JP3511005B2 - 無毒、非毒素原性、非病原性の発現系、並びにその中で利用するためのプロモーター及びターミネーター - Google Patents

無毒、非毒素原性、非病原性の発現系、並びにその中で利用するためのプロモーター及びターミネーター

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】１．発明の分野 本発明は組換タンパク質の製造において有用な宿主細胞
に関する。特に、本発明は高レベルでの組換タンパク
質、特に酵素の発現において利用できうる無毒、非毒素
原性及び非病原性のフサリウム（Fusarium) の菌類宿主
細胞に関する。
【０００２】２．発明の背景 異種タンパク質の発現における組換宿主細胞の利用は近
年大量の商業的に有用なタンパク質の製造を簡略化し
た。その利用がなければ、それらのタンパク質はその天
然起源からの精製によってのみ得られる。現在、任意の
所定のタンパク質の製造のために選択される原核系及び
真核系宿主を含む発現系の様々な選別がある。適当な発
現系の選別は往々にして、活性状態のタンパク質の適正
な収量をもたらす宿主細胞の能力に依存するのみなら
ず、タンパク質の意図される最終用途によってもかなり
支配されうる。
【０００３】哺乳動物及び酵母の細胞が最も一般的に利
用されている真核系宿主であるが、組換タンパク質の製
造のための宿主細胞として糸状菌類が非常に有用である
ことが認識され始めている。現在かかるプロセスに利用
されている又は利用が提案されている糸状菌類の例はニ
ューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa)、アクレ
モニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum) 、
トリポケラジウム・ゲオデス（Tolypocladium geodes)
、ムコール・サーシネロイデス（Mucor circinelloide
s) 及びトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei)
、アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidul
ans）、アスペルギルス・ニガー（A. niger) 及びアス
ペルギルス・オリザ（A. oryzae)である。
【０００４】フサリウム属の所定の種、例えばフサリウ
ム・オキシスポルム（F. oxysporum) （Diolezら、199
3，Gene 131 : 61-67 ; Langin ら、1990, Curr. Gene
t. 17: 313-319 ; Malardier ら、1989, Gene 78 : 147
-156 及びKistler and Benny,1988, Curr. Genet. 13 :
145-149) 、フサリウム・ソラニ（F. solani) (Crowh
urstら、1992, Curr. Genet. 21 : 463-469)及びフサリ
ウム・カルモルム（F.culmorum) (Curraghら、1992, M
ycol. Res. 97 : 313-317) が植物病原及び遺伝子調節
の研究のためのモデル系として利用されている。これら
のフサリウム種は異種タンパク質の製造にとっては商業
的に適当でなく、その理由は植物病原体であるが如きの
その所望されない特徴又はそれらが安全でないレベルで
マイトマイシンを産生することにある。Dickman and Le
slie (1992, Mol. Gen. Genet. 235 : 458-462) はニュ
ーロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa)の nit−２
を含むプラスミドによるジッベレラ・ジー（Gibberella
zeae)の形質転換を開示する。Dickman and Leslieに開
示されているジッベレラ・ジーの株は植物病原体であ
り、そしてエストロゲン様ミコトキシンであるゼアラレ
ノン（zearalenone)を産生する。Sanchez-Fernandez ら
（1991, Mol. Gen. Genet. 225 : 231-233) はアスペル
ギルス・ニガーの niaＤ遺伝子を含むプラスミドによる
niaＤ突然変異を担持するジッベレラ・フジコロイ（G.
fujikoroi) の形質転換を開示する。
【０００５】理想的な発現系は、プロテアーゼ及びミコ
トキシン産生力を実質的に有さず、またその他の大量の
内生産生された分泌タンパク質を実質的にもたず、そし
て既知の宿主細胞よりも高いレベルの発現が可能なもの
である。本発明はこのような要件を満たす新規のフサリ
ウム発現系をこの度提供する。
【０００６】３．発明の概要 本発明は、プロモーターに作用可能式に連結された異種
タンパク質をコードする核酸配列を含んで成る無毒、非
毒素原性及び非病原性組換フサリウム宿主細胞を提供す
る。本明細書において規定する「無毒」とは、その宿主
細胞が植物又は動物に対して毒素として作用しないこと
を意味する。例えば、フサリウム宿主細胞は、約20mlの
用量の（１：１希釈した）３日目のフサリウム培養培地
／体重kg／マウスで約５匹のマウスに注射を施してから
約14日後にどのマウスもフサリウム処置の結果として死
亡しなかったとき、無毒であると考えられるであろう。
本明細書において規定する「非毒素原性」とは、その宿
主細胞がHPLC分析の如き標準の分析方法による決定に従
い本質的にミコトキシンを有さないことを意味する。例
えば、固体栄養培地を有する２枚の９cmのペトリ皿上で
増殖した所定量のフサリウムを有機溶媒で抽出し、そし
て 0.5％の抽出物を分析のためにHPLCにインジェクトし
てよい。既知のミコトキシンの無さは、ミコトキシン標
準に関してわかっている位置での検出可能なHPLCピーク
の無さにより推定されるであろう。本明細書において規
定する「非病原性」とは、その宿主細胞が健康な植物又
は健康な動物において有意義な病気を及ぼさないことを
意味する。例えば、植物に対して病原性であるフサリウ
ム種は植物の木質組織の菌類侵入を示し得、そして一般
にしおれ症状を特徴とする疾病状態をもたらす。本明細
書において規定する「異種タンパク質」とは、宿主細胞
にとって天然でないタンパク質、又は天然タンパク質で
あってその天然配列が変わるように修飾の施されたも
の、又は天然タンパク質であってその発現がその天然タ
ンパク質の発現にとって必須の天然調節配列、例えばプ
ロモーター、リポソーム結合性部位等の操作の結果とし
てもしくは組換DNA 技術による宿主細胞のその他の操作
の結果として量的に改変されたものをいう。核酸配列は
適当なプロモーター配列に作用可能式に連結されてお
り、そのプロモーター配列は選定の宿主細胞におけるそ
の核酸配列の転写を指令することができる。本発明は更
に組換タンパク質の製造のための方法に関連し、この方
法は異種タンパク質をコードする核酸配列を含む上記の
種のいづれかの宿主細胞をタンパク質の発現が誘導され
る条件下で培養し、そしてこのタンパク質をその培養物
から回収することを含んで成る。好適な態様において、
本発明は菌類タンパク質、最も好ましくは菌類酵素であ
る。本発明の方法を利用して、少なくとも約 0.5ｇの異
種タンパク質／１ｌの宿主細胞が産生される。
【０００７】本発明の宿主細胞は、以降の第５．１章に
記載のカゼイン清浄アッセイによる決定に従い、驚くべ
きほどに少量のみのプロテアーゼを分泌する。特にほん
の小さな加水分解ゾーンしか検出されないか、又はその
ゾーンは全く検出されない。本発明の宿主細胞及び方法
は、その他の既知の菌類種、例えばアスペルギルス・ニ
ガー、アスペルギルス・オリザ又はフサリウム・オキシ
スポルムよりも驚くべきほどに効率的に所定の菌類酵素
を組換生産せしめる。本発明は更にフサリウム・オキシ
スポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝
子に由来するプロモーター配列又はその配列と実質的に
同じプロモーター活性を有するそのフラグメントに関す
る。このプロモーターの配列をSEQ IDNO : ５に示す。
【０００８】更に、本発明はフサリウム・オキシスポル
ム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子に由
来するターミネーター配列又はその配列と実質的に同じ
ターミネーター活性を有するそのフラグメントに関す
る。このターミネーターの配列をSEQ ID NO : ６に示
す。
【０００９】４．発明の詳細な説明 フサリウムは培養中での菌糸体過剰及び綿様状を特徴と
し、往々にして固体培地上の菌糸体における若干のピン
ク、紫又は黄色の色合いを有する。分生子柄は変則的に
細く、そして単純であるか、又は太い、短い、不規則的
に分岐している、もしくは小梗の輪生体を抱え、単独で
あるか又は分生子褥へとまとまっている。分生子は主に
２通りあり、往々にして小さな湿った頭部の中に保持さ
れている。即ち、大分生子は多区画となっており、若干
曲屈しているか、又は先端で曲がっており、一般にカヌ
ー型であり、そして小分生子は一区画となっており、卵
形又は長だ円形であり、単独で又は鎖状で保持されてい
る。一部の分生子は中間型であり、２又は３区画となっ
ており、長だ円形又は若干屈曲している。
【００１０】特定の態様において、本発明の宿主細胞は
以下の特徴を有するフサリウム・ベネナトゥム種であ
る。分生子：小分生子がない。大分生子ははっきりと隔
壁で仕切られ、厚壁であり、まっすぐからやや鎌状であ
り、不規則的に屈曲し、腹部の面はほぼまっすぐであ
り、そしてなめらかに弓なりとなった背面を有する。基
底細胞は明瞭に足型となっている。頂点の細胞は円錐形
又は鼻（snout)のようにくびれている。分生子柄：分岐
していない又は分岐した単分生子柄。厚壁胞子は一般に
培養物を非常にゆっくりと形成する；そのようなとき、
それらは往々にして大分生子の形態であるが、しかし菌
糸体の形態でもありうる。コロニー形態：PDA 上で、増
殖は迅速であり、密な気生菌糸体はチューブをほぼ滴林
にし得、そして往々にして黄色から黄かっ色であり、白
色から深紅色のふち取りをもつ。赤茶色から橙色の分生
子褥は存在しているならまばらであり、往々にしてその
培養物が30日目より古いときに見れる。下層は通常深紅
色である。この菌類は変色（Discolor ：ディスカラ
ー）の種の全ての種のうちで最もシリンダー状（背面と
側面とが平行）の大分生子を産生する。
【００１１】最も特別な態様において、フサリウム・ベ
ネナトゥムはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに寄託され、そして番号ATCC 20334の付けられた
フサリウム・ベネナトゥム・シュワベ（Schwabe) IMI 1
45425(米国特許第 4,091,189号）、並びに同様に無毒、
非毒素原性及び非病原性である誘導体及び突然変異体、
例えば米国特許第 4,041,189号に教示のものである。
【００１２】本明細書及び請求の範囲全体を通じて、
「フサリウム・ベネナトゥム」なる語の利用はこの種に
包括される生物のみならず、別の分類系列において別の
種に従来又は現在割り当てられているが、しかしながら
上記と同じ形態学及び培養特性をもつ種であって、Ｆ．
ベネナトゥムの異名でありうるものをも含む。これらに
は、限定することなく、フサリウム・ロゼウム（F. ros
eum)、Ｆ．ロゼウム．var.グラミネアルム、ジッベレラ
・ジー、又はジッベレラ・ロゼウム（G. roseum)、ジッ
ベレラ・ロゼウムf. sp.セレアリス（G. roseum f. sp.
cerealis)が含まれる。
【００１３】当業者は本明細書に記載の宿主種の有効な
形質転換が特異的に例示しているベクター、プロモータ
ー及び選択マーカーの利用に限定されないことをも認識
するであろう。一般に、Ｆ．オキシスポルム、Ｆ．ソラ
ン及びＦ．カルモルム（F. culmorum)の形質転換におい
て有用な技術は本発明の宿主細胞にも有用である。例え
ば、 amdＳ選択マーカーが好適であるが、その他の有用
な選択マーカーには argＢ（Ａ．ニドゥランス又はＡ．
ニガー）、 trpＣ（Ａ．ニガー又はＡ．ニドゥラン
ス）、 pyrＧ（Ａ．ニガー、Ａ．オリザ又はＡ．ニドゥ
ランス、 niaＤ（Ａ．ニドゥランス、Ａ．ニガー又は
Ｆ．オキシスポルム）及び hygＢ（Ｅ．コリ（E. col
i)) マーカーが含まれる。プロモーターはこれらの種に
おいて強力な転写活性を示す任意のDNA 配列であってよ
く、そして細胞外及び細胞内タンパク質の双方、例えば
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパー
ゼ、セルラーゼ及び解糖酵素をコードする遺伝子に由来
しうる。かかるプロモーターの例には、限定することな
く、Ａ．ニドゥランス amdＳプロモーター、又は解糖酵
素、例えばTPI, ADH, GAPDH 及びPGK についての遺伝子
由来のプロモーターが含まれる。プロモーターは同族プ
ロモーター、即ち、使用する宿主株にとって天然の遺伝
子のためのプロモーターであってもよい。このプロモー
ター配列には、プロモーター配列と選定の遺伝子又は選
定のシグナルペプチドもしくはプレ領域とのライゲーシ
ョンを助長する特定の制限部位を導入する目的でリンカ
ーが施されていてもよい。
【００１４】プロモーター配列はフサリウム・オキシス
ポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子
又はこの配列と実質的に同じプロモーター活性を有する
そのフラグメントに由来しうる。プロモーターの配列を
SEQ ID NO : ５に示す。本発明は更に以下の条件下でSE
Q ID NO : ５に示すプロモーター配列とハイブリダイズ
する核酸配列を包括する：〔５×のSSC の中での予備浸
漬及び20％のホルムアミド、５×のDenhardt溶液、50mM
のリン酸ナトリウム、pH6.8 及び50μｇの変性音波処理
仔牛胸腺DNA の溶液中での約40℃で１ｈにわたるプレハ
イブリダイゼーション、それに続く 100μＭのATP の添
加された同一の溶液中での約40℃で18hrにわたるハイブ
リダイゼーション、それに続く 0.4×のSSC の中での約
45℃の温度での洗浄〕。又は、本発明は更に、SEQ ID N
O : ５に対して約90％以上の相同性、そして好ましくは
約95％以上の相同性を有するが、しかしこの配列と実質
的に同じプロモーター活性を有する核酸配列を包括す
る。別の態様において、プロモーターは窒素制限の際に
発現される遺伝子の陽性レギュレーターであるAreAの大
量の結合性部位を含んで成る配列であってよい；これら
の部位はニューロスポラ・クラッサにおいて nit−２と
呼ばれている（Fu and Marzlus, 1990, Proc.Natl. Aca
d. Sci. U. S. A. 87 : 5331-5335) 。プロモーター配
列はかかるAreA部位の付加又は置換により修飾され得
る。
【００１５】ターミネーター及びポリアデニル化配列は
プロモーターと同じ起源に由来してもよい。特定の態様
において、このターミネーター配列はフサリウム・オキ
シスポルム・トリプシン様プロテアーゼをコードする遺
伝子に由来するものであるか、又はこの配列と実質的に
同じターミネーター活性を有するそのフラグメントであ
る。このターミネーターの配列をSEQ ID NO : ６に示
す。本発明は更に以下の条件下でSEQ ID NO : ６に示す
ターミネーター配列とハイブリダイズする核酸配列を包
括する：〔５×のSSC の中での予備浸漬及び20％のホル
ムアミド、５×のDenhardt溶液、50mMのリン酸ナトリウ
ム、pH6.8 及び50μｇの変性音波処理仔牛胸腺DNA の溶
液中での約40℃で１hrにわたるプレハイブリダイゼーシ
ョン、それに続く 100μＭのATP の添加された同一の溶
液中での約40℃で18hrにわたるハイブリダイゼーショ
ン、それに続く 0.4×のSSC の中での約45℃の温度での
洗浄〕。又は、本発明は更に、SEQ ID NO : ６に対して
約90％以上の相同性、そして好ましくは約95％以上の相
同性を有するが、しかしこの配列と実質的に同じターミ
ネーター活性を有する核酸配列を包括する。
【００１６】エンハンサーもこの構築体に挿入してよ
い。発現生成物を得るための細胞の破壊の必要性を回避
するため、及び細胞内の発現生成物の考えられる分解の
程度を最小限とするため、その生成物は細胞外に分泌さ
れることが好ましい。このため、好適な態様において、
注目の遺伝子を、発現生成物を細胞の分泌経路に導き得
るシグナル又はリーダーペプチドの如きプレ領域に連結
する。このプレ領域は任意の生物からの任意の分泌タン
パク質にとっての遺伝子に由来しうるか、又は天然プレ
領域であってよい。かかるプレ領域にとってのとりわけ
有用な起源はアスペルギル種由来のグルコアミラーゼも
しくはアミラーゼ遺伝子、バチルス種由来のアミラーゼ
遺伝子、リゾムコール・ミーヘイ由来のリパーゼもしく
はプロテイナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビジ
エ（Saccharomyces cerevisiae）由来のα因子について
の遺伝子、又は仔牛プロキモシン遺伝子である。プレ領
域はＡ．オリザTAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー中性α−ア
ミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定性α−アミラーゼ、Ｂ．リ
シェニホルミス（Bacillus licheniformis) α−アミラ
ーゼ、バチルスNCIB 11837由来のマルトジェニックアミ
ラーゼ、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearotherm
ophilus)・α−アミラーゼ又はＢ．リシェニホルミス・
スブチリシンについての遺伝子に由来しうる。有効なシ
グナル配列はＡ．オリザTAKAアミラーゼシグナル、リゾ
ムコール・ミーヘイ・アスパラギン酸プロテイナーゼシ
グナル及びリゾムコール・ミーヘイ・リパーゼシグナル
である。他に、発現すべき遺伝子にとって天然の遺伝
子、例えばSEQ ID NO : ４のアミノ酸−24と−５との間
の遺伝子も利用できうる。
【００１７】プロモーター及びターミネーター配列に機
能的に連結された所望の生成物に関する遺伝子を選択マ
ーカーを含むベクターの中に組込むか、又は宿主株のゲ
ノムの中に組込まれることのできる独立のベクターもし
くはプラスミドの上に載せてよい。他方、使用するベク
ターは宿主細胞中の線形又は環状染色体外因子として複
製可能でありうる。これらのタイプのベクターには、例
えばプラスミド及びミニ染色体が含まれる。このベクタ
ー系は単一のベクターもしくはプラスミド、又は２以上
のベクターもしくはプラスミドであってゲノムの中に組
込まれるべき全DNA を共に含むものであってよい。
【００１８】宿主細胞は当業界において公知の手順、例
えば形質転換及びエレクトロポレーションを利用して異
種タンパク質をコードする核酸により形質転換されうる
（例えば、Fincham, 1989, Microbial Rev. 53 : 148-1
70を参照のこと）。
【００１９】本発明の組換宿主細胞は当業界公知の手順
を利用して培養されうる。簡単には、宿主細胞を標準の
増殖培地、例えば無機塩、ビタミン、適当な有機炭素
源、例えばグルコースもしくはデンプン、任意の様々な
複合栄養源（酵母抽出物、加水分解カゼイン、ダイズマ
メミール等）の組合せを含むものの上で培養する。一例
はFP−１培地（５％のダイズマメミール、５％のグルコ
ース、２％の K2HPO4, 0.2％のCaCl2, 0.2％のMgSO4 ・
７H2O 及び 0.1％のプルロニン酸（BASF））である。発
酵は約 4.5〜8.0 のpH及び約20〜37℃の温度で約２〜７
日間行う。
【００２０】当該宿主細胞種は注目の任意の原核又は真
核異種タンパク質を発現させるために使用でき、そして
好ましくは真核系タンパク質を発現させるために使用す
る。これらの種にとって特に注目されるのは異種タンパ
ク質、特に菌類酵素の発現におけるその使用である。こ
の新規の発現系は酵素、例えばカタラーゼ、ラッカー
ゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシド
リダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、リパーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、キュ
チナーゼ、プロテアーゼ及びその他のタンパク質分解酵
素、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、フ
ィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼ及びその他のペクチ
ン分解酵素、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−ガラ
クトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダ
ーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシターゼ、イソメラ
ーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌク
レアーゼ、キチナーゼ、ムタナーゼ及びデオキシリボヌ
クレアーゼを発現させるために使用できる。
【００２１】特定の態様において、この酵素はアルカリ
性プロテアーゼ、例えばフサリウム・オキシスポルム・
プレープロ−トリプシン遺伝子である。最も特別な態様
において、ゲノム配列をSEQ ID NO : ３において示し、
そしてタンパク質配列をSEQID NO : ４に示す。別の特
定の態様において、この酵素はアルカリ性エンドグルカ
ナーゼであり、これはヒュミコラ・インソレンス（Humi
cola insolens) DSM 1800 由来の高純度の〜43kDエンド
グルカナーゼに対して生起させた抗体と免疫学的に反応
性であるか、又はセルラーゼ活性を示す〜43kDのエンド
グルカナーゼの誘導体である（WO91/17243 を参照のこ
と）。以降に「Careyme(登録商標）」と称するエンドグ
ルカナーゼはSEQ ID NO : ７に示す遺伝子によりコード
され得、そしてSEQ ID NO: ８に示すタンパク質配列を
有しうる。この酵素はCarezyme（登録商標）変異体でも
ありうる。
【００２２】更なる別の特定の態様において、この酵素
は１，３特異性リパーゼあり、以降にLipolase（登録商
標）と呼ぶ。この酵素はSEQ ID NO : ９に示すDNA 配列
によりコードされ得、そしてSEQ ID NO : 10に示すアミ
ノ酸配列を有しうる。この酵素はLipolase（登録商標）
変異体、例えばD96L, E210K, E210Lであってもよい（WO
92/05249 を参照のこと）。
【００２３】当業者は、「菌類酵素」なる語が天然菌類
酵素のみならず、活性、熱安定性、pH寛容性等を高める
ために施されうるアミノ酸置換、欠失、付加又はその他
の修飾により修飾されている菌類酵素も含むことを理解
するであろう。当該宿主細胞種はホルモン、成長因子、
レセプター等の如き薬理学的に注目される異種タンパク
質の発現のためにも利用できうる。本発明を以下の非限
定例により更に説明する。
【００２４】５．実施例 ５．１．フサリウム・ベネナトゥム20334 は低レベルで
のみタンパク質を分泌する。フサリウム・ベネナトゥム
株20334 ，Ａ．オリザ及びＡ．ニガーの分生胞子懸濁物
を125ml の振盪フラスコの中の25mlのYPD 培地（１％の
酵母抽出物（Difco)、２％のバクトペプトン（Difco)、
２％のグルコース）に接種し、そして30℃，300rpmで５
日間インキュベートする。培養物由来の上清液を遠心に
より回収する。総量10μｌづつのサンプルを10μｌの
0.1Ｍのジチオスレイトール（Sigma)及び10μｌの装填
バッファー（40mMのトリスベース、６％のドデシル硫酸
ナトリウム、2.5mM のEDTA，15％のグリセロール、２mg
／mlのブロモクレゾール・パープル）と混合する。これ
らのサンプルを５分間煮沸し、そして４−12％のポリア
クリルアミドゲル（Novex)で泳動させる。タンパク質を
クマジーブルーによる染色により識別化させる。その結
果（図１）は、フサリウム・ベネナトゥム株20334 がご
くわずかな分泌タンパク質しか生成しないことを示し
た。
【００２５】５．２．フサリウム・ベネナトゥム20334
は低レベルでのみプロテアーゼを分泌する。フサリウム
・ベネナトゥム株20334 ，Ａ．オリザ及びＡ．ニガー由
来の全量40μｌの培養液（上記の５．１章を参照のこ
と）をカゼインアガープレート（２％の脱脂粉乳（Luce
rne)、50mMのトリス−HCl pH＝7.5 ，１％のノブルアガ
ー（Difco)）へと切ったウェルの中にそれぞれ分注す
る。これらのプレートを37℃で５時間インキュベート
し、そしてタンパク質加水分解ゾーンを観察する。その
結果（図２）は、フサリウム・ベネナトゥム株20334 培
養液が非常にわずかなタンパク質分解活性しかもたない
ことを示した。
【００２６】５．３．フサリウム・オキシスポルム・ゲ
ノム・プレプロ−トリプシン遺伝子のクローニング ラムダファージ中のゲノムDNA ライブラリーをSambrook
ら、1989，MolecularCloning, A Laboratory Manual, C
old Spring Harbor, NYにおいて記載されている如き方
法を利用してＦ．オキシスポルムゲノムDNA から調製す
る。全部で50μｇのゲノムDNA を10mMのトリス（pH＝7.
5)、50mMのNaCl, ７mMのMgCl2 ，７mMの２−メルカプト
エタノール及び４ユニットの制限酵素Sau ３Ａを含む 2
00μｌの容量において37℃で１分消化させる。分子サイ
ズ10−20kbの部分消化DNA をアガロースゲル電気泳動に
より単離し、次いで透析膜に電気溶離させ、そしてElut
ip−Ｄカラム（Schleicher and Schuell) を利用して濃
縮する。制限酵素BamHＩで切り、そしてホスファターゼ
（Clonetech)で処理したEMBL４のファージの１μｇのラ
ムダアームを標準条件下（Sambrookら、1989，Molecula
r Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r, NY) で25μｌの容量において 300〜400 μｇのSau
３Ａ切断ゲノムDNA とライゲーションさせる。ラムダフ
ァージを、商業的に有用なキット（Gigapack Gold II，
Stratagene) を利用し、その製造者の仕様に従い、この
ライゲーション混合物から調製する。
【００２７】約15,000個の組換ラムダファージのプレー
ティング及びフィルターリフトの製造（Hybond Ｎ+ フ
ィルター、Amershamに対する）は標準の方法を利用して
行う（Sambrookら、1989，Molecular Cloning, A Labor
atory Manual, Cold SpringHarbor, NY) 。これらのフ
ィルターをハイブリダイゼーションのために非放射能核
酸検出（Boehringer Mannheim)用のGenius Kitにより、
標準の方法（Sambrookら、1989，Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) を利用
して処理する。プローブとして使用するDNA はプラスミ
ドpSX 233 の中に存在するＦ．オキシスポルム・トリプ
シン様プロテアーゼ（以降SP387 と称す）遺伝子の全コ
ード領域の0.75kbのジゴキシゲニン（DIG)ラベル化PCR
フラグメントとする。このプラスミドはNRRLに受託番号
NRRL Ｂ−21241 で寄託されている。PCR 反応のための
プライマーは５’−tgcggatccATGGTCAAGTTCGCTTCCGTC
（フォワードプライマー；SEQ ID NO : １）及び５’−
gacctcgagTTAAGCATAGGTGTCAATGAA（リバースプライマ
ー；SEQ ID NO : ２）とする。双方のプライマーにおい
て、小文字はリンカー配列を表わし、そして大文字はSP
387 遺伝子のコード領域に相当する。PCR を実施するた
め、プラスミドpSX233由来のSP387 遺伝子を含む907bp
のBamHＩ/XbaＩ DNAフラグメント25ngを68pmole づつの
フォワード及びリバースプライマーと混合する。
【００２８】DNA フラグメント及びプライマーの混合物
を１ＸのTaq バッファー／１ＸのDIG ラベル用ミックス
／５ユニットのTaq (Boehringer Mannbeim) 中で80μｌ
の容量にする。反応条件は95℃で３分、次いで35サイク
ルの95℃で30秒、50℃で１分、72℃で１分、とする。
Ｆ．オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼ由来の
PCR により誘導されたDNA 配列をSEQ ID NO : ３に示
す。ファージプラークをGeniusキット（Boehringer Man
nheim)の改良（Engler and Blum, 1993, Anal. Bioche
m. 210 : 235-244)を利用し、DIG ラベル化プローブに
よりスクリーニングする。陽性クローンを単離し、そし
て第２ラウンドのプレーティング及びハイブリダイゼー
ションにより精製する。Ｆ．オキシスポルム・トリプシ
ン様プロテアーゼ遺伝子を含む組換ラムダファージを調
製し、そしてDNA をQuiagen lamda midi調製用キット
（Quiagen)を利用してファージから単離する。
【００２９】５．４．発現プラスミド pJRoy６の構築 制限地図、サザンブロッティング及びハイブリダイゼー
ション技術（Sambrookら、1989，Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) を、
Ｆ．オキシスポルム・トリプシン様プロテアーゼコード
遺伝子及び隣接DNA 配列を含む組換ファージの１つから
5.5kb の PstＩ制限酵素フラグメントを同定するために
用いる。この5.5kb の PstＩフラグメントを PstＩ消化
したpUC118にサブクローニングし、そしてこのプラスミ
ドを pJRoy４と命名する（図３参照）。プラスミド pJR
oy４を制限酵素EcoRＩで消化し、そしてSP387 遺伝子を
含む3.5kb のEcoRＩフラグメントとpUC118ポリリンカー
の43bpのEcoRＩ/PstＩ領域を単離し、そしてベクターpT
oC90にサブクローニングしてプラスミド pJRoy６を作り
上げる（図３）。
【００３０】５．５．SP387 発現カセットの構築 pUC118中のBamHＩ部位により連結されたSP387 プロモー
ター及びターミネーターを含む発現カセット（pJRoy20)
を構築する。pJRoy20 を含むＥ．コリ株はNRRLに寄託し
てある。プロモーターフラグメントを、SP387 ベクター
pJRoy６をEcoRＩ（これは−1200を切る）及び NcoＩ
（これは翻訳開始部位を切る；図５参照）で消化するこ
とにより作る。ターミネーター配列（図５のbp2056−31
07）は以下のオリゴヌクレオチドを利用するPCR 増幅に
より作る： フォワード ５’gcacaccatggtcgctggatccATACCTTGTTGGAAGCGTCG３’
（SEQ ID NO : 11） リバース ５’atcggagcatgcggtaccgtttaaacgaattcAGGTAAACAAGATA
TAATTTTCTG３’（SEQID NO : 12）
【００３１】大文字はSP387 ターミネーターDNA に対応
し、一方小文字は操作された制限部位を含むテールであ
る。
【００３２】NcoＩ及び SphＩによる消化後、５’末端
上で NcoＩ及びBamHＩ部位の隣接する並びに３’末端上
でEcoRＩ， PmeＩ， KpnＩ及び SphＩ部位の隣接するタ
ーミネーターを含む得られる増幅生成物を単離する。プ
ロモーターフラグメント、ターミネーターフラグメント
及び KpnＩ/SphＩ切断pUC118の三段ライゲーションを行
ってpJRoy20 を作る（図５参照）。
【００３３】５．６．Carezyme（登録商標）構築体 SP387 プロモーターにおける−15位のEcoRＶ部位及びCa
rezyme（登録商標）コード領域の＋243 位にある NcoＩ
部位をSP387 プロモーターとCarezyme（登録商標）遺伝
子との正確な融合体を作り上げるために利用する。SP38
7 プロモーターの−18〜−１、それに直接続くCarezyme
（登録商標）遺伝子の−１〜＋294 を含むPCR フラグメ
ントを以下のプライマーを利用してCarezyme（登録商
標）ベクターpCaHj418（図12参照）から作る： フォワード EcoRＶ ５’ctcttggatatctatctcttcaccATGCGTTCCTCCCCCCTCCT
３’（SEQ ID NO : 13） リバース ５’CAATAGAGGTGGCAGCAAAA３’（SEQ ID NO : 14）
【００３４】フォワードプライマーの小文字はSP387 プ
ロモーターのbp−24〜−１であり、一方大文字はCarezy
me（登録商標）のbp１〜20である。
【００３５】利用するPCR 条件は、95℃で５分、それに
続く30サイクルの95℃で30秒、50℃で１分、72℃で１分
とする。得られる0.32kbのフラグメントをInvitrogenの
TAクローニングキットを利用してベクター pCRIIにクロ
ーニングし、pDM148を得る（図13参照）。0.26kbのEcoR
Ｖ/NcoＩフラグメントをpDM148から単離し、そしてpCaH
j418由来の0.69kbの NcoＩ/BglIIフラグメントにライゲ
ーションし、そしてEcoRＶ／BamHＩ消化したpJRoy20 に
クローニングし、pDM149を作り上げる（図14参照）。3.
2kb のEcoRＩ Carezyme（登録商標）発現カセット（SP
387 プロモーター／Carezyme（登録商標）／SP387 ター
ミネーター）をpDM149から単離し、そしてpToC90のEcoR
Ｉ部位にクローニングしてpDM151を作り上げる（図６参
照）。発現構築体pDM151は発現カセット及び amdＳ選択
マーカーの双方を含む。pDM151を含むＥ．コリ株はNRRL
に寄託してある。
【００３６】５．７．Lipolase（登録商標）構築体 SP387 プロモーターの−15位のEcoRＶ及びLipolase（登
録商標）コード領域の＋６位の SacＩ部位をSP387 プロ
モーターとLipolase（登録商標）遺伝子との正確な融合
体を作るために用いる。SP387 プロモーターの最後の15
bp、それに続くLipolase（登録商標）コード領域の最初
の６bpを含むアダプターを構築し、それを以下に示す。 EcoRＶ SacＩ atctatctcttcaccATGAGGAGCT （SEQ ID NO : 15） tagatagagaagtggTACTCC （SEQ ID NO : 16）
【００３７】Lipolase（登録商標）cDNA遺伝子の0.9kb
の SacＩ／BamHＩフラグメントをＡ．オリザ発現構築体
pMHan37(図15参照）から単離する。EcoRＶ/SacＩアダプ
ター及び SacＩ／BamHＩ Lipolase（登録商標）フラグ
メントをライゲーションし、そしてEcoRＶ／BamHＩ消化
したpJRoy20 にクローニングしてプラスミドpDM154を作
り上げる（図16参照）。3.2kb の KpnＩ Lipolase（登
録商標）発現カセット（SP387 プロモーター／Lipolase
（登録商標）／SP387 ターミネーター）をpDM154から単
離し、そしてpToC90の KpnＩ部位にクローニングしてプ
ラスミドpDM155を作り上げる（図７参照）。発現構築体
pDM155はLipolase（登録商標）発現カセット及び amdＳ
選択マーカーの双方を含む。pDM151を含むＥ．コリ株は
NRRLに寄託してある。
【００３８】５．８．Ｆ．ベネナトゥムの形質転換フサリウム・ベネナトゥム 株ATCC 20334培養物をVogels
培地（Vogel, 1964, Am. Nature 98 : 435-446) と 1.5
％のグルコース及び 1.5％のアガーの 100枚の15mmのペ
トリ皿の上で25℃で３週間増殖させる。分生子（約108
／プレート）をトランスファーループを用いて10mlの無
菌水に入れ、そして４層のチーズクロスそして最後に一
層のミラクロスで濾過することにより精製する。分生子
懸濁物を遠心により濃縮する。50mlのYPG(１％の酵母抽
出物（Difco)、２％のバクトペプトン（Difco)、２％の
グルコース）に108 の分生子を接種し、そして20℃，15
0rpmで14ｈインキュベートする。得られる菌糸を 0.4μ
ｍの滅菌フィルター上で捕捉し、そして無菌蒸留水及び
1.0ＭのMgSO4 で順に洗う。その菌糸を10mlのNovozym
(登録商標）234 (Novo Nordisk)溶液(1.0ＭのMgSO4 中
２〜10mg／ml）に再懸濁し、そして34℃で15〜30分、80
rpm で撹拌しながら消化する。未消化の菌糸材料を得ら
れるプロトプラスト懸濁物から４層のチーズクロス及び
ミラクロスでの順々の濾過により除去する。20mlの１Ｍ
のソルビトールをこのチーズクロス及びミラクロスに通
し、そしてプロトプラスト溶液と合わせる。混合後、プ
ロトプラスト（約５×108 ）を遠心によりペレットに
し、そして20mlの１Ｍのソルビトール及び20mlのSTC
(0.8Ｍのソルビトール、50mMのトリス−HCl ，pH＝8.0
，50mMのCaCl2)中での再懸濁及び遠心により順々に洗
う。この洗浄プロトプラストを４部のSTC 及び１部のSP
TC(0.8Ｍのソルビトール、40％のポリエチレングリコー
ル4000 (BDH), 50mMのトリス−HCl pH＝8.0 ，50mMのCa
Cl2)の中に１〜２×108 ／mlの濃度で再懸濁する。 100
μｌのプロトプラスト懸濁物をポリプロピレンチューブ
（17×100mm)の中の５μｇの pJRoy６及び５μｌのヘパ
リン(STC中５mg／ml）に加え、そして氷の上で30分イン
キュベーションする。１mlのSPTCを静かにこのプロトプ
ラスト懸濁物に混合し、そしてインキュベーションを室
温で20分続ける。プロトプラストをCove塩（Cove, D.
J., 1966, Biochem. Biophys. Acta 113 : 51-56)と10m
Mのアセトアミド、15mMのCsCl2, 2.5％のノブルアガー
（Difco)及び 1.0Ｍのスクロースとより成る選択培地の
上に 0.6Ｍのスクロースと 1.0％の低融点アガロース
（Sigma)とを有する同じ培地の上層を利用してプレーテ
ィングする。プレートを25℃でインキュベートし、そし
て形質転換体は６〜21日目に出現する。
【００３９】５．９．フサリウム・ベネナトゥムにおけ
るトリプシン様プロテアーゼの発現 形質転換体をCOVE２培地（上記のCOVE培地と同じである
が、塩化セシウムがなく、その代わりに30ｇ／ｌの濃度
の 1.0Ｍのスクロースが入ってる）のプレートに移し、
そして25℃で３日以上増殖させる。150ml のフラスコの
中の25mlのアリコートのFP−１培地（５％のダイズマメ
ミール、５％のグルコース、２％のK2HPO4， 0.2％のCa
Cl2, 0.2％のMgSO4 ・７H2O 及び 0.1％のプルロニン酸
（BASF））にCOVE２プレート培養物由来の約１cmのアガ
ープラグを接種し、そして30℃で６日撹拌しながら（15
0rpm) インキュベートする。上清培養液サンプルを遠心
を経て回収し、そして以下の通りの SDS−PAGE分析にか
ける。30μｌづつの培養液を10μｌの SDS−PAGEサンプ
ルバッファー（１mlの 0.5ＭのトリスpH＝6.8, 0.8mlの
グリセロール、1.6ml の10％のSDS, 0.4mlの 0.8Ｍのジ
チオスレイトール、0.2ml の１％のブロモフェノールブ
ルー）、イソプロパノール中の２μｌの２％のPMSF（Si
gma)及び２μｌのグリセロールと混合する。これらのサ
ンプルを沸騰湯浴の中に４分入れ、そして40μｌづつを
10−27％のポリアクリルアミドゲル（Novex)上で泳動さ
せる。そのゲルを標準的な方法を利用してクマージ染料
で染色及び脱色する。トリプシン様プロテアーゼの発現
レベルは≧0.5 ｇ／ｌのと決定される。
【００４０】５．10．酵素アッセイ ５．10．１．Carezyme（登録商標） バッファー：リン酸ナトリウム（50mM，pH7.0) 基質：AZCL−HEセルロース（Megazyme) : ２mg／mlのバ
ッファー
【００４１】酵素標準品：100mg のCarezyme（登録商
標）標準品（10,070 ECU／ｇ）を１mlのバッファーに溶
かし、そして−20℃で保持する。このストックを酵素ア
ッセイに利用する直前にバッファーの中に１：100 で希
釈する。アッセイレンジは 0.5−5.0ECU／mlである。65
0,000ECU／ｇのCarezyme（登録商標）の換算係数を使用
する。
【００４２】基質溶液（990ml)を24穴マイクロタイター
プレートのサンプルウェルに加える。10μｌのCarezyme
（登録商標）サンプル（バッファーに希釈して 0.5〜10
ECU／mlの活性にしてある）を基質に加える。反応体を
45℃で30分インキュベートし、上清液を96穴マイクロタ
イタプレートに移し、そして650nm の吸収を測定する。
【００４３】５．10．２．Lipolase（登録商標）アッセ
イ バッファー：４mMのCaCl2 を含む 0.1ＭのMOPS, pH7.5 基質：１mlのDMSO中の10mlのｐ−ニトロフェニルブチレ
ート（pNB)； DMSO中の基質に４mlのバッファーを添加* ストック濃度＝20％のDMSO中11.5mM 酵素標準品：Lipolase（登録商標）（23,100LU／ｇ）を
1000LU／mlにて50％のグリセロールに溶かし、そして−
20℃で保存する。このストックをアッセイ直前にバッフ
ァーに１：100 に希釈する。アッセイレンジは 0.125〜
3.0 LU／mlである。100μｌのpNB ストック溶液を 100
μｌの適宜希釈した酵素サンプルに加える。活性(mOD／
min)を405nm にて、25℃で５分測定する。
【００４４】５．10．３．SP387 アッセイ Ｌ−BAPNA 基質は、ジメチルスルホキシド中のＬ−BAPN
A の 0.2Ｍのストック溶液（Sigma B3133)（凍結保存）
を使用直前にバッファー（0.01Ｍのジメチルグルタル酸
（Sigma)、 0.2Ｍの硼酸及び 0.002Ｍの塩化カルシウ
ム、pHはNaOHにより6.5 に調整）に 0.004Ｍにまで希釈
することにより調製する。１μｌの培養物を遠心する(1
45,000ｇ，10min)。 100μｌの希釈培養液のアリコート
を96穴マイクロタイタープレート中の 100μｌの基質に
加える。405nm での吸収変化をELISA リーダーを用い、
25℃で５分間にわたり30秒間隔でアッセイする。結果を
精製SP387 標準品に対して計算する。
【００４５】５．11．Carezyme（登録商標）の発現 pDM151の23の形質転換体を精製し、振盪フラスコの中で
ダイズ／グルコース培地上で培養し、そして９日後にCa
rezyme（登録商標）活性についてアッセイする（以下の
表１参照）。４つの形質転換体が約50〜100 mg／ｌのレ
ベルでCarezyme（登録商標）を発現する。形質転換体pD
M151−４をSP387 製造に関して開発された条件を利用し
て小スケール発酵槽の中で培養する（章５．９参照）。
約 6.0ｇ／ｌのCarezyme（登録商標）が７日後に示され
る（図８）。Carezyme（登録商標）は７日目に基づき分
泌タンパク質の90％以上を占める（図８）。Carezyme
（登録商標）はSDS ゲル電気泳動に基づく分泌タンパク
質の90％以上を占める。
【００４６】
【表１】
【００４７】６．12．Lipolase（登録商標）の発現 pDM155の15の形質転換体を精製し、振盪フラスコの中で
ダイズ／グルコース培地上で培養し、そして９日後にLi
polase（登録商標）活性についてアッセイする（表参
照）。
【００４８】
【表２】
【００４９】４つの形質転換体がLipolase（登録商標）
を約 100〜200 mg／ｌのレベル(pNBアッセイに基づく）
で発現する。形質転換体pDM155−10をSP387 製造に関し
て開発された条件を利用して小スケール発酵槽の中で培
養する（章５．９参照）。約2.0ｇ／ｌのLipolaseが７
日後に示される（図10）。Lipolase（登録商標）はSDS
ゲル電気泳動に基づき分泌タンパク質の90％以上を占め
る（図11）。
【００５０】７．微生物の寄託 以下の生物材料をブダペスト条約のもとで、Agricultur
al Research ServicePatent Culture Collection, Noth
ern Regional Research Center, 1815 University Stre
et, Peoria, Illinois, 61604に寄託してある。 株 受託番号 寄託日 pJRoy６含有Ｅ．コリ NRRL Ｂ−21285 94年６月20日 含有Ｅ．コリ NRRL Ｂ−21418 95年３月10日 pDM151含有Ｅ．コリ NRRL Ｂ−21419 95年３月10日 pDM155含有Ｅ．コリ NRRL Ｂ−21420 95年３月10日
【００５１】これらの株は、本特許出願の係属中での特
許及び商標庁により認められた者の、37 C.F.R. §１．
14及びU.S.C.§122 並びにブダペスト条約の条件のもと
で規定に従うその培養物に対するアクセスが保障される
ように寄託してある。この寄託物は各寄託株の生物学的
に純粋な培養物である。この寄託物は本願又はその関連
出願の提出された図の特許法の要求に従い入手できる。
しかしながら、寄託物の入手性は政府活動により認定さ
れる特許権の減縮の点において本発明の実施の許可を構
成するものではない。
【００５２】本明細書及び請求の範囲に記載の発明は開
示の特定の態様に限定されない。その理由は、これらの
態様は本発明のいくつかの見解の例示を意図するからで
ある。任意の均等な態様は本発明の範囲に属する。事
実、示しているもの他に本発明の様々な改良ができるこ
とが当業者にとって明らかであろう。かかる改良は請求
の範囲の発明に属する。様々な参考文献が本明細書にお
いて例示され、その開示内容は引用することで本明細書
に組入れる。
【００５３】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【図面の簡単な説明】
【図１】フサリウム・ベネナトゥム（F. venenatum)(レ
ーン１）；アスペルギルス・ニガー（レーン２）；及び
アスペルギルス・オリザ（レーン３）の分泌タンパク質
のSDS ゲルを示す。レーン４は分子量マーカーを示す。
【図２】以下のサンプルに基づくプロテアーゼアッセイ
の結果を示す：アスペルギルス・オリザ（ウェル１）；
アスペルギルス・ニガー（ウェル２）；フサリウム・ベ
ネナトゥム（ウェル３）；空のウェルコントロール（ウ
ェル４−６）。
【図３】プラスミド pJRoy６の構築を示す。
【図４】Ｆ．ベネナトゥム 20334 の形質転換体におけ
るトリプシン様プロテアーゼ（SP387)の分泌の SDS−PA
GE分析を示す。レーン１：分子サイズマーカー；レーン
２：ブランク；レーン３：精製トリプシン様プロテアー
ゼタンパク質標準品；レーン４：ブランク；レーン５：
未形質転換のＦ．ベネナトゥム株20334 ；レーン６：ブ
ランク；レーン７：プラスミド pJRoy６により形質転換
されたＦ．ベネナトゥム株20334 ；レーン８：ブラン
ク；レーン９：分子サイズマーカー。
【図５】pJRoy20の制限地図を示す。
【図６】pDM151の制限地図を示す。
【図７】pDM155の制限地図を示す。
【図８】DSM151−４をフサリウム・ベネナトゥムにおい
て20から160hr 発酵した場合のフサリウム・ベネナトゥ
ムのCarezyme（登録商標）の発現レベルを示す。
【図９】図８の前記フサリウム・ベネナトゥムにおける
Carezyme（登録商標）の産生の SDS−PAGE分析を示す。
レーン１：分子サイズマーカー；レーン２：20hr；レー
ン３：50hr；レーン４：70hr；レーン５：90hr；レーン
６；120hr ；レーン７：140hr ；レーン８：160hr 。
【図１０】DSM155−10をフサリウム・ベネナトゥムの中
で20から160hr 発酵した場合のLipolase（登録商標）の
発現レベルを示す。図10はLipolase（登録商標）のアッ
セイの結果を示す。
【図１１】図１０の前記フサリウム・ベネナトゥムにお
けるLipolase（登録商標）の産生の SDS−PAGE分析を示
す。レーン１：分子サイズマーカー；レーン２：20hr；
レーン３：50hr；レーン４：60hr；レーン５：90hr；レ
ーン６：120hr ；レーン７：140hr ；レーン８：160hr
。
【図１２】pCaHj418の制限地図を示す。
【図１３】pDM148の制限地図を示す。
【図１４】pDM149の制限地図を示す。
【図１５】pMHan37 の制限地図を示す。
【図１６】pDM154の制限地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 9/58 Ｃ１２Ｒ 1:77） (72)発明者 モーヤー，ドナ エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616，デイビス，コーウェル ブール バード 5219 (72)発明者 ヨダー，ウェンディー アメリカ合衆国，カリフォルニア 95694，ウインターズ，プレザント バ レー ロード 8503 (72)発明者 シュスター，ジェフリー アール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616，デイビス，レガッタ レーン 2619 (56)参考文献 Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（1992），21 （６），ｐ．463−469 Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（1989），15 （６），ｐ．453−456 Ｇｅｎｅ（1993），131（１），ｐ. 61−67 Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．（1992），97 （３），ｐ．313−317 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 異種タンパク質を発現する、ディスカラ
    ー（Discolor）もしくはそのテレオモルフ又はそれらの
    異名をもつ無毒、非毒素原性、非病原性の組換フサリウ
    ム・ベネナトゥム宿主細胞の特徴を有する組換宿主細胞
    であって、プロモーターに作用可能式に連結された当該
    異種タンパク質をコードする核酸配列を含んで成り、こ
    こでフサリウム・ベネナトゥムはＡＴＣＣ２０３４４を
    除く、宿主細胞。
  2. 【請求項２】 異種タンパク質をコードする核酸を含ん
    で成る、ＡＴＣＣ２０３４４を除く単離されたフサリウ
    ム・ベネナトゥム宿主細胞。
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