BR112014017074A2 - microorganismo do gênero escherichia tendo produtividade de l-triptofano intensificada e método para a produção de l-triptofano utilizando-o - Google Patents
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Abstract
microorganismo do gênero escherichia tendo produtividade de l-triptofano intensificada e método para a produção de l-triptofano utilizando-o. a presente invenção refere-se a microrganismos de escherichia coli tendo produtividade de l-triptofano intensificada e a um método para a produção de l-triptofano utilizando-os. mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma variante da escherichia coli em que o controle de repressão e atenuação do opéron de triptofano é liberado e o acúmulo de antranilato é reduzido, intensificando assim a produtividade do l-triptofano. a presente invenção também se refere a um método para a produção de l-triptofano utilizando a variante de escherichia coli.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MICRO- ORGANISMO DO GÊNERO ESCHERICHIA TENDO PRODUTIVIDA- DE DE L-TRIPTOFANO INTENSIFICADA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE L-TRIPTOFANO UTILIZANDO-O". Campo Técnico
[001] A presente invenção refere-se a um micro-organismo do gênero Escherichia tendo uma produtividade acentuada de L- triptofano, e um método de produção de L-triptofano utilizando-o. Técnica Antecedente
[002] O L-triptofano, um aminoácido essencial, tem sido ampla- mente utilizado como um aditivo alimentar, uma matéria-prima para medicamentos tais como soluções de infusão, e um material para ali- mentos saudáveis, e tem sido produzido através da síntese química, reação enzimática, fermentação, etc.
[003] Recentemente, a produção de L-triptofano é principalmente realizada através da fermentação microbiana. No estágio inicial de in- dustrialização, as cepas resistentes análogas obtidas pela mutação química foram principalmente utilizadas. No entanto, visto que as tec- nologias de recombinação genética rapidamente se desenvolveram na década de 1990 e os mecanismos reguladores foram compreendidos a nível molecular, as cepas recombinantes de E. coli e Corynebacterium obtidas por técnicas de engenharia genética têm sido principalmente utilizadas.
[004] A produção de triptofano por micro-organismos começa com DAHP (3-deóxi-D-arobino-heptulosonato-7-fosfato) produzido pela polimerização de PEP (FosfoEnolPiruvato) que é um intermediário da glicólise, com E4P (eritrose-4-fosfato) que é um intermediário da via de pentose fosfato. Depois, o triptofano é biossintetizado a partir do co- rismato através da via biossintética aromática comum. Especificamen- te, o triptofano é sintetizado pela antranilato sintase (CE 4.1.3.27) codi-
ficada pelo gene trpE, pela antranilato sintase (EC 4.1.3.27) e antrani- lato PRPP transferase (EC 2.4.1.28) codificadas pelo gene trpD, pela indol-3-glicerol-fosfato sintase (CE 4.1.1.48) e fosforibosilantranilato isomerase (CE 5.3.1.24) codificadas pelo gene trpC e pela triptofano sintase (EC 4.2.1.20) codificada pelo gene trpB e gene trpA. O conjun- to genético tropoEDCBA que medeia a reação acima é colocado no cro- mossoma e possui uma estrutura de opéron contendo uma região re- guladora isolada.
[005] Um opéron de triptofano é ativamente transcrita de modo a produzir uma quantidade suficiente de triptofano requerida pela célula. No entanto, se o nível de triptofano na célula for elevado, um repressor se liga ao triptofano e em seguida o opéron de triptofano é inativado pela ligação do repressor à região reguladora do opéron, desse modo a transcrição é inibida.
[006] Além disso, os opérons para a biossíntese de aminoácidos tais como treonina, fenilalanina, leucina, triptofano e histidina possuem outro mecanismo de regulação conhecido como uma atenuação (J Bacteriol. (1991) 173, 2328-2340). Como é conhecido na técnica no que diz respeito à atenuação, sob condições deficientes nos aminoáci- dos, a estrutura da região de sequência específica correspondente ao mMRNA entre o promotor e o primeiro gene do opéron no cromossoma, se altera para uma estrutura vantajosa pelo processo de translação para promover a expressão dos genes biossintéticos, mas sob condi- ções ricas em aminoácidos, o mMRNA transcrito curto forma uma estru- tura tridimensional, denominada "estrutura grampo de cabelo", para inibir o processo de translação (J Biol Chem., (1988) 263:609-612).
[007] No estágio inicial do desenvolvimento de cepas produtoras de L-triptofano, foi uma coisa importante aumentar a eficiência de pro- dução através do aumento da atividade da enzima através da libera- ção da inibição da realimentação de enzimas da via de biossíntese de triptofano motivada pelo produto final, do triptofano ou através do au- mento do número de cópias dos genes do opéron de triptofano no cromossoma ou na forma de vetor, a fim de aumentar a expressão das enzimas biossintéticas de triptofano (Appl. Environ. Microbiol., (1982) 43:289-297; Appl. Microbiol. Biotechnol., (1993) 40:301-305; Trends Biotechnol., (1996) 14:250-256).
[008] Os métodos para conceder a capacidade de produzir L- triptofano aos micro-organismos incluem um método de conceder re- sistência aos análogos de triptofano ou antranilato como produto in- termediário através da mutação química, ou um método de modifica- ção dos micro-organismos através da engenharia genética. Exemplos do método de mutação química incluem aqueles descritos no Registro de Pedido de Patente Coreana No. 1987-0001813, Registro de Paten- te Coreana No. 0949312 e outros mais, e exemplos do método de mo- dificação com base na engenharia genética incluem várias abordagens que utilizam uma cepa obtida através do aumento do gene tktA que codific a transcetolase ou o gene galP que codifica a galactose perme- ase na via de biossíntese de aminoácido aromático para aumentar o fornecimento de E4P (eritrose4-fosfato) ou PEP (fosfoenolpiruvato) e reduzir a inibição da realimentação de DAHP (3-deóxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato), a fim de intensificar a via biossintética aro- mática (Trends Biotechnol., (1996) 14:250-256, Microbial Cell Factori- es (2009) 8:19), ou uma cepa obtida pela introdução adicional dos ge- nes do opéron de triptofano no vetor ou cromossoma (Appl. Environ. Microbiol. (1982) 43:289-297, Appl. Microbiol. Biotechnol., (1993) 40:301-305).
[009] No entanto, mesmo que o opéron de triptofano fosse intro- duzido com a liberação da inibição de realimentação das enzimas bi- ossintéticas, essas abordagens não alcançariam um aumento no ren- dimento da produção de triptofano, devido aos mecanismos regulado-
res tais como a inibição ou a atenuação dos genes do opéron no nível de transcrição. Divulgação Problema Técnico
[0010] Os presentes inventores desenvolveram um método de |i- berar a inibição ou atenuação dos genes do opéron de triptofano no nível da transcrição em uma cepa de produção de L-triptofano, e um método capaz de aumentar as enzimas biossintéticas de triptofano uti- lizando-o. Além disso, a fim de resolver o problema em que o rendi- mento de produção de cepas produtoras de triptofano não aumenta por causa do acúmulo de antranilato quando o opéron de triptofano é intensificado, os presentes inventores construíram uma cepa produtora de triptofano que aumentou o rendimento de produção e o nível baixo de acúmulo de antranilato através da expressão do grupo de genes diferente do gene que codifica a antranilato sintase (TrpE) entre os ge- nes do opéron de triptofano, como uma forma que dessensibiliza um mecanismo de regulação tal como a inibição da realimentação ou o mecanismo de inibição.
[0011] É um objetivo da presente invenção fornecer um micro- organismo do gênero Escherichia tendo uma produtividade acentuada de L-triptofano, através da modificação de forma a dessensibilizar a inibição ou a atenuação do opéron de triptofano e reduzir a acúmulo de antranilato.
[0012] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um método de produção de L-triptofano utilizando o micro-organismo do gênero Escherichia. Solução Técnica
[0013] A fim de realizar os objetivos acima, uma modalidade da presente invenção fornece um micro-organismo recombinante do gê- nero Escherichia tendo uma produtividade acentuada de L-triptofano,
que foi modificado para suprimir uma parte ou a totalidade de um pep- tídeo condutor que possui uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 2, em uma região reguladora de expressão tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 1 em um opéron de triptofano endógeno.
[0014] Outra modalidade da presente invenção também fornece um método para a produção de L-triptofano, que compreende o cultivo do micro-organismo recombinante acima descrito do gênero Escheri- chia. Efeitos Vantajosos
[0015] O micro-organismo recombinante produzido de acordo com a presente invenção elimina o acúmulo excessivo de antranilato nesse particular e pode ser vantajosamente utilizado para produzir L- triptofano com alto rendimento. Descrição dos Desenhos
[0016] A FIG. 1 mostra uma vista esquemática que representa os genes do opéron de triptofano, uma região reguladora para os genes no cromossoma de E. coli, e a forma de supressão do gene descrito na presente invenção.
[0017] Genes do opéron de triptofano, e uma região reguladora destes no cromossoma de E. coli (Ptrp);
[0018] Uma forma de Ptrp;
[0019] Uma forma em que o gene trpl. que codifica o peptídeo condutor é suprimido (DtrpL); e
[0020] Uma forma em que o gene trpl. que codifica o peptídeo condutor e o atenuador são suprimidos (Dtrp att).
[0021] A FIG. 2 mostra um vetor de pCL-GFP usado para medir a intensidade de uma região reguladora de expressão do opéron de trip- tofano.
[0022] A FIG. 3 mostra o vetor plINT17E-Patt-trpoDCBA para a in-
trodução dos genes biossintéticos de triptofano troDCBA no cromos- soma para aumentar o número de cópias dos genes. Modo para a Invenção
[0023] Daqui em diante, a presente invenção será descrita com detalhes.
[0024] Uma modalidade da presente invenção fornece um micro- organismo recombinante do gênero Escherichia tendo produtividade acentuada de L-triptofano, o qual foi modificado para suprimir parte ou a totalidade de um peptídeo condutor tendo uma sequência de nucleo- tídeo representada pela SEQ ID NO: 2 em uma região reguladora de expressão tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 1 em um opéron de triptofano endógeno.
[0025] Como aqui utilizado, o termo "opéron de triptofano" ou "opé- ron de Trp" significa o opéron inteiro incluindo todos os genes troEDC- BA. O opéron de triptofano possui uma sequência de nucleotídeo re- presentada pela SEQ ID NO: 9.
[0026] Um micro-organismo produtor de L-triptofano que pode ser usado na presente invenção pode ser qualquer micro-organismo pro- cariota ou eucariota, contato que eles tenham uma produtividade de L- triptofano. Exemplos deste micro-organismo podem incluir os micro- organismos que pertencem ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacteri- um e ao gênero Brevibacterium. O micro-organismo é especificamente um micro-organismo pertencente ao gênero Escherichia, e mais espe- cificamente a E. coli. Mais especificamente, a cepa de E. coli da pre- sente invenção pode ser uma cepa obtida através da intensificação das atividades da enzimas biossintética de triptofano tais como antra- nilato sintase (TrpE), antranilato PRPP transferase (TrpD), fosforribosil antranilato isomerase (TrpC) ou triptofano sintase (trpA, trpB), enquan- to mantém a 3-deóxi-D-arabino-heptulosonato 7-fosfato sintase (aroG)
que é liberada para a inibição da realimentação, intensificando as ati- vidades das enzimas da via de biossíntese aromática, tais como 3- deidroquinato sintetase (AroB), chiquimato desidrogenase (AroE), chi- quimato cinase (AroL), 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (AroA) ou corismato sintase (aROC), que intensifica a atividade da fosfoglice- rato desidrogenase (SerA) ou transcetolase (TKtA) para aumentar o fornecimento dos intermediários, serina e PRPP, da via de biossíntese de triptofano. Além disso, a cepa de E. coli da presente invenção pode ser uma cepa obtida pela inativação das atividades de prefenato desi- drogenase e corismato mutase (PheA) na via de biossíntese aromática ou inativação das atividades de prefenato desidrogenase, corismato mutase (tyrA), triptofanase (tnaA) e transportador de triptofano (tnaB, mir).
[0027] Mais especificamente, o micro-organismo recombinante da presente invenção é a cepa de E. coli recombinante CA04-2004 (nú- mero de acesso: KCCM11246P).
[0028] Como aqui utilizado, o termo "região reguladora de expres- são" do opéron de triptofano endógeno significa uma região que inclui um promotor, um peptídeo condutor e um atenuador endógeno. Espe- cificamente, a região reguladora de expressão possui uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 1.
[0029] Como aqui utilizado, o termo "peptídeo condutor" significa um peptídeo de baixo peso molecular que é codificado pela sequência líder a montante do códon de partida do gene. Especificamente, o pep- tídeo condutor possui uma sequência de nucleotídeo representada pe- la SEQ ID NO: 2, e um polipeptídeo que é expresso pelo peptídeo condutor pode ser uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 4. Este peptídeo condutor funciona para formar a estrutu- ra grampo de cabelo quando a concentração de triptofano for elevada, promovendo assim a formação da estrutura do atenuador endógeno para concluir a transcrição dos genes biossintéticos de triptofano.
[0030] Como aqui usado, o termo "suprimir" significa a remoção de parte ou da totalidade de uma sequência de nucleotídeo do códon de partida para o códon de detenção do gene alvo, ou da sequência de nucleotídeo de uma região reguladora desta, a partir do ccomossoma.
[0031] Um aspecto da presente invenção também fornece um mi- cro-organismo recombinante do gênero Escherichia, o qual ainda foi modificado para suprimir parte ou a totalidade de um atenuador endó- gena tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 3, de modo a acentuar a sua capacidade de produzir L-triptofano.
[0032] Como aqui utilizado, o termo "atenuador endógeno" signifi- ca uma região tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 3, que exclui o promotor e o peptídeo condutor na região reguladora de expressão que motiva o mecanismo de atenuação.
[0033] Um aspecto da presente invenção também fornece um mi- cro-organismo do gênero Escherichia, o qual ainda foi modificado para intensificar as atividades das proteínas que são codificadas pelo opé- ron de triptofano.
[0034] Um aspecto da presente invenção também fornece um mi- cro-organismo do gênero Escherichia, o qual ainda foi modificado para intensificar a atividade das proteínas que são codificadas pelo grupo genético biossintético de triptofano troDCBA excluindo o gene trpE que codifica a antranilato sintase.
[0035] Como aqui utilizado, a frase "grupo de genes biossintéticos de triptofano" significa um grupo de genes que consiste de uma com- binação de dois ou mais de trpD, trpC, trpB e trpA que são os genes do opéron de triptofano. Especificamente, o grupo de genes biossinté- ticos de triptofano pode ser um grupo de genes troDCBA tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 10. Aqui, o gene trpD codifica uma proteína que possui uma sequência de amino-
ácido representada pela SEQ ID NO: 37; o gene trpC codifica uma pro- teína tendo uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 38; o gene trpB codifica uma proteína que possui uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 39; e o gene trpA codi- fica uma proteína que possui uma sequência de aminoácido represen- tada pela SEQ ID NO: 40.
[0036] A intensificação da atividade do grupo de genes biossintéti- cos de triptofano, exceto para a antranilato sintase que é codificada pelo gene trpE do opéron de triptofano, é executada para resolver o problema de que o rendimento de produção do triptofano não aumenta devido ao acúmulo de antranilato quando o opéron de triptofano é a- centuado.
[0037] Os métodos para o aumento da expressão dos genes in- cluem: 1) um método de aumentar o número de cópias cromossômicas ou intracelulares dos genes; ou 2) um método de substituição do pro- motor cromossômico dos genes com um forte promotor exógeno ou modificação do promotor cromossômico de um promotor forte.
[0038] Exemplos do método de aumento do número de cópias in- cluem um método de introdução do gene em um vetor para aumentar a expressão do gene. Exemplos de um vetor que pode ser usado na presente invenção incluem os vetores plasmídeos tais como os plas- mídeos do tipo pBR, pUC, pBluescriptll, pGEM, pTZ, pCL e pET. Os vetores que podem ser usados na presente invenção não são particu- larmente limitados, e quaisquer vetores de expressão conhecidos po- dem ser utilizados. Especificamente, os vetores pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, puC19, pBR322 ou pMW118 podem ser utilizados. Mais especificamente, os vetores pACYC177, pCL e pCC1BAC pode ser utilizados.
[0039] Entretanto, exemplos de um promotor exógeno que pode ser usado na presente invenção incluem, mas não são limitados a es-
tes, os promotores conhecidos tais como os promotores trc, lac e tac. Além disso, a modificação do promotor cromossômico em um promo- tor forte pode ser executada mediante a supressão de parte ou da to- talidade do peptídeo condutor e/ou outra supressão de parte ou da to- talidade do atenuador endógeno como descrito acima, mas não é limi- tado a estas.
[0040] Em uma modalidade específica da presente invenção, um micro-organismo produtor de L-triptofano recombinante do gênero Es- cherichia foi produzido mediante a supressão de parte ou da totalidade do peptídeo condutor, tendo uma sequência de nucleotídeo represen- tada pela SEQ ID NO: 2 na região reguladora de expressão que possui uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 1 no opéron de triptofano endógeno, e supressão de parte ou da totalidade do atenuador endógeno tendo uma sequência de nucleotídeo repre- sentada pela SEQ ID NO: 3, de modo a aumentar a capacidade de produzir L-triptofano. Além disso, o micro-organismo produtor de L- triptofano recombinante foi produzido através de outra intensificação das atividades das proteínas que possuem uma sequência de aminoá- cido representada pelas SEQ ID NOS: 37, 38, 39 e 40, que são codifi- cadas pelo grupo de genes biossintéticos de triptofano trpoDCBA, ex- cluindo o gene trpE que codifica a antranilato sintase. O micro- organismo recombinante produzido foi depositado como o número de acesso KCCM11246P.
[0041] Outra modalidade da presente invenção também fornece um método para a produção de L-triptofano, compreendendo o cultivo de micro-organismo produtor de L-triptofano recombinante do gênero Escherichia, tendo uma produtividade acentuada de L-triptofano.
[0042] Em um aspecto específico, a presente invenção fornece um método que compreende o cultivo de um micro-organismo produtor de L-triptofano recombinante do gênero Escherichia tendo produtividade acentuada de L-triptofano, que foi modificado para suprimir parte ou a totalidade do peptídeo condutor que possui uma sequência de nucleo- tídeo representada pela SEQ ID NO: 2 na região reguladora de ex pressão que possui uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 1 em um opéron de triptofano endógeno, e para suprimir parte ou a totalidade do atenuador endógeno tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 3, de modo a aumentar a capacidade para produzir L-triptofano, e ainda intensificar a atividades das proteínas que são codificadas pelo opéron de triptofano através do aumento da expressão do grupo de genes biossintéticos de triptofano trpDCBA excluindo o gene trpE gene que codifica a antranilato sintase.
[0043] O meio e as condições de cultura que são utilizados no cul- tivo do micro-organismo da presente invenção podem ser qualquer um daqueles que são utilizados na cultura de micro-organismos perten- centes ao gênero Escherichia, mas estes devem satisfazer adequa- damente os requisitos do micro-organismo da presente invenção. Es- pecificamente, o micro-organismo da presente invenção pode ser culti- vado em um meio convencional contendo fontes adequadas de carbo- no, fontes de nitrogênio, aminoácidos, vitaminas e outros mais sob condições aeróbicas, enquanto se ajusta a temperatura, pH e outros mais.
[0044] As fontes de carbono que podem ser utilizadas na presente invenção incluem carboidratos tais como glicose, frutose, sacarose, maltose, manitol, sorbitol; álcoois tais como álcool de açúcar, glicerol, ácido pirúvico, ácido láctico e ácido cítrico; e aminoácidos tais como ácido orgânico, ácido glutâmico, metionina e lisina. Além disso, fontes de nutrientes orgânicos naturais tais como os hidrolisados de amido, melaços, melaço viscoso escuro, farelo de arroz, mandioca, bagaço e substância líquida da maceração de milho, podem ser utilizadas. Es- pecificamente, carboidratos tais como glicose e melaços pré-tratados estéreis (isto é, melaços convertidos em açúcares reduzidos), podem ser utilizados. Além disso, quantidades adequadas de outras fontes de carbono podem ser utilizadas sem limitação.
[0045] As fontes de nitrogênio que podem ser utilizadas na presen- te invenção incluem fontes de nitrogênio inorgânicas tais como amô- nia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio, carbona- to de amônio e nitrato de amônio; aminoácidos tais como ácido glutã- mico, metionina e glutamina; e fontes de nitrogênio orgânicas tais co- mo peptona, NZ-amina, extrato de carne, extrato de levedura, extrato de malte, substância líquida da maceração do milho, hidrolisado de caseína, farinha de peixe, ou o seu produto digerido, bolo de soja sem gordura ou o seu produto digerido, etc. Estas fontes de nitrogênio po- dem ser utilizadas isoladamente ou em combinação.
[0046] O meio pode conter, como fontes de fósforo, fosfato de po- tássio monobásico, fosfato de potássio dibásico e os sais contendo sódio correspondentes. Os compostos inorgânicos que podem ser uti- lizados na presente invenção incluem cloreto de sódio, cloreto de cál- cio, cloreto de ferro, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de manganês e carbonato de cálcio. Além disso, o meio pode conter ami- noácidos, vitaminas e precursores adequados. Estas fontes ou precur- sores podem ser adicionados ao meio em uma batelada ou de modo contínuo.
[0047] Os compostos tais como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico, podem ser adicio- nados ao meio de uma forma adequada durante o cultivo para ajustar o pH do meio de cultura. Além disso, durante o cultivo, um agente an- tiespumante tal como o éster poliglicólico de ácido graxo pode ser utili- zado para suprimir a formação de bolhas. Além disso, a fim de manter o meio de cultura em um estado aeróbico, o oxigênio ou o gás conten- do oxigênio pode ser injetado no meio de cultura. Além disso, de modo a manter o meio de cultura em um estado anaeróbico ou não aeróbico, nenhum gás é injetado, ou gás de nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono pode ser injetado no meio de cultura.
[0048] O meio de cultura é tipicamente mantido em uma tempera- tura que varia de 27 ºC a 37 ºC, e especificamente de 30 ºC a 35ºC. À cultura do micro-organismo pode continuar até que o nível desejado da substância útil seja obtido. Especificamente, o período de cultivo pode ser de 10 a 100 horas.
[0049] O método da presente invenção pode compreender ainda a purificação ou a recuperação do L-aminoácido produzido na etapa de cultivo. O processo de purificação ou recuperação pode ser executado através da purificação ou recuperação do L-aminoácido desejado do meio de cultura utilizando um método adequado, por exemplo, um mé- todo de cultivo por batelada, contínuo ou batelada alimentada.
[0050] Em seguida, a presente invenção será descrita com mais detalhes com referência aos exemplos. Deve ficar entendido, no en- tanto, que estes exemplos são para propósitos ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção. Exemplos Exemplo 1: Construção de um vetor de fusão compreendendo GFP e uma região reguladora de expressão da qual um peptídeo condutor foi removido, a fim de libertar uma regulação da expressão para a bios- síntese de triptofano
[0051] Como mostrado na FIG. 1, de modo a amplificar uma região reguladora de expressão que compreende uma supressão do gene troL que codifica um peptídeo condutor (L) (a região reguladora de ex- pressão é em seguida referida como "DtrpL", que corresponde à FIG. 1C) em uma região reguladora de expressão do opéron de triptofano que é composta de um promotor (P), o peptídeo condutor (L) e um a- tenuador (A), a reação da cadeia de polimerase (em seguida referida como "PCR") foi executada utilizando o DNA cromossômico de uma cepa de E. coli W3110 (adquirida da American Type Culture Collection (ATCC), número de acesso GenBank ACO00091) como um modelo.
[0052] Especificamente, um fragmento de 155bp tendo um sítio de enzima de restrição Kpnl na região 5' foi amplificado pela PCR com Pfu polimerase utilizando os iniciadores 1 e 2 sob as seguintes condi- ções: 30 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94 ºC durante 1 min, recozimento a 58 ºC durante 30 seg, e extensão a 72 ºC duran- te 30 seg. Entretanto, um fragmento de 105bp tendo um sítio de enzi- ma de restrição EcoRV na região 3' foi amplificado pela PCR utilizando os iniciadores 3 e 4 sob as condições acima descritas. Os fragmentos de DNA obtidos foram recuperados utilizando GeneAlI* Expin'Y GEL SV kit (Seoul, Korea), e depois utilizado como um molde para PCR cruzada.
[0053] A fim de compor o DtrpL, a PCR cruzada foi executada utili- zando os dois fragmentos de DNA como um molde e os iniciadores 1 e
4. Especificamente, um fragmento de 245bp (SEQ ID NO: 5) foi ampli- ficado pela PCR sob as condições acima descritas. O fragmento ampli- ficado foi tratado com as enzimas de restrição Kpnl e EcoRV, e depois ligado com pCL1920GFP (SEQ ID NO: 8) que foi tratado com as mesmas enzimas de restrição, construindo assim pCL-Dtrpl. GFP.
[0054] A fim de amplificar uma região reguladora de expressão compreendendo uma supressão dos genes que codificam o peptídeo condutor (L) e o atenuador (A) (a região reguladora de expressão é em seguida referida como "Dtrp att") na região reguladora de expressão do opéron de triptofano, um fragmento 148bp (SEQ ID NO: 6) que possui um sítio de enzima de restrição Kpnl na região 5' e um sítio de enzima de restrição EcoRV na região 3' foi amplificado pela PCR utili- zando o DNA cromossômico da cepa W3110 de E. coli como um mo- delo e iniciadores 1 e 5. O fragmento amplificado foi tratado com as enzimas de restrição Kpnl e EcoRV, e depois ligado com p- CL1920GFP que foi tratado com as mesmas enzimas de restrição, construindo assim pCL-Dtrp att-GFP.
[0055] Além disso, de modo a construir um vetor tendo uma região reguladora de expressão do tipo silvestre para uso como um controle nas experiências subsequentes, um fragmento de 290bp tendo um sí- tio de enzima de restrição Kpnl na região 5' e um sítio de enzima de restrição EcoRV na região 3' foi amplificado pela PCR utilizando o DNA cromossômico da cepa W3110 de E. coli como um modelo e os iniciadores 1 e 4. O fragmento amplificado foi tratado com as enzimas de restrição Kpnl e EcoRV, e depois ligado com pCL1920GFP que foi tratado com as mesmas enzimas de restrição, construindo assim pCL- Ptrp-GFP. Iniciador 1: 58' TTAGGTACCGGCGCACTCCCGTTCTGGATA 3' (SEQ ID NO: 11); Iniciador 2: 5' ACTGCCCGTTGTCGATACCCTTTTTACGT 3' (SEQ ID NO: 12); Iniciador 3: 58' TEGACAACGGGCAGTGTATTCACCATG 3' (SEQ ID NO: 13); Iniciador 4: 5' AANTGATATCTGTTATTCTCTAATTTTGTT 3' (SEQ ID NO: 14); Iniciador 5: 5' AANTGATATCACCCTTTTTACGTGAACTTG 3' (SEQ ID NO: 15). Exemplo 2: Medição do nível de expressão de GFP
[0056] Cada um dos vetores pCL-Dtrpl. GFP, pCL-Dtrp att-GFP e pCL-Ptrp GFP preparados no Exemplo 1 foi transformado no tipo sil- vestre E. coli W3110 e na cepa produtora de triptofano de E. coli KCCM10812P, e depois as intensidades de GFP nas cepas foram me- didas.
[0057] A cepa de E. coli KCCM10812P de origem (Registro de Pa-
tente Coreana No. 10-0792095) utilizada neste Exemplo é uma cepa derivada de uma variante de E. coli tendo produtividade de L- fenilalanina (KFCC 10066, Publicação de Patente Coreana No. 1985- 0001232). Especificamente, KCCM10812P é uma cepa de E. coli re- combinante tendo produtividade de L-triptofano, em que a cepa foi modificado para recuperar a auxotrofia de triptofano, para inativar os genes pheA, trpR, mtr e tnaAB, e a submeter a mutação os genes a- roG e trpE.
[0058] Especificamente, cada uma das cepas foi inoculada em 25 ml de meio M9 (contendo glicose a 0,5 % + 2 g/L de extrato de levedu- ra e ainda contendo 0,1 g/L de tirosina e 0,1 g/L de fenilalanina no ca- so de KCCM10812) em um frasco de 250 ml com uma relação de vo- lume de 1/100 (v/v) e cultivada a 37 ºC até que uma OD predetermina- da fosse alcançada. As cepas cultivadas foram recuperadas por centri- fugação e lavadas uma vez com 1xTE, e a GFP foi medida utilizando Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Biotek, USA).
[0059] Os resultados da medição são mostrados na Tabela 1 abai- xo. OD1 e OD3 na Tabela 1 indicam os valores de OD medidos em 600 nm, utilizando o espectrofotômetro UV mini-1240 (Shimadzu) após diluição de cada um dos produtos da cultura para uma concentração adequada.
[0060] Como mostrado na FIG. 1, no caso da cepa W3110 tipo sil- vestre, no que diz respeito àquela do Ptrp como 1, a intensidade relati- va de Dtrp att (que compreende uma supressão do peptídeo condutor e do atenuador) foi ao redor de 7 vezes a um valor de OD de 1 (OD1) e 10 vezes a um valor de OD de 3 (OD3), e a intensidade relativa de Dtrpl. compreendendo apenas uma supressão do peptídeo condutor foi de cerca de 1,5 a 2 vezes mais elevada do que a da região regula- dora do tipo silvestre (Ptrp). Em comparação com isso, no caso da ce- pa produtora de L-triptofano KCCM 10812P, com respeito àquela de
Ptrp tomada como 1, a intensidade relativa de Dtrp att (que compre- ende uma supressão do peptídeo condutor e do atenuador) foi cerca de 19 vezes a um valor de OD de 1 (OD1) e 27 vezes a um valor de OD de 3 (OD3), e a intensidade relativa de Dtrpl. compreendendo a- penas uma supressão do peptídeo condutor foi ao redor de 4 vezes mais elevada do que aquela da região reguladora do tipo silvestre (P- trp). Tais resultados indicam que a supressão do peptídeo condutor ou do atenuador leva a um aumento na expressão, mesmo embora este aumento na expressão da cepa do tipo silvestre seja mais fraco do que na cepa produtora de L-triptofano. Tabela 1 NS Ra ara cc watro Exemplo 3: Construção de vetores contendo opéron de triptofano (tr- PpEDCBA) cuja região reguladora de expressão foi substituída
[0061] Com base nos resultados do Exemplo 2, a fim de construir uma cepa de E. coli cujos genes do opéron de triptofano foram aumen- tados utilizando um vetor, um fragmento 6564bp (SEQ ID NO: 9) foi amplificado utilizando DNA cromossômico da cepa de origem de E. coli KCCM10812P como um modelo e iniciadores 6 e 7 sob as condi- ções de PCR descritas acima.
[0062] O fragmento de DNA amplificado foi recuperado utilizando o kit GeneAII* Expin'ty GEL SV (Seoul, Korea), e depois tratado com as enzimas de restrição EcoRV e Hindlll. Para a clonagem com o frag- mento de DNA preparado, cada um dos vetores pCL-Dtrp att-GFP,
pCL-Dtrpl. GFP e pCL-Ptrp GFP foi tratado com EcoRV e Hindlll para remover a região de GFP, obtendo-se assim fragmentos de 4291bp. Cada um dos vetores preparados foi ligado com a inserção, e depois introduzido em E. coli DH5a através da transformação, construindo assim os vetores pCL-Dtrp att-trpEDCBA, pCL-Dtrpl trpEDCBA e pCL-Ptrp trpEDCBA. Iniciador 6: 58' CCOGATATCATGCAAACACAAAAACCGAC 3' (SEQ ID NO: 16); Iniciador 7: GGGAAGCTTAAAGGATCCGTGGGATTAACTGCGCGTCGC- CGCTTT 3' (SEQ ID NO: 17). Exemplo 4: Construção de vetores cuja região reguladora de expres- são foi substituída e que tinha o grupo de genes biossintéticos de trip- tofano (trpDCBA) excluindo trpE
[0063] De modo a construir vetores mediante a substituição da re- gião de GFP dos vetores pCL-Dtrp att-GFP, pCL-Dtrpl GFP e pCL- Ptrp GFP preparados no Exemplo 1 com trpoDCBA, cada um dos veto- res pCL Dtrp att-GFP, pCL-Dtrpl. GFP e pCL-Ptrp GFP foi tratado com EcoRV e Hindlll para remover a região de GFP, obtendo-se assim fragmentos de 4291bp.
[0064] Depois, a fim de construir cepas de E. coli cujos genes trpDCBA do opéron de triptofano foram aumentados utilizando um ve- tor, um fragmento de 5002-pb (SEQ ID NO: 10) foi amplificado pela PCR utilizando o DNA cromossômico da cepa de origem E. coli KCCM10812P como um modelo e iniciadores 7 e 8.
[0065] O fragmento de DNA amplificado foi recuperado utilizando o kit GeneAII* Expinty GEL SV (Seoul, Korea), e depois tratado com as enzimas de restrição EcoRV e Hindlll. O vetor preparado e a inserção foram ligados entre si, e depois introduzidos em E. coli DH5a através da transformação, construindo assim os vetores pCL-Dtrp att-
trpDCBA, pCL-DtrpL trpDCBA e pCL-Ptrp troDCBA. Iniciador 8: 5' AMAAGATATCATGGCTGACATTCTGCTGCT 3' (SEQ ID NO: 18). Exemplo 5: Construção de vetores tendo baixo número de cópias de genes do opéron de triptofano tendo várias regiões reguladoras de ex- pressão
[0066] Um vetor típico que é expresso com baixo número de có- pias em E. coli é pCC1BAC (Epicentre, USA). A fim de expressar os genes do opéron de triptofano com baixo número de cópia utilizando esse vetor, os pCL-Dtrp att-trpEDCBA, pCL-DtrpL trpEDCBA, pCL- Ptrp trpEDCBA, pCL-Dtrp att-trpDCBA, pCL-DtrpL trpDCBA e pCL- Ptrp trpoDCBA preparados nos Exemplos 3 e 4 foram digeridos com a enzima de restrição Hindlll.
[0067] Os fragmentos de DNA resultantes foram submetidos a ele- troforese em agarose, e depois cortados de acordo com seu tamanho e recuperados utilizando o kit GeneAII? Expin'y GEL SV kit (Seoul, Ko- rea). Logo depois, cada um dos fragmentos foi ligado com o vetor pCC1BAC (digerido no sítio de Hindlll), e depois introduzido em E. coli DH5a através da transformação.
[0068] Cada uma das cepas transformadas foi manchada em meio sólido LB Cm (placa de ágar LB + cloranfenicol), e as cepas tendo re- sistência Cm foram selecionadas, construindo assim os vetores pBAC- Dtrp att-trpoEDCBA, pBAC-Dtrpl trpEDCBA, pBAC-Ptrp trpoEDCBA, pBAC-Dtrp att-trpoDCBA, pBAC-DtrpL trpDCBA and pBAC- Ptrp trpDCB. Exemplo 6: Construção da cepa de E. coli em que o gene PheaA foi ina- tivado
[0069] De modo a construir uma cepa exata a uma cepa produtora de triptofano do tipo silvestre de E. coli W3110, o gene pheA (gene NCBI ID: 12934467) que codifica corismato mutase/prefenato desidra-
tase (CM-PDT) foi inativado pela supressão através da recombinação homóloga. CM-PDT é uma enzima da primeira etapa de produção de fenilalanina a partir do corismato, e a supressão do gene pheA foi usa- da para inibir a via de biossíntese da fenilalanina. Para esta supres- são, o método de inativação de um etapa (desenvolvido pela Datsenko KA et al.), técnica de mutagênese utilizando lambda vermelho recom- binase, foi utilizado (inativação de uma etapa dos genes cromosso- mais em Escherichia coli K-12 utilizando produtos da PCR, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640- 5). Como um marcador para confirmar a inserção dentro dos genes, o gene resistente a cloranfenicol de puCprmímloxC foi utilizado (Publi- cação Aberta ao Público da Patente Coreana No. 2009-0075549).
[0070] Um fragmento genético de quase 1200bp foi amplificado pela PCR utilizando o vetor puCprmímloxP como um modelo e inicia- dores 9 e 10, que possuem uma parte do gene pheA e uma parte da sequência de nucleotídeo do gene resistente a cloranfenicol do vetor pUCprmfímioxP. Iniciador 9: 5-
GGCCTCCCAAATCEGGGGGGCCTTTTTTATTGATAACAAAAAGGCA ACACTAGGTGACACTATAGAACGCG -3' (SEQ ID NO: 19); Iniciador 10: 58-AACAGCCCAATACCTTCATTGAACGGGTGATTTCCCCTAACTCT- TTCAATTAGTGGATCTGATGGGTACC -3' (SEQ ID NO: 20).
[0071] O fragmento de DNA obtido pela amplificação de PCR foi submetido a eletroforese em 0,8% de gel de agarose, e depois eluído e utilizado como um modelo na PCR secundária. A PCR secundária foi executada de modo a que as regiões 5' e 3' do fragmento de DNA pri- mário tivessem 20 pares de bases de nucleotídeo complementares. Além disso, um fragmento genético de quase 1300bp foi amplificado pela PCR utilizando o produto da PCR primária eluído como um mode- lo e iniciadores 11 e 12, que incluem as regiões 5' e 3' do gene pheA. O fragmento de DNA resultante foi submetido a eletroforese em 0,8 % de gel de agarose, e depois eluído e utilizado na recombinação. Iniciador 11: 5-GAATGGGAGGCGTTTCGTCGTGTGAAACAGAATGCGAAGAC- GAACAATAAGGCCTCCCAAATCGGGGGGC -3' (SEQ ID NO: 21); Iniciador 12: B5-GGCACCTTTTCATCAGGTTGGATCAACAGGCACTACGTTCTCAC- TTGGGTAACAGCCCAATACCTTCATT -3' (SEQ ID NO: 22).
[0072] De acordo com o método desenvolvido por Datsenko KA et al., a cepa de E. coli W3110 transformada com o vetor pKD46 foi pro- duzida como condição apta, e depois transformada com o fragmento genético de 1300bp obtido através da PCR. A cepa tendo resistência ao cloranfenicol foi selecionada em meio LB. A PCR foi executada uti- lizando os iniciadores 13 e 14, e o produto de amplificação por PCR tinha um tamanho ao redor de 2500 pb, indicando que o gene pheA foi suprimido na cepa. Iniciador 13: 5'- TIGAGTGTATCGCCAACGCG -3' (SEQ ID NO: 23); Iniciador 14: 5'- AAMAAGCCGCGTGTTATTGCGT -3' (SEQ ID NO: 24).
[0073] O vetor pKD46 foi removido a partir da cepa recombinante primária tendo resistência ao cloranfenicol, e depois um vetor de pJW 168 foi introduzido na cepa, e o gene marcador de cloranfenicol foi removido da cepa (Gene, (2000) 247,255-264). A cepa resultante foi um produto de amplificação de quase 500 pb obtido pela PCR utilizan- do os iniciadores 13 e 14, o que indicando que a supressão do gene alvo foi alcançada. A cepa construída foi chamada "E. coli W3110 trpA1".
Exemplo 7: Construção da cepa de E. coli da qual o gene tnaAB foi inativado
[0074] A partir da cepa de E. coli W3110 trpA1 construída no E- xemplo 6, o opéron de tnaAB (gene NCBI ID: 12933600, 12933602) que consiste do gene tnaA que codifica a triptofanase e do gene tnaB que codifica o importador de triptofano foi suprimido através da recom- binação homóloga. Devido a esta supressão, a via de degradação do triptofano após a sua produção pode ser bloqueada, e o influxo de trip- tofano que é segregado no meio dentro das células pode ser preveni- do, conferindo assim as propriedades de cepas produtoras de triptofa- no. Para esta supressão, um fragmento genético de quase 1200bp foi amplificado pela PCR da mesma maneira como descrito no Exemplo 6, utilizando o vetor puCprmímloxP como um modelo juntamente com os iniciadores 15 e 16, que possuem uma parte do gene tnaAB e uma parte da sequência de nucleotídeo do gene resistente a cloranfenicol do vetor puCprmímloxP. Além disso, o fragmento de DNA obtido pela amplificação da PCR foi ainda amplificado através da PCR da mesma forma como descrito no Exemplo 6 utilizando os iniciadores 17 e 18, obtendo-se assim um fragmento genético de 1300bp. Iniciador 15: 58- — TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTTGCCGAACCA- GCACAAAAAGGTGACACTATAGAACGCG -3' (SEQ ID NO: 25); Iniciador 16: 5- — ATGAAGGATTATGTAATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAA- CCGTTCCGTAGTGGATCTGATGGGTACC -3' (SEQ ID NO: 26); Iniciador 17: 5"- TGATTTCCTGAGAGGCAAGAAGCCAGCGAATGGCTGGCTTCT- TGAAGGATTTAGCCAAATTTAGGTAACA -3' (SEQ ID NO: 27); Iniciador 18: 5- — AATCGGTATAGCAGATGTAATATTCACAGGGATCACTGTAAT-
TAAAATAAATGAAGGATTATGTAATGGA -3' (SEQ ID NO: 28).
[0075] De modo a suprimir os genes tnaAB, a cepa de E. coli W3110 trpA1 em que o vetor pKD46 foi introduzido tornou-se apta, foi construída da mesma maneira descrita no Exemplo 6, e depois o fragmento genético de 1300bp obtido pela PCR foi transformado na cepa de E. coli. A cepa tendo resistência ao cloranfenicol foi selecio- nada em meio LB. A PCR foi executada utilizando os iniciadores 19 e 20, e o produto de amplificação da PCR tinha um tamanho de cerca de 5400 pb, o que indica que os genes tnaAB foram suprimidos na cepa. Iniciador 19: 5'- COGOGGATAAAGTAAAACCAGG -3' (SEQ ID NO: 29); Iniciador 20: 5'- CGGCGAAGGTAAGTTGATGA -3' (SEQ ID NO: 30).
[0076] O vetor pKD46 foi removido da cepa recombinante primária tendo resistência a cloranfenicol da mesma maneira descrita no E- xemplo 6, e depois o gene marcador de cloranfenicol foi removido da cepa. A cepa resultante era um produto de amplificação de quase 550bp obtido pela PCR utilizando os iniciadores 19 e 20, o que indica que a supressão do gene desejada foi alcançada. A cepa construída foi chamada de "E. coli W3110 trpA2". Exemplo 8: Identificação da produtividade de L-triptofano das cepas que possuem o opéron de triptofano tendo vários padrões de expres- são
[0077] As cepas de E. coli foram transformadas com os vetores preparados de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 3, 4 e
5. Os efeitos da variante de E. Coli foram avaliados utilizando W3110 trpA2 preparado nos Exemplos 6 e 7 como uma cepa de origem, e a sua fonte carbono foi a glicose.
[0078] A fim de avaliar o título, cada cepa foi inoculada por uma alça de platina e cultivada durante a noite em meio LB sólido. Então,
uma alça de platina de cada cepa foi inoculada em 25 ml de meio con- tendo glicose, a composição do meio é mostrada na Tabela 2 abaixo.
Após a inoculação, cada cepa foi incubada a 37 ºC e 200 rpm durante 48 horas.
Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo.
Todos os resultados foram registrados como a média de três resultados de fras- co.
Tabela 2 Glicose 29 Nac! 19 MgSO, HO 19 Extrato de levedura 19 BR |
Tabela 3 origem triptofano lato glL)** mg/L)** w3110 [| pcLlisºo | pceltBae | o1 | 13 | Ptrp trpEDCBA | Ptrp trpEDCBA DtrplL trpEDCBA trpEDCBA Dtr- Ptrp trpEDCBA DtrpL trpEDCBA trpoEDCBA trpEDCBA Ptrp trpEDCBA DtrpL. trpEDCBA [Ele o | trpoEDCBA trpEDCBA Ptrp trpEDCBA
PCR DtrpL trpEDCBA [ss e | trpEDCBA trpEDCBA Ptrp trpoDCBA DtrpL troDCBA troDCBA trpEDCBA Ptrp trpoDCBA | ompétmeema | DtrpL. trpDCBA trpoDCBA
[0079] Como pode ser visto a partir dos resultados na Tabela 3 acima, no caso em que a cepa de origem de E. coli W3110 trpA?2 foi transformada com uma combinação de vários vetores, se apenas o opéron de triptofano for aumentado de forma contínua, nenhum efeito positivo sobre o rendimento de produção de triptofano apareceu en- quanto o antranilato se acumulou. Ao contrário, a cepa modificada pa- ra aumentar o opéron de Trp e trpDCBA apresentou um efeito positivo sobre o rendimento de produção de triptofano juntamente com uma diminuição no acúmulo de antranilato, em comparação com a cepa em que apenas o opéron de triptofano foi aumentado. Assim, confirmou-se que uma diminuição no acúmulo de antranilato é uma forma eficaz de aumentar o rendimento de produção de L-triptofano nas cepas produ- toras de triptofano. Exemplo 9: Identificação da produtividade de L-triptofano de cepas tendo o opéron de triptofano que possui vários padrões de expressão
[0080] Os vetores construídos de acordo com os métodos descri- tos nos Exemplos 3, 4 e 5 foram introduzidos na cepa de origem pro- dutora de L-triptofano E. coli KCCM10812P de acordo com a combina- ção mostrada na Tabela 5 abaixo. Os títulos das cepas foram avalia- dos utilizando glicose como uma fonte de carbono. Como um resulta- do, revelou-se que não apenas o aumento de trpoDCBA, mas também o aumento do opéron de triptofano, é importante, semelhante aos resul- tados do Exemplo 8. Dessa maneira, os efeitos sobre as cepas produ- toras de triptofano foram avaliados.
[0081] De modo a avaliar o título, cada cepa foi inoculada por uma alça de platina e cultivada durante a noite em meio LB sólido. Depois, uma alça de platina de cada cepa foi inoculada em 25 mL de meio contendo glicose, a composição do meio é apresentada na Tabela 4 abaixo. Após a inoculação, cada cepa foi incubada a 37 ºC e 200 rpm durante 48 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. Todos os resultados foram registrados como a média de três resulta-
dos de frasco.
Tabela 4 tros As Extrato de levedura PB 68 | Tabela 5 a e | Consumo L-trip- | Antranila- (g/L) (9/L)* | (ma/L)* P- Ptrp trpEDCBA BA Dtr- pL trpEDCBA trpoEDCBA Dtr- Ptrp trpEDCBA BA Dtr- pL trpEDCBA trpEDCBA de glicose | tofano to (GL) | (Ly | (may Ptrp att Ptrp trpEDCBA troEDCBA pBAC- 13,1 47,6 7,6 1501 Dtr- atm trpoEDCBA P- Ptrp trpDCBA BA Dtrpl. troDCBA troDCBA Dtr- Ptrp trpDCBA BA Dtrpl. tro DCBA troDCBA Dtrp att Ptrp trpDCBA DtrpL trpoDCBA trpoDCBA * Medido em 33 horas ** Medido em 48 horas
[0082] Como pode ser visto a partir dos resultados na Tabela 5 acima, no caso em que a cepa de origem de E.coli KCCM10812P foi transformada com uma combinação de vários vetores, se apenas o opéron de triptofano for aumentado de forma contínua, nenhum efeito positivo sobre o rendimento de produção de triptofano revelou-se en- quanto o antranilato se acumulou. Ao contrário, parece que a cepa modificada através do aumento do opéron utilizando o vetor pCL e do aumento de trpDCBA utilizando o vetor pBAC, apresentou um efeito positivo sobre o rendimento de produção de triptofano juntamente com uma diminuição do acúmulo de antranilato, em comparação com a ce- pa em que apenas o opéron de triptofano foi aumentado. Assim, con- firmou-se que uma diminuição no acúmulo de antranilato é uma forma eficaz de aumentar o rendimento de produção de L-triptofano nas ce- pas produtoras de triptofano. Exemplo 10: Construção da cepa em que o número de cópias do gru- po de genes biossintéticos de triptofano trpoDCBA no cromossoma foi aumentado e o acúmulo de antranilato diminuiu
[0083] Com base nos resultados do Exemplo 9, a fim de aumentar o número de cópias do grupo de genes biossintéticos de triptofano trpDCBA no cromossoma, um vetor foi construído.
[0084] Especificamente, PCL-Dtrp att-troDCBA descrito no Exem- plo 5 foi clivado com as enzimas de restrição EcoRI| e BamHI para ob- ter Dtrp att-troDCBA, e depois ligado com pINT1I7E tratado com as mesmas enzimas de restrição, obtendo-se assim pINT1I7E-Patt- trpDCBA. De modo a introduzir pINT17E-Patt-troDCBA na cepa de ori- gem produtora de triptofano de E. coli KCCM10812P para aumentar o número de cópias do grupo de genes biossintéticos de triptofano trpDCBA, pKD46 que é utilizado no método de inativação de um etapa (desenvolvido pela Datsenko KA et al.), uma técnica de mutagênese que utiliza lambda vermelho recombinase, de acordo com o Exemplo
6. Como um marcador para confirmar a inserção nos genes, o gene resistente a cloranfenicol de puCprmímloxC foi utilizado. Especifica- mente, a cepa de origem, na qual pKD46 foi introduzido, foi transfor- mada com pINT17E-Patt-trpoDCBA, e depois cultivada a 37 ºC durante 1 a 2 dias para se obter colônias. Para confirmar se o pINT1I7E-Patt- trpDCBA foi corretamente inserido no cromossoma das colônias obti-
das, o fragmento de quase 2000pb foi amplificado pela PCR utilizando iniciadores 21 e 22. Iniciador 21: 58' TATTITGCTGTCACGAGCAGG 3' (SEQ ID NO: 31); Iniciador 22: 5' AGITCCGGCATACAACCGGCTT 3' (SEQ ID NO: 32).
[0085] O pKD46 foi removido da cepa recombinante primária tendo resistência ao cloranfenicol, e depois o plasmídeo pJW 168 foi introdu- zido para remover o gene marcador de cloranfenicol da cepa (Gene, (2000) 247, 255-264). Um produto de amplificação de quase 5000pb obtido pela PCR utilizando iniciadores 23 e 24, e um produto de ampli- ficação de quase 6500pb obtido pela PCR utilizando iniciadores 25 e 26, demonstraram que trpDCBA é continuamente colocado após o o- péron de triptofano que endogenamente é colocado sobre o cromos- soma. Esta cepa foi chamada de "KCCM10812P/trpDCBA". Iniciador 23: 5' TANTACGACTCACTATAGGG 3' (SEQ ID NO: 33); Iniciador 24: 5' CTGTTGGGCGGAAAAATGAC 3' (SEQ ID NO: 34); Iniciador 25: 5' TEATCGCCAGGGTGCCGACG 3' (SEQ ID NO: 35); Iniciador 26: 5' CCCTATAGTGAGTCGTATTA 3' (SEQ ID NO: 36).
[0086] A fim de adicionalmente inserir uma cópia dentro da cepa acima preparada em que o número de cópias de trpçDCBA aumentou, o pKD46 foi introduzido na cepa KCCM10812P/trpDCBA acima prepa- rada. Depois o vetor plNT1I7E-Patt-trp6DCBA foi introduzido no KCCM10812P/trpoDCBA/pKD46, construindo assim uma cepa tendo duas cópias de trpoDCBA inseridas no cromossoma. Esta cepa constru- ída foi chamada de "KCCM10812P/2trpDCBA". Esta cepa foi deposita-
da no Korean Culture Center of Microorganisms (361-221, Hongje 1- dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea), an international depository au- thority, on December 29, 2011 under the accession number KCCM11246P. Exemplo 11: Exame do efeito da cepa produtora de L-triptofano tendo atividades aumentadas de proteínas que são codificadas pelo grupo de genes biossintéticos de triptofano tro DCBA
[0087] De acordo com o método descrito no Exemplo 10, o título de KCCM10812P/trpDCBA foi avaliado utilizando glicose como uma fonte de carbono. O KCCM10812P/trpDCBA foi obtido através da in- trodução adicional de trpoDCBA na cepa produtora de triptofano de E. coli KCCM10812P para intensificar as atividades de algumas enzimas da via de biossíntese de triptofano.
[0088] Para avaliar o título, a cepa foi inoculada por uma alça de platina e cultivada durante a noite em meio sólido LB. Depois, uma al- ça de platina da cultura de cepas foi inoculada em 25 ml de um meio de titulação em frasco, a composição do meio é apresentada na Tabe- la 4 acima. Após a inoculação, a cepa foi cultivada a 37 ºC e 200 rom durante 48 horas. Os resultados são apresentados na Tabela 6 abaixo. Todos os resultados foram registrados como a média de três resulta- dos em frasco. Tabela 6 | 1 SOS SS [um glicose (g/L)* (g/L)** to (mg/L) KCCM10812P/ KCCM10812P/2 * Medido em 33 horas ** Medido em 48 horas
[0089] Como pode ser visto na Tabela 6 acima, quando uma cópia do grupo de genes biossintéticos de triptofano trpDCBA foi inserida no cromossoma, a concentração de antranilato diminuiu 39 % em compa- ração com aquela na cepa de origem. Contudo, duas cópias foram in- seridas no cromossoma, a concentração de antranilato diminuiu 69 % em comparação com aquela na cepa de origem.
[0090] Além disso, as concentrações de L-triptofano nas duas ce- pas aumentaram 10 % e 13 %, respectivamente. Como mostrado na Tabela 6 acima, quando o número de cópias de trpDCBA foi aumenta- do, a taxa de consumo de glicose diminuiu ligeiramente em alguns ca- sos, mas o aumento do grupo de genes biossintéticos de triptofano possui efeitos positivos sobre um aumento na concentração de L- triptofano e uma diminuição na concentração de antranilato.
[0091] Embora a presente invenção tenha sido descrita com refe- rência às modalidades ilustrativas particulares, aqueles versados na técnica a qual a presente invenção pertence, podem compreender que a presente invenção pode ser personificada em outras formas especí- ficas sem se afastar do espírito técnico ou características essenciais da presente invenção. Portanto, as modalidades acima descritas são consideradas como ilustrativas em todos os aspectos e não restritiva. Além disso, o escopo da presente invenção é definido pelas reivindi- cações anexas em vez da descrição detalhada, e deve ficar entendido que todas as modificações ou variações derivadas dos significados e escopo da presente invenção e os seus equivalentes são incluídas no escopo das reivindicações anexas. Número de Acesso
[0092] Autoridade Depositária: Korean Culture Center of Microor- ganisms (international)
[0093] Número de acesso: KCCM11246P
[0094] Data do depósito: 29 de dezembro de 2011
Claims (10)
1. Micro-organismo recombinante do gênero Escherichia tendo uma produtividade acentuada de L-triptofano, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante foi modificado para su- primir parte ou a totalidade de um peptídeo condutor tendo uma se- quência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 2, em uma re- gião reguladora de expressão que possui uma sequência de nucleotí- deo representada pela SEQ ID NO: 1 sobre um opéron de triptofano endógeno.
2. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombi- nante ainda foi modificado para suprimir parte ou a totalidade de um atenuador endógeno tendo uma sequência de nucleotídeo representa- da pela SEQ ID NO: 3, na região reguladora de expressão que possui uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 1.
3. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombi- nante ainda foi modificado para intensificar a atividade das proteínas que são codificadas pelo opéron de triptofano.
4. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombi- nante ainda foi modificado para intensificar a atividade de uma ou mais proteínas tendo sequências de aminoácido representadas pelas SEQ ID NOs: 37, 38, 39 e 40, respectivamente, que são codificadas pelo grupo genético biossintético de triptofano trpDCBA.
5. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindi- cação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que as atividades das proteí- nas são acentuadas por um método de aumento do número de cópias cromossômicas ou intracelulares de genes que codificam as proteínas, um método de substituição da região reguladora de expressão do ge-
ne sobre o cromossoma com um promotor forte, ou um método de modificação da região reguladora de expressão em uma região regu- ladora de expressão tendo atividade acentuada.
6. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombi- nante é uma cepa de E. coli.
7. Método para a produção de L-triptofano, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de um micro-organismo recom- binante do gênero Escherichia tendo uma produtividade de L-triptofano intensificada, em que o micro-organismo recombinante foi modificado para suprimir parte ou a totalidade de um peptídeo condutor tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 2, em uma região reguladora de expressão que possui uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 1 sobre um opéron de trip- tofano endógeno de um micro-organismo do gênero Escherichia.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante ainda foi modificado para suprimir parte ou a totalidade de um atenuador endógeno tendo uma sequência de nucleotídeo representada pela SEQ ID NO: 3 na expressão da região reguladora que possui uma sequência de nucleo- tídeo representada pela SEQ ID NO: 1.
9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante é uma cepa de E. coli.
10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo recombinante ainda foi modificado para acentuar as atividades das proteínas que são codificadas por um ou mais genes do grupo genético biossintético de triptofano troDCBA.
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