JP4629439B2 - キモトリプシン活性を有する微生物トリプシン変異体及びそれをコードする核酸 - Google Patents
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Description
本発明は、キモトリプシン様活性を有する変異体、その変異体をコードする核酸、その変異体の生成方法、及び前記変異体の使用方法に関する。
タンパク質分解酵素は、広範な商業的適用を有し、そして異なった産業、例えば洗剤、革、化学、農業、医薬、食品及び酪農産業において都合よく実施されて来た。キモトリプシン及びトリプシンは、哺乳類源から入手できる2種のそのようなタンパク質分解酵素である。キモトリプシンは、トリプシン、フェニルアラニン及びトリプトファンのL−異性体のペプチド結合のC−末端側で選択的に分解する。トリプシンは、リシン及びアルギニンのL−異性体のペプチド結合のC−末端側で選択的に分解する。哺乳類トリプシン及びキモトリプシンは、分泌を指図するアミノ末端シグナルペプチド、及びプロペプチドが酵素の同時活性を伴ってタンパク質分解除去されるまで、酵素活性を隠れた状態にするプロペプチドの両者を有する、それぞれトリプシノーゲン及びキモトリプシノーゲンとして知られている前駆体として合成される。プロペプチドの分解は、高い特異的セリンエンドプロテアーゼ活性を必要とする。
キモトリプシンは哺乳類源から入手でき、そしてキモトリプシン酵素は少数の微生物源から入手できるが、新規酵素工程を確立するために他の源を供給し、そして改良された費用及び性能を提供するためにキモトリプシン様酵素の新規源についての必要性が当業界において存在する。
本発明は、
(a)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置144,193, 198, 201,218, 223,227, 228,229, 230, 及び 231に対応する1又は複数の位置での置換;
(b)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置192、197及び226に対応する1又は複数の位置での欠失、及び
(c)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置224及び225に対応する位置間への挿入、
から成る群から選択された1又は複数の修飾を含んで成る、キモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体に関し、
ここで前記微生物トリプシンが、(a)配列番号2のアミノ酸25〜248に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は(b)配列番号1のヌクレオチド202〜801と、少なくとも低い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は相補鎖であり、前記変異体がキモトリプシン様活性を有し、そして前記微生物トリプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
(a)(1)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置144,193, 198, 201,218, 223,227, 228,229, 230, 及び 231に対応する1又は複数の位置での置換;
(2)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置192、197及び226に対応する1又は複数の位置での欠失、及び
(3)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置224及び225に対応する位置間への挿入、
から成る群から選択された1又は複数の修飾を導入し、
ここで前記微生物トリプシンが、(a)配列番号2のアミノ酸25〜248に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は(b)配列番号1のヌクレオチド202〜801と、少なくとも低い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は相補鎖であり、前記変異体が微生物トリプシン活性を有し、そして前記微生物トリプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有し;そして
(b)キモトリプシン様活性を有する変異体を回収することを含んで成る。
本発明はさらに、キモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体の洗剤への使用に関する。
本発明は、(a)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置144,193, 198, 201,218, 223,227, 228,229, 230, 及び 231に対応する1又は複数の位置での置換;(b)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置192、197及び226に対応する1又は複数の位置での欠失、及び(c)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置224及び225に対応する位置間への挿入から成る群から選択された1又は複数の修飾を含んで成る、キモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体に関し、ここで前記微生物トリプシンが、(a)配列番号2のアミノ酸25〜248に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、及びさらに最も好ましくは少なくとも97%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;又は(b)配列番号1のヌクレオチド202〜801と、少なくとも低い緊縮条件下、好ましく中位の緊縮条件下、より好ましくは中位に高い緊縮条件下、さらにより好ましくは高い緊縮条件下、及び最も好ましくは非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、又は相補鎖であり、前記変異体がキモトリプシン様活性を有し、そして前記微生物トリプシンのアミノ酸配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%、及びさらに最も好ましくは少なくとも約97%の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
用語“変異体”とは、1又は複数の修飾又は変更、例えば微生物のトリプシンにおける1又は複数の特定の位置で1又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失及び/又は切断を含んで成る、キモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体として本明細書において定義される。
用語“キモトリプシン”とは、Tyr、Trp、Phe又はLeuのC末端側での選択的分解を伴ってカルボン酸アミドの加水分解を触媒するエンドペプチダーゼとして本明細書において定義される(E.C.3.4.21.1)。本発明のためには、キモトリプシン活性は、100mMのMOPS緩衝液、4mMのCaCl2、0.01%Triton X-100(pH7.5)1ml当たり2mgのN−ベンゾイル−L−アルギニンp−ニトロアニリド塩酸塩と共に25℃で基質としてN−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe p−ニトロアニリドを用いて決定される。アッセイは405nmでモニターされる。1単位のキモトリプシン活性とは、25℃、pH7.5で、1分当たり加水分解される1.0μモルのN−スクシニル−Ala−Ala−Pro−Phe p−ニトロアニリドとして定義される。
用語“キモトリプシン様”とは、キモトリプシンの活性に類似する活性、すなわちTyr、Trp、Phe又はLeuのC−末端側でのペプチド結合分解活性を有する酵素として定義される。
用語、配列番号2のアミノ酸25〜248の“位置に対応する位置”、又はその種々の用語法は、配列番号2のアミノ酸25〜248に対応する、微生物トリプシンの類似する位置として本明細書において定義される。
本発明においては、変異体におけるアミノ酸残基位置の特定の番号付けが使用される。例えば、既知の微生物トリプシンのアミノ酸配列を、一列整列することにより、いずれかの微生物トリプシンにおけるいずれかのアミノ酸残基に対するいずれかのアミノ酸位置番号を表すことが可能である。同じことが、キモトリプシン及びキモトリプシン様酵素に適用される。
他の微生物トリプシンのアミノ酸配列と一列整列される、配列番号2で開示される微生物トリプシンのアミノ酸配列に起因する番号づけシステムを用いて、構造的相同性の領域における微生物トリプシンにおけるアミノ酸残基の位置を示すことが可能である。
そのような場合、挿入されるアミノ酸残基は、挿入されるアミノ酸残基の後のアミノ酸残基の位置番号への下付文字の追加により番号付けされる。上記例においては、次の通りである:
アミノ酸配列セグメントが親ポリペプチド及び/又は変異体において反復される場合、同等の縮重表示が、また挿入以外の変更、例えば欠失/又は置換が列挙される場合に生じる事は当業者に明らかであろう。例えば、配列“AGAG”における位置194-97からの2種の連続したアミノ酸“AG”の欠失は、"A194*+G195*"又は"A196*+G197*"として記載される:
"Tyr167Gly+Arg170Gly","Tyr167Gly+Arg170Ala","Tyr167Gly+Arg170Ser", "Tyr167Gly+Arg170Thr","Tyr167Ala+Arg170Gly","Tyr167Ala+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Ser","Tyr167Ala+Arg170Thr","Tyr167Ser+Arg170Gly", "Tyr167Ser+Arg170Ala","Tyr167Ser+Arg170Ser","Tyr167Ser+Arg170Thr", "Tyr167Thr+Arg170Gly","Tyr167Thr+Arg170Ala","Tyr167Thr+Arg170Ser",及び"Tyr167Thr+Arg170Thr"。
本発明においては、微生物トリプシン又はトリプシノーゲン、及びそのヌクレオチドは、いずれかの属の微生物から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関して本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列によりコードされる微生物トリプシン又はトリプシノーゲンが、前記源により、又は前記源からのヌクレオチド配列が挿入されている細胞により生成されることを意味するであろう。
本発明においては、微生物トリプシンからのキモトリプシン様活性を有する変異体の構成は、触媒活性を担当するキモトリプシンのアミノ酸に対応する微生物トリプシンにおけるアミノ酸の位置を同定し、そして特定部位の突然変異誘発、又は当業界において知られているいずれか他の方法により、キモトリプシンの同じ及び/又は類似するアミノ酸に対応するよう、微生物トリプシンにおけるアミノ酸を置換し、欠失し、そして/又は挿入することにより達成され得る。用語、“触媒活性を担当するキモトリプシンのアミノ酸”とは、酵素触媒に関与するアミノ酸のみならず、また結合ポケットの結合部位及び表面ループのアミノ酸も包含することが理解されるであろう。
いずれかのキモトリプシン又はその前駆体が、アミノ酸配列の比較のために、本発明において使用され得る。キモトリプシンは、それらのDNA及びアミノ酸配列が相同である、保存された酵素のグループである。好ましくは、キモトリプシンは、そのアミノ酸配列が微生物トリプシンのアミノ酸配列とほぼ同一であるので、比較目的のために選択され得る。
本発明においては、キモトリプシン活性を有する微生物トリプシン変異性は、(a)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置144,193, 198, 201,218, 223,227, 228,229, 230, 及び 231に対応する1又は複数の位置での置換;(b)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置192、197及び226に対応する1又は複数の位置での欠失、及び(c)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置224及び225に対応する位置間への挿入から成る群から選択された1又は複数の修飾を含んで成り、ここでキモトリプシン様活性を有する変異体は、親微生物トリプシンに対して、少なくとも約70%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、最も好ましく少なくとも約95%及びさらに最も好ましくは少なくとも約97%の配列番号2のアミノ酸25〜248(すなわち、成熟ポリペプチド)に対する程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
本明細書において定義される場合、キモトリプシン様活性を有する“単利された”トリプシン変異体は、SDS−PAGEにより決定される場合、少なくとも約20%の純度、好ましくは少なくとも約40%の純度、より好ましくは約60%の純度、さらにより好ましくは約80%の純度、最も好ましくは約90%の純度、及びさらに最も好ましくは約95%の純度であるポリペプチドである。
もう1つの好ましい態様においては、前記変異体は、配列番号2のアミノ酸25〜248のV144T + S193A + D198S + Q201M + A218I + N223S + R227S + P228T + N229S + Y230T + S231Pから成る群から選択された1又は複数の置換を含んで成る。
もう1つのより好ましい態様においては、前記変異体、置換V144T + S193A + D198S + Q201M + A218I + N223S + R227S + P228T + N229S + Y230T + S231P、及び配列番号2のアミノ酸25〜248の欠失V192* + K197* + A226*を含んで成る。
もう1つのより好ましい態様においては、前記変異体は、置換V144T + S193A + D198S + Q201M + A218I + N223S + R227S + P228T + N229S + Y230T + S231P、欠失V192* + K197* + A226*、及び配列番号4のアミノ酸25〜248の挿入G224GTを含んでなる。
もう1つの最も好ましい態様においは、上記変異体は、その変異体のアミノ末端と翻訳読み取り枠に整合して結合される、プレブロ領域、又は、その一部として配列番号2のアミノ酸1〜24を含んで成る前駆体の形で存在する。
もう1つの最も好ましい態様においては、変異体は、キモトリプシン様活性を有する、配列番号4のアミノ酸25〜246、又はそのフラグメントを含んで成る。
本発明はまた、微生物トリプシンから得られたキモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体をコードする単離されたヌクレオチドに関し、ここで前記変異体は、
(1)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置144,193, 198, 201,218, 223,227, 228,229, 230, 及び 231に対応する1又は複数の位置での置換;
(2)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置192、197及び226に対応する1又は複数の位置での欠失、及び
(3)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置224及び225に対応する位置間への挿入、
から成る群から選択された1又は複数の修飾を含んで成り、
配列番号4のアミノ酸25〜246のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ及び/又はカルボキシル末端から欠失された1又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。好ましくは、フラグメントは、少なくとも165個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも175個のアミノ酸残基、及び最も好ましくは少なくとも185個のアミノ酸残基を含む。
もう1つの好ましい態様においては、単離されたヌクレオチド配列は、配列番号2のアミノ酸25〜248の置換V144T + S193A + D198S + Q201M + A218I + N223S + R227S + P228T + N229S + Y230T + S231Pを含んで成る変異体をコードする。
もう1つのさらに好ましい態様においては、単離されたヌクレオチドは、置換V144T + S193A + D198S + Q201M + A218I + N223S + R227S + P228T + N229S + Y230T + S231P、及び配列番号2のアミノ酸配列25〜248の欠失V192* + K197* + A226*を含んで成る変異体をコードする。
もう1つのより好ましい態様においては、単離されたヌクレオチド配列は、置換V144T + S193A + D198S + Q201M + A218I + N223S + R227S + P228T + N229S + Y230T + S231P、欠失V192* + K197* + 及び A226*、及び配列番号2のアミノ酸25〜248の挿入G224GTを含んで成る変異体をコードする。
用語“単離されたヌクレオチド配列”とは、本明細書において使用される場合、他のヌクレオチドを実質的に有さない、例えばアガロース電気泳動により決定される場合、少なくとも約20%純度、好ましくは少なくとも約40%純度、より好ましくは少なくとも約60%純度、さらにより好ましくは少なくとも約80%の純度、及び最も好ましくは少なくとも約90%の純度であるヌクレオチド配列を言及する。
本発明はまた、制御配列と適合できる条件下で、適切な宿主細胞においてコード配列の発現を方向づける1又は複数の制御配列に作用可能に連結される本発明のキモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体をコードするヌクレオチド配列にも関する。発現は、ポリペプチドの生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾及び分泌(但し、それらだけには限定されない)を、包含することが理解される方法。
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギキラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセル・セレビシアエインバーターゼについての遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanos など., 1992, 前記により記載される。
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
好ましい態様においては、プレプロコード領域は、配列番号2のアミノ酸1〜24をコードする配列番号1のヌクレオチド58〜129である。
本発明はまた、本発明のキモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体をコードするヌクレオチド配列、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々のヌクレオチド及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位で変異体をコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明のヌクレオチド配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている(例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと)。
本発明はまた、変異体の組換え生成において都合良く使用される、キモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体をコードするヌクレオチド配列を含んで成る組換え宿主にも関する。本発明のヌクレオチド配列を含んでなるベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
宿主細胞は、真核生物、たとえば哺乳類、昆虫、植物、又は菌類細胞であり得る。
本発明はまた、
(a)(1)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置144,193, 198, 201,218, 223,227, 228,229, 230, 及び 231に対応する1又は複数の位置での置換;
(2)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置192、197及び226に対応する1又は複数の位置での欠失、及び
(3)配列番号2のアミノ酸25〜248の位置224及び225に対応する位置間への挿入から成る群から選択された1又は複数の修飾を含んで成るヌクレオチオド配列を含んで成る宿主細胞を、前記変異体の発現のために適切な条件下で培養し;そして
(b)前記培養培地から前記変異体を回収すること含んで成るキモトリプシン様活性を有する変異体の生成方法に関する。
キモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体は、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。それらの検出方法は、特定の抗体、酵素生成物の形成、又は酵素基質の消出の使用を包含する。例えば、基質としてN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phep−ニトロアニリドを用いての酵素アッセイは、本明細書に記載されるような変異体のキモトリプシン様活性を決定するために使用され得る。
本発明のキモトリプシン様活性を有する微生物トリプシン変異体は、多くの産業、例えば洗剤、革、化学、農業、医薬、食品、及び酪農産業に使用され得る。例えば、ポリペプチドは、例えばアメリカ特許第5,288,627号、第5,693,520及び第5,948,746号に記載されるように、洗剤組成物の成分として使用され得る。ポリペプチドはまた、例えばOwen R. Fennema, ed. , in Food Chemistry, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985に記載されるように、食品産業において、多く使用され得る。ポリペプチドはまた、革産業においてなめし酵素としても使用され得る。ポリペプチドはさらに、例えばアメリカ特許第5,948,746号に記載されるように、チーズ製造において使用され得る。
本発明の変異体は、洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり(すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのpH−最適適合性)、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM及びKannaseTM (Novo Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM及びFN3TM (Genencor International Inc.) を包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、LipolaseTM 及びLipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
有用なアミラーゼの例は、WO94/02597号、WO94/18314号、WO96/23873号及びWO/43424号に記載される変異体、特に1又は複数の次の位置での置換を有する変異体である:15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408及び444。
市販のアミラーゼは、DuramylTM, TermamaylTM, FungamylTM 及びBAMTM (Novo Nordisk A/S), RapidaseTM 及びPurastarTM (Genencor International Inc.)である。
市販のセルラーゼは、CelluzymeTM 及びCarezymeTM (Novo Nordisk A/S), ClazinaseTM 及びPuradex HATM (Genencor International Inc.) 及びKAC−500 (B)TM (Kao Corporation) を包含する。
市販のペルオキシダーゼは、GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る1又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量%のレベルで存在する。そこに含まれる場合、洗剤は通常、約1%〜約40%のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート(脂肪酸スルフェート)、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。
洗剤は、1又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピリジン−N−オキシド)、ポリ(ビニルイミダゾール)、ポリカルボキシレート(例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーを含んで成る。
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば4−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体1L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体1L当たり0.05−5mgの酵素タンパク質、特に洗浄液体1L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
本発明の酵素はさらに、WO97/07202号(引例として本明細書組み込まれる)に開示される洗剤配合物に導入され得る。
本発明は、次の例によりさらに詳細に記載されるが、それらは本発明を制限するものではない。
緩衝液及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬品種の市販の製品である。N−スクシニル−Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド、N−スクシニル−Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド、N−α−ベンゾイル−DL−アルギニン−p−ニトロアニリド及びβ−ラクトグロブリンAは、Sigma Chemicals (St. Louis, Missouri) から得られた。すべてのプライマーは、MWG, High Point, NCにより合成された。
VNO3KLMTは、1Lあたり、20mlの50X Vogels-24mMのNaNO3, 273.33gのスクロース、及び15gのLMTアガロースから構成される。
50×Vogelsは、1L当たり、125gのクエン酸ナトリウム、250gのKH2PO4, 106.25gのNaNO3, 10gのMgSO4・7H2O, 5gのCaCl2・2H2O, 2.5mlのビオチン原液(100mlの50%エタノール中、5mgのビオチン)、及び5.0mlのVogels微量金属溶液から構成された。
RA胞子形質培地は、1L当たり、50gの琥珀酸、12.1gのNaNO3, 1gのグルコース、20mlの50×Vogels及び0.5mlの10mg/mlのNaMoO4原液(pH6.0)から構成された。
YEPG培地は、1L当たり、10gの酵母抽出、20gのペプトン及び20gのグルコーズから構成された。
SPTCは、40%のPEG4000、0.8Mのソルビトール、25mMのトリス(pH8)、25mMのCaCl2から構成された。
M400Da培地は、1L当たり、50gのマルトデキストリン、2gのMgSO4・7H2O, 2gのKH2PO4, 4gのクエン酸、8gの酵母抽出物、2gのウレア及び1mlのCOVE微量金属溶液から構成された。
AMG微量金属溶液は、1L当たり、14.3gのZnSO4・7H2O, 2.5gのCuSO4・5H2O, 0.5gのNiCl2, 13.8gのFeSO4, 8.5gのMnSO4及び3.0gのクエン酸から構成された。
フサリウム・オキシスポラムトリプシノーゲン様遺伝子のDNA配列(配列番号1)及びその推定されるアミノ酸配列(配列番号2)を、図1に示す。
Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Los Angeles, CA)を、その製造業者の説明書に従って使用し、バリンからトレオニンへのコドン144での単一アミノ酸変化を創造した。次のプライマーを用いて、バリンからトレオニンへの変化を生成し、ここで突然変異は太字で存在する:
上方991056:GGATCTTCTGCCACTACTGCTGGCTGGTAAGTCG(配列番号5);
下方991057:CGACTTACCAGCCAGCAGTAGTGGCAGAAGATCC(配列番号6)。
上方991058:GACACCTATGCTTAATTAATACCTTGTTGGAAGCGTCGAGATG(配列番号7);
下方991958:CATCTCGACGCTTCCAACAAGGTATTAATTAAGCATAGGTGTC(配列番号8)。
プライマー991051 (上方) : AGCGGCGGCCCCATCGTCGACAGCTCCAACACTCTTATCGGTATCGTCTCTTGGGGTTCT GGAACTTGTTCTAC (配列番号10);
プライマー991052 (上方) : TTCTACTCCTGGTGTCTATGCCAGCGTTGGTGCTCTCCGCTCTTTCATTGACACCTATGCT TAA (配列番号11);
プライマー991053 (上方) :TTAAGCATAGGTGTCAATGAAAGAGCGGAGAGCACCAACGCTGGCATAGACACCAGGAGT AGAAGTAGAACAAGTTCCAGA (配列番号12);
プライマー991054 (下方) : ACCCCAAGAGACGATACCGATAAGAGTGTTGGAGCTGTCGACGATGGGGCCGCCGCTGT CACCCATGCAAGAAG (配列番号13);
プライマー991055 (下方) : AGCCACCGGAAGCACCAGCACAGAACATCTGGTTGGTGATGGCGGAGGTGCCGTAT (配列番号14)。
プライマー991063(上方):CCCGAGCTCAGTACGGCACCTCCG(配列番号15);
プライマー991064(下方);CCCTTAATTAAGCATAGGTGTC(配列番号16)。
正しい配列を含む、TOPO TA−生成されたクローン(例1)を、SacI及びPacIにより消化し、そして得られる200塩基対のフラグメントを、Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて精製した。プラスミドpMUT2を、SpeI及びPacIにより消化し、そして得られる5823塩基対のフラグメントを、Qiaquick Gel Extraction Kit. Plasmid pMUT2を用いて精製した。プラスミドpMUT2を、SpcIにより消化し、そして得られる2673個の塩基対のフラグメントを、Qiaquick Gel Extraction Kitを用いて精製した。
991070: TATCTCAGATGTCAGAGAACG (配列番号18);
991069: ATGGTCAAGTTCGCTTCCGTC (配列番号19);
991071: GCTCTGACCCTGTCGCTGGAT (配列番号20);
991074: CTGCCAACATAGATAATGAGG (配列番号21);
991073: GTTGGATCTTAGTCCTGGTTG (配列番号22);
990904: ATCCAAGACTCAAGCTAGAGA (配列番号23)。
フサリウム・ベネナタム(Δtri5, Δdps1)を、WO00/42203号に記載のようにして得た。フサリウム・ベネナタム(Δtri5, Δdps1)の胞子を、2.5%のグルコース及び2.5mMの硝酸ナトリウムにより補充された1×Vogels培地プレート(2.5%のNoble寒天)からの10個のプラグにより500mlのRA胞子形成培地を含むフラスコを接種し、そして28℃、150rpmで2〜3日間インキュベートすることによって生成した。胞子をMIRACLOTHTM (Calbiochem, San Diego, CA)を通して収穫し、そしてSorvall RC-5B遠心分離機(E.I. Dupont De Nemours and Co., Wilmington, DE)により7000rpmで20分間、遠心分離した。ペレット化された胞子を、無菌蒸留水により2度洗浄し、少量の水に再懸濁し、そして次に、血球計数器を用いて計数した。
フサリウム・ベネナタム形質転換#29の100ml振盪フラスコを、M400倍地において5日間、培養し、そして収穫し、精製のためのタンパク質を得た。ブイヨンをMIRACLOTHTMを通して濾過し、そして−20℃で貯蔵した。融解されたブイヨンを、10,000×gでの20分間の遠心分離により透明にし、そして上清液画分を、3体積の脱イオン水により希釈した。タンパク質溶液を、YM-3膜(Millipore, Bedford, MA)を用いて、限外濾過により濃縮した。
N-スクシニル−Ala-Ala-Pro-X p-ニトロアニリド基質(ここでXはPhe, Leu, Val, Met Ala, Glu, 又は Lysである)を、DMSO(100mg/mlの濃度で)に溶解し、そしてさらに、100mMのMOPS緩衝液、4mMのCaCl2、0.01%のTriton X-100 (pH7.5)(アッセイ緩衝液)により1:50に希釈し、2mg/mlの溶液にした。10μlの希釈された酵素ブイヨン(典型的には、1:10)を、90μlのアッセイ緩衝液及び100μlのN-スクシニル−Ala-Ala-Pro-X p-ニトロアニリド基質に添加し、1.6mM(1.0mg/ml)の最終濃度にした。加水分解速度を、405nm及び30℃で3分間、運動学的に測定した。キモトリプシン様活性を有するポリペプチドに構築されたフサリウム・オキシスポラムトリプシン様酵素を、ウシキモトリプシン(Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO)及びスブチリシンAに比較した。
例6.キモトリプシン様活性を有するポリペプチドに構築されるフサリウム・オキシスポラムトリプシン様酵素のタンパク質配列決定
精製されたフサリウム・キモトリプシン様酵素のN−末端アミノ酸配列決定を、オンラインHPLC及び液相トリフルオロ酢酸(TFA)供給を備えた、Applied Biosystems 476A Protein Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA)上で行った。精製されたキモトリプシンを、BlobrenoTMを備えた、TFA処理されたマイクロフィルター上にスポットし、そして液相を用いて、N−末端配列決定した。フェニルチオヒダントイン−アミノ酸の検出を、酢酸、酢酸ナトリウム及びナトリウムヘキサンスルホネートを含むPremix濃縮物(Applied Biosystems, Foster City, CA)18mlと共に、水中、3.5%のテトラヒドロフランを含む緩衝液A、及びアセトニトリルを含む緩衝液Bを用いて、オンラインHPLCにより達成した。データを集め、そしてApplied Biosystems 610 Data Analysisソフトウェアを用いて、Micintosh IIsiにより分析した。配列決定を、光源に対してクロマトグラムを可視化することにより行った。
例4に記載される、精製されたキモトリプシン様酵素を、その温度安定性、pH最適性及び理論的係数について特徴づけられた。
100mMのMOPS, 4mMのCaCl2, 0.01%のTriton X-100緩衝液(pH7.5)中、50μlの精製された酵素を、種々の温度(25, 30, 37, 42, 50, 55, 60, 65及び70℃)で60分間インキュベートした。反応を、氷上に置くことにより停止した。個々の温度での20μlのサンプルを、例3に記載のようにして、基質としてN-スクシニル−Ala-Ala-Pro-Pheを用いて、残留活性についてアッセイした。その結果は、キモトリプシン様活性が有意に50℃以上、低下したことを示した(図7)。
次の生物学的材料を、Agriculture Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL),1815 University Street, Peoria, Illinois に、ブタペスト条件に基づいて寄託し、そして次の受託番号を付与された:
寄託物:E. coli pEJG66.2 XL 10GOLD
受託番号:NRRL B-30627
寄託日:2002年9月6日
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
Claims (9)
- 配列番号:4に示される25位のIleから246位のAlaまでのアミノ酸配列から成るトリプシン変異体。
- 親トリプシンの変異体であって、当該親トリプシンが、配列番号:2に示される25位のIleから246位のAlaまでのアミノ酸配列から成り、そして前記変異体が、キモトリプシン様活性を有しそして配列番号:2に示される25位のIleから248位のAlaまでのアミノ酸配列において、置換V144T+S193A+D198S+Q201M+A218I+N223S+R227S+P228T+N229S+Y230T+S231P;欠失V192*+K197*+A226*;及び挿入G224GTを含んで成る、ことを特徴とするトリプシン変異体。
- 親トリプシンの変異体であって、当該親トリプシンが、
(a)配列番号:2に示される25位のIleから248位のAlaまでのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し且つトリプシン活性を有するアミノ酸配列、又は
(b)配列番号:1のヌクレオチド202〜801の相補鎖に高緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされ且つトリプシン活性を有するアミノ酸配列、
から成り;そして
前記変異体が、キモトリプシン様活性を有しそして配列番号:2に示される25位のIleから246位のAlaまでのアミノ酸配列において、置換V144T+S193A+D198S+Q201M+A218I+N223S+R227S+P228T+N229S+Y230T+S231P;欠失V192*+K197*+A226*;及び挿入G224GTを含んで成る、
ことを特徴とするトリプシン変異体。 - E. コリNRRL B-30627に含まれるpEJG66.2 XL 10GOLDに含まれるヌクレオチド配列によりコードされる請求項1記載のトリプシン変異体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のトリプシン変異体をコードする単離された核酸。
- 請求項5記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターを含んで成る宿主細胞。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のトリプシン変異体の製造方法において、請求項7に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のトリプシン変異体及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
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