JPH0731477A

JPH0731477A - コリネ型細菌内でプロモーター機能を有するｄｎａ断片

Info

Publication number: JPH0731477A
Application number: JP5183596A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Hatakeyama; 和久畠山; Miki Kobayashi; 幹小林; Yasurou Kurusu; 泰朗久留主; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1995-02-03

Abstract

(57)【要約】【構成】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
から単離されたビオチンシンセターゼをコードする遺伝
子に由来する１８９塩基対より成るプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片。【効果】このプロモーター機能を有するＤＮＡ断片
を、タンパク質をコードする構造遺伝子とともにプラス
ミドベクターに組み込み宿主コリネ型細菌に導入した時
に、該構造遺伝子が高発現する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はコリネ型細菌内のビオチ
ンシンセターゼをコードする遺伝子に由来するコリネ型
細菌内でプロモーター機能を有する新規なＤＮＡを含む
ＤＮＡ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ
型細菌は、アミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を
生産する工業的に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ
技術の導入による菌株の育種改良は、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等に比べて遅れ
ている。特に、プラスミドベクターに挿入された構造遺
伝子のコリネ型細菌内での発現のために必要なプロモー
ターの構造に関する知見は極めて少く、コリネ型細菌を
宿主として用いて構造遺伝子を発現させようとする場合
にはかなり問題となっている。

【０００３】一方、本発明者らは先にコリネ型細菌染色
体からビオチン生合成に関与するビオチンシンセターゼ
をコードする遺伝子を単離し提案した（特開平４−２７
８０８８号明細書参照）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の主たる目的
は、プラスミドベクターに挿入された構造遺伝子をコリ
ネ型細菌内で確実に発現せしめるようなプロモーター機
能を有する新規なＤＮＡ断片を取得することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、コリネ型
細菌内でプロモーター機能を有するＤＮＡを鋭意検索し
た結果、先に提案したコリネ型細菌内のビオチンシンセ
ターゼをコードする遺伝子（以下これを「ｂｉｏＢ」と
いうことがある；特開平４−２７８０８８号明細書参
照）上流の１８９ｂｐのＤＮＡがコリネ型細菌内でプロ
モーター機能を有することを見い出し、本発明を完成す
るに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、コリネ型細菌内のビ
オチンシンセターゼをコードする遺伝子（ｂｉｏＢ）に
由来するコリネ型細菌内でプロモーター機能を有する後
記配列表の配列番号：１に示される１８９ｂｐ塩基配列
を含むＤＮＡ断片である。以下、本発明についてさらに
詳細に説明する。本明細書において、「プロモーター機
能を有するＤＮＡ」とは、遺伝子の転写を開始するため
にＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ上の領
域であって、タンパク質をコードする構造遺伝子ととも
にプラスミドベクターに組み込まれ宿主コリネ型細菌に
導入された時に、該構造遺伝子の発現強度の増加作用を
有するＤＮＡを意味する。

【０００７】本発明のプロモーター機能を有するＤＮＡ
は、通常はコリネ型細菌内のｂｉｏＢを含むＤＮＡ断片
から得ることができる。上記ｂｉｏＢを含むＤＮＡ断片
の供給源となる微生物は、コリネ型細菌であれば特に限
定されるものではないが、一般的には、ブレビバクテリ
ウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９
７）およびその由来株、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎ
ｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７
４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバクテリウム・デ
バリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｖａ
ｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３
８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴ
ＣＣ３１８３１等が有利に使用される。

【０００８】これらの供給源微生物からｂｉｏＢを含む
ＤＮＡ断片を調製するための基本的操作の一例を述べれ
ば次のとおりである。すなわち、ｂｉｏＢを含むＤＮＡ
断片の調製は、上記コリネ型細菌、例えばブレビバクテ
リウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆ
ｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９
７）株の染色体上に存在し、この染色体を適当な制限酵
素で切断することにより生ずる切断断片の中から以下に
述べる方法で分離、取得することができる。

【０００９】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩを
用いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂになる
ように部分分解する。得られたＤＮＡ断片をコスミドベ
クター、例えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドを、
λＤＮＡｉｎｖｉｔｒｏＰａｃｋａｇｉｎｇＫ
ｉｔを用いる形質導入により、ｂｉｏＢの欠損した大腸
菌変異株（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ，ｖｏｌ９４，ｐ２０６５−２０６６，１９６
７及びＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ，ｖｏｌ１１２，ｐ８３０−８３９，１９７２参
照）に導入する。この大腸菌変異株を、ビオチンを含ま
ない選択培地に塗沫する。

【００１０】得られる形質転換株よりコスミドＤＮＡを
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
ｂｉｏＢ断片を確認・取得することができる。かくして
得られるｂｉｏＢ断片は、大きさが約２０〜３０ｋｂと
大きく、実用的でないので、さらに短かい断片に特定化
する必要がある。

【００１１】次に、上記で得られたｂｉｏＢを含むＤＮ
Ａ断片を保有するコスミドを適当な制限酵素を用いて切
断し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌で複製可能なベク
タープラスミドに挿入しこのベクタープラスミドを通常
用いられる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法、電
気パルス法による形質転換により、前記ｂｉｏＢの欠損
した大腸菌変異株に導入し、この大腸菌変異株をビオチ
ンを含まない選択培地に塗沫する。

【００１２】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のｂｉｏＢを含むＤＮＡ断片を確認・取得することがで
きる。このようにして得られるｂｉｏＢを含む断片の一
つは、前記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩの部分分解に
より切り出し、さらにそれを制限酵素ＨｉｎｄIII およ
びＳａｃＩで切り出すことによって得られる大きさが約
１．７ｋｂのＤＮＡ断片を挙げることができる。

【００１３】この約１．７ｋｂのｂｉｏＢを含むＤＮＡ
断片を、各種の制限酵素で切断したときの認識部位数及
び切断断片の大きさを下記表１に示す。なお、本明細書
において、制限酵素による「認識部位数」は、ＤＮＡ断
片又はプラスミドを、過剰の制限酵素の存在下で完全分
解し、それらの分解物をそれ自体既知の方法に従い１％
アガロースゲル電気泳動および４％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供し、分離可能な断片の数から決定した
値を採用した。

【００１４】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシェリヒア・コリのラムダファージ（λ ｐｈａ
ｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得ら
れる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上で
の泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φｘ１７
４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅIIIで切断し
て得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリル
アミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、
切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさ
を算出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれ
の大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大き
さの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。

【００１５】

【表１】表１制限酵素認識部位数切断断片の大きさ（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ１１．１，０．６ＨｉｎｃII １１．５，０．２ＳｍａＩ１１．０，０．７

【００１６】上記したブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII およ
びＳａｃＩで切り出すことにより得られる大きさが約
１．７ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列をプ
ラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９を用いるジデ
オキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉ
ｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ７４，５４６３，１９７７）により決定すること
ができる。このようにして決定した約１．７ｋｂのＤＮ
Ａ断片の塩基配列中に３３４個のアミノ酸をコードする
１００２塩基対より成るオープンリーディングフレーム
が存在し（特開平４−２７８０８８号明細書参照）、該
オープンリーディングフレームの上流部分がプロモータ
ー機能を有すると考えられた。

【００１７】次に、該オープンリーディングフレームの
上流部分のプロモーター機能を有すると考えられるＤＮ
Ａ領域の上流および下流の配列に相当する適当な塩基配
列、例えば後記配列表の配列番号：２および配列番号：
３に示される塩基配列を化学合成し、これをプライマー
ＤＮＡとして用いて、プロモーター機能を有すると考え
られるＤＮＡ領域を増幅することができる。プライマー
ＤＮＡの合成は、例えばベックマン社製ＤＮＡ合成機Ｓ
ｙｓｔｅｍ−１Ｐｌｕｓを用いて合成でき、ＤＮＡ領
域の増幅は、例えばＤＮＡサーマルサイクラー４０８型
（宝酒造社製）を用いてＮａｔｕｒｅ，３２４，ｐ１６
３（１９８６年）に記載の方法により行うことができ
る。

【００１８】かくして得られる増幅ＤＮＡ断片をコリネ
型細菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクター
に組み込むことによって該増幅ＤＮＡのプロモーター機
能を確認することができる。「コリネ型細菌内で自律増
殖可能なプロモーター検出用ベクター」としては、例え
ば、コリネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）
と、プロモーターが欠失している発現されるべきタンパ
ク質をコードする構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ）
（以下これを「発現されるべき遺伝子」と略称すること
がある）とを保有するプラスミドであれば特に制限はな
い。このプラスミド検出用ベクターの具体例としては、
コリネ型細菌内で自律増殖可能なＤＮＡ断片（ａ）とし
てブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦＯ１２１４
４（ＦＥＲＭＢＰ−２５１５）由来のプラスミドｐＢ
Ｙ５０３を制限酵素ＫｐｎＩで切り出すことによって得
られる約６ｋｂのＤＮＡ断片、プロモーターが欠失して
いる発現されるべきタンパク質をコードする構造遺伝子
を含むＤＮＡ断片（ｂ）としてエシェリヒア・コリのト
ランポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝
子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝子を保有するプラスミ
ドｐＰＲ３（特開平３−１４７７９２号明細書参照）を
挙げることができる。

【００１９】次に、上記プラスミド検出用ベクターを用
てプロモーター機能を有するＤＮＡ断片の検出法を述べ
る。先ず、上記プラスミド検出用ベクターを、それ自体
既知の通常用いられる形質転換法、例えば電気パルス法
〔ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５４，４４３，（１９９
０）参照〕等でコリネ型細菌、例えばブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９
７）へ導入し、形質転換株を適当な培地で培養し、プロ
モーターが欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）が
発現しないことを確認しておく。ここで、プロモーター
が欠失している発現されるべき遺伝子（ｂ）の発現の有
無および発現強度の測定は、該遺伝子（ｂ）が薬剤耐性
遺伝子である場合はその薬剤を含有する選択培地で培養
し、形質転換株の薬剤感受性を調べることで容易に行う
ことができる。また発現の有無および発現強度は、形質
転換株を通常用いられる培地で培養し、培地中の発現さ
れるべき遺伝子（ｂ）の発現産物を、該遺伝子の発現産
物の性質を利用して調べることもできる。

【００２０】次に、発現されるべき遺伝子（ｂ）がコリ
ネ型細菌内で発現していないことが確認できたプラスミ
ド検出用ベクター、例えばｐＰＲ３の発現されるべきＣ
ＡＴ遺伝子の上流部位を適当な制限酵素、例えばＢａｍ
ＨＩで解裂し、該部位に前記ｂｉｏＢを含むＤＮＡ断片
由来の増幅ＤＮＡをＤＮＡリガーゼ処理により連絡し、
コリネ型細菌へ電気パルス法等により導入する。得られ
る形質転換株を培養し、前記した発現されるべき遺伝子
（ｂ）の確認法により、形質転換株の該遺伝子の発現の
有無及び強度を調べることにより、挿入されたＤＮＡ断
片のプロモーター機能を確認することができる。

【００２１】かくして得られる本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片としては、後記配列表の配列番
号：１に示される１８９塩基対より成るＤＮＡを挙げる
ことができる。上記した後記配列表の配列番号：１に示
される塩基配列を包含して成る本発明のプロモーター機
能を有するＤＮＡ断片は、天然のコリネ型細菌染色体Ｄ
ＮＡから分離されたｂｉｏＢを含むＤＮＡ断片に由来す
るもののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例
えばベックマン社製Ｓｙｓｔｅｍ−１Ｐｌｕｓを用い
て合成されたものであってもよい。

【００２２】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから増幅して得られ
る本発明のＤＮＡ断片は、プロモーター機能を実質的に
損なうことがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩
基と置換されていてもよく又は削除されていてもよく、
或いは新たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基
配列の一部が転位されているものであってもよく、これ
らの誘導体のいずれもが、本発明のプロモーター機能を
有するＤＮＡ断片に包含されるものである。

【００２３】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明するが、下記の実施例は本発明について具体的認識を
得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本
発明の範囲は何ら限定されるものではない。

【００２４】実施例１ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のプロ
モーター機能を有する断片およびビオチンシンセターゼ
構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）のクローン化（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ
₄ ７ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄
０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ₄ ４〜６Ｈ₂Ｏ６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ、蒸留
水１ｌ〕１ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期
まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／
ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ−２
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭＥＤＴＡ
・２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナーゼＫ
を、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、
３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウ
ムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で
６時間保温して容菌した。この溶菌液に、等量のフェノ
ール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆる
やかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、
２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸
ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量
のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層
の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エ
タノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ
・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の
実験に用いた。

【００２５】（Ｂ）組換え体の創製上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ９０μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
１ｕｎｉｔを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解
した。この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（スト
ラタジーン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、
脱リン酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
ＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００２６】（Ｃ）ｂｉｏＢ断片を含むコスミドの選抜上記（Ｂ）項で得たコスミド混液を用い、常法に従いエ
シェリヒア・コリＲ８７５株（ｂｉｏＢ）〔（）内は
ビオチンシンセターゼ遺伝子型を示す。またこの菌株の
詳細は、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１１２，８３
０１９７２参照〕を形質導入し、アンピシリン５０ｍ
ｇを含む選択培地〔Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄
２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及
び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解〕に塗沫した。なお形
質導入には、宝酒造より販売されているλ ＤＮＡｉ
ｎｖｉｔｒｏＰａｃｋａｇｉｎｇＫｉｔを用いた。
培地上の生育株を常法により、液体培養し、培養液より
コスミドＤＮＡを抽出し、該コスミドを制限酵素により
切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて調べたとこ
ろ、コスミドｐＷＥ１５の長さ８．８ｋｂのＤＮＡ断片
に加え、長さ約３０ｋｂのＤＮＡ断片が認められた。本
コスミドをｐＷＥ１５−ｂｉｏＢと命名した。

【００２７】（Ｄ）コリネ型細菌内でプロモーター機能
を有する断片およびビオチンシンセターゼ構造遺伝子を
含むＤＮＡ断片（ｂｉｏＢを含むＤＮＡ断片）のプラス
ミドｐＨＳＧ３９９へのサブクローニング上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−ｂｉｏＢに含
まれるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的で
ないので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化
するために、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市
販）へｂｉｏＢを含むＤＮＡ断片を下記のとおりサブク
ローニングした。

【００２８】上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−
ｂｉｏＢを制限酵素ＨｉｎｄIII ，ＳａｃＩで切断した
ものと、プラスミドｐＨＳＧ３９９を制限酵素Ｈｉｎｄ
III，ＳａｃＩで切断したものを混合し、５０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、１ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂及びＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃
度は最終濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、結
合させた。

【００２９】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，ｐ１５９，１９７０）によりエ
シェリヒア・コリＲ８７５（ｂｉｏＢ）株を形質転換
し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む選択培地〔Ｋ
₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ、（ＮＨ₄） ₂
ＳＯ₄ １ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１ｇ、カザ
ミノ酸１０ｇ、グルコース２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水
１ｌに溶解〕に塗沫した。

【００３０】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１．７ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あった。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に
示す。

【００３１】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表２に示す。

【００３２】

【表２】表２プラスミドｐＨＳＧ３９９−ｂｉｏＢ制限酵素認識部位数切断断片の大きさ（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ２２．８，１．１ＨｉｎｃII １３．９ＳｍａＩ１３．９上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＨ
ＳＧ３９９−ｂｉｏＢと命名した。

【００３３】以上により、コリネ型細菌内でプロモータ
ー機能を有する断片およびビオチンシンセターゼ構造遺
伝子を含む大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（ｂｉｏ
Ｂを含むＤＮＡ断片）を得ることができた。

【００３４】実施例２コリネ型細菌内でプロモーター機能を有する断片および
ビオチンシンセターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩
基配列の決定実施例２の（Ｄ）で得られた長さが約１．７ｋｂのコリ
ネ型細菌内でプロモーター機能を有する断片およびビオ
チンシンセターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片につい
て、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵ
Ｃ１１９を用いるジヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘ
ｙｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ法）（Ｓａｎ
ｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ７４，５４６３，１９７７）によ
り図１に示した戦略図に従って決定した。その塩基配列
中のオープンリーディングフレームの存在から、ビオチ
ンシンセターゼ構造遺伝子は３３４アミノ酸をコードす
る１００５塩基対より構成され、該オープンリーディン
グフレームの上流部分にプロモーター機能を有すると考
えられる後記配列表の配列番号：１に示される１８９塩
基対よりなる配列が存在した。

【００３５】実施例３プロモーター機能を有するＤＮＡ断片の単離（Ａ）ＤＮＡ領域の増幅に使用するプライマーＤＮＡの
合成実施例２において決定したビオチンシンセターゼ構造遺
伝子上流の配列番号：１に示される１８９ｂｐの配列を
基に、該領域のみを特異的に増幅するために下記のプラ
イマーＤＮＡを合成した（アンダーライン部分はＢａｍ
ＨＩ部位）。

【００３６】５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＡ
ＧＣＡＡＧＧＣＣＧＴ−３′（配列番号：２）５′−ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＡ
ＴＡＡＣ−３′（相補鎖；配列番号：３）プライマーＤＮＡの合成はベックマン社製ＤＮＡ合成機
Ｓｙｓｔｅｍ−１ｐｌｕｓを用いて行った。

【００３７】（Ｂ）プロモーター機能を有するＤＮＡ断
片の増幅反応液〔５０ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８．８），１．５ｍＭＭｇＣｌ₂，１００μｇ
／ｍｌゼラチン，２００μＭｄＮＴＰｓ，２５０ｐｍｏ
ｌプライマー〕に、２．５ｕｎｉｔｓのＴａｑポリメラ
ーゼ、１ｎｇのＤＮＡを添加し、ディネーチャー９４℃
１分間、アニーリング３７℃、２分間、ポリメライゼー
ション７２℃、３分間の反応を、ＤＮＡサーマルサイク
ラー４０８型（宝酒造社製）で２５回繰り返すことによ
りＤＮＡ断片を増幅させた。増幅ＤＮＡ断片の確認は４
％アガロースゲル電気泳動により１８９ｂｐのＤＮＡ断
片を視認することにより行なった。

【００３８】実施例４プロモーター機能を有するＤＮＡ断片のプラスミドｐＰ
Ｒ３への導入特開平３−１４７７９２号明細書の記載に基いて調製し
たプラスミドｐＰＲ３０．５μｇに制限酵素ＢａｍＨＩ
（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ、プラスミ
ドＤＮＡを完全に分解した。

【００３９】実施例３で調製したプロモーター機能を有
するＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制
限酵素を不活化するために６５℃で１０分間加熱処理し
た後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍ
Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、
１．０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ
４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造
社製）を形質転換した。

【００４０】形質転換株は５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシンを含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母
エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ７．
２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られ
た。これら生育株のプラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法
〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏ
ｎｉｎｇ”（１９８２）９０〜９１参照〕により抽出し
た。

【００４１】得られたプラスミドは電気パルス法によ
り、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭＢＰ−１４９７）プラスミド除去株へ形質転換
し、アルカリ−ＳＤＳ法を用いてプラスミドを抽出し
た。このプラスミドの制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃＩ等の制限酵素による切断パターンによってｐＰ
Ｒ３に前記増幅ＤＮＡが組み込まれていることを確認
し、このプラスミドを“ｐＰＲ３−ｂｉｏＢ”と命名し
た。

【００４２】実施例５プロモーター強度の測定：実施例４でｐＰＲ３に挿入し
たプロモーターの強度を、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の活性を測定すること
によって調べた。

【００４３】ｐＰＲ３を保有するブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３株とｐＰＲ３−ｂｉｏＢを保有す
るブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株をそれ
ぞれ、実施例１の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａ培地に
カナマイシンを５０μｇ／ｍｌ加えた培地１０ｍｌの入
った試験管で一晩前培養し、その培養液を上記の培地１
００ｍｌの入った三角フラスコで約６時間培養後集菌
し、ＣＡＴの活性測定に用いた。ＣＡＴの活性はＷ．
Ｖ．Ｓｈａｗらの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
Ｊａｎ．（１９６８）２８〜３６参照〕により測定し
た。その結果、ｐＰＲ３−ｂｉｏＢを有するＭＪ−２３
３株は、プロモーターの挿入されていないｐＰＲ３を有
するＭＪ−２３３株の約５倍のＣＡＴ活性をもってい
た。

【００４４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１８９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacteri
um flavum ）株名：ＭＪ２３３配列の特徴特徴を表す記号：Ｐｒｏｍｏｔｅｒ特徴を決定した方法：Ｅ配列： TCTTGTTAGC AAGGCCGTTC AACCGCGCTG TTAATCAGCC ATTTTTGAAC ATGTGTTCAA 60 AAATTCTTGA ACACTGTTCA AGTCATGGGT TAAGGTTGTC GTTTAAGGCA CGTGTCATTT 120 TGCATGCGCG TGCCCAATTC TTCTTAAGTG TGCTCAATTT TTAAGCGCGC AGTTATTGAC 180 AACCAGCCT 189

【００４５】配列番号：２配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列： CCGGATCCTC TTGTTAGCAA GGCCGT 26

【００４６】配列番号：３配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列： CCGGATCCAG GCTGGTTGTC AATAAC 26

【図面の簡単な説明】

【図１】コリネ型細菌内でプロモーター機能を有する断
片およびビオチンシンセターゼ構造遺伝子を含む大きさ
が約１．７ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図、お
よび塩基配列決定のための戦略図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネ型細菌内のビオチンシンセターゼ
をコードする遺伝子に由来するコリネ型細菌内でプロモ
ーター機能を有する下記の塩基配列： TCTTGTTAGC AAGGCCGTTC AACCGCGCTG TTAATCAGCC ATTTTTGAAC ATGTGTTCAA 60 AAATTCTTGA ACACTGTTCA AGTCATGGGT TAAGGTTGTC GTTTAAGGCA CGTGTCATTT 120 TGCATGCGCG TGCCCAATTC TTCTTAAGTG TGCTCAATTT TTAAGCGCGC AGTTATTGAC 180 AACCAGCCT 189 を含むＤＮＡ断片。