(1993)；Wright等，生物工艺学(纽约)9：830-834(1991)；和Hoppe等，美国专利4873191(1989))；逆转录病毒介导基因转移进入生殖系(Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-6152(1985))，胚细胞或胚胎；基因定向至胚胎干细胞(Thompson等，细胞56：313-321(1989))；细胞或胚胎电穿孔(Lo，分子细胞生物学3：1803-1814(1983))：使用基因枪导入本发明的多核苷酸(见，例如Ulmer等，科学259：1745(1993))；将核酸构建物导入胚胎全能干细胞，然后将干细胞转移回胚细胞；和精液介导的基因转移(Lavitrano等，细胞57：717-723(1989))等。关于这些技术的综述见Gordon，“转基因动物”，Intl.Rev.Cytol.115：171-229(1989)，全文引入本文做参考。也见美国专利5464764(Capecchi等，阳性-阴性选择方法和载体)；美国专利5631153(Capecchi等，含有预先决定的基因组修饰和阳性-阴性选择方法以及制备类似物的载体的人体)；美国专利4736866(Leder等，非人转基因动物)；和美国专利4873191(Wagner等，zygotes的基因转化)；以上每一篇文献全文引入本文做参考。而且，在此段中引用的每一篇文献的内容也引入本文做参考。
本领域任何一项已知的技术都可被用于生产含有本发明多核苷酸的转基因克隆，例如，核转移入诱导至静止期的培养的胚胎或成人细胞中的去核的卵母细胞(Campell等，自然380：64-66(1996)；Wilmut等，自然385：810-813(1997))，以上每一篇文献全文引入本文做参考。
本发明提供了在所有细胞中携带转基因的转基因动物，以及在部分而不是全部细胞中携带转基因的动物，即马赛克动物或嵌合动物。转基因既可以以单个转基因的形式整合又可以以多拷贝例如链状聚合物的形式整合，例如头-头串联或头-尾串联。转基因可以被选择性引入并通过下列方法例如Lasko等的方法(Lasko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236(1992))在特定类型的细胞中被激活。这样的细胞类型特异的激活所需要的调控序列将依赖于所感兴趣的特定细胞类型，并且本领域熟练技术人员很明白这些。当我们希望多核苷酸转基因整合进入内源基因的染色体位点时，优选使用基因打靶技术。简言之，当利用这种技术时，设计含有与内源基因同源的一些多核苷酸的载体，然后将其通过与染色体序列同源重组而整合进入内源性基因的核苷酸序列并破坏其功能。转基因也可被选择性导入一种特定细胞类型中，然后通过下列，例如Gu等(科学265：103-106(1994))的方法使仅在那种细胞类型中的内源性基因失活。这样的细胞类型特异的失活所需要的调控序列将依赖于所感兴趣的特定细胞类型，并且本领域熟练技术人员很明白这些。在本段中引用的每一篇文献的内容也全文引入本文做参考。
一旦转基因动物产生，就可以使用标准技术分析重组基因的表达。首先的筛查可通过Southern印迹分析或PCR技术分析动物组织以证实转基因已经整合进去来完成。转基因在转基因动物组织中的表达的mRNA水平可以利用包括但不局限于对从动物组织中获得的样品进行Northern印迹分析、原位杂交分析以及逆转录PCR(rt-PCR)分析等方法来完成。转基因基因表达组织的样品也可以使用转基因产物特异性的抗体通过免疫细胞化学或免疫组织化学的方法评价。
一旦建立者品系动物产生，它们即可被繁殖、近交、远交或种间杂交以产生特定动物品系克隆。这些繁殖策略的实施例包括但不局限于：将带有多于一个整合位点的基线动物进行远交以建立各个不同的系；在各个不同的系之间近交以产生由于每个转基因过度表达而导致的转基因表达水平更高的复合转基因；为了提高表达并且消除对动物进行DNA分析筛查的必要，将杂合子转基因动物进行种间杂交以产生给定整合位点的纯合子动物；将各个不同的纯合子品系间杂交以产生复合杂合子或纯合子品系；繁殖将转基因置于适于目的实验模型的远距离背景下。
本发明的转基因和“基因敲除”动物具有包括但不局限于用于阐释TNFR多肽生物学功能的动物模型系统中，研究与TNFR异常表达相关的条件和/或紊乱，和筛选在减缓这些条件和/或紊乱中有效的化合物中的应用。
在本发明另外的实施方案中，基因重组表达本发明蛋白质的细胞，或基因重组不表达本发明蛋白质(例如基因敲除)的细胞被体内施与病人。这样的细胞可从病人(即，动物包括人)或一个MHC相容的供体中得到，并且包括但不局限于成纤维细胞、骨髓细胞、血细胞(例如，淋巴细胞)、脂肪细胞、肌肉细胞、内皮细胞等。在体外使用重组DNA技术将本发明多肽的编码序列基因工程导入细胞，或者破坏与本发明多肽相关的编码序列和/或内源性调控序列，例如通过转导(使用病毒载体，并且优选将转基因整合入细胞基因组的载体)或转化程序，包括但不局限于使用质粒、粘粒、YACs、裸DNA、电穿孔、脂质体等。本发明多肽的编码序列可被置于强组成型或诱导型启动子或启动子/增强子控制之下以表达和优选分泌本发明的多肽。表达和优选分泌本发明多肽的工程细胞可被全身导入病人体内，例如循环中或腹膜内。另外，细胞可并入基质中并且移植入体内，例如，基因工程成纤维细胞可作为皮肤移植的一部分而移植；基因工程的内皮细胞可作为淋巴或血管移植的一部分而移植。(见，例如Anderson等，美国专利5399349；和Mulligan&Wilson，美国专利5460959，以上每一篇文献全文引入本文做参考。)
当待施与的细胞是非自身细胞或MHC不相容的细胞时，它们可使用众所周知的阻止宿主针对所导入细胞的发生免疫应答的技术而被施与。例如，细胞可以胶囊的形式被施与，此胶囊在允许与接近的细胞外环境交换成分的同时，并不允许所导入的细胞被宿主免疫系统所识别。抗体
本发明另外涉及可免疫特异性结合本发明多肽优选表位的抗体和T细胞抗原受体(TCR)(正如通过本领域众所周知的分析特异性抗原抗体结合的免疫分析方法所测定的)。本发明的抗体包括但不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(anti-ID)抗体(包括，例如抗本发明抗体的抗独特型抗体)和以上任何一种表位结合片段。术语“抗体”，正如文中所用的，是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有可与抗原免疫特异性结合的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何一种型的(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgAl和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。
最优选的是抗体是本发明的人抗原结合抗体片段，并且包括但不局限于Fab，Fab’和F(ab’)2，Fd，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(scFv)和包含VL或VH功能区的片段。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可能仅含有可变区或与下列全部或部分组合：铰链区，CH1、CH2和CH3功能区。本发明也包括含有可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3功能区任意组合的抗原结合片段。本发明的抗体可能是动物来源的包括鸟类和哺乳动物。优选的是，本发明的抗体是人、鼠、猴子、船兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡来源的。正如文中所用的，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白分子氨基酸序列的抗体和包括从人免疫球蛋白库中分离出的抗体和包括从并不表达内源性免疫球蛋白的一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物的免疫球蛋白库中分离出的抗体，如下文中所描述的，和Kucherlapati等的美国专利5939598中的实施例。
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或更高的多重特异性的。多重特异性抗体可以是对本发明多肽的不同表位特异的或可以是对本发明多肽以及异源表位例如异源多肽或固相支持物质特异性的。见，例如PCT出版物WO 93/17715；WO92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等，免疫学期刊147：60-69(1991)；美国专利4474893，4714681，4925648，5573920，5601819；Kostelny等，免疫学期刊148：1547-1553(1992)。
本发明抗体也可以用它们识别或特异性结合的本发明的表位或多肽部分的术语来特定化或描述。表位或多肽部分可为如文中所述而特定化，例如通过N端和C端位置，通过连续氨基酸残基的大小或表中和图中所列出的数据。可与本发明任何表位或多肽特异性结合的抗体也可被排除在外。因此，本发明包括特异性结合本发明多肽的抗体，和排除相似的抗体。
本发明抗体也可以用它们的交叉反应性的术语来特定化或描述。不与本发明多肽的任何其它类似物、ortholog或同系物结合的抗体被包括在内。和与本发明的多肽具有至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，和至少50％相同性(如同使用本领域已知的方法和文中所述的方法所计算的)的多肽结合的抗体也在本发明的范围之内。不和与本发明的多肽具有至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，和至少50％相同性(如同使用本领域已知的方法和文中所述的方法所计算的)的多肽结合的抗体也在本发明的范围之内。能够在严格杂交条件下(如文中所述)与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽结合的抗体也在本发明的包括之内。本发明抗体也可以用它们与本发明多肽的结合亲和性的术语来特定化或描述。优选的结合亲和性的解离常数或Kd小于5×10-2M，10-2M，5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M，10-5M，5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M 。
本发明也提供了竞争性抑制抗体与本发明表位结合的抗体，正如通过本领域任何一种已知的测定竞争性结合的方法例如文中所述的免疫分析方法所测定的。在优选的实施方案中，抗体竞争性抑制与表位的至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，和至少50％的结合。
本发明的抗体也可作为本发明多肽的激动剂或拮抗剂起作用。例如，本发明包括部分或完全破坏受体/配体与本发明多肽相互作用的抗体。受体特异性抗体和配体特异性抗体在本发明中起重要作用。在本发明中并不阻止配体结合但是阻止受体活化的受体特异性抗体具有重要作用。受体激活(即，信号传导)可以通过文中所述的技术或本领域已知的其它技术测定。例如，受体激活可以通过免疫沉淀后蛋白印迹(例如，如上所述)的方法检测受体或底物的磷酸化(例如，酪氨酸或丝氨酸/苏氨酰胺)而测定。在特定的实施方案中，提供了抑制在不存在抗体时的配体或受体至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，和至少50％活性的抗体。
本发明还包括既阻止配体结合又阻止受体激活的受体特异性抗体以及识别受体-配体复合物，并且优选不特异性识别未结合的受体或未结合的配体的抗体。而且，结合配体并且阻止配体与受体结合的中和抗体，以及结合配体并籍此阻止受体激活但并不阻止配体与受体结合的抗体也在本发明的包括之内。另外被包括在本发明之内的是激活受体的抗体。这些抗体可作为受体激动剂起作用，即活化配体介导的受体激活的生物学活性的全部或一部分。这些抗体可被特化为包含文中所述的本发明多肽的生物学活性在内的生物学活性的激动剂、拮抗剂或反向激动剂。可以利用本领域所熟知的技术方法制备上述抗体激动剂。见，例如PCT出版号WO 96/40281；美国专利5811097；Deng等，血液92(6)：1981-1988(1998)；Chen等，癌症研究58(16)：3668-3678(1998)；Harrop等，免疫学期刊161(4)：1786-1794(1998)；Zhu等，癌症研究58(15)：3209-3214(1998)；Yoon等，免疫学期刊160(7)：3170-3179(1998)；Prat等，细胞科学期刊111(Pt2)：237-247(1998)；Pitard等，免疫学方法期刊205(2)：177-190(1997)；Liautard等，细胞因子9(4)：233-241(1997)；Carlson等，生命的化学期刊272(17)：11295-11301(1997)；Taryman等，神经原14(4)：755-762(1995)；Muller等，结构6(9)：1153-1167(1998)；Bartunek等，细胞因子8(1)：14-20(1996)(以上文献全文引入本文做参考)。
本发明的抗体可被用于，但不局限于，例如纯化、检测和定向本发明的多肽，包括体外和体内的诊断和治疗方法。例如，抗体可用于免疫分析中以定性或定量测定生物学样品中本发明的多肽的水平，例如参见Harlow等，抗体实验手册(冷泉港实验室出版社，2版，1988)(引入本文作参考)。
如下述所详细讨论的，本发明的抗体可单独使用或与其它组合物联合使用。这些抗体还可进一步重组融合至异源多肽的N末端或C末端，或化学偶联(包括共价和非共价结合)至多肽或其它组合物。例如，本发明的抗体可被重组融合至或偶联至在检测系统中用做标记的分子和效应分子如异源多肽、药物或毒素上。见，例如PCT出版号WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利5314995；和EP396387。
本发明的抗体包括修饰的衍生物，即通过将任何类型的分子共价结合至抗体以致于此共价结合并不阻止抗体产生抗独特型应答。例如，但是并不是通过限制的方式，抗体衍生物包括已经被修饰的抗体，例如糖基化，乙酰化，pegylation，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护或阻断基团衍生化，水解裂解，与一种细胞配体或其它蛋白分子连接等。任何一种化学修饰都可以通过众所周知的技术实施，包括但不局限于特异性化学裂解，酰化，甲酰化，在衣霉素存在的情况下代谢合成等等。此外，此衍生物可能包含一个或多个非典型的氨基酸。
本发明抗体可以通过本领域已知的任何合适的方法生产。目的抗原的多克隆抗体可通过本领域众所周知的各种不同的方法生产。例如，本发明的多肽可被施与至各种不同的动物体内，包括但不局限于兔子、小鼠、大鼠等以诱导含有抗原特异性的多克隆抗体的血清产生。根据宿主种类，各种不同的佐剂可被用于增强免疫学应答，并且这些佐剂包括但不局限于弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔嘁血蓝蛋白、二硝基苯酚(dinitriphenol)和可能有用的人佐剂例如BCG(卡介苗结核杆菌)和小棒状杆菌。这些佐剂在本领域中也是众所周知的。
单克隆抗体也可以使用本领域中已知的各种不同的技术制备，包括杂交瘤、重组、噬菌体展示技术或其组合。例如，可以使用包括本领域已知的和传授的那些杂交瘤技术生产单克隆抗体，例如，在Harlow等，抗体：实验室手册(冷泉港实验室出版，第二版，1988)；Hammerling等，在单克隆抗体和T细胞杂交瘤563-681(Elsevier，纽约，1981)(上述文献全文引入本文做参考)。术语“单克隆抗体”正如文中所用的，不仅仅局限于通过杂交瘤技术生产出来的抗体。术语“单克隆抗体”意指产生自一个单一克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆的抗体，而不是生产此抗体的方法。
用于生产和筛选特异性抗体的杂交瘤技术是本领域众所周知的常规方法并且在实施例11中详细讨论了此方法。简言之，可用本发明的多肽或表达这种多肽的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到抗原特异性抗体，就采集小鼠的脾脏然后分离脾细胞。然后使用众所周知的技术将脾细胞与任何合适的瘤细胞融合，例如来自于可从ATCC得到的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释的方法选择和克隆杂交瘤。然后通过本领域已知的方法分析杂交瘤克隆的能够与本发明的多肽结合的抗体分泌细胞。通常含有高水平抗体的腹水可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠产生。
因此，本发明提供了生产单克隆抗体的方法以及由此方法所产生的抗体，此方法包含培养分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，其中杂交瘤优选是通过将从用本发明抗原免疫的小鼠体内分离的脾细胞与瘤细胞融合，然后筛选融合的产物杂交瘤以选择能够分泌与本发明的多肽结合的抗体的杂交瘤克隆而生成的。
可以通过已知的技术产生识别特异性表位的抗体片段。例如，本发明的Fab和F(ab’)2片段可以通过水解裂解免疫球蛋白分子而产生，使用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)和胰蛋白酶(产生F(ab’)2片段)。F(ab’)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1功能区。
例如，本发明的抗体也可通过本领域已知的各种噬菌体展示技术而生产。在噬菌体展示方法中，功能性抗体区显示在携带编码此区多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面。在一个特别的实施方案中，这样的噬菌体可被用于显示总成分库或组合的抗体文库(例如，人或鼠)所表达的抗原结合区。可以利用抗原选择和鉴定表达能够结合目的抗原的抗原结合区的噬菌体，例如，使用标记的抗原或结合或捕获至固相表面或珠上的抗原。用于这些方法中的噬菌体是典型的丝状噬菌体包括fd和M13。带有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv的噬菌体表达的结合区重组融合至噬菌体基因III或VIII蛋白上。噬菌体展示方法的实施例可被用于制备本发明的抗体包括在Brinkman等，免疫学方法期刊182：41-50(1995)；Ames等，免疫学方法期刊184：177-186(1995)；Kettleborough等，欧洲免疫学期刊24：952-958(1994)；Persic等，基因187：9-18(1997)；Burton等，免疫学进展57：191-280(1994)；PCT出版号PCT/GB91/01134；PCT出版物WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美国专利5698426；5223409；5403484；5580717；5427908；5750753；5821047；5571698；5427908；5516637；5780225；5658727；5733743和5969108中所透露的抗体，以上每一篇文献全文引入本文做参考。
如在上面的参考文献中所述的，噬菌体选择后，噬菌体中的抗体编码区可被分离出来并且用于生产整个的抗体包括人抗体，或其它任何我们所希望的抗原结合片段，并且在任何我们所希望的宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌等宿主中表达，例如，正如下面详细描述的。例如，用于重组生产Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术也可以使用本领域所已知的例如在PCT出版号WO 92/22324；Mullinax等，生物技术12(6)：864-869(1992)；和Sawai等，AJRI 34：26-34(1995)；和Better等，科学240：1041-1043(1988)中所批露的方法(所述参考文献引入本文做参考)。
可被用于生产单链Fvs和抗体的技术的例子包括在美国专利4946778和5258498；Huston等，酶学方法203：46-88(1991)；Shu等，PNAS 90：7995-7999(1993)；和Skerra等，科学240：1038-1040(1988)中所描述的技术。对于一些应用来说，包括在人体内应用抗体和体外检测分析中应用，优选使用嵌合的、人源化的或人抗体。嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物物种的分子，例如具有来源自鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。用于生产嵌合抗体的方法是本领域中已知的。见，例如，Morrison等，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术4：214(1986)；Gillies等，免疫学方法期刊125：191-202(1989)；美国专利5807715；4816567和4816397，以上文献全文引入本文做参考。人源化抗体是来源自非人物种的能够与我们所希望的抗原结合的抗体分子，它具有一个或多个来源自非人物种的补体决定簇区(CDRs)和来源自人免疫球蛋白分子的框架结构区。人框架结构区中的框架残基经常与CDR供体抗体的对应残基替换以改变，优选改进抗原结合。这些框架结构的替换可以通过本领域众所周知的方法鉴定，例如，通过模拟CDR和框架结构的相互作用鉴定对抗原结合很重要的框架结构残基，和通过序列比较鉴定特定位点的非寻常的框架残基。(见，例如Queen等，美国专利5585089；Riechmann等，自然332：323(1988)，在此全文引入本文做参考)。抗体可以使用本领域已知的各种不同的技术进行人源化，包括例如CDR-接枝(EP239400；PCT出版号WO91/09967；美国专利5225539；5530101和5585089)，veneering和resurfacing(EP592106；EP519596；Padlan等，分子免疫学28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等，蛋白质工程7(6)：805-814(1994)；Roguska等，PNAS 91：969-973(1994))，和链重排(美国专利5565332)。
完全的人抗体是特别希望被用于患者的治疗的。人抗体可以使用本领域已知的各种不同的方法来制备包括上面所述的使用来源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。也见，例如美国专利4444887和4716111；和PCT出版号WO 98/46645，WO98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735，和WO 91/10741；以上每一篇文献全文引入本文做参考。
人抗体也可利用不能表达内源性免疫球蛋白但是能够表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合体可被随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。此外，除了人重链和轻链基因以外，人的可变区、恒定区以及多变区也可被引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因在通过同源重组引入人免疫球蛋白位点的同时或单独处理使之变为无功能活性。特别是，JH区的纯合子缺失会阻止内源性抗体的产生。修饰的胚胎干细胞被扩增并且被微注射入胚细胞以生成嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠产生能够表达人抗体的纯合子后代。转基因小鼠被用正常方式免疫接种所选择的抗原，例如本发明多肽的全部或部分。针对于此抗原的单克隆抗体可利用传统的杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因B细胞分化过程中重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，生产治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体是可能的。关于生产人抗体的这种技术的综述，见Lonberg和Huszar(1995，Intl.Rev.Immunol.13：65-93)。关于生产人抗体和人单克隆抗体的这种技术的详细讨论以及用于生产这些抗体的方法程序，见例如PCT出版物WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利5413923；5625126；5633425；5568825；5661016；5545806；5814318；和5939598，全文引入本文做参考。此外，一些公司例如Abgenix公司(Freemont，加州)和Genpharm(San Jose，加州)主要使用与上面所述的方法相似的技术致力于提供抗所选择的抗原的人抗体。
识别所选择的表位的完全的人抗体可以利用称为“指导的选择”的技术而产生。在这种方法中非人单克隆抗体例如小鼠抗体被用于指导能够识别同一个表位的完全人抗体的选择(Jespers等，生物技术12：899-903(1988))。
而且，使用本领域熟练技术人员众所周知的技术，针对本发明的多肽的抗体可被用于生产能够“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体(见，例如Greenspan&Bona，FASEB J 7(5)：437-444(1989)；和Nissinoff，免疫学期刊147(8)：2429-2438(1991))。例如，能够结合多肽和竞争性抑制多肽多聚体化和/或本发明多肽与配体结合的抗体可被用于生产“模拟”了多肽多聚体化和/或结合区并且因此结合并中和了多肽和/或其配体的抗独特型抗体。这样的中和抗独特型抗体或这样的抗独特型抗体的Fab片段可被用于治疗方案中以中和多肽配体。例如，这样的抗独特型抗体可被用于结合本发明的多肽和/或被用于结合其配体/受体，并籍此阻断TNFR介导的对凋亡的抑制。
编码抗体的多核苷酸
本发明另外提供了含有编码本发明抗体或其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也包括能够在严格杂交条件下或如在supra中所阐释的较低的严格杂交条件下与编码抗体，优选能够与本发明多肽特异性结合的抗体，优选与具有SEQ ID NOS：2和4中氨基酸序列的多肽结合的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。
可以通过本领域已知的方法获得此多核苷酸，并且测定多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果此抗体的核苷酸序列是已知的，编码此抗体的多核苷酸可以通过化学合成寡核苷酸来合成(例如，如在Kutmeier等，生物技术17：242(1994)中所述的)，此方法，简言之涉及合成重叠的含有抗体编码序列部分的寡核苷酸，退火和连接这些寡核苷酸然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
另外，编码抗体的多核苷酸可从合适原料的核酸分子中产生。如果一个含有编码特定抗体的核酸分子的克隆不存在，但是已经知道此抗体分子的序列，就可以从合适的原料(例如，抗体cDNA文库，或产生自任何表达此抗体的组织或细胞的cDNA文库，或分离自任何表达此抗体的组织或细胞的核酸，优选poly(A)+RNA，例如所选择的表达本发明抗体的杂交瘤细胞)通过使用与序列的3’端和5’端杂交的合成引物PCR扩增得到或通过使用对特定基因序列特异的寡核苷酸探针例如从编码此抗体的cDNA文库中鉴定出cDNA克隆而得到编码免疫球蛋白的核酸分子。然后利用本领域众所周知的任何方法将通过PCR扩增出的核酸克隆入可复制的克隆载体中。
一旦测定了抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，此抗体的核苷酸序列就可利用本领域众所周知的操作核苷酸序列的方法操作，例如重组DNA技术，定点突变，PCR等。(见，例如在Sambrook等，1990，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约和Ausubel等编，1998，现代分子生物学实验指南，约翰威利父子出版社，纽约，全文引入本文做参考)，以产生具有不同氨基酸序列例如制造氨基酸替换、缺失和/或添加的抗体。
在一个特定的实施方案中，可以通过本领域众所周知的方法检测重链和/或轻链可变区的氨基酸序列以鉴定互补决定簇区(CDRs)的序列，例如，通过比较其它重链和轻链可变区已知的氨基酸序列以确定序列高变区。使用常规的重组DNA技术，一个或多个CDRs可被插入进框架区，例如插入到人框架区以对非人抗体人源化，如supra所述。框架区可是天然发生的或连续的框架区，优选人框架区(见，例如Chothia等，分子生物学期刊278：457-479(1998)中的一系列人的框架区)。优选的是，通过组合框架区和CDRs区所产生的多核苷酸编码一种能够特异性结合本发明多肽的抗体。如上所述，优选在框架区内制造一个或多个氨基酸替换，并且优选这些氨基酸替换改进了抗体与其抗原的结合。此外，这些方法可被用于在替换或删除可变区内参与到链内二硫键形成的一个或多个半胱氨段残基，以产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。对多核苷酸的其它改变也在本发明的包括之内并且也在本领域的技术范围之内。
此外，通过剪接来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自具有合适的生物学活性的人抗体分子的基因发展而来的用于生产“嵌合抗体”(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci USA81：851-855；Neuberger等，1984，自然312：604-608；Takeda等，1985，自然314：452-454)的技术也可以被使用。正如supra所述，嵌合抗体是一种分子不同部分来自不同动物物种的抗体，例如那些具有来自于小鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合分子，例如人源化抗体。
另外，所述的用于生产单链抗体的技术(美国专利4694778；Bird，1988，科学242：423-42；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.SciUSA 85：5879-5883；和Ward等，1989，自然334：544-54)可被采纳用于生产单链抗体。单链抗体是通过氨基酸桥连接重链和轻链片段的Fv区而形成的一条单链多肽。在大肠杆菌中组装合成功能性Fv片段的技术也可被使用(Skerra等，1988，科学242：1038-1041)。
生产抗体的方法
本发明的抗体可以使用本领域已知的任何合成抗体的方法产生，特别是，通过化学合成或优选通过重组表达技术。
重组表达本发明的抗体或片段、衍生物或其类似物例如本发明抗体的重链或轻链需要构建一种含有编码抗体的多核苷酸的表达载体。一旦得到编码本发明抗体分子或抗体的重链或轻链，或其部分(优选含有重链或轻链可变区)的多核苷酸序列，通过重组DNA技术使用本领域众所周知的技术就可产生表达抗体的载体。因此，文中描述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸而制备蛋白质的方法。本领域熟练技术人员众所周知的方法可被用于构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术，合成技术以及体内基因重组。因此，本发明提供了与启动子可操作连接的含有编码本发明抗体分子，或其重链或轻链，或其重链或轻链可变区的核苷酸序列的可复制的载体。这些载体可以包括抗体分子恒定区的核苷酸序列(见，例如PCT出版号WO 86/05807；PCT出版号WO 89/01036；美国专利5122464)并且为了表达完整的重链或轻链，抗体分子的可变区也可被克隆入这样的载体中。
表达载体通过传统技术被转移到宿主细胞中并且通过传统的技术收获细胞以产生本发明的抗体。因此，本发明包括含有与异源启动子可操作连接的编码本发明抗体或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞。在优选的表达双链抗体的实施方案中，如下所述，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞内共同表达以表达完整的免疫球蛋白分子。
多种不同的宿主表达载体系统可被用于表达本发明的抗体分子。这些宿主表达系统不仅代表目的编码序列产生和随后纯化的运送工具，而且代表当被合适的核苷酸编码序列转化或转染时能够在原位表达本发明抗体分子的细胞。这些包括但不局限于微生物如用含有抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌，枯草杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；携带有含有来源自哺乳动物基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子，痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(例如，COS，CHO，BHK，293，3T3细胞)。在表达重组抗体分子时优选细菌细胞例如大肠杆菌，更优选真核细胞，特别是用于表达完整的重组抗体分子时。例如，哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与一种载体例如来自于人巨细胞病毒主要立即早期启动子成分组合是一个非常有效的抗体表达系统(Foecking等，1986，基因45：101；Cockett等，1990，生物技术8：2)。
在细菌系统中，根据所要表达的抗体分子的用途许多表达载体可被优先选择。例如，当要产生大量的这种蛋白质用于抗体分子的药物组合物时，能够高水平地表达易于纯化的融合蛋白产物的载体可能是我们所希望的。这样的载体包括但不局限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983，EMBO J 2：1791)，其中抗体编码序列被单独连接到框内lacZ基因编码区以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，1985，核酸研究13：3101-3109；Van Heeke &Schuster，1989，生命的化学期刊24：5503-5509)；以及类似的载体。pGEX载体也可被用于表达融合至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的外源多肽。通常情况下，这样的融合蛋白是可溶的并且可以很容易地通过吸附和结合至谷胱甘肽琼脂珠随后在游离的谷胱甘肽存在的情况下洗脱而从裂解细胞中纯化出来。pGEX载体被设计为包括凝血酶和因子Xa蛋白酶裂解位点，从而克隆的目的基因产物可从GST分子部分被释放下来。
在一个昆虫系统中，加利福尼亚核形多角体病毒(AcNPV)被用做表达外源基因的载体。此病毒在草地夜蛾昆虫细胞中生长。抗体编码序列可被分别克隆至病毒的非必需区(例如，多角体基因)并且置于AcNPV启动子(例如，多角体基因启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多以病毒为基础的表达系统。在腺病毒被用做表达载体的情况下，目的抗体编码序列可被连接至腺病毒转录/翻译控制复合体上，例如晚期启动子和三部分的前导序列。然后这种嵌合基因通过体外或体内重组被插入到腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区(例如，E1和E3区)将导致活的并且能够在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒产生(例如，见Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359)。有效翻译插入的抗体编码序列需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。而且，起始密码子必须同目的编码序列的读码框相协调以确保整个插入序列的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以是各种不同起源的，天然的和合成的。有效表达可被加入合适的转录增强成分、转录终止子等所加强(见Bittner等，1987，酶学方法153：51-544)。
此外，调控所插入的序列表达的，或以我们所希望的方式修饰或处理表达产物的宿主细胞株也可以选择。对蛋白质产物的这些修饰(例如，糖基化)或处理(例如，裂解)可能对蛋白的功能是很重要的。不同的宿主细胞具有其独特的对蛋白质和基因产物的翻译后处理和修饰的特性以及机制。为确保要表达的外源蛋白的正确修饰和处理可以选择合适的细胞系或宿主系统。就此目的而言，可以选择使用拥有细胞机制对基因产物进行转录、糖基化和磷酸化等适当处理的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不局限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、WI38和特别是乳癌细胞系例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D以及正常的乳腺细胞系例如CRL7030和Hs578Bst。
对于长期、高产量地表达重组蛋白质来说，优选稳定的表达。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可被工程化。宿主细胞可被用在合适的表达序列(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制之下的DNA和一个选择标记所转化，而不是使用含有病毒来源的复制起点的表达载体。在导入外源DNA以后，先将工程细胞在丰富培养基中培养生长1-2天，然后转换到选择培养基。重组质粒中的选择标记转移选择抗性，并且允许细胞将此质粒稳定整合到其染色体中，形成可被克隆和扩增到细胞系中的基因源。此方法可优先用于对表达抗体分子的细胞系进行工程化。这样的工程细胞系可能在筛选和评价能够与抗体分子直接或间接相互作用的化合物中特别有用。
许多选择系统可被使用，包括但不局限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，细胞11：223)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Azybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：202)，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，细胞28：817)基因可被分别运用至tk-、hgprt或aprt-细胞内。抗代谢物抗性也可被用做选择下列基因的基础：dhfr，转移对甲氨喋呤的抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：357；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，转移对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，转移对氨基糖苷G-418的抗性(Goldspiel等，临床药物12：488-505；Wu和Wu，1991，生物治疗3：87-95；Tolstoshev，1993，药物学毒理学年度评论32：573-596；Mulligan，1993，科学260：926-932；和Morgan&Anderson，1993，年度生物化学评论62：191-217；May，1993，TIB TECH 11(5)：155-215)；和hygro，转移对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，基因30：147)。在Ausubel等编，1998，现代分子生物学实验指南，约翰威利父子出版社，纽约；Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册，斯托克顿出版社，纽约；和第12和13章，Dracopoli等编，1994，人类遗传学实验指南，约翰威利父子出版社，纽约；Colberre-Garapin等，1981，分子生物学期刊150：1中描述了在重组DNA技术领域普遍所知的可被应用的方法，以上文献引入本文做参考。
抗体分子的表达水平可被载体扩增所增强(综述见Bebbington和Hentschel，在DNA克隆中应用基于基因扩增基础之上的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因，第三卷(学院出版社，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记也是可以扩增时，宿主细胞培养中抑制剂水平的升高将增加标记基因的拷贝数。由于扩增区与抗体基因相关，抗体的产量也会增加(Crouse等，1983，分子细胞生物学3：257)。
宿主细胞可以被本发明的两种表达载体共转染，第一种载体编码重链来源的多肽并且第二种载体编码轻链来源的多肽。这两种载体含有使重链和轻链多肽等量表达的相同的选择标记。在这种情况下，轻链应该置于重链之前以避免无毒重链的过量表达(Proudfoot，1986，自然322：52；Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197)。重链和轻链的编码序列可能包含cDNA或基因组DNA。
一旦本发明的抗体分子被重组表达，即可利用本领域纯化免疫球蛋白分子的任何已知的方法对其进行纯化，例如，通过层析(例如，离子交换、亲和，特别是在蛋白质A后与特异性抗原的亲和、分子大小柱层析)，离心，分级溶解或通过其它任何一种用于蛋白质纯化的标准技术。
抗体缀合物
为产生融合蛋白，本发明的所包含的抗体重组融合至或化学偶联(包括共价和非共价缀合)至本发明多肽(或其部分，优选此多肽的至少10、20或50个氨基酸)上。这种融合并不必要是直接的，但可以通过连接序列融合。抗体也可以是对除本发明多肽(或其部分，优选此多肽的至少10、20或50个氨基酸)以外的抗原特异性的抗体。例如，通过体外或体内将本发明的多肽融合至或偶联至特定细胞表面受体特异性的抗体上，抗体可被用于将本发明多肽定向至特定细胞类型上。融合或偶联至本发明多肽上的抗体也可被用于使用本领域已知方法的体外免疫分析和纯化中。见，例如Harbor等，supra，和PCT出版号WO 93/21232；EP439095；Naramura等，免疫学通信39：91-99(1994)；美国专利5474981；Gillies等，PNAS 89：1428-1432(1992)；Fell等，免疫学期刊146：2446-2452(1991)，全文引入本文做参考。
本发明另外包括含有融合或结合至非可变区抗体功能区的本发明多肽的组合物。例如，本发明多肽可融合或结合至抗体Fc区或其部分。融合至本发明多肽上的抗体部分可能包含恒定区、铰链区、CHl功能区、CH2功能区、CH3功能区或完整功能区及其部分的任何一种组合。本发明多肽也可被融合至或结合至上述抗体部分以形成多聚体。例如，融合至本发明多肽上的Fc部分能够通过Fc部分之间的二硫键形成二聚体。更高的多聚体形式可以通过将多肽融合至IgA或IgM的部分上形成。将本发明多肽融合至或结合至抗体部分的方法是本领域所熟知的。见，例如美国专利5336603；5622929；5359046；5349053；5447851；5112946；EP307434；EP367166；PCT出版号WO96/04338；WO 91/06570；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Zheng等，免疫学期刊154：5590-5600(1995)；和Vil等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341(1992)(上述文献全文引入本文做参考)。
如上所讨论的，本发明多肽可被融合至或缀合至上述抗体部分以增加多肽在体内的半衰期或用于使用本领域所熟知方法的免疫分析中。而且，本发明多肽可被融合至或结合至上述抗体部分以促进纯化。一个报道的例子描述了由人CD4多肽的前两个区和哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区各个不同功能区所组成的嵌合蛋白(见，例如EP 394827；Traunecker等，自然，331：84-86(1988))。具有二硫桥连接的二聚体结构(由于IgG部分)的融合或结合至抗体的本发明多肽也已经被发现比其单体分泌的蛋白或单独的蛋白更有效的结合和中和其它分子(见Fountoulakis等，生物化学期刊270：3958-3964(1995))。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗及诊断中非常有用，并且因此能够导致例如改进的药物动力学特征(EP A 232262)。另外，在融合蛋白已经被表达、检测和纯化以后去除Fc部分是我们所希望的。例如，Fc部分的存在是对治疗和诊断的一种障碍，如果融合蛋白被用做免疫接种中的免疫原时。在药物发现研究中，例如人蛋白如hIL-5已经和Fc部分融合以用于高产量筛选分析中鉴定hIL-5的拮抗剂。见D.Bennett等，分子识别期刊8：52-58(1995)和K.Johanson等，生物化学期刊270：9459-9471(1995)。
而且，本发明的抗体或其片段可被融合至标记序列上去，例如一种促进融合多肽纯化的肽。在某些优选的实施方案中，标记氨基酸序列是6个组氨酸肽，例如在pQE载体中所提供的标记(QIAGEN公司，加州Chatsworth市，Eton大街9259号，91311)，还有许多其它商业上有售的标记。正如在Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824(1989)中所描述的，例如，为了方便纯化融合蛋白使用了6个组氨酸。其它用于纯化的肽标记包括但不局限于对应于流感血凝素蛋白来源的表位的“HA”标记(Wilson等，细胞37：767(1984))和“flag”标记。
本发明另外包含与诊断和治疗试剂缀合的抗体或其片段。抗体可被用于诊断性监测肿瘤的发展或进展，作为临床检测程序的一部分例如测定某一给定的治疗策略的效率。将抗体偶联到一种可检测到的物质上去可促进检测。可检测到的物质的例子包括各种酶、修复基团、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用各种阳离子释放体层摄影的阳离子释放金属、和非放射性顺磁金属离子。见，例如美国专利4741900的根据本发明可被结合至抗体用于诊断的金属离子。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的修复基团复合体的例子包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；合适的发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括虫荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
而且，本发明的抗体或其片段可与治疗性分子部分如细胞毒素结合，例如一种细胞抑制剂或杀细胞剂，一种治疗剂或一种放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒性试剂包括任何对细胞具有致命危害的试剂。例子包括紫杉酚，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴乙啡啶，吐根碱，丝裂霉素，依托泊甙，tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙素，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，心得安和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗性试剂包括但不局限于抗代谢物(例如，甲氨喋呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，碱基化试剂(例如，氮芥，泛磺瘤可宁，美法仑，卡氮芥(BSNU)和罗氮芥(CCNU)，cyclothosphamide，白消安，二溴甘露醇，链佐星，丝裂霉素C，和二氯二胺顺铂(II)(DDP)，顺铂)，蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(以前称做柔红霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素(以前称做放线菌素)，博来霉素，光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂试剂(例如，长春新碱和长春碱)。
本发明的缀合物可被用于修饰一种给定的生物学应答，治疗剂或药物分子部分不应被理解为限于经典的化学治疗剂。例如，药物分子部分可以是具有一种我们所希望的生物学活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可能包括，例如一种毒素如红豆毒素，蓖麻子蛋白A，假单胞菌外毒素，或白喉毒素；一种蛋白质如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板来源的生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、一种血栓形成试剂或一种抗血管生成试剂；例如制管张素或endostatin；或生物学应答修饰剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
抗体也可被吸附至在免疫分析或纯化目的抗原中特别有用的固相支持载体。这样的固相支持载体包括但不局限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
将这样的治疗性部分缀合至抗体的方法是众所周知的，见，例如Amon等，“在癌症治疗中用于药物免疫定向的单克隆抗体”，在单克隆抗体和癌症治疗中，Reisfield等编，243-56页(Alan R.Liss公司1985)；Hellstrom等，“用于运送药物的抗体”，在控制的药物运送中(第二版)，Robinson等编，623-53页(Marcel Dekker公司1987)；Thrope，“综述：在癌症治疗中细胞毒性试剂的抗体载体”，在单克隆抗体：生物学的和临床应用，Pinchera等编，475-506页(1985)；“在癌症治疗中放射性标记的抗体的治疗应用的分析、结果以及展望”，在癌症检测和治疗的单克隆抗体中，Baldwin等编，303-16页(学院出版社1985)；和Thrope等，“抗体-毒素结合物的制备和细胞毒性特性”，免疫学综述62：119-58(1982)。
另外，抗体可被缀合至第二抗体以形成抗体异源缀合物，正如Segal在美国专利4676980中所描述的，引入本文做参考。
一种带有或不带有缀合的治疗性部分的抗体可单独施与，或与细胞毒性因子和/或细胞因子组合施与用于治疗。
抗体结合的分析
可以通过本领域任何一种已知的方法分析本发明抗体的免疫特异性结合。可以使用的免疫分析方法包括但不局限于使用例如蛋白印迹、放射免疫分析技术、ELISA(酶联免疫吸附分析技术)、“夹心法”免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、凝集分析、补体结合分析、免疫放射性测量分析、免疫荧光分析、蛋白质A免疫分析等技术的竞争性以及非竞争性分析方法。这样的分析方法是本领域众所周知的常规方法(见，例如Ausubel等编，1994，现代分子生物学实验指南，第一卷，约翰威利父子公司，纽约，全文引入本文做参考)。下文中简要描述了有代表性的免疫分析方法(但并未限制)。
免疫沉淀步骤通常包括在裂解缓冲液如补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA，PMSF，抑肽酶，钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％的NP-40或曲拉通X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，0.15M NaCl，0.01M磷酸钠pH7.2，1％抑肽酶)中裂解细胞，将目的抗体加入到裂解液中4℃孵育一段时间(例如，1-4小时)，向细胞裂解液中加入蛋白质A和/或蛋白质G葡聚糖珠，在4℃孵育1个小时或更长时间，用裂解缓冲液洗涤珠然后将珠重悬在SDS/样品缓冲液中。目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白印迹分析测得。本领域熟练技术人员应该对参数具有足够的知识以便修饰参数增加抗体与抗原的结合并且降低背景(例如，用葡聚糖珠预先清洗细胞裂解液)。另外的关于免疫沉淀方法的讨论见l0.16.1.的Ausubel等编，1994，现代分子生物学实验指南，第一卷，约翰威利父子公司，纽约。
蛋白印迹分析通常包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，根据抗原的分子量选用8％-20％的SDS-PAGE)中对蛋白质样品进行电泳，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质样品转移到膜例如尼龙纤维素膜、PVDF或尼龙膜，在封闭液(例如，含有3％BSA的PBS溶液或脱脂奶)中封闭膜，用洗涤液(例如，含有吐温-20的PBS溶液)洗涤膜，用稀释在封闭液中的一抗(目的抗体)封闭膜，用洗涤液洗涤膜，用稀释在封闭液中的与酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性标记(例如，32P或125I)结合的第二抗体(识别一抗的抗体，例如一种抗人抗体)封闭膜，用洗涤液洗涤膜，然后检测抗原的存在。本领域熟练技术人员应该对参数具有足够的知识以便修饰参数增强所检测的信号并且降低背景。关于蛋白印迹的另外的讨论，见10.8.1的Ausubel等编，1994，现代分子生物学实验指南，第一卷，约翰威利父子公司，纽约。
ELISAs包含制备抗原，使用抗原包被96孔微量滴定板，将与可检测的化合物如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)缀合的目的抗体加入到孔中并且孵育一段时间，然后检测抗原的存在。在ELISAs中，目的抗体并不一定要和可检测的化合物缀合；相反，与可检测的化合物缀合的二抗(识别目的抗体)可被加入到孔中。而且，除了用抗原包被板孔之外，也可用抗体包被板孔。在这种情况下，在向已经包被的孔中加入目的抗原以后，再加入与可检测的化合物缀合的二抗。本领域熟练技术人员应该对参数具有足够的知识以便修饰参数增强所检测的信号以及本领域已知的ELISAs方法的其它变化。关于ELISAs的另外的讨论，见11.2.1的Ausubel等编，1994，现代分子生物学实验指南，第一卷，约翰威利父子公司，纽约。
抗体与抗原的结合亲和性以及抗原抗体相互作用的解离率可通过竞争结合分析测定。竞争性结合分析的一个实施例是放射免疫分析，它包括将标记的抗原(例如，3H或125I)在存在数量不断增加的未标记抗原的情况下与目的抗体孵育，然后检测与标记的抗原结合的抗体。目的抗体与特定抗原的亲和性以及结合的解离率可以从scatchard plot分析得到的数据中测定。与二抗的竞争也可用放射免疫分析测定。在这种情况下，抗原在存在数量不断增加的未标记抗体的情况下与结合了标记化合物的目的抗体(例如，3H或125I)孵育。
治疗性用途
本发明另外涉及以抗体为基础的治疗，此治疗涉及向患病动物优选哺乳动物最优选人施与本发明的抗体治疗一种或多种上述的紊乱。本发明的治疗性化合物包括但不局限于本发明的抗体(如文中所述，包括其片段、类似物和衍生物)和编码本发明抗体的核酸(如文中所述，包括其片段、类似物和衍生物)。本发明抗体可被用于治疗或预防与本发明多肽异常表达和/或异常活性相关的疾病和紊乱，包括但不局限于疾病和/或紊乱例如自身免疫疾病和/或缺陷，如文中所述。对本发明多肽异常表达和/或异常活性相关的疾病和紊乱的治疗包括但不局限于减缓与这些疾病和紊乱相关的症状。如本领域众所周知的以及正如文中所述，本发明抗体可在药物学认可的组合物中被提供。
本发明抗体可被治疗性应用的方式包括在体内局部或全身结合本发明的多核苷酸或多肽，或引导抗体的细胞毒性，例如如同由补体(CDC)或效应细胞(ADCC)所介导的。下文中详细描述了一些这样的方法。利用本文中所提供的知识和教导，本领域熟练技术人员将会懂得如何在不进行多余实验的情况下将本发明的抗体用于诊断、监测或治疗目的。
本发明的抗体可优先与其它单克隆抗体或嵌合抗体组合使用，或与淋巴因子或造血生长因子(例如，IL-2，IL-3和IL-7)组合使用，例如它们有助于增加能够与抗体相互作用的效应细胞的数目或活性。
本发明的抗体既可单独施与，又可与其它治疗手段(例如，放疗、化疗、激素治疗、免疫治疗和抗肿瘤试剂)组合施与。通常情况下，优选所施与的产品的物种来源或物种反应性(当是抗体的情况下)与患者是同一物种的。因此，在一个优选的实施方案中，人抗体、片段、衍生物、类似物或核酸被施与患病的人体内用于治疗或预防。
优选使用抗本发明的多核苷酸或多肽或其片段或功能区的高亲和性和/或强体内抑制和/或中和抗体，用于免疫分析和治疗与本发明的多核苷酸或多肽包括其片段相关的紊乱。这些抗体、片段或功能区将优选与多核苷酸或多肽包括其片段具有亲和性。优选的结合亲和性的解离常数或Kd小于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M，和10-15M。
基因治疗
在特定的实施方案中，包含抗体或其功能性衍生物编码序列的核酸被通过基因治疗的方式施与以治疗、抑制或预防与本发明多肽的异常表达和/或活性相关的疾病或紊乱。基因治疗指向待治疗个体施与表达的或可表达的核酸的治疗。在本发明这方面的实施方案中，核酸产生它们所编码的介导治疗效应的蛋白质。
根据本发明本领域中任何一种可用于基因治疗的方法都可被使用。下文中描述了代表性方法。
关于基因治疗方法的一般综述，见Goldspiel等，1993，临床药物12：488-505；Wu和Wu，1991，生物治疗3：87-95；Tolstoshev，1993，药物学毒理学年度评论32：573-596；Mulligan，1993，科学260：926-932；和Morgan&Anderson，1993，年度生物化学评论62：191-217；May，1993，TIB TECH 11(5)：155-215)。在Ausubel等编，1998，现代分子生物学实验指南，约翰威利父子出版社，纽约；和Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册，斯托克顿出版社，纽约中描述了在重组DNA技术领域普遍所知的可被应用的方法。
在一个优选的方面，化合物包含编码抗体的核酸，所述核酸序列是在合适的宿主中表达抗体或片段或嵌合蛋白或其重链或轻链的载体的一部分。尤其是，这样的核酸序列具有与抗体编码基因可操作连接的启动子，所述的启动子是诱导型或组成型表达的，并且任选是组织特异性的。在另外一个特别的实施方案中，所使用的核酸分子或任何其它目的序列的两端都有促进在基因组目的位点发生同源重组的侧翼区，这样就提供了抗体核酸分子的染色体内表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等，1989，自然342：435-438)。在特定的实施方案中，表达的抗体分子是单链分子；另外，核酸序列包括抗体的重链和轻链或其片段的编码序列。
可将核酸分子直接运送进入病人体内，在这种情况下病人直接暴露至核酸分子或核酸携带载体，也可以间接进入病人体内，在此情况下先用核酸在体外转化细胞然后将转化的细胞移植入病人体内。这两种方法分别是已知的体内和离体基因治疗。
在一个特定的实施方案中，核酸分子被直接施与体内表达产生编码产物。这可以通过本领域已知的无数方法中的任何一种来完成，例如将它们构建作为一个合适的核酸表达载体然后施与体内使之进入细胞内，例如通过使用缺陷的或减毒的逆转录病毒载体或其它病毒载体(见美国专利4980286)，或通过直接注射裸DNA，或通过微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或利用脂类、细胞表面受体或转染试剂包被，形成胶囊化的脂质体、微粒或微胶囊，或通过将它们与一段已知能够进入核中的肽连接然后施与，或通过将它们与一已知能够易于起始受体介导的内吞的配体连接然后施与(见，例如Wu和Wu，1987，生命的化学期刊262：4429-4432)(可被用于定向至特异性表达受体的细胞类型上)等。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合体其中配体包含一种破坏核内体的溶基因病毒肽，这使得核酸分子能够避免核酶降解。在另外一个实施方案中，由于细胞的特异性摄入和表达，核酸能够通过定向至一个特异性受体在体内定向(见，例如PCT出版号WO 92/06180，1992年4月16日公开(Wu等)；WO 92/22635，1992年12月23日公开(Wilson等)；WO 92/20316，1992年11月26日公开(Findeis等)；WO93/14188，1993年7月22日公开(Clarke等)；WO 93/20221，1993年10月14日公开(Young等))。另外，核酸可被导入细胞内并且通过同源重组整合至宿主细胞DNA中表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等，1989，自然342：435-438)。
在一个特定的实施方案中，使用了含有编码本发明抗体的核酸序列病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(见Miller等，1993，酶学方法217：581-599)。这些逆转录病毒载体已经被去除对病毒基因组包装和整合进入宿主细胞DNA非必要的逆转录病毒序列。在基因治疗中所用的编码抗体的核酸序列被克隆到一个或多个促进将基因运送进入病人体内的载体中。关于逆转录病毒载体更详细的信息可在Boesen等，1994，生物治疗6：291-302中发现，其中描述了使用逆转录病毒载体向造血干细胞运送mdrl基因以使干细胞对化疗产生抗性。其它关于在基因治疗中使用逆转录病毒载体的文献有Clowes等，1994，临床投资期刊93：644-651；Kiem等，1994，血液83：1467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，人体基因治疗4：129-141；以及Grossman和Wilson，1993，遗传学和发育现代论点3：110-114。
腺病毒是可被用于基因治疗的其它病毒载体。对于将基因运送到呼吸道上皮来说，腺病毒是特别具有吸引力的运送工具。腺病毒自然感染呼吸道上皮并且引起轻微疾病。腺病毒运送系统的其它靶有肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson，1993，遗传学和发育现代论点3：499-503中发表了一篇基于腺病毒基因治疗的综述。Bout等，1994，人体基因治疗5：3-10显示了使用腺病毒载体运送基因到恒河猴的呼吸道上皮。其它关于在基因治疗中使用腺病毒的例子见Rosenfeld等，1991，科学252：431-434；Rosenfeld等，1992，细胞68：143-155；Mastrangeli等，1995，临床投资期刊91：225-234；PCT出版号WO 94/12649；和Wang等，1995，基因治疗2：775-783。在一个优选的实施方案中，使用了腺病毒载体。
腺病毒伴随病毒(AAV)也已经被提出可在基因治疗中应用(Awlsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300；美国专利5436146)。
基因治疗的另一途径涉及通过一些方法例如电穿孔、脂质体转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染等将基因运送到组织培养中的细胞内。通常情况下，转移方法包括将一种可选择标记转移到细胞内。然后将选择细胞以分离那些已经摄入并且表达所转移的基因的细胞。然后把这些细胞运送到病人体内。
在这个实施方案中，在体内施与产物重组细胞之前将核酸导入细胞内。这样的导入可以使用本领域任何一种已知的方法，包括但不局限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒载体或细菌噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质体融合等。本领域中有许多中已知的技术可被用于将外源基因导入到细胞内(见，例如Loeffler和Behr，1993，酶学方法217：599-618；Cohen等，1993，酶学方法217：618-644；Cline，1985，药物治疗29：69-92)并且根据本发明都可被使用，但是受体细胞的必须的发育和生理功能不能被破坏。此技术应该向细胞提供稳定的核酸转移，以致于核算是可被细胞表达的优选是遗传的并且由后代细胞表达。
得到的重组细胞可以通过本领域已知的各种不同的方法被运送到病人体内。重组的血液细胞(造血干细胞或祖细胞)优选被静脉内施与。所使用的细胞的数量依赖于所希望的效果、病人的状态等等，并且可被本领域熟练技术人员确定。
核酸可被导入其中以用于基因治疗的细胞包括任何我们所希望的、可用的细胞类型，并且包括但不局限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞：血液细胞例如T淋巴细胞、B 淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、成巨核细胞、粒细胞；各种不同的干细胞或祖先细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血液、外周血、胎肝等中获得的细胞。
在一个优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞与病人是自体同源的。
在一个重组细胞用于基因治疗的实施方案中，编码抗体的核酸序列被导入细胞以使得它们能够被细胞或其后代细胞所表达，然后重组细胞被体内施与用于治疗。在一个特定的实施方案中，使用了干细胞或祖先细胞。根据本发明的这个实施方案，任何能够被分离并且能够在体外维持的干细胞和/或祖先细胞都可能被使用(见，例如PCT出版号WO 94/08598，1994年4月8日公开；Stemple和Anderson，1992，细胞71：973-985；Rheinwald，1980，细胞生物学方法21A：229；以及Pittelkow和Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61：771)。
在一个特定的实施方案中，将被导入用于基因治疗的核酸包含一个与编码区可操作连接的可诱导的启动子，因此核酸的表达是通过控制转录的合适的诱导子的存在或不存在而受控制的。
治疗或预防活性的证明
本发明的化合物或药物组合物在用于人体之前优选先在体外然后在体内测试所希望的治疗或预防活性。例如，显示化合物或药物组合物治疗或预防应用的体外分析包括化合物对细胞系或病人组织样品的效果。化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的效果可通过利用本领域熟练技术人员已知的方法去测定，这些方法包括但不局限于玫瑰花结形成分析和细胞裂解分析。根据本发明，用于测定是否施与的一种特定的化合物效果显现出来的体外分析，包括体外细胞培养分析，其中病人的组织样品在培养中生长，并且暴露至或另外施与一种化合物，然后观测这种化合物对组织样品的效果。
治疗性/预防性施与方法和组合物
本发明提供了通过向研究对象施与本发明有效剂量的化合物或药物组合物优选本发明抗体的治疗、抑制和预防方法。在一个优选的实施方案中，化合物是基本纯化的(例如，基本没有限制其效果或产生所不希望的副反应的物质)。研究对象优选是动物，包括但不局限于动物如牛、猪、马、鸡、猫、狗等，并且优选是哺乳动物，最优选是人。
当此化合物包含核酸分子或免疫球蛋白时，已经在上文中描述了可被应用的施与此化合物的制剂和方法；其它合适的制剂形式和施与途径可从下文的描述中选择应用。
各种不同的运送系统都是已知的并且都可被用于施与本发明的化合物，例如胶囊化脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达此化合物的重组细胞、受体介导的内吞(见，例如Wu和Wu，1987，生命的化学期刊262：4429-4432)、核酸作为逆转录病毒或其它载体部分的构建物等。导入的方法包括但不局限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。化合物或组合物可以任何便利的途径被施与，例如通过输液或团块注射，通过内皮或皮肤粘膜(例如，口腔粘膜、直肠和消化道粘膜等)吸收和可与其它生物学活性试剂一起施与。可全身施与或局部施与。此外，可以通过任何合适的途径将本发明的药物组合物或化合物导入到中枢神经系统中，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可被连接到贮器例如奥马耶贮器的心室内导管所促进。也可以应用肺部施与，例如通过使用吸入器或喷雾器，和带有喷雾剂的剂型。
在一个特定的实施方案中，我们希望将本发明的药物化合物或组合物局部施与需要治疗的区域；这可以通过例如，但不是限制的方式，手术时局部输液，局部应用，例如手术后与伤口纱布结合应用、通过注射、通过导管方法、通过栓剂方法或通过移植物，所述的移植物是多孔的、非多孔的或凝胶材料包括膜例如sialastic膜或纤维。优选的，当施与本发明的一种蛋白质包括抗体时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。
在另一个实施方案中，化合物或组合物可在一种运送工具中被运送，特别是在脂质体中(见Langer，1990，科学249：1527-1533；Treat等，治疗传染性疾病和癌症中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler编，利兹出版社，纽约，353-365页(1989)；Lopez-Berestein，ibid，317-327页；见ibid)。
在另一个实施方案中，化合物或组合物可在一种控制的释放系统中被运送。在一个实施方案中，可使用泵(见，Langer，supra；Sefton，1987，CRC Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980，外科88：507；Saudek等，1989，新英格兰医学期刊321：574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(见，可控制的释放的医学应用，Langer和Wise编，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达(1974)；控制的药物生物存在，药物产品设计和表现，Smolen和Ball编，Wiley出版社，纽约(1984)；Ranger和Peppas J，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；也见Levy等，1985，科学228：190；During等，1980，年度神经学25：351；Howard等，1989，神经外科期刊71：105)。在另一个实施方案中，可控制的释放系统可被放置在治疗靶的附近，即脑，因此仅仅只需要全身剂量的一部分(见，例如Goodson，可控制的释放的医学应用，supra，第2卷，115-138页(1984))。
在Langer的综述(1990，科学249：1527-1533)中详细讨论了其它的可控制的释放系统。
在一个特定的实施方案中，其中本发明的化合物是编码蛋白质的核酸，此核酸可被体内施与以促进它所编码的蛋白质的表达，通过将它构建作为一个合适的核酸表达载体的一部分然后施与体内使之进入细胞内，例如通过使用逆转录病毒载体(见美国专利4980286)，或通过直接注射，或通过微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或利用脂类、细胞表面受体或转染试剂包被，或通过将它们与一段已知能够进入核中的同源盒样的多肽连接然后施与(见，例如Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)等。另外，核酸可被导入细胞内并且通过同源重组整合至宿主细胞DNA中表达。
本发明也提供了药物组合物。这样的组合物含有治疗上有效剂量的化合物和一种治疗上认可的载体。在一个特定的实施方案中，术语“治疗上认可的”意指在动物更优选在人体内使用被联邦或州政府的协调处所允许的或在美国药物标准或其它普遍认可的标准中列出的。术语“载体”意指与治疗同时施与的一种稀释剂、佐剂、赋形剂或运送载体。这样的药物载体也可以是无菌的液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物来源的或合成的，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和类似物。当药物组合物被静脉内施与时，水是优选的载体。盐溶液和葡萄糖水以及甘油溶液也可被用做液体载体，特别是用于注射溶液中。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、动物胶、麦芽、大米、面粉、白垩、二氧化硅凝胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石粉、氯化钠、表面的干奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇和类似物。如果需要的话，组合物中也可以含有少量的加湿剂、乳化剂或pH缓冲试剂。这些组合物可以采用溶液、悬液、乳剂、药片、药丸、胶囊、粉末、持久释放的剂型以及类似剂型。组合物可与传统的粘合剂和载体例如甘油三酯一起配制成为栓剂。口服剂型可以包括标准载体例如药物学等级的甘露糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁，糖精钠、纤维素、碳酸镁等。E.W.Martin在“Remington’s药物科学”中描述了合适的药物载体的实施例。这样的组合物含有治疗有效剂量的化合物，优选以纯化的形式，和提供适当形式施与病人的合适剂量的载体。剂型必须与施与方式相配。
在优选的实施方案中，根据常规方法组合物被配制成为用于人体静脉注射的药物组合物。典型的是，用于静脉注射的组合物是在无菌的等渗缓冲水溶液中。当需要时，组合物也可含有溶解试剂以及局部麻醉剂例如利多卡因以减缓注射位点的疼痛。通常情况下，成分是以单位剂量的形式单独提供或混合在一起提供，例如，在一个标明活性成分数量的密封容器如安瓿瓶或小包中的冻干粉末或无水浓缩物。当组合物将要通过输液施与时，它可被配制到含有无菌的药物等级的水或盐溶液的输液瓶中。当组合物通过注射方式被施与时，可提供一安瓿瓶的用于注射的无菌水或盐溶液以在注射前用于混合药物成分。
本发明的化合物也可以中性或盐形式配制。药物学可接受的盐包括那些与阴离子例如那些来自盐酸，磷酸，醋酸，草酸，酒石酸等一起形成的盐以及那些与阳离子例如那些来自钠，钾，铵，钙，氢氧化铁，异丙基胺，三乙胺，2-巯基乙醇，组胺，普鲁卡因等形成的盐。
在治疗、抑制和预防与本发明多肽异常表达和/或异常活性相关的疾病或紊乱中有效的本发明化合物的量可通过标准的临床技术测定。此外，体外分析也可被任选应用以辅助鉴定最佳的剂量范围。在剂型配制中的精确剂量也取决于施与途径以及疾病和紊乱的严重程度，并且应该根据实施者的判断和每个病人的环境条件做出判断。有效剂量可从体外或动物模型检测系统的剂量应答曲线中推算出来。
对于抗体来说，给病人施与的典型的抗体剂量是0.1mg/kg病人体重到100mg/kg。优选给病人施与的抗体剂量通常是0.1mg/kg到20mg/kg病人体重，更优选是1mg/kg到10mg/kg病人体重。通常情况下，由于机体对外源多肽的免疫应答，人抗体在人体内的半衰期要比其它物种来源的抗体要长一些。因此，较低剂量和较少次数的施与是可能的。而且，本发明抗体的剂量和施与频率可以通过修饰例如脂质化增加抗体的摄入和组织穿透性(例如，进入大脑)而减少。
本发明也提供了包含一个或多个装有本发明药物组合物一种或多种成分的容器的药物包装或试剂盒。这些容器任选地包含由协调生产、使用和销售药物或生物学制品的政府部门所签发的一则通知，此通知反映了对制造、使用和销售用于人的这些产品的批准。
诊断和影象
可与目的多肽特异性结合的标记的抗体及其衍生物和类似物可被用于诊断用途以检测、诊断或监测与本发明多肽异常表达和/或异常活性相关的疾病和/或紊乱。本发明提供了检测目的多肽的异常表达，包含(a)使用一种或多种目的多肽特异性的抗体分析目的多肽在个体细胞或体液中的表达和(b)将基因表达水平与标准基因表达水平相比，与标准表达水平相比所分析的多肽基因表达水平的升高或降低预示着异常表达。
本发明提供了一种诊断紊乱的诊断性分析，包括(a)使用一种或多种目的多肽特异性的抗体分析目的多肽在个体细胞或体液中的表达和(b)将基因表达水平与标准基因表达水平相比，与标准表达水平相比所分析的多肽基因表达水平的升高或降低预示着某一特定紊乱。就癌症而言，来自一个体的组织活检标本中存在的相对较高数量的转录本可能预示易于发展疾病的体质，或可能提供了在实际临床症状出现之前检测这种疾病的方法。对这种类型疾病更决定性的诊断可以允许健康职业者更早地运用预防性手段或主动治疗，籍此预防癌症的发展和进一步进展。
可以使用基于抗体的技术分析生物学样品中的TR-6α和/或TR-6β多肽水平。通过使用本领域熟练技术人员已知的经典的免疫组织学方法本发明抗体可被用于分析生物学样品中的蛋白质水平(例如，见Jalknen，M.等，细胞生物学期刊101：976-985(1985)；Jalknen，M.等，细胞生物学期刊105：3087-3096(1987))。其它用于检测蛋白质基因表达的基于抗体的方法包括免疫分析例如酶联免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。合适的抗体分析标记是本领域所熟知的并且包括酶标记例如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素例如碘(131I，25I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氢(3H)，铟(115mIn，113mIn，112In，111In)，和钛(99Tc，99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142pr，105Rh，97Ru；发光物质标记例如鲁米诺；和荧光物质标记例如荧光素和罗丹明，和生物素。
本领域已知的技术可被用于标记本发明的抗体。这样的技术包括但不局限于使用双功能性结合试剂(见，例如美国专利5756065，5714631，5696239，5652361，5505931，5489425，5435990，5428139，5342604，5274119，4994560和5808003；以上文献全文引入本文做参考)。
本发明的一个方面是在一种动物，优选哺乳动物和最优选人中检测和诊断与本发明的多肽异常表达相关的疾病或紊乱。在一个实施方案中，诊断包含：a)向受试个体施与(例如，非胃肠道，皮下或腹膜内)有效剂量的能够与目的多肽特异性结合的标记的分子；b)在施与药物后等待一段时间间隔以允许标记的分子优选在受试个体的多肽表达的位点聚集(未标记的分子被清除至背景水平)；c)测定背景水平；和d)在受试个体中检测标记的分子，如果所检测的标记的分子高于背景水平意味着此受试个体患有某特定疾病或患有与本发明多肽异常表达相关的紊乱。背景水平可以通过各种不同的方法检测，包括将所检测的标记分子的量与在一特定系统中预先测定的标准值进行比较。
本领域理解的是，所使用的受试个体以及图象系统的大小将决定需要产生诊断影象的图象分子部分的数量。当是放射性同位素分子的情况下，对于人来说，所要注射入的放射活性通常在99mTc大约5至20毫居里之间。标记的抗体或抗体片段将优选在含有特定抗原的细胞部位积聚。在S.W.Burchiel等“放射标记的抗体及其片段的免疫药物动力学”(在肿瘤影象的第13章：癌症的放射化学检测，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，梅森出版公司(1982))描述了体内肿瘤影象。
根据几种变量，包括所用标记的类型和施与方式，施与药物后允许标记的分子优先在受试个体局部聚集以及用于将未标记的分子清除至本底水平的时间间隔是6至48小时或6至24小时或6至12小时。在另一个实施方案中，施与药物后的时间间隔是5到20天或5到10天。
在一个实施方案中，对疾病或紊乱的监测是通过重复诊断疾病或紊乱的方法而实施的，例如在初次诊断后一个月，初次诊断后六个月，初次诊断后一年等。
使用本领域所熟知的体内扫描的方法，病人体内存在的标记的分子可被检测出来。这些方法取决于标记的类型。熟练技术人员能够决定用于检测某种特定标记的合适的方法。可被用于本发明诊断方法中的方法和设施包括但不局限于计算机体层摄影(CT)，全身扫描例如正电子发射体层摄影(PET)，磁共振成像(MRI)和超声检查。
在一个特定的实施方案中，用放射性同位素标记分子并且使用放射性应答医疗仪器(Thurston等，美国专利5441050)在病人体内检测。在另一个实施方案中，用荧光化合物标记分子并且使用荧光应答扫描仪器在病人体内检测。也在另一个实施方案中，用顺磁标记分子并且使用磁共振成像(MRI)在病人体内检测。
试剂盒
本发明提供了可用于以上方法的试剂盒。在一个实施方案中，一种试剂盒包括在一个或多个容器中的本发明的抗体优选是纯化的抗体。在一个特定的实施方案中，本发明的试剂盒包含一种由能够与试剂盒中所含有的抗体发生特异性免疫反应的表位组成的基本分离的多肽。优选的，本发明的试剂盒另外包含一种不与目的多肽发生反应的对照抗体。在另一个特定的实施方案中，本发明的试剂盒含有一种用于检测抗体与目的多肽结合的方法(例如，抗体可与一种可检测的底物结合例如荧光化合物、酶底物、放射活性化合物或一种发光物质，或一种能够识别一抗的二抗也可与可检测的底物结合)。
在本发明的另一个特定的实施方案中，试剂盒是一个用于筛查含有针对增殖性和/或癌症性多核苷酸和多肽的特异性抗体的血清的诊断试剂盒。这样的试剂盒可能含有不与目的多肽反应的对照抗体。这样的试剂盒可能含有基本分离的包含能够与至少一种抗多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应的表位的多肽抗原。而且，这样的试剂盒包括用于检测所述抗体与抗原结合的方法(例如，抗体可被结合至能够被流式细胞术检测出的荧光化合物上如荧光素和罗丹明)。在特定的实施方案中，试剂盒可能包含重组生产的或化学合成的多肽抗原。试剂盒的多肽抗原也可被吸附到固相支持载体上去。
在一个更特定的实施方案中，上述试剂盒的检测方法包括一种所述多肽抗原可吸附在其上的固相支持载体。这样的试剂盒可能包括一种非吸附的报告物标记的抗人抗体。在这个实施方案中，抗体与多肽抗原的结合可以通过上述的报告物标记的抗体的结合而检测出来。
在另外的一个实施方案中，本发明包括一种用于筛查含有本发明多肽抗原的血清的诊断试剂盒。此诊断试剂盒包括一种基本分离的能够与多肽或多核苷酸抗原发生特异性免疫反应的抗体，和检测多核苷酸和多肽抗原与抗体结合的方法。在一个实施方案中，抗体被吸附到固相支持载体上。在一个特定的实施方案中，抗体可能是单克隆抗体。此试剂盒的检测方法可能包括一种标记的单克隆二抗。另外，或此外检测方法可能包括一种标记的竞争性抗原。
在一个诊断过程中，待测血清与通过本发明方法获得的表面结合有抗原的固相试剂反应。在抗体与试剂中的特定抗原结合以后，通过洗涤去除未结合的血清成分，然后试剂与报告物标记的抗人抗体反应以使报告物随着结合在固相支持载体上的抗抗原抗体的量而结合到试剂上去。然后洗涤试剂以去除未结合的标记的抗体，并且测定与试剂相关的报告物的数量。典型的情况下，报告物是一种酶，它是通过在存在合适的荧光测定的，发光的或光测定的底物的情况下孵育固相基质而测定的。
在上述分析中固相表面试剂是通过已知的技术将蛋白材料吸附到固相支持材料如聚合珠、浸泡棒、96孔板或过滤材料上而制备的。这种吸附方法通常包括蛋白质非特异性吸附至支持物上或将此蛋白质共价结合，典型的是通过自由的氨基基团，到支持物上的化学反应基团上例如活化的羧基、羟基或醛基基团。另外，链亲和素包被的板子可以和生物素化的抗原组合使用。
因此，本发明提供了一种实施这种诊断方法的分析系统或试剂盒。试剂盒通常包括一种表面结合有重组抗原的支持物，以及一种用于检测表面包被的抗抗原抗体的报告物标记的抗人抗体。免疫系统相关的紊乱诊断
本发明人已经发现TNFR-6α和TNFR-6β在造血和转化的组织中表达。对于许多免疫系统相关的紊乱来说，相对于“标准的”TNFR基因表达水平，即不患有这样的紊乱的个体的免疫系统组织或其它细胞或体液中的TNFR基因表达水平，明显改变的(升高或降低)TNFR基因表达水平可以从患有这样的紊乱的个体中采集的免疫系统组织或其它细胞或体液(例如，血清和血浆)中检测出来。因此，本发明提供了一种在诊断免疫系统紊乱中有用的诊断方法，此方法包括测量某个体的免疫系统组织或其它细胞或体液中的编码TNFR蛋白质的基因的表达水平，并且将所测量的基因表达水平与标准的TNFR基因表达水平进行比较，籍此与标准的表达水平相比升高的或降低的基因表达水平预示着免疫系统紊乱。
特别是，当与相应的“标准”水平相比较时，据认为患有癌症(例如，结肠、乳和肺癌)的哺乳动物的某些组织中具有升高的TNFR基因拷贝数和/或表达显著升高水平的TNFR蛋白质和编码TNFR蛋白的mRNA。另外，与采集自未患有癌症的同种哺乳动物的血清相比，据认为升高的TNFR蛋白水平可被在患有癌症的哺乳动物的某些细胞或体液(例如，血清和血浆)中检测出来。
因此，本发明提供了一种在诊断免疫系统紊乱包括癌症中有用的诊断方法，此方法涉及测量某个体的免疫系统组织或其它细胞或体液中的编码TNFR蛋白质的基因的表达水平，并且将所测量的基因表达水平与标准的TNFR基因表达水平进行比较，籍此与标准的表达水平相比升高的或降低的基因表达水平预示着免疫系统紊乱。
当免疫系统紊乱的诊断包括肿瘤的诊断已经根据传统的方法完成时，本发明用做预后指标，籍此相对于基因表达水平接近于标准水平的个体来说，显示出降低的基因表达的个体将经历更差的临床结果。
“分析编码TNFR蛋白质的基因表达水平”意指直接(测量或评价绝对的蛋白质水平或mRNA水平)或相对(与第二个生物样品中的蛋白质水平或mRNA水平进行比较)地定性或定量测量或评价第一份生物样品中的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白质的水平或编码TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白质mRNA的水平。优选的是，测量或评价第一份生物样品中的TNFR蛋白质水平或mRNA水平然后将其与标准的TNFR蛋白质水平或mRNA水平进行比较，标准得自未患有此紊乱的个体的第二份生物样品或是通过平均未患有免疫系统紊乱的群体的结果而得到的。正如本领域所明了的，一旦测得标准的TNFR蛋白质水平或mRNA水平，它们可被反复用于比较的标准。
“生物学样品”意思是指任何从一个个体、体液、细胞系、组织培养或其它来源获得的含有TNFR蛋白质或mRNA的生物学样品。如文中所述，生物学样品包括含有TNFR蛋白游离的细胞外功能区(或可溶形式)的体液(例如，血清、胞浆、尿液、滑液和脊髓液)，免疫系统组织和其它已被发现表达完整TNFR、成熟TNFR或TNFR胞外功能区的组织。从哺乳动物中获得组织活检标本或体液的方法是本领域众所周知的。由于生物学样品含有mRNA，组织活检标本是优选的原料。
本发明也包括本发明的基因用于诊断TNFR基因的突变的应用。例如，如果在本发明的基因中的一个基因中存在突变，就会导致本发明多肽受体产生的减少。而且，增强受体多肽活性的突变将会导致与受体多肽过度表达相关的疾病例如癌症。基因中的突变可以通过将缺陷基因的序列与正常基因的序列进行比较而检测出来。因此，我们可以证实突变基因与疾病状况或易于发生一种疾病状况相关。那就是说，能够导致本发明受体多肽低表达的突变基因将与TNFR失去抑制Fas配体和/或AIM-II介导的凋亡的能力相关，并且籍此导致异常的细胞增殖(例如，肿瘤生长)。
其他的可被前述的分析方法所诊断的免疫系统紊乱包括但不局限于超敏、过敏、传染性疾病、移植宿主疾病、免疫缺陷、自身免疫性疾病以及类似疾病。
携带本发明基因突变的个体可以通过多种不同的技术在DNA水平被检测出。用于诊断的核酸可从病人的细胞例如从血液、尿液、唾液和其它组织活检标本中获得。基因组DNA可直接用于检测或在分析前利用PCR技术进行酶扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或cDNA也可用于同样目的。作为一个实施例，与本发明核酸互补的PCR引物可被用于鉴定和分析本发明中人基因的突变。例如，缺式和插入可以通过与正常基因表型相比扩增产物大小的改变而检测出来。点突变可以通过将扩增的DNA与放射标记的RNA或与放射标记的本发明的反义DNA序列杂交而检测出来。通过RNA酶A消化或熔点温度的不同可以区分完全配对的序列和不配对的序列。这样的诊断方法在产前或新生儿检查中非常有用。
参考序列和“突变体”之间的差别也可以通过直接DNA测序的方法而检测出来。此外，克隆的DNA片段可用做探针去检测特异性DNA片段。当与PCR组合使用时，此方法的敏感性大大增强。例如，将测序引物与双链PCR产物或一段通过修饰的PCR产物产生的单链模板分子一起使用。序列测定是通过使用放射性标记的核苷酸的传统方法或使用荧光标记的自动测序方法进行的。
在特定位点的序列改变可以通过核酶保护分析例如RNA酶和Sl保护或化学裂解方法而检测出来(例如，Cotton等，PNAS 85：4397-4401(1985))。
可以使用基于抗体的技术分析生物样品中的TNFR蛋白水平。例如，可以使用经典的免疫组织学方法研究组织中的TNFR蛋白表达(Jalkanen，M.等，细胞生物学期刊101：976-985(1985)；Jalkanen，M.等，细胞生物学期刊105：3087-3096(1987))。其它用于检测TNFR基因表达的基于抗体的技术包括免疫分析例如酶联免疫吸附分析(ELISA)和放射免疫分析(RIA)。合适的抗体分析标记是本领域所熟知的并且包括酶标记例如葡萄糖氧化酶，和放射性同位素例如碘(125I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氢(3H)，铟(112In)，和钛(99mTc)，和荧光物质标记例如荧光素和罗丹明，和生物素。
除了分析从个体中获得的生物样品中的TNFR蛋白水平以外，也可以通过影像的方法体内检测TNFR蛋白。用于TNFR蛋白体内影像的抗体标记或标志包括可被X光照相、NMR或ESR检测出的标记。对于X光照相术来说，合适的标记包括放射性同位素例如能够释放可检测出的射线但是对人无害的钯和铯。合适的用于NMR和ESR的标记包括那些带有可检测的特征性spin的标记例如重氢，它们可以通过标记相关杂交瘤的营养物而被掺入到抗体中去。
一种已经被用合适的可检测出的影像分子例如一种放射性同位素(例如，碘(131I，25I，123I，121I)，碳(14C)，硫(35S)，氢(3H)，铟(115mIn，113mIn，112In，111In)，和钛(99Tc，99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142pr，105Rh，97Ru)、一种放射性模糊的物质、或一种可被核磁共振检测的物质标记的TNFR特异的抗体或抗体片段被导入(例如，非胃肠道，皮下或腹膜内)将要检测免疫系统紊乱的哺乳动物。在本领域中将要明白的是，所使用的受试个体以及图象系统的大小将决定需要产生诊断影象的图象分子部分的数量。当是放射性同位素分子的情况下，对于人来说，所要注射入的放射活性通常在大约5至20毫居里99mTc之间。标记的抗体或抗体片段将优选在含有神经因子α蛋白的细胞部位积聚。在S.W.Burchiel等“放射标记的抗体及其片段的免疫药物动力学”(在肿瘤影象的第13章：癌症的放射化学检测，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，梅森出版公司(1982))描述了体内肿瘤成像。治疗
已知肿瘤坏死因子家族配体属于能够引发许多种细胞应答的最多效的细胞因子，其中包括细胞毒性、抗病毒活性、免疫调控活性以及一些基因的转录后调控(Goeddel，D.V.等，“肿瘤坏死因子：基因结构和生物学活性”Symp.Quant.Biol.51：597-609(1986)，冷泉港；Beutler，B和Cerami，A，生物化学年度评论57：505-518(1988)；Old，L.J.，科学美国人258：59-75(1988)；Fiers，W，FEBS Lett 285：199-224(1991))。TNF家族配体通过与TNF家族受体结合而引发如此多种不同的细胞应答。
本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸和多肽可被用于发展对任何由缺陷的或量不足的TNFR-6α和/或TNFR-6β所介导(直接或间接)的紊乱的治疗方法。TNFR-6α和/或TNFR-6β可被施与患有这种紊乱的患者(例如，哺乳动物，优选人)体内。另外，基因治疗方法可被运用以治疗此种紊乱。文中显示的TNFR-6α和/或TNFR-6β核苷酸序列使得检测缺陷的TNFR-6α和/或TNFR-6β并且用正常的TNFR-6α和/或TNFR-6β编码基因替换成为可能。缺陷基因可以在体外诊断分析中通过比较文中所述的TNFR-6α和/或TNFR-6β核苷酸序列和从怀疑此基因缺陷的患者中得到的TNFR-6α和/或TNFR-6β的核苷酸序列而被检测。
在另一个实施方案中，本发明多肽被用做研究在不同细胞类型中抑制Fas配体/TNFR-6α和/或TNFR-6β和/或AIM-II相互作用所导致的生物学效应的研究工具。TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽也可被用于体外分析检测Fas配体、AIM-II或TNFR-6α和/或TNFR-6β或其相互作用。
在另一个实施方案中，本发明的纯化的TNFR-6α和/或TNFR-6β被用于抑制Fas配体和/或AIM-II与内源性细胞表面Fas配体和/或AIM-II受体的结合。已经报道TNF家族(Fas配体和/或AIM-II是其中成员)的某些配体可以结合多于一种的远距离的细胞表面受体蛋白。而且据认为AIM-II可结合多个细胞表面蛋白。通过与Fas配体和/或AIM-II结合，本发明的可溶性TNFR-6α和/或TNFR-6β不仅可被用于抑制Fas配体和/或AIM-II与内源性TNFR-6α和/或TNFR-6β的结合，而且可被用于抑制距离TNFR-6α和/或TNFR-6β较远的Fas配体和/或AIM-II受体蛋白。因此，在另一个实施方案中，TNFR-6α和/或TNFR-6β被用于体外或体内方法抑制Fas配体和/或AIM-II的生物学活性。通过抑制Fas配体和/或AIM-II与细胞表面受体的结合，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽也被用于抑制由于Fas配体和/或AIM-II与内源性受体的结合而导致的生物学效应。可以使用不同形式的TNFR-6α和/或TNFR-6β，包括例如上述的TNFR-6α和/或TNFR-6β片段、衍生物和能够结合Fas配体和/或AIM-II的突变体。在优选的实施方案中，本发明的可溶性TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽被施与抑制Fas配体和/或AIM-II的生物学活性，例如抑制易于凋亡的细胞的Fas配体介导的和/或AIM-II介导的细胞凋亡。
在另外的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽被施与至哺乳动物体内治疗Fas配体介导的和/或AIM-II介导的紊乱。这些Fas配体介导的和/或AIM-II介导的(例如，人)紊乱包括由Fas配体和/或AIM-II导致的(直接或间接)或恶化的情况。
能够表达TNFR多肽并且能够针对TNFR-6α和/或TNFR-6β配体产生强的免疫应答的细胞包括淋巴细胞、内皮细胞、角质形成细胞和前列腺组织。“针对TNFR家族配体的细胞应答”意思是指由TNF家族配体在细胞、细胞系、组织、组织培养或病人中引发的任何一种基因型、表型、和/或多形性改变。如文中所述，这样的细胞应答不仅包括对TNF家族配体的正常的生理应答，而且包括与增加的细胞凋亡或对凋亡的抑制相关的疾病。此外，如文中所述，本发明TNFR多肽与Fas配体和AIM-II结合并且因此阻断Fas配体和AIM-II介导的细胞凋亡。凋亡-细胞程序性死亡是一种涉及去除免疫系统B和/或T淋巴细胞的生理学机制，并且它的失调能够造成许多不同的致病过程(J.C.Ameisen，AIDS 8：1197-1213(1994)；P.H.Kramner等，免疫学现代论点6：279-289(1994))。
与增加的细胞存活或凋亡的抑制相关的疾病包括癌症(例如滤泡性淋巴瘤，带有p53突变的癌症，和激素依赖的肿瘤包括但不局限于结肠癌、心脏肿瘤、胰腺癌、黑素瘤、成视网膜细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、肠癌、睾丸癌、胃癌、神经胶质细胞瘤、粘液瘤、淋巴瘤、内皮瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、腺瘤、乳癌、前列腺癌、卡波济氏肉瘤和卵巢癌)：自身免疫紊乱(例如，多发性硬化、斯耶格伦综合症、突眼性甲状腺肿疾病、淋巴瘤性甲状腺肿、自身免疫性糖尿病、胆汁性肝硬变、贝赫切特综合症、局限性回肠炎、多发性肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关的肾小球肾炎(例如，增殖性肾小球肾炎)、自身免疫性胃炎、自身免疫血小板减少性紫癜、和类风湿性关节炎)和病毒感染(例如，单纯疱疹病毒、天花病毒和腺病毒)，炎症，移植宿主疾病(急性和/或慢性)，急性移植排斥和慢性移植排斥。在优选的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或拮抗剂被用于抑制癌症特别是上面列出的癌症的生长、进展和/或转移。
其它与增加的细胞存活相关的疾病或情形包括但不局限于恶性瘤的进展和/或转移以及相关的紊乱例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括成髓细胞，前髓细胞，骨髓单核细胞，单核细胞，和红白血病)和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞白血病))，真性红细胞增多，淋巴瘤(例如，霍奇森病和非霍奇森病)，多发性骨髓瘤，Waldenstrom’s巨球蛋白血症，重链病和实体瘤包括但不局限于肉瘤和癌症例如成纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因肿瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳癌，乳腺癌，囊腺癌，髓癌，支气管源性癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚癌，维尔姆斯瘤，子宫癌，肠癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，成神经管细胞瘤，颅喉管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，声学神经瘤，少突神经胶质瘤，menangioma，黑素瘤，神经胶质细胞瘤、和成视网膜细胞瘤。
与增加的凋亡相关的疾病包括AIDS；神经变性紊乱(例如阿尔茨海默病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，无色素性视网膜炎，小脑变性和脑瘤或前面相关的疾病)；自身免疫性紊乱(例如，多发性硬化、斯耶格伦综合症、突眼性甲状腺肿、淋巴瘤性甲状腺肿、自身免疫性糖尿病、胆汁性肝硬变、贝赫切特综合症、局限性回肠炎、多发性肌炎、系统性红斑狼疮和免疫相关的肾小球肾炎(例如，增殖性肾小球肾炎)、自身免疫性胃炎、血小板减少性紫癜、和类风湿性关节炎)；骨髓发育不良综合症(例如再生障碍性贫血)，移植宿主疾病(急性和/或慢性)，局部缺血性损伤(例如心脏局部缺血性损伤以及由心肌梗塞、中风和reperfusion引起的损伤)，肝损伤或疾病(例如，肝炎相关的肝损伤，肝硬变，局部缺血性/reperfusion损伤，胆固醇沉着和肝癌)；毒素诱生的肝疾病(例如由酒精引起的)，脓毒性休克，溃疡性结肠炎，恶病质和厌食。在优选的实施方案中，TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂被用于治疗或预防上面列出的这些疾病和紊乱。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗和/或预防肾小球肾炎。在另外的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗和/或预防慢性肾小球肾炎和/或细胞/组织损伤(例如，肾细胞死亡)和/或与这种疾病相关的医学状况。在另外一个非专用的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗和/或预防增生性肾小球肾炎和/或细胞/组织损伤(例如，肾细胞死亡)和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗或预防胆汁性肝硬变和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗或预防疾病，例如酒精肝疾病和/或与这种疾病相关的医学状况(例如肝硬变)。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗和/或预防移植宿主疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗(例如，减轻)或预防组织或细胞损伤或破坏(例如，与移植宿主疾病相关的淋巴细胞耗竭)和/或与这种疾病相关的医学状况。在另外一个非专用的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗(例如，减轻)和/或预防移植宿主疾病中的腹泻。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗和/或预防斯耶格伦综合症和/或减轻组织/细胞损伤或破坏(例如，唾液和/或泪组织的损伤或破坏)和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗和/或预防多发性硬化和/或减轻组织损伤或破坏(例如，神经学组织(例如中枢神经系统组织)的损伤或破坏)和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂，包括抗体或抗体片段被用于治疗和/或预防阿尔茨海默病和/或减轻组织损伤或破坏(例如，神经学组织或细胞的损伤或破坏)和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗，预防帕金森氏病和/或减轻组织损伤或破坏(例如，神经学组织或细胞的损伤或破坏，例如神经原细胞)和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于中风前、中风过程中、中风后立即和/或中风后治疗、预防或减轻细胞或组织的损伤(例如，神经学组织)和/或与中风相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗、预防或减轻局部缺血性损伤(例如，心脏局部缺血性损伤)和/或与局部缺血性损伤相关的医学状况。在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于心脏病前、心脏病过程中、心脏病后立即和/或心脏病后治疗、预防或减轻局部心脏缺血性损伤。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂被用于治疗或预防骨髓发育不良综合症(MDS)和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于增加患有血细胞减少，淋巴细胞减少和/或贫血的病人体内循环血细胞的数目。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗和/或预防淋巴瘤性甲状腺肿和/或减轻组织或细胞的损伤或破坏(例如，甲状腺)和/或治疗或预防与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗(例如，减轻)和/或预防自身免疫性胃炎和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽或激动剂被用于治疗和/或预防溃疡性结肠炎和/或细胞/组织损伤(例如，结肠中的溃疡)和/或与这种疾病相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗和/或预防类风湿性关节炎和/或与这种疾病相关的医学状况。
此外，许多癌症分泌能够结合Fas阳性T细胞并且杀死它们的FasL。任何能够分泌FasL的癌症因此可以作为本发明TBFR和TNFR激动剂治疗的靶。这样的癌症包括但不局限于恶性黑素瘤、白血病和淋巴瘤。
许多与HIV相关的病理过程也是由凋亡介导的，包括HIV诱导的糖尿病肾病和HIV脑炎。因此，在另外的优选的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂被用于治疗或预防与AIDS相关的病理过程。本发明的另一个实施方案旨在在HIV感染的病人体内应用TNFR-6α和/或TNFR-6β以减少Fas配体和AIM-II介导的细胞死亡。
描述AIDS的免疫缺陷状态与CD4+T淋巴细胞功能和数目的减少相比是次要的。最近的报道表明每天损失CD4+T淋巴细胞数目在3.5X107和2X109之间(Wei X.等，自然373：117-122(1995))。在HIV感染过程中CD4+T淋巴细胞耗竭的一个原因据认为是HIV诱导的凋亡(见，例如Meyaard等，科学257：217-219(1992)；Groux等，实验医学期刊175：331(1992)；和Oyaizu等，在HIV感染中的细胞激活和凋亡，Andrieu和Lu编，Plenum出版社，纽约，1995，第101-114页)。实际上，已经表明HIV诱导的细胞凋亡死亡不仅在体外发生而且在感染的个体内发生(Ameisen，J.C.，AIDS 8：1197-1213(1994)；Finkel，T.H.和Banda，N.K.，现代免疫学论点6：605-615(1995)；Muro-Cach0，C.A.等，免疫学期刊154-5555-5566(1995))。而且，在AIDS的各种不同动物模型中凋亡和CD4+T淋巴细胞耗竭是紧密相关的(Brunner，T等，自然373：441-444(1995)；Gougeon，M.L.等，AIDS研究和人类逆转录病毒9：553-563(1993))和，在病毒复制不导致AIDS的模型中未观测到凋亡(Gougeon，M.L.等，AIDS研究和人类逆转录病毒9：553-563(1993))。另外的数据表明来自于HIV感染个体的未感染的但是被起始或激活的T淋巴细胞在遭遇Fas配体后经历凋亡。使用在HIV感染后会导致细胞死亡的单核细胞系，已经表明用HIV感染U937细胞导致de novo Fas配体的表达和Fas配体介导的HIV诱导的凋亡(Badley，A.D.等，病毒学期刊70：199-206(1996))。而且，TNF家族配体在未感染的巨噬细胞中是可以检测到的并且它的表达在HIV感染后被上调，导致杀死未感染的CD4+T淋巴细胞(Badley，A.D.等，病毒学期刊70：199-206(1996))。而且，另外的研究也已经暗示HIV感染个体T细胞损失中的Fas介导的凋亡(Katsikis等，实验医学期刊181：2029-2036，1995)。
因此，本发明提供了一种HIV阳性个体的方法，此方法涉及施与本发明的TNFR和/或TNFR激动剂以减少对CD4 T淋巴细胞的选择性杀伤。在下文中详细讨论了施与的方式和剂量。
也有可能T细胞通过多种机制发生凋亡。另外在HIV患者中观察到至少一部分T细胞死亡是由AIM-II介导的。在不被理论束缚的情况下，据认为这种Fas配体和/或AIM-II介导T细胞死亡是通过称做激活-诱导的细胞死亡(AICD)的机制发生的。
一旦由CD3/T细胞受体复合物引发，激活的人T细胞被诱导经历程序性细胞死亡(凋亡)，这个过程被定义为激活-诱导的细胞死亡(AICD)。已经报道了从HIV无症状感染者体内分离出的CD4 T细胞的AICD(Groux等，supra)。因此，ACID可能在HIV感染者CD4+T淋巴细胞耗竭以及疾病进展为AIDS中具有重要作用。因此，本发明提供了一种在HIV感染者体内通过向患者施与本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽而抑制Fas配体介导的和/或AIM-II介导的T细胞死亡的方法。在一个实施方案中，当用TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽开始治疗时此患者是无症状的。如果需要的话，在治疗之前可以提取HIV患者的外周血T细胞，并且通过经典的方法测定其对Fas配体介导的和/或AIM-II介导的细胞死亡的易感性。在一个实施方案中，患者的血液或血浆在离体的情况下与TNFR-6α和/或TNFR-6β相互作用。TNFR-6α和/或TNFR-6β可以通过传统的方法结合到本领域已知的层析基质上。在返回病人体内之前，患者的血液或血浆流过基质上结合有本发明TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的层析柱。静止的TNFR-6α和/或TNFR-6β结合Fas配体和/或AIM-II，因此从患者的血液中去除了Fas配体和/或AIM-II蛋白。
在另外的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽可以与其它T细胞凋亡的抑制剂组合施与。例如，在HIV感染者中据认为至少有一部分所观察到的T细胞死亡是由TRAIL介导的(国际申请公开号WO 97/01663，引入本文做参考)。因此，例如易于经受Fas配体介导的和TRAIL介导的细胞死亡的患者可被用阻断TRAIL/TRAIL受体相互作用的试剂和阻断Fas配体/Fas相互作用的试剂一起治疗。能够和本发明的多核苷酸和或/多肽一起施与以阻断TRAIL与TRAIL受体结合的合适的试剂包括但不局限于可溶性TRAIL受体多肽(例如，OPG的可溶性形式，DR4(国际申请公开号WO 98/32856)；TR5(国际申请公开号WO 98/30693)；DR5(国际申请公开号WO 98/41629)；TR10(国际申请公开号WO98/54202))；可溶性TRAIL受体多肽的多聚体形式；和与TRAIL受体结合从而不传导导致凋亡的生物学信号的抗TRAIL受体的抗体；阻断TRAIL与一个或多个TRAIL受体结合的抗TRAIL抗体，和能结合TRAIL受体但不传导导致凋亡的生物学信号的TRAIL突变蛋白质。根据本发明实施的抗体优选为单克隆抗体。
能够和本发明的多核苷酸和多肽一起施与以阻断Fas配体和Fas结合的合适的试剂包括但不局限于可溶性Fas多肽；可溶性Fas多肽的多聚体形式(例如，sFas/Fc的二聚体)；与Fas结合从而不传导导致凋亡的生物学信号的抗Fas抗体；阻断Fas配体与Fas结合的抗Fas配体的抗体，和能结合Fas但不传导导致凋亡的生物学信号的Fas配体突变蛋白质。在国际申请公开号WO 95/10540中描述了阻断FasL/Fas相互作用包括阻断抗Fas单克隆抗体的合适的试剂的实施例，引入本文做参考。
能够和本发明的多核苷酸和/或多肽一起施与以阻断AIM-II与AIM-II受体结合的合适的试剂包括但不局限于可溶性AIM-II受体多肽(例如，TR2的可溶性形式(国际申请公开号WO 96/34095)；LT-β受体；和TR8(国际申请公开号WO 98/54201))；可溶性AIM-II受体多肽的多聚体形式；和与AIM-II受体结合从而不传导导致凋亡的生物学信号的抗AIM-II受体的抗体；阻断AIM-II与一个或多个AIM-II受体结合的抗AIM-II抗体，和能结合AIM-II受体但不传导导致凋亡的生物学信号的AIM-II突变蛋白质。根据本发明实施的抗体优选为单克隆抗体。
在同种移植排斥中，受体动物的免疫系统此前未被初始去应答，因为免疫系统的大部分仅被环境抗原所初始免疫。从相同物种动物的其它个体中得到的组织也未被以同样的方式，例如病毒和细菌被呈递的方式被呈递。在同种移植排斥的情况下，设计免疫抑制方案以阻止免疫系统到达效应阶段。但是，异体移植排斥的免疫分布比同种移植排斥更象疾病复发。在疾病复发的情况下，免疫系统已经被激活，其证据是破坏原始岛细胞。因此，在疾病复发中免疫系统已经处于效应期了。本发明的拮抗剂能够抑制对同种移植和异体移植的免疫应答，因为淋巴细胞激活和分化成的效应细胞将表达TNFR多肽，并且因此对增强TNFR活性的化合物很敏感。因此，本发明另外提供了制造免疫特权组织的方法。本发明的拮抗剂可被另外用于治疗炎性肠道疾病。
本发明的TNFR多核苷酸、多肽和激动剂可被用于抑制免疫应答。在一个实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和激动剂被用于将与移植相关的副反应降到最低。在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和激动剂被用于抑制Fas介导的免疫应答(例如，以一种与免疫抑制相似的方式，例如雷帕霉素或环胞菌素)。在另一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和激动剂被用于抑制AIM-II介导的免疫应答。
此外，移植排斥和移植宿主疾病部分是由凋亡引发的。因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂被用于治疗和预防和/或降低移植排斥。在另外的优选的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和激动剂被用于本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂被用于治疗和预防和/或降低移植宿主疾病。
此外，TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或激动剂可被用于治疗或预防移植排斥(例如，异体移植排斥和同种移植排斥(例如急性同种移植排斥))和/或与移植排斥相关的医学状况。在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或激动剂可被用于治疗或预防急性同种移植排斥和/或与急性同种移植排斥相关的医学状况。在另外的一个特定的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或激动剂可被用于治疗或预防肾急性同种移植排斥和/或与肾急性同种移植排斥相关的医学状况。
Fas配体是一种通过与Fas结合而诱导凋亡的II型膜蛋白。Fas配体由激活的T细胞所表达，并且作为细胞毒性淋巴细胞的效应器起作用。对Fas和Fas配体的分子遗传学分析表明鼠淋巴增生性突变(lpr)和普通的淋巴增生病(gld)是分别由Fas和Fas配体突变引起的。Gld鼠的lpr发展淋巴结病，并且患有自身免疫性疾病。根据这些表型研究和其它研究，据认为Fas系统涉及T细胞发育、特异性外周克隆耗竭或成熟T细胞激活诱导的自杀中的凋亡过程。除了激活的淋巴细胞之外，肝脏、心和肺中也表达Fas。已经表明向小鼠施与拮抗的抗Fas抗体可在肝脏中诱导凋亡并且很快杀死小鼠，造成肝损伤。这些发现表明Fas系统不仅在T淋巴细胞发育的正常生理过程中起重要作用，而且在细胞毒性T淋巴细胞介导的疾病例如暴发性肝炎和/或由于病毒感染或毒性试剂导致的肝炎中也起重要作用。正如文中所述，TNFR-6α和/或TNFR-6β结合Fas配体，因此作为Fas配体介导的活性的激动剂起作用。因此，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β和/或多核苷酸，和/或其激动剂可被用于治疗或预防淋巴增生性疾病(例如，淋巴结病和文中所述的其它疾病)，自身免疫性紊乱(例如，自身免疫性糖尿病，系统性红斑狼疮，突眼性甲状腺肿，淋巴瘤性甲状腺肿，和免疫相关的肾小球肾炎，自身免疫性胃炎，自身免疫血小板减少性紫癜，多发性硬化，类风湿性关节炎和文中所述的其它疾病)和/或肝病(例如，急性和/或慢性肝炎，和肝硬变)。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防肝炎和/或组织/细胞的损伤或破坏和/或与肝炎相关的医学状况。在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防暴发性肝炎和/或与暴发性肝炎相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防系统性红斑狼疮(SLE)和/或组织/细胞的损伤或破坏和/或与SLE相关的医学状况。在另外特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防SLE中的皮肤损伤。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防胰岛素依赖的糖尿病和/或组织/细胞的损伤或破坏和/或与胰岛素依赖的糖尿病相关的医学状况。在另外特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被在糖尿病发作前、过程中、发作以后立即用于降低或阻止对岛细胞的损伤和/或降低对外源胰岛素的需要。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防毒性表皮坏死松解(TEN)和/或组织/细胞的损伤或破坏和/或与TEN相关的医学状况。在另外特定的实施方案中，本发明的TNFR多核苷酸、多肽和/或激动剂或拮抗剂被用于治疗或阻止莱尔病综合症。
肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)是慢性肝病的主要病因。在肝炎感染中，根据肝脏炎症的严重程度肝细胞中Fas的表达被上调。当肝炎病毒特异性的T细胞进入肝细胞并且通过T细胞受体识别病毒抗原，它们会被激活并且表达能够将凋亡信号转导给携带有Fas的肝细胞。因此，Fas系统在由病毒性肝炎所导致的肝细胞损伤中起重要作用。因此，在特定的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和/或多核苷酸和/或其激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防由病毒感染导致的肝炎(例如，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的肝炎)。在一个实施方案中，患者的血液或血浆在离体的情况下与本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β相互作用。TNFR-6α和/或TNFR-6β可以通过传统的方法结合到本领域已知的层析基质上。在返回病人体内之前，患者的血液或血浆流过基质上结合有本发明TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的层析柱。静止的TNFR-6α和/或TNFR-6β结合Fas配体，因此从患者的血液中去除了Fas配体。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和/或多核苷酸和/或其激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防肾衰竭(例如，慢性肾衰竭)和/或组织/细胞的损伤或破坏(例如，管状上皮细胞耗竭)和/或与肾衰竭相关的医学状况。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或本发明的激动剂或拮抗剂被用于调控(即，刺激或抑制)骨生长。在特定的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或本发明的激动剂或拮抗剂被用于刺激骨生长。特异的可被本发明组合物治疗和预防的疾病或状况包括但不局限于骨折和缺陷，以及导致骨虚弱的紊乱例如骨质疏松，骨软化病和年龄相关的骨质损失。
本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽或编码TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的多核苷酸和/或其激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防心血管紊乱包括外周主动脉病例如四肢局部缺血。
心血管紊乱包括心血管异常，例如，动脉瘘，动静脉瘘，脑动静脉畸形，肺闭锁，和短弯刀形综合症。先天性心脏缺陷包括主动脉缩窄，cor triatriatum，冠状血管异常，十字形心脏，右位心，动脉导管开放，埃伯斯坦异常，艾森门格尔复合征，左心发育不良综合症，坐位心，沉降灰四联症，大血管错位，右心室双出口，三尖瓣闭锁，持续性动脉躯干，和心间隔不全，例如主动脉与肺动脉间的间隔不全，心内膜sushion不全，鲁藤巴赫综合症，沉降灰三联症，心室间隔不全。
心血管紊乱也包括心脏疾病例如动脉粥样硬化，心律失常，类癌心脏病，高心输出量，低心输出量，心压塞，心内膜炎(包括细菌性的)，心脏动脉瘤，心动停止，充血性心力衰竭(例如，慢性充血性心力衰竭)，充血性心脏病，阵发性呼吸困难，心水肿，心脏肥大，充血性心脏病，左心室肥大，右心室肥大，心肌梗死后心脏破裂，心室间隔破裂，心瓣膜疾病，心肌病，心肌局部缺血，心包渗漏，心包炎(包括狭窄性和结核性)，气心包，心包切开术后综合症，肺纤维化，肺心病，风湿性心脏病，心室功能障碍，充血，妊娠期心血管并发症，短弯刀形综合症，心血管梅毒和心血管结核。
在一个特定的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽或本发明的激动剂被用于治疗和/或预防慢性充血性心力衰竭和/或与慢性充血性心力衰竭相关的医学状况。
在另一个特定的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽或本发明上午激动剂被用于治疗和/或预防肺损伤或疾病(例如，肺纤维化和慢性阻塞性肺病，如肺气肿和慢性支气管炎)和/或组织/细胞的损伤或破坏(例如，牙槽壁和或支气管性牙槽壁)和/或与肺损伤或疾病相关的医学状况。
心律失常包括窦性心律失常，心房纤维性颤动，心房扑动，心动过缓，期外收缩，心源性脑缺氧综合症，bundle-branch综合症，窦房阻塞，long QT综合症，平行收缩，朗-甘-莱综合症，Mahaim样兴奋过早综合症，午非-帕金森-怀特综合症，患病心房综合症，心动过速，和心室纤维性颤动。心动过速包括阵发性心动过速，室上心动过速，心室自身节律加快，房室结折返心动过速，心房异位心动过速，结合异位心动过速，窦房结折返心动过速，Torsades dePointes，和心室性心动过速。
心脏瓣膜疾病包括主动脉瓣膜不全，主动脉瓣膜狭窄，听觉杂音，主动脉瓣膜脱垂，左房室瓣膜脱垂，三尖瓣瓣膜脱垂，左房室瓣膜不全，左房室瓣膜狭窄，肺闭锁，肺瓣膜不全，肺瓣膜狭窄，三尖瓣闭锁，三尖瓣瓣膜不全，和三尖瓣瓣膜狭窄。
心肌病包括酒精性心脏病，充血性心脏病，肥大性心脏病，主动脉亚瓣不全，肺亚瓣狭窄，限制性心脏病，恰加斯心脏病，心内膜弹性组织纤维增生，心内膜心肌纤维化，克氏综合症，心肌再灌注，和心肌炎。
心肌局部缺血包括冠心病，例如心绞痛，冠状动脉瘤，冠状动脉硬化，冠状动脉血栓形成，冠状动脉血管痉挛，心肌梗塞和心肌功能丧失。
心血管疾病也包括血管疾病例如血管痉挛，血管发育异常，多发性血管瘤，杆状血管瘤，希佩尔-林道疾病，克-特-韦综合症，斯特奇-韦伯综合症，血管神经水肿，主动脉疾病，Takayasu’s Arteritis，主动脉炎，外伤后骨质疏松，动脉堵塞疾病，动脉炎，内动脉炎，结节性多动脉炎，脑血管紊乱，糖尿病血管病，糖尿病视网膜病，栓塞，血栓形成，红斑性肢痛病，痔，肝静脉堵塞，高血压，低血压，局部缺血，外周血管疾病，静脉炎，肺静脉堵塞，雷诺病，CREST综合症，视网膜静脉堵塞，短弯刀综合症，superior vena cava综合症，毛细血管扩张，atacia telangiectasia，遗传性出血性毛细血管扩张，精索静脉曲张，静脉曲张，静脉曲张溃疡，脉管炎和静脉不全。
血管痉挛包括解剖性血管痉挛，假血管痉挛，感染性血管痉挛，破裂性血管痉挛，主动脉血管痉挛，脑血管痉挛，冠状动脉血管痉挛，心血管痉挛，和髋血管痉挛。
动脉堵塞疾病包括动脉硬化，间歇性跛行，颈动脉狭窄，肌纤维性发育不良，肠系膜血管堵塞，莫雅病，肾动脉堵塞，视网膜动脉堵塞，和闭塞性血栓血管炎。
脑血管紊乱包括颈动脉血管病，淀粉样脑血管病，脑血管痉挛，脑缺氧，大脑动脉硬化，脑动静脉畸形，脑动脉病，脑栓塞和血栓形成，颈动脉血栓形成，窦性血栓形成，瓦伦贝格综合症，脑出血，硬膜外血肿，硬膜下血肿，蛛网膜下血肿，脑梗塞，脑缺血(包括瞬间缺血)，锁骨下窃血综合症，室周白斑软化，血管性头痛，集束性头痛，偏头痛，和脊椎基底动脉不全。
栓塞包括空气栓赛，羊水栓塞，胆固醇栓塞，钝趾综合症，脂肪栓塞，肺栓塞，和血栓栓塞。血栓形成包括冠状动脉血栓形成，肝静脉血栓形成，视网膜静脉血栓形成，颈动脉血栓形成，窦性血栓形成，瓦伦贝格综合症，和血栓性静脉炎。
局部缺血包括脑局部缺血，局部缺血性结肠炎，隔室综合症，前隔室综合症，心肌局部缺血，再灌注损伤，和外周肢体局部缺血。脉管炎包括主动脉炎，动脉炎，贝赫切特综合症，丘-施综合症，粘膜皮肤淋巴结综合症，闭锁性血栓血管炎，超敏性脉管炎，舍恩莱茵-亨诺紫癜，皮肤过敏性脉管炎，和韦格纳肉芽肿病。
在一个实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或本发明的激动剂或拮抗剂被用于治疗或预防血栓形成性微血管病。一种这样的紊乱的例子是血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)(Kwaan，H.C.，Semin.Hematol.24：71(1987)；Thompson等，血液80：1890(1992))。美国疾病控制中心已经报道与TTP相关的死亡率一直在增加(Torok等，美国血液学期刊50：84(1995))。采集自患有TTP的病人(包括HIV阳性病人和HIV阴性病人)的血浆诱导皮肤微血管起源的而不是大血管起源的内皮细胞凋亡(Laurence等，血液87：3245(1996))。因此，据认为TTP病人的血浆含有一种或多种能够直接或间接诱导凋亡的因子。已经表明一种抗Fas阻断抗体能够降低TTP血浆介导的微血管内皮细胞的凋亡(Laurence等，血液87：3245(1996)；引入本文做参考)。因此，存在于TTP病人血清中的Fas配体可能在诱导微血管内皮细胞的凋亡中起重要作用。另外一种血栓形成性微血管病是溶血性尿毒性综合症(HUS)(Moake，J.L.，柳叶刀343：393(1994)；Melnyk等，国际医学档案155：2077(1995)；Thompson等，supra)。因此，在一个实施方案中，本发明旨在使用TNFR-6α和/或TNFR-6β治疗或预防经常被称做“成人HUS”的情形(尽管它也在儿童中发作)。称为儿童/腹泻相关的HUS的紊乱在病因学上与成人HUS不同。在另一个实施方案中，以小血管凝结成块为特征的疾病状况可被使用本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和/或多核苷酸所治疗。这样的疾病状况包括但是不局限于在本文中所描述的那些情形。例如，在大约5-10％的儿童AIDS患者中观察到的心脏问题据认为与小血管凝块有关。已有报道称在多发性硬化患者的心脏中存在微血管系统的崩溃。作为一个另外的实施例，我们设想去治疗系统性红斑狼疮(SLE)。在一个实施方案中，患者的血液或血浆在离体的情况下与TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽相互作用。TNFR-6α和/或TNFR-6β可以通过传统的方法结合到本领域已知的合适的层析基质上。在返回病人体内之前，根据本实施方案患者的血液或血浆流过基质上结合有本发明TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的层析柱。静止的TNFR-6α和/或TNFR-6β结合Fas配体和/或AIM-II，因此从患者的血液中去除了Fas配体蛋白。另外，TNFR-6α和/或TNFR-6β可被体内施与血栓形成性微血管病患者。在一个实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸或多肽被施与到患者体内。因此，本发明提供了一种治疗血栓形成性微血管病的方法，此方法涉及使用有效剂量的本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽。TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽可被用于体内或离体方法中以抑制Fas配体介导的和/或AIM-II介导的对微血管内皮细胞的损伤(例如，凋亡)。
本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和多核苷酸可以与其它在治疗特定紊乱中有用的试剂组合应用。例如，在一个由Laurence等报道的体外研究中(血液87：3245(1996))，通过使用抗Fas阻断抗体、aurintricarboxylic acid或去除冷沉淀物的正常血浆获得了对TTP血浆介导的对微血管内皮细胞凋亡的降低。因此，可组合使用另外的能够抑制Fas配体介导的内皮细胞凋亡的试剂例如上述试剂对患者进行治疗。在一个实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽和一种抗Fas阻断抗体被施与到患有以血栓形成性微血管病为特征的紊乱例如TTP或HUS的患者体内。在国际申请公开号WO95/10540中描述了抗Fas抗原(CD95)的阻断单克隆抗体的实施例。
在天然发生的内源性刺激因素与血管生成的抑制之间的平衡中抑制性影响占主导地位。Rastinejad等，细胞56：345-355(1989)。在正常生理条件下发生新血管生成的那些稀有情形有例如伤口愈合、器官再生、胚胎发育以及雌性生殖过程，血管生成是受到严格控制的，只有在一定的空间或时间才会去除限制。在以实体瘤生长为特征的生理性血管生成的情形下，这些调节控制失去效力。不受调控的血管生成是病理性的，并且维持许多瘤形成性或非瘤形成性疾病的进展。许多严重的疾病受新血管生成所控制例如实体瘤生长和转移、关节炎、一些类型的眼睛疾病和牛皮癣。见，例如Moses等的综述，生物技术9：630-634(1991)；Folkman等，新英格兰医学期刊333：1757-1763(1995)；Auerbach等，微血管研究期刊29：401-411(1985)；Folkman，癌症研究进展，Klein和Weinhouse编，学院出版社，纽约，175-203页(1985)；Pat，美国血液学期刊94.715-743(1982)；和Folkman等，科学221：719-725(1983)。在许多病理情况下，血管生成的过程对疾病的状态贡献很大。例如，已经积聚起来的大量的数据表明实体瘤的生长依赖于血管生成。Folkman和Klagsbrun，科学235：442-447(1987)。
本发明提供了通过施与本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸和/或多肽而治疗与新血管生成有关的疾病和紊乱的方法。可被本发明的多核苷酸和多肽治疗的恶性或转移的疾病情形包括但是不局限于恶性瘤、实体瘤和文中所述的癌症以及本领域所已知的其它疾病(对于这些疾病的综述，见Fishman等，医学第二版，J.B.Lippincott公司出版，费城(1985))。
可被本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸和多肽(包括本发明的激动剂和/或拮抗剂)治疗的与新血管生成相关的的眼部疾病包括但是不局限于：新血管性青光眼，糖尿病视网膜病，成视网膜细胞瘤，晶体状后纤维组织形成，眼色素层炎，早熟斑点变性视网膜病，角膜移植新血管形成，以及其它眼睛炎症疾病、眼部肿瘤或与脉络膜或虹膜新血管形成相关的疾病。见，例如，Waltman等的综述，美国眼科学期刊85：704-710(1978)和Gartner等，眼睛外科22：291-312(1978)。
在另一个实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽、多核苷酸和/或本发明的激动剂或拮抗剂被用于刺激图象受体细胞的分化和/或存活和/或治疗或预防与图象受体细胞的数目减少、分化和/或存活相关的疾病、紊乱或情形。
此外，可被本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸和多肽(包括TNFR激动剂和/或拮抗剂)治疗的紊乱包括但是不局限于血管瘤，关节炎，牛皮癣，血管纤维瘤，粥样硬化斑，延迟的伤口愈合，肉芽发生，嗜血性关节，肥大性斑痕，不结合骨折，奥斯勒-韦伯综合症，化脓性肉芽肿，硬皮病，沙眼，和血管粘附。
在另外的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽和/或其它本发明的组合物(例如，抗TNFR-6α和/或抗TNFR-6β抗体)被用于治疗或预防与过敏和/或炎症相关的疾病或情形。
在一个特定的实施方案中，TNFR多核苷酸、多肽和/或其激动剂或拮抗剂可被用于治疗或预防甲状腺相关的眼睛疾病和/或组织/细胞损伤或破坏，和/或与甲状腺相关的眼睛疾病相关的疾病情形。
在一个特定的实施方案中，TNFR多核苷酸、多肽或本发明的激动剂被用于通过抑制或降低对转基因表达细胞的清除而延长基因治疗后的蛋白表达。
在另外的实施方案中，本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽和/或其激动剂或拮抗剂被用于促进伤口愈合。
本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸、多肽和/或其激动剂或拮抗剂在诊断和治疗或预防广泛范围的疾病和/或情形中是非常有用的。这样的疾病和情形包括但不局限于癌症(例如免疫细胞相关的癌症、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、滤泡淋巴瘤、p53突变或改变相关的癌症、脑瘤、膀胱癌、子宫宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、胃癌等)；淋巴增生性紊乱(例如，淋巴结病)；微生物(例如，病毒、细菌等)感染(例如，HIV-1感染，HIV-2感染，疱疹病毒感染(包括但不局限于HSV-1，HSV-2，CMV，VZV，HHV-6，HHV-7，EBV)，腺病毒感染，天花病毒感染，人乳头瘤病毒感染，肝炎病毒感染(例如，HAV，HBV，HCV等)，幽门螺旋菌感染，侵袭性葡萄球菌等)，寄生虫感染，肾炎，骨疾病(例如，骨质疏松)，动脉粥样硬化，疼痛，心血管紊乱(例如，新血管生成，血管生成减少或循环降低(例如，局部缺血疾病(例如，心肌梗塞，中风等)))，AIDS，过敏，炎症，神经变性疾病(例如，阿尔茨海默疾病，帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，色素性视网膜炎，小脑退化等)，移植排斥(急性和慢性)，移植宿主疾病，由于骨髓发育不良导致的疾病(例如，再生障碍性贫血)，风湿病中的关节组织破坏，肝病(例如，急性和慢性肝炎，肝损伤和肝硬变)，自身免疫性疾病(例如，多发性硬化，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，免疫复合物肾小球肾炎，自身免疫性糖尿病，自身免疫血小板减少紫癜，突眼性甲状腺肿，淋巴瘤性甲状腺肿等)，心脏病(例如，扩张性心脏病)，糖尿病，糖尿病并发症(例如，糖尿病性肾病，糖尿病性神经病，糖尿病性视网膜病)，流感，哮喘，牛皮癣，肾炎，脓毒性休克，和溃疡性结肠炎。
本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂在促进血管生成、调节血细胞生成和伤口愈合(例如，创伤，烧伤和骨折)中是非常有用的。
本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂和/或拮抗剂也可用做佐剂以增强针对特异性抗原的免疫应答以及抗病毒应答。
更为普遍的是，本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂或拮抗剂在调节免疫系统(例如，升高或降低)中非常有用。例如，本发明的多核苷酸和/或多肽可被用于外科手术、创伤、放疗、化疗和移植的准备和恢复，或可被用于加强免疫应答和/或老年人和免疫妥协的病人恢复。另外，本发明的多核苷酸和/或多肽和/或其激动剂或拮抗剂可被用做免疫抑制剂，例如在治疗或预防自身免疫性紊乱中。在特定的实施方案中，本发明的多核苷酸和/或多肽被用于治疗或预防慢性炎症、过敏或自身免疫病，例如文中所述的疾病或本领域已知的其它疾病。
在一个方面，本发明涉及一种促进由TNF家族配体诱导的凋亡的方法，此方法涉及向患者(优选人)施与一种TNFR拮抗剂(例如，一种抗TNFR抗体或TNFR多肽片段)。此TNFR拮抗剂优选被施与治疗显示出增加的细胞存活的疾病或情形。本发明的拮抗剂包括TNFR多肽的可溶性形式和抗TNFR多肽的单克隆抗体。
“拮抗剂”是指能够增强或强化凋亡的天然或人工合成的化合物。“激动剂”是指能够抑制凋亡的天然或人工合成的化合物。本发明的任何一种“激动剂”或“拮抗剂”是否能够抑制或增强凋亡可通过本领域已知的TNF家族配体/受体细胞应答分析包括将要在下面详细描述的那些方法所确定。
一种这样的筛选方法涉及应用已经被转染表达本发明受体的黑素细胞。在1992年2月6日出版的国际申请公开号WO 92/01810中描述了这样的筛选技术。这样的方法可被用于例如通过将编码本发明受体的黑素细胞与TNF家族配体和候选拮抗剂(或激动剂)相互作用从而筛选能够抑制(或增强)本发明受体多肽激活的化合物。抑制或增强由配体所产生的信号预示着此化合物是配体/受体信号途径的一种拮抗剂或激动剂。
其它的筛选技术包括在一个测定由受体激活引起的细胞外pH变化的系统中使用能够表达受体的细胞(例如，转染的CHO细胞)，例如，如同在自然246：181-296(1989年10月)中所描述的。例如，化合物可与表达本发明受体多肽的细胞相互作用以及测定第二信使应答，例如信号传导或pH改变，以确定此潜在的化合物是否激活或抑制受体。
另一个这样的筛选技术涉及将编码受体的RNA导入非洲爪蟾卵母细胞瞬时表达受体。然后将受体卵母细胞与受体配体以及待筛选的化合物相互作用，在筛选被认为抑制受体激活的化合物的情况下检测钙信号的抑制或激活。
另一种筛选技术涉及在细胞中表达一种构建物，其中受体与磷脂酶C或D连接。这样的细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞、胚肾细胞等。如同上文所述，筛选可以通过从磷脂酶信号中检测受体的激活或者抑制受体的激活来完成。
另一种方法涉及通过测定标记的配体与表面带有受体的细胞的结合的抑制来筛选能够抑制本发明受体多肽激活的化合物拮抗剂。这样的方法包括使用编码受体的DNA转染真核细胞以使得细胞在其表面表达受体，然后在存在已知配体标记形式的条件下将此细胞与化合物作用。配体可被例如放射活性所标记。然后测定与受体结合的标记的配体的数量，例如通过测定受体的放射活性。如同所测的，如果化合物通过降低可与受体结合的标记的配体而与受体结合，那么标记的配体对受体是抑制的。
另外的筛选本发明激动剂和拮抗剂的方法见Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.，生命的化学期刊267(7)：4304-4307(1992)。
因此，在另一方面，本发明提供了一种用于确定候选激动剂或拮抗剂是否能够增强或抑制针对TNF家族配体的细胞应答的筛选方法。此方法包含将表达TNFR多肽的细胞与一种候选化合物以及TNF家族配体作用，分析细胞应答，并且将此细胞应答与标准的细胞应答进行比较，标准应答是在不存在候选化合物的情况下与配体作用而测得的，与标准应答相比升高的细胞应答表明候选化合物是配体/受体信号途径的激动剂，与标准应答相比降低的细胞应答表明候选化合物是配体/受体信号途径的拮抗剂。“分析细胞应答”意思是指定性或定量测定针对候选化合物和/或TNF家族配体的细胞应答(例如，测定或检测T细胞增殖或3H标记的胸苷升高或降低)。通过本发明，表达TNFR多肽的细胞可与内源性或外源性施与的TNF家族配体作用。
本发明的激动剂包括天然的和人工合成的化合物，例如TNF家族配体肽片段、转化生长因子、神经递质(如谷氨酰胺，多巴胺，N-甲基-D-天冬氨酸)、肿瘤抑制剂(p53)、溶细胞T细胞和抗代谢物。优选的激动剂包括化疗药物例如顺铂、dexorubicin、博来霉素、阿糖胞苷、氮芥类、甲氨喋呤和长春新碱。其他包括乙醇和淀粉肽(科学267：1457-1458(1995))。另外的优选的激动剂包括抗TNFR多肽的多克隆和单克隆抗体或其片段。在Tartaglia，LA.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9292-9296(1991)；和Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.，生命的化学期刊267(7)：4304-4307(1992)中描述了这样的抗TNF家族受体的抗体激动剂，也见国际申请公开号WO94/09137。
本发明的拮抗剂包括天然的和人工合成的化合物，例如CD40配体、中性氨基酸、锌、雌激素、雄激素、病毒基因(如腺病毒的ELB基因，杆状病毒的p35和IAP基因，牛痘病毒的crmA基因，EB病毒的BHRF1、LMP-1基因，非洲猪瘟病毒的LMW5-HL基因以及疱疹病毒的y134.5基因)，calpain抑制剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂以及肿瘤启动子(如PMA，苯巴比妥，六氯化苯)。其它的拮抗剂包括抗TNFR多肽的多克隆和单克隆拮抗剂抗体或其片段。在Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.，生命的化学期刊267(7)：4304-4307(1992)；和Tartaglia，L.A.等，细胞73：213-216(1993)中描述了这样的抗TNF家族受体的拮抗剂抗体，也见国际申请公开号WO94/09137。
在特定的实施方案中，本发明的拮抗剂是对应于TNFR所含的序列或其互补链，和/或对应于保藏的克隆(ATCC保藏号97810和97809)中所含的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，反义链是由有机体内在产生的，在另一个实施方案中，反义链是单独施与的(见，例如O’Connor，J.，神经化学56：560(1991)；和寡聚脱氧核苷酸作为基因治疗的反义抑制剂，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达(1988))。反义技术可被用于通过反义DNA或RNA，或通过三螺旋形成控制基因表达。在Okano，J，神经化学56：560(1991)；和寡聚脱氧核苷酸作为基因治疗的反义抑制剂，CRC出版社，BocaRaton，佛罗里达(1988)中描述了反义技术。在例如Lee等，核酸研究6：3073(1979)；Cooney等，科学241：456(1988)；和Dervan等，科学251：1300(1991)中描述了三螺旋形成。这些方法都是基于多核苷酸与其互补的DNA或RNA结合的基础之上的。
例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸的5’端编码部分可被用于设计一段大约10到40个碱基对长度的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸是根据与基因转录区互补的原理而设计的，因此阻止了转录和受体的产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并且因此阻断了mRNA分子翻译为受体多肽。
在一个实施方案中，本发明的TNFR反义核酸是通过外源序列的转录而在细胞内产生的。例如，一个载体或其部分被转录，从而产生了本发明的反义核酸(RNA)。这样的载体必须含有编码TNFR反义核酸的序列。这样的载体可以是附加体的形式或整合在染色体中，只要它能够被转录产生目的反义RNA。这样的载体可通过本领域标准的重组DNA技术被构建。载体可以是用于脊椎动物细胞复制和表达的质粒、病毒或并领域已知的其它载体。TNFR编码序列或其片段可以通过任何本领域已知的可在脊椎动物优选人细胞中起作用的启动子起始表达。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。这样的启动子包括但不局限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，自然29：304-310(1981))，劳氏肉瘤病毒3’端长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等，细胞22：787-797(1980))，疱疹胸苷启动子(Wagner等，Proc Natl Acad Sci USA 78：1441-1445(1981))，金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，自然296：39-42(1982))等。
本发明的反义核酸包含一段与TNFR基因RNA转录本的至少一部分互补的序列。但是，不要求绝对互补，尽管优选绝对互补。与“RNA的至少一部分互补的”序列在文中意思是指具有足够的互补性以致于可与RNA杂交形成稳定的双链形式的序列；在双链TNFR反义核酸的情况下，必须测定双链DNA的一条单链，或可能分析三链形成。杂交的能力取决于互补的程度以及反义核酸的程度。通常情况下，核酸序列越长，其所含的与TNFR RNA不配对的碱基越多，但仍然形成稳定的双螺旋形式(或可能形成三链形式)。本领域熟练技术人员可以通过使用标准技术测定杂交复合体的熔点来确定对错配的耐受程度。
与信使5’末端互补的寡核苷酸，例如从5’端向上并且包括AUG起始密码子的非翻译序列，必须有效地翻译。但是，已经表明与mRNAs 3’末端非翻译序列互补的序列在抑制mRNAs的翻译中同样有效。见Wagner，R.，自然372：333-335(1994)。因此，与图1和2中所示的TNFR的5’端或3’端不翻译的非编码区互补的寡核苷酸可被用于反义方法中抑制内源性TNFR mRNA的翻译。与mRNA 5’端非翻译区互补的寡核苷酸必须包括完整的AUG起始密码子。与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸在抑制翻译中效率较差但根据本发明同样可被使用。无论是否设计为与TNFR mRNA的5’端或3’端或编码区杂交，反义核酸在长度上应该至少由6个核苷酸组成，优选寡核苷酸的长度范围在6个到50个核苷酸之间。在特定的方面，寡核苷酸至少由10个核苷酸，至少由17个核苷酸，至少由25个核苷酸，或至少由50个核苷酸组成。
本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或其修饰的分子部分，可以是单链或双链的。寡核苷酸可以在碱基分子、糖分子或磷酸骨架上被修饰例如以增加分子的稳定性、杂交等。寡核苷酸也可包括其它附属基团例如肽(例如，用于体内定向至宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的试剂(见Letsinger等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556(1989)；Lemaitre等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652(1987)；出版于1988年12月15日的PCT出版号WO 88/09810)或血脑屏障(见，例如出版于1988年4月25日的PCT出版号WO 89/10134)，杂交引发的裂解试剂(见，例如Krol等，生物技术6：958-976(1988))或插入试剂(见，例如Zon，药物研究5：539-549(1988))。为此目的，寡核苷酸可结合至另一个分子上例如肽、杂交引发交联试剂、转运试剂、杂交引发裂解试剂等。
反义寡核苷酸可以包括至少一个修饰的碱基分子，此碱基分子选自下组包括但不局限于：5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-羧羟甲基尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，beta-D-galactosylqueosine，肌苷，N6异戊烯腺苷酸，1-甲基鸟苷酸，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟苷酸，2-甲基腺苷酸，2-甲基鸟苷酸，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺苷酸，7-甲基鸟苷酸，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲基氨基甲基-2-硫氧嘧啶，beta-D-mannosylqueosine，5-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-硫甲基-N6-异戊烯腺苷酸，尿嘧啶-5-羟乙酸，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯，尿嘧啶-5-羟乙酸，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。
反义寡核苷酸可以包括至少一个修饰的糖基分子，此糖基分子选自以下组，包括但不局限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木聚糖，和己糖。
在另一个实施方案中，反义寡核苷酸包括至少一个修饰的磷酸骨架，此磷酸骨架选自以下组，包括但不局限于硫代磷酸，二硫代磷酸，二硫代磷酸酰胺化物(phosphoramidothioate)，磷酸酰胺化物(phosphoramidate)，磷酸二酰胺化物(phosphordiamidate)，甲基磷酸盐，碱性磷酸三酯，和缩醛形式或其类似物。
在另一个实施方案中，反义寡核苷酸是α-异构寡核苷酸。α-异构寡核苷酸与互补的RNA形成特定双链结构的杂交体，其中与普通的β单位不同，两条链是平行的(见Gautier等，核酸研究15：6625-6641(1987))。此寡核苷酸是2φ-0-甲基核糖核苷酸(Inoue等，核酸研究15：6131-6148(1987))，或一种嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等，FEBS lett 215：327-330(1987))。
本发明的多核苷酸也可以是通过本领域已知的方法合成的，例如通过使用自动DNA合成仪(例如Biosearch应用生物系统公司的商品)。例如，可以通过Stein等(核酸研究16：3209(1988))的方法合成硫代磷酸寡核苷酸，通过使用受控制的带孔玻璃多聚体支持物制备甲基磷酸盐(Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：7448-7451(1988))等。
尽管可以使用与TNFR编码区序列互补的反义核苷酸，但是与转录的未翻译区互补的反义核苷酸是最优选的。
本发明可能的拮抗剂还包括催化RNA，或核酶(见，例如出版于1990年10月4日的国际申请公开号WO 90/11364；Sarver等，科学247：1222-1225(1990))。虽然在位点特异性识别序列切割mRNA的核酶可被用于破坏TNFR的mRNAs，但优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在与目的mRNA形成互补碱基配对的侧翼区位置切割mRNAs。唯一的要求是目的mRNA带有下列两个碱基的序列：5’-UG-3’。锤头状核酶的结构和生产是本领域众所周知的，在Haseloff和Gerlach，自然334：585-591(1988)中具有更详细的描述。在TNFR-6α(图1，SEQ ID NO：1)和TNFR-6β(图2，SEQ ID NO：3)的核苷酸序列中有许多潜在的锤头状核酶裂解位点。优选的情况是，对核酶进行改造以使得切割识别位点位于TNFR mRNA的5’末端，即增加效率并且减少非功能性mRNA转录本在细胞外的积累。
如同在反义方法中，本发明的核酶可由修饰的寡核苷酸(例如，为增加稳定性、靶定向等)组成并且应该在体内被运送给表达TNFR的细胞。编码核酶的DNA构建物可以使用与上述的用于导入反义编码DNA的方法相同的方式被导入到细胞中。一种优选的运送方法包含在强组成型启动子例如polIII或polII启动子的控制之下使用“编码”核酶的DNA构建物，转染细胞将表达足够数量的核酶去破坏内源性TNFR信使和抑制翻译。由于核酶不同于反义分子，它是具有催化性的，所以对于效率来说仅需要较低的细胞内浓度。
通过使用靶向同源重组的方法“敲除”TNFR基因和/或其启动子，或使之失活也可以降低内源性基因的表达(例如，见Smithies等，自然317：230-234(1985)；Thomas & Capecchi，细胞51：503-512(1987)：Thompson等，细胞5：313-321(1989)；以上文献全文引入本文做参考)。例如，本发明的一种突变的非功能性的并且基因侧翼DNA序列与内源性多核苷酸序列(编码序列或基因的调控区)同源的多核苷酸(或完全无关的DNA序列)在带有或不带有选择标记和/或阴性选择标记的情况下可被用于体内转染表达本发明多肽的细胞。在另一个实施方案中，本领域已知的技术可被用于在含有目的基因但是不表达此基因的细胞内以制造基因敲除。通过靶向同源重组插入DNA构建物导致靶基因的失活。这样的方法特别适用于研究领域和农业领域，其中对胚胎干细胞的修饰可被用于生产带有失活的靶基因的动物后代(例如，见Thomas & Capecchi 1987和Thompson 1988，supra)。但是此方法可被常规采纳用于人体中，只要通过使用本领域熟练技术人员熟悉的合适的病毒载体将重组DNA构建物体内直接施与或定向至所要求的位点。本段所引用的参考文献全文引入本文做参考。
本发明的抗体可以通过使用任何一种标准方法以本发明TNFR作为免疫原而制备。这样的TNFR免疫原包括在图1和图2(分别是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4)中所示的TNFR蛋白(可能包括或不包括前导序列)和包含TNFR配体结合区和/或胞外区的TNFR多肽片段。
本发明的多克隆和单克隆抗体激动剂或拮抗剂可根据文中所述的许多不同方法中的任何一种方法和/或本领域已知的方法制备，例如，在Tartaglia，L.A.和Goeddel，D.V.，生命的化学期刊267(7)：4304-4307(1992)；和Tartaglia，L.A.等，细胞73：213-216(1993)以及国际申请公开号WO 94/09137中所描述的方法(本段所引用的参考文献全文引入本文做参考)，并且对本发明多肽特异的抗体优选具有SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。本发明的抗体可根据文中所述的许多不同方法中的任何一种方法和/或本领域已知的方法制备。
本发明另外的拮抗剂包括TNFR的可溶性形式，例如包含从全长受体的胞外区开始的配体结合区的TNFR片段。受体的这些天然或合成的可溶性形式通过与细胞表面TNFR竞争性结合TNF家族配体而拮抗TNFR介导的信号传导和/或拮抗TNFR介导的对凋亡的抑制，例如，通过破坏TNFR形成多聚体的能力或结合的能力并且籍此中和诱发凋亡的配体如Fas配体和/或AIM-II。因此，包括配体结合区的受体的可溶性形式是能够降低由TNFR介导的抑制TNF家族配体介导的肿瘤坏死的新型细胞因子。其它这样的细胞因子是本领域已知的并且包括生理性限制由Fas配体介导的凋亡的FasB(鼠Fas受体的一种可溶性形式)(Hughes，D.P.和Crispe，I.N.，实验医学期刊182：1395-1401(1995))。
与胞外区结合的蛋白质和其它化合物也是本发明候选的激动剂和拮抗剂。这样的结合化合物可以通过使用酵母双杂交系统来“捕获”(Fields和Song，自然 340：245-246(1989))。Roger Brent及其同事描述了修饰的酵母双杂交系统(Gyuris，J等，细胞75：791-803(1993)；Zervos，A.S.等，细胞72：223-232(1993))。
“TNF家族配体”意思是指能够与TNFR受体家族的成员结合并且诱发配体/受体信号传导途径的天然的、重组的或合成的配体。TNF配体家族的成员包括但是不局限于TNFR-6α和TNFR-6β配体，TNF-α，淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)，LT-β，FasL，CD40，CD27，CD30，4-1BB，OX40，TRAIL，AIM-II，神经生长因子(NGF)。配方和施与方式
考虑到每个患者的临床状况(特别是单独用TNFR-6α或TNFR-6β多肽治疗的副反应)、TNFR多肽组合物的运送位置、施与方式、免疫计划以及实施者已知的其它因素，TNFR多肽组合物将以与良好的医疗实践相同的方式被配制或给药。用于本文的TNFR多肽的“有效量”意思是在这些考虑的基础上做出的。
作为一个普通建议，通过肠道外途径施与的TNFR多肽的每次服药的总药物学有效剂量的范围将是大约病人体重的1微克/公斤/天至10毫克/公斤/天，尽管如上所述此剂量根据治疗的情况而变化。更优选此剂量是至少0.01毫克/公斤/天，对于人来说最优选的激素的剂量是大约0.01到1毫克/公斤/天。如果持续给药，TNFR多肽典型以大约1微克/公斤/小时到大约50微克/公斤/小时的剂量比率被施与，每天注射1到次或持续性皮下输液，例如使用微泵。静脉内液体也可使用。观察变化需要的治疗时间长度和治疗后等待应答发生的间隔根据所希望的效果而变化。
待施与的本发明的组合物的有效剂量可通过本领域熟练技术人员众所周知的方法确定，所要考虑的参数包括生物学半衰期，生物利用度和毒性。这样的测定方法是完全在本领域熟练技术人员的能力范围之内的，特别是根据文中所提供的详细描述。
在治疗过程中有机体的TNFR-6α或TNFR-6β生物暴露度在决定治疗学和/或药物学有效的剂量策略中起重要作用。剂量的变化例如在相当长的一段时间内重复施与相对低剂量的TNFR-6α或TNFR-6β多肽所取得的治疗效果在治疗学上和/或药物学上都与在相对短的一段时间内重复施与相对高剂量的TNFR-6α或TNFR-6β多肽所取得的治疗效果不同。
使用由Freireich，E.J.等(癌症化疗报告50(4)：219-44(1996))提供的相等的表面积剂量换算因子，本领域普通技术人员可以很方便地将从在一个给定的实验系统中使用TNFR-6α或TNFR-6β多肽获得的数据换算成为将要在另一个实验系统中施与的每次服药的TNFR-6α或TNFR-6β多肽药物学有效剂量的精确估计。通过向小鼠施与TNFR6-Fc(见，例如实施例21)所获得的实验数据可通过由Freireich，E.J.等所提供的换算因子换算成为在大鼠、狗、猴子和人中TNFR-6的精确的药物学有效剂量。下面的换算表是对Freireich，E.J.等所提供的数据的总结。表IV列出了剂量换算的大致因子，其表述方式是在一个动物物种中毫克/公斤到另一动物物种以毫克/公斤表示的相同表面积剂量。
表IV相同表面积剂量转换因子
                        到
     小鼠       大鼠        猴子       狗       人来自于   (20克)    (150克)    (3.5公斤)  (8公斤)  (60公斤)小鼠     1         1/2         1/4        1/6      1/12大鼠     2         1           1/2        1/4      1/7猴子     4         2           1          3/5      1/3狗       6         4           5/3        1        1/2人       12        7           3          2        1
因此，例如，使用表IV中提供的换算因子，在小鼠中50毫克/公斤的剂量在猴子中换算成为大约12.5毫克/公斤的剂量，因为(50毫克/公斤)×(1/4)＝12.45毫克/公斤。作为另外的一个例子，在小鼠中0.02，0.08，0.8，2和8毫克/公斤的剂量分别等于在人体内1.667微克/公斤，6.67微克/公斤，66.7微克/公斤，166.7微克/公斤，和0.667毫克/公斤。
本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽可使用本领域已知的任何一种方法被施与，包括但是不局限于在运送位点直接注射、静脉注射、局部施与、导管输液、biolistic injectors、粒子加速、可吸收明胶海绵积存、其它商用积存材料、外科手术或气溶胶运送时倾析或局部使用。这样的方法是本领域已知的。本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽也可作为药物组合物的一部分被施与，下面详细描述了这一点。运送本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸的方法是本领域已知的并且在文中更详细地，描述了这些方法。
含有本发明TNFR的药物组合物可通过口服、直肠内、非胃肠道途径、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(作为粉末，油膏，滴液或经皮的贴片)，向颊或作为口或鼻喷雾剂途径施与。“药物学可接受的”意思是指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、胶囊化材料或任何类型的辅助剂型。如果需要的话，组合物也可含有少量的加湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬液、乳剂、药片、药丸、胶囊、粉末、持久释放的剂型以及类似剂型。术语“非胃肠道途径”，如文中所述，是指一种施与方式包括静脉、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液。
TNFR多肽也可通过持久释放的系统被施与。持久释放的组合物的合适的例子包括合适的聚合物材料(例如，以有形状的物品形式存在的半渗透性的聚合物基质，如胶片或微胶囊)，合适的疏水材料(例如以在认可的油中的乳剂的形式)或离子交换树脂，以及少量的可溶性衍生物(例如，少量的可溶性盐)。
持久释放的基质包括聚交酯(美国专利号3773919；EP 58481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，U.等，生物聚合物22：547-556(1983))，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(R.Langer等，生物医学材料研究期刊15：167-277(1981)，和R.Langer等，化学技术12：98-105(1982))，乙烯基乙酸酯(R.Langer等，Id.)或聚-D-(-)-3-羟丁酸(EP 133988)。
持久释放的组合物也包括脂质体包裹的本发明的组合物(见，Langer，科学249：1527-1533(1990)；Treat等，在治疗传染性疾病和癌症中的脂质体，Lopez-Berestein和Fidler编，利兹出版社，纽约，317-327页和353-365页(1989))。包含有TNFR多肽的脂质体可以通过已知的方法制备，参见DE3218121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：3688-3692(1 985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4030-4034(1980)；EP52322；EP36676；EP88046；EP143949；EP142641；日本专利申请号83-118008；美国专利号4485045和4544545；和EP102324。通常，脂质体是小的(大约200-800埃)单层形式，其中脂类内容物多于大约30摩尔百分比的胆固醇，用于最佳的TNFR多肽治疗的选择的部分。
在一个另外的实施方案中，本发明的组合物是通过泵运送的(见Langer，supra；Sefton，CDC生物医学工程参考标准14：201(1987)；Buchwald等，外科学88：507(1980)；Saudek等，新英格兰医学期刊321：574(1989))。
在Langer(科学249：1527-1533(1990))的综述中讨论了其它的可控制的释放系统。
对于肠道外途径施与药物来说，在一个实施方案中，TNFR多肽是通过在我们所希望的纯度上，以单位剂量可注射的形式(溶液，悬液或乳剂)，将其与药物学可接受的载体即在实施剂量和浓度上对受体无毒并且与剂型组成中其它成分相容的载体混合而配置的。例如，配方中优选不包括氧化试剂和其它已知对多肽有害的化合物。
通常情况下，剂型是通过将TNFR多肽与液体载体或精细分开的固体载体或二者均一地和紧密地作用而制备的。然后，如果需要的话，产品被赋予一定的形状成为我们所希望的剂型。优选的载体是非胃肠道载体，更优选的载体是与受体血液等渗的溶液。这样的载体运送工具的例子包括水、盐、林格注射液、和葡萄糖溶液。非水载体例如固体油和乙基油酸盐以及脂质体也是有用的载体。
载体最好含有少量添加剂例如增加等渗性和化学稳定性的物质。这样的物质在实施剂量和浓度是对受体无毒的，并且包括缓冲液如磷酸、柠檬酸、琥珀酸、醋酸和其它有机酸以及它们的盐；抗氧化剂例如抗坏血酸；低分子量(少于大约10个残基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸；单糖，双糖和其它碳水化合物包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合试剂如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；反离子例如钠；和/或非离子性表面活性剂例如聚山梨醇、泊洛沙姆或PEG。
TNFR多肽典型地以大约0.1毫克/毫升到100毫克/毫升，优选1-10毫克/毫升的浓度在pH值3到8之间被配制到这样的运送工具中。需要明白的是，使用前述的赋形剂、载体或稳定剂将会导致TNFR多肽盐的形成。
将要被用于治疗性施与的TNFR多肽必须是无菌的。通过无菌滤膜(例如，0.2微米滤膜)过滤很容易达到无菌要求。治疗性TNFR多肽组合物通常被置于一个带有无菌开口的容器中，例如静脉注射液贮存袋或带有可被皮下注射针穿透的塞子的药瓶。
TNFR多肽通常以单位贮存或多剂量容器中贮存例如密封的安瓿瓶或药瓶，以水溶液的形式或以用于恢复的冻干剂型贮存的。作为冻干剂型的一个例子，10毫升药瓶里装了5毫升无菌过滤的1％(重量/体积比)TNFR多肽水溶液，并且此产物混合物被冻干。待输入液体是通过用抑菌注射水恢复冻干的TNFR多肽而制备的。
本发明也提供了一种包含一个或多个装有一种或多种本发明药物组合物成分的容器中的药物学包装或试剂盒。这样的容器包含一由政府机构签发的调控药物或生物制品生产、使用或销售的通知，它反应了政府机构对施与人体的制品的生产、销售或使用的许可。此外，本发明多肽可与其它治疗性化合物组合使用。
本发明的组合物可被单独施与或与其它治疗试剂组合施与，包括但不局限于化疗试剂、抗机会感染试剂、抗病毒药、抗生素、类固醇或非类固醇消炎药、免疫抑制剂、传统的免疫治疗试剂和细胞因子。组合使用的试剂可同时施与例如作为混合物，单独但是立即或同时施与，或连续施与。这包括组合的试剂作为混合物一起施与的呈递方式和组合的试剂分别施与但是同时给药的方法，例如，通过不同的静脉进入同一人体。“组合”施与另外包括单独施与一种化合物或试剂，然后施与另外一种。
在一个实施方案中，本发明的组合物与TNF家族的其它成员组合施与到体内。可与本发明的组合物一起施与的TNF、TNF相关的或TNF样分子包括但不局限于TNF-α的可溶性形式、淋巴毒素-α(LT-α，也称为TNF-β)、LT-β(在LT-α2-β异源三聚体复合物中发现)、OPGL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国际申请公开号WO 96/14328)、AIM-I(国际申请公开号WO 97/33899)、AIM-II(国际申请公开号WO 97/34911)、APRIL(实验医学，188(6)：1185-1190)、因子α(国际申请公开号WO98/07880)、OPG和神经因子α(国际申请公开号WO 98/18921)、TWEAK、OX40、和神经生长因子(NGF)、和Fas的可溶性形式、CD30、CD27、CD40、和4-1BB、TR2(国际申请公开号WO96/34095)、DR3(国际申请公开号WO 97/33904)、DR4(国际申请公开号WO98/32856)、TR5(国际申请公开号WO 98/30693)、TR7(国际申请公开号WO 98/41629)、TRANK、TR9(国际申请公开号WO98/56892)、TR10(国际申请公开号WO 98/54202)、312C2(国际申请公开号WO 98/06842)和TR12。
可与本发明的组合物一起施与的传统的非特异性免疫抑制试剂包括但不局限于类固醇、环孢菌素类似物、环磷酰胺甲基强的松、强的松、硫唑嘌呤、FK-506、15-deoxyspergualin和其它通过抑制应答T细胞的功能而起抑制作用的免疫抑制剂。
在特定的实施方案中，本发明的组合物可与免疫抑制剂组合施与。可与本发明的组合物一起施与的免疫抑制剂制备物包括但不局限于ORTHOCLONETM(OKT3)、SANDIMMUNETM/NEORALTM/SANGDYA TM(头孢菌素)、PROGRAFTM(tacrolimus)、CELLCEPTTM(麦考酚盐)、硫唑嘌呤、糖类固醇和RAPAMUNETM(sirolimus)。在一个特定的实施方案中，免疫抑制剂被用于预防器官或骨髓移植排斥。
在某些实施方案中，本发明的组合物可与抗逆转录病毒试剂、核苷逆转录酶抑制剂、非核苷逆转录酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂组合施与。可与本发明的组合物一起施与的核苷逆转录酶抑制剂包括但不局限于RETROVIRTM(叠氮胸苷/AZT)、VIDEXTM(didanosine/DDZ)、HIVIDTM(zalcitabine/ddC)、ZERITTM(stavudine/d4T)、EPIVIRTM(lamivudine/3TC)和COMBIVIRTM(叠氮胸苷/lamivudine)。可与本发明的组合物一起施与的非核苷逆转录酶抑制剂包括但不局限于VIRAMUNETM(nevirapine)、RESCRIPTORTM(delvuirdine)、和SUSTIVATM(efavirenz)。可与本发明的组合物一起施与的蛋白酶抑制剂包括但不局限于CRIXIVANTM(indinavir)、NORVIRTM(vitonavir)、INVIRASETM(saquinavir)和VIRACEPTTM(nelfinavir)。在一个特定的实施方案中，核苷逆转录酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂可与本发明组合物任意组合用于治疗AIDS和/或预防或治疗HIV感染。
在其它的实施方案中，本发明的组合物可与抗机会感染试剂组合施与。可与本发明的组合物一起施与的抗机会感染试剂包括但不局限于TRIMETHOPRIM-SULFAMETHIXAZOLETM、DAPSONETM、PENTAMIDINETM、ATOVAQUONETM、ISONIAZIDTM、RIFAMPINTM、PYRAZINAMIDETM、ETHAMBUTOLTM、RIFABUTINTM、CLARITHROMYCINTM、AZITHROMYCINTM、GANCICLOVIRTM、FOSCARNETTM、CIDOFOVIRTM、FLUCONAZOLETM、TMITRACONAZOLETM、KETOCONAZOLETM、ACYCLOVIRTM、FAMCICOLVIRTM、PYRIMETHAMINETM、LEUCOVORINTM、NEUPOGENTM(filgrastim/C-GSF)和LEUKINETM(sargramostim/GM-CSF)。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物可与TRIMETHOPRIM-SULFAMETHIXAZOLETM、DAPSONETM、PENTAMIDINETM和/或ATOVAQUONETM任意组合使用预防性治疗或预防卡氏肺囊虫机会感染。在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物可与RIFABUTINTM、CLARITHROMYCINTM和/或AZITHROMYCINTM任意组合使用预防性治疗或预防结核杆菌机会感染。在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物可与GANCICLOVIRTM、FOSCARNETTM和/或CIDOFOVIRTM任意组合使用预防性治疗或预防巨细胞病毒机会感染。在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物可与FLUCONAZOLETM、ITRACONAZOLETM和/或KETOCONAZOLETM任意组合使用预防性治疗或预防真菌机会感染。在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物可与ACYCLOVIRTM和/或FAMCICOLVIRTM任意组合使用预防性治疗或预防单纯疱疹病毒I型和/或II型机会感染。在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物可与PYRIMETHAMINE TM和/或LEUCOVORINTM任意组合使用预防性治疗或预防鼠弓形体机会感染。在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物可与LEUCOVORINTM和/或NEUPOGENTM任意组合使用预防性治疗或预防机会性细菌感染。
在另一实施方案中，本发明的组合物可与抗病毒剂组合施与。可于本发明的组合物一起施与的抗病毒剂包括但不限于无环鸟苷(acyelovir)，三唑核苷(ribavirin)，金刚烷胺和remantidine。
在其它的实施方案中，本发明的组合物可与抗生素试剂组合施与。可与本发明的组合物一起施与的抗生素试剂包括但不局限于羟氨苄青霉素、氨基糖苷、β-内酰胺酶(糖肽)、克林霉素、氯霉素、头孢菌素、环丙沙星、红霉素、氟喹啉、大环内酯物、甲硝唑、青霉素、喹啉、利福平、链霉素、磺胺、四环素、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑和万古霉素。
在另外的一个实施方案中，本发明的组合物可单独施与或与一种抗炎症试剂组合施与。可与本发明的组合物一起施与的抗炎症试剂包括但不局限于糖皮质类固醇和非类固醇抗炎症试剂、氨芳基羧酸衍生物、arylacetic酸衍生物、pyrazoles、吡唑啉、水杨酸衍生物、噻嗪羧胺、e-对乙酰己酸、s-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟丁酸、amixatrine、苄达酸、苄达明、nimesulide、奥古蛋白、oxaceprol、paranyline、perisoxal、pifoxime、普罗喹宗、普罗沙唑和tenidap。
在另外的一个实施方案中，本发明的组合物与一种化疗试剂组合施与。可与本发明的组合物一起施与的化疗试剂包括但不局限于抗生素衍生物(例如阿霉素、博来霉素、柔红霉素、放线菌素)；抗雌性激素(例如他黄昔芬)；抗代谢物(例如氟尿嘧啶、5-FU、氨甲喋呤、氟尿苷、干扰素α-2b、谷氨酸、光辉霉素、乐疾宁和6-硫鸟嘌呤)；细胞毒性试剂(例如卡氮芥、BCNU、罗氮芥、CCNU、阿拉伯糖胞嘧啶、环磷酰胺、雌氮芥、羟基脲、丙卡巴肼、丝裂霉素、百消安、顺铂和硫酸长春新碱)；激素(例如甲羟孕酮、雌氮芥磷酸钠、雌二醇、甲地孕酮、甲睾酮、乙烯雌酚、二瞵酸盐、氯烯雌醚和睾酮)；氮芥衍生物(例如meohalen、chorambucil、氮芥和塞替派)；以及其它(例如dizarbazine、天冬酰胺酶、米托坦、硫酸长春新碱、硫酸长春碱以及依托泊甙)。
在一个特定的实施方案中，本发明的组合物与CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)或CHOP成分的任何一种组合一起组合施与。在另一个实施方案中，本发明的组合物与Rituximab一起施与。。在另外的实施方案中，本发明的组合物与Rituximab和CHOP或Rituximab和CHOP的成分任意组合一起施与体内。
在另外的一个实施方案中，本发明的组合物与细胞因子组合施与。可与本发明的组合物一起施与的细胞因子包括但不局限于GM-CSF、G-CSF、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、抗CCD40、CD40L、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和TNF-β。在另一个实施方案中，本发明的组合物可与任何一种白细胞介素一起施与包括但不局限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20和IL-21。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物与TNF-α组合施与。在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物与IFN-α组合施与。
在另外的实施方案中，本发明的组合物与血管生成蛋白一起组合施与。可与本发明的组合物一起施与的血管生成蛋白包括但不局限于神经胶质瘤来源的生长因子(GDGF)，如在欧洲专利号EP-399816中所述；血小板来源的生长因子-A(PDGF-A)，如在欧洲专利号EP-682110中所述；血小板来源的生长因子-B(PDGF-B)，如在欧洲专利号EP-282317中所述；胎盘生长因子(PIGF)，如在国际申请公开号WO 92/06194中所述；胎盘生长因子-2(PIGF-2)，如在Hauser等，生长因子4：259-268(1993)中所述；血管内皮生长因子(VEGF)，如在国际申请公开号WO 90/13649中所述；血管内皮生长因子A(VEGF-A)，如在欧洲专利号EP-506477中所述；血管内皮生长因子2(VEGF-2)，如在国际申请公开号WO96/39515中所述；血管内皮生长因子B-186(VEGF-B186)，如在国际申请公开号WO96/26736中所述；血管内皮生长因子D(VEGF-D)，如在国际申请公开号WO98/02543中所述；血管内皮生长因子D(VEGF-D)，如在国际申请公开号WO98/07832中所述；血管内皮生长因子E(VEGF-E)，如德国专利号DEl9639601中所述；上面提到的参考文献引入本文做参考。
在另外的实施方案中，本发明的组合物与成纤维生长因子组合施与。可与本发明的组合物一起施与的成纤维生长因子包括但不局限于FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15。
在另外的实施方案中，本发明的组合物与其它治疗性或预防性方法组合施与，例如放疗。染色体分析
本发明的核酸分子在染色体鉴定中也是有用的。序列特异性定向至并与个体染色体的特定位置杂交。而且，现在有必要鉴定染色体的特定位置。现在很少有基于实际序列(重复多形性)数据的染色体标记试剂可用于焦急染色体位置。根据本发明给染色体做DNA图谱是将那些序列与疾病相关的基因联系起来的重要的第一步。
在某些优选的实施方案中，就这一点而言，文中所述的cDNAs被用于TNFR蛋白基因的基因组DNA。这可以通过使用各种不同的众所周知的技术以及商业上普遍有售的文库来完成。然后基因组DNA被用于原位染色体图谱。
此外，在一些情况下，序列可通过从cDNA中制备PCR引物(优选15-25bp)被绘制倒染色体图谱上去。对基因3’端未翻译区的计算机分析被用于快速选择在基因组DNA中并不跨越多于一个外显子的引物，因此，使扩增过程复杂化。然后这些引物被用于PCR筛选含有个体染色体的体细胞杂交体。cDNA克隆与一个中期染色体涂片进行的荧光原位杂交(“FISH”)可被用于在一步之内提供精确的染色体位置。此技术可与来自cDNA的短至50-60bp的探针一起使用。这项技术的综述，见Verma等，人类染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦一段序列被定位至精确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可与基因图谱数据联系起来。这些数据可见如V.McKusick，人体中的孟德尔遗传，可通过约翰霍普金斯大学Welch医学图书馆从网上查阅。已经被定位至相同染色体区域上的基因与疾病就可通过联系分析(物理相邻基因的共遗传)而鉴定。
接着，有必要测定受影响的个体和未受影响的个体的cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部受到影响的个体中观察到突变而不是在任何一个普通个体中，那么此突变可能是疾病的致病因素。
已经概括描述了本发明，通过参考下列的实施例将会更易于理解本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，其意并不在于限制本发明。实施例
实施例1：TNFR-6α和TNFR-6β在大肠杆菌中的表达和纯化
细菌表达载体pQE60被用于本实施例中的细菌表达(QIAGEN公司，9259 Eton大街，Chatsworth，加州，91311)。pQE60编码氨苄青霉素抗性(“Ampr”)和含有一个细菌的复制起始子(“Ori”)，一个IPTG诱导的启动子，一个核酶结合位点(“RBS”)，6个编码组氨酸残基的密码子，这6个组氨酸允许使用QIAGEN公司所售的次氮基三乙酸镍(“Ni-NTA”)亲和层析树脂进行亲和纯化，和合适的单一的限制性酶切位点。安排这些成分以使得编码多肽的DNA片段被以这样的方式插入以致于产生在多肽的羧基末端共价连接有6个组氨酸残基(即“6×His标记”)的多肽。但是，在此实施例中，插入多肽编码序列以使得6个组氨酸密码子的翻译受到抑制，因此，所产生的多肽是不带有6×His标记的。
编码含有成熟形式TNFR-6α和TNFR-6β序列的我们所希望的TNFR-6α和TNFR-6β蛋白部分的DNA序列是使用与TNFR-6α和TNFR-6β蛋白目的部分的氨基末端序列以及与保藏的构建物中3’端至cDNA编码序列之间的序列退火的PCR寡核苷酸引物从保藏的cDNA克隆中扩增出来的。另外的含有限制性位点以促进在pQE60众克隆的核苷酸被分别加入到序列的5’和3’端。
为克隆成熟形式的TNFR-6α蛋白，5’端引物具有含有下划线表示的NcoI限制性位点的序列5’-CGCCCATGGCAGAAACACCCACCTAC-3’(SEQ ID NO：19)。当然本领域普通技术人员应该明白在蛋白质编码序列中5’引物开始的位点可被改变以扩增短于或长于成熟形式的完整蛋白的目的部分。3’端引物具有含有下划线表示的HindIII限制性位点的5’-CGCAAGCTTCTCTTTCAGTGCAAGTG-3’(SEQ ID NO：20)序列。为克隆成熟形式的TNFR-6β蛋白，5’引物具有上面SEQ ID NO：19的序列，3’端引物具有含有下划线表示的HindIII限制性位点的5’-CGCAAGCTTCTCCTCAGCTCCTGCAGTG-3’(SEQ ID NO：21)序列。
用NcoI和HindIH消化扩增的TNFR-6α和TNFR-6βDNA片段和pQE60载体，然后将它们连接在一起。TNFR-6α和TNFR-6βDNA插入倒限制性酶切的pQE60载体中，将包括它相关的终止密码子的TNFR-6α和TNFR-6β蛋白编码序列置于IΠTH诱导型启动子的下游，并且位于读码框内带有起始密码子AUG。相关的终止密码子阻止插入位点下游的6个组氨酸密码子的翻译。
使用标准的方法，例如在Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)中所描述的方法用连接混合物转化感受态大肠杆菌细胞。含有多个拷贝的表达lac抑制子并且转移卡那霉素抗性(“Kanr”)的pREP4质粒的大肠杆菌M15/rep4菌株被用于实施文中所述的实施例。此菌株只是许多适于表达TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白的菌株中的一种，可购自QIAGEN公司。可根据其具有在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上生长的能力而鉴定转化株。从抗性克隆中分离质粒DNA，并且使用限制性分析、PCR和DNA测序对克隆的DNA进行确认鉴定。
含有目的构建物的克隆在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)和卡那霉素(25微克/毫升)的LB液体培养基中过夜(“O/N”)，O/N培养物用于以大约1∶25-1∶250的稀释度接种大的培养物。细胞生长至600纳米光密度值(“OD600”)至0.4-0.6时，加入异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，以通过使lacI抑制子失活的方式从lac抑制子敏感的启动子诱导转录。随后细菌被继续培养3-4小时，离心收集细菌。
为纯化TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽，然后将细胞置于pH8的6M盐酸胍中4℃搅拌3-4小时。离心去除细胞残渣，然后含有TNFR-6α和/或TNFR-6β的上清在加有200mM NaCl的pH6的50mM醋酸钠缓冲溶液中透析。另外，在含有蛋白酶抑制剂的500mM NaCl、20％甘油、25mM Tris/HCl pH7.4的透析液众透析可使蛋白质成功折叠。复性后蛋白质可通过离子交换、疏水性相互作用和分子大小排阻层析而纯化。另外，一种亲和层析步骤例如抗体柱可被用于获取纯的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白。纯化的蛋白在4℃保存或在-80℃冻存。
当表达产物以包涵体形式存在时，下列替代方法可被用于纯化大肠杆菌表达的TNFR-6α或TNFR-6β。除非另做说明，所有下列步骤都是在4-10℃实施的。
完成大肠杆菌发酵的生产期后，细菌培养物被冷却至4-10℃，然后通过1500转连续离心收获细菌(Heraeus Sepatech)。根据我们所希望的每单位重量细胞糊的蛋白产量和所要求的纯化的蛋白的数量，合适数量的细胞糊重悬于含有100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4的缓冲溶液中，使用高剪切混合器细菌被分散成为均一的悬液。
在4000-6000psi时，将细胞通过microfluidizer(Microfluidics公司或APV Gaulin公司)两次以裂解细胞。均一溶液与NaCl溶液混合至NaCl终浓度为0.5M，然后7000×g离心15分钟。使用0.5M NaCl，100mM Tris，50mM EDTA，pH7.4溶液洗涤沉淀。
使用1.5M盐酸胍(GnHCl)溶解洗涤过的产物包涵体2-4小时，7000×g离心15分钟后，弃去沉淀，将含有TNFR-6α或TNFR-6β多肽的上清置于4℃过夜以允许进一步GnHCl提取。
高速(30000×g)离心去除不溶的颗粒后，通过将GnHCl提取物与20倍体积的含有50mM钠，pH4.5，150mM NaCl，2mM EDTA的缓冲液快速混合剧烈振荡，GnHCl溶解的蛋白进行再折叠。再折叠的稀释的蛋白溶液在进行下一步纯化之前4℃静置12小时。
为澄清再折叠的TNF受体多肽溶液，使用了一种事先制备的用pH6.0的40mM醋酸钠溶液平衡过的带有0.16微米合适表面面积滤膜的滤器。过滤后的样品被装载到阳离子交换树脂(例如，PorosHS-50，前景生物系统)上，用pH6.0的40mM醋酸钠溶液洗涤柱子，用含有250mM，500mM，1000mM和1500mM NaCl的同样溶液逐步洗脱柱子。连续监测洗脱流出液在280纳米波长的吸收值。收集各个部分进一步用SDS-PAGE分析。
混合含有TNF受体多肽的各部分并且与4倍体积的水混合。稀释的样品然后被装载到事先制备的强阴离子(Poros HS-50，前景生物系统)上，用pH6.0的40mM醋酸钠溶液平衡柱子。两柱子都是用pH6.0的40mM醋酸钠，200mM NaCl溶液洗涤。然后用10倍体积的从pH6.0的0.2M NaCl，50mM醋酸钠溶液到1.0MNaCl，50mM醋酸钠溶液线形梯度洗脱CM-20柱。连续监测洗脱流出液在280纳米波长的吸收值，收集各个部分。混合含有TNFR-6α或TNFR-6β(例如通过10％SDS-PAGE测定)的部分。
经过上述的再折叠和纯化步骤后，产物TNFR受体肽的纯度在95％以上。当上样5微克纯化的蛋白时，考马斯亮蓝染色的16％SDS-PAGE凝胶众并未观察倒主要的污染条带。也检测纯化的蛋白的内毒素/LPS污染情况，根据LAL分析通常LPS含量在0.1纳克/毫升以下。实施例2在杆状病毒表达系统中克隆和表达TNFR-6α和TNFR-6β
在此实施例中，通过使用在Summers等，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法技术手册，德克萨斯农业实验站编号1555(1987)中所描述的标准方法，质粒穿梭载体pA2被用于将编码包括其天然相关的分泌信号(前导)的完整蛋白的克隆的DNA插入到杆状病毒中以表达成熟的TNFR-6α或TNFR-6β蛋白。这种表达载体包含Autographa California核形多角体病毒(AcMNPV)的强的多角体启动子，随后是方便的限制性酶切位点如BamHI，XbaI和Asp718。猴病毒40(“SV40”)的多聚腺苷酸化位点被用于有效的多聚腺苷酸化。为易于选择重组病毒，质粒含有一个受同一方向果蝇弱启动子控制之下的来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，随后是多角体基因的多聚腺苷酸化信号。插入基因的两个侧翼区是病毒序列以与野生型病毒DNA通过细胞介导的同源重组产生表达克隆的核苷酸的活病毒。
许多其它的杆状病毒载体也可被用于替换上述载体，例如pAc373，pVL941和pAcIMl，正如本领域熟练技术人员所明白的，只要构建物提供了合适的转录、翻译、分泌等信号，包括所必需的一段信号肽和框内AUG。在Luckow等，病毒学170：31-39(1989)众描述了这样的载体。
使用对应于基因的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物从保藏的克隆中扩增了包括SEQ ID NO：2或4所示的AUG起始密码子和天然相关的前导序列在内的编码全长TNFR-6α或TNFR-6β蛋白的cDNA序列。TNFR-6α和TNFR-6β的5’端引物是具有含有下划线表示的HindIII限制性位点的5’-CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCACG-3’(SEQ ID NO：22)序列。正如Kozak，M，分子生物学196：947-950(1987)等所述的，所有前述引物编码一种在真核细胞中起始翻译的有效信号。TNFR-6α的3’端引物是具有含有下划线表示的Asp718限制性位点的5’-CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG-3’(SEQ ID NO：23)序列。TNFR-6β的3’端引物是具有含有下划线表示的Asp718限制性位点的5’-CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG-3’(SEQ ID NO：24)序列。
使用商用试剂盒(“Genedean”BIO 101公司，La Jolla，加州)从1％琼脂糖凝胶中分离扩增的片段。然后对于所使用的每一条引物如上所述，用合适的限制性酶消化片段，再次用1％琼脂糖凝胶纯化。
用相同的限制性酶消化质粒，并且任选利用本领域已知的常规技术使用小牛肠磷酸酶去磷酸化。然后使用商用试剂盒(“Genedean”BIO 101公司，La Jolla，加州)从1％琼脂糖凝胶中回收DNA。
用T4 DNA连接酶将片段和去磷酸化的质粒连接在一起。然后用连接混合物转化大肠杆菌HB 101或其它合适的大肠杆菌宿主XL-1蓝细胞(Stratagene克隆系统，La Jolla，加州)并且铺平板。通过使用上面所用的酶鲜花单个克隆的DNA然后通过凝胶电泳分析酶切产物来鉴定含有带有TNF人受体基因质粒的细菌。通过DNA测序证实克隆片段的序列。这个质粒在此命名为pA2-TNFR-6α/或pA2-TNFR-6β(统称为pA2-TNFR)。
使用由Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417(1987)中所述的脂质体转染方法，5微克的pA2-TNFR质粒与1.0微克的商用线形化的杆状病毒DNA(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，圣迭哥，加州)共转染。1微克BaculoGoldTM杆状病毒DNA和5微克pA2-TNFR质粒在含有50微升无血清的Grace’s培养基(生命科技公司，Gaithersburgh，MD)微量滴定板的无菌孔中混合。然后，加入10微升lipofectin和90微升Grace’s培养基，混合并室温孵育15分钟。然后转染混合液被逐滴加入倒种植在35毫米组织培养板中1毫升无血清Grace’s培养基中sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中。然后，27℃孵育5小时。去除板中的转染溶液然后加入1毫升含有10％小牛血清的Grace’s昆虫细胞培养基，27℃连续培养4天。
4天后收集上清然后进行噬斑分析，如Summers和Smith，supra中所述的方法。带有“BlueGal”(生命科技公司，Gaithersburgh，MD)的琼脂糖凝胶被使用，使得易于鉴定和分离产生染色噬斑的gal表达克隆(在生命科技公司的昆虫细胞培养和杆状病毒学应用手册众可以找到关于这种类型“噬斑分析”的详细描述，第9-10页)。适当孵育后用枪尖挑出蓝色噬斑。含有重组病毒的琼脂被重悬于含有200微升Grace’s培养基的微量离心管内，然后含有重组杆状病毒的悬液被用于感染种植在35毫米培养皿上的sr9细胞。4天后收集上清并且4℃保存。
为证实TNF受体基因的表达，sf9细胞培养在含有10％热灭活的胎牛血清的Grace’s培养基中。细胞被感染复数(“MOI”)为2的重组杆状病毒所感染。如果需要放射性标记的蛋白，6小时以后去除培养基，加入不含甲硫氨酸和半胱氨酸(生命科技公司，Rockville，MD)的sf900 II培养基中。42小时后加入5微居35S标记的甲硫氨酸和5微居35S标记的半胱氨酸(Amersham)。再培养细胞16小时，然后离心收获细胞。通过SDS-PAGE随后进行放射自显影(如果放射性标记)来分析上清中的蛋白质以及细胞内蛋白质。
纯化蛋白的氨基末端氨基酸序列的微量测序可被用于测定成熟形式TNF受体蛋白的氨基末端序列。实施例3：在哺乳动物细胞中克隆和表达TNFR-6α和TNFR-6β
典型的哺乳动物表达载体含有介导起始mRNA转录的启动子成分，蛋白质编码序列和转录终止以及多聚腺苷酸化需要的信号。另外的成分包括增强子、Kozak序列和基因的两端带有用于RNA剪接的供受体位点的干预序列。高效转录可通过SV40的早期和晚期启动子、逆转露病毒例如RSV、HTLV1、HIV1的长末端重复序列(LTRs)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子完成。但是也可以使用细胞成分(例如人的肌动蛋白启动子)。合适的可用于实践本发明的载体包括例如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，pRSVcat(ATCC 37512)，pSV2dhfr(ATCC 37416)和pBC12M1(ATCC67109)。可被使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela，293，H9和Jurkat细胞，小鼠的NIH3T3和C127细胞，COS1，COS7和CV1，QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
另外，基因可在含有基因整合入染色体的稳定细胞系中表达。与可选择的标记例如dhfr，gpt，新霉素，潮霉素共转染易于鉴定和分离转染细胞。
转染的基因也可被扩增以大量表达所编码的蛋白质。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记在发展含有几百甚至几千个拷贝目的基因的细胞系中很有用。另一个有用的选择标记是谷氨酰胺合成酶(GS)(Murphy等，生物化学期刊277“-279(1991)；Bebbington等，生物技术10：169-175(1992))。使用这些标记，哺乳动物细胞在选择行培养基中生长并且具有最强抗性的细胞被选择出来。这些细胞含有整合进染色体的扩增的基因。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和NSO细胞也常被用于生产蛋白。
pC1和pC4表达载体含有劳氏肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Gullen等，分子和细胞生物学438-447(1985年3月))和CMV增强子片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))。多克隆位点例如带有限制性酶切位点BamHI，XbaI和Asp718促进了目的基因的克隆。载体另外含有3’内含子、小鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化信号和终止信号。实施例3(a)：在COS细胞中的克隆和表达
表达质粒pTNFR-α-HA和pTNFR-6β-HA是通过将编码成熟形式TNF受体蛋白的cDNA的一部分克隆入表达载体pcDNA I/Amp或pcDNA III(可从Invitrogen公司购买)中而构建的。
pcDNA I/Amp表达载体含有：(1)在大肠杆菌以及其它原核细胞中有效繁殖的大肠杆菌复制起始点；(2)用于筛选含有质粒的原核细胞的氨苄青霉素抗性基因；(3)用于在真核细胞中繁殖的SV40复制起点；(4)CMV启动子，多聚接头和SV40内含子；(5)编码血凝素的片段(即，促进纯化的“HA”标记)的几个密码子，其后是终止信号和多聚腺苷酸化信号，之所以这样安排是因为DNA可被很方便地置于CMV启动子的表达控制之下并且通过多聚接头中的限制性酶切位点与SV40内含子以及多聚腺苷酸化信号可操作连接。HA标记对应于来源自流感血凝素蛋白的一个表位，Wilson等，细胞37：767(1984)。HA标记与目的蛋白的融合使得应用识别HA表位的抗体可以很容易地检测到重组蛋白并且重组蛋白易于复性。pDNA III此外还含有新霉素选择标记。
编码全长TNF受体多肽的DNA片段被克隆到载体的多聚接头区，以使得重组蛋白的表达受到CMV启动子的控制。此质粒构建策略如下。使用含有方便的限制性酶切位点的引物扩增保藏克隆中的TNF受体DNA。
用Xba I和ExoR I消化PCR扩增的DNA片段以及pcDNA I/Amp载体，然后将它们连接，连接混合物转化入大肠杆菌SURE菌株(Stratagene克隆系统有售，11099 North Pines Road，La Jolla，加州92037)，然后转化的培养物涂布在含有氨苄青霉素的培养皿上培养以使氨苄青霉素抗性克隆生长。从抗性克隆中分离质粒DNA并且通过限制性分析或其它方法检测编码TNFR-6α和TNFR-6β多肽的片段的存在。
为表达重组的TNFR-6和TNFR-6β，使用在例如Sambrook等，1990，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)中所述的DEAE-葡聚糖法用上述表达质粒转染COS细胞。细胞在利于表达TNFR的条件下培养。
利用例如Harlow等，抗体：实验室指南，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1988)中所述的方法通过放射性标记和免疫沉淀检测pTNFR-6α-HA和pTNFR-6β-HA融合蛋白的表达。为达到此目的，转染后2天，细胞在含有3sS标记的半胱氨酸的培养基中标记8小时。然后收集细胞和培养基，洗涤细胞，然后用含有去垢剂的RIPA缓冲液：150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5裂解细胞，如同上文众引用的Wilson等的描述。使用HA特异性的单克隆抗体将蛋白从细胞裂解液以及培养上清中沉淀下来。然后通过SDS-PAGE和放射自显影分析沉淀的蛋白。可在细胞裂解液众观察到预期大小的表达产物，阴性对照中则没有。实施例3(b)：在CHO细胞中的克隆和表达
pC4载体被用于表达TNFR-6α和TNFR-6β多肽。pC4质粒是pSV2-dhfr(ATCC 37146)质粒的衍生物。质粒含有SV40早期启动子控制之下的小鼠DHFR基因。用这些质粒转染的中国仓鼠卵巢细胞或其它缺少二氢叶酸活性的细胞可通过在加有化疗试剂氨甲喋呤的选择培养基(α-MEM，生命科技)中生长而被选择出来。很多记载表明DHFR基因在氨甲喋呤(MTX)抗性的细胞中扩增见，例如Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.和Schimke，R.T.，生命的化学期刊253：1357-1370；Hamlin，J.L.和Ma，C.，1990，生物化学和生物物理学报1097：107-143；Page，M.J.和Sydenham，M.A.，1991，生物技术9：64-68)。在不断增加的MTX浓度中生长的细胞由于DHFR基因过量扩增所产生的酶DHFR从而发展了对此药物的抗性。如果另一种基因与DHFR基因连接，它也通常是被共扩增并且过量表达的。本领域已知此方法可被用于发展携带有1000个以上拷贝扩增基因的细胞系。随后，当去除氨甲喋呤时，获得了含有扩增基因整合入宿主细胞一个或多个染色体的细胞系。
pC4质粒含有例如目的基因，劳氏肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Gullen等，分子和细胞生物学，1985年3月，38-447)和一个分离自人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因增强子的片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))，启动子的下游是允许基因整合的下列单一的限制性酶切位点：BamHI，XbaI和Asp718。在这些克隆位点之后质粒含有3’内含子和大鼠前胰岛素原基因的多聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可被用于表达，例如人-β-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或逆转录病毒如HIV和HTLV1的长末端重复序列。Clontech的Tet-off和Tet-on基因表达系统以及其它类似的系统可被用于以受调控的方式在哺乳动物细胞众表达TNF受体多肽(Gossen，M和Bujard，，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992))。对mRNA的多聚腺苷酸化，其它信号例如来自人生长激素或珠蛋白基因的信号也可使用。携带整合入染色体中目的基因的稳定细胞系也可通过与一种选择性标记如gpt、G418或潮霉素共转染二选择出来。优选在开始时使用一种以上的选择标记，例如G418加氨甲喋呤。
使用对于扩增所选择的TNF受体特异性引物合适的限制性酶消化pC4质粒，然后通过本领域已知的技术用小牛肠磷酸酶对其去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶众分离载体。使用对应于基因目的部分5’和3’序列的寡核苷酸引物PCR扩增编码TNF受体多肽的DNA序列。TNFR-6α和TNFR-6β的5’端引物是具有含有下划线表示的BamH I限制性位点的5’-CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG-3’(SEQ ID NO：22)序列。正如Kozak，M，分子生物学196：947-950(1987)等所述的，所有前述引物编码一种在真核细胞中起始翻译的有效信号。TNFR-6α的3’端引物是具有含有下划线表示的Asp718限制性位点的5’-CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG-3’(SEQ ID NO：23)序列。TNFR-6β的3’端引物是具有含有下划线表示的Asp718限制性位点的5’-CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG-3’(SEQ ID NO：24)序列。使用将在工程限制性位点切开的内切核酸酶消化扩增的片段，然后再次在1％琼脂糖凝胶中纯化。然后用T4 DNA连接酶连接分离的片段和去磷酸化的载体。转化大肠杆菌HB 101或XL-1蓝细胞，使用例如限制性分析的方法鉴定细菌含有插入到pC4载体中的片段。
缺少活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞被用于转染。5微克pC4表达质粒与0.5微克pSVneo质粒使用lipofectin的方法共转染(Felgner等，supra)。pSV2neo质粒含有一个显性的选择标记，来自Tn5编码一种转移抗生素包括G418抗性的酶的neo基因。细胞被种植到含有1毫克/毫升G418的α-MEM培养基中。2天后，用胰酶消化细胞然后种植到杂交瘤克隆板(Greiner，德国)上加有10，25或50纳克/毫升氨甲喋呤和1毫克/毫升G418的α-MEM培养基中。大约10-14天后，用胰酶消化单克隆然后种植到6孔板中或10毫升培养瓶中，使用不同的氨甲喋呤浓度(50nM，100nM，200nM，400nM，800nM)。在最高浓度氨甲喋呤中生长的克隆被转移到含有更高氨甲喋呤浓度(1uM，2uM，5uM，10mM，20mM)的新6孔板中。重复操作直至获得可在100-200 uM浓度中生长的克隆。然后分析目的基因的表达产物，例如通过SDS-PAGE和蛋白印迹或通过反向HPLC分析。实施例4：TNF受体mRNA表达的组织分布
使用上面引用的Sambrook等所述的方法进行Northern分析以检测TNFR-6α或TNFR-6β在人体组织中的表达。含有TNF受体蛋白(SEQ ID NOS：1或3)完整核苷酸序列的cDNA探针，通过在制造商的指导之下使用rediprimeTM DNA标记系统(Amersham生命科学)被标记上32P。标记之后，在制造商技术手册PT1200-1的指导之下应用HROMA SPIN-100TM柱(Clontech公司)对探针进行纯化。然后纯化的标记探针被用于检测各种不同的人体组织中TNF受体mRNA的表达，
包含各种不同人体组织(H)或人免疫系统组织(IM)的多组织Northern印迹(MTN)购自Clontech公司，然后利用ExprexxHybTM杂交溶液(Clontech公司)根据制造商技术手册PT1190-1使用标记的探针进行检测。杂交和洗涤后，计算印迹点数目然后在-70℃过夜暴光至胶片，并且根据标准程序对胶片进行处理。
所要明白的是，本发明可通过其它不同于特别是前述方法以及实施例的方法而被实践。根据本发明的教导，对本发明的各种修改和改变都是可能的，但都在附属的权利要求的范围之内。实施例5：使用内源性TNFR-6基因进行基因治疗
本发明基因治疗的另一种方法涉及将内源性TNFR(即TNFR-6)序列与一个启动子根据如下列文献中所述的方法通过同源重组而可操作连接。见，例如1997年6月24日授权的美国专利5641670；1996年9月26日出版的国际申请公开号WO 96/29411；1994年8月4日出版的国际申请公开号WO 94/12650；Koller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935(1989)；和Zijlstra等，自然342：435-438(1989)。此方法涉及激活一个靶细胞中所含有但不表达或低于预期水平表达的基因。制备含有启动子以及与内源性TNFR 5′端非编码区同源的启动子侧翼靶序列的多核苷酸构建物。靶基因将与TNFR-6基因的5’端足够近，以使得通过同源重组启动子与内源性序列可操作连接。可通过PCR扩增启动子和靶序列，扩增的启动子优选在5’和3’末端含有相距较远的限制性酶切点。优选的情况是，第一个靶序列的3’末端含有与扩增的启动子5’末端相同的限制酶位点；并且第二个靶序列的5’末端含有与扩增的启动子3’末端相同的限制酶位点。
用合适的限制酶消化扩增的启动子和扩增的靶序列，然后用小牛肠磷酸酶处理。消化的启动子和消化的靶序列在T4 DNA连接酶存在的情况下被加在一起，产物混合物在适于两片段连接的条件下维持。在琼脂糖凝胶上分离构建物，然后用酚抽提和乙醇沉淀进行纯化。
在本实施例中，寡聚核苷酸构建物通过电穿孔的方法以裸的多核苷酸的形式被施与。但是，多核苷酸构建物也可能与促进转染的试剂如脂质体、病毒序列、病毒颗粒、沉淀试剂等一起施与。这些运送方法也是本领域已知的。
一旦细胞被转染，将会发生启动子与内源性TNFR-6序列可操作连接的同源重组。这导致TNFR-6在细胞中表达。可以通过免疫学染色或本领域已知的其它方法检测蛋白表达。
通过皮肤活检，从受检者得到了成纤维细胞。产物组织被置于含有10％胎牛血清的DMEM中。对数生长或早期静止期的成纤维细胞被用胰酶消化下来并用丰富培养基从塑料表面冲洗下来。一部分细胞悬液被计数，剩下的细胞悬液离心。吸去上清，沉淀重悬于5毫升电穿孔缓冲液中(20mM HEPES pH7.3，137mM NaCl，5mM KCl，0.7mM Na2HPO4，6mM葡聚糖)。细胞重离心，吸去上清，沉淀重悬于含有1毫克/毫升乙酰化牛血清白蛋白的电穿孔缓冲液中。终细胞悬液含有大约3×106细胞/毫升。重悬后应立即开始电穿孔。
根据标准技术制备DNA质粒。例如，为构建一种定向至TNFR-6位点的质粒，用HindIII消化pUC18质粒(MBI Fermentas，Amherst，NY)。用PCR扩增5’末端带有Xba I位点并且3’末端带有BamH I位点的CMV启动子。通过PCR扩增两段TNFR-6非编码序列：一段TNFR-6非编码序列(TNFR片段1)5’末端带有Hind III位点并且3’末端带有Xba I位点；另一段TNFR-6非编码序列(TNFR片段2)被扩增带有5’末端BamH I位点和3’末端Hind III位点。用合适的酶消化CMV启动子和TNFR-6片段(CMV启动子-Xba I和BamH I；TNFR-6片段1-Xba I；TNFR-6片段2-BamH I)并且将它们连接在一起。用Hind III消化连接产物，Hind III消化的pUC18质粒连接。
质粒DNA被加入倒一个带有0.4厘米电极裂隙的无菌小杯中(Bio-Rad)。DNA浓度通常是至少120微克/毫升。然后向小杯众加入0.5微升细胞悬液(大约含有1.5×106细胞)，温和混匀细胞悬液和DNA溶液。使用Gene-Pulser设备(Bio-Rad)进行电穿孔。电容和电压分别是960uF和250-300伏。随着电压增加，细胞存活增加，但是将导入的DNA稳定整合基因组的存活细胞百分比急剧增加。考虑到这些参数，应该观察到的刺激时间大约是14-20毫秒。
电穿孔的细胞在室温大约维持15分钟，然后使用移液器轻柔移走小杯内容物。细胞被直接加入到10厘米平皿预温的丰富培养基中(含有15％小牛血清DMEM)，并在37℃孵育。次日，吸去培养液然后换上新鲜培养基，再孵育16-24小时。
然后将工程化的成纤维细胞注射到宿主体内，单独注射或与cytodex 3微载体珠生长汇合后注射。现在成纤维细胞表达产物蛋白。然后如上所述成纤维细胞可被导入到患者体内。实施例6：TNFR在治疗小鼠移植宿主疾病中的效果
本发明也包含一种通过向患者(优选人)施与本发明的TNFR多肽或TNFR激动剂从而治疗顽固性/严重的急性GVHD的方法。
分析本发明可溶性TNFR多肽(例如TNFR-6)在治疗移植宿主疾病(GVHD)中的应用的方法是使用C57BL/6亲本注射的(BALB/c×C57BL/6)F1小鼠模型进行的。这种F1小鼠模型是特征清楚的并且是可在骨髓移植患者中可繁殖的GVHD动物模型，这是本领域熟练技术人员众所周知的(见，例如Gleichemann等，今日免疫学5：324 1984，全文引入本文做参考)。我们希望可溶性TNFR结合FasL和抑制由FasL介导的凋亡，其在GVHD这种动物模型中所观察到的肝、皮下以及淋巴器官的损伤中起重要的病理学作用(Baker等，实验医学183：2645(1996)；Charles等，免疫学期刊157：5387(1996)；和Hattori等，血液91：4051(1988)，以上文献引入本文做参考)。
GVHD病情的起始是通过静脉注射C57BL/6小鼠的大约1-3×108个脾细胞进入(BALB/c×C57BL/6)F1小鼠(可从Jackson实验室得到，Barharbor，缅因)。每组6-8只小鼠，在注射脾细胞间隔一天以后腹膜内或皮下注射0.1-5.0毫克/公斤的TNFR或同型人IgG对照。每周分析两次TNFR对血清中作为肝损伤指示剂的肝酶释放的影响，此分析持续3周。当在人IgG治疗的小鼠中检测到显著数量的肝酶时，杀死小鼠生理学评价肝、脾、皮肤和肠的组织损伤的相对程度，和评价TNFR在这些器官上引发的治疗效果。
TNFR缓解与顽固性/严重的急性GVHD相关的系统是通过与对照相比血清中肝酶释放的减少、组织损伤和/或降低的恶病质、体重减低和/或致死率的降低而表示的。
最后，隔日临床评价TNFR和人IgG治疗的动物的恶病质、体重和致死率。
也可在此GVHD小鼠模型中检测TNFR与TNF-α抑制剂的组合治疗。实施例7：TNFR-6α(DcR3)抑制AIM-II介导的凋亡背景
肿瘤坏死因子(TNF)家族成员涉及调节不同的生物学活性例如调节细胞增殖、分化、细胞存活、细胞死亡、细胞因子产生、淋巴细胞共刺激、免疫球蛋白分泌和型别转换(Armitage，R.等，免疫学现代论点6：407-413(1994)；Tewari，M.等，遗传发育学现代论点6：39-44(1996))。此家族的受体在胞外区共享一个由大约30到40个氨基酸的多个半胱氨酸重复组成的结构基序(Gruss，H.J.等，血液85：3378-3404(1995))。TNFR1、CD95/Fas/APO-I、DR3/TRAMP/APO-3、DR4/TRAIL-R1/APO-2、DR5/TRAIL-R2和DR6受体含有一个大约30到40个氨基酸组成的保守的胞内基序称为死亡区，与凋亡信号传导途径的激活相关，在胞内区含有低序列相同性的其它成员，刺激转录因子NF-κB和AP-1(Armitage，R.等，免疫学现代论点6：407-413(1994)；Tewari，M.等，遗传发育学现代论点6：39-44(1996)；Gruss，H.J.等，血液85：3378-3404(1995))。
大多数TNF受体含有功能性胞质区，包括TNFR1(Loetscher，H.等，细胞61：351-356(1990)；Schall，T.J.等，)细胞61：361-370(1990))；TNFR2(Smith，C.A.等，基因组16：214-214(1993))；4-1BB(Kwon，B.S.等，Proc Natl Acad Sci USA 86：1963-1967(1989))；HVEM/TR2/ATAR(Kwon，B.S.等，生命的化学272：14272-14276(1997)；Montgomery，R.I等，细胞87：427-436(1996)；Hsu，H.等，生命的化学272：13471-13474(1997))；NGFR(Johnson，D.等，细胞47：545-554(1986))，CD27(Van Lier，R.A.等，免疫学期刊139：1589-1596(1987))，CD30(Durop，H.等，细胞68：421-427(1992))，CD4O(Banchereau，J.等，细胞68：421-427(1994))，OX40(Mallett，S.等，EMBO J 9：1063-1068(1990))，Fas(Itoh，N等，细胞66：233-243(1991))，DR3/TRAMP(Chinnaiyan，A.M.等，科学274：990-992(1996))，DR4/TRAIL-R1(Pan，G等，科学277：815-818(1997))和RANK(Anderson，D.等，自然390：175-179(1997))。TNFR超家族的一些成员不具有分泌的，例如骨前整合素(OPG)(Simmonet等，细胞89：309-319(1997))，或通过糖磷脂尾巴，例如TRID/DcR1/TRAIL-R3(Delgi-Eposti，M.A等，实验医学186：1165-1170(1997)；Sheridan，J.P.等，科学277：818-821(1997))连接的胞质区。也已经鉴定了编码可溶性TNFRs的病毒开放读码框，例如SFV-T2(Smith，C.A.等，科学248：1019-1023(1990))、Va53(Howard，S.T.等，病毒学180：633-647(1991))、G4RG(Hu，E.Q.等，病毒学204：343-356(1994))和crmB(Gruss，H.J.等，血液85：3378-3404(1995))。
通过搜索表达序列标记(EST)数据库，鉴定出TNFR超家族的一个新成员，命名为TNFR-6α，其特征是其是AIM-II和FasL/CD95L的可溶性同族配体。AIM-II和FasL介导的凋亡是细胞死亡的最常见的生理性形式，可在胚胎发组织重建、免疫调节和肿瘤消退过程中发生。
在激活T淋巴细胞和巨噬细胞中AIM-II是高度诱导的。AIM-II的特征是其是HVEM/TR2和LTβR的细胞受体(Mauri，D.W.等，免疫8：21-30(1998))。HVEM/TR2是单纯疱疹病毒2型(HSV-2)进入人成淋巴细胞的受体。已经表明HVEM/TR2-Fc的可溶性形式和HVEM/TR2的抗体抑制混合的淋巴细胞反应，预示着这种受体或其配体在T淋巴细胞激活中的作用(Kwon，B.S.等，生命的化学272：14272-14276(1997)；Mauri，D.W.等，免疫8：21-30(1998)；Harrop等，免疫学期刊161(4)：1786-1794(1998))。LTβR在上皮细胞上明显地表达，但在T及B淋巴细胞中不存在表达。在一些腺瘤中通过LTβR进行信号传导引发细胞死亡(Browning，J.L等，实验医学183：867-878(1996))。由激活的淋巴细胞产生的AIM-II可逃避只表达HVEM/TR2的造血细胞的调控，并且诱发表达LTβR和HVEM/TR2受体的肿瘤细胞凋亡(Zhai，Y.等，临床投资期刊102：1142-1151(1998)；Harrop，J.A.等，生命的化学273：27548-27556(1998))。
FasL是细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的一个主要效应器。它也涉及到在激活诱导的淋巴细胞死亡中外周耐受的建立。而且，FasL在非淋巴细胞和肿瘤细胞中的表达通过阻止Fas敏感的淋巴细胞浸润而有助于维持组织的免疫特权(Nagata，S.，细胞88：355-365(1997))。FasL也被处理并从人细胞的表面出芽(Schneider，P.等，实验医学期刊187：1205-1213(1998))。
在此，我们显示了TNFR超家族的一个新成员TNFR-6α与AIM-II和FasL结合。因此，TNFR-6α可通过阻断AIM-II与其受体的相互作用而作为AIM-II诱导的细胞死亡的抑制剂。材料和方法：TNFR超家族新成员的鉴定和克隆
使用blastn和tblastn计算程序在从多于600种不同的cDNA文库种获得的EST cDNA数据库种筛选与TNFR超家族半胱氨酸丰富区同源的序列。从正常的人前列腺以及胰腺肿瘤cDNA文库中鉴定出了三个含有氨基酸序列与TNFR-II显著同源的开放读码框完全相同的克隆。从正常人前列腺文库中获得了一个编码完整N端信号肽的全长TNFR-6α cDNA克隆。RT-PCR分析
为用于RT-PCR分析，使用Trizol试剂盒(GIBCO)从用PMA/离子霉素或LPS刺激之前或之后的各种不同的人细胞系中分离总RNA。通过逆转录将RNA转变为cDNA并用PCR扩增35个循环。用于扩增的TNFR-6α片段的引物是根据TNFR-6α序列而设计的。β-肌动蛋白被用做RNA完整性的内在对照。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，溴酚蓝染色并在紫外灯下观察结果。重组蛋白的产生和纯化
重组TNFR-6α蛋白是利用C末端的6个组氨酸生产的。PCR扩增编码完整TNFR-6α蛋白的TNFR-6α-(His)。为正确克隆，在上游引物(5’-AGACCCAAGCTTCCTGCTCCAGCAAGGACCATG-3’SEQ ID NO：25)的5’端设计了BamHI位点。用BamHI和HindIII酶切扩增片段然后克隆入哺乳动物表达载体pCEP4(Invitrogen)中。TNFR-6α-(His)/pCEP4稳定转染入HEK 293 EBNA细胞中以产生重组的TNFR-6α-(His)。转染有TNFR-6α-(His)/pCEP4质粒的细胞的无血清培养基经过镍柱(Novagen)。通过SDS-PAGE将柱流出液分成几部分，然后使用抗多聚(His)6抗体(Sigma)进行蛋白印迹分析检测TNFR-6α-(His)。
前面已经描述了HVEM/TP2-Fc，LTβR-Fc和Flag标记的可溶性AIM-II融合蛋白的生产(Zhai，Y.等，临床投资期刊102：1142-1151(1998))。过滤含有Fc融合蛋白的上清然后捕获到蛋白G Sepharose珠上去。使用抗Flag单克隆抗体亲和柱对Flag标记的可溶性AIM-II进行纯化。免疫沉淀
TNFR-6α-(His)与Flag标记的TNFR超家族的各种不同的配体以及Flag琼脂糖在结合缓冲液中(150mM NaCl，0.1％NP-40，0.25％明胶，50mM HEPES，pH7.4)4℃过夜孵育，然后进行沉淀分析，通过12.5％的SDS-PAGE解析结合的蛋白，并HRP标记的抗多聚(His)6抗体或抗人IgG1抗体进行蛋白印迹分析。细胞结合分析
为用于细胞结合分析，用pCEP4/AIM-II cDNA全序列或只用pCEP4载体稳定转染HEK 293 EBNA细胞。用潮霉素B选择以后，用含有1mM的EDTA的PBS收获细胞，然后与TNFR-6α-(His)、HVEM/TP2-Fc或LTβR-Fc在冰上孵育20分钟。为检测Fc融合蛋白，用FITC标记的羊抗人IgG对细胞进行染色。为了检测TNFR-6α的结合，用抗多聚(His)6抗体和FITC标记的羊抗人IgG连续对细胞进行染色。然后用流式细胞仪(Becton Dickinson)分析细胞。细胞毒性分析
使用HT29细胞的细胞毒性分析如前所述(Browning，J.L.等，实验医学183：867-878(1996))。简言之，5000个HT29细胞被种植在96孔板上含有1％FBS的DMEM中，然后用可溶性AIM-II(10ng/ml)和10单位/ml的人重组γ干扰素(IFNγ)处理。系列稀释的TNFR-6α-(His)被加入到微量滴定板孔中，做4个复孔。在加入3H标记的胸苷进行最后6个小时的培养之前，用IFNγ和可溶性AIM-II处理的细胞与各种不同量的TNFR-6α-(His)孵育4天。收获细胞，使用液体闪烁计数仪测定掺入的胸苷。结果和讨论TNFR-6α是TNFR超家族的新成员
TNFR-6α是通过搜索EΣT数据库鉴定出来的。三个含有完全相同的开放读码框的克隆被从正常的人前列腺以及胰腺肿瘤cDNA文库中鉴定出来。从正常人前列腺文库中获得了一个编码完整N端信号肽的全长TNFR-6αcDNA克隆。TNFR-6α的开放读码框编码300个氨基酸。为测定成熟TNFR-6α的N端氨基酸序列，在哺乳动物表达系统中表达6个组氨酸标记的TNFR-6α并通过多肽测序测定N末端氨基酸序列。处理后的成熟TNFR-6α-(His)的N端氨基酸序列第第30位开始，这表明前29个氨基酸组成了信号序列。因此，成熟的TNFR-6α蛋白由271个氨基酸组成，并不含跨膜区。在TNFR-6α中无潜在的N端糖基化位点(Asn173)。与OPG(Simmonet等，细胞89：309-319(1997))一样，推测的蛋白是一种可溶性的分泌蛋白，并且在哺乳动物中表达的重组TNFR-6α蛋白的分子量大约位40KD，如同在聚丙烯酰胺凝胶电泳中所测定的那样。对TNFR-I、TNFR-II、4-1BB、TR2/HVEN、LTβR、TR1/OPG和TNFR-6α进行氨基酸序列比较表明存在潜在的半胱氨酸丰富基序并且其氨基酸序列与TR1/OPG的氨基酸序列惊人地相似。TNFR-6α与OPG和TNFR-II具有大约30％的序列同源性。mRNA表达
通过Northern杂交我们分析了TNFR-6αmRNA在各种人体组织中的表达。Northern分析表明TNFR-6αmRNA大约为1.3Kb大小并且在肺组织以及结肠直肠腺瘤细胞系SW480中优势表达。RT-PCR分析以测定TNFR-6α在各种不同细胞系中的表达特征。在Jurkat白血病细胞中一旦激活TNFR-6α立即表达。有趣的是，TNFR-6α在内皮细胞中组成型表达，而HUVEC则高水平表达。鉴定TNFR-6α配体
为鉴定TNFR-6α配体，通过免疫沉淀筛选TNF配体家族成员的几种Flag标记的可溶性蛋白与重组的TNFR-6α-(His)蛋白的结合。在所测试的Flag标记的可溶性TNF配体家族成员中，TNFR-6α-(His)与AIM-II-Flag和FasL-Flag选择性结合。这个结果表明TNFR-6α至少可与两种配体结合，即AIM-II和FasL。AIM-II和FasL的C末端受体结合区显示出明显的序列同源性(31％)，但是可溶性AIM-II不能与Fas结合(Mauri，D.N.，免疫8：21-30(1998)；Zhai，Y.等，临床投资期刊102：1142-1151(1998))。它们可能具有TNFR-6α结合的相同的表位。
此前，Zhai和Harrop(Zhai，Y.等，临床投资期刊102：1142-1151(1998)；Harrop，J.A.等，生命的化学273：27548-27556(1998))报道了AIM-II的生物学功能以及它作为HVEM/TR2和/或LTβR配体的可能机制。AIM-II在激活的T细胞中表达。AIM-II与血清饥饿或加入IFNγ一起抑制肿瘤细胞MDA-MB-231和HT29的细胞增殖。
为测定TNFR-6α是否以AIM-II与HVEM/TR2或LTβR相互作用的抑制剂起作用，TNFR-6α-(His)被用做AIM-II-HVEM/TR2相互作用的竞争性抑制剂。当AIM-II在存在TNFR-6α-(His)的情况下被HVEM/TR2-Fc免疫沉淀时，HVEM/TR2-Fc与AIM-II的结合被TNFR-6α-(His)竞争性降低，但是HVEM/TR2-Fc并不影响TNFR-6α-(His)与AIM-II的结合。而且在免疫沉淀分析中，HVEM/TR2-Fc(6nM)或LTβR(6nM)的结合受到20nM TNFR-6α-(His)的竞争性抑制。这些结果支持TNFR-6α通过HVEM/TR2或LTβR作为AIM-II功能的强抑制剂而起作用这一论断。TNFR-6α-(His)与AIM-II转染的细胞的结合
为了测定TNFR-6α-(His)是否与表达在细胞表面的AIM-II结合，我们使用了AIM-II转染的HEK 293 EBNA细胞通过流式细胞术进行了结合分析。AIM-II转染的HEK 293 EBNA细胞可被TNFR-6α-(His)以及HVEM/TR2-Fc和LTβR-Fc明显染色。在pCEP4载体转染的HEK 293 EBNA细胞上并未观察到HVEM/TR2-Fc或LTβR-Fc的结合。而且，同型对照并不与AIM-II转染的HEK 293EBNA细胞结合，并且任何一种上述融合蛋白都不与载体转染的细胞结合，证明了这些结合的特异性。这些结合表明TNFR-6α可与可溶性的以及膜结合形式的AIM-II结合。在HT29细胞中TNFR-6α抑制AIM-II介导的细胞毒性
Browning等(实验医学183：867-878(1996))已经表明Fas激活导致细胞快速死亡(12-24小时)，而LTβR诱导结肠直肠腺瘤细胞系HT29发生凋亡至少需要2-3天。Zhai等(临床投资期刊102：1142-1151(1998))也报道AIM-II导致同时表达LTβR和HVEM/TR2的细胞死亡，而不是只表达LTβR或HVEM/TR2的细胞死亡。在AIM-II介导的对HT29细胞的杀伤中，LTβR和HVEM/TR2协同作用(Zhai等，临床投资期刊102：1142-1151(1998))。
为测定TNFR-6α的结合是否抑制AIM-II介导的细胞毒性，在存在200ng/ml LTβR-Fc或TNFR-6α-(His)的情况下，HT29细胞与10ug/ml的可溶性AIM-II和10u/ml的IFNγ孵育。TNFR-6α-(His)显著阻断AIM-II介导的细胞杀伤。细胞也在存在不同浓度的TNFR-6α-(His)的情况下与可溶性AIM-II和/或IFNγ孵育。TNFR-6α-(His)以一种剂量依赖的方式阻断AIM-II介导的细胞死亡。综合到一起，TNFR-6α似乎以一种AIM-II介导的肿瘤细胞杀伤的天然抑制剂起作用。这些数据也表明TNFR-6α有利于肿瘤的免疫逃避。
AIM-II与HVEM/TR2和/或LTβR的相互作用可能引发不同的生物学作用，例如细胞增殖、阻断HVEM依赖的HSV1感染和抗肿瘤活性(Mauri，D.N.等，免疫8：21-30(1998)；Zhai等，临床投资期刊102：1142-1151(1998)；Harrop，J.A.等，生命的化学273：27548-27556(1998))。TNFR-6α可能作为AIM-II相互作用的抑制剂起作用并且在不同细胞类型中起不同作用。在由AIM-II和/或FasL介导的凋亡途径介导的快速和慢速肿瘤细胞死亡中，TNFR-6α也可作为诱饵受体起作用并且有助于免疫逃避。
另一种可能是TNFR-6α可能作为细胞因子起作用引发膜结合FasL或AIM-II并且直接通过FasL或AIM-II传导信号。最近Desbarats和Suzuki研究组报道FasL自身就能传导信号，导致CD4+T细胞的细胞循环停止和细胞死亡，但在CD8+T细胞中却导致细胞增殖(Desbarats，J.等，自然医学4：1377-1382(1998)；Suzuki等，实验医学期刊187：123-128(1998))。因此，TNFR-6α涉及通过FasL和AIM-II传导信号。
在RT-PCR分析中，HUVEC细胞组成型表达TNFR-6α。已知AIM-II和/或FasL在活化的T细胞中被表达。因此，据推测TNFR-6α及其配体在激活的T细胞与内皮细胞的相互作用中很重要。TNFR-6α可能与活化的T细胞之间的交流以及内皮细胞存活有关。实施例8：活化诱导的凋亡分析
活化诱导的凋亡式使用SupT13 T白血病细胞分析并通过细胞周期分析方法测定的。分析过程如下。SupT13 T细胞在含有10％的FCS的RPMI培养基中培养并指数增长(大约1×106)。SupT13 T种植到24孔板的孔中，细胞浓度为0.5×106/ml，1ml/孔。AIM-II和FasL蛋白(0.01，0.1，1，10，100，1000ng/ml)或缓冲液对照被加入到孔中，在存在或不存在本发明多肽的情况下37℃孵育24小时。在另一块24孔板上，通过将溶于无菌过滤的pH9.5的0.05M碳酸氢盐缓冲液中的浓度为10ug/ml的纯化的CD3单抗或缓冲液加入到孔中孵育每孔0.5毫升以制备带有或不带有抗CD3抗体的孔。板子4℃包被过夜。处理的SupT13 T细胞被转移到抗体包被孔中，37℃孵育18小时。使用PI和流式细胞仪通过细胞循环的分析方法测定凋亡。为测定处理细胞的增殖，从处理孔中吸出300ul每种处理的细胞，然后转移到96孔板上的3个复孔种(100ul/孔)，每孔加入3H标记的胸苷(0.5uCi/20ul，2Ci/mM)并37℃孵育18小时。收获细胞并对细胞摄入的3H标记的胸苷计数。这种测量方法可被用于证实对通过其它方法观察到的凋亡的效应。此分析的阳性对照是单独用抗CD3交联抗体，单独用Fas配体和/或单独用AIM-II。此外，使用Fas单克隆抗体(500ng/ml，可溶形式的IgM单克隆抗体)已经在此细胞系中表现出复杂的和增殖性的凋亡。此分析方法的阴性对照是只加培养基或只加缓冲液。同样，已经表明与另一种抗CD3单克隆抗体(OKT3)交联没有什么影响。当与在TNFR激动剂存在的情况下用AIM-II或FasL处理SupT13 T细胞比较时，本发明的TNFR激动剂表现出降低的凋亡。本发明的拮抗剂可以通过将具有FasL和/或AIM-II结合亲和性(例如成熟TNFR)的TNFR多肽与待测的TNFR多肽组合，然后将此组合与AIM-II或FasL和SupT13 T细胞作用而鉴定。此分析的阴性对照只含有成熟TNFR、SupT13 T细胞和AIM-II或FasL的混合物。与阴性对照相比，含有本发明拮抗剂的样品显示出增加的凋亡。
如果通过细胞周期分析观测到效果，此细胞可被进一步使用本领域熟练技术人员众所周知的技术用Annexin V染色进行流式细胞仪TUNEL分析。实施例9：通过TNFR-6α-Fc阻断配体介导的Jurkat细胞凋亡
方法
单独用sFas配体或sFas配体与Fas-Fc或TNFR-6α-Fc(如文中所述，对应于与Fc区融合的全长的NFR-6α蛋白(SEQ ID NO：2中1-300氨基酸序列))组合处理表达Fas受体的Jurkat T细胞。所使用的sFas配体蛋白购自Alexis公司并且在N末端含有一个FLAG表位标记。正如此前所表明的，使用单克隆Flag表位交联Fas配体显著增强了Fas配体介导凋亡的能力，Flag抗体被包括在本研究中。特异地，用Fas配体(Alexis)(20ng/ml)和抗Flag单抗(200ng/ml)处理106Jurkat细胞(RPMI+5％血清)，然后37℃孵育16小时。当此分析中包括TNFR-6α-Fc时，受体与Fas配体和抗Fas单抗预孵育15分钟。
结果
孵育后收获细胞重悬于PBS中并进行流式细胞术分析(表V)。在不存在Fas配体(FasL)的情况下，如同通过较高的annexin染色和较低的PI染色所测定的大约1％的细胞经历凋亡。单独用可溶性FasL处理导致凋亡细胞数目增加大约7倍，并可被Fas-Fc的存在而阻断。与Fas-Fc相似，TNFR-6α-Fc也能阻断Fas介导的凋亡。如同所观察到的，TNFR-6α-Fc以剂量依赖的方式在三个对数级(表V)上阻断凋亡。也可在细胞死亡分析(图7A-B)中测定TNFR-6α-Fc阻断Fas介导的Jurkat细胞杀伤的能力。在此分析中，再次用FasL和TNFR-6α-Fc组合处理细胞16小时。为测定处理后的细胞存活水平，将细胞与10％的ALOMAR蓝孵育5小时后在570-630纳米波长下用分光光度计测量OD值。Fas配体的处理导致细胞存活率减少50％(图7A-B)。细胞存活率的降低可被Fas-Fc或TNFR-6α-Fc而不是TR5-Fc所克服(图7A-B)，表明TNFR-6α干预Fas配体介导的活性的能力。与不加入TNFR-6α-Fc相比，在此分析中TNFR-6α-Fc在100ng/ml和10ng/ml时阻断Fas配体介导的活性的能力时显著不同的(p＜0.05)(图7A-B)。而且，TNFR-6α-Fc在阻断Fas配体介导的细胞死亡和凋亡中与Fas-Fc一样有效(表V和图7A-B)。
表V流式细胞术分析表明阻断了Fas配体介导的凋亡：
用Fas配体(Alexis)(20ng/ml)和抗Flag单抗(200ng/ml)处理106Jurkat细胞(RPMI+5％血清)，然后37℃孵育16小时。当此分析中包括Fc受体时，受体与Fas配体和抗Flag单抗预孵育15分钟。孵育后收获细胞重悬于PBS中然后进行流式细胞术分析。
处理                         经历凋亡的细胞％
对照(缓冲液)                       1.24
FasL(20ng)                         8.87
FasL(20ng)+Fas-Fc(100ng)           1.78
FasL(20ng)+TNFR-6α-Fc(100ng)      1.24
FasL(20ng)+TNFR-6α-Fc(10ng)       2.79
FasL(20ng)+TNFR-6α-Fc(1ng)        7.95
FasL(20ng)+TNFR-6α-Fc(0.1ng)      8.58
结论
TNFR-6α-Fc于Fas配体一样以一种剂量依赖的方式阻断Fas配体介导的Jurkat细胞的凋亡。实施例10：TNFR-6α和/或TNFR-6β的融合蛋白
本发明的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽可任选融合至其它蛋白，这些融合蛋白可用于各种应用中。例如，TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽融合至His标记、HA标记、蛋白A、IgG功能区和麦芽糖结合蛋白促进纯化(见，EP A 394827；Traunecker等，自然331：84-86(1988))。同样，融合至IgG-1、IgG-3和白蛋白增加了在体内的半衰期，共价结合异聚体或同聚体可以增加或降低融合蛋白的活性。融合蛋白也可产生具有多个功能区的嵌合分子。最后，与非融合蛋白相比，融合蛋白可增加融合的蛋白的溶解性合/或稳定性。上述所有类型的融合蛋白都可使用本领域已知的技术制备，或通过使用常规修改的下述将多肽融合至IgG分子上的方法来制备。
简言之，使用跨越下述序列5‘和3’端的引物PCR扩增人IgG分子的Fc部分。这些引物也优选含有合适的限制性位点，以利于将其克隆入表达载体优选哺乳动物表达载体。
例如，如果使用pC4(209646)表达载体，Fc部分可连接到BamHI位点上。注意3’端BamHI位点应该被破坏掉。其次，用BamHI酶切含有人Fc部分的载体并使之线性化，用实施例1中的方法PCR扩增分离的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸被连接到BamH I位点上。注意克隆的多核苷酸应无终止密码子，否则不会产生融合。
如果天然信号序列被用于产生分泌蛋白，pC4不需要另外的信号肽。如果未用天然的信号序列，可修饰载体使之含有一段异源信号序列(见，例如国际申请公开号WO 96/34891)。
人IgG分子的Fc区的序列如下：AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT(SEQ ID NO：27)
实施例11：抗体的生产
a)杂交瘤技术
本发明的抗体可通过各种方法制备(见，现有方法，第二章)。作为这些方法的一个例子，表达TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的细胞可被施与到动物体内诱导产生含有多克隆抗体的血清。在一个优选的实施方案中，制备TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白，然后纯化去除天然杂质。这样的制备物被导入动物体内以产生具有更高特异性活性的多克隆抗血清。
TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白特异性的单克隆抗体使通过杂交瘤技术制备的(Kohler等，自然256：495(1975)；Kohler等，欧洲免疫学期刊6：511(1976)；Kohler等，欧洲免疫学期刊6：292(1976)；Hammerling等，单克隆抗体和T细胞杂交瘤，Elsevier出版社，纽约，563-681页(1981))。通常来说，用TR-6α和/或TR-6β多肽优选使用分泌TR-6α和/或TR-6β多肽的细胞免疫一种动物(优选小鼠)。这样的多肽表达细胞可在任何合适的组织培养基中培养，优选在含有10％胎牛血清(56℃热灭活)和加有10g/l非必需氨基酸，大约1000u/ml青霉素和100ug/ml链霉素)的Earle’s修改的Eagle’s培养基中培养。
分离这些小鼠的脾细胞然后与合适的骨髓瘤细胞融合。根据本发明可使用任何合适的骨髓瘤细胞系；但是，优选使用亲本骨髓瘤细胞系(PS20)，可从ATCC索取。融合后，产物杂交瘤细胞在HAT培养基中被选择性培养并通过Wands等(胃肠道学80：225-232(1981))中所述的有限稀释法克隆。然后对通过这样的选择获得的杂交瘤细胞进行分析以鉴定能够分泌可TR-6α和/或TR-6β多肽结合的抗体的克隆。
另外，可在使用抗独特型抗体的两步法中生产另外的能够结合TR-6α和/或TR-6β多肽的抗体。这样的方法使用抗体本身就使抗原这个事实，因此可能获得与二抗结合的抗体。根基此方法，用蛋白质特异性抗体免疫动物优选小鼠。免疫动物的脾细胞被用于生产杂交瘤细胞，并且筛选这些杂交瘤细胞以鉴定能够产生具有与TR-6α和/或TR-6β蛋白特异性抗体结合能力的抗体，并且此结合可被TR-6α和/或TR-6β阻断的克隆。这样的包含针对TR-6α和/或TR-6β蛋白特异性抗体的抗独特型抗体的抗体可被用于免疫动物以诱导TR-6α和/或TR-6β蛋白特异性抗体的形成。
为在人体内应用抗体，抗体被“人源化”。这样的抗体可以通过利用来自上述产生单抗的杂交瘤细胞的基因构建物而制备。用于制备嵌合的人源化抗体的方法是本领域已知的，并在文中已经详细讨论(见，例如Morrison等，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术4：214(1986)； Cabilly等，美国专利4816567；Taniguchi等，EP 171496；Morrison等，EP 173494；Neuberger等，WO 8601533；Robison等，WO 8702671；Boulianne等，自然312：643(1984)；Neuberger等，，自然314：268(1985))。
b)从scFvs库中分离抗TR-6α和/或TR-6β的抗体片段
分离自PBLs的天然V基因被构建到一个含有供体可能显示出或未显示出抗TR-6α和/或TR-6β反应活性的抗体片段文库中(见，例如美国专利5885793，全文引入本文做参考)。
文库的拯救。如IIXT出版号WO 92/01047中所述的方法，从PBLs的RNA构建了scFvs库。为拯救噬菌体展示抗体片段，大约109含有噬菌体质粒的大肠杆菌被用于接种50毫升含有1％葡萄糖和100ug/ml氨苄青霉素的2×TY(2×TY-AMP-GLU)，然后振摇直至生长至OD值为0.8。用5毫升培养物接种至50毫升2×TY-AMP-GLU中，然后加入2×108δ基因III辅助子(M13δ基因III，见PCT出版号WO 92/01047)，37℃静置培养45分钟，然后37℃摇动培养45分钟。培养物4000转离心10分钟。沉淀重悬至含有100ug/ml氨苄青霉素和50ug/ml卡那霉素的2升2×TY中过夜培养。按照PCT出版号WO 92/01047所述的方法制备噬菌体。
按照如下方法制备M13 δ基因III：M13 δ基因III辅助噬菌体并不编码基因III蛋白，因此噬菌体展示抗体片段具有较强的抗原结合亲和性。通过辅助噬菌体在携带有在噬菌体形态形成中提供野生型基因III蛋白的pUC19衍生质粒的细胞中生长而制备了传染性M13δ基因III颗粒。培养物在37℃静置培养1小时，然后37℃摇动培养1小时。细胞离心(84000rpm×10分钟)后重悬至含有100ug/ml氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的300毫升2×TY中37℃过夜摇动培养。通过2次PEG沉淀(Sambrook等，1990)从培养基中纯化和浓缩噬菌体颗粒，重悬于2毫升PBS中然后用0.45微米滤器过滤(Minisart NML，Sartorius)，最后得到终浓度大约为1013转导单位/ml(氨苄青霉素抗性克隆)。
文库的筛选。用含有100ug/ml或10ug/ml本发明多肽的PBS包被免疫试管(Nunc)。37℃用2％Marvel-PBS封闭试管2小时，然后用PBS洗涤3次。大约1013噬菌体被加入到管中，翻转室温孵育30分钟，然后直立孵育1.5小时。使用含有0.1％土温20的PBS洗涤试管10次，再用PBS洗涤10次。加入1mM三乙胺并且翻转15分钟洗脱噬菌体，然后立即用pH7.4的0.5毫升1M的Tris-HCl中和流出液。然后通过将流出的噬菌体与细菌37℃孵育30分钟用噬菌体感染10毫升对数生长期的大肠杆菌TG1。然后细菌被铺到含有1％葡萄糖和100ug/ml氨苄青霉素的YEC平板上。然后用上述方法使用δ基因III辅助噬菌体拯救产物细菌文库为随后的选择过程制备噬菌体。重复此亲和纯化过程共4次，对于第3和第4回合，试管洗涤液使用20倍体积含有0.1％吐温20的PBS洗涤，再用20倍体积PBS洗涤。
结合者的鉴定。从第3和第4回合中流出的噬菌体倍用于感染大肠杆菌HB2151菌株，并且可溶性scFv从用于分析的单克隆中生产出来(Marks等，1991)。然后使用包被有10pg/ml溶于pH9.6的50mM碳酸氢盐中的本发明多肽的96孔板进行ELISA分析。ELISA分析中的阳性克隆被用于PCR指纹图谱法(见，例如PCT出版号WO92/01047)进一步鉴定，然后测序鉴定。实施例12：测定TNFR-6α和/或TNFR-6β基因改变的方法
从整个家族或单个表现出目的表型(例如，疾病)的个体中分离RNA。使用这样的RNA样品通过本领域已知的技术得到cDNA。然后以此cDNA为模板，以环绕在SEQ ID NO：1中目的区域周围的引物进行PCR扩增。建议的PCR条件为35个循环，95℃30秒；52-58℃60-120秒；70℃60-120秒。使用Sidransky，D等，科学252：706(1991)中所描述的缓冲溶液。
然后使用5’端标记有T4多核苷酸激酶的引物，和SequiTherm的聚合酶对PCR产物进行测序。已经测定了选择的TNFR-6α和/或TNFR-6β外显子的内含子-外显子界线，并且分析基因组PCR产物证实了此结果。然后怀疑TNFR-6α和/或TNFR-6β上带有突变的PCR产物被克隆并测序以证实直接测序的结果。
如Holton，T.A.和Graham，M.W.，核酸研究19：1156(1991)所述将TNFR-6α和/或TNFR-6β的PCR产物克隆进T加尾载体中，并用T7聚合酶测序(United States Biochemical)。通过在未受影响的个体中不存在的TNFR-6α和/或TNFR-6β中的突变鉴别受影响的个体。
基因重排也是鉴定TNFR-6α和/或TNFR-6β改变的一个方法。利用本领域已知的技术分离的基因组克隆被用毛地黄毒苷脱氧尿苷-5-三磷酸(宝灵曼)进行缺口翻译，并用Johnson等，细胞生物学方法35：73-99(1991)所述的方法进行FISH分析。用标记的探针进行的杂交是使用大量TNFR-6α和/或TNFR-6β基因组位点特异性杂交的人cot-1 DNA进行的。
用4，6-二氨基-2-phenylidole和PI对染色体进行染色，产生了C带和R带的组合。精确图谱的排列图象组合3条带过滤设置(Chroma技术，Brattleoboro，VT)与冷却的带电装置相机(Photometrics，Tucson，AZ)和可变的激发波长滤镜而获得的(Johnson等，Genet.Anal.Tech.Appl.8：75(1991))。使用Isee图象程序系统(Invision公司，Durham，NC)进行图象收集、分析和染色体部分长度测量。TNFR-6α和/或TNFR-6β基因组位置的染色体改变(通过探针杂交)被鉴定位插入、缺失和转位。这些TNFR-6α和/或TNFR-6β改变被用做相关疾病的诊断标志。实施例13：检测生物样品中异常水平TNFR-6α和/或TNFR-6β的方法
可检测一生物学样品中的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽，并且如果检测到TNFR-6α和/或TNFR-6β水平的升高或降低，这一多肽就是某一特定表型的标志。检测方法多种多样，因此，本领域熟练技术人员可根据他们的需要对下列方法做些改动。
例如，抗体夹心法ELISA被用于检测样品中优选生物学样品中的TNFR-6α和/或TNFR-6β。微量板的孔用终浓度微0.2到10ug/ml的TNFR-6α和/或TNFR-6β特异性抗体所包被。抗体是利用本领域已知的技术生产的单抗或多抗。封闭孔以减少TNFR-6α和/或TNFR-6β的非特异性结合。
然后包被孔与含有TNFR-6α和/或TNFR-6β的样品在室温下孵育2小时以上。为使结果正确，优选使用系列稀释的样品。然后用去离子水或蒸馏水洗涤板子3次以去除未结合的TNFR-6α和/或TNFR-6β。
接着，加入50ul终浓度为25-400ng的碱性磷酸酶标记的特异性抗体，室温孵育2小时。然后用去离子水或蒸馏水洗涤板3次以去除未结合的缀合物。
然后每孔加入75ul MUP或NPP底物溶液，室温孵育1小时，以允许底物和荧光的分离。使用微量滴定板读数仪测定荧光。使用系列稀释的对照样品的实验数据绘制标准曲线，其中X轴代表样品浓度(对数轴)，Y轴代表荧光或光吸收值(线性轴)。样品中TNFR-6α和/或TNFR-6β浓度就可以利用标准曲线在所测得的荧光读数的基础上算出来。实施例14：TNFR-6α和/或TNFR-6β降低水平的治疗方法
本发明涉及对需要降低体内TNFR-6α和/或TNFR-6β生物学活性的个体进行治疗的方法，此方法包括向此个体施与治疗学有效量的TNFR-6α和/或TNFR-6β拮抗剂组成的组合物。优选用于本发明的拮抗剂使TNFR-6α和/或TNFR-6β特异性抗体。
而且，个体中标准或正常TNFR-6α和/或TNFR-6β表达水平的降低可通过向此个体施与优选可溶性的和/或分泌形式的TNFR-6α和/或TNFR-6β而治疗。因此，本发明也提供了一种在需要增加TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的个体中进行治疗的方法，此方法包括向此个体施与由一定剂量TNFR-6α和/或TNFR-6β组成的药物组合物以增加此个体的TNFR-6α和/或TNFR-6β生物活性水平。
例如，具有低水平TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的患者每天接受0.1-100ug/kg此多肽，连续6天。此多肽优选可溶性的和/或分泌形式的。实施例15：TNFR-6α和/或TNFR-6β升高水平的治疗方法
本发明还涉及对需要升高体内TNFR-6α和/或TNFR-6β生物学活性的个体进行治疗的方法，此方法包括向此个体施与治疗学有效量的TNFR-6α和/或TNFR-6β激动剂组成的组合物。
反义技术被用于抑制TNFR-6α和/或TNFR-6β的产生。由于各种不同的病因学例如癌症，此技术是降低TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽水平，优选可溶性的和/或分泌形式的TNFR-6α和/或TNFR-6β水平的一个例子。
例如，被诊断为具有异常的TNFR-6α和/或TNFR-6β水平的个体被静脉注射反义寡核苷酸，注射剂量为0.5，1.0，1.5，2.0和3.0mg/kg/天，持续21天。如果确认为耐受良好的话，休息7天后重复此项治疗。实施例16：离体使用基因治疗的方法
基因治疗的一个方法是将能够表达可溶性和/或成熟的TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的成纤维细胞移植入患者体内。通常情况下，成纤维细胞通过皮肤活检从受检者获得。所得到的组织被置于组织培养液中并被分解成许多小块。小块的组织被置于潮湿的组织培养瓶表面，每个瓶中大约可放置10块这样的组织。将培养瓶平置，盖紧，置于室温过夜。24小时后，翻转培养瓶，组织块仍然固着在培养瓶底部，加入新鲜培养基(例如Ham’s F12培养基，含有10％FCS，青霉素链霉素)。然后置于37℃培养大约7天。
此时，加入新鲜培养基并且每间隔几天换液。另外培养2周后，形成成纤维细胞单层。用胰酶消化此细胞单层并分入大瓶中。
用EcoR I和Hind III消化侧翼区带有莫罗尼鼠肉瘤病毒长末端重复序列的pMV7(kirschmeier，R.T等，DNA 7：219-225(1988))，然后用小牛肠磷酸酶处理。线性载体在琼脂糖凝胶上分离并用玻璃珠法纯化。
可使用分别对应于编码序列5’和3’端的引物PCR扩增编码TNFR-6α和/或TNFR-6β的cDNA。优选的5’端引物含有EcoR I位点并且3’端引物含有Hind III位点。等量的莫罗尼鼠肉瘤病毒线性骨架以及扩增的EcoR I和Hind III片段在T4 DNA连接酶存在的情况下被加入到一起。产物混合物在适于两片段连接的条件下维持，以确保载体含有正确插入的TNFR-6α和/或TNFR-6β。
两嗜性的pA317活GP+am12包装细胞在含有10％小牛血清、青霉素链霉素的DMEM组织培养中生长至细胞汇片密度。然后加入含有TNFR-6α和/或TNFR-6β的MSV载体和用此载体转导的包装细胞。包装细胞此时产生含有TNFR-6α和/或TNFR-6β基因的传染性病毒颗粒(此时包装细胞被称做生产者细胞)。
新鲜培养基被加入到转导的生产者细胞中，随后，从10厘米生产者细胞完全汇片的培养瓶中收获培养液。使用掉的含有传染性病毒颗粒的培养液经过微孔滤器过滤除去其中的生产者细胞，然后此培养液滤液被用于感染人成纤维细胞。从成纤维细胞的亚汇片培养瓶中除去培养基然后快速用来自生产者细胞的培养液替换。除去此培养液然后用新鲜培养基替换。如果病毒滴度高，那么几乎所有的成纤维细胞被感染，就不用再选择了；如果病毒滴度非常低，那么很有必要使用含有可选择标记如neo或his的逆转录病毒载体。一旦成纤维细胞被有效感染，就分析成纤维细胞以测定TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白是否产生。
然后将工程化的成纤维细胞移植入宿主体内，单独或生长至cytodex 3微载体上以后。实施例17：体内使用基因治疗的方法
本发明的另一方面是使用体内基因治疗方法治疗紊乱、疾病以及类似情况。此基因治疗方法涉及向动物体内导入TNFR-6α和/或TNFR-6β裸核酸序列(DNA、RNA和反义DNA或RNA)以提高或降低TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的表达。TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸可操作地连接至启动子或靶组织表达TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽必需的其它遗传成分。这样的基因治疗方法和运送技术是本领域已知的，见，例如国际申请公开号WO 90/11092；国际申请公开号WO 98/11779；美国专利号5693622；5705151；5580589；Tabata，H.等，心血管研究35：470-479(1997)；Chao，J.等，药物研究35：517-522(1997)；Wolff，J.A.等，神经肌肉紊乱7：314-318(1997)；Schwartz，B.等，基因治疗3：405-411(1996)；Tsurumi，Y.等，循环94：3281-3290(1996)(以上文献引入本文做参考)。
TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸构建物可通过任何运送可注射物质到动物细胞内的方法被运送，例如注射至组织(心脏、肌肉、皮肤、肺、肝、肠及其它)间隙。TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸构建物可再药物学可接受的液体或水溶液载体中被运送。
术语“裸”寡核苷酸，DNA或RNA，意思是指不使用任何起辅助、促进或利于进入细胞的运送工具，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体、lipofectin或沉淀试剂和其它。但是，TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸也可被包裹在脂质体中运送(例如，Felgner等，(1995)，Ann.NY Acad.Sci，772：126-139和Abdallah，B.等(1995)，生命的化学85(1)：1-7的方法)，这可通过本领域熟练技术人员已知的方法制备。
用于基因治疗的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸载体构建物优选不整何入宿主基因组也不含有复制序列。任何强启动子可被本领域熟练技术人员用于驱动DNA表达。于其它基因治疗方法不同，将裸核酸序列导入靶细胞的一个优点是细胞中多核苷酸合成的瞬时性。研究表明非复制性DNA序列可被引入细胞中以在最多至6个月的时间内提供目的多肽的产生。
TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸构建物可被运送至动物的组织包括肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼睛、腺体的组织间隙和连接组织中。组织间隙包括细胞间质、器官组织网状纤维中的粘多糖、血管壁或室壁的弹性纤维、纤维性组织的胶原纤维或连续组织中包裹肌肉组织或骨腔隙中的相同基质。同样还有被循环中的血浆和淋巴管中的淋巴液所占据的间隙。优选向肌肉组织间隙运送药物是因为以下原因：它们可被方便地注射入包含这些细胞的组织中。它们优选被运送至持续、分化但未分裂的细胞中表达，尽管它们也可被运送至未分化的或未完全分化的细胞例如血液中的干细胞或皮肤成纤维细胞中并表达。体内肌细胞特别胜任于摄入并表达多核苷酸。
对于裸的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸注射来说，有效剂量的DNA或RNA范围将在大约0.05g/kg到大约50g/kg之间，优选剂量范围将在大约0.005mg/kg到大约20g/kg之间，更优选剂量范围将在大约0.05mg/kg到大约5mg/kg之间。当然，本领域熟练技术人员所要明白的是，这个剂量将随注射部位的变化而改变。核酸序列的有效剂量可很容易地被本领域熟练技术人员所确定，并且它取决于待治疗的情况和施与方式。优选的施与方式是通过非胃肠道途径注射入组织间隙。但是，也可使用其它的非胃肠道途径例如吸入特别是用于运送至肺或支气管组织、喉或鼻粘膜的喷雾剂型。此外，裸的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸构建物可在血管成形术中通过导管而被施与到动脉内。
可通过下列方法测定注射入的TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸的体内剂量应答效应。根据标准的重组DNA方法学，合适的TNFR-6α和/或TNFR-6β模板DNA被用于产生编码TNFR-6α和/或TNFR-6β多肽的mRNA。环状或线性的模板DNA或以裸DNA形式被使用，或与脂质体形成复合物。然后用不同剂量的模板DNA注射小鼠四头肌。
通过腹膜内注射0.3ml 2.5％的阿佛丁麻醉5-6周龄的Bala/b雌鼠和雄鼠。在大腿前方切开一段长1.5厘米的伤口就可直接看到股四头肌。在0.1ml载体中的TNFR-6α和/或TNFR-6β模板DNA就可通过使用带有27号针头的1毫升注射器在1分钟的时间内注射到肌肉中，从远端插入点到膝盖大约1.5厘米，插入深度为0.2厘米。注射部位染色以利于将来识别，皮肤用不锈钢夹固定。
孵育一段合适的时间之后(例如，7天)切除小鼠的整个四头肌制备肌肉提取物。对每个小鼠的四头肌肌肉组织部分进行组织化学染色以测定TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白的表达。TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白的表达时间可以以相似的方式测定除了不同小鼠的四头肌在不同时间收获之外。注射以后，TNFR-6α和/或TNFR-6β DNA在肌肉中的持续时间可在制备注射鼠以及对照鼠的总细胞DNA以及HIRT上清以后通过Southern印迹分析来测定。上述小鼠实验的数据可被用于在人以及其它动物中使用TNFR-6α和/或TNFR-6β裸DNA时推测合适的剂量以及其它的治疗参数。实施例18：兔子下肢模型中局部缺血的拯救
为研究TNFR-6α和/或TNFR-6β模板在体内对局部缺血的影响，如前所述手术去除兔子一只后肢的股动脉而建立了兔子后肢局部缺血模型(Takeshita等，美国病理学期刊147：1649-1660(1995))。股动脉的切除导致了血栓的变性散播并且阻塞了外部的髋动脉，因此，血液流至局部缺血后肢只能依赖于深部髋动脉分支的平行血管(Takeshita等，美国病理学期刊147：1649-1660(1995))。术后有10天的间隔期以利于兔子的手术后恢复以及内源性平行血管的生成。术后第10天(第0天)，在进行基底膜血管造影后，根据所述的方法通过水凝胶气囊管动脉基因转移技术用500mg裸的TNFR-6α和/或TNFR-6β表达质粒转染局部缺血后肢的深部髋动脉(Riessen，R等，人体基因治疗4：749-758(1993)；Leclerc，G等，临床投资90：936-944(1992))。当用于治疗中时，500mg单一块状的蛋白质或对照通过输液管在大约1分钟左右的时间内被运送至局部缺血肢的深部髋动脉。在第30天，测量这只兔子的各种不同的参数：(a)BP比率-局部缺血肢的收缩压于正常肢的收缩压之比；(b)血流以及血流储备-剩余FL：血管未扩张的情况下的血流和最大FL：血管充分扩张的情况下的血流(也作为血管容量的一个间接指标)，并且最大FL与剩余FL的比率反映了血流储备；(c)血管造影值-对平行血管进行血管造影所测定的数值。此数值是通过在一覆盖的栅格中的具有交叉的不透明化动脉除以兔大腿的总数m的圆圈百分比测定的；(d)毛细血管密度-从后肢切片显微镜视野中平行血管的数目。
本实施例所描述的研究检测了TNFR-6蛋白的活性。但是，本领域熟练技术人员应该能够很容易地改动实施例中的方法以检测TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸(例如，基因治疗)、激动剂和/或拮抗剂。实施例19：糖尿病小鼠以及糖皮质类固醇损伤的伤口愈合模型
   A.db+/db+糖尿病小鼠模型
为证明TNFR-6促进伤口愈合过程，我们使用了伤口愈合的糖尿病小鼠模型。在db+/db+小鼠的全皮厚度伤口愈合模型是一种鉴定清楚的、临床相关的并且可繁殖的损伤伤口愈合模型。糖尿病性伤口的愈合取决于肉芽组织的形成以及上皮重新形成而不是缔结(Gartner，M.H.等外科研究52：389(1992)；Greenhalgh，D.G等，美国病理学136：1235(1990))。
糖尿病动物具有许多在II型糖尿病中观察到的典型特征。与杂合子鼠(db+/+m)相比，纯合子小鼠(db+/db+)脂肪较多一些。糖尿病小鼠突变体(db+/db+)在染色体4(db+)上存在一个隐性的单一常染色体突变(Coleman等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 77：283-293(1982))。动物表现为贪食、多饮、多尿。糖尿病小鼠突变体(db+/db+)血糖升高，胰岛素水平升高或正常并且细胞介导的免疫受到抑制(Mandel等，免疫学期刊120：1375(1978)；Debray-Sachs，M等，临床实验免疫学51(1)：1-7(1983)；Leiter等，美国病理学114：46-55(1985))。外周神经病、心肌综合症、微血管损伤、基底膜加厚和肾小球渗透性异常也已在这些动物中有所报道(Norido，F等，实验神经学83(2)：221-232(1984)；Roberston等，糖尿病29(1)：60-67(1980)；Giacomelli等，实验室投资40(4)：460-473(1979)；Coleman，D.L.等，糖尿病31(增刊)：1-6(1982))。这些纯合子糖尿病小鼠发展为与人类II型糖尿病相似的抗胰岛素的高血糖症(Mandel等，免疫学期刊120：1375(1978))。
在这些动物中观察到的特征表明此模型中伤口的愈合与人糖尿病中伤口愈合相似(Greenhalgh，D.G等，美国病理学136：1235-1246(1990))。
糖尿病雌鼠C57BL/KsJ(db+/db+)以及与其同窝的非糖尿病杂合子(db+/+m)被用于此研究之中。开始实验时动物6-8周龄大小。每只动物单独饲养并且给予充足的食物和水。所有的操作都是无菌操作。实验是在人类基因组科学有限公司的研究型动物使用规则和条例以及实验动物使用规定之下进行的。
根据前述的报道造成创伤(Tsuboi，R.和Rifkin，D.B.，实验医学172：245-251(1990))。简言之，创伤前一天，腹膜内注射溶于去离子水中的阿佛丁(0.01mg/ml)、2，2，2-三溴乙醇和methyl-2-butanol以麻醉动物。注射区域进行剃毛处理，并用酒精以及碘酒棉球消毒。创伤之前，手术区域用无菌纱布干燥。使用Keyes组织穿刺造成8毫米的全皮厚度创伤。创伤之后，轻柔局部组织以防止伤口扩展。在整个治疗期间伤口都是开放的。在造成创伤的当天开始一项连续5天的局部治疗。在治疗前用无菌生理盐水以及无菌棉球清洗局部伤口。
自手术之日起每隔两日观察伤口并且在固定距离照相。伤口愈合是通过在第1至第5天每日测量以及第8天的测量所测定的。使用Jameson测径器水平以及垂直测量伤口。如果肉芽组织不再可见并且伤口被连续的上皮所覆盖，那么就认为伤口愈合了。
每个伤口每天施与不同剂量的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白，从4mg到500mg不等。载体对照组施与50ul的运送液体。
第8天腹膜内注射戊巴比妥钠实施安乐死(300mg/kg)。采集伤口以及周围组织用于组织学以及免疫组化研究。组织标本是置于10％的中性缓冲的福尔马林中的。
共评价了3组小鼠每组十只(5只糖尿病小鼠+5只非糖尿病对照小鼠)，评价：1)运送载体安慰对照，2)TNFR-6α和/或TNFR-6β。
伤口愈合是通过纵向及横向测量伤口直径从而获得伤口面积大小而分析的。伤口的收缩值是通过创伤时的面积(第0天)和治疗结束后(第8天)的面积之间的差值算出来的。第1天时创伤面积时64平方厘米，对应于皮肤穿刺的面积大小。通过下列公式计算：
【第8天的开放面积】-【第1天的开放面积】/【第1天的开放面积】
标本用10％中性缓冲的福尔马林固定，石蜡垂直插入伤口表面(5mm)，用Reichert-Jung组织切片机进行组织切片。在等分的伤口的交联部分进行常规的嗜酸苏木精染色。伤口的组织学检查嗜用于评价是否愈合过程和修复皮肤的形态学再现受到TNFR-6治疗的改变。这种评价包括证实细胞聚集、炎性细胞、血管、成纤维细胞、上皮重新形成的存在和皮肤成熟度(Greenhalgh，D.G等，美国病理学136：1235(1990))。
使用ABC Elite检测系统对组织切片部分进行兔抗人角蛋白多克隆抗体免疫组化染色。人皮肤被用做阳性对照，非免疫IgG被用做阴性对照。角质形成细胞的生长是使用带有测量镜头的测微仪评价上皮重新形成的程度而测定的。
使用ABC Elite检测系统用PCNA抗体(1∶50)检测出了皮肤标本中的增殖细胞核抗原(PCNA)。人结肠癌组织作为阳性对照，人脑组织作为阴性对照。每个标本都有一部分忽略了一抗，而用非免疫小鼠IgG替代。根据增殖的程度以增殖尺度0-8表示对这些组织部分排序，尺度低表明轻微增殖，否则是剧烈增殖。
实验数据是使用不配对t检验分析的。P值小于0.05被认为是显著的。
  B.类固醇损伤的大鼠模型
在各种体外以及体内系统中都有记载表明类固醇很有效地抑制伤口愈合(Wahl，S.M.，糖皮质类固醇和伤口愈合，在抗炎性类固醇作用：基础和临床280-302页(1989)；Wahl，S.M.，免疫学期刊115：476-481(1975)；Werb，Z.等，实验医学147：1684-1694(1978))。糖皮质类固醇通过抑制血管生成，降低血管通透性(Ebert，R.H.等，An.Intern.Med.37：701-705(1952))，抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成(Beck，L.S.等，生长因子5：295-304(1991)；Haynes，B.F.等，临床投资61：703-797(1978))并且产生对循环单核细胞的瞬时减少(Haynes，B.F.等，临床研究61：703-797(1978)；Wahl，S.M.，糖皮质类固醇和伤口愈合，在抗炎性类固醇作用：基础和临床280-302页(1989))而阻碍伤口愈合。全身施与类固醇破坏伤口愈合在大鼠中时一个已经建立的现象(Beck，L.S.等，生长因子5：295-304(1991)；Haynes，B.F.等，临床投资61：703-797(1978)；Wahl，S.M.，糖皮质类固醇和伤口愈合，在抗炎性类固醇作用：基础和临床280-302页(1989)；Pierce，G.F等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2229-2233(1989))。
为证明TNFR-6α和/或TNFR-6β能够加速伤口愈合过程，评价了在创伤愈合已经被全身施与甲基强的松龙所破坏的大鼠全皮厚度切开创伤局部多次应用TNFR-6的效果。
本实施例所用的大鼠是体重250-300克的雄性SD鼠。开始实验时动物8-9周龄大小。已经表明在造成创伤时全身施与甲基强的松龙(17mg/kg/rat，肌肉注射)破坏创伤的愈合。每只动物单独饲养并且给予充足的食物和水。所有的操作都是无菌操作。实验是在人类基因组科学，研究型动物使用规则和条例以及实验动物使用规定之下进行的。
创伤方法见上述A部分。创伤前一天，肌肉注射盐酸氯酮胺(50mg/kg)和盐酸噻拉嗪(5mg/kg)以麻醉动物。注射区域进行剃毛处理，并用酒精以及碘酒棉球消毒。创伤之前，手术区域用无菌纱布干燥。使用Keyes组织穿刺造成8毫米的全皮厚度创伤。创伤之后，轻柔局部组织以防止伤口扩展。在整个治疗期间伤口都是开放的。在造成创伤并且注射甲基强的松龙的当天开始一项连续7天的局部应用待测物质的治疗。在治疗前用无菌生理盐水以及无菌棉球清洗局部伤口。
自手术之日起每隔两日观察伤口并且在固定距离照相。伤口愈合是通过在第1至第5天每日测量以及第8天的测量所测定的。使用Jameson测径器水平以及垂直测量伤口。如果肉芽组织不再可见并且伤口被连续的上皮所覆盖，那么就认为伤口愈合了。
每个伤口每天施与不同剂量的TNFR-6α和/或TNFR-6β蛋白，从4mg到500mg不等。载体对照组施与50ul的运送液体。
第8天腹膜内注射戊巴比妥钠实施安乐死(300mg/kg)。采集伤口以及周围组织用于组织学以及免疫组化研究。组织标本是置于10％的中性缓冲的福尔马林中的。
共评价了4组大鼠每组十只(5只甲基强的松龙+5只无糖皮质类固醇鼠)，评价：1)未治疗组，2)运送载体安慰对照，3)TNFR-6α和/或TNFR-6β。
伤口愈合是通过纵向及横向测量伤口直径从而获得伤口面积大小而分析的。伤口的收缩值是通过创伤时的面积(第0天)和治疗结束后(第8天)的面积之间的差值算出来的。第1天时创伤面积时64平方厘米，对应于皮肤穿刺的面积大小。通过下列公式计算：
【第8天的开放面积】-【第1天的开放面积】/【第1天的开放面积】
标本用10％中性缓冲的福尔马林固定，石蜡垂直插入伤口表面(5mm)，用奥林巴斯组织切片机进行组织切片。在等分的伤口的交联部分进行常规的嗜酸苏木精染色。伤口的组织学检查嗜用于评价是否愈合过程和修复皮肤的形态学再现受到TNFR-6α和/或TNFR-6β治疗的改变。无经验观察者可使用带有测量镜头的测微仪以决定伤口的位置。
实验数据是使用不配对t检验分析的。P值小于0.05被认为是显著的。
本实施例所描述的研究检测了TNFR-6蛋白的活性。但是，本领域熟练技术人员应该能够很容易地改动实施例中的方法以检测TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸(例如，基因治疗)、激动剂和/或拮抗剂。实施例20：淋巴水肿动物模型
本实验的目的时建立一个合适的持续的淋巴水肿模型以用于在大鼠后肢检测对淋巴血管生成以及淋巴循环系统重建的治疗效果。效果是通过测量受影响肢的肿胀体积、对淋巴血管系统数目定量、总血浆蛋白以及组织病理而评价的。观察到的急性水肿通常7-10天。可能更重要的，水肿的慢性进展长至3-4周。
在开始手术以前，进行血样的蛋白质浓度分析。雄鼠体重大约在350克左右，注射戊巴比妥。随后，右腿从膝到臀剃毛，用70％酒精棉球消毒。采血测定血清中总蛋白。在给爪子注射染料之前测量周长和体积。左右爪的皮下都注射0.05毫升1％的伊文斯蓝。折射染料后，再次测量周长和体积。
以膝关节为标志，在腿中部腹股沟处环绕切开以定位股血管。镊子和止血钳被用于切开以及分离皮肤。在找到股血管后，那么在股血管旁侧以及其下的淋巴血管就找到了。在此部位的主淋巴血管被电凝结然后再缝合到一起。
使用显微镜切开腿背后的肌肉组织找到PP淋巴结。两个近端以及两个远端的淋巴血管以及向PP淋巴结供血的远端血管被缝合连接。去除PP淋巴结以及其所连接的脂肪组织。
此过程应该十分小心防止出血。淋巴被阻塞以后，使用液体皮肤是伤口皮肤回合。或缝合将肌肉缝合在内。
为避免感染，动物单独饲养。每日通过观察水肿高度而检查复原的动物，通常在第5-7天发生，水肿部位变平。为评价淋巴水肿的程度，每个爪子的2个指定位置在手术开始时以及术后第7天测量周长和体积。检测淋巴水肿的血浆效应蛋白并且研究是否蛋白质分析时有用的实验参数。在两处评价对照以及水肿肢的重量。分析采取随即分析的方式。
周长测量：简单气体麻醉以防止动物移动，使用布条测量周长。分别在踝骨处和爪背由2个不同的人测量，取读数的平均值。测量对照组以及水肿肢的读数。
体积测量：手术当天，用戊巴比妥麻醉动物并在术前测量。对于日常的体积测量，使用简单的气体麻醉即可。双腿都去毛并且用防水笔标记。将腿浸入水中，标记位置并用Buxco水肿软件测量。两人操作，一人记录数据，另一人将鼠腿浸入水中。
血液-血浆蛋白分析：在术前以及实验结束时采集血液、离心得到血清，测量总蛋白以及钙离子水平并比较。
肢重比较：采集血液以后，动物被用于组织收集。在关节连接处切除整个后肢然后称重。第二次称重时在关节处切断，仅测量足的重量。
组织学制备：膝后区域的肌肉被切除下来并置于金属模子重，充满冻胶，然后浸入冷的methylbutane中，装入标记样品袋直至切开。然后在荧光显微镜下观察。目前正在评价其它的免疫/组织学方法。
本实施例所描述的研究检测了TNFR-6蛋白的活性。但是，本领域熟练技术人员应该能够很容易地改动实施例中的方法以检测TNFR-6α和/或TNFR-6β多核苷酸(例如，基因治疗)、激动剂和/或拮抗剂。
很明白本发明可以通过其它不同于前述方法和实施例的方法实践。但是，根据此前的描述，任何对本发明的修改和变化都在本发明附属的权利要求的范围之内。实施例21：TNFR6-Fc在肝损伤的ConA鼠模型中抑制FasL介导的细胞毒性
向小鼠静脉注射刀豆蛋白A激活T淋巴细胞并且诱导肝细胞的凋亡和坏死死亡，模仿了慢性肝炎的病理生理学特性(Tiegs等，临床投资90：196(1992))。被希望抑制Fas配体活性的Fas的一种嵌合形式Fas-Fc已被报道可在这种模型中通过抑制Fas配体而降低肝损伤表明Fas途径也涉及到病理学之中(Ksontini等，免疫学期刊60(8)：4082-4089(1998))。
模型的证明
为证明ConA小鼠模型，向Balb/c小鼠静脉注射刀豆蛋白A，剂量分别为10，15和20mg/kg，对照组每鼠注射97.5mg安慰剂或Fas-Fc。治疗组每组10只小鼠。治疗后22小时，杀死小鼠采集血清使用临床生化分析仪ILAB90进行生化分析测定肝中特异性的肝损伤时释放至血清的转氨酶、丙氨酸转氨酶以及天冬氨酸转氨酶水平(Tiegs等，临床投资90：196(1992))。在存在10-15mg/kg而不是20mg/kg的ConA时，向小鼠静脉注射97.5mg Fas-Fc可明显抑制升高的肝酶水平，因此，证明了本模型。
向Balb/c小鼠静脉注射刀豆蛋白A，剂量15mg/kg，同时注射或不注射三个对数剂量的TNFR6-Fc(0.6，6，60ug/鼠)。本实施例中所用的TNFR6-Fc对应于融合至Fc的全长TNFR-6α多肽序列(SEQID NO：2的1-300氨基酸)。每治疗组10只小鼠。治疗后22小时，杀死小鼠采集血清使用临床生化分析仪ILAB90进行生化分析测定丙氨酸转氨酶以及天冬氨酸转氨酶水平。注射TNFR6-Fc，在最高剂量(60mg/鼠，3mg/kg)时明显抑制50％的ALT和AST(数据未显示)。因此，TNFR6-Fc以剂量应答的方式显著降低血清中ConA诱导的AST和ALT水平。
TNFR6-Fc对ConA在肝中诱导的凋亡的影响
由于血清中肝酶水平的升高反映了肝细胞破坏的凋亡途径以及非凋亡途径，因此，对肝损伤程度的一个更关键的测定可以通过对凋亡的测量来完成。凋亡是使用从用TNFR6-Fc和ConA处理的小鼠中分离的全肝细胞悬液而分析的。在同一样品上检测了三个独立的凋亡标志，包括三磷酰丝氨酸表面表达的改变、DNA损伤的测量以及caspase激活。
向Balb/c小鼠静脉注射刀豆蛋白A(剂量15mg/kg)，同时注射或不注射三个对数剂量的TNFR6-Fc(0.6，6，60ug/鼠)。利用每组三只小鼠的肝制备细胞悬液，将完整的肝组织置于70um细胞筛中，用5毫升注射器内芯破碎肝组织，使用含由10％FCS的RPMI 1640培养基制备肝细胞悬液。为除去红细胞以及组织残渣，将过滤的细胞悬液置于淋巴细胞分离液上。收集界面层的细胞，洗涤并计数。在上流式细胞仪分析之前，用40um滤器再次过滤细胞悬液。
为测量Annexin V(凋亡指示剂)的结合，细胞先与荧光素标记的单抗CD45 CyChrome和B220或PE标记的抗TCRβ(Pharmingen，San Diego，CA)。用结合缓冲液洗涤细胞然后与FITC标记的AnnexinV孵育。使用Becton Dickinson流式细胞仪分析染色的细胞。只有CD45阳性的情况被收集。B220和Annexin V染色的细胞被认为是凋亡的B细胞；抗TCRβ和Annexin V染色的细胞被认为是凋亡的T细胞。
通过末端UTP缺刻标记(TUNEL)测定DNA的降解(凋亡的另一个标志)，末端UTP缺刻标记是使用Apo-DIRECT试剂盒利用TdT酶将FITC标记的dUTP加入到缺刻DNA的3’末端而测定这种DNA降解的。简言之，用1％的多聚甲醛固定细胞，用PBS洗涤然后用冰预冷的70％乙醇固定。用洗涤液洗涤细胞两次，然后与含由TdT酶和dUTP-FITC的染色液37℃孵育1小时。用冲洗液洗涤两次，重悬于PI溶液中然后进行上机分析。对于分析来说，电门设置为单一，并且dUTP-FITC染色的细胞即被认为是凋亡细胞。
为测定活性形式caspase-3(凋亡的早期指示剂)的存在，细胞于IC FIX孵育，用PBS洗涤两次，然后渗透过IC PERM。细胞与ICPERM中的5ug PE标记的大鼠抗caspase-3抗体孵育，在IC PERM中洗涤，然后再用PBS洗涤两次。然后进行上机分析平均的PE荧光度。
对于凋亡的这三种指示剂来说，与只用ConA处理的小鼠相比，TNFR6-Fc抑制小鼠肝中的凋亡(表VI)。使用DNA损伤作为标志再TUNEL分析中观察到TNFR6-Fc的抑制是以一种剂量依赖的方式发生的。这些数据支持了TNFR6-Fc在抑制ConA诱导的肝炎中的凋亡作用。
        表VI从TNFR6-Fc处理的小鼠分离的肝细胞的凋亡1
                        由以下方法测定的凋亡细胞百分比处理                      Tunel  Caspase-3   Annexin  Annexin
                                         V/TcRβ  V/B220未处理的对照               -        18.7      2.0      6.1ConA(15mg/kg)对照          24.4     35.2      7.0      12.2TNFR6-Fc(0.6μg/小鼠)      15.6     22.7      3.5      6.3TNFR6-Fc(6.0μg/小鼠)      13.6     22.5      2.3      2.9TNFR6-Fc(60μg/小鼠)       9.5      20.3      3.0      4.21肝细胞悬液用三种独立测量的一种分析凋亡。用TUNEL染色测量DNA降解；通过分析caspase-3的活性形式分析caspase活化；annexin V染色分析表面膜变化。从3只小鼠/组的肝分离细胞悬液并合并。得到的合并的悬液用于进行每项分析。对于Annexin染色，只获取CD45+肝细胞并且Annexin V与TCRβ或B220进行共染色分析。
结论
TNFR6-Fc既降低ConA诱导的血清中AST和ALT水平又降低由ConA诱导的肝细胞凋亡支持了本发明的TNFR-6α和TNFR-6β多肽在治疗和/或抑制肝炎和其它形式肝损伤中的治疗性应用。
以上所有的出版物(包括专利、专利出版物、学术期刊文献、实验指南、书或其它文献)全文引入本文做参考。

Claims (23)

1.一种分离的核酸分子，其包含具有与选自以下一组的序列具有至少80％，85％，90％，或95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：
(a)编码具有SEQ ID NOS：2和4的完整氨基酸序列，或如ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列的TNFR多肽的核苷酸序列；
(b)编码具有SEQ ID NO：2中31-300位氨基酸序列或SEQ IDNO：4中31-170位氨基酸序列的成熟TNFR多肽，或编码如ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的成熟多肽的核苷酸序列；
(c)编码具有SEQ ID NO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ IDNO：4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽的可溶性胞外区的核苷酸序列；
(d)与上述(a)(b)或(c)中任何一种核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.如权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的完整核苷酸序列。
3.如权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列编码具有选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的完整氨基酸序列的TNFR多肽。
4.如权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-170位氨基酸序列的成熟TNFR多肽。
5.如权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-166位氨基酸序列的TNFR多肽的可溶性胞外区。
6.一种分离的核酸分子，其包含具有与选自以下一组的序列具有至少80％，85％，90％，或95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：
(a)编码具有SEQ ID NO：2中m-300位氨基酸残基序列的多肽的核苷酸序列，其中m是1-49之间的整数；
(b)编码具有SEQ ID NO：4中n-170位氨基酸残基序列的多肽的核苷酸序列，其中n是1-49之间的整数；
(c)编码具有SEQ ID NO：2中1-y位氨基酸残基序列的多肽的核苷酸序列，其中y是193-300之间的整数；
(d)编码具有SEQ ID NO：4中1-z位氨基酸残基序列的多肽的核苷酸序列，其中z是132-170之间的整数；和
(e)编码具有SEQ ID NO：2中m-y位或SEQ ID NO：4中n-z位氨基酸残基序列的多肽的核苷酸序列，其中m，n，y，z分别见上面(a)，(b)，(c)或(d)中的定义。
7.一种分离的核酸分子，其包含具有与选自以下一组的序列具有至少80％，85％，90％，或95％相同性的核苷酸序列的多核苷酸：
(a)编码由ATCC保藏号为97810或97809中所含的cDNA克隆所编码的完整TNFR氨基酸序列的一部分的多肽的核苷酸序列，其中所述部分不包括由ATCC保藏号为97810或97809中所含的cDNA克隆所编码的所述完整氨基酸序列的氨基末端的第1位到第48位氨基酸；
(b)编码由ATCC保藏号为97810或97809中所含的cDNA克隆所编码的完整TNFR氨基酸序列的一部分的多肽的核苷酸序列，其中所述部分不包括分别由ATCC保藏号为97810和97809中所含的cDNA克隆所编码的所述完整氨基酸序列的羧基末端的第1位到第107位氨基酸和第1位到第38位氨基酸；
(c)编码由ATCC保藏号为97810或97809中所含的cDNA克隆所编码的完整TNFR氨基酸序列的一部分的多肽的核苷酸序列，其中所述部分包括(a)和(b)各个克隆中氨基端和羧基端缺失的的任何一种组合。
8.如权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸具有ATCC保藏号97810和97809中所包含的cDNA克隆的完整核苷酸序列。
9.如权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列编码具有由ATCC保藏号97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的完整氨基酸序列的TNFR多肽。
10.如权利要求1的核酸分子，其中所述的多核苷酸的核苷酸序列编码具有由ATCC保藏号97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的氨基酸序列的成熟TNFR多肽。
11.一种分离的核酸分子，其包含在严格杂交条件下与具有与权利要求1(a)(b)(c)或(d)中核苷酸序列相同的核苷酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸，所述的多核苷酸在严格杂交条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基构成的核苷序列的多核苷酸杂交。
12.一种分离的核酸分子，其包含编码具有权利要求1(a)(b)(c)或(d)中氨基酸序列的TNFR多肽的表位携带部分的氨基酸序列的多核苷酸。
13.如权利要求12的核酸分子，其编码由选自下列氨基酸组成的TNFR多肽的表位携带部分：SEQ ID NO：2中从大约第31位丙氨酸到大约第46位苏氨酸残基，从大约第57位苯丙氨酸到大约第117位苏氨酸残基，从大约第132位半胱氨酸到大约第175位苏氨酸残基，从大约第185位甘氨酸到大约第194位苏氨酸残基，从大约第205位缬氨酸到大约第217位天冬氨酸残基，从大约第239位脯氨酸到大约第264位亮氨酸残基，和从大约第283位丙氨酸到大约第298位脯氨酸残基；和SEQ ID NO：4中从大约第31位丙氨酸到大约第46位苏氨酸残基，从大约第57位苯丙氨酸到大约第80位谷氨酰胺残基，从大约第86位谷氨酸到大约第106位组氨酸残基，从大约第108位苏氨酸到大约第119位苯丙氨酸残基，从大约第129位组氨酸到大约第138位缬氨酸残基，和从大约第142位甘氨酸到大约第166位脯氨酸残基。
14.一种制备重组载体的方法，包括将权利要求1分离的核酸分子插入到载体中。
15.如权利要求14的方法制备的重组载体。
16.一种制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求15的重组载体导入到宿主细胞。
17.如权利要求16的方法制备的重组宿主细胞。
18.一种生产TNFR多肽的重组方法，包括在合适条件下培养权利要求17的重组宿主细胞以使得所述多肽表达，并回收所述多肽。
19.分离的TNFR多肽，其包含与选自下列一组的氨基酸序列具有至少80％，85％，90％，或95％相同性的氨基酸序列：
(a)具有SEQ ID NOS 2或4中所示的完整氨基酸序列的或如ATCC保藏号97810或97809中所含cDNA克隆所编码的全长TNFR多肽的氨基酸序列；
(b)具有SEQ ID NO：2中31-300位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-170位氨基酸序列，或如ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的成熟TNFR多肽的氨基酸序列；
(c)具有SEQ ID NO：2中31-283位氨基酸序列或SEQ ID NO：4中31-166位氨基酸序列，或如ATCC保藏号为97810和97809中所包含的cDNA克隆所编码的TNFR多肽的可溶性胞外区的氨基酸序列。
20.包括TNFR蛋白质表位携带部分的分离的多肽，其中所述的部分是含有选自下列氨基酸残基的多肽：SEQ ID NO：2中从大约第31位丙氨酸到大约第46位苏氨酸残基，从大约第57位苯丙氨酸到大约第117位苏氨酸残基，从大约第132位半胱氨酸到大约第175位苏氨酸残基，从大约第185位甘氨酸到大约第194位苏氨酸残基，从大约第205位缬氨酸到大约第217位天冬氨酸残基，从大约第239位脯氨酸到大约第264位亮氨酸残基，和从大约第283位丙氨酸到大约第298位脯氨酸残基；和SEQ ID NO：4中从大约第31位丙氨酸到大约第46位苏氨酸残基，从大约第57位苯丙氨酸到大约第80位谷氨酰胺残基，从大约第86位谷氨酸到大约第106位组氨酸残基，从大约第108位苏氨酸到大约第119位苯丙氨酸残基，从大约第129位组氨酸到大约第138位缬氨酸残基，和从大约第142位甘氨酸到大约第166位脯氨酸残基。
21.与权利要求19的TNFR多肽特异性结合的分离的抗体。
22.一种对需要TNFR多肽活性的患者进行治疗的方法，包括将权利要求19的TNFR多肽施与患者。
23.一种对需要TNFR多肽活性的患者进行治疗的方法，包括将权利要求1的核酸施与患者。
CN00804601A 1999-03-04 2000-03-03 肿瘤坏死因子受体6α和6β Pending CN1345329A (zh)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12177499P 1999-03-04 1999-03-04
US60/121,774 1999-03-04
US12409299P 1999-03-12 1999-03-12
US60/124,092 1999-03-12
US13127999P 1999-04-27 1999-04-27
US60/131,279 1999-04-27
US13196499P 1999-04-30 1999-04-30
US60/131,964 1999-04-30
US14637199P 1999-08-02 1999-08-02
US60/146,371 1999-08-02
US16823599P 1999-12-01 1999-12-01
US60/168,235 1999-12-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1345329A true CN1345329A (zh) 2002-04-17

Family

ID=27557975

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN00804601A Pending CN1345329A (zh) 1999-03-04 2000-03-03 肿瘤坏死因子受体6α和6β

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP1159286A4 (zh)
JP (1) JP2003512020A (zh)
KR (1) KR20020013506A (zh)
CN (1) CN1345329A (zh)
AU (1) AU774845B2 (zh)
CA (1) CA2362929A1 (zh)
HK (1) HK1042498A1 (zh)
MX (1) MXPA01008936A (zh)
NZ (1) NZ513294A (zh)
WO (1) WO2000052028A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111592601A (zh) * 2011-07-06 2020-08-28 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69837996T2 (de) 1997-01-14 2008-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Tumornekrosefaktor-rezeptoren 6 alpha& 6 beta
US7285267B2 (en) 1997-01-14 2007-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor receptors 6α & 6β
EP1015587B1 (en) 1997-09-18 2008-04-23 Genentech, Inc. DcR3 POLYPEPTIDE, A TNFR HOMOLOG
EP1244783A1 (en) * 1999-12-07 2002-10-02 Eli Lilly And Company Improving stability of flint through o-linked glycosylation
EP1336619A3 (en) * 2002-02-19 2003-12-10 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Combination of a HVEM-LIGHT inhibitor and an immunosuppressive agent in the treatment or prevention of immune disorders
CA2706729A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-11 Genentech, Inc. Gene expression markers for inflammatory bowel disease
KR102435324B1 (ko) 2015-01-20 2022-08-23 아이쥐엠 바이오사이언스 인코포레이티드 종양 괴사 인자(ｔｎｆ) 수퍼패밀리 수용체 결합 분자 및 그의 용도

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69837996T2 (de) * 1997-01-14 2008-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Tumornekrosefaktor-rezeptoren 6 alpha& 6 beta
US5885800A (en) * 1997-02-04 1999-03-23 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding tumor necrosis related receptor, TR4
AU9013998A (en) * 1997-07-21 1999-02-10 Zymogenetics Inc. Tumor necrosis factor receptor ztnfr-5
EP1019502A2 (en) * 1997-08-06 2000-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human orphan receptor ntr-1
EP1015587B1 (en) * 1997-09-18 2008-04-23 Genentech, Inc. DcR3 POLYPEPTIDE, A TNFR HOMOLOG
AU1535699A (en) * 1997-11-24 1999-06-15 Apotech S.A. Novel receptors opg-2
DE19809978A1 (de) * 1998-03-09 1999-09-16 Basf Ag Neuer Rezeptor aus der menschlichen Lunge

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111592601A (zh) * 2011-07-06 2020-08-28 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种肿瘤靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡配体变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000052028A1 (en) 2000-09-08
EP1159286A4 (en) 2003-01-15
MXPA01008936A (es) 2003-07-21
EP1159286A1 (en) 2001-12-05
KR20020013506A (ko) 2002-02-20
JP2003512020A (ja) 2003-04-02
HK1042498A1 (zh) 2002-08-16
NZ513294A (en) 2004-04-30
AU774845B2 (en) 2004-07-08
AU3723400A (en) 2000-09-21
CA2362929A1 (en) 2000-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8329179B2 (en) Death domain containing receptor 4 antibodies and methods
US7476384B2 (en) Death domain containing receptor 4 antibody and methods
US7452538B2 (en) Death domain containing receptor 4 antibodies and methods
US6902910B2 (en) Death domain containing receptor 4
US8105589B2 (en) Use of DR3 antibodies in the treatment of inflammatory disease
CN1894275A (zh) 模仿人epo的铰链核心模仿体、组合物、方法和用途
JP2012525847A (ja) Ｆｇｆ２１変異体およびその使用
US20050233958A1 (en) Death domain containing receptor 5
CN1402733A (zh) 血管生成蛋白及其应用
CN116942811A (zh) Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
JP2021518132A (ja) Ｇｉｐｒ抗体及びｇｌｐ−１とのその融合タンパク質、並びにその医薬組成物及び用途
CN1345329A (zh) 肿瘤坏死因子受体6α和6β
JP2002543151A (ja) 死ドメイン含有レセプター５
JP2003508034A (ja) サイトカインレセプター共通γ鎖類似体
JP2003531107A (ja) スタニオカルシンタンパク質およびスタニオカルシン核酸ならびにそれらに基づいた方法
JP2002544172A (ja) 死ドメイン含有レセプター４
JP2003528030A (ja) アポトーシス誘導分子ｉｉ
JP2003522118A (ja) デスドメイン含有受容体
JP2005534641A (ja) Ｆａｓペプチド模倣体およびその使用
US6713061B1 (en) Death domain containing receptors
CZ98598A3 (cs) Molekula protilátky proti FAS a způsob výroby
WO2001005998A1 (en) Follistatin-3
JP2003502287A (ja) 腫瘍壊死因子レセプター５
CN1795207A (zh) 抗淀粉状蛋白抗体、组合物、方法和用途
JP2003501015A (ja) ヒト腫瘍壊死因子レセプターｔｒ１０

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned
C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned