KR20230063438A - 신규한 한천 분해 세균 유래의 ＧＨ５０Ａ β­아가레이즈 및 이를 이용한 네오아가로비오스의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기탁번호 KCTC 13629BP로 기탁된 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 유래의 글리코사이드 가수분해효소 GH50A β-아가레이즈(Glycoside hydrolase GH50 A β-agarase) 및 상기 효소를 이용한 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종 KY-GH-1 유래의 글리코사이드 가수분해효소 GH50A β-아가레이즈는 난분해성인 한천, 아가로오스, 아가로올리고당 및 네오아가로올리고당 등을 기질로 하여 온도 범위와 pH 범위에 크게 제한됨이 없이 네오아가로비오스를 고효율로 생산할 수 있으므로 발효 산업, 식품 산업, 의약품 산업 등에 광범위하게 활용될 수 있는 우수한 우수한 효과가 있다.

Description

신규한 한천 분해 세균 유래의 ＧＨ５０Ａ β­아가레이즈 및 이를 이용한 네오아가로비오스의 생산 방법{GH50A β-AGARASE DERIVED FROM A NOVEL AGAR-DEGRADING BACTERIUM AND PRODUCING METHOD OF NEOAGAROBIOSE USING THE SAME}
본 발명은 기탁번호 KCTC 13629BP로 기탁된 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 유래의 글리코사이드 가수분해효소 GH50A β-아가레이즈(Glycoside hydrolase GH50 A β-agarase) 및 상기 효소를 이용한 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법에 관한 것이다.
해양 홍조류의 세포벽으로 잘 알려진 다당류인 한천은 두가지 다른 성분의 혼합물이다. 중성 아가로오스 및 음전하를 띈 아가로펙틴으로 이루어져 있다. 아가로오스는 α-1,3으로 연결된 3,6-anhydro-L-galactose(L-AHG)와 β-1,4로 연결된 D-갈락토오스의 교차적인 잔기로 구성된다 [1]. 아가로펙틴은 동일한 구조이지만, L-AHG 잔기가 L-galactose sulfate로, D-갈락토오스 잔기는 pyruvic acid acetal 4,6-O-(1-carboxyethylidene)-D-galactose로 일부 대체되어 있다. 한천의 겔 매트릭스는 일반적으로 미생물 분해에 내성이 있으므로, 식품산업 및 미생물 배양배지에서 겔화 소재로 널리 사용되고 있다. 최소 15속의 해양 세균들과 7속의 비 해양 세균들이 한천을 단량체인 D-갈락토오스 및 L-AHG로 분해하는 아가레이즈를 생산하는 것으로 보고되었다 [2-6].
아가레이즈(agarases)는 기질의 절단 방식에 따라 두 가지 유형으로 나눈다. α-아가레이즈(EC 3.2.1.158)는 α-1,3-글리코시드 결합(α-1,3-glycosidic linkage)을 절단하고, β-아가레이즈(EC 3.2.1.81)는 β-1,4-글리코시드 결합(glycosidic linkage)를 절단한다 [2,3]. 현재까지 보고된 대부분의 아가레이즈들은 한천을 액화시켜 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharides, NAOS)을 생산하는 엔도형 β-아가레이즈들이며, 아가로올리고당(agarooligosaccharides, AOS)을 생성하는 α-아가레이즈에 대한 연구보고는 많지 않은 실정이다. 탄수화물 활성 효소(Carbohydrate-Active Enzymes, CAZyme) 데이터베이스는, 세균성 아가레이즈들 간의 아미노산 서열의 유사성을 비교분석하여, 아가레이즈들을 여러 글리코사이드 가수분해효소(glycoside hydrolase, GH) 패밀리로 분류하는데, 즉 β-아가레이즈의 경우는 GH16, GH50, GH86 및 GH118 패밀리가 있으며 [7-9], α-아가레이즈에는 GH96 및 GH117 패밀리가 있다 [10,11]. GH16, GH86 및 GH118 β-아가레이즈는 아가로오스로부터 네오아가로테트로오스(NA4)/네오아가로헥소오스(NA6), 네오아가로헥소오스(NA6)/네오아가로옥타오스(NA8) 및 NA8/네오아가로데카오스(NA10)을 주로 생성한다. GH50 β-아가레이즈는 엑소형 및 엔도형의 아가로오스 분해활성을 통해 최종 생산물로 NA2, NA4 또는 NA2/NA4를 생성한다 [2,12-15]. GH96 α-아가레이즈는 주로 아가로오스에서 아가로테트로오스(A4)를 생산한다. GH117 α-네오아가로비오스 가수분해효소(α-neoagarobiose hydrolase, α-NABH)는 NA2를 가수분해하여 D-갈락토오스 및 L-AHG를 생성한다 [10,11].
최근, 한천(agar) 분해산물인 NAOS와 AOS는 항산화 [16], 항종양 [17,18], 프리바이오틱 [19], 항염증 [20], 항당뇨 및 항비만 활성 등 다양한 생물학적 활성을 가진 것으로 보고되었다 [21]. NA2 및 L-AHG는 피부보습 및 미백, 항염증 및 항우식 효과가 있음이 보고되었다 [22-24]. 이와 같은 한천 분해 산물의 생물학적 활성은 L-AHG의 존재와 관련이 있는 것으로 추정되지만, L-AHG의 생물학적 기능에 대한 직접적인 증거를 제공하는 생체내 연구는 대부분 수행되지 않은 상태로 남아있는데, 이는 L-AHG 상용화를 위한 양산의 어려움 때문이다. 최근 아가로오스를 GH50 β-아가레이즈와 GH117 α-NABH를 함께 처리하여 NA2로 분해시키고, 이어서 NA2를 D-갈락토오스 및 L-AHG로 분해시키는 방법을 통해 아가로오스로부터 L-AHG를 생산하는 효소공정이 제안되었다 [25,26]. 그러나, 성공적인 효소공정을 위해서는 아가로오스로부터 NA2를 효율적으로 생산할 수 있는 GH50 패밀리 β-아가레이즈의 개발이 절실히 필요한 실정에 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 한천 등으로부터 NA2 생산에 필요한 효율적인 엑소형 β-아가레이즈를 개발하고, 이를 이용하여 NA2를 고효율로 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈를 제공한다.
상기 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈는 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종 KY-GH-1 균주 기원인 것이 바람직하다.
상기 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈는 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈 유전자가 도입된 대장균 형질전환체로부터 수득되는 것이 바람직하다.
상기 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈 유전자는 발현 벡터(expression vector)에 클로닝(cloning)되어 대장균에 도입되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명에 기재된 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈를 기질에 처리하여 효소적 분해시키는 네오아가로비오스의 생산 방법을 제공한다.
상기 기질은 한천(agar), 아가로오스(agarose), 아가로올리고당(agaro-oliggosacchrides, AOS) 및 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosacchrides, NAOS)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 20~50℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 pH 6.0~10.0의 pH 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 Mn2+를 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 Mn2+는 MnCl2, MnSO4 또는 이들의 혼합물의 형태인 것이 바람직하다.
상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 신규한 한천 분해 세균 셀비브리오 종 KY-GH-1 유래의 글리코사이드 가수분해효소 GH50A β-아가레이즈는 난분해성인 한천, 아가로오스, 아가로올리고당 및 네오아가로올리고당 등을 기질로 하여 온도 범위와 pH 범위에 크게 제한됨이 없이 네오아가로비오스를 고효율로 생산할 수 있으므로 발효 산업, 식품 산업, 의약품 산업 등에 광범위하게 활용될 수 있는 우수한 우수한 효과가 있다.
도 1은 대장균에서 발현된 재조합 His-tag된 GH50A, GH50B 및 GH50C β-아가레이즈들의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 Lugol's 요오드 용액을 사용하여 아가로오스 플레이트에서 세포 외 아가레이즈 활성 검출의 실험 결과이다. (A) 개별 E. coli BL21 (DE3) 형질전환체를 0.075mM IPTG의 존재하는 배양액에 배양한 후, 세포를 수확하고 전체, 가용성 및 불용성 세포 부분으로 분획하였다. 각 부분의 등가량을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. (B) 재조합 His-tag된 GH50A, GH50B 또는 GH50C β-아가레이즈를 발현하는 형질전환체를 카나마이신 및 IPTG를 포함하는 LB 아가로오스 플레이트에 스폿팅하고 30℃에서 2일 동안 배양하였다. 이어서 배양 플레이트를 RT에서 Lugol's 요오드 용액으로 염색하였다. 도 1에는 대표적인 결과를 나타내었고 두 번의 추가 실험에서도 비슷한 결과가 나타났다.
도 2a는 GeneBank 데이터베이스에서 확보 가능한 9개의 GH50 패밀리 β-아가레이즈와 GH50A β-아가레이즈의 다중 아미노산 서열 정렬 결과를 나타낸다. 아미노산은 Clustal X [29]을 사용하여 최대 동일성을 위해 열린해독틀(open reading frame)을 정렬한 후 단일 문자 약어로 나타내었다. 배열된 모든 서열 상의 동일한 잔기는 배열 상단에 별표로 표시하였다. 보존적인 치환은 콜론으로 나타내었고 반보존적인 치환은 점으로 나타내었다. 또한, 가 잔기들은 Clustal X 색 구성표를 사용하여 강조하였고, 결손은 대시로 표시하였다.
도 2b는 아미노산 서열 유사성을 기반으로 구성된 계통학적 관계도를 나타낸다. 뿌리가 없는 계통수는 UPGMA31을 사용하여 구성하였다 [30]. 노드의 숫자는 부트스트랩 발생 수준이다.
도 3은 정제된 재조합 his-tagged GH50A β-아가레이즈의 SDS-PAGE를 나타낸다. 전기영동 레인; SM, size marker; Crude GH50A, GH50A β-아가레이즈를 발현하는 대장균 형질전환체로부터 얻은 가용성 분획; purified GH50A, 가용성 분획에서 정제된 재조합 GH50A.
도 4는 GH50A β-아가레이즈의 생화학적 특성을 나타낸다. (A, B) 효소활성에 미치는 온도 및 pH의 영향은 0.4% 아가로오스와 20μg/mL 정제된 GH50A β-아가레이즈를 사용하여 측정하였다. (C, D) GH50A β-아가레이즈의 온도 및 pH 안정성은 개별 pH 또는 온도에서 4시간 처리 후 조사하였다. (E) GH50A β-아가레이즈의 Km, Vmax, Kcat 및 Kcat/Km 값을 얻기 위한 Lineweaver-Burk 플롯은 표시된 농도의 효소 및 아가로오스 기질을 사용하여 조사하였다. 각 값은 평균 ± SD(n = 3, 각 개별 실험 당 3 반복으로 측정)로 표시하였다. 도 4에는 대표적인 결과를 나타내었고, 두 번의 추가 실험에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
도 5는 GH50A β-아가레이즈 활성에 대한 금속 이온, 환원제 및 킬레이트제의 효과를 보여준다. (A) β-agarse 활성에 미치는 금속 이온, SH 환원제 TCEP 및 킬레이터 EDTA의 5mM 농도에서의 개별 효과 및 (B) GH50A의 효소 활성에 미치는 MnSO4(5mM) 및 TCEP(5mM 또는 10mM)의 공동 처리 효과를 측정하기 위해, 정제된 효소(20μg/mL)를 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5), 0.4% 아가로오스와 혼합한 후 35℃에서 30분 동안 처리하였다. 이때, 여러 이온과 시약들을 처리하지 않고 측정한 효소활성을 100%로 정의하였다. 각 값은 평균 ± SD(n = 3, 각 개별 실험 당 3반복으로 측정)로 표시하였다. * P <0.05 및 ** P <0.01.
도 6은 아가로오스, NAOS 및 AOS 기질에 대한 GH50A β-아가레이즈의 시간별 처리로 얻어진 가수분해 생성물들의 TLC 분석 결과를 나타낸다. 각 기질의 가수분해를 위해, 0.4% 아가로오스 (A), 1.0% NAOS (B) 또는 1.0% AOS (C)를 35℃에서 20mM Tris-HCl(pH 7.5)에서 효소 10μg/mL와 함께 표시된 시간 동안 처리하였다. 각 반응 혼합물의 등가량을 Silica Gel 60 알루미늄 플레이트에 스폿팅한 후 n-부탄올-에탄올-H2O[3:2:2 (v/v)] 용매로 전개하였다. TLC 상의 당 물질은 0.2% (w/v) 나프토레소르시놀과 10% (v/v) H2SO4를 포함하는 에탄올 용액을 분무한 다음 80℃에서 가열하여 검출하였다. 도 6에는 대표적인 결과를 나타내었고, 두 번의 추가 실험에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
도 7은 NAOS에 대한 GH50A β-아가레이즈의 시간 별 처리로 얻어진 가수분해 생성물의 LC-MS/MS 분석 결과를 나타낸다. NAOS의 가수분해를 위해 1% NAOS를 20mM Tris-HCl(pH 7.5)에서 효소 10μg/mL와 함께 35℃에서 개별 시간 동안 처리하였다. LC-MS/MS 분석은 재료 및 방법에 설명한 대로 수행하였다.
도 8은 AOS에 대한 GH50A β-아가레이즈의 시간 별 처리로 얻어진 가수분해 생성물의 LC-MS/MS 분석 결과를 나타낸다. AOS의 가수분해를 위해 1% AOS를 20mM Tris-HCl(pH 7.5)에서 효소 10μg/mL와 함께 35℃에서 개별 시간 동안 처리하였다. LC-MS/MS 분석은 재료 및 방법에 설명한 대로 수행하였다.
도 9는 GH50A β-아가레이즈에 의한 아가로오스, NAOS 또는 AOS의 가수분해 양상을 나타낸다. GH50A β-아가레이즈는 아가로오스 혹은 NAOS의 비환원성 말단에서 NA2를 엑소형 가수분해작용을 통해 생산하는 반면, AOS의 경우는 비환원성 말단에서 A3를 방출한 후 동일한 방식으로 NA2를 생산한다.
도 10은 아가로오스의 엑소형 가수분해에 미치는 GH50A β-아가레이즈 효소 농도의 영향 및 GH50A β-아가레이즈 처리에 의한 아가로오스 가수분해물의 Bio-Gel P-2 컬럼 크로마토그래피 분획들의 TLC 분석 결과를 나타낸다. (A) 최적 조건(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 5mM MnSO4, 10mM TCEP)에서 0.4% 아가로오스를 개별 양의 효소와 함께 4시간 동안 처리하여 가수분해반응을 유도하고 생성되는 환원당을 DNS 법으로 측정하였다. 각 값은 평균 ± SD(n = 3, 독립 실험 당 3회 반복)로 얻었다. * P <0.05 및 ** P <0.01. (B) 0.4% 아가로오스를 GH50A β-아가레이즈 효소(20μg/mL)로 최적 조건에서 4시간 동안 처리한 다음 동결 건조하였다. 건조된 시료를 3차 증류수에 녹인 후 3차 증류수를 이동상으로 하는 Bio-Gel P-2 컬럼 크로마토그래피로써 분획하였다. 동일한 부피의 각 분획을 Silica Gel 60 알루미늄 플레이트에 스폿팅하고 n-부탄올-에탄올-H2O [3:2:2 (v/v)]로 전개하였다. TLC 플레이트 상의 당 물질은 도 6에서 설명한 대로 발색시켜 확인하였다. 도 10에는 대표적인 결과를 나타내었고, 두 번의 추가 실험에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
도 11은 GH50A β-아가레이즈 처리에 의한 AOS 가수 분해물의 Sephadex G-10 컬럼 크로마토그래피분획들의 TLC 분석 및 컬럼 크로마토그래피에서 얻은 NA2 및 A3의 LC-MS/MS 분석 결과를 나타낸다. (A) 1.0% AOS를 20μg/mL의 GH50A β-아가레이즈 효소로 최적 조건에서 14시간 동안 처리 한 후 동결 건조하였다. 건조된 시료를 3차 증류수에 녹인 후 3차 증류수를 이동상으로 하여 Sephadex G-10 컬럼 크로마토그래피로써 분획하였다. 동일한 부피의 각 분획을 Silica Gel 60 TLC 알루미늄 플레이트에 스폿팅한 후 n-부탄올:에탄올:H2O [3:2:2 (v/v)]로 전개시켰다. TLC 플레이트 상의 당 물질, A3 및 NA2는 그림 6에서 설명한대로 발색시켜 확인하였다. (B) 재료 및 방법에서 설명한대로 LC-MS/MS 분석으로 NA2 및 A3의 확인하였다. 도 11에는 대표적인 결과를 나타내었고, 두 번의 추가 실험에서도 유사한 결과가 얻어졌다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
최근 본 발명자들은 아가로오스를 최종산물인 L-AHG 및 D-갈락토오스로 가수분해하는 아가레이즈들을 암호화하는 유전정보를 탐색하기 위해서, 담수 한천 분해 세균인 Cellvibrio sp. KY-GH-1(기탁번호 : KCTC 13629BP) 균주의 전체 유전체의 염기서열을 분석하였다 [27]. 유전체 염기서열의 분석 결과, KY-GH-1 균주는 유전체 상에 약 77kb에 걸쳐 있는 아가레이즈 유전자 클러스터에 3개의 액소형 GH50 β-아가레이즈들(GH50A, GH50B 및 GH50C)에 대한 유전정보를 보유한 것으로 나타났다. 따라서, 아가로오스로부터 NA2를 생산하기 위한 가장 두드러진 GH50 β-아가레이즈 활성을 갖는 효소가 이들 3개의 동위효소들(isozymes) 중 어느 것인지를 구명하기 위해, 본 발명에서는 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 세 가지 GH50 β-아가레이즈들을 pET-30a 벡터와 함께 E. coli 발현 시스템을 사용하여 재조합 His-tagged 단백질로 생산한 후, 그들의 효소 활성을 비교하였다. 아울러 이들 동위효소들 중에서 아가로오스 기질의 가수분해를 통한 NA2 생성에 적합한 엑소형 β-아가레이즈 활성을 가장 높게 나타내는 GH50A β-아가레이즈(서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산서열 참조)를 선발하고, 그 효소학적 특성, 아가로오스로부터 NA2 생산을 위한 효소처리 조건 및 가수분해산물로부터 NA2 정제 조건 및 생산수율을 조사하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈(Glycoside hydrolase GH50 A β-agarase)를 제공한다.
상기 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈는 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 균주 기원인 것이 바람직하다.
상기 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈는 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈 유전자가 도입된 대장균 형질전환체로부터 수득되는 것이 바람직하다.
상기 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈 유전자는 발현 벡터(expression vector)에 클로닝(cloning)되어 대장균에 도입되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명에 기재된 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈를 기질에 처리하여 효소적 분해시키는 네오아가로비오스의 생산 방법을 제공한다.
상기 기질은 한천(agar), 아가로오스(agarose), 아가로올리고당(agaro-oliggosacchrides, AOS) 및 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosacchrides, NAOS)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 20~50℃의 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 pH 6.0~10.0의 pH 범위에서 수행되는 것이 바람직하다.
상기 처리는 Mn2+를 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기 Mn2+는 MnCl2, MnSO4 또는 이들의 혼합물의 형태인 것이 바람직하다. 상기 MnCl2, MnSO4 또는 이들의 혼합물의 농도는 1~10mM, 바람직하게는 3~8mM, 보다 바람직하게는 4~6mM, 가장 바람직하게는 5mM일 수 있다.
상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것이 바람직하다. 상기 TCEP의 농도는 1~10mM, 바람직하게는 3~8mM, 보다 바람직하게는 4~6mM, 가장 바람직하게는 5mM일 수 있다.
이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것이 아님은 명백하다.
[실시예]
1. 재료 및 방법
1.1. E. coli 발현 시스템을 이용한 GH50 β-아가레이즈 유전자의 클로닝 및 발현
Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주의 게놈 DNA에서 3개의 β-아가레이즈들 (GH50A, GH50B 및 GH50C)을 암호화하는 각 유전자 중에서, NdeI-포워드 프라이머(GH50A의 경우 5'-CCCGCATATGATGTGTTCGAGTTATAAGCTTG-3'(서열번호 3), GH50B의 경우 5'-GCGGCATATGAAAAACTCACAACATCTTAATC-3'(서열번호 4)), BamHI-포워드 프라이머(GH50C의 경우 5'-GGCGGGATCCATGAAAAAAAATCAACTACATTTA-3'(서열번호 5)) 및 XhoI-역방향 프라이머(GH50A의 경우 5'-CGGGCTCGAGTTTTTTCGCGCGGCGAGTA-3'(서열번호 6), GH50B의 경우 5'-GCGCTCGAGTTTTCCAAAACGCTTAATGTAAAGG-3'(서열번호 7), GH50C의 경우 5'-GAATCTCGAGTTGGATGGGAGGAATTTTA-3'(서열번호 8))를 사용하여 증폭하였다. GH50A 및 GH50B 유전자의 PCR 산물들은 정제 후 NdeI/XhoI으로 처리하였으며, GH50C 유전자의 PCR 산물은 정제 후 BamHI/XhoI으로 처리하였다. 또한, 제한효소로 처리된 이들 효소유전자들을 T4 ligase(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 pET-30a 발현 벡터(Novagen, Madison, WI, USA)에 연결하여 발현되는 각 효소단백질의 C-말단에 6x his-tag이 연결되도록 하였다. 각각의 재조합 pET-30a 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)(Novagen) 세포에 형질전환시킨 후 50μg/mL 카나마이신(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 함유한 LB 플레이트에 도말하고 30℃에서 배양하여 형질전환체를 선발하였다.
E. coli BL21(DE3)의 pET-30a 플라스미드에 삽입된 개별 β-아가레이즈 유전자의 발현을 위해, 각 형질전환체를 50μg/mL 카나마이신(Sigma-Aldrich)을 함유한 LB 배지에서 25℃로 진탕배양하였고, 배양액의 OD600 값이 0.5~0.6에 도달하였을 때 0.075mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG, Sigma-Aldrich)를 첨가하여 25℃에서 5시간 동안 더 배양하였다 [28].
1.2. 시퀀스 분석 및 계통수 구성
9개의 GH50 패밀리 β-아가레이즈들의 아미노산 서열은 NCBI 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) BLAST 검색에 의해 확보하였다. 개별 아가레이즈 유전자들의 오픈-리딩 프레임의 아미노산 서열은 Clustal X [29]을 사용하여 정렬하였다. 이때, 보존된 아미노산 잔기는 Clustal X 색 구성표를 사용하여 표시하였다. UPGMA를 사용하여 각 GH50 패밀리 β-아가레이즈들의 아미노산 서열 유사성을 기반으로 개별 GH50 패밀리 구성원들의 뿌리가 없는 계통수를 구성하였다 [30].
1.3. LB 아가로오스 플레이트에서 지모그람(zymogram) 분석에 의한 아가레이즈 활성 비교
pET-30a 플라스미드, 그리고 GH50A, GH50B 또는 GH50C β-아가레이즈 유전자를 포함하는 각각의 재조합 pET-30a 플라스미드를 가지고 있는 E. coli BL21(DE3) 형질전환체를 1.5% 아가로오스(Invitrogen, Life Technology, Grand Island NY, USA), 50μg/mL 카나마이신 및 0.05mM IPTG 포함하는 LB 플레이트에 스폿팅하였다. 그 후 30℃에서 2일 동안 배양한 다음, 지모그람분석을 위해 배양 플레이트를 실온 (RT)에서 Lugol's 요오드 용액으로 염색하였다.
1.4. 세포 용해물, 단백질 정량 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)
형질전환체에 의해 생성된 재조합 효소단백질을 확인하고 위치를 파악하기 위해 세포를 40mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 현탁하고 10초 동안 20번의 초음파 처리를 통해 용해를 시키고 4℃에서 30분 동안 추출한 다음, 용해물을 총 분획, 가용성 분획, 비가용성 분획으로 분별하였다 [31].
세포 용해물의 단백질 함량은 Micro BCA 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였다. 동일량의 세포용해물(10μg)을 Laemmli의 방법으로 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하였다 [32]. 겔을 Coomassie brilliant blue(CBB) R-250으로 염색하여 단백질 밴드를 검출하였다. 세포 용해물의 가용성 분획에 함유된 특정 재조합 단백질의 농도를 정량하기 위해서는, 겔 상의 재조합 단백질 밴드의 밀도를 측정하고 그 측정 단위를 동일 겔 상의 연속 희석된 소혈청알부민(BSA) 밴드의 밀도 측정 단위로 확보한 표준곡선과 비교하였다 [33]. 이때, 겔 상의 단백질 밴드의 밀도 측정은 ImageQuant TL 소프트웨어(Amersham, Arlington Heights, IL, USA)를 사용하여 수행하였다.
1.5. 재조합 His-Tag된 GH50A β-아가레이즈의 정제
재조합 His-tag된 GH50A β-아가레이즈를 정제하기 위해, GH50A 유전자를 포함하는 E. coli 형질전환체의 세포 용해물에서 가용성 분획을 Ni-NTA resin(ThermoFisher Scientific, Rockford, IL USA)을 사용하여 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 수행하였다 [34].
1.6. 아가레이즈 활성 분석
GH50 β-아가레이즈 활성에 대한 정량적 분석은 아가로오스에서 방출된 환원당을 검출하는 DNS 방법 [35]을 사용하여 수행되었다. 효소 용액(100μL)을 20mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5)에 액화된 동일한 부피의 0.8% 아가로오스와 혼합하였다. 35℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 반응 혼합물에 형성된 환원당을 DNS 시약을 사용하여 비색 측정하였다. 이때, 효소활성의 한 단위는 분당 1μmol의 D-갈락토오스(Sigma-Aldrich)에 해당하는 환원력을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.
1.7. 박층 크로마토그래피(TLC)
아가로오스, NAOS 또는 AOS의 GH50A β-아가레이즈 촉매 가수분해물에 대한 TLC 분석은 Silica Gel 60 알루미늄 플레이트(F254 Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하여 수행하였다. TLC는 n-부탄올-에탄올-H2O[3:2:2(v/v)]의 용매로 전개하였고, TLC 상의 당 물질의 확인을 위해 에탄올에 0.2%(w/v) 나프토레소시놀(Sigma-Aldrich)과 10%(v/v) H2SO4를 첨가한 발색용액을 TLC 판에 분사한 다음 80℃에서 가열하여 검출했다. D-갈락토오스와 NA2~NA18을 포함하는 NAOS 혼합물은 부산 신라대학교 이상현 박사가 제공한 혼합물 [36]을 표준으로 사용하였다. 아가로오스를 약한 산으로 가수분해하여 얻을 수 있는 AOS 혼합물을 제조하기 위해, 먼저 아가로오스를 3M 아세트산 용액에 1% 농도로 첨가한 후 3시간 동안 80℃에서 처리하였다. 이를 5M NaOH를 사용하여 pH를 대략 7.0으로 조정하고 동결건조 후, 얻어진 고체시료를 95%(v/v) 차가운 에탄올로 3회 세척하여 아세트산 나트륨 염을 제거하였고 이를 회전증발기로 건조하여 AOS 분말을 얻었다.
1.8. Bio-Gel P-2 또는 Sephadex G-10 컬럼을 사용한 분자체 크로마토그래피
NA2를 정제하기 위해, 최적의 반응조건에서 GH50A β-아가레이즈로 아가로오스를 처리한 후 NA2 함유 가수분해물을 동결건조하였고, 이를 3차 증류수(DI)에 녹인 다음 Bio-Gel P-2 컬럼(I.D. 1.3×60cm, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 크로마토그래피를 실시하였다. 컬럼은 3차 DI를 이동상으로 사용하여 용출하였고 각각 3mL로 용출된 분획들을 TLC 방법으로 분석하여 NA2 만을 함유하는 분획을 회수하였다.
한편, 네오아가로바이오즈(NA2) 및 아가로트리오즈(A3) 함유한 AOS 가수분해산물을 얻기 위해, 1% AOS 기질을 GH50A β-아가레이즈 (20μg/mL)로 4시간 동안 최적의 반응조건에서 처리한 후 동결건조하였다. 제조한 가수분해물을 3차 증류수(DI)에 녹인 후 Sephadex G-10 컬럼(ID 1.3×60cm, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden Uppsala)을 사용한 크로마토그래피로 수행하였다. 컬럼은 3차 DI를 이동상으로 사용하여 2ml씩 용출하였고, 각 용출된 분획은 TLC로 분석하여 NA2 또는 A3를 함유하는 분획을 회수하였다.
1.9. 액체 크로마토그래피와 텐덤 질량 분석기(LC-MS/MS)를 이용한 효소 반응 생성물 분석
LC-MS/MS 분석은 Acquity UPLC H-Class 코어 시스템(Waters Corporation, Milford, MA, USA)이 장착된 다중 모드 ESI 이온 소스에서 전기 분무 이온화 기능이 있는 Xevo TQ-S 마이크로 질량 분석기를 사용하여 수행하였다 [37,38]. 시료 용출은 200μL/min의 용매 유속으로 40℃로 유지시킨 Waters Acquity UPLC Spherisorb 아미노 컬럼(2mm×100mm, 입자 크기 3μm)을 사용하여 수행하였다. LC 시스템은 (A) 0.1% 포름산 수용액과 (B) 0.1% 아세토니트릴로 구성하였다. NAOS의 효소 반응 생성물에서 NA2~NA8을 확인하기 위해, 크로마토그래피는 A:B의 비율이 35:65인 이중 구배 용매 시스템으로 개시 후 5분 동안 수행하였으며, 개시 후 12분만에는 A:B의 비율이 65:35에 도달하도록 점진적으로 변경하였다. 또한, 크로마토그래피 개시 후 13분에는 A:B의 비율이 35:65에 도달하도록 변경하였으며 크로마토그래피 개시 후 20분만에 크로마토그래피를 멈출 때까지 이 비율을 유지시켰다. 이 비율을 유지하면서 크로마토그래피를 개시 후 20분만에 중지시켰다.
AOS의 효소 가수 분해물에서 NA2 및 A3를 확인하기 위한 크로마토그래피는, A:B의 비율이95:5인 이중 구배 용매 시스템으로 개시 후 3분 동안 수행하였으며, 개시 후 13분에 도달할 때 까지 A:B의 비율을 75:25로 점차적으로 변경하였고, 이러한 A:B의 75:25 비율을 개시 후 15분까지는 유지하였다. 이어서 개시 후 16분에는 A:B의 비율을 95:5이 되도록 변경하였고 이 조건을 크로마토그래피를 30분에서 종료시킬 때까지 계속 유지하였다. 주입량은 5μL이고 시료 보관 온도는 5℃로 설정하였다. 질량 분석기 검출기 조건은 다음과 같이 설정하였다: 모세관 전압, 2.0kV; 콘 전압, 20V; 소스 온도, 150℃; 탈 용매 온도, 250℃; 탈 용매 가스 흐름, 550m/h; 콘 가스 흐름, 5L/h; 및 질량 범위 100~1500.
1.10. 통계적 분석
달리 명시되지 않는 한, 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험을 통해 나타내었다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD, 각 그룹 n ≤ 3에 대해)로 표현하였다. 통계 분석은 Student's t-test를 사용하여 두 그룹과 일원 분산 분석 사이의 차이의 중요성을 평가한 다음, 세 개 이상의 그룹을 비교하기 위한 Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행하였다. P 값 <0.05는 통계적 유의성을 나타낸다. 통계분석은 SPSS Statistics 버전 23(IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 수행하였다.
2. 결과 및 논의
2.1. Cellvibrio sp. KY-GH-1의 개별 C-말단 His-Tagged 단백질로서 GH50 β-아가레이즈의 pET-30a 벡터와 E. coli 발현을 이용한 생산
Cellvibrio sp. KY-GH-1의 전체 게놈 서열 분석에 대한 이전 연구에서 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 염색체 DNA에서 3개의 GH50 β-아가레이즈 유전자(GH50A, GH50B 및 GH50C)의 존재를 확인한 바 있다 [27]. 이러한 데이터를 바탕으로 GH50A, GH50B 및 GH50C β-아가레이즈들 중 어떤 isozyme이 E. coli 발현 시스템에서 발현되는 재조합 His-tag된 효소를 사용하여 가장 두드러진 엑소형 β-아가레이즈 활성을 갖는지 조사하였다.
개별 E. coli 형질전환체를 IPTG 유도에 적용한 후, 세포를 수확하여 전체, 가용성 및 불용성 부분으로의 분획을 준비하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 각 부분의 동등한 양을 전기영동 한 후 얻어지는 재조합 GH50A, GH50B, GH50C β-아가레이즈는 주로 세포 용해성 분획에서 검출되었다. 그러나, 불용성 분획에서 검출된 개별 효소의 수준은 두드러지지 않았다(도 1의 A). GH50A, GH50B 및 GH50C에 대한 6x His-tag를 포함하는 아미노산 조성에서 계산된 분자량(MWs)은 90.3, 88.7 및 88.5kDa인 반면, 재조합 His-tag된 단백질의 MW는 Size marker를 이용한 SDS-PAGE 이동성을 이용하여 추정했을 때, 각각 약 89.0, 90.1 및 94.0kDa인 것으로 나타났다.
GH50A, GH50B, GH50C β-아가레이즈를 각각 발현하는 형질전환체를 0.05mM IPTG가 포함된 LB 아가로오스 플레이트에서 2일 동안 배양한 후, LB 아가로오스 플레이트에 Lugol's 요오드 용액을 부어 염색하였다. 이때, 콜로니 주변의 투명한 영역의 크기로서 콜로니의 아가레이즈 효소활성을 확인하였다. 그 결과, 도 1의 B에 나타난 바와 같이, 아가로오스 분해활성은 GH50A β-아가레이즈 형질전환체의 콜로니에서 가장 강력하게 나타났다. 이러한 결과는, Cellvibrio sp. KY-GH-1의 아가로오스 분해효소 공정에 관여하는 GH50 계열 효소의 개별 동위효소들 중에서 GH50A β-아가레이즈가 가장 주된 엑소형 β-아가레이즈임을 나타낸다.
2.2. GH50A β-아가레이즈의 아미노산 서열과 다른 균주 유래 관련 효소의 아미노산 서열과의 비교
GH50A β-아가레이즈의 아미노산 서열을 CLUSTALW 프로그램을 사용하여 다른 β-아가레이즈 서열과 비교 분석하였다(도 2a). Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50A β-아가레이즈는 Alteromonas sp. E-1 β-아가레이즈(GenBank 수탁번호 BAE97587.1) [39]와 97.6% 유사성을 나타내었다. 또한, Cellvibrio sp. OA-2007(GenBank 수탁번호 WP_062065002.1) [40], Cellvibrio sp. pealriver(GenBank 수탁번호 WP_049629422.1) [41], Cellvibrio sp. KY-YJ-3(GenBank 수탁번호 WP_151059417.1) 및 Cellvibrio sp. BR(GenBank 수탁번호 WP_157152532.1)의 β-아가레이즈들과는 각각 96.9%, 96.4%, 95.6% 및 91.7%의 유사성을 나타내었다. 이러한 결과는 Cellvibrio sp. GH50 β-아가레이즈들 간에는 높은 수준의 상동성이 있음을 보여준다.
또한, Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50A β-아가레이즈는 Catenovulum sp. RQJ05(GenBank 수탁번호 WP_111979256.1), Catenovulum sediminis(GenBank 수탁번호 WP_143873817.1), Catenovulum agarivorans(GenBank 수탁번호 WP_035016017.1) [42] 및 Saccharophagus degradans(GenBank 수탁번호 WP_143710996.1) [43]의 β-아가레이즈들과는 66.9%, 64.3%, 63.2%, 62.7%의 유사성을 나타내었다. 이러한 β-아가레이즈들은 NCBI GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 발견된 뉴클레오티드 서열에서 번역된 아미노산 서열에서 높은 수준의 상동성 (62.7~96.9%)을 가지고 있지만, 이들 중 어느 것도 현재까지 정제된 효소 또는 재조합 효소를 대상으로 하여 효소적 특성에 대해 조사된 바가 없는 실정이다.
개별 β-아가레이즈들의 뿌리가 없는 계통수에서는, Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50A β-아가레이즈가 해양환경에서 분리된 한천 분해세균들인 Catenovulum sp. RQJ05, Catenovulum sediminis, Catenovulum agarivorans 및 Saccharophagus degradans의 β-아가레이즈들에 비해서 비해양성 환경에서 분리된 한천 분해세균들인 Alteromonas sp. E-1, Cellvibrio sp. OA-2007, Cellvibrio sp. pealriver, Cellvibrio sp. KY-YJ-3 및 Cellvibrio sp. BR의 β-아가레이즈들과 더 밀접하게 그룹화됨을 확인하였다 (도 2b).
여러 선행연구에서, GH50 계열 β-아가레이즈들은 엑소형 또는 엑소형/엔도형 가수분해 활성을 통해 아가로오스를 절단하여 낮은 중합도(degree of polymerization, DP)를 가지는 NA2, NA4 또는 NA2/NA4를 생산하는 것으로 보고되었다 [2,12-15]. 아울러 GH50A 유전자의 동족체(homologs)가 모든 한천 분해세균들에 존재함을 보여주는 현재의 분석결과는, GH50A β-아가레이즈가 아가로오스를 NA2 혹은 NA2/NA4로 가수분해하는 효소로서, Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주의 아가로오스 분해 공정에 필수적으로 요구되는 구성 효소임을 시사한다.
2.3. GH50A β-아가레이즈의 효소적 특성
재조합 GH50A β-아가레이즈가 아가로오스로부터 NA2의 대량생산에 활용될 수 있는지를 타진하기 위해, 다양한 효소학적 특성을 조사하였다. GH50A β-아가레이즈를 발현하는 형질전환체를 OD 600nm가 0.5에 도달할 때까지 25℃에서 50μg/mL kanamycin을 함유하는 100ml LB 배지에서 진탕 배양한 다음, 0.075mM IPTG를 첨가하여 25℃에서 추가적으로 5시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 세척 한 후 40mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에서 현탁하고 10초 동안 20번 반복으로 초음파 처리하였으며, 이어서 4℃에서 30분 동안 방치한 다음, 16,000g에서 20분 동안 원심 분리하여 세포 용해물의 가용성 분획을 원심 상층액으로 확보하였다.
Ni-NTA 정제 시스템을 사용하여 가용성 세포 용해물로부터 재조합 GH50A β-아가레이즈를 정제한 후, 정제된 효소와 가용성 세포 용해물(10μg)을 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 정제된 GH50A β-아가레이즈는 8% SDS-PAGE에서 단일 밴드로 검출되었으며, MW는 사전 염색된 size maker와 비교하였을 때, ~90.3 kDa로 확인되었다. 이러한 결과는 높은 순도의 재조합 GH50A β-아가레이즈 효소가 정제과정을 통해 얻어졌음을 보여준다.
이러한 조건하에서, 가용성 분획에 함유된 GH50A β-아가레이즈 밴드의 밀도 단위를 알려진 농도의 BSA를 이용한 표준곡선과 비교하였을 때, 재조합 GH50A β-아가레이즈가 전체 가용성 단백질의 약 32%를 차지하는 것으로 확인되었다. 이는 GH50A β-아가레이즈 단백질이 E. coli 단백질 발현 시스템에서 가용성 단백질로 성공적으로 과발현됨을 나타낸다.
정제된 GH50A β-아가레이즈의 효소 활성을 다양한 온도에서 측정했을 때 35℃에서 가장 높은 활성을 보였으며 20~50℃의 온도 범위에서 최대 활성의 80% 이상이 유지되었다(도 4의 A). 또한, 효소는 6.0~10.0의 현저하게 넓은 pH 범위에서 최대 활성을 나타내었다(도 4의 B). 효소는 35℃까지 안정하였다. 그러나, 40℃에서 4시간 동안 처리한 후 최대 활성의 60% 만 유지되었으며, 50℃에서 4시간 동안 처리한 후에는 효소활성이 완전히 상실되었다(도 4의 C). 또한, GH50A β-아가레이즈는 pH 7.0~9.0 범위에서 안정적이었지만 산성 pH에서 빠르게 활성을 잃고 pH 6.0에서 4시간 처리 후에는 최대 활성의 30%만 유지하여 알칼리성 pH에서 더 안정적인 것으로 확인되었다(도 4의 D). 한편, GH50A β-아가레이즈의 Km, Vmax, Kcat 및 Kcat/Km 값은 각각 26.6mg/ml, 16.9U/mg, 25.2S-1, 및 1.2×105s-1·M-1로 나타났다 (도 4의 E).
GH50A β-아가레이즈 활성은 5mM MnCl2 또는 5mM MnSO4의 존재 하에서 1.7~1.8배까지 향상되었으며, 이는 효소활성이 Mn2+에 의존적임을 시사한다(도 5의 A). 그러나, 효소활성은 5mM EDTA의 영향을 받지 않았다. 일반적으로 Mg2+와 Na+의 존재에 의존하는 것으로 보고된 해양성 세균 유래 β-아가레이즈들 [14,44,45]과는 달리, 본 연구에서 조사한 GH50A β-아가레이즈 활성은 MgCl2 및 NaCl의 영향을 받지 않았으며, 오히려 Mn2+ 의존적으로 활성이 향상되는 것으로 나타났다. 또한, SH 환원제로 알려진 tris(2-carboxyethyl)-phosphine(TCEP) 5mM이 첨가될 경우에는 효소활성이 1.2배 향상되었다.
GH50A β-아가레이즈 효소활성에 대한 Mn2+ 및 환원제 TCEP의 향상 효과는 농도 의존적으로 나타났다. 특히, 10mM MnSO4 및 10mM TCEP는 아가레이즈 효소활성을 각각 1.8배 및 1.4배 증가시켰다(도 5의 B). 또한, 5mM MnSO4와 10mM TCEP가 동시에 첨가되는 경우, 효소활성이 2.5배까지 상승하여 GH50A β-아가레이즈 활성에 대한 Mn2+ 및 TCEP의 시너지 효과가 확인되었다. 이는 TCEP가 효소의 SH 그룹의 산화를 방지하여 효소활성을 촉진하는데 기여할 수 있음을 시사한다.
결과적으로, GH50A β-아가레이즈의 효율적인 효소활성 발휘를 위해서는 Mn2+ 이온과 SH 환원제 TCEP가 요구됨을 확인하였다.
2.4. GH50A β-아가레이즈의 기질 분해 모드
선행 연구 보고들에 따르면, GH16, GH86, GH118 β-아가레이즈들은 아가로오스를 4~10의 다양한 DP의 NAOS로 분해하는 엔도형 가수분해효소들인 반면에, GH50 β-아가레이즈들은 아가로오스를 엑소형 혹은 엔도형 활성을 통해 우세한 최종산물로서는 NA2, NA4 또는 NA2/NA4를 생산하는 가수분해효소들이다 [2,12-15].
본 연구에서 재조합 효소로 생산한 GH50A β-아가레이즈의 기질 분해 모드를 결정하기 위해, 아가로오스 또는 NA2~NA18의 NAOS 혼합물을 기질로 하여 GH50A β-아가레이즈 효소로 시간 별로 처리하여 준비된 가수분해생성물을 TLC로 분석하였다. GH50A β-아가레이즈에 의한 아가로오스 기질의 시간 별 가수분해 양상을 확인한 결과, 아가로오스의 엑소형 가수분해를 통해 효소반응 개시로 부터 NA2가 주로 생성되고 NA2의 양은 60분의 반응 기간 동안 주된 생성물로서 지속적으로 증가함을 확인하였다(도 6의 A). 또한, 주된 생성물인 NA2와 함께 NA4 및 DP가 더 높은 일부 NAOS가 훨씬 적은 양으로 생성됨을 확인하였다.
한편, NA2~NA18을 포함하는 NAOS 혼합물을 GH50A β-아가레이즈 처리하여 얻은 효소가수분해물을 TLC로 분석하였을 때, NA6 혹은 NA6보다 더 큰 DP를 갖는 NAOS가 NA2를 생성시키는 효소작용에 선호되는 기질임을 보여주었다(도 6의 B). 또한, TLC 분석 결과는 GH50A β-아가레이즈가 아가로오스를 약산성 처리로 액화시켜 얻은 여러 DPs의 AOS 혼합물도 가수분해할 수 있으며, 최종적으로는 NA2를 주생성물로, 그리고 AOS의 비환원성 말단을 처음 가수분해할 때 절단되어 생성되는 아가로트리오즈(NA3)를 부생성물로 생산함을 보여주었다(도 6의 C).
TLC 분석결과, NA4에 비해 NA6~NA8를 더 선호하는 GH50A β-아가레이즈의 기질 선호도를 확인하기 위해 지정된 시간 동안 효소로 처리된 NAOS의 가수분해 생성물을 LC-MS/MS로 분석하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, LC-MS/MS 결과는 TLC 데이터와 일치하여, NA6~NA8의 효소 촉매 가수분해가 NA4보다 먼저 발생함을 보여주었다. 이는 NA4보다 더 큰 DP를 갖는 NAOS가 GH50A β-아가레이즈에 대한 NA2 생산의 선호 기질임을 확인시켜주는 것이다. 또한, AOS의 효소 촉매 가수분해물에 대한 LC-MS/MS분석은 주요 생성물인 NA2와 소량의 부생성물 A3이 효소처리 시간에 정비례하여 생산됨을 보여주었다. 이러한 결과는 NA2를 생성하기위한 GH50A β-아가레이즈에 의한 AOS의 엑소형 분해가 AOS의 비환원 말단으로부터 A3를 절단하여 방출시킨 후에 개시된다는 것을 입증한다(도 8).
현재까지 보고된 GH50 계열 β-아가레이즈들 중에서 AOS의 비환원 말단에서 A3를 방출시키 후 엑소형으로 NA2를 생성하는 효소는 없으므로, 본 발명에서 보고하는 GH50A β-아가레이즈 이러한 반응을 촉매할 수 있는 최초의 효소라고 할 수 있다. 또한, 보고된 대부분의 GH50 β-아가레이즈들은 그들의 엑소형 가수분해 및 엔도형 가수분해작용을 통해, 아가로오스에서 NA4 또는 NA2/NA4를 생성하는 것으로 보고되었지만 [2,12-15], 엑소형 가수분해작용을 통해 아가로오스에서 직접 NA2를 생성하는 GH50 β-아가레이즈는 비교적 드문 실정이다. 이러한 맥락에서 담수 세균 Cellvibrio sp. KY-GH-1에서 유래하는 재조합 GH50A β-아가레이즈는 독특한 GH50 계열 β-아가레이즈로서 기질(아가로오스, NAOS 또는 AOS)을 엑소형으로 가수분해하여 NA2를 주요 생성물로 최종 생산할 수 있는 매우 유용한 효소로 기대된다(도 9).
본 발명의 발명자들은 담수 유래 한천 분해 세균인 Cellvibrio sp. KY-GH-1의 유전체염기서열을 분석한 선행 연구를 통해, Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주는 아가로오스를 각각 NA4/NA6 및 NA6/NA8로 엔도형 가수분해를 하는 것으로 알려진 4개의 GH16 패밀리 β-아가레이즈들 및 2개의 GH86 패밀리 β-아가레이즈를 암호화하는 유전자들을 보유하며, 또한 3개의 엑소형 가수분해를 통해 NA2를 생성하는 GH50 패밀리 β-아가레이즈들을 암호화하는 유전자들을 보유함을 밝혔다 [27]. 이러한 선행 연구결과와 현재의 연구결과는, 아가로오스를 GH50A β-아가레이즈로 단독 처리하는 것에 비해, 아가로오스를 엔도형 GH16/GH86 β-아가레이즈들과 엑소형 GH50A β-아가레이즈로 복합처리하거나 혹은 약산응 이용한 전처리와 GH50A β-아가레이즈 처리를 병용하는 방법이 아가로오스를 NA2로 가수분해시키는 공정으로서 훨씬 더 효과적일 수 있음을 시사한다.
2.5. 최적 반응 조건에서 GH50A β-아가레이즈에 의한 아가로오스 또는 AOS 처리로 생산할 수 있는 NA2의 수율
GH50A β-아가레이즈가 아가로오스로 부터 NA2 생산에 효율적인 효소인지를 좀 더 상세히 조사하기 위해, 최적의 반응 조건(5mM MnSO4, 10mM TCEP, 35℃, 20mM Tris-HCl, pH 7.5)에서 0.4% 아가로오스의 NA2 수율을 조사하였다. 최적의 반응 조건에서 4시간 동안 처리 한 후 0.4% 아가로오스로부터 환원당을 최대한 생산하는 데 필요한 GH50A β-아가레이즈의 농도는 DNS 방법을 사용하여 측정한 결과, 20μg/mL로 밝혀졌다(도 10의 A). 동일한 조건에서 12시간 동안 처리했을 때, 환원당의 최대 생산에 필요한 효소의 농도는 5μg/mL로 나타났다(데이터 생략). 0.4% 아가로오스(100mL)를 GH50A β-아가레이즈(20μg/mL)로 4시간 동안 최적 조건에서 처리한 후, 반응 생성물을 동결건조하고, 건조된 시료를 3차 증류수(6mL)에 녹였다. 시료 6mL 중 2mL을 Bio-Gel P-2 컬럼으로 분자체 크로마토그래피를 수행하였다. 이때 분자체 크로마토그래피에서 얻어진 개별 분획의 TLC 분석 결과, NA2는 주로 분획 18~19에서 순수 분리되는 것으로 확인되었다. 이는 Bio-Gel P-2 컬럼(I.D. 1.3×60cm, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 분자체 크로마토그래피를 통해 효소 반응 생성물에서 NA2를 정제할 수 있음을 보여준다(도 10의 B). 따라서, 분획 18~19를 회수하고 동결 건조로 NA2를 분말로 회수하였다. 아가로오스의 효소 가수분해물(400mg)을 3회의 분자체 크로마토그래피를 반복하여 분별했을 때, 총 216mg의 NA2가 얻어졌는데, 이는 아가로오스로부터의 NA2 수율이 ~54%임을 나타낸다.
GH50A β-아가레이즈가 AOS에서 NA2 생산을 위한 효율적인 효소인지 여부를 조사하기 위해, 최적의 반응조건(5mM MnSO4, 10mM TCEP, 35℃, 20mM Tris-HC pH 7.5)에서 AOS로 부터의 NA2 생산수율을 조사하였다. 1.0% AOS(30ml)를 20μg/ml GH50A β-아가레이즈로 최적의 반응조건에서 4시간 동안 처리한 후, 반응 생성물을 동결 건조하였다. 건조된 시료를 3차 증류수 2mL에 녹인 후 Sephadex G-10 컬럼(ID 1.3×60cm, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 분자체 크로마토그래피를 수행하였다. 분자체 크로마토그래피를 통해 얻은 각 분획의 TLC 분석 결과, A3는 분획 18~19에서, 그리고 NA2는 주로 분획 21~23에서 확인되었다(도 11의 A). 아울러 확보된 각 분획의 NA2 및 A3의 존재를 LC-MS/MS 분석으로 추가로 검정하였다(도 11의 B). 이러한 결과는, Sephadex G-10 컬럼 크로마토그래피에 의해 효소 반응 생성물로부터 NA2 및 A3가 정제될 수 있음을 보여준다. 분획 21~23의 동결 건조하여 NA2 분말(184mg)을 회수하였는데, 이는 AOS로부터 ~61%의 NA2 수율을 나타낸다.
3. 결 론
담수 한천 분해 Cellvibrio sp. KY-GH-1에서 유래한 재조합 his-tagged GH50A β-아가레이즈는 아가로오스 기질에 작용하여 주된 가수분해산물로서 NA2를 생성하였다. 효소 활성은 pH 6.0~10.0, 20~50℃에서 최대 활성의 80% 이상을 나타내었으며, MnSO4와 TCEP의 공존으로 2.5배 향상되었지만 5mM EDTA의 영향을 받지 않았다. GH50A β-아가레이즈는 DP에 관계없이 NAOS를 가수분해하여 NA2를 생성하며, NA2 생성을 위한 기질로서는 NA4보다 NA6~NA18을 더 선호하였다. 또한, GH50A β-아가레이즈에 의한 NA2의 생산을 위한 기질로서는, 아가로오스를 엔도형 β-아가레이즈로 전 처리하여 제조한 NAOS 혼합물(NA6~NA18)이 아가로오스 혹은 약산인 아세트산으로 아가로오스를 전 처리하여 제조한 AOS 혼합물에 비해 더 선호되는 GH50A β-아가레이즈의 기질로 확인되었다. GH50A β-아가레이즈의 효소학적 특성은 아가로오스를 ~54% 수율로 NA2로 전환하는 단일공정 또는 GH16/GH86/GH118과 같은 엔도형 β-아가레이즈들과의 복합처리 공정에 매우 유용할 수 있음을 보여주었다. 또한, GH50A β-아가레이즈는 GH117 패밀리 α-NABH와의 복합 처리를 통해서는, 단당류인 L-AHG 및 D-갈락토오스를 생산하는 아가로오스 바이오매스의 당화공정에 매우 유용할 것으로 기대된다. 한편, 미국 국립보건원(NIH) Genbank 데이터베이스에 수록되어 있는 GH50 패밀리 β-아가레이즈들과 아미노산 서열에서 높은 수준의 상동성(62.7~96.9%)을 보이는 9개의 β-아가레이즈들 중에서 어느 것도 현재까지 효소학적 특성에 대해 연구조사가 수행되지 않았기 때문에, 본 발명에서 보고하는 Cellvibrio sp. KY-GH-1 균주의 GH50A β-아가레이즈에 대한 결과들은 GH50A β-아가레이즈와 높은 상동성을 나타내는 기타 β-아가레이즈들에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC13629BP 20180827
<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> GH50A BETA-AGARASE DERIVED FROM A NOVEL AGAR-DEGRADING BACTERIUM AND PRODUCING METHOD OF NEOAGAROBIOSE USING THE SAME <130> YP190039 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2391 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50A beta-agarase <400> 1 atgtgttcga gttataagct tgatcggccc attactttgt ttctgaaaac cagcgtgctt 60 agtgtggctg cgctgttctt aatcgcctgt caggaagagg cggcagataa gggcgctgct 120 gtatccgaag ttaaatcaat gcctgcggat aaggtgttgt ttgattttga aggcgatcag 180 ttaccggcag aaattagttt ttttaacgct cagggaagtt tggttaaatc ctcagcgagt 240 gatacctccg catcgcaagc attaaaagta aagttcaact ctgttgatca tgaatacacc 300 tccttagtta tccagccaaa gtcagataca tggaattgga gtgatattgg cgatgctagt 360 cttgcctttg atattgccaa tgacggtgag cattccgtac agctattttt agatgtgtct 420 gatgcaaaag gtaatagctt tactcgcagc gtcagtgtgc cggtaggcaa gtcccgcgtt 480 tattattcca agttaagtgg ccacgatatg gtcagtgcaa atccggattc caaagtggag 540 ttgaatgcag cctcaggatt gcgcggcaac ccgccgacct ggtctggcga tgatgtgcag 600 ttcatctgga tgtggggcgt tatgaatttg gatttgtccg ctattaagcg catatcctta 660 agtgttcaat atgctttgca cgataaagaa atcaccctcg acaatattcg ggttattaaa 720 agccctgcaa tgaataaaga tttcctggtc aatctggtcg ataaatttgg ccagccagcc 780 aaagtggatt ttgccggtaa gattcattct gagacagagt tgcaagcagc aacccagagc 840 gagttgaaag agctaaataa cggtgcgcca ctagccgata gatctacatt tggcggttgg 900 aaaaatggtc cgaaacaacc tgcaacaggc tatttttatc ctaaaaaagt tgatggaaaa 960 tggtggttgg ttgatccaga agggtatctt tattttgcga caggattgga tatcatacgt 1020 ttagccaatg catacactat gactggctat gattacgatg cttcaactat tgagcagcgc 1080 agtgccgatg atttgactcc cgaagactcg aaaggaaaaa tccttatttc agaagaggcg 1140 caaaaaaccc gtcatttggt ttctaaaact cgcgccgaca tgtttgagtg gttgcccaag 1200 cacactgacc ctttgggtaa tcactatgat tacaatcgtg atgcccactc aggcccactg 1260 ctaaaaggcg aagcctttag tttctatagt gccaatcttg agcgtaaata cggtgaaaca 1320 gaacctgatt cctatttgcg ccaatgggaa aaagttactg tggatcgcat gttgaattgg 1380 ggtttcacct cgctaggaaa ctggactgat ccaaaattct acagcaatca acgcattcct 1440 tattttgcca atggctggat tattggcaac ttcaaaacag tttccagtgg caatgatttt 1500 tggggcggtt tgcctgatcc atttgatccg gtatttaaag agcgcgcact tgccacggcc 1560 aaggctattg ctgaagaaac taaaaatagc ccttggtgtg tcggcgtatt tattgataac 1620 gaaaaaagct gggggcgctc agaaagcaaa gagtctgaat atggcatagt gttaaataca 1680 ctgactcgcg atggcgcaga ctcgccaacg aaaaataaat ttacgcagtt gatgaaagaa 1740 aagtatgtgg atatagcagc attaaatacc gcatggggaa cctcagttga atcctgggat 1800 gcatttcaaa aaggtgtaaa aactggcatt aacaacgatg ttcaattgca agatttcagt 1860 ctgttattta cccagtatgc tgaagagtat ttcaaaattg ttgagggcgc cttaacacaa 1920 tatatgccta atcacctgta cttgggtgtg cgttttgcag attggggaat gccaaaagat 1980 gtagttaaag cagcggcaaa atacgccgat gttgttagct ataacttcta taaagaaggt 2040 ttaaccaaaa ataaatggac gtttttagcg gagctggata aacccagcat aatcggtgaa 2100 ttccatgtag gcacaacgga gtcaggtttg ttccacccag gcttggtgca tgcggccaat 2160 caggaagatc gtgcaaaaat gtataaagag tacatggaaa cggttgtcga taatccttat 2220 tttattggtg cacattggtt ccagtatatg gattcaccgg taactggccg ctcctatgat 2280 ggtgaaaact acaatgtagg ttttgtgtcg gtgactgata caccctatgc acctatggtg 2340 aaagccgcca aagagctgca cggtgaaatg tatactcgcc gcgcgaaaaa a 2391 <210> 2 <211> 797 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50A beta-agarase <400> 2 Met Cys Ser Ser Tyr Lys Leu Asp Arg Pro Ile Thr Leu Phe Leu Lys 1 5 10 15 Thr Ser Val Leu Ser Val Ala Ala Leu Phe Leu Ile Ala Cys Gln Glu 20 25 30 Glu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Ala Val Ser Glu Val Lys Ser Met Pro 35 40 45 Ala Asp Lys Val Leu Phe Asp Phe Glu Gly Asp Gln Leu Pro Ala Glu 50 55 60 Ile Ser Phe Phe Asn Ala Gln Gly Ser Leu Val Lys Ser Ser Ala Ser 65 70 75 80 Asp Thr Ser Ala Ser Gln Ala Leu Lys Val Lys Phe Asn Ser Val Asp 85 90 95 His Glu Tyr Thr Ser Leu Val Ile Gln Pro Lys Ser Asp Thr Trp Asn 100 105 110 Trp Ser Asp Ile Gly Asp Ala Ser Leu Ala Phe Asp Ile Ala Asn Asp 115 120 125 Gly Glu His Ser Val Gln Leu Phe Leu Asp Val Ser Asp Ala Lys Gly 130 135 140 Asn Ser Phe Thr Arg Ser Val Ser Val Pro Val Gly Lys Ser Arg Val 145 150 155 160 Tyr Tyr Ser Lys Leu Ser Gly His Asp Met Val Ser Ala Asn Pro Asp 165 170 175 Ser Lys Val Glu Leu Asn Ala Ala Ser Gly Leu Arg Gly Asn Pro Pro 180 185 190 Thr Trp Ser Gly Asp Asp Val Gln Phe Ile Trp Met Trp Gly Val Met 195 200 205 Asn Leu Asp Leu Ser Ala Ile Lys Arg Ile Ser Leu Ser Val Gln Tyr 210 215 220 Ala Leu His Asp Lys Glu Ile Thr Leu Asp Asn Ile Arg Val Ile Lys 225 230 235 240 Ser Pro Ala Met Asn Lys Asp Phe Leu Val Asn Leu Val Asp Lys Phe 245 250 255 Gly Gln Pro Ala Lys Val Asp Phe Ala Gly Lys Ile His Ser Glu Thr 260 265 270 Glu Leu Gln Ala Ala Thr Gln Ser Glu Leu Lys Glu Leu Asn Asn Gly 275 280 285 Ala Pro Leu Ala Asp Arg Ser Thr Phe Gly Gly Trp Lys Asn Gly Pro 290 295 300 Lys Gln Pro Ala Thr Gly Tyr Phe Tyr Pro Lys Lys Val Asp Gly Lys 305 310 315 320 Trp Trp Leu Val Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Thr Gly Leu 325 330 335 Asp Ile Ile Arg Leu Ala Asn Ala Tyr Thr Met Thr Gly Tyr Asp Tyr 340 345 350 Asp Ala Ser Thr Ile Glu Gln Arg Ser Ala Asp Asp Leu Thr Pro Glu 355 360 365 Asp Ser Lys Gly Lys Ile Leu Ile Ser Glu Glu Ala Gln Lys Thr Arg 370 375 380 His Leu Val Ser Lys Thr Arg Ala Asp Met Phe Glu Trp Leu Pro Lys 385 390 395 400 His Thr Asp Pro Leu Gly Asn His Tyr Asp Tyr Asn Arg Asp Ala His 405 410 415 Ser Gly Pro Leu Leu Lys Gly Glu Ala Phe Ser Phe Tyr Ser Ala Asn 420 425 430 Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Glu Thr Glu Pro Asp Ser Tyr Leu Arg Gln 435 440 445 Trp Glu Lys Val Thr Val Asp Arg Met Leu Asn Trp Gly Phe Thr Ser 450 455 460 Leu Gly Asn Trp Thr Asp Pro Lys Phe Tyr Ser Asn Gln Arg Ile Pro 465 470 475 480 Tyr Phe Ala Asn Gly Trp Ile Ile Gly Asn Phe Lys Thr Val Ser Ser 485 490 495 Gly Asn Asp Phe Trp Gly Gly Leu Pro Asp Pro Phe Asp Pro Val Phe 500 505 510 Lys Glu Arg Ala Leu Ala Thr Ala Lys Ala Ile Ala Glu Glu Thr Lys 515 520 525 Asn Ser Pro Trp Cys Val Gly Val Phe Ile Asp Asn Glu Lys Ser Trp 530 535 540 Gly Arg Ser Glu Ser Lys Glu Ser Glu Tyr Gly Ile Val Leu Asn Thr 545 550 555 560 Leu Thr Arg Asp Gly Ala Asp Ser Pro Thr Lys Asn Lys Phe Thr Gln 565 570 575 Leu Met Lys Glu Lys Tyr Val Asp Ile Ala Ala Leu Asn Thr Ala Trp 580 585 590 Gly Thr Ser Val Glu Ser Trp Asp Ala Phe Gln Lys Gly Val Lys Thr 595 600 605 Gly Ile Asn Asn Asp Val Gln Leu Gln Asp Phe Ser Leu Leu Phe Thr 610 615 620 Gln Tyr Ala Glu Glu Tyr Phe Lys Ile Val Glu Gly Ala Leu Thr Gln 625 630 635 640 Tyr Met Pro Asn His Leu Tyr Leu Gly Val Arg Phe Ala Asp Trp Gly 645 650 655 Met Pro Lys Asp Val Val Lys Ala Ala Ala Lys Tyr Ala Asp Val Val 660 665 670 Ser Tyr Asn Phe Tyr Lys Glu Gly Leu Thr Lys Asn Lys Trp Thr Phe 675 680 685 Leu Ala Glu Leu Asp Lys Pro Ser Ile Ile Gly Glu Phe His Val Gly 690 695 700 Thr Thr Glu Ser Gly Leu Phe His Pro Gly Leu Val His Ala Ala Asn 705 710 715 720 Gln Glu Asp Arg Ala Lys Met Tyr Lys Glu Tyr Met Glu Thr Val Val 725 730 735 Asp Asn Pro Tyr Phe Ile Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Met Asp Ser 740 745 750 Pro Val Thr Gly Arg Ser Tyr Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Val Gly Phe 755 760 765 Val Ser Val Thr Asp Thr Pro Tyr Ala Pro Met Val Lys Ala Ala Lys 770 775 780 Glu Leu His Gly Glu Met Tyr Thr Arg Arg Ala Lys Lys 785 790 795 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50A beta-agarase Nde1 forward primer <400> 3 cccgcatatg atgtgttcga gttataagct tg 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50B beta-agarase Nde1 forward primer <400> 4 gcggcatatg aaaaactcac aacatcttaa tc 32 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50C beta-agarase BamH1 forward primer <400> 5 ggcgggatcc atgaaaaaaa atcaactaca ttta 34 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50A beta-agarase Xho1 reverse primer <400> 6 cgggctcgag ttttttcgcg cggcgagta 29 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50B beta-agarase Xho1 reverse primer <400> 7 gcgctcgagt tttccaaaac gcttaatgta aagg 34 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cellvibrio sp. KY-GH-1 GH50C beta-agarase Xho1 reverse primer <400> 8 gaatctcgag ttggatggga ggaatttta 29

Claims (11)

  1. 서열번호 1을 포함하는 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈(Glycoside hydrolase GH50 A β-agarase).
  2. 제 1항에 있어서, 기탁번호 KCTC 13629BP인 셀비브리오 종(Cellvibrio sp.) KY-GH-1 균주 기원인 것을 특징으로 하는 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈(Glycoside hydrolase GH50 A β-agarase).
  3. 제 2항에 있어서, 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈 유전자가 도입된 대장균 형질전환체로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈(Glycoside hydrolase GH50 A β-agarase).
  4. 제 3항에 있어서, 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈 유전자는 발현 벡터(expression vector)에 클로닝(cloning)되어 대장균에 도입되는 것을 특징으로 하는 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈(Glycoside hydrolase GH50 A β-agarase).
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 글리코사이드 가수분해효소 지에이치50 에이 β-아가레이즈(Glycoside hydrolase GH50 A β-agarase)를 기질에 처리하여 효소적 분해시키는 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 기질은 한천(agar), 아가로오스(agarose), 아가로올리고당(agaro-oliggosacchrides, AOS) 및 네오아가로올리고당(neoagaro-oligosacchrides, NAOS)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 처리는 20~50℃의 온도 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 처리는 pH 6.0~10.0의 pH 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 처리는 Mn2+를 더 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 Mn2+는 MnCl2, MnSO4 또는 이들의 혼합물의 형태인 것을 특징으로 하는 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 처리는 트리스(2-카복시에틸)-포스핀(Tris(2-carboxyethyl)-phosphine, TCEP)을 더 첨가하여 수행되는 것을 특징으로 하는 네오아가로비오스(neoagarobiose, NA2)의 생산 방법.
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