EA034253B1 - Пролин-специфическая эндопротеаза - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему активностью пролин-специфической эндопротеазы, выбранному из группы, состоящей из: i) полипептида, содержащего последовательность зрелого полипептида, представленную в SEQ ID NO: 2; ii) полипептида, который имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности зрелого полипептида, представленной в SEQ ID NO: 2; iii) полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в условиях средней жесткости, предпочтительно в условиях высокой жесткости с цепью, последовательность которой комплементарна последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1; iv) полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1. Кроме того, изобретение относится к способу получения полипептида и процессу производства пищевого или кормового продукта, в котором применяют полипептид.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему активностью пролинспецифической эндопротеазы, композиции, содержащей указанный полипептид, нуклеиновой кислоте, кодирующей пролин-специфическую эндопротеазу, экспрессионному вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, кодирующую пролин-специфическую эндопротеазу, рекомбинантной клетке-хозяину, способу получения пролин-специфической эндопротеазы и процессу получения пищевого или кормового продукта, в котором применяют пролин-специфическую эндопротеазу.

Сведения о предшествующем уровне техники

Пролин-специфические эндопротеазы представляют сбой ферменты, которые гидролизуют белок или пептид в положении, в котором находится пролин в белке или пептиде.

Пролин-специфическая эндопротеаза может быть получена, например, из Aspergillus niger или Penicillium chrysogenum, как это описано в WO 2002046381 и WO 2009144269 соответственно.

Другие пролин-специфические эндопротеазы известны из WO 2012174127. В WO 2012174127 раскрыта пролин-специфическая протеаза, полученная из Botryotinia, fuckeliana, Aspergillus clavatus, Sclerotinia sclerotiotum, Mycosphaerelly graminicola, Neuropspora crasse, Talaromyces stipitatus и Gibberella zeae.

Пролин-специфическую эндопротеазу можно применять в различных областях, например для расщепления глютена (см., например, WO 2005027953 или WO 2003068170). Глютен представляет собой нерастворимую белковую фракцию зерновых, таких как пшеница, рожь, овес и ячмень. Глютен представляет собой сложную смесь молекул глютенина и проламина, которые, как предполагается, вызывают токсические эффекты, например у пациентов, страдающих глютеновой болезнью. Целиакия спру или глютеновая болезнь считается аутоиммунным заболеванием. Пациенты, страдающие целиакией спру, должны соблюдать жесткую безглютеновую диету, которой очень сложно следовать из-за широкого применения глютена. Использование пролин-специфической эндопротеазы в качестве лекарственного средства или диетической добавки может уменьшить необходимость в жесткой безглютеновой диете (WO 2003068170).

Пролин-специфические эндопротеазы также применяют для уменьшения помутнения в пиве, при этом пролин-специфическую протеазу можно добавлять во время нескольких стадий процесса производства пива, что описано, например, в WO 2002046381 или WO 2007101888 A2.

Целью настоящего изобретения является альтернативная пролин-специфическая эндопротеаза с улучшенными характеристиками.

Краткое описание изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к изолированному полипептиду, обладающему активностью пролин-специфической эндопротеазы, выбранному из группы, состоящей из:

i. полипептида, содержащего последовательность зрелого полипептида, представленную в SEQ ID NO: 2;

ii. полипептида, который имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности зрелого полипептида, представленной в SEQ ID NO: 2;

iii. полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в условиях средней жесткости, предпочтительно в условиях высокой жесткости с цепью, последовательность которой комплементарна последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1;

iv. полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей описанный здесь полипептид.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1.

Настоящее изобретение также относится к экспрессионному вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотидную последовательность или экспрессионный вектор, как описано в настоящем документе.

В еще другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения полипептида, включающему культивирование клетки-хозяина, как описано в настоящем документе, в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида и получение полипептида.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к процессу получения пищевого или кормового продукта, включающему инкубацию промежуточной формы пищевого или кормового продукта с описанным здесь полипептидом и получение пищевого продукта.

Настоящее изобретение также относится к пищевому и кормовому продукту, который может быть получен согласно описанному в настоящем документе процессу.

Определения

Термин выпечка в настоящем документе определен как любой продукт, приготовленный из теста,

- 1 034253 например из жидкого теста. Продукт может иметь мягкую или хрустящую текстуру и может быть белого, светлого или темного типа. Выпечка включает, но без ограничения, хлеб, такой как, например, белый хлеб, цельнозерновой хлеб или хлеб из ржаной муки, хлеб типа французского багета; выпечку из слоеного теста, например из дрожжевого слоеного теста, такую как круассаны, или выпечку из пресного слоеного теста; питу, тортилью, горячую маисовую лепешку с начинкой, кексы, панкейки, бисквиты, печенье, пончики, бублики, песочное тесто, маффины, паровой хлеб и хрустящий хлеб. Типы выпечки, способы их характеристики и получения известны специалистам в данной области, см., например, Baking Science and Technology by E.J. Pyler, L.A. Gorton, 2008, (2 volumes) Sosland Publishing Company, Kansas, USA, или Baked Products: Science, Technology and Practice by S.P. Cauvain, L.S. Young, 2006, Blackwell Publishing Ltd, Oxford, UK.

Термин комплементарная цепь может быть использован взаимозаменяемо с термином комплемент. Комплемент нуклеотидной цепи может представлять собой комплемент кодирующей цепи или комплемент некодирующей цепи. При упоминании двухцепочечных нуклеиновых кислот комплемент нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, относится к комплементарной цепи кодирующей аминокислотную последовательность цепи или к любой содержащей ее молекуле нуклеиновой кислоты.

Термин контрольная последовательность может быть использован взаимозаменяемо с термином регулирующая экспрессию последовательность нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин относится к последовательностям нуклеиновых кислот, необходимым для экспрессии и/или влияющим на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в организме конкретного хозяина или in vitro. Когда две нуклеотидные последовательности функционально связаны, они, как правило, будут находиться в одинаковой ориентации, а также в одинаковой рамке считывания. Как правило, они будут, по существу, смежными, хотя это может не требоваться. Регулирующие экспрессию нуклеотидные последовательности, такие как inter alia, подходящие последовательности инициации, терминации транскрипции, промоторные, лидерные последовательности, последовательности сигнального пептида, пропептидные последовательности, препропептидные последовательности или энхансерные последовательности; последовательность Шайна Дальгарно, последовательности репрессоров или активаторов; сигналы эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые усиливают эффективность трансляции (то есть сайты связывания рибосом); последовательности, которые увеличивают стабильность белка; и, если желательно, последовательности, которые усиливают секрецию белка, могут представлять собой нуклеотидную последовательность, проявляющую активность в выбранном организме-хозяине, и могут быть получены из генов, кодирующих белки, которые являются эндогенными или гетерологичными для клетки-хозяина. Каждая контрольная последовательность может быть нативной или чужеродной по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. По желанию контрольная последовательность может быть обеспечена линкерами с целью введения специфических сайтов рестрикции, облегчающих лигирование контрольных последовательностей с кодирующим участком нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Контрольные последовательности могут быть оптимизированы в соответствии с их конкретным назначением.

Молочный продукт относится к любому виду продукта на основе молока, предназначенному для использования в качестве пищевого, кормового продукта или напитка, включая, но без ограничения, сыр, молоко, обезжиренное молоко, сквашенное молоко, кефир, сгущенное молоко, пастообразные продукты, маргарины, йогурт, мороженое, сухое молоко, масло, EMC (модифицированный ферментированный сыр), вареное сгущенное молоко, забеливатель для кофе; сливки для кофе, сливки, топленое масло, аналог молочного продукта и т.д. Сыр может представлять собой сыр любого вида, например молодой сыр, твердый сыр, творожный сыр, сливочный сыр, сыр с белой плесенью, сыр с голубой плесенью и плавленый сыр. Примерами молодого сыра являются сыр рикотта, сливочный сыр, сыр невшатель или деревенский сыр. Примерами твердых сыров являются честер, данбо, манчего, сен полен, чеддер, монтерей, колби, эдам, гауда, мюнстерский, сыр типа швейцарского, грюйер, эмментальский, пармиджано реджано, грана падано, пармезан, пекорино, проволоне и романо. Примерами творожного сыра являются сыр фета, сыр котиха, сыр паста филата, такой как моцарелла, и сыр кесо фреско. Примерами сыра с белой плесенью являются сыр бри и камамбер. Примерами сыра с голубой плесенью являются сыр горгонзола и дэниш блю.

Используемый здесь термин эндогенный относится к нуклеотидной или аминокислотной последовательности, которая в природе присутствует в данном хозяине.

Эндопептидазы, эндопротеиназы или эндопротеазы представляют собой ферменты, которые способны расщеплять пептидные связи нетерминальных аминокислот (то есть в пределах белка), в отличие от экзопептидаз, которые расщепляют пептидные связи с амино- или карбоксильного конца. Эндопептидазы не имеют тенденции к расщеплению пептидов на мономеры, но приводят к образованию относительно крупных пептидных фрагментов. Специфическое образование относительно крупных фрагментов является весьма предпочтительным во многих применениях, связанных с пищевыми и кормовыми продуктами. Конкретным примером эндопептидазы является олигопептидаза, субстратами которой являются олигопептиды вместо белков.

- 2 034253

Термин экспрессия включает любую стадию, вовлеченную в продукцию полипептида, включая, но без ограничения, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Экспрессионный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, функционально связанный с подходящими контрольными последовательностями (такими как промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции) для экспрессии и/или трансляции полинуклеотида in vitro или в клеткехозяине.

Экспрессионным вектором может являться любой вектор (например, плазмидный или вирусный), который легко может быть подвергнут процедурам рекомбинации ДНК и может осуществлять экспрессию полинуклеотида. Выбор вектора обычно будет зависеть от совместимости вектора с клеткой, в которую вектор следует ввести. Векторы могут быть линейными или циклически замкнутыми плазмидами. Вектор может быть автономно реплицирующимся, то есть вектором, который существует как внехромосомный организм, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, как, например, у плазмиды, внехромосомного элемента, мини-хромосомы или искусственной хромосомы. В качестве альтернативы вектор может быть таким, что при введении в клетку-хозяина он интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ми), в которую был интегрирован. Интегративный клонирующий вектор можно интегрировать в случайный или предварительно определенный локус мишени в хромосомах клетки-хозяина. Векторная система может представлять собой единичный вектор или плазмиду, либо два или более вектора или плазмид, которые вместе содержат тотальную ДНК для того, чтобы их можно было ввести в геном клетки-хозяина или в транспозон.

Клетка-хозяин, как определено здесь, представляет собой организм, подходящий для генетической манипуляции, и который может быть культивирован при значениях клеточной плотности, применяемой в промышленном производстве целевого продукта, такого как полипептид согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой клетку-хозяина, обнаруживаемую в природе, или клеткухозяина, полученную из родительской клетки-хозяина в результате генетической манипуляции или классического мутагенеза. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой рекомбинантную клеткухозяина.

Клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую, архебактериальную или эукариотическую клетку-хозяина. Прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой, но без ограничения, бактериальную клетку-хозяина. Эукариотическая клетка-хозяин может представлять собой, но без ограничения, клетку-хозяина дрожжей, грибов, амеб, водорослей, растения, животного или насекомого.

Используемый здесь термин гетерологичные относится к нуклеотидным или аминокислотным последовательностям, которые в природе не встречаются в данной клетке-хозяине. Другими словами, указанные нуклеотидные или аминокислотные последовательности не идентичны нуклеотидным или аминокислотным последовательностям, в природе встречающимся в данной клетке-хозяине.

Термин гибридизация означает спаривание в основном комплементарных цепей олигомерных соединений, таких как нуклеиновые кислоты.

Гибридизация может быть выполнена в условиях низкой, средней или высокой жесткости. Гибридизация в условиях низкой жесткости включает гибридизацию в 6Х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при температуре примерно 45°С с последующими двумя промывками в 0,2Х SSC, 0,1% SDS при температуре не менее 50°С (температура промывок может быть повышена до 55°С для условий низкой жесткости). Гибридизация в условиях средней жесткости включает гибридизацию в 6Х SSC при температуре примерно 45°С с последующей одной или несколькими промывками в 0,2Х SSC, 0,1% SDS при 60°С, и гибридизация в условиях высокой жесткости включает гибридизацию в 6Х SSC при температуре около 45°С с последующей одной или несколькими промывками в 0,2Х SSC, 0,1% SDS при 65°С.

Нуклеотидная или полинуклеотидная последовательность определена в настоящем документе как нуклеотидный полимер, содержащий по меньшей мере 5 нуклеотидов или нуклеотидных звеньев. Нуклеотид или нуклеиновая кислота относится к РНК и РНК.

Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотидная последовательность используются здесь взаимозаменяемо.

Пептид относится к короткой цепи аминокислотных остатков, связанных пептидными (амидными) связями. Самый короткий пептид, дипептид, состоит из 2 аминокислот, соединенных простой пептидной связью.

Термин полипептид относится к молекуле, содержащей аминокислотные остатки, связанные пептидными связями и содержащие более пяти аминокислотных остатков. Используемый здесь термин белок является синонимом термину полипептид и может также относиться к двум или более полипептидам. Таким образом, термины белок и полипептид могут быть использованы взаимозаменяемо. Полипептиды могут быть необязательно модифицированы (например, гликозилированы, фосфорилированы, ацилированы, фарнезилированы, пренилированы, сульфонированы и т.д.) для добавления функциональности. Полипептиды, проявляющие активность в присутствии специфического субстрата в определенных условиях, могут называться ферментами. Следует понимать, что вследствие вырожденности генетического кода может быть получено множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих

- 3 034253 один полипептид.

Изолированный фрагмент нуклеиновой кислоты представляет собой фрагмент нуклеиновой кислоты, который не существует в природе в виде фрагмента и не обнаруживается в природном состоянии.

Используемый здесь термин изолированный полипептид означает полипептид, который отделен по меньшей мере от одного компонента, например другого полипептидного материала, с которым он ассоциирован в природе. Изолированный полипептид может не содержать какие-либо другие примеси. Изолированный полипептид может иметь чистоту по меньшей мере 50%, например по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9% по результатам анализов методом SDS-PAGE или любого другого аналитического метода, подходящего для этой цели и известного специалисту в данной области. Изолированный полипептид может продуцироваться рекомбинантной клеткой-хозяином.

Зрелый полипептид определяется в настоящем документе как полипептид в его конечной форме и получен в результате трансляции мРНК в полипептид и посттрансляционных модификаций указанного полипептида. Посттрансляционные модификации включают N-концевой процессинг, C-концевое усечение, гликозилирование, фосфорилирование и удаление лидерных последовательностей, таких как сигнальные пептиды, пропептиды и/или препропептиды, путем расщепления.

Последовательность, кодирующая зрелый полипептид означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид.

Используемый в настоящем документе термин конструкция нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты, одноцепочечной или двухцепочечной, которая выделена из существующего в природе гена или которая модифицирована таким образом, что содержит сегменты нуклеиновых кислот, которые объединены и наложены друг на друга таким образом, который не встречается в природе. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термину кассета экспрессии, если конструкция нуклеиновой кислоты содержит все контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности, при этом указанные контрольные последовательности функционально связаны с указанной кодирующей последовательностью.

Пролин-специфическая эндопротеаза представляет собой протеазу, которая гидролизует белок или пептид в положении, в котором белок или пептид содержит остаток пролина. Пролин-специфическая эндопротеаза может обладать активностью пролин-специфической эндопротеазы и/или пролинспецифической олигопептидазы (EC3.4.21.26). Пролин-специфическая эндопротеаза предпочтительно представляет собой фермент, который гидролизует пептидную связь на карбокси-конце остатков пролина, что приводит к образованию пептидного и/или полипептидного фрагмента с C-концевым пролином.

Термин промотор определен в настоящем документе как последовательность ДНК, которая связывается с РНК-полимеразой и направляет полимеразу в правильный нижележащий сайт начала транскрипции нуклеотидной последовательности для инициации транскрипции.

Термин рекомбинантная (рекомбинантный) при использовании в отношении клетки, нуклеиновой кислоты, белка или вектора означает, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка, или путем изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не найдены в нативной (не рекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые в ином случае аномально экспрессируются, экспрессия которых снижена или отсутствует совсем. Термин рекомбинантный является синонимом генетически модифицированный и трансгенный.

Термины идентичность последовательностей или гомология последовательностей используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Для целей данного изобретения в настоящем документе принимается, что для выявления процента гомологии или идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты указанные последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения. Для оптимизации выравнивания между двумя последовательностями могут быть введены разрывы (гэпы) в любую из двух сравниваемых последовательностей. Такое выравнивание может быть проведено по всей длине сравниваемых последовательностей. Альтернативно выравнивание может быть проведено по более короткой длине, например около 20, около 50, около 100 или более нуклеиновых кислот/оснований или аминокислот. Идентичность последовательностей представляет собой процент идентичных совпадений между двумя последовательностями по указанной выровненной области. Процент идентичности последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определен с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша для выравнивания двух последовательностей. (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности могут быть выровнены с помощью указанного алгоритма. Алгоритм Нидлмана-Вунша внедрен в компьютерную программу NEEDLE. Для целей настоящего изобретения использовали программу NEEDLE пакета программ EMBOSS (версии 2.8.0 или более поздней, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genet- 4 034253 ics 16, (6) p. 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Для белковых последовательностей использовали матрицу замен EBLOSUM62. Для нуклеотидной последовательности использовали EDNAFULL. Оптимальными используемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, равный 10, и штраф за продление гэпа, равный 0,5. Специалист в данной области поймет, что все эти различные параметры будут давать несколько отличающиеся результаты, но что общая процентная идентичность двух последовательностей значительно не изменяется при использовании разных алгоритмов.

После выравнивания с помощью описанной выше программы NEEDLE процент идентичности последовательностей между последовательностью запроса и последовательностью согласно изобретению рассчитывают следующим образом: число соответствующих положений в выравнивании, показывающее идентичную аминокислоту или идентичный нуклеотид в обеих последовательностях, деленое на общую длину выравнивания после вычитания общего числа гэпов в выравнивании. Идентичность, определенная здесь, может быть получена из NEEDLE путем использования опции NOBRIEF и обозначена на выходе программы как идентичность наибольшей длины.

Последовательности нуклеиновой кислоты и белковые последовательности согласно настоящему изобретению, кроме того, могут быть использованы в качестве последовательности запроса для проведения поиска в общедоступных базах данных, например для идентификации других представителей семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут проводиться с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиски нуклеотидов в режиме BLAST могут проводиться с использованием программы NBLAST, где шкала =100, длина слова =12, с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Поиски белковых последовательностей по BLAST могут проводиться с использованием программы XBLAST, где шкала =50, длина слова =3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам по настоящему изобретению. В варианте выравнивания с включением гэпов для целей сравнения может быть использована гэпированная версия программы Gapped BLAST, описанная Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. В случае программ BLAST и Gapped BLAST может быть использовано введение по умолчанию параметров соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. веб-страницу National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Термин в основном чистый, используемый в отношении полипептидов, относится к полипептидному препарату, который содержит не более 50 мас.% другого полипептидного материала. Раскрытые в настоящем документе полипептиды предпочтительно находятся в основном в чистой форме. В частности, предпочтительно, чтобы раскрытые здесь полипептиды находились по существу, в чистой форме, то есть чтобы полипептидный препарат, по существу, не содержал другого полипептидного материала. При необходимости полипептид может также, по существу, не содержать неполипептидного материала, такого как нуклеиновые кислоты, липиды, компоненты среды и т.п. В настоящем документе термин в основном чистый полипептид является синонимом терминам изолированный полипептид и полипептид в изолированной форме. Термин в основном чистый в отношении полинуклеотида относится к полинуклеотидному препарату, который содержит не более 50 мас.% другого полинуклеотидного материала. Раскрытые здесь полинуклеотиды предпочтительно находятся в основном в чистой форме. В частности, предпочтительно, чтобы раскрытый здесь полинуклеотид находился по существу, в чистой форме, то есть чтобы полинуклеотидный препарат, по существу, не содержал другого полинуклеотидного материала. При необходимости полинуклеотид может также, по существу, не содержать неполинуклеотидного материала, такого как полипептиды, липиды, компоненты среды и т.п. В настоящем документе термин в основном чистый полинуклеотид является синонимом терминам изолированный полинуклеотид и полинуклеотид в изолированной форме.

Синтетическую молекулу, такую как синтетическая нуклеиновая кислота или синтетический полипептид, получают путем in vitro химического или ферментативного синтеза. Она включает, но без ограничения, варианты последовательностей нуклеиновых кислот, полученные с использованием оптимизированных кодонов для предпочтительных организмов-хозяев.

Синтетическая нуклеиновая кислота может быть оптимизирована по кодонам, предпочтительно в соответствии со способами, описанными в WO 2006077258 и/или WO 2008000632, которые включены здесь посредством ссылки. В WO 2008000632 описана оптимизация пар кодонов. Оптимизация пар кодонов представляет собой способ, в котором нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, были модифицированы с точки зрения используемых в них кодонов, в частности используемых пар кодонов, для обеспечения улучшенной экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, и/или улучшенного продуцирования кодированного полипептида. Пары кодонов определены как набор из двух последовательных триплетов (кодонов) в кодирующей последовательности. Специалистам в данной области известно, что использование кодонов необходимо адаптировать в зависимости от вида хозяина, что, возможно, приведет к получению вариантов со значительным отклонением по гомологии от SEQ ID NO: 1, но все еще кодирующих полипептид в соответствии с изобретением.

Используемые здесь термины вариант, производное, мутант или гомолог могут быть использованы взаимозаменяемо. Они могут относиться к полипептидам или нуклеиновым кислотам. Вари

- 5 034253 анты включают замены, вставки, делеции, усечения, трансверсии и/или инверсии в одной или нескольких локализаций относительно референсной последовательности. Варианты могут быть сделаны, например, с помощью сайт-насыщающего мутагенеза, сканирующего мутагенеза, инсерционного мутагенеза, неспецифического мутагенеза, сайт-направленного мутагенеза и направленной эволюции, а также различных других рекомбинантных подходов, известных специалисту в данной области. Различные гены нуклеиновых кислот могут быть синтезированы искусственно с помощью известных технологий в данной области.

Описание чертежа

Вектор pGBTOP-16, используемый для клонирования гена GLA. Вектор pGBTOP-16 получен из вектора pGBTOP-12, описанного в WO 2011009700. В дополнение к pGBTOP-12 он содержит ген ccdB из E. coli для положительной селекции в отношении присутствия вставки между сайтами клонирования EcoRI и PacI. Сайт рестрикции PacI заменяет сайт рестрикции SnaBI, присутствующий в pGBTOP-12. Этот вектор линеаризован путем расщепления с помощью NotI перед трансформацией.

Подробное описание изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему активностью пролин-специфической эндопротеазы, выбранному из группы, состоящей из

i. полипептида, содержащего последовательность зрелого полипептида, представленную в SEQ ID NO: 2;

ii. полипептида, который имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности зрелого полипептида, представленной в SEQ ID NO: 2;

iii. полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в условиях средней жесткости, предпочтительно в условиях высокой жесткости с цепью, комплементарной последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1;

iv. полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду, который представляет собой изолированный, в основном чистый, чистый, рекомбинатный, синтетический или вариантный полипептид описанного здесь полипептида.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к изолированному полипептиду, обладающему активностью пролин-специфической эндопротеазы, содержащему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Описанная здесь пролин-специфическая эндопротеаза может быть получена из Rasamsonia emersonii. Выражение полученный из или может быть получен из в отношении происхождения раскрытого здесь полипептида означает, что при проведении поиска BLAST с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением указанный полипептид согласно настоящему изобретению может быть получен из природного источника, такого как микробная клетка, при этом эндогенный полипептид показывает самый высокий процент гомологии или идентичности с описанным здесь полипептидом.

Предпочтительно полипептид, содержащий пролин-специфическую эндопротеазу, обеспеченную настоящим изобретением, является относительно термически устойчивым. Удивительным образом было обнаружено, что полипептид согласно настоящему изобретению является более термически устойчивым, чем пролин-специфическая эндопротеаза из Aspergillus niger. Было обнаружено, что полипептид согласно настоящему изобретению обладает по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 55%, или по меньшей мере 60% остаточной активностью после пребывания полипептида при температуре по меньшей мере 70°С в течение 15 мин, например при 70°С в течение 15 мин или при 71°С в течение 15 мин, при этом активность измеряли с помощью Ацетил AlaAlaPro-пара-нитроанилина (Ac-AAP-pNA) в качестве субстрата. Таким образом, описанную здесь пролин-специфическую эндопротеазу можно легко использовать для производства пищевых продуктов, при этом в пищевой промышленности желательно использовать фермент при более высоких температурах, например во время приготовления затора в процессе производства пива.

Предпочтительно предлагаемый в изобретении полипептид может представлять собой полипептид, который имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности зрелого полипептида, представленной в SEQ ID NO: 2. Полипептид согласно SEQ ID NO: 2 содержит пре-про-последовательность. При секреции полипептида через мембрану клетки хозяина происходит удаление пре-про-последовательности, такой как аминокислоты с 1 по 35, с 1 по 36, с 1 по 37, с 1 по 38, с 1 по 39, с 1 по 40, с 1 по 41, с 1 по 42, с 1 по 43, с 1 по 44, с 1 по 45, с 1 по 46, с 1 по 47, с 1 по 48, с 1 по 49, с 1 по 50 или с 1 по 51 последовательности SEQ ID NO: 2. Последовательность зрелого полипептида, обладающая активностью пролин-специфической эндопротеазы, представленная в SEQ ID NO: 2, может содержать аминокислоты с 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или 51 по аминокислоты 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520 или 526 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом аминокислота метионин в положении 1 в SEQ ID NO: 2 обозначена

- 6 034253 номером 1. Последовательность зрелого полипептида, представленная в SEQ ID NO: 2, может включать или содержать аминокислоты с 36 по 526 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом аминокислоте метионину в положении 1 в SEQ ID NO: 2 присвоен номер 1.

Полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть кодирован любой подходящей полинуклеотидной последовательностью. Обычно полинуклеотидная последовательность представляет собой последовательность, оптимизированную по кодонам или парам кодонов для экспрессии полипептида, описанного здесь, в конкретной клетке-хозяине.

Полипептид, описанный здесь, может быть кодирован полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях средней жесткости, предпочтительно в условиях высокой жесткости с цепью, последовательность которой комплементарна последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 представляет собой кодон-оптимизированную полинуклеотидную последовательность для экспрессии полипептида, описанного здесь, в клетке-хозяине Aspergillus niger.

Полипептид, описанный здесь, может быть также кодирован нуклеиновой кислотой, которая имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1.

Полипептид, обладающий активностью пролин-специфической эндопротеазы, как описано здесь, может также представлять собой вариант зрелого полипептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, содержащую замену, делецию и/или вставку в одном или нескольких положениях зрелого полипептида SEQ ID NO: 2. Вариант зрелого полипептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, может представлять собой аминокислотную последовательность, которая отличается на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислот от аминокислот зрелого полипептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение характеризует биологически активный фрагмент описанного здесь полипептида.

Биологически активные фрагменты полипептида согласно изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, в достаточной мере идентичные аминокислотной последовательности белка, пролин-специфической эндопротеазы, или полученные из нее (например, зрелая аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 2), которые включают меньшее число аминокислот, чем белок полной длины, но проявляют по меньшей мере одну биологическую активность соответствующего белка полной длины. В типичном случае биологически активные фрагменты включают домен или мотив по меньшей мере с одной активностью, свойственной белку, пролинспецифической эндопротеазе. Биологически активный фрагмент может, например, содержать каталитический домен. Биологически активный фрагмент белка по настоящему изобретению может представлять собой полипептид, который включает, например, 10, 25, 50, 100 или более аминокислот в длину. Кроме того, рекомбинантными методиками могут быть получены другие биологически активные части, в которых делетированы другие области белка, и оценены на наличие одной или более биологических активностей, свойственных нативной форме полипептида по настоящему изобретению.

В изобретении также предлагаются фрагменты нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные выше биологически активные фрагменты белка, пролин-специфической эндопротеазы.

Полипептид согласно настоящему изобретению может представлять собой слитый белок. Методы для получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды так, чтобы они находились в рамке. Экспрессия слитого полипептида находится под контролем одного и того же промотора(ов) и терминатора. Гибридные полипептиды могут содержать комбинацию частичных или полных полипептидных последовательностей, полученных по меньшей мере из двух различных полипептидов, где один или более могут являться гетерологичными для клетки-хозяина. Такие слитые полипептиды по меньшей мере из двух различных полипептидов могут содержать связывающий домен из одного полипептида, функционально связанный с каталитическим доменом из второго полипептида. Примеры слитых полипептидов и слитых сигнальных последовательностей описаны, например, в WO 2010121933, WO 2013007820 и WO 2013007821.

Полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть получен из любого подходящего эукариота. Эукариотическая клетка может представлять собой клетку млекопитающего, насекомого, растения, гриба или водорослей.

Полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть также получен из клетки мицелиального гриба или клетки термофильного мицелиального гриба. Предпочтительные клетки мицелиальных грибов принадлежат к видам рода Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Myceliophthora, Penicillium, Talaromyces, Rasamsonia, Thielavia, Fusarium или Trichoderma, Amorphotheca, Pseudocercosporella, Trametes, Rhizomucor, Calcarisporiella, Thermomyces, Thermoascus, Cornyascus, Myricoccum, Scytalidium, Chaetomium, Paecilomyces, Corynascus, Malbranchea, Stilbella, Thermomyces, Dactylomyces, Humicola, Chaetomium, Melanocarpus, Rhizomucor, Lentinula, Anaeromyces, и наиболее предпочтительно принадлежат видам Aspergillus niger, Acremonium alabamense, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Rasamsonia emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium oxysporum, Myceliophthora thermophila, Trichoderma reesei, Thielavia terrestris,

- 7 034253

Penicillium chrysogenum, Amorphotheca resinae, Aureobasidium pullulans, Pseudocercosporella herpotrichoides, Trametes versicolor 52J, Rhizomucor pusillus, Calcarisporiella thermophila, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lanuginosus, Thermoascus auratiacus, Cornyascus thermophilus, Myricoccum thermophilum, Scytalidium thermophilum, Myceliophthora hinnulea, Chaetomium thermophilum, Paecilomyces byssochlamydoides, Corynascus sepedonium, Malbranchea cinnamonmea, Thielavia australiensis, Stilbella thermophila, Thermomyces stellatus, Talaromyces emersonii, Dactylomyces thermophilus, Humicola hyalothermophilia, Acremonium thermophilum, Chaetomium olivicolor, Melanocarpus albomyces, Rhizomucor miehei, Lentinula edodes или Anaeromyces mucronatus. Предпочтительно полипептид получен из Rasamsonia emersonii.

Полипептид в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой полипептид природного происхождения, или генетически модифицированный, или рекомбинантный полипептид.

Полипептид, описанный здесь, может быть очищенным. Очистка белка известна специалистам в данной области.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей описанный здесь полипептид.

Описанная здесь композиция может содержать носитель, вспомогательное вещество, дополнительный фермент или другие соединения. Как правило, композиция или состав содержит соединение, с которым может быть составлена пролин-специфическая эндопротеаза. Используемое здесь вспомогательное вещество представляет собой неактивное вещество, составленное вместе с полипептидом, описанным здесь, например сахарозу или лактозу, глицерин, сорбитол или хлорид натрия. Композиция, содержащая описанный здесь полипептид, может представлять собой жидкую композицию или твердую композицию. Жидкая композиция обычно содержит воду. При составлении в виде жидкой композиции указанная композиция, как правило, содержит компоненты, которые понижают активность воды, такие как глицерин, сорбитол или хлорид натрия (NaCl). Твердая композиция, содержащая описанный здесь полипептид, может содержать гранулят, содержащий фермент, или композиция содержит инкапсулированный полипептид в жидких матрицах, таких как липосомы, или гели, таких как альгинат или каррагинаны. Существует много технологий, известных в данной области, для инкапсулирования или гранулирования полипептида или фермента (см., например, G.M.H. Meesters, Encapsulation of Enzymes and Peptides, Chapter 9, in N.J. Zuidam and V.A. Nedovic (eds.) Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and food processing 2010). Описанная здесь композиция может также включать носитель, содержащий описанный здесь полипептид. Описанный здесь полипептид может быть связан или иммобилизован на носитель с помощью известных в данной области технологий.

Настоящее изобретение также относится к процессу приготовления композиции, содержащей описанный здесь полипептид, при этом указанный процесс может включать сушку распылением ферментационной среды, содержащей полипептид, или гранулирование, или инкапсулирование описанного здесь полипептида и приготовление композиции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей описанный здесь полипептид, которая имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, или последовательности, кодирующей зрелый полипептид, представленной в SEQ ID NO: 1. Описанная здесь полинуклеотидная последовательность может содержать SEQ ID NO: 1 или может содержать последовательность, кодирующую зрелый полипептид, представленную в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения описана нуклеиновая кислота, которая представляет собой изолированную, в основном чистую, чистую, рекомбинантную, синтетическую или вариантную нуклеиновую кислоту нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 1. Например, вариантная нуклеотидная последовательность может быть по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO: 1.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему описанный здесь полинуклеотид, функционально связанный с одной или более чем одной контрольной последовательностью(ми), которая направляет экспрессию полипептида на экспрессию в клетке-хозяине.

Существует несколько способов вставки нуклеиновой кислоты в конструкцию нуклеиновой кислоты или экспрессионный вектор, которые известны специалистам в данной области, см., например, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Также может быть желательно манипулировать нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид согласно настоящему изобретению, с помощью контрольных последовательностей, таких как промоторные и терминаторные последовательности.

Промотор может представлять собой любую соответствующую промоторную последовательность, подходящую для эукариотической или прокариотической клетки-хозяина, которая демонстрирует транскрипционную активность, включая мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из полинуклеотидов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, эндогенные (нативные) или гетерологичные (чужеродные) для клетки. Промотор может представлять собой конститутивный или индуцируемый промотор. Предпочтительно промотор представляет собой индуцируемый промотор, например индуцируемый крахмалом промотор. Промоторы, подходящие для использования в

- 8 034253 мицелиальных грибах, представляют собой промоторы, которые могут быть выбраны из группы, включающей, но без ограничения, промоторы, полученные из полинуклеотидов, кодирующих TAKA амилазу A. oryzae; аспарагиновую протеиназу Rhizomucor miehei; промотор Aspergillus gpdA; нейтральную альфа-амилазу A. niger; устойчивую к действию кислоты альфа-амилазу A. niger; глюкоамилазу (glaA) A. niger или A. awamori; эндоксиланазу (xlnA) или бета-ксилозидазу (xlnD) A. niger или A. awamori., целлобиогидролазу I (CBHI) T. reesei; липазу R. miehei; щелочную протеазу A. oryzae; триозофосфат изомеразу A. oryzae; ацетамидазу A. nidulans; амилоглюкозидазу Fusarium venenatum (WO 0056900); Dania Fusarium venenatum (WO 0056900); Quinn Fusarium venenatum (WO 0056900); трипсинподобную протеазу Fusarium oxysporum (WO 96/00787); бета-глюкозидазу Trichoderma reesei; целлобиогидролазу I Trichoderma reesei; целлобиогидролазу II Trichoderma reesei; эндоглюканазу I Trichoderma reesei; эндоглюконазу II Trichoderma reesei; эндоглюконазу III Trichoderma reesei; эндоглюконазу IV Trichoderma reesei; эндоглюконазу V Trichoderma reesei; ксиланазу I Trichoderma reesei; ксиланазу II Trichoderma reesei; бета-ксилозидазу Trichoderma reesei; а также промотор NA2-tpi (гибрид промоторов из полинуклеотидов, кодирующих нейтральную альфа-амилазу A. niger и триозофосфат изомеразу A. oryzae), и их мутантные, усеченные и гибридные промоторы.

Может быть использован любой терминатор, который является функциональным в клетке, описанной здесь, известный специалисту в данной области. Примеры терминаторных последовательностей, подходящих для использования в мицелиальных грибах, включают терминаторные последовательности гена мицелиальных грибов, такие как из генов Aspergillus, например, из гена амилазы TAKA A. oryzae, генов, кодирующих глюкоамилазу (glaA) A. niger, антранилат синтазу A. nidulans, альфа-глюкозидазу A. niger, trpC и/или трипсинподобную протеазу Fusarium oxysporum.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей описанную здесь конструкцию нуклеиновой кислоты или экспрессионный вектор. Подходящая клетка-хозяин может представлять собой клетку млекопитающего, насекомого, растения, грибов, или водорослей, или клетку бактерий. Подходящая клетка-хозяин может представлять собой клетку грибов, например из рода Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Fusarium, Myceliophthora, Penicillium, Rasamsonia, Talaromyces, Thielavia, Trichoderma, Saccaromyces, Kluyveromyces, Pichia, например, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, A. oryzae, A. sojae, Talaromyces emersonii, Rasamsonia emersonii Chrysosporium lucknowense, Fusarium oxysporum, Myceliophthora thermophila, Thielavia terrestris или Trichoderma reesei, или Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris.

Клетка-хозяин может представлять собой рекомбинантную или трансгенную клетку-хозяина. Клетка-хозяин может быть генетически модифицирована конструкцией нуклеиновой кислоты или экспрессионным вектором, описанным здесь, с помощью стандартных методик, известных в данной области, таких как электропорация, трансформация протопласта или конъюгация, например, описанных в Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к процессу получения полипептида, описанного здесь, включающему культивирование клетки-хозяина в подходящей ферментационной среде в условиях, подходящих для получения и продуцирования полипептида. Специалисту в данной области будет понятно, как выполнить процесс для получения полипептида, описанного здесь, в зависимости от используемой клетки-хозяина, например pH, температуры и состава ферментационной среды. Клеткихозяева могут быть культивированы во встряхиваемых колбах или в ферментерах объемом от 0,5 до 1 л или более крупных до 10, 100 или более кубических метров. Культивирование может быть выполнено в аэробных или анаэробных условиях в зависимости от требований, предъявляемых клеткой-хозяином.

Предпочтительно описанный здесь полипептид извлекают или изолируют из ферментационной среды.

Полипептид, обладающий активностью пролин-специфической эндопротеазы, или композицию, содержащую описанный здесь полипептид, можно использовать в разнообразных применениях, например, в производстве пищевого или кормового продукта, таком как производство белкового гидролизата. Некоторые пищевые белки содержат высокоаллергенные субфракции, которые могут быть даже токсичными для определенных индивидуумов, такие как глютен, который содержит проламины с богатыми пролином пептидными последовательностями. Эти белки могут быть подвергнуты воздействию нового фермента для ослабления их антигенности или токсичности.

Группа людей, для которых глютен является токсичным, представляет собой индивидуумов, страдающих целиакией спру, также известной как глютеновая болезнь, которая представляет собой аутоиммунное заболевание тонкого кишечника, вызванное приемом внутрь клейковинных белков зерновых, таких как альфа-глиадин из пшеницы, хордеин из ячменя, секалин из ржи и авенин из овса.

Таким образом, полипептид, обладающий активностью пролин-специфической эндопротеазы, или композиция, содержащая описанный здесь полипептид, может быть использована в производстве диетической добавки или в качестве лекарственного средства для лечения пациента, страдающего цеаликией спру, и/или для лечения людей, не переносящих глютен.

Описанный здесь полипептид может быть также использован в качестве обрабатывающей добавки для гидролиза глютена в пищевом продукте.

- 9 034253

Таким образом, настоящее изобретение относится к процессу производства пищевого или кормового продукта, включающему инкубацию промежуточной формы пищевого или кормового продукта с полипептидом или композицией, содержащей описанный здесь полипептид, и производство пищевого или кормового продукта. Пищевой продукт в описанном здесь процессе включает напиток, такой как пиво, вино или фруктовый сок, или выпечку, или молочный продукт, но ими не ограничивается.

Инкубация промежуточной формы пищевого или кормового продукта с полипептидом или композицией, содержащей описанный здесь полипептид, может включать добавление полипептида или композиции, содержащей полипептид, в промежуточную форму пищевого или кормового продукта.

Процесс производства пищевого продукта может представлять собой процесс производства пива. Как правило, процесс производства пива включает затирание солода с получением затора и фильтрацию затора с получением сусла, кипячение сусла, например с хмелем, и сбраживание сусла путем инокуляции сусла дрожжами. После сбраживания процесс производства пива обычно включает фазу созревания и стабилизации, а также обычно фазу фильтрации, в зависимости от типа получаемого пива.

Промежуточная форма пищевого продукта может представлять собой любую подходящую форму пищевого продукта во время производства пищевого продукта. Промежуточная форма пива может представлять собой, например, затор, сусло, ферментативный бульон или молодое пиво. Молодое пиво, используемое здесь, представляет собой пиво, которое получено в результате первичного сбраживания, и обычно может содержать некоторое количество неосажденных дрожжей и нежелательные вкусовые компоненты. Промежуточная форма хлеба может представлять собой, например, тесто. Предпочтительно полипептид, обладающий активностью пролин-специфической эндопротеазы, или композиция, содержащая полипептид согласно настоящему изобретению, инкубируют с затором во время приготовления затора в процессе производства пива. Удивительным образом было обнаружено, что значительное количество вызывающих помутнение белков было уменьшено с помощью полипептида согласно настоящему изобретению во время приготовления затора. Таким образом, образование помутнения в конечном пиве может быть предотвращено. Предпочтительно, чтобы полипептид, обладающий активностью пролинспецифической эндопротеазы, согласно настоящему изобретению являлся активным во время приготовления затора, поскольку после приготовления затора отделенное сусло подвергают кипячению и фермент инактивируется. Это является предпочтительным, поскольку нежелательно, чтобы ферменты являлись активными в конечном пищевом продукте, таком как пиво.

Приготовление затора представляет собой процесс, во время которого крахмал распадается на сахара под действием природных ферментов, присутствующих в зерне, известных специалисту в данной области. Как правило, приготовление затора включает постепенное доведение солода, то есть смеси молотых зерен, таких как зерна ячменного солода, и воды до температуры примерно 45-52°С, затем до температуры от 72 до 76°С за определенный интервал времени, известный специалистам в данной области. Как правило, приготовление затора включает доведение солода до температуры 45-52°С, затем до температуры от 60 до 65°С, затем до температуры примерно от 71 до 76°С и необязательно до конечной температуры от 76 до 79°С.

После приготовления затора жидкую фракцию, также называемую сусло, отделяют от твердой фракции. Затем сусло обычно подвергают кипячению с дополнительными ингредиентами, такими как хмель. Во время кипячения сусла ферменты, присутствующие в сусле, инактивируются.

В одном варианте осуществления процесс производства пива включает инкубацию затора с полипептидом или композицией, содержащей описанный здесь полипептид, и производство пива.

Вызывающие помутнение белки представляют собой богатые пролином белки, которые могут взаимодействовать с полифенолами с образованием агрегатов белок-полифенол. Эти агрегаты белокполифенол вызывают образование помутнения, также называемого холодное помутнение в пиве. Соответственно в одном аспекте настоящее изобретение относится к использованию описанного здесь полипептида или описанной композиции для уменьшения помутнения в напитке. Напиток, используемый здесь, может представлять собой пиво.

Пищевой продукт и/или промежуточная форма пищевого продукта может содержать глютен.

Было обнаружено, что описанный здесь полипептид, обладающий активностью пролинспецифической эндопротеазы, способен гидролизовать токсичные эпитопы в глютене в нетоксичные фрагменты. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида или композиции, содержащей описанный здесь полипептид, для уменьшения содержания глютена в пищевом продукте.

Процесс производства пищевого продукта в соответствии с настоящим изобретением может включать стадию пастеризации пищевого продукта. Пастеризация обычно включает нагрев пищевого продукта или промежуточной формы пищевого продукта, например путем доведения пищевого продукта или промежуточной формы пищевого продукта до температуры в диапазоне от 60 до 68°С в течение периода времени от 10 до 20 мин или от 12 до 18 мин или до температуры 70-74°С, такой как примерно 72°С, в течение периода времени по меньшей мере 5, 10 или 15 с.

Пищевой продукт в описанном здесь процессе также может представлять собой белковый гидролизат. Таким образом, настоящее изобретение относится к процессу производства белкового гидролизата,

- 10 034253 включающему приведение в контакт белкового субстрата с полипептидом или описанной здесь композицией и получение белкового гидролизата. Белковый гидролизат может быть получен из любого подходящего белкового субстрата, например белкового субстрата, который богат остатками пролина, такими как глютен в зерновых или казенны в коровьем молоке.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к пищевому продукту, который может быть получен с помощью описанного здесь процесса производства пищевого продукта.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение.

Примеры

Материалы и методы

Пример 1. Клонирование, экспрессия и извлечение BC2G079 пролин-специфической эндопротеазы (PEP).

Пример 1.1. Клонирование и экспрессия.

Белковая последовательность пролин-специфической эндопротеазы (PEP) Rasamsonia emersonii показана в SEQ ID NO: 2 и названа BC2G079 PEP.

Разработана кодон-адаптированная последовательность ДНК для экспрессии этого белка в Aspergillus niger, содержащая дополнительные сайты рестрикции для субклонирования в экспрессионный вектор Aspergillus. Адаптацию по кодонам выполняли, как описано в WO 2008000632. Кодон-оптимизированная последовательность ДНК для A. niger гена, кодирующего белок PEP последовательности SEQ ID: NO: 2, показана в SEQ ID NO: 1.

Последовательность инициации трансляции промотора глюкоамилазы glaA модифицировали в 5'CACCGTCAAA ATG-3' и оптимальную последовательность терминации трансляции 5'-TAAA-3' использовали для создания экспрессионной конструкции (как подробно описано также в WO 2006077258). Фрагмент ДНК, содержащий часть промотора глюкоамилазы и ген, кодирующий PEP, синтезировали полностью, очищали и расщепляли с помощью EcoRI и PacI Вектор pGBTOP-16 (см. чертеж), линеаризовали путем расщепления с помощью EcoRI/PacI и фрагмент линеаризованного вектора затем очищали путем экстракции из геля. Фрагмент ДНК, содержащий PEP-кодирующий участок, клонировали в вектор pGBTOP-16 с получением pGBTOP-PEP. Затем GBA 306 A. niger (AglaA, ApepA, AhdfA, адаптированный ампликон BamHI, негативный по альфа-амилазе и глюкоамилазе штамм AamyBII, AamyBI, AamyA) трансформировали линеаризованным вектором pGBTOP-PEP путем расщепления с помощью NotI, в протоколе совместной трансформации линеаризованным pGBAAS-4, с использованием штамма и способов, описанных в заявке WO 2011009700 и приведенных в ней ссылках, и отбирали на ацетамидсодержащей среде и колонию очищали согласно стандартным процедурам. Трансформацию и отбор выполняли, как описано в WO 9846772 и WO 9932617. Штаммы, содержащие ген PEP, кодирующий BC2G079 PEP, отбирали посредством PCR с праймерами, специфическими для гена PEP, для подтверждения присутствия экспрессионной кассеты pGBTOP-PEP. Отбирали единичный трансформант, названный PEP1, и затем высевали методом реплик с получением одноштаммового инокулята.

Пример 1.2. Продуцирование BC2G079 PEP в штамме PEP1 A. niger.

Готовили свежие споры PEP-1 A. niger. Каждую из 4 встряхиваемых колб объемом 500 мл, снабженных перегородками и содержащих 100 мл ферментационной среды 1 (10% мас./об. Corn Steep Solids, 1% мас./об. глюкозы-Н^, 0,1% мас./об. NaH₂PO₄-H₂O, 0,05% мас./об. MgSO₄-7H₂O, 0,025% мас./об. Basildon, pH 5,8), инокулировали 10⁷ спор. Эти предварительные культуры инкубировали при 34°С и 170 об/мин в течение 16-24 ч. Из предварительных культур 50 мл использовали для инокуляции 1 встряхиваемой колбы объемом 5 л, содержащей 1 л ферментационной среды 2 (15% мас./об. мальтозы, 6% мас./об. Bacto-Soytone, 1,5% мас./об. (NH₄)₂SO₄, 0,1% мас./об. NaH₂PO₄-H₂O, 0,1% мас./об. MgSO₄-7H₂O, 0,1% мас./об. L-аргинина, 8% мас./об. Tween-80, 2% мас./об. Basildon, 2% мас./об. MES, pH 5,1), и встряхивали при 34°С и 170 об/мин. Через 3, 4, 5 и 6 дней инкубации pH культуры понижали до pH 5,0 с помощью 2N HCl и образцы, взятые в каждый указанный момент времени, анализировали на активность PEP. Отбирали образцы объемом 50 мл, супернатант отделяли от биомассы путем центрифугирования и затем фильтровали. Образцы с самой высокой активностью использовали для характеристики полученной PEP.

Пример 1.3. Продуцирование референсной пролин-специфической эндопротеазы из A. niger.

Пролин-специфическая эндопротеаза из A. niger известна из WO 2002046381. Белковая последовательность пролин-специфической эндопротеазы (PEP) из A. niger показана в SEQ ID NO: 5, в которой первые 17 аминокислот представляют собой сигнальную последовательность пектинметилэстеразы A. niger (PMeA ss; SEQ ID NO: 3) и следующая часть содержит 19 аминокислот пропоследовательности пролин-специфической эндопротеазы A. niger (SEQ ID NO: 4).

Экспрессию и получение PEP из A. niger выполняли таким же способом, который описан в примере

1.1. и 1.2. PEP A niger использовали в качестве референсного фермента в примере 2.

Пример 2. Измерение активности пролин-специфической эндопротеазы (PEP).

100 мкл полученного в примере 1 супернатанта культуры, разбавленного в 0,1М буферном растворе ацетата натрия при pH 4,5 с помощью 50 мМ NaCl, инкубировали с 100 мкл 6 мМ Ac-AAP-pNA (ацетилAlaAlaPro-паранитроанилин от фирмы Selleckchem или CPC Scientific; чистота >95,0% по данным анализа HPLC) в 0,1 М буферном растворе NaAc при pH 4,5 с 50 мМ NaCl, в 96-луночном планшете фирмы

- 11 034253

Nunc с плоским дном MTP (микротитровальный планшет). Через 60 мин при 20°С реакцию останавливали путем добавления 40 мкл 1M HCl. Высвобождение pNA из PEP измеряли на спектрофотометре Tecan MTP при длине волны 405 нм (A405) (www.tecan.com). Контрольный образец готовили путем смешивания разбавленного супернатанта культуры с раствором субстрата, который предварительно был смешан с раствором HCl. Активность выражали в единицах pNASU. Единица pNASU представляет собой количество фермента, которое освобождает из Ac-AAP-pNA за 1 ч количество pNA, которое соответствует увеличению поглощения при 405 нм 1 OD с использованием условий, описанных выше. Величина A405 не должна быть ниже контрольной величины в начале реакции, или выше 2,5 в конце реакции, или A405 не может превышать линейный диапазон используемого спектрофотометра.

Таблица 1. Относительная активность BC2G079 PEP по сравнению с референсной PEP

Описание	Активность (pNASU/мл)	Специфическая активность (pNASU/мг)
Референсная РЕР	100%	100%
BC2G079 РЕР	171%	150%

Для сравнения специфической активности BC2G079 PEP с референсной PEP белковые концентрации соответственно BC2G079 PEP и референсной PEP определяли путем измерения поглощения при длине волны 280 нм после гель-фильтрации на колонке PD10 для удаления низкомолекулярных соединений, которые могут препятствовать измерению при 280 нм. Количественный анализ SDS-PAGE, проведенный, как описано в WO 2013160316, показал, что более 80% присутствующего белка представляет собой искомую PEP. Коэффициент экстинкции рассчитывали с использованием инструмента Prot Param, как описано на сайте http://web.expasy.org/protparam/. Зрелую последовательность SEQ ID NO: 2 (аминокислоты 36-526) использовали для расчета коэффициента экстинкции для BC2G079 PEP ^280^^^=2,81). Зрелую последовательность SEQ ID NO: 5 (аминокислоты 37-521) использовали для референсной PEP ^280^^=3,05).

Пример 3. Термическая устойчивость BC2G079 пролин-специфической эндопротеазы (PEP).

Для оценки термической устойчивости BC2G079 PEP перед анализом активности проводили инкубацию аликвот объемом 100 мкл десятикратного разведения полученного в примере 1 супернатанта культуры в буфере (0,1 М NaAc, pH 4,5, с 50 мМ NaCl) при 55 и 65°С в течение 15 мин в планшете PCR в PCR-машине. Через 15 мин инкубации образцы быстро охлаждали до 25°С в PCR-машине. Измеряли pNASU/мл каждого образца. Исходную активность, измеренную до инкубации при повышенной температуре (0 мин), использовали в качестве контроля (100%) для определения остаточной активности.

Таблица 2. Активность пролин-специфической эндопротеазы BC2G079 PEP через 15 мин инкубации при 55 и 65°С.

Описание	Остаточная активность через 15 мин при 5 5 °C (pNASU)	Остаточная активность через 15 мин при 65°С (pNASU)
BC2G079 РЕР	105%	84%

Результаты в табл. 1 показывают, что BCG079 PEP, полученная из Rasamsonia emersonii, является относительно устойчивой при температуре 65°С.

Пример 5. Профиль термической устойчивости BC2G079 PEP по сравнению с референсной PEP из A. niger.

Для оценки профиля термической устойчивости BC2G079 PEP в более экстремальных условиях анализу активности предшествовала стадия нагрева. Аликвоты объемом 100 мкл полученного в примере 1 супернатанта культуры десятикратно разводили в буфере (0,1 М NaAc, pH 4,5, с помощью 50 мМ NaCl) и нагревали в температурной интервале в планшете PCR в PCR-машине. После инкубации в течение 15 мин образцы быстро охлаждали до 25°С в PCR-машине. Измеряли pNASU/мл каждого образца. Исходную активность, измеренную до инкубации при повышенной температуре (0 мин), использовали в качестве контроля (100%) для определения остаточной активности. Результаты в табл. 3 показывают, что пролинспецифическая эндопротеаза (BCG079) из Rasamsonia emersonii является в основном более термически устойчивой по сравнению с референсной пролин-специфической эндопротеазой из A. niger.

- 12 034253

Таблица 3. Остаточная активность пролин-специфической эндопротеазы BC2G079 PEP и референсной PEP из A.niger через 15 мин инкубации при различных температурах.

Температура инкубации (°C)	Остаточная активность референсной РЕР (pNASU/мл)	Остаточная активность BC2G079 (pNASU/мл)
51,4	100%
54,4	97%
59,0	93%
63,5		100%
64,5	76%
66,6		91%
69,3	24%
71,2		65%
72,4	1%
74,0	0%
76,7		11%
81,4		0%

Пример 6. Профиль pH-активности BC2G079 PEP.

Для оценки рабочего pH-диапазона BC2G079 PEP супернатант культуры и субстрат Ac-AAP-pNA разбавляли в буферах в диапазоне от pH 3,5 до pH 7 (0,1 М лимонная кислота/Na₂HPO4 с 50 мМ NaCl). Затем 100 мкл разбавленного супернатанта смешивали со 100 мкл 6 мМ раствора субстрата Ac-AAP-pNA в 96-луночном плоском планшете MTP. Реакцию останавливали через 60 мин при 20°С путем добавления 40 мкл 1 М NaOH. Активность PEP измеряли по увеличению поглощения при 405 нм. Результаты в табл. 4 показывают, что самая высокая активность для BC2G079 наблюдалась при pH=5,0, которую принимали за 100%, тогда как референсная PEP из A.niger показала самую высокую активность (100%) при pH=5,5. Общий профиль pH-активности BC2G079 сместился на 0,5 единиц pH в сторону рабочих условий с более кислым pH. Таким образом, BC2G079 PEP проявляет более высокую относительную активность при pH ниже 5,5 по сравнению с референсной PEP.

Таблица 4. Профиль pH-активности PEP BC2G079

pH	BC2G079 РЕР (pNASU/мл)	Референсная РЕР (pNASU/мл)
3,5	59%	54%
4,0	81%	68%
4,5	97%	78%
5,0	100%	97%
5,5	86%	100%
6,0	63%	92%
6,5	41%	60%
7,0	24%	34%

Пример 7. Эксперимент по приготовлению затора.

7.1. Способы.

Для определения PNACU аликвоту объемом 100 мкл смешивали в 96-луночном планшете Nunc с плоским дном MTP со 100 мкл 6 мМ Ac-AAP-pNA в 0,1 М буфере NaAc, pH 4,5, содержащем 50 мМ NaCl. Увеличение оптической плотности (OD) при длине волны 405 нм регистрировали в зависимости от времени на спектрофотометре Tecan MTP. PNACU рассчитывали из линейной части кривой, предпочтительно начального наклона. Анализ проводили при 20°С. Для измерения увеличения оптической плотности (OD) в течение достаточно длительного промежутка времени, оставаясь в пределах линейного диапазона детектора, образец фермента разбавляли соответственно 0,1 М буфером NaAc, pH 4,5, содержащим 50 мМ NaCl. Одна единица PNACU представляет собой количество фермента, которое высвобождает за 1 ч из Ac-AAP-pNA количество pNA, которое соответствует увеличению поглощения при длине волны 405 нм одной единицы OD.

Вызывающие помутнение белки измеряли с помощью таннометра с использованием инструкции по эксплуатации от фирмы Pfeuffer для этого метода. В образцы добавляли дубильную кислоту и помутнение, измеренное под углом рассеяния в 90°, выражали в единицах EBC и регистрировали при добавлении 2,5, 5 и 10 мг/л дубильной кислоты.

В качестве показателя содержания глютена определяли содержание глиадина в сусле с помощью конкурентного анализа Elisa (RIDASCREEN® Gliadin competitive (R-Biopharm)).

7.2. Деградация вызывающих помутнение белков и глютена во время приготовления затора.

- 13 034253

Деградацию вызывающих помутнение белков и глютена под действием термически устойчивого фермента BC2G079 PEP в процессе приготовления затора определяли и сравнивали с параметрами менее термически устойчивого референсного фермента PEP из A.niger. В одном эксперименте по приготовлению затора 5 мл термически устойчивого фермента BC2G079 PEP, содержащего 460 PNACU/мл, добавляли в 200 мл затора. В другом эксперименте по приготовлению затора добавляли 5 мл референсного фермента PEP, содержащего 460 PNACU/мл. Ферменты добавляли в начале процесса приготовления затора. В третьем эксперименте по приготовлению затора вместо ферментного раствора добавляли такой же объем водопроводной воды для контрольного сравнения.

Эксперименты по приготовлению затора в лабораторных условиях выполняли в заторном аппарате (Lochner Labor technik, Germany). Использовали 80 г молотого стандартного солода EBC в 200 мл воды. Затор ступенчато нагревали, как показано в табл. 5. Заторы непрерывно перемешивали при 100 об/мин во время процесса приготовления затора. В конце процесса приготовления затора его фильтровали через бумажный фильтр (Macherey-Nagel, MN614 ¹/₄, диаметр 320 мм). Фильтрат называется суслом. Отбирали образец сусла и анализировали на присутствие вызывающих помутнение белков и глютена, а также для определения активности пролин-специфической эндопротеазы (pNASU).

Таблица 5. Схема приготовления затора

Время от начала (мин)	Температура (°C)
0	50
15	50
28	63
43	63
55	75

Результаты по деградации вызывающих помутнение белков и глиадина показаны в табл. 6 и 7. Таблица 6. Количество вызывающих помутнение белков (измерено в единицах ЕВС) в образцах сусла из заторов, в которых не присутствовала PEP, и заторов, обработанных термически устойчивой BC2G079 PEP и референсной PEP

	Помутнение ЕВС после добавления дубильной кислоты
Образцы с	'уела
Дубильная кислота	Без РЕР	Референсная РЕР	Термоустойчивая РЕР
2,5 мг/л	1,2	0,7	0,3
5 мг/л	4,0	2,7	0,8
10 мг/л	9,3	6,2	1,5

Таблица 7. Содержание глиадина в сусле из заторов, в которых не присутствовала PEP, и заторов, обработанных термически устойчивой BC2G079 PEP и референсной PEP

Образцы сусла	Глиадин в ppm
Без РЕР	362
Референсная РЕР	135
Термически устойчивая РЕР	82

Результаты в табл. 6 и 7 показывают, что термически устойчивая PEP, такая как BC2G079, является гораздо более эффективной в отношении деградации вызывающих помутнение белков и глиадина в ходе процесса приготовления затора по сравнению с менее термически устойчивой референсной PEP. Остаточную активность PEP также определяли в конце процесса приготовления затора, описанного выше (табл. 8). Только термически устойчивая BC2G079 PEP остается активной, тогда как референсная PEP полностью инактивируется. Более высокая термическая устойчивость коррелирует с деградацией вызывающих помутнение белков и удалением глиадина. Данные по приготовлению затора показывают, что термически устойчивая PEP является предпочтительной для приготовления затора, поскольку термическая устойчивость значительно продлевает время, в течение которого PEP остается активной в процессе приготовления затора.

Таблица 8. Остаточная активность PEP в конце процесса приготовления затора

	Остаточная активность в конце приготовления затора (pNASU/мл)
Референсная РЕР	0%
Термически устойчивая РЕР	41%

Пример 8. Определение молекулярной массы зрелой PEP BC2G079 с помощью LC-MS.

Для анализа LC-MS зрелой PEP BC2G079 100 мкл образца полученного в примере 1.2. супернатанта

- 14 034253 ферментационной среды смешивали со 100 мкл 20% TCA (Chem Lab NV, Belgium). Этот раствор помещали на лед на 1 ч. После осаждения белков образец центрифугировали при 14000 об/мин и 4°С в течение 15 мин. После центрифугирования супернатант удаляли и осадок промывали один раз 500 мкл ацетона (-20°С, Sigma-Aldrich, Нидерланды) и центрифугировали при 14000 об/мин и 4°С в течение 10 мин. Супернатант удаляли и осадок растворяли в 50 мкл 50 мМ NaOH (Sigma-Aldrich, Нидерланды), а затем добавляли 350 мкл 100 мМ NH₄HCO₃ (Sigma-Aldrich, Нидерланды). Затем 200 мкл образца восстанавливали и алкилировали. Для восстановления в раствор добавляли 5 мкл TCEP (Sigma-Aldrich, Нидерланды) и инкубировали при комнатной температуре в термомиксере при 1000 об/мин в течение 30 мин. Для алкилирования добавляли 5 мкл 550 мМ IAA (йодацетамид, Sigma-Aldrich, Нидерланды) и инкубировали в термомиксере при 1000 об/мин в условиях темноты в течение 30 мин. Для дегликозилирования образца добавляли 20 мкл PNGase F (Promega, США). Образец инкубировали в термомиксере при 1000 об/мин при 37°С в течение ночи. На следующий день добавляли 1% муравьиную кислоту (Merk, Германия) для разбавления образца до концентрации 50 мкг/мл. Концентрацию белка измеряли с помощью набора Qubit quantitative protein assay (Life technologies). Образец анализировали на системе Acquity I-classSynapt G2-S (Waters, Великобритания) с использованием следующих параметров: колонка Waters Acquity UPLC BEH300 C4, 1,7 мкм, размер пор 300 А, 2,1*50 мм; температура колонки: 75°С; инжектируемый объем 1 мкл; подвижная фаза A: 0,1% муравьиная кислота в Mili-Q (Biosolve, Нидерланды); подвижная фаза B: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле (Biosolve, Нидерланды). В течение 15 мин на колонке применяли градиент путем изменения фаз A и B (от 20 до 50% B). Настройки MS-детектора представляли собой следующие: диапазон детектируемых масс 500-3500 m/z, время сканирования 1 с, положительный режим ESI, режим разрешения TOF MS, с коррекцией данных с использованием Leu-Enk (SigmaAldrich, Нидерланды) в качестве фиксированной массы в процессе работы в рабочем режиме. Деконволюцию спектральных данных, обдирку (изменения) зарядового состояния выполняли с помощью программного обеспечения Waters MassLynx MaxEnt1: выходное разрешение по массе=1 Да/канал; модель повреждения: Gaussian (FWHH=0,750 Да; минимальные величины интенсивностей=33% слева и справа); сходимость итерации.

После коррекции на алкилирование и дегликозилирование масс-спектр показал главные виды с молекулярной массой, соответствующей аминокислотам 36-526 последовательности SEQ ID NO 2. Кроме того, имелись второстепенные виды с молекулярной массой, соответствующей аминокислотам 41-526 последовательности SEQ ID NO 2. Таким образом, N-конец наиболее представленных видов в образце зрелой PEP BC2G079 соответствует RDPLHGPT и N-конец менее представленных видов начинается с GPTNAS. Оба вида показывают множественные пики на масс-спектре. Каждый пик сдвинут на 57 Да или множество 57 Да, что указывает на различие в алкилировании. Одно алкилирование добавляет 57 Да на цистеин. На спектре наблюдалось добавление 1, 3, 5 и 7 IAA в соответствии с присутствием 7 цистеинов в аминокислотной последовательности. Наблюдаемые массы для полностью алкилированных главных и второстепенных видов составляют соответственно 55218 Да и 54598 Да. Так как дегликозилирование добавляет дополнительно 1 Да на дегликозилированный участок, данные дают основание предположить, что 6-7 из теоретических 8 участков гликозилирования являются фактически гликозилированными.

- 15 034253

Перечень последовательностей <110> ДСМ АЙПИ АССЕТС Б.В.

<120> Пролин-специфическая эндопротеаза <130> 30254-WO-PCT <160> б <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 1580 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> Источник <222> 1..1580 <223> /организм=Искусственная последовательность /примечание=кодон-оптимизированная нуклеиновая кислота кодирующая пролин-специфическую эндопротеазу из

Rasamsom'a emersom'i BC2G079 для экспрессии в

A. niger /тип молекулы=не обозначенная ДНК

<400> 1 atgccctccc	tctcctccct	cgttgccttg	actgcttctc	ttgtctctct	ggctgctgcc	60
gctgctcctc	gtctccctct	tcctcctcgc	cctcccttgc	ctccccgtga	ccccttgcac	120
ggacctacca	acgcctccgc	cactttccag	cagctcatcg	accacaacca	ccccgagctt	180
ggcaccttct	cccagcgcta	ctggtggaat	gatgagttet	ggaagggtcc	cggctctccc	240
gttgtccttt	tcacccccgg	tgaagaagat	gccagcggtt	acgtgggcta	cctgaagaac	300
accaccatca	ccggtctgat	cgctcagacc	atcggtggtg	ccgtcatcgt	cctcgaacac	360
cgctactggg	gccagtcctc	cccctacgac	tctctgacca	ccaagaacct	gcagtacctg	420
accctcaagc	agtccattgc	cgacctcacc	tacttcgcca	agaccgtcaa	gctccccttc	480
gaccgcaacg	gcagctccaa	cgccgacaag	gctccctggg	ttctcagcgg	tggaagctac	540
tctggtgctc	tctccgcctg	gactgccagc	acctcccccg	gtactttctg	ggcctaccac	600
gccagctctg	ctcctgttga	ggccatctac	gattaetgge	agtaettege	tcccgtgcag	660
gatggattgc	ctgccaactg	ctcgaaggac	ctctcccgtg	tcgtcgacta	catcgactcc	720
gttctccagt	ccggcaacgc	cactgccaag	caacagctca	aggacctttt	cggtctgggt	780
getetggage	aegaegatga	cttcgcctcc	getettgaga	acggcccttg	gctctggcag	840
tcgaactcgt	tctacgaccc	ctaccctcct	gtetaegagt	tctgcgacta	cgttgagaac	900
gcctacgcca	gccctcccgt	tgctgctggt	cccgatggtg	ttggtctgga	gaaggetetg	960
tctggctacg	ccacctggtg	gaacaaggtc	ttcttccccg	gctactgcgc	tacctacggc	1020
tactggtcct	ccaacgactc	cattgcctgc	ttcgacacct	acaaccagtc	gtcgcccatg	1080
ttcaccgacc	tttccgtctc	caacactatc	aaccgccagt	ggaactggtt	cctctgcaac	1140
gagcccttct	tetaetggea	ggatggtgct	cccaagaacg	tccccagcat	tgtetetegt	1200
ctggtcactg	etgagtaetg	gcagcgccag	tgccccttgt	tcttccctga	agaggatggc	1260

- 16 034253 tacacctacg gaagcgccaa gggcaagact gctgccgatg tcaacgcctg gaccaagggc 1320 tggttcttga ctaacaccac ccgtctgatc tggaccaacg gcgagcttga cccctggcgc 1380 tctgctggtg tcagcagcaa gttccgtccc ggtggtcccc tccagtccac tccccaggct 1440 cctctgcagc tcattcccga gggtgtccac tgctacgatc tgatcctcaa gaacgccgag 1500 gccaacgccg gtgtgcagcg tgttgtcacc aacgaggttg ctcagatcaa ggcctgggtg 1560 aacgaatact

1580 <210> 2 <211> 526 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Rasamsonia em <400> 2

Met Pro ser Leu ser

5

Leu Ala Ala Ala Ala

Leu Pro Pro Arg Asp

Phe Gin Gin Leu lie

Gin Arg Tyr Trp Trp

Val Val Leu Phe Thr

Tyr Leu Lys Asn Thr

100

Gly Ala Val He Val

115

Tyr Asp ser Leu Thr

130 ser lie Ala Asp Leu

145

Asp Arg Asn Gly ser

165

Gly Gly ser Tyr ser

180

Pro Gly Thr Phe Trp

195 lie Tyr Asp Tyr Trp

210

Ala Asn cys ser Lys

225

Val Leu Gin ser Gly

245

Phe Gly Leu Gly Ala

260

Glu Asn Gly Pro Trp

275

Pro Pro Val Tyr Glu

290

Pro Pro Val Ala Ala

305 ser Gly Tyr Ala Thr

325

Ala Thr Tyr Gly Tyr

340

Thr Tyr Asn Gin ser

355

Thr lie Asn Arg Gin последовател rsoni i ser Leu Val Ala

Ala Pro Arg Leu

Pro Leu His Gly

Asp His Asn His

Asn Asp Glu Phe 70

Pro Gly Glu Glu

Thr lie Thr Gly

105

Leu Glu His Arg

120

Thr Lys Asn Leu

135

Thr Tyr Phe Ala

150 ser Asn Ala Asp

Gly Ala Leu ser

185

Ala Tyr His Ala

200

Gin Tyr Phe Ala

215

Asp Leu ser Arg 2 30

Asn Ala Thr Ala

Leu Glu His Asp

265

Leu Trp Gin ser

280

Phe Cys Asp Tyr

295

Gly Pro Asp Gly

310

Trp Trp Asn Lys

Trp ser ser Asn

345 ser Pro Met Phe

360

Trp Asn Trp Phe

Leu Thr Ala ser Leu 10

Pro Leu Pro Pro Arg

Pro Thr Asn Ala ser

Pro Glu Leu Gly Thr

Trp Lys Gly Pro Gly 75

Asp Ala ser Gly Tyr 90

Leu lie Ala Gin Thr

110

Tyr Trp Gly Gin ser 12 5

Gin Tyr Leu Thr Leu

140

Lys Thr Val Lys Leu

155

Lys Ala Pro Trp Val

170

Ala Trp Thr Ala ser

190 ser ser Ala Pro Val 205

Pro Val Gin Asp Gly

220

Val Val Asp Tyr lie

235

Lys Gin Gin Leu Lys

250

Asp Asp Phe Ala ser

270

Asn ser Phe Tyr Asp 285

Val Glu Asn Ala Tyr

300

Val Gly Leu Glu Lys

315

Val Phe Phe Pro Gly

330

Asp ser lie Ala cys

350

Thr Asp Leu ser Val

365

Leu cys Asn Glu Pro

Val ser

Pro Pro

Ala Thr

Phe ser ser Pro

Val Gly 95 He Gly ser Pro

Lys G1n

Pro Phe

160 Leu ser 175 Thr ser

G1 u Al a

Leu Pro

Asp ser

240 Asp Leu 255 Ala Leu

Pro Tyr Ala Ser Ala Leu

320 Tyr cys

335

Phe Asp ser Asn Phe Phe

370

375

380

Туг

T rp

G1 n

Asp

Gly

Al a

Pro

Lys

Asn

Val

Pro

ser

He

Val

ser

Arg

385

390

395

400

Leu

Val

Thr

Al a

G1 u

Tyr

T rp

G1 П

Arg

G1 n

cys

Pro

Leu

Phe

Phe

Pro

405

410

415

G1 и

G1 u

Asp

Gly

Tyr

Thr

Tyr

Gly

ser

Al a

Lys

Gly

Lys

Thr

Al a

Al a

420

42 5

430

Asp

Val

Asn

Al a

T rp

Thr

Lys

Gly

T rp

Phe

Leu

Thr

Asn

Thr

Thr

Arg

435

440

445

Leu

He

T rp

Thr

Asn

Gly

Glu

Leu

Asp

Pro

Trp

Arg

Ser

Al a

Gly

Val

450

455

460

ser

ser

Lys

Phe

Arg

Pro

Gly

Gly

Pro

Leu

G1 n

ser

Thr

Pro

G1 n

Al a

465

470

475

480

Pro

Leu

G1 П

Leu

He

Pro

Glu

Gly

Val

Hi s

cys

Tyr

Asp

Leu

He

Leu

485

490

495

Lys

Asn

Al a

G1 u

Al a

Asn

Ala

Gly

Val

G1 n

Arg

Val

Val

Thr

Asn

G1 u

500

505

510

Val

Al a

G1 n

He

Lys

Al a

T rp

Val

Asn

G1 u

Tyr

Tyr

Arg

Lys

515

520

525

<210> 3 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> сигнальная последовательность A. niger пектинметилэстеразы РМеА ss <400> 3

Met Val Lys ser lie Leu Ala ser Val Phe Phe Ala Ala Thr Ala Leu 15 10 15

Al a <210> 4 <211> 19 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Про-последовательность A.niger пролин-специфической эндопротеазы <400> 4

Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Val ser Arg Pro Ala ser ser

10 15

Lys ser Ala <210> 5 <211> 521 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Пролин-специфическая эндопротеаза из Aspergillus niger содержащая РМеА сигнальную последовательность из A. niger <400> 5

Met

Val

Lys

ser

He

Leu

Ala

ser

Val

Phe

Phe

Al a

Al a

Thr

Al a

Leu

1

5

10

15

Al a

Al a

Arg

Pro

Arg

Leu

Val

Pro

Lys

Pro

Val

ser

Arg

Pro

Al a

ser

20

25

30

ser

Lys

ser

Al a

Al a

Thr

Thr

Gly

G1 u

Al a

Tyr

Phe

G1 u

G1 n

Leu

Leu

35

40

45

Asp

Hi s

Hi s

Asn

Pro

G1 u

Lys

Gly

Thr

Phe

ser

G1 n

Arg

Tyr

T rp

T rp

50

55

60

ser

Thr

G1 u

Tyr

T rp

Gly

Gly

Pro

Gly

ser

Pro

Val

Val

Leu

Phe

Thr

65

70

75

80

Pro

Gly

G1 U

Val

ser

Al a

Asp

Gly

Tyr

G1 u

Gly

Tyr

Leu

Thr

Asn

G1 u

85

90

95

Thr

Leu Thr

Gly 100

Val

Tyr

Ala

Gin Glu 105

He Gin

Gly

Al a

Val 110

He

Leu

Не

G1 u

Hi s

Arg

Tyr

T rp

Gly

Asp

ser

ser

Pro

Tyr

G1 u

Val

Leu

Asn

115

120

12 5

А1 а

G1 u

Thr

Leu

G1 n

Tyr

Leu

Thr

Leu

Asp

G1 n

Al a

He

Leu

Asp

Met

130

135

140

Thr

Tyr

Phe

Al a

G1 u

Thr

Val

Lys

Leu

G1 n

Phe

Asp

Asn

ser

Thr

Arg

145

150

155

160

ser

Asn

Al a

G1 n

Asn

Al a

Pro

T rp

Val

Met

Val

Gly

Gly

ser

Tyr

ser

165

170

175

Gly

Al a

Leu

Thr

Al a

T rp

Thr

G1 U

ser

Val

Al a

Pro

Gly

Thr

Phe

T rp

180

185

190

Al a

Tyr

Hi s

Al a

Thr

ser

Ala

Pro

Val

G1 u

Al a

He

Tyr

Asp

Tyr

T rp

195

200

205

G1 n

Tyr

Phe

Tyr

Pro

He

Gin

G1 n

Gly

Met

Al a

G1 n

Asn

cys

ser

Lys

210

215

220

Asp

Val

ser

Leu

Val

Al a

Glu

Tyr

Val

Asp

Lys

He

Gly

Lys

Asn

Gly

225

2 30

235

240

Thr

Al a

Lys

G1 u

G1 n

G1 n

Ala

Leu

Lys

G1 U

Leu

Phe

Gly

Leu

Gly

Al a

245

250

255

Val

G1 u

Hi s

Phe

Asp

Asp

Phe

Al a

Al a

Val

Leu

Pro

Asn

Gly

Pro

Tyr

260

265

270

Leu

T rp

G1 n

Asp

Asn

Asp

Phe

Al a

Thr

Gly

Tyr

ser

ser

Phe

Phe

G1 n

275

280

285

Phe

cys

Asp

Al a

Val

G1 u

Gly

Val

G1 u

Al a

Gly

Al a

Al a

Val

Thr

Pro

290

295

300

Gly

Pro

G1 U

Gly

Val

Gly

Leu

G1 u

Lys

Al a

Leu

Al a

Asn

Tyr

Al a

Asn

305

310

315

320

T rp

Phe

Asn

ser

Thr

He

Leu

Pro

Asp

Tyr

cys

Al a

ser

Tyr

Gly

Tyr

325

330

335

T rp

Thr

Asp

G1 u

T rp

ser

Val

Al a

cys

Phe

Asp

ser

Tyr

Asn

Al a

ser

340

345

350

ser

Pro

He

Tyr

Thr

Asp

Thr

ser

Val

Gly

Asn

Al a

Val

Asp

Arg

G1 n

355

360

365

T rp

G1 u

T rp

Phe

Leu

cys

Asn

G1 u

Pro

Phe

Phe

Tyr

T rp

G1 n

Asp

Gly

370

375

380

Al a

Pro

G1 U

Gly

Thr

ser

Thr

He

Val

Pro

Arg

Leu

Val

ser

Al a

ser

385

390

395

400

Tyr

T rp

G1 П

Arg

G1 n

cys

Pro

Leu

Tyr

Phe

Pro

G1 u

Thr

Asn

Gly

Tyr

405

410

415

Thr

Tyr

Gly

ser

Al a

Lys

Gly

Lys

Asn

Al a

Al a

Thr

Val

Asn

ser

T rp

420

42 5

430

Thr

Gly

Gly

T rp

Asp

Met

Thr

Arg

Asn

Thr

Thr

Arg

Leu

He

T rp

Thr

435

440

445

Asn

Gly

G1 n

Tyr

Asp

Pro

T rp

Arg

Asp

ser

Gly

Val

ser

ser

Thr

Phe

450

455

460

Arg

Pro

Gly

Gly

Pro

Leu

Ala

ser

Thr

Al a

Asn

G1 u

Pro

Val

G1 n

He

465

470

475

480

He

Pro

Gly

Gly

Phe

Hi s

cys

ser

Asp

Leu

Tyr

Met

Al a

Asp

Tyr

Tyr

485

490

495

Al a

Asn

G1 U

Gly

Val

Lys

Lys

Val

Val

Asp

Asn

G1 U

Val

Lys

G1 n

He

500

505

510

Lys

G1 U

T rp

Val

G1 u

G1 U

Tyr

Tyr

Al a

515 520 <210> б <211> 1566 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> Источник <222> 1..1566 <223> /организм=Искусственная последовательность /примечание=Г1ролин-специфическая эндопротеаза из Aspergillus niger содержащая РМеА сигнальную последовательность из A. niger /тип молекулы=не обозначенная ДНК <400> б

- 19 034253

atggtcaagt	ccatcctggc	ctccgtcttc	ttcgctgcca	ctgctcttgc	tgcaaggcct	60
cgtctcgttc	ccaagcccgt	ttctcgtccc	gccagctcca	agtccgctgc	tactactggt	120
gaggcctact	ttgaacagct	gttggaccac	cacaaccctg	agaagggtac	tttctcgcaa	180
agatactggt	ggagcaccga	gtactggggt	ggtcccggat	cccccgttgt	cctgttcact	240
cccggtgagg	tcagcgctga	tggctacgag	ggttatctga	ccaacgagac	tctcaccggt	300
gtctacgccc	aggagattca	gggtgctgtc	atcctgatcg	aacaccgata	ctggggtgac	360
tcgtctccct	acgaggtgct	gaacgccgag	actctccagt	acttgaccct	cgaccaggct	420
atccttgata	tgacctactt	cgccgaaacc	gtcaagctcc	agtttgacaa	ctccacccgc	480
tccaacgctc	agaacgctcc	ttgggttatg	gtcggcggca	gctacagcgg	tgctctgact	540
gcttggaccg	agtccgttgc	tcccggcacc	ttctgggctt	accacgccac	ctctgctcct	600
gttgaggcca	tctacgacta	ctggcaatac	ttctacccca	ttcagcaggg	tatggctcag	660
aactgctcca	aagatgtctc	tcttgtagca	gaatacgtcg	acaagatcgg	caagaacggc	720
actgccaagg	agcaacaggc	tctgaaggag	cttttcggcc	taggagcagt	ggagcacttc	780
gacgacttcg	ccgctgttct	gcccaacggt	ccttacctct	ggcaagacaa	cgactttgcc	840
accggttact	cttctttctt	ccagttctgt	gatgccgtcg	agggtgtcga	ggctggtgct	900
gccgtcaccc	ccggtcctga	aggtgttggt	ctggaaaagg	cccttgctaa	ctacgcgaac	960
tggttcaact	ctaccatcct	ccccgattac	tgcgccagct	acggctactg	gactgacgag	1020
tggtccgtcg	cctgcttcga	ctcctacaac	gcctcctctc	ctatatacac	cgacaccagc	1080
gttggtaacg	ccgtcgaccg	tcagtgggag	tggttcctct	gcaatgagcc	cttcttttac	1140
tggcaggacg	gtgcccccga	gggtacttca	acgatagtac	cccgcttagt	gtccgcctcc	1200
tactggcagc	gtcaatgtcc	gttgtacttc	cccgagacta	acggttacac	ctacggctcc	1260
gccaagggaa	agaacgccgc	caccgtcaac	agctggaccg	gtggctggga	catgacccgt	1320
aacaccaccc	gtctgatctg	gacgaacggc	caatacgacc	cctggcgtga	ctccggtgtc	1380
tcttccacct	tccgccccgg	tggtcccctc	gcttcgaccg	ccaacgagcc	cgtccagata	1440
atacccggtg	gtttccattg	ctccgacctc	tacatggcag	actactacgc	caacgagggc	1500
gtcaagaagg	ttgtcgacaa	cgaagtcaaa	caaatcaagg	agtgggttga	ggaatactac	1560
gcgtaa						1566

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (19)

1. Полипептид, обладающий активностью пролин-специфической эндопротеазы, выбранный из группы, состоящей из:

i) полипептида, содержащего последовательность зрелого полипептида, представленную в SEQ ID NO: 2;

ii) полипептида, который имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности зрелого полипептида, представленной в SEQ ID NO: 2;

iii) полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в условиях средней жесткости, предпочтительно в условиях высокой жесткости с цепью, являющейся комплементарной цепи последовательности SEQ ID NO: 1, представляющей собой последовательность, кодирующую зрелый полипептид;

iv) полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, где нуклеиновая кислота имеет последовательность, по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, кодирующей зрелый полипептид.

2. Полипептид по п.1, который представляет собой изолированный, чистый, рекомбинантный, синтетический или вариантный полипептид полипептида по п.1.

3. Полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что последовательность зрелого полипептида, представленная в SEQ ID NO: 2, содержит аминокислоты с 36 по 526 последовательности SEQ ID NO: 2.

4. Композиция для использования в производстве пищевого продукта или кормового продукта, характеризующаяся тем, что она содержит полипептид по любому из пп.1-3.

5. Композиция по п.4, содержащая носитель, вспомогательное вещество или вспомогательный фермент.

- 20 034253

6. Нуклеиновая кислота, кодирующая пролин-специфическую эндопротеазу, которая имеет последовательность, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1, кодирующей зрелый полипептид.

7. Нуклеиновая кислота по п.6, которая представляет собой изолированную, чистую, рекомбинантную, синтетическую или вариантную нуклеиновую кислоту по п.6.

8. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.6 или 7, функционально связанную с одной или более чем одной контрольной последовательностью(ми), которая управляет экспрессией полипептида в клетке-хозяине.

9. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая либо нуклеиновую кислоту по п.6 или 7, либо экспрессионный вектор по п.8.

10. Способ получения полипептида по пп.1-3, включающий культивирование клетки-хозяина по п.9 в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида и его получение.

11. Способ по п.10, дополнительно включающий выделение полипептида.

12. Способ получения пищевого или кормового продукта, включающий приведение промежуточной формы пищевого или кормового продукта в контакт с полипептидом по п.1-3 или композицией по п.4 или 5 и получение пищевого или кормового продукта.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что пищевой продукт представляет собой напиток, предпочтительно пиво.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что промежуточная форма пищевого продукта представляет собой затор.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что способ, кроме того, включает инкубацию полипептида с затором во время приготовления затора.

16. Способ по любому из пп.12 или 15, отличающийся тем, что пищевой продукт содержит глютен.

17. Пищевой или кормовой продукт, полученный способом по любому из пп.12-16.

18. Применение полипептида по любому из пп.1-3 или композиции по п.4 или 5 уменьшает помутнение в напитке.

19. Применение по п.18, отличающееся тем, что напиток представляет собой пиво.