MXPA01008936A - Receptores 6 alfa y 6 beta del factor de necrosis tumoral. - Google Patents

Receptores 6 alfa y 6 beta del factor de necrosis tumoral.

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Abstract

La presente invención se refiere a proteínas novedosas del Receptor del Factor de Necrosis de Tumor. En particular, se proporcionan moléculas aisladas deácidos nucleicos que codifican las proteínas humanas TNFR-6a y TNFR-6ß. Los polipéptidos TNFR-6a y TNFR-6ßtambién se proporcionan, asícomo vectores, células huésped y métodos recombinantes para producir los mismos. La invención además se refiere a métodos de separación por exclusión para la identificación de agonistas y antagonistas de la actividad del TNFR- 6a y TNFR-6ß. También se proporcionan métodos de diagnóstico para detectar trastornos relacionados con el sistema inmune y métodos terapéuticos para el tratamiento de trastornos relacionados con el sistema inmu

Description

RECEPTORES 6 ALFA y 6 BETA DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL Campo de la Invención La presente invención se refiere a polipéptidos novedosos que codifican genes humanos que son miembros de la familia de receptores de TNF. Más específicamente, se suministran moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican polipéptidos humanos denominados receptor 6a y 6ß del factor necrosis tumoral de aquí en'' adelante, algunas veces referido como "TNFR-6a y TNFR-ßß" o genéricamente como "polipéptidos TNFR" . También se suministran polipéptidos TNFR así como vectores, células huésped y métodos recombinantes para producir los mismos. La invención además se refiere a métodos de selección por exclusión para identificar agonistas y antagonistas de la actividad de los polipéptidos TNFR. También se suministran métodos de diagnóstico y terapéuticos que utilizan tales composiciones. Antecedentes de la Invención Diversas acciones biológicas, por ejemplo, la respuesta a ciertos estímulos y procesos naturales biológicos, se controlan por factores tales como la citosina. Muchas citosinas actúan a través de REF: 132146 los receptores al acoplar al receptor y producir una respuesta intracelular . Por ejemplo, los factores de necrosis tumoral (TNF) alfa y beta son citosinas que actúan a través de los receptores TNF para regular diversos procesos biológicos, incluyendo la protección contra infección e inducción de choque y enfermedad inflamatoria. Las moléculas de TNF pertenecen a la superfamilia " TNF- 1 i gando " y actúan juntas con sus receptores o contra ligandos, la superfamilia "TNF-receptor " . Hasta ahora, han sido identificados nueve miembros de la superfamilia TNF ligando y han sido caracterizados diez miembros de la superfamilia TNF receptor. Entre los ligandos se incluyen el TNF-a, linfotoxina- (LT-a también conocida como TNF-ß) LT-ß (encontrada, en el heterotr imero complejo LY-a2-ß), FasL, CD40L, CD27L, CD30L, 4-IBBL, OX40L y factor de crecimiento de los nervios (NGF) . La superfamilia de receptores TNF incluye el receptor p55TNF, receptor p75TNF, proteina relaciona con el receptor TNF, antigeno FAS o APO-1, CD40, CD27, CD30, 4-IBB, 0X40, p75 de baja afinidad y receptor NGF (Meager, A., Biologicals, 22:291-295 (1994) ) .
Muchos miembros de la superfamilia TNF ligando se expresan por células T activadas, implicando que son necesarios para las interacciones de las células T con otros tipos de células que llevan las funciones y ontogénesis de las células. (Meager, A., supra) . Un detalle considerable de las funciones esenciales de diversos miembros de la familia del receptor TNF, se ha recuperado de la identificación y creación de mutantes que liberan la expresión de estas proteínas. Por ejemplo, las mutaciones que se presentan naturalmente en el antígeno FAS y sus ligandos, provocan una enfermedad linfoproliferativa ( Watanabe - Fu kunaga , et al., Nature 356:314 (1992)), reflejando tal vez una falla de la muerte programada de las células. Las mutaciones del ligando CD40 provocan un estado de inmunodef iciencia ligado a X caracterizado por altos niveles de inmunoglobulina M y bajos niveles de inmunoglobulina G en el plasma, indicando una activación fallida de las células B dependiente de las células T (Alien, R.C. et al., Sciece 259:990 (1993) ) . Las mutaciones dirigidas del receptor de baja afinidad del factor de crecimiento de los nervios., provocan un trastorno caracterizado por una innovación errónea sensorial de las estructuras periféricas (Lee, K.F. et al., Cell 69:737 ( 1992 ) ) . El TNF y LT-oc son capaces de enlazarse a dos receptores TNF (los receptores TNF 55 y 75-kd) . Un gran número de efectos biológicos producidos por el TNF y el LT-a, actúan a través de sus receptores, incluyen necrosis hemorrágica de tumores transplantados, citotoxicidad, una función en el choque endotóxico, inflamación, inmunorregulación , proliferación y respuestas anti-virales , asi como la protección contra los efectos perjudiciales de la radiación ionizante. El TNF y LT-oc se involucran en la patógenesis de una amplia variedad de enfermedades incluyendo el choque endotóxico, malaria cerebral, tumores, enfermedad autoinmune, SIDA y rechazo huésped injerto (Beutler, B. y Von Huffel, C., Science 264:661-668 (1994)) . Las mutaciones en el receptor p55 provocan una susceptibilidad creciente a la infección microbiana. Además, un dominio de alrededor de 80 aminoácidos cerca de la terminación C del TNFR1 (p55) y el Fas se reportó como un "dominio de muerte" que es responsable de transducir señales para la muerte programada de las células (Tartaglia et al., Cell 74:845 (1993)) . La apoptosis, o muerte programada de las células, es un proceso fisiológico esencial para el desarrollo normal y la homeostasis de los organismos multicelulares (H. Steller, Science- 267, 1445-1449 (1995) ) . Los desarreglos de la apoptosis contribuyen a la patogénesis de diversas enfermedades humanas incluyendo el cáncer, trastornos neurodegenerativos, y el síndrome de inmunodef iciencia adquirida (C.B. Thompson, Science 267, 1456-1462 (1995)) . Se ha dirigido mucha atención recientemente a la transducción de señal y a la función biológica de dos receptores de muerte celular superficial, Fas/APO-1 y TNFR-1 (J.L. Cleveland, J.N. Ihle, Cell 81, 479-482 (1995) ; A. Fraser, G. Evan, Cell 85, 781-784 (1996) ; S. Nagata, P. Golstein, Science 267, 1449-56 (1995)) . Ambos miembros de la familia del receptor TNF también incluyen el TNFR-2, NGFR de baja afinidad, CD40 y CD30, entre otros (C.A. Smith, et al., Science 248, 1019-23 (1990); M. Tewari, V. . Dixit, in Modular, Texts in Molecular and Cell Biology M. Purton, Heldin, Cari, Ed. (Chapman and Hall, London, 1995) . Aunque los miembros de la familia se definen por la presencia de repeticiones ricas en cisteina en sus dominios extracelulares, el Fas/APO-1 y TNFR-1 también comparten una región de homología int racelular , designada apropiadamente el "dominio de muerte" que se relaciona lejanamente al gen suicida de Drosophila, segador (P. Golstein, D. Marguet, V. Depratere, Cell 81, 185-6 (1995); K. White et al., Science 264, 677-83 (1994) . Este dominio compartido de muerte, sugiere que ambos receptores interactúan con un conjunto relacionado de moléculas de señal t ransduct ora , que hasta recientemente, permanecían sin identificar. La activación del Fas/APO-1 capta la molécula adaptadora que contiene el dominio de muerte FADD/MORTI (A.M. Chinnaiyan, K. O'Rourke, M. Te ari, V. M. Dixit, Cell 81, 505-12 (1995); M.P. Boldin. et al., J. Biol Chem 270, 7795-8 (1995); F.C. Kischkel, et al., EMBO 14, 5579-5588 (1995)), lo cual a su vez se enlaza y activa presumiblemente el FLICE/MACHl, un miembro de la familia ICE/CED-3 de proteasas pro-apoptóticas (M. Muzio et al., Cell 85, 817-827 (1996); M.P. Boldin, T.M. Goncharov, Y.V. Goltsev, D. Wallach, Cell 85, 803-815 (1996) . Aunque el papel central de la Fas/APO-1 es activar la muerte celular, el TNFR-1 puede señalar una configuración de diversas actividades biológicas muchas de las cuales parten de su capacidad de activar el NF-kB (L.A. Tartaglia, D.V. Goeddel, Immunol Today 13, 151-3 (1992)) . De esta manera, el TNFR-1 capta la molécula multivalente adaptadora TRADD, que como el FADD, también contiene un dominio de muerte (H. Hsu, J. Xiong, D.V. Goeddel, Cell 81, 495-504 (1995); H.Hsu, H.-B. Shu, M.-P. Pan, D.V. Goeddel, Cell 84, 299-308 (1996)) . A través de sus asociaciones con una variedad de moléculas de señal incluyendo FADD, TRAF2, y RIP, el TRADD puede señalar tanto la apoptosis y activación NF-kB (H. Hsu, H.-B. Shu, M.-P. Pan, D.V. Goeddel, Cell 84, 299-308(1996) ; H. Hsu, J. Huang, H.-B. Shu, V. Baichwal, D.V. Goeddel, Immunity 4, 387-396 (1996) ) . Los efectos de los ligandos de la familia TNF y los receptores de la familia TNF son variados y tienen influencia en funciones diversas, normales y anormales, en el proceso biológico del sistema de los mamíferos. Existe una clara necesidad por lo tanto, para la identificación y caracterización de tales receptores y ligandos que tienen influencia en la actividad biológica, normalmente y en estados enfermos. En particular, hay una necesidad de aislar y caracterizar miembros novedosos de la familia del receptor TNF. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden, o consisten alternativamente de, un polinucleót ido que codifica al menos una porción de un TNFR (esto es, el polipéptido T FR- 6a o TNFR- 6 ß ) que tiene las secuencias completas de aminoácido mostradas en la SEQ ID NOS: 2 y 4 respectivamente, o la secuencia completa de aminoácido codificada por un clon de cADN con el número de depósito ATCC 97810 y 97809, respectivamente. La secuencia de nucleótidos determinada por la formación de secuencia de los clones depositados TNFR-6cc y TNFR-dß, que se muestran en las figuras 1 y 2 (SEQ ID NOS: 1 y 3, respectivamente), contienen estructuras abiertas de lectura que codifican a los polipéptidos completos de 300 y 170 residuos de aminoácidos respectivamente, incluyendo un codón de iniciación que codifica una metionina en la terminal N en las posiciones de nucleótido 25- 27 y 73-75 en la SEQ ID NOS: 1 y 3, respectivamente. Las proteínas TNFR de la presente invención, comparten una homología de secuencias con otros receptores TNF. Las variantes empalmadas TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta muestran el grado más alto de homología de secuencias con los productos de traducción del mARN humano para TNFR-I y II, (Figura 3) (SEQ ID NOS: 5 y 6, respectivamente) que también incluyen dominios ricos en cisteína múltiples conservados. Los polipéptidos TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta han previsto secuencias líder de 30 aminoácidos cada una; y la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta previstos maduros también se muestran en las figuras 1 y 2 como residuos de los aminoácidos 31-300 (SEQ ID NO: 2) y 31-170 (SEQ ID NO: 4) respectivamente. Así, un aspecto de la invención suministra una molécula aislada de ácido nucleico que comprende o consiste alternativamente de, un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de (a) una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido TNFR que tiene la secuencia completa de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 ó 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 ó 97809; (b) una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido maduro TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 31-300 en la SEQ ID NO: 2 ó 31-170 en la SEQ ID NO: 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 ó 97809; (c) una secuencia de nucleótido que codifica un dominio soluble extracelular de un polipéptido TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 31 a 283 en la SEQ ID NO: 2 ó 31 a 166 en la SEQ ID NO: 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 ó 97809; (d) una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento del polipéptido TNFR que tiene la secuencia de aminoácido en las posiciones 31 a 283 en la SEQ ID NO: 2 ó 31 a 166 en la SEQ ID NO: 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 o 97809 en donde dicho fragmento tiene la actividad funcional TNFR- 6a y/o TNFR-ßß, y (e) una secuencia de nucleótido complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótido en (a), (b), (c), o (d) arriba .
Modalidades adicionales de la invención, incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden, o consisten alternativamente de un pol inucleót ido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica y más preferiblemente al menos 80%, 85%-, 90%, 92%, ó 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica, a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b), (c), (d) y (e) arriba, o un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones severas de hibridación a un polinucleótido en (a), (b), (c), (d), o (e) arriba. Este polinucleótido que hibridiza, no se hibridiza bajo condiciones severas de hibridación a un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que consista de solamente residuos A o de solamente residuos T. Una modalidad adicional de ácidos nucleicos de la invención, se relaciona con una molécula aislada de ácido nucleico que comprende, o consiste alternativamente de, un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácido de una porción que soporta un epitope de un polipéptido TNFR que tiene una secuencia de aminoácido en (a), (b), (c), o (d) arriba. La presente invención también se refiere a vectores recombinantes , que incluyen las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención, y a células huésped que contienen los vectores recombinantes, asi como a métodos para hacer tales vectores y células huésped y para usarlos para la producción de polipéptidos TNFR o péptidos por técnicas recombinantes. La invención proporciona además un polipéptido aislado TNFR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido TNFR de longitud completa que tiene la secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N0:2 ó 4 o como se codifica por el clon de cADN contenido en el . depósito ATCC No. 97810 ó 97809; (b) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido maduro de TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 31-300 en la SEQ ID NO: 2, ó 31-170 en la SEQ ID NO: 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 ó 97809; ' (c) la secuencia de aminoácidos de un dominio soluble extracelular de un polipéptido TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos 31 a 283 en la SEQ ID NO: 2, ó 31 a 166 en la SEQ ID NO: 4, o como se codifica por el clon cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 ó 97809; o (d) la secuencia de aminoácidos de un fragmento del polipéptido TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 31 a 283 en la SEQ ID NO: 2, ó 31 a 166 en la SEQ ID NO: 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 ó 97809, en donde el fragmento tiene actividad funcional TNFR- 6a y/o TNFR- 6ß . Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica, más preferiblemente al menos 85% idéntica, y todavía más preferiblemente 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica, a aquella descrita en (a), (b), (c), o (d) arriba, así como polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 90% de similitud y más preferiblemente al menos 80%, 85%, 90%, 92%, o 95% de similitud, con aquellos de arriba. Una modalidad adicional de este aspecto de la invención, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de una porción que soporta un epítope de un polipéptido TNFR . que tiene una secuencia de · aminoácido descrita en (a), (b), (c) o (d), arriba. Los péptidos o polipépt idos que tienen la secuencia de aminoácidos de una porción que soporta un epitope de un polipéptido TNFR de la invención, incluyen porciones de tales polipéptidos con al menos 6 ó 7, preferiblemente al menos 9, y más preferiblemente al menos alrededor de 30 aminoácidos hasta alrededor de 50 aminoácidos, aunque también se incluyen en la invención los polipéptidos que soportan el epitope de cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia completa de aminoácidos de un polipéptido de la invención arriba descrito. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a un polipéptido TNFR que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en (a), (b), (c) o (d) arriba. La invención además proporciona métodos para aislar anticuerpos que se enlazan específicamente a un polipéptido TNFR que tiene una secuencia de aminoácidos como se describió aquí. Tales anticuerpos son útiles en forma de diagnóstico o terapéuticamente como se describe a ajo. Los ligandos de la familia del factor de necrosis de tumor (TNF), se conocen por ser entre las citosinas más pleiot rópicas , induciendo un gran número de respuestas celulares incluyendo la citot oxicidad, actividad anti-viral, actividades inmunoregulatorias y la regulación transcripcional de diversos genes. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos TNFR, particularmente polipéptidos TNFR humanos que se pueden emplear por ejemplo, para tratar enfermedades infecciosas incluyendo la infección por VIH, choque endotóxico, cáncer, enfermedades autoinmunes, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo agudo de injertos, rechazo crónico de injertos, trastornos neurodegenerativos, síndromes mielo displásticos, lesión isquémica (por ejemplo lesión cardiaca isquémica), enfermedad del hígado inducida por toxinas, choque séptico, caquexia y anorexia. También se suministran métodos para tratar a los individuos que necesitan polipéptidos de TNFR. La invención proporciona además composiciones que comprenden un polinucleót ido de TNFR o un polipéptido de TNFR para administración a células in vitro, a células ex vivo o a células in vivo, o a un organismo multicelular. En ciertas modalidades particularmente preferidas de este aspecto de la invención, las composiciones comprenden un polinucleót ido de TNFR para la expresión de un polipéptido TNFR en un organismo huésped para el tratamiento de enfermedades. Particularmente preferida a este respecto, es la expresión en un paciente humano para el tratamiento de una disfunción asociada con la actividad endógena aberrante de un polipéptido TNFR. En otro aspecto, se suministra un ensayo de separación por exclusión para agonistas y antagonistas que involucra la determinación del efecto que tiene un compuesto candidato sobre un polipéptido TNFR que se enlaza a un ligando de la familia TNF en particular, el método involucra poner en contacto al ligando de la familia TNF con un polipéptido TNFR y un compuesto candidato, y determinar si el polipéptido TNFR se enlaza al ligando de la familia TNF, se incrementa o disminuye debido a la presencia del compuesto candidato. En este ensayo, un incremento en el enlace del polipéptido TNFR sobre el enlace estándar, indica que el compuesto candidato es un agonista de la actividad de enlace del polipéptido TNFR y una disminución en el enlace del polipéptido TNFR en comparación con el estándar, indica que el compuesto es un antagonista de la actividad de enlace del polipéptido TNFR. El TNFR- 6 alfa y TNFR-6 beta, se expresan en células endoteliales , queratinocitos , de próstata normal y tejido del tumor de la próstata. Para una diversidad de trastornos de estos tejidos o células, particularmente del sistema inmune, se pueden detectar niveles significativamente mayores o menores de la expresión del gen de TNFR en ciertos tejidos, (por ejemplo, tejidos cancerosos) o fluidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, fluido sinovial o fluido espinal) tomados de un individuo que tiene tal trastorno, con relación a un nivel "estándar" de la expresión del gen TNFR, esto es, el nivel de expresión de TNFR en un tejido saludable de un individuo que no tiene un trastorno del sistema inmune. Asi, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de tal trastorno que involucra: (a) ensayar el nivel de expresión del gen TNFR en células o fluido corporal de un individuo; (b) comparar el nivel de expresión del gen TNFR con un nivel de expresión estándar del gen TNFR, por lo cual un incremento o disminución en el nivel de expresión del gen TNFR ensayado en comparación con el nivel de expresión estándar, es indicativo de trastorno en el sistema inmune. Un aspecto adicional de la invención, se relaciona a un método para tratar a un individuo que necesita un nivel creciente de actividad de polipéptidos de TNFR en el cuerpo, que comprende administrar a tal individuo una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido aislado de TNFR de la invención o un agonista del mismo. Todavía un aspecto adicional de la invención, se refiere a un método para tratar a un individuo que necesita de un nivel disminuido de la actividad del polipéptido TNFR en el cuerpo, que, comprende administrar a tal individuo una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista TNFR. Los antagonistas preferidos para su uso en la presente invención son anticuerpos específicos de TNFR. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 1) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de TNFR-ßa. Los 30 aminoácidos iniciales (subrayados) son la secuencia líder supuesta. La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de TNFR-ßß. Los 30 aminoácidos iniciales (subrayados) son la secuencia líder supuesta. La figura 3 muestra una alineación creada por el método Clustal usando el programa Megaline en el conjunto ADNStar que compara las secuencias de aminoácidos de TNFR-6a ("TNFR-6 alfa" (SEQ ID NO: 2)), y TNFR-ßß ("TNFR-6 beta" (SEQ ID NO: 4) ) con otros receptores TNF, como siguen: TNFR1 (SEQ ID NO: 5); TNFR2 (SEQ ID NO: 6); NGFR (SEQ ID NO: 7); LTbR (SEQ ID NO: 8) ; FAS (SEQ ID NO: 9); CD27 (SEQ ID NO: 10); CD30 (SEQ ID NO: 11) CD40 (SEQ ID NO: 12); 4-1BB (SEQ ID NO: 13); OX40 (SEQ ID NO: 14); VC22 (SEQ ID NO: 15); y CRMB (SEQ ID NO: 16) . Las figuras 4 y 5 muestran análisis separados de las secuencias de aminoácidos TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta, respectivamente. Se muestran las regiones alfa, beta, de giro y de espiral, la hidrofilia; regiones antipáticas, regiones flexibles, índice antigénico y probabilidad en la superficie, como se predicen de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4 respectivamente, usando los parámetros por eliminación de los programas de cómputo mencionados. En la gráfica "Indice antigénico Jameson-Wol f " , que indica la ubicación de las regiones altamente antigénicas de las regiones TNFR-6a y TNFR-ßß, esto es se pueden obtener regiones de péptidos que soportan epitopes de la invención. Las regiones antigénicas de TNFR-6a incluyen desde alrededor de Ala-3- hasta alrededor de Thr-46, desde alrededor de Phe-57 hasta alrededor de Thr-117, 'desde alrededor de Cys-132 hasta alrededor de Thr-175, desde alrededor de Gly-185 hasta alrededor de Thr-194, desde alrededor de Val-205 hasta alrededor de Asp-217, desde alrededor de Pro-239 hasta alrededor de Leu-264, y desde alrededor de Ala 283 hasta alrededor de Pro-298 (SEQ ID NO: 2) . Las regiones antigénicas de TNFR-ßß, incluyen desde alrededor de Ala-31 hasta alrededor de Thr-46, desde alrededor de Phe-57 hasta alrededor de Gln-80, desde alrededor de Glu-86 hasta alrededor de His-106, desde alrededor de Thr-108 hasta alrededor de Phe-119, desde alrededor de His-129 hasta alrededor de Val-138, y desde alrededor de Gly-142 hasta alrededor de Pro-166 (SEQ ID NO: 4) . Se ha determinado que estos fragmentos de polipéptidos soportan epítopes antigénicos de los polipéptidos TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta por el análisis del índice antigénico de Jameson-Wolf . Los datos presentados en las figuras 4 y 5 también se representan en forma tabular en las tablas 1 y 2 respectivamente. Las columnas están etiquetadas con los encabezados "Res", "posición", y los números Romanos I-XIV. Los encabezados de las columnas se refieren a las siguientes características de la secuencia de aminoácidos presentado en la figura 4 (tabla 1) y figura 5 (Tabla 2) : "Res": residuo de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 (figura l)o SEQ ID NO: 4 (figura 2); "posición": posición del residuo correspondiente dentro de SEQ ID NO: 2 (figura.1) o SEQ ID NO: 4 (figura 2); 1. Regiones Alfa - Ga rn i er-Robs on ; II: Regiones Alfa - Chou-Fasman; III: Regiones Beta -Garnier-Robson ; IV: Regiones Beta - Chou-Fasman; V: Regiones de Giro - Garnier-Robson; VI: Regiones de Giro - Chou-Fasman; VII: Regiones de Espiral -Garnier-Robson; VIII: Gráfica de hidrofilia Kyte-Doolittle ; IX: Gráfica de Hidrofobia - Hopp- oods; X Regiones Anfipáticas Alfa - Eisenberg; XI: Regiones Anfipáticas Beta - Eisenberg; XII: Regiones Flexibles - Karplus-Schulz ; XIII: Indice Antigénico - Jame s on-Wol f , y XIV: Gráfica de probabilidad de superficie - Emini. La figura 6 muestra las secuencias de nucleótido de HELD106R (SEQ ID NO: 17) y HCEOW38R (SEQ ID NO: 18) que se relacionan a la SEQ ID NOS: 1 y 3. Las figuras 7A-B muestran el bloqueo del TNFR-6 alfa o muerte celular mediada por el ligando Fas. Las células T de Jurkat se trataron con una combinación del ligando Fas y receptor Fe del TNFR-6 alfa durante 16 horas. Para medir los niveles de las células viables después del tratamiento, se incubaron células durante 5 horas con 10% de azul de Alamar y se examinaron espectro fotomét ricamente a un OD de 570 nm-630nm. Todas las muestras se probaron por triplicado. El FC del TNFR-6 alfa parece bloquear al ligando Fas mediado por la apoptosis de células- Jurkat en una forma dependiente de la dosis tan efectivamente como el ligando Fas .
Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden, o consisten alternativamente de, un polinucleótido que codifica un polipéptido TNFR- 6a o -6ß, genéricamente "polipépt idos de TNFR" que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente, que se determinaron por la formación de secuencias de cADN clonados. Las secuencias de nucleótidos mostradas en las figuras 1 y 2 (SEQ ID NO: 1 y 3) se obtuvieron por la formación de secuencias de los clones HPHAE52 y HTPCH84 respecti amente, que se depositaron el 22 de Noviembre de 1996 en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 y dando los números de acceso ATCC 97810 y 97809, respectivamente. Los clones depositados se contienen en el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA) . Las proteínas de TNFR- 6 alfa y T FR- 6 beta de la presente invención, son variantes empalmadas que comparten una secuencia idéntica de aminoácidos y nucleótidos sobre los residuos 142 de la terminal N de las proteínas respectivas. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas son alrededor de 23% similares y comparten dominios múltiples conservados ricos en cisteina con el producto de traducción de la TNFR2 de mARN humano (figura 3) (SEQ ID NO: 6) . De forma importante, estas proteínas comparten una similitud substancial de secuencias sobre una secuencia de polipéptidos que incluye 4 porciones repetidas ricas en cisteina con una homología importante entre las subunidades. El TNFR2 se piensa que media exclusivamente la proliferación de células T humanas por el TNF ( PCT WO/ 9 / 09137 ) . Moléculas de Acido Nucleico A menos que se indique de otra manera, todas la secuencias de nucleótidos determinadas por la formación aquí de secuencias de una molécula de ADN, se determinaron en un formador de secuencias automatizado de ADN (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) , y todas las secuencias de aminoácidos de polipéptidos modificados por moléculas de ADN aquí determinados, se pronosticaron por la traducción de una secuencia de ADN determinada como arriba. Por lo tanto, como se conoce en el arte para cualquier secuencia de ADN determinada por este enfoque automatizado, cualquier secuencia de nucleótido determinada aquí puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por automatización son típicamente al menos alrededor de 90% idénticas, más típicamente alrededor de 95% a al menos alrededor de 99.9% idénticas a la secuencia actual de nucleótidos de la molécula de ADN formada en secuencia. La secuencia actual se puede determinar más precisamente por otros enfoques incluyendo, métodos manuales de formación de secuencias de ADN bien conocidas en el arte. Como también se conoce en el arte, una inserción o eliminación simple en una secuencia determinada de nucleótidos comparada con la secuencia actual, provocará un cambio de estructura en la traducción de la secuencia de nucleótidos tal que la secuencia prevista de aminoácidos codificada por una secuencia determinada de nucleótidos, será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos codificada actualmente por la molécula de ADN formada en secuencia, comenzando en el punto de una inserción o eliminación. Por "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o de un polinucleótido se pretende, para una molécula o polinucleótido de ADN, una secuencia de desoxiribonucleótidos y para una molécula o polinucleótido de ARN, la secuencia correspondiente de ribonucleótidos (A, G, C y U), en donde cada desoxiribonucleotido de timidina (T) en la secuencia especificada de desoxiribonucleotido se substituye por una uridina de ribonucleótido (U) . Usando la información aqui suministrada, tal como las secuencias de nucleótido en las figuras 1 y 2 (SEQ ID NOS: 1 y 3) , se puede obtener una molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica un polipéptido TNFR usando los procedimientos estándar de clonación y separación por exclusión, tales como aquellos para la clonación de cADN usando mARN como el material de partida. Como una forma de ilustrar la invención, se identificaron los clones TNFR-6a y TNFR-ßß (figuras 1 y 2, respectivamente), en colecciones de cADN de los siguientes tejidos: células endoteliales , querat inoci t os , tejido normal de próstata y tejido del tumor de próstata.
Las secuencias determinadas de nucleótidos de los cADN de TNFR de las figuras 1 y 2, (SEQ ID NOS: - 1 y 3) contienen estructuras abiertas de lectura que codifican de 300 y 170 residuos de aminoácidos, con un codón de iniciación en las posiciones de nucleótidos 25-27 y 73-75 de la secuencia de nucleótidos en las figuras 1 y 2 (SEQ ID NO: 1 y 3), respectivamente. Las estructuras abiertas de lectura de los genes TNFR-6a y TN FR- 6 ß comparten la homología de secuencias con el producto de traducción del mARN humano para el TNFR2, incluyendo el dominio soluble extracelular de alrededor de los residuos 31-283 de SEQ ID NO: 2, y 31-166 de SEQ ID NO: 4, respectivamente. Como lo apreciaría alguien con habilidad ordinaria debido a las posibilidades de los errores de secuencia arriba discutidos, los polipéptidos de TNFR completos actuales codificados por los cADN depositados que comprenden alrededor de 300 y 170 aminoácidos, puede ser de alguna forma más largos y más cortos. Más generalmente, las estructuras actuales de lectura abierta pueden estar en cualquier lugar en el rango de ± 20 aminoácidos, más probablemente en el rango de ± 10 aminoácidos, de aquellos pronosticados del primer codón de metionina de la terminación N mostrada en las figuras 1 y 2 (SEQ ID NOS: 1 y 3), que está dentro de la estructura con las secuencias traducidas mostradas en cada figura respectiva. Se apreciará además que dependiendo de los criterios analíticos usados para identificar los diversos dominios funcionales, la "dirección" exacta de los dominios extracelulares y de transmembrana de los polipéptidos de TNFR, puede diferir ligeramente de las posiciones arriba pronosticadas. Por ejemplo, la ubicación exacta del dominio extracelular o regiones antigénicas en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, pueden variar ligeramente (por ejemplo, la dirección puede "girar" por alrededor de 1 a alrededor de 20 residuos,. más probablemente alrededor de 1 hasta alrededor de 5 residuos) dependiendo de los criterios usados para definir los dominios y las regiones antigénicas. En cualquier paso, como se discute además abajo, la invención proporciona además polipéptidos que tienen diversos residuos eliminados de la terminación N del polipéptido completo, incluyendo polipéptidos que carecen de uno o más aminoácidos de la terminación N del dominio extracelular aquí descrito, lo cual constituye formas solubles de los dominios extracelulares de las proteínas TNFR-6a y TNFR-ßß.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas completas de TNFR incluyen una secuencia líder y una proteína madura, como se muestra en la SEQ ID NO: 2 y 4. Más en particular, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican formas maduras de las proteínas TNFR. Así, según la hipótesis de señal, una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de crecimiento de la proteína a través del retículo áspero endoplásmico , las proteínas segregadas por las células de mamíferos tienen una secuencia líder secretora o de señal que es desdoblada del péptido completo para producir una forma segregada "madura" de la proteína. La mayoría de las células de mamíferos y aun las células de insectos desdoblan proteínas segregadas con la misma especificidad. Sin embargo en algunos casos, el desdoblamiento de la proteína segregada no es completamente uniforme, lo cual resulta en dos o más especies maduras de la proteína. Además, se ha conocido por mucho tiempo que la especificidad del desdoblamiento de una proteína segregada, se determina finalmente por la estructura primaria de la proteína completa, esto es, es inherente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por lo tanto, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido maduro de TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un clon de cADN identificado como depósito ATCC No. 97810 ó 97809. Por los "polipéptidos maduros de TNFR que tienen la secuencia de aminoácidos codificada por un clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC 97810 ó 97809", significa la forma madura de la proteina producida por la expresión en una célula de mamífero (por ejemplo, células COS, como se describen abajo) de la estructura completa de lectura abierta, codificada por la secuencia humana de ADN del clon contenido en el vector depositado. Además, están disponibles los métodos para pronosticar si una proteína tiene un líder secretor así como el punto de desdoblamiento para esa secuencia líder. Por ejemplo, el método de McGeoch (Virus Res. 3:271-286(1985) ) usa la información de una región corta cargada en la terminal N y una región posterior sin carga de la proteína completa (sin desdoblar) . El método de vonHeinje {Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986)) usa la información de los residuos que rodean al sitio de desdoblamiento típicamente residuos -13 a + 2 en donde +1 indica la terminación amino de la proteína madura. La precisión para pronosticar los puntos de desdoblamiento de las proteínas secretoras mamíferas conocidas para cada uno de estos métodos, está en el rango de 75-80% (von Heinje, supra) . Sin embargo, los dos métodos no producen siempre los mismos puntos de desdoblamiento pronosticados para una proteína dada . En el caso actual, la secuencia deducida de aminoácidos de los polipéptidos completos de TNFR, se analizó por un programa de cómputo "PSORT", disponibles del Dr. Kenta Nakai del Institute for Chemical Research, Kyoto University (ver K. Nakai and . Kanehisa, Genomics 14:897-911(1992)), que es un sistema experto para predecir la ubicación celular de una proteína basado en la secuencia de aminoácidos. Como parte de esta predicción comput acional de la ubicación, se incorporan los métodos de McGeoch y von Heinje. El análisis de la secuencia de aminoácidos de TNFR por este programa suministra los siguientes resultados: el TNFR-6a y TNFR- 6 ß codifican polipéptidos maduros que tienen la secuencia de aminoácidos de los residuos 31-300 y 31-170 de la SEQ ID NO: 2 y 4, respecti amente. En ciertas modalidades preferidas, el TNFR-6a y TNFR-ßß codifican polipéptidos maduros que tienen la secuencia de aminoácido de los residuos 31-299 y 31-169 de la SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente. Como se indica, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tal como el mARN, o en forma de ADN incluyendo por ejemplo, cADN y ADN genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente. El ADN puede ser de hebra simple o hebra doble. El ADN de hebra simple o ARN puede ser la hebra codificante, también conocida como la hebra de sentido o puede ser la hebra no codificante también referida como la hebra antisentido. Por moléculas "aisladas" de ácido nucleico, se pretende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que se ha separado de su medio natural, por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de moléculas aisladas de ADN, incluyen moléculas recombinante s de ADN mantenidas en células huésped heterólogas o moléculas purificadas de ADN (parcial o substancialmente ) en solución. Las moléculas aisladas de ARN incluyen transcriptos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Sin embargo, un ácido nucleico contenido en un clon que es miembro de una colección mezclada de clones (por ejemplo, una colección genómica o de cADN) y que no ha sido aislado de otros clones de la colección (por ejemplo, en forma de una solución homogénea que contiene al clon sin otros miembros de la colección) o un cromosoma aislado o separado de una célula o lisato de célula (por ejemplo, una "distribución de cromosoma", como en un cariotipo), no esta " aislado" para los propósitos de esta invención. Como se discute adicionalmente aquí, las moléculas aisladas de ácido nucleico de conformidad con la presente invención pueden producirse naturalmente, de forma recombinante o sintéticamente. Las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención, incluyen moléculas de ADN que comprenden una estructura de lectura abierta (ORF) con un codón de iniciación en las posiciones 25-27 y 73-75 de las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NOS: 1 y 3, respectivamente. También se incluyen moléculas de ADN que comprenden la secuencia de codificación para los polipéptidos maduros pronosticados de TNFR mostrados en las posiciones 31-300 y 31-170 en la SEQ ID NOS: 2 y 4, respectivamente. También se incluyen moléculas de ADN que comprenden la secuencia de codificación para los polipéptidos maduros pronosticados de TNFR mostrados en las posiciones 31-299 y 31-169 de la SEQ I NOS: 2 y 4, respectivamente. Además, las moléculas aisladas de ácido nucleico de la invención incluyen moléculas de ADN que comprenden una secuencia substancialmente diferente de aquella descrita arriba pero la cual, debido a la degeneración del código genético, codifica todavía una proteína de TNFR. Por supuesto, las preferencias de código genético y codón especifico de las especies son bien conocidas en el arte. Así, sería rutina para alguien habilitado en el arte generar las variantes degeneradas arriba descritas por ejemplo, optimizar la expresión del codón para un huésped particular (por ejemplo, cambiar codones en el mARN humano por aquellos preferidos por un huésped bacteriano tal como la E. coli) . En otro aspecto, la invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de TNFR que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC 97810 ó 97809. Preferiblemente, esta molécula de ácido nucleico codificará el polipéptido maduro codificado por el clon de cADN depositado arriba descrito. La invención proporciona además una molécula aislada de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 1 ó 2 (SEQ ID NO: 1 ó 3) o la secuencia de nuclelótidos del cADN de TNFR contenido en los clones depositados arriba descritos, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a alguna de las secuencias anteriores. Tales moléculas aisladas, particularmente moléculas de ADN son útiles por ejemplo, como sondas para el mapeo de genes por hibridación in situ con cromosomas, y para detectar la expresión de los genes de TNFR en tejido humano por ejemplo, por análisis de manchado Northern.
La presente invención se dirige además a moléculas de ácido nucleico que codifican porciones de las secuencias de nucleótidos aquí descritas, asi como a fragmentos de las moléculas aisladas de ácido nucleico aquí descritas, en particular, la invención proporciona polinucleót idos que tienen una secuencia de nucleótidos que representa la porción de SEQ ID NO: 1 ó 3, la cual consiste de las posiciones 25- 924 y 73-582 de la SEQ ID NO: 1 y 3 respectivamente. También se contemplan polinucleótidos que codifican los polipéptidos de TNFR que carecen de una metionina en la terminal amino, tales polinuclelótidos tienen una secuencia de nucleótidos que representa la porción de la SEQ ID NOS: 1 y 3 que consisten de las posiciones 28-924 y 76-582 respectivamente. Los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos también se suministran, tales polipéptidos comprende una secuencia de aminoácido en las posiciones 2-300 y 2-170 de SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente. Además, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias de nucleótidos relacionadas con las porciones prolongadas de SEQ ID NOS: 1 y 3, como siguen: HELD106R (SEQ ID NO: 17) y HCEOW38R (SEQ ID NO: 18) se relacionan a ambas SEQ ID NOS: 1 y 3. Se prefieren los fragmentos de polinucleót ido de la SEQ ID NOS: 1 y 3 que no son la SEQ ID NO: 17 o 18 o de la SEQ ID NO: 17 6 18. Las secuencias de HELD106R y HCEOW38R se muestran . en la figura 6. Más generalmente, mediante un fragmento de una molécula aislada de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos del cADN depositado o la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 1 ó 2 (SEQ ID NO: 1 ó 3) se pretenden fragmentos de al menos alrededor 15 nt, y más preferiblemente alrededor de 20 nt, aún más preferiblemente al menos alrededor de 30 nt y todavía más preferiblemente al menos alrededor de 40 nt de longitud. Estos fragmentos tienen diversos usos que incluyen pero no se limitan a, sondas de diagnóstico y cebadores como se discute aquí. Por supuesto, los fragmentos más grandes de 50 a 300 nt de longitud, son también útiles según la presente invención como lo son los fragmentos que corresponden a la mayoría de, si no es que a toda, la secuencia de nucleótidos de los cADN depositados o como se muestran en las figuras 1 y 2 (SEQ ID NOS: 1 y 3) . Se prefieren especialmente los fragmentos que comprenden al menos 500 nucleótidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 92%, o 95% idénticos a 500 nucleótidos contiguos mostrados en la SEQ ID NO: 1. Por un fragmento de al menos alrededor 20 nt de longitud por ejemplo, se pretenden fragmentos que incluyen 20 o más bases contiguas de la secuencia de nucleótidos de un cADN depositado o la secuencia de nucleótido como se muestra en las figuras 1 y 2 (SEQ ID NOS: 1 y 3) . En este contexto, "alrededor" incluye el tamaño particularmente mencionado, y aquellos tamaños que son más grandes o más pequeños por varios nucleótidos (5,4,3,2 ó 1), en cualquier terminación o en ambas terminaciones. Los fragmentos preferidos de ácido nucleico de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican porciones que soportan epitopes de los polipéptidos de TNFR como se identifican en las figuras 4 y 5 y se describen abajo en mayor detalle. Ejemplos representativos de los fragmentos de ácido nucleico de TNFR-6oc de la invención, incluyen por ejemplo, fragmentos que comprenden, o consisten alternativamente de una secuencia desde alrededor del nucleótido 1 hasta alrededor del nucleótido 25, alrededor del nucleótido 26 hasta alrededor del nucleótido 75, alrededor del nucleótido 76 hasta alrededor del nucleótido 114, alrededor del nucleótido 115 hasta alrededor de 162, alrededor del 163 hasta alrededor del nucleótido 216, alrededor del nucleótido 217 hasta alrededor del nucleótido 267, alrededor del nucleótido 268 hasta alrededor del nucleótido 318, alrededor del nucleótido 319 hasta alrededor del nucleótido 369, alrededor del nucleótido 370 hasta alrededor del nucleótido 420, alrededor del nucleótido 421 hasta alrededor del nucleótido 471, alrededor del nucleótido 472 hasta alrededor del nucleótido 522, alrededor del nucleótido 523 hasta alrededor del nucleótido 573, alrededor del nucleótido 574 hasta alrededor del nucleótido 625, alrededor del nucleótido 626 hasta alrededor del nucleótido 675, alrededor del 676 hasta alrededor del nucleótido 714, alrededor del nucleótido 715 hasta alrededor del nucleótido 765, alrededor del nucleótido 766 hasta alrededor del nucleótido 816, alrededor del nucleótido 817 hasta alrededor del nucleótido 867, alrededor del nucleótido 868 hasta alrededor del nucleótido 924, alrededor del nucleótido 925 hasta alrededor del nucleótido 975 de SEQ ID NO: 1, o la hebra complementaria al mismo, o el cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No. 97810. En este contexto, "alrededor" incluyen los intervalos particularmente mencionados y aquellos intervalos que son mayores o más pequeños por varios nucleótidos (5,4,3,2 ó 1) en cualquier terminación o en ambas terminaciones. En modalidades especificas, los fragmentos de ácido nucleico de la invención comprenden, o consisten alternativamente de, una secuencia de polinucleót idos que codifican residuos de aminoácidos 100 a 150, 150 a 200, 200 a 300, 220 a 300, 240 a 300, 250 a 300, 260 a 300, y/o 280 a 300, de SEQ ID NO: 2, o la hebra complementaria al mismo. Los polinucleótidos que hibridizan a estos fragmentos de polinucleótidos están también cubiertos por la invención. Ejemplos representativos de' los fragmentos de ácido nucleico de TNFR-ßß de la invención incluyen por ejemplo, fragmentos que comprenden o consisten alternativamente de una secuencia desde alrededor del nucleótido 1 hasta alrededor del nucleótido 36, alrededor del nucleótido 37 hasta alrededor del nucleótido 72, alrededor del nucleótido 73 hasta alrededor del nucleotido 123, alrededor del nucleotido 124 hasta alrededor del nucleotido 175, alrededor del nucleotido 176 hasta alrededor del nucleotido 216, alrededor del nucleotido 217 hasta alrededor del nucleotido 267, alrededor del nucleotido 268 hasta alrededor del nucleotido 318, alrededor del nucleotido 319 hasta alrededor del 369, alrededor del nucleotido 370 hasta alrededor del nucleotido 420, alrededor del nucleotido 421 hasta alrededor, del nucleotido 471, alrededor del nucleotido 472 hasta alrededor del nucleotido 522, alrededor del nucleotido 523 hasta alrededor del nucleotido 58'2, alrededor del nucleotido 583 hasta alrededor del nucleotido 622, alrededor del nucleotido 623 hasta alrededor del 682, alrededor del nucleotido 683 hasta alrededor del nucleotido 750, alrededor del nucleotido 751 hasta alrededor del nucleotido 800, alrededor del nucleotido 801 hasta alrededor del 850, alrededor del nucleotido 851 hasta alrededor del nucleotido 900, alrededor del nucleotido 901 hasta alrededor del nucleotido 950, alrededor del nucleotido 951 hasta alrededor del nucleotido 1000, alrededor del nucleotido 1001 hasta alrededor del nucleotido 1050, alrededor del nucleotido 1051 hasta alrededor del 1100, alrededor del nucleótido 1101 hasta alrededor del nucleótido 1150, alrededor del nucleótido 1151 hasta alrededor del nucleótido 1200, alrededor del nucleótido 1201 hasta alrededor del nucleótido 1250, alrededor del nucleótido 1251 hasta alrededor del nucleótido 1300, alrededor del nucleótido 1301 hasta alrededor del 1350, alrededor del nucleótido 1351 hasta alrededor del 1400, alrededor del nucleótido 1401 hasta alrededor del nucleótido 1450, alrededor del nucleótido 1451 hasta alrededor del 1500, alrededor del nucleótido 1501 hasta alrededor del 1550, alrededor del nucleótido 1551 hasta alrededor del nucleótido 1600, alrededor del nucleótido 1601 hasta alrededor del nucleótido 1650, alrededor del nucleótido 1651 hasta alrededor del 1667 de SEQ ID NO: 3, o la hebra complementaria al mismo, o el cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No. 97809. En este contexto, "alrededor" incluye los intervalos particularmente mencionados, y aquellos intervalos que son mayores o menores por varios nucleótidos (5,4,3,2 ó 1), en cualquier terminación o ambas terminaciones.
En modalidades especificas, los fragmentos de ácido nucleico de la invención comprenden o consisten alternativamente de, una secuencia de polinucleotidos que codifica residuos de aminoácido 50 a 100, 100 a 170, 110 a 170, 130 a 170, 140 a 170, 150 a 170, y/o 160 a 170, de la SEQ ID NO: 4, o la hebra complementaria al mismo, los polinucleotidos que hibridizan a estos fragmentos de polinucleotidos también están abarcados por la invención. Preferiblemente, los fragmentos de polinucleótido de la invención, codifican un polipéptido que demuestra una actividad funcional TNFR-6cc y/o TNFR-ßß. Por un polipéptido que demuestra "actividad funcional" quiere decir, un polipéptido capaz de desplegar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con un TNFR-6a y/o TNFR- 6ß completo (de longitud completa) o maduro. Tales actividades funcionales incluyen pero no se limitan a, actividad biológica (por ejemplo, inhibición o reducción de la apoptosis mediada por FasL, inhibición o reducción de. la apoptosis mediada por AI -II), ant igenicidad [capacidad para enlazar (o completar un polipéptido TNFR- 6a y/o TNFR- 6ß para enlace) a un anticuerpo anti-TNFR-6a y/o anticuerpo anti-TNFR- 6ß), inmunogenicidad (capacidad de generar anticuerpos que se enlazan al polipéptido TNFR-ßa y/o TNFR-ßß) , capacidad para formar multimeros con los polipéptidos TNFR-6ct y/o TNFR-ßß de la invención, y capacidad para enlazarse a un receptor o ligando para un polipéptido TNFR-6a y/o TNFR-dß (por ejemplo, ligando Fas y/o AI -II (solicitud internacional con número de publicación WO 97 /34911, publicada el 25 de Septiembre del 97) ) . La actividad funcional de los polipéptidos TNFR-6cc y/o TNFR- 6ß y fragmentos, derivados de variantes y análogos de los mismos se pueden ensayar por diversos métodos. Por ejemplo, en una modalidad donde se ensaya la capacidad para enlazar o competir con el polipéptido completo (longitud completa) o maduro de TNFR- 6a y/o TNFR-ßß para enlazar el anticuerpo anti-TNFR-6oc y/o ant i -TN FR- 6ß , se pueden usar diversos inmunoensayos conocidos en el arte, incluyendo pero no limitándose .a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como radio inmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos "intercalados" ensayos inmunoradiomét ricos , reacciones de precipitación por difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos inmunes in si tu (usando oro coloidal, enzimas o etiquetas de radioisótopos por ejemplo), manchados Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación por gel, ensayos de hemoaglutinación ) , ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmuno f luore s cene i a , ensayos de la proteina A, ensayos de inmunoelectroforesis etc. En una modalidad, el enlace de anticuerpo se detecta al detectar una etiqueta en el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario se detecta al detectar el enlace del anticuerpo o reactivo secundario al anticuerpo primario. En una modalidad adicional, el anticuerpo secundario se etiqueta. Se conocen muchos medios en el arte para detectar el enlace en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. En otra modalidad, en donde se identifica un ligando-TNF (por ejemplo, ligando Fas y/o AIM-II (Solicitud Internacional con número de publicación WO 97/34911, publicada el 25 de Septiembre de 1997) ), o se está evaluando la capacidad de un fragmento de polipéptido, variante o derivado de la invención para muí t ime r i za r , se puede ensayar el enlace, por ejemplo, por medios bien conocidos en el arte tales como por ejemplo, cromatografía por gel reductora y no reductora, cromatografía por afinidad de proteínas y manchado por afinidad. Ver generalmente, Phizicky, E., et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995) . En otra modalidad, se pueden ensayar correlaciones fisiológicas del enlace TNFR- 6a y/o TNFR-ßß a sus substratos ( t rans ducci ón por señal). Además, los ensayos aquí descritos (por ejemplo, ver ejemplos 7 - 9) y de otra manera conocidos en el arte, se pueden aplicar rutinariamente o modificar para medir la capacidad de los polipéptidos y fragmentos TNFR-6cc y/o TNFR-6ß, derivados de variantes y análogos de los mismos, para producir la actividad biológica relacionada con TNFR- 6a y/o TNFR- 6ß (por ejemplo para inhibir o reducir la apoptosis mediada por FasL in vitro o in vivo, o para inhibir o reducir la apoptosis mediada por AIM-II in vitro o in vivo) .
Por ejemplo, la capacidad de los po 1 ipép t ido s TNFR de la invención para reducir o bloquear la apoptosis mediada por FasL, se puede ensayar usando una linea de células T que expresa Fas, tal como Jurkat. En este ensayo, las células Jurkat tratadas con FasL soluble, se someten a apoptosis. El pre-tratamiento de células con TNFR y/o agonistas de TNFR antes de la adición del FasL protege a la célula de padecer apoptosis y resulta en un nivel reducido de apoptosis cuando se compara con aquel observado cuando la misma concentración de FasL soluble, está en contacto con la misma concentración de células que expresan Fas en ausencia del polipéptido de TNFR o el agonista de TNFR. Alternativamente, la mezcla de la proteina FasL con el TNFR y/o agonista de TNFR, bloqueará también la capacidad de FasL para enlazar las células Jurkat y mediar la apoptos s (ver por ejemplo, ejemplo 9) . En contraste, los antagonistas de TNFR de la invención bloquean la inhibición mediada por TNFR de la apoptosis mediada por FasL. De esta manera, los antagonistas de TNFR de la invención se pueden ensayar por ejemplo, al combinar el TNFR maduro (conocido por enlazar el FasL) , el antagonista TNFR a ser probado, y el FasL soluble, y poner en contacto esta combinación con una linea de células que expresan el Fas. Los antagonistas de TNFR reducen o bloquean la inhibición mediada por TNFR o la apoptosis mediada por FasL. De esta manera, las células T que expresan Fas en contacto con TNFR maduro, antagonista de TNFR o FasL soluble, muestran niveles elevados de apoptosis cuando se comparan con la misma concentración de células que expresan Fas que han estado en contacto con las mismas concentraciones de TNFR maduro y FasL en ausencia del antagonista TNFR. Se puede medir la apoptosis por ejemplo, por el teñido creciente con anexina, que enlaza selectivamente las células apoptóticas. En otro ejemplo, la disminución en los números de células debido a la apoptosis se puede detectar por una disminución en el teñido con azul ALOMAR que detecta las células viables. Otros métodos serán conocidos por el técnico habilitado y están dentro del alcance de la invención . En modalidades adicionales, los polinucleót idos de la invención codifican atributos funcionales del TNFR- 6a y/o TNFR-ßß. Las modalidades preferidas de la invención a este respecto incluyen fragmentos que comprenden alfa- hélice y regiones formadoras alfa-hélice ("regiones alfa") beta-lámina y regiones formadoras beta-lámina ("regiones beta"), giro y regiones formadoras de giro ("regiones de giro"), serpentín y regiones formadoras de espiral (regiones de espiral ("regiones de espiral") regiones hidrofílicas , regiones hidrof óbicas , regiones a 1 fa -an f ipá t i ca s , regiones beta- anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman superficies y regiones de elevado índice antigénico de los polipéptidos TNFR- 6a y/o TNFR- 6ß. Ciertas regiones preferidas a este respecto, se establecen en la figura 4 (tabla 1) y en la figura 5 (tabla II) . Los datos presentados en la figura 4 y figura 5 y aquellos presentados en la tabla I y tabla II respectivamente, presentan meramente un formato diferente de los mismos resultados obtenidos cuando la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 se analizan usando los parámetros por eliminación del algoritmo de computadora DNA * S TAR .
Las regiones preferidas arriba mencionadas establecidas en la figura 4 (tabla I) y la figura 5 (tabla II) incluyen pero se limitan a, regiones de los tipos arriba mencionados identificados por el análisis de la secuencia de aminoácidos establecido en la figura 1 y figura 2. Como se establece en la figura 4 (tabla I) y figura 5 (tabla II), tales regiones preferidas incluyen regiones alfa Garnier-Robson, regiones beta, regiones de giro, y regiones de espiral, regiones alfa Chou-Fasman, regiones beta y regiones de espiral, regiones hidrofilicas Kyt e - Doo 1 i 11 le , regiones alfa y beta anfipáticas Eisenberg, regiones flexibles Ka rplus - S chul z , regiones formadoras de superficie Emini y regiones Jameson-Wolf de alto índice antigénico. Entre los polipéptidos altamente preferidos a este respecto, están aquellos que codifican polipéptidos que comprenden las regiones TNFR-6oc y/o TNFR-ßß que combinan diversas características estructurales, tales como diversas (por ejemplo, 1, 2, 3, ó 4) de las características arriba establecidas. Adicionalment e , los datos presentados en las columnas VIII, IX, XIII y XIV de las tablas I y II se pueden usar rutinariamente para determinar las regiones de TNFR-ß las cuales muestran un alto grado de potencial para ant igenicidad . Las regiones de alta ant igenicidad se determinan de los datos presentados en las columnas VIII, IX, XIII y/o XIV al escoger los valores que representan las regiones de polipéptido que probablemente se expondrán a la superficie del polipéptido en un medio en el cual el reconocimiento del antigeno puede suceder en el proceso de iniciación de una respuesta inmune.
Tabla I Res Posición I II III IV V Vil VII! EX X xi.. XII XII! XIV ei 1 B 0.06 0.09 • -0.10 0.60 Ara B 0.10 -0.34 - 0.50 o.s: Ala 3 B 0.2S -0.34 • 0.50 0.63 Leu 4 A 0.32 -0.34 0.50 O.oo Glu 5 A -0.10 -0.53 • F 0.95 0.50 Gly 6 T c 0.20 0.16 * F 0.45 0.41 Pro 7 T T -0.72 004 * F 0.65 0.66 Gly S T T -0.94 0.04 F 0.65 0.32 Leu 9 A T -O.gO 0.73 -0.20 0.26 Ser 10 A A -1.61 0.87 -0.60 O.OO Leu I 1 A B -2.1 1.13 -0.60 0.08 Leu 12 A B 1.34 -0.60 0.07 Cys 13 A B -2.97 1.34 -0.60 0.04 Leu 14 A B ' -2.97 1.46 -0.60 0.05 Val 15 A B -2.88 146 -0.60 0.05 Leu 16 A B -2.66 1.20 -0.60 0.15 Ala 17 A B -2.66 1 13 -0.60 0.18 Leu 18 A B -2.80 1.13 -0.60 0.20 Pro 10 A A -2.20 1,17 -0.60 0.20 Ala 20 A B -2.20 0.91 -0.60 0. 1 Leu 21 A B -1.60 1.06 * -0.60 028 Leu A B -1.60 0.80 -0.60 0.28 Pro 23 A B -1.64 0.87 * -0.60 0.28 Val 24 B -1.32 1.01 • -0.40 0.25 Pro 25 B -1.08 0.33 • -0.10 0.60 Ala 26 B B -1.12 0.07 -0.30 0.38 Val B B -0.90 0.29 • * -0.30 0.38 Ara 28 B B -0.69 0.14 • * -0.30 0.25 Gl 29 B B -0.14 -0.29 * 0.30 0.43 Vai 30 B B -0.14 -0.30 • • 0.30 0.83 Ala 31 B B 013 -0.51 * • 0.60 0.66 Glu 32 B 0.74 -0.03 • F 0.65 0.96 Thr 33 B T 0.42 0.30 • * F 0.40 2.02 Pro 34 T T 0.48 0.09 * • F 0.80 3.10 Thr 35 T T 1.44 0.50 F 0.50 1.88 Tyr 36 T c 2.03 0.50 0.15 2.55 Pro 37 T 1.44 0.01 * 0.45 2.76 Trp 38 A c 1.76 0.09 0.05 1.93 Arg 39 A B 1.66 -0.40 • F 0.60 2.13 Asp 40 A A 1.62 -0.67 • F 0.90 1.99 Ala 41 A c 1.87 -0.67 F 1.10 1.87 Glu 42 A A 2.19 -1.59 • * F 0.90 1.66 Thr 43 A A 1.67 -1.59 - F 0.90 1.94 Glv 44 A T 0.70 -0.90 F 1.30 1.59 Glu 45 A A 0.03 -0.76 • * F 0.75 0.68 Arg 46 A A 0.03 -0.19 * F 0.45 0.25 Leu 47 A A 0.03 -017 • 0.30 0.26 Val 48 A B -0.32 -0.20 0.30 0.26 Cys 49 A B -0.19 0.37 •0.30 0.07 Ala 50 A B -0.40 0.80 -0.60 0.13 Gln 51 A B -086 0.54 -0.60 0.28 Cys 52 A B -0.36 0.33 -0.30 0. 1 Pro 53 T -0.20 0.24 F 0.45 0.73 Pro 54 T T -0.39 0.53 F 0.35 0.36 Glv 55 T T 0.20 0.77 • F 0.35 0.50 Thr 56 B T 0. 1 0.60 F -0.05 0.56 Tabla I Res Posición 1 11 111 G?' V VI Vil VIH IX X X! . XI! ?1? xrv Phe 57 B B 077 017 r -0.15 0.71 Va! 58 B B 0. 1 0.1 0.10 1.12 Gln 59 B B 0.63 0.3! F 0.53 0.41 Arg 60 B T 1.09 -0.P · F 1.S7 0.94 Pro 61 B T 1.40 -0.96 ' F 2.66 2.47 Cys 62 T T 1.80 -1.60 · F 3.40 2.38 Arg 63 T T 244 -1.61 * F 3.06 1.63 Arg 64 T 2.13 -1.19 · F 2.77 1.63 Asp 65 T 1.7! -1.13 ' F 2.68 4.39 Ser 66 T T 1.26 -1.21 F 2.79 3.24 Pro 67 T T 1.58 -0.64 F 2.55 0.89 Thr 68 T T 1.26 -0.2 ! F 2.50 0.52 Thr 69 T T 0.48 0. 1 F 1.65 0.61 Cys 70 T 0.27 0.40 F 1.14 0.21 Glv 7 ¡ T T 036 0.40 * F 1.33 0.22 Pro 72 T T 0.68 0.34 c 1.62 0.24 Cvs 73 T c 0.96 ¦01 - . - F 2.01 0.88 Pro 74 T c 1.02 -0.21 · F 2.40 1.21 Pro 75 T T 1.38 0.11 · F 1.76 1.23 Arg 76 T T 1.72 0.17 * F 1.52 3.30 His 77 B T 1.23 O.OO · F 0.88 3.70 Tyr 78 B T 161 0.36 * • 0.49 2.07 Thr 79 B 1.82 0.84 - -0.25 1.11 Gin 80 B 1.79 1.24 - • -0.25 1.31 Phe 81 T 0.87 1.50 · • 0.15 1.31 ? 82 T 0.90 1.43 · 0.00 0.75 Asn 83 A T 1.26 0.94 · -0.20 0.75 Tyr 84 A T 0.90 0.54 · • -o:os 1.70 Leu 35 A T 1.01 0.33 · • 0.38 0.87 Glu 86 A T 1.47 -0.59 · • 1.71 1.05 Arg 87 A T 1.09 -0.23 • 1.69 1.05 Cys 88 T T 1.09 -0.41 • 2.22 0.69 Arg 89 T T 0.48 -0.70 . • 2.80 0.64 Tvr 90 T T 0.48 -0.06 . • 2.22 0.24 Cys 91 T T -0.1 0.63 • 1.04 0.37 Asn 92 B B -0.64 0.63 • -0.04 0.10 Val 93 B B 0.02 1.06 • -0.32 0.06 Leu 94 B B 0.02 0.30 -0.30 0.21 Cys 95 B T 0.27 -0.27 0.70 0.25 Gly 96 T c 0.93 -0.67 F 1.35 0.59 Glu 97 A T 0.93 -1.31 F 1.30 1.24 Arg 98 A T 1.20 -2.00 F 1.30 4.00 Giu 99 A A 2.12 -2.07 . F 0.90 4.08 Glu 100 A A 2.20 -2.50 F 0.90 4.61 Glu 101 A A 1.88 •2.00 F 0.90 2.38 Ala 102 A A 1.84 -1.43 F 0.75 0.74 Arg 103 A A 1.14 -0.93 0.60 0.58 Ala 104 A A 0.83 -0.43 0.30 0.34 Cvs 105 A A 0.80 0.06 • -0.30 0.48 His 106 A A 0.80 0.06 · • -0.30 0.34 Ala 107 A A 1.50 0.46 · • -0.60 0.53 Thr 108 A A 0.80 -004 · 0.45 1.95 His 109 A T 0.72 -0.11 * 1.13 1.45 Asn 110 A T 1.50 -0.04 · 1.26 0.77 Arg 111 A T 0.87 -0.54 . - 1.99 1.04 Ala 112 A T 1.57 -0.46 • 1.82 0.41 Tabla I (contínuacion) Res Posición II til rv V VI VII VIII K X X! XI! XI!! XTV Cys 1 '.5 T T 1.57 -096 * 2.80 0.50 Are 114 3 T 1.26 -0.S7 · 2. ¡2 0.37 Cys 115 T T 0.56 -0.44 · * 1.94 0.36 Ars 116 T T -0.26 -0.16 * 1.6o 0.5S Thr" 11" A B T -0.26 0.06 * F 0.53 0.26 Gly 115 A B T 0.38 0.56 • -0.20 0.49 Phe 119 A B B -0.32 0.49 • -O.eO 0.34 Phe 120 A B B -0.00 0.99 * -060 0.24 Ala 121 A A B -0.8! 093 • -0.60 0.24 Kis 122 A A -1.17 1.29 -0.60 0.24 Aia 123 A A -1.63 1.07 -0.60 0.15 CW 124 A A -0.93 0.97 -0.60 0.12 Phe 125 A A -0.27 047 -O.60 0.15 Cvs 12ó A A -0.27 0.47 * -0.60 0.20 Leu 127 A A -0.53 0.47 •0 oO 0.21 Clu 128 A A -0.6! 043 -0.60 0.32 His 129 T T -0.48 0.21 0.50 0.32 Ala 130 T T 0.01 0.07 0.63 0.61 Ser 131 T T 0.33 -0.19 . 1.36 0.54 Cvs 132 T c 0.56 0.24 0.69 0.39 Pro 133 T c 0.21 0.24 F 0.9- 0.39 Pro 1 4 T T -0.61 0.17 F 1.30 0.29 Gly 135 T T -0.9! 0.43 F 0.87 0.40 Ala 136 B T -1.20 054 0.19 0.18 Gly 137 B B -0.74 0.6! -0.34 0.12 Va! 138 B B -0.88 0.6! -0.47 0.1 lie 139 B B -0.98 0.61 -0.60 0.18 Aia 140 B B -0.84 0.60 -0.60 0.27 Pro 141 B -0.56 0.60 F -0.25 055 Gly 142 T -0.21 0.34 F 0.88 1.06 Thr 143 T c 0.64 0.06 F 1.16 1.82 Pro 1 4 T c 1.22 -0.04 F 2.04 1.89 Ser 145 T T 1.81 0.01 F 1.92 2.76 Gln 146 T T 1.36 -0.01 F 2.80 3.31 Asn 147 T T 1.70 0.07 F 1.92 1.15 Thr 148 T T 1.80 0.04 F 1.64 1.48 Gln 1 4 T T 1.34 0.09 F 1.36 1.32 Cys 150 B T 1.43 0.26 F 0.53 0.44 Gln 151 B 1.22 0.29 F 0.05 0.47 Pro 152 B 088 0.23 • F 0.05 0.42 Cvs 153 B 0.88 0.26 * F 0.05 0.78 Pro 154 B T 0.18 0.17 F 0.25 0.65 Pro 155 T T 0.5J 0.56 • F 0.35 0.36 Glv 156 T T -0.04 0.51 * F 0.35 0.91 Thr 157 B T -0.13 0.44 F -0.05 0.59 Phe 153 B 0.23 0.40 F -0.25 0.51 Ser 159 B 0.14 0.36 F 0.39 0.70 Ala 160 B 0.06 0.3! F 0.73 0.65 Ser 161 T c 0.10 0.21 F 1.62 1.00 Ser 162 T c 0.41 -0.19 F 2.56 1.00 Ser 163 T T !.! ! -0.57 F 3.40 1.72 Ser 164 T T 0.74 -0.67 F 3.06 2.22 Ser 165 T 1.33 -0.49 F 2.07 0.89 Glu 166 T 1.42 -0.47 F 1.88 1.15 Gln 167 T 1.69 -0.43 F 1.82 1.32 Cvs 168 T 2.10 -0.31 F 1.76 1.34 Tabla I (continuación) Res Posición 1 11 III IV V VI il VIII K X XI XII XIII XTY GIn 169 B 2.40 -0.70 F 1.04 1.52 Pro 170 T 2.03 -0.30 F 2.32 1.41 His 171 T T 1.72 -0.13 r 2.80 1 41 Arg 172 T T 1.13 -0. 1 F 2.52 1.18 Asn 173 T T 0.99 -o.i i • 1.94 0.77 Cys 174 B T 0.64 0.14 0.66 0.4? Thr 175 A B 0.04 0.07 -0.02 0.24 Ala 176 A B -0.51 0.76 • -0.60 0.12 Leu ¡77 A E -1.43 0.86 * -0.60 0.23 Cly 173 A E -1.43 0.97 • -0.60 0 13 Leu 179 A B -1.62 0.89 • -0.60 0.21 Ala 180 A B -1.52 1.03 -0.60 0.19 Leu 181 A B -1.28 0.77 -0.60 0.29 Asn 182 A B -0.77 0.77 • -0.60 0.35 Val 183 B T -0.72 0.47 * F -0.05 0.46 Pro 184 T c -0. 1 0.36 F 0.73 0.75 Cly 185- T T 0.34 0.06 • - F 1.21 0.63 Ser 186 T T 1.16 0.16 F 1.64 1 15 Ser 187 T c 0.84 -0.49 F 2.32 1.24 Ser 188 T T 0.89 -0.43 F 2.80 1.81 His 189 B T 0.43 -0.17 F 2.12 I I 1 Asp 190 T T 0.47 0.01 F 1.49 0.45 Thr 191 B 0.47 0.11 F 0.61 0.48 Leu 192 B 0.10 0.11 0.18 0.47 Cys 193 B T 0.09 0.19 0.10 0.15 Thr 1 4 B T -0.22 0.67 -0.20 0.15 Ser 195 B T -0.92 0.61 F -0.05 0.18 Cys 196 B T -0.82 0.71 F -0.05 0.29 Thr 197 T -0.82 0.57 F 0.15 0.31 Oly 198 T -0.46 0.77 0.00 0.19 P e 199 B -0.46 0.77 • -0.40 0.48 Pro 200 B -0.04 0.69 * • -0.40 0.48 Leu 201 B -0.23 0.20 • * -0.10 0.96 Ser 202 B -0.13 0.41 • F 0.02 0.82 Thr 203 B -0.13 0.06 F 0.59 0.82 Arg 204 c -0.02 0.06 F 1.06 0.99 Val 205 T c 0.19 -0.1 F 2.13 0.74 Pro 206 T c 1.00 -0.51 F 2.70 0.89 Cly 207 T c 0.63 -1.00 F 2.43 0.79 Ala 208 A T 0.94 -0.43 F 1.66 0.57 Glu 209 A A 0.94 -1.07 F 1.29 0.64 Glu 210 A A 1. 1 -1.50 • F 1.17 1.26 Cys 211 A A 0.57 -1.43 * F 0.90 1.26 Glu 212 A A 0.02 -1.29 * F 0.75 0.54 Arg 213 A A 0. 1 -0.60 * • 0.60 0.22 Ala 214 A A -0.09 -O.60 * • 0.60 0.68 Val 215 A A -0.94 -0.39 * 0.30 0.34 lie 216 A A -0.87 0.26 * • -0.30 0.13 Asp 217 A A -1.57 0.76 * • -0.60 0.13 Phe 218 A A -1.68 1.04 • • -0.60 0.15 Val 219 A A -1.09 0.80 -0.60 0.37 Ala 220 A A -1.12 0.11 -0.30 0.37 Phe 221 A A -0.53 0.80 • -0.60 0.30 Gln 222 A A -1.42 0.40 • -0.60 0.54 Asp 223 A A -0.68 0.44 F -0.45 0.38 lie 224 A A 0.29 -0.06 F 0.45 0.87 Tabla I (continuación) Res Posición 1 II ni rv v VI VII VIH K X XI ... XII XII! XTV Ser 225 A A 0.0" -0.84 . F 0.75 099 He 226 A A 0.-7 -0.56 · p 0."5 0.49 Lys 22? A A 0.8S -0.16 · F 060 1.20 228 A A 0.07 -0.84 * F 0.90 1.76 Leu 229 A A 0.14 -0.54 · F 0.90 2.07 Gln 230 A A 0.44 -0.54 · F 0.75 0.85 Arg 231 A B 0.74 -0.14 · 0.30 0.76 Leu 232 A A -0.11 0.36 -0.30 0.93 Leu 233 A B -0.22 0.36 ' -0.30 044 Gln 234 A B -0.00 -0.04 · 0.30 0.39 Ala 235 A B -0. 1 0.46 -0.60 0.4S Leu 236 A B -0.32 0.20 * - -0.30 0.89 Giu 237 A B 0.14 -049 . 0.30 0.S9 Ala 23S B T 067 -0.46 F 0.85 0.8S Pro 239 T T 0.32 -0.04 r 1.40 1.12 Glu 240 T T 0.70 -0.30 F 1.25 0.64 Glv 241 T T 1.20 0.13 F 0.65 0.98 Trp 242 T 099 0.11 F 04 0.91 Gly 243 c 1,69 0.11 F 0.59 081 Pr¿ 244 c 1.31 0.11 F 1.08 1.61 Thr 245 T c 0.97 0.19 F 1.62 1.55 Pro 246 T c 1.42 -0.30 · F 2.56 1.55 Arg 247 T T 1 12 -0.73 · F 3.40 1.96 Ala 24S T c 0.88 -0.66 * F 2.86 1.37 Gly 249 A A 0.28 -0.64 · F 1.77 0.90 A g 250 A A 0.59 -0.39 · • 0.98 0.38 Ala 251 A A -0.01 0.01 0.04 0.65 Ala 252 A A -0.08 0.20 • -0.30 0.54 Leu 253 A A -0.30 -0.23 · * 0.30 0.55 Gln 254 A A 0.1 0.46 • -0.60 0.45 Leu 255 A A 0.16 -0.04 • 0.30 0.87 Lys 256 A A 0.86 -0.54 • 0.75 2.07 Leu 257 A A 0.63 -1.23 . F 0.90 2.34 Arg 258 A A 1.13 -0.94 · F 0.90 2.34 Arg 259 A B 1.13 -1.14 · F 0.90 1.69 Arg 260 A B 1.13 -1.14 · F 0.90 3.55 Leu 261 A B 0.28 -1.14 * F 0.90 1.49 Thr 262 A B 0.74 -0.46 * F 0.45 0.63 Glu 263 A B 0.04 -0.03 · • 0.30 0.32 Leu 264 A B -0.07 0.47 · -0.60 0.39 Leu 265 A B -0.18 0.19 • -0.30 047 Gly 266 A A 0.29 -0.30 0.30 0.45 Ala 267 A T 0.01 0.? F 0.25 0.54 Gln 268 A T -0.80 -0.06 F 0.85 0.66 Asp 269 A T -0.80 -0.06 F 0.85 0.55 Gly 270 A T -0.84 0.20 • 0.10 0.45 Ala 271 A A -0.39 0.34 · • -0.30 0.19 Leu 272 A B -0.61 -0.06 · 0.30 0.23 Leu 273 A B -1.42 0.63 • -0.60 0.19 Val 274 A A -1.42 0.89 · • -0.60 0.15 Arg 275 A A -1.67 0.79 · • -0.60 0.32 Leu 276 A A -1.89 0.60 * • -0.60 040 Leu 277 A A -0.97 0.60 • -060 0.44 Gin 278 A A -1.01 -0.04 · • 0.30 0.44 Ala 279 A A -0.74 0.60 • -0.60 0.40 Leu 280 A A -0.74 0. 1 * -0.60 0.49 Tabla I (continuación) Res Posición 1 II II¡ IV V VI Vil vm EX Xi ?? x:¡i XTV Ars 28! A B -0.53 -0.2 0.30 0.55 VaF 2S2 A B 0.07 -O.06 0.30 0.54 Ala 2S3 A B -0.28 -0.13 0.7: 1.01 Arg 28¿ A B -0.50 -0.39 0.84 0.5 i Met 285 B T 0.31 0.30 0. 1 0.
Pro 286 T c 0.31 -0.34 F 2.13 0.97 Gly 28" T c 0.87 -0.S4 F 2.70 01- Leu 2S8 A T 0.60 -0.46 F 2.0S 1.32 Glu 289 A 0.60 -0.43 r 1.40 0.63 Arg 290 A 1.20 -0.86 F 1.64 1.25 Ser 291 A 1.52 -1.29 F 1.37 2.62 Val 292 A t.17 -1.97 F 1.10 2.97 Arg 293 A 1.17 -1.19 F 1 10 1.31 Glu 294 A 0.96 -0.50 F 0.65 0.81 Ars 295 A -0.01 -046 F 0.80 1.6S Ph. 296 B 0.26 -0.46 0.50 0.64 297 3 0.72 0.0J -0.10 0.50 Pro 298 A 0.22 0.47 -040 0.33 Val 299 A -0.1 0.90 -0.40 0.48 His 300 A -0.67 0.54 -0.40 0.75 Tabla II Res Posición 1 II III IV V VI Vil VIH K X XI XI! Xlíi XIV Mei 1 B 0.06 0.09 * -0.10 0.60 ?G2 B 0.10 -0.34 • 0.50 0.S2 Ala 3 B 0.2S -0.34 • 0.50 0.63 Leu 4 B 0.32 -0.34 0.50 0.99 Gil! 5 B -0.10 -0.53 p 0.95 0.50 Gly 6 T c 0.20 0.16 F 0.45 0.41 Pro 7 T T -0.72 004 • F 0.65 0.66 Glv 8 T T -0.94 004 F 0.65 0.32 Leu 9 B T -0.80 0.73 -0.20 0.26 Ser 10 A B -1.61 0.87 -0.60 0.09 Leu 11 A B • 2.12 1.13 -0.60 0.08 Leu i: A B -2.72 1.34 -0.60 0.07 Cvs 13 A B -2.97 1.34 -0.60 0.04 Leu 14 A B -2.97 1.46 -060 0.05 Val 15 A B -2.88 1.46 -0.60 0.05 Leu 16 A B -2.66 1.20 -0.60 0.15 Alo 17 A B -2.66 1.13 -O.óO 0.18 Leu 18 A B -2.80 1.13 -0.60 0.20 Pro 19 A B -2.20 1.17 -0.60 0.20 Ala 20 A B -2.20 0. 1 -0.60 0. 1 Leu 21 A B -1.60 1.06 • -0.60 0.28 Leu 22 A B -1.60 0.80 -0.60 0.2? Pro 23 A B -1.64 0.37 * -0.60 0.28 Val 24 B -1.32 1.01 • -0.40 0.25 Pro 25 B -1.08 0.33 -0 10 0.60 Ala 26 B B -1.12 0.07 -0.30 0.38 Val 27 B B -0.90 0.29 -0.30 0.38 Arg 28 B B -0.69 0.14 * • -0.30 0.25 Glv 29 B B -0.14 -0.29 * * 0.30 0.43 Vaí 30 B B •0.14 -0.30 * • 0.30 0.83 Ala 31 B B 0.13 -0.51 • 0.60 0.66 Glu 32 B 0.74 -0.03 * F 0.65 0.96 Thr 33 B T 0.42 0.30 • F 0.40 2.02 Pro 34 T t 0.48 009 F 0.80 3.10 Thr 35 T T 1 44 0.50 • F 0.50 1.88 Tvr 36 T c 2.03 0.50 • 0.15 2.55 Pro 37 T 1.44 0.0! 0.45 2.76 Trp 38 A c 1.76 0.09 • 0.05 1.93 Arg 39 A B 1.66 -0.40 • F 0.60 2.13 Asp 40 A c 1.62 -0.67 • F 1.10 1 99 Ala 41 A c 1.87 -0.67 F 1.10 1.87 Glu 42 A c 2.19 -1.59 • F 1.10 1.66 Thr 43 A T 1.67 -1.59 • F 1.30 1.94 Gly 44 A T 0.70 -0.90 F 1.30 1.59 Glú 45 A T 0.03 -0.76 * F 1.15 0.68 Arg 46 A T 0.03 -0.19 - F 0.85 0.25 Leu 47 A B 0.03 -0.17 * 0.30 0.26 Va! 48 A B -0.32 -0.20 0.30 0.26 Cys 49 A B -0.19 0.37 -0.30 0.07 Aia 50 A B -0.40 0.80 -0.60 0.13 Gln 51 A B -0.86 0.54 -0.60 0.28 Cvs 52 A B -0.36 0.33 -0.30 0.51 Pro 53 T c -0.20 0.24 F 0.45 0.73 Pro 54 T T -0.39 0.53 F 0.35 0.36 Glv 55 T T 0.20 0.77 F 0.35 0.50 Thr 56 B T 0.31 O.60 F -0.05 0.56 Tabla II (continuación) Res Posición 1 11 III IV V VJ vu VIH Vi X XII XIII XIV P c 57 B B 0.77 0.17 - F -0.15 0.71 Va! 58 B B 0.31 0.17 • 0.1 1.12 Gln 59 B B 0.63 0.31 * F 0.5? 04! Ar° 60 B T 1.09 -0.1 • F 1.S7 094 Pro 61 B T 1.40 -0.96 * F 2.66 2.47 Cys 62 T T 1.80 -1.60 - F 3.40 2.38 Ara 63 T T 2.44 -1.61 * F 3.06 1.6? AT£ 64 T 2.13 -1.19 • F -) 77 1.63 Asp 65 T 1.7! -?.? F 2.68 4.39 Ser 66 T T 1.26 -1.21 F 2 3.24 Pro 6" T T 1.58 -0.64 F 2.55 0.89 Thr 68 T T 1.26 -0.21 F 2.50 0.52 Thr 69 T T 0.48 0.21 F 1.65 0. 1 Cys 70 T 0.2 0.40 F 1.14 0.21 Giy 71 T T 0.36 0.40 * F 1.33 0.22 Pro 72 T T 0.68 0.34 * F 1.62 0.24 Cvs 7 T c 0.96 -0.14 • F 2.01 0.88 Pío 74 T c 1.02 -0. 1 • F 2.40 1.21 Pro 75 T T 1.38 0.11 * F 1.76 1.23 Are 76 T T 1.72 0.17 * * F 1.52 3.30 His 77 B T 1.23 0.00 • • F 0.88 3.70 Tyr 78 B T 1.61 0.36 * • 0.49 2.07 Thr 79 B 1.82 0.84 * * -0.25 l.l 1 Gln 80 B 1.79 1.24 * • -0.25 1.31 Phe 81 T 0.87 1.50 * 0.15 1.31 Trp 82 T 0.90 1.43 • 0.00 0.75 Asn 83 A T 1.26 0.94 -0.20 0.75 Tyr 84 A T 0.90 0.54 * • -0.05 1.70 Leu 85 A T 1.01 0.33 • * 0.38 0.87 Glu 86 A T 1.47 -0.59 • * 1.71 1.05 Arg 87 A T 1.09 -0.23 1.69 1.05 Cys 88 T T 1.09 -0.41 * 2.22 0.69 Arg 89 T T 0.48 -0.70 * 2.80 0.64 Tvr 90 T T 0.48 -0.05 * 2.22 0.24 Cys 91 T T -0.19 0.63 • 1.04 0.37 Asn 92 B B -0.64 0.63 * -0.04 0.10 Val 93 B B 0.02 1.06 -0.02 0.06 Leu 94 B B 0.02 0.30 0.30 0. 1 Cvs 95 B T 0.27 -0.27 1.60 0.25 Glv 96 T c 0.93 -0.67 F 2.55 0.59 Glu 97 T c 0.93 -1.3 i F 3.00 1.24 Arg 98 A T 1.20 -2.00 * F 2.50 400 Glu 99 A A 2.12 -2.07 • F 1.80 408 Glu 100 A A 2.20 -2.50 F 150 4.61 Glu 101 A A 1.88 -2.00 F 1.20 2.38 Ala 102 A A 1.84 -1.43 F 0.75 0.74 Arg 103 A A 1.14 -0.93 0.60 0.58 Ala 104 A A 0.83 -0.43 * 0.30 0.34 Cys 105 A A 0.80 0.06 * -0.30 0.48 H.s 106 A A 0.80 0.06 * * -0.30 0.34 Ala 107 A T 1.50 0.46 * -0.20 0.53 Thr 108 A T 0.80 -0.04 • 0.85 1.95 His 109 A T 0.72 -0.11 1.13 1.45 Asn 110 A T 1.50 -0.04 * 1.26 0.77 Arg 1 \ 1 A T 0.87 -0.54 1.99 1.04 Ala 112 A T 1.57 -0.46 • 1.82 0. 1 Tabla 2 (continuación) Res Posición 1 11 III rv V VI Vil VIH K X x XI¡¡ ?G?' Cys 113 T T ! .57 -0.96 * 2.80 0.50 Arg 114 B T 1.26 -0.87 * 2.12 0.37 Cys 115 T T 0.56 -0.44 • * !.94 0.36 Ara 116 T T -0.26 -0.16 * 1.6 0.5S Thr" 11" A B T -0.26 0.06 * F 0.53 0.26 Glv 113 A B t 0.3S 0.56 • -0.20 0.49 Phe 119 A B B -0.32 0.49 * -0.60 0.34 Phe 120 A B B -0.00 0.99 * -0.60 0.24 Ala 121 A B B -0.81 0.93 * -0.60 0.24 His 122 A c -1.17 1.29 * -0.40 0.24 Al3 123 A c -1.63 1.07 * -0.40 0.15 Glv 124 A T -0.93 0.97 * -0.20 0.¡2 Phe 125 A T -0.27 0.47 -0.20 0.1 Cys 126 A T -0.27 0.47 • -0.20 0.20 Leu 127 A B -0.53 0.47 -0.60 0. 1 Glu 128 A B T -0.61 0.43 -0.20 0.32 His 129 T T -0.4S 0.21 0.50 0.32 Ala 130 T T o.oi 0.07 0.63 0. 1 Ser 1 1 T T 0.33 -0.19 1.36 0.54 Cys 132 T c 0.56 0.24 0.69 0.39 Pro 133 T c 0.2! 0.24 F 0.97 0.39 Pro 134 T T -0.61 0.17 F 1.30 0.29 Gly 135 T T -0.91 043 F 0.S7 0.40 Ala 136 B T -1.20 054 0.1 0.18 Glv 137 B B -0.74 0.61 -0.34 0.12 Val 138 B B -0.8S 0.61 -0.47 0.1 lie 139 B B -0.67 0.61 -0.60 0.18.
Ala 140 B T -0.62 0.11 0.10 0.32 Pro 141 B T -0.32 0.07 F 0.25 0.58 Gly 142 T c -0.57 0.34 • F 045 086 Glu 143 T c 0.40 0.16 • * F 045 0.86 Ser 144 B 0.94 -0.34 * * F 0.80 1.10 Trp 145 T 1.19 -0.34 • * F 1.20 1.10 Ala 146 B T 0.81 -0.34 • * F 0.85 0.63 Arg 147 T t 0.94 0.16 * F 0.65 0.47 Glv 148 T T 1.06 0.20 • F 0.65 0.69 Gly 149 T c 1.06 -0. 1 F 1.84 1.35 Ala 150 c 1.00 -0.83 F 1.83 0.92 Pro 151 c 1.24 -0.40 F 1.87 0.92 Arg 152 T T 1.24 -0.40 F 2.61 0.92 Ser 153 T T 1.70 -0.83 F 3.40 1.78 Gly 154 T T 1.38 -1.33 * * F 3.06 2.26 Gly 155 T T 1.62 -1.19 • • F 2.57 0.62 Arg 156 T 1.94 -0.76 • * F 2.26 0.46 Arg 157 T 1.49 -1.14 * • F 2.15 0.90 Cvs 158 B 1.79 -1.14 * * F 1.64 0.90 Gly 159 T T 1.28 -1.17 * • F 2.47 0.80 Arg 160 B T 1.03 •0.53 * * F 2.30 0.30 Gly 161 B t 0.58 -003 * * F 1.77 0.57 Gln 162 B T 0.26 -0.1 • F 1.54 0.57 Val 163 B 0.62 -0.1 * F 1.11 0.45 Ala 164 B 0.16 0. 1 F 0.28 0.61 Glv 165 B T -0.54 0.47 * F -0,05 0.29 Pro 166 B T •04 i 0.57 F -005 0.40 Ser 167 T c -0.80 0.36 F 0.45 0.61 Leu 168 B T -0.33 0.29 0.10 0.78 Ala 169 B -0.13 0.29 -0.10 0.65 Pro 170 B -0.18 0.29 -0.10 0.62 Los fragmentos adicionales preferidos de ácido nucleico de la presente invención comprenden, o consisten alternativamente de, moléculas de ácido nucleico que codifican una o más porciones que soportan epitopes de TNFR- 6a y/o TNFR-ßß. En particular, tales fragmentos de ácido nucleico de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican: un polipéptido que comprende, o consiste alternativamente de, residuos de aminoácido desde alrededor de Phe-57 hasta alrededor de Thr-117, desde alrededor de Cys-132 hasta alrededor de Thr-175, desde alrededor de Gly-185 hasta alrededor de Thr-194, desde alrededor de Val-205 hasta alrededor de Asp-217, desde alrededor de Pro-239 hasta alrededor de Leu-264, y/o desde alrededor de Ala-283 hasta alrededor de Pro-298 en SEQ ID NO: 2. En modalidades adicionales, los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención comprenden, o consisten alternativamente de moléculas de ácido nucleico que codifican una o más porciones que soportan epitopes de T FR- 6ß desde alrededor de Ala-31 hasta alrededor de Thr-46, desde alrededor de Phe-57 hasta alrededor de Gln-80, desde alrededor de Glu-86 hasta alrededor de His-106, desde alrededor de Thr-108 hasta alrededor de Phe- 119, desde alrededor de His-129 hasta alrededor de Val-138, y/o desde alrededor de Gly-142 hasta alrededor de Pro-166 en SEQ ID NO : 4. En este contexto "alrededor de" incluye los intervalos particularmente mencionados y rangos mayores o menores por varios aminoácidos (5,4,3,2 ó 1) en cualquier terminación o ambas terminaciones. Estos fragmentos de polipéptidos se han determinado que soportan epitopes antigénicos de los polipéptidos TNFR- 6a y TNFR-ßß respectivamente, por el análisis del índice antigénico Jameson-Wolf como se muestra en las figuras 4 y 5 arriba. Además, los fragmentos de polipéptido que soportan epitopes antigénicos de TNFR- 6a y/o TNFR- 6ß , se pueden determinar fácilmente por alguien con habilidad en el arte usando el análisis arriba descrito del índice antigénico Jameson-Wolf, como se muestra en las figuras 4 y 5. Los métodos para determinar otras porciones tales que soportan epitopes de TNFR-6a y/o TNFR- 6 ß se describen en detalle abajo.
En modalidades específicas los ácidos nucleicos de la invención tienen menos de 100000 kb, 50000 kb, 10000 kb, 1000 kb, 500 kb, 400 kb, 350 kb, 300 kb, 250 kb, 200 kb, 175 kb, 150 kb, 125 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 40 kb, 30 kb, 25 kb , 20 kb, 15 kb, 10 kb, 7.5 kb, o 5 kb en longitud. En modalidades adicionales, los ácidos nucleicos de la invención comprenden al menos 12, al menos 30, al menos 50, al menos 100, o al menos 250, al menos 500 o al menos 1000 nucleótidos contiguos de la secuencia codificadora de TNFR, pero consisten de menos de o igual a 1000 kb, 500 kb, 250 kb, 200 kb, 150 kb, 100 kb, 75 kb, 50 kb, 30 kb, 25 kb, 20 kb, 15 kb, 10 kb, o 5 kb de ADN genómico que flanquea la secuencia de nucleótidos codificadora 5' o 3' establecida en la figura (SEQ ID NO: 1) o figura 2 (SEQ ID NO: 3) . En modalidades adicionales, los ácidos nucleicos de la invención comprenden al menos 15, al menos 30, al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, o al menos 1000 nucleótidos contiguos de la secuencia codificadora del TNFR, pero no comprenden todo o una porción de cualquier intrón de TNFR. En otra modalidad, el ácido nucleico que comprende la secuencia codificadora de TNFR no contiene las secuencias codificadoras de un gen genómico de flanqueo (esto es, 5' o 3' al gen TNFR en el genoma) . En otras modalidades, los ácido nucleicos de la invención no contienen la secuencia codificadora de más de 1000, 500, 250, 100, 50, 25, '20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ó 1 gen(es) de flanqueo genómico. En otro aspecto, la invención suministra una molécula aislada de ácido nucleico que comprende, o consiste alternativamente de, un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones severas de hibridación a una porción del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la invención arriba descrita por ejemplo, el cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No. 97810 ó 97809, o un fragmento de la secuencia de polinucleótido descrita en la figura 1 y/o en la figura 2. Por "condiciones severas de hibridación" se pretende incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende 50% de formamida, 5xSSC (NaCl 750 mM, citrato de trisodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano al 10% y 20 µg/ml de ADN de esperma de salmón partido desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en SSC O.lx a alrededor de 65°C. Por un polinucleótido que se hibridiza a una "porción" de un polinucleótido se pretende un polinucleótido ya sea ADN o ARN que hibridiza al menos alrededor de 15 nucleótidos (nt) y más preferiblemente al menos alrededor de 20 nt, todavía más preferiblemente alrededor de 30-70 (por ejemplo 50) nt del polinucleótido referencia. Estos tienen usos que incluyen pero no se limitan a, sondas de diagnóstico y cebadores como se discutió arriba y en más detalle abajo. Por una porción de un nucleótido de "al menos alrededor 20 nt de longitud" por ejemplo, se pretenden nucleótidos de 20 o más contiguos de la secuencia de nucleótido del polinucleótido de referencia (por ejemplo un cADN depositado o una secuencia de nucleótido como se muestra en la figura 1 o 2 (SEQ ID NO:l o 3)) . En este contexto, "alrededor" incluye el tamaño particularmente mencionado y aquellos tamaños que son más grandes o más pequeños por varios nucleótidos (5, 4, 3, 2, o 1), en cualquier terminación o en ambas terminaciones. Por supuesto, un polinucleótido que hibridiza solamente a una secuencia poli A (tal como el tracto poli (A) de la terminal 3' de un cADN de TNFR, o a una extensión complementaria de residuos T (o U) , no estaría incluido en un polinucleótido de la invención usado para hibridizar a una porción de un ácido nucleico de la invención, ya que tal polinucleótido hibridizaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga una extensión poli (A) del complemento de la misma (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de cADN de doble hebra que se haya generado usando el oligo dT como cebador ) . Como se indica, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican un polipéptido TNFR pueden incluir, pero no se limitan a, aquellas que codifican la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro por si mismo; y la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y secuencias adicionales, tales como aquellas que codifican la secuencia líder de aminoácidos de alrededor de 26-35 o la secuencia segregada, tal como una secuencia pre-, o pro- o prepro- proteína, la secuencia de codificación del polipéptido maduro sin o con las secuencias codificadoras adicionales arriba mencionadas. También se codifican por los ácidos nucleicos de la invención, las secuencias anteriores de proteínas junto con secuencias adicionales no codificadoras incluyendo por ejemplo, pero no limitándose a intrones y secuencias no codificadoras 5' y 3', tales como las secuencias transcritas no traducidas que juegan un papel en la transcripción, el procesamiento del mARN, incluyendo la división y señales de poliadeni lación, por ejemplo enlace de ribosomas y estabilidad del mARN, una secuencia de codificación adicional que codifica los aminoácidos adicionales tales como aquellos que proporcionan funcionalidades adicionales. Asi, la secuencia que codifica al polipéptido se puede fundir a una secuencia marcadora tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido fundido. En ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora de aminoácidos es un péptido de hexa-histidina , tal como la etiqueta suministrada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describe en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la he a-histidina proporciona la purificación conveniente de la proteina de fusión. La etiqueta "HA", es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítope derivado de la proteína de la heraaglut inina de la influenza, que se ha descrito por ilson et al., Cell 37: 767 (1984) . Como se discute abajo, otras proteínas de fusión tales incluyen un TNFR- 6a o TNFR-ßß fundido a un Fe en la terminación N- o C- . La presente invención además se relaciona con variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que codifican porciones, análogos o derivados de un polipéptido TNFR. Las variantes se pueden presentar naturalmente tal como una variante natural alélica. Por una "variante alélica" se pretende una de varias formas alternas de un gen que ocupa un lugar dado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed. , John Wiley & Sons, New York (1985) . Las variantes que se presentan de forma no natural se pueden producir usando técnicas de mutagénesis conocidas en el arte que incluyen pero no se limitan a, mutagénesis mediada por el oligonucleótido, barrido con alanina, mutagénesis de PCR, mutagénesis dirigida al sitio (ver por ejemplo Cárter et al., Nucí. Acids Res. 13:4331 (1986) ; y Zoller et al., Nucí. Acids Res. 10:6487 (1982) ), mutagénesis de cinta (ver por ejemplo Wells et al., Gene 34:315 (1985) ) , mutagénesis de selección de restricción (ver por ejemplo Wells et al. , Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415 (1986) ) . Asi, la invención también abarca variantes de TNFR (por ejemplo derivados y análogos) que tienen uno o más residuos de aminoácidos eliminados, agregados, o substituidos para generar polipéptidos TNFR que están mejor apropiados para la expresión, escalamiento, etc. en las células huésped escogidas. Por ejemplo, los residuos de cisteina se pueden eliminar o sustituir con otro residuo de aminoácido con objeto de eliminar los puentes bísulf uro; se pueden alterar los sitios de glicosilación ligados a N o eliminarse para lograr por ejemplo, la expresión de un producto homogéneo que sea más fácilmente recuperado y purificado de los huéspedes de levadura que se conocen por hiperglicosilar los sitios ligados a N. A este punto, una diversidad de substituciones de aminoácidos en uno o ambos de las primera o tercera posiciones de aminoácido en una o más de las secuencias de reconocimiento de la glicosilación en los polipéptidos TNFR de la invención, y/o una eliminación de aminoácidos en la segunda posición de alguna o más de tales secuencias de reconocimiento, evitarán la glicosilación del TNFR en la secuencia modificada de tripéptidos (ver por ejemplo Miyajimo et al., EMBO J 5 ( 6) : 1193-97 ) . Adicionalmente, uno o más residuos de los aminoácidos de los polipéptidos de la invención (por ejemplo arginina y residuos de lisina) se pueden eliminar o sustituir con otro residuo para eliminar el procesamiento indeseable por proteasas tal como por ejemplo, furinas o kexinas. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención que contienen secuencias de polipéptidos de TNFR con terminal carboxi, pueden tener el residuo de aminoácido correspondiente al residuo de arginina en la posición 290 y/o 295 de la SEQ ID NO:2 eliminada o substituida con otros residuos . Las variantes de la invención incluyen aquellas producidas por substituciones, eliminaciones o adiciones de nucleótido. Las substituciones, eliminaciones o adiciones pueden involucrar uno o más nucleótidos. Las variantes se pueden alterar en regiones de codificación, regiones no codificadoras o ambas. Las alteraciones en las regiones de codificación pueden producir substituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, eliminaciones o adiciones. Se prefieren especialmente entre estas las substituciones silentes, adiciones o eliminaciones, que no alteran las propiedades y actividades de los polipéptidos TNFR o porciones de los mismos. También se prefieren especialmente a este respecto las substituciones conservadoras. Son altamente preferidas las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteina madura que tiene una secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NOS : 2 y 4 o las secuencias de polipéptido de TNFR maduras codificadas por un clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No.97810 o depósito ATCC No .97809. Modalidades adicionales incluyen una molécula de ácido nucleico aislada que comprende, o consiste alternativamente de, un polinucleót ido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica, y más preferiblemente al menos 80%, 85%, 90%, 92%, o 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a un polinucleót ido seleccionado del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TNFR que tiene la secuencia, completa de aminoácidos en la SEQ ID NO : 2 o 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No.97810 o 97809; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido maduro de TNFR que tiene una secuencia de aminoácidos en las posiciones 31-300 o 31-170 en la SEQ ID NO : 2 o 4 respectivamente, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No. 97810 o 97809; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio soluble extracelular de un polipéptido de TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 31-283 y 31-166 de la SEQ ID NOS : 2 y 4 respectivamente; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento del polipéptido TNFR que tiene la secuencia completa de aminoácidos en la SEQ ID NO:2 o 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No.97810 o 97809, en donde el fragmento tiene una actividad funcional TNFR-6cc y/o TNFR-ßß; y (e) una secuencia de nucleótidos complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c) o (d) arriba. Los polipéptidos codificados por los polinucleót idos también están cubiertos por la invención. Modalidades adicionales de la invención incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica y más preferiblemente al menos 80%, 85%, 90%, 92%, ó 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c), (d), o (e) arriba, o un polinucleótido que se hibridiza bajo condiciones severas de hibridación a un polinucleótido en (a), (b), (c), (d), o (e), arriba. Este polinucleótido que se hibridiza no se hibridiza bajo condiciones severas de hibridación a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste de solamente residuos A o solamente residuos T. Una modalidad adicional de ácido nucleico de la invención, se relaciona con una molécula aislada de ácido nucleico que comprende, o consiste alternativamente de, un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una porción que soporta un epitope de un polipéptido TNFR que tiene una secuencia de aminoácido en (a), (b), (c), (d), o (e), arriba.
Por un polinucleotido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos por ejemplo 95% "idéntica" a una secuencia de referencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TNFR, se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleotido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia de polinucleotidos puede incluir hasta 5 mutaciones de punto por cada 100 nucleótidos de la secuencia de referencia del nucleótido que codifica al polipéptido TNFR. En otras palabras, para obtener un polinucleotido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 80%, 90%, 92%, o 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, se pueden eliminar o sustituir hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia con otro nucleótido, o un número de nucleótidos hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se pueden insertar dentro de la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden suceder en las posiciones de terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótido de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, diseminadas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. La secuencia de referencia puede ser la secuencia codificadora completa de TNFR-6a y/o TNFR-ßß mostrada en las figuras 1 ( SEQ ID NO : 1 y 2) o figura 2 (SEQ ID N0:3 y 4) o cualquier fragmento variante derivado o análogo de la misma como aquí se describe. Como un asunto práctico, si cualquier molécula particular de ácido nucleico es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a por ejemplo, una secuencia de nucleótido mostrada en la figura 1 o 2, o la secuencia de nucleótidos contenida en uno o ambos de los clones depositados de cADN, se puede determinar convencionalmente usando programas conocidos de cámputo tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Análisis Package, Versión 8 for Unís, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) . El Bestfit usa el algoritmo local de homología de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa el Bestfit, o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia particular es por ejemplo 95% idéntica a una secuencia de referencia de conformidad con la presente invención, se establecen los parámetros por supuesto, tales que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud total de la secuencia de referencia del nucleótido y se permitan los espacios en la homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. La secuencia de referencia (interrogación) puede ser la secuencia completa de nucleótidos que codifican el TNFR mostrado en la figura 1 (SEQ ID N0:1), figura 2 (SEQ ID NO : 3 ) o cualquiera de los fragmentos de polinucleót ido de TNFR-6a y/o TNFR-ßß (por ejemplo, un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las eliminaciones de terminal N o C descritas aquí) , variante, derivado o análogo como se describe aquí. En una modalidad especifica, la identidad entre una secuencia de referencia (de interrogación) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también referida como una alineación de secuencia, se determina usando el programa de cómputo FAS T DB basado en el algoritmo de Brutlag et al., (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)) . Los parámetros preferidos usados en la alineación FASTDB de las secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Mat ri z=unitaria , múltiplo K=4, penalización por mal apareamiento=l , penalización por unión=30, longitud del grupo aleatorio=0, calificación por int errupción=l , penalización por espacio=5, penalización por tamaño de espacio 0.05, tamaño de la ventana=500 o la longitud de la secuencia objetivo de nucleótidos, lo que sea más corto. Según esta modalidad, si la secuencia objeto es más corta que la secuencia de interrogación debido a las eliminaciones 5' o 3', no debido a eliminaciones internas, se hace una corrección manual a los resultados para tomar en cuanta el hecho de que el programa FASTDB no cuenta las interrupciones 5' y 3' de la secuencia objeto cuando se calcula el porcentaje de identidad. Para secuencias objeto truncadas en las terminaciones 5' o 3', con relación a la secuencia de interrogación, se corrige el porcentaje de identidad al calcular el número de bases de la secuencia de interrogación que son 5' o 3' de la secuencia objeto, que no están apa reada s /a 1 ineadas como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de interrogación. Una determinación sobre si un nucleótido está apareado/alineado, se determina por los resultados de la alineación de la secuencia FASTDB. Este porcentaje se resta después del porcentaje de identidad, calculado por el programa anterior FASTDB usando los parámetros especificados, para llegar a un registro final de identidad de porcentaje. Este registro corregido es lo que se usa para los propósitos de esta modalidad. Solamente las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia objeto, como se muestran por la alineación FASTDB, que no se aparean/alinean con la secuencia de interrogación, se calculan para los propósitos de ajustar manualmente el registro del porcentaje de identidad. Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 bases se alinea a una secuencia de interrogación de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las eliminaciones se presentan en la terminación 5' de la secuencia objeto que por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de las primeras 10 bases en la terminación 5' . Las 10 bases no apareadas representan .el 10% de la secuencia (número de bases en las terminaciones 5' y 3' no apareadas / sobre el número total de bases en la secuencia de interrogación) de manera que el 10% se resta del porcentaje de identidad registrado calculado por el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes estuvieran perfectamente apareadas, el porcentaje final de identidad seria de 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 bases se compara con una secuencia de interrogación de 100 bases. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas de manera que no hay bases en la 5' o 3' de la secuencia objeto que no estén apareada s /a 1 ineada s con la interrogación. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez nuevamente, solamente las bases 5' y 3' de la secuencia objeto que no están apareadas /al ineadas con la secuencia de interrogación se corrigen manualmente. No se hacen otras correcciones manuales para propósitos de esta modalidad. La presente solicitud se dirige a moléculas de ácido nucleico al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 1 o 2 (SEQ ID NO : 1 o 3), a la secuencia de · ácido nucleico de un cADN depositado y/o a una secuencia de ácido nucleico descrita de otra manera aquí (por ejemplo, que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una eliminación de la terminal N y/o C aquí descrita tal como por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica aminoácidos Val-30 para His-300 de la SEQ ID NO:2), independiente de si codifican un polipéptido que tenga actividad funcional TNFR. Esto es debido a que aun cuando una molécula particular de ácido nucleico no codifica un polipéptido que tiene actividad funcional TNFR, alguien con habilidad en el arte sabría todavía como usar la molécula de ácido nucleico por ejemplo, como una sonda de hibridación o un cebador de una reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tenga una actividad funcional TNFR incluyen entre otras, (1) aislar un gen TNFR o variantes alélicas del mismo en una colección de cADN; (2) hibridación in situ (por ejemplo, "FISH") para distribuciones cromos órnales de metafase para suministrar la ubicación cromosomal precisa del gen de TNFR como se describe en Verma et al., Human Chromosomes : A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); y análisis de manchado Northern para detectar la expresión de mARN de TNFR en tejidos específicos. Se prefieren sin embargo, moléculas de ácido nucleico que tengan secuencias al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a una secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 1 o 2 (SEQ ID NOS:l o 3) o a la secuencia de ácido nucleico del clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No.97810 o ATCC No.97809, y/o a una secuencia de ácido nucleico descrita de otra manera aquí (por ejemplo, codificar el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una eliminación de terminal C y/o N aquí descrita), lo que de hecho codifica polipéptidos que tienen una actividad funcional de la proteína de TNFR (esto es, TNFR- 6a y/o TNFR-dß) . Por "un polipéptido que tiene actividad funcional de TNFR" se pretenden polipéptidos que muestran actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la proteína TNFR-6a y/o TNFR- 6ß de la invención (por ejemplo, un dominio completo (de longitud completa), maduro y extracelular como se mide por ejemplo, en un ensayo particular de inmunoensayo o biológico. Por ejemplo, la actividad TNFR-6 y/o TNFR-ßß se puede medir al determinar la capacidad del polipéptido TNFR- 6a y/o TNFR-ßß para enlazar un ligando TNFR-6a y/o -6ß (por ejemplo, el ligando Fas y/o AIM-II (publicación de la Solicitud Internacional número WO 97/34911, publicada el 25 de septiembre de 1997 ) . En otro ejemplo, la actividad funcional TNFR-6ct y/o TNFR- 6ß se mide al determinar la capacidad de un polipéptido, tal como un ligando similar o parecido, que está libre o expresado en una superficie de células, para inducir la apoptosis. Los ligandos de la familia TNF inducen diversas respuestas celulares al enlazar a los receptores de la familia TNF, incluyendo el TNFR-6a y TNFR-dß de la presente invención. Las células que expresan las proteínas TNFR se cree que tienen una respuesta celular potente a los ligandos del receptor T FR- I incluyendo los linfocitos B (CD19+), tanto linfocitos CD4 y CD8+ T, monocitos y células endoteliales. Por una "respuesta celular a un ligando de la familia TNF" se pretende cualquier cambio genotípico, fenotípico y/o morfológico a una célula, línea de célula, tejido, cultivo de tejido o paciente que está inducido por un ligando de la familia TNF. Como se indica, tales respuestas celulares incluyen no solamente respuestas normales fisiológicas a ligandos de la familia TNF, sino también enfermedades asociadas con la proliferación creciente de células o la inhibición de la proliferación creciente de células tal como por la inhibición de la apoptosis . Se conocen en el arte ensayos de separación por exclusión para lo anterior. Uno de tales ensayos de separación por exclusión involucra el uso de células que expresan el receptor (por ejemplo, células transfectadas de CHO) en un sistema que mide los cambios extracelulares del pH provocados por la activación del receptor, por ejemplo como se describe en Science 246:181-296 (octubre 1989) . Por ejemplo, un ligando de la familia TNF puede estar en contacto con una célula que exprese la forma madura del polipéptido receptor de la presente invención y una respuesta de un segundo mensajero por ejemplo, transducción de señal o cambios del pH se pueden medir para determinar si es activo el polipéptido TNFR.
Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, alguien con habilidad ordinaria en el arte reconocerá inmediatamente que un gran número de moléculas de ácido nucleico tienen una secuencia al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico del clon de cADN depositado como depósito ATCC No. 97810 o 97809, la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 1 o 2 (SEQ ID NO : 1 y 3) o fragmentos de la misma, codificarán un polipéptido "que tiene una actividad funcional de la proteina TNFR". De hecho, ya que las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican todas al mismo polipéptido, será claro para el técnico habilitado aún sin llevar a cabo el ensayo de comparación arriba descrito. Se reconocerá además en el arte que, para tales moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable también codificara un polipéptido que tiene la actividad funcional de la proteina TNFR. Esto se debe a que el técnico capacitado está completamente consciente de las substituciones de aminoácidos que son menos probable o no probable para afectar significativamente la función de las proteínas (por ejemplo, substituyendo un aminoácido alífático con un segundo aminoácido alifático) como se describe abajo. Vectores y células huésped La presente invención también se refiere a vectores que incluyen las moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente . invención, células huésped que son preparadas por ingeniería genética con los vectores recombinantes , o que son preparadas por ingeniería de otra forma para producir a los polipéptidos de la invención, y la producción de polipéptidos TNFR o fragmentos de los mismos por técnicas recombinantes. En una modalidad, los polinucleót idos de la invención se unen a un vector (por ejemplo, un vector de expresión o clonación).. El vector puede ser por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes a la replicación o defectuosos a la replicación. En el último caso, la propagación viral ocurrirá generalmente sólo en las células huésped complementarias. Generalmente, se introduce un vector de plásmido en un precipitado tal como un precipitado de fosfato de calcio o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede empacar in vitro usando una línea de células de empaque apropiada y después transducirse las células huésped. Generalmente, los vectores recombinant es de expresión incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina del gen TRP1 de E. coli y S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural en el sentido 3' . Tales promotores se pueden derivar de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como la 3 - fo s fogl i cerato cinasa (PGK), factor a-, fosfatasa de ácido, o proteínas de choque térmico entre otros. Los constructos de expresión contendrán además sitios para la iniciación de la t anscripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de enlace de ribosomas para la traducción. La porción de codificación de los transcriptos expresadas por los constructos incluirá preferiblemente un codón de iniciación de la traducción al comienzo y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) posicionado apropiadamente en la terminación del polipéptido a ser traducido. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de la traducción y preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida dentro del espacio periplásmico o medio ext racelular . Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación de la terminal N que imparte las características deseadas, por ejemplo, la estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. En una modalidad, el ADN de la invención se asocia operativamente con un elemento regulatorio heterólogo apropiado (por ejemplo, promotor o enriquecedor ) , tal como el promotor de fagos lambda PL, los promotores de E. coli lac, trp, phoA, y tac, los promotores temprano y tardío SV40 y promotores del LTRs retroviral por nombrar unos cuantos. Otros promotores apropiados se conocerán por el técnico habilitado. Como se indicó, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable . Tales marcadores incluyen la dihidrofolato reductasa, G418 o resistencia a la neomicina para un cultivo de células eucarióticas y genes con resistencia a la tet ra c i c 1 ina , canamicina o ampicilina para cultivarse en E. coli y otras Bacterias. Ejemplos representativos de los huéspedes apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium ; células de hongos tales como células de levadura, células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células animales tales como células CHO, COS, 293 y de melanoma Bowes y células de plantas. Los medios y condiciones de cultivo apropiados para las células huésped arriba descritas se conocen en el arte. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior tal como una célula de mamífero (por ejemplo una célula derivada del humano) o una célula eucariótica inferior tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica tal como una célula bacteriana. La cepa del huésped se puede escoger para que module la expresión de las secuencias insertadas de genes, o modifique y procese el producto del gen en la forma especifica deseada. La expresión de ciertos promotores puede ser elevada en presencia de ciertos inductores; asi, la expresión del polipéptido preparado por ingeniería genética se puede controlar.
Adicionalmente, células huésped diferentes tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento traduccional y post traduccional y la modificación de las proteínas (por ejemplo, fosforilación, desdoblamiento) . Las líneas de células apropiadas se pueden escoger para asegurar las modificaciones deseadas y el procesamiento de la proteína externa expresada. La selección de los vectores y promotores apropiados para la expresión en ' una célula huésped, es un procedimiento bien conocido y las técnicas de requisito para la construcción del vector de expresión, introducción del vector dentro del huésped y expresión en el huésped, son habilidades de rutina en el arte. Los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano se construyen al insertar una secuencia estructural de ADN que codifica una proteína deseada junto con señales apropiadas de iniciación y terminación de la traducción en una fase operativa de lectura con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y hasta proporcionar si se desea la amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procariót icos apropiados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y diversas especies dentro de los géneros Pseudo ona s , Streptomyces y Staphylococcus , aunque otros se pueden emplear como una opción de elección. Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para el uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación derivado de plásmido, comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocidos pBR322 (ATCC 37017) . Tales vectores comerciales incluyen por ejemplo pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) y GEMI (Promega Biotec, Madison, WI, USA) . Esta sección de pBR322 de "columna vertebral" se combina con un promotor apropiado y la secuencia estructural a ser expresada. Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias incluyen pHE4-5 (número de acceso ATCC 209311 y variaciones del mismo) , pQE70, pQE 60 y pQE-9 disponibles de QIAGEN, Inc., supra; vectores pBS, vectores Phagescript , vectores Bluescript, pNH8A, pNHI6a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponible de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores apropiados serán fácilmente aparentes para el técnico habilitado. Después de la transformación de una cepa apropiada de huésped y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad apropiada de células, se induce el promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo cambio de temperatura o inducción química) y las células se cultivan por un periodo adicional. Las células se cosechan típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto crudo resultante se retiene hasta purificación adicional . Las células microbianas empleadas en las expresión de proteínas se pueden romper por cualquier método conveniente, incluyendo la ciclización, deshielo-congelado, sonicación, disrupción mecánica o el uso de agentes de lisado de células, tales métodos son bien conocidos por aquellos hábiles en el arte. La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores, se incrementa al insertar una secuencia enriquecedora dentro del vector. Los enriquecedores son elementos que actúan en la posición cis del ADN, usualmente alrededor desde 100 hasta 300 bp que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Ejemplos incluyen el enriquecedor . SV40 en el costado tardío del origen de replicación de 100 bp hasta 270, un enriquecedor promotor . del citomegalovirus temprano, el enriquecedor de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y enriquecedores de adenovi rus . Se pueden emplear también diversos sistemas · de cultivo de células de mamíferos para expresar la proteína recombinant e . Ejemplos de los sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono descrito por Gluzman (Cell 23:175 (1981)), y otras líneas de células capaces de expresar un vector compatible por ejemplo, las líneas de célula C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y enriquecedor apropiado, y también cualesquiera sitios necesarios para enlace de ribosomas, sitios de poliadeni lación , sitios de aceptador y donador de empalme, secuencias transcripcionales de terminación, y secuencias no transcritas de flanqueo de 5'. Las secuencias de ADN derivadas del empalme SV40, y los sitios de poliadenilación se pueden usar para administrar los elementos genéticos requeridos no transcritos. La introducción del constructo del vector dentro de la célula huésped, se puede efectuar por técnicas conocidas en el arte que incluyen pero no se limitan a, la transfección por fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dext rano , la transfección mediada por lípidos catiónicos, electroforación, t ransducc i ón , infección o otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales estándar de laboratorio tales como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) . Además de abarcar las células huésped que contienen los constructos de vector aquí discutidos, la invención también abarca células huésped inmortalizadas primarias y secundarias de origen vertebrado, particularmente de origen mamífero que han sido preparadas por ingeniería para eliminar o reemplazar material genético endógeno (por ejemplo la secuencia de codificación de TNFR) , y/o incluir material genético (por ejemplo secuencias heterólogas de polinucleót idos ) que se asocian operativamente con los polinucleótidos TNFR de la invención, y los cuales activan, alteran y/o amplifican los polinucleótidos endógenos de TNFR. Por ejemplo, las técnicas conocidas en el arte se pueden usar para asociar operativamente regiones de control heterólogas (por ejemplo promotor y/o en r i que cedo r ) y secuencias endógenas de polinucleótidos TNFR por medio de la recombinación homologa (ver por ejemplo, la patente U.S. No. 5,641,670, emitida el 24 de junio 1997; número de publicación de la Solicitud Internacional WO 96/29411, publicada el 26 de septiembre 1996; número de publicación de la Solicitud Internacional WO 94/12650 publicado el 4 de agosto 1994 ; Koller et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989), Las descripciones de cada una de las cuales se incorporan como referencia en su totalidad) . Las células huésped descritas infra, se pueden usar en una forma convencional para producir el producto de gen codificado por la secuencia recombinante . Alternativamente, se pueden también emplear sistemas de traducción libres de células para producir los polipéptidos de la invención usando ARNs derivados de los constructos de ADN de la presente invención. El polipéptido de la invención se puede expresar o sintetizar en una forma modificada, tal como una proteina de fusión (que comprende al polipéptido unido por medio de un enlace péptido a una secuencia de proteina heteróloga (de una proteina diferente) , por ejemplo el péptido de señal de CK-beta8 (aminoácidos -21 a -1 de la secuencia CK-8 descrita en la solicitud publicada PCT PCT/US95/09058 ; presentada 6/23/95) o el péptido de señal de la estanocalcina (ver número de acceso ATCC No. 75652 depositado el 25 de enero de 1994)), y puede incluir no solamente señales de secreción sino también regiones adicionales funcionales heterólogas. Tal proteina de fusión se puede hacer al ligar los polinucleótidos de la invención y la secuencia deseada de ácido nucleico codificando la secuencia deseada de aminoácido una con otra, por métodos conocidos en el arte, en la estructura adecuada de lectura, y expresando el producto de la proteina de fusión por métodos conocidos en el arte. Alternativamente, dicha proteina de fusión se puede hacer por técnicas sintéticas de proteínas por ejemplo, por el uso de un sintetizador de péptidos. Así por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, se puede agregar a la terminación N del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia de la célula huésped durante la purificación, o durante el manejo y almacenamiento posterior. También se pueden agregar porciones de péptidos al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones se pueden separar antes de la preparación final del polipéptido. La adición de porciones de péptidos a los polípéptidos para producir secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación entre otros, son técnicas familiares y de rutina en el arte. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para estabilizar y purificar proteínas. Por ejemplo, la EP-A-0 464 533 (contraparte Canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diversas porciones de una región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o par.te de la misma. En muchos casos, la parte Fe en una proteína de fusión es totalmente ventajosa para su uso en terapia y diagnóstico y así resulta por ejemplo, en propiedades farmacocinéticas mejoradas (EP-A 0232 262) . Por otro lado, para algunos usos sería deseable poder eliminar la parte Fe después de que la proteína de fusión se ha expresado, detectado y purificado en una forma ventajosa descrita. Este es el caso cuando la porción Fe prueba ser un obstáculo para uso en terapia y diagnóstico, por ejemplo cuando la proteína de fusión se va usar como un antígeno para inmunización. En el descubrimiento de medicamentos por ejemplo, las proteínas humanas tales como hIL-5 se han fundido con porciones FC para el propósito de ensayos de separación por exclusión de alta producción para identificar antagonistas del hIL-5. Ver, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995) y K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995) . En otro ejemplo, las proteínas de fusión preferidas de la invención comprenden una porción de una cadena ligera de inmunoglobulina (esto es, una porción de la cadena ligera kappa o lambda) . En modalidades específicas de las proteínas de fusión de la invención, comprende una porción de la región constante de una cadena ligera kappa o lambda. Las proteínas de la presente invención incluyen: productos purificados de fuentes naturales, incluyendo fluidos corporales tejidos y células, ya sea directamente aislados o cultivados; productos de procedimientos químicos sintéticos; y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, incluyendo por ejemplo células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, insectos y mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en el procedimiento de producción recombinante , los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados . Además, los polipéptidos de la invención pueden también incluir un residuo inicial modificado de metionina, en algunos casos como resultado de los procesos mediados por el huésped . Las proteínas de la invención se pueden sintetizar químicamente usando técnicas conocidas en el arte (por ejemplo ver Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co., N.Y., y Hunkapi 11 er , M . , et al., Nature 310:105-111 (1984))) . Por ejemplo, un péptido que corresponde a un fragmento de los polipéptidos de la invención TNFR completos (esto es, TNFR- 6a y/o TNFR-ßß) se pueden sintetizar por el uso de un sintetizador de péptidos. Adicionalmente si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una substitución o adición dentro de la secuencia del polipéptido de TNFR. Los aminoácidos no clásicos incluyen pero no se limitan a, los isómeros de los aminoácidos comunes, ácido 2,4 diaminobutí rico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4 -aminobutí rico , Abu, ácido 2-amino butírico, g—Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propionico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homoci t rulina , ácido cisteico, t-butilglicina , t- butilalanina , fenilglicina , ciclohexilalanina , b- alanina, fluoro aminoácidos, aminoácidos de diseñador tales como aminoácidos b-metilo, aminoácidos Ca-metilo, aminoácidos Na-metilo y análogos de aminoácidos en general. Además, el aminoácido puede ser D (dextrorotatorio) o L (levorotatorio) . Las proteínas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta, se pueden modificar por cualesquiera procesos naturales, tales como el procesamiento post-traduccional o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en el arte. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en grados iguales o variantes en diversos sitios en una proteína dada TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. También, una proteína dada TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta puede contener muchos tipos de modificaciones. Las proteínas TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden ser ramificadas por ejemplo, como resultado de una ubicuitinación y pueden ser cíclicas con o sin ramificados. Las proteínas cíclicas ramificadas y ramificadas cíclicas TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden resultar de procesos naturales posteriores a la traducción o pueden hacerse por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación ADP, amidación, colocación covalente de flavina, colocación covalente de una porción heme, colocación covalente de un nucleótido o un derivado de nucleótido, colocación covalente de un lipido o derivado de lipido, colocación covalente de fosfotidilinositol, reticulado, ciclización, formación de enlace disulfuro, desmet i lación , formación de reticulados covalentes, formación de cisteina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación , glicosi lación , formación de ancla GPI, hidroxilación , yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemi zación , s e 1 enoi 1 ac i ón , sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación y ubicuitinación . (ver por ejemplo, PROTEINS- STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); POST- TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs . 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992) .) La invención abarca proteínas de TNFR- 6a y/o TNFR-ßß que son modificadas diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo por glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivación de grupos conocidos protectores /de bloqueo, desdoblamiento proteolí tico , enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etcétera. Cualquiera de las diversas modificaciones químicas se pueden llevar a cabo por técnicas conocidas, incluyendo pero no limitadas a, desdoblamiento químico específico por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiot ripsina , papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina , etc. Las modificaciones adicionales posteriores a la traducción abarcadas por la invención incluyen por ejemplo, cadenas de carbohidratos ligadas en O o ligadas en N, procesamiento de las terminales C o terminal N, colocación de las porciones químicas de la columna vertebral de aminoácidos, modificaciones químicas de las cadenas de carbohidratos ligadas a O- o ligadas a N-, o adición o eliminación de un residuo de terminal N- de metionina como resultado de una expresión procariótica de la célula huésped. Los polipéptidos se pueden también modificar con una etiqueta detectable tal como una etiqueta de afinidad o isotópica enzimática, fluorescente, para permitir la detección y aislamiento de la proteina . También se suministran por la invención derivados químicamente modificados de la TNFR-6oc y/o TNFR-ßß que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como solubilidad creciente, estabilidad y tiempo de circulación del polipéptido o inmunogenicidad disminuida (ver patente US número 4,179,337) . Las porciones químicas para derivación se pueden seleccionar de polímeros solubles en agua tales como polietilen glicol, copolímeros de etilen glicol / propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Los polipéptidos se pueden modificar en posiciones aleatorias dentro de la molécula o en posiciones predeterminadas dentro de la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más porciones químicas colocadas. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o sin ramificar. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre alrededor de 1 kDa y alrededor de 100 kDa (el término "alrededor" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesaran más, algunas menos que el peso molecular establecido) para facilidad en el manejo y . fabricación. Se pueden usar otros tamaños dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación prolongada deseada, los efectos si hay algunos en la actividad biológica, la facilidad en el manejo, el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína o análogo terapéutico) . Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de alrededor de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, o 100,000 kDa.
Como se observa arriba, el polietilenglicol puede tener una estructura ramificada. Se describen los poliet ilenglicoles ramificados por ejemplo, en la patente U.S. No. 5,643,575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia. Las moléculas de polietilenglicol (u otras porciones químicas) se deben colocar a la proteína considerando los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existe un número de métodos de colocación disponibles para aquellos hábiles en el arte, por ejemplo la EP 0 401 384, aquí incorporada como referencia (acoplamiento PEG al G-CSF) , ver también Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (reportando la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo) . Por ejemplo, el polietilenglicol se puede enlazar covalentemente a través de residuos de aminoácido por medio de un grupo reactivo tal como, un grupo carboxilo o amino libre. Los grupos reactivos son aquellos a los cuales se puede enlazar una molécula activada de polie ilenglicol. Los residuos de aminoácido que tienen un grupo amino libre, pueden incluir residuos de lisina y los residuos de aminoácido N-terminal, aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido en la terminal C. Los grupos sulfhidrilo pueden también usarse como un grupo reactivo para colocar las moléculas de polietilenglicol. Se prefiere para propósitos terapéuticos la colocación en un grupo amino, tal como la colocación en la terminación N o grupo de lisina. Como se sugirió arriba, el polietilenglicol se puede colocar a las proteínas por medio de enlace a cualquiera de una diversidad de residuos de aminoácidos. Por ejemplo, el polietilenglicol se puede ligar a proteínas por medio de enlaces covalentes a la lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, o residuos de cisteína. Una o más químicas de reacción se pueden emplear para colocar el polietilenglicol a residuos específicos de aminoácidos (por ejemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína) de la proteína o a más de un tipo de residuo de aminoácido (por ejemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteina y combinaciones del mismo) de la proteina . Uno puede desear específicamente proteínas químicamente modificadas en la terminación N. Usando polietilenglicol como una ilustración de la composición actual, se puede seleccionar de una variedad de moléculas de polietilenglicol (por peso molecular, ramificado, etc.), la proporción de las moléculas de polietilenglicol a las moléculas de proteína (o de péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación a llevarse a cabo y el método de obtención de la proteína seleccionada pegilada con terminación N. El método de obtención de la preparación pegilada con terminación. N (esto es separando esta porción de otras porciones monopegiladas si es necesario) puede ser por purificación del material pegilado con terminal N de una población de moléculas de proteínas pegiladas. Las proteínas selectivas químicamente modificadas en la modificación de terminación N se pueden llevar a cabo por alquilación reductora que explota la reactividad diferencial de tipos diferentes de grupos amino primarios (lisina contra terminal N) disponible para la derivación en una proteína particular. Bajo las condiciones apropiadas de reacción, se alcanza la derivación substancialmente selectiva de la proteína en la terminación N con un polímero que contiene un grupo carbonilo. Como se indicó arriba, la pegilación de las proteínas de la invención se puede llevar a cabo por diversos medios. Por ejemplo, el polietilenglicol se puede colocar a la proteína directamente o por un ligador de intervención. Los sistemas sin ligadores para colocar el polietilen glicol a las proteínas se describen en Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992); Francis et al., Intern. J. of Hematol. 68:1-18 (1998); patente U.S. No..4 , 002 , 531 ; patente U.S. No.5, 349, 052; O 95/06058; y WO 98/32466, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia. Un sistema para colocar el polietilenglicol directamente a los residuos de aminoácidos de las proteínas, sin que intervenga un ligador, emplea MPEG tresilado, que se produce por la modificación de 'monometoxipolietilenglicol (MPEG) usando cloruro de tresilo ( CIS02CH2CF3 ) . Al reaccionar la proteína con el MPEG tresilado, se coloca directamente el polietilenglicol a los grupos amino de la proteína. Así, la invención incluye conjugados de polietilenglicol-proteína producidos por proteínas de reacción de la invención con una molécula de polietilenglicol que tiene un grupo sulfonilo de 2 , 2 , 2-trif luoroetano . El polietilenglicol también se puede colocar a proteínas usando una diversidad de diferentes enlazadores que participan. Por ejemplo, la patente U.S. No. 5,612,460, la descripción completa de la cual se incorpora aquí como referencia, describe enlazadores de uretano para conectar el polietilenglicol a las proteínas. Los conjugados proteína-polietilenglicol en donde el polietilenglicol se coloca a la proteína por un enlazador, se pueden también producir por la reacción de proteínas con compuestos tales como el MPEG-succinimidilsuecinato , MPEG activado con 1 , 1 ' -carbonildimidasol , MPEG-2,4,5-triclorofenilcarbonato, MPEG-p-nitrofenolcarbonato, y diversos derivados de succina to-MPEG . Se describen una diversidad de derivados adicionales de polietilenglicol y químicas de reacción para colocar el polietilenglicol a las proteínas en WO 98/32465, la descripción completa de la cual se incorpora aquí como referencia. Los productos de proteína pegilados producidos usando las químicas de reacción aquí establecidas, se incluyen dentro del alcance de la invención. El número de porciones de polietilenglicol colocadas a cada proteína de la invención (esto es, el grado de substitución) puede también variar. Por ejemplo, las proteínas pegiladas de la invención se pueden enlazar en promedio a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, o más moléculas de polietilenglicol. Similarmente , el grado promedio de substitución dentro de rangos tales como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, o 18-20 de porciones de polietilenglicol por molécula de proteína. Los métodos para determinar el grado de substitución se discuten por ejemplo en Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992) . Las proteínas de TNFR se pueden recuperar y purificar por métodos conocidos que incluyen pero no se limitan a, sulfato de amonio o precipitación por etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio con anión o catión, cromatografía de f os f ocelul osa , cromatografía de interacción hidroóobica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapat it a y cromatografía de lectina. Mas preferiblemente, se emplea para purificación la cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC) . Proteínas TNFR La invención proporciona además las proteínas que contienen secuencias de polipéptidos codificadas por los polinucleótidos de la invención . Las proteínas TNFR de la invención, pueden estar en monómeros o multímeros (esto es, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores) . De esta manera, la presente invención se relaciona con monómeros y multímeros de las proteínas TNFR de la invención, su preparación y composiciones (preferiblemente composiciones farmacéuticas) que las contienen. En modalidades específicas, los polipéptidos de la invención son monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. En modalidades adicionales, los multímeros de la invención son al menos dimeros, al menos trímeros o al menos tetrámeros . Los multímeros cubiertos por la invención pueden ser homómeros o heterómeros. Como se usa aquí, el término homómero se refiere a un multímero que contiene solamente proteínas TNFR de la invención (incluyendo fragmentos de TNFR, variantes y proteínas de fusión como se describen aquí) . Estos monómeros pueden contener proteínas TNFR que tienen secuencias idénticas o diferentes de polipéptidos . En una modalidad específica, un homómero de la invención es un multímero que contiene solamente proteínas TNFR que tienen una secuencia idéntica de polipéptidos. En otra modalidad especifica, un homómero de la invención es un multímero que contiene proteínas TNFR que tienen diferentes secuencias de polipéptido. En modalidades especificas, el multímero de la invención es un homodímero (por ejemplo, proteínas que contienen TNFR que tienen secuencias idénticas o diferentes de polipéptidos) o un homotrímero (por ejemplo,. proteínas que contienen TNFR que tiene . secuencias idénticas o diferentes de polipéptidos) . En modalidades adicionales, el multímero homomérico de la invención es al menos un homodímero, al menos un homotrimero o al menos un homot et rámero . Como se usan aquí, el término heterómero se refiere a un multimero que contiene proteínas heterólogas (esto es, proteínas que contienen solamente secuencias de polipéptidos que no corresponden a secuencias de polipéptidos codificadas por el gen de TNFR) además de las proteínas TNFR de la invención. En una modalidad específica, el multimero de la invención es un heterodímero , un heterotrímero o heterotetrámero . En modalidades adicionales, el multimero heteromérico de la invención es al menos un heterodímero, al menos un heterotrímero, o al menos un heterotetrámero. Los multímeros de la invención pueden ser el resultado de asociaciones hidrofóbicas , hidro f i 1 i cas , iónicas y/o covalentes y/o pueden enlazarse indirectamente mediante por ejemplo, la formación de liposomas. Así, en una modalidad los multímeros de la invención tales como por ejemplo homodímeros u homot rimeros , se forman cuando las proteínas de la invención hacen contacto una con la otra · en solución. En otra modalidad, los heteromultímeros de la invención tales como por ejemplo, heterotrímeros o heterotetrámeros , se forman cuando las proteínas de la invención hacen contacto con anticuerpos a los polipéptidos de la invención (incluyendo anticuerpos a la secuencia heteróloga de polipéptidos en una proteína de fusión de la invención) en solución. En otras modalidades, los multímeros de la invención se forman por asociaciones covalentes con y/o entre las proteínas TNFR de la invención. Tales asociaciones covalentes pueden involucrar uno o más residuos de aminoácido contenidos en la secuencia de polipéptidos de la proteína (por ejemplo, la secuencia de polipéptidos mencionada en la SEQ ID N0:2 o SEQ ID N0:4, contenida en el polipéptido codificado por el clon de cADN contenido en el depósito ATCC No.97810), contenido en el polipéptido codificado por el clon de cADN contenido en el depósito ATCC No. 97809) . En un ejemplo, las asociaciones covalentes se reticulan entre los residuos de cisteínas localizados dentro de las secuencias de polipéptidos de las proteínas que interactúan en el polipéptido natural (esto es, que se presenta naturalmente) . En otro ejemplo, las asociaciones covalentes son la consecuencia de la manipulación química o recombinante . Alternativamente, tales asociaciones covalentes pueden involucrar uno o más residuos de aminoácidos contenidos en la secuencia heteróloga de polipéptido en una proteina de fusión TNFR. En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entre la secuencia heteróloga contenida en una proteina de fusión de la invención (ver por ejemplo, patente U.S. número 5,478,925) . En un ejemplo especifico, las asociaciones covalentes son entre la secuencia heteróloga contenida en una proteina de fusión TNFR-Fc de la invención (como se describe aquí) . En otro ejemplo especifico, las asociaciones covalentes de las proteínas de fusión de la invención son entre las secuencias heterólogas de polipéptidos de otro miembro receptor-ligando de la familia TNF que es capaz de formar multímeros covalentemente asociados tales como por ejemplo, oseteoproteger ina (ver por ejemplo, números de publicación de la Solicitud Internacional WO 98/49305, los contenidos de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . En otra modalidad, dos o más polipéptidos TR6-alfa y/o TR6-beta de la invención se unen a través de enlazadores de ' péptidos. Ejemplos incluyen aquellos enlazadores de péptidos descritos en la patente U.S. No. 5,073,627 (incorporada aquí como referencia) . Las proteínas que comprenden polipéptidos múltiples TR6-alfa y/o TR6-beta separados por enlazadores de péptidos, se pueden producir usando tecnología convencional recombinante de ADN . Otro método para la preparación de polipéptidos multímeros de TR6-alfa y/o TR6-beta de la invención, involucra el uso de polipéptido RT6-alfa y/o TR6-beta unidos a una cremallera de leucina o a una secuencia de polipéptido en cremallera de isoleucina. Los dominios de cremallera de isoleucina y cremallera de leucina son polipéptidos que promueven la multimerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Las secuencias de cremallera de leucina se identificaron originalmente en diversas proteínas de enlace de ADN (Landschulz et al., Science 240:1759, (1988) ), y desde entonces se han encontrado en una diversidad de proteínas diferentes. Entre las secuencias de cremallera conocidas de leucina están los péptidos que se presentan naturalmente y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Ejemplos de los dominios de cremallera de leucina apropiados para producir proteínas multiméricas solubles TR6-alfa y/o TR6-beta, son aquellos descritos en la solicitud PCT WO 94/10308, que se incorpora aquí como referencia. Las proteínas de fusión recombinant es que comprenden un polipéptido soluble TR6-alfa y/o TR6-beta fundido a un péptido que se dimeriza o trimeriza en solución, se expresan en células huésped apropiadas, y el TR6-alfa y/o TR6-beta multimérico soluble resultante se recupera del sobrenadante del cultivo usando las técnicas conocidas en el arte. Ciertos miembros de la familia TNF de las proteínas, se cree que existen en forma trimérica (Beutler and Huffel, Science 264:667, 1994; Banner et al., Cell 73:431 , 1993) . Así, el TR6-alfa y/o TR6-beta triméricos pueden ofrecer la ventaja de una actividad biológica creciente. Las porciones preferidas de cremallera de leucina, son aquellas que forman preferiblemente trímeros. Un ejemplo es la secuencia de cremallera de leucina derivada de la proteína de tensoactiva del pulmón (SPD) como se describe en Hoppe et al. (FEBS Letters 344:191, (1994) ) y en la solicitud de patente U.S. Ser. No. 08/446, 922, que se incorpora aquí como referencia. Se pueden emplear otros péptidos derivados de proteínas triméricas que se presentan naturalmente para preparar el TR6-alfa y/o TR6-beta trimérico.
En modalidades adicionales preferidas, los polinucleót idos TR6-alfa y/o TR6-beta de la invención, se unen a un polinucleót ido que codifica un polipéptido "FLAG". Así, la proteína de fusión TR6-alfa-FLAG o TR6-beta-FLAG esta abarcada por la presente invención. El polipéptido antigénico FLAG se puede unir a un polipéptido TR6-alfa o un TR6-beta de la invención en una o ambas de las terminaciones amino o carboxi . En modalidades preferidas, una proteína de fusión TR6-alfa-FLAG o TR 6 -beta- FLAG se expresa a partir de un vector de expresión pFLAG-CMV-5a o un pFLAG-CMV-1 (disponible de Sigma, St . Louis, MO, USA) . Ver Andersson, S., et al., J. Biol. Chem. 264:8222-29 (1989); Thomsen, D.R., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:659-63 (1984) ; y Kozak, M . , Nature 308:241 (1984 ) (cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia) . En modalidades adicionales preferidas, una proteína de fusión TR6-alfa-FLAG o TR6-beta-FLAG se detecta por anticuerpos monoclonales anti-FLAG (también disponibles de Sigma) .
Los muí t imeros de la invención se pueden generar usando técnicas químicas conocidas en el arte. Por ejemplo, las proteínas que se desea contener en los multímeros de la invención, se pueden reticular químicamente usando moléculas enlazadoras y técnicas de optimización de la longitud de la molécula enlazadora conocidas en el arte (ver por ejemplo, patente US número, 5,478,925, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Adicionalmente, los multímeros de la invención se pueden generar usando técnicas conocidas en el arte para formar uno o más reticulados inter-moléculas entre los residuos de cisteína localizados dentro de la secuencia de polipéptidos de las proteínas que se desea contener en el multímero (ver por ejemplo, patente US número 5 , 478 , 925 , la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Además, las proteínas de la invención se pueden modificar rutinariamente por la adición de cisteína o biotina a la terminación C o la terminación N de la secuencia de polipéptidos de la proteína y las técnicas conocidas en el arte se pueden aplicar para generar multímeros que contiene una o más de estas proteínas modificadas (ver por ejemplo, patente US número 5,478,925, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Adicionalment e , las técnicas conocidas en el arte se pueden aplicar para generar liposomas que contienen los componentes de la proteina que se desea contener en el multimero de la invención (ver por ejemplo, Patente US Número 5,478,925, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Alternativamente, los multimeros de la invención se pueden generar usando técnicas de ingeniería genética conocidas en el arte. En una modalidad, las proteínas contenidas en los multimeros de la invención se producen de forma recombinante usando la tecnología de proteína de fusión descrita aquí o conocida de otra manera en el arte (ver por ejemplo, Patente US Número 5,478,925, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . En una modalidad . específica , los polinucleótidos que codifican un homodímero de la invención, se generan al unir una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención a una secuencia que codifica un polipéptido de unión y después además a un polinucleótido sintético que codifica el producto traducido del polipéptido en la orientación inversa de la terminación C original a la terminación N (careciendo de la secuencia líder) (ver por ejemplo, Patente US: número 5,478,925, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . En otra modalidad, las técnicas recombinantes aquí descritas o conocidas de otra manera en el arte, se aplican para generar polipéptidos recombinantes de la invención que contienen un dominio de transmembrana y que se pueden incorporar por técnicas de reconstitución de membranas en liposomas (ver por ejemplo, Patente US Número que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . En una modalidad, la invención proporciona proteínas aisladas de TNFR que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNFR completo (longitud completa) codificado por el cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810, la secuencia de aminoácido del polipéptido TNFR completo (longitud completa) codificada por el cADN contenida en el depósito ATCC No. 97809, la. secuencia de aminoácido del polipéptido completo TNFR- 6a descrito en la figura 1 (SEQ ID NO: 2), la secuencia de aminoácidos del polipéptido completo TNFR-ßß descrito en la figura 2 (SEQ ID NO: 4), o una porción de los polipéptidos anteriores. En otra modalidad, la invención proporciona proteínas aisladas de TNFR que comprenden o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro de TNFR codificado por el cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810, la secuencia de aminoácido del polipéptido maduro de TNFR codificado por el cADN contenido en el depósito ATCC No. 97809, los residuos de aminoácido, 31 a 300 de la secuencia TNFR-ßa descrita en la figura 1 (SEQ ID NO: 2), los residuos de aminoácidos 31 a 170 de la secuencia TNFR-ßß descrita en la figura 2 (SEQ ID NO: 4) , o una porción (esto es, fragmento) de los polipéptidos anteriores. Los fragmentos de polipéptidos de la presente invención, incluyen polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, una secuencia de aminoácido contenida en la SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos contenida en la SEQ ID NO: 4, una secuencia de aminoácidos codificada por el plásmido de cADN depositado como depósito ATCC No. 97810, una secuencia de aminoácidos codificada or el plásmido cADN depositado como depósito ATCC No. 97809, o una secuencia de aminoácidoa codificada por un ácido nucleico que hibridiza (por ejemplo, bajo condiciones de hibridación severa) a la secuencia de nucleótidos del cADN contenida en el depósito ATCC No. 97810 y/o 97809, o mostrado en las figuras 1 y/o 2 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente) o la hebra complementaria al mismo. Los polinucleótidos que hibridizan a estos fragmentos de polinucleótidos también están cubiertos por la invención. Los fragmentos de proteina pueden ser "de soporte libre" o comprenderse dentro de un polipéptido más grande de cuyo fragmento forma una parte o región, más preferiblemente una región simple continua. Ejemplos representativos de los fragmentos de polipéptidos de la invención incluyen por ejemplo, fragmentos que comprenden o consisten alternativamente de, residuos de aminoácidos: 1 a 31, 32 a 50, 51 a 100, 101 a 150, 151 a 200, 201 a 250, y/o 251 a 300 SEQ ID NO: 2. Ejemplos adicionales representativos de los fragmentos de polipéptidos de la invención, incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, los aminoácidos 1 a 31, 32 a 70, 70 a 100, 100 a 125, 126 a 150, y/o 151 a 170 de SEQ ID NO: 4. Más aún, los fragmentos de polipéptido pueden ser al menos de 10, 20, 30, 40, 50 , 60 , 70, 80 , 90 , 100 , 110, 120 , 130 , 140, 150, 175 o 200 aminoácidos en longitud. Los polinucleót idos que codifican estos polipéptidos también están cubiertos por la invención. En modalidades especificas, los fragmentos de polipéptidos de la invención comprenden o consisten alternativamente de, residuos de aminoácido: 100 a 150, 150 a 200, 200 a 300, 210 a 300, 220 a 300, 230 a 300, 240 a 300, 250 a 300, 260 a 300, 270 a 300, 280 a 300, y/o 290 a 300 como se señala en la figura 1 (SEQ ID NO: 2) . Los polinucleót idos que codifican estos polipéptidos también están cubiertos por la invención. El TNFR comprenden dos dominios que tienen diferentes propiedades estructurales y funcionales. El dominio de terminal amino abarca los residuos 30 a 196 de la SEQ ID NO: 2, muestra homología con otros miembros de la familia TNFR, a través de la conservación de cuatro dominios ricos en cisteína característicos de las familias TNFR. Las secuencias de aminoácidos contenidas en cada uno de los cuatro dominios incluyen residuos de aminoácidos 34 a 70, 73 a 113, 115 a 150, y 153 a 193, de la SEQ ID NO: 2, respectivamente. El dominio de terminal carboxi, que abarca los dominios de aminoácido 197 a 300 de la SEQ ID NO: 2, no tiene una homología significati a con cualquiera de las secuencias conocidas. A diferencia de diversos otros miembros de la familia del receptor TNF, el TNFR parece segregar exclusivamente una proteína y no parece sintetizarse como una forma asociada a la membrana ya que el dominio de terminal amino de la TNFR parece requerir actividad biológica del TNFR, el dominio de terminal carboxi parece ser importante para la multimerización del TNFR. En una modalidad, los polipéptidos de la invención comprenden o consisten alternativamente de, residuos de aminoácidos 34 a 70, 73 a 113, 115 a 150, y 153 a 193, y/o 30-196 de la SEQ ID NO: 2. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están cubiertos por la invención . En otra modalidad, los polipéptidos de la invención comprenden o consisten alternativamente, de, residuos de aminoácidos 197 a 240, 241 a 270, 271-300 , y/o 197 a 300 de la SEQ ID NO: 2. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también están cubiertos por la invención. Ya que se cree que estas secuencias de polipéptido se asocian con la multimerización del TNFR, las proteínas que tienen una o más de estas secuencias de polipéptido se esperaría que formen dímeros, trímeros y multímeros superiores, que pueden tener propiedades ventajosas tales como afinidad creciente de enlace, estabilidad mayor, y una vida media más extensa de circulación en comparación a las formas monómericas. En una modalidad específica, la invención suministra proteínas de fusión que comprenden fusiones de uno o más de los polipéptidos anteriores a una secuencia heteróloga de una molécula de señalización de células, tal como un receptor, un dominio extracelular del mismo y un fragmento activo, derivado o análogo de un receptor o un dominio extracelular. En una modalidad preferida, las secuencias heterólogas se seleccionan de la familia de receptores similares al TNR. Tales secuencias incluyen preferiblemente dominios de enlace y ligando extracelular funcional y carecen de dominios citoplásmicos y/o funcionales de transmembrana. Tales proteínas de fusión son útiles para detectar moléculas de interacción con las secuencias fundidas heterólogas con lo que se identifican nuevos receptores y ligandos potenciales. Las proteínas de fusión también son útiles para el tratamiento de una diversidad de trastornos, por ejemplo, aquellos relacionados con el enlace del receptor. En una modalidad, las proteínas de fusión de la invención que comprenden secuencias TNF/TNFR y receptor TNFR/TNFR se usan para tratar trastornos mediados por el receptor TNF, tales como inflamación, enfermedades autoinmunes, cáncer y trastornos asociados con la apoptosis excesiva o alternativamente reducida. Modalidades adicionales de los fragmentos de polipéptidos de TNFR comprenden, o consisten alternativamente de, regiones funcionales de polipéptidos de la invención, tales como las regiones alfa Garnier-Robson , regiones beta, regiones de giro y regiones de espiral, regiones alfa Chou-Fasman, regiones beta, y regiones de espiral, regiones hidrofílicas Kyt e - Dol i t t le , regiones anfipáticas alfa y beta Eisenberg, regiones flexibles Ka rplus - S chu 1 z , regiones formadoras de superficie Emini y regiones Jameson-Wolf de alto índice antigénico establecidas en la figura 4 (tabla 1) y figura 5 (tabla 2) como se describen aquí. En una modalidad preferida, los fragmentos de polipéptido de la invención son antigénicos . Los datos presentados en las columnas VIII, IX, XIII y XIV de las tablas I y II se pueden usar para determinar rutinariamente regiones de TNFR que muestran un alto grado de potencial para la antigenicidad . Las regiones de alta antigenicidad se determinan de los datos presentados en las columnas VIII, IX, XIII y/o XIV al escoger los valores que representan las regiones del polipéptido que son probables de estar expuestas sobre la superficie del polipéptido en un medio en el cual el reconocimiento del antígeno puede suceder en el proceso de iniciación de una respuesta inmune. Entre los fragmentos altamente preferidos de la invención, están aquellos que comprenden regiones del TNFR que combinan diversas características estructurales, tales como diversas de las características arriba establecidas (por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4) . Los polinucleót idos que codifican estos polipéptidos también están cubiertos por la invención. La presente invención abarca polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, un epítope del polipéptido que tiene una secu4encia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente, o un epitope de la secuencia de polipéptido codificada por una secuencia de polinucleótido contenida en el clon depositado en el depósito ATCC Número 97810 y 97809, respectivamente, o codificado por un polinucleótido que hibridiza al complemento de la secuencia de SEQ ID NOS: 1 y 3, respectivamente, o contenido en el clon depositado en el depósito ATCC Número 97810 y 97809, respectivamente, bajo condiciones severas de hibridación o condiciones de baja severidad de hibridación como se describe en supra. La presente invención además cubre secuencias de polinucleót idos que codifican un epitope de una secuencia de polipéptidos de la invención (tal como por ejemplo, la secuencia descrita en la SEQ ID NOS: 1 y/o 3), secuencias de polinucleótidos de la hebra complementaria de una secuencia de polinucleótidos que codifica un epitope de la invención, y secuencias de polinucleótidos que hibridizan a la hebra complementaria bajo condiciones severas de hibridación o condiciones de baja severidad de hibridación definida supra.
El término "epítopes", como se usa aquí, se refiere a porciones de un polipéptido que tienen una actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente en un humano. En una modalidad preferida, la presente invención abarca un polipéptido que comprende un epítope, así como el polinucleótido que codifica este polipéptido. Un "epítope inmunogénico" como se usa aquí, se define como una porción de una proteína que obtiene una respuesta de anticuerpo en un animal como se determina por cualquier método conocido en el arte, por ejemplo, por los métodos para generar anticuerpos descritos infra. (ver, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 1983)) . El término "epítope antigénico", como se usa aquí, se define como una porción de una proteína la cual un anticuerpo puede enlazar i nmunoe spec í f i cament e su antígeno como se determina por cualquier método bien conocido en el arte por ejemplo, por los inmunoensayos aquí descritos. El enlace i nmunoe spec í f i co excluye el enlace no específico pero no necesariamente excluye la reactividad cruzada con otros antígenos. Los epítopes antigénicos no necesariamente requieren ser inmunogénicos . Ejemplos no limitativos de los polipéptidos antigénicos o péptidos que se pueden usar para generar anticuerpos específicos de TNFR incluyen: un polipéptido ' que comprende o consiste alternativamente dé, residuos de aminoácido desde alrededor de Ala-31 hasta alrededor de Thr-46, desde alrededor de Phe-57 hasta alrededor de Thr- 117, desde alrededor de Cys-132 hasta alrededor de Thr-175, desde alrededor de Gly-185 hasta alrededor de Thr-194, desde alrededor de Val-205 hasta alrededor de Asp-217, desde alrededor de Pro-239 hasta alrededor de Leu-264, y desde alrededor de Ala-283 hasta alrededor de Pro-298 en la SEQ ID NO: 2; y desde alrededor de Ala-31 hasta alrededor de Thr-46, desde alrededor de Phe-57 hasta alrededor de Gln-80, desde alrededor de Glu-86 hasta alrededor de His-106, desde alrededor de Thr-108 hasta alrededor de Phe-119, desde alrededor de His-129 hasta alrededor de Val-138, y desde alrededor de Gly-142 hasta alrededor de Pro-166 en la SEQ ID NO: 4. Estos fragmentos de polipéptidos se han determinado que soportan epítopes antigénicos de los polipéptidos T FR- 6 alfa y TNFR-6 beta, respectivamente, por el análisis del índice antigénico Jameson-Wolf como se muestra arriba en las figuras 4 y 5. Los fragmentos que funcionan como epítope se pueden producir por cualquier medio convencional (ver por ejemplo, Houghten, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985), descrito además en la Patente U.S. Patente No. 4,631,211) . En la presente invención, los epítopes antigénicos contienen preferiblemente una secuencia de al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, más preferiblemente al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, y más preferiblemente, entre alrededor de 15 hasta alrededor de 30 aminoácidos. Los polipéptidos preferidos que comprenden epítopes inmunogénicos o antigénicos tienen al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 residuos de aminoácidos de longitud. Los epítopes antigénicos son útiles por ejemplo, para elevar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente al epítope. Los epítopes antigénicos se pueden usar como las moléculas objetivo en inmunoensayos . (ver por ejemplo, Wilson et al., Cell 37:767-778(1984); Sutcliffe et al., Science 219:660-656 (1983)) . S imi larment e , se pueden usar los epitopes inmunogénicos , por ejemplo, para inducir anticuerpos según los métodos bien conocidos en el arte. (ver por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:910-914; and Bittle et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985) . Los polipéptidos que comprenden uno o más epitopes inmunogénicos se pueden, presentar para obtener una respuesta de anticuerpo junto con una proteina portadora tal como una albúmina, a un sistema animal (tal como, por ejemplo, conejo o ratón), o si el polipéptido tiene la longitud suficiente (al menos alrededor de 25 aminoácidos), el polipéptido se puede presentar sin un portador. Sin embargo, los epitopes inmunogénicos gue comprenden solamente de 8 a 10 aminoácidos han demostrado ser suficientes para elevar anticuerpos capaces de enlazarse a, hasta el último, epitopes lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en el manchado Western) . Los polipéptidos gue soportan epitopes de la presente invención, se pueden usar para inducir anticuerpos según los métodos bien conocidos en el arte incluyendo pero no limitados a, inmunización in vivo, inmunización in vitro, y métodos de despliegue de fagos, ver por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; ilson et al., supra, y Bittle et al., J. Gen, Virol., 66:2347+2354(1 85) . Si se usa la inmunización in vivo, los animales se pueden inmunizar con un péptido libre, sin embargo, la titulación del anticuerpo de anti-péptido puede elevarse al acoplar el péptido a un portador macromolecular tal como una hemocianina de una variedad de lapa (KLH) o toxoide tetánico. Por ejemplo, los péptidos que contienen residuos de cisteina se pueden acoplar a un portador usando un agente de unión tal como un éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) , mientras que otros péptidos se pueden acoplar a portadores usando un agente más general de enlace tal como el glut araldehido . Los animales tales como, por ejemplo, conejos, ratas y ratones, se inmunizan con péptidos libres o acoplados a un portador, por ejemplo, por inyecciones intraperitonales y/o intradermales de emulsiones que contienen alrededor de 100 microgramos de péptido o proteina portadora y un adyuvante de Freund o cualquier otro adyuvante conocido para estimular una respuesta inmune. Se pueden necesitar diversas inyecciones de elevación por ejemplo, en intervalos de alrededor de dos semanas para suministrar una titulación útil de anticuerpo anti-péptido que se pueda detectar por ejemplo, por el ensayo ELISA usando un péptido libre adsorbido a una superficie sólida. La titulación de los anticuerpos anti-péptido en suero de un animal inmunizado, se puede incrementar por la selección de anticuerpos anti-pépt idos por ejemplo, por la dbsorción al péptido sobre un soporte sólido y la elución de los anticuerpos seleccionados según los métodos bien conocidos en el arte. Como lo apreciará alguien con habilidad en el arte como se discute arriba, los polipéptidos de la presente invención que comprenden un epitope inmunogénico o antigénico, se pueden fundir a otras secuencias de polipéptido. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención se pueden fundir por el dominio constante de inmunoglobulina (IgA, IgE, IgG, IgM) , o porciones de las mismas (CH1, CH2, CH3, o cualquier combinación de las mismas y porciones de las mismas) resultando en polipéptidos quiméricos. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación y pueden incrementar la vida media in vivo. Esto se ha demostrado para proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido humano CD4 y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de las inmunoglobulinas de mamíferos. Ver por ejemplo, EP 394,827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988) . Las proteínas de fusión IgG que tienen una estructura dimérica ligada al bisulfuro debido a los enlaces bisulfuro de porción IgG, también se han encontrado ser más eficientes en el enlace y neutralización de otras moléculas que sólo los polipéptidos o fragmentos monoméricos de los mismos. Ver por ejemplo, Fount oul a ki s et al., J. Biochem. , . 270:3958-3964 (1995) . Los ácidos nucleicos que codifican los epítopes anteriores también se puede recombinar con un gen de interés con una etiqueta de epítopes (por ejemplo, la etiqueta de hemaglut inina ("HA") o etiqueta de bandera) para ayudar en la detección y purificación del polipéptido expresado. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al., permite la purificación rápida de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en lineas de células humanas (Janknecht et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8972-897) . En este sistema, el gen de interés se subclona dentro de un plásmido de recombinación de vacuna, tal que la estructura de lectura abierta del gen se funde por traducción a una etiqueta de terminal amino que consiste de seis residuos de histidina. La etiqueta sirve como el dominio de enlace a la matriz para la proteina de fusión. Los extractos de las células infectadas con el virus de vacuna recombinante se cargan sobre la columna de agarosa-ácido nitriloacético Ni2+ y las proteínas etiquetadas con histidina se pueden eluir selectivamente con soluciones amortiguadoras que contienen imidazol. Se pueden emplear las técnicas de mezclado de genes, mezclado de porciones, mezclado de exones, y/o mezclado de codones (referido colectivamente como "mezclado de ADN") para modular las actividades del TR6 alfa y/o TR6 beta por lo cual se generan efectivamente agonistas y antagonistas del TR6 alfa y/o TR6 beta. Ver generalmente, Patentes U.S. Nos. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, y 5,837,458, y Patten, P.A., et al., Curr Opinión Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, S. Trends Biotechnol. 16(2) :76-82 (1998); Hansson, L. 0., et al . , J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); Lorenzo, M. . and Blasco, R. Biotechniques 24(2) :308-13 (1998) (cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan aquí como referencia) . En una modalidad, la alteración de los polinucleót idos de TR6 alfa y/o TR6 beta y los polipéptidos correspondientes, se pueden lograr por mezclado de ADN. El mezclado de ADN involucra el ensamble de dos o más segmentos de ADN dentro de la molécula deseada TR6 alfa y/o TR6 beta por recombinación homologa o especifica del sitio. En otra modalidad, los polinucleótidos TR6 alfa y/o TR6 beta y los polipéptidos correspondientes se pueden alterar al someterse a una mutagénesis aleatoria por PCR propensa al error, inserción de nucleótidos aleatoria u otros métodos previos a la re comb i na c i ón . En otra modalidad, uno o más componentes, porciones, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. del TR6 alfa y/o TR6 beta se pueden recombinar con uno o más componentes, porciones, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas. En modalidades preferidas, las moléculas heterólogas son TNF-alfa, TNF-beta, linfotoxina alfa, linfotoxina beta, ligando FAS, APRIL. En modalidades adicionales preferidas, las moléculas heterólogas son cualquier miembro de la familia TNF. Adicionalmente, las técnicas de mezclado de gen, mezclado de porción, mezclado de exones, y/o mezclado de codones (referidas colectivamente, como "mezclado de ADN" ) se pueden emplear para modular las actividades del TNFR con lo cual se generan efectivamente agonistas y antagonistas de TNFR. Ver generalmente las Patentes U.S. Nos. 5, 605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, y 5,837,458, y Patten et al., Curr. Opinión Biotechnol. 8:724-33 (1997); Harayama, Trens Biotechnol. 16(2) :76-82 (1998) ; Hansson et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999); y Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24(2) :308-13 (1998) (cada una de estas patentes y publicaciones se incorporan aqui como referencia) . En una modalidad, la alteración de los polinucleót idos TNFR y los polipéptidos correspondientes se puede alcanzar por mezclado de ADN. El mezclado de ADN involucra el ensamble de dos o más enlaces de ADN dentro de una molécula deseada de TNFR por recombinación homologa o especifica del sitio. En otra modalidad, los polinucleótidos de TNFR y los polipéptidos correspondientes se pueden alterar al someterse a mutagénesis aleatoria por PCR propensa al error, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos previos a la recombinación. En otra modalidad, uno o más componentes, porciones, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. del TNFR se pueden recombinar con uno o más componentes, porciones, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas. En modalidades preferidas, las moléculas heterólogas incluyen pero no se limitan a, TNF alfa, linfotoxina alfa (LT alfa también conocida como TNF beta), LT-beta (encontrada en el heterotrimero complejo LT - a 1 f a 2 -be t a ) , OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-IBBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (Publicación internacional No. O 96/14328), TRAIL, AIM-II (Publicación internacional No. WO 97/34911), APRIL (J.Exp.Med. 188 ( 6 ) : 1185 - 1190 ) , alfa endocina (Publicación internacional No. WO 98/07880), alfa neutrocina (Publicación internacional No. WO 98/18921), TR6 (Publicación internacional No. WO 98/30694), OPG, 0X40, y factor de crecimiento de nervio (NGF) , y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-IBB, TR2 (Publicación internacional No. WO 96/34095), DR3 (Publicación internacional No. WO 97/33904), DR4 (Publicación internacional No. WO 98/32856), TR5 (Publicación internacional No. WO 98/30693), TR7 (Publicación internacional No. WO 98/41629), TRANK, TR9 (Publicación ' internacional No. WO 98/56892), TRIO (Publicación internacional No. WO 98/54202), 312C2 (Publicación internacional No. WO 98/06842), y TR12, y formas solubles de CD154, CD70, y CD153. En modalidades adicionales preferidas, las moléculas heterólogas son cualquier miembro de la familia TNF. Para mejorar o alterar las características de un polipéptido TNFR, se puede emplear la ingeniería de proteínas. La tecnología de ADN recombinante conocida por aquellos hábiles en el arte, se puede usar para crear proteínas mutantes novedosas o "muteínas" que incluyen substituciones, eliminaciones, y adiciones de aminoácidos múltiples o simples o proteínas de fusión. Tales polipéptidos modificados pueden mostrar por ejemplo una actividad creciente o estabilidad aumentada. Además, se pueden purificar con mayores rendimientos y mostrar una mejor solubilidad que el polipéptido natural correspondiente, al menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento. Por ejemplo, para muchas proteínas, incluyendo el dominio extracelular de una proteina asociada a la membrana o la forma madura de una proteína segregada, se conoce en el arte que uno o más aminoácidos se pueden eliminar de la terminación C o la terminación N sin una pérdida substancial de la función biológica. Por ejemplo, Ron et al., J. Biol. Chem., 268 : 298 -2988 (1993) reporta proteínas modificadas con KGF que tienen una actividad de enlace a la heparina aun si estaban faltando los residuos de aminoácidos de terminal amino 3 , 8 , ó 27. En el caso actual, ya que las proteínas de la invención son miembros de la familia del polipéptido TNFR, las eliminaciones de los aminoácidos de la terminal N hasta la cisteína en la posición 49 de la SEQ ID NOS: 2 y 4 ( TNFR- 6 alfa y TNFR-6beta) pueden retener alguna actividad biológica tal como por ejemplo la regulación de la proliferación celular y la apoptosis (por ejemplo, de célula linfoide) la capacidad para enlazar el ligando Fas (FasL) y la capacidad para enlazar el AIM-II. Los polipéptidos que tienen eliminaciones adicionales en la terminal N incluyen el residuo Cys-49 en la SEQ ID NOS: 2 y 4 , no se esperaría que retengan tales actividades biológicas ya que se conoce que estos residuos en un polipéptido relacionado al TNFR se requieren para formar un puente bisulfuro, para proporcionar la estabilidad estructural que se necesita para el enlace receptor/ligando y la transducción de señal. Sin embargo, si la eliminación de uno o más aminoácidos de la terminación N de una proteína resulta en la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, se pueden retener todavía actividades funcionales. Así, la capacidad de una proteína recortada para inducir y/o enlazar dos anticuerpos que reconozcan el TNFR maduro o completo o el dominio extracelular de la proteína TNFR, estarán generalmente retenidas cuando menos de la mayoría de los residuos de los TNFR completos, TNFR maduro o dominio extracelular de TNFR se separan de la terminación N. Si un polipéptido particular que carece de los residuos de la terminal N de una proteína completa retiene tales actividades inmunológicas , se puede determinar fácilmente por métodos de rutina aquí descritos y otros conocidos en el arte. De esta manera, la presente invención proporciona además polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, uno o más residuos eliminados de la terminación amino en la secuencia de aminoácidos del TNFR mostrado en la SEQ ID NOS: 2 y 4, hasta el residuo de cisteina en la posición número 49, y los polinucleót idos que codifican tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos TNFR que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de los residuos m-300 de la figura 1 (SEQ ID NO: 2) y/o residuos n-170 de la figura 2 (SEQ ID NO: 4), en donde m y n son enteros en el rango de 1-49 y en donde 49 es la posición del primer residuo cisteina de la terminación N de los polipéptidos completos TNFR-ßa y TNFR-ßß (mostrados en la SEQ ID NOS 2 y 4, respectivamente) que se cree y se requieren para la actividad de la actividad de las proteínas TNFR-60C y TNFR-dß. Más en particular, la invención proporciona polinucleót idos que codifican polipéptidos que tienen (esto es, comprenden) o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de un miembro seleccionado del grupo que consiste de los res iduos : : 1- 300, 2-300, 3-300, 4 -300, 5- 300, 6- 300, 7-300, 8-300, 9 -300, 10--300, 11- 300, 12-300, 13-300, 14- 300 , 15-¦300 , 16-¦300, 17- 300 , 18-300, 19-300, 20- 300, 21-¦300, 22-¦300, 23- 300 , 24-300, 25-300, 26- 300, 27- 300 , 28-•300, 29- 300 , -300, 31-300, 32- 300, 33- 300 , 34- 300, 35- 300, 36-300, 37-300, 38- 300, 39- 300 , 40- 300, 41- 300, 42-300, 43-300, 44- 300, 45- 300, 46- 300 , 47- 300 , 48-300, y 49-300 de la SEQ ID NO: 2 ; y 1-70,r 2- 170, 3- 170, 4-170, 5 -170, 6- 170, 7-170, G 1-170, 9- 170, 10 -170, 11- 170, 12 -170, 13- 170, 14- 170, 15- 170, 16 -170, 17- 170, 18 -170, 19- 170, 20- 170, 21- 170, 22 -170, 23- 170, 24· -170, 25- 170, 26- 170, 27- 170, 28 -170, 29- 170 , 30· -170, 31- 170, 32- 170 , 33- 170, 34 -170, 35- 170, 36--170, 37- 170, 38- 170, 39- 170, 40 -170, 41- 170, 42· -170, 43- 170, 44- 170 , 45- 170, 46--170, 47-170, 48- 170 y 49- 170 de la SEQ ID NO: 4. Los polipéptidos codificados por estos fragmentos de polinucleótidos también están abarcados por la invención. En una modalidad especifica, la invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos y un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos: Val-30 a His-300 de la SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos codificados por estos fragmentos de nucléotidos también están cubiertos por la invenció . En otras modalidades especificas, la invención proporciona polinucleót idos que codifican polipéptidos que comprenden, o consisten alternati amente de, la secuencia de aminoácido y un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos: P-23 hasta H-300 , y/o P-34 a H-300 de la SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos codificados por estos pol inucleót idos también están abarcados por la invención. Como se mencionó arriba, aun si la eliminación de uno o más aminoácidos de la terminación N de una proteina resulta en la modificación de pérdida de una o más fusiones biológicas de la proteina, se pueden todavía retener otras actividades funcionales (por ejemplo actividades biológicas) . Así, la capacidad de la muteínas TNFR recortadas para inducir y/o enlazar los anticuerpos que reconocen las formas maduras o completas de los polipéptidos, se retendrá generalmente cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo maduro, se eliminen de la terminación N. Si un polipéptido particular que carece de los residuos de la terminal N de un polipéptido completo retiene tales actividades inraunológicas, se pueden determinar fácilmente por métodos de rutina aquí descritos y de otra manera conocidos en el arte. No es improbable que una muteína TNFR con un gran número de residuos de aminoácido eliminados en la terminal N, pueda retener algunas actividades biológicas o inmunogénicas . De hecho, los péptidos compuestos de solamente seis residuos de aminoácidos TNFR pueden a menudo provocar una respuesta inmune. De esta manera, la presente invención proporciona además polipéptidos que tienen uno o más residuos eliminados de la terminación amino de la secuencia de aminoácido TNFR-6a mostrada en la figura 1 (esto es, SEQ ID NO: 2), hasta el residuo de arginina en la posición número 295 y polinucleótidos que codifican tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, el aminoácido de residuos n1-300 de la figura 1 (SEQ ID NO: 2), en donde n1 es un entero de 49 a 295, correspondiendo a la posición del residuo de aminoácido en la figura 1 (SEQ ID NO: 2) . Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de un miembro seleccionado de un grupo que consiste de los residuos de C -49 a H -300 , A -50 a H - 300 ; Q-¦51 a H- 300 ; C-52 a H -300 ; P -53 a H - 300 ; P -54 a H-¦300; G- 55 a H-300 ; T -56 a H - 300 ; F -57 a H - 300 ; V-•58 a H- 300 ; Q-59 a H -300 ; R -60 a H - 300 ; P -61 a H-¦300; C- 62 a H-300; R -63 a H -300 ; R -64 a H -300 ; D- 65 a H- 300 ; S-66 a H -300; P--67 a H -300; T -68 a H-¦300; T- 69 a H-300; C -70 a H -300 ; G -71 a H -300 ; P- 72 a H- 300 ; C-73 a H -300; P--74 a H -300; P -75 a H- 300; R- 76 a H-300; ?· -77 a H ¦ -300 ; Y--78 a H -300 ; T- 7 a H- 300; Q-80 a ?· -300; F--81 a H -300 ; W--82 a H- 300 ; N- 83 a H-300; Y--84 a H--300 ; L--85 a H--300; E- 86 a H- 300; R-87 a H--300; C--88 a H--300; R--89 a H- 300 ; Y- 90 a H-300; C--91 a H--300 ; N--92 a H--300; V- 93 a H- 300 ; L-94 a H--300; C--95 a H--300 ; G--96 a H- 300 ; E- 97 a H-300 ; R-¦98 a H-.300 ; E- 99 a H- 300 ; E -100. a H- 300 ; E-101 a H-300 ; A-102 a H-300; R-103 a H-300; A-104 a H-300; C-105 a H-300; H-106 a H-300; A-107 a H-300; T-108 a H-300; H-109 a H-300; N-110 a H- 300;' R-lll a H-300; A-112 a H-300; C-113 a H-300; R-114 a H-300; C-115 a H-300; R-116 a H-300; T-117 a H-300; G-118 a H-300; F-119 a H-300; F-120 a H- 300; A-121 a H-300; H-122 a H-300; A-123 a H-300; G-124 a H-300; F-125 a H-300; C-126 a H-300; L-127 a H-300; E-128 a H-300; H-129 a H-300; A-130 a H-300; S-131 a H-300; C-132 a H-300; P-133 a H-300; P-134 a H-300; G-135 a H-300; A-136 a H-300; G-137 a H-300; V-138 a H-300; 1-139 a H-300; A-140 a H-300; P-141 a H-300; G-142 a H-300; T-143 a H-300; P-144 a H-300; S-145 a H-300; Q-146 a H-300; N-147 a H-300; T-148 a H-300; Q-149 a H-300; C-150 a H-300; Q-151 a H-300; P-152 a H-300; C-153 a H-300; P-154 a H-300; P-155 a H-300; G-156 a H-300; T-157 a H-300; F-158 a H-300; S-159 a H-300; A-160 a H-300; S-161 a H-300; S-162 a H-300; S-163 a H-300; S-164 a H-300; S-165 a H-300; E-166 a H-300; Q-167 a H-300; C-168 a H-300; Q-169 a H-300; P-170 a H-300; H-171 a H-300; R-172 a H-300; N-173 a H-300; C-174 a H-300; T-175 a H-300; A-176 a H-300; L-77 a H-300; G-178, L-179 a H-300; A-180 a H-300; L-181 a H-300; N-182 a H-300; V-183 a H-300; P-184 a H-300; G-185 a H-300; S-186 a H-300; S-187 a H-300; S-188 a H-300; H-189 a H-300; D-190 a H-300; T-191 a ?-300; L-192 a H-300; C-193 a H-300; T-194 a H-300; S-195 a H-300; C-196 a H-300; T-197 a H- 300; G-198 a H-300; F-199 a H-300; P-200 a H-300; L-201 a H-300; S-202 a H-300; T-203 a H-300; R-204 a H-300; V-205 a H-300; P-206 a H-300; G-207 a H- 300; A-208 a H-300; E-209 a H-300; E-210 a H-300; C-211 a H-300; E-212 a H-300; R-213 a H-300; A-214 a H-300; V-215 a H-300; 1-216 a H-300; D-217 a H- 300; F-218 a H-300; V-219 a H-300; A-220 a H-300; F-221 a H-300; Q-222 a H-300; D-223 a H-300; 1-224 a H-300; S-225 a H-300; 1-226 a H-300; K-227 a H-300; R-228 a H-300; L-229 a H-300; Q-230 a H-300; R-231 a H-300; L-232 a H-300; L-233 a H-300; Q-234 a H-300; A-235 a H-300; L-236 a H-300; E-237 a H-300; A-238 a H-300; P-239 a H-300; E-240 a H-300; G-241 a H-300; W-242 a H-300; G-243 a H-300; P-244 a H-300; T-245 a H-300; P-246 a H-300; R-247 a H-300; A-248 a H-300; G-249 a H-300; R-250 a H-300; A-251 a H-300; A-252 a H-300; L-253 a H-300; Q-254 a H-300; L-255 a H-300; K-256 a H-300; L-257 a H-300; a H-30Ó; R-258 a H-300; R-259 a H-300; R-260 a H-300; L-261 a H-300; T-262 a H-300; E-263 a H-300; L-264 a H-300; L-265 a H-300; G-266 a H-300; A-267 a H-300; Q-268 a H-300; D-269 a H-300; G-270 a H-300; A-271 a H-300; L-272 a H-300; L-273 a H- 300; V-274 a H-300; R-275 a H-300; L-276 a H-300; L-277 a H-300; Q-278 a H-300; A-279 a H-300; L-280 a H-300; R-281 a H-300; V-282 a H-300; A-283 a H -300; R-284 a H-300; M-285 a H-300; P-286 a H-300; G-287 a H-300; L-288 a H-300; E-289 a H-300; R-290 a H-300; S-291 a H-300; V-292 a H-300; R-293 a H-300; E-294 a' H-300; Y R-295 a H-300; de la secuencia TNFR-ßa mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 2) . Los polipéptidos codificados por estos fragmentos de polinucleótidos también están cubiertos por la invención. Similarmente , se conocen muchos ejemplos de muteinas de eliminación en la terminal C biológicamente funcionales. Por ejemplo, el gamma interferon muestra actividades hasta diez veces superiores al eliminar 8-10 residuos de aminoácidos de la terminación carboxi de la proteina (Dóbeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)) . En el caso actual, ya que la proteina de la invención es un miembro de la familia del polipéptido de TNFR, las eliminaciones de los aminoácidos en la terminación C hasta la cisteina en la posición 193 y 132 de la SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente, puede retener alguna actividad funcional tal como por ejemplo una actividad biológica (tal como, por ejemplo, la regulación de la proliferación de apoptosis (por ejemplo, de células linfoides, capacidad de enlazar el ligando Fas y capacidad de enlazar AIM-II)) . Los polipéptidos que tienen eliminaciones adicionales en la terminal C incluyen las cisteinas en las posiciones 193 y 132 de la SEQ ID NOS: 2 y 4, respectivamente, no se esperaría que retengan tales actividades biológicas ya que se conoce que este residuo en los polipéptidos relacionados con el receptor TNF se requiere para formar puentes bisulfuro para proporcionar la estabilidad estructural que se necesita para el enlace del receptor . Sin embargo, aun si la eliminación de uno o más aminoácidos de la terminación C de una proteína resulta en la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, otras actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, la capacidad de multimeri zar y la capacidad de enlazar ligandos (por ejemplo ligando Fas y AIM-II)) se puede todavía retener. Así, la capacidad de la proteína recortada para inducir y/o enlazar los anticuerpos que reconozcan la forma madura o completa de la proteína, se retendrá generalmente cuando menos de la mayoría de los residuos de la proteína en forma madura o completa se separan de la terminación C. Si un polipéptido particular que carece de los residuos en la terminal C de una proteína completa retiene tales actividades inmunologicas , se puede determinar fácilmente por métodos de rutina aquí descritos y conocidos de otra manera en el arte. De esta manera, la presente invención proporciona además polipéptidos que tienen uno o más residuos de la terminación carboxi de la secuencia de aminoácidos de TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta mostrado en la SEQ ID NOS 2 y 4, hasta la cisteína en la posición 193 y 132 de la SEQ ID NOS: 2 y 4, respectivamente, y los polinucleót idos que codifican tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos y un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos 1-y y 1-z de la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NOS: 2 y 4, respectivamente, en donde y es cualquier entero en el rango de 2 y , en donde y. es cualquier entero en el rango de 193-300 y z es cualquier entero en el rango de 132-170. Los pol inucleót i do s que codifican estos polipéptidos también se suministran . En ciertas modalidades preferidas, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos 1-y' y 1-z' de la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NOS: 2 y 4, respectivamente, en donde y' es cualquier entero en el rango de 193-299 y z' es cualquier entero en el rango de 132-169. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos también se suministran . En modalidades especificas preferidas adicionales, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos Pro-23 a His-300, Val-30 a His-300 y Pro-34 a His-300 de la SEQ ID NO: y polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácido de un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos Pro-23-a Pro-170, Val-.30 a Pro-170, y Pro-34 a His-Pro-170 de la SEQ ID NO: 4. Como se describe aquí, estos polipéptidos se pueden fundir a secuencias heterólogas de polipéptido. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos y estos polipéptidos de fusión también se proporcionan. La invención también suministra polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos eliminados de la terminaciones amino y carboxilo, que se pueden describir generalmente como que tienen residuos m-y de la SEQ ID NO: 2 y n-z de la SEQ ID NO: 4, en donde m, n, y e z son enteros como se describió arriba . También como se mencionó arriba, aun si la eliminación de uno o más aminoácidos de la terminación C de la proteína resulta en la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, otras actividades funcionales, (por ejemplo actividades biológicas, la capacidad de formar homomult ímeros y la capacidad de enlazar un ligando (por ejemplo, ligando Fas y AIM-II)) se puede todavía retener. Por ejemplo, la capacidad de la muteína de TNFR recortada para inducir y/o enlazar los anticuerpos, la cual reconoce las formas completas o maduras de los polipéptidos, se retendrá generalmente cuando menos de la mayoría de los residuos y el polipéptido completo o maduro, se separen de la terminación C. Si un polipéptido particular que carece de los residuos en la terminal C de un polipéptido completo retiene tales actividades inmunológicas , se puede determinar fácilmente por métodos de rutina aquí descritos y conocidos de otra manera en el arte. No es improbable que una muteína de TNFR con un gran número de residuos de aminoácido en 1 terminal C eliminados, pueda retener algunas actividades biológicas e inmunogénicas . De hecho, los péptidos que se componen de solamente seis residuos de aminoácido TNFR pueden a menudo provocar una respuesta inmune. De esta manera, la presente invención proporciona además polipéptidos que tienen uno o más residuos eliminados de la terminación carboxi de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNFR mostrado en la figura 1 (SEQ ID NO: 2), hasta el residuo de glicina en la posición número 6, y los pol inucleót idos que codifican tales polipéptidos. En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprende o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácido de los residuos 1-m1 de la figura 1 (esto es, SEQ ID NO: 2), en donde m1 es un entero desde 6 hasta 299, correspondiendo a la posición del residuo de aminoácido en la figura 1 (SEQ ID NO: 2) . Más en particular, la invención proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos que comprenden, o' consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácido de un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos M-l a V-299; M-l a P-298 ; M-l a L-297 ; M-l a F-296 ; M-l a R-295; M-l a E-294; M-l a R-293 ; M-l a V-292 ; M-l a S-291; M-l a R-290; M-l a E-289; M-l a L-88; M-l a G-287; M-l a P-286; M-l a M-285; M-l a R-284; M-1 a A-283; M-l a V-282 ; M-l a R-281; M-l a L-280; M-l a A-279; M-l a Q-278; M-l a L-277; M-l a L-276; M-l a R-275 ; M-l a V-274 ; M-l a L-273 ; M-l a L-272 ; M-l a A-271; M-l a G-270 ; M-l a D-269 ; M-l a Q-268; M-l a A-267; M-l a G-266; M-l a L-265; M-1 a L-264; M-l a E-263; M-l a T-262; M-l a L-261; M-l a R-260; M-l a R-259; M-l a R-258; M-l a L-257 ; M-l a K-256 ; M-l a L-255; M-l a Q-254 ; M-l a L-253; M-l a A-252 ; M-l a A-251; M-l a R-250; M-l a G-249; M-l a A-248; M-l a R-247; M-l a P-246; M-1 a T-245; M-l a P-244 ; M-l a G-243 M-l a W-242 ; M-l a G-241; M-l a E-240; M-l a P-239; M-l a A- 238 ; M-l a E-237 ; M-l a L-236; M-l a A-235; M-l a Q-234 ; M-l a L-233; M-l a L-232; M-l a R-231; M-l a Q-230; M-l a .L-229; M-l a R-228; M-l a K-227; M- 1 a 1-226; M-l a S-225; M-l a 1-224; M-l a D-223; M-l a Q-222 ; M-l a F-221; M-l a A-220; M-l a V-219; M-l a F-218; M-l a D-217; M-l a 1-216; M-l a V-215; M-l a A-214, M-l a R-213; M-l a E-212; M-l a C-211; M-l a E-210; M-l a E-209; M-l a A-208; M-1 a G-207; M-l a P-206; M-l a V-205; M-l a 204; -1 a T-203; M-l a S-202; M-l a L-201; M-l a P-200; M-l a F-199; M-l a G-198; M-l a T-197; M-l a C-196; M-l a S-195; M-l a T-194; M-l a C-193; M-l a L-192; M-l a T-191; M-l a D-190; M-l a H-189; M-l a S-188; M-l a S-187; M-l a S-186; M-l a G-185; M-1 a P-184; M-l a V-183; M-l a N-182; M-l a L-181; M-l a A-180; M-l a L-179; M-l a G-178; M-l a L-177; M-l a A-176; M-l a T-175; M-l a C-174; M-l a N-173; M-l a R-172; M-l a H-171; M-l a P-170; -l a Q-169; M-l a C-168; M-l a Q-167; M-l a E-166; M-1 a S-165; M-l a S-164; M-l a S-163; M-l a S-162; M-l a S-161; M-l a A-160; M-l a S-159; M-l a F-158; M-l a T-157; M-l a G-156; M-l a P-155; M-l a P-154; M-l a C-153; M-l a P-152; M-l a Q-151; M-l a C-150; M-l a Q-149; M-l a T-148; M-l a N-147; M-1 a Q-146; M-l a S-145; M-l a P-144; M-l a T-143; M-1 a G -142; M-1 a P<-141; M-1 a. A-140; M-1 a I- 139; • M-1 a V-138; M -1 a G-137; M -1 a A-136: M- 1 5 G-135; M [-1 a P-¦134; M--1 a P - 133 ; M -1 a C -132 r M-1 a S--131; M-l a A-130; M-1 a H-129; M-1 a E-128 ; M- 1 a L-127; M-1 a C- 126; M-1 a F- 125; M-1 a G - 124 ; M-1 a A--123; M--1 a H--122; M-l a A- 121 ; M-1 a F- 120; M-1 a F-119; M -1 a G-118; M -1 a T-117; M- 1 a R-116; M -1 a C- 115; M--1 a R - 114 ; -1 a C - 113 ; M-1 a A-•112; M-l a R-lll ; M-1 a N-110; M-1 a H-109; M- 1 a T-108; M-1 a A- 107; M-1 a H- 106; M-1 a C - 105 ; M-1 a A--104; M --1 a R--103; : M-l a A .-102 ; M-1 a E- 101; M-l a E-100; M-¦1 a E-99; M-1 a R-98 ; M-1 a E- 97; M-1 a G-96; M-1 a C-95; M-1 a L-94 ; M-1 a V- 93; M-1 a N - 92 ; M-1 a C - 91 ; M-1 a Y- 90 ; M-1 a R- 89; M-1 a C-88; M-1 a R-87 ; M-1 a E - 86 ; M-1 a L- 85; M-1 a Y - 84 ; M-1 a N - 83 ; M-1 a W-82 ; M-1 a F- 81; M-1 a Q-80; M-1 a T - 79 ; M-1 a Y- 78 ; M-1 a H- 77 ; M-1 a R-76; M-1 a P-75 ; M-1 a P-74 ; M-1 a C- 73; M-1 a P-72; M-1 a G-71 ; M-1 a C - 70 ; M-1 a T- 69; M-1 a T-68, M-1 a P-67 ; M-1 a S - 66 ; M-1 a · D- 65; M-1 a R-64; M-1 a R-63 ; M-1 a C - 62 ; M-1 a P- 61; M-1 a R-60; M-1 a Q-59; M-1 a V-58 ; M-1 a F- 7; M-1 a T - 56 ; M-1 a G - 55 ; M-1 a P-54 ; M-1 a P- 3; M-1 a C - 52 ; M-1 a Q-51; M-1 a A- 50 ; M-1 a c- 9; M-1 a V-48; M-1 a L - 47 ; M-1 a R-46; M-1 a E- 45; M-l a G-44; M-l a T-43; M-l a E-42; M-l a A- 41; M-l a D-40; M-l a R-39; M-l a W-38; M-l a P- 37; M-l a Y-36; M-l a T-35; M-l a P-34; M-l a T - 33; M-l a E-32; M-l a A-31; M-l a V-30; M-l a G- 29; M-l a R-28; M-l a V-27; M-l a A-26; M-l a P- 25; M-l a V-24; M-l a P-23; M-l a L-22; M-l a L- 21; M-l a A-20; M-l a P-19; M-l a L-18; M-l a A- 17; M-l a L-16; M-l a V-15; M-l a L-14; M-l a C- 13; M-l a L-12; M-l a L-ll; M-l a S-10; M-l a L-9; G-8; M-l a P-7; y M-l a G-6 de la secuencia TNFR mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 2) . Los polipéptidos codificados por estos fragmentos de polinucleótidos también se cubren por la invención . En modalidades especificas, la invención suministra polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de la secuencia de aminoácidos y un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos M-l a A-271, M-l a Q-254 y/o M-l a F-221 de la SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos codificados por estos fragmentos de polinucleótidos también están cubiertos por la invención .
La invención también proporciona polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos eliminados de las terminaciones amino y carboxilo de un polipéptido TNFR, que se puede describir generalmente como que tienen los residuos n1-m1 de la figura 1 (SEQ ID NO: 2) , en donde n1 y m1 son enteros como se describió arriba. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de residuos 30-m3 de la figura 1 (esto es, SEQ ID NO: 2), en donde m3 es un entero desde 36 hasta 299, correspondiente a la posición del residuo de aminoácido de la figura 1 (SEQ ID NO: 2) . Por ejemplo, la invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos V-30 a V-299; V-30 P-298 ; V-30 a L-297 ; V-30 a F-296; V-30 a R-295; V-30 a E-294 ; V-30 a R-293; V-30 a V-292; V-30 a S-291; V-30 a R-290; V-30 a E-289; V-30 a L-88; V-30 a G-287; V-30 a P-286; V-30 a M-285 ; V-30 a R-284 ; V-30 a A-283; V-30 a V-282; V-30 a R-281; V-30 a L-280 ; V-30 a A- 279; V-30 a Q-278; V-30 a L-277; V-30 a L-276; V- 30 a R-275 ; V-30 a V-274 ; V-30 a L-273; V-30 a L- 272 ; V-30 a A-271; V-30 a G-270; V-30 a D-269; V- 30 a Q-268 ; V-30 a A-267 ; V-30 a G-266; V-30 a L- 265; V-30 a L-264 ; V-30 a E-263 ; V-30 a T-262 ; V- 30 a L-261; V-30 a R-260; V-30 a R-259; V-30 a R- 258 ; V-30 a L-257 ; V-30 a K-256; V-30 a L-255 ; V- 30 a Q-254 ; V-30 a L-253; V-30 a A-252; V-30 a A- 251; V-30 a R-250; V-30 a G-249 ; V-30 a A-248 ; V- 30 a R-247 ; V-30 a P-246; V-30 a T-245; V-30 a P-244; V-30 a G-243 V-30 a -242; V-30 a G-241; V-30 a E-240; V-30 a P-239; V-30 a A-238; V-30 a E-237; V-30 a L-236; V-30 a A-235 ; V-30 a Q-234 ; V-30 a L-233; V-30 a L-232; V-30 a R-231; V-30 a Q-230; V-30 a L-229 ; V-30 a R-228 ; V-30 a K-227; V-30 a 1-226; V-30 a S-225; V-30 a 1-224; V-30 a 'D-223; V-30 a Q-222 ; V-30 a F-221; V-30 a A-220; V-30 a V-219; V-30 a F-218; V-30 a D-217; V-30 a 1-216; V-30 a V-215; V-30 a A-214, V-30 a R-213; V-30 a E-212; V-30 a C-211; V-30 a E-210; V-30 a E-209; V-30 a A-208 ; V-30 a G-207 ; V-30 a P-206; V-30 a V-205 ; V-30 a 204 ; V-30 a T-203; V-30 a S-202; V-30 a L-201; V-30 a P-200 ; V-30 a F-199; V-30 a G-198; V-30 a T-197; V-30 a C-196; V-30 a S-195; V-30 a T-194; V-30 a C-193; V-30 a L-192; V-30 a T- 191; V·-30 a D--190; V·-30 a H-189; V--30 a S -188; V- 30 a S -187; V--30 a S -186; V--30 a G--185; V--30 a P- 184 ; V--30 a V--183; V--30 a ?· -182; V--30 a L--181; V- 30 a A -180; V--30 a L--179; V--30 a G--178; V--30 a L- 177 ; V--30 a A--176; V--30 a T--175; V--30 a c--174; V- 30 a N ¦ -173; V--30 a R--172; V--30 a H--171; V--30 a P- 170; V--30 a Q--169; V--30 a c--168 ; V--30 a Q--167; V- 30 a E--166; V--30 a S--165; V--30 a S--164; V--30 a S- 163; V--30 a s--162 ; V--30 a s--161; V--30 a A--160; V- 30 a s --159; V-¦30 a F--158; V--30 a T--157; V-¦30 a G- 156; V--30 a P-¦155; V--30 a P--154; V-•30 a C--153; V- 30 a P--152 ; V-•30 a Q--151; V--30 a c-¦150; V-¦30 a Q- 149; V-¦30 a T-¦148; V-¦30 a N --147; V-¦30 a Q-¦146; V- 30 a s--145; V-¦30 a . P--144; V-¦30 a T-¦143; V-¦30 a G- 142 ; V-¦30 a P-•141; V-•30 a A-¦1 0; V-¦30 a I-¦139; V- 30 a V--138; V- 30 a G--137; V-¦30 a A-¦136 : V- 30 a G- 135; V-¦30 a P-•134; V-¦30 a P--133; V- 30 a c-¦132; V- 30 a s-¦131; V- 30 a A-¦130; V- 30 a H- 129; V- 30 a E- 128; V-¦30 a L- 127 ; V- 30 a C-¦126; V- 30 a F-¦125; V- 30 a G-¦124; V- 30 a A-¦123; V- 30 a H- 122; V- 30 a A- 121; V- 30 a F- 120 ; V- 30 a F- 119; V- 30 a G- 118 ; V- 30 a T-¦117; V- 30 a R-¦116; V- 30 a c- 115; V- 30 a R- 114 ; V- 30 a C- 113 ; V- 30 a A- 112; V- 30 a R- 111; V- 30 a N- ¦ l l C- V- 30 a H- 109; V- 30 a T- 108 ; V- 30 a A- 107; V- SO a H- 106; V- 30 a c- 105 ; V- 30 a A- 104 ; V- 30 a R-103; V-30 a A- 102; V-30 a E-101; V-30 a E- 100; V-30 a E-99; V-30 a R-98; V-30 a E-97; V-30 a G-96; V-30 a C-95; V-30 a L-94; V-30 a V-93; V-30 a N-92; V-30 a C-91; V-30 a Y-90; V-30 a R-89; V- 30 a C-88; V-30 a R-87; V-30 a E-86; V-30 a L-85; V-30 a Y-84; V-30 a N-83; V-30 a W-82; V-30 a F- 81; V-30 a Q-80; V-30 a T-79; V-30 a Y-78; V-30 a H-77; V-30 a R-76; V-30 a P-75; V-30 a P-74; V-30 a C-73; V-30 a P-72; V-30 a G-71; V-30 a C-70; V-30 a T-69; V-30 a T-68, V-30 a P-67; V-30 a S-66; V-30 a D-65; V-30 a R-64; V-30 a R-63; V-30 a C-62; V-30 a P-61; V-30 a R-60; V-30 a Q-59; V-30 a V-58; V-30 a F-57; V-30 a T-56; V-30 a G-55; V-30 a P-54; V-30 a P-53; V-30 a C-52; V-30 a Q-51; V-30 a A- 50; V-30 a C-49; V-30 a V-48; V-30 a L-47; V-30 a R-46; V-30 a E-45; V-30 a G-44; V-30 a T-43; V-30 a E-42; V-30 a A-41; V-30 a D-40; V-30 a R-39; V-30 a W-38; V-30 a P-37; y V-30 a Y-36 de la secuencia TNFR mostrada en la figura (SEQ ID NO: 2) . Los polipéptidos codificados por estos fragmentos de polinucleótidos también están abarcados por la invención. En modalidades especificas, la invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos y un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos V-30 a A271, V-30 a Q254 y/o V-30 a F-221 de la SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos codificados por estos pol inucleót idos también están cubiertos por la invención. La presente solicitud también se dirige a polinucleót idos o polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos al menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% idéntica a una secuencia de polipéptidos o polipéptidos arriba descritos, respectivamente. La presente invención también cubre los polinucleótidos anteriores y secuencia de polipéptidos unidas a un polinucleótido heterólogo o secuencia de polipéptidos, respectivamente. Con respecto a los fragmentos de TNFR- 6ß , como se mencionaron arriba, aún si la eliminación de uno o más aminoácidos de la terminación N de una proteina resulta en la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la proteina, pueden retenerse todavía otras actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, la capacidad de multimerizar, la capacidad de enlazar el ligando (por ejemplo, ligando Fas y/o AIM-II)) . Por ejemplo, la capacidad de las muteinas recortadas TNFR para inducir y/o enlazar los anticuerpos que reconocen las formas maduras o completas de los polipépt idos , se retendrán generalmente cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo maduro se separen de la terminación N. Si un polipéptido particular carece de los residuos en la terminal N de un polipéptido completo, retiene tales actividades inmunológicas y se puede determinar fácilmente por métodos de rutina aquí descritos y conocidos de otra manera en el arte. No es improbable que una muteína TNFR con un gran número de residuos de aminoácidos eliminados en la terminal N, pueda retener algunas actividades biológoicas o inmunogéni ca s . De hecho, los péptidos compuestos por solamente seis residuos de aminoácidos TNFR, pueden a menudo provocar una respuesta inmune. De esta manera, la presente invención proporciona además polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, uno o más residuos eliminados de la terminación amino en la secuencia de aminoácidos TNFR-ßß mostrada en la figura 2 (esto es, SEQ ID NO: 4), hasta el residuo de glicina en la posición número 165 y los polinucleót idos que codifican tales pol ipépt idos . En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de los residuos n2-170 de la figura 2 (SEQ ID NO: 4), en donde n2 es un entero desde 2 hasta 165, correspondiendo a la posición del residuo de aminoácido en la figura 2 (SEQ ID NO: 4) . Más en particular, la invención proporciona po 1 i núcleot idos que codifican polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácido de un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos R-2 a P-170; A-3 a P-170; L-4 a P-170; E-5 a P-170; G-6 a P-170; P-7 a P-170; G-8 a P-170; L-9 a P-170; S-10 a P-170; L-ll a P-170; L-12 a P-170; C-13 a P-170; L-14 a P-170; V-15 a P-170; L-16 a P-170; A-17 a P-170; L-18 a P-170; P-19 a P-170; A-20 a P-170; L-21 a P-170; L-22 a P-170; P-23 a P-170; V-24 a P-170; P-25 a P-170; A-26 a P-170; V-27 a P-170; R-28 a P-170;G-29 a P-170; V-30 a P-170; A-31 a P-170; E-32 a P-170; T-33 a P-170; P-34 a P-170; T-35 a P-170; Y-36 a P-170; P-37 a P-170; -38 a P-170; R-39 a P-170; D-40 a P-170; A-41 a P-170; E-42 a P- -170; T- •43 a P - 170 ; G -44 a P- •170; E- 45 a P- 170; R- ¦46 a P- •170; L -47 a P -170; V- 48 a P- •170; c- 49 a P- -1 0; A- 50 a P - 170 ; Q -51 a P- ¦170; C- 52 a P- 170; P- ¦53 a P- 170; P -54 a P -170; G- 55 a P- ¦170; T- 56 a P- -170; F- 57 a P -170; V· -58 a P- 170; Q- 59 a P- 170 ; R- 60 a P- 170; P -61 a P -170; C- 62 a P- 170; R- 63 a P- •170; R- 64 a P -170; D' -65 a P- 170; s- 66 a P- 170; P- 67 a P- 170; -68 a P -170; T- 69 a P- 170; C- 70 a P- ¦170; G- 71 a P -170; P- -72 a P- 170; c- 73 a P- 170; P- 74 a P- 170; P- -75 a P -170; R- 76 a P- 170 ; H- 77 a P- ¦170; Y- 78 a P -170; T- -79 a P- 170 ; Q- 80 a P- 170; F- 81 a P- 170; W- -82 a P- -170; N- 83 a P- 170 ; Y- 84 a P- 170; L- 85 a P- -170; E- -86 a P- 170; R- 87 a P- 170; C- 88 a P- 170; R- -89 a P- -170; Y- 90 a P- 170; c- 91 a P- 170 ; N -92 a P-170 ; V-93 a P-170 L-94 a P-170; C-95 a P-17C i ; G-96 a P-170 ; E-97 a P-170; R-98 a P-170; 1 ?-99 a P-170; E-100 a P-170 ; E-101 a P-170; A-102 a P-170; R-103 a P-170; A-104 a P-170; C-105 a P-170; H-106 a P-170; A-107 a P-170; T-108 a P-170; H-109 a P-170; N-110 a P-170; R-lll a P-170; A-112 a P-170; C-113 a P-170; R-114 a P-170; C-115 a P-170; R-116 a P-170; T-117 a P-170; G-118 a P-170; F-119 a P-170; F-120 a P-170; A-121 a P-170; H-122 a P-170; A-123 a P-170; G-124 a P-170; F-125 a P-170; C-126 a P-170; L-127 a P-170; E-128 a P-170; H-129 a P-170; A-130 a P-170; S-131 a P-170; C-132 a P-170; P-133 a P-170; P-134 a P- 170; G-135 a P-170; A-136 a P-170; G-137 a P-170; V-138 a P-170; 1-139 a P-170; A-140 a P-170; P-141 a P-170; G-142 a P-170; E-143 a P-170; S-144 a P- 170; W-145 a P-170; A-146 a P-170; R-147 a P-170; G-148 a P-170;' G-149 a P-170; A-150 a P-170; P-151 a P-170; R-152 a P-170; S-153 a P-170; G-154 a P-170; G-155 a P-170; R-156 a P-170; R-157 a P-170; C-158 a P-170; G-159 a P-170; R-160 a P-170; G-161 a P-170; Q-162 a P-170; V-163 a P-170; A-164 a P- 170; y G-165 a P-170 de la secuencia TNFR-ßß mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 4) . Los polipéptidos codificados por estos fragmentos de polinucleótidos también están cubiertos por la invención . También como se mencionó arriba, aún si la eliminación de uno o más aminoácidos de la terminación C de la proteína, resulta en la modificación de pérdida de una o más funciones biológicas de la proteína, otras actividades funcionales (por e emplo, actividades biológicas, la capacidad de muí t imer i z a r , capacidad de enlace al ligando (por ejemplo, ligando Fas y/o AI -II) se puede todavía retener. Por ejemplo, la capacidad de la muteina recortada TNFR-ßß para inducir y/o enlazar los anticuerpos que reconocen las formas completas o maduras del polipéptido, generalmente se retendrá cuando menos de la mayoría de los residuos, si el polipéptido maduro o completo se separen de la terminación C. Si un polipéptido particular que carece de los residuos en la terminal C de un polipéptido completo retiene tales actividades inmunólogicas , se puede determinar fácilmente por métodos de rutina aquí descritos y conocidos de otra manera en el arte. No es improbable que una muteina TNFR-ßß con un gran número de residuos de aminoácidos eliminados en la terminal C pueda retener algunas actividades biológicas o inmunogénicas . De hecho, los péptidos compuestos por solamente seis residuos de aminoácido de TNFR-ßß pueden a menudo provocar una respuesta inmune. De esta manera, la presente invención proporciona además polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, uno o más residuos eliminados de la terminación carboxi de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TNFR-ßß mostrado en la figura 2 (SEQ ID NO: 4), hasta el residuo de glicina en la posición número 6, y los polinucleót idos que codifican tales polipépt idos . En particular, la presente invención proporciona polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-m2 de la figura 2 (esto es, SEQ ID NO: 2), en donde m2 es un entero desde 6 hasta 169, correspondiendo a la posición del residuo de aminoácido en la figura 2 (SEQ ID NO: 4) . Más en particular, la invención proporciona polinucleót idos que codifican polipéptidos que comprenden o consisten alternativamente de, la secuencia de aminoácidos y un miembro seleccionado del grupo que consiste de los residuos M-l a A169; M-l a L-168; M-l a S-167; M-l a P-166; M-l a G-165; M-l a A-164; M-l a V-163; M-l a Q-162; M-l a G-161; M-l a R-160; M-l a G-159; M-l a C-158; M-l a R-157; M-l a R-156; M-l a G-155; M-l a G-154; M-1 a S-153; M-l a R-152; M-l a P-151; M-l a A- 150; M-l a G-149; M-l a G-148; M-l a R-147; M-l a A-146; M-l a W-145; M-l a S-144; M-l a E-143; M-l a G-142; M-l a P-141; M-l a A-140; M-l a 1-139; M-l a V-138; M-l a G-137; M-l a A-136: M-l a G-135; M-1 a P-134; M-l a P-133; M-l a C-132; M-l a S-131; M-l a A-130; . M-l a H-129; M-l a E-128; M-l a L-127; M-l a C-126; M-l a F-125; M-l a G-124; M-l a A- 123; M-l a H-122; M-l a A- 121; M-l a F-120; M-l a F-119; M-l a G-118; M-l a T-117; M-l a R-116; M-1 a C-115; M-l a R-114; M-l a C-113; M-l a A-112; M-l a R-lll; M-l a N-110; M-l a H-109; M-l a T-108; M-l a A-107; M-l a H-106; M-l a C-105; M-l a A-104; M-l a R-103; M-l a A-102; M-l a E-101; M-l a E-100; M-l a E-99; M-l a R-98; M-l a E-97; M-l a G-96; M- 1 a C-95; M- 1 a L - 94 ; M-l a V -93; M- -1 a N- 92; M- •1 a C-91; M-l a Y- 90 ; M-l a R- •89; M- ¦1 a C- 88; M- ¦1 a R-87 ; M-l a E-86; M-l a L- ¦85; M- •1 a Y- 84 ; M- ¦1 a N - 83 ; M-l a W-82 ; M-l a F- ¦81; M- ¦1 a Q- 80; M- ¦1 a T-79; M-l a Y- 78 ; M-l a H- •77 ; M- ¦1 a R- 76; M- ¦1 a P-75; M-l a P-74 ; M-l a C- •73; M- ¦1 a P- 72 ; M- ¦1 a G-71; M-l a C-70 ; M-l a T- 69; M- •1 a T- 68 , . M- 1 a P-67 ; M-l a S - 66 ; M-l a D- 65 ; M- 1 a R- 64 ; M- 1 a R-63 ; M-l a C-62 ; M-l a P- 61; M- 1 a R- 60 ; M- 1 a Q-59; M-l a V-58 ; M-l a F- 57 ; M- 1 a T- 56; M- 1 a G - 55 ; M-l a P-54 ; M-l a P- 53; M- 1 a C- 52; M- 1 a Q-51; M-l a A- 50 ; M-l a C- 49; M- 1 a V- 48 ; M- 1 a L - 47 ; M-l a R-46; M-l a E- 45; M- 1 a G- 44 ; M- 1 a T-43; M-l a E-42 ; M-l a A- 41; M- 1 a D- 40; M- 1 a R-39; M-l a W-38 ; M-l a P- 37 ; M- 1 a Y- 36; M- 1 a T - 35 ; M-l a P-34 ; M-l a T- 33 ; M- 1 a E- 32; M- 1 a A- 31 ; M-l a V-30 ; M-l a G- 29; M- 1 a R- 8 ; M- 1 a V-27 ; M-l a A- 26 ; M-l a P- 25; M- 1 a V- 24; M-l a P-23; -l a L-22; M-l a L-21; M-l a A- 20; M-l a P-19; M-l a L-18; M-l a A-17; M-l a L- 16; M-l a V-15; M-l a L-14; M-l a C-13; M-l a L- 12; M-l a L-ll; M-l a S-10; M-l a L-9; G-8; M-l a P-7; y M-l a G-6 de la secuencia del TNFR-ßß mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 4) . Los polipéptidos codificados por estos fragmentos de polinucleót idos también están abarcados por la invención . La invención también suministra polipéptidos que comprenden, o consisten alternativamente de uno o más aminoácidos eliminados de las terminaciones amino o carboxilo de un polipéptido TNFR- 6ß , que se puede describir generalmente como que tienen residuos n2-m2 de la figura 2 (esto es, SEQ ID NO: 4), donde n2 y m2 son enteros como se describe arriba. La presente solicitud también se dirige a moléculas de ácido nucleico que comprenden, o consisten alternativamente de, una secuencia de polinucleót ido al menos 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de polinucleót idos que codifica un polipéptido TNFR establecido aquí como m-y, n-z, n1-m1, 30-m3, y/o n2-m2. En modalidades preferidas, la solicitud se dirige a moléculas de ácido nucleico que comprenden, o consisten alternativamente de, una secuencia de polinucleót idos al menos 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las eliminaciones especificas en la terminal N y C aquí mencionada. La presente invención también abarca las secuencias anteriores de polinucleótidos unidas a una secuencia heteróloga de polinucleótidos. Los polipéptidos codificados por estos ácidos nucleicos y/o secuencia de polinucleót ido también se abarcan por la invención . También se incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que consiste de una porción de una secuencia completa de aminoácidos TNFR codificada por un clon de cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 ó 97809, en donde esta porción excluye desde 1 hasta alrededor de 49 aminoácidos de la terminación amino de la secuencia completa de aminoácidos codificada por el clon de cADN contenida en el depósito ATCC No. 97810 y 97809, respectivamente, o desde 1 hasta alrededor de 107 ó 58 aminoácidos de la terminación carboxi de la secuencia completa de aminoácidos codificada por el clon cADN contenido en el depósito ATCC No.97810 y 97809, respectivamente, o cualquier combinación de las eliminaciones anteriores de la terminal amino y terminal carboxi, o la secuencia completa de aminoácidos codificada por el clon cADN contenido en el depósito ATCC No. 97810 ó 97809. Los polipéptidos codificados por todos los polinucleót idos anteriores también están abarcados por la invención. Además de las formas terminales de eliminación de la proteina arriba discutida, también se reconocerán por alguien con habilidad ordinaria en el arte, que algunas secuencias de aminoácidos de los polipéptidos TNFR se pueden variar sin un efecto significativo sobre la estructura o función de las proteínas. Si tales diferencias en la secuencia se contemplan, se debe recordar que hay áreas críticas en la proteína que determinan la actividad. Así, la invención además incluye variaciones de los polipéptidos de TNFR que muestran una actividad funcional substancial del polipéptido TNFR (por ejemplo, actividad inmunogénica , actividad biológica), o que incluyen regiones de la proteina TNFR tales como las porciones de proteina abajo discutidas. Tales mutantes incluyen eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y substituciones de tipo, seleccionadas según las reglas generales conocidas en el arte, de manera que tengan un poco efecto en la actividad. Por ejemplo, la guia sobre como hacer las substituciones de aminoácidos fenotipicamete silentes, se suministra en Bowie, J. U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Subst itut ions , " Science 247:1306-1310(1990), en donde los autores indican que existen dos enfoques principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio. El primer método se soporta en el proceso de evolución en el cual las mutaciones se aceptan o rechazan por selección natural. El segundo enfoque usa la ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado y selecciones o separaciones por exclusión para identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Como lo establecen los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las substituciones de aminoácido. Los autores indican además cuales cambios de aminoácidos son probables de permitirse en una cierta posición de la proteina. Por ejemplo, la mayoría de los residuos ocultos de aminoácidos requieren cadenas laterales no polares con las que se conservan generalmente unas cuantas características de las cadenas laterales de superficie. Otras de tales substituciones genot ípicamente silentes, se describen en Bowie, J. U. et al., supra, y las referencias allí citadas. Típicamente se ven como substituciones conservadoras los reemplazos, uno del otro, entre aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e lie; el intercambio de residuos hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, la substitución entre los residuos amida Asn y Gln, el intercambio en los residuos básicos Lys y Arg y los reemplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr. Así, el fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 4 ó 6, o aquel codificado por un cADN depositado, puede ser (i) uno en el cual uno o más de los residuos aminoácido se substituyan con un residuo aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo conservado de aminoácido) y tal residuo substituido de aminoácido puede o no codificarse por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácido incluyan un grupo subst ituyente , o (iii) uno en el cual el polipéptido extracelular maduro o soluble se funda con otro compuesto, tal como el compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, el poliet ilenglicol ) , o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales (tal como por ejemplo, una fusión de péptido Fe de IgG y/o un péptido de reacción constante de cadena ligera de inmunoglobulina ) , una secuencia líder o segregadora, o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido TNFR) se funden al polipéptido TNFR aquí descrito. Tales fragmentos derivados y análogos merecen estar dentro del alcance de alguien habilitado en el arte a partir de las enseñanzas de aquí. Así, el TNFR de la presente invención puede incluir una o más substituciones, eliminaciones o adiciones, de aminoácidos ya sea de mutaciones naturales o manipulación humana. Como se indica, los cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, tal como substituciones conservadoras de aminoácidos, que no afectan significativamente el repliegue o actividad de la proteína (ver tabla III) . TABLA III. Substituciones conservadoras de Aromático Fenilalanina Triptofano Tirosina Hidrof óbico Leucina I soleucina Valina Polar G 1 ut ami na Asparagina Básico Arginina Lisina Histidina Ácido Ácido aspártico Ácido glutámico Pequeño Alanina Serina Treonina Metionina glicina Los aminoácidos en las proteínas TNFR de la presente invención que son esenciales para la función, se pueden identificar por métodos conocidos en el arte, tal como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081- 1085(1989)) . El último procedimiento introduce mutaciones simples de alanina en cada residuo en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se prueban después por actividad funcional tal como por ejemplo, enlace receptor / 1 igando (por ejemplo, ligando Fas y/o AIM-II) o actividad proliferativa in vitro o in vivo. De especial interés son las substituciones de aminoácidos cargados con otros aminoácidos neutrales o cargados, que pueden producir proteínas con características deseables altamente mejoradas tales como una agregación menor. La agregación no solamente puede reducir la actividad sino también ser problemática cuando se preparan formulaciones farmacéuticas, ya que los agregados pueden ser inmunogénicos (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340(1967) ; Robbins et al., Diabetes 35:838-8 5(1987); Cleland et al., Cri t .
Rev . Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307- 377 (1993) . El reemplazo de aminoácidos también puede cambiar la selectividad del enlace de un ligando a receptores de superficie de célula. Por ejemplo, Ostade et al., Nature 352:266-268(1993) describe ciertas mutaciones que resultan en el enlace selectivo de un TNF-cc a solamente uno de los dos tipos conocidos de receptores TNF. Los sitios que son críticos para el enlace receptor ligando se pueden también determinar por análisis estructural tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o etiquetado de fotoafinidad (Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos et al. Science 255:306-312 (1992)) . Ya que el TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta son miembros de la familia de proteínas relacionadas con el receptor TNF, para modular más que para eliminar completamente las actividades biológicas del TNFR, se hacen preferiblemente mutaciones en secuencias que codifican aminoácidos en el dominio extracelular conservado de TNFR, más preferiblemente un residuo dentro de esta región que no se conservan entre los miembros de la familia del receptor de TNF. También forman parte de la presente invención, polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican los mutantes de TNFR anteriores. Los polipéptidos de la presente invención, se suministran preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente se purifican de forma substancial. Una versión producida de forma recombinante de los polipéptidos de TNFR, se puede purificar substancialmente por un método de una etapa descrita en Smith and Johnson, Gene 67:31-40(1988) . Los polipéptidos de la invención también se pueden purificar de fuentes naturales o recombinantes usando anticuerpos anti-TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta de la invención, en métodos que son bien conocidos en el arte de la purificación de proteínas . La invención además proporciona polipéptidos aislados de TNFR que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TNFR de longitud completa que tiene la secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 ó 4 o como se codifica por el clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No. 97810 ó 97809; (b) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido maduro de TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 31-300 en la SEQ ID NO: 2, ó 31-170 en la SEQ ID NO: 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No. 97810 ó 97809; o (c) la secuencia de aminoácidos de un dominio soluble extracelular de un polipéptido TNFR que tiene la secuencia de aminoácidos en las posiciones 31 a 283 en la SEQ ID NO: 2, ó 31 a 166 en la SEQ ID NO: 4, o como se codifica por el clon de cADN contenido en el plásmido depositado como depósito ATCC No. 97810 ó 97809. Los polipéptidos adicionales de la presente invención, incluyen polipéptidos que tienen al menos 90% de similitud más preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 92%, ó 95% de similitud, y todavía más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, ó 99%, de similitud, con aquellos arriba descritos. Los polipéptidos de la invención también comprenden aquellos que son al menos 80% idénticos, más preferiblemente al menos 85%, 90% 92%, ó 95% idénticos, todavía más preferiblemente al menos 96%, 97%, 98%, ó 99%, idénticos al polipéptido codificado por el cADN depositado (deposito ATCC No. 97810 ó 97809) o al polipéptido de la SEQ ID NO: 2 ó 4, y también incluye porciones de tales polipéptidos con al menos 30 aminoácidos o más preferiblemente al menos 50 aminoácidos . Por "% de similitud" para dos polipéptidos, se pretende un registro de similitud producido al comparar la secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos, usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI53711) y los parámetros por eliminación para determinar la similitud. El Bestfit usa el algoritmo de homología local Smith and Waterman (Advances in Applied Mathgematics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos y al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de referencia de aminoácidos de un polipéptido TNFR, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto de que la secuencia de polipéptido puede incluir hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia del polipéptido TNFR. En otras palabras, para obtener el polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, ó 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta un 5% de los residuos de aminoácido en la secuencia de referencia se pueden eliminar o substituir con otro aminoácido, o un número de aminoácidos hasta el 5% de los residuos totales de aminoácido en la secuencia de referencia, se pueden insertar dentro de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia, pueden suceder en las posiciones amino o carboxi de la secuencia de referencia de aminoácido o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, esparcidas ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como un asunto práctico, si cualquier polipéptido particular es al menos 80%, 85%, 90% 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntico a por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 ó 4, o a una secuencia de aminoácidos codificada por el cADN contenido en los depósitos que tienen el depósito ATCC No. 97810 ó 97809, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, la secuencia de cualquiera de los polipéptidos que corresponden a las eliminaciones de la terminal N o C de TNFR como se describe aquí, (por ejemplo, el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos 30 a 300 de la SEQ ID NO: 2)) se puede determinar convencionalmente usando programas de cómputo conocidos tales como el programa Bestfit ( ( isconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI53711) . Cuando se usa el Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar que si una secuencia en particular es por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia según la presente invención, se establecen los parámetros por supuesto, de manera que el porcentaje de identidad de calcule sobre la longitud completa de la secuencia de referencia de aminoácidos y que los espacios en la homología de hasta el 5% del número tal de residuos de aminoácido en la secuencia de referencia se permitan.
En una modalidad específica, la identidad entre una secuencia de referencia (de interrogación) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objeto, también referida como alineación de secuencia global, se determinan usando el programa de cómputo FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App . Biosci. 6:231-245 (1990)) . Los parámetros preferidos usados en la alineación de aminoácidos por FASTDB son: Matriz=AM 0, k-tuplo=2, penalización por Mal apareamiento=l , penalización por unión=20, longitud del grupo aleatorio=0, registro de corte=l, tamaño de la ventana=longitud de la secuencia, penalización por espacio=5, penalización por tamaño del espacio=0.05 , tamaño de la ventana= 500 o la longitud de la secuencia objeto de aminoácidos, la que sea más corta. Según esta modalidad, si la secuencia objeto es más corta que la secuencia de interrogación debido a eliminaciones en la terminal N o C, no debido a eliminaciones internas, se hace una corrección manual a los resultados para tomar en cuenta el hecho de que el programa FASTDB no cuenta para las truncaciones en la terminal C y N, de la secuencia objeto cuando se calcula el porcentaje global de identidad. Para secuencias objeto truncadas en las terminaciones N y C, relativas a la secuencia de interrogación, se corrige el porcentaje de identidad al calcular el número de residuos de la secuencia de interrogación que tienen terminal N y C de la secuencia objeto, que no están apa reado s / a 1 ineado s con un residuo objeto correspondiente, como un porcentaje de la base total de la secuencia de interrogación. Una determinación sobre si un residuo está apareado /a 1 i neado , se determina por los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. Este porcentaje se resta después del porcentaje de identidad, calculado por el programa anterior FASTDB usando los parámetros especificados para ayudar a un registro final de porcentaje de identidad. Este registro final de porcentaje de identidad es el que se usa para los propósitos de esta modalidad. Solamente los residuos a las terminaciones N y C de la secuencia objeto, que no están apareados /alineados con la secuencia de interrogación, se consideran para los propósitos de ajuste manual del registro de porcentaje de identidad. Esto es, solamente las posiciones de residuos de interrogación fuera de los residuos de terminal C y N más alejados de la secuencia objeto. Por ejemplo, una secuencia objeto de residuos de 90 aminoácidos se alinea con una secuencia de interrogación de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La eliminación ocurre en la terminación N de la secuencia objeto y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de los primeros 10 residuos en la terminación N. Los 10 residuos no apareados representan 10% de la secuencia (números de residuos en las terminaciones N y C no apareados/número total de residuos en la secuencia de interrogación) de manera que se resta el 10% del registro de porcentaje de identidad calculado por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes estuvieran perfectamente acoplados, su porcentaje final de identidad seria del 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 residuos se compara con una secuencia de interrogación de 100 residuos. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas de manera que no hay residuos en las terminaciones N o C de la secuencia objeto que no estén acopladas/alineadas con la interrogación. En este caso, el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez nuevamente, solamente las posiciones de residuos fuera de los extremos de las terminales N y C de la secuencia objeto, se despliegan en la alineación FASTDB los cuales no están acoplados/alineados con la secuencia de interrogación y se corrigen manualmente. No se hacen otras correcciones manuales para los propósitos de esta modalidad. El polipéptido de la presente invención tiene usos que incluyen pero no se limitan a marcadores de peso molecular en geles SDS-PAGE, en columnas de filtración de gel de malla molecular usando métodos bien conocidos por aquellos hábiles en el arte. Como se describe en detalle abajo, los polipéptidos de la presente invención también se pueden usar para elevar los anticuerpos policlonales y monoclonales , que son útiles en ensayos para detectar la expresión de proteínas TNFR como se describe abajo o como agonistas y antagonistas capaces de enriquecer o inhibir la función de proteínas TNFR. Además, tales polipéptidos se pueden usar en el sistema de dos híbridos de levadura para capturar las proteínas de enlace de proteína TNFR que son también agonistas y antagonistas candidatos según la presente invención. El sistema de levaduras de dos híbridos se describe en Fields and Song, Nature 340: 245-246 (1989) . Transgénicos Las proteínas' de la invención se pueden también expresar en animales transgénicos . Animales de cualquier especie incluyendo pero no limitándose a, ratones, ratas, conejos, hámsters, conejillos de Indias, cerdos, micro-cerdos, cabras, ovejas, vacas, y primates no humanos por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés se pueden usar para generar animales transgénicos. En una modalidad específica, las técnicas aquí descritas o de otra manera conocidas en el arte se usan para expresar polipéptidos de la invención en humanos, como parte de un protocolo de terapia de genes. Cualquier técnica conocida en el arte se puede usar para producir el transgen (esto es, po 1 inuc 1 eót ido s de la invención) dentro de animales para producir las, líneas de origen de animales transgénicos. Tales técnicas incluyen pero no se limitan a la microinyección pronuclear (Paterson et al., Appl. Microbiol. Biotechnol . 40:691-698(1994) ; Carver et al., Biochnology (NY) 22:1263-1270(1993); Wright et al., Biotechnology ( NY ) 9:830-834 ( 1991); y Hoppe et al., U.S. Pat . No. 4,873,191 (1989)) ; transferencia de genes mediada por un retrovirus dentro de lineas germen (Van der Pitten et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 82:6148-6152 (1985)), blastocitos o embriones; dirección de genes en células madre embriónicas (Thompson et al., Cell 56:313-321 (1989) ; electroforacion de células o embriones (Lo, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983)); introducción de polinucleót idos de la invención usando un disparador de genes (ver, por ejemplo, Ulmer et al., Science 259: 1745(1993); introducción de constructos de ácido nucleico en células madre pleuripot entes embriónicas y transferencia de células madre de vuelta al blastocisto; y t rnasferencia de genes mediada por espermas (Lavitrato et al., Cell 57:717-723 (1989)); etc. Para una revisión de dichas técnicas, ver Gordon, "Transgenic Animáis", Intl. Rev . Cytol. 115:171-229 (1989), que se incorpora aquí como referecia en su totalidad. Ver también la patente U.S. No. 5,464,764 (Capecchi, et al., Posit ive-Negat ive Selection Methods and Vectors); patente U.S. No. 5, 631,153 (Capecchi, et al., Cells and Non- Human Organisms Containing Prede t ermined Genomic Modifications and Positive-Negative Selection Methods and Vectors for Making Same); patente U.S. No.4, 736, 866 (Leder, et al., Transgenic Non-Human Animáis); y patente U.S. No.4,873,191 (Wagner, et al., Genetic Transíormat ion oí Zygotes); cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Además, los contenidos de cada uno de los documentos mencionados en este párrafo se incorporan aqui como referencia en su totalidad. Cualquier técnica conocida en el arte se puede usar para producir clones transgénicos que contienen a los polinucleót idos de la invención, por ejemplo, transferencia nuclear en oocitos en nucleados de los núcleos de células adultas embriónicas o fetales cultivadas que inducen a la quiescencia (Campell et al., Nature 380:64-66 (1996) ; Wilmut et al., Nature 382:810-813 (1997)), cada una de las cuales se incorpora aqui como referencia en su totalidad. La presente invención proporciona los animales transgénicos que llevan el transgen en todas sus células, asi como animales que llevan el transgen en algunas pero no todas sus células por ejemplo, animales de mosaico o animales quiméricos. El transgen se puede integrar como un transgen simple o como copias múltiples tales como concatámeros , por ejemplo, tándems cabeza a cabeza o tándems cabeza a cola. El transgen se puede también introducir selectivamente y activarse de un tipo particular de células siguiendo por ejemplo la enseñanza del Lasko et al. (Lasko et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6232-6236 (1992)) . Las secuencias regulatorias requeridas para tal activación especifica del tipo de célula, dependerán del tipo particular de célula de interés y serán aparentes para aquellos hábiles en el arte. Cuando se desea que ese transgen polinuceótido se integre dentro del sitio cromosomal del gen endógeno, se prefiere la dirección de genes. Brevemente, cuando se utiliza tal técnica, los vectores que contienen algunas secuencias de nucleótidos homologas al gen endógeno, se designan para el propósito de integrarse dentro por medio de la recombinación de homólogos con las secuencias crorno s orna 1 e s , y romper la función de la secuencia de nucleótido del gen endógeno. El transgen se puede introducir selectivamente dentro de un tipo particular de célula, inactivando así el gen endógeno en solamente ese tipo de célula al seguir por ejemplo en la enseñanza de Gu et al. (Science 265:103-106(199 )) . Las secuencias regulatorias requeridas para tal inactivación específica del tipo de células, dependerán del tipo particular de célula de interés y serán aparentes para aquellos con habilidad en la arte. Los contenidos de cada uno de los documentos mencionados en este párrafo, se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Una vez que se han generado los animales t ransgénicos , se puede ensayar la expresión del gen recombinante utilizando técnicas estándar. La separación inicial por exclusión se puede llevar a cabo por análisis de manchado Southern o técnicas PCR para analizar tejidos animales para verificar que ha tomado lugar la integración del transgen. El nivel de expresión del mARN del transgen en los tejidos de los animales t ransgénicos , se puede también evaluar usando técnicas que incluyen pero no se limitan a, análisis de manchado Northern de las muestras de tejido sostenidas del animal, análisis de hibridación in situ, y PCR-transcriptasa inversa (rt-PCR) . Las muestras de los tejidos que expresan el gen transgénico, se pueden también evaluar de forma citoquímica inmune o histoquimica inmune usando anticuerpos específicos para el producto del transgen. Una vez que se producen los animales de origen, se pueden reproducir, criar por consanguinidad, criar por cruce de razas o como híbridos para producir colonias del animal particular. Ejemplos de tales estrategias de cruza incluyen pero no se limitan a, cría por cruce de razas de animales de origen con más de un sitio de integración con objeto de establecer líneas separadas; cría por consanguinidad de líneas separadas con objeto de producir compuestos transgénicos que expresan el transgen a niveles superiores debido a los efectos de la expresión aditiva de cada transgen; cruza de animales transgénicos heterocigóticos para producir animales homocigót icos para un sitio de integración dado con objeto de aumentar la expresión y eliminar la necesidad de separación por exclusión de animales para el análisis ADN; cruce de líneas separadas homocigót icas para producir líneas de compuestos heterocigóticos u homocigóticos ; y reproducción para colocar el transgen en un marco de referencia distinto que sea apropiado para el modelo experimental de interés . Los animales transgénicos y "agénicos o no t ransgénicos " de la invención tienen usos que incluyen pero no se limitan a, sistemas de modelos animales útiles en la elaboración de la función biológica de los polipéptidos TNFR, condiciones de estudio y/o trastornos asociados con la expresión aberrante del TNFR, y en la separación por exclusión para compuestos efectivos en la disminución de _ condiciones y/o trastornos tales. En modalidades adicionales de la invención, las células que se preparan por ingeniería genética para expresar las proteínas de la invención, o al ernativamente, que son preparadas por ingeniería genética para no expresar las proteínas de la invención (por ejemplo no transgénico) se administran a un paciente in vivo. Tales células se pueden obtener del paciente (esto es animal, incluyendo humano) o un donador compatible MHC y pueden incluir pero no limitarse a, fibroblastos, células de la médula espinal, células de sangre (por ejemplo linfocitos), adipocitos, células musculares, células endot e 1 i a 1 e s , etc. Las células se preparan por ingeniería genética dn v tro usando técnicas recombinantes de ADN para introducir la secuencia de codificación de los polipéptidos de la invención dentro de las células, o alternativamente, para romper la secuencia de codificación y/o la secuencia endógena regulatoria asociada con los polipéptidos de la invención, por ejemplo, por transducción (usando vectores vírales y preferiblemente vectores que integran al transgen dentro del genoma de célula) o procedimientos de transfección, incluyendo pero no limitándose al uso de plásmidos, cósmidos, YACs, ADN desnudo, e 1 ect roporac i ón , liposomas, etc. La secuencia de codificación de los polipéptidos de la invención se puede colocar bajo el control de un promotor inductor o fuerte constitutivo o un promotor /enriquecedor para alcanzar la expresión y preferiblemente secreción de los polipéptidos de la invención. Las células preparadas por ingeniería que expresan y segregan preferiblemente los polipéptidos de la invención, se pueden introducir dentro del paciente sistemáticamente, por ejemplo en la circulación o intraperitonalmente . Alternativamente, las células se pueden incorporar dentro de una matriz e implantarse en el cuerpo, por ejemplo, se pueden implantar los fibroblastos preparados por ingeniería genética como parte de un injerto en la piel; las células endoteliales preparadas por ingeniería genética se pueden implantar como parte de un injerto vascular o linfático (ver por ejemplo, Anderson et al. patente US No .5 , 399 , 349 ; y Mulligan & Wilson, patente US No .5 , 60 , 959 , cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Cuando las células a ser administradas son células compatibles no autólogas o no MHC, se pueden administrar usando técnicas bien conocidas que evitan el desarrollo de una respuesta inmune al huésped contra las células introducidas. Por ejemplo, las células se pueden introducir en forma encapsulada a la cual, mientras permite el intercambio de componentes con el medio extracelular inmediato, no permite que las células introducidas sean reconocidas por el sistema inmune del huésped. Anticuerpos . La presente invención se refiere, además, a anticuerpos y receptores de antígeno de célula T (TCR) que se enlazan inmunoe specí f i cament e a un polipéptido , preferiblemente un epitope, de la presente invención (como se determina por un inmunoensayo bien conocido en el arte para evaluar el enlace anticuerpo-antigeno especifico) . Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales , monoclonales , multiespecificos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una colección de expresión Fab, anticuerpos anti-idiotipicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id hasta anticuerpos de la invención) , y fragmentos que enlazan el epitope de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo", como se usa aquí, se refiere a moléculas de inmunoglobul ina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina , esto es, moléculas que contienen un sitio de enlace antigeno que se enlaza inmunoespeci ficamente al antigeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
Más preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo que enlazan el antigeno de la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, Fvs enlazados al bisulfuro (sdFv) y fragmentos que comprende tanto un dominio VL como VH . Los fragmentos de anticuerpo que enlazan el antigeno, incluyendo anticuerpos de cadena simple, pueden comprender la o las regiones variables solas o en combinación con la totalidad o una porción de lo siguiente: región de articulación, dominios CH1, CH2, y CH3. También están incluidos en la invención los fragmentos que enlazan el antigeno, que comprenden de la misma manera, cualquier combinación de región o regiones variables con una región de articulación, dominios CH1, CH2, y CH3. Los anticuerpos de la invención pueden formarse a partir de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, murinos, asno, de una variedad de conejo (ship rabbit), cabra, conejillo de indias, camello, caballo, o pollo. Como se usa aquí, anticuerpos "humanos" incluyen los anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de las colecciones de inmunoglobulina humanas o de animales transgénicos para una o más ihmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, como se describe en la parte de abajo y, por ejemplo en, la Patente U.S. No. 5,939,598 por Kucherlapati y colaboradores. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecif icos , biespecif icos , triespecif icos o · de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecificos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido de la presente invención, o pueden ser específicos para ambos polipéptidos de la presente invención así cerno para un epítope heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Ver, por ejemplo, publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, y colaboradores, J. Immunol. 147:50-69 (1991); Patentes U.S. Nos. 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny y colaboradores, J. Immunol. 148:1547-1553 (1992 ) . Los anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse en términos de epítope o epitopes o porción o porciones de un polipéptido de la presente invención que se reconoce o se enlaza específicamente. El o los epitopes o la o las porciones de polipéptido pueden especificarse como se describe en la presente, por ejemplo, por .las posiciones N terminal y C terminal, por tamaño en residuos de aminoácido contiguos, o listarse en las Tablas y Figuras. Los anticuerpos que enlazan específicamente cualquier epítope o polipéptido de la presente invención, pueden también excluirse. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que enlazan específicamente polipéptidos de la presente invención, y permite la exclusión del mismo. Los anticuerpos de la presente invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Se incluyen anticuerpos que no enlazan cualquier otro análogo, ortólogo, u homólogo de un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos que enlazan polipéptidos con al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75%, al menos el 70%, al menos el 65%, al menos el 60%, al menos el 55%, y al menos el 50% de identidad (como se calcula usando métodos conocidos en el arte y descritos en la presente) con un polipéptido de la presente invención, también se incluyen en la presente invención. Los anticuerpos que no enlazan polipéptidos con menos del 95%, menos del 90%, menos del 85%, menos del 80%, menos del 75%, menos del 70%, menos del 65%, menos del 60%, menos del 55%, y menos del 50% de identidad (como se calcula usando métodos conocidos en el arte y descritos en la presente) con un polipéptido de la presente invención, también se incluyen en la presente invención. Además, se incluyen en la presente invención anticuerpos que enlazan polipéptidos codificados por poi inuc 1 eót idos que hibridizan un polinucleót i do de la presente invención bajo condiciones de hibridi zación estrictas (como se describe en la presente) . Los anticuerpos de la presente invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de enlace a un polipéptido de la invención. Las afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd menos que 5X10~¿M, 10"2M, 5X10"3M, 10"3M, 5X10~4M, 10"4M, 5X10"5M, 10"5M, 5X10~6M, 10~6M, 5X10~7M, 10"7M, 5X10"8M, 10"8M, 5X10" 9M, 10"9M, 5X10_10M, 10_10M, 5X10_11M, 10_11 , 5X10" 12M, 10"12M, 5X10"13M, 10~13M, 5X10'1 M, 10_14M, 5X10" 15M, y 10"15M. La invención también proporciona anticuerpos que inhiben completamente el enlace de un anticuerpo a un epitope de la invención como se determina por cualquier método conocido en el arte para determinar el enlace competitivo, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en la presente. En modalidades preferidas, el anticuerpo inhibe competitivamente el enlace al epitope por al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, o al menos el 50%, . Los anticuerpos de la presente invención pueden actuar como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que rompen las interacciones recept or / 1 igando con los polipéptidos de la invención ya sea parcialmente o completamente. La invención presenta tanto anticuerpos específicos para receptor, como anticuerpos específicos para ligando. La invención también presenta anticuerpos específicos para receptor que no evitan el enlace del ligando, pero evitan la activación del receptor. La activación del receptor (esto es, señalización) , puede determinarse por técnicas descritas en la presente o de lo contrario conocidas en el arte. Por ejemplo, la activación del receptor puede determinarse detectando la fosforilación (por ejemplo, tirosina o serina/treonina) del receptor o sus sustratos por la inmunoprecipi tación seguida por el análisis de manchado Western (por ejemplo, como se describe en la parte superior) . En modalidades especificas, se proporcionan los anticuerpos para inhibir la actividad del ligando o receptor por al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, o al menos el 50% de la actividad en ausencia del anticuerpo. La invención también presenta anticuerpos específicos para el receptor que tanto evitan el enlace del ligando como la activación del receptor, así como anticuerpos que reconocen el complejo re cept o r- 1 i gando , y, preferiblemente, no reconocen específicamente el receptor no enlazado o el ligando no enlazado. Del mismo modo, se incluyen en la invención los anticuerpos neutralizantes que enlazan el ligando y evitan el enlace del ligando al receptor, así como anticuerpos que enlazan el ligando, por lo cual se evita la activación del receptor, pero no evitan el ligando del enlace al receptor. Además, en la invención se incluyen anticuerpos que activan el receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas, esto es, potencian o activan ya sea todas o un sub-conjunto de las actividades biológicas de la activación del receptor mediada por el ligando. Los anticuerpos pueden ser específicos como agonistas, antagonistas o agonistas inversos para actividades biológicas que comprenden las actividades biológicas especificas de los péptidos de la invención descritos en la presente. Los agonistas de anticuerpo de arriba puede hacerse usando métodos conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, publicación PCT WO 96/40281; Patente U.S. No. 5,811,097; Deng y colaboradores, Blood 92 ( 6) : 1981-1988 (1988); Chen, y colaboradores, Cáncer Res. 58 ( 16 ) : 3668 - 3678 (1998); Harrop y colaboradores, J. Immunol. 161 ( ) : 1786-1794 (1998); Zhu y colaboradores, Cáncer Res. 58 ( 15 ) : 3209-3214 (1998); Yoon, y colaboradores, J. Immunol. 160 ( / ) : 3170 - 3179 (1998); Prat y colaboradores, J. Cell. Sci. 111 (Pt2) .237-247 (1998); Pitard y colaboradores, J. Immunol. Met ods 205 (2 ) : 177-190 (1997); Liautard y colaboradores, Cytokine 9(4) :233-241 (1997); Carlson y colaboradores, J. Biol. C em. 272 ( 17 ) : 112 5-11301 (1997); Taryman y colaboradores, Neuron 14 ( ) : 55-762 (1995); Muller y colaboradores, Structure 6 ( 9 ) : 1153 - 1167 (1998); Bartunek y colaboradores, Cytokine 8(l) :14-20 (1996) (que se incorporan todas para referencia en la presente completamente) . Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse, por ejemplo, pero no limitándose a, para purificar, detectar, y señalar los polipéptidos de la presente invención, incluyen tanto diagnóstico y métodos terapéuticos in vitro e in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para medir cualitativamente y cuantitativamente los niveles de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas. Ver, por ejemplo, Harlow y colaboradores, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. 1988) (incorporada para referencia en la presente complement amenté ) . Como se discute en más detalle a continuación, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse ya sea solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos pueden, además, fundirse recombinantemente a un polipéptido heterólogo en el término N ó C o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden fundirse recombinantemente o conjugarse a moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, medicamentos,. o toxinas. Ver, por ejemplo, publicaciones PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente U.S. No. 5,314,995; y EP 396,387. Los anticuerpos de la invención incluyen derivados que se modifican, esto es, por el enlace covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de tal manera que el enlace covalente no previene al anticuerpo de generar una respuesta anti-idiotipica . Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que se modifican, por ejemplo, por g 1 i eos i 1 a c ión , acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivación por grupos protectores /de bloqueo conocidos, partición proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteina, etc. Muchas de las diversas modificaciones químicas pueden llevarse a cabo por técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitando a partición química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de t unicamicina , etc. Adicionalmente , el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. Los anticuerpos de la presente invención pueden generarse por cualquier · método apropiado conocido en el arte. Los anticuerpos policlonales de un antígeno de interés pueden producirse por varios procedimientos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un polipéptido de la invención puede administrarse a varios animales huéspedes incluyendo, pero no limitándose a, conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción del suero que contiene los anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. Pueden usarse diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica , dependiendo de las especies huésped, e incluyen, pero no se limitan a, Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, substancias de superficie activa tales como lisolecit ina , polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de una variedad de lapa, dinitrifenol , y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y corinebacterium parvum. Tales adyuvantes son bien conocidos en el arte. Los anticuerpos monoclonales puede prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en el arte que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recorabinante, y de exhibición de fagos, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando técnicas de hibridoma que incluyen aquellas conocidas en el arte y enseñadas, por ejemplo, en Harlow y colaboradores, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da ed. 1988) ; Hammerling, y colaboradores, en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (las referencias se incorporan para referencia completamente) . El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon simple, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no el método por el cual se produce. Los métodos para producir y para la separación por exclusión de anticuerpos específicos que usan tecnología de hibridoma, son rutinarios y bien conocidos en el arte, y se discuten en detalle en el Ejemplo 11. Brevemente, pueden inmunizarse ratones con un polipéptido de la invención o una célula que expresa tal péptido. Una vez que se detecta una respuesta inmune, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero de ratón, el bazo del ratón se cosecha y se aislan los espl.enocitos . Los esplenocitos se funden entonces por técnicas bien conocidas para cualesquiera de las células de mieloma, por ejemplo células de la línea de célula SP20 disponible del ATCC. Se seleccionan los hibridomas y se clonan por dilución limitada. Los clones de hibridoma se ensayan entonces por métodos conocidos en el arte para células que secretan anticuerpos capaces de enlazar un polipéptido de la invención. El fluido de ascitos, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos. En consecuencia, la presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos monoclonales asi como anticuerpos producidos por el método que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención en donde, preferiblemente, el hibridoma se genera fundiendo esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antigeno de la invención, con células de mieloma y entonces separando por exclusión las hibridomas resultantes de la fusión para clones de hibridoma que secretan un anticuerpo hábil para enlazar un polipéptido de la invención . Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epitopes específicos por técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 de la invención, pueden producirse por partición proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(Ab')2) . Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CHl de la cadena pesada. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden también generarse usando varios métodos de exhibición de fagos conocidos en el arte. En los métodos de exhibición de fagos, los dominios de anticuerpo funcional se exhiben en la superficie de las partículas del fago que portan las secuencias de polinucleót ido que lo codifican. En particular, tales fagos pueden utilizarse para exhibir dominios que enlazan el antígeno expresados de un repertorio o colección de anticuerpo combinacional (por ejemplo, humano o murino) . Los fagos que expresan un dominio enlazado al antígeno que enlaza el antígeno de interés, puede seleccionarse o identificarse con un antígeno, por ejemplo, usando un antígeno etiquetado o antígeno enlazado o capturado en una superficie sólida o redonda. El fago usado en estos métodos típicamente son fagos filamentosos que incluyen dominios de enlace fd y M13 expresados de fagos con dominios de anticuerpo Fab, Fv o Fv estabilizado con bisulfuro fundidos recombinant emente ya sea a la proteína de gen fago III o gen VIII. Los ejemplos de métodos de exhibición de fagos que pueden usarse para elaborar los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkman y colaboradores, J. Immunol . Methods 182:41-50 (1995) ; Ames y colaboradores, Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kett leborough y colaboradores, Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); persic y colaboradores, Gene 187 9-18 (1997); burton y colaboradores, Advances in Immunology 57:191-280 (1994) ; solicitud PCT No. PCT/GB 91 / 01134 ; publicaciones PCT O 90/02809; O 91/10737; O 92/01047; WO 92/18619; W093/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes U.S. Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,72; 5,733,743 y 5 , 969, 108 , cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia completamente. Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección del fago, las regiones que codifican el anticuerpo del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento enlazado al antigeno, y expresado en cualquier huésped, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células de planta, levadura, y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle abajo. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en el arte tales como aquellos descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax y colaboradores, BioTechniques 12 (6) : 864-869 (1992); y Sawai y colaboradores, AJRI 34:26-34 (1995); y Better y colaboradores, Science 240:1041-1043 (1988) (las referencias se incorporan completamente para referencia) . Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fvs de cadena simple y anticuerpos, incluyen aquellos descritos en las Patentes U.S. 4,946,778 y 5,258,498; Huston. y colaboradores, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu y colaboradores, PNAS 90:7995-7999 (1993) ; y Skerra y colaboradores, Science 240:1038-10 0 (1988) . Para algunos usos, incluyendo uso in vivo de anticuerpos en ensayos de detección en humanos in vitro, se pueden usar de preferencia anticuerpos quiméricos, humanizados, o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se derivan diferentes porciones del anticuerpo de diferentes especies animales, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada- de una anticuerpo monoclonal de murina y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en el arte. Ver, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y colaboradores, BioTechniques 4:214(1986); Gillies y colaboradores, (1989) J. Immunol. ethods 125:191-202; Patente U.S. Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 4,816,397, que se incorporan en la. presente para referencia completamente. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de anticuerpos de especies no humanas que enlazan el antigeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de las especies no humanas y regiones de armazón de una molécula de inmunoglobulina humana. Frecuentemente, los residuos de armazón en las regiones de armazón humanas serán substituidos con el residuo correspondiente del anticuerpo donador CDR para alterar, preferiblemente mejorar, el enlace del antigeno. Estas substituciones de armazón se identifican por métodos bien conocidos en el arte, por ejemplo, modelando las interacciones del CDR y los residuos de armazón para identificar los residuos de armazón importantes para el enlace del antigeno y la secuencia de comparación para identificar residuos de armazón inusuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Queen y colaboradores, Patente U.S. No. 5,585,089; Riechmann y colaboradores, Nature 332:323 (1988) , que se incorpora en la presente para referencia completamente) . Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas conocidas en el arte que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (EP 239,400; publicación PCT O 91/09967; Patentes U.S. Nos. 5,225,539; 5,530,101; Y 5,585,089) chapeado o reformación de superficie (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4 /5) : 489-498 ( 1991); Studnicka y colaboradores, Protein Engineering 7(6) :805-814 (1994); Roguska y colaboradores, PNAS 91:969-973 (1994)), y mezclado de cadenas (Patente U.S. No. 5, 565, 332) . Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden hacerse de una variedad de métodos conocidos en el arte que incluyen los métodos de exhibición de fagos descritos arriba usando colecciones de anticuerpo derivados de secuencias de inmunoglobulina humanas. Ver también, Patentes U.S. Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y publicaciones PCT WO 98/46645, O 98/50433, WO 98/24893, O 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741; cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia completamente. Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humanos. Por ejemplo, los complejos de gen de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humanos, pueden introducirse aleatoriamente o por recombinación homologa en células del rabo de ratón embriónico. Alternativamente, la región variable, región constante, y región de diversidad, pueden introducirse en las células del rabo de ratón embriónico además de los genes de cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera pueden volverse no funcionales separadamente o simultáneamente con la introducción de ubicaciones de inmunoglobulina humana por recombinación homologa. En particular, la eliminación homocigót ica de la región JH evita la producción de anticuerpo endógeno. Las células del rabo embriónico modificadas se expanden y se mi cr oinyect an en blastocitos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se crian entonces para producir progenie que expresa anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal con un antigeno selecto, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales que se dirigen contra el antigeno pueden obtenerse de ratones transgénicos, inmunizados, usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humanos alojados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de la célula B, y subsecuentemente experimentan una interrupción de clase y mutación somática. De esta manera, usando tal técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM, e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol . 13:65-93) . Para una descripción detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, ver, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 96/34096; O 96/33735; Patentes U.S. Nos. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; y 5,939,598, que se incorporan para referencia en la presente completamente. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San José, CA) pueden comprometerse para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra una antígeno selecto usando tecnología similar a la que se describe arriba. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope selecto pueden generarse usando una técnica referida como "selección guiada". En este enfoque, se usa un anticuerpo monoclonal no humano selecto, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano reconociendo el mismo epítope. (Jespers y colaboradores, Bio/Technology 12:899-903 (1988)) . Además, los anticuerpos para los polipéptidos de la invención pueden, de vuelta, utilizarse para generar anticuerpos ant i-idiot ipo que "imitan" los polipéptidos de la invención usando técnicas bien conocidas por aquellos hábiles en el arte. (Ver, por ejemplo, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5) :437-444; (1989) y Nissinoff, J. Immunol. 147(8) :2429-2438 (1991 )) . Por ejemplo, los anticuerpos que se enlazan a, e inhiben competitivamente la mult imerización del polipéptido de la invención a un ligando, pueden usarse para generar anti-idiotipos que "imitan" la mult imeri zación del polipéptido y/o enlazan el dominio y, en consecuencia, se enlazan a y neutralizan el polipéptido y/o sus ligandos. Tales ant i-idiot ipos neutralizados o fragmentos Fab de tales anti-idiotipos pueden usarse en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando de polipéptido. Por ejemplo, tales anticuerpos anti-idiot ipo pueden usarse para enlazar un polipéptido de la invención y/o para enlazar sus ligandos /receptores , y por lo cual bloquear la inhibición mediada por TNFR de la apoptosis . Polinucleótidos que Codifican Anticuerpos. La invención proporciona además polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica un anticuerpo de la invención y fragmentos del mismo. La invención también abarca polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones de hibridización rigurosas o no tan rigurosas, por ejemplo, como se define arriba, a polinucleótidos que codifican un anticuerpo, preferiblemente, que se enlazan específicamente a un polipéptido de la invención, preferiblemente, un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO . : 2 ó 4. Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótido determinarse, por cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótido del anticuerpo se conoce, el polinucleótido que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligbnucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo, como se describe en Kutmeier y colaboradores, BioTechniques 17:242 (1994) ), que, brevemente, involucra la síntesis de o 1 i gonuc 1 eót i do s superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, recocido y ligado de aquellos nucleótidos, y entonces la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR. Alternativamente, un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede generarse a partir de ácido nucleico de una fuente apropiada. Si un clon contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular que no está disponible, pero la secuencia de la molécula del anticuerpo se conoce, el ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede obtenerse de una fuente apropiada (por ejemplo, una colección de anticuerpos de cADN, o una colección cADN generada de, o ácido nucleico, preferiblemente poli A+ARN, aislado de, cualquier tejido o células que expresan el anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar el anticuerpo de la invención) por amplificación PCR usando cebadores hibridi zables en las extremos 3' y 5' de la secuencia, o por clonación usando una sonda o 1 igonucl eót i da específica para la secuencia de gen particular para identificar, por ejemplo, un clon cADN a partir de una colección cADN que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificado generados por PCR pueden entonces clonarse en vectores de clonación replicables usando cualquier método conocido en el arte. | Una vez que la secuencia de nucleótido y la correspondiente secuencia de aminoácidos del anticuerpo se determina, la secuencia de nucleótido del anticuerpo puede manipularse usando métodos bien conocidos en el arte para la manipulación de secuencia de nucleótido, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante , mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc., (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y colaboradores, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY y Ausubel y colaboradores, editores, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, ambas se incorporan para referencia en la presente completamente), para generar anticuerpos gue tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo, para crear substituciones, eliminaciones, y/o inserciones de aminoácidos. En una modalidad especifica, la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera, pueden inspeccionarse para identificar las secuencias de las regiones complementariamente determinantes (CDR) por métodos que son bien conocidos en el arte, por ejemplo, por comparación a secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de cadena pesada y/o ligera para determinar las regiones de la secuencia hipervariablemente. Usando técnicas de ADN recombinante de rutina, uno o más de los CDR pueden insertarse dentro de las regiones de armazón, por ejemplo en regiones de armazón humanas para humanizar un anticuerpo no humano, como se describe arriba. Las regiones de armazón pueden ser regiones de armazón que ocurren naturalmente o por consenso, y preferiblemente regiones de armazón humanas (ver, por ejemplo, Chothia y colaboradores, J. Mol. Biol.. 278: 457-479 (1998) para un listado de regiones de armazón humanas) . Preferiblemente, el pol inucleót ido generado por la combinación de las regiones de armazón y los CDR que codifican un anticuerpo se enlazan específicamente a una polipéptido de la invención. Preferiblemente, como se discute arriba, una o más substituciones de aminoácido pueden hacerse dentro de las regiones de armazón, y, preferiblemente, las substituciones de aminoácidos mejoran el enlace del anticuerpo a su antígeno. Adi ci ona l en t e , tales métodos pueden usarse para hacer substituciones o eliminaciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína de región variable que participan en un enlace bisulfuro intracadenas para generar moléculas de anticuerpos que carecen de uno o más enlaces bisulfuro intracadena. Otras alteraciones al polinucleótido se abarcan por la presente invención y dentro de la habilidad del arte. Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y colaboradores, 1984, Proc, Nati. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger y colaboradores, 1984, Nature 312:604-608; Takeda y colaboradores, 1985, Nature 314:452- 54) por división de genes de una molécula de anticuerpos de ratón de un antigeno especifico, junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Como se describe arriba, un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se derivan diferentes porciones de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de una mAb murina y una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, anticuerpo humanizados. Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (Patente U.S. No. 4,694,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward y colaboradores, 1989, Nature 334:544-54) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena simple. Los anticuerpos de cadena simple se forman por enlace de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un aminoácido puente, resultando en un polipéptido de cadena simple. También pueden usarse técnicas para el ensamblado de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra y colaboradores, 1988, Science 242:1038-1041 ) . Métodos para producir anticuerpos . Los antic erpos de la invención pueden producirse por cualquier método conocido en el arte para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o preferiblemente, por técnicas de expresión recombinantes . La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o fragmento, derivado o análogo del mismo, por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención, requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o porción del mismo (preferiblemente que contenga el dominio variable de la cadena pesada o ligera) de la invención, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en el arte. De esta manera, los métodos para preparar una proteína expresando un pol inucleót ido que contiene un anticuerpo que codifica una secuencia nucleótida, se describen en la presente. Los métodos que son bien conocidos por aquellos hábiles en el arte, pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen el anticuerpo que codifica las secuencias y las señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. La invención, de esta manera, proporciona vectores replicables que comprende una secuencia de nucleótido que codifica una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, enlazado operativamente a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótido que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (ver, por ejemplo, Publicación PCT WO 86/05807; Publicación PCT WO 89/01036; y Patente U.S. No. 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en tal vector para la expresión de la cadena pesada o ligera completa. El vector de expresión se transfiere a una célula huésped por técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan entonces por técnicas convencionales para producir el anticuerpo de la invención. De esta manera, la invención incluye células huésped que contienen un polinucleótido que codifica el anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera del mismo, enlazada operativamente a un promotor heterólogo. En modalidades preferidas para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican tanto las cadenas pesada y ligera, pueden co-expresarse en la célula huésped para la expresión de la molécula de inmunoglobulina completa, como se detalla a continuación. Una variedad de sistemas de vector de expresión huésped pueden utilizarse para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención. Tales sistemas de expresión huéspedes representan vehículos por lo cuales las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias que codifican el nucleótido apropiadas, expresar la molécula de anticuerpo de la invención in situ. Esto incluye, pero no se limita a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. Subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante , ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen las secuencias que codifican el anticuerpo; levadura (por ejemplo, Saccharomices , Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen las secuencias que codifican el anticuerpo; sistemas de células de insecto infectadas con los vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contiene las secuencias que codifican el anticuerpo; sistemas de células de planta infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen las secuencias que codifican el anticuerpo; o sistemas de célula de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que hospedan constructos de expresión recombinante que contienen promotores derivados del gemona de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor del virus de vacuna 7.5K) . preferiblemente, las células bacterianas tales como Escherichia coli, y más preferiblemente, células eucariót icas , especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa, se usan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamífero tales como las células de ovario de Hámster chino (CHO) , en conjunto con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermediario mayor del citomegalovirus humano, es un sistema de expresión efectivo para anticuerpos (Foecking y colaboradores, 1986, Gene 45:101; Cockett y colaboradores, 1990, Bio/Technology 8:2) .
En sistemas de bacterias, un número de vectores ¦ de expresión pueden seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso pretendido para la molécula del anticuerpo expresada. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de tal proteina se produce, para la generación, de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, pueden desearse vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteina de fusión que se purifiquen fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión E. coli pUR278 (Ruther y colaboradores, 1983, EMBO J. 2:1791), en los cuales la secuencia que codifica el anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en la estructura con la región que codifica el lac Z para que la proteina de fusión se produzca; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX pueden usarse para expresar polipéptidos exteriores como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST) . En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden fácilmente purificarse a partir de células lisadas por la adsorción y enlace a perlas de una matriz de glutat iona-agarosa seguido por la elución en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de partición de proteasa de trombina o factor Xa para que el producto del gen objetivo clonado pueda liberarse de la porción GST. En un sistema de insectos, se usa el virus de poli edrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes externos. El virus crece en células Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de polihedrina ) . En células huésped de mamífero, puede utilizarse un número de sistemas de expresión de base viral. En los casos donde se usa un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede entonces insertarse en el genoma del adenovirus por recombinación in vitro e in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El ó E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados (por ejemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:355-359) . Las señales de inicio especificas pueden también requerirse para la traducción eficiente de las secuencias que codifican el anticuerpo insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Adicionalmente, el codón de iniciación deberá estar en fase con la estructura de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Estas señales de control de traducción exógena y codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto natural como sintético. La eficiencia de la expresión puede aumentarse por la inclusión de elementos aumentadores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc., (ver Brittner y colaboradores, 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544) .
Además, una cepa de célula huésped puede elegirse para que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto de gen en la forma especifica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilacion) y procesamiento (por ejemplo, partición) de los productos de proteina, puede ser importante en la función de la proteina. Diferentes células huésped tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento pos t-t reducción y la modificación de proteínas y productos de gen. Las líneas de célula apropiadas o sistemas huésped pueden elegirse para asegurar la modificación y procesamiento correcto de la proteína externa expresada. Para este resultado, células huésped eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto primario, glicosilacion, y fosforilación del producto del gen pueden usarse. Tales células huésped de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, y en particular, líneas de célula de cáncer de pecho' tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y línea de célula de glándula mamaria normal tal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst . Para la producción de alto rendimiento de largo plazo de proteínas recombinantes , se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden producirse- por ingeniería las líneas de células que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. En vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado por los elementos de control de expresión apropiado (por ejemplo, promotor, enriquecedor , secuencias, transcripción, terminadores , sitios de pol iadeni 1 ac i ón , etc.), y un marcador seleccionable . Después de la introducción del ADN externo, las células producidas por ingeniería pueden permitirse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y entonces se conectó a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrarse establemente al plásmido en sus cromosomas y crecer para formar focos que pueden clonarse nuevamente y expanderse en líneas de célula. Este método puede venta osamente usarse para producir por ingeniería líneas de células que expresan la molécula de anticuerpo. Tales líneas de célula producidas por ingeniería pueden ser particularmente útiles en la separación por exclusión y la evaluación de los compuestos que interactúan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo. Puede usarse un número de sistemas de selección, incluyendo, pero no limitándose a, genes de la cinasa timidina del virus del herpes simplex ( igler y colaboradores, 1977, Cell 11:223), fosforibosiltransferasa hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:202), y fosforibosiltransferasa adenina (Lowy y colaboradores, 1980, Cell 22:817) que pueden usarse en células tk-, hgprt- ó aprt-, respectivamente. También, puede usarse la resistencia antimetabolito como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y colaboradores, 1980, Nati. Acad. Sci USA 77:357; O'Hare y colaboradores, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligen & Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia a la aminoglicosida G-418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95, Tolstoshev, 1993, ann . Rev. Pharmacol, Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993; Ann. Rev. Biochem'. 62:191-217; Mayo, 1993 , TIB TECH 11 (5) : 155-215) ; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y colaboradores, 1984, Gene 30:147) . Los métodos comúnmente conocidos en el arte de la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse, se describen en Ausubel y colaboradores (editores), 1993; Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, Y ; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expresson, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los capítulos 12 y 13, Dracopoli y colaboradores (editores), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY; Colberre-Garapin y colaboradores, 1981, J. Mol. Biol . 150:1, que se incorporan para referencia en la presente completamente. Los niveles de expre.sión de una molécula de anticuerpo pueden incrementarse por la amplificación del vector (para una revisión, ver Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplif ication for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol . 3 (Academic Press, Nueva York, 1987)) . Cuando un marcador en el sistema vector que expresa el anticuerpo, es amp 1 i f icable , el incremento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped, incrementará el número de copias del gen marcador. Ya que la región amplificable se asocia con el gen de anticuerpos, la producción del anticuerpo también se incrementará (Crouse y colaboradores, 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257) . La célula huésped puede co-transfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, un vector simple puede usarse de manera que codifique tanto los polipéptidos de cadena pesada como los de cadena ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre de tóxicos (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197) . Las secuencias que codifican para las cadenas pesada y ligera pueden comprender cADN o ADN genómico. Una vez que la molécula de anticuerpo de la invención se ha expresado recombinant emente , esta puede purificarse por cualquier método conocido en el arte para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico después de la proteína A, y columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Conjugados de Anticuerpos . La presente invención abarca anticuerpos fundidos recombinantemente o químicamente conjugados (incluyendo tanto conjugaciones covalentes como no covalentes) a un polipéptido (o una porción del mismo, preferiblemente al menos 10, 20 ó 50 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención para generar proteínas de fusión. La fusión no necesita de manera necesaria ser directa, pero puede ocurrir a través de secuencias de enlace. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes a los polipéptidos (o porciones de los mismos, preferiblemente al menos 10, 20 ó 50 aminoácidos del polipéptido) de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse para identificar los polipéptidos de la presente invención para tipos de célula particulares, ya sea in vitro o in vivo, fundiendo o conjugando los polipéptidos de la presente invención a anticuerpos específicos para receptores de superficie de célula particulares. Los anticuerpos fundidos o conjugados a los polipéptidos de la presente invención también pueden usarse en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación usando los métodos conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Harbor y colaboradores, supra, y publicación PCT O 93/21232; EP 439,095; Naramura y colaboradores, Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); Patente U.S. 5,474,981; Gillies y colaboradores, PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell y colaboradores, J. Immunol. 1 6:2446-2452 (1991), que se incorpora para referencia completamente. La presente invención incluye además composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fundidos o conjugados a los dominios de anticuerpos diferentes a las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden fundirse o conjugarse a una región Fe del anticuerpo, o porción del mismo. La porción del anticuerpo fundida al polipéptido de la presente invención puede comprender la región constante, región de articulación, dominio CH1, dominio CH2, y dominio CH3 o cualquier combinaciones de los dominios completos o porciones de los mismos. Los polipéptidos pueden también fundirse o conjugarse con las porciones de ¦anticuerpos anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fe fundidas a los polipéptidos de la presente invención pueden formar dimeros a través del enlace bisulfuro entre las porciones Fe. Las formas multiméricas superiores pueden hacerse fundiendo los polipéptidos a porciones de IgA e Ig . Los métodos para fundir o conjugar los polipéptidos de la presente invención a porciones de anticuerpo son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; publicaciones PCT WO 96/14388; WO 91/06570; Ashkenazi y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng y colaboradores, J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); y Vil y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:11337-11341 (1992) (dichas referencias se incorporan para referencia completamente) . Como se discute, en la parte de arriba, los polipéptidos de la presente invención pueden fundirse o conjugarse a las porciones de anticuerpo anteriores para incrementar la vida media in vivo del polipéptido o para usarse en inmunoensayos usando métodos conocidos en el arte. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden fundirse o conjugarse a las porciones de anticuerpo anteriores para facilitar la purificación. Un ejemplo reportado describe proteínas quiméricas que consisten de los primeros dos dominios del polipéptido CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobul inas de mamífero. (EP 394,827; Traunecker y colaboradores, Nature 331:84-86 (1988) . Los polipéptidos de la presente invención fundidos o conjugados a un anticuerpo que tienen estructuras diméricas enlazadas al bisulfuro (debido al IgG) también pueden ser más eficientes en el enlace y la neutralización de otras moléculas, diferente a la proteina secretada monomérica o fragmento de proteina solo. ( Fountoulakis y colaboradores, J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)) . En muchos casos, la parte Fe en una proteina de fusión . es benéfica en la terapia y diagnóstico, y puede de esta manera resultar en, por ejemplo, propiedades farmacocinét icas mejoradas. (EP A 232,262) . Alternativamente, retirar la parte Fe después de que la proteina de fusión se ha expresado, detectado, y purificado, seria deseable. Por ejemplo, la porción Fe puede dificultar la terapia y diagnóstico si la proteina de fusión se usa como un antigeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de medicamentos, por ejemplo, las proteínas humanas, tales como la hIL-5, se han fundido con porciones Fe para el propósito de ensayos de separación por exclusión totalmente superiores para identificar antagonistas de la hIL-5. (Ver, D. Bennett y colaboradores, J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995) ; K. Johanson y colaboradores, J. Biol. Chem. 270:9 59-9471 (1995) .
Por otra parte, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención pueden ser secuencias fundidas o marcadoras, tales como un péptido para facilitar su purificación. En modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina se proporciona para la purificación conveniente de la proteina de fusión. Otras etiquetas de péptido útiles para su purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta "HA", que corresponde a un epitope derivado de la proteina de la influenza de hemaglut inina ( ilson y colaboradores, Cell 37:767 (1984) y la etiqueta "bandera". La presente invención además abarca anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados para un agente de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse en forma de diagnóstico para, observar el desarrollo o progreso de un tumor como parte de un procedimiento de prueba clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia que puede detectarse. Los ejemplos de sustancias que pueden detectarse incluyen varias enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , materiales radioactivos, metales que emiten positrones usando varias tomografías de emisión de positrones, e iones de metal paramagnét ico no radioactivo. Ver, por ejemplo, Patente U.S. No. 4,741,900 para iones de metal que pueden conjugarse a anticuerpos para usarse como diagnóstico de conformidad con la presente invención. Los ejemplos de enzimas apropiadas incluyen peroxidasa del rábano gigante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa , o ace t i 1 co 1 ine s t e ra s a ; ejemplos de complejos de grupo protésico apropiados incluyen estreptavidina/biotina y a vidina /bi ot ina ; ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen umbelliferona, f luoresceí na , isotiocianato de fluoresceína , rodamina, fluorescein diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o f icoerit riña ; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, lucíferina, y equorina; y ejemplos de material radioactivo apropiado incluye 125I, 131I, lnIn ó "Te. Además, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse a una porción terapéutica tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citoestático o citocidal, un agente terapéutico o un ión de metal radioactivo. Un agente de citotoxina o citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etiodio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina , daunorubicina , dihidroxi ant racindiona , mitoxant roña , mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona , glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propanolol, y puromicin y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, ant imet abo 1 i t os (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopur ina , 6- tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina ) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloret amina , tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) ( DDP ) cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antiguamente daunomicina) y doxorubicina ) , antibióticos (por ejemplo, dact inomicina (antiguamente act inomicina ) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinb 1 a s t ina ) . Los conjugados de la invención pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada, el agente terapéutico o la porción de medicamento no se construye como limitante para agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de medicamento puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, pseudomonas exotoxina, o difteria toxina; una proteína tal como el factor de necrosis de tumor, a-interferon, ß- int er feron , factor del crecimiento del nervio, factor del crecimiento derivado de la plaqueta, activador del plasminógeno de tejido, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucin- 1 ("IL- 1"), interleucin-2 ("IL-2"), ínter leucin- 6 ("IL- 6"), factor estimulante de la colonia de macrofase de granulocitos ("GM-CSF"), factor estimulante de la colonia de granulocitos ("G-CSF") , u otros factores de crecimiento. Los anticuerpos pueden enlazarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno objetivo. Tales soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, pol ie s t i reno , cloruro de polivinilo o polipropileno . La técnicas para conjugar tal porción terapéutica a los anticuerpos son bien conocidas, ver, por ejemplo, Arnon y colaboradores, "Monoclonal Antibodies For Immunotarget ing Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld y colaborado es, (editores), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ; Hellstrom y colaboradores, "Antibodies For Drig Delivery", en Controlled Drig Delivery (2da edición), Robinson y colaboradores (editores), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Torpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y colaboradores, (editores), páginas 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabel Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy/ Baldwin y colaboradores, (editores), páginas 303-16 (Academic Press 1985) , y Thorpe y colaboradores, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Ant ibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982) . Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heterocon j ugado como se describe por Segal en la Patente U.S. No. 4,676, 980, que se incorpora en la presente para referencia completamente . Un anticuerpo, con o sin una porción terapéutica conjugada a éste, administrada sólo o en combinación con un o unos factores citotóxicos y/o citocinas, puede usarse como un terapéutico. Ensayo para Enlace de Anticuerpos. Los anticuerpos de la invención puede ensayarse para enlace de inmunoespeci f icidad por cualquier método conocido en el arte. El inmunoensayo que puede usarse incluye, pero no se limita a, sistemas de ensayo no competitivos usando técnicas tales como manchado Western, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunosorbente enlazado a enzimas), inmunoensayos "intercalados", ensayos de inmunoprecipit ación , reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación al complemento, ensayos inmunoradiométricos , inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteina A, por nombrar algunos. Tales ensayos son de rutina y bien conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, editores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, que se incorpora para referencia en la presente completamente) . Los inmunoensayos ejemplares se describen brevemente a continuación (pero no se intentan a modo de limitación) . Los protocolos de inmunoprecipitación comprende generalmente la lisis de una población de células en una solución amortiguadora de lisis tal como solución amortiguadora RIPA (NP-40 al 1% o Tritón X-100, deoxicolato de sodio al 1%, SDS al 0.1%, NaCl 0.15 M, fosfato de sodio 0.01 M a un pH de 7.2, Trasilol al 1%) suplementado con fosfatasa de proteina y/o inhibidores de proteasa (por ejemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sodio) , agregando el anticuerpo de interés a la célula lisada, incubando durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 1-4 horas) a 4°C, agregando perlas de sefarosa de proteina A y/o proteina G a la célula lisada, incubando durante alrededor de una hora o más a 4°C, lavando las perlas en solución amortiguadora de lisis y volviendo a suspender las perlas en solución amortiguadora de muestra/SDS. La capacidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipi tar un antigeno particular puede evaluarse, por ejemplo, por análisis de manchado Western. Alguien hábil en el arte reconocerá los parámetros que pueden modificarse para incrementar el enlace del anticuerpo a un antigeno y reducir el soporte (por ejemplo, pre-limpieza con la célula lisada con perlas de sefarosa) . Para una discusión adicional con respecto a los protocolos de inmunoprecipitación ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, editores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York a 10.16.1. El análisis de manchado Western generalmente comprende preparar muestra de proteina, electroforesis de las muestras de proteínas en un gel de poliacrilamida (por ejemplo, 8%-20% SDS-PAGE dependiendo del peso molecular del antígeno), transfiriendo la muestra de proteína del gel de poliacrilamida a una membrana tal como ni t rocelulosa , PVDF o nylon, bloqueando la membrana en una solución de bloqueo (por ejemplo, PBS con BSA al 3% o leche no grasa), lavando la membrana en una solución amortiguadora de lavado (por ejemplo, PBS-Tween 20), bloqueando la membrana con anticuerpo primario (el anticuerpo de interés) diluyendo en solución amortiguadora de bloqueo, lavando la membrana en solución amortiguadora de lavado, bloqueando la membrana con un anticuerpo secundario (que reconoce el anticuerpo primario, por ejemplo, un anticuerpo anti-humano) conjugado a un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano gigante o fosfatasa alcalina) o molécula radioactiva (por ejemplo 32P ó 1251) diluyendo en solución amortiguadora de bloqueo, lavando la membrana en solución amortiguadora de lavado, y detectando la presencia del antigeno. Alguien hábil en el arte reconocerá que parámetros pueden modificarse para incrementar la señal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para una discusión adicional con respecto a los protocolos de manchado Western ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, editores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York a 10.8.1. El ELISA comprende preparar el antigeno, recubriendo el pozo de la placa microt itulada de 96 pozos con el antigeno, agregando el anticuerpo de interés conjugado a un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (por ejemplo, peroxidasa de rábano gigante o fosfatasa alcalina) al pozo e incubando durante un periodo de tiempo, y detectando la presencia del antigeno. En el ELISA, el anticuerpo de interés- no se ha conjugado al compuesto detectable; en su lugar, un segundo anticuerpo (que reconoce el anticuerpo de interés) conjugado a un compuesto detectable puede agregarse al pozo. Además, en lugar de recubrir el pozo con el antigeno, el anticuerpo puede recubrirse en el pozo. En este caso, puede agregarse un segundo antigeno conjugado a un compuesto detectable después de la adición del antigeno de interés al pozo recubierto. Alguien con habilidad en el arte reconocerá los parámetros que pueden modificarse para incrementar la señal detectada asi como otras variaciones del ELISA conocidas en el arte. Para una discusión adicional con respecto al ELISA ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, editores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John iley & Sons, Inc., Nueva York a 11.2.1. El enlace de afinidad de un anticuerpo a un antigeno y la relación en apagado de una interacción ant i cue rpo- ant i geno , puede determinarse por ensayo de enlace competitivo. Un ejemplo de un ensayo de enlace competitivo es un radioinmunoensayo que comprende la incubación del antigeno etiquetado (por ejemplo, 3H ó 1251) con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades incrementadas de antigeno no etiquetado, y la detección del anticuerpo enlazado al antígeno etiquetado. La afinidad del anticuerpo de interés para un antigeno particular y el enlace de relaciones apagadas puede determinarse a partir de los datos por análisis de manchado Scatchard. la competencia con un segundo .anticuerpo también puede determinarse usando radioinmunoensayo . En este caso, el antigeno se incuba con el anticuerpo de interés conjugado a un compuesto etiquetado (por ejemplo, 3H ó 1251) en presencia de cantidades incrementadas de un segundo anticuerpo no etiquetado . Usos Terapéuticos. La presente invención se dirige además a terapias basadas en el anticuerpo que involucran administrar los anticuerpos de la invención a un paciente animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano, para tratar uno o más de los desórdenes descritos. Los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de la invención (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos como se describe en la presente) y ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención (incluyen fragmentos, análogos y derivados de los mismos como se describe en la presente) . Los anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar o prevenir enfermedades y desórdenes asociados con la expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención, incluyendo, pero no limitándose a, enfermedades y/o desórdenes tales como enfermedades autoinmunes y/o deficiencias, como se discute en la presente. El tatamiento y/o la prevención de las enfermedades y desórdenes asociados con la expresión aberrante y/o la actividad de un polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, aliviar los síntomas asociados con aquellas enfermedades y desórdenes. Los anticuerpos de la invención pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticamente aceptables como se conoce en el arte o como se describe en la presente . Un resumen de formas en las cuales pueden usarse terapéuticamente los anticuerpos de la presente invención incluye enlace de polinucleótidos o polipéptidos de la presente invención localmente o s i s t émi camente en el cuerpo o por citotoxicidad directa del anticuerpo, por ejemplo, mediada por el complemento (CDC) o por células efectoras (ADCC) . Algunos de estos enfoques se describen en más detalle abajo. Armados con las enseñanzas/ provistas en la presente, alguien con habilidad ordinaria en el arte conocerá el uso de los anticuerpos de la presente invención para diagnóstico, monitoreo o propósitos terapéuticos sin experimentación indebida . Los anticuerpos de esta invención pueden utilizarse ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con factores de crecimiento hematopoiét ico o de linfocinas (tales como, por ejemplo IL-2, IL-3 e IL-7), por ejemplo, que sirven para incrementar el número de actividad de las células efectoras que interactúan con los anticuerpos. Los anticuerpos de la invención pueden administrarse solos o en combinación con otros tipos de tratamientos (por ejemplo, terapia de radiación, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia y agentes anti-tumor) . Generalmente, la administración de productos de un origen de especies o reactividad de especies (en el caso de anticuerpos) que es la misma especie que el paciente prefiere. De esta manera, en una modalidad preferida, los anticuerpos humanos, fragmentos derivados, análogos, o ácidos nucleicos, se administran a un paciente humano para terapia o profilaxis. Se prefiere usar anticuerpos neutralizantes y/o inhibidores de alta afinidad y/o potencia in vivo contra polipéptidos o polinucleót idos de la presente invención, fragmentos o regiones de los mismos, tanto para inmunoensayos dirigidos a y terapia de desórdenes relacionados a los pol inucleót idos o polipéptidos, incluyendo fragmentos de los mismos, de la presente invención. Tales anticuerpos, fragmentos, o regiones, preferiblemente tienen una afinidad para los polinucleótidos o polipéptidos, incluyendo los fragmentos de los mismos. Las afinidades de enlace preferidas incluyen aquellas con una dosiciación consiste o Kd menos a 5 X 10-6 M, 10-6 M, 5 X 10-7 M, 10-7 M, 5 X 10-8 M, 10-8 M, 5 X 10-9 M , 10-9 M , 5 X 10-10 M , 10-10 M , 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M , 10-13 , 5 X 10-14 M, 10-14 M , 5 X 10-15 M, y 10-15 M . Terapia de Genes . En una modalidad especifica, los ácidos nucleicos comprenden secuencias que codifican anticuerpos o derivados funcionales del mismo, administrados para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o desorden asociado con la expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención, por medio de una terapia de genes. La terapia de genes se refiere a una terapia realizada por la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen su proteina codificada que media un efecto terapéutico. Cualquiera de los métodos de terapia general disponibles en el arte pueden usarse de conformidad con la presente invención. Los métodos ejemplares se describen a continuación. Para una revisión general de los métodos de terapia de genes, ver Goldspiel y colaboradores, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:4191-217; Mayo, 1993, TIBTECH 11 (5) : 155-215) . Los métodos comúnmente conocidos en el arte de la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse, se describen en Ausubel y colaboradores (editores), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; y Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY . En un aspecto preferido, el compuesto comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo, las secuencias de ácido nucleico son parte de los vectores de expresión que expresan el anticuerpo o fragmentos de proteínas quiméricas o cadenas pesadas o ligeras de los mismos en un huésped apropiado. En particular, tales secuencias de ácido nucleico tienen promotores enlazados operablemente a la región que codifica el anticuerpo, el promotor siendo inductor o constitutivo, y, opcionalmente, específico de tejido. En otra modalidad particular, las moléculas de ácido nucleico se usan de manera que las secuencias que codifican el anticuerpo y cualquier otra secuencia deseada estén flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homologa a un sitio deseado en el genoma, esto se proporciona para expresión intracromosomal de los ácidos nucleicos del anticuerpo (Koller y Smithies, 1989, Proc. Nati.
Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlsttra y colaboradores, 1989, Nature 342:435- 38) . En modalidades específicas, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo de cadena simple; alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos incluyen secuencias que codifican tanto las cadenas pesadas como ligeras, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo. La entrega de los ácidos nucleicos en un paciente puede ser ya sea directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o a los vectores que portan el ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, las células se transforman primero con los ácido nucleicos in vitro, y después se transplantan en el paciente. Estos dos enfoques son conocidos, respectivamente, como terapia de genes in vitro o ex vivo. En una modalidad específica, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, donde se expresan para producir el producto codificado. Esto puede realizarse por cualesquiera de los numerosos métodos conocidos en el arte, por ejemplo, construyéndolos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo para que se vuelva int racelular , por ejemplo, por infección usando retrovirales defectuosos o atenuantes u otros vectores virales (ver, Patente U.S. No. 4,980,286) o por inyección directa de ADN desnudo, o usando bombardeo de microparticulas (por ejemplo, un disparador de genes; Biolistic, Dupont), recubriendo con lipidos o receptores de superficie de célula o agentes t rans fect antes , encapsulación en liposomas, microparticulas, o microcápsulas , o administrándolos en conjunto con un péptido que es conocido para entrar en el núcleo, administrándolo en conjunto con un ligando sujeto a la endocitosis mediada por el receptor (ver, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 29-4 32) (que puede usarse para tipos de célula objetivo que expresan específicamente los receptores), etc. En otra modalidad, los complejos ácido nucleico-ligando pueden formarse de manera que el ligando comprende un péptido viral fusogénico para romper los endosomas, permitiendo al ácido nucleico evitar la degradación lisosomal. Todavía en otra modalidad, el ácido nucleico puede dirigirse in vivo para células de retoma y expresión específicas, dirigiendo un receptor específico (ver, por ejemplo, Publicaciones PCT WO 92/06180 fechada el 16 de Abril de 1992 (Wu y colaboradores); WO 92/22635 fechada el 23 de Diciembre de 1992 (Wilson y colaboradores); WO 92/20316 fechada el 26 de Noviembre de 1992 (Findeis y colaboradores) ; WO 93/14188 fechada el 22 de Julio de 1993 (Clarke y colaboradores), WO 93/20221 fechada el 14 de Octubre de 1993 (Young) ) . Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de una célula huésped para la expresión, por recombinación homologa (Koller y Smithies, 1989, Proc, Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra y colaboradores, 1989, Nature 342: 35- 38) . En una modalidad especifica, se usan vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (ver, Miller y colaboradores, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599) . Estos vectores retrovirales están para retirar secuencias retrovirales que no son necesarias para empacar el genoma viral y la integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo para usarse en la terapia de genes, se clonan en uno o más vectores, que facilitan la entrega del gen en un paciente. Más detalles acerca de los vectores retrovirales pueden encontrarse en Boesen y colaboradores, 1994, Biotheray 6:291-302, que describen el uso de un vector retroviral para entregar el gen mdrl a células madre hematopoiéticas con objeto de hacer a las células madre más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en la terapia de genes son: Clowes y colaboradores, 1994 , J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem y colaboradores, 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons y Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; y Grossman y ilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics and Devel. 3:110-114. Los adenovirus son otros vectores virales que pueden usarse en la terapia de gen. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para entregar genes en la epitelia respiratoria. Los adenovirus infectan naturalmente los epitelios respiratorios donde causan una enfermedad moderada. Otros objetivos para los sistemas de entrega basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, células endot eliales , y músculos. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células no divididas. Kozarsky y Wilson, 1993, Current Opinión in Genetics and Development 3:499-503, presenta un revisión de la terapia de genes basada en adenovirus. Bout y colaboradores, 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demuestra el uso de los vectores de adenovirus para transferir genes a epitelios respiratorios de monos rhesus. Otros ejemplos del uso de los adenovirus en la terapia de genes pueden encontrarse en Rosenfeld y colaboradores, 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld y colaboradores, 1992; Cell 68:143-155; Mastrangeli y colaboradores, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234; Publicación PCT O 94/12649; y Wang, y colaboradores, 1995, Gene Therapy 2:775-783. En una modalidad preferida, se usan vectores de adenovirus . Los virus asociados con el adeno (AAV) también se han propuesto para su uso en la terapia de genes (Walsh y colaboradores, Proc. Soc. Exp. Biol.. Med. 204:289-300; Patente U.S. No. 5 , 436, 146) . Otro enfoque para la terapia de genes involucra transferir un gen a células en cultivo de tejido por métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, o infección viral, üsualmente, el método de transferir incluye transferir un marcador seleccionable a las células. Las células se colocan entonces bajo selección para aislar aquellas células que se han tomado y que expresan el gen transferido. Aquellas células se entregan entonces a un paciente. En esta modalidad, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en el arte, incluyendo, pero no limitándose a, transfección, elect roporación , mícroinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión de célula, transferencia de gen mediada por cromosoma, transferencia de gen mediada por microcélula, fusión esferoplasta , etc. Se conocen en el arte numerosas técnicas para la introducción de genes externos en las células (ver, por ejemplo, Loeffler y Behr, 1993, eth. Enzymol, 217:599-618; Cohén y colaboradores, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-6 4; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92) y pueden usarse de acuerdo con la presente invención, con la condición de que no se alteren las funciones de desarrollo y fisiológicas de las células receptoras. La técnica deberá proporcionar una transferencia estable del ácido nucleico a la célula, para que el ácido nucleico sea expresable por la célula . y preferiblemente heredable y expresable por su progenie de la célula . Las células recombinantes resultantes se entregan al paciente por varios métodos conocidos en el arte. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, madres hematopoiét icas o células de progenitor) se administran preferiblemente de manera intravenosa. La cantidad de células pensadas para usarse depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y puede determinarse por alguien habilidoso en el arte. Las células en las cuales puede introducirse un ácido nucleico para propósitos de terapia de genes, abarcan cualquier tipo de célula disponible, deseada, e incluye, pero no se limita a, células epiteliales, células endoteliales , queratinocitos , fibroblastos, células de músculo, hepat ocitos ; células sanguíneas tales como Tlimfocitos, Blimfocitos, monocitos, macrófagos, neutrofilos, eosinofilos, megacariocitos, granulocit os ; diferentes células madre o de progenitor, en particular células progenitoras o madre hematopoiét icas , por ejemplo, las obtenidas de la médula espinal, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc. En una modalidad preferida, la célula usada para la terapia de genes es autóloga para el paciente. En una modalidad en la cual se usan células recombinant es en la terapia de genes, se introducen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo en las células, de tal manera que estas son expresables por las células o su progenie, y las células recombinantes se administran entonces in vivo, para un efecto terapéutico. En una modalidad específica, se usan células de progenitor o madres. Cualesquiera de las células de progenitor y/o madres que pueden aislarse y mantenerse in vitro, pueden usarse de manera potencial de conformidad con esta modalidad de la presente invención (ver, por ejemplo, Publicación PCT WO 94/08598, fechada el 28 de Abril de 1994; Stemple y Anderson, 1992, Cell 71:973-985; Rheinwald, 1980, eth. Cell Bio. 21A:229; y Pittelkow y Scott, 1986, Mayo Clinic Proc . 61:771) . En una modalidad especifica, el ácido nucleico a introducirse para propósitos de terapia de genes, comprende un promotor inducible enlazado de manera operable a la región codificable, de tal manera que la expresión del ácido nucleico es controlable controlando la presencia o ausencia del inductor apropiado de la transcripción. Demostración de la Actividad Terapéutica o Profiláctica. Los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención se prueban preferiblemente in vitro, y después in vivo para la actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de usarse en humanos. Por ejemplo, los ensayos in vitro para demostrar la utilidad terapéutica o profiláctica de un compuesto o composición farmacéutica incluyen, el efecto de un compuesto en una linea de célula o una muestra de tejido del paciente. El efecto del compuesto o composición en la linea de célula y/o muestra de tejido puede determinarse usando técnicas conocidas por aquellos de habilidad en el arte, e incluyen, pero no se limitan a, ensayos de formación de roseta y lisis de célula. De conformidad con la invención, los ensayos in vitro que pueden usarse para determinar que la administración de un compuesto especifico es la indicada, incluyen ensayos de cultivo de célula in vitro en los cuales se hace crecer una muestra de tejido del paciente en un cultivo, y se expone a, o de lo contrario se administra, un compuesto, y se observa el efecto de tal compuesto sobre la muestra de tejido. Administración y Composición La invención proporciona métodos de tratamiento, inhibición y profilaxis por la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto o composición farmacéutica de la invención, preferiblemente un anticuerpo de la invención. En un aspecto preferido, el compuesto se purifica substancialmente (por ejemplo, substancialmente libre de sustancias que limiten o produzcan efectos laterales indeseables) . El sujeto preferiblemente es un animal, incluyendo, pero no limitándose a, animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y preferiblemente es un mamífero, y más preferiblemente humano. Las formulaciones y métodos de administración que pueden emplearse donde el compuesto comprende un ácido nucleico o una inmunoglobul ina se describen arriba; las formulaciones y rutas apropiadas adicionales de administración pueden seleccionarse de entre aquellas descritas en la presente a continuación. Se conocen varios sistemas de entrega y pueden usarse para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartí culas , microcapsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por el receptor (ver, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol . Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral o diferente, etc. Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, vías intradermal, intramuscular, intraperitonal , intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y oral. Los compuestos o composiciones pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolos, por absorción a través del epitelio o forros mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal o intestinal, etc) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede desearse introducir los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier ruta apropiada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse por cualquier catéter intraventricular, por ejemplo, enlazado a un depósito, tal como un depósito Ommaya. También puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, por el uso de un inhalador o nebülizador, y la formulación con un agente para producir aerosol . En una modalidad especifica, puede desearse administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área que necesite del tratamiento; esto puede realizarse por, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje para herida después de la cirugía, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, el implante siendo de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. Preferiblemente, cuando se administra una proteina, incluyendo un anticuerpo, de la invención, deberá tenerse cuidado para usar materiales los cuales no absorban la proteina. En otra modalidad, el compuesto o la composición pueden entregarse en una vesícula, en particular una liposoma (ver Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treta y colaboradores, en Lipos ornes en the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lope z-Berestein y Fidler (editores), Liss, Nueva York, páginas 353-365 (1989); Lopez-Berestein, idib, páginas 317-327; ver generalmente ibid) . Todavía en otra modalidad, el compuesto o composición puede entregarse en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, puede usarse una bomba (ver Langer, parte de arriba; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald y colaboradores, 1980, Sugerí 88:507; Saudek y colaboradores, 1989, N. Engl. J. ed. 321:574) . En otra modalidad, pueden usarse materiales poliméricos (ver Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (editores), CDC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Cointrolled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (editores), iley, Nueva York (1984); Ranger y Pepas, J. 1983 , Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver también Levy y colaboradores, 1985, Science 228:190; During y colaboradores, 1989, Ann . Neurol. 25:351; Howard y colaboradores, 1989, J. Neurosurg, 71:105) . Todavía en otra modalidad, puede colocarse un sistema dé liberación controlada en la proximidad del objetivo terapéutico, esto es, el cerebro, de esta manera requiriendo solamente una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, parte superior, Vol . 2, páginas 115-138 (1984)) . Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (1990, Science 249 : 1527-1533) . En una modalidad específica donde el compuesto de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su proteina codificada, construyéndose como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándose para que se vuelva intracelular, por ejemplo, por el uso de un vector retroviral (ver Patente U.S. No. 4,980,286), o por inyección directa, o usando un bombardeo de micropart iculas (por ejemplo, un disparador de genes; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie de célula o agentes t rans fectantes , o administrándolo en un enlace a un péptido tipo homeocaja que se conoce que entra al núcleo (ver, por ejemplo, Joliot y colaboradores, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, puede introducirse un ácido nucleico int racelularment e e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para la expresión, por recombinación homologa. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad especifica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal o listada en la U.S Farmacopea u otra farmacopea reconocida generalmente para usarse en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica es administrada intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa acuosa y glicerol también pueden emplearse como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes apropiados farmacéuticos incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsif icantes , o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos . La formulación oral puede incluir portadores estándar tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Los ejemplo de portadores farmacéuticos apropiados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tales composiciones contienen una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad apropiada de portador para proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación deberá apropiarse al modo de administración. En una modalidad preferida, la composición se formula de conformidad con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en solución amortiguadora acuosa isotónica estéril. Donde es necesario, la composición puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como lignocaina para suavizar el dolor en el sitio de inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran ya sea separadamente o mezclados de manera conjunta en una forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolleta o saquito indicando la cantidad de agente activo. Donde la composición es para administrarse por infusión, puede dosificarse con una botella de infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril o salina. Donde la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolleta de agua estéril para inyección o salina para que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración. Los compuestos de la invención pueden formularse como formas neutrales o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídricos, fosfóricos, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina , t riet i lamina , 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc. La cantidad del compuesto de la invención que es efectiva en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o desorden asociado con la expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención, puede determinarse por técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro pueden opcionalmente emplearse para auxiliar a identificar los rangos de dosis óptimos. La dosis precisa a emplearse en la formulación también depende de la vía de administración, y la seriedad de la enfermedad o desorden, y deberá decidirse de conformidad con el juicio del practicante y cada una de las Circunstancias del paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivada de sistemas de prueba de modelo in vitro o animal. Para los anticuerpos, la dosis administrada a un paciente es típicamente de 0.1 mg/kg hasta 100 mg/kg del peso corporal del paciente.
Preferiblemente, la dosis administrada al paciente es entre 0.1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente 1 mg/kg hasta 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una vida media más larga dentro del cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmune de los polipéptidos externos. De esta manera, es frecuentemente posible dosis inferiores de anticuerpos humanos y una administración menos frecuente. Además, la dosis y la frecuencia de administración de los anticuerpos de la invención puede reducirse aumentando la incorporación y penetración de tejido (por ejemplo, en el cerebro) de los anticuerpos por modificaciones tales como,. por ejemplo, lipidación . La invención también proporciona un paquete o estuche farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenados con uno . o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociados opcionales con tales recipientes puede ser un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la manufactura, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que informan los avisos reflejan la aprobación por la agencia para la manufactura, uso o venta para administración humana . Diagnóstico y Formación de Imágenes. Los anticuerpos etiquetados, y derivados y análogos del mismo, que se enlazan específicamente a un polipéptido de interés, pueden usarse para propósitos de diagnóstico para detectar, dar un diagnóstico, o monitorear enfermedades y/o desórdenes asociados con la expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención. La invención proporciona para la detección de expresión aberrante de un polipéptido de interés, que comprende (a) evaluar la expresión del polipéptido de interés en las células o fluido corporal de un individuo usando uno o más anticuerpos específicos para el polipéptido de interés y (b) comparar el nivel de la expresión de gen con un nivel de expresión de gen estándar, por lo cual un incremento o reducción en el nivel de expresión de gen de polipéptido ensayado comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de la expresión aberrante.
La invención proporciona un ensayo de diagnóstico para diagnosticar un desorden, que comprende (a) evaluar la expresión del polipéptido de interés en las células o fluido corporal de un individuo usando uno o más anticuerpos específicos al polipéptido de interés y (b) comparar el nivel de expresión del gen con un nivel de expresión del gen estándar, por lo cual un incremento o reducción en el nivel de expresión del gen del polipéptido evaluado para el nivel de expresión estándar es indicativo de un desorden particular. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente alta de t ranscriptasa en el tejido tomado en biopsia de un individuo, puede indicar una predisposición para el desarrollo de la enfermedad, o puede proporcionar medios para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos actuales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales de la salud emplear medidas preventivas o tratamientos agresivos tempranos por lo cual se previene el desarrollo o progreso adicional del cáncer. La evaluación de los niveles de polipéptido TR6-alfa y/o TR6-beta en una muestra biológica puede ocurrir usando técnicas basadas en anticuerpos. Los anticuerpos de la invención pueden usarse para evaluar niveles de proteina en una muestra biológica usando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por aquellos hábiles en el arte (por ejemplo, ver, Jalkanen, M . , y colaboradores, J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M. y colaboradores, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)) . Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión del gen de proteina incluyen inmunoensayos , tales como el ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA) . Las etiquetas de ensayo de anticuerpo apropiadas son conocidas en el arte e incluyen etiquetas de enzima, tales como, glucosa oxidasa, y radioisótopos, tales como yodo (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115mln, 113mln, 112In, niIn) , y tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (1SF), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru; etiquetas luminiscentes, tales como luminol; y etiquetas fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y bio t ina . Técnicas conocidas en el arte pueden aplicarse para los anticuerpos etiquetados de la invención. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan al uso de agentes conjugantes bi-funcionales (ver, por ejemplo, Patentes U.S. Nos. 5,756,065; 5,714,631; 5,696,239; 5,652,361; 5,505,931; 5,489,425; ,435,990; 5,428,139; 5,342,604; 5,274,119; 4,994,560; y 5,808,003; los contenidos de cada una de estas se incorpora en la presente para referencia completamente) . Un aspecto de la invención es la detección y diagnóstico de una enfermedad o desorden asociado con la expresión aberrante de un polipéptido de interés en un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un humano. En una modalidad, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, parenteralmente , subcutáneamente, o int raperi tonalmente ) a un sujeto una cantidad efectiva de una molécula etiquetada que se enlaza específicamente al polipéptido de interés; b) esperar durante un intervalo de tiempo después de la administración para permitir que la molécula etiquetada se concentre preferiblemente en el sujeto donde el polipéptido se expresa (y para que la molécula etiquetada no enlazada se libre hasta el nivel de respaldo); c) determinar el nivel de respaldo; y d) detectar la molécula etiquetada en el sujeto, de tal manera que la detección de la molécula etiquetada sobre el nivel de respaldo indica que el sujeto tiene una enfermedad o desorden particular asociado con la expresión aberrante del polipéptido de interés. El nivel de respaldo puede determinarse por varios métodos incluyendo, comparar la cantidad de molécula etiquetada detectada a un valor estándar antes de determinar un sistema particular. Se entenderá en el arte que el tamaño del sujeto y el sistema de imagen usado determina la cantidad de porción generadora de imagen que se necesita para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada estará normalmente en el rango desde alrededor de 5 hasta 20 milicurios de 99mTc. El anticuerpo etiquetado o fragmento de anticuerpo se acumula entonces preferiblemente en el lugar de las células que contienen la proteina especifica. La formación de imagen de tumor in vivo se describe en S. W. Burchiel y colaboradores, " Immunolpharmaco kinet i es of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments". (Capitulo 13 en formación de imágenes de tumor: The Radiochemical Detection of Cáncer, S. W. Burchiel y B. A. Rodees, editores, Masson Publishing Inc. (1982) . Dependiendo de diversas variables, incluyendo el tipo de etiqueta · usada y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir a la molécula etiquetada concentrarse preferiblemente en los sitios en el sujeto y para la molécula etiquetada no enlazada librar el nivel de respaldo, es de 6 hasta 48 horas ó de 6 hasta 24 horas, ó de 6 hasta 12 horas. En otra modalidad, el intervalo de tiempo después de la administración es de 5 hasta 20 días ó de 5 hasta 10 días. En una modalidad, el monitoreo de la enfermedad o desorden se lleva a cabo repitiendo el método para el diagnóstico de la enfermedad o enfermedades, por ejemplo, un mes después de iniciar el diagnóstico, seis meses después de iniciar el diagnóstico, un año después de iniciar el diagnóstico, etc.
La presencia de la molécula etiquetada puede detectarse en el paciente usando métodos conocidos en el arte para el barrido. Estos métodos dependen del tipo de etiqueta usado. Los técnicos habilidosos serán hábiles para determinar el método apropiado para detectar una etiqueta particular. Los métodos y dispositivos que pueden usarse en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, pero no se limitan a, tomografia comput ari zada (CT), barrido de cuerpo completo tal como tomografia de emisión de posición (PET), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y sonografia. En una modalidad específica, la molécula se etiqueta con un radioisótopo y se detecta en el paciente usando un instrumento quirúrgico de respuesta a la radiación (Thurston y colaboradores, Patente U.S. No 5,441,050) . En otra modalidad, la molécula se etiqueta con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de barrido que responde a la fluorescencia. En otra modalidad, la molécula se etiqueta con un metal que emite un positrón y se detecta en el paciente usando tomografia de emisión de positrones. Todavía en otra modalidad, la molécula se etiqueta con una etiqueta paramagnét ica en un paciente usando formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) . Estuches. La presente invención proporciona estuches que pueden usarse en los métodos anteriores. En una modalidad, un estuche comprende un anticuerpo de la invención, preferiblemente un anticuerpo purificado, en uno o más recipientes. En una modalidad especifica, los estuches de la presente invención contienen un polipéptido substancialmente aislado que comprende un epitope que es específicamente inmunoreact ivo con el anticuerpo incluido en el estuche. Preferiblemente, los estuches de la presente invención comprende además un anticuerpo de control que no reacciona con el polipéptido de interés. En otra modalidad específica, los estuches de la presente invención contienen medios para detectar el enlace de un anticuerpo a un polipéptido de interés (por ejemplo, el anticuerpo de interés puede conjugarse a un sustrato detectable tal como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimático, un compuesto radioactivo o un compuestos luminiscente, o un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo puede conjugarse a un sustrato detectable) . En otra modalidad especifica de la presente invención, el estuche es un estuche de diagnóstico para usarse en la separación por exclusión del suero que contiene los anticuerpos específicos contra polinucleótidos y polipéptidos prolif erativos y/o cancerígenos. Tal estuche puede incluir un anticuerpo de control que no reacciona con el polipéptido de interés. Tal estuche puede incluir un antígeno polipéptido substancialmente aislado que comprende un epítope que es específicamente inmunoreact i vo con al menos un anticuerpo antígeno ant i -po 1 ipépt ido . Además, tal estuche incluye medios para detectar el enlace del anticuerpo al antígeno (por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse a un compuesto fluorescente tal como fluoresceína o rodamina que puede detectarse por citometría de flujo) . En modalidades específicas, el estuche puede incluir un antígeno de polipéptido recombinantemente producido o químicamente sintetizado. El antígeno de polipéptido del estuche puede también enlazarse al soporte sólido.
En una modalidad más específica, los medios de detección del estuche arriba descrito incluyen un soporte sólido al cual el antígeno de polipéptido se enlaza. Tal estuche también puede incluir un anticuerpo anti-humano etiquetado por el reportero no enlazado. En esta modalidad, el enlace del anticuerpo al antígeno de polipéptido puede detectarse enlazando el anticuerpo etiquetado por el reportero. En una modalidad adicional, la invención incluye un estuche de diagnóstico para usarse en la separación por exclusión del suero que contiene antígeno del polipéptido de la invención. El estuche de diagnóstico incluye un anticuerpo sust ancialmente aislado específicamente inmunoreact i o con antígenos de polipéptidos o polinucleót idos , y medios para detectar el enlace del antígeno de polinucleótido o polinucleótido al anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo se enlaza a un soporte sólido. En una modalidad específica, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Los medios de detección del estuche pueden incluir un segundo anticuerpo, monoclonal etiquetado. Alternativamente, o además, los medios de detección pueden incluir un antigeno de competencia, etiquetado. En una configuración de diagnóstico, el suero de prueba con un reactivo de fase sólida tiene un antigeno enlazado a la superficie por los métodos de la presente invención. Después de enlazarse con un anticuerpo especifico al reactivo y de remover los componentes de suero no enlazados por lavado, el reactivo se hace reaccionar con un anticuerpo anti-humano etiquetado por el reportero para enlazar el reportero al reactivo en proporción a la cantidad de anticuerpo anti-antigeno enlazado en el soporte sólido. El reactivo se lava nuevamente para remover el anticuerpo etiquetado no enlazado, y la cantidad de reportero asociado con el reactivo se determina. Típicamente, el reportero es una enzima que se detecta incubando la fase sólida en presencia de un sustrato f luorométrico , luminiscente o colorimét rico apropiado (Sigma, San Luis, MO) . El reactivo de superficie sólida en el ensayo anterior se prepara por técnicas conocidas para enlazar el material de proteína al material de soporte sólido, tal como perlas poliméricas, barras de inmersión, placas de 96 pozos o material de filtro. Estos métodos de enlace incluyen generalmente la adsorción no especifica de la proteina al soporte o el enlace covalente de la proteina, típicamente a través de un grupo libre de amina, a un grupo químicamente reactivo en el soporte sólido, tal como un grupo carboxilo activado, hidroxilo, o grupo aldehido.
Alternativamente, .las placas recubiertas con est reptavidina pueden usarse en conjunto con antígenos biodegradables . De esta manera, la invención proporciona un sistema o estuche de ensayo para llevar a cabo este método de diagnóstico. El estuche generalmente incluye un soporte con antígenos recombinantes enlazados a la superficie, y un anticuerpo anti-humano etiquetado por el reportero para detectar el anticuerpo ant i-antígeno enlazado a la superficie . Trastornos Relacionados con el Sistema Inmune.
Diagnós ico . Los presentes inventores han descubierto que el TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta se expresan en tejidos hematopoyéticos y transformados. Para un número de trastornos relacionados con el sistema inmune, pueden detectarse niveles subs tancialmente alterados (incrementados o reducidos) de expresión del gen TNFR en el tejido u otras células o fluidos corporales del sistema inmune (por ejemplo, suero y plasma) tomados de un individuo que tiene tal desorden, con relación al nivel de expresión de gen TNFR "estándar", que es, el nivel de expresión TNFR en tejidos u otras células o fluidos corporales del sistema inmune de un individuo que no tiene el desorden del sistema inmune. De esta manera, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de un desorden del sistema inmune, que involucra medir el nivel de expresión del gen que codifica la proteína TNFR en el tejido u otras células o fluido corporal del sistema inmune de un individuo y comparar el nivel de expresión del gen medido con un nivel de expresión del gen TNFR estándar, por lo cual un incremento o reducción en el nivel de expresión del gen comparado con el estándar es indicativo de un desorden del sistema inmune . En particular, se considera que ciertos tejidos en mamíferos con cáncer (por ejemplo, colón, pecho y pulmón) tienen un elevado número de copias de genes TNFR y/o expresan niveles significativamente elevados de la proteína TNFR y mARN que codifica el TNFR cuando se compara a un nivel "estándar" correspondiente. Además, se considera que pueden detectarse niveles elevados de la proteína TNFR en ciertas células o fluidos corporales (por ejemplo suero y plasma) de mamíferos con un tipo de cáncer cuando se compara con el suero de mamíferos de la misma especie que no tienen el cáncer. De esta manera, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de un desorden del sistema inmune, incluyendo tipos de cáncer que involucran medir el nivel de expresión del gen que codifica la proteína TNFR en el tejido u otras células o fluido corporal del sistema inmune de un individuo y comparar el nivel de expresión del gen medido con un nivel de expresión de gen TNFR estándar, por lo cual un incremento o reducción en el nivel de expresión del gen comparado con el estándar es indicativo de un desorden del sistema inmune. Donde ya sea ha hecho un diagnóstico de un desorden en el sistema inmune que incluye el diagnóstico de un tumor, de conformidad con métodos convencionales, la presente invención es útil como un indicador de prognosis, por lo cual los pacientes exhiben una expresión del gen reducido experimentando un peor resultado clínico con relación a pacientes que expresan el gen a un nivel próximo al nivel estándar. Por "evaluar el nivel de expresión del gen que codifica una proteína TNFR" se intenta cualitativamente o cuantitativamente medir o estimar el nivel de la proteína TNFR- 6a y/o TNFR- 6ß o el nivel del mARN que codifica la proteína TNFR- 6a y/o TNFR- 6ß en una primera muestra biológica ya sea directamente (por ejemplo, determinando o estimando el nivel de proteína absoluto o el nivel e mARN) o relativamente (por ejemplo, comparando al nivel de proteína TNFR o el nivel de mARN en una segunda muestra biológica) . Preferiblemente, el nivel de la proteína TNFR o nivel de mARN en la primera muestra biológica se mide o estima y compara con un nivel de proteína TNFR o nivel de mARN estándar, el estándar siendo tomado de una segunda muestra biológica obtenida de un individuo que no tiene el desorden o se determina por niveles promedio a partir de una población de individuos que no tienen el desorden del sistema inmune. Se apreciará en el arte, una vez que los niveles de proteína TNFR o niveles de mARN estándar se conocen, que pueden usarse repetidamente como un estándar para comparación. Por "muestra biológica" se pretende cualquier muestra biológica obtenida de un individuo, fluido corporal, línea de célula, tejido de cultivo, u otra fuente que contiene la proteina TNFR o mARN. Como se indica, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como suero, plasma, orina, fluido sinoval y fluido espinal) que contienen dominios extracelulares libres (o formas solubles) de una proteína TNFR, tejidos del sistema inmune, y otras fuentes de tejido encontradas para expresar el TNFR completo, TNFR maduro, o dominio extracelular de un TNFR. Los métodos para obtener tejidos de biopsia y fluidos corporales de mamíferos, son bien conocidos en el arte. Donde la muestra biológica no incluye mARN, un tejido de biopsia es la fuente preferida. La invención también contempla el uso del gen de la presente invención para diagnosticar mutaciones en el gen TNFR. Por ejemplo, si se presenta una mutación en uno de los genes de la presente invención, las condiciones resultarán de una carencia de producción de los polipéptidos receptores de la presente invención. Además, las mutaciones que aumentan la actividad del polipéptido receptor conducen a enfermedades asociadas con una sobre expresión del polipéptido receptor, por ejemplo, cáncer. Las mutaciones en los genes pueden detectarse comparando la secuencia del gen defectuoso con uno normal. Posteriormente, puede verificarse que el gen mutante se asocia con la condición de enfermedad o la susceptibilidad a una condición de enfermedad. Esto es, un gen mutante que conduce a la subexpresión de los polipéptidos receptores de la presente invención se asociará con la incapacidad de la TNFR para inhibir el ligando Fas y/o la apoptosis mediada por AIM-II, y por lo cual resulta en una proliferación de célula irregular (por ejemplo crecimiento del tumor) . Otros desórdenes del sistema inmune que pueden diagnosticarse por los ensayos anteriormente mencionados incluyen, pero no se limitan a, hipersensibilidad, alergia, enfermedades infecciosas, enfermedades in erto-huésped, inmunodeficiencia , enfermedades auto-inmunes y s imilares .
Los individuos que presentan mutaciones en los genes de la presente invención pueden detectarse en el nivel de ADN por una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos usados para el diagnóstico pueden obtenerse de células, de pacientes, tales, como la sangre, orina, saliva y tejidos de biopsia entre otros tejidos. El ADN genómico puede usarse directamente para detectar o puede amplificarse enzimát icamente usando PCR. (Saiki y colaboradores, Nature, 324:163-166 (1986)) antes del análisis. El ARN o cADN también puede usarse para el propósito de muestra. Como un ejemplo, los cebadores PCR complementarios al ácido nucleico de la presente invención pueden usarse para identificar y analizar mutaciones en los genes humanos de la presente invención. Por ejemplo, pueden detectarse retiros o inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones de punto pueden identificarse hibridizando ADN amplificado para un ARN radioet iquetado o alternativamente, secuencias ADN anti-sentido radioetiquetadas de la presente invención. Las secuencias perfectamente apareadas pueden distinguirse de las dobles mal apareadas por digestión de RNasa A ó por diferencias en las temperaturas de fusión. Tal diagnóstico deberá ser particularmente útil para prueba pre-natal o aún neo-natal . Las diferencias de secuencia entre el gen de referencia y los "mutantes" pueden revelarse por el método de secuenciado de ADN directo. Además, los segmentos de ADN clonado pueden usarse como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este método se aumenta mayormente cuando se combina con PCR. Por ejemplo, un cebador secuenciado usado con un producto PCR de doble hebra o una molécula de plantilla de hebra sencilla generada por un producto PCR modificado. La determinación de secuencias se determina por procedimientos convencionales con nucleótidos radioetiquetados o por procedimientos de secuenciado automático con etiquetas fluorescentes . Los cambios en la secuencia en lugares específicos pueden revelarse por ensayos de protección de nucleasa, tales como RNasa y protección Si o el método de partición química (por ejemplo, Cotton y colaboradores, PNAS, 85: 4397-4401 (1985) ) .
La evaluación de los niveles de proteina TNFR en una muestra biológica puede ocurrir usando técnicas basadas en anti-cuerpos . Por ejemplo, la expresión de la proteína TNFR en tejidos puede estudiarse con métodos imnunohistológicos clásicos (Jalkanen, M . y colaboradores, J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985) ; Jalkanen, M . , y colaboradores, J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)) . Otros métodos basados en anticuerpo útiles para detectar la expresión del gen TNFR incluyen inmunoensayos , tales como el ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA) . Las etiquetas de ensayo de anticuerpo apropiadas se conocen en el arte e incluyen etiquetas de enzima, tales como, glucosa oxidasa, y radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112In), y tecnecio (99mTc), y etiquetas fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina. Además de evaluar los niveles de proteína TNFR en una muestra biológica obtenida de un individuo, las proteínas TNFR pueden también detectarse in vivo por formación de imágenes. Las etiquetas o marcadores de anticuerpos para formación de imágenes in vivo de proteínas TNFR incluyen aquellas que se pueden detectar por radiografía X, RMN o ESR, para la radiografía X, las etiquetas apropiadas incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero no son evidentemente perjudiciales al sujeto. Los marcadores apropiados para RMN y ESR incluyen aquellos con un giro característico detectable, tales como deuterio, que puede incorporarse en el anticuerpo por etiquetado de los nutrientes para la hibridoma relevante. El anticuerpo específico de TNFR ó fragmento de anticuerpo que se etiqueta con una porción formadora de imágenes detectable apropiada, tal como un radioisótopo (por ejemplo, 131I, 112In, 99mm Te_, (, 131TI, 125tI, 123TI, 121 carbono (, azufcre (35S), tritio (3H), indio (115mIn, 113mIn, 112In, luIn), y tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru), una sustancia radio-opaca, o un material detectable por resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente o intraperitonalmente) en el mamífero a examinarse para un desorden del sistema inmune. Se entenderá en el arte que el tamaño del sujeto y el sistema de formación de imágenes usado, determina la cantidad de porción formadora de imágenes necesaria para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada está normalmente en el rango desde alrededor de 5 hasta 20 milicurios de 99mTc. El anticuerpo etiquetado o fragmento de anticuerpo preferiblemente se acumula en el lugar de las células que contiene la proteína Neutrocina-alfa . La formación de imágenes de tumor in vivo se describe en S.W. Burchiel y colaboradores, "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragmente" (capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S.W. Burchiel y B. A. Rodees, editores, Masson Publishing Inc. (1982)) . Tratamien o. Los ligandos de la familia del Factor de Necrosis de Tumor (TNF) se conoce que están entre la mayoría de las citocinas pie i t rópi ca s , induciendo un gran número de respuestas celulares, incluyendo citotoxicidad, actividad anti-viral, actividades inmunoregulatorias , y la regulación t rans cr ipcional de varios genes (Goeddel, D.V. y colaboradores, "Tumor Necrosis Factor: Gene Structure and Biological Activities", Sym. Quant. Biol. 51:597-609 (1986) Cold Spring Harbor; Beutler,- B., y Ceirami, A., Annu . Rev. Biochem. 57:505-518 (1988); Oíd, L. J . , Sci. Am. 258:59-75 (1988); Fiers, W. FEBS Lett. 285-199-224 (1991) . Los ligandos de la familia TNF inducen diferentes respuestas celulares enlazando a receptores de la familia TNF. Los pol inucleót idos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta y polipéptidos de la invención pueden usarse en el desarrollo del tratamiento para cualquier desorden mediado (directamente o indirectamente) por cantidades defectuosas o insuficientes de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden administrarse a un paciente (por ejemplo, mamífero, preferiblemente humano) que padece de tal desorden. Alternativamente, puede aplicarse un enfoque de terapia de genes al tratamiento de tales desórdenes. La descripción en la presente de las secuencias de nucleótido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta permite la detección de los genes TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta defectuosos, y el reemplazo de los mismos con genes que codifican al TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta normal. Los genes defectuosos pueden detectarse en ensayos de diagnóstico in vitro, y comparando las secuencias de nucleótido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta descritas en la presente con un gen TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta derivado de un paciente sospechoso de hospedar un defecto en este gen. En otra modalidad, los polipéptidos de la presente invención se usan como una herramienta característica para estudiar los efectos biológicos que resultan de inhibir las interacciones ligando Fas/TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta y/o AIM-II en diferentes tipos de célula. Los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta también pueden emplearse en ensayos in vivo para detectar' ligando Fas, AIM-II, o TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta o las interacciones de los mismos. En otra modalidad, un polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta purificado de la invención se usa para inhibir el enlace del ligando Fas y/o AIM-II al ligando Fas de superficie de célula endógena y/o receptores AIM-II. Ciertos ligandos de la familia TNF (de la cual el ligando Fas y AIM-II son miembros) se han reportado para enlazar hasta más de una proteina receptora de superficie de célula distinta. De manera similar, el AIM-II se considera que enlaza múltiples proteínas de superficie de célula. Enlazando el ligando Fas y/o AIM-II, los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta solubles ' de la presente invención pueden emplearse para inhibir el enlace del ligando Fas y/o AIM-II no solamente al TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta endógeno, sino también al ligando Fas y proteínas receptoras AIM-II que son distintas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. De esta manera, en otra modalidad, TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se usa para inhibir una actividad biológica del ligando Fas y/o AIM-II, en procedimientos in vitro o inp vivo. Inhibiendo el enlace del ligando Fas y/o AIM-II a los receptores de superficie de célula, los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención también inhiben los efectos biológicos que resultan del enlace del ligando Fas y/o AIM-II a los receptores endógenos. Diversas formas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden emplearse, incluyendo, por ejemplo, los fragmentos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta arriba descritos, derivados, y variantes que son capaces de enlazar el ligando Fas y/o AIM-II. En una. modalidad preferida, un polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta soluble de la invención se administra para inhibir una actividad biológica del ligando Fas y/o AIM-II, por ejemplo, para inhibir la apoptosis mediada por ligando Fas y/o mediada por AIM-II de las células susceptibles a tal apoptosis. En una modalidad adicional, un polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención se administra a un mamífero para tratar un desorden mediado por el ligando Fas y/o mediado por AIM-II. Tales desórdenes mediados por el ligando Fas y/o mediado por AIM-II (por ejemplo, un humano) incluyen condiciones causadas (directamente o indirectamente) o exacerbadas por el ligando Fas y/o AIM-II. Las células que expresan un polipéptido TNFR y tienen una respuesta celular potente a los ligandos TNFR- 6a y/o TNFR- 6ß incluyen linfocitos, células endoteliales , queratinocitos, y tejido de la próstata. Por "una respuesta celular a un ligando de la familia TNF" se entiende cualquier cambio genotípico, fenotípico, y/o morfológico a una célula, línea de célula, tejido, cultivo de tejido o paciente que se induce por un ligando de la familia TNF. Como se indica, tales respuestas celulares incluyen no únicamente respuestas fisiológicas normales a ligandos de la familia TNF, sino también enfermedades asociadas con la apoptosis incrementada o la inhibición de la apoptosis. Adicionalmente , como se describe en la presente, los polipéptidos TNFR de la invención enlazan el ligando Fas y AIM-II y en consecuencia bloquean el ligando Fas y la apoptosis mediada por el AIM-II. La muerte de las células programada por la apoptosis es un mecanismo fisiológico involucrado en el retiro de los linfocitos B y/o T del sistema inmune, y su desregulación puede llevar a un número de procesos patogénicos diferentes (J. C. Ameisen AIDS 8:1197-1213 (1994); P. H. Kramer y colaboradores, Curr. Opin. Immunol. 6:279-289 (1994) ) . Las enfermedades asociadas con un incremento en la supervi encia de la célula, o la inhibición de la apoptosis, incluye tipos de cáncer (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones p53, y tumores dependientes de la hormona, incluyendo, pero no limitándose a cáncer de colon, tumores cardiacos, cáncer de páncreas, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma , cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer del estómago, neuroblas t orna , mixoma, linfoma, endot el i orna , osteoblastoma, os teoclastoma , os t eosar coma , condrosarcoma , adenoma, cáncer de pecho, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovario); desórdenes autoinmunes (tales como esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, diabetes autoinmune, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, pe 1 imi t o s i t i s , lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis inmuno-relacionada (por ejemplo, glomerulonefritis proliferat iva ) , gastritis autoinmune, púrpura trombocitopénico autoinmune, y artritis reumatoide) e infecciones virales (tales como virus del herpes, virus de la viruela y adenovirus), inflamación, enfermedad injerto contra huésped ) aguda y/o crónica), rechazo del injerto agudo, y rechazo del injerto crónico. En modalidades preferidas, los polinucleót idos TNFR, polipépt idos , y/o antagonistas de la invención se usan para inhibir el crecimiento, progreso, y/o metástasis de los tipos de cáncer, en particular aquellos enlistados arriba .
Enfermedades o condiciones adicionales asociadas con una supervivencia de la célula incrementada incluyen, pero no se limitan a, progreso y/o metástasis de desórdenes malignos y relacionados tales como leucemia (incluyendo leucemias agudas (por ejemplo, leucemia de linfocito aguda, leucemia de mielocito aguda (incluyendo mieloblást ica , promieloci t ica , mielomonocitica , monocitica, y erit roleucemia ) ) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocitica crónica ( granulocit i ca ) y leucemia linfocitica crónica)), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no de Hodgkin) , mieloma múltiple, macroglonulenemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, y tumores sólidos que incluyen, pero no se limitan a, sarcomas y carcinomas tales como f ibrosarcoma , mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma , sarcoma osteogénico, condorma, angiosarcoma , endotel iosarcoma , linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomi o s a rcoma , carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de pecho, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal, adenocarcinoma , carcinoma de glándula sudorativa, carcinoma de glándula cebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocar cinoma , carcinoma medular, carcinoma broncogénico , carcinoma de célula renal, hepatoma, carcinoma del ducto biliar, cor iocarcinoma , seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor de testículo, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de célula pequeña, carcinoma de vesícula, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, medulob 1 a s t orna , cr aniofaringioma , ependimona, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanima, neuroblastoma , y ret inoblastoma . Las enfermedades asociadas con una apoptosis incrementada incluyen SIDA; desórdenes neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrópica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebral y tumor en el cerebro o enfermedad asociada previa); desórdenes autoinmunes (tales como esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, enfermedad de Grave tiroiditis de Hashimoto, diabetes autoinmune, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis , lupus erit ematoso sistémico, glomerulonefritis inmuno-relacionada (por ejemplo, glomerulonefritis pro 1 i ferat iva ) , gastritis autoinmune, púrpura t rombocitopénico autoinmune, y artritis reumatoide), síndromes mielodi splá s t icos (tales como anemia aplástica), enfermedad injerto contra huésped (aguda y/o crónica), lesión isquémica tal como lesión cardiaca isquémica y la causada por infarto al miocardio, ataque y lesión de reperfusión), lesión o enfermedad del hígado (por ejemplo, lesión del hígado relacionada con la hepatitis, cirrosis, lesión de isquemia/reperfusión, colestosis (lesión del ducto biliar) y cáncer de hígado); enfermedad del hígado inducida por toxina (tal como la causada por el alcohol), choque séptico, colitis ulcerativa, caquexia y anorexia. En modalidades preferidas, los polinucleótidos , polipéptidos y/o agonistas de TNFR se usan para tratar o prevenir las enfermedades y desórdenes listados arriba. En una modalidad específica, los polinucleótidos, polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la glomerulonefritis. En una modalidad adicional, los polinucleótidos , pol ipéptidos , o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la glomerulonefritis crónica y/o el daño a la célula/tejido (por ejemplo, muerte de célula glomerular ) y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad. En una modalidad no exclusiva adicional, los polinucleótidos, polipépt idos , o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la glomerulonefritis proliferativa y/o el daño a la célula/tejido (por ejemplo, muerte de célula glomerular) y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad.
En una modalidad especifica, los polinucleótidos, polipéptidos , o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir cirrosis biliar y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad. En una modalidad especifica, los polinucleótidos, polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir enfermedades, tales como, por ejemplo enfermedad del hígado alcohólica y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad (por ejemplo, cirrosis ) .
En una modalidad específica, los polinucleót idos , polipéptidos , o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la enfermedad del injerto contra huésped. En una modalidad específica, los polinucleótidos , polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar (por ejemplo, reducir) o prevenir el daño o la destrucción del tejido o célula (por ejemplo, disminución de la célula linfoide asociado con la enfermedad injerto contra huésped) y/o otras condiciones médicas asociadas con esta enfermedad. En otra modalidad específica no exclusiva, los polinucleótidos, polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar (por ejemplo, reducir) y/o prevenir la diarrea durante la enfermedad injerto contra huésped. En una modalidad específica, los polinucleótidos, polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la enfermedad de Sjogren y/o para reducir el daño o destrucción de tejido/célula (por ejemplo, daño o destrucción de tejidos salivares y/o lagrimales) y/o otras condiciones médicas asociadas con esta enfermedad .
En una modalidad especifica, los polinucleót idos , polipépt idos , o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la esclerosis múltiple y/o reducir el daño o destrucción de tejido (tal como, por ejemplo, daño o destrucción de tejido neurológico (por ejemplo, tejido CNS) y/o lesiones u otras condiciones médicas asociadas con esta enfermedad. En una modalidad especifica, los polinucleótidos , pol ipépt idos , o agonistas de TNFR, incluyendo anticuerpo y fragmento de anticuerpos, de la invención se usan para tratar y/o prevenir la enfermedad de Alzheimer y/o reducir el daño o destrucción de tejido (por ejemplo daño o destrucción de tejido o células neurológicas ) y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad. En una modalidad especifica, los polinucleótidos, pol ipépt i do s , o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir la enfermedad de Parkinson y/o para reducir el daño o destrucción de tejido (por ejemplo, daño o destrucción de tejido o células neurológicas, tales como, por ejemplo, células neuronales) y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad.
En una modalidad específica, los polinucleót idos , polipépt idos , o agonistas de TNFR de la invención se usan antes, durante, inmediatamente después, y/o después de un infarto para tratar, prevenir, o reducir el daño de células o tejidos (tales como, por ejemplo, tejido neurológico) y/o condiciones médicas asociadas con el infarto. En una modalidad específica, los polinucleót idos , pol ipépt idos , o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar, prevenir o reducir la lesión isquémica (tal como, por ejemplo, lesión cardiaca isquémica) y/o condiciones médicas asociadas con la lesión isquémica. En una modalidad específica, los polinucleótidos , po 1 ipépt idos , o agonistas de TNFR de la invención se usan antes, durante, inmediatamente después, y/o después de un ataque al corazón para tratar, prevenir, o reducir la lesión cardiaca isquémica. En una modalidad específica, los polinucleótidos, polipéptidos , y/o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir los síndromes mielodisplásticos (MDS) y/o condiciones médicas asociadas con los MDS.
En otra modalidad específica, los po 1 inucleót i dos , polipéptidos , o agonistas de TNFR de la invención se usan para incrementar el número de glóbulos rojos circulantes en pacientes que sufren de citopenia, linfopenia y/o anemia. En una modalidad específica, los polinucleót idos , polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la tiroiditis de Hashimoto y/o para reducir la destrucción o daño de tejido o células (por ejemplo, glándula de la tiroides) y/o para tratar o prevenir condiciones médicas asociadas con esta enfermedad . En una modalidad específica, los polinucleótidos , polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar (por ejemplo, reducir) y/o prevenir la gastritis autoinmune y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad.
En una modalidad específica, los polinucleótidos, polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la colitis ulcerativa y/o daño a la célula/tejido (por ejemplo, ulceración en el colon) y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad.
En una modalidad específica, los polinucleót idos , polipépt idos , y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y/o prevenir la artritis reumatoide y/o condiciones médicas asociadas con esta enfermedad.
Adicionalmente, una variedad de tipos de cáncer secretan la FasL que enlaza las células T positivas Fas y eliminadoras de las mismas. Cualquier tipo de cáncer que expresa FasL deberá ser por lo tanto un objetivo para el tratamiento por TNFR y agonistas de TNFR de la invención. Tales tipos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, mieloma maligno, leucemia y linfoma. Muchas de las patologías asociadas con el VIH se median por la apoptosis, incluyendo la nefropatía inducida por VIH y la encefalitis por VIH. De esta manera, en modalidades preferidas adicionales, los pol inucleót idos , polipéptidos , y/o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir el SIDA y las patologías asociadas con el SIDA. Otra modalidad de la presente invención se dirige al uso de TNFR- 6 alfa y/o TNFR- 6 beta para reducir el ligando Fas y/o la muerte mediada por AIM-II de las células T en pacientes infectados con VIH.
El estado de inmunodeficiencia que define el SIDA es secundario a una reducción en el número y función de los linfocitos T CD4+. Informes recientes estiman la pérdida diaria de células T CD4 + para ser de entre 3.5 X 107 y 2 X 109 células (Wei X, y colaboradores, Nature 373:117-122 (1995)) . Una causa de la disminución de células T CD4+ en el establecimiento de la infección por VIH se considera que es la apoptosis inducida por VIH (ver, por ejemplo, Meyaard y colaboradores, 257- 219, (1992); Groux y colaboradores, J. Exp . Med, 175:331, (1992); y Oyaizu y colaboradores, en Cell Activation and Apoptosis in HIV Infection, Adrieu y Lu, editores, Plenum Press, Nueva York, 1995, páginas 101-114) . En efecto, la muerte celular apoptótica inducida por el VIH se ha demostrado no solamente in vitro sino también, más importantemente, en individuos infectados (Ameisen, J. C, AIDS 8:1197-1213 (1994); Finkel, T. H., y Banda, N. K., Curr. Opin. Immunol. 6:605-615 (1995); Muro-Cacho, C. A. y colaboradores, J. Immunol. 154:5555-5566 (1995)) . Adicionalmente , la apoptosis y la disminución en los linfocitos T CD4 está estrechamente correlacionada en diferentes modelos animales del SIDA (Brunner, T. y colaboradores, Nature 373:441-444 (1995); Gougeon, M. L., y colaboradores, AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563 (1993) y, la apoptosis no se observa en aquellos modelos de animales en los cuales la replicación viral no resulta en SIDA (Gougeon, . L. y colaboradores, AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:553-563 (1993)) . Además, los datos indican que los linfocitos T no infectados pero cebados o activados de individuos infectados con VIH experimentan apoptosis después de enfrentar el ligando Fas. Usando lineas de célula monociticas que resultan en la muerte después de la infección por VIH, se ha demostrado que la infección en células U937 con VIH resulta en la expresión de novo del ligando Fas y la apoptosis inducida por VIH mediada por el ligando Fas (Badley, A. D. y colaboradores, J. Virol. 70:199-206 (1996) . Además, el ligando de la familia TNF se detecta en macrófagos no infectados y su expresión se sobre-regula después de la infección por VIH resultando en el exterminio selectivo de linfocitos T CD4 no infectados (Badley, A. D. y colaboradores, J. Virol. 70:199-206 (1996) . Además, estudios adicionales han implicado la apoptosis mediada por Fas en la pérdida de células T en individuos con VIH (Katsikis y colaboradores, J. Exp. Med. 181:2029-2036, 1995) . De esta manera, por la invención, se proporciona un método para tratar individuos con VIH+ que involucra administrar TNFR y/o agonistas de la presente invención para reducir el exterminio de linfocitos T CD4. Los modos de administración y dosis se discuten en detalle a continuación . También es posible que la apoptosis de la célula T ocurra a través de múltiples mecanismos. Además, al menos algo de la muerte de célula T en pacientes con VIH puede mediarse por el AIM-II. Aunque no se desea enlazarse por la teoría, tal muerte de la célula T mediada por AIM-II y/o ligando Fas se considera que ocurre a través del mecanismo conocido como muerte de la célula inducida por la activación (AICD) . Las células T activadas humanas se inducen para experimentar la muerte de célula programada (apoptosis) durante el funcionamiento a través del complejo receptor de la célula CD3/T, un proceso que termina en la muerte de la célula inducida por la activación (AICD) . La AICD de las células CD4T aisladas de individuos a s int omá t i eos infectados con VIH se han reportado (Groux y colaboradores, supra) . De esta manera, la AICD puede jugar un papel en la disminución de células T CD4+ y en el progreso del SIDA en individuos infectados con VIH. De esta manera, la presente invención proporciona un método que inhibe la muerte de la célula T mediada por AIM-II y/o mediada por el ligando Fas en pacientes con VIH, que comprende administrar un polipéptido TNFR-ß alfa y/o TNFR-6 beta de la invención a los pacientes . En una modalidad, el paciente es asintomático cuando comienza el tratamiento con TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Si se desea, antes del tratamiento, pueden extraerse células T sanguíneas periféricas de un paciente con VIH, y probarse para susceptibilidad a la muerte de célula mediada por ligando Fas y/o mediada por AIM-II por procedimientos convencionales. En una modalidad, se pone en contacto la sangre o plasma del paciente con TNFR-6 alfa y/o TNFR-ß beta ex vivo. El TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta puede enlazarse por una cromatografía de matriz apropiada conocida en el arte por procedimientos convencionales. La sangre o plasma del paciente fluye a través de una cromatografía de columna que contiene polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención enlazados a la matriz, antes de regresarla al paciente. El TNFR- 6 alfa y/o TNFR-6 beta enlazan el ligando Fas y/o AIM-II, de esta manera removiendo el ligando Fas y/o la proteína AIM-II de la sangre del paciente. En modalidades adicionales, un polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención puede administrarse en combinación con otros inhibidores de la apoptosis de célula T. Por ejemplo, al menos algo de la muerte de célula T observada en pacientes con VIH se considera que es mediada por TRAIL (publicación de solicitud Internacional número WO 97/01633 incorporada en la presente para referencia) . De esta manera, por ejemplo, un paciente susceptible a la muerte de célula T mediada tanto por ligando Fas y . mediada por TRAIL puede tratarse tanto con un agente gue bloquea las interacciones TRAIL/receptor TRAIL y un agente que bloquea las interacciones Fa s - 1 i gando / Fa s . Los agentes apropiados que pueden administrarse con los polinucleót idos y/o polipéptidos de la invención para bloquear en enlace de TRAIL a los receptores TRAIL incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos receptores de TRAIL solubles (por ejemplo, una forma soluble de OPG, DR4 (publicación de solicitud Internacional número WO 98/32856); TR5 (publicación de solicitud Internacional número WO 98/30693); DR5 (publicación de solicitud Internacional número WO 98/41629); TRIO (publicación de solicitud Internacional número WO 98/54202)); formas multiméricas ' de polipéptidos receptores TRAIL solubles; y anticuerpos del receptor TRAIL que enlazan el receptor TRAIL sin transducir la señal biológica que resulta en la apoptosis, anticuerpos anti-TRAIL que bloquean el enlace de TRAIL para uno o más receptores TRAIL, y muteinas de TRAIL que enlazan receptores TRAIL pero no transducen la señal biológica que resulta en la apoptosis. Preferiblemente, los anticuerpos empleados de acuerdo con este método son anticuerpo monoclonales . Los agentes apropiados, que también bloquean el enlace de ligando Fas al Fas que puede administrarse con los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos Fas solubles; formas multiméricas de polipéptidos Fas solubles (por ejemplo, dímeros de sFas/Fc) ; anticuerpos anti-Fas que enlazan el Fas sin transducir la señal biológica que resulta en la apoptosis; anticuerpos ant i-ligando Fas que bloquean el enlace del ligando fas al Fas; y muteínas de ligando Fas que enlazan el Fas pero no transducen la señal biológica que resulta en la apoptosis. Los ejemplos de agentes apropiados para bloquear las interacciones Fas-L/Fas, incluyendo los anticuerpo anti-Fas monoclonales , se describen en la publicación de solicitud Internacional número WO 95/10540, incorporada en la presente para referencia . Los agentes apropiados que pueden administrarse con los polinucleót idos y/o polipéptidos de la invención para bloquear el enlace del AIM-II a los receptores AIM-II incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos del receptor AIM-II soluble (por ejemplo, una forma soluble de TR2 (publicación de solicitud Internacional número WO 96/34095); receptor beta LT; y T R 8 (publicación de solicitud Internacional número WO 98/54201)); formas multiméricas de polipéptidos del receptor AIM-II soluble; y anticuerpos del receptor AIM-II que enlazan el receptor AIM-II sin transducir la señal biológica que resulta en la apoptosis, anticuerpos anti-AIM- II que bloquean el enlace de AIM-II para uno o más receptores AIM-II, y muteínas de AIM-II que enlazan los receptores del AIM-II pero no transducen la señal biológica que resulta en la apoptosis. Preferiblemente, los anticuerpos empleados de conformidad con este método son anticuerpos monoclonales. En el rechazo de un aloinjerto, el sistema inmune del animal receptor no se ha cebado previamente para responder debido a que el sistema inmune en su mayor parte, solo se ha cebado por antigenos circundantes. Los tejidos de otros miembros de la misma especie no se han presentado de la misma manera que, por ejemplo, los virus y bacterias que se han presentado. En el caso de rechazo al aloinjerto, se diseñan regímenes inmunodepre sores para prevenir que el sistema inmune alcance la etapa efectora. Sin embargo, el perfil inmune del rechazo al xenoinjerto puede parecerse a la enfermedad recurrente más que el rechazo al aloinjerto. En el caso de la recurrencia de la enfermedad, el sistema inmune ya se ha activado, como se evidencia por la destrucción de las células isletas nativas. Por lo tanto, en la recurrencia de la enfermedad, el sistema inmune ya está en la etapa de efector. Los antagonistas de la presente invención son hábiles para suprimir la respuesta inmune tanto para aloinjertos como para xenoinjertos debido a los linfocitos activados y la diferenciación entre las células efectoras que expresan el polipéptido TNFR, y por lo cual son susceptibles a los compuestos con actividad TNFR aumentada. De esta manera, la presente invención proporciona, además, un método para crear tejidos privilegiados inmunes. Los antagonistas de la invención puede usarse, además, en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino. Los pol inucleótidos , pol ipépt i do s , y agonistas de TNFR de la invención, también pueden usarse para suprimir las respuestas inmunes. En una modalidad, los polinucleót idos , polipéptidos , y agonistas de TNFR de la invención se usan para minimizar los efectos adversos asociados con el transplante. En una modalidad especifica, los polinucleótidos , polipéptidos, y agonistas de TNFR de la invención se usan para suprimir las respuestas inmunes mediadas por Fas (por ejemplo, de manera similar a un inmunosupresor tal como, por ejemplo, rapamicina o ciclospor ina ) . En otra modalidad específica, los polinucleót idos , polipépt idos , y agonistas de TNFR de la invención se usan para suprimir las respuestas inmunes mediadas por AIM-II. Adicionalmente , tanto el rechazo al injerto y la enfermedad injerto contra huésped se accionan en parte por la apoptosis. En consecuencia, en una modalidad preferida adicional, los polinucleót idos , polipéptidos de TNFR, y/o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y prevenir y/o reducir el rechazo al injerto. En una modalidad adicional preferida, los polinucleót idos , polipéptidos de TNFR, y/o agonistas de TNFR de la invención se usan para tratar y prevenir y/o reducir la enfermedad injerto contra huésped. Ad i c i ona lment e , los polipéptidos, polinucleótidos , y/o agonistas TNFR- 6 alfa y/o T FR- 6 beta pueden usarse para tratar o prevenir el rechazo al injerto (por ejemplo rechazo al xenoinjerto y aloinjerto (por ejemplo rechazo al aloinjerto agudo) ) y/o condiciones médicas asociadas con el rechazo al injerto. En una modalidad específica, los polipéptidos, polinucleótidos, y/o agonistas TNFR- 6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención se usan para tratar o prevenir el rechazo al aloinjerto aguda y/o condiciones médicas asociadas con el rechazo al aloinjerto agudas. En una modalidad adicional especifica, los polipéptidos , polinucleótidos , y/o agonistas TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención se usan para tratar o prevenir el rechazo al aloinjerto aguda de un riñon y/o condiciones médicas asociadas con el rechazo al aloinjerto aguda de un riñon. El ligando Fas es una proteina de membrana del tipo II que induce la apoptosis enlazando al Fas. el ligando Fas se expresa en células T activadas, y trabaja como un efector de los linfocitos citotóxicos. El análisis molecular y genético del Fas y del ligando Fas indican que la linfoproliferación de mutación en el ratón (lpr) y la enfermedad linfoproliferativa generalizada (gld) son mutaciones de Fas y ligando Fas, respectivamente. Los ratones lpr y gld desarrollan linfadenopatia , y sufren de enfermedad autoinmune. Con base en estos fenotipos y otros estudios, se considera que el sistema Fas está involucrado en el proceso apoptótico durante el desarrollo de la célula T, específicamente el retiro clonal periférico o el suicidio inducido por la activación de las células T maduras. Además de los linfocitos activados, el Fas se expresa en el hígado, corazón y pulmón. La administración de anticuerpos anti-Fas agonistas en los ratones, ha mostrado que induce la apoptosis en el hígado y rápidamente mata al ratón, causando daño en el hígado. Estos hallazgos indican que el sistema Fas juega un papel no solo en el proceso fisiológico de desarrollo de linfocitos, sino también en la enfermedad mediada por el linfocito T citotóxico tal como hepatitis fulminante y/o hepatitis resultante de infección viral o agentes tóxicos. Como se discute en la presente, el TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta enlazan al ligando Fas, y de esta manera funciona como un antagonista de la actividad mediada por el ligando Fas. En consecuencia, los polipéptidos , y/o polinucleótidos, TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención, y/o agonistas de los mismos, pueden usarse para tratar o prevenir los desórdenes linf oproliferativos (por ejemplo, linfadenopat í a y otras descritos en la presente), desórdenes autoinmunes (por ejemplo, diabetes, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, glomerulonef rit is inmuno- relacionada, gastritis autoinmune, púrpura troraboeitopénico autoinmune, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, y otros descritos en la presente), y/o enfermedad del hígado (por ejemplo, hepatitis aguda y crónica, y cirrosis) . En una modalidad específica, los polinucleót idos , polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir la hepatitis y/o el daño o destrucción del tejido/célula y/o condiciones médicas asociadas con la hepatitis. En una modalidad específica, los pol inuc leó t i dos , polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir la hepatitis fulminante y/o condiciones médicas asociadas con la hepatitis fulminante. En una modalidad específica, los polinucleótidos , polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir el lupus eritematoso sistémico (SLE) y/o daño o destrucción del tejido/célula y/o condiciones médicas asociadas con el SLE. En una modalidad específica adicional, los polinucleótidos, polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir lesiones de la piel en pacientes con SLE. En una modalidad especifica, los polinucleótidos , polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir la diabetes mellitus dependiente de la insulina y/o daño o destrucción del te ido/célula y/o condiciones médicas asociadas con la diabetes mellitus dependiente de la insulina. En una modalidad especifica adicional, los polinucleótidos, polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan antes de, durante, o inmediatamente después del inicio de la diabetes para reducir o prevenir el daño a células isletas y/o reducir el requerimiento de insulina exógena . En una modalidad especifica, los polinucleótidos, polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir la necrolisis epidérmica tóxica (TEN) y/o daño o destrucción del tejido/célula, y/o condiciones médicas asociadas con la TEN. En una modalidad especifica adicional, los polinucleótidos, polipéptidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR de la invención se usan para tratar o prevenir el síndrome de Lyell. El virus de la hepatitis (por ejemplo, virus de la hepatitis B y virus de la hepatitis C) es el principal agente causante de la enfermedad crónica del hígado. En la infección de hepatitis, la expresión Fas en hepatocitos se sobre-regula de acuerdo con la severidad de la inflamación de hígado. Cuando las células T específicas del virus de hepatitis migran en hepatocitos y reconocen el antígeno viral por medio del receptor de la célula T, vuelven a activar y expresar el ligando Fas que puede transducir señal de muerte apoptótica a los hepatocitos que portan el Fas. De esta manera, el sistema Fas juega un papel importante en la lesión de célula de hígado por hepatitis viral. En consecuencia, en modalidades específicas, los polipéptidos y/o polinucleótidos de TNFR- 6 alfa y/o TNFR- 6 beta de la invención y/o agonistas y antagonistas de los mismos, se usan para tratar o prevenir la hepatitis que resulta de la infección viral (por ejemplo, infección que resulta de la infección con virus de hepatitis B o virus de hepatitis C) . En una modalidad, la sangre o plasma de un paciente se pone en contacto con polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención ex vivo. Los TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden enlazarse a una matriz de cromatografía apropiada por procedimientos convencionales. De conformidad con esta modalidad, la sangre o plasma del paciente fluye a través de una cromatografía de columna que contiene TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta enlazado a la matriz, antes de regresarse al paciente. El TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta inmovilizado enlazado al ligando Fas, remueve de esta manera la proteína del ligando Fas de la sangre del paciente. En una modalidad específica, los polipéptidos, polinucleótidos , y/o agonistas o antagonistas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención pueden usarse para tratar o prevenir la falla renal (por ejemplo, falla renal crónica), y/o daño o destrucción del tejido/célula (por ejemplo, retiro de célula epitelial tubular) y/o condiciones médicas asociadas con la falla renal. En una modalidad específica, los polipéptidos, polinucleótidos, y/o agonistas o antagonistas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención, pueden usarse para regular (esto es, estimular o inhibir) el crecimiento óseo. En modalidades específicas, los po 1 ipépt ido s , polinucleót idos , y/o agonistas o antagonistas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención se usan para estimular el crecimiento óseo. Las enfermedades o condiciones específicas que pueden tratarse o prevenirse con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, fracturas de hueso, y defectos, y desórdenes que resultan de la debilidad de los huesos tales como osteoporosis , osteomalacia, y pérdida de masa ósea relacionada con la edad. Los polipéptidos o polinucleótidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta que codifican el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención, y/o agonistas o antagonistas de los mismos, pueden usarse para tratar o prevenir desórdenes . cardiovasculares, incluyendo enfermedad arterial periférica, tal como isquemia de las extremidades. Los desórdenes cardiovasculares que incluyen anormalidades cardiovasculares, tales como fístula arterio-arterial , fístula art er iovenosa , malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos congénitos del corazón, atresia pulmonar, y síndrome de Scimitar. Los defectos del corazón congénitos incluyen contracción aórtica, cor triatriatum, anormalidades del vaso coronario, corazón entrecruzado, dextrocardia , ductos abiertos arteriosos, anormalidad de Enstein, complejo de Eisenmenger, síndrome de corazón izquierdo hipoplást ico, levocardia, tetralogía de Fallot, transposición de vasos mayores, ventrículo derecho de doble salida, artresia tricúspide, tronco persistente arterioso y defectos septales del corazón, tales como defecto septal aortopulmonar , defectos de amortiguación endocardial, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos septales del corazón ventricular.
Los desórdenes cardiovasculares también incluyen enfermedad del corazón, tal como ateroesclerosis, arritmias, enfermedad carcinoide del corazón, salida cardiaca alta, salida cardiaca baja, tamponación cardiaca, endocarditis (incluyendo bacterial), aneurisma del corazón, arresto cardiaco, falla congestiva del corazón (por ejemplo falla congestiva del corazón crónica) , cardiomiopatía congestiva, dispnea paroxismal, edema cardiaco, hipertrofia de corazón, cardiomiopatía congestiva, hipertrofia ventricular izquierda, hipertrofia ventricular derecha, ruptura del corazón después de infarto, ruptura septal ventricular, enfermedades de las válvulas del corazón, enfermedades de miocardio, isquemia miocardial, efusión pericardial, pericarditis (incluyendo constructiva y tuberculosa), pneumopericardio , síndrome post- pericardiotómico, fibrosis pulmonar, enfermedad del corazón pulmonar, enfermedad del corazón reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones prenatales cardiovasculares, síndrome de Scimitar, sífilis cardiovascular, y tuberculosis cardiovascular. En una modalidad específica, los polinucleótidos , po 1 ipépt idos , o agonistas de TNFR-,6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención pueden usarse para tratar y/o prevenir la falla del corazón congestiva crónica y/o condiciones médicas asociadas con la falla del corazón congestiva crónica . En otra modalidad específica, los polinucleótidos, pol ipépt idos , o agonistas de TNFR-6 alfa y/c TNFR-6 beta de la invención, pueden usarse para tratar y/o prevenir lesión o enfermedad pulmonar (por ejemplo, fibrosis pulmonar y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, tal como, por ejemplo, enfisema y bronquitis crónica), y/o daño o destrucción del tejido/célula (por ejemplo destrucción de la pared alveolar y/o pared bronquial) y/o condiciones médicas asociadas con la lesión o enfermedad pulmonar . Las arritmias incluyen arritmia de senos, fibrilación atrial, palpitación atrial, bradicardia, ext ra s i sto la , síndrome de Adams- Stokes, bloqueo paquete ramificado, bloqueo sinoatrial, síndrome QT grande, parasistola, síndrome de Lown-Ganong-Levine , síndrome de pre-excitación tipo Mahaim, síndrome Wolf -Parkinson-White, síndrome de seno enfermo, taquicardias, y fibrilación ventricular. Las taquicardias incluyen taquicardia paroxismal, taquicardia supraventricular, ritmo indioventricular acelerado, taquicardia de re-entrada nodal atrioventricular, taquicardia atrial ectópica, taquicardia juncional ectópica, taquicardia de reentrada nodal sinoatrial, taquicardia de seno, Torsades de Pointes, y taquicardia ventricular. La enfermedad de la válvula del corazón incluye insuficiencia aórtica, estenosis de válvula aórtica, soplo cardiaco, prolapso de válvula aórtica, prolapso de válvula mitral, prolapso de válvula tricúspide, insuficiencia de válvula mitral, estenosis de válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de válvula pulmonar, estenosis de válvula pulmonar, atresia tricúspide, insuficiencia de válvula tricúspide, y estenosis de válvula tricúspide. Lsa enfermedades del miocardio incluyen cardiomiopatia alcohólica, cardiomiopatia hipertrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, cardiomiopatia restrictiva, cardiomiopatia de Chagas, f ibroelastosis endocardial, fibrosis endomiocardial, síndrome de Kearns, lesión de reperfusión miocardial, y miocarditis. Las isquemias de miocardio incluyen enfermedades coronarias, tales como angina de pecho, aneurisma coronaria, arterioesclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto al miocardio y golpe miocardial . Las enfermedades cardiovasculares también incluyen enfermedades vasculares tales como aneurismia, angiodi spla s ia , angiomatosis , angiomatosis bacilar, enfermedad de Hippel-Lindau , síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber , síndrome de Sturge-Weber , edema angioneurótico, enfermedades aórticas, arteritis de Takayasu, aortitis, síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas, arteritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, desórdenes cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolismos, trombosis, er it romelalgia , hemorroides, enfermedad veno-oclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad veno-oclusi a pulmonar, enfermedad de Rayanaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena retinal, síndrome Scimitar, síndrome de vena cava superior, telangiectasia, atacia telangiectasia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis, e insuficiencia venosa. Los aneurismas incluyen aneurismas disecadores, aneurismas falsos, aneurismas infectados, aneurismas rotas, aneurismas aórticos, aneurismas cerebrales, aneurismas coronarios, aneurismas del corazón, y aneurismas iliacos. Las enfermedades oclusivas de las arterias incluyen arterioesclerosis, claudicación intermitente, estenosis carótida, displasias f ibromusculares , oclusión vascular mesentérica, enfermedad de Moyamoya, obstrucción arterial renal, oclusión arterial retinal, y t romboangi t i s obliterantes . Los desórdenes cerebrovasculares incluyen enfermedades de la arteria carótida, angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arterioesclerosis cerebral, malformación arteriovenosa cerebral, enfermedades de las arterias cerebrales, embolismo y trombosis cerebral, trombosis de la arteria carótida, trombosis del seno, síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaraxnoide , infarto cerebral, isquemia cerebral (incluyendo transitoria), síndrome del despojo subclaviano, leucomalacia periventricular, .dolor de cabeza vascular, dolor de cabeza en grupo, migraña, e insuficiencia vertebrobasilar. Las embolias incluyen embolias de aire, embolias de fluido amniótico, embolias de colesterol, síndrome de dedo azul, embolias de grasa, embolias pulmonares, y t romboembolias . Las trombosis incluyen, trombosis de vena hepática, oclusión de vena retinal, trombosis de arteria carótida, trombosis de seno, síndrome de Wallenberg, y tromboflebitis. Las isquemias incluyen isquemia cerebral, colitis isquémica, síndromes de compartimiento, síndrome de compartimiento anterior, isquemia miocardial, lesiones de reperfusión, e isquemia de articulaciones periféricas. Las vasculitis incluyen aortitis, arteritis, síndrome de Behcet, síndrome de Churg-St rauss , síndrome de ganglio linfático mucocut añoso , tromboangitis obliterana, vasculitis hipe r s en s ibl e , púrpura Schoenlein-Henoch, vasculitis cutánea alérgica, y granulomatosis de Wegener. En una modalidad, los polipépt idos , polinucleótidos y/o agonistas o antagonistas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-ß beta de la invención se usan para tratar o prevenir microangiopatí as trombóticas. Uno de tales desórdenes es el púrpura tromboci topénico trombótico (TTP) (Kwaan, H. C, Semin. Hematol. 24:71 (1987); Thompson y colaboradores, Blood 80:1890 (1992)) . Se han reportado incrementos en la relación de mortalidad asociada con el TTP por los centros estadounidenses para el control de la enfermedad (U.S. Centres for Disease Control) (Torok y colaboradores, Am. J. Hematol. 50:84 (1995)) . El plasma de pacientes afectados con TTP (incluyendo pacientes con VIH+ y VIH-) induce la apoptosis en células endoteliales humanas de origen microvascular dermal, pero no de origen del vaso grande (Laurence y colaboradores, Blood 87:3245 (1996)) . El plasma de pacientes con TTP de esta manera se tiene la idea de que contiene uno o más factores que inducen la apoptosis directamente o indirectamente. Un anticuerpo de bloqueo anti-Fas se ha mostrado para reducir la apoptosis mediada por el plasma con TTP de células endoteliales microvasculares (Lawrence y colaboradores, Blood 87:3245 (1996); incorporada en la presente para referencia) . En consecuencia, el ligando Fas presente en el suero de pacientes con TTP probablemente juega un papel en inducir la apoptosis de células endoteliales microvasculares. Otra microangicpatia trombótica es el síndrome hemolítico-urémico (HUS) (Moake, J. L., Lancet, 343:393, (1994); Melnyk y colaboradores, (Arch. Intern. Med., 155:2077, (1995); Thomson y colaboradores, supra) . De esta manera, en una modalidad, la invención se dirige al uso de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta para tratar o prevenir la condición que frecuentemente se refiere como "HUS adulto" (aunque pueda darse en niños) . Un desorden conocido como HUS asociado con la diarrea en la niñez, difiere en la etiología del HUS adulto. En otra modalidad, las condiciones caracterizadas por la coagulación de vasos pequeños de sangre pueden tratarse usando polipéptidos y/o pol inucleót idos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención. Tales condiciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas en la presente. Por ejemplo, los problemas cardiacos observados en alrededor del 5-10% de pacientes pediátricos con SIDA, se considera que involucran la coagulación de vasos pequeños. La descomposición de la microvasculatura en el corazón, se ha reportado en pacientes con esclerosis múltiple. Como un ejemplo adicional, se contempla el tratamiento de lupus sistémico eritematoso (SLE) . En una modalidad, la sangre o plasma de un paciente se pone, en contacto con polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención ex vivo. El TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden enlazarse a una cromatografía de matriz apropiada usando técnicas conocidas en el arte. De conformidad con esta modalidad, la sangre o plasma del paciente fluye a través de una cromatografía de columna que contiene TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta enlazado a la matriz, antes de regresarse al paciente. El TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta inmovilizado enlaza el ligando Fas y/o AIM-II, de esta manera removiendo la proteina del ligando Fas de la sangre del paciente. Alternativamente, el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta puede administrarse in vivo al paciente afectado con una microangiopatia trombótica. En una modalidad, un polinucleót ido o polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención se administra al paciente. De esta manera, la presente invención proporciona un método para tratar una microangiopatia trombótica, involucrando el uso de una cantidad efectiva de un polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención. El polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta puede emplearse en procedimientos in vivo o ex vivo, para inhibir el daño mediado por el ligando Fas y/o mediado por AIM-II a (por ejemplo, apoptosis de) las células microvasculares endot el iales . Los polipéptidos y polinucleótidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención pueden emplearse en conjunto con otros agentes útiles en el tratamiento de un desorden particular. Por ejemplo, en un estudio in vitro reportado por Laurence y colaboradores (Blood 87:3245, 1996) , se realiza alguna reducción de la apoptosis mediada por plasma con TTP de células endoteliales microvasculares usando un anticuerpo de bloqueo anti-Fas, ácido aurint ricarbo.xi 1 i co , o plasma normal reducido de crioprecipitado. De esta manera, el paciente puede tratarse en combinación con un agente adicional que inhibe la apoptosis mediada por el ligando Fas de las células endoteliales tales como, por ejemplo, un agente descrito arriba. En una modalidad, los polipéptidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención y un anticuerpo de bloqueo anti-Fas se administran al paciente afectado con un desorden caracterizado por microanglopatia trombótica, tal como TTP ó HUS. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales de bloqueo dirigidos contra el antigeno Fas (CD95) se describen en la publicación de solicitud internacional número O 95/10540, incorporada en la presente para referencia. El balance que ocurre naturalmente entre los estimuladores endógenos y los inhibidores de la angiogénesis , es uno en el cual predomina la influencia inhibitoria. Rastijead y colaboradores, Cell 56:345-355 (1989). En aquellos casos raros en los que ocurre la neovascularización bajo condiciones fisiológicas normales, tales como curación de heridas, regeneración de órganos, desarrollo . embriónico, y proceso reproductivo femenino, la angiogénesis es rigurosamente regulada y espacialmente y temporalmente delimitada. Bajo las condiciones de angiogénesis patológica tal como la que caracteriza el crecimiento de tumor sólido, estos controles reguladores fallan. La angiogénesis no regulada se vuelve patológica y sostiene el progreso de muchas enfermedades neoplásticas y no neoplásticas. Un número de enfermedades serias se dominan por la neovascularización anormal, e incluyen el crecimiento del tumor sólido y metástasis, artritis, algunos tipos de desórdenes en los ojos, y psoriasis. Ver, por ejemplo, revisiones de Moses y colaboradores, Biotech. 9:60-634 (1991); Folkman y colaboradores, N. Engl . J. Med. 333:1757-1763 (1995); Auerbach y colaboradores, J. Microvasc. Res. 29:401-411 (1985); Folkman, Advances in Cáncer Research, editores, Klein y Weinhouse, Academic Press, Nueva York, páginas 175-203 (1985); Patz, Am . J. Opthalmol. 94:715-743 (1982); y Folkman y colaboradores, Science 221:719-725 (1983) . En un número de condiciones patológicas, el proceso de angiogénesis contribuye al estado de la enfermedad. Por ejemplo, se han acumulado datos importantes que sugieren que el crecimiento de tumores sólidos depende de la angiogénesis. Folkman y Klagsbrun, Science 235:442-447 (1987) . La presente invención se proporciona para el tratamiento de enfermedades o desórdenes asociados con la neovasculari zación por la administración de los pol inucleótidos y/o polipéptidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención. Las condiciones malignas y metastáticas que pueden tratarse con los polinucleót idos y polipéptidos de la invención incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, malignos, y tipos de cáncer descritos en la presente o de lo contrario conocidos en el arte (para una revisión de tales desórdenes, ver Fishman y colaboradores, Medicine, 2da edición, J. B. Lippincott Co., Filadelfia (1985) ) . Los desórdenes oculares asociados con la neovascularización que pueden tratarse con los polinucleótidos y polipéptidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la presente invención (incluyendo agonistas y/o antagonistas de TNFR) incluyen, pero no se limitan a: glaucoma neovascular, retinopatia diabética, ret inlastoma , fibroplasia retrolental, uveitis, retinopatia de degeneración macular prematura, neo asculari zación de injerto de córnea, asi como otras enfermedades inflamatorias de los ojos, tumores oculares y enfermedades asociadas con la neovascularización coroidal o de iris. Ver, por ejemplo, revisiones por Waltman y colaboradores, Am. J. Ophthal. 85:704-710 (1978) y Gartner y colaboradores, Surv. Ophthal. 22:291-312 ( 1978) . En otra modalidad, los polipéptidos , polinucleót idos y/o agonistas o antagonistas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención se usan para estimular la diferenciación y/o supervivencia de las células f ot orreceptoras y/o el tratamiento o prevención de enfermedades, desórdenes, o condiciones asociadas con un número reducido, diferenciación y/o supervivencia de las células fotorreceptoras . Adicionalmente, los desórde es que pueden tratarse con los polinucleótidos y polipéptidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la presente invención (incluyendo agonistas y/o antagonistas de TNFR) incluyen, pero no se limitan a, heraangioma, artritis, psoriasis, angiof r ibroma , placas ateroescieróticas, retraso en la curación de herida, granulación, articulaciones hemofilicas, cicatrices hipertróficas, fracturas no de unión, síndrome de Olser-Weber, granuloma piogénico, escleroderma , tracoma, y adhesiones vasculares . En modalidades adicionales, los polinucleotidos, polipéptidos de TNFR- 6 alfa y/o TNFR-6 beta y/o otras composiciones de la invención (por ejemplo anticuerpo anti-TNFR-6 alfa y/o anti-TNFR-ß beta) se usan para tratar o prevenir enfermedades o condiciones asociadas con alergia y/o inflamación. En una modalidad específica, los polinucleotidos, polipéptidos de TNFR y/o agonistas o antagonistas de los mismos, pueden usarse para tratar o prevenir oftalmopatía asociada con la tiroides y/o daño o destrucción del te ido/células, y/o condiciones médicas asociadas con la oftalmopatía asociada con la tiroides . En una modalidad específica, los polinucleotidos, polipéptidos, o agonistas de TNFR de la invención, se usan para prolongar la expresión de la proteína después de la terapia de genes inhibiendo o reduciendo la eliminación de células que expresan el transgen. En modalidades adicionales, los polinucleót idos y/o polipéptidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta, y/o agonistas o antagonistas de los mismos, se usan para promover la curación de heridas . Los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos son útiles en el diagnóstico y tratamiento o prevención de un amplio rango de enfermedades y/o condiciones. Tales enfermedades y condiciones incluyen, pero no se limitan a, cáncer (por ejemplo, tipos de cáncer relacionados con la célula inmune, cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de ovario, linfoma folicular, cáncer asociado con la mutación o alteración de p53, tumor cerebral, cáncer de vejiga, cáncer ut erocervical , cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma de célula no pequeña del pulmón, carcinoma de célula pequeña del pulmón, cáncer del estómago, etc.), desórdenes 1 infopro 1 i fe ra t i vos (por ejemplo, linfadenopat í a ) , microbianos (por ejemplo, viral, bacterial, etc.) infección (por ejemplo infección por VIH-1, infección por VIH-2, infección por virus del herpes (incluyendo, pero no limitándose a, HSV-1, HSV-2, CMV, VZV, HHV-6, HHV-7, EBV) , infección por adenovirus, infección por virus de la viruela, infección por virus del papiloma humano, infección por hepatitis (por ejemplo, HAV, HBV, HCV, etc.), infección por Helicobacter pylori, Staphylococcia invasora, etc.), infección parasítica, nefritis, enfermedad ósea (por ejemplo, os t eopor os i s ) , arterioesclerosis , dolor, desórdenes cardiovasculares (por ejemplo, neovas culari z a c i ón , hipova s cul a r i z aci ón o circulación reducida (por ejemplo, enfermedad isquémica (por ejemplo, infarto al miocardio, ataque, etc.)) ), SIDA, alergia, inflamación, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentaria, degeneración cerebral, etc.) rechazo al injerto (agudo y crónico), enfermedad injerto, contra huésped, enfermedades debidas a la osteomielodisplasia (por ejemplo, anemia aplástica, etc.) , destrucción del tejido de articulaciones en reumatismo, enfermedad del hígado (por ejemplo, hepatitis aguda y crónica, lesión el hígado, y cirrosis), enfermedad autoinmune (por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, glomerulonefritis compleja inmune, diabetes autoinmune, púrpura trombocitopénico autoinmune, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, etc.) , cardiomiopat i a (por ejemplo, cardiomiopatí a dilatada), diabetes, complicaciones diabéticas (por ejemplo, nefropatía diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética), influenza, asma, psoriasis, glomerulonefrit is , choque séptico, y colitis ulcerativa. Los pol inucleót idos y/o polipéptidos de la invención y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos son útiles para promover la angiogénesis , regular la hematopoyesis y curar las heridas (por ejemplo, heridas, quemaduras, y huesos fracturados ) . Los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos también son útiles como un adyuvante para aumentar las respuestas inmunes al antígeno específico, respuestas inmunes ant i-virales .
Más generalmente, los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos son útiles para regular (esto es, elevar o reducir) la respuesta inmune. Por ejemplo, los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención pueden ser útiles en la preparación o recuperación de cirugía, trauma, terapia de radiación, quimioterapia, y transplante, o puede usarse para estimular la respuesta inmune y/o la recuperación en la gente mayor y en los individuos con compromiso inmune. Alternativamente, los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención y/o agonistas y/o antagonistas de los mismos son útiles como agentes inmunodepresores , por ejemplo en el tratamiento o prevención de desórdenes autoinmunes. En modalidaes específicas, los polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención se usan para tratar o prevenir condiciones alérgicas o autoinmunes, inflamatorias crónicas, tales como aquellas descritas en la presente o de lo contrario conocidas en el arte. En un aspecto, la presente invención se dirige a un método para aumentar la apoptosis inducida por un ligando de la familia TNF, que involucra administrar a un paciente (preferiblemente un humano) antagonistas de TNFR (por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFR o un fragmento de péptido TNFR) . Preferiblemente, el antagonista de TNFR se administra para tratar una enfermedad o condición en donde se exhibe una supervivencia de la célula incrementada. Los antagonistas de la invención incluyen formas solubles e TNFR y anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido TNFR.
Por "antagonista" se entienden compuestos que ocurren naturalmente y sintéticos capaces de aumentar o potenciar la apoptosis. Por "agonista" se entiende compuestos que ocurren naturalmente o sintéticos capaces de inhibir la apoptosis. Si cualquier candidato "agonistas" o "antagonista" de la presente invención puede inhibir o aumentar la apoptosis puede determinarse usando ensayos de respuesta celular ligando/receptor de la familia TNF conocidos en el arte, incluyendo aquellos descritos con más detalle a continuación. Uno de tales procedimientos de separación por exclusión involucra el uso de melanóforos que se transfectan para expresar el receptor de la presente invención. Tal técnicas de separación por exclusión se describen en la publicación de solicitud internacional número WO 92/01810, publicada el 6 de Febrero de 1992. Tal ensayo puede emplearse, por ejemplo para separar por exclusión un compuesto que inhibe (o aumenta) la activación del polipéptido receptor de la presente invención poniendo en contacto las células melonóforas que codifican el receptor tanto con un ligando de la familia TNF y el candidato antagonista (o agonista) . La inhibición o aumento de la señal generada por el ligando indica que el compuesto es un antagonista o agonista de la via de señalización 1 i gando / receptor . Otras técnicas de separación por exclusión incluyen el uso de células que expresan el receptor (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema que mide los cambios en el pH extracelular causados por la activación del receptor, por ejemplo, como se describe en Science 246:181-296 (Octubre 1989) . Por ejemplo, los compuestos pueden ponerse en contacto con una célula que expresa el polipéptido receptor de la presente invención y una segunda respuesta de un mensajero, por ejemplo la transducción de señal o cambio del pH, pueden medirse para determinar si el compuesto potencial activa o inhibe el receptor . Otra de tales técnicas de separación por exclusión involucra introducir ARN que codifica el receptor en oocitos Xenopus para expresar transitoriamente el receptor. Los oocitos receptores pueden entonces ponerse en contacto con el receptor ligando y un compuesto puede separarse por exclusión, seguido por la detección de la inhibición o activación de una señal de calcio en el caso de separación por exclusión para compuestos que se pretende que inhiban la activación el receptor. Otra técnica de separación por exclusión involucra expresar en células un constructo en donde el receptor se enlaza a una fosfolipasa C ó D. Tales células incluyen células endoteliales, células del músculo liso, células de ríñones embriónicos, etc. La separación por exclusión puede realizarse como se describe anteriormente detectando la activación del receptor o inhibición de la activación del receptor de la señal de fosfolipasa . Otro método involucra la separación por exclusión para compuestos que inhiben la activación del polipéptido receptor de la presente invención o antagonistas, determinando la inhibición del enlace del ligando etiquetado a las células que tienen el receptor en la superficie de las mismas. Tal método involucra transfectar una célula eucariótica con ADN . que codifica el receptor de tal manera que la célula exprese el receptor en su superficie y ponga en contacto la célula con un compuesto en presencia de una forma etiquetada de un ligando conocido. El ligando puede etiquetarse, por ejemplo, por radioactividad. La cantidad de ligando etiquetado enlazado a los receptores se mide, por ejemplo, midiendo la radioactividad de los receptores. Si el compuesto se enlaza al receptor como se determina por una reducción del ligando etiquetado que se enlaza a los receptores, el enlace del ligando al receptor se inhibe. Ensayos de separación por exclusión adicionales para agonistas y antagonistas de la presente invención, se describen en Tartaglia, L. A. y Goeddel, D. V. J. Biol. Chem. 267(7) :4304-4307 (1992) . De esta manera, en un aspecto adicional, se proporciona un método de separación por exclusión determinando si un agonista o antagonista candidato es capaz de aumentar o inhibir una respuesta -celular para un ligando de la familia TNF. El método involucra poner en contacto las células que expresan el polipéptido TNFR con un compuesto candidato y un ligando de la familia TNF, evaluando una respuesta celular, y comparando la respuesta celular para una respuesta celular estándar, el estándar siendo evaluado cuando se hace contacto con el ligando en ausencia del compuesto candidato, por lo cual una respuesta celular incrementada sobre el estándar indica que el compuesto candidato es un agonista de la vía de señalización ligando/receptor y una respuesta celular reducida comparada con el estándar indica que el compuesto candidato es un antagonista de la vía de señalización ligando/receptor. Por "evaluar una respuesta celular" se entiende medir cualitativamente o cuantitativamente una respuesta celular para un compuesto candidato y/o un ligando de la familia TNF (por ejemplo, determinando o estimando un incremento o reducción en la proliferación de células T o etiquetado de timidina titulada) . Por la invención, una célula que expresa el polipéptido TNFR puede ponerse en contacto ya sea con un ligando de la familia TNF administrado endógena o exógenament e . El agonista de conformidad con la presente invención incluye compuestos que ocurren naturalmente y sintéticos tales como, por ejemplo, fragmentos de péptido de ligando de la familia TNF, factor' de crecimiento transformante, neurotransmisores (tal como glutamato, dopamina, N-metil-D-aspartato) , supresores de tumor (p53), células T citoliticas y antimetabolitos. Los agonistas preferidos incluyen medicamentos quimioterapéuticos tales como, por ejemplo, cisplatina, doxorubicina , . bleomicina, citosina arabinosida, mostaza de nitrógeno, metotrexato y vincristina. Otros incluyen etanol y amiloide péptido (Science 267:1457-1458 (1995)) . Agonistas preferidos adicionales incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales levantados contra el polipéptido TNFR, o un fragmento del mismo. Tales anticuerpos agonistas levantados contra una receptor de la familia TNF se describen en Tartaglia, L. A., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:9292-9296 (1991); y Tartablia, L. A., y Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267 (7 ) : 304-4307 (1992) . Ver, también, solicitud internacional número de publicación WO 94/09137. Los antagonistas de conformidad con la presente invención incluyen compuestos que ocurren naturalmente y sintéticos tales como, por ejemplo, el ligando CD40, aminoácidos neutrales, zinc, estrógeno, andrógenos, genes virales (tales como Adenovirus A1B, Baculovirus p35 e IAP, virus de vacuna crmA, virus Epstein-Barr BHRFI, LMP-1, virus de la fiebre del cerdo africano LMW5-HL, y virus del herpes yl 34.5), inhibidores de calpaina, inhibidores de cisteina proteasas, y promotores de tumor (tales como PMA, Fenobarni t al , y -Hexaclorociclohexano) . Otros antagonistas incluyen antagonistas policlonales y monoclonales presentados contra los polipéptidos TNFR o un fragmento de los mismos. Tales anticuerpos antagonistas presentados contra un receptor de la familia TNF se describen en Tartaglia, L. A. y Goeddel, D. V., J. Biol. Chem. 267 ( 7 ) : 4304 - 4307 (1992) y Tartaglia, L. A. y colaboradores 73:213-216 (1993) . Ver también, solicitud internacional número de publicación WO 94/09137. En modalidades especificas, los antagonistas de conformidad con la presente invención son ácidos nucleicos que corresponden a las secuencias contenidas en TNFR, o la hebra complementaria de las mismas, y/o secuencias nucleótidas que están contenidas en los clones depositados (Depósitos ATCC Nos. 97810 y 97809) . En una modalidad, la secuencia anti-sentido se genera internamente por el organismo, en otra modalidad, la secuencia anti-sentido se administra separadamente (ver, por ejemplo, O'Connor, J. , Neurochem. 56:560 (1991) y Oligodeoxinucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) . La tecnología anti-sentido puede usarse para controlar la expresión del gen a través del ADN o ARN anti-sentido, o a través de la formación de una hélice triple. Las técnicas anti-sentido se discuten por ejemplo, en Okano, J., Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxinucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988) . La formación de hélice triple se discute en, por ejemplo, Lee y colaboradores, Nucleic Acids Research 6:3073 (1979); Cooney y colaboradores, Science 241:456 (1988); y Dervan y colaboradores, Science 251:1300 (1991) . Los métodos se basan en el enlace de un polinucleót ido a un ADN o ARN complementario.
Por ejemplo, la porción codificadora 5' de un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la presente invención puede usarse para diseñar un oligonucleótido ARN anti-sentido desde alrededor de 10 hasta 40 pares base en longitud. Se diseña un oligonucleótido ADN para ser complementario a una región del gen involucrado en la transcripción, por lo cual se evita la transc ipción y la producción del receptor. El oligonucleótido ARN anti-sentido hibridiza el mARN in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mARN en el polipéptido receptor. En una modalidad, el ácido nucleico antisentido de T FR de la invención se produce intracelularmente por la transcripción de una secuencia exógena . Por ejemplo, un vector o una porción del mismo, se transcribe, produciendo el ácido nucleico anti-sentido (ARN) de la invención. Tal vector deberá contener una secuencia que codifica el ácido nucleico anti-sentido TNFR. Tal vector puede quedarse como episomal o volverse cromosómicamente integrado, mientras que se transcribe para producir el ARN anti-sentido deseado. Tales vectores pueden construirse por métodos de tecnología de ADN recombinante estándar en el arte. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, u otros conocidos en el arte, usados para la replicación y expresión en células vertebradas. La expresión de la secuencia que codifica el TNFR, o fragmentos de la misma, puede ser por cualquier promotor conocido en el arte para actuar en las células vertebradas, preferiblemente de humanos. Tales promotores pueden ser inductores o constitutivos. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a, la región promotora temprana SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 29:304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal de longitud 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto y colaboradores, Cell 22:787-797 (1980), el promotor de timidina de herpes (Wagner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981), las secuencias regulatorias del gen de metalotioneina (Brinster, y colaboradores, Nature 296:39-42 (1982)), etc. Los ácidos nucleicos anti-sentido de la invención comprenden una secuencia complementaria para al menos una porción de un ARN transcripto de un gen de TNFR. Sin embargo, no se requiere, aunque es preferido, absolutamente complementario. Una secuencia "complementaria para al menos una porción del ARN", referida en la presente, significa una secuencia que tiene suficiente capacidad complementaria para ser capaz de hibridizarse con el ARN, formando un doble •estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido TNFR de doble hebra, una hebra simple del ADN doble puede de esta manera probarse, o una formación triple puede evaluarse. La capacidad para hibrizarse depende tanto del grado de capacidad complementaria como de la longitud del ácido nucleico ant i-sentido . Generalmente, entre mayor sea el tamaño del ácido nucleico hibridizado, mayor es el desacoplamiento que puede contener un ARN de TNFR y todavía formar un doble estable (o triple, como sea el caso) . Alguien con habilidad en el arte puede comprobar un grado tolerable de des-acoplamiento usando procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridizado. Los oligonucleót idos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia no traducida 5' y que incluye el codón de iniciación AUG, deberán trabajar más eficientemente al inhibir la traducción. Sin embargo, las secuencias complementarias a las secuencias no traducidas 3' de los mARN se han mostrado que son efectivas para inhibir la traducción de los mARN . Ver generalmente, Wagner, R., Nature 372:333-335 (1994) . De esta manera, los oligonucleótidos complementarios para las regiones no codificadas, no traducidas, tanto 5' como 3' del TNFR mostradas en las Figuras 1 y 2 pueden usarse en un enfoque anti-sentido para inhibir la traducción del mARN endógeno del TNFR. Los oligonucleótidos complementarios a la región no traducida 5' del mARN deberán incluir el complemento del codón de inicio AUG. Los oligonucleótidos anti-sentido complementario a las regiones que codifican el mARN son inhibidores menos eficientes de la traducción pero pueden usarse de conformidad con la invención. Si se diseñan para hibridizar la región 5', 3' o codificadora del mARN del TNFR, los ácidos nucleicos anti-sentido deberán ser de al menos seis nucleótidos de largo, y son preferiblemente oligonucleótidos en el rango desde 6 hasta alrededor de 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleót ido es de al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 24 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos.
Los pol inucleót idos de la invención pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, de hebra simple o de hebra, doble. El oligonucleót ido puede modificarse en la porción base, porción de azúcar, o fosfato de columna, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, hibr idi zación , etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos adjuntos tales como péptidos (por ejemplo, para receptores de células huésped objetivo in vivo), o agentes para facilitar el transporte a través de la membrana de célula (ver, por ejemplo, Letsinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6553-6556 (1989); Lemaitre y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. 84:648-652 (1987); Publicación PCT No. WO 88/09810, publicada el 15 de Diciembre de 1988) o la barrera sangre-cerebro (ver, por ejemplo, Publicación PCT No. WO 89/10134, publicada el 25 de Abril, 1988), agentes de partición de accionamiento de hibridización . (Ver, por ejemplo, Krol y colaboradores, BioTechniques 6:958-976 (1988)) o agentes intercalantes. (Ver, por ejemplo, Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988)) . En este punto, el oligonuleótido puede conjugarse para otra molécula, por ejemplo, un péptido, agente reticulante de accionamiento de hibridi zación, agente de transporte, agente de desdoblamiento activador de la hibridación, etc. El oligonucleótido anti-sentido puede comprender al menos una porción base modificada que se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, . 5-f luorouracilo, 5 -br omourac i 1 o , 5- clorouracilo, 5-yodour aci 1 o , hipoxantina, xantina, 4- acetilcitosina, 5 - ( ca rbo ihidroximet i 1) uracilo, - carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5 - carboximet i laminóme ti luraci lo , dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopent eni ladenina , 1-metilguanina , 1-metilinosina , 2 , 2 -dime t i 1 guanina , 2 -me t i 1 adenina , 2 -met i lguanina , 3 -me t i le i t o s ina , 5 -me t i 1 c i t ocina , N6-adenina, 7 -met i lguanina , 5-metilaminometiluracilo, 5 -me t oxi aminome t i 1 -2 -tiouracilo, beta-D-manosilqueosina , 5-metoxicarboximetiluracilo, 5 -met oxiuraci lo , 2-me ti lt io-N 6- i sopent eni 1 adenina , ácido uracil-5-oxiacético (v), wibut oxo s i na , pseudouraci lo , queosina, 2 - 1 i oci t o s ina , 5 -me t i 1 - 2 - 1 i ouraci 1 o , 2-tiouracilo, 4 -tiouracilo, 5-met i lurac i lo , metiléster del ácido uracil-5-oxiacético , ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-me t i 1 -2 - 1 i ourac i 1 o , 3- ( 3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, y 2, 6-diaminopurina. El oligonucleót ido antisentido también puede comprender al menos una porción de azúcar modificada seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a, arabinosa, 2-f luoroarabinosa, xilulosa, y hexosa. Todavía en otra modalidad, el oligonucleót ido anti-sentido comprende al menos una columna de fosfato modificada seleccionada del grupo que incluye, pero no se limita a, fosforot ioato , un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fos foramidat o , un fo s fordi amida t o , un me t i 1 fos fonat o , un alquil fos fotrié s t er , y un formacetal o análogos de los mismos. Todavía en otra modalidad, el oligonucleótido anti-sentido es un oligonucleótido a-anomérico. Las formas de oligonucleótido a-anomérico específico de doble hebra que hibridiza con ARN complementario en la cual, contrario a las unidades ß usuales, las hebras corren en paralelo una a la otra (Gautier y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15:6625-6641 (1987)) . El oligonucleótido es un 2<z-0-metilribonucleótido (Inoue y colaboradores, Nucí. Acids Res. 15:6131- 6148 (1987)), o un análogo ARN-ADN quimérico (Inoue y colaboradores, FEBS Lett . 215:327-330 (1987) ) . Los polinucleótidos de la invención pueden sintetizarse por métodos estándar conocidos en el arte, por ejemplo, por el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como los comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.) . Como ejemplos, los ol igonucleót idos de f o s f o r ot i o at o pueden sintetizarse por el método de Stein y colaboradores, (Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988), oligonucleótidos de met ilf osfonato pueden prepararse por el uso de soportes de polímero de vidrio poroso controlado (sarin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:7448-7451 (1988), etc . Aunque los nucleótidos anti-sentido complementarios a la secuencia de la región codificante TNFR puede usarse, aquellos complementarios a la región no traducida transcrita son los más preferidos. Los antagonistas potenciales de conformidad con la invención también incluyen ARN catalítico, o una ribozima (Ver, por ejemplo, solicitud Internacional número de publicación WO 90/11364, publicada el 4 de Octubre de 1990; Sarver y colaboradores, Science 247:1222-1225 (1990) . Aunque las ribozimas que cortan el mARN en las secuencias de reconocimiento de sitio especifico pueden usarse para destruir los mARN de TNFR, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo desdoblan los mARN en los lugares dictados por las regiones de flanqueo que forman bases pares complementarias con el mARN objetivo. El único requerimiento es que el mARN objetivo tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3' . La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo es bien conocida en el arte y se describe más completamente en Haseloff y Gerlach, Nature 334:585-591 (1988) . Hay numerosos sitios de partición de ribozima de cabeza de martillo potencial dentro de la secuencia de nucleótido del TNFR-6 (Figura 1, SEQ ID NO.:l) y TNFR-ßß (Figura 2, SEQ ID NO.:3) . Preferiblemente, la ribozima se produce por ingeniería para que el sitio de reconocimiento de partición se localice cercano al extremo 5' del mARN de TNFR; esto es, para incrementar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcriptos de mARN no funcionales. Como en el enfoque ant i-sentido , las ribozimas de la invención pueden componerse de oligonucleót idos modificados (por ejemplo, mejorando la estabilidad, objetivo, etc.) y deberán entregar células que expresen el TNFR in vivo. Los constructos de ADN que codifican la ribozima pueden introducirse en la célula de la misma manera como se describe arriba para la introducción del ADN codificante a t i - s ent ido . Un método preferido de entrega involucra usar un constructo de ADN "que codifica" la ribozima bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, tal como, por ejemplo, promotor pol III ó pol II, para que transfecten células produciendo cantidades suficientes de la ribozima para destruir el mensajero TNFR endógeno e inhibir la traducción. Ya que las moléculas anti-sentido a diferencia de la ribozima, son catalíticas, se requiere una concentración intracelular inferior por eficiencia . La expresión del gen endógeno puede también reducirse inactivando o "haciendo agénico" el gen TNFR y/o su promotor usando recombinación homologa objetiva. (Por ejemplo, ver Smit ies y colaboradores, Nature 317:230-234 (1985); Thomas & Capecchi, Cell 51:503-512 (1987); Thompson y colaboradores, Cell 5:313-321 (1989); cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente completamente) . Por ejemplo, un mutante, polinucleótido no funcional de la invención (o una secuencia de ADN no relacionada completamente) flanqueada por ADN homólogo para la secuencia de polinucleótido endógeno (ya sea las regiones codificantes o regiones reguladoras del gen) pueden usarse, con o sin un marcador de selección y/o un marcador de selección negativo, para transfectar células que expresan los polipéptidos de la invención in vivo. En otra modalidad, se usan técnicas conocidas en el ar e para generar agénicos en las células que contienen, pero no expresan el gen de interés. La inserción del constructo de ADN, por medio de recombinación homologa objetivo, resulta en la inactivación del gen objetivo. Tales enfoques son particularmente apropiados en campos de investigación y agricultura donde pueden usarse modificaciones a las células madre embriónicas para generar progenie de animales con un gen objetivo inactivo (por ejemplo, ver Thomas & Capecchi 1987 y Thompson 1989, supra) . Sin embargo, este enfoque puede ser adaptado de manera rutinaria para usarse en humanos proporcionando constructos de ADN recombinante administrados directamente o dirigidos al sitio requerido in vivo usando vectores virales apropiados que serán aparentes para aquellos hábiles en el arte. Los contenidos de cada uno de los documentos recitados en este párrafo se incorporan en la presente para referencia completamente. Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por cualquiera de una variedad de métodos estándar usando inmunogenes de TNFR de la presente invención. Tales inmunogenes de TNFR incluyen la proteina TNFR mostrada en las Figuras 1 y 2 (SEQ ID NO . : 2 y SEQ ID N0.:4, respectivamente) (que puede o no incluir una secuencia líder) y fragmentos de polipéptido de TNFR que comprende el ligando de enlace y/o dominios extracelulares de TNFR. Los agonistas o antagonistas de anticuerpo policlonales o monoclonales de conformidad con la presente invención pueden elevarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente y/o conocidos en el arte, tal como, por ejemplo, aquellos métodos descritos en Tartaglia y Goeddel, J. Biol. Chem. 267 (7 ) : 4304-4307 (1992) ; Tartaglia y colaboradores, Cell 73:213-216 (1993), y solicitud internacional publicación número WO 94/09137 (el contenido de estas tres solicitudes se incorpora en la presente para referencia completamente) , y son preferiblemente específicos a los polipéptidos de la invención que tienen la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO.:2 y/o SEQ ID NO.:4. Los anticuerpos de conformidad con la presente invención pueden prepararse por cualquiera de una variedad de métodos descritos en la presente, y conocidos en el arte. Antagonistas adicionales de la presente invención incluyen formas solubles de TNFR, por ejemplo fragmentos de TNFR que incluyen el dominio de enlace del ligando de la región extracelular del receptor de longitud completa. Tales formas solubles del receptor, que pueden presentarse naturalmente o sintéticas, antagonizan la señalización mediada por el TNFR al competir con el TNFR de la superficie de célula para enlazarse a ligandos de la familia TNF y/o antagonizar la inhibición mediada por el TNFR de la apoptosis, por ejemplo, rompiendo la habilidad del TNFR para multimerizar y/o enlazar y por lo cual neutralizar la apoptosis inducida por ligandos, tales como, por ejemplo, ligando Fas y AIM-II. De esta manera, las formas solubles del receptor que incluyen el dominio de enlace del ligando son citosinas novedosas capaces de reducir la inhibición mediada por TNFR de la necrosis de tumor inducida por los ligandos de la familia TNF. Oras de estas citosinas se conocen en el arte e incluyen Fas B (una forma soluble del receptor Fas de ratón) que actúa fisiológicamente para limitar la apoptosis inducida por el ligando Fas (Hughes, D. P. y Crispe, I. N . , J. Exp. Med. 182:1395-1401 (1995) ) . Las proteínas y otros compuestos que enlazan el dominio extracelular también son agonistas y antagonistas candidatos de conformidad con la presente invención. Tales compuestos de enlace pueden "capturarse" usando el sistema de dos híbridos de levadura (Fields y Sing, Nature 340:245-246 (1989)) . Una versión modificada del sistema de dos híbridos de levadura se ha descrito por Roger Brent y sus colegas (Gyuris, J. y colaboradores, Cell 75:791-803 (1993); Zervos, A. S. y colaboradores, Cell 72:223-232 (1993) ) . 8 Por un "ligando de la familia TNF" se entiende ligandos que ocurren naturalmente, recombinantes , y sintéticos que son capaces de enlazarse a una membrana de la familia del receptor TNF y que inducen la via de señalización 1 igando /receptor . Los miembros de la familia del ligando TNF incluyen, pero no se limitan a, ligandos TNFR- 6a y -6ß, TNF-a, 1 infotoxina-a (LT-a, también conocida como TNF-ß), LT-ß, FasL, CD40, CD27, CD30, 4-IBB, OX40, TRAIL, AIM-II, y factor del crecimiento del nervio (NGF) . Formulación y administración. La composición de polipéptido TNFR puede formularse y dosificarse de una manera consistente con la buena práctica médica, tomando en cuenta la condición clínica del paciente individual (especialmente los efectos laterales del tratamiento con polipéptido TNFR-6cc o TNFR- 6ß solamente), el sitio de entrega de la composición de polipéptido TNFR, el método de administración, el horario de administración, y otros factores conocidos por los practicantes. La "cantidad efectiva" del polipéptido TNFR para' los propósitos de la presente se determina de esta manera por tales consideraciones.
Como una propuesta general, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del polipéptido TNFR administrada parenteralmente por dosis estará en el rango desde alrededor de 1 µg/kg/día del peso corporal del paciente, no obstante, como se nota arriba, esto estará sujeto a la discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 0.01 mg/kg/dia, y más preferiblemente para humanos entre alrededor de 0.01 y 1 mg/kg/dia para la hormona. Si se da continuamente, el polipéptido TNFR se administra típicamente a una relación de dosis de alrededor de 1 µg/kg/hora hasta alrededor de 50 µg/kg/hora, ya sea por 1-4 inyección por día o por infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una mini-bomba. También puede emplearse una solución de bolsa intravenosa. La duración del tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo después del tratamiento para que ocurran las respuestas, parece variar dependiendo del efecto deseado. Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención para administrarse pueden determinarse a través de procedimientos bien conocidos por aquellos en el arte que dirigen tales parámetros como vida media biológica, biodisponibilidad, y toxicidad. Tal determinación está dentro de la capacidad de aquellos habilidosos en el arte, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en la presente . La bioexpos ición de un organismo al polipéptido TNFR- 6a o TNFR-ßß durante la terapia, puede también jugar un papel importante para determinar un régimen de dosis terapéuticamente y farmacológicamente efectivo. Las variaciones de las dosis tales como administraciones repetidas de una dosis relativamente baja del polipéptido TNFR-6a o TNFR-dß por un periodo relativamente largo de tiempo, puede tener un efecto que es terapéuticamente y/o farmacológicamente distinguible del que se alcanza con admin straciones repetidas de una dosis relativamente alta del polipéptido TNFR-6a o -6ß durante un periodo de tiempo relativamente corto. Usando los factores de conversión de dosis de área superficial equivalente suministrados por Freireich, E. J., y colaboradores (Cáncer Chemotherapy Reports 50(4) :219-44 (1966) ), alguien con habilidad ordinaria en el arte es capaz de convertir convenientemente los datos obtenidos del uso del polipéptido TNFR-6a o -ßß en un sistema experimental dado, sobre una estimación precisa de una cantidad farmacéuticamente efectiva del polipéptido TNFR- 6a o -6ß a administrarse por dosis en otro sistema experimental. Los datos experimentales obtenidos a través de la administración del polipéptido TNFR6-Fc en ratones (ver, por ejemplo, Ejemplo 21) pueden convertirse por los factores de conversión suministrados por Freireich, y colaboradores, para estimar de manera precisa las dosis farmacéuticamente efectivas del TNFR-6 en ratas, monos, perros, y humanos. La siguiente tabla de conversión (Tabla IB) es un resumen de los datos proporcionados por Freireich, y colaboradores. La Tabla IV proporciona factores aproximados para convertir dosis expresadas en términos de mg/kg de una especie a una dosis de área de superficie equivalente expresada como mg/kg en otra especie tabulada.
- Tabla IV. Factores de Conversión de Dosis de Área Superficial Equivalente. PARA Ratón Rata Mono Perro Humano --DE-- (20g) (150g) (3.5kg) (8kg) ( 60kg) Ra t ón 1 1/2 1/4 1/6 1/12 Rata 2 1 1/2 1/4 1/7 Mono 4 2 1 3/5 1/3 Perro 6 4 5/3 1 1/2 Humano 12 7 3 2 1 De esta manera, por ejemplo, usando los factores de conversión proporcionados en la Tabla IV, una dosis de 50 mg/kg en el ratón se convierte a una dosis apropiada de 12.5 mg/kg en el mono debido a (50 mg/kg) x ( 1/4 ) =12. 5 mg/kg. Como un ejemplo adicional, dosis de 0.02, 0.08, 2, y 8 mg/kg en el ratón, igualan el efecto de dosis de 1.667 microgramos/kg, 6.67 microgramos/kg, 66.7 microgramos/kg, 166.7 microgramos/kg, y 0.667 mg/kg, respecti amente, en el humano. Los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención pueden administrarse usando cualquier método conocido en el arte, incluyendo, pero no limitándose a, inyección de aguja directa en el sitio de entrega, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores biolisticos, aceleradores de partícula, depósito de esponja con espuma de gel, otros materiales de depósito comercialment e disponibles, bombas osmóticas, o formulaciones farmacéuticas sólidas para supositorio, aplicaciones de decantación o tópicas durante la cirugía, entregas en aerosol. Tales métodos se conocen en el arte. Los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención pueden administrarse como parte de una composición farmacéutica, descrita en más detalle a continuación. Los métodos de entrega de los polinucleótidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención se conocen en el arte y se describen en más detalle en la presente. Las composiciones farmacéuticas que contienen el TNFR de la invención pueden administrarse oralmente, rectalmente, parent eralmente , i nt ra s i s t émicament e , intravaginalmente , intraperitonalmente, localmente (como por polvos, ungüentos, gotas o parches transdermales ) , bucalmente, o como un atomizador oral o nasal. Por "portador farmacéuticamente aceptable" significa un sólido no tóxico, semisólido o relleno líquido, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsif icantes , o agentes amortiguadores del pH . Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. El término "parenteral" como se usa en la presente, se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, int raperitoneal , int raesternal , subcutánea e int raart icular . El polipéptido TNFR es también apropiado para administrarse por sistemas de liberación sostenida. Ejemplos de composición de liberación sostenida incluyen materiales poliméricos apropiados (tales como, por ejemplo, matrices de polímero semi-permeable en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas ) , materiales hidrofóbicos apropiados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, y derivados poco solubles (tales como, por ejemplo, una sal poco soluble) .
Las matrices de liberación sostenida incluyen polilacturos (Patente U.S. No. 3,773,919, EP 58,481), copolimeros de ácido L-glutámico y gamma- etil-L-glutamato (Sidman, U. y colaboradores, Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli ( 2 -hidrox iet i 1 metacrilato ) (R. Langer y colaboradores, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) , y R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), acetato de etilen vinilo (R. Langer y colaboradores, Id.) o ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutí rico (EP 133,988) . Las composiciones de liberación sostenida también incluyen composiciones entrampadas liposomáticamente de la invención (ver, generalmente, Langer, Science 249:1527-1533 (1990) ; Treta y colaboradores, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein y Fidler (editores), Liss, Nueva York, páginas 317-327 y 353-365 (1989)) . Las liposomas que contienen los polipéptidos TNFR pueden prepararse por métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Epstein y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes U.S. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; Y EP 102,324.
Ordinariamente, las liposomas son del tipo unilamelar pequeño (alrededor de 200-800 Angstroms) en las cuales el contenido de lipido es mayor que alrededor de 30 mol por ciento de colesterol, la proporción seleccionada se ajusta para la terapia de polipéptido de TNFR óptima. Todavía en una modalidad adicional, las composiciones de la invención se entregan por medio de una bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987) : Buchwald y colaboradores, Surgery 88:507 (1980); Saudek y colaboradores, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989) ) . Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (Science 249: 1527-1533 ( 1990) ) . Para administración parenteral, en una modalidad, el polipéptido TNFR se formula generalmente para mezclarse en el grado deseado de pureza, en una forma inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión, o emulsión), con un portador farmacéuticamente aceptable, esto es, uno que no es tóxico a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que son conocidos por ser perjudiciales a los pol ipépt idos . Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto el polipéptido TNFR uniformemente e intimamente con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos. Entonces, si es necesario, el producto se forma en la formulación deseada. Preferiblemente, el portador es un portador parenteral, más preferiblemente, una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos tales como aceites fijados y oleato de etilo, también son útiles en la presente, como liposomas. El portador apropiado contiene cantidades menores de aditivos tales como sustancias que aumentan la isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales no son tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; los antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos dé bajo peso molecular (menos de alrededor de diez residuos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como mannitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; y/o agentes tensoactivos no iónicos tales como polisorbato, poloxámeros, o PEG. El polipéptido de TNFR se formula típicamente en tales vehículos a una concentración de alrededor de 0.1 mg/ml hasta 100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH de alrededor de 3 hasta 8. Se entenderá que el uso de ciertos de los excipientes, portadores, o estabilizantes anteriormente mencionados resultará en la formación de sales de polipéptido de TNFR.
Los polipéptidos de TNFR para usarse para administración terapéutica deben ser estériles. La esterilidad se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0.2 micrones) . Las composiciones de polipéptido de TNFR terapéuticas se colocan en un recipiente que tiene una puerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene una parte que detiene penetrante por una aguja de inyección hipodérmica . Los polipéptidos TNFR ordinariamente se almacenan en recipientes de dosis unitaria o múltiple, por ejemplo, ampolletas selladas o frascos pequeños, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para su reconstrucción. Como un ejemplo de una formulación liofilizada, frascos pequeños de 10 mi se rellenan con 5 mi de solución de polipéptido TNFR acuosa al 1% (p/v) filtrada estéril, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo el polipéptido TNFR liofilizado usando agua bacterios tática para inyección. La invención también proporciona un paquete o estuche farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado con tales recipientes, puede estar una notificación en la forma prescrita por la agencia del gobierno que regula la manufactura, uso o venta de los farmacéuticos o productos biológicos, cuya notificación refleje la aprobación por la agencia de la manufactura, uso o venta para administración humana. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse en conjunto con otros compuestos terapéuticos . Las composiciones de la invención pueden administrarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos, incluyendo pero no limitándose a, agentes quimiot e rapéut i eos , agentes anti-oportunistas de la infección, antivirales, antibióticos, anti-inflamatorios esteroidales y no esteroidales , inmunodepresores , agentes inmunoterapéut icos convencionales y citosinas. Las combinaciones pueden administrarse ya sea en conjunto, por ejemplo como una mezcla, separadamente pero simultáneamente o concurrentemente; o secuencialmente . Esto incluye presentaciones en las cuales los agentes combinados se administran junto con una mezcla terapéutica, y también procede en que los agentes combinados se administran de manera separada pero simultáneamente, por ejemplo, como a través de lineas intravenosas separadas en el mismo individuo. La administración "en combinación" incluye además, la administración separada de uno de los compuestos o agentes dados primero, seguido por el segundo. En una modalidad, las composiciones de la invención se administran en combinación con otros miembros de la familia TNF. Las moléculas TNF, relacionadas con TNF o similares a TNF que pueden administrarse con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, formas solubles de TNF-alfa, linfotoxina-alfa (LT-alfa, también conocida como TNF-beta), LT-betá (encontrado en el complejo heterotrimero LT-alfa2-beta), OPGL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-IBBL, DcR3, OX40L, TNF-gamma (solicitud internacional publicación número WO 96/14328), AIM-I (solicitud internacional publicación número WO 97/33899), AIM-II (solicitud internacional publicación número WO 97/34911), APRIL (J. Exp . Med. 188(6) :1185-1190), endocina-al fa (solicitud internacional publicación número WO 98/07880), OPG, y neut rocina-alfa (solicitud internacional publicación número WO 98/18921), TWEAK, OX40, y factor del crecimiento del nervio (NGF) , y formas solubles de Fas, CD30, CD27, CD40 y 4-IBB, TR2 (solicitud internacional publicación número WO 96/34095), DR3 (solicitud internacional publicación número WO 97/33904), DR4 (solicitud internacional publicación número WO 98/32856), TR5 (solicitud internacional publicación número WO 98/30693), TR7 (solicitud internacional publicación número WO 98/41629), TRANK, TR9 (solicitud internacional publicación número WO 98/56892) , TRIO (solicitud internacional publicación número WO 98/54202), 312C2 (solicitud internacional publicación número WO 98/06842) , y TR12. Los agentes inmunodepresores no específicos convencionales, que pueden administrarse en combinación con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, esferoides, ciclospor ina , análogos de ciclosporina , ciclofosfamida metilprednisona, prednisona, azatioprina, FK-506, 15 -deoxi spergual ina , y otros agentes inmunodepresores que actúan suprimiendo la función de las células T de respuesta. En modalidades especificas, las composiciones de la invención se administran en combinación con inmunodepresores. Las preparaciones de inmunodepresores que pueden administrarse con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, ORTHOCLONE® (0KT3), SANDIMMUNE®/NEORAL®/ SANGDYA® ciclospor ina ) , PROGRAF® ( tacrolimus ) , CELLCEPT® (micofenolato ) , azatioprina, glucocorticosteroides, y RAPAMUNE® sirolimus) . En una modalidad especifica, los inmunosupresores pueden usarse para prevenir el rechazo de un transplante de órgano o de médula espinal . En ciertas modalidades, las composiciones de la invención se administran en combinación con agentes antiretrovirales , inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa, inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos, y/o inhibidores de la proteasa. Los inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa que pueden administrarse en combinación con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, RETROVIR® ( zidovudina/AZT) , VIDEX® (didanosina/ddl) , HIVID® ( zalcitabina/ddC ) , ZERIT® (estavudina/d4T) , EPIVIR® ( lamivudina/ 3TC ) , y CONBIVIR® ( zidovudina/lamivudina ) . Los inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos que pueden administrarse en combinación con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, VIRAMUNE® ( e i rapiña ) , RESCRIPTOR® ( delavirdina ) , y SUSTIVA® (efavirenz) . Los inhibidores de la proteasa que pueden administrarse en combinación con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, CRIXIVAN® (indinavir), NORVIR® (ritonavir), INVIRASA® ( saquinavir) , y VIRACEPT® (NELFINAVIR) . En una modalidad especifica, los agentes anti-ret rovirales , inhibidores de la transcriptasa inversa nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos, y/o inhibidores de la proteasa, pueden usarse en cualquier combinación con composiciones de la invención para tratar el SIDA y/o prevenir o tratar la infección con VIH. En otras modalidades, las composiciones de la invención pueden administrarse en combinación con agentes ant i-oportunistas de infección. Los agentes anti-oportunistas de infección que pueden administrarse en combinación con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, TRIMETHOPRIM- SULFAMETHOXAZOLE®, DAPSONE®, PEN AMI DI E®, ATOVAQUINE®, ISONIAZID®, RIFAMPIN®, PYRAZ I AMI DE®, ETHAMBUTOL®, RIFABUTIN®, CLARITHROMYCIN®, ' AZ I THROMYC IN®, GANCICLOVIR®, FOSCARNET®, CIDOFOVIR®, FLUCONAZOLE®, ITRACONAZOLE®, KETOCONAZ OLE®, ACYCLOVIR®, FAMCICOLVIR®, PYRIMETHAMINE®, LEUCOVORIN®, NEUPOGEN® ( fi lgra s t ima /G-C S F ) , y LEUKINE® (sargramistima/GM-CSF) . En una modalidad especifica, las composiciones de la invención se usan en cualquier combinación con TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE®, DAPSONE®, PENTAMI DI E®, y/o ATOVAQUONE® para tratar o prevenir profilácticamente una infección de neumonía por Pneumocystis carinii . En otra modalidad específica, las composiciones de la invención se usan en cualquier combinación con ISONIAZID®, RIFAMPIN®, PYRAZ INAMI DE®, y/o ETHAMBUTOL® para tratar o prevenir profilácticamente una infección por complejo Mycobacterium avium oportunista. En otra modalidad específica, las composiciones de la invención se usan en cualquier combinación con RIFABUTIN®, CLARITHROMYCIN®, y/o AZ I THROMYC I ® para tratar o prevenir profilácticamente una infección por Mycobacterium tuberculosis oportunista. En otra modalidad especifica, las composiciones de la invención se usan en cualquier combinación con GANCICLOVIR®, FOSCARNET®, y/o CIDOFOVIR® para tratar o prevenir profilácticamente una infección por ci tomegalovirus oportunista. En otra modalidad especifica, las composiciones de la invención se usan en cualquier combinación con FLUCONAZOLE®, ITRACONAZOLE®, y/o KETOCONAZ OLE® para tratar o prevenir profilácticamente una infección de hongos. En otra modalidad especifica, las composiciones de la invención se usan en cualquier combinación con ACYCLOVIR® y/o FAMC I COLVI R® para tratar o prevenir profilácticamente una infección por virus del herpes simples del tipo I y/o del tipo II. En otra modalidad especifica, las composiciones de la invención se usan en cualquier combinación con PYRIMETHAMINE® y/o LEUCOVORIN® para tratar o prevenir profilácticamente una infección por Toxoplasma gondii oportunista. En otra modalidad especifica, las composiciones de la invención se usan en cualquier combinación con LEUCOVORIN® y/o NEUPOGEN® para tratar o prevenir profilácticamente una infección por bacterias oportunista. En una modalidad adicional, las composiciones de la invención se administran en combinación con un agente antiviral. Los agentes antivirales que pueden administrarse con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, acilovir, ribavirina, amantadina, y remantidina. En una modalidad adicional, las composiciones de la invención se administran en combinación con un agente antibiótico. Los agentes antibióticos que pueden administrarse con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, amoxicilina, aminoglicosidas, beta-lactamo ( glicopéptido ) , bet a-lactamasa , clindamicina , cloranf enicol , cef alospor inas , ciprofloxacina , ciprof loxacina , e t i t romi ciña , f luoroquinolonas , macrolidas , metronidazol , penicilinas, quinolonas, rifampina, estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, t rimetorpima , trimetoprima-sul fantoxa zol , y vancomicina. En una modalidad adicional, las composiciones de la invención se administran solas o en combinación con un agente ant i-inflamatorio . Los agentes anti-inf lamatorios que pueden administrarse con las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, glucocort icoides y los anti-inf lamatorios no es teroidales , derivados de ácido aminoarilcarboxilico, derivados del ácido arilacético, derivados del ácido a r i lbut í r i co , ácidos arilcarboxilicos , derivados del ácido arilpropiónico, pirazoles, pirazolonas, derivados del ácido salicilico, t i a z inecarboxamidas , ácido e-acetamidocapróico, S - adenos i lme t ioni a , ácido 3-amino-4-hidroxibutirico, amixet riña , bendazac, bencidamina, bucoloma, di fenpiramida , ditazol, emorfazona, guaiazuleno, nabumetona, nimesulida, orgoteina, oxaceprol, paranilina, perisoxal, pifoxime, proquazona, proxazol, y tenidap. En otra modalidad, las composiciones de la invención se administran en combinación con un agente quimioterapéut ico . Los agentes quimiot erapéut icos que pueden administrarse con las composiciones de la invención incluye, pero no se limitan a, derivados de antibióticos (por ejemplo doxorubicina , bleomicina, daunorubicina , y dact inomicina ) ; ant iestrógenos (por ejemplo, tamoxifen); antemetanolitos (por ejemplo, fluoroacil, 5-FU, metotrexato, floxuridina, interferon alfa-2b, ácido glutámico, plicamicina, mercapt opur ina , y 6-t ioguanina ) ; agentes citotóxicos (por ejemplo, carmustina, BCNU, lomustina, CCNU, citosina arabinosa, ciclofosfamida, est ramust ina , hidroxiurea, procarba zina , mitomicina , busulfan, cis-platina, y sulfato de vincristina ) ; hormonas (por ejemplo, medroxiprogesterona, estramustina de fosfato de sodio, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, metiltestosterona, dietilstilbestrol difosfato, ciorotrianiseno, y testolactona); derivados de mostaza de nitrógeno (por ejemplo, mefaleno, corambucilo, mecloretamina (mostaza de nitrógeno) y tiotepa); esteroides y combinaciones (por ejemplo, fosfato de betametasona de sodio); Y otras (por ejemplo, dicarbazina, a spar ag ina sa , mitotano, sulfato de vincristina, y etoposido) . En una modalidad especifica, las composiciones de la invención se administran en combinación con CHOP ( ciclofosf amida, doxoribucina , vincristina y prednisona) o cualquier combinación de los componentes de CHOP. En otra modalidad, las composiciones de la invención se administran en combinación con Rituximab. En una modalidad adicional, las composiciones de la invención se administran con Rituximab y CHOP, o Rituximab o cualquier combinación de los componentes de CHOP. En la modalidad adicional, las composiciones de la invención se administran en combinación con citosinas. Las citosinas que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen pero no se limitan a GM-CSF, G-CSF, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD40, CD40L, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, TNF-alfa y TNF-beta. En otra modalidad, las, composiciones de la invención se pueden administrar con cualquier interleucina , incluyendo pero no limitándose a IL-lalfa, IL-lbeta, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20 y IL21. En una modalidad preferida, las composiciones de la invención se administran en combinación con TNF-alfa. En otra modalidad preferida, las composiciones de la invención se administran en combinación con IFN-alfa. En una modalidad adicional, las composiciones de la invención se administran en combinación con proteínas angiogénicas . Las proteínas angiogénicas que se pueden administrar con las composiciones de la invención incluyen pero no se limitan a, factor de crecimiento derivado del Glioma (GDGF) como se describe en la patente número EP-399816; factor A de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-A) , como se describe en la patente europea número EP-682110; factor B de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-B),' como se describe en la patente europea número EP-282317; factor de crecimiento de placenta (PIGF), como se describe en la publicación internacional número O 92/06194; factor 2 de crecimiento de placenta (PIGF-2) como se describe en Hauser et al., Gorwth Factors, 4:259-268 (1993); factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como se describe en la publicación internacional número WO 90/13649; factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) como se describe en la patente europea número EP-506477; factor 2 de crecimiento endotelial vascular (VEGF-2) como se describe en la publicación internacional número WO 96/39515; factor B-186 de crecimiento endotelial vascular (VEGF-B186) como se describe en la publicación internacional número WO. 96/26736; factor D de crecimiento endotelial vascular (VEGF-D) como se describe en la publicación internacional número WO 98/02543; factor D de crecimiento endotelial vascular (VEGF- D) como se describe en la publicación internacional número WO 98/07832; y factor E de crecimiento endotelial vascular (VEGF-E), como se describe en la patente alemana número DE 19639601. Las referencias arriba mencionadas se incorporan aquí como referencia. En una modalidad adicional, las composiciones de la invención se administran en combinación con factores de crecimiento de fibroblastos. Los factores de crecimiento de fibroblastos que se pueden administrar con las composi iones de la invención incluyen pero no se limitan a FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8 , FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 y FGF-15. En modalidades adicionales, las composiciones de la invención se administran en combinación con otros regímenes terapéuticos o profilácticos tales como por ejemplo terapia de radiación. Ensayos de cromosomas Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia se ataca específicamente y se puede hibridizar con una ubicación particular sobre un cromosoma humano individual. Más aún, existe una necesidad actual para identificar sitios particulares en el cromosoma. Pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en los datos actuales de secuencia (polimorfismos de repetición) están disponibles actualmente para marcar la ubicación cromosomal. El mapeo de los ADN a cromosomas según la presente invención, es el primer paso importante para correlacionar esas secuencias con los genes asociados con la enfermedad. En ciertas modalidades preferidas a este respecto, los cADN aquí descritos se usan para clonar el ADN genómico de un gen de proteina TNFR. Esto se puede llevar a cabo usando una diversidad de técnicas bien conocidas y colecciones, que están generalmente disponibles comercialmente . El ADN genómico se usa después para un mapeo de cromosomas in situ usando técnicas bien conocidas para este propósito. Además en algunos casos, se pueden mapear las secuencias para cromosomas al preparar los cebadores PCR (preferiblemente de 15 a 25 pares bases) del cADN . El análisis por computadora de la región 3' no traducida del gen, se usa para seleccionar rápidamente cebadores que no tienen una extensión de más de un exon en el ADN genómico, complicando asi el proceso de amplificación. Estos cebadores se usan después para selección por exclusión de PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. La hibridación por fluorescencia in situ ("FISH") de un clon de cADN a una distribución cromosomal de metafase, se puede usar para proporcionar una ubicación cromosomal precisa en una etapa. Esta técnica se puede usar con sondas a partir del cADN tan corto como 50 o 60 bp . Para una revisión de esta técnica ver Verma et al., Human Chromosomes : A Manual Of Basic Techniques, Pergamon Pess, New York (1988) . Una vez que se ha mapeado una secuencia hasta una ubicación cromosomal precisa, la posición física de la secuencia del cromosoma se puede correlacionar con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran por ejemplo en V. McKusick, Mendelian Inheritance In Man, disponible en línea a través de la Johns Hopkins University, elch Medical Library. La relación entre los genes y las enfermedades que han sido mapeadas para la misma región cromosomal, se identifican después a través de un análisis de uniones (co-herencia de genes físicamente adyacentes) . Después es necesario determinar las diferencias en el cADN o la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa . una mutación en algunos o todos los individuos afectados, pero no en individuos normales, entonces la mutación es probable que sea el agente causativo de la enfermedad. Habiendo descrito generalmente la invención, la misma será más fácilmente entendida con referencia a los siguientes ejemplos que se suministran a manera de ilustración y no se pretende que sean limitantes.
Ejemplos Ejemplo 1: Expresión y purificación del TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta en E. coli El vector de expresión bacteriana pQE60 se usa para la expresión bacteriana . en este ejemplo (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) . El pQE60 codifica la resistencia al antibiótico de ampicilina ("Ampr") y contiene un origen bacteriano de replicación ("ori") , un promotor inducible a IPTG, un sitio de enlace de ribosoma ("RBS"), seis codones que codifican residuos de histidina que permiten la purificación por afinidad usando una resina de afinidad de ácido triacét ico-nitrilo-niquel ("Ni-NTA") vendido por QIAGEN, INC., supra, y sitios de desdoblamiento de enzimas de restricción simples apropiados. Estos elementos se arreglan de manera que un fragmento de ADN que codifica un polipéptido, se pueda insertar en una forma tal para producir ese polipéptido con los seis residuos His (esto es una etiqueta 6 X His) unidos co a 1 en t emente a la terminación carboxilo de ese polipéptido. Sin embargo en este ejemplo, la secuencia de codificación del polipéptido se inserta de manera que la traducción de los seis codones His se edita y por lo tanto, el polipéptido se produce sin ninguna etiqueta 6 X His . Las secuencias de ADN que codifican las posiciones deseadas de las proteínas TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta, que comprenden las formas maduras de las secuencias de aminoácidos TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta, se amplifican de los clones de cADN depositados usando cebadores de oligonucleót idos de PCR, que endurecen a las secuencias de terminal amino de las porciones deseadas de las proteínas TNFR-6a o -6ß y a secuencias en los constructos depositados 3' a la secuencia de codificación de cAD . Los nucleótidos adicionales que contienen sitios de restricción para facilitar la clonación en el vector pQE60, se agregan a las secuencias 5' y 3' respectivamente. Para la clonación de la forma madura de la proteína TNFR-6a, el cebador 5' tiene la secuencia 5 ' CGCCCATGGCAGAAACACCCACCTAC 3 ' (SEQ ID NO: 19) que contiene el sitio de restricción subrayado Ncol. Alguien con habilidad ordinaria en el arte apreciaría por supuesto, que el punto en la secuencia de codificación de la proteína en donde comienza el cebador 5', se puede variar para amplificar una porción deseada de la proteina completa más corta o más larga que la forma madura. El cebador 3' tiene la secuencia 5 ' CGCAAGCTTCTCTTTCAGTGCAAGTG3 ' (SEQ ID NO: 20) que contiene el sitio de restricción subrayado HindIII. Para la clonación de la forma madura de la proteina TNFR-ßß, el cebador 5' tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 19 arriba, y el cebador 3' tiene la secuencia 5' CGCAAGCTTCTCCYCAGCTCCTGCAGTG 3' (SEQ ID NO:21), que contiene el sitio de restricción subrayado HindIII . Los fragmentos amplificados de TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta y el vector pQE60, se digieren con Ncol y HindIII y el ADN digerido se liga después junto. La inserción del ADN de TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta dentro del vector restringido pQE60, coloca a la región codificadora de la proteina TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta incluyendo su codón de detención asociado en la dirección 3' a partir del promotor inductor- I PTG y en estructura con un AUG de iniciación. El codón de detención asociado evita la traducción de los seis codones de histidina en la dirección 3' del punto de inserción.
La mezcla de unión se transforma en células competentes de E. coli usando los procedimientos estándar tales como aquellos descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) . La cepa de E. coli M15/rep4, que contiene copias múltiples del plásmido pREP4, que expresa el represor lac y confiere la resistencia a la kanamicina ("Kanr"), se usa para llevar a cabo el ejemplo ilustrativo aquí descrito. Esta cepa, que es solamente una de muchas que son apropiadas para expresar la proteina TNFR-ßa o -6ß, está disponible comercialmente de QIAGEN, Inc., supra . Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas LB en presencia de ampicilina y kanamicina. El ADN del plásmido se aisla de colonias resistentes y la identidad del ADN clonado se confirma por análisis de restricción, PCR y formación de secuencias de ADN. Los clones que contienen los constructos deseados se hacen crecer durante la noche ("O/N") en cultivo liquido en medios LB complementados con ampicilina (100 µg/ l) y kanamicina (25 µ?/p??) . El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo grande a una dilución de aproximadamente 1:25 a 1:250. Las células crecen hasta una densidad óptica a 600 nm ("00600") de entre 0.4 y 0.6 de isopropil-p-D-t iogalactopiranosida ("IPTG") se agrega después hasta una concentración final de 1 m para inducir la transcripción del promotor sensible al represor lac, al inactivar el represor lacl las células se incuban posteriormente durante 3 a 4 horas. Las células se cosechan después por centrifugación. Para purificar el polipéptido TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta, las células se agitan después durante 3-4 horas a 4°C en guanidina-HCl 6M, pH8. Los residuos de células se separan por centrifugación y el sobrenadante que contiene la TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta se trata por diálisis contra una solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM pH 6, complementada con NaCl 200 mM . Alternativamente, la proteina se puede replegar exitosamente al tratarla con diálisis contra NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl 25 mM pH 7.4, que contienen inhibidores de proteasa. Después de la renaturalización, se puede purificar la proteina por intercambio de iones, interacción hidrofóbica y cromatografía por exclusión de tamaños. Alternativamente, una etapa de cromatografía de afinidad tal como una columna de anticuerpos se puede usar para obtener la proteína pura TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta. La proteína purificada se almacena a 4°C o se congelan a menos 80°C. El siguiente método alternativo se puede usar para purificar el TNFR-6 o -6ß expresado en E . coli, cuando está presente en forma de cuerpos de inclusión. A menos que se especifique de otra manera, todos los siguientes pasos se conducen a 4-10°C. Al terminar la fase de producción de la fermentación de E coli, el cultivo de células se enfría a 4-10°C y las células se cosechan por centrifugación continua a 15,000 rpm (Heraeus Sepatech) . Sobre la base del rendimiento esperado de proteína por unidad de peso de pasta de célula y la cantidad de proteína purificada requerida, se suspende una cantidad apropiada de pasta de células en peso en una solución amortiguadora que contiene 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7.4. Las células se dispersan hasta una suspensión homogénea usando un mezclador de alto esfuerzo cortante.
El conjunto de células se lisa al pasar la solución a través de un microfluidizador (Microfuidics , Corp. 0 APV Gaulin, Inc.) dos veces a 4000-6000 psi. La mezcla homogénea se mezcla después con solución de NaCl hasta una concentración final de NaCl 0.5M, seguido por centrifugación a 7000xg por 15 minutos. El peletizador resultante se lava nuevamente usando NaCl 0.5M, 100 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 7.4. Los cuerpos de inclusión lavados resultantes se solubilizan con clorohidrato de guanidina 1.5 M (GnHCl) durante 2-4 horas. Después de la centrifugación 7000xg durante 15 minutos, se descarga el peletizado y el sobrenadante que contiene el péptido TNFR -6a o -6ß se incuba a 4°C durante la noche para permitir la extracción adicional del GnHCl. Después de la centrifugación a alta velocidad (30,000xg) para separar las partículas insolubles, la proteina solubilizada de GnHCl se repliega al mezclar rápidamente el extracto de GnHCl con 20 volúmenes de solución amortiguadora que contiene 50 mM de sodio, pH 4.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, por agitación vigorosa. La solución de proteina diluida replegada se mantiene a 4°C sin mezclado durante 12 horas antes de las etapas adicionales de purificación. Para clarificar la solución de polipéptido del receptor TNF replegada, se emplea una unidad de filtración tangencial previamente preparada, equipada con un filtro de membrana de 0.16 µp? con un área superficial apropiada (por ejemplo Filtron), equilibrada con acetato de sodio 40 mM pH 6.0. La muestra filtrada se carga sobre una resina de intercambio de cationes (por ejemplo, Poros HS-50, Perseptive Biosystems) . La columna se lava con acetato de sodio 40 mM, pH 6.0 y se eluye con 250 mM, 500 mM, 1000 mM, y 1500 mM NaCl en la misma solución amortiguadora de una forma intermitente. La absorbancia 280 mm de la fuente se observa continuamente. Las fracciones se recolectan y se analizan además por SDS-PAGE. Las fracciones que contienen el polipéptido del receptor TNF se acumulan y mezclan con 4 volúmenes de agua. La muestra diluida se carga después sobre un conjunto previamente preparado de columnas en tándem de resinas de intercambio de anión fuerte (Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) y anión débil (Poros CM-20, Perseptive Biosystems) . Las columnas se equilibran con acetato de sodio 40 mM pH 6.0. Ambas columnas se lavan con acetato de sodio 40 mM pH 6.0 y NaCl 200 mM. La columna CM-20 se eluye después usando un gradiente lineal de un volumen de 10 columnas en el intervalo de NaCl 0.2 M, acetato de sodio 50 mM, pH 6.0 hasta NaCl 1.0 M, acetato de sodio 50 mM, pH 6.5. Las fracciones se recolectan bajo A28o constante monitoreando el efluente. Las fracciones que contienen el polipéptido TNFR-6a o -6ß (determinado por ejemplo por SDS-PAGE al 16%) se acumulan después. El polipéptido resultante del receptor TNF muestra una pureza superior al 95% después de las etapas anteriores de repliegue en purificación. No se observan bandas contaminantes importantes del gel de SDS-PAGE al 16% teñido con azul de Commassie cuando se cargan 5 µg de proteina purificada. La proteina purificada se prueba también por contaminación de endotoxinas/LPS y típicamente el contenido de LPS es menor a 0.1 ng/ml según los ensayos LAL . Ejemplo 2: Clonación y expresión de las proteínas TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta en un sistema de expresión de baculovirus .
En este ejemplo ilustrativo, el vector de transferencia de plásmido pA2, se usa para insertar la proteina completa que codifica el ADN clonado, incluyendo su secuencia naturalmente asociada de señal segregada (lider), dentro de un baculovirus para expresar la proteina madura TNFR- 6a o -6ß, utilizando los métodos estándar como se describen en Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures , Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987) . Este vector de expresión contiene al promotor fuerte de polihedrina del virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV) seguidos por sitios convenientes de restricción tales como BamHI, Xba I y Asp718. El sitio de pol iadeni lación del virus de simio 40 (SV40) se usa para una poliadenilación eficiente. Para facilidad de selección del virus r ecombinant e , el plásmido contiene el gen de beta-galactosidasa de E. coli bajo control de un promotor débil de Drosophila en la misma orientación, seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Los genes insertados se flanquean en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homologa mediada por células con ADN viral de tipo silvestre para generar un virus viable' que expresa el polinucleót ido clonado. Muchos otros vectores de baculovirus se pueden usar en lugar del vector anterior, tal como pAc373, pVL941 y pAcIMl, como alguien con habilidad en el arte lo apreciaría fácilmente, con tal de que el constructo suministre las señales apropiadamente ubicadas para transcripción, traducción, secreción y similares, incluyendo un péptido de señal y un AUG dentro de la estructura como se requiere. Tales vectores se describen por ejemplo en Luckow et al., Virology 170:31-39 ( 1989) . La secuencia de cADN que codifica la proteina TNFR-ßa o -ßß de longitud completa en un clon depositado, incluyendo el codón de iniciación AUG y la secuencia líder naturalmente asociada mostrada en la SEQ ID NO:2 o 4, se amplifica utilizando cebadores de oligonucleótidos PCR que corresponden a la secuencia 5' y 3' del gen. El cebador 5' del TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta tiene la secuencia 5' CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG. 3' (SEQ ID NO:22), que contiene el sitio de enzimas de restricción BamHl subrayado. Todos los cebadores previamente descritos codifican una señal eficiente para la iniciación de la traducción en las células eucarióticas como se describe por Kozak, M . , J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987) . El cebador 3' del TNFR-6a, tiene la secuencia 5' CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG 3' (SEQ ID NO:23) que contiene el sitio de restricción subrayado Asp718. El cebador 3' para el TNFR-ßß tiene la secuencia 5' CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG 3' (SEQ ID NO:24) que contiene el sitio de restricción subrayado Asp718. El fragmento amplificado se aisla de un gel de agarosa al 1% usando un estuche comercialmente disponible ( "Geneclean , " BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) . El fragmento se digiere después con la enzima de restricción apropiada para cada uno de los cebadores usados como se especificó arriba, y se purifica nuevamente sobre un gel de agarosa al 1% . El plásmido se digiere con las mismas enzimas de restricción y opcionalmente , se puede de s f os f o i lar usando fosfatasa intestinal de cordero utilizando los procedimientos de rutina conocidos en el arte. El ADN se aisla después del gel de agarosa al 1% usando un estuche comercialment e disponible ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca. ) . El fragmento y el plásmido desfosforilados, se ligan juntos con la ligasa de ADN T4. Se transforman las células HB101 de E . coli u otros huéspedes apropiados de E. coli tal como el Azul XL-1 (Atatagene Cloning Systems, La Jolla, CA) con la mezcla de unión y se distribuyen en placas de cultivo . Las bacterias se identifican que contienen el plásmido con el gen receptor TNF humano al digerir el ADN de las colonias individuales usando las enzimas utilizadas inmediatamente arriba y después analizando el producto de digestión por electroforesis de gel. La secuencia del fragmento clonado se confirma por formación de secuencias de ADN. Este plásmido se designa aquí como pA2-TNFR-6a o pATNFR-ßß (colectivamente pA2-TNFR) . Cinco µg de plásmido pA2-TNFR se co-transfectan con 1.0 µg de un baculovirus de ADN linealizado comercialmente disponible ( "Baculogold™ baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego, CA) , usando el método de lipofección descrito por Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987) . Un µg de ADN del virus BaculoGold™ y 5 µg de plásmido pA2-TNFR se mezclan en un pozo estéril de una placa de microt i tulación que contiene 50 µ? de medio libre de suero de Grace (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Después, se agregan 10 µ? de lipofectina mas 90 µ? del medio de Grace, se mezclan e incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, la mezcla de transfección se agrega gota a gota a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo de tejido de 35 mm con 1 mi de medio Grace sin suero. La placa se incuba después durante 5 horas a 27°C. La solución de transfección se elimina después de la placa y se agrega un mililitro de medio Grace del insecto complementado con suero fetal de cordero al 10%. Se continúa después el cultivo a 27°C durante cuatro días. Después de cuatro días, el sobrenadante se recolecta y se lleva a cabo un ensayo de placas, como se describe por Summers and Smith, supra. Se usa un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir la fácil identificación y aislamiento de los clones que expresan gal, que producen las placas teñidas en azul. (Una descripción detallada de un "ensayo de placa" de este tipo se puede también encontrar en la guía del usuario para cultivo de células de insectos y bací lovirologí a distribuido por Life Technologies Inc., Gai ther sburg , pg . 9-10) . Después de la incubación apropiada, se recogen las placas teñidas en azul con la punta de una micro pipeta (por ejemplo, Eppendorf ) . El agar que contiene los viruses recombinantes , se vuelve a suspender después en un tubo microcent rí fugo que contiene 200 µ? del medio de Grace y la suspensión que contiene el baculovirus recombinante se usa para infectar las células Sf9 sembradas en platos de 35 mm. Cuatro días después, se cosechan los sobrenadantes de estos platos de cultivo y se almacenan a 4°C. Para verificar la expresión del gen receptor de TNF, se hacen crecer células Sf9 en el medio de Grace complementado con FBS inactivado por calor al 10%. Las células se infectan con el baculovirus recombinante en una multiplicidad de infección ("MOI") de alrededor de 2. Si se desean proteínas radioetiquetadas, 6 horas después se separa el medio y se reemplaza con medio SF900 II menos metionina y cisteína (disponible de Life Technologies Inc., Rockville, MD) . Después de 42 horas, se agregan 5 µ?? de 35S-met ionina y 5 µ<2? 35S-cisteina (disponible de Amersham) . Las células se incuban después durante 16 horas y después se cosechan por centrifugación. Las proteínas en el sobrenadante así como las proteínas int racelulares se analizan por SDS-PAGE seguida por autoradiograf í a (si está radioet iquetado ) . Se puede usar la microformación de secuencias de la secuencia de aminoácidos de la terminación amino de la proteína purificada, para determinar la secuencia de la terminal amino de la forma madura de la proteína del receptor TNF. Ejemplo 3: Clonación y expresión del TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta en células de mamíferos . Un vector de expresión típico de mamíferos contiene el elemento promotor, el cual media la iniciación de la transcripción de mARN, la secuencia de codificación de la proteína, y las señales requeridas para la terminación de la transcripción y poliadenilación del transcripto. Los elementos adicionales incluyen enriquecedores , secuencias Kozak y secuencias que intervienen flanqueadas por los sitios del donador y aceptador para la división de ARN . Se puede alcanzar una transcripción altamente eficiente con los promotores tempranos y tardíos para el SV40, las repeticiones de la terminal larga (LTRs) de los retroviruses, por ejemplo, RSV, HTL VI, HIVI y el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) . Sin embargo, se pueden también usar elementos celulares (por ejemplo, el promotor de la actina humana) . Los vectores apropiados de expresión para su uso en la práctica de la presente invención incluyen por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSV cat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBCl2Ml (ATCC 67109) . Las células huésped de mamíferos que se pueden usar incluyen Hela humana, células 293, H9 y Jurkat, células de ratón NIH3T3 y C127, Cos-1, Cos 7 y CV1, células de codorniz QC1-3, células de ratón L y células de ovario de hámster chino. Alternativamente, se puede expresar el gen en líneas de células estables que contienen al gen integrado en un cromosoma. La co-trans fección con un marcador de selección tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y aislamiento de las células t rans fectadas . El gen transfectado también se puede amplificar para expresar grandes cantidades de proteínas codificadas. El marcador DHFR ( dihidro folat o reductasa) es útil para desarrollar líneas de células que llevan varios cientos o aun varios miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintética (GS) (Murpy et al., Biochem J. 227:277- 279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology :169-175 (1992)) . Usando estos marcadores, las células de mamíferos crecen en un medio selectivo y las células con la resistencia más alta se seleccionan. Estas líneas de células contienen al gen amplificado integrado dentro de un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO se usan a menudo para la producción de proteínas. Los vectores de expresión pCl y pC4 contienen al promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (marzo 1985)) más un fragmento del enriquecedor del CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)) . Los sitios múltiples de clonación, por ejemplo, con los sitios de desdoblamiento de las enzimas de restricción BamHI, Xbal y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además al intrón 3', la señal de poliadenilación y terminación del gen de rata de preproinsulina .
Ejemplo 3(a): Clonación y expresión en células COS. El plásmido de expresión pTNFR-a-?? y - 6ß -HA , se hace por la clonación de una porción del cADN que codifica la forma madura de la proteina del receptor TNF dentro del vector de expresión pcDNAI/Amp o pcDNAIII (que se puede obtener de Invitrogen, Inc. ) . El vector de expresión pcDNAI/amp contiene: (1) un origen E. coli de una replicación efectiva para la propagación en E. coli y otras células procarióticas; (2) un gen de resistencia a la ampicilina para la selección de células procarióticas que contienen el plásmido; (3) un origen SV40 de replicación para la propagación de células eucaríóticas; (4) un promotor CMV, un polienlazador, un intrón SV40; (5) diversos codones que codifican un fragmento de hemaglut inina (esto es, una etiqueta HA para facilitar la purificación) seguido por un codón de terminación y una señal de pol iadeni lación colocada de manera que un cADN se puede ubicar convenientemente bajo el control de expresión del promotor CMV y unirse operativamente al intrón SV40 y la señal de poliadenilación por medio de los sitios de restricción en el polienlazador. La etiqueta HA corresponde a un epitope derivado de la proteina de hemaglut inina de la influenza descrita por ilson et al. , Cell 37:767 (1984) . La fusión de la etiqueta HA a la proteina objetivo permite la fácil detección y recuperación de la proteina recombinante en un anticuerpo que reconoce al epitope HA. El pcDNAIII contiene además, el marcador de selección de neomicina. Un fragmento de ADN que codifica al polipéptido completo del receptor TNF, se clona dentro de la región del polienlazador del vector de manera que la expresión de la proteina recombinante se dirige por el promotor CMV. La estrategia de construcción del plásmido es como sigue. El cADN del receptor TNF de un clon depositado, se amplifica usando los cebadores que contienen los sitios convenientes de restricción mucho como se describió arriba para la construcción de vectores para la expresión de un receptor TNF en E. coli. Se pueden diseñar fácilmente los cebadores apropiados por aquellos con habilidad ordinaria en el arte. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digieren con Xbal y EcoRI y después se ligan. La mezcla ligada se transforma en la cepa de E. coli SURE (disponible de Stragene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, la Jolla, CA 92037), y el cultivo transformado se coloca en placas con medios de ampicilina que se incuban después para permitir el crecimiento de colonias resistentes a la ampicilina. El ADN del plásmido se aisla de las colonias resistentes y se examina por análisis de restricción u otros medios para la presencia del fragmento que codifica los polipéptidos TNFR-oc y -6ß. Para la expresión del TNFR-a y -6ß recombinant e , se transfectan células COS con un vector de expresión como se describe arriba usando DEAE- DEXTRA , como se describe por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) . Las células se incuban bajo condiciones para la expresión del TNFR por el vector. La expresión de la proteina de fusión pTNFR-cc-HA y -ßß-HA se detecta por radioetiquetado e inmunoprecipitación , usando los métodos descritos en por ejemplo, Harlow et al., An tibodi es : A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988 ) . Hasta este punto, dos días después de la transfección las células se etiquetan por incubación en un medio que contiene 35S-cisteina durante 8 horas. Las células y el medio se colectan y las células se lavan y se lisan con solución amortiguadora RIPA que contiene detergente: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7.5, como se describe por Wilson et al. arriba citado. Las proteínas se precipitan del lisado de células y del medio de cultivo usando un anticuerpo monoclonal específico del HA. Las proteínas precipitadas se analizan después por SDS-PAGE y aut oradi ogra f í a . Un producto de expresión del tamaño esperado se observa en el lisado de células que no se observa en controles negativos. Ejemplo 3(b): Clonación y expresión en células CHO. El vector pC4 se usa para la expresión de los polipéptidos TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (número de acceso ATCC 37146) . El plásmido que contiene el gen de ratón DHFR bajo control del promotor temprano SV40. Se pueden seleccionar células de ovario de hámster chino u otras células que carecen de la actividad del dihidrofolat o que se transfectan con estos plásmidos, al hacer crecer las células en un medio selectivo (alfa menos MEM, Life Technologies) complementado con el agente quimiot erapéutico de metotrexato. La amplificación de los genes DHFR en células resistentes al metotrexato (MTX) ha sido bien documentada (ver por ejemplo, Alt, F. W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., y Schimke, R.T., 1978, J.Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. y Ma, C. 1990, Biochem. Et Biophys. Acta, 1097:107-1 3, Page, M.J. y Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology ) :64-68) . Las células crecidas en concentraciones crecientes de MTX, desarrollan resistencia al medicamento por la sobreproducción de la enzima objetivo, DHFR como resultado de la amplificación del gen de DHFR. Si se une un segundo gen al gen de DHFR, usualmente es co-ampl i f icado y sobre-expresado. Se conoce en el arte que este enfoque se puede usar para desarrollar lineas de célula que llevan más de mil copias del gen (es) amplificado. Posteriormente, cuando el metotrexato se retira, se obtienen lineas de células que contienen al gen amplificado integrado en uno o más cromosomas de la célula huésped. El plásmido pC4 contiene para la expresión del gen de interés, al promotor fuerte de la repetición de terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rouse (Cullen, et. al., Molecular and Cellular Biology, marzo 1985:438-4 7) más un fragmento aislado del enriquecedor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)) . En la dirección 3' del promotor, están los siguientes sitios de desdoblamiento de enzimas de restricción simple que permiten la integración de los genes: BamHI, Xba I, y Asp718. Detrás de estos sitios de clonación, el plásmido que contiene el intrón 3' y el sitio de poliadenilación del gen de rata de preproinsulina . Otros promotores de alta eficiencia se pueden también usar para la expresión, por ejemplo, el promotor humano de la ß-actina, los promotores temprano o tardío de SV40 o las repeticiones de la terminal larga para otros ret roviruses , por ejemplo VIH y HTLVI . Se pueden usar los sistemas de expresión de genes de Clontech Tet-Off y Tet-On y sistemas similares para expresar el polipéptido del receptor TNF de una forma regulada en células de mamífero (Gossen, M . , & Bujard, H., Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:5547-5551 (1992)) . Para la poliadenilación del mARN, se pueden usar también otras señales por ejemplo, de la hormona del crecimiento humano o genes de globina. Se pueden también seleccionar líneas estables de células que llevan el gen de interés integrado dentro de los cromosomas, con la co-transfección con un marcador de selección tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso usar más de un marcador de selección al comienzo, por ejemplo, G418 más metotrexato. El plásmido pC4 se digiere con las enzimas de restricción apropiadas para los cebadores específicos, usados para amplificar el receptor TNF de elección como se señalo abajo y después se desfosforilan usando fosfatos intestinales de cordero por procedimientos conocidos en el arte. El vector se aisla después de un gel de agarosa al 1%. La secuencia de ADN que codifica al polipéptido receptor TNF se amplifica usando cebadores de oligonucleótidos de PCR que corresponden a la secuencia 5' y 3' de la porción deseada del gen. El cebador 5' para el TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta que contiene el sitio subrayado BamHI, tiene la siguiente secuencia: 5' CGCGGATCCGCCATCATGAGGGCGTGGAGGGGCCAG 3' (SEQ ID NO:22) . El cebador 3' para el TNFR-6a tiene la secuencia 5' CGCGGTACCCTCTTTCAGTGCAAGTG 3' (SEQ ID NO:23), que contiene el sitio de restricción subrayado Asp718. El cebador 3' para el TNF-ßß tiene la secuencia 5' CGCGGTACCCTCCTCAGCTCCTGCAGTG 3' (SEQ ID NO:24), que contiene el sitio de restricción subrayado Asp718. El fragmento amplificado se digiere con las endonucleasas que cortarán los sitios de restricción preparados por ingeniería y purificados después nuevamente sobre un gel de agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan después con una ligasa de ADN T4. Las células de E. coli HB101 o azul XL-1, se transforman después y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado dentro del plásmido pC4 usando por ejemplo, el análisis de enzimas de restricción. Se usan para la transfección células de ovario de hámster chino que carecen de un gen activo DHFR. Cinco µg del plásmido de expresión pC4, se co-transfectan con 0.5 µg del plásmido pSVneo usando lipofectina (Frlgner et al., supra) . El plásmido pSV2-neo contiene un marcador de selección dominante, el gen neo Tn5 que codifica una enzima que le confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo el G418. Las células se siembran en alfa menos MEM complementado con 1 mg/ml de G418. Después de 2 días, las células se tratan con tripsina y se siembran en placas de clonación de hibridomas (Greiner, Germany) en alfa menos MEM complementado con 10, 25 o 50 ng/ml de metotrexato más 1 mg/ml de G418. Después de alrededor de 10-14 días, los clones simples se tratan con tripsina y se siembran después en cajas de Petri de 6 pozos o matraces de 10 mi usando concentraciones diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM) . Los clones que crecen a concentraciones más altas de metotrexato se transfieren después a nuevas placas de 6 pozos que contienen concentraciones aún mayores del metotrexato (1 µ?, 2 µ?, 5µ?, 10 mM, 20 m ) . Se repite el mismo procedimiento hasta que los clones se obtiene que crecen a una concentración de 100-200 µ . La expresión del producto del gen deseado se analiza por ejemplo, por SDS-PAGE y manchado Western o por análisis de HPLC de fase inversa. Ejemplo 4: Distribución de tejido para la expresión del mARN del receptor TNF.
Se lleva a cabo un análisis de manchado Northern para examinar la expresión del gen TNFR- 6a o -6ß en tejidos humanos, usando los métodos descritos por entre otros Sambrook et al., arriba citado. Una sonda de cADN que contiene la secuencia completa de nucleótido de una proteina del receptor TNF (SEQ ID N0:1 o 3) se etiqueta con 32P usando el sistema de etiquetado de ADN rediprime™ (Amersham Life Science), según las instrucciones del fabricante. Después de etiquetar, se purifica la sonda usando una columna CHRO A SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.), según el número de protocolo del fabricante PT1200-1. La sonda etiquetada purificada se usa después para examinar diversos tejidos humanos para el mARN del receptor TNF. Se obtienen múltiples manchados de tejidos Northern (MTN) que contienen diversos tejidos humanos (H) o tejidos del sistema inmune humano (I ), de Clontech y se examinan con la sonda etiquetada usando una solución de hibridación ExpressHyb™ (Clontech) según el número de protocolo del fabricante PT1190-1. Después de la hibridación y lavado, se montan y exponen a una película los manchados a -70°C durante la noche, y las películas se revelan según los procedimientos estándar . Será claro que la invención se puede practicar de otra manera como se describe particularmente en la descripción y ejemplos anteriores.
Modificaciones y variaciones diversas de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores y por lo tanto están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Ejemplo 5: Terapia de genes usando el gen endógeno de TNFR-6. Otro método de terapia de genes según la presente invención, involucra la asociación operativa de la secuencia endógena de TNFR (esto es TNFR-6) con un promotor por medio de la recombinación homologa como se describe por ejemplo en la patente U.S. No. 5,641,670, emitida el 24 de junio 1997 ; número de publicación de la Solicitud Internacional WO 96/294/11, publicada el 26 de septiembre 1996; número de publicación de la solicitud Internacional WO 94/12650, publicada el 4 de agosto 1994; Koller et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); y Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989) . Este método involucra la activación de un gen que está presente en las células objetivo, pero que no se expresan las células o se expresa a un nivel menor del deseado. Se hacen constructos de polinucleótidos que contienen un promotor y secuencias objetivo, que son homologas a la secuencia no codificadora 5'del TNFR-6 endógeno, que flanquea al promotor. La secuencia objetivo estará lo suficientemente cerca de la terminación 5' del TNFR-6 de manera que el promotor se unirá operativamente a la secuencia endógena con recombinación homologa. El promotor y las secuencias objetivo se pueden amplificar usando PCR. Preferiblemente, el promotor amplificado contiene diferentes sitios de restricción de enzimas en los extremos 5' y 3' . Preferiblemente, el extremo 3' de la primera secuencia objetivo contiene el mismo sitio de enzima de restricción como el extremo 5' del promotor amplificado y el extremo 5' de la segunda secuencia objetivo contiene el mismo sitio de restricción que el extremo 3' del promotor ampl i f i cado . El promotor amplificado y las secuencias objetivo amplificadas se digieren con las enzimas apropiadas de restricción y posteriormente se tratan con fosfatasa intestinal de cordero. El promotor digerido y las secuencias digeridas objetivo se agregan juntas en presencia de una ligasa de ADN T4. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para la unión de los dos fragmentos. El constructo se fracciona por tamaño sobre un gel de agarosa y después se purifica por extracción de fenol y precipitación de et anol . En este ejemplo, los constructos de polinucleotidos se administran como polinucleotidos desnudos por medio de electrof oración . Sin embargo, los constructos de polinucleotidos se pueden también administrar con agentes que facilitan una transfección tales como liposomas, secuencias virales, partículas vírales, agentes de precipitación, etc. Tales métodos de entrega se conocen en el arte. Una vez que se transfectan las células, la recombinación homologa tomará lugar, lo cual resulta en que el promotor se una operativamente a la secuencia endógena TNFR-6. Esto resulta en la expresión del TNFR-6 en la célula. Se puede detectar la expresión por teñido inmunológico o cualquier otro método conocido en el arte.
Los fibroblastos se obtienen de un sujeto por biopsia de la piel. El tejido resultante se coloca en suero de cordero fetal al 10% + DMEM. Los fibroblastos de la fase estacionaria temprana o que crecen exponencialment e , se tratan con tripsina y se enjuagan de .la superficie de plástico con el medio del nutriente. Se separa una alícuota de la suspensión de células para conteo, y las células restantes se someten a centrifugación. El sobrenadante se aspira y el peletizado se vuelve a suspender en 5 mi de solución amortiguadora de electroforacion (20 mM HEPES pH 7.3, 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0.7 mM Na2 HP04,6 mM dextrosa) . Las células se vuelven a centrifugar, se aspira el sobrenadante y se vuelven a suspender las células en solución amortiguadora de electroforacion que contiene 1 mg/ml de albúmina de suero de bovino acetilada. La suspensión final de células contiene aproximadamente 3X106 células/ml. La electroforacion se debe llevar a cabo inmediatamente después de la resuspensión. El ADN del plásmido se prepara según las técnicas estándar. Por ejemplo, para construir un plásmido para dirigir la ubicación del TNFR-6, se digiere el plásmido pUC18 (MBI Fermentas, Amherst, NY) con HindIII. El promotor CMV se amplifica por PCR con un sitio Xbal en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3' . Se amplifican dos secuencias no codificadoras de TNFR-6 por medio de PCR: una secuencia no codificadora de TNFR-6 (fragmento 1 de TNFR-6) se amplifica con un sitio HindIII en el extremo 5' y un sitio Xba en el extremo 3'; la otra secuencia no codificadora de TNFR-6 (fragmento 2 de TNFR-6) se amplifica con un sitio BamHI en el extremo 5' y un sitio HindIII en el extremo 3' . El promotor de CMV y los fragmentos de TNFR-6 se digieren con las enzimas apropiadas (promotor CMV-Xbal y BamHI; fragmento 1 de TNFR-6 - Xbal; fragmento 2 de TNFR-6 -BamHI) y se ligan juntos. El producto resultante de la unión se digiere con HindIII y se liga con el plásmido pUC18 digerido con HindIII. El ADN del plásmido se agrega a una cuba estéril con un espacio de electrodos de 0.4 cm (Bio-Rad) . La concentración final de ADN estará generalmente al menos 120 µg/ml. Se agregan después 0.5 mi de la suspensión de células (que contiene aproximadamente 1.5X106 células) a la cuba, y la suspensión de células y soluciones de ADN se mezclan suavemente. Se lleva a cabo la electroforación con un aparato Gene-Pulser (Bio- Rad) . La capacitancia y el voltaje se establecen a 960 µG y 250-300 V, respectivamente. Cuando se incrementa el voltaje, disminuye la supervivencia de células, pero se incrementa dramáticamente el porcentaje de células que sobreviven que se incorporan de forma estable el ADN introducido dentro de su genoma. Dados estos parámetros, se debe observar un tiempo de pulsos de aproximadamente 14-20 mSec. Las células electroforadas se mantienen a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min., y los contenidos de la cuba se separan suavemente con una pipeta de transferencia estéril. Las células se agregan directamente a 10 mi de medios de nutrientes precalentados ( DME con suero de cordero al 15%) en un plato de 10 cm y se incuban a 37°C. Al día siguiente, se aspira y reemplaza el medio con 10 mi de medio fresco y se incuba por 16-24 horas adicionales. Los fibroblastos preparados por ingeniería se inyectan después al huésped, ya sea solos o después de haber crecido para confluir en las perlas microportadoras de citodex 3. Los fibroblastos producen ahora al producto de la proteína. Los fibroblastos se pueden después introducir en el paciente como se describió arriba . Ejemplo 6: Efecto del TNFR en el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped en ratones . La invención también abarca un método para el tratamiento de GVHD agudo, severo/refractario en pacientes que comprende administrar a los pacientes (preferiblemente humanos) polipéptidos TNFR o agonistas de TNFR de la invención. Un análisis del uso de los polipéptidos solubles de TNFR de la invención (por ejemplo TNFR-6) para tratar la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) se lleva a cabo a través del uso de un padre C57BL/6 dentro de un modelo de ratón (BALB/c X C57BL/6) . Este padre dentro del modelo de ratón Fl es un modelo animal reproducible y bien caracterizado de GVHD en pacientes con transplante de médula espinal, que es bien conocido por alguien con habilidad en el arte (ver por ejemplo, Gleichemann et al, Immunol Today 5:324,1984, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Se espera que el TNFR soluble se enlace al FasL e inhiba la apoptosis mediada por FasL, que juega un papel critico patogénico en la lesión a órganos hepáticos cutáneos y linfoides observada en este modelo animal de GVHD (Baker et al., Exp . Med. 183:2645, (1996); Charles et al, J. Immunol. 157:5387, (1996); y Hattori et al, Blood 91:4051, (1998), cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . La iniciación de la condición GVHD se induce por una inyección intravenosa de células de bazo -1-3 x 108 de ratones C57BL/6 y ratones Fl (BALB/c X C57BL/6) (ambos disponibles de Jackson Lab, Bar Harbor, aine) . Grupos de 6 a 8 ratones reciben de 0.1 a 5.0 mg/kg de TNFR o un isotipo de IgG humana como control, intraperitonalmente o intradermalmente cada tercer día después de la inyección de la células de bazo. El efecto del TNFR en la liberación de la enzima del hígado en los sueros, un indicador del daño al hígado, se analiza dos veces por semana por al menos tres semanas. Cuando hay una cantidad importante de enzimas de hígado detectadas en los ratones tratados con IgG humana, se sacrifican los animales para la evaluación histológica del grado relativo de daño al tejido en el hígado, bazo, piel e intestino y para el efecto terapéutico del TNFR que se ha obtenido en estos órganos. La capacidad del TNFR para disminuir los sistemas asociados con el GVHD agudo severo refractario, se indican por una reducción de la liberación de la enzima del hígado en los sueros, daño a tejidos y/o caquexia reducida, pérdida de peso corporal y/o fatalidad cuando se comparan al control. Finalmente, los animales tratados con IgG humana y TNFR se someten a una evaluación clínica cada tercer día para evaluar caquexia, pérdida de peso y fatalidad. El TNFR en terapia de combinación con inhibidores TNF- puede también examinarse en este modelo de murina GVHD. Ejemplo 7: El TNFR- 6a (DcR3) suprime la apoptosis mediada, por el AIM-II . Antecedentes Los miembros de la familia del factor de necrosis de tumor (TNF) se involucran en la regulación de diversas actividades biológicas tales como la regulación de la proliferación de células, diferenciación, supervivencia de células, muerte celular, producción de citosina, coestimulación de linfocitos, segregación de inmunoglobulina y cambio de isotipos (Armitage, R., Curr. Opin. Immunol . 6,407-413 (1994); Tewari, M . et al., Curr. Opin. Genet . Dev. 6,39-44 (1996)) . Los receptores en esta familia comparten una porción estructural común en sus dominios extracelulares que consisten de repeticiones múltiples ricas en cisteína de aproximadamente 30 a 40 aminoácidos (Gruss, H.-J., et al., Blood 85, 3378-3404 (1995)) . Ya que los receptores TNFR1, CD95/Fas/APO-l, DR3 / TRAMP /APO- 3 , DR4 /TRAIL-R1 /APO-2, DR5 /TRAIL-R2 , y DR6 contienen una porción conservada intracelular de 30-40 aminoácidos llamada dominio mortal, asociado con la activación de trayectorias de señalamiento apoptóticas, otros miembros que contienen una identidad de secuencia baja en los dominios celulares, estimulan los factores de transcripción NF-kB y AP-1 (Armitage, R., Curr. Opin. Immunol. 6,407-413 (1994); Tewari, M. et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 6,39-44 (1996); Gruss, H.-J. et al., Bood 85, 3378-3404 (1995)) . La mayoría de los receptores TNF contienen un dominio citoplásmico funcional e incluyen el TNFR-1 (Loetscher, H et al., Cell 61,351-356 (1990); Schall, T.J. et al., Cell 61, 361-370 (1990)), TNFR2 (Smith, C.A., et al., Science 248, 1019-1023 (1990)), receptor de la linfotoxina ß (LTpR) (Baens, M . , et al., Genomics 16, 214-218 (1993)) , 4-1 BB (Kwon, B.S., et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1963-1967 (1989)), HVEM/TR2 /ATAR (Kwon, B.S., et al., J. Biol. Chem. 272,14272-1 276 (1997) ; Montgomery, R.I., et al., Cell 87, 427-436 (1996) ; Hsu, H., et al., J. Biol. Chem. 272, 13471-13474 (1997) ), NGFR (Johnson, D., et al., Cell 47, 545-554 (1986)), CD27 (Van Lier, R.A., et al., J. Immunol. 139, 1589-1596 (1987)), CD30 (Durkorp, H., et al., Cell 68,421-427 (1992)), CD40 (Banchereau, J., et al., Cell 68, 421-427 (1994) ), OX40 ( allett, S., et al., EMBO J. 9, 1063-1068 (1990)), Fas (Itoh, . , et al., Cell 66, 233-243 (1991)), DR3/TRAMP (Chinnaiyan, A . . , et al., Science 274, 990-992 (1996)), DR4/TRAIL-R1 (Pan, G . , et al., Science 276, 111-113 (1996)), DR5/TRAIL-R2 (Pan, G., et al., Science 277,815-818) (1997), y RANK (Anderson, D. et al., Nature 390, 175-179 (1997)) . Algunos miembros de la super familia de TNFR no tienen los dominios citoplásmicos y se segregan tales como la os t eoproteger ina (OPG) (Simmonet et al., Cell 89,309-319 (1997)) o se unen a una membrana a través de una cola de glicofosfolipidos tal como el TRID/DcRl / RAIL-R3 ( Degli-Espost i , M.A., et al., J. Exp. Med. 186, 1165-1170 (1997); Sheridan, J.P., et al., Science 277,818-821 (1997)) . Las estructuras virales de lectura abierta que codifican TNFRs solubles también se han identificado tales como la SFV-T2 (Smith, C.A., et al., Science 248, 1019-1023 (1990) ), Va53 (Howad, S.T., et al., Virology 180, 633-647 (1991)), G4RG (Hu, F.Q., et al., Virology 204, 343-356 (1994)), y crmB (Gruss, H-J, et al., Blood 85,3378-3404 ( 1995) ) . Al buscar una base de datos de etiquetas de secuencias expresadas (EST), se identifica un nuevo miembro de la superfamilia de TNFR denominado TNFR- 6a y se caracterizó como un ligando soluble de similaridades para AIM-II y FasL/CD95L. El AIM-II y Fas L median la apoptosis, que es la forma fisiológica más común de muerte celular y sucede durante el desarrollo embriónico, remodelamiento de tejidos, regulación inmune y regresión de tumores. El AIM-II es altamente inducido en linfocitos T activados y macrófagos. El AIM-II se caracteriza como un ligando celular para HVEM/TR2 y LTPR (Mauri, D.N., et al-, Immunity 8, 21-30 (1998)) . El HEVEM/TR2 es un receptor para el virus del herpes simplex tipo 1 (HSV-1) en su entrada a los linfoblastos T humanos. Una forma soluble del HVEM/TR2-Fc y anticuerpos al HVEM/TR2 se muestra que inhibe una reacción mezclada de linfocitos, sugiriendo un rol para este receptor o su ligando en la proliferación de los linfocitos T (Kwon, B. Et al., J. Biol. Chem. 272,14272-1 276 (1997); Mauri, D. N., et al., Immunity, 21-30 (1998); Harrop, J. A., et al., J. Immunol. 161,1786-179 (1998)) . El nivel de expresión LTPR es prominente en las células epiteliales pero está ausente en los linfocitos T y B. La señalización por medio de LT R, dispara la muerte celular en algunos adenocarcinomas (Browning, J. L., et al., J. Exp. Med. 183, 867-878 (1996)) . El AIM-II producido por linfocitos activados puede provocar la modulación inmune de células hematopoyét icas que expresan solamente el HVEM/TR2, e inducen la apoptosis de células de tumores que expresan los receptores L PR y HEVM/TR2 (Zhai, Y., et al ., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998); Harrop, J. A., et al., Biol. Chem. 273,27548-27556 (1998)) .
El FasL es uno de los principales efectores de los linfocitos T citotóxicos y las células exterminadoras naturales. También se involucra en el establecimiento de la tolerancia periférica, en la muerte celular inducida por activación de linfocitos. Más aún, la expresión del FasL en células no linfoides y de tumor contribuye al mantenimiento de un privilegio inmune de los tejidos al evitar la infiltración de linfocitos sensibles al Fas (Nagata, S., Cell 88,355-365 (1997) ) . El FasL también se procesa y esparce de la superficie de las células humanas (Schneider, P., et al., J. Exp. Med. 187, 1205-1213 (1998)) . Aquí, se demuestra que el TNFR-6a, un nuevo miembro de la super familia de TNFR enlaza al AIM-II y FasL. Por lo tanto el TNFR-6a puede actuar como un inhibidor en la muerte celular de tumores inducida por el AIM-II al bloquear la interacción del AIM-II con sus receptores. Materiales y Métodos Identificación y clonación de nuevos miembros de la super familia de TNFR. Una base de datos de cADN EST, obtenida de más de 600 colecciones diferentes de cADN, se separó por exclusión para la homología de secuencias con la porción rica en cisteina de la superfamilia TNFR, usando los algoritmos blastn y tblastn. Tres clones de EST que contienen una estructura idéntica de lectura abierta cuya secuencia de aminoácido mostró una homología importante al TNFR-II, se identificaron de colecciones de cADN de la próstata normal humana y de un tumor de páncreas. Un clon de cADN de TNFR- 6 alfa de longitud completa que codifica un péptido de señal intacto en la terminal N, se obtuvo de una colección de próstata normal humana. Análisis RT-PCR. Para el análisis RT-PCR, se aisló el ARN total usando trizol (GIBCO) de diversas líneas de célula humanas antes y después de la estimulación con PMA/Ionomicina o LPS. El ARN se convirtió en cADN por transcripción inversa y se amplificó a 35 ciclos por PRC. Los cebadores usados para la amplificación del fragmento TNFR- 6 alfa siguen la secuencia del TNFR- 6 alfa. Se usó la ß-actina como un control interno para la integridad del ARN. Los productos PCR se operaron en un gel de agarosa al 2%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron para iluminación UV.
Producción y purificación de la proteína recombinan te . La proteína recombinante TNFR-6 alfa se produjo con hexa-hi s t idina en la terminación C. La TNFR-6 alfa-(His) que codifica la proteína completa de TNFR-6 alfa se amplificó por PCR. Para una clonación correctamente orientada, se crearon un sitio HindIII en el extremo 5' del cebador delantero ( 5 ' -AGACCCAAGCTTCCTGCTCCA GCAAGGACCATG-3' :SEQ ID NO:25) y un sitio BamHI en el extremo 5' en el cebador inverso (5'- AGACGGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCACAGGGAGGAAGCGCTC -3' :SEQ ID NO:26) . El fragmento amplificado se cortó con Hindl 11 /BamHI y se clonó dentro de un vector de expresión mamífero pCEP4 (Invitrogen) . El plásmido de TNFR-6 alfa- (His ) /pCEP4 se transfectó establemente dentro de células HEK 293 EBNA para generar el TNFR-6 alfa (His) . Se pasaron medios de cultivo libres de suero de células trans f ect adas con TNFR-6 alfa (His)/pCEP4 a través de una columna Ni (Novagen) . Los eluyentes de la columna se fraccionaron por SDS-PAGE y el TNFR-6 alfa- (His) se detectó por un análisis de manchado Western usando el anti-poli (His ) 6 a anticuerpo (Si gma ) .
La producción de las proteínas de fusión HVEM/TR2-FC, LTPR-Fc y al AIM-II soluble etiquetado Flag (AIM-II soluble) se describieron previamente (Zhai, Y., eet al., J. Clin. Invest. 102,1142-1151 (1998)) . Los sobrenadantes que contienen la proteína de fusión Fe se filtraron y entramparon sobre perlas de proteína G sefarosa. Las proteínas AIM-II solubles etiquetadas con Flag se purificaron en una columna de afinidad anti-Flag mAb . Inmunoprecipi t ación El TNFR-6 alfa-(His) se incubó durante la noche con diversos ligandos etiquetados Flag de la superfamilia TNF de la agarosa anti-Flag en solución amortiguadora de enlace (150 mM de NaCl, 0.1 % NP-40, 0.25% gelatina, 50. mM HEPES, pH 7.4) a 4°C y después se precipitó. Las proteínas enlazadas se resolvieron por SDS-PAGE al 12.5% y se detectaron por manchado Western con anticuerpos antihumanos de IgGl o anti poli(his)s conjugado con HRP. Ensayo de enlace de células Para ensayos de enlace de células, se transfectaron establemente células HEK 293 EBNA usando el método del fosfato de calcio con una secuencia completa/pCEP4 del cADN de AIM-II o el vector pCEP4 solamente. Después de la selección con Higromicina B, se cosecharon células con EDTA 1 m en PBS y se incubaron con TNFR-6 alfa-(His), HVEM/TR2 - Fe o LTpR-Fc durante 20 minutos sobre hielo. Para detectar la proteina de fusión Fe, las células se tiñeron con un conjugado de cabra FITC anti-humano de IgG. Para detectar el enlace TNFR-6 alfa, se tiñeron las células con ant i -pol i ( Hi s ) 6 y conjugado FITC de cabra anti-ratón de IgG consecutivamente. Las células se analizaron por FACScan (Becton Dickinson) . Ensayo de citotoxicidad Los ensayos de citotoxicidad usando las células HT29 se llevaron a cabo como se describió previamente (Browning, J. L. et al., J. Exp. Med. 183, 867-878 (1996)) . Brevemente, se sembraron 5000 células HT29 en placas de 96 pozos con FBS al 1%, DMEM y se trataron con AIM-II soluble (10 ng/ml) y 10 unidades/ml de interferon-? recombinante humano (IFN-?) . Se agregaron diluciones en serie de TNFR-6 alfa-(His) por cuadruplicado a los pozos de .microt itulación . Las células tratadas con IFN-? y AIM-II soluble se incubaron con diversas cantidades de TNFR-6 alfa- (His) durante 4 días antes de la adición de [3H]timidina durante las últimas 6 horas de cultivo. Las células se cosecharon y se determinó la incorporación de timidina usando un contador de escint ilación liquido. Resultados y Discusión TNFR-6 alfa es un nuevo miembro de la superfamilia del TNFR Se identificó el TNFR-6 alfa al buscar una base de datos EST. Se identificaron tres clones que contenían una estructura idéntica de lectura abierta de las colecciones de cADN de la próstata normal humana y del tumor de páncreas. El cADN del TNFR-6 alfa de longitud completa que codifica un péptido de señal intacto en la terminal N, se obtuvo de una colección de próstata normal humana. La estructura de lectura abierta del TNFR-6 alfa, codifica 300 aminoácidos. Para determinar la secuencia de aminoácidos en la terminal N del TNFR-6 alfa maduro, se expresó el TNFR-6 alfa etiquetado con hexa- histidina, en un sistema de expresión de células de mamífero y la secuencia de aminoácidos en la terminal N se determinó por formación de secuencias de péptido. La secuencia en la terminal N del TNFR-6 alfa- (His) maduro procesado, comenzó desde el aminoácido 30, indicando que los primeros 29 aminoácidos constituían la secuencia de señal. Por lo tanto, la proteína madura del TNFR-6 alfa estaba compuesta de 271 aminoácidos sin región de transmembrana. Había un sitio potencial de glicosilación unido a N (Asnl73) en el TNFR-6 alfa. Como el OPG (Simmonet, W. Et al., Cell 89, 309-319 (1997)), la proteína predecible era una proteína segregada soluble y el TNFR-6 alfa recombinante expresado en células de mamíferos fue alrededor de 40kD como se estimó en el gel de poliacrilamida . La alineación de las secuencias amino de TNFR-I, TNFR-II, 4-1BB, TR2/HVEM, LTpR, TR1/OPG y TNFR-6 alfa, ilustraron la existencia de una porción potencial rica en cisteína. El TNFR-6 alfa contenía dos porciones perfectas y dos imperfectas ricas en cisteína y su secuencia de aminoácidos era notablemente similar con la secuencia de aminoácidos TR1/OPG. El TNFR-6 alfa comparte alrededor del ~30% de la homología de la secuencia con el OPG y TNFR-II. Exprésión del mARN Se analizó la expresión del mARN del TNFR-6 alfa en tejidos múltiples humanos por hibridación de manchado Northern. El análisis de manchado Northern indicó que el mARN del TNFR-6 alfa tenia alrededor de -1.3 kD de longitud y se expresó predominantemente en el tejido de pulmón y en la linea de célula colorectal de adenocarcinoma SW480. Los análisis RT-PCR se llevaron a cabo para determinar los patrones de expresión del TNFR-6 alfa en diversas lineas de células. Se detectó el transcripto de TNFR-6 alfa débilmente en la mayoría de las líneas de células hematopoyéticas . La expresión del TNFR-6 alfa se indujo con la activación de las células T de Jurkat de leucemia. De manera interesante, el mARN del TNFR-6 alfa se expresó consecutivamente en la línea de célula endotelial HUVEC a niveles elevados. Identificación del ligando para el TNFR-6 alfa Para identificar el ligando del TNFR-6 alfa, se seleccionaron por exclusión proteínas solubles diversas etiquetadas con Flag de los miembros de la familia del ligando del TNF, para enlazarse a la proteína TNFR-6 alfa-(His) recombinante de inmunoprecipitación . El TNFR-6 alfa- (His) se enlazó selectivamente al AIM-II-Flag y al FasL-Flag entre los miembros probados del ligando de TNF soluble. Este resultado indica que el TNFR-6 alfa enlaza al menos dos ligandos AIM-II y Fas L . El AIM-II muestra una homología importante de la secuencia con el dominio de enlace del receptor de la terminal C del Fas L (31%) pero el AIM-II soluble es incapaz de enlazar al Fas (Mauri, D. . , et al., Immunity 8 , 21-30(1998) ; Zhai, Y., et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998)) . Pueden tener un epítope similar de enlace para el enlace TNFR-6 alfa. Previamente, Zhai y Harrop, et al., J. Clin.
Invest. 102, 1142-1151 (1998); Harrop, J. A. et al., J. Biol. Chem. 273,27548-27556 (1998) ) reportaron las funciones biológicas del AIM-II, y sus posibles mecanismos de acción como ligando para el HVEM/TR2 y/o L pR. El AIM-II se expresa en células T activadas. El AIM-II en conjunto con la desaparición de un suero o la adición del IFN-? inhibe la proliferación de células en células de tumor, MDA-MB- y HT29. Para determinar si el TNFR-6 alfa pudiera actuar como un inhibidor para las interacciones de AIM-II con HVEM/TR2 o LTpR, se usó el TNFR-6 alfa-(His) como un inhibidor competitivo en la interacción. Cuando se inmunoprecipitó el AIM-II con HVEM / TR2 - Fe en presencia de TNFR-6 alfa-(His), el HVEM/TR2 -Fe que se enlaza al AIM-II se disminuyó competitivamente por el TNFR-6 alfa- (His) pero el enlace de TNFR-6 alfa-(His) al AIM- II no se cambió por el HVEM/TR2-Fc. Además, el enlace de HVEM/TR2 - Fe (6 nM) o LTpR (6 nM) se inhibió completamente por 20 nM de la proteina TNFR-6 alfa-(His) en ensayos de inmunoprecipitación . Estos resultados soportan la noción de que el TNFR-6 alfa puede actuar como un fuerte inhibidor de la función AIM-II a través del HVEM/TR2 y LT R. Enlace del TNFR-6 alfa-(His) a las células transfectadas de AIM-II Para determinar si el TNFR-6 alfa se enlaza al AIM-II expresado en la superficie de las células, se llevaron a cabo ensayos de enlace usando células HEK 293 EBNA transfectadas con AIM-II por citometria de flujo. Las células HEK 293 EBNA transfectadas con AIM-II se tiñeron de manera importante con el TNFR-6 alfa-(His) asi como por el HVEM/TR2-Fc y LTpR-Fc. No se detectó enlace por el HVEM/TR2-FC o LTpR-Fc sobre las células HEK 293 EBNA transfectadas con el vector pCEP4. Además, el isotipo de control, no se enlazó a las células HEK 293 EBNA transfectadas con AIM-II, y cualquiera de las proteínas de fusión anteriores no se enlazaron a las células t ransf ectadas por el vector, confirmando la especificidad de estos enlaces. Estos enlaces indican que el TNFR-6 alfa se puede enlazar a formas solubles y enlazadas a la membrana del AIM-II. TNFR-6 alfa inhibe la citotoxicidad inducida por el AIM-II en células HT29 Browning et al. (J. Exp. Med. 183,867-878 (1996) ) ha mostrado que la activación Fas conduce a una muerte rápida de células (12-24 h) mientras que el LTPR toma de 2-3 días en la inducción de la apoptosis para la línea de células colorectal de adenocarcinomas HT29. Zhai et al. (J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998) ) también reporta que el AIM-II conduce a la muerte de las células que expresan tanto el LT R como el HVEM/TR2 pero no a las células que expresan solamente al receptor LTPR O HVEM/TR2. Aunque el HVEM/TR2 y el LTPR se involucran cooperativamente en el exterminio mediado por el AIM-II de las células HT29 (Zhai Y. , et al. J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998 ) ) . Para determinar si el enlace de TNFR-6 alfa inhibe la citotoxicidad mediada por AIM-II, se incubaron células HR29 con 10 mg/ral de AIM-II soluble e IFN-? (10 U/ml) en presencia de 200 ng/ml de LTpR-Fc o TNFR-6 alfa-(His) . El TNFR-6 alfa- (His) bloquea significativamente el exterminio de células' mediado por AIM-II. Las células se incubaron también con AIM-II soluble y/o IFN-? en presencia de una concentración variable de TNFR-6 alfa-(His) . El TNFR-6 alfa- (His) bloqueó la muerte celular inducida por AIM-II soluble en una forma dependiente de la dosis. Tomado junto, el TNFR-6 alfa parece actuar como un inhibidor natural del exterminio de células de tumor inducidas por AIM-II los datos también sugieren que el TNFR-6 alfa contribuye a la evasión inmune de tumores. La interacción del AIM-II con HVEM/TR2-Fc y/o LTPR puede disparar los diferentes eventos biológicos tales como la proliferación de células T, bloqueando la infección de HSV1 dependiente del HVEM y la actividad anti-tumor (Mauri, D. N . , et al., Immunity 8, 21-30 (1998); Zhai Y., et al., J. Clin. Invest. 102, 1142-1151 (1998); Harrop, J. A. et al., J. Biol. Chem. 273,27548-27556 (1998) ) . El TNFR-6 alfa puede actuar como un inhibidor de la interacción AIM-II que puede jugar diversos roles en diferentes tipos de células. El TNFR-6 alfa puede actuar como un receptor de señuelo y contribuir a la evasión inmune en una muerte celular de tumores rápida y lenta, que está mediada por la trayectoria de la apoptosis mediada por Fas L y/o AIM-II. Otra posibilidad es que el TNFR-6 alfa pueda funcionar como una citosina para disparar el FasL o el AIM-II enlazados a la membrana y transducir directamente señales a través del FasL o el AIM-II. Recientemente los grupos de Desbarate y Suzuki reportaron que el FasL puede por si mismo transducir señales, conduciendo a un arresto del ciclo de la célula y muerte celular en células T CD4+ pero a la proliferación de células en las células TCD8+ (Desbarats, et al., Nature medicine 4, 1377-1382(1998); Suzuki, I., et al. J. Exp. Med. 187, 123-128(1998)) . Por lo tanto, el TNFR-6 alfa puede estar involucrado en la señalización a través del FasL y AIM-II. Las células HUVEC constitutivamente expresan el TNFR-6 alfa en el análisis RT-PCR. El AIM-II y FasL se ha conocido que se expresan en las células T activadas. Por lo tanto, se especula que el TNFR-6 alfa y sus ligandos son importantes para las interacciones entre los linfocitos T activados y el endotelio. El TNFR-6 alfa puede estar involucrado en el movimiento de las células T activadas asi como en la supervivencia de las células endoteliales . Ejemplo 8: Ensayo de apoptosls inducido por la activación La apoptosis inducida por la activación se ensaya usando células de leucemia Sub T-13T y se mide por el análisis de ciclo de células. El ensayo se lleva a cabo como sigue. Las células sub T-13 se mantienen en RPMI conteniendo FCS al 10% en un crecimiento logarítmico (alrededor de 1 x 106) . Las células sub t-13 se siembran en pozos de una placa de 24 pozos a 0.5 x 106/ml, 1 ml/pozo . Se agrega la proteína AIM-II o la proteína del ligando Fas (0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 ng7ml) o una solución amortiguadora de control a los pozos y las células de incuban a 37°C durante 24 horas en presencia o ausencia de los polipéptidos TNFR de la invención. Los pozos de otra placa de 24 pozos se preparan con o sin el anticuerpo anti-CD3 al incubar BC3 mAb purificado a una concentración de 10 µ?/p?? en solución amortiguadora de bicarbonato 0.5 M filtrada estéril, pH 9.5 o solamente solución amortiguadora en pozos a 0.5 ml/pozo. La placa se incuba a 4°C durante la noche. Los pozos de las placas recubiertas con anticuerpo se lavan tres veces con PBS estéril a 4°C. las células Sub-tl3 tratadas se transfieren a los pozos recubiertos con anticuerpos y se incuban durante 18 horas ' a 37°C. La apoptosis se mide por el análisis del ciclo de célula usando el yoduro de propidio y citometria de flujo. La proliferación de las células tratadas se mide al tomar un total de 300 µ? de cada pozo de tratamiento y entregarlo en pozos triplicados (100 µ?/????) de placas de 96 pozos. A cada pozo se agregan 20 µ?/???? de 3H-timidina (0.5 µ??/20 µ? , 2 Ci/mM) y se incuba a 18 horas a 37°C. Se cosecha y se cuenta la retoma de 3H-timidina por las células. Esta medición se puede usar para confirmar un efecto sobre la apoptosis si se observa por otros métodos. Los controles positivos para el ensayo son el reticulado Anti-CD3 solamente, ligando Fas solamente y/o AIM-II solamente. Además, la apoptosis profunda y reproducible en esta linea usando el anticuerpo monoclonal anti-Fas (500 ng/ml en forma soluble IgM mAb ) ha sido demostrada. El control negativo para el ensayo es el medio o la selección amortiguadora solamente. También, el reticulado con otro anti-CD3 mAb (0KT3), se ha demostrado que no tiene efecto. Los agonistas de TNFR de conformidad con la invención, demostrarán una apoptosis reducida cuando se comparan con el tratamiento de la célula Sub-T13 con AIM-II o el ligando Fas en ausencia del agonista TNFR. Los antagonistas TNFR de la invención, se pueden identificar al combinar los polipéptidos TNFR que tienen el ligando Fas o la afinidad de enlace AIM-II (por ejemplo el TNFR maduro) con el polipéptido TNFR a probarse y hacer contacto de esta combinación y solución con el AIM-II y/o el ligando Fas y las células Sub-T13. El control negativo para este ensayo es una mezcla que contiene el TNFR maduro, las células sub-T13 y el AIM-II o el ligando Fas (FasL) solamente. Las muestras que contienen los antagonistas TNFR de la invención, demostraran una apoptosis creciente cuando se comparen con el control negativo. Si se observa un efecto por análisis de ciclo de células, las células se pueden además teñir por el ensayo TUNEL para citometria de flujo o con Anexina V, usando las técnicas bien conocidas por aquellos hábiles en el arte. Ejemplo 9: Bloqueo de la apoptosis mediada por el ligando Fas de las células T de Jur at por el TNFR-6 alfa-Fe Métodos Las células T de Jurkat que expresan al receptor Fas se trataron con el ligando sFas solamente o con el ligando sFas en combinación con Fas-Fc, o TNFR-6 alfa-Fc (correspondiendo a la proteina TNFR-6 alfa de longitud completa (aminoácidos 1-300 de la SEQ ID NO. 2) fundida a un dominio Fe, como aquí se describe) . La proteina del ligando sFas utilizada se obtuvo de Alexis Corporation y contiene una etiqueta de epitope Flag en su terminación N. Como se ha demostrado previamente, el reticulado del ligando Fas que utiliza el epitope monoclonal Flag aumenta significativamente la capacidad del ligando Fas para mediar la apoptosis, el anticuerpo Flag se incluyó en este estudio. Específicamente, 106 células Jurkat (RPMI + suero al 5%) se trataron con el ligando Fas (Alexis) (20 hg/ml) y anti-Flag Mab (200 ng/ml) y se incubaron después a 37°C durante 16 horas. Cuando se incluyó el TNFR-6 alfa-Fc en el ensayo, el receptor se preincubó con el ligando Fas y el anti-Flag Mab durante 15 minutos . Resul tados Después de la incubación, se cosecharon las células se volvieron a suspender en PBS y se sometieron a un análisis citométrico de flujo (Tabla V) . En ausencia del ligando Fas(FasL), aproximadamente 1% de las células parecían someterse a la apoptosis como se mide por un alto teñido de anexina y un pobre teñido con el yoduro de propidio (Tabla IV) . El tratamiento con el ligando Fas soluble solamente, resultó en un incremento de aproximadamente 7 veces en el número de células apoptóticas que se esperaba pudieran bloquearse en presencia del Fas-Fc. Similar al Fas-Fc, el TNFR-6 alfa-Fc fue también capaz de bloquear la apoptosis mediada por Fas con el bloqueo del TNFR-6 alfa-Fc observado en una forma dependiente de la dosis sobre tres escalas logarítmicas (Tabla V) . La capacidad del TNFR-6 alfa-Fc para bloquear el exterminio mediado por el Fas de las células Jurkat, se determinó también en un ensayo de muerte celular (figura 7A-B) . En este ensayo, las células se trataron nuevamente con combinaciones del ligando Fas y el TNFR-6 alfa-Fc durante 16 horas. Para medir los niveles de células viables después del tratamiento, se incubaron células durante 5 horas con azul ALOMAR al 10% y se examinaron espectrofotomét ricamente a un OD 570nm-630nm. El tratamiento con el ligando Fas resultó en una. disminución de 50% en la viabilidad de las células (figuras 7A-B) . La disminución en la viabilidad de las células se puede superar por el Fas-Fc o TNFR-6 alfa-Fc pero no el TR5-Fc (figuras 7A-B), confirmando la capacidad del TNFR-6 alfa de interferir con la actividad mediada con el ligando Fas. La capacidad del TNFR-6 alfa-Fc a 100 ng/ml para bloquear la actividad mediada por el ligando Fas en este ensayo, es estadísticamente diferente (p<0.05) que cuando no se agrega TNFR-6 alfa-Fc (figuras 7A-B) . Además, la capacidad del TNFR-6 alfa-Fc para bloquear la muerte celular mediada por el ligando Fas y la apoptosis, parece ser tan eficiente como el Fas-Fc (Tabla V y figura 7A-B) . Tabla V. El análisis FACS revela el bloqueo de la apoptosis mediada por el ligando Fas: Se trataron 106 células Jurkat (RPMI + 5% de suero) con el ligando Fas (Allexis; 20 ng/ml) y anti-FLAG (200 ng/ml) y después se incubaron a 37°C 16 horas. Cuando se incluyó el receptor Fe en el ensayo, el receptor se preincubó con el ligando Fas y el anti-FLAG Mab durante 15 minutos. Después de la incubación, se cosecharon las células, se volvieron a suspender en PBS y se sometieron a un análisis citométrico de flujo. Tratamiento % de células que se someten a apoptosis Control (solución amortiguadora) 1. 24 FasL (20 ng) 8. 87 Fas L (20 ng)+Fas-Fc (100 ng) 1. 78 FasL (20 ng)+ TNFR-6 al fa- Fe ( 100 ng ) 1. 24 FasL (20 ¦ng)+ TNFR-6 alfa-Fc ( 1 Ong ) 2. 79 FasL (20 ng)+ TNFR-6 alfa-Fc(lng) 7. 95 FasL (20 ng)+ TNFR-6 al fa- Fe ( 0. lng ) 8. 58 Conclusiones . El TNFR-6 alfa-Fc parece bloquear la apoptosis mediada por el ligando Fas de las células Jurkat de una forma dependiente de la dosis tan efectivamente como el ligando Fas. Ejemplo 10: Fusiones de proteínas del TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta Los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de la invención se funden opcionalmente a otras proteínas. Estas proteínas de fusión se pueden usar para una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, la fusión de los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta a la etiqueta His, etiqueta HA, proteína A, dominios IgG y proteína de enlace a la maltosa facilita ' la purificación. (Ver EP A 394,827; Traunecker, et al.r Nature 331:84-86(1998)) . Similarmente, la fusión de IgG-1, IgG-3, y albúmina incrementa el tiempo de vida medio in vivo. Las señales de localización nuclear fundidas a los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden atacar la proteína hasta una localización sub-celular específica, ya que el heterodímero u homodímero covalentes pueden incrementar o disminuir la actividad de una proteína de fusión. Las proteínas de fusión también pueden crear moléculas quiméricas que tienen más de una función. Finalmente las proteínas de fusión pueden incrementar la solubilidad y/o estabilidad, de una proteína fundida en comparación con la proteína no fundida. Todos los tipos de proteínas de fusión descritos arriba se pueden hacer usando las técnicas conocidas en el arte o al usar o modificar rutinariamente el siguiente protocolo, que detalla la fusión de un polipéptido a una molécula de IgG.
Brevemente, la porción humana de Fe de la molécula de IgG puede ser amplificada por PCR, usando cebadores que abarcan los extremos 5' y 3' de la secuencia descrita abajo. Estos cebadores contienen también preferiblemente sitios convenientes de enzimas de restricción que facilitarán la clonación dentro de un vector de expresión, preferiblemente un vector de expresión mamí fe ro . Por ejemplo, si el vector de expresión pC4 (número de acceso 209646) se usa, la porción humana de Fe se puede ligar dentro del sitio de clonación BamHI. Observar que el sitio BamHI en 3' se debe destruir. Después, el vector que contiene la porción de Fe humano se vuelve a restringir con BamHI, se linealiza el vector, y el polinucleótido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta, aislado por el protocolo de PCR descrito en el ejemplo 1, se liga dentro del sitio BamHI. Observar que el polinucleótido se clona sin un codón de detención, de otra manera no se producirá una proteina de fusión .
Si se usa la secuencia de señal que se presenta naturalmente para producir la proteina segregada, el pC4 no necesita un segundo péptido de señal. Alternativamente, si no se usa la secuencia de señal que se presenta naturalmente, el vector se puede modificar para incluir una secuencia de señal heteróloga. (Ver por ejemplo, publicación de la solicitud Internacional No. O 96/34891) . Región Fe de IgG humano: AGACAAAGCCKGGGAGGAGC¾GTAC.^^ GGCTGAATC^XLAAGGAG^^^ AAGCG¾A C X^¾GCCCCGAGAAC^ T AGCC GACCTGCCTCGT AAAGGC^ AaAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGlX^ ??????s?????? ????s??^ A ^GAGCCTCTCCCTGXTCCGGGTA^ (SEQ ID NO:27) Ejemplo 11: Producción de un Anticuerpo a) Tecnología de hibridoma los anticuerpos de la presente invención se puede preparar por una diversidad de métodos. (Ver, Protocolos Actuales, Capitulo 2) . Un ejemplo de tales métodos, la expresión de células TR-6 alfa y/o TR-6 beta se administran a un animal para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. En un método preferido, una preparación de proteina TR-6 alfa y/o TR-6 beta se prepara y purifica para producirla substancialmente libre de contaminantes naturales. Dicha preparación se introduce después dentro de un animal para producir los antisueros policlonales de mayor actividad especifica. Los anticuerpos monoclonales específicos para la proteína TR-6 alfa y/o TR-6 beta se preparan usando tecnología de hibridoma (Kohler et al., Nature 256: 95(1975) ; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511(1976) ; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292(1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp . 563-681(1981)) . En general, se inmuniza un animal (preferiblemente un ratón) con el polipéptido TR-6 alfa y/o TR-6 beta o más preferiblemente con una célula que expresa a los polipéptidos TR-6 alfa y/o TR-6 beta segregados. Tales células que expresan polipéptidos se cultivan en cualquier medio apropiado de cultivo de tejido, preferiblemente en un medio de Eagle modificado por Earle complementado con suero fetal de bovino al 10% (inactivado alrededor de 56°C) , y complementado con alrededor de 10 g 1 de aminoácidos no esenciales, alrededor de 1,000 U/ml de penicilina, y alrededor de 100 µq/vc?l de estreptomicina. Se extraen los esplenocitos de tales ratones y se funden con una linea apropiada celular de mieloma. Cualquier linea celular de mieloma apropiada se puede emplear según la presente invención, sin embargo, es preferible emplear la linea padre de célula de mieloma (SP20) , disponible de ATCC. Después de la fusión, se mantienen selectivamente las células de hibridoma resultantes en un medio HAT, y después se clonan por dilución limitada como se describe por Wands et al, (Gastroenterology 80:225-232 (1981) . Las células de hibridoma obtenidas a través de dicha selección se ensayan después para identificar clones que segregan anticuerpos capaces de enlazar al polipéptido TR-6 alfa y/o TR-6 beta. Alternativamente, se pueden producir anticuerpos adicionales capaces de enlazar al polipéptido TR-6 alfa y/o TR-6 beta en un procedimiento de dos etapas usando anticuerpos ant i-idiotipicos . Tal método hace uso del hecho de que los anticuerpos son en sí mismos antígenos y por lo tanto, es posible tener un anticuerpo que se enlace a un segundo anticuerpo. De conformidad con este método, los anticuerpos específicos de proteínas se usan para inmunizar un animal preferiblemente en un ratón. Los esplenocitos de tal animal se usan después para producir células de hibridoma y las células de hibridoma se separan por exclusión para identificar los clones que producen un anticuerpo cuya habilidad para enlazar al anticuerpo especifico de la proteína TR-6 alfa y/o TR-6 beta se puede bloquear por el TR-6 alfa y/o TR-6 beta. Tales anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos al anticuerpo específico de la proteína TR-6 alfa y/o TR-6 beta y se usan para inmunizar un animal para inducir la formación de anticuerpos adicionales específicos de proteína TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Para el uso in vivo de anticuerpos en humanos, un anticuerpo se "humaniza". Tales anticuerpos se pueden producir usando constructos genéticos derivados de células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales arriba descritos. Se conocen en el arte y se discuten infra los métodos para la producción de anticuerpos quiméricos y humanizados. (Ver para revisión, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214(1986); Cabilly et al., U.S. Patente No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al.r WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671; Boulianne et al., Nature 312:643(1984); Neuberger et al., Nature 314:268 ( 1985) ) . b) Aislamiento de fragmentos de anticuerpo dirigidos contra el TR-6 alfa y/o TR-6 beta de una colección de scFvs. Los genes V que se presentan naturalmente aislados de PBL humano se construyen en una colección de fragmentos de anticuerpo que contienen reacciones contra el TR-6 alfa y/o TR-6 beta a las cuales puede o puede no haber sido expuesto el donador (ver por ejemplo, Patente U.S. 5,885,793 que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Rescate de la colección. Se construye una colección de scFvs del ARN de PBLs humano como se describen en la publicación PCT WO 92/01047. Para rescatar los fragmentos de anticuerpos que despliegan fagos, se usan aproximadamente 109 E. coli que alojan el fagémido para inocular 50 mi de 2 x TY que contienen glucosa al 1% y 100 µ?/ml de ampicilina ( 2xTY-AMP-CLU ) y se hace crecer hasta un O.D. de 0.8 con agitación. Se usan cinco mi de este cultivo para inocular 50 mi de 2xTY-AMP-CLU , se agregan 2 x 108 TU del auxiliar del gen delta 3 (gen III delta M13, ver la publicación PCT WO 92/01047) y el cultivo se incuba a 37°C durante 45 minutos sin agitar y después a 37°C durante 45 minutos con agitación. El cultivo se centrifuga a 4000 r.p.m. durante 10 minutos y el peletizado se vuelve a suspender en 2 litros de 2xTY que contiene 100 µg/ml· de ampicilina y 20 µg ml de kanamicina y se hace crecer durante la noche. Se preparan los fagos como se describe en la publicación PCT WO 92/01047. El gen III delta M13 se prepara como sigue: el fago auxiliar del gen III delta M13 no codifica la prote na del gen III, por lo tanto el fago (medio) que despliega los fragmentos de anticuerpo tiene una mayor avidez para enlazar al antigeno. Las partículas del gen III delta M13 infeccioso se hacen al hacer crecer el fago auxiliar en células que alojan un derivado pUC19 que suministra la proteína del gen III de tipo silvestre durante la morfogénesis de fago. El cultivo se incuba durante 1 hora a 37°C sin agitación y después por 1 hora adicional a 37°C con agitación. Las células se hacen girar (IEC-Centra 8,400 r-p-m. durante 10 minutos), se vuelven a suspender en un caldo de 300 mi de 2xTY que contiene 100 de ampicilina/ml y 25 µg de kanamicina/ml (2xTY-AMP- KA ) y crecen durante la noche agitando a 37°C. Las partículas de fago se purifican y concentran del medio de cultivo por dos precipitaciones PEG (Sambrook et al., 1990), se vuelven a suspender en 2 mi de PBS y pasan a través de un filtro de 0.45µp? (Minisart NML; Sartorius) para dar una concentración final de aproximadamente 1013 unidades de transducción/ml (clones resistentes a la ampicilina ) . Lavado por extracción de la colección. Se recubren los inmunotubos (Nunc) durante la noche en PBS con mi de 100 µg/ml o 10 µg/ml de un polipéptido de la presente invención. Los tubos se bloquean con Marvel-PBS al 2% durante 2 horas a 37°C y después se lavan 3 veces en PBS. Aproximadamente 1013 TU de fago se aplican al tubo y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente moviendo por encima y bajo la tornamesa y después dejándose estático por otras 1.5 horas. Los tubos se lavan 10 veces con PBS al 0.1% Tween- 20 y 10 veces con PBS. Se inhiben los fagos al agregar 1 mi de trietilamina 100 mM y girando 15 minutos sobre y bajo la tornamesa después de lo cual se neutraliza inmediatamente la solución con 0.5 mi de Tris-HCl 1.0 , pH 7.4. Los fagos se usan después para infectar 10 mi de E.coli TG1 mid-log al incubar los fagos inhibidos con bacterias durante 30 minutos a 37°C. Las E. coli se colocan después en placas sobre placas TYE que contienen glucosa al 1% y 100 µg/ml de ampicilina. La colección bacteriana resultante se rescata después con el fago auxiliar del gen 3 delta como se describió arriba para preparar el fago para una subsecuente ronda de selección. Este proceso se repite después por un total de 4 rondas de purificación por afinidad con lavado de tubos sincronizado hasta 20 veces con PBS, Tween-20 al 0.1% y 20 veces con PBS para las rondas 3 y 4. Caracterización de los enlazadores. Los fagos eluidos de la tercera y cuarta ronda de selección se usan para infectar E. coli HB 2151 y se produce scFv soluble (Marks, et al., 1991) de colonias simples para el ensayo. Se llevan a cabo ELISAs con placas de microtitulacion recubiertas con 10 pg/ml del polipéptido de la presente invención en 50 mM de bicarbonato pH 9.6. Los clones positivos en ELISA se caracterizan además por la impresión de huellas PCR (ver, por ejemplo, la publicación PCT WO 92/01047)y después por formación de secuencias . Ejemplo 12: Método para la determinación de alteraciones en los genes de TNFR-6 alfa y/o TNFR- 6 beta Se aisla el ARN de familias completas o de pacientes individuales que presentan un fenotipo de interés (tal como una enfermedad) . Se genera después el cADN de estas muestras de ARN usando protocolos conocidos en el arte (ver, Sambrook) . El cADN se usa después como una plantilla para el PCR, empleando cebadores que rodean las regiones de interés en SEQ ID NO: 1. Las condiciones sugeridas de PCR consisten de 35 ciclos a 95°C durante 30 segundos, 60-120 segundos a 52-58°C; y 60-120 segundos a 70°C, usando soluciones amortiguadoras descritas en Sidransky, D., et al., Science 252:106(1991) . Los productos de PCR se forman en secuencias después usando los cebadores etiquetados en su extremo 5' con cinasa de polinucleót ido T4, empleando la polimerasa SequiTherm . (Epicentre Technologies) . Las fronteras intron-exon de los exones seleccionados del TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se determinan también y se analizan los productos del PCR genómico para confirmar los resultados. Los productos de PCR que alojan las mutaciones esperadas en TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se clonan después y forman secuencias para validar los resultados de la formación directa de secuencia . Los productos de PCR de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se clonan en vectores de cola T como se describen en Holton, T.A. and Graham, M.W., Nucleic Acids Research, 19:1156(1991) y forman secuencias con la polimerasa T7 (United States Biochemical) . Los individuos afectados se identifican por mutaciones en el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta no presentes en los individuos no afectados . Se observan también rearreglos genómicos como un método para la determinación de alteraciones en los genes TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Los clones genómicos aislados usando técnicas conocidas en el arte, se traducen a hendiduras con digoxigenindeoxi-uridina 5' -trifosfato (Boehringer Manheim) , y FISH llevado a cabo como se describe en Johnson, et al., Methods Ceel Biol. 35:73- 99(1991) . Se lleva a cabo la hibridación con la sonda etiquetada usando un exceso amplio de ADN cot-1 humano para la hibridación especifica hasta el lugar genómico del TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta.
Los cromosomas se contratiñen con 4,6-diamino- 2-fenilidol y yoduro de propidio, produciendo una combinación de bandas C y R. Se obtienen imágenes alineadas para un mapeo preciso usando un conjunto de filtros de triple banda (Chroma Technology, Brattleboro, VT) en combinación con una cámara acoplada con un dispositivo de carga enfriada. ( Photometrics, Tucson, AZ ) y filtros variables de excitación de longitud de sondas. (Johnson, et al., Genet. Anal. Tech. Appl . , 8:75(1991)) . Se llevan a cabo la formación de imágenes recolección, análisis y mediciones de la longitud fraccional de los cromosomas usando el sistema de programa gráfico Isee. (Inovision Corporation, Durham, NC) . Las alteraciones de cromosomas de la región genómica de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta (hibridizado por las sondas) se identifican como inserciones, eliminaciones y transubicaciones.
Estas alteraciones TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se usan como un marcador de diagnóstico para una enfermedad asociada. Ejemplo 13: Método para detecció de niveles anormales y el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en una muestra biológica Se pueden detectar polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en una muestra biológica y si se detecta un nivel creciente o disminuido de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta, este polipéptido es un marcador para un genotipo particular. Son numerosos los métodos de detección, y asi, se entiende que alguien habilitado en el arte puede modificar el siguiente ensayo para ajustar las necesidades particulares. Por ejemplo, se usan ELISA intercaladas con anticuerpos para detectar el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en una muestra, preferiblemente una muestra biológica. Se recubren pozos de una placa de microtitulación con anticuerpos específicos al TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta, a una concentración final de 0.2 a 10 µg/ml. Los anticuerpos son ya sea policlonales o monoclonales y se producen usando la técnica conocida en el arte. Los pozos se bloquean de manera que se reduce el enlace no específico del TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta al pozo . Los pozos recubiertos se incuban después durante >2 horas a RT con una muestra que contiene TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Preferiblemente, las diluciones en serie de la muestra se deben usar para validar los resultados. Las placas se lavan después tres veces con agua desionizada o destilada para separar el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta no enlazado. En seguida, se agregan 50 µ? de un conjugado de fosfatasa alcalina de anticuerpo específico a una concentración de 25-400 ng, y se incuba por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan nuevamente tres veces con agua desionizada o destilada para eliminar el conjugado no enlazado. Se agregan después 75 ul de una solución de substrato de -me t i lumbe 1 i t e r i 1 fo s fa t o (MUP) o p-nitrofenil fosfato (NPP) a cada pozo y se incuba 1 hora a temperatura ambiente para permitir el desdoblamiento del substrato y la fluorescencia. Se mide la fluorescencia por un vector de placas de microtitulación . Se prepara una curva estándar usando los resultados experimentales de diluciones en serie de una muestra de control con una concentración de muestra graficada en el eje de las X (escala log) y la fluorescencia o absorbancia en el eje de las Y (escala lineal) . La concentración de polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en una muestra se interpola después usando la curva estándar con base en la fluorescencia medida de esa muestra. Ejemplo 14: Métodos para tratar los niveles disminuidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta La presente invención se refiere a un método para tratar a un individuo que requiere un nivel disminuido de actividad biológica TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en el cuerpo, que comprende administrar a tal individuo una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta antagonista. Los antagonistas preferidos para su uso en la presente invención son los anticuerpos específicos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Más aún, se apreciará que las condiciones provocadas por una disminución en un nivel de expresión estándar o normal de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en un individuo, se pueden tratar al administrar el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta, preferiblemente en una forma soluble y/o segregada. Así, la invención también suministra un método para el tratamiento de un individuo que necesita un nivel creciente del polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta que comprende la administración a tal individuo de una composición farmacéutica que comprende una cantidad de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta para incrementar el nivel de actividad biológica del TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en tal individuo. Por ejemplo, un paciente con niveles disminuidos de polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta recibe una dosis diaria de 0.1-100 ug/kg del polipéptido durante seis días consecutivos. Preferiblemente, el polipéptido está en una forma soluble y/o segregada. Ejemplo 15: método para el tratamiento de niveles de crecientes de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta La presente invención también se refiere a un método para el tratamiento de un individuo que necesita un nivel creciente de actividad biológica TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en el cuerpo, que comprende la administración a dicho individuo de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de TNFR-6 alfa y/o TNFR- 6 beta o un agonista del mismo. Se usa la tecnología antisentido para inhibir la producción de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Esta tecnología es un ejemplo de un método para disminuir los niveles del polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta, preferiblemente una forma soluble y/o segregada debido a una variedad de etiologías tales como el cáncer. Por ejemplo, un paciente diagnosticado con niveles anormalmente crecientes de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se le administran polinucleótidos antisentido de forma intravenosa a 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 3.0 mg/kg día por 21 días. Este tratamiento se repite después de un periodo de descanso de 7 días y se determina que es bien tolerado. Ejemplo 16: Método de tratamiento usando terapia de genes - ex vivo Un método de terapia de genes transplanta fibroblastos, que son capaces de expresar los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta solubles y/o maduros sobre un paciente. Generalmente los fibroblastos se obtienen de un sujeto por biopsia de la piel. El tejido resultante se coloca en un medio de cultivo de tejido si se separan en piezas pequeñas. Trozos pequeños del tejido se colocan por sobre una superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejidos, se colocan aproximadamente 10 piezas en cada matraz. El matraz se mueve hacia arriba y abajo, se cierra hermético y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, se invierte el matraz y los trozos de tejido permanecen fijos al fondo del matraz y se agrega medio fresco (por ejemplo, medio Ham F12 con penicilina FBS al 10% y estreptomicina) , los matraces se incuban después a 37°C durante aproximadamente una semana. En este punto, se agregan medios frescos y se cambian posteriormente cada varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, aparece una monocapa de fibroblastos. La monocapa se trata con tripsina y se escala en matraces más grandes. El pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988)), flanqueado por las repeticiones de la terminal larga del virus del sarcoma de murina de Moloney, se digiere con EcoRI e HindIII y se trata posteriormente con fosfatasa intestinal de cordero. Se fracciona el vector lineal sobre gel de agarosa y se purifica usando perlas de vidrio .
El cADN que codifica el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se puede amplificar usando los cebadores de PCR que corresponden al extremo 5' y 3' que codifican la secuencia respecti amente. Preferiblemente el cebador 5' contiene un sitio EciRI y y el cebador 3' incluye un sitio HindIII. Cantidades iguales de la columna vertebral lineal del virus de sarcoma murina de Moloney y el fragmento amplificado EcoRI e HindIII se agregan juntos en presencia de una ligasa de ADN T4. La mezcla resultante se mantiene bajo condiciones apropiadas para la unión de los dos fragmentos. La mezcla de unión se usa después para transformar la E. coli HB101, que es después colocada en placas sobre agar que contienen kanamicina para efecto de confirmar que el vector contiene adecuadamente insertados el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Las células anfotrópicas de empaque pA317 o GP+aml2 se hacen crecer en cultivo de tejidos hasta una densidad confluente en el medio modificado Dulbecco Eagles (DME ) con suero de cordero al 10% (CS) , penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene los genes de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se agrega después a los medios y se transducen las células de empaque con el vector. Las células de empaque producen ahora partículas vírales infecciosas que contienen el gen de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta (las células de empaque se refieren ahora como células productoras ) . Se agregan medios frescos a las células productoras transducidas y posteriormente, los medios se cosechan de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. Los medios gastados que contienen las partículas vírales infecciosas, se filtran a través de un filtro millipore para separar las células productoras eliminadas y este medio se usa después para infectar células de fibroblastos. Se separan los medios de una placa sub-confluent e de fibroblastos y se reemplazan rápidamente con los medios de las células productoras. Este medio se separa y se reemplaza con medios frescos. Si la titulación del virus es alta, entonces estarán infectados virtualmente todos los fibroblastos y no se requiere ninguna selección. Si la titulación es muy baja entonces es necesario usar un vector retroviral que tengan un marcador de selección tal como neo o his. Una vez que los fibroblastos han sudo infectados eficientemente, se analizan los fibroblastos para determinar si la proteina TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se produce. Los fibroblastos preparados con ingeniería se transplantan después sobre el huésped ya sea solos o después de hacerse crecer para confluir en el microportador de perlas cytodex 3. Ejemplo 17 Método de tratamiento usando terapia de genes in vivo Otro aspecto de la presente invención es el uso de una terapia de genes in vivo para tratar trastornos, enfermedades y condiciones. El método de la terapia de genes se refiere a la introducción de secuencias desnudas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de ácido nucleico ( AD , ARN y ADN o ARN antisentido) dentro de un animal para aumentar o disminuir la expresión del polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. El polinucleótido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta puede unirse operativamente a un promotor o a cualquier otro elemento genético necesario para la expresión del polipéptido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta por el tejido objetivo. Tales técnicas y métodos de terapia de genes y entrega se conocen en el arte, ver por ejemplo, publicación de la Solicitud Internacional número WO 90/11092, publicación de la Solicitud Internacional número WO 98/11779; Patente US No. 5693622, 5705151, 5580859, Tabata H. et al., Cardiovasc. Res. 35:470- 79(1997) ; Chao J. et al., Pharmacol. Res. 35:517-522 (1997); Wolff J.A. Neuromuscul . Disorb. 7:314-318 (1997); Schwartz B. et al., Gene Ther. 3:405-411 (1996); Tsurumi Y. et al., Circulation 94:3281-3290(1996); (incorporado aquí como referencia) . Los constructos de polinucleótidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se pueden suministrar por cualquier método que suministre materiales inyectables a la célula de un animal, tales como, por ejemplo, inyección dentro del espacio intersticial de tejidos (corazón, músculos, piel, pulmón, hígado, intestino y similares. Los constructos de polinucleótidos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se pueden suministrar en un portador líquido o acuoso farmacéuticamente aceptable. El término po 1 inucl eót ido , ADN o ARN "desnudo", se refiere a secuencias que están libres de cualquier vehículo de entrega que actúe para ayudar a promover o facilitar la entrada dentro de las células incluyendo secuencias virales, partículas virales, formulaciones de liposomas, lipofectina o agentes de precipitación similares. Sin embargo, los polinucleót idos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden también entregarse en formulaciones de liposomas (tal como aquellas enseñadas en Felgne P.L. et al., (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772:126-139 y Abdallah B. et al. (1995)Biol. Cell 85(1) :l-7) que se pueden preparar por métodos bien conocidos por aquellos hábiles en el arte . Los constructos del vector de polinucleót idos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta usados en el método de terapia de genes, son preferiblemente constructos que no se integraran dentro del genoma Western ni contendrán secuencias que permitan la replicación. Cualquier promotor fuerte conocido por aquellos hábiles en el arte se puede usar para impulsar la expresión del ADN . A diferencia de otras técnicas de terapia de genes, una ventaja importante dentro de sus secuencias desnudas de ácido nucleicos en las células objetivo, por la naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleót idos en las células. Los estudios han mostrado que las secuencias no replicantes de ADN se pueden introducir en células para proporcionar la producción del polipéptido deseado por periodos de hasta seis meses.
El constructo de polinucleótidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se puede entregar al espacio intersticial de tejidos dentro de animales incluyendo músculos, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula espinal, timo, corazón, ganglio, sangre, huesos, cartílagos, páncreas, riñon, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovarios, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándulas y tejido conectivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende el fluido intercelular, la matriz mu copo 1 i s a cá r i do entre las fibras reticulares de los tejidos orgánicos, fibras elásticas en las paredes de los vasos o cámaras, fibras de colágeno, o tejidos fibrosos, o la misma matriz dentro del tejido conectivo que protege a las células del músculo o en las lagunas de los huesos. Es similarmente el espacio ocupado por el plasma de la circulación del fluido linfático de los canales linfáticos. La entrega al espacio intersticial de tejido muscular, se prefiere por las razones abajo discutidas. Pueden entregarse convenientemente por inyección dentro de los tejidos que comprenden estas células. Se entregan preferiblemente y se expresan en células persistentes, no divisorias que se diferencian, aunque la entrega y expresión se puede alcanzar en células no diferenciadas o diferenciadas menos completamente, tales como, por ejemplo, células madre de la sangre o fibroblastos de la piel. Las células musculares in vivo son particularmente competentes por su capacidad de tomar y expresar polinucleótidos . Para la inyección de polinucleótidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta desnudos, una cantidad efectiva de dosis de ADN o ARN estará en el intervalo de alrededor de 0.5 g/kg de peso corporal hasta alrededor de 50 mg/kg. Preferiblemente la dosis estará desde alrededor de 0.005 mg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg y más preferiblemente desde alrededor de 0.05 mg/kg hasta alrededor de 5 mg/kg. Por supuesto, como lo apreciará el técnico con la habilidad ordinaria, esta dosis variará según el sitio de tejido de la inyección. La dosis efectiva y apropiada de secuencia de ácido nucleico se puede determinar fácilmente por aquellos con habilidad ordinaria en el arte y puede depender de la condición mejor tratada en la via de administración. La vía de administración preferida es la via parenteral de inyección dentro del espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, otras vías parenterales se pueden usar tales como la inhalación de una formulación en aerosol particularmente para suministro a los pulmones o tejidos bronquiales, garganta, o en membranas mucosas de la nariz. Además, los constructos de po 1 inuc 1 eó t i dos desnudos de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta se pueden suministra a las arterias durante la angioplastia por el catéter usado en el procedimiento. Los efectos de respuesta a la dosis de polinucleótido TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en músculos in vivo se determina como sigue. Se prepara un ADN de plantilla apropiado de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta para la producción de un mARN que codifique a los polipéptidos TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta según una metodología estándar de ADN recombinante . El ADN de la plantilla, que puede ser circular o lineal, se usa como ADN desnudo o forma complejos con liposomas. Los músculos del cuadríceps de ratones se inyectan después con diversas cantidades del ADN de plantilla. Se anestesian ratones hembra y machos Balb/C de cinco a seis semanas de edad por inyección int raper itoneal con 0.3 mi de Avertina al 2.5%. Se hace una incisión de 1.5cm en el muslo y se visualiza directamente el músculo del cuadríceps. Se inyecta ADN de plantilla de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en 0.1 mi de portador en una jeringa de Ice a través de una aguja de calibre 27 durante un minuto, aproximadamente a 0.5 era del sitio de inserción distal del músculo en la rodilla y alrededor de 0.2 cm de profundidad. Se coloca una sutura sobre el sitio de inyección para ubicación futura y se cierra la piel con pinzas de acero inoxidable. Después de un tiempo de incubación apropiado (por ejemplo, 7 días) se preparan extractos de músculo al cortar el cuadríceps completo. Cada quinto de sección transversal de 15 um de los músculos individuales del cuadríceps se tiñen hi s t oquímicamente para la expresión de proteína TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Se puede hacer un curso de tiempo para la expresión de proteína TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta de una forma similar excepto que el cuadríceps de diferentes ratones se cosecha en diferentes tiempos. La persistencia del ADN de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta en un músculo que sigue a la inyección, se puede determinar por un análisis de manchado Southern después de preparar el ADN celular fetal y los sobrenadantes HIRT de ratones inyectados y de control. Los resultados de la experimentación anterior en ratones, se pueden usar para extrapolar dosis apropiadas y otros parámetros de tratamiento humanos y otros animales usando el ADN desnudo de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Ejemplo 18: Rescate de la isquemia en el modelo del miembro inferior del conejo Para estudiar los efectos in vivo del TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta sobre la isquemia, un modelo de isquemia del miembro trasero del conejo se crea por la iluminación quirúrgica de una arteria femoral como se describió anteriormente (Takeshita, S. et al., Am J. Pathol 147:1649-1660(1995)) . La extirpación de la arteria femoral resulta en una propagación retrograda de trombos y la oclusión de la arteria iliaca externa. Consecuentemente, el flujo sanguíneo al miembro isquémico depende de vasos colaterales que se originan de la arteria iliaca interna (Takeshita, et al., Am J. Pathol 147:1649-1660(1995)) . Se deja un intervalo de 10 días para la recuperación post-operativa de los conejos y el desarrollo de vasos colaterales endógenos. Al día 10 posterior a la operación (día 0) después de llevar a cabo un angiograma en línea base, la arteria iliaca interna del miembro isquémico se transfecta con 500 mg de plásmido de expresión desnudo de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta por tecnología arterial de transferencia de genes usando un catéter de globo recubierto con hidrogel, se describe (Riessen, R. et al., Hum Gene Ther. 4:749-758(1993) ; Leclerc, G. et al., J. Clin. Invest. 90:936-944 (1992) ) . Cuando se usa en el tratamiento, un bolo simple de 500 mg de proteína o control, se suministra dentro de la arteria iliaca interna del miembro isquémico durante un periodo de un minuto a través de un catéter de infusión. Al día 30, se miden diversos parámetros en estos conejos: (a) relación BP, la relación de presión sanguínea de la presión sistólica del miembro isquémico con aquella del miembro normal; (b) flujo sanguíneo y reserva de flujo- FL de reposo: el flujo sanguínea durante la condición no dilatada y FL Max: el flujo sanguíneo durante la condición completamente dilatada (también una medición directa de la cantidad de vasos sanguíneos) y la reserva se refleja por la relación de FL Max: FL de reposo; (c) registro angiográfico - este se mide por un angiograma de datos colaterales. Se determina un registro por el porcentaje de círculos sin una malla superpuesta con arterias de cruce opacas divididas por el número total m del muslo del conejo; (d) densidad capilar - número de capilares colaterales determinados en secciones microscópicas de luz tomadas, de los miembros traseros . Los estudios descritos en este ejemplo prueban la actividad de las proteínas TNFR-6. Sin embargo, alguien habilitado en el arte puede modificar fácilmente los estudios ejemplificados para probar la actividad de polinucleótidos (por ejemplo, terapia de genes), agonistas y/o antagonistas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Ejemplo 19: Modelos de ratón diabético y cicatrización de heridas deteriorada por gl cocorticoides A. modelo del ratón diabético db+/db+ Para demostrar que el T FR-6 acelera el proceso de cicatrización, se usa el modelo de ratón genéticamente diabético para cicatrización de heridas. El modelo de cicatrización de heridas de espesor completo en el ratón db+/db+ es un modelo bien caracterizado, químicamente relevante y reproducible de la cicatrización de heridas deterioradas. La cicatrización de una herida diabética depende de la formación de tejidos de granulación y de la re-epitelización más que de la contracción (Gartner, M.H. et al., J. Surg. Res. 52:389(199.2); Greenhalgh, et al., Am . J. Pathol. 236:1235(1990)) . Los animales diabéticos tienen muchas de las características comunes observadas en la diabetes mellitus de tipo II. Los ratones homocigót icos (db+/db+) son obesos en comparación con sus compañeros normales heterocigót icos (db+/+m) . Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen una mutación recesiva simple autosomal en el cromosoma 4(db+) (Coleman et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:283-293(1982) ) . Los animales muestran polifagia, polidipsia y poliuria. Los ratones mutantes diabéticos (db+/db+) tienen una glucosa elevada en la sangre, niveles de insulina normales o crecientes, e inmunidad mediada por células suprimidas (Mandel et al., J. Immunol . 120:1315 (1978) ; Debray-Sachs, . et al., Clin. Exp. Immunol. 51 ( 1 ) : 1 - 7 ( 1983 ) ; Leiter et al., Am . J. of Pathol. 124:46-55(1985)) . Han sido descritas en estos animales la neuropatía periférica, complicaciones del miocardio, y lesiones microvasculares, aumento del grosor de la membrana base y anormalidades de su filtración glomerular ( (Norido, F. et al., Exp. Neurol. 83(2) :221- 232(1984); Robertson et al., Diabetes 29(1) : 60- 67(1980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40(4) : 60-473 (1979) ; Coleman, D.L. Diabetes 31 (Suppl) : 1-6 ( 1982 )) . Estos ratones diabéticos homocigót icos desarrollan hiperglicemia que es resistente a la insulina de forma análoga con la diabetes humana de tipo II (Mandel et al., J. Immunol. 220:1375-1377(1978)) . Las características observadas en estos animales sugieren que la cicatrización en este modelo puede ser similar a la cicatrización observada en la diabetes humana (Greenhalgh, et al., Am. J, of Pathol. 136:1235-146(1990) ) . Se usan en este estudio ratones hembra genéticamente diabéticos C57BL/KsJ (db+/db+) y sus compañeros heterocigóticos no diabéticos (db+/+m) (Jackson Laboratories) . Se compran los animales de 6 semanas de edad y se dejan hasta 8 semanas de edad al comienzo del estudio. Se alojan individualmente los animales y reciben alimento y agua ad libitum. Todas las manipulaciones se llevan a cabo usando técnicas asépticas. Se conducen los experimentos según las reglas y lineamientos de Human Genome Sciences, Inc. Inst itut ional Animal Care and Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animáis . El protocolo de formación de heridas se lleva a cabo según los métodos previamente reportados (Tsuboi, R. And Rifkin, D.B., J. Exp . Med. 172:245-251(1990)) . Brevemente, el día de la formación de heridas se anestesian los animales con una inyección intraperitoneal de Avertina (0.01 itig/mL) , 2 , 2 , 2-tribromoetanol y 2-metil-2-butanol disuelto en agua desionizada. Se afeita la región dorsal del animal y se lava la piel con una solución de etanol al 70% y yodo. El área quirúrgica se seca con una gasa estéril antes de la formación de herida. Se crea entonces una herida de espesor completo de 8 mm usando un punzón de tejido Keyes. Inmediatamente después de la herida, la piel circundante se estira suavemente para eliminar la expansión de la herida. Las heridas se dejan abiertas durante la duración del experimento. Se da localmente la aplicación del tratamiento por 5 días consecutivos comenzando en día de la formación de herida. Antes del tratamiento, se limpian suavemente las heridas con solución salina estéril y esponjas de gasa. Las heridas se examinan visualmente y se fotografía a una distancia fija el día de la cirugía y en el intervalo de dos días posteriormente. El cierre de las heridas se determina por una medición diaria en los días 1-5 y en el día 8 las heridas se miden horizontal y vert realmente usando un calibrador Jameson calibrado. Se consideran cicatrizadas las heridas si ya no es visible el tejido de granulación y se cubre la herida por un epitelio continuo. Se administra el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta usando un intervalo de dosis diferentes de la proteína TNFR-6 desde 4 mg hasta 500 mg por herida por día durante 8 días en el vehículo. Los grupos de control de vehículo recibieron 50 mL de la solución de vehículo. Se aplica la eutanasia a los animales el día 8 con una inyección intraperitoneal de pent obarbi tal de sodio (300 mg/kg) . Las heridas y piel circundantes se cosechan para histología inmunohistoquímica . Los especímenes de tejido se colocan en forma línea amortiguada neutral al 10% en cintas de tejido entre esponjas de biopsia para procesamiento adicional. Se evalúan tres grupos de 10 animales cada uno (5 diabéticos, y 5 de control no diabéticos) : 1) control de placebo del vehículo, 2) TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. El cierre de la herida se analiza al medir el área en el eje vertical y horizontal y obteniendo el área total cuadrada de la herida. Se estima después la contracción al establecer las diferencias entre el área inicial de la herida (día 0) y aquella posterior al tratamiento (día 8) . El área de la herida en el día 1 fue de 64 mm2 , y el tamaño correspondiente del punzón dermal. Se hicieron cálculos usando la siguiente formula : [área abierta en el día 8] - [área abierta en el día 1] / [área abierta en el día 1] Se fijan especímenes en forma de línea amortiguada al 10% y bloques alojados de parafina se forman en secciones perpendiculares a la superficie de la herida (5 mm) y se cortan usando un microtomo Reichert- Jung . El teñido de rutina de hematoxilina-eosina (H&E) se lleva a cabo en secciones transversales de heridas biseccionadas .
El examen histológico de las heridas se usa para evaluar si el proceso de cicatrización y la apariencia morfológica de la piel reparada se alteran con TNFR-6. Esta evaluación incluye la verificación de la presencia de acumulación de células, células inflamatorias, capilares, fibroblastos, re-epi teli zación y madurez epidermal (Greenhalg, D.G. et al., Am . J. Pathol. 235:1235(1990)) . Se usa un micrómetro de lente calibrado por un observador ciego. Se tiñen también secciones de tejido inmunohistoquimicamente con un anticuerpo de queratina anti-humano de conejo policlonal usando un sistema de detección ABC Elite. Se usa piel humana como un control positivo de tejidos mientras que la IgG no inmune se usa como un control negativo. El crecimiento del querat inocito se determina para evaluar el grado de re-epi t e 1 i z ación de la herida usando un micrómetro de lente calibrado. La proliferación del antigeno nuclear de células /ciclina (PCNA) en especímenes de la piel se demuestra por el uso de un anticuerpo anti-PCNA (1:50) con un sistema de detección ABC Elite. El cáncer de colon humano sirvió como un control positivo de tejido y el tejido de cerebro humano se usó como un control de tejido negativo. Cada espécimen incluyó una sección con omisión del anticuerpo primario y substitución con un ratón no inmune. La clasificación de estas secciónese basa en el grado de proliferación en una escala de 0-8, el lado inferior de la escala refleja una ligera proliferación, hasta el lado superior que refleja una proliferación intensa. Los datos experimentales se analizan usando una prueba t impar. Un valor p de < 0.05 se considera importante. B. Modelo de rata deteriorado por esteroides La inhibición de la cicatrización de heridas por esteroide ha sido bien documentada en diversos sistemas in vitro e in vivo (Wahl, S.M. Glucocorticoids and Wound healing. In: Anti-Inflammatury Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280-302 (1989); Wahl, S.M. et al., J. Immunol. 115:476-481 (1975); Werb, Z. et al., Exp . Med. 147:1684-1694 (1978)) . Los glucocort icoides retradan la cicatrización de heridas al inhibir la angi ogéne s i s , disminuir la permeabilidad vascular (Ebert, R.H., et al., An . Intern. Med. 37:701-705 (1952)),' proliferación de fibroblastos y síntesis de colágeno (Beck, L.S. et al., Growth Factors. 5:295-304(1991); Haynes, B.F. et al., J. Clin. Invest. 61 : 703-7 7 ( 1978 ) ) y la producción de una reducción transitoria de los monocitos en la circulación (Haynes, B.F., et al., J. Clin. Invest. 51:703-797(1978); Wahl, S.M., "Glucocosticoids and Wound healing", In: Antiinf lammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp . 280-302 (1989)) . La administración sistémica de esteroides a la cicatrización de heridas deterioradas es un fenómeno bien establecido en ratas (Beck, L.S. et al., Growth Factors. 5:295-304(1991); Haynes, B.F. et al., J., Clin. Invest. 61:703-797(1978); Wahl, S . M . , "Glucocorticoids and wound Healing", In: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp. 280-302(1989); Pierce, G.F. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2229-2233 (1989) ) . Para demostrar que el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta pueden acelerar el proceso de cicatrización, se evaluaron los efectos de las aplicaciones múltiples locales de TNFR-6 sobre heridas en la piel extirpadas de espesor completo en ratas en las cuales se había deteriorado la cicatrización por la administración sistémica de metilprednisolona. Se usaron ratas macho adultas, jóvenes, Sprague Da ley 250-300 g (Charles River Laboratories) en este ejemplo. Los animales se compraron de 8 semanas de edad y se dejaron hasta 9 semanas de edad al comienzo del estudio. La respuesta de las ratas a la cicatrización se deteriora por la administración sistémica de metilprednisolona ( 17mg/ kg/rata intramuscularmente) al momento de la formación de la heridas. Los animales se alojaron individualmente y recibieron alimento y agua ad libitum. Todas las manipulaciones se llevaron a cabo usando técnicas asépticas. Este estudio se llevó a cabo según las reglas y lineamientos de Human Genome Sciences, Inc. Ins t i t u t i onal Animal Care and Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animáis. El protocolo de formación de heridas se sigue según la sección A, arriba. El dia de la formación de heridas, se anestesiaron los animales con una inyección intramuscular de cetamina (50 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) . La región dorsal del animal se afeitó y la piel se lavó con soluciones de etanol al 70% y yodo. El área quirúrgica se seca con gasa estéril antes de la formación de herida. Se crea una herida de espesor completo de 8 mm usando un punzón de tejido Keyes. Se dejan abiertas las heridas durante la duración del experimento. La aplicación de los materiales de prueba se da localmente una vez al día durante 7 días consecutivos, comenzando el día de la formación de heridas y posterior a la administración de la metilprednisolona. Antes del tratamiento, se lavaron suavemente las heridas con solución salina estéril y esponjas de gasa. Las heridas se examinaron visualmente y se fotografiaron a una distancia fija el día de la formación de heridas y al final del tratamiento. El cierre de la herida se determina por la medición del área en los días 1-5 y en el día 8. Las heridas se miden horizontal y vert icalmente usando un calibrador calibrado Jameson. Las heridas se consideran cicatrizadas si ya no fue visible el tejido de granulación y la herida que se cubrió por un epitelio continuo. Se administra el TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta usando un intervalo de diferentes dosis de la proteína TNFR-6 desde 4 mg hasta 500 mg por herida, por día durante 8 días en vehículo. Los grupos de control en vehículo recibieron 50 mL de la solución de vehículo. Se aplicó la eutanasia a los animales el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbi tal de sodio (300 mg/kg) . Se cosecharon después las heridas y la piel circundante para histología. Los especímenes de tejido se colocaron en formalina amortiguada neutral al 10% en cintas de tejido entre las esponjas de biopsia para procesamiento adicional . Se evaluaron cuatro grupos de 10 animales cada uno (5 con metilprednisolona y 5 sin glucocorticoides) : 1) grupo no tratado 2) control de placebo con vehículo 3) grupos tratados con TNFR-6. El cierre de la herida se analiza al medir el área en el eje vertical y horizontal y obteniendo el área total de la herida. El cierre se estima después al establecer entre el área inicial de la herida (día 0) y aquella posterior al tratamiento (día 8) . El área en la herida en el día 1 fue de 64 mm2 , el tamaño correspondiente del punzón dermal. Se hicieron cálculos usando la siguiente fórmula : [área abierta en el día 8] - [área abierta en el día l]/[área abierta en el dia 1] Los especímenes se fijaron en formalina amortiguada al 10% y bloques alojados de parafina se formaron en secciones perpendiculares en la superficie de la herida (5mm) y se cortaron usando un microtomo Olympus. Se llevó a cabo un teñido de rutina con hematoxilina-eosina (H&E) sobre secciones transversales de las heridas biseccionadas . El examen histológico de las heridas permite la evaluación de si el proceso de cicatrización y la apariencia morfológica de la piel reparada, se mejoró con el tratamiento con TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Se usa un micrómetro de lente calibrado por un observador ciego para determinar la distancia del espacio de la herida. Se analizan los datos experimentales usando una prueba t no acoplada. Un valor p de <0.05 se considera importante. Los estudios descritos en este ejemplo, prueban la actividad de la proteina TNFR-6. Sin embargo, alguien con habilidad en el arte puede fácilmente modificar los estudios ejemplificados para probar la actividad de polinucleótidos (por ejemplo, terapia de genes) agonistas y antagonistas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Ejemplo 20: Modelo animal de linfedema El propósito de este enfoque experimental es crear un modelo apropiado .y consistente de linfedema para probar los efectos terapéuticos de la linf oangiogénesis y el re-establecimiento del sistema linfático circulatorio en el miembro trasero de la rata. Se inhibe la eficiencia por el volumen de hinchado del miembro afectado, la cuantif icación de la cantidad de la vasculatura linfática, proteina total de plasma sanguíneo e histopatología . Se observó un linfedema agudo por 7-10 días. Tal vez más importante, se siguió el progreso crónico del edema por hasta 3-4 semanas. Antes de comenzar la cirugía, se obtuvo una muestra de sangre para análisis de concentración de proteína. Ratas macho que pesaban aproximadamente ~350g se dosificaron con Pentobarbit al . Posteriormente, se afeitaron las piernas derechas desde la rodilla hasta la base. El área afeitada se frotó con gasa enjuagada con EtOH al 70%. Se obtuvo sangre para una prueba de proteína total en suero. Se hacen mediciones volumétricas y de circunferencia antes de inyectar colorante dentro de las patas después de hacer dos niveles de medición (0.5 cm arriba del talón, en mid-pt y el la tapa dorsal) . El dorso intradermal de las patas derecha e izquierda se inyectó con azul Evan al 1% en 0.05 mi. Las mediciones de circunferencia y volumétricas se hacen después siguiendo después de la inyección del colorante en las patas . Usando la articulación de la rodilla como punto de referencia, se hace una incisión inguinal a media pierna de forma circunferencial permitiendo que se localicen los vasos femorales. Se usan fórceps y hemostatos para diseccionar y separar las secciones de piel. Después de localizare los vasos femorales, el vaso linfático que va a lo largo del costado y debajo de los vasos se localiza. Los principales vasos linfáticos en esta área se coagulan eléctricamente y se ligan por sutura. Usando un microscopio, los músculos en la parte posterior de la pierna (cerca de la semi tendinosis y los aductores) se disectan categóricamente. El ganglio linfático poplietal se localiza entonces.
Los vasos linfáticos 2 proximal y 2 distal y el suministro de sangre distal del ganglio poplietal se ligan después por suturación. El ganglio poplietal y cualquier tejido adiposo acompañante se separa después por el corte del tejido conectivo. Se tiene cuidado de controlar cualquier sangrado moderado resultante de este procedimiento. Después de que los ganglios linfáticos son ocluidos, las secciones de piel se sellan usando piel liquida (Vetbond) (AJ Buck) . Los bordes de piel separada se sellan hasta el tejido muscular subyacente mientras se deja un espacio de alrededor de ~0.5 cm rodeando la pierna. La piel también se puede anclar por saturación al músculo subyacente cuando sea necesario. Para evitar la infección, los animales se alojan individualmente con malla (sin lecho) . Los animales en recuperación se verifican diariamente a través de un pico óptimo edematoso que típicamente sucede en el día 5-7. El pico edematoso sin cambio se observa después. Para evaluar la intensidad del linfedema, la circunferencia y volúmenes de 2 lugares designados en cada pata se inhiben antes de la operación y diariamente durante 7 días. Se determina el efecto de las proteínas de plasma en el linfedema y si el análisis de proteína es un parámetro de prueba útil también se investiga. Los pesos de los miembros de control y edematosos se evalúan en dos lugares. El análisis se lleva a cabo de una forma ciega . Mediciones de circunferencia. Bajo una breve anestesia con gas para evitar el movimiento de los miembros, se usa una cinta de tela para medir la circunferencia del miembro. Se hacen las mediciones en el hueso del tobillo y la pata dorsal por 2 gentes diferentes y se promedian las lecturas. Las lecturas se toman de los miembros de control y adematoso. Mediciones volumétricas: El día de la cirugía se anestesian los animales con pentobarbi tal y se prueban antes de la cirugía. Para la medición volumétrica diaria, los animales están bajo un anestésico breve de halotano (inmovilización rápida y recuperación rápida), se afeitan ambas piernas y se marcan igualmente usando un marcador a prueba de agua en las piernas. Las piernas se sumergen primero en agua, después se sumergen en el instrumento para cada nivel marcado, y después se inhiben con el paquete de cómputo de edema Buxco (Chen/Victor) . Se registran los datos por una persona mientras que la otra sumerge el miembro hasta el área marcada. Mediciones de proteina de plasma en sangre: Se saca sangre, se agita y se separa del suero antes de la cirugía y la conclusión del experimento para medir la proteína total y la comparación de Ca2+. Comparación del peso del miembro: Después de sacar la sangre se prepara el animal para la recolección de tejidos. Se amputan los miembros usando una guillotina y después se cortan las piernas de control experimentales en la ligadura y se pesan. Se hace un segundo peso en la articulación t ibio-cacaneal se desarticula y el pie se pesa . Preparaciones histológicas: el músculo transversal localizado detrás de la rodilla (popliteal) se disecta y arregla en un molde metálico llenado con gel congelado, se sumerge en metilbutano frío, se coloca en bolsas de muestra etiquetadas a -80°C hasta que se forman las secciones. Después de formar las secciones, se observa el músculo bajo microscopía fluorescente para observar los linfáticos. Están siendo evaluados actualmente otros métodos inmuno/histológicos . Los estudios descritos en este ejemplo muestran la actividad de la proteina TNFR-6. Sin embargo alguien con habilidad en el arte puede modificar fácilmente los estudios ejemplificados para probar la actividad de los polinucleót idos (por ejemplo, terapia de genes) agonistas y/o antagonistas de TNFR-6 alfa y/o TNFR-6 beta. Será claro que la invención se puede practicar de otra manera que la particularmente descrita en la descripción y ejemplos anteriores. Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores y por lo tanto están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Ejemplo 21: El TNFR6-Fc inhibe la toxicidad mediada por FasL en el modelo de ratón ConA de lesión al hígado. La administración intravenosa de concanava 1 ina A a ratones, activa los linfocitos T e induce la muerte celular apóptica y necrótica de hepatocitos, aspectos de imitación de la patof isiologia de la hepatitis crónica activa (Tiegs et al., J. Clin. Invest. 50:196. (1992)) .
La proteina Fas-Fc, una forma dimérica del Fas que se espera inhiba la actividad del ligando Fas, se ha reportado que reduce la lesión del ligando en este modelo por medio de la inhibición del ligando Fas demostrando el involucramient o de la trayectoria Fas en la patología. (Ksontiniet al., J Immunol .; 60(8) :4082-4089(1998)) . Validación del modelo: Para validar el modelo de ratón ConA, se administró ConA de forma intravenosa a ratones Balb/c a 10, 15 y 20 mg/kg de dosis de ConA junto con el placebo o Fas-Fc a 97.5 microgramos/ratón . Se usaron 10 ratones Balb/c por grupo de tratamiento. Se sacrificaron los ratones 22 horas después del tratamiento, se recolectó el suero y se llevó a cabo el análisis bioquímico usando un analizador de química clínica ILAB900 ( Instrumentat ion Laboratory) para determinar los niveles de las transaminasas específicas del hígado, la aminot rans ferasa de alanina (ALT) y la aminot rans fe r a s a de aspartato (AST), que se liberan en el suero cuando hay un daño al hígado ( (Tiegs et al., J. Clin. Invest. 90:196. (1992)) . La administración de FasFc a una dosis de 97.5 microgramos/ratón (alrededor 5 mg/kg) se encontró que inhibía de forma importante las enzimas elevadas en el hígado a dosis de ConA de 10 y 15 mg/kg pero no a 20 mg/kg (pero no se muestran los datos), validando así el modelo. Se inyectaron por vía intravenosa ratones Balb/c con ConA (15 mg/kg) junto con o sin una dosis de tres log de TNFR6-Fc (0.6, 6.60 ug/ratón) . La proteína de fusión TNFR6-Fc usada en este ejemplo corresponde a la secuencia de polipéptido de longitud completa TNFR-6 alfa (aminoácidos 1-300 de la SEQ ID NO: 2) fundidos a un dominio Fe. Se usaron 10 ratones Balb/c por grupo de tratamiento. Se sacrificaron los ratones 22 horas después del tratamiento y los niveles de suero de ALT y AST se determinaron usando un analizador de química clínica ILAB900 ( Instrumentat ion Laboratory) . La administración del TNFR6-Fc inhibió significativamente los niveles de ALT y AST en la dosis más alta probada 60 microgramos /ratón , 3mg/kg) en 50% (no se muestran los datos) . Así, el TRNFR6-Fc redujo significativamente la AST y ALT en suero inducido por ConA en una forma de respuesta a dosis. Efecto del TNFR6-Fc en los eventos apoptót icos inducidos por ConA en el hígado Ya que la elevación de los niveles de enzima del hígado en el suero refleja trayectorias apoptóticas y no apoptóticas de la destrucción de hepatocitos, se puede derivar una determinación más crítica del grado de lesión al hígado por medio de mediciones directas de los eventos apoptóticos. Así, se analizó la apoptosis usando suspensiones completas de células de hígado aisladas de ratones tratados con TNFR6-Fc y ConA. Se evaluaron tres marcadores independientes de la apoptosis en la misma muestra. Estos incluyen cambios en la expresión de superficie de fosfatidilserina, mediciones del daño de ADN y activación de la carpasa. Se inyectaron por vía intravenosa ratones Balb/c con ConA (15 mg/kg) junto con o sin una dosis de tres log de TNFR6- Fe (0.6, 6.60 ug/ratón) . Se aislaron las suspensiones de células de los hígados de 3 ratones /grupo y se aislaron las células de hígado al colocar el tejido intacto de hígado sobre un colador de células de 70 µ?? y se rompieron aparte con el sujetador de una jeringa de 5 ce usando RPMI 1640/FBS al 10%. Para separar las células de glóbulos rojos y una pieza grande de los desechos de tejidos, la suspensión de células filtradas se colocó en capas sobre un medio de separación de linfocitos (densidad 1.0770 g/ml) . La capa de la interfase se recolectó, se lavó y se contaron las células. Antes del análisis FACS, se volvió a filtrar la suspensión de células sobre un filtro de 40 µp?. Para la medición del enlace a la Anexina V (un indicador de la apoptosis), se incubaron primero las células, anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo CD45 CyChrome y B220 o anti-TCRpPE (Pharmingen, San Diego, CA) . Se lavaron las células con solución amortiguadora del enlace (Pharmingen) se incubaron después con Anexina V FITC (Pharmingen) . Se adquirieron células teñidas y se analizaron usando un lector Becton Dickinson FACScan (Becto Dickinson, San José, CA) . Se recolectaron solamente los eventos positivos de CD45. Las células que se tiñeron de forma más intensa con B220 y Anexina V se consideraron células B apoptót icas ; las células que se tiñeron más intensamente con anti-TCR y Annexina V se consideraron células T apoptóticas. Se determinó el nivel de la degradación de ADN (otra referencia de la apoptosis) por un etiquetado en el extremo con hendidura de la terminal UTP (TUNEL) que mide esta degradación usando la enzima TdT para agregar el dUTP etiquetado con FITC a los extremos 3' del ADN marcado usando un estuche Apo-DIRECT (Pharmingen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se fijaron las células en paraformaldehido al 1%, lavado en PBS y después se fijaron con etanol enfriado con hielo al 70%. Se lavaron las células dos veces en solución amortiguadora de lavado, se incubaron después con solución de teñido que contenia la enzima TdT y dUTP-FITC a 37°C durante una hora. Se lavaron dos veces las células con solución amortiguadora de enjuague, se volvieron a suspender en solución de yoduro de propidio y se adquirieron en el FACScan. Para el análisis, se estableció una puerta electrónica con eventos de singlete y las células que teñían intensamente para el dUTP-FITC se consideraron células apoptóticas. Para determinar de la forma activa de la caspasa-3 (un indicador temprano de la apoptosis) se incubaron células en IC FIX (BioSource International, Camarillo, CA) , se lavaron dos veces en PBS, y se permeabilizaron con IC PERM (BioSource) . Se incubaron las células con 5 µg de ant i-caspasa-3 de conejo PE (Pharmingen) en IC PERM, se lavaron en IC PERM, después se lavaron dos veces con PBS . Se adquirieron las células sobre el FACScan y se analizaron para fluorescencia media PE. Para los tres indicadores de la apoptosis, el TN FR 6 - Fe inhibió la apoptosis en los hígados de ratón en comparación con los ratones tratados solamente con ConA (Tabla VI) . Usando el daño al ADN como un marcador y el análisis TUNEL, se observó una ascendencia dependiente de la dosis de la inhibición con el TR6-Fc. Estos datos soportan un rol para el TNFR6-Fc en la inhibición de la apoptosis en la hepatitis inducida por ConA. Tabla VI. Apoptosis de las células de hígado aisladas de ratones tratados con TNFR6-Fc. Porcentaje % de células apoptóticas medidas por : Tratamiento Túnel Caspasa-3 Anexina Anexina Control sin tratar - 18.7 2.0 6.1 Control de ConA 24.4 35.2 7.0 12.2 (15 mg/kg) TNFR6-FC 15.6 22.7 3.5 6.3 (0.6 µ?/Gß???) TNFR6-FC 13.6 22.5 2.3 2.9 (6.0 µ?/ratón) TNFR6-FC .5 20.3 3.0 4.2 (60 µ?/Gß???) 1Las suspensiones de células del hígado se analizaron para apoptosis usando una de tres medidas independientes. La degradación de ADN se midió usando el teñido de TUNEL; la activación con caspasa por el análisis de la forma activa de caspasa-3; y el teñido con anexina V de los cambios en la membrana de superficie. Se aislaron suspensiones de células de los hígados de 3 ratones/por grupo y se acumularon. La suspensión acumulada resultante se usó para llevar a cabo cada análisis. Para el teñido con Anexina V, se adquirieron solamente células de hígado CD45+ y para el teñido con anexina V evaluados en células coteñidas para B220 o TcRp. Conclusión Los hallazgos de que el TNFR6-Fc redujo los niveles de AS T y ALT en el suero inducido por ConA y la apoptosis de células de hígado inducida por ConA soporta la aplicación terapéutica de los polipéptidos TNFR-6 alfa y TNFR-6 beta de la invención para el tratamiento y/o prevención de la hepatitis y otras formas de daño al hígado. La descripción completa de todas las publicaciones (incluyendo patentes, solicitudes de patentes, artículos de revistas, manuales de laboratorios, libros u otros documentos) aquí citados se incorporan aquí como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a cabo la invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción.
LISTADO DE SECUENCIA <110> Humar. Genoir.e Sciences, Inc. <120> Receptores 6 Alfa y 6 Beta del Factor de Necrosis de Tumor <130> PF454P1.PCT <I40> Unassigned <141> 2000-03-03 <150> 60/121,774 <15i> 1995-03-04 <150> 50/124,092 <15-> 1999-03-12 <150 60/131,279 <151> 1999-04-27 <15C> 60/131,964 <151> 1999-04-30 <150> 60/146,371 <151> 1999-0S-O2 <150> 60/163,235 <151> 1999-12-01 <160> 27 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <2il> 1077 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CD3 <222> (25) .. (924) <400> 1 gccctccctg ctccagcaag gacc atg agg gcg ctg gag ggg cea ggc ctg 51 Met Arg Ala Leu Glu Gly Pro Gly Leu 1 5 teg ctg ctg tgc ctg gtg ttg gcg ctg ect gee ctg ctg ceg gtg ceg 99 Ser Leu Leu Cys Leu Val Leu Ala Leu Pro Ala Leu Leu Pro Val Pro 10 15 20 25 gee gta cgc gga gtg gca gaa acá ecc acc tac ecc tgg cgg gac gca 147 Ala Val Arg Gly Val Ala Glu Thr Pro Thr Tyr Pro Trp Arg Asp Ala 30 35 40 gag ac ggg gag cgg ctg gtg tgc gee cag tgc ecc cea ggc acc ttt 195 Glu Thr Gly Glu Arg Leu Val Cys Ala Glu Cys Pro Pro Gly Thr Phe 45 50 55 gtg cag cgg ccg cgc cgc cga gac age ccc acg acg cgc ggc ccg cgc 2-ÍJ Val Gln Arg Pro Cys Arg Arg Asp Ser Pro Thr Thr Cys Giy Pro Cys 60 65 70 cea ccg cgc cae tac acg cag ttc tgg aac tac ctg gag cgc tg cgc 291 Pro Pro Arg His Tyr Thr Gir. Phe Trp Asn Tyr Leu Glu Arg Cys Arg 75 80 85 tac tgc aac grc ccc cgc ggg gag cgt gag gag gag gca cgg gcc cgc 329 Tyr Cys Asn Val Leu Cys Giy Glu Arg Glu Giu Glu Ala Arg Ala Cys 90 95 100 105 cae gcc acc cae aac cgt gcc cgc cgc cgc cgc acc ggc Ctc ccc gcg 337 His Ala Thr His Asn Arg Ala Cys Arg Cys Arg Thr GLy Phe Phe Ala 110 115 120 cae gcc ggt ccc cgc tCg gag cae gca teg tgc cea ccc ggc gcc ggc 425 His Ala Giy Phe Cys Leu Glu His Ala Ser Cys Pro Pro Giy Ala Giy 125 130 135 gtg ate gcc ccg ggc acc ccc age cag aac acg cag cgc cag ccg cgc 483 Val lie Ala Pro Giy Thr Pro Ser Gln Asn Thr Gln Cys Gln Pro Cys 140 145 150 ccc cea ggc acc ctc cea gcc age age tec age cea gag cag cgc cag 531 Pro Pro Giy Thr Phe Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Glu Gln Cys Gln 155 160 1Ó5 ccc cae cgc aac cgc acg gcc ccg ggc ccg gcc ccc aac gcg cea ggc 579 Pro His Arg Asn Cys Thr Ala Leu Giy Leu Ala Leu Asn Val Pro Giy 170 175 180 185 ccc ccc ccc cae gac acc ccg gc acc age tgc acc ggc CCc ccc ccc 627 Ser Ser Ser Kis Asp Thr Leu Cys Thr Ser Cys Thr Giy Phe Pro Leu 190 195 200 age acc agg gca cea gga gc gag gag gc gag cgc gcc gcc acc gac 675 Ser Thr Arg Val Pro Giy Ala Glu Glu Cys Glu Arg Ala Val lie Asp 205 210 215 CCC gcg gcc CCc cag gac acc tec acc aag agg ctg cag cgg c g ctg 723 Phe Val Ala Phe Gln Asp lie Ser lie Lys Arg Leu Gln Arg Leu Leu 220 225 230 cag gcc ccc gag gcc ccg gag ggc tgg ggc ccg acá cea agg gcg ggc 771 Gln Ala Leu Giu Ala Pro Glu Giy Trp Giy Pro Thr Pro Arg Ala Giy 235 240 245 cgc gcg gcc c g cag ccg aag c g cgt cgg cgg ctc acg gag ccc ccg 819 Arg Ala Ala Leu Gln Leu Lys Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Leu Leu 250 255 260 265 999 gcg cag gac ggg gcg ccg c g gcg cgg cCg c g cag gcg ccg cgc 867 Giy Ala Gln Asp Giy Ala Leu Leu Val Arg Leu Leu Gln Ala Leu Arg 270 275 280 gtg gcc agg a g ccc ggg ccg gag cgg age gcc cgc gag cgc ctc ccc 915 Val Ala Arg Mee Pro Giy Leu Glu Arg Ser Val Arg Glu Arg Phe Leu 285 290 295 ccc gtg cae cgaccctggc cccctccca; ttattctaca ccccrggcac 964 Pro Val His 300 cccact gca ccgaaagagg cztctxctta aazagaagaa atgaggczzc ttaaagctta 1024 ttzztazaaa gc-ztttcat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 107" <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ala Leu Glu Gly Pro Gly Leu Ser Leu Leu Cys Leu Val Leu 1 5 10 15 Ala Leu Pro Ala Leu Leu Pro Val Pro Ala Val Arg Gly Val Ala Glu 20 25 30 Thr Pro Thr Tyr Pro Trp Arg Asp Ala Glu Thr Gly Glu Arg Leu Val 35 40 45 Cys Ala Gln Cys Pro Pro Gly Thr Phe Val Gln Arg Pro Cys Arg Arg 50 55 60 Asp Ser Pro Thr Thr Cys Gly Pro Cys Pro Pro Arg Kis Tyr Thr Gln 65 70 75 80 Phe Trp Asn Tyr Leu Glu Arg Cys Arg Tyr Cys Asn Val Leu Cys Gly 85 90 95 Glu Arg Glu Glu Glu Ala Arg Ala Cys His Ala Thr His Asn Arg Ala 100 105 110 Cys Arg Cys Arg Thr Gly Phe Phe Ala His Ala Gly Phe Cys Leu Glu 115 120 125 His Ala Ser Cys Pro Pro Gly Ala Gly Val lie Ala Pro Gly Thr Pro ' 130 135 140 Ser Gln Asn Thr Gln Cys Gln Pro Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Ala 145 150 155 160 Ser Ser Ser 3er Ser Glu Gln Cys Gln Pro His Arg Asn Cys Thr Ala 165 170 175 Leu Gly Leu Ala Leu Asn Val Pro Gly Ser Ser Ser His Asp Thr Leu 180 185 190 Cys Thr Ser Cys Thr Gly Phe Pro Leu Ser Thr Arg Val Pro Gly Ala 195 200 205 Glu Glu Cys Glu Arg Ala Val lie Asp Phe Val Ala Phe Gln Asp lie 210 215 220 Ser lie Lys Arg Leu Gln Arg Leu Leu Gln Ala Leu Glu Ala Pro Glu 225 230 235 240 Gly Trp Gly Pro Thr Pro Arg Ala Gly Arg Ala Ala Leu Gln Leu Lys 245 250 255 Leu Axg Arg Arg Leu Thr Glu Leu Leu Gly Ala Gln Asp Gly Ala Leu 260 265 270 Leu Val Arg Leu Leu Gln Ala Leu Arg Val Ala Arg Met Pro Giy Leu 275 280 285 Glu Arg Ser Val Arg Glu Arg Phe Leu Pro Val His 290 295 300 <210> 3 <211> 1667 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (73) .. (582) <400> 3 tggcatgtcg gtcaggcaca gcagggtcct gtgtccgcgc tgagccgcgc tctccctgct 60 ccagcaagga cc atg agg gcg ctg gag ggg cca ggc ctg tcg ctg ctg tgc 111 Met Arg Ala Leu Glu Gly Pro Gly Leu Ser Leu Leu Cys 1 5 10 ctg gtg ttg gcg ctg cct gcc ctg ctg ccg gtg ccg gct gta cgc gga 159 Leu Val Leu Ala Leu Pro Ala Leu Leu Pro Val Pro Ala Val Arg Gly 15 20 25 gtg gca gaa aca ccc acc tac ccc tgg cgg gac gca gag aca ggg gag 207 Val Ala Glu Thr Pro Thr Tyr Pro Trp Arg Asp Ala Glu Thr Gly Glu 35 40 45 cgg ctg gtg tgc gcc cag tgc ccc cca ggc acc ttt gtg cag cgg ccg 255 Arg Leu Val Cys Ala Gln Cys Pro Pro Gly Thr Phe Val Gln Arg Pro 50 55 60 tgc cgc cga gac age ccc acg acg tgt ggc ccg tgt cca ccg cgc cac 303 Cys Arg Arg Asp Ser Pro Thr Thr Cys Gly Pro Cys Pro Pro Arg His 65 70 75 tac acg cag ttc tgg aac tac ctg gag cgc tgc cgc tac tgc aac gtc 351 Tyr Thr Gln Phe Trp Asn Tyr Leu Glu Arg Cys Arg Tyr Cys Asn Val 80 85 90 etc tg ggg gag cgt gag gag gag gca cgg gct tgc cac gcc acc cac 399 Leu Cys Giy Glu Arg Glu Glu Glu Ala Arg Ala Cys His Ala Thr His 95 100 105 aac cgt gcc tgc cgc tgc cgc acc ggc ttc ttc gcg cac gct ggt ttc 447 Asn Arg Ala Cys Arg Cys Arg Thr Giy Phe Phe Ala His Ala Gly Phe 110 115 120 125 tgc erg gag cae gca tcg tgc cca ccr ggr gcc ggc gtg att gcc ccg 495 Cys Leu Glu His Ala Ser Cys Pro Pro Gly Ala Gly Val lie Ala Pro 130 135 140 ggt gag age tgg gcg agg gga ggg gcc ecc agg age ggt ggc cgg agg 543 Gly G u Ser Trp Ala Arg Gly Gly Aia Pro Arg Ser Gly Gly Arg Arg 145 150 155 zgt ggc agg ggt cag gct gcc ggt ecc age ctt gca ecc tgagccagga 592 Cys Gly Arg Gly Gln Val Ala Gly Pro Ser Leu Ala Pro 160 155 170 caccagtccc cctgaccctg tcct ccctc ctggctgcag gcacccccag ccagaacacg 652 cagcgccagc cg gcccccc aggcaccctc tcagccagca gctccagctc agagcagtgc 712 cagccccacc gcaactgcac ggccctgggc ccggccctca atgtgccagg ctcctcctcc 772 catgacaccc tg gcaccag ccgcactggc rcccccccca g accagggt accaggtgag 832 ccagaggccr gagggggcag cacactgcag gccaggccca cttgtgccct cactcctgcc 892 cctgcacgcg cacccagccc gaggcatgcc agctggctct gggaaggggc cacag ggat 952 ttgaggggtc aggggtccct ccactagacc cccaccaagt ctgccctctc aggggtgg t 1012 gagaattegg atctgagcca gggcacagcc tcccctggag agctctggga aagtgggcag 1072 caatctccta accgcccgag gggaaggtgg ctggctcctc cgacacgggg aaaccgaggc 1132 crgatggtaa ccctcccaac tgcccgagag gaaggcggct gccccctctg acatggggaa 1192 accgaggccc aatgttaacc actgtrgaga agtcacaggg ggaagtgacc cccttaacat 1252 caagtcaggt ccgg ccatc tgcaggtccc aactcgcccc tcccgatggc ccaggagccc 1312 caagcccttg cctgggcccc cttgcctcct g agccaagg tccgagtggc cgctcctgcc 1372 ccccaggccc ttgccccagc tctccgaccg aaggctcctg ccccctctcc agtccccatc 1432 gtcgcactgc cctctccagc acggctcact gcacagggat ttctctctcc tgcaaacccc 1492 ccgagcgggg cccagáaagc agggcacctg gcagcccccg ccagtgtgtg tgggtgaaat 1552 gaccggaccg ctgccccccc accccactgc aggagccgag gagcgtgagc gtgccgtcat 1612 cgactttgcg gccttccagg acatctccat caagaggagc gg tgctgca ggece 1567 <210> 4 <211> 170 < 12> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Arg Ala Leu Glu Gly Pro Gly Leu Ser Leu Leu Cys Leu Val Leu 1 5 10 15 Ala Leu Pro Ala Leu Leu Pro Val Pro Ala Val Arg Gly Val Ala Glu 20 25 30 Thr Pro Thr Tyr Pro Trp Arg Asp Ala Glu Thr Gly Glu Arg Leu Val 35 40 45 Cys Ala Gln Cys Pro Pro Gly Thr Phe Val Glr. Arg Pro Cys Arg Arg 50 55 60 ASD Ser Pro Thr Thr Cys Gly Pro Cys Pro Pro Arg- His Tyr Thr Gln 65 70 75 80 ?he Trp Asn Tyr Leu Glu Arg Cys Arg Tyr Cys Asn Val Leu Cys Gly 85 9C 95 Glu Arg Glu Glu Glu Ala Arg Ala Cys Kis Ala Thr His Asn Arg Ala 100 105 110 Cys Arg Cys Arg Thr Gly Phe Phe Ala His Ala Gly Phe Cys Leu Glu 115 120 125 His A. a Ser Cys Pro Pro Gly Ala Gly Val lie Ala Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Trp Ala Arg Gly Gly Ala Pro Arg Ser Gly Gly Arg Arg Cys Gly Arg 145 150 155 160 Gly Gln Val Ala Gly Pro Ser Leu Ala Pro 165 170 <210> 5 <21i> 455 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Mee Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Gly lie Tyr Pro Ser Gly Val lie Gly Leu Val Pro 20 25 30 His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys 35 40 45 Tyr lie His Pro Gln Asn Asn Ser lie Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 50 ' 55 60 Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 85 90 95 Arg Kis Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val 100 105 110 Glu lie Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125 Lys Asn Gln Tyr Arg Kis Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe 130 135 140 Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu 145 150 155 160 Lys Glr. Asn Thr val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 165 170 175 Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 180 ¦ 185 190 Lys Leu Cys Leu Pro Gln lie Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 195 200 205 Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val lie Phe Phe Gly Leu Cys Leu '210 215 220 Leu Ser Leu Leu Phe lie Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys 225 230 235 240 Ser Lys Leu Tyr Ser lie Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu 245 250 255 Gly Glu Leu Glu Gly Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser 260 265 270 Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val 275 280 285 Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys 290 295 300 Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly 305 310 315 320 Ala Asp Pro lie Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro lie Pro Asn 325 330 335 Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp 340 345 350 Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro 355 360 365 Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu 370 375 380 lie Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln 385 390 395 400 Tyr Ser Mee Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala 405 410 415 Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly 420 425 430 Cys Leu Giu Asp He Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro 435 440 445 Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg 450 455 <21C> 5 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Mee Ala Pro val Aia Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 T ü Ala Ala Ala Kis Ala Leu Pro Ala Glr. Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr A Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg lie Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 15C 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 Asp He Cys Arg Pro His Gln He Cys Asn Val Val Ala He Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ser Arg Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Giu Gly Ser Thr Gly 245 250 255 Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu lie Val Gly Val Thr Ala Leu Gly 260 265 270 Leu lie lie Gly Val Val Asn Cys Val lie Met Thr Gln Val Lys 275 280 2S5 Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro 290 295 300 Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu 305 310 315 320 lie Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser 325 330 335 Ala Leu Asp Arg Axg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly 34C 345 350 Val Ala Ser Gly Ala Gly Giu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser 335 3S0 365 Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys lie 370 375 380 Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln 385 390 395 400 Ala Ser Ser Thr Mee Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro 405 410 415 Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser 420 425 430 Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro 435 440 445 Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser 450 455 460 <210> 7 <211> 427 <212> PRT <2I3> Homo sapiens <400> 7 Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys 20 25 30 Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn 35 40 45 Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cvs Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr 55 ' ' 70 75 30 Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Mer Ser 85 90 95 Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly 100 105 liC Tyr Tyr Glr. Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys 115 120 125 Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr 130 " 135 140 Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser ASO Glu Ala Asn Kis 145 150 155 160 Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln 165 170 175 Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu lie Pro 180 165 190 Gly Arg Trp lie Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr 195 200 205 Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu lie 210 215 220 Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln 225 230 235 240 Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu lie Pro Val Tyr Cys 245 250 255 Ser lie Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr lie Ala Phe 260 265 270 Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Glr. Asn Lys Gln Gly Ala Asn Ser Arg 275 280 285 Pro Val Asn Gln Thr Pro Pro Pro Glu Gly Glu Lys Leu Kis Ser Asp 290 295 300 Ser Gly lie Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro His 305 310 315 320 Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr 325 330 335 Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn 340 345 350 Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Glv Glu Leu Gly Tyr 355 360 " 365 Gln Pro Glu His lie Asp Ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro Val Arg 370 375 380 Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala 385 390 395 400 Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg lie Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser 405 410 415 Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val 420 425 <210> 8 <211> 415 <212> P T <213> Homo sapiens <400>.8 Mee Arg Leu Pro Arg Ala Ser Ser Pro Cys Gly Leu Ala Trp Gly Pro 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Ser Gly Leu Leu Val Ala Ser Gln Pro Gln Leu 20 25 30 Val Pro Pro Tyr Arg lie Glu Asn Gln Thr Cys Trp Asp Gln Asp Lys 35 40 45 Glu Tyr Tyr Glu Pro Met His Asp Val Cys Cys Ser Arg Cys Pro Pro 50 55 60 Gly Glu Phe val Phe Ala val cys Ser Arg Ser Gln Asp Thr Val Cys €5 70 75 80 Lys Thr Cys Pro Kis Asn Ser Tyr Asn Glu His Trp Asn His Leu Ser 85 90 95 Thr Cys Gln Leu Cys Arg Pro Cys Asp lie Val Leu Gly Phe Glu Glu 100 105 110 Val Ala Pro Cys Thr Ser Asp Arg Lys Ala Glu Cys Arg Cys Gln Pro 115 120 125 Gly Met Ser Cys Val Tyr Leu Asp Asn Glu Cys Val His Cys Glu Glu 130 135 140 Glu Arg Leu Val Leu Cys Gln Pro Gly Thr Glu Ala Glu Val Thr Asp 145 150 155 160 Glu lie Met Asp Thr Asp Val Asn Cys Val Pro Cys Lys Pro Gly His 165 170 175 Phe Gln Asn Thr Ser Ser Pro Arg Ala Arg Cys Gln Pro His Thr Arg 180 185 190 Cys Glu lie Gln Gly Leu Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr Ser Tyr Ser 195 200 205 Asp Thr lie Cys Lys Asn Pro Pro Glu Pro Gly Ala Met Leu Leu Leu 210 215 220 Ala lie Leu Leu Ser Leu Val Leu Phe Leu Leu Phe Thr Thr Val Leu 225 230 235 240 Ala Cvs Ala Trp Mes Arg His Pro Ser Leu Cys Arg Lys Leu Gly Thr 245 250 255 Leu Leu Lys Arg His Pro Glu Gly Glu Glu Ser Pro Pro Cys Pro Ala 260 265 270 Pro Arg Ala Asp Pro His Phe Pro Asp Leu Ala Glu Pro Leu Leu Pro 275 280 285 Met Ser Gly Asp Leu Ser Pro Ser Pro Ala Gly Pro Pro Thr Ala Pro 290 295 300 Ser Leu Glu Glu Val Val Leu Gln Gln Gln ser Pro Leu Val Gln Ala 305 310 315 320 Arg Glu Leu Glu Ala Glu Pro Giy Glu His Gly Gln Val Ala His Gly 325 330 335 Ala Asn Giy lie Kis Val Thr Gly Gly Ser Val Thr Val Thr Giy Asn 340 345 350 lie Tyr lie Tyr Asn Giy Pro Val Leu Gly Giy Thr Arg Gly Pro Gly 355 360 365 Asp Pro Pro Ala Pro Pro Glu Pro Pro Tyr Pro Thr Pro Glu Glu Gly 370 375 380 Ala Pro Gly Pro Ser Glu Leu Ser Thr Pro Tyr Gln Glu Asp Gly Lys 385 390 395 400 Ala Trp His Leu Ala Glu Thr Glu Thr Leu Gly Cys Gln Asp Leu 405 410 415 <210> S <211> 335 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Me: Leu Giy lie Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp lie Asn Ser 20 25 30 Lys Gly Leu Giu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn 35 40 45 Leu Glu Gly Leu Kis Kis Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Giy Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro 65 70 75 80 Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His 85 90 95 Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Giu Gly His Gly 100 105 110 Leu Glu Val Giu lie Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg 115 120 125 Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu Kis Cys Asp 130 135 140 Pro Cys Thr Lys Cys Giu His Gly lie lie Lys Glu Cys Thr Leu Thr 145 150 155 160 Ser Asn Thr Lys Cys Lys Giu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp 165 170 175 Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro lie Pro Leu lie Val Trp Val Lys Arg 180 185 190 Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly 195 200 205 Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala lie Asn Leu 210 215 220 Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr lie Thr Thr lie Ala Gly Val Mee 225 230 235 240 Thr Leu Ser Gl Val Lys Giy Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu 245 250 255 Ala Lys lie Asp Glu lie Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu 260 265 270 Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys 275 280 285 Glu Ala Tyr Asp Thr Leu lie Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys 290 295 300 Thr Leu Ala Glu Lys lie Gln Thr lie lie Leu Lys Asp lie Thr Ser 305 310 315 320 Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn . Glu lie Gln Ser Leu Val 325 330 335 <210> 10 <211> 250 <212> PRT <2I3> Homo sapiens <40C> 10 Mee Ala Arg pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 Gly Leu Ser Ala Thr ?ro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr 20 25 30 Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly T r ?he 35 40 45 Leu Val Lys Asp Cys Asp Glr. His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro 50 55 60 Cys lie Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His 65 70 75 80 Cvs Glu Ser Cvs Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys 85 90 95 Thr lie Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys 10C 105 110 Arg Aso Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu 115 120 125 Thr Ala Arg .Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr Kis 130 135 140 Leu Pro Tyr Val Ser Glu Mee Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met 145 150 155 160 Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr 165 170 175 His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe lie Arg lie 180 185 190 Leu Val lie Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala 195 200 2C5 Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser 210 215 220 Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu 225 230 235 240 Glu Gly Ser Thr lie Pro lie Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro 245 250 255 Ala Cys Ser Pro 250 <210> 11 <211> 595 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu 1 5 10 15 Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn 20 25 30 Pro Ser Kis Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys 4C 45 Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp 50 55 60 Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg 65 70 75 80 Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr 85 90 95 Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Mee 100 105 110 Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His 115 120 125 Ser Val Cys Pro Ala Gly Met lie Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln 130 140 Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys 145 150 155 160 Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr lie Pro Gln 165 170 175 Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro ,Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met 180 185 190 Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu 195 200 205 Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp 210 215 220 Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys 225 230 235 240 Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys 245 250 255 Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro 260 265 . 270 Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met lie 275 280 285 Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro 290 295 300 lie Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys 305 310 315 320 Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn 325 330 335 Pro Thr Prc Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Glr. 340 345 350 Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro lie Pro Thr 355 360 365 Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala 370 375 380 Gly Pro Val Leu Phe Trp Val lie Leu Val Leu Val Val Val Val Gly 385 390 395 400 Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Aro Arg Ala Cys Arg Lys Arg lie 405 410 415 Arg Glr. Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys 420 425 430 Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg 435 440 445 Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met 450 455 460 Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu 465 470 475 480 Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser 485 490 495 Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu Kis Thr Asn Asn 500 505 510 Lys lie Glu Lys lie Tyr lie Mee Lys Ala Asp Thr Val lie Val Gly 515 520 525 Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala 530 535 540 Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr 545 550 555 550 Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met 565 570 575 Leu Ser Val Giu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala 580 585 590 Ser Gly Lys 595 <210> 12 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Mee Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 * 30 lie Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser GL Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr. His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr lie Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln lie Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr lie Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 130 185 190 Arg Ala Leu Val Val lie Pro lie lie Phe Gly lie Leu Phe Ala lie 195 200 205 Leu Leu Val Leu Val Phe lie Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu lie Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg lie Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275 <210> 13 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <4C0> 13 Mee Gly Asn Ser Cys Tyr Asr. lie Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser. Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asr. Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asr. Asn Arg Asn Gln lie Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asr. Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp lie 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Glr. Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly lie Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln lie lie Ser Phe Phe Leu 180 135 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr lie Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Mee Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 14 <211> 277 <212> PP.T <213> Homo sapiens <400> 14 Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu Kis Cys Val 20 25 30 Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro . 35 40 45 Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 50 55 60 Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 65 70 75 80 Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 85 90 95 Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 100 105 110 Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 115 120 125 Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 130 135 140 Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Asp Ala lie Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 165 170 175 Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro lie Thr Val Gln Pro Thr 180 185 190 Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 195 200 205 Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala lie Leu Gly Leu Gly Leu Val 210 215 220 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala lie Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala Kis Lys Pro Pro Gly Gly 245 250 255 Gly Ser Phe Arg Thr Pro lie Gln Glu Glu Gln Ala ASD Ala His Ser 260 265 270 Leu Ala Lys 275 <210> 15 <2U> 349 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Lys Ser Val Leu Tyr Leu Tyr lie Leu Phe Leu Ser Cys lie lie He Asn Giy Arg Asp Ala Ala Prc yr Thr Pro Pro Asn Gly Lys Cys 20 25 30 Lys Asp Thr Glu Tyr Lys Arg His Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro 35 40 45 Pro Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln 50 55 60 Cys Thr Pro Cys Gly Ser Gly Thr Phe Thr Ser Arg Asn Asn His Leu 65 70 75 80 Pro Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asn Ser Asn Gln Val Glu 85 90 95 Thr Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg lie Cys Glu Cys Ser Pro 100 105 110 Giv Tyr Tyr Cys Leu Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys .Lys Ala Cys Val .115 120 125 Ser Glr. Thr Lys Cys Gly lie Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Ser 130 135 140 Val Gly Asp Val lie Cys Ser Pro Cys Gly Phe Gly Thr Tyr Ser His 145 150 155 160 Thr Val Ser Ser Ala Asp Lys Cys Glu Pro Val Pro Asn Asn Thr Phe 165 170 175 Asn Tyr lie Asp Val Glu lie Thr Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser 180 185 190 Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser lie Leu Thr Ser 195 200 205 Glu Leu Thr lie Thr Mee Asr. His Thr Asp Cys Asn Pro Val Phe Arg 210 215 220 Glu Glu Tyr ?he Ser Val Leu Asn Lys Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe 225 230 235 240 Thr Gly Glu Asn Arg Tyr Gln Asn lie Ser Lys Val Cys Thr Leu Asn 245 250 255 Phe Glu lie Lys Cys Asn Asn Lys Gly Ser Ser Phe Lys Gln Leu Thr 260 265 270 Lys Ala Lys Asn Asp Asp Gly Het Mee Ser Kis Ser Glu Thr Val Thr 275 280 285 Leu Ala Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp lie Tyr lie Leu Tyr Ser 290 295 300 Asn Thr Asn Ala Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr lie Ser Tyr Arg Val 305 310 315 320 Gly Asn Val Leu Asp Asp Asp Ser His Met Pro Gly Ser Cys Asn lie 325 330 335 Lys Pro lie Thr Asn Ser Lys Pro Thr Arg Phe Leu 340 345 <210> lo <2il> 355 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Mee Lys Ser Tyr lie Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys lie lie lie lie 1 5 10 15 Asn Ser Aso lie Thr Pro Kis Glu Pro Ser Asn Gly Lys Cys Lys Asp 20 25 30 Asn Glu Tyr Lys Arg His Eis Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro Pro Gly 35 40 45 Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Asn Thr Gln 50 55 60 Cys Thr Pro Cys Ala Ser Asp Thr Phe Thr Ser Arg Asn Asn His Leu 65 70 75 80 Pro Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asp Ser Asn Gln Val Glu 85 90 95 Thr Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg lie Cys Asp Cys Ala Pro 100 105 110 Gly Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys Lys Ala Cys Val 115 120 125 Ser Gln Thr Lys Cys Gly lie Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Pro 130 135 140 Thr Gly Asp Val Val Cys Ser Pro Cys Gly Leu Gly Thr Tyr Ser His 145 150 155 160 Thr Val Ser Ser Val Asp Lys Cys Glu Pro Val Pro Ser Asn Thr Phe 165 170 175 Asn Tyr lie Asp Val Glu lie Asn Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser 180 185 190 Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser lie Ser Thr Ser 195 200 205 Glu Leu Thr lie Thr Meü Asn His Lys Asp Cys Asp Pro Val Phe Arg 210 215 220 Asn Gly Tyr Phe Ser Val Leu Asn Glu Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe 225 230 235 240 Thr Gly Gln Asn Arg Tyr Gln Asn lie Ser Lys Val Cys Thr Leu Asn 245 250 255 P e Gi'u Xle Lys Cys Asn Asn Lys Asp Ser Tyr Ser Ser Ser Lys Gln 250 265 270 Leu Thr Lys Thr Lys Asn Asp Asp Asp Ser lie Met Pro His Ser Glu 275 280 285 Ser Val Thr Leu Val G y Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp lie Tyr lie 290 295 300 Leu Tyr Ser Asn Thr Asn Thr Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr lie Ser 305 310 315 320 Tyr Kis Val Giy Asn Val Leu Asp Val Asp Ser Kis Met Pro Gly Arg 325 330 335 Cys Asp Thr Kis Lys Leu lie Thr Asn Ser Asn Ser Gln Tyr Pro Thr 340 345 350 His Phe Leu 355 <210> 17 <211> 497 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> < 221 > caracteristicas_diversas <222> (20) <222> n iguala, a, t, g. o c <220> < 22 i > caracteristicas_diversas <222> (41) <222 r. iguala, a, z, g, o c <220> <221 caracteristicas_diversas <222> (159) .. (160) <223 n iguala, a, t , g, o c <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (163) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> < 221 > caracteristicas_diversas <222> (180) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> < 221 > caracteristicas_diversas <222> (204) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> < 2 1 > caracteristicas_diversas <222> (206) <223> n iguala, a, z, s. <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (211) <223> n iguala, a, t, g, <220> <221> caracteristicas_diversas ' <222> (229) <223> n iguala, a, t, g, <220> < 2 1 > caracteristicas_diversas <222> (24S) <223> r. iguala, a, t, g, <220> < 22 i > caracteristicas_diversas <222> (275) < 223 > n igual a, a , t , g , <220> < 2 1 > caracteristicas_diversas <222> (320) <223> ? iguala, a, t, g, <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (328) < 223 > n igual a, , t , g , <220> < 221 > caracteristicas_diversas <222> (351) <223> n iguala, a, t, g, <220> < 221 > caracteristicas_diversas <222> (370) <223> n iguala, a, t, g, <220> <221 caracteristicas_diversas <222> (376) <223> n iguala, a, t, g, <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (389) <223> n iguala, a, t, g, <220> 221 > caracteristicas_diversas 222> (392) 223 > r. iguala, a. t, g. <220> <22 > caracteristicas diversas iguala, <222> (400) <223> G. iguala, a, t, g, o c <220> < 221 > caracteristicas_diversas <222> (405) <223> n iguala, a, z. g, o c <220> < 22 i > caracteristicas diversas <222> ¡419) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> < 221 > caracteristicas_diversas <222> (435) .. (436) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (444) < 223 > n igual a, a , ? , g , o c <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (458) <223> ? iguala, a, ? , g. o c . <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (464) < 223 > ? igual a, , , g , o c <220> < 2 1 > caracteristicas_diversas <222> (472) <223> r. iguala, a, t, g, o c <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (480) .. (482) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> < 2 1 > ca racteristicas diversas <222> (484) < 223 > n igual a, a , t , g . o c <22C> < 221 > caracteristicas_diversas <222 (494) <223> n iguala, a, t, g, o c <400> 17 ggcacgagca gggtcccgcn cccgccc ga gccgcgctct ncctgctcca gcaaggacca 60 tgagggcgct ggaggggcca ggcctgtcgc tgccgtcctg gtgttggcgc tgcctgccct 120 gctgccggtg ccggccgtac gcggagtggc agaaacacnn acntacccct ggcgggacgr. 180 agagacaggg gagcggccgg tgtntnccca ntgcccccag gcaccttcr.t gcagcggccg 240 cgccgncgag acagccccac gacgcgtggc ccgtntccac cgcgccacta cacgcatccc 300 ggaactacct ggagcgctgr. ccttactnca acgtcctctg cggggagcgt naggaggagg 360 cacgggcttn ccacgncaac cacaaccgng gnctaccg n gccgnaccgg tttcttcgng 420 gcaagttggt c ttnnttcg gagnaaggat tcgtgttnca atcna tgac gnagtgattn 480 nncr.cgggaa accnaaa 497 <210> 18 <211> 191 <212> ADN <2 3> Homo sapiens <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (42) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (106) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> <221> caracteristicas_diversas <222> (125) <223> n iguala, a, t, g, o c <220> <221 > caracteristicas_diversas <222> (188) <223> n iguala, a, t, g, or c <400> 18 cgcaactgca cggccctggg actggccctc aatgtgccag gntcttcctc ccatgacacc 60 ctgtgcacca gctgcactgg cttccccctc agcaccaggg taccangagc tgaggagtgt 120 gagcntgccg tcatcgactt tttggctttc caggacatct ccatcaagag gctgcagcgg 180 ctgctcangc c 191 <210> 19 <211> 26 •c212> ADN < 13> Homo sapiens <400> 19 cgcccatggc agaaacaccc acctac <210> 20 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 cgcaagcttc tctttcagtg caagtg 26 <210> 21 <2II> 28 <212> ADN < 3> Homo sapiens <400> 21 cgcaagcttc tcctcagctc ctgcagtg 23 <210> 22 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 cgcggatccg ccatcatgag ggcgtggagg ggccag 36 <210> 23 <211> 26 <2 2> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 cgcggtaccc tc ttcagtg caagtg 26 <210> 24 <2il> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 24 cgcgg-accc tcctcagctc ctgcagtg 28 <210> 25 <21i> 33 <212> ADN <213> Komo sapiens <40C> 25 agacccaagc ttcctgctcc agcaaggacc atg 33 <210> 26 <211> 50 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 26 agacgggatc cctagtggtg gtggtggtgg cgcacaggga ggaagcgctc 50 <210> 27 <211> 733 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 27 ggga ccgga gcccaaatcc tcrgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg ou aarcccaggg tgcaccgtca gtcttcccct cccccccaaa acccaaggac accctcatga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggcggacgc aagccacgaa gaccctgagg 180 tcaagcccaa ccggcacgtg gacggcgcgg aggtgcacaa tgccaagaca aagccgcggg 240 aggagcagta caacagcacg caccgtgtgg tcagcgtccr caccgtcctg caccaggact 300 ggccgaacgc caaggagcac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca accccc rcg 350 agaaaaccat crccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggcgtac accc gcccc 420 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcccct 480 atccaagcga catcgccgtg gagcgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga 540 ccacgcct.cc cgtgccggac tccgacggct ccttcttcct ccacagcaag ctcaccgtgg 600 acaagagcag g ggcagcag gggaacgcct tcccatgctc cgtgatgcac gaggctctgc 660 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720 gaccctagag gat 733

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito a invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteina seleccionada del grupo que consiste de: (a) una proteína cuya sequencia comprende residuos de aminoácidos de 1 a 300 de la SEQ ID NO: 2; (b) una proteína cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 30 a 300 de la SEQ ID NO: 2; (c) una proteína cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 31 a 283 de la SEQ ID NO: 2; (d) una proteína cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 31 a 300 de la SEQ ID NO: 2; (e) una proteína cuya sequencia de aminoácido comprende al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; (f) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de polipéptido de longitud completa codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; (g) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; (h) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; y (i) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; y un portador farmacéuticamente aceptable.
  2. 2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína comprende un polipéptido heterólogo.
  3. 3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polipéptido heterólogo es un dominio constante de inmunoglobulina.
  4. 4. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de inflamación .
  5. 5. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de hepatitis .
  6. 6. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de enfermedades del hígado.
  7. 7. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de rechazo de injerto.
  8. 8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de injerto versus enfermedad del huésped (GVHD) .
  9. 9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento del síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto o gastritis autoinmune .
  10. 10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de esclerosis múltiple.
  11. 11. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de diabetes .
  12. 12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de necrólisis epidermal tóxica.
  13. 13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de falla renal .
  14. 14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, para utilizarse en el tratamiento de colitis ulcerosa .
  15. 15. La composición farmacéutica de conformidad con la rei indicación 1, para regular el crecimiento del hueso.
  16. 16. Un método -para inhibir la actividad del ligando Fas (FasL) o que comprende poner en contacto FasL con una proteina seleccionada del grupo que consiste de: (a) una proteina cuya sequencia comprende residuos de aminoácidos de 1 a 300 de la SEQ ID NO: 2; (b) una proteina cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 30 a 300 de la SEQ ID NO: 2; (c) una proteína cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 31 a 283 de la SEQ ID NO: 2; (d) una proteína cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 31 a 300 de la SEQ ID NO: 2; (e) una proteína cuya sequencia de aminoácido comprende al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; (f) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de polipéptido de longitud completa codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; (g) una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; (h) una proteina cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; y (i) una proteina cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810.
  17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la proteina comprende un polipéptido heterólogo .
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido heterólogo es. un dominio constante de inmunoglobulina .
  19. 19. Un método para inhibir la actividad de AIM-II, caracterizado porque comprende poner en contacto AIM-II con una proteina seleccionada del grupo que consiste de: (a) una proteina cuya sequencia comprende residuos de aminoácidos de 1 a 300 de la SEQ ID NO: 2; (b) una proteina cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 30 a 300 de la SEQ ID NO: 2; (c) una proteina cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 31 a 283 de la SEQ ID NO : 2 ; (d) una proteina cuya sequencia de aminoácidos comprende residuos de aminoácido de 31 a 300 de la SSQ ID NO: 2; (e) una proteina cuya sequencia de aminoácido comprende al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2; (f) una proteina cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de polipéptido de longitud completa codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; (g) una proteina cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; (h) una proteina cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810; y (i) una proteina cuya secuencia de aminoácidos comprende al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos del polipéptido codificado por el ADNc contenido en el número de depósito ATCC 97810.
  20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteina comprende un polipéptido heterólogo .
  21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido heterólogo es un dominio constante de inmunoglobulina .
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