KR20020089548A

KR20020089548A - 설폴로버스 하코네시스로부터 분리된 트레할로스 합성관여 유전자 및 이들의 단백질

Info

Publication number: KR20020089548A
Application number: KR1020010028420A
Authority: KR
Inventors: 최양도; 정 호 김; 서주석
Original assignee: 주식회사 싸이젠하베스트; 최양도; 정 호 김
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2002-11-29

Abstract

본 발명은 트레할로스(trehalose) 합성 관여 유전자 및 이들의 단백질에 관한 것으로, 설폴로버스 하코네시스로부터 분리된 말토올리고실트레할로스 가수분해효소(ShMTH) 유전자, 말토올리고실트레할로스 생합성효소(ShMTS) 유전자 및 이들의 단백질을 제공한다. 본 발명의 말토올리고실트레할로스 합성 관여 단백질은 트레할로스 생산효율이 높으면서 내열성이 우수한 장점때문에, 기존의 트레할로스 합성 관여 단백질보다 효과적으로 트레할로스를 생산할 수 있다.

Description

설폴로버스 하코네시스로부터 분리된 트레할로스 합성 관여 유전자 및 이들의 단백질{Genes associated with synthesis of trehalose isolated from Sulfolobus hakonesis and proteins thereof}

본 발명은 트레할로스 합성 관여 유전자 및 이들의 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 건조 식품의 색과 풍미를 보존할 수 있고, 고온처리를 필요로하는 식음료 분야에서 감미료로 사용될 수 있는 트레할로스를 효과적으로 합성할 수 있는, 설폴로버스 하코네시스로부터 분리된 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 유전자, 말토올리고실트레할로스 생합성효소 유전자 및 이들의 단백질에 관한 것이다.

트레할로스(α-D-glucopyranosyl-[1-1]-α-D-glucopyranose, trehalose)는 포도당 2분자가 α,α-1,1 결합으로 이루어진 비환원성 이당류로 식물, 곤충, 미생물 등에 널리 존재한다. 트레할로스는 환원성 탄수화물의 저장 형태로 특히, 버섯, 효모, 해조 및 새우 등의 식품에 존재한다(Elbein, A.,Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 30:227-256, 1974). 트레할로스는 영양분 고갈, 고온, 건조, 산소 결핍 및 삼투압 등 외부의 물리적, 화학적 자극으로부터 세포를 보호하는 것으로 알려져있다. 건조 환경에서 트레할로스의 -OH 기가 세포내 단백질 및 세포막 인지질과 수소 결합을 하여 세포 구조를 유지해 준다.

트레할로스는 수분 결합 특성이 우수하여 전분의 노화와 동결건조 단백질의 변성을 방지할 수 있어, 식품 첨가제로 사용되면 식품 고유의 풍미, 색상 및 질감 등을 유지할 수 있다. 또한, 내열성, 내산성, 저흡습성 및 저충치성 등의 특성이 있어 가공식품 뿐만 아니라, 의약품 및 화장품 등의 각 분야에 폭 넓게 사용될 수 있다(Eleutherio, E. C. A.et al.,Cryobiology, 30:591-596, 1993; Crowe, J. H. and L.M. Croweet al., Science, 223:701-703, 1984; Tsvetkova, N. M.et al.,Biophys J., 75:2947-2955, 1998; Eroglu, A.et al.,Nature Biotechnol., 18:163-167, 2000; Guo, N.et al.,Nature Biotechnol., 18:168-171, 2000). 또한, 트레할로스는 당도가 설탕 당도의 45%로 저감미이면서 완화한 단맛을 가지고 있고 다른 감미료와 잘 조화되어 독특한 단맛을 만들어 낸다. 게다가, 비환원성으로 단백질과 함께 가열하여도 갈변현상이 일어나지 않기 때문에 고온 처리 및 보존을 필요로 하는 식음료 분야에 널리 이용될 수 있다. 용해도는 설탕보다 낮으며 말토스와 유사하기 때문에 결정성이 우수하고 흡습성이 낮은 토핑 등에 사용될 수 있으며, 상대습도 95%까지는 거의 흡방습을 하지 않는 안정한 특성 때문에 정과 및 당의정 등의 원료로 적합하다. 아울러, 트레할로스는 천연 이당류 중에서 가장 안정하며, 착색이나 분해가 일어나지 않아 식품 가공 전반에 폭넓게 이용될 수 있다(Roser,Trends in Food Sci. & Technol.466-469, 1991; Kidd, G. and J. Devorak,Biotechnology, 12:1328-1329, 1994; Portmann and Birch,J. Sci. FoodAgric. 69: 275-281, 1995).

트레할로스 합성반응은 효모에서 가장 잘 알려져 있으며 효모에서 트레할로스는 다음과 같이 두 종류의 효소에 의해 합성된다. 먼저, 트레할로스-6-포스페이트 생합성효소(trehalose-6-phosphate synthase, 이하 'TPS'라 함)가 UDP-글루코스(UDP-glucose)와 글루코스-6-포스페이트(glucose-6-phosphate)를 축합시켜 트레할로스-6-포스페이트(trehalose-6-phosphate)를 합성한다. 다음으로, 트레할로스-6-포스페이트 포스파타제(trehalose-6-phosphate phosphatase, 이하 'TPP'라 함)가 트레할로스-6-포스페이트에 작용하여 트레할로스를 합성한다. 효모의 트레할로스 생합성효소 복합체(trehalose synthase complex)는 56kDa TPS 서브유닛(TPS subunit, TSS1, TPS1 또는 CIF1), 102kDa TPP 서브유닛(TPP subunit, TPS2) 및 123kDa의 조절 서브유닛(regulatory subunit, TSL1)으로 구성되어 있다. 또한, 상기 트레할로스 생합성효소 복합체의 유전자 및 단백질이 분리되었고 단백질의 3차 구조도 결정된 바 있다(Bell, W.,et al.,Eur. J. Biochem., 209:951-959, 1992; Thevelein, J. M. and S. Hohmann,TIBS, 20:3-10, 1995; De Virgilio, C.,et al.,Eur. J. Biochem., 212:315-323, 1993; Vuorio O. E.,et al,Eur. J. Biochem., 216:849-861, 1993).

대장균의 트레할로스는OtsA 유전자에 의해 암호화되는 53.6kDa TPS와OtsB에 의해 암호화되는 29.1kDa TPP에 의해 합성된다. 상기 두 종류 효소는 그 유전자가 분리되었고 단백질의 구조도 결정되었다(Kaasen, I.,et al.,J. Bacteriol.,174:889-898, 1992; Kaasen, I.,et al.,Gene, 145:9-145, 1994).

또한, 리조비움 속(Rhizobiumsp.)등의 근류균에서 TPS의 활성이 측정된 바 있다(Mueller, J.,et al.,Physiol Plant, 90:86-92, 1994).

최근에 보고된 트레할로스 합성과정은 일본 쿠레아 화학 인더스트리(Kurea Chemical Industry)사에서 발견한 것으로 다음과 같다. 먼저, 싸카라이드 포스포릴라제(saccharide phosphorylase)가 인산염 존재하에서 전분을 가수분해하여 α-글루코스-1-포스페이트(α-glucose-1-phosphate)를 생성한다. 다음으로, 트레할로스 포스포릴라제(trehalose phosphorylase)의 존재하에서 상기 α-글루코스-1-포스페이트와 글루코스가 반응하여 트레할로스를 합성하게 된다(Aisaka, K. and T. Masuda,FEMS Microbiology Letter, 131:47-51, 1995; Schick, I.,et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol., 43:1088-1095, 1995).

또한, 파이메로박터(Pimelobacter), 수도모나스(Pseudomonas) 및 써머스(Thermus) 등에서는 말토스를 직접 트레할로스로 전환시키는 트레할로스 합성효소 유전자가 분리된 바 있다(Nishimoto, T.,et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 59(11):2189-2190, 1995; 한국공개특허공보 제 1712호: 출원번호 95-15140).

한편, 트레할로스를 생산하고 있는 일본 하야시바라사(Hayashibara Seibutsu Kagaku, 林原生物化學硏究所)는 설폴로버스 애시도칼다리우스(S. acidocaldarius)에서 분리된 내열성 MTS/MTH 효소 시스템을 이용하여 트레할로스를 생산하고 있다. 또한, 리조비움(Rhizobium) 및 아트로박터(Arthrobacter) 속 미생물에서 말토올리고실트레할로스 생합성효소(maltooligosyltrehalose synthase; MTS)와 말토올리고실트레할로스 가수분해효소(maltooligosyltrehalose trehalohydrolase; MTH)를 분리하여 트레할로스를 합성하는 공정을 개발한 바 있다(Kizawa, H.,et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 59(10):1908-1912, 1995; Maruta, K.,et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 59(10):1829-1834, 1995; Nakata, T.,Biosci. Biotech. Biochem., 59(12):2210-2214, 1995a; Nakata, T.,Biosci. Biotech. Biochem., 59(12):2215-2218, 1995b).

또 다른 내열성 균주인 설폴로버스 솔파타리커스(Sulfolobus solfataricus), 설폴로버스 애시도칼다리우스(S. acidocaldarius) 및 설폴로버스 쉬바타에(S. shibatae)로부터, 상기 MTS 및 MTH와 동일한 트레할로스 합성 기작을 수행하는 트레할로스 합성효소 유전자 및 단백질이 분리된 바 있다(Kobayashi, K.,et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 60:1882-1885, 1996a, b; Isabellaet al.,Extremophiles2: 409-416, 1998).

본 발명자들은 트레할로스 생합성 효소를 연구하던 중, 내열성 균주인 설폴로버스 하코네시스가 트레할로스를 생산하는 것을 발견하여, 상기 설폴로버스 하코네시스로부터 트레할로스 가수분해효소 및 생합성효소의 유전자를 분리하고, 상기 유전자를 발현시켜 내열성의 트레할로스 합성효소 단백질을 획득함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 트레할로스 생산효율이 높고 내열성이 우수한 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 유전자 및 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 트레할로스 생산효율이 높고 내열성이 우수한 말토올리고실트레할로스 생합성효소 유전자 및 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 말토올리고실트레할로스 가수분해효소 유전자 또는 말토올리고실트레할로스 생합성효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

도 1은 설폴로버스 하코네시스의 게놈 DNA를 제한효소BamHI,EcoRI,HindIII,PstI 및XhoI으로 절단하여 서던블럿을 실시한 결과를 나타낸 사진이다.

M : λ/HindIII

레인 1 :BamHI

레인 2 :EcoRI

레인 3 :HindIII

레인 4 :PstI

레인 5 :XhoI

도 2는 말토올리고실트레할로스 가수분해효소(ShMTH) 및 말토올리고실트레할로스 생합성효소(ShMTS) 유전자 단편의 상대적인 위치와 제한효소지도를 나타낸 것이다.

E :EcoRI 부위

K :KpnI 부위

Sc :SacI 부위

Ps :PstI 부위

Bg :BglII 부위

Xo :XhoI 부위

도 3은 대장균에서 발현시킨 말토올리고실트레할로스 가수분해효소(ShMTH) 및 말토올리고실트레할로스 생합성효소(ShMTS) 단백질을 분리하여 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

M : 단백질 분자량 마커

C : pRSET 벡터로 형질전환시킨 대장균의 단백질

S : pRBShMTS 벡터로 형질전환시킨 대장균의 단백질

H : pRBShMTH 벡터로 형질전환시킨 대장균의 단백질

도 4는 도 3의 각각의 효소 단백질과 말토펜타오스(maltopentaose, G5)를 반응시켜 트레할로스 합성반응을 실시한 후, 트레할로스 합성 여부를 얇은막크로마토그래피 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

M : 기준물질

C : 음성 대조구

레인 1 : 반응 시간 1시간

레인 2 : 반응 시간 30분

도 5a는 도 4의 기준물질을 HPLC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5b는 트레할로스 합성반응을 실시한 후, 음성 대조구를 HPLC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5c는 트레할로스 합성반응을 1시간 동안 실시한 후, 합성된 트레할로스를 HPLC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 설폴로버스 하코네시스(Sulfolobus hakonesis, JCM 8857)로부터 분리된, 서열번호 1로 표시되는 말토올리고실트레할로스 가수분해효소(maltooligosyltrehalose trehalohydrolase; ShMTH) 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 ShMTH 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 설폴로버스 하코네시스로부터 분리된, 서열번호 3으로 표시되는 말토올리고실트레할로스 생합성효소(maltooligosyltrehalose synthase; ShMTS) 유전자 및 서열번호 4로 표시되는 ShMTS 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, ShMTH 유전자 또는 ShMTS 유전자를 각각 포함하는 재조합 벡터 pRBShMTH(기탁번호 : KCTC 1006BP) 또는 pRBShMTS(기탁번호 : KCTC 1007BP)를 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 각각 형질전환된 형질전환체 를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

설폴로버스 하코네시스로부터 분리된 트레할로스 합성 관여 유전자는 ShMTH 유전자 및 ShMTS 유전자로 이루어져 있으며, 이로부터 암호화되는 단백질들의 기작은 다음과 같다. 먼저, ShMTS 유전자로부터 암호화되는 ShMTS 단백질은 말토올리고당(maltooligosaccharide)의 환원말단에 존재하는 α(1→4)글리코시딕 결합(glycosidic bond)을 α(1→1) 글리코시딕 결합으로 전환시킴으로써, 말토올리고실트레할로스를 생성한다. 다음으로, ShMTH 유전자로부터 암호화되는 ShMTH 단백질은 말토올리고실트레할로스의 말토올리고실과 트레할로스 사이의 α(1→4) 글리코시딕 결합을 가수분해시킴으로써, 포도당 단위 2개가 감소된 말토올리고당과 트레할로스를 생성한다.

본 발명의 일 실시예에서는 설폴로버스 하코네시스로부터 트레할로스 합성 관여 유전자를 분리하기 위하여 설폴로버스 하코네시스의 게놈 DNA를 분리하였다. 본 발명에서 사용한 내열성 균주 설폴로버스 하코네시스(JCM8857)는 일본 미생물 보관기관(Japan Collection of Microorganisms; JCM)으로부터 구입하여 사용하였다. 게놈 DNA의 분리는 공지의 방법에 따라 분리할 수 있으나, 차보니어 등의 방법(Charbonnieret al., Archaea, A Laboratory manual. Thermophiles. pp87-90. CSH laboratory Press, 1995)에 따라 분리하는 것이 바람직하다.

분리된 게놈 DNA를 여러가지 제한효소로 절단한 후 서던블럿(Southern blot)을 실시하여 탐침자(probe)와 혼성화되는 DNA 단편들로부터 트레할로스 합성 관여 유전자를 분리하고 분석하였다.

상기 탐침자로는 기존에 분리된 트레할로스 합성효소 유전자를 사용할 수 있고, 설폴로버스 속(Sulfolobus sp.)으로부터 분리된 유전자를 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 설폴로버스 솔파타리커스로부터 분리된 트레할로스 합성효소 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 기존에 알려진 트레할로스 합성효소 유전자들은 만은 경우에, 트레할로스 가수분해효소 유전자와 트레할로스 생합성효소 유전자가 5' 또는 3' 방향으로 5-10 kbp 이내에 존재한다. 따라서, 기존에 분리된 트레할로스 합성효소 유전자를 탐침자로 사용하여 ShMTH 유전자를 분리한 후, 분리된 ShMTH 유전자를 새로운 탐침자로 사용하면 ShMTS 유전자를 용이하게 분리할 수 있다.

상기 서던블럿을 실시할 때 탐침자를 표지(labelling)시키는 방법으로는 방사선 동위원소 표지법, DIG(digoxigen) 표지법 및 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 표지법 등을 사용할 수 있으나, DIG 표지법을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 서던블럿 결과 혼성화된 DNA 단편들을 분석하기 위하여, 각 DNA 단편들을 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한 후, 재조합 벡터로 세균을 형질전환하였다. 다음으로, 콜로니 혼성화(colony hybridization)를 실시하여 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체를 선별하였다. 선별된 형질전환체로부터 상기 재조합 벡터를 분리하여 벡터에 삽입된 DNA 단편들을 분석하였다. 분석 결과,EcoRI으로 절단된 DNA 단편은 트레할로스 합성 관여 유전자 중 2.1kbp(kilo base pair)의 ShMTH 유전자를 포함하고 있었고,BglII로 절단된 DNA 단편은 트레할로스 합성 관여 유전자 중 5.5kbp의 ShMTS 유전자를 포함하고 있었다. 상기 콜로니 혼성화에 사용된 탐침자와 탐침자 표지법은 서던블럿을 실시할 때와 동일한 것을 사용하였다.

상기에서 서던블럿의 결과로 혼성화된 DNA를 삽입할 수 있는 벡터로는 특별한 제한없이 공지의 벡터를 사용할 수 있으나, pRSET-B(Invitrogen Co.) 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환시킬 수 있는 세균으로는 특별한 제한이 없으나 대장균을 사용하는 것이 바람직하다. 벡터에 삽입된 DNA 단편의 분석 방법으로는 특별한 제한이 없으나, 염기서열 결정방법 및 제한효소지도 작성방법이 바람직하다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기에서 분리·확인된 ShMTS 및 ShMTH 유전자를 발현시키고 발현된 단백질을 분석하였다. 상기 ShMTS 또는 ShMTH 유전자 를 포함하는 재조합 벡터로부터 각각의 유전자를 분리하고, 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 벡터로 세균을 형질전환시킨 후 형질전환체로부터 각각의 유전자를 발현시키고, 발현된 단백질을 SDS-PAGE 방법으로 분석하였다. 그 결과, 발현된 ShMTS는 아미노산 718개로 구성된 분자량 83.8kDa의 단백질이었고, ShMTH 효소는 아미노산 558개로 구성된 분자량 63.7kDa의 단백질이었다.

상기 발현 벡터로는 특별한 제한없이 공지의 벡터를 사용할 수 있으나, pRSET(Invitrogen Co.) 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 세균으로는 특별한 제한은 없으나 대장균을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 상기에서 발현된 ShMTS 및 ShMTH 단백질을 이용하여, 트레할로스 합성반응을 수행하고 합성된 트레할로스를 확인하였다. 트레할로스를 합성하기 위하여, 말토펜타오스(maltopentaose, G5) 기질, 20mM 소디움 아세테이트 반응 완충용액(pH5.5), ShMTS 및 ShMTH 단백질을 혼합하고, 70℃에서 30분 또는 1시간 동안 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 후, 크로마토그래피를 실시하여 트레할로스의 합성 여부를 확인하였다. 상기 크로마토그래피 방법으로는 얇은막크로마토그래피 방법 및 HPLC 방법이 바람직하다.

상기 트레할로스 합성반응에 사용될 수 있는 기질로는 특별한 제한이 없으나 말토펜타오스(G5)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 기질로는 아밀로스 및 전분 등을 포함하는 말토테트라오스(G4) 이상의 모든 말토올리고당을 사용할 수 있다. 트레할로스 합성반응은 설폴로버스 하코네시스의 배양 온도인 70℃에서 실시하는 것이 바람직하고, 합성반응 시간은 30분 내지 2시간 동안 실시하는 것이 바람직하다. 그 결과, 말토펜타오스(G5)로부터 트레할로스가 합성된 것을 확인할 수 있었고, 1시간 동안 반응시킨 경우에 더 많은 양의 트레할로스가 합성된 것을 알 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> 설폴로버스 하코네시스의 게놈 DNA 분리

내열성 균주 설폴로버스 하코네시스(JCM 8857)를 500㎖ JCM #171(Japan Collection of Microorganisms #171) 배지를 이용하여, 70℃에서 호기적 조건으로 5일 동안 배양하였다.

상기와 같이 배양된 설폴로버스 하코네시스로부터 게놈 DNA를 차보니어 등의 방법(Charbonnieret al., Archaea, A Laboratory manual. Thermophiles.pp87-90. CSH laboratory Press, 1995)에 따라 다음과 같이 분리하였다.

배양된 균체를 6,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 회수하였다. 회수된 균체를 100mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 50mM EDTA로 구성된 8㎖ TNE 완충용액(pH 7.5)으로 현탁한 후, 10% N-라우로일사코신(N-lauroylsarcosine) 1㎖을 첨가하여 천천히 혼합하였다. 10% SDS 1㎖을 첨가하여 혼합한 후, 0.5㎖ 프로티네이즈 K(proteinase K, 20mg/㎖)를 첨가하고 50℃에서 3시간 동안 반응하였다. 반응 종료 후, 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(phenol:chloroform:isoamyl alcohol) = 25:24:1인 용액으로 게놈 DNA를 3회 추출하고, 반응액 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 게놈 DNA를 침전시켰다. 분리된 게놈 DNA를 500㎕ TE(Tris-EDTA) 완충용액으로 현탁하고 RNase A를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 상기 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 = 25:24:1인 용액으로 3회 추출하고, 반응액 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 게놈 DNA를 침전시켰다.

<실시예 2> 트레할로스 합성 관여 유전자의 분리 및 분석

<2-1> ShMTH 유전자의 분리 및 분석

상기 실시예 1에서 분리한 설폴로버스 하코네시스의 게놈 DNA로부터 다음과 같이 ShMTH 유전자를 분리하였다.

설폴로버스 하코네시스의 게놈 DNA를 제한효소BamHI,EcoRI,HindIII,PstI 및XhoI으로 절단하고 아가로스 겔에 전기영동하였다. 탐침자로 서열번호 5로 표시되는 설폴로버스 솔파타리커스의 트레할로스 합성효소 유전자의 일부를 DIG(Roche MB)로 표지하여 공지의 방법(Sambrook, J.et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 따라 서던블럿을 실시하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이,EcoRI으로 절단한 약 2.1kbp의 DNA 단편이 상기 탐침자와 혼성화되었다.

상기 2.1kbp의 DNA 단편을 분리하고 이를EcoRI으로 절단한 벡터 pRSET-B(Invitrogen Co.)에 삽입하여, 재조합 벡터 pRBSh2.1을 제조하였다. 상기 재조합벡터로 대장균 MC1061을 CaCl₂방법(Sambrooket al., Molecular cloning.A laboratory mannual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)을 이용하여 형질전환시켰다. 공지의 방법(Sambrooket al., Molecular cloning.A laboratory mannual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)에 따라 콜로니 혼성화를 실시하여, 양성을 나타내는 대장균 콜로니를 선별하였다. 상기 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여 제한효소지도를 작성하고 염기서열을 결정함으로써 상기 2.1kbp의 DNA 단편을 분석하였다.

상기 2.1kbp DNA 단편의 염기서열을 결정한 후, NCBI 블라스트 써치(NCBI blast search)를 수행하였다. 그 결과, 상기 2.1kbp DNA 단편의 아미노산 서열을 설폴로버스 쉬바타에의 MTH 단백질의 아미노산 서열과 62%의 상동성을 나타냈다. 또한, 상기 DNA 단편을 형질전환체로부터 발현시킨 후 실시예 4와 같이 트레할로스 합성반응을 수행하고 트레할로스의 생성을 확인하여, 상기 DNA 단편이 설폴로버스 하코네시스의 트레할로스 합성 관여 유전자 중 서열번호 1로 표시되는 ShMTH임을 확인할 수 있었다. 또한, ShMTH 유전자의 제한효소지도 작성 결과를 도 2에 나타내었다.

<2-2> ShMTS 유전자의 분리 및 분석

제한효소로BglII를 사용하여 게놈 DNA를 절단하고 상기 실시예 2-1에서 분리한 2.1kbp DNA 단편을 탐침자로 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 ShMTS 유전자를 분리하였다.

설폴로버스 하코네시스 게놈 DNA를BglII로 절단한 경우에는 서던블럿 결과 약 5.5kbp의 DNA 단편이 탐침자와 혼성화되었다.

상기 5.5kbp의BglII DNA 단편을 분리하고 이를BglII로 절단한 벡터 pRSET-B(Invitrogen Co.)에 삽입하여 재조합 벡터 pRBSh5.5를 제조하였다.

재조합 벡터 pRBSh5.5로 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 대장균 형질전환체를 제조하고, 콜로니 혼성화를 실시하여 양성을 나타내는 대장균 콜로니를 선별하였다. 상기 대장균으로부터 재조합 벡터 pRBSh5.5를 분리하여 제한효소지도를 작성하고 염기서열을 결정함으로써, 상기 5.5kbp의 DNA 단편을 분석하였다.

상기 5.5kbp DNA 단편의 염기서열을 결정한 후, NCBI 블라스트 써치(NCBI blast search)를 수행하였다. 그 결과, 상기 5.5kbp DNA 단편의 아미노산 서열을설폴로버스 쉬바타에의 MTS 단백질의 아미노산 서열과 61%의 상동성을 나타냈다. 또한, 상기 DNA 단편을 형질전환체로부터 발현시킨 후 실시예 4와 같이 트레할로스 합성반응을 수행하고 트레할로스의 생성을 확인하여, 상기 DNA 단편이 설폴로버스 하코네시스의 트레할로스 합성 관여 유전자 중 서열번호 3으로 표시되는 ShMTS임을 확인할 수 있었다. 또한, ShMTS 유전자의 제한효소지도 작성 결과를 도 2에 나타내었다.

<실시예 3> ShMTS 유전자 및 ShMTH 유전자의 발현 및 단백질 분석

실시예 2에서 분리한 유전자로부터 암호화되는 ShMTS 및 ShMTH를 대장균에서발현시켜 그 결과를 확인하였다.

<3-1> ShMTS 유전자의 발현 및 단백질 분석

실시예 2-2에서 분리한 ShMTS 유전자를 대장균용 발현벡터인 pRSET(Invitrogen Co.)에 삽입하여 pRBShMTS를 제조하였다. 상기 재조합 벡터 pRBShMTS는 2001년 5월 10일에 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁되었다(기탁번호 : KCTC 1007BP). 이와 같이 제조된 재조합 벡터로 실시예 2-1과 동일한 방법으로 대장균 BL21(Promega)을 형질전환시킨 후, LB 플레이트상에서 12시간 동안 배양하였다. IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)가 1mM로 포함된 LB 플레이트로 옮겨 4시간 동안 더 배양함으로써, ShMTS 유전자의 발현을 유도하였다.

ShMTS 유전자의 발현이 유도된 대장균 BL21을 원심분리하여 회수하였다. 0.1 M NaH₂PO₄, 0.01 M Tris, 0.02 M β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)로 구성된 라이시스 완충용액 A(lysis buffer A, pH8.0)를 회수된 세포 1g당 5㎖이 되도록 현탁하였다. 초음파 파쇄기를 이용하여 현탁된 세포를 분쇄하였다. 이를 원심분리함으로써 상등액을 분리하였고, SDS-PAGE로 단백질을 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

<3-2> ShMTH 유전자의 발현 및 단백질 분석

상기 실시예 2-1에서 분리한 ShMTH 유전자를 대장균용 발현벡터인 pRSET(Invitrogen Co.)에 삽입하여 pRBShMTH를 제조하였다. 상기 재조합 벡터pRBShMTH는 2001년 5월 10일에 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁되었다(기탁번호 : KCTC 1006BP). 상기 pRBShMTH로 실시예 3-1과 동일한 방법으로 형질전환체를 제조하고, 형질전환체로부터 ShMTH의 발현을 유도한 후, 발현된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 SDS-PAGE 분석 결과, S로 표기된 83.8kDa의 ShMTS 단백질 및 H로 표기된 63.7kDa의 ShMTH 단백질이 다량 발현된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 트레할로스의 합성 및 확인

상기 실시예 3에서 분리된 ShMTS 및 ShMTH 단백질을 이용하여 트레할로스 합성능을 검정하였다.

<4-1> 트레할로스의 합성

말토펜타오스(G5)를 기질로 사용하여 트레할로스 합성반응을 다음과 같이 실시하였다.

소디움 아세테이트(sodium acetate) 완충용액(pH 5.5)을 20mM 농도로 조성하고, 말토펜타오스(G5)를 5mM 농도로 첨가한 후, ShMTS 및 ShMTH 단백질을 각각 10㎕씩 첨가하여 전체 반응 혼합액의 부피를 50㎕로 조정하였다. 반응 혼합액을 70℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 100℃에서 10분 동안 처리하여 반응을 종결하였다.

<4-2> 트레할로스의 합성 확인

상기 실시예 4-1에서 반응이 종결된 반응 혼합액을 얇은막크로마토그래피 및HPLC로 확인하였다.

얇은막크로마토그래피(Merck)는 김 등의 방법(Kimet al.,Applied & Environ. Microbiol., 66: 4620-4624, 2000)에 따라 실시하였으며, 도 4에 얇은막크로마토그래피의 결과를 나타내었다.

또한, HPLC(Dionex)는 제조사의 권장 방법에 따라 실시하여, 도 5a, 5b 및 5c에 HPLC의 결과를 나타내었다.

도 4는 얇은막크로마토그래피의 수행 결과를 나타낸다. 여기에서, M은 기준물질(Sigma Co.)로서 포도당(glucose, G1), 트레할로스(T), 말토스(maltose, G2), 말토트리오스(maltotriose, G3), 말토테트라오스(maltotetraose, G4) 및 말토펜타오스(G5)의 혼합물을 나타낸다. C는 음성 대조군으로 ShMTS 및 ShMTH 단백질을 100℃에서 10분간 열처리한 후 기질과 반응시킨 것으로, 상기 기준물질과 비교했을 때 기질인 말토펜타오스(G5)가 그대로 있음을 알 수 있다. 레인 1 또는 2는 트레할로스 합성반응을 각각 1시간 또는 30분 동안 실시한 것으로, 말토펜타오스(G5)로부터 트레할로스가 합성된 것을 확인할 수 있었고, 1시간 동안 반응시킨 경우에 더 많은 양의 트레할로스가 합성된 것을 알 수 있었다.

도 5a, 5b 및 5c는 HPLC의 결과를 나타낸다. 도 5a는 도 4와 동일한 기준물질의 HPLC 결과를 나타낸다. 상기 기준물질에 포함되어 있는 말토스와 트레할로스는 모두 포도당이 2개 연결되어 있으나, 말토스는 α(1-4) 결합이고 트레할로스는 α(1-1) 결합이다. 이러한 결합상의 차이는 도 4의 얇은막크로마토그래피에서는서로 구분이 되지 않으나, 도 5a의 HPLC에서는 구분이 된다. 도 5b는 얇은막크로마토그래피에서 음성 대조구를 HPLC 방법으로 확인한 것으로, 기질인 말토펜타오스(G5)가 그대로 남아 있음을 알 수 있다. 도 5c는 트레할로스 합성반응을 1시간 동안 수행한 결과를 나타낸 것으로, 트레할로스 합성반응에 첨가된 말토펜타오스(G5)의 약 20%가 트레할로스로 전환된 것을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 설폴로버스 하코네시스의 ShMTH 또는 ShMTS 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 상기 각각의 벡터로 형질전환된 형질전환체로부터 상기 ShMTH 또는 ShMTS 유전자를 발현시켰으며, 상기 두 종류의 효소를 이용하여 말토펜토오스로부터 트레할로스를 생산하였다. 본 발명의 트레할로스 합성 관여 효소인 ShMTH 및 ShMTS 단백질은 트레할로스 생산효율이 높으면서 내열성이 우수한 장점때문에, 기존의 트레할로스 합성효소보다 효과적으로 트레할로스를 생산할 수 있다.

Claims

설폴로버스 하코네시스로부터 분리된, 서열번호 1로 표시되는 말토올리고실트레할로스 가수분해효소(ShMTH) 유전자.
제 1항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pRBShMTH(기탁번호 : KCTC 1006BP).
제 2항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
서열번호 2로 표시되는 말토올리고실트레할로스 가수분해효소(ShMTH) 단백질.
설폴로버스 하코네시스로부터 분리된, 서열번호 3으로 표시되는 말토올리고실트레할로스 생합성효소(ShMTS) 유전자.
제 5항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pRBShMTS(기탁번호 : KCTC 1007BP).
제 6항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
서열번호 4로 표시되는 말토올리고실트레할로스 생합성효소(ShMTS) 단백질.