JP7193902B2 - Ｎａｄｐ依存的グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼを含む微生物を用いてｌ－アミノ酸を生産する方法 - Google Patents

Ｎａｄｐ依存的グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼを含む微生物を用いてｌ－アミノ酸を生産する方法 Download PDF

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Description

KCCM KCCM12580P KCCM KCCM12581P KCCM KCCM12582P KCCM KCCM12583P KCCM KCCM12584P KCCM KCCM12585P KCCM KCCM12586P KCCM KCCM12587P
本出願は、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含むL-アミノ酸生産能が増加したコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いたL-アミノ酸の生産方法に関する。
コリネバクテリウム属微生物(Corynebacterium sp.)は、L-アミノ酸及び各種核酸を含む飼料、医薬品及び食品等の多様な用途を有する物質を産業的に生産するのによく用いられるグラム陽性微生物である。最近は、ジアミン(diamine)、ケト酸(keto-acid)などをコリネバクテリウム属微生物から生産することもある。
微生物発酵を通じて有用産物を生産するために、微生物内の目的産物の生合成経路の強化と共にエネルギー源又は還元力に対する要求が増加する。このうち、還元力の供給においてNADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)は必須要素である。酸化型であるNADP+と還元型であるNADPHは互いに生体内電子伝達物質であり、種々の合成過程に関与する。中央代謝経路中、NADPHを生産する経路には1)酸化的五炭糖リン酸経路(oxidative pentose phosphate pathway)と2)TCA経路のNADP依存性イソクエン酸脱水素酵素(NADP-dependent isocitrate dehydrogenase;Icd遺伝子)により主に生産されることが知られている。それ以外に種々の微生物においてNADPHを供給するための多様な代替的経路としてマレイン酸酵素(malate enzyme)、グルコースデヒドロゲナーゼ(glucose dehydrogenase)、非リン酸化グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(nonphosphorylation glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を有している。
また、中央代謝経路と無関係にNADPHを生産する酵素としては、トランス水素化酵素(transhydrogenase)、フェレドキシンNADP+酸化還元酵素(Ferredoxin: NADP+ oxidoredutase)などがある(Spaans et al, 2015, NADPH-generating systems in bacteria and archaea, Front. Microbiol. 6:742（非特許文献１）)。
大韓民国登録特許第10-0620092号 大韓民国登録特許第10-1783170号 大韓民国登録特許第10-1632642号 大韓民国登録特許第10-1182033号 大韓民国登録特許第10-0159812号 大韓民国登録特許第10-0073610号 大韓民国登録特許第10-0924065号 大韓民国登録特許第10-2011994号 大韓民国登録特許第10-1947959号 WO2013/081296 大韓民国登録特許第10-0057684号 大韓民国登録特許第10-1335789号 大韓民国公開特許第2018-0077008号 大韓民国登録特許第10-1851898号 大韓民国登録特許第10-1796830号 大韓民国登録特許第10-1117022号 大韓民国登録特許第10-0791659号 大韓民国登録特許第10-0292299号
Spaans et al, 2015, NADPH-generating systems in bacteria and archaea, Front. Microbiol. 6:742 J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984) Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990) Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 「Manual of Methods for General Bacteriology」by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008 S. Morbach et al., Appl. Enviro. Microbiol., 62(12): 4345-4351, 1996 Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467
本発明者らは、アミノ酸生産微生物においてそれぞれのアミノ酸生産を増加させるために鋭意努力した結果、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコリネバクテリウム属微生物に導入する多方面の研究を通じてコリネバクテリウム属微生物においてアミノ酸及びその前駆体生産が増加することを確認することにより本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び本出願の培養された微生物又は培養物からL-アミノ酸を回収する段階;を含む、L-アミノ酸生産方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含む、L-アミノ酸生産能が増加したコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含むコリネバクテリウム属微生物のL-アミノ酸生産用途を提供することにある。
本出願によるラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)由来のgapNを暗号化する遺伝子を導入することによりgapN活性を通じて還元力を増加させ、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物のL-アミノ酸生産能を増大させることができる。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用され得る。即ち、本出願で開示された多様な要素の全ての組合わせが本出願の範疇に属する。また、下記記述された具体的な記述により本出願の範疇が制限されると見られない。
上記目的を達成するための本出願の一つの様態は、配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び上記培養された微生物又は培養物からL-アミノ酸を回収する段階;を含む、L-アミノ酸生産方法を提供することである。
本出願において、用語「NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ」はグリセルアルデヒド-3-ホスフェート(glyceraldehyde-3-phosphate)を基質とし、助酵素であるNADPを用いて3-ホスホグリセリン酸(3-phasphateglycerate)に転換する活性を有するポリペプチドを意味する。上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼには動物、植物及びバクテリアに由来したNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼが含まれてもよい。具体的には、上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼはバクテリアに由来するものであってもよく、より具体的には、ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)に由来するものであってもよく、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)に由来するものであってもよい。上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼは、例えば、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。上記配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドは配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号1のアミノ酸配列で構成されるポリペプチドと混用されてもよい。
本出願において、上記配列番号1はNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列を意味する。具体的には、上記配列番号1はgapN遺伝子によりコーディングされるNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド配列であってもよい。本出願の目的上、上記ポリペプチドはラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)由来であってもよく、具体的には、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)に由来であってもよいが、これらに制限されず、上記アミノ酸と同一の活性を有する配列は制限なく含まれてもよい。上記配列番号1のアミノ酸配列は公知のデータベースである米国国立衛生研究所のジーンバンク(NIH GenBank)から得ることができる。また、本出願におけるNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、たとえ配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義しても、配列番号1のアミノ酸配列前後への無意味な配列の追加又は自然に発生し得る突然変異、あるいはその潜在性突然変異(silentmutation)を除くものでない。配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドと互いに同一又は対応する活性を有する場合であれば、本出願のNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドに該当することは当業者に自明である。具体的な例として、本出願のNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列又はこれと80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列で構成されるポリペプチドであってもよい。また、このような相同性又は同一性を有し、上記ポリペプチドに対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも本出願の変異対象となるポリペプチドの範囲内に含まれることは自明である。
即ち、本出願において、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はポリペプチド」と記載されているとしても、該当配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも本出願で用いられることは自明である。例えば、「配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、これと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、「配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド」に属し得ることは自明である。
本出願において、上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はgapN遺伝子であり、上記遺伝子はバクテリアに由来するものであり得、より具体的にラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)微生物に由来するものであってもよいが、gapN遺伝子を発現するラクトバチルス属微生物であれば、特に制限されない。具体的には、上記ラクトバチルス属微生物は、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)であってもよい。上記遺伝子は、配列番号1のアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよく、より具体的には、配列番号2の塩基配列を含む配列であってもよいが、これらに制限されない。上記配列番号2の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号2の塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号2の塩基配列で構成されるポリヌクレオチドと混用されてもよい。
本出願において、用語、「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単位体(monomer)が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体(polymer)であり、一定の長さ以上のDNA又はRNA鎖であり、より具体的には、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性(degeneracy)により、又は上記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形がなされる。具体的には、配列番号1のアミノ酸配列を含むNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含んでもよい。
また、公知の遺伝子配列から調剤され得るプローブ、例えば、上記塩基配列の全体又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下にハイブリッド化し、配列番号1のアミノ酸配列を含むNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列であれば、制限なく含んでもよい。上記「ストリンジェントな条件(stringent condition)」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献(J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989（非特許文献２）; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8（非特許文献３）を参照)に具体的に記載されている。例えば、相同性又は同一性が高い遺伝子同士、40％以上、具体的には90％以上、より具体的には95％以上、さらに具体的には97％以上、特に具体的には99％以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士ハイブリダイズし、それより相同性又は同一性が低い遺伝子同士ハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション(southern hybridization)の洗浄条件である60℃、1×SSC,0.1％SDS、具体的には60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より具体的には68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度及び温度で1回、具体的には2回～3回洗浄する条件を列挙することができる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにより塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であっても、2個の核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、DNAについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離した核酸断片を含むことができる。
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは55℃のTm値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を使用し、上述した条件を用いて探知することができる。また、上記Tm値は、60℃、63℃又は65℃であってもよいが、これらに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節され得る。
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性程度に依存し、変数は該当技術分野においてよく知られている(例えば、J. Sambrook et al., 同上)。
本出願において、用語「相同性(homology)」又は「同一性(identity)」とは、2個の与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と関連した程度を意味し、百分率で表され得る。用語、相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。
保存された(conserved)ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立したデフォルトギャップペナルティが共に用いられる。実質的に、相同性を有する(homologous)か、又は同一の(identical)配列は、一般に配列全長又は全長の少なくとも約50％、60％、70％、80％又は90％により中程度又は高度にストリンジェントな条件(stringent conditions)でハイブリッドすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
任意の2個のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するかどうかは、例えば, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444でのようなデフォルトパラメータを用いて「FASTA」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定されてもよい。又は、EMBOSSパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277（非特許文献４）)(バージョン5.0.0又は以後バージョン)で行われるような、ニードルマン-ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453（非特許文献５）)が用いられて決定され得る(GCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)（非特許文献６）), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)（非特許文献７）; Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994（非特許文献８）,及び[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073（非特許文献９）を含む)。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのBLAST、又はClustalWを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば、 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482（非特許文献１０）に公知となっている通り、例えば、Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443（非特許文献５）のようなGAPコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定されてもよい。要約すると、GAPプログラムは、2配列中、より短いものにおける記号の全体数で類似の配列された記号(即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸)の数を除した値と定義する。GAPプログラムのためのデフォルトパラメータは、(1)二進法比較マトリックス(同一性のために1そして非同一性のために0の値を含有する)及び Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)（非特許文献１１）により開示された通り、 Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745（非特許文献１２）の重み付けされた比較マトリックス(又は EDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックス);(2)各ギャップのための3.0のペナルティ及び各ギャップで各記号のための追加の0.10ペナルティ(又はギャップ開放ペナルティ10、ギャップ延長ペナルティ0.5);及び(3)末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。
また、任意の2個のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するかどうかは定義されたストリンジェントな条件下でサザンハイブリダイゼーション実験により配列を比較することにより確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者においてよく知られている方法(例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989（非特許文献２）; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York（非特許文献３）)で決定されてもよい。
上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、当業界において知られた通常の方法によりコリネバクテリウム属微生物内に導入され、コリネバクテリウム属微生物内でNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼが発現されてもよい。
本出願において、用語、ポリペプチドが「発現されるように/される」とは、目的ポリペプチドが微生物内に導入されたか、又は微生物内で発現されるように変形された状態を意味する。本出願の目的上、「目的ポリペプチド」とは、前述したNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホ-6-スフェートデヒドロゲナーゼであってもよい。
具体的には、「ポリペプチドの導入」とは、微生物が本来有していなかった目的ポリペプチドの活性を示されるようになることを意味する。例えば、目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが微生物内の染色体に導入されたか、又は目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物内に導入され、その活性が示されることであってもよい。たとえ上記目的ポリペプチドが微生物内に既に存在しても、上記目的ポリペプチドが微生物内に導入されることにより、微生物内の上記ポリペプチドの発現又は活性が非変形微生物に比べて増加又は強化され得る。
また、「活性の強化」とは、微生物内の特定ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて向上したことを意味するか、又は非変異微生物内のポリペプチドの活性に比べて向上したことを意味する。上記「内在的活性」とは、自然的、又は人為的要因による遺伝的変異により微生物の形質が変化する場合、形質変化前に親菌株が本来有していた特定ポリペプチドの活性をいう。
具体的には、活性強化は、上記微生物にポリペプチドを導入する方法、ポリペプチドをコードする遺伝子の細胞内コピー数増加方法、上記ポリペプチドを暗号化する遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、上記ポリペプチドを暗号化する遺伝子発現調節配列を活性が強力な配列に交替する方法及び上記ポリペプチドの活性が強化するようにポリペプチドを暗号化する遺伝子に変異を追加で導入させる方法からなる群から選択されるいずれか一つ以上の方法からなってもよいが、これらに制限されない。
上記において微生物にポリペプチドを導入する方法又はポリペプチドをコードする遺伝子の細胞内コピー数の増加方法は、特に制限されないが、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ベクターを用いて微生物内の染色体又はプラスミドに挿入して行われてもよい。具体的には、本出願のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主と無関係に複製されて機能するベクターが宿主細胞内に導入されるものであってもよい。又は、上記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入させるベクターが宿主細胞の染色体内に導入されるものであってもよい。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界において知られた任意の方法、例えば、相同組換えによりなされてもよい。
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形することは、特に制限されないが、上記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組合わせにより配列上の変異を誘導して行われるか、又はさらに強い活性を有する核酸配列に交替することにより行われてもよい。上記発現調節配列は、特に制限されないが、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。
上記ポリヌクレオチド発現単位の上部には本来のプロモーターの代わりに強力なプロモーターが連結されてもよく、これに限定されるものではない。公知となった強力なプロモーターの例としては、cj1～cj7プロモーター(大韓民国登録特許第10-0620092号（特許文献１）)、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、gapAプロモーター、SPL7プロモーター、SPL13(sm3)プロモーター(大韓民国登録特許第10-1783170号（特許文献２）)、O2プロモーター(大韓民国登録特許第10-1632642（特許文献３）)、tktプロモーター及びyccAプロモーターなどがあるが、これらに限定されるものではない。
また、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特に制限されないが、上記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的又は保存的置換又はこれらの組合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行われるか、又はさらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交替することにより行われてもよい。
このようなポリペプチド活性の導入及び強化は、対応するポリペプチドの活性又は濃度が野生型や非変形微生物菌株におけるポリペプチドの活性又は濃度に比べて増加するものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
具体的には、上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性導入又は強化は、これをコードする遺伝子を含む発現用組換えベクターを製造し、上記ベクターをコリネバクテリウム属微生物内に導入して形質転換されたコリネバクテリウム属微生物を生産することにより行われる。即ち、上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む微生物は、上記遺伝子を含むベクターに形質転換されて製造される組換え微生物であってもよいが、これらに制限されない。
本出願において用いられた用語「ベクター」とは、適した宿主内で目的ポリペプチドを発現させるように、適した調節配列及び上記目的ポリペプチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。上記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレータ配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係なく複製又は機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
本出願において用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能であれば、特に限定されず、当業界において知られている任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態、又は組み換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしてpWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及びCharon21Aなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてpBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pET系、pMal系、pQE系及びpCL系などを用いることができる。具体的には pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いることができる。
上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ発現用組換えベクターは、通常の方法、即ち、適切なベクターに制限酵素を用いてNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺伝子塩基配列をライゲーションさせることにより製造されたものであってもよい。
上記ポリペプチド発現用組換えベクターを通じて染色体内に目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は当業界において知られた任意の方法、例えば、相同組換え(homologous recombination)により行われてもよいが、これに限定されない。上記染色体挿入の存否を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入の存否を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性又は表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤(selective agent)が処理された環境では選別マーカーを発現する細胞のみ生存したり、他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願において用語「形質転換」とは、目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現され得るならば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体以外に位置するかに関係なく、これらをいずれも含み得る。また、上記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするDNA及びRNAを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現され得るならば、如何なる形態で導入されるものであれ、問題ない。例えば、上記ポリヌクレオチドは独自に発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入されてもよい。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含んでもよい。上記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよいが、これに限定されない。
また、上記において用語「作動可能に連結」されているとは、本出願の目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と上記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
本出願のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入する如何なる方法も含まれ、宿主細胞により当分野において公知となっている適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法(electroporation)、リン酸カルシウム(CaPO4)沈殿、塩化カルシウム(CaCl2)沈殿、マイクロインジェクション法(microinjection)、ポリエチレングリコール(PEG)法、DEAE-デキストラン法、カチオンリポソーム法、及び硝酸リチウム-DMSO法などがあるが、これらに制限されない。
本出願の目的上、上記配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼを発現するように遺伝的に変形されたコリネバクテリウム属微生物は、非変形微生物に比べてL-アミノ酸生産能が増加した微生物であってもよい。
本出願において、用語、「L-アミノ酸を生産する微生物」又は「L-アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物」は、自然的又は人為的に遺伝的変形が起こった微生物又はコリネバクテリウム属微生物をいずれも含み、外部遺伝子の挿入、内在的遺伝子の活性強化又は不活性化等の原因により特定機序が弱化又は強化された微生物であり、目的とするL-アミノ酸生産のために遺伝的変異が起きたり活性を強化させたコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
具体的には、上記L-アミノ酸を生産する微生物は、目的とするL-アミノ酸の生合成経路内ポリペプチド一部の活性が強化されたり、目的とするL-アミノ酸分解経路内のポリペプチド一部の活性が弱化されて目的とするL-アミノ酸の生産能が強化した微生物であってもよい。例えば、上記微生物は、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase, lysC)、ホモセリンデヒドロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase, hom)、L-スレオニンデヒドラターゼ(L-threonine dehydratase, ilvA)、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ(2-isopropylmalate synthase, leuA)、アセト乳酸シンターゼ(Acetolactate synthase, ilvN)、又は/及びホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ(Homoserine O-acetyltransferase, metX)の活性が強化された微生物であってもよい。また、例えば、上記微生物はフィードバック阻害(feedback inhibition)抵抗性を有するように変形されて活性が強化された遺伝子又はポリペプチドを含んでもよい。また、例えば、上記微生物は目的とするL-アミノ酸を分解する多様な遺伝子又はポリペプチドの活性が弱化又は不活性化されたものであってもよい。また、例えば、上記微生物はランダム変異でL-アミノ酸生産能が増加した微生物であってもよいが、これらに制限されるものではない。即ち、上記微生物は、目的とするL-アミノ酸生合成経路のポリペプチド活性を強化させたり分解経路のポリペプチド活性を不活性化/弱化させ、目的とするL-アミノ酸の生産が増加した微生物であってもよい。
前述したようなポリペプチドの活性強化は、該当ポリペプチドをコードする遺伝子の細胞内コピー数増加；ポリペプチドを暗号化する染色体上遺伝子及び／又はその発現調節配列に変異導入；ポリペプチドを暗号化する染色体上の遺伝子発現調節配列の活性が強力な配列への置換；ポリペプチド発現を増加させたりフィードバック阻害抵抗性を有するように、ポリペプチドを暗号化する染色体上の遺伝子の一部に変異導入；又はこれらを組み合わせた方法で行われてもよいが、これらに制限されない。
本出願の用語「ポリペプチド活性の弱化/不活性化」とは、酵素又はポリペプチドの発現が天然の野生型菌株、親菌株又は当該ポリペプチドが非変形された菌株に比べて全く発現されなかったり又は発現されてもその活性がなかったり減少したことを意味する。この時、上記減少は、上記ポリペプチドを暗号化する遺伝子の変異、発現調節配列の変形、遺伝子の一部又は全体の欠損などによりポリペプチドの活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少した場合と、これを暗号化する遺伝子の発現阻害又は翻訳(translation)阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチドの活性程度が天然型菌株又は変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組合わせも含む概念である。本出願において、上記不活性化は当該分野においてよく知られている多様な方法の適用により達成される。上記方法の例として、上記ポリペプチドを暗号化する上記遺伝子の全体又は一部を欠失させる方法;上記ポリペプチドを暗号化する上記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列の変形;上記ポリペプチドの活性が除去又は弱化されるようにポリペプチドを暗号化する上記遺伝子配列の変形;上記ポリペプチドを暗号化する上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)の導入:上記ポリペプチドを暗号化する上記遺伝子のシャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列上流にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加して2次構造物を形成させ、リボソーム(ribosome)の付着を不可能にさせる方法;上記ポリペプチドを暗号化する上記遺伝子のポリヌクレオチド配列のORF(open reading frame)の3'末端に、反対向きに転写されるプロモーターを付加する方法(Reverse transcription engineering, RTE)などがあり、これらの組合わせでも達成することができるが、これに特に制限されるものではない。
ただし、前述した方法は、一つの例示であり、ポリペプチドの活性強化又は不活性化方法及び遺伝子操作方法は当業界において公知となっているところ、上記L-アミノ酸生産微生物は、公知の多様な方法を適用して製造されてもよい。
本出願の目的上、上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼを含む上記L-アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物は、培地中の炭素源から目的とするL-アミノ酸を非変形野生型菌株又は非変形変異株と比較して過量に生産することができ、これについては前述した通りである。本出願において、上記「L-アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物」は「L-アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属菌株」又は「L-アミノ酸生産コリネバクテリウム属菌株」と混用されてもよい。
上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドが発現されるように変形された、L-アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物は、L-アミノ酸を生産できるコリネバクテリウム属微生物であれば、特に制限されない。具体的には、上記コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・クルジラクチス(Corynebacterium crudilactis)、コリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・スタティオニス Corynebacterium stationis)、コリネバクテリウム・シングラレ(Corynebacterium singulare)、コリネバクテリウム・ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)、コリネバクテリウム・ストリアツム(Corynebacterium striatum)、コリネバクテリウム・ポルティソリ(Corynebacterium pollutisoli)、コリネバクテリウム・イミタンス(Corynebacterium imitans)、コリネバクテリウム・テスツディノリス(Corynebacterium testudinoris)及びコリネバクテリウム・フラベッセンス(Corynebacterium flavescens)からなる群から選択されるいずれか一つ以上でありってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)であってもよいが、これらに制限されない。
上記Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物は、組換え微生物であってもよい。上記組換え微生物は、前述した通りである。
本出願において、用語「培養」とは、上記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界において知られた適当な培地と培養条件に応じて行われ得る。このような培養過程は、選択される菌株により当業者が容易に調整して用いることができる。具体的には、上記培養は、回分式、連続式及び流加式であってもよいが、これらに制限されるものではない。
本出願において、用語、「培地」とは、上記微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとして栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及びその他培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であれば、特別な制限なくいずれも用いられるが、本出願の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び/又はビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件下で温度、pHなどを調節しながら培養することができる。具体的には、コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は文献[「Manual of Methods for General Bacteriology」by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)（非特許文献１３）]から見ることができる。
本出願において、上記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物:マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸;グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などが含まれ得る。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜(即ち、還元糖に転換された糖蜜)などのような炭水化物が用いられ、それ以外の適正量の炭素源を制限なく多様に用いることができる。これら炭素源は、単独で用いられるか、又は2種以上が組み合わせられて用いられるが、これらに限定されるものではない。
上記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等のような無機窒素源;グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、NZ-アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物等のような有機窒素源が用いられる。これら窒素源は、単独で用いられるか、又は2種以上が組み合わせられて用いられるが、これらに限定されるものではない。
上記リン源としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、又はこれに対応するナトリウムを含有塩などが含まれてもよい。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが用いられ、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び/又は適切な前駆体などが含まれ得る。これら構成成分又は前駆体は培地に回分式又は連続式で添加され得る。しかし、これに限定されるものではない。
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方式で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素若しくは酸素含有気体を注入すること、又は嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしに、若しくは窒素、水素若しくは二酸化炭素ガスを注入することができるが、これに限定されるものではない。
培地の温度は20℃～45℃、具体的には25℃～40℃であってもよいが、これに制限されない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けることができ、具体的には、10時間～160時間であってもよいが、これに制限されない。
上記培養により生産されたL-アミノ酸は、培地中に排出されること、又は排出されずに細胞内に残留することができる。
本出願の上記培養段階で生産されたL-アミノ酸を回収する方法は、培養方法により当該分野において公知となった適した方法を用いて培養液から目的とするL-アミノ酸を収集(collect)するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、アニオン交換クロマトグラフィ、結晶化及びHPLCなどが用いられ、当該分野において公知となった適した方法を用いて培地又は微生物から目的とするL-アミノ酸を回収することができる。
また、上記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野において公知となった適した方法を用いて行われてもよい。従って、上記回収されるL-アミノ酸は、精製された形態又はL-アミノ酸を含有した微生物発酵液であってもよい(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008（非特許文献１４）)。
本出願によるL-アミノ酸生産方法で生産されるL-アミノ酸は、その種類に制限がない。即ち、コリネバクテリウム属微生物から生産されるL-アミノ酸は、制限なく全て含まれてもよく、L-アミノ酸の中間体も含まれてもよい。上記L-アミノ酸は、例えば、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-リシン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-セリン、L-スレオニン、L-アスパラギン、L-グルタミン、L-チロシン、L-アラニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-フェニルアラニン、L-メチオニン、L-トリプトファン、L-グリシン、L-プロリン及びL-システインなどであり得、具体的には、L-リシン、L-スレオニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-アルギニン、L-グルタミン酸であってもよいが、これらに制限されるものではなく、上記L-アミノ酸の中間体は、例えば、O-アセチルホモセリンであってもよいが、これらに制限されない。
本出願のもう一つの様態は配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含む、L-アミノ酸生産能が増加したコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、これをコードする遺伝子、この発現及びコリネバクテリウム属微生物については前述した通りである。
本出願において、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むコリネバクテリウム属微生物は、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼが発現されて非変形微生物に比べてL-アミノ酸生産能が増大又は向上したものであってもよい。
本出願のコリネバクテリウム属微生物はＬ－アミノ酸を生産する微生物であり、野生型微生物だけでなく、Ｌ－アミノ酸生産能が改善されるように遺伝的に変形された微生物を含んでもよい。Ｌ－アミノ酸を生産する微生物については前述した通りである。
本出願の微生物は、上記ラクトバチルス属由来のNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼを含む組換え微生物であり、上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼを含まない微生物に比べて培地中の炭素源から目的とするL-アミノ酸を過量に生産することができる。上記組換え微生物の増大したL-アミノ酸生産能は、上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼの活性化により増加した還元力から得られるものであってもよい。即ち、上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをL-アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物に導入することにより、NADを助酵素として用いる代わりにNADPを用いるように上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼを活性化させ、これを通じてNADPHの量を増やしてL-アミノ酸生合成過程でエネルギー源である還元力として用いることができる。
本出願において、用語「非変形微生物」とは、天然型菌株自体であるか、又は上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼを含まない微生物、又は上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに形質転換されない微生物を意味することができるが、これらに制限されない。
上記L-アミノ酸については前述した通りである。
本出願によるNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入され、L-アミノ酸生産能が増大したコリネバクテリウム属微生物は、受託番号KCCM12580P、受託番号KCCM12581P、受託番号KCCM12582P、受託番号KCCM12583P、受託番号KCCM12584P、受託番号KCCM12585P、受託番号KCCM12586P又は受託番号KCCM12587Pで寄託されたコリネバクテリウム属微生物からなる群から選択されるいずれか一つであってもよい。
本出願のもう一つの態様は、配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含むコリネバクテリウム属微生物のL-アミノ酸生産用途を提供するものである。
上記NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、これをコードする遺伝子、その発現、微生物、コリネバクテリウム属微生物、配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ (NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含むコリネバクテリウム属微生物、及びL-アミノ酸については前述の通りである。
以下、本出願を実施例により、より詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれら実施例により制限されるものではなく、本出願の属する技術分野において通常の知識を有する者にとって明白であるだろう。
実施例1-1.ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクスATCC11842由来のNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapN(L))をコリネバクテリウム属微生物の染色体内トランスポゾンに導入するためのベクター製作
コリネバクテリウムに親和力が高いNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼとしてラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)由来のNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼを選定した。その後、上記活性を向上させるために、次の実験を進行した。
ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクスATCC11842由来のgapNを暗号化するLdb1179遺伝子のアミノ酸配列(配列番号1)と塩基配列(配列番号2)は、米国国立衛生研究所のジーンバンク(NIH GenBank)から確保した。
また、コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて染色体内Ldb1179遺伝子を導入するために形質転換用ベクター4種をそれぞれ製作し、プロモーターはcj7(大韓民国登録特許第10-0620092号（特許文献１）)を用いた。
1-1-1)pDZ2457::P(cj7)-gapN(L)ベクター製作
Ldb1179遺伝子は、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクスATCC11842菌株の染色体を鋳型として配列番号3及び4プライマーを用いて開始コドンTTGをATGに変更した形態で約1.43kbの遺伝子断片を増幅した(表1)。この時、PCR反応は95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で1分30秒間の伸長過程を30回繰り返した。そのPCR結果物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した後、約1.4kbバンドを溶離して精製した。また、cj7プロモーター部位は配列番号5及び6のプライマー対を用いて同一の条件でPCRを行ってPCR産物を得た。この時、PCR反応は95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で30秒間の伸長過程を30回繰り返した。上記で得られたPCR産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニング時にIn-Fusion（登録商標） HDクローニングキット(Clontech)を用いた。これから得られたプラスミドをPDZ2457::P(cj7)-gapN(L)と命名した。
上記ベクターは、リシン、ロイシン又はアセチルホモセリン生産菌株にｇａｐＮを導入するために用いた。
1-1-2)pDZ1108::P(cj7)-gapN(L)ベクター製作
Ldb1179遺伝子は、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクスATCC11842菌株の染色体を鋳型として配列番号3及び7プライマーを用いて開始コドンTTGをATGに変更した形態で約1.43kbの遺伝子断片を増幅した(表1)。この時、PCR反応は95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で1分30秒間の伸長過程を30回繰り返した。そのPCR結果物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した後、約1.4kbバンドを溶離して精製した。また、cj7プロモーター部位は、配列番号8及び6のプライマー対を用いて同一の条件でPCRを行ってPCR産物を得た。この時、PCR反応は、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で30秒間の伸長過程を30回繰り返した。上記で得られたPCR産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニング時にIn-Fusion（登録商標） HDクローニングキット(Clontech)を用いた。これから得られたプラスミドをPDZ1108::P(cj7)-gapN(L)と命名した。
上記べクターは、イソロイシン又はスレオニン生産菌株にgapNを導入するために用いた。
1-1-3)pDZTn5::P(cj7)-gapN(L)ベクター製作
Ldb1179遺伝子は、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクスATCC11842菌株の染色体を鋳型として配列番号3及び10プライマーを用いて開始コドンTTGをATGに変更した形態で約1.43kbの遺伝子断片を増幅した(表1)。この時、PCR反応は95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で1分30秒間の伸長過程を30回繰り返した。そのPCR結果物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した後、約1.4kbバンドを溶離して精製した。また、cj7プロモーター部位は配列番号9及び6のプライマー対を用いて同一の条件でPCRを行ってPCR産物を得た。この時、PCR反応は、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で30秒間の伸長過程を30回繰り返した。上記で得られたPCR産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニング時にIn-Fusion（登録商標） HDクローニングキット(Clontech)を用いた。これから得られたプラスミドをpDZTn5::P(cj7)-gapN(L)と命名した。
上記ベクターはバリン又はアルギニン生産菌株にgapNを導入するために用いた。
1-1-4)pDZ0286::P(cj7)-gapN(L)ベクター製作
Ldb1179遺伝子は、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクスATCC11842菌株の染色体を鋳型として配列番号3及び12プライマーを用いて開始コドンTTGをATGに変更した形態で約1.43kbの遺伝子断片を増幅した(表1)。この時、PCR反応は95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で1分30秒間の伸長過程を30回繰り返した。そのPCR結果物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した後、約1.4kbバンドを溶離して精製した。また、cj7プロモーター部位は配列番号11及び6のプライマー対を用いて同一の条件でPCRを行ってPCR産物を得た。この時、PCR反応は95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で30秒間の伸長過程を30回繰り返した。上記で得られたPCR産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニング時にIn-Fusion（登録商標） HDクローニングキット(Clontech)を用いた。これから得られたプラスミドをpDZ0286::P(cj7)-gapN(L)と命名した。
上記ベクターはグルタミン酸生産菌株にgapNを導入するために用いた。
Figure 0007193902000001
実施例1-2.ストレプトコッカス変異株(Streptococcus mutans)ATCC25175由来のNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapN(S))をコリネバクテリウム属微生物の染色体内トランスポゾンに導入するためのベクター製作
ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクスATCC11842由来のgapNの対照群としてストレプトコッカス変異株(Streptococcusmutans)ATCC25175内NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するSMUFR_0590(大韓民国登録特許第10-1182033号（特許文献４）)を導入するために次の実験を進めた。
ストレプトコッカス変異株ATCC25175由来のgapNを暗号化するSMUFR_0590遺伝子のアミノ酸配列(配列番号13)及び塩基配列(配列番号14)は米国国立衛生研究所のジーンバンク(NIH GenBank)から確保し、トランスポゾン遺伝子内CJ7プロモーターにより発現されるSMUFR_0590を導入するためのベクターを製作した。
実施例1-1と同様に形質転換用ベクターpDZを用い、プロモーターはcj7を用いた。ストレプトコッカス変異株ATCC25175由来のSMUFR_0590遺伝子はpECCG122-Pcj7-gapN(大韓民国登録特許第10-1182033号（特許文献４）)を鋳型として配列番号15及び16プライマーを用いて約1.7kbの遺伝子断片を増幅した(表2)。この時、PCR反応は95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で2分間の伸長過程を30回繰り返した。そのPCR結果物を0.8％アガロースゲルで電気泳動した後、所望の大きさのバンドを溶離して精製した。上記で得られたPCR産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニング時にIn-Fusion（登録商標） HDクローニングキット(Clontech)を用いた。これから得られたプラスミドをpDZTn::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
Figure 0007193902000002
実施例1-3. Clostridium acetobutylicum由来のNADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(gapN(C))をコリネバクテリウム属微生物の染色体内トランスポゾンに導入するためのベクター製作
ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクスATCC 11842由来のgapNの対照群として、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)内NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ活性を有するNCBI GenBank WP_010966919.1のgapNを導入するために、次の実験を行った。
クロストリジウム・アセトブチリカム由来のNCBI GenBank WP_010966919.1及びNCBI GenBank NC_015687.1のgapN遺伝子のアミノ酸配列(配列番号35)及び塩基配列(配列番号36)はNCBI GenBankから確保し、トランスポゾン遺伝子内のCJ7プロモーターにより発現されるNCBI GenBank WP_010966919.1のgapNを導入するためのベクターを製作した。
実施例1-1と同様に形質転換用ベクターpDZを使用し、プロモーターはcj7を利用した。クロストリジウム・アセトブチリカム由来のNCBI GenBank WP_010966919.1のgapN遺伝子は、クロストリジウム・アセトブチリカムのgDNAを鋳型として配列番号37及び38プライマーを用いて約1.5 kbの遺伝子断片を増幅した。また、CJ7プロモーターを得るために、pECCG122-Pcj7-gapN（大韓民国登録特許第10-1182033号（特許文献４））を鋳型として配列番号15及び配列番号39を利用して約400bpの遺伝子断片を増幅した（表3）。その時、PCR反応は95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で2分間の伸長過程を30回繰り返した。このPCRの結果物を0.8％アガロスゲルで電気泳動した後、目的とする大きさのバンドを溶離して精製した。上記で得られたPCR産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニング時にIn-Fusion（登録商標）HDクローニングキット（Clontech）を使用した。これから得られたプラスミドをpDZTn::P(cj7)-gapN(C)と命名した。
Figure 0007193902000003
実施例2-1.L-リシン生産菌株KCCM11016PでgapN(L)、gapN(S)又はgapN(C)が導入された菌株の製作及び評価
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032菌株基盤にL.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapNが導入によるL-リシン生産能に及ぼす効果を確認するために実施例1-1-1で製作したプラスミド、実施例1-2で製作したプラスミド、 及び実施例1-3で製作したプラスミドを電気穿孔法でコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11016P(大韓民国登録特許第10-0159812号（特許文献５）)に導入して形質転換体を得、上記形質転換体をカナマイシン(25μg/ml)とX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリン-β-D-ガラクトシド、5-bromo-4-chloro-3-indoline-β-D-galactoside)が含まれたBHIS平板培地(Braine heart infusion 37 g/l,ソルビトール91 g/l、寒天2％)に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。これより形成されたコロニーの中で青色のコロニーを選択することにより、P(CJ7)-gapN(L), P(CJ7)-gapN(S),又はP(CJ7)-gapN(C)が導入された菌株を選抜した。
上記選抜された菌株をそれぞれKCCM11016P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11016P::P(cj7)-gapN(S), KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C)と命名した。
製作された菌株を次のような方法で培養してリシン生産能を比較した。種培地25mlを含む250mlコーナー-バッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含む250mlコーナー-バッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で72時間、200rpmで振盪培養した。 上記種培地と生産培地の組成はそれぞれ下記の通りである。
<種培地(pH7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、 KH2PO4 4g, K2HPO4 8g, MgSO4・7H2O 0.5g 、ビオチン100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg (蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH7.0)>
ブドウ糖100g、(NH4)2SO4 40g 、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids) 5g 、尿素3g、 KH2PO4 1g, MgSO4・7H2O 0.5g、ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド3000μg、CaCO3 30g (蒸溜水1リットル基準)。
培養終了後にHPLCでL-リシンの生産能を測定した。実験した各菌株に対する培養液中のL-リシン濃度及び濃度増加率は下記表4の通りである。
Figure 0007193902000004
上記表4で示された通りL-リシン生産菌株KCCM11016Pに比べてgapN遺伝子が導入されたKCCM11016P::P(cj7)-gapN(S)ではL-リシンの濃度が約16％増加、 KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(L)ではL-リシンの濃度が約20％増加、KCCM11016P:::P(cj7)-gapN(C)ではL-リシンの濃度が約9％増加することを確認した。
KCCM11016P::P(cj7)-gapN(L)はCA01-7528と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年9月2日付で寄託して受託番号KCCM12585Pの付与を受けた。
実施例2-2.L-リシン生産菌株KCCM11347PでgapN(L)、gapN(S)又はgapN(C)が導入された菌株の製作及び評価
コリネバクテリウム・グルタミクムに属する他のリシン生産菌株でリシン生産能を確認するために実施例1-1-1で製作したプラスミド、実施例1-2で製作したプラスミド、及び実施例1-3で製作したプラスミドを用いて、上記実施例2-1と同様の方法でL-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11347P(大韓民国登録特許第10-0073610号（特許文献６）)に導入した菌株を製作し、それぞれ KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L), KCCM11347P::P(cj7)-gapN(S), KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C)と命名した。
製作された菌株を上記実施例2-1と同様の方法で培養し、培養終了後にHPLCでL-リシンの生産能を測定した。実験した各菌株に対する培養液中のL-リシン濃度及び濃度増加率は下記表5の通りである。
Figure 0007193902000005
上記の表5で示された通り、L-リシン生産菌株KCCM11347Pに比べてgapN遺伝子が導入されたKCCM11347P::P(cj7)-gapN(S)ではL-リシンの濃度が約14％増加、KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(L)ではL-リシンの濃度が約19％増加、KCCM11347P:::P(cj7)-gapN(C)ではL-リシンの濃度が約5％増加することを確認した。
実施例2-3.L-リシン生産菌株CJ3PでgapN(L), gapN(S), 又はgapN(C)が導入された菌株の製作及び評価
コリネバクテリウム・グルタミクムに属する更に他のリシン生産菌株で効果を確認するために実施例1-1-1で製作したプラスミド、実施例1-2で製作したプラスミド、 及び実施例1-3で製作したプラスミドを用いて、上記実施例2-1と同様の方法でL-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムCJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)に導入した菌株を製作し、それぞれCJ3P::P(cj7)-gapN(L), CJ3P::P(cj7)-gapN(S), CJ3P::P(cj7)-gapN(C)と命名した。CJ3P菌株は既に公知となった技術に基づいて野生株に3種の変異(pyc(Pro458Ser), hom(Val59Ala), lysC(Thr311Ile))を導入してL-リシン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミクム菌株である。
製作された菌株を上記実施例2-1と同様の方法で培養し、培養終了後にHPLCでL-リシンの生産能を測定した。実験した各菌株に対する培養液中のL-リシン濃度及び濃度増加率は下記表6の通りである。
Figure 0007193902000006
上記表6で示された通りL-リシン生産菌株CJ3Pに比べてgapN遺伝子が導入されたCJ3P::P(cj7)-gapN(S)ではLリシンの濃度が約8％増加、 CJ3P::P(cj7)-gapN(L)ではL-リシンの濃度が約13％増加、CJ3P::P(cj7)-gapN(C)ではL-リシンの濃度が約4％増加することを確認した。
実施例2-4.L-リシン生産菌株KCCM10770PでgapN(L), gapN(S)又はgapN(C)が導入された菌株の製作及び評価
コリネバクテリウム・グルタミクムに属する更に他のリシン生産菌株で効果を確認するために実施例1-1-1で製作したプラスミド、実施例1-2で製作したプラスミド, 及び実施例1-3で製作したプラスミドを用いて、上記実施例2-1と同様の方法でリシン生合成経路が強化されたL-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM10770P(大韓民国登録特許第10-0924065号（特許文献７）)に導入した菌株を製作し、それぞれKCCM10770P::P(cj7)-gapN(L), KCCM10770P::P(cj7)-gapN(S), KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C)と命名した。上記KCCM10770P菌株はリシン生合成経路構成遺伝子中、aspB(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子)、lysC(アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子)、asd(アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子)、dapA(ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子)、dapB(ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子)及び1ysA(ジアミノジピメレートジカルボキシラーゼをコードする遺伝子)、即ち、6種の遺伝子を染色体上にそれぞれ2コピーずつ保有しているL-リシン生産菌株である。
製作された菌株を上記実施例2-1と同様の方法で培養し、培養終了後にHPLCでL-リシンの生産能を測定した。実験した各菌株に対する培養液中のL-リシン濃度及び濃度増加率は下記表7の通りである。
Figure 0007193902000007
上記表7で示された通りL-リシン生産菌株KCCM10770Pに比べてgapN遺伝子が導入されたKCCM10770P::P(cj7)-gapN(S)ではL-リシンの濃度が約17％増加、 KCCM10770P::P(cj7)-gapN(L)ではL-リシンの濃度が約25％増加, KCCM10770P::P(cj7)-gapN(C) はL-リシンの濃度が約10％増加することを確認した。
上記実施例2-1～4の結果から互いに異なる系列の多様なL-リシン生産コリネバクテリウム・グルタミクム菌株で L.delbrueckii subsp. Bulgaricus由来のgapN導入がL-リシン生産に効果的であることが分かった。また、既に公知となった大韓民国登録特許第10-1182033号（特許文献４）のS.mutans 由来gapNを導入した菌株及び既に公知となったNCBI GenBank WP_010966919.1のC.acetobutylicum由来のgapN導入した菌株よりL.delbrueckii subsp. Bulgaricus由来gapNを導入した菌株がL-リシン生産能に優れることを確認した。
実施例3-1.L-スレオニン生産菌株でgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032(以下WT)菌株基盤にlysC(L377K)変異体(大韓民国登録特許第10-2011994号（特許文献８）)と hom(R398Q) 変異体(大韓民国登録特許第10-1947959号（特許文献９）)を導入してL-スレオニン生産菌株を製作した。この菌株に実施例1-1-2で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作してスレオニン生産能を比較した。
lysC(L377K)を導入するベクターを製作するためにWTの染色体を鋳型として配列番号17及び18あるいは配列番号19及び20プライマーを用いてPCRを行った。95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、lysC遺伝子の変異を中心に5'上端部位の509bp DNA断片と3'下端部位の520bpのDNA断片をそれぞれ得た。
増幅された2種類のDNA切片を鋳型として、配列番号17及び20のプライマーでPCRを行った。95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、377番目のロイシンがリシンで置換されたアスパルトキナーゼ変異体を暗号化するlysC遺伝子の変異を含む1011bpのDNA断片が増幅された。
コリネバクテリウム・グルタミクム内で複製が不可能なpDZベクター(大韓民国登録特許第10-0924065号（特許文献７）)と1011bpのDNA断片を制限酵素XbaIで処理した後、DNA接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることにより、プラスミドを獲得し、これをpDZ-lysC(L377K)と命名した。
上記で獲得したpDZ-lysC(L377K)ベクターをWT菌株に電気穿孔法で導入した後、カナマイシン25mg/Lを含有した選別培地で形質転換菌株を獲得した。2次組換え過程(cross-over)で染色体上に挿入されたDNA断片によりlysC遺伝子にヌクレオチド変異が導入された菌株WT::lysC(L377K)を獲得した。
Figure 0007193902000008
また、hom(R398Q)を導入するベクターを製作するためにWTゲノムDNAを鋳型として配列番号21及び22のプライマー、配列番号23及び24のプライマーを用いてPCRを進行した。PCR条件は95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、hom遺伝子の変異を中心に5’上端部位の290bp DNA断片と3’下端部位の170bpのDNA断片を得た。この2つのPCR生産物を鋳型として配列番号21と24のプライマーを用いてPCRを進行した。95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、hom遺伝子の変異を含む440bpのDNA断片が増幅された。
Figure 0007193902000009
先に用いられたpDZベクターと440bpのDNA断片を制限酵素XbaIで処理した後、DNA接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをpDZ-hom(R398Q)と命名した。
獲得したpDZ-hom(R398Q)ベクターをWT::lysC(L377K)菌株に電気穿孔法で導入した後、カナマイシン25mg/Lを含有した選別培地で形質転換菌株を獲得した。2次組換え過程(cross-over)で染色体上に挿入されたDNA断片によりhom遺伝子にヌクレオチド変異が導入された菌株、 WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)を獲得した。
上記WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)菌株に実施例1-1-2で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれWT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L), WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
製作された菌株を上記実施例2-1と同様の方法で培養し、培養終了後にL-スレオニン生産能を比較した。実験した各菌株に対する培養液中のL-スレオニン濃度及び濃度増加率は下記表10の通りである。
Figure 0007193902000010
上記表10で示された通り、WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)に比べてgapN遺伝子が導入されたWT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)ではL-スレオニンの濃度が約15％増加、WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)ではL-スレオニンの濃度が約22％増加することを確認した。
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)はCA09-0906と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年9月2日付で寄託して受託番号KCCM12586Pの付与を受けた。
実施例3-2.L-スレオニン生産菌株KCCM11222PでgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L-スレオニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11222P(WO2013/081296（特許文献１０）)に実施例1-1-2で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれKCCM11222P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11222P::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
製作された菌株を上記実施例2-1と同様の方法で培養し、培養終了後にL-スレオニン生産能を比較した。実験した各菌株に対する培養液中のL-スレオニン濃度及び濃度増加率は、下記表11の通りである。
Figure 0007193902000011
上記表11で示された通りL-スレオニン生産菌株KCCM11222Pに比べてgapN遺伝子が導入されたKCCM11222P::P(cj7)-gapN(S)ではL-スレオニンの濃度が約14％増加、 KCCM11222P::P(cj7)-gapN(L)ではL-スレオニンの濃度が約20％増加することを確認した。
上記実施例の結果は、コリネバクテリウム属L-スレオニン生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus由来のgapNの導入がL-スレオニン生産に効果的であることを示した。
実施例4-1.L-イソロイシン生産菌株でgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032(以下WT)菌株基盤にL.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN導入によるL-イソロイシン生産能に及ぼす効果を確認するために既に公知となったスレオニンデヒドラターゼ(L-threonine dehydratase)をコードする遺伝子であるilvA変異[ilvA(V323A); S. Morbach et al., Appl. Enviro. Microbiol., 62(12): 4345-4351, 1996（非特許文献１５）]を導入してL-イソロイシン生産能が強化された菌株を製作した。
ilvA遺伝子を対象に変異導入ベクターを製作するために変異位置を中心に5’上端部位を増幅するためのプライマー一対(配列番号25及び26)と3’下端部位を増幅するためのプライマー一対(配列番号27及び28)を考案した。配列番号25及び28のプライマーは各末端にBamHI制限酵素部位(下線で表示)を挿入し、配列番号26及び27のプライマーは互いに交差するように考案した部位にヌクレオチド置換変異(下線で表示)が位置するようにした。
Figure 0007193902000012
WTの染色体を鋳型として配列番号25及び配列番号26、配列番号27及び配列番号28のプライマーを用いてPCRを行った。PCR条件は95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、ilvA遺伝子の変異を中心に5’上端部位の627bp DNA断片と3’下端部位の608bpのDNA断片を得た。
増幅された2種類のDNA切片を鋳型として、配列番号25及び配列番号28のプライマーでPCRを行った。95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、323番目のバリンがアラニンで置換されたIlvA変異体を暗号化するilvA遺伝子の変異を含む1217bpのDNA断片が増幅された。
pECCG117ベクター(大韓民国登録特許第10-0057684号（特許文献１１）)と1011bpのDNA断片を制限酵素BamHIで処理し、DNA接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることにより、プラスミドを獲得し、これをpECCG117-ilvA(V323A)と命名した。
上記pECCG117-ilvA(V323A)ベクターを上記実施例3-1のWT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)、WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)菌株に導入し、ilvA(V323A)変異が導入された菌株を製作した。また、この対照群としてWT::lysC(L377K)-hom(R398Q)にilvA(V323A)変異のみ導入した菌株も製作した。
製作された菌株を上記実施例2-1と同様の方法で培養し、培養終了後にL-イソロイシン生産能を比較した。実験した各菌株に対する培養液中のL-イソロイシン濃度及び濃度増加率は下記表13の通りである。
Figure 0007193902000013
上記表13で示された通り、WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-ilvA(V323A)に比べてgapN遺伝子が導入されたWT::lysC(L377K)-hom(R3989)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-ilva(V323A)ではL-イソロイシンの濃度が約18.6％増加、WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A)ではL-イソロイシンの濃度が約30％増加することを確認した。
WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-ilvA(V323A)はCA10-3108と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年9月2日付で寄託して受託番号KCCM12582Pの付与を受けた。
実施例4-2.L-イソロイシン生産菌株KCCM11248PでgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L-イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11248P(大韓民国登録特許第10-1335789号（特許文献１２）)に実施例1-1-2で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれKCCM11248P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11248P::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
製作された菌株を実施例2-1と同様の方法で培養してL-イソロイシン生産能を比較した。培養終了後にHPLCでL-イソロイシンの生産能を測定し、実験した各菌株に対する培養液中のL-イソロイシン濃度及び濃度増加率は下記表14の通りである。
Figure 0007193902000014
上記表14で示された通りL-イソロイシン生産菌株KCCM11248Pに比べてgapN遺伝子が導入されたKCCM11248P::P(cj7)-gapN(S)ではL-イソロイシンの濃度が約38％増加、KCCM11248P:::P(cj7)-gapN(L)ではL-イソロイシンの濃度が約61.5％増加することを確認した。
上記結果は、コリネバクテリウム属のL-イソロイシン生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus由来gapNの導入がL-イソロイシン生産に効果的であることを示した。
実施例5-1.L-ロイシン生産菌株でgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032菌株基盤に L.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN導入によるL-ロイシン生産能に及ぼす効果を確認するために既に公知となった2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ(2-isopropylmalate synthase)をコードする遺伝子であるleuAの変異[leuA (R558H, G561D);大韓民国公開特許番号第2018-0077008号（特許文献１３）]を導入してL-ロイシン生産能が向上した菌株を製作した。
具体的には、上記特許で製作された組換えプラスミドpDZ-leuA(R558H,G561D)をWT菌株に電気パルス法で導入した後、カナマイシン(kanamycin)25mg/lを含有した培地で選別した。2次組換え過程(cross-over)で染色体上に挿入されたDNA断片によりleuA遺伝子にヌクレオチド変異が導入された菌株、WT::leuA(R558H, G561D)を獲得し、これをCJL8001と命名した。
L-ロイシン生産能を獲得したコリネバクテリウム・グルタミクムCJL8001を対象に実施例1-1-1で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれCJL8001::P(cj7)-gapN(S), CJL8001::P(cj7)-gapN(L)と命名した。
製作された菌株のL-ロイシン生産能を比較するために製作された菌株を下記のような方法で培養してロイシン生産能を比較した。各菌株を栄養培地で継代培養した後、生産培地25mlを含有する250mlコーナー-バッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃で72時間、200rpmで振盪培養した。その後、HPLCを用いてL-ロイシンの濃度を分析し、分析したL-ロイシンの濃度及び濃度増加率を下記表15に示した。
<栄養培地(pH7.2)>
ブドウ糖10g、肉汁5g、ポリペプトン10g、塩化ナトリウム2.5g、酵母エキス5g、寒天20g、ウレア2g(蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH7.0)>
ブドウ糖50g、硫酸アンモニウム20g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)20g、第2リン酸カリウム1g、硫酸マグネシウム7水塩0.5g、ビオチン100μg、チアミン-HCl 1mg炭酸カルシウム15g(蒸溜水1リットル基準)
Figure 0007193902000015
上記表15で示された通りL-ロイシン生産菌株CJL8001に比べてgapN遺伝子が導入されたCJL8001::P(cj7)-gapN(S)ではL-ロイシンの濃度が約15％増加、CJL8001::P(cj7)-gapN(L)ではL-ロイシンの濃度が約21％増加することを確認した。
CJL8001::P(cj7)-gapN(L)はCA13-8102と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年9月2日付で寄託し、受託番号KCCM12583Pの付与を受けた。
実施例5-2:L-ロイシン生産菌株KCCM11661P,KCCM11662PでgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L-ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11661P(大韓民国登録特許第10-1851898号（特許文献１４）)、KCCM11662P(大韓民国登録特許第10-1796830号（特許文献１５）)を対象に実施例1-1-1で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれKCCM11661P::P(cj7)-gapN(L)、KCCM11661P::P(cj7)-gapN(S)、KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L)、KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
製作された菌株を上記実施例5-1と同様の方法で培養し、培養終了後にL-ロイシン生産能を比較した。各菌株で生産したL-ロイシンの濃度及び濃度増加率を下記表16に示した。
Figure 0007193902000016
上記表16で示された通りL-ロイシン生産菌株KCCM11661P及びKCCM11662P比べてgapN遺伝子が導入されたKCCM11661P::P(cj7)-gapN(S)、KCCM11662P::P(cj7)-gapN(S)ではL-ロイシンの濃度が約4％増加、KCCM11661P::P(cj7)-gapN(L)、KCCM11662P::P(cj7)-gapN(L)ではL-ロイシンの濃度が約11％増加することを確認した。
上記結果は、コリネバクテリウム属のL-ロイシン生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus由来のgapN導入がL-ロイシン生産に効果的であることを示した。
実施例6-1.L-バリン生産菌株でgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapNの導入がL-バリン生産能に及ぼす効果を確認するために野生株コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13869に1種の変異[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467（非特許文献１６）]を導入してL-バリン生産能を有するようになった変異株を製作し、上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムCJ8Vと命名した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクム野生型であるATCC13869菌株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを実施した。ilvN遺伝子にA42V変異を導入するベクターを製作するために、配列番号29及び配列番号30のプライマー対、配列番号31及び配列番号32のプライマー対を用いて遺伝子断片(A,B)をそれぞれ得た。PCRの条件は94℃で5分間の変性後、94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で60秒間の重合を25回繰り返し、72℃で7分間の重合反応を行った。
その結果、断片A、Bはいずれも537bpのポリヌクレオチドを獲得することができた。上記両断片を鋳型として配列番号29と配列番号32のプライマーを用いてOverlapping PCRを実施して1044bpのDNA断片を得た。
上記得られた1044bpのDNA断片と先に用いられたpDZベクターを制限酵素XbaIで処理した後、接合酵素を利用して連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをpDZ-ilvN(A42V)と命名した。
Figure 0007193902000017
その後、上記で製作された組換えプラスミドpDZ-ilvN(A42V)を染色体上での相同組換えにより野生型であるコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13869に電気パルス法で導入した後、カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有した選別培地で形質転換菌株を獲得した。2次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミクム形質転換株を対象に配列番号29及び配列番号32のプライマーを用いたPCRを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列分析を通じて変異導入菌株を確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミクムCJ8Vと命名した。
最後に、L-バリン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミクムCJ8Vを対象に実施例1-1-3で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれCJ8V::P(cj7)-gapN(L)、CJ8V::Pcj7-gapN(S)と命名した。製作された菌株を下記のような方法で培養してL-バリン生産能を比較した。
それぞれ菌株を栄養培地で継代培養した後、生産培地25mlを含有する250mlコーナー-バッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃で72時間、200rpmで振盪培養した。その後、HPLCを用いてL-バリンの濃度を分析し、分析したL-バリンの濃度及び濃度増加率を下記表18に示した。
<栄養培地(pH7.2)>
ブドウ糖10g、肉汁5g、ポリペプトン10g、塩化ナトリウム2.5g、酵母エキス5g、寒天20g、ウレア2g(蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH7.0)>
ブドウ糖100g、硫酸アンモニウム40g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、第2リン酸カリウム1g、硫酸マグネシウム7水塩0.5g、ビオチン100μg、チアミン-HCl 1mg、パントテン酸カルシウム2mg、ニコチンアマイド3mg、炭酸カルシウム30g(蒸溜水1リットル基準)
Figure 0007193902000018
上記表18の結果のように、CJ8V-Pcj7/gapN(L)、CJ8V-Pcj7/gapN(S)菌株のL-バリン生産能は対照群比それぞれ18％、12％増加することを確認した。
結果的に、コリネバクテリウム属のL-バリン生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN遺伝子導入がL-バリンの生産能を向上させることができることを確認した。
CJ8V-Pcj7/gapN(L)はCA08-2038と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年9月2日付で寄託して受託番号KCCM12581Pの付与を受けた。
実施例6-2.Lバリン生産菌株KCCM11201PでgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L-バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM11201P(大韓民国登録特許第10-1117022号（特許文献１６）)に実施例1-1-3で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作してそれぞれKCCM11201P::P(cj7)-gapN(L)、KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
製作された菌株のL-バリン生産能を比較するために上記実施例6-1と同様の方法で培養してL-バリンの濃度を分析し、分析したL-バリンの濃度及び濃度増加率を下記表19に示した。
Figure 0007193902000019
上記結果のように、KCCM11201P::P(cj7)-gapN(L), KCCM11201P::P(cj7)-gapN(S) 菌株のL-バリン生産能は対照群比それぞれ32.1％、17.9％増加することを確認した。
結果的に、コリネバクテリウム属のL-バリン生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN遺伝子導入がL-バリンの生産能を向上させることを確認した。
実施例7-1.L-アルギニン生産菌株でgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapNの導入がL-アルギニン生産能に及ぼす効果を確認するために野生株コリネバクテリウム・グルタミクムATCC21831を対象に実施例1-1-3で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれ ATCC21831::P(cj7)gapN(L)、ATCC21831::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
製作された菌株を次のような方法で培養してL-アルギニン生産能を比較した。それぞれ菌株を栄養培地で継代培養した後、種培地25mlを含有する250mlコーナー-バッフルフラスコにそれぞれ接種し、30℃で20時間200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlコーナー-バッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で72時間、200rpmで振盪培養した。上記栄養培地、種培地、生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。培養終了後にHPLCによりL-アルギニンの生産量を測定し、分析したL-アルギニンの濃度及び濃度増加率を下記表20に示した。
<栄養培地(pH7.2)>
ブドウ糖10g、肉汁5g、ポリペプトン10g、塩化ナトリウム2.5g、酵母エキス5g、寒天20g、ウレア2g(蒸溜水1リットル基準)
<種培地(pH7.0)>
スクロース20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、 KH2PO44g, K2HPO4 8g, MgSO4・7H2O 0.5g 、ビオチン100μg、チアミンHCl 1mgパントテン酸カルシウム2mg、ニコチンアミド2mg(蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH7.0)>
スクロース6％、硫酸アンモニウム3％、第1リン酸カリウム0.1％、硫酸マグネシウム7水塩0.2％、CSL(トウモロコシ浸漬液)1.5％、NaCl 1％、酵母抽出物0.5％、ビオチン100mg/L(蒸溜水1リットル基準)。
Figure 0007193902000020
上記結果のように、ATCC21831::P(cj7)gapN(L), ATCC21831::P(cj7)-gapN(S)菌株のL-アルギニン生産能は対照群比それぞれ19.5％、12.1％増加することを確認した。
ATCC21831::P(cj7)-gapN(L)はCA06-2951と命名して、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年9月2日付で寄託して受託番号KCCM12580Pの付与を受けた。
結果的に、コリネバクテリウム属のL-アルギニン生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN遺伝子導入がL-アルギニンの生産能を向上させることができることを確認した。
実施例7-2.L-アルギニン生産菌株KCCM10741PでgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L-アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKCCM10741P(大韓民国登録特許第10-0791659号（特許文献１７）)を対象に実施例1-1-3で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれKCCM10741P::P(cj7)-gapN(L)、KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
製作された菌株のL-アルギニン生産能を比較するために、上記実施例7-1と同様の方法で培養してL-アルギニンの濃度を分析し、分析したL-アルギニンの濃度及び濃度増加率を下記表21に示した。
Figure 0007193902000021
上記結果のように、KCCM10741P::P(cj7)-gapN(L), KCCM10741P::P(cj7)-gapN(S)菌株のL-アルギニン生産能は対照群比それぞれ22.6％、9.7％増加することを確認した。
結果的に、コリネバクテリウム属のL-アルギニン生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN遺伝子の導入がL-アルギニンの生産能を向上させることを確認した。
実施例8-1.O-アセチルホモセリン生産菌株でgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
野生型菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032に実施例1-1-1で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で菌株を製作し、それぞれATCC13032::P(cj7)-gapN(L), ATCC13032::P(cj7)-gapN(S)と命名した。製作された菌株を下記のような方法で培養し、O-アセチルホモセリン生産能を比較した。
種培地25mlを含有する250mlコーナー-バッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlコーナー-バッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で48時間、200rpmで振盪培養した。上記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
<種培地(pH7.0)>
ブドウ糖20g、ペプトン10g、酵母抽出物5g、尿素1.5g、 KH2PO4 4g, K2HPO4 8g, MgSO4・7H2O 0.5g, ビオチン100μg、チアミンHC11000μg、パントテン酸カルシウム2000μg、ニコチンアミド2000μg(蒸溜水1リットル基準)
<生産培地(pH7.0)>
ブドウ糖50g、(NH4)2SO4 12.5g、大豆タンパク質2.5g、トウモロコシ浸漬固形分(Corn Steep Solids)5g、尿素3g、 KH2PO4 1g, MgSO4・7H2O 0.5g, ビオチン100μg、チアミン塩酸塩1000μg、カルシウム-パントテン酸2000g、ニコチンアミド3000μg、 CaCO3 30g (蒸溜水1リットル基準)
培養終了後、HPLCでO-アセチルホモセリンの生産能を測定した。実験した各菌株に対する培養液中のO-アセチルホモセリン濃度及び濃度増加率は下記表22の通りである。
Figure 0007193902000022
上記表22で示された通り野生型菌株であるATCC13032に比べてgapN遺伝子が導入されたATCC13032::P(cj7)-gapN(S)ではO-アセチルホモセリンの濃度が約33％増加、ATCC13032:::P(cj7)-gapN(L)ではO-アセチルホモセリンの濃度が約67％増加することを確認した。
ATCC13032::P(cj7)-gapN(L)はCM04-0531と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年9月2日付で寄託し、受託番号KCCM12584Pの付与を受けた。
実施例8-2.O-アセチルホモセリン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクム菌株で L.delbrueckii subsp. Bulgaricus由来のgapN(L)又はS.mutans由来のgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN導入がO-アセチルホモセリン生産能に及ぼす効果を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミクムの自己ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ(Metx)を強化した。
MetXをコードする遺伝子を増幅するためにWT(Wildtype)由来の報告された配列に基づいてプロモーター部位(開始コドン上段約300bp)からターミネーター部位(終結コドン下端約100bp)まで増幅するための配列番号33及び34を考案した。配列番号33及び34のプライマーの両末端にBamHI制限酵素部位を挿入した。PCR条件は95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で90秒間の重合を30回繰り返した後、72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、metX遺伝子のコーディング部位1546bpのDNA断片を得た。pECCG117ベクター(大韓民国登録特許第10-0057684号（特許文献１１）)とmetXDNA断片をBamHIで処理し、DNA接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることにより、プラスミドを獲得し、これをpECCG117-metX WTと命名した。
Figure 0007193902000023
pECCG117-metX WTベクターを上記実施例3-1の WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L), WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)菌株に導入し、コリネバクテリウム・グルタミクム自己metXが過発現された菌株を製作した。また、その対照群としてWT::lysC(L377K)-hom(R398Q)にも、同一のベクターを導入した。
製造された菌株を実施例8-1のフラスコ培養法と同様の方法で培養し、培養液中のO-アセチルホモセリン濃度及び濃度増加率を分析し、その結果を表24に示した。
Figure 0007193902000024
上記表24で示された通りWT::lysC(L377K)-hom(R398Q)/pECCG117-metX WTに比べてgapN遺伝子が導入されたWT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(S)/pECCG117-metX WTではO-アセチルホモセリンの濃度が約35％増加、WT::lysC(L377K)-hom(R398Q)::P(cj7)-gapN(L)/pECCG117-metX WTではO-アセチルホモセリンの濃度が約55％増加することを確認した。
上記結果は、コリネバクテリウム属の野生型菌株で L.delbrueckii subsp. Bulgaricus由来のgapNの導入がO-アセチルホモセリン生産に効果的であることを示す。
実施例9-1.グルタミン酸生産菌株でgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans 由来gapNの導入がグルタミン酸生産能に及ぼす効果を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13869菌株を対象に実施例1-1-4で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で製作された菌株をそれぞれ ATCC13869::P(cj7)-gapN(L), ATCC13869::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
種培地25mlを含有する250mlコーナー-バッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃で20時間、200rpmで振盪培養した。その後、生産培地25mlを含有する250mlコーナー-バッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で40時間、200rpmで振盪培養した。培養はビオチン制限条件で進行された。培養終了後、HPLCを用いた方法を通じてL-グルタミン酸濃度及び濃度増加率を測定し、測定結果は下記表25に示した。
<種培地(pH7.2)>
ブドウ糖1％、肉汁0.5％、ポリペプトン1％、塩化ナトリウム0.25％、酵母エキス0.5％、寒天2％、ウレア0.2％
<生産培地>
原糖6％、炭酸カルシウム5％、硫酸アンモニウム2.25％、一リン酸カリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.04％、硫酸鉄10mg/L、チアミン塩酸塩0.2mg/L
Figure 0007193902000025
上記表25で示された通り、野生型菌株であるATCC13869に比べてgapN遺伝子が導入されたATCC13869::P(cj7)-gapN(S)ではグルタミン酸の濃度が約60％増加、ATCC13869:::P(cj7)-gapN(L)ではグルタミン酸の濃度が約80％増加することを確認した。
ATCC13869::P(cj7)-gapN(L)はCA02-1360と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに2019年9月2日付で寄託して受託番号KCCM12587Pの付与を受けた。
実施例9-2.L-グルタミン酸生産菌株KFCC11074でgapN(L)又はgapN(S)が導入された菌株の製作及び評価
L-グルタミン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムKFCC11074菌株(大韓民国登録特許第10-0292299号（特許文献１８）)に実施例1-1-4で製作したプラスミドと実施例1-2で製作したプラスミドを導入し、上記実施例2-1と同様の方法で製作された菌株をそれぞれKFCC11074::P(cj7)-gapN(L)、KFCC11074::P(cj7)-gapN(S)と命名した。
製作された菌株のL-グルタミン酸生産能を比較するために上記実施例10-1と同様の方法で培養してL-グルタミン酸の濃度を分析し、分析したLグルタミン酸の濃度及び濃度増加率を下記表26に示した。
Figure 0007193902000026
上記表25で示された通り、KFCC11074に比べてgapN遺伝子が導入されたKFCC11074::P(cj7)-gapN(S)ではグルタミン酸の濃度が約22.9％増加、KFCC11074::P(cj7)-gapN(L)ではグルタミン酸の濃度が約37.3％増加することを確認した。
結果的に、コリネバクテリウム属のL-グルタミン酸生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN遺伝子導入がL-グルタミン酸の生産能を向上させることを確認した。
上記実施例1-9の結果を総合してみれば、コリネバクテリウム属のL-グルタミン酸生産菌株でL.delbrueckii subsp. Bulgaricus又はS.mutans由来のgapN遺伝子の導入がL-アミノ酸の生産能を向上させ、特に、 S.mutans由来のgapN遺伝子を導入した時より L.delbrueckii subsp. Bulgaricus由来のgapN遺伝子を導入した時にさらに優れたL-アミノ酸生産能を示すことを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
Figure 0007193902000027
Figure 0007193902000028
Figure 0007193902000029
Figure 0007193902000030
Figure 0007193902000031
Figure 0007193902000032
Figure 0007193902000033
Figure 0007193902000034

Claims (7)

  1. 配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階;及び上記培養された微生物又は培養物からL-アミノ酸を回収する段階;を含む、L-アミノ酸生産方法。
  2. 上記配列番号1のアミノ酸配列は、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus)由来である、請求項1に記載のL-アミノ酸生産方法。
  3. 上記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項1に記載のL-アミノ酸生産方法。
  4. 配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含む、L-アミノ酸生産能が増加したコリネバクテリウム属微生物。
  5. 上記配列番号1のアミノ酸配列は、ラクトバチルスデルブリッキィ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbruecki subsp. Bulgaricus)由来である、請求項4に記載のコリネバクテリウム属微生物。
  6. 上記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項4に記載のコリネバクテリウム属微生物。
  7. 配列番号1のアミノ酸配列を含む、NADP依存的グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NADP dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)を含むコリネバクテリウム属微生物のL-アミノ酸生産における使用。
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