DE69333016T2

DE69333016T2 - Rhamnogalacturonan acetylesterase (RGAE) von Aspergillus aculeatus

Info

Publication number: DE69333016T2
Application number: DE69333016T
Authority: DE
Inventors: Kurt Dörreich; Mark Flemming CHRISTENSEN; Yvette Schnell; Marcel Mischler; Henrik Dalböge; Peter Hans HELDT-HANSEN
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1992-03-27
Filing date: 1993-03-29
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2013-03-30
Also published as: ZA932078B; AU671829B2; DK42092D0; AU3948493A; ES2199942T3; DE69333016D1; DK0635053T3; JP3655303B2; BR9306151A; IL105172A0; JPH07505286A; ATE242318T1; US5585256A; CA2132433A1; WO1993020190A1; EP0635053B1; EP0635053A1

Description

Die Erfindung umfasst ein neues Enzym, das eine Rhamnogalacturonan-Acetylesterase ist (die Abkürzung RGAE wird im Folgenden für gewöhnlich verwendet werden), eine korrespondierende DNA-Sequenz, einen Vektor, einen transformierten Wirt, ein Verfahren zur Herstellung einer RGAE, eine Enzympräparation und eine Verwendung der RGAE.
Die Erfindung stellt die Charakterisierung, den Nachweis und die Beschreibung einer neuen RGAE, einer teilweisen Aminosäuresequenz dieses Enzyms, teilweise DNA-Sequenzen und eine gesamte Aminosäuresequenz und eine gesamte DNA-Sequenz zur Verfügung.
RGAE ist eine Hydrolase mit dem systematischen Enzymnamen Rhamnogalacturonanessigsäureester-Acetylhydrolase, die zur Gruppe der Acetylesterasen gehört (EC Nr. 3.1.1.6), welche die Hydrolyse von Essigsäureestern zu den korrespondierenden Alkoholen und Acetat katalysiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Polysaccharide (z. B. Pektine) von Pflanzen sind häufig mit Acetylgruppen substituiert (Rombouts, F. M., J. F. Thibault, C. Mercier, „Oxidative enzyme-catalyzed crosslinking of beet pectins", US-Patent Nr. 4,672,034). In den Anwendungen von Polysacchariden beeinflussen diese Substitutionen die Geliereigenschaften (Williamson G., C. B. Faulds, J. A. Matthew, D. B. Archer, V. J. Morris, G. J. Brownsey, M. J. Ridout, „Gelation of sugarbeet and citrus pectins using enzymes extracted from orange peel", Carbohydrate Polymers 13, 387–397, 1990). In der Verarbei tung von Pflanzenmaterial, z. B. Früchten und Gemüsen, werden endogene Enzyme als Verarbeitungshilfen verwendet, um die Ausbeute und Qualität der Endprodukte zu verbessern (Pilnik, W., A. G. J. Voragen, „Effect of enzyme treatment on the quality of processed fruits and vegetables", in: Jen J. J., „Quality factors of fruits and vegetables, chemistry and technology", ACS Symp. Ser. 405, American Chemical Society, Washington DC, 250–269, 1989). Schols et al. isolierten und charakterisierten aus Apfelzellwänden ein saures polymerisches Pektinfragment unter Verwendung einer technischen Enzympräparation enthaltend pektolytische, hemizellulolytische und zellulolytische Enzyme. Dieses Enzym-resistente Polysaccharid, als „modifizierte haarige ("hairy") Region" (MHR) bezeichnet, besteht aus einem hochverzweigten Rhamnogalacturonan-Rückgrat, mit Acetylgruppen an den Galacturonsäureresten (Schols, H. A., M. A. Posthumus, A. G. J. Voragen, „Structural features of hairy regions of pectins isolated from apple juice produced by the liquefaction process", Carbohydrate Research, 206, 117–129, 1990). Extensives Screenen von kommerziell erhältlichen Enzympräparationen haben zu einer Aspergillus aculeatus-Präparation geführt, welche die Fähigkeit besaß, MHR abzubauen bzw. zu degradieren. Ein neues Enzym, das als Rhamnogalacturonase (RG) bezeichnet wird, wurde aus dieser Präparation identifiziert und gereinigt. Während der Reinigung von RG wurde es offensichtlich, dass das Enzym nur auf saponifiziertem bzw. verseiftem MHR wirkt und dass daher Esterasen, insbesondere Acetylesterasen, eine wichtige Rolle für die Degradation von MHR spielen müssen (Schols, H. A., C. C. J. M. Geraeds, M. J. F. Searle-van Leuwen, F. J. M. Kormelink, A. G. J. Voragen, „Rhamnogalacturonase: a novel enzyme that degrades the hairy regions of pectins", Carbohydrate research 206, 105–115, 1990). Enzyme, die verzweigte Rhamnogalacturonane, wie HMR, deacetylieren können, werden daher benötigt, da der hohe Grad der Acetylierung an verzweigten Rhamnogalacturonanen die Wirkung von Enzymen mit höherer Aktivität auf deacetylierte Rhamnogalacturonane behindert.
Von einigen Polysacchariden (Xylan, Mannan und Pektin) ist bekannt, dass sie acetyliert sind, und von den Acetylesterasen ist bekannt, dass sie sehr spezifisch gegenüber ihrem spezifischen Polysaccharidsubstrat sind, aber einige von ihnen zeigen Aktivität gegenüber Nicht-Polysaccharidsubstraten, wie Triacetin und Naphtholacetat. Eine Aspergillus niger-Acetylesterase, die aktiv ist gegenüber Triacetin und Rübenpektin, wurde von Mathew et al. beschrieben (Mathew, J. A., S. J. Howson, M. H. J. Keenan, P. S. Belton, „Improvement of the gelation properties of sugarbeet pectin following treatment with an enzyme preparation derived from Aspergillus niger – Comparison with a chemical modification", Carbohydrate Polymers 12, 295–306, 1990). Pectinacetylesterase, hoch wirksam gegenüber Triacetin, wurde aus Zitrusschale gereinigt (Williamson, G., „Purification and characterisation of pectin acetyl esterase from orange peel", Phytochemistry 30, 445–449, 1991). Aktivität gegenüber HMR wurde für keine dieser Polysaccharidacetylesterasen des Standes der Technik gezeigt.
Daher wurde die Fähigkeit von Acetylesterasen, die Acetylgruppen von HMR zu hydrolysieren, bisher für keine der Acetylesterasen des Standes der Technik beschrieben, und es ist der Zweck der Erfindung, eine RGAE mit hoher Spezifität gegenüber HMR zur Verfügung zu stellen.
Die erfindungsgemäße RGAE ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie mit einem Antikörper immunologisch reaktiv ist, der gegen eine gereinigte RGAE gerichtet ist, die von Aspergillus aculeatus, CBS 101.43 abgeleitet ist.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff „abgeleitet von" nicht nur eine RGAE bedeuten, die durch Stamm CBS 101.43 gebildet ist, sondern auch eine RGAE, kodiert durch eine DNA-Sequenz, die aus Stamm CBS 101.43 isoliert ist und in einem Wirtsorganismus, der mit dieser DNA-Sequenz transformiert ist, gebildet wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen RGAE zeigt die folgende teilweise Aminosäuresequenz
oder eine teilweise Aminosäuresequenz, die hierzu homolog ist, wobei diese teilweise Aminosäuresequenz Teil eines Polypeptids mit RGAE-Aktivität ist.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff „homolog" ein Polypeptid bezeichnen, das von DNA kodiert wird, die mit derselben Sonde hybridisiert wie die DNA kodierend für das RGAE-Enzym unter bestimmten spezifischen Bedingungen (wie Prä-Tränken in 5 × SSC und Prähybridisieren für 1 Stunde bei ∼40°C in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und 50 μg denaturierter sonifizierter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisieren in derselben Lösung, die ergänzt ist mit 50 μCi 32-P-dCTP-markierter Sonde für 18 Stunden bei ∼40°C, gefolgt von drei Mal Waschen in 2 × SSC, 0,2% SDS bei 40°C für 30 Minuten). Genauer soll sich der Begriff auf eine DNA-Sequenz mit wenigstens 70% Homologie zu der oben gezeigten Sequenz kodierend die erfindungsgemäße RGAE beziehen. Der Begriff soll Modifikationen der oben gezeigten DNA-Sequenz einschließen, wie Nukleotidsubstitutionen, die zu keiner anderen Aminosäuresequenz der RGAE führen, aber die der Kodonverwendung des Wirtsorganismus entsprechen, in den das DNA-Konstrukt eingeführt wird, oder Nukleotidsubstitutionen, die zu einer anderen Aminosäuresequenz führen und daher, möglicherweise, zu einer unterschiedlichen Proteinstruktur führen, die zu einer RGAE-Mutante mit unterschiedlichen Eigenschaften gegenüber dem nativen Enzym führen kann. Weitere Beispiele möglicher Modifikationen sind Insertion eines oder mehrerer Nukleotide in die Sequenz, Addition eines oder mehrerer Nukleotide an jedem Ende der Sequenz oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide an jedem Ende oder innerhalb der Sequenz.
Daher wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäße RGAE hochspezifisch für die Deacetylierung von MHR ist, aber dass sie keine Aktivität gegenüber Triacetin und Rübenpektin zeigt und dass sie außerdem eine höhere Spezifität als die Acetylesterasen des Standes der Technik zeigt.
Die oben beschriebene teilweise Aminosäuresequenz kann für die Herstellung von DNA-Sonden verwendet werden, die zum Screenen einer genomischen Bibliothek hinsichtlich Organismen, die ein solches Enzym exprimieren, oder einer cDNA-Bibliothek verwendet werden, wobei DNA-Sequenzen erhalten werden, die entweder für eine Überproduktion von RGAE, wenn sie in die Mikroorganismenspezies eingeführt wird, von der das Eltern-DNA-Molekül abstammt, oder für die Herstellung von RGAE ohne die Begleitung von nahe verwandten Enzymen, wenn sie in einen Wirtsorganismus eingeführt werden, der unter nicht transformierten Bedingungen keine Enzyme bildet, die mit RGAE nahe verwandt sind, verwendet werden. Die DNA-Sequenzen können anders gebildet werden, wie aus dem Folgenden offensichtlich wird.
Daher ist der Zweck der Erfindung das Zurverfügungstellen einer neuen RGAE und von Mitteln und Verfahren zur Herstellung von RGAE in größerer Ausbeute und höherer Reinheit als bisher möglich und einer Verwendung von RGAE entweder alleine oder in Kombination mit anderen signifikanten Mengen an Enzymen zur Degradation von Pflanzenzellwandgewebe, die effizienter ist als bisher möglich. Es ist ebenso der Zweck der Erfindung, neue Produkte zur Verfügung zu stellen, wobei der Anteil von RGAE entweder gesteigert oder erniedrigt ist im Vergleich zu dem Anteil in dem Ausgangsprodukt.
Die erfindungsgemäß erhältliche rekombinante DNA-Sequenz umfasst eine DNA-Sequenz kodierend für ein Polypeptid mit RGAE-Aktivität, oder eine DNA-Sequenz mit substanzieller Sequenzhomologie zu einer solchen RGAE-kodierenden Sequenz.
Im Folgenden wird im Detail beschrieben werden, wie die erfindungsgemäße rekombinante DNA-Sequenz hergestellt werden kann.
Rohenzympräparationen, hergestellt aus Aspergillus aculeatus für die Reinigung der RGAE können wie folgt hergestellt werden. Aus Gründen der Kürze wird diese Roh-Aspergillus-aculeatus-Präparation im Folgenden als A. a. e. p. bezeichnet werden.
Der Stamm Aspergillus aculeatus CBS 101.43 als ein Gendonor wurde in einem Pilotpflanzenmaßstab in der folgenden Weise fermentiert.
Ein Agarsubstrat mit der folgenden Zusammensetzung wurde in einer Fernbach-Flasche hergestellt:

Pepton Difco 6 g

Aminolin Ortana 4 g

Glucose 1 g

Hefeextrakt Difco 3 g

Fleischextrakt Difco 1,5 g

KH₂PO₄ Merck 20 g

Malzextrakt Evers 20 g

ionenausgetauschtes H₂O ad 1000 ml
Der pH wurde zwischen 5,30 und 5,35 eingestellt. Anschließend wurden 40 g Agar Difco hinzugefügt, und die Mischung wurde für 20 Minuten bei 120°C autoklaviert (das Substrat wird als E-Agar bezeichnet).
Der Stamm CBS 101.43 wurde auf einem E-Agar-Schrägagarröhrchen (37°C) kultiviert. Die Sporen von dem Schrägagarröhrchen wurden in sterilisierter Magermilch suspendiert, und die Suspension wurde in Röhrchen lyophilisiert. Der Gehalt eines lyophilisierten Röhrchens wurde in die Fernbach-Flasche transferiert.
Die Flasche wurde anschließend für 13 Tage bei 30°C inkubiert.
Ein Substrat mit der folgenden Zusammensetzung wurde in einem 500 Liter Anzuchtfermenter hergestellt:

CaCO₃ 1,2 kg

Glucose 7,2 kg

Rofec (eingeweichte Mais-flüssigkeit Trockensubstanz) 3,6 kg

Sojabohnenöl 1,2 kg
Es wurde Leitungswasser bis zu einem Gesamtvolumen von ungefähr 240 Litern hinzugefügt. Der pH wurde bei ungefähr 5,5 vor dem Hinzufügen von CaCO₃ eingestellt. Das Substrat wurde in dem Anzuchtfermenter für 1 Stunde bei 121°C sterilisiert. Das Endvolumen vor der Animpfung bzw. Inokulation betrug ungefähr 300 Liter.
Die Fernbach-Flaschen-Sporensuspension wurde in den Anzuchtfermenter überführt. Die Anzuchtfermentationsbedingungen waren:
Fermentertyp: Herkömmlich belüfteter und bewegter Fermenter mit einem Höhe/Durchmesser-Verhältnis von ungefähr 2,3.

Bewegung: 300 rpm (zwei Turbinenantriebsräder)

Belüftung: 300 Liter normaler Luft pro Minute

Temperatur: 30 bis 31°C

Zeit: ungefähr 28 Stunden
Ungefähr 28 Stunden nach der Inokulation wurden 150 Liter von dem Anzuchtfermenter in den Hauptfermenter überführt.
Es wurde ein Substrat mit der folgenden Zusammensetzung in einem 2500 Liter Hauptfermenter hergestellt:

Geröstetes Sojamehl 90 kg

KH₂PO₄ 20 kg

Pluronic^® Antischaummittel 150 ml
Leitungswasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von ungefähr 900 Litern hinzugefügt. Das geröstete Sojamehl wurde in Wasser suspendiert. Der pH wurde auf 8,0 mit NaOH eingestellt, und die Temperatur wurde auf 50°C angehoben.
Danach wurden ungefähr 925 Anson-Einheiten von Alcalase^® 0,6 L zu der Suspension hinzugefügt. Die Mischung wurde für 4 Stunden bei 50°C und pH = 8,0 (Na₂CO₃-Zusatz) ohne Belüftung und 100 rpm Bewegung gehalten. Anschließend wurden die verbleibenden Substratbestandteile hinzugefügt, und der pH wurde bei ungefähr 6,0 mit Phosphorsäure eingestellt. Das Substrat wurde in dem Hauptfermenter für 1½ Stunden bei 123°C sterilisiert. Das Endvolumen vor der Inokulation betrug ungefähr 1080 Liter.
Anschließend wurden 150 Liter der Anzuchtkultur hinzugefügt.
Die Fermentationsbedingungen waren:
Fermentertyp: Herkömmlich belüfteter und bewegter Fermenter mit einem Höhe/Durchmesser-Verhältnis von ungefähr 2,7.

Bewegung: 250 rpm (zwei Turbinenantriebsräder)

Belüftung: 1200 Liter normaler Luft pro Minute

Temperatur: 30°C

Zeit: ungefähr 151 Stunden
Von 24 Fermentationsstunden bis ungefähr 116 Fermentationsstunden wurde Pektinlösung aseptisch zu dem Hauptfermenter in einer konstanten Rate von ungefähr 8 Litern pro Stunde hinzugefügt. Die Pektinlösung mit der folgenden Zusammensetzung wurde in einem 500 Liter Dosiertank hergestellt:

Pektin genu) 22 kg

Phosphorsäure, konz. 6 kg

Pluronic^® Antischaummittel 50 ml
Leitungswasser wurde bis zu einem Gesamtvolumen von ungefähr 325 Litern hinzugefügt. Das Substrat wurde in dem Dosiertank für 1 Stunde bei 121°C sterilisiert. Das Endvolumen vor dem Beginn der Dosierung betrug ungefähr 360 Liter. Wenn dieser Anteil ausging, wurde ein anderer ähnlicher Anteil hergestellt. Das Gesamtvolumen der Pektinlösung für eine Fermentation betrug ungefähr 725 Liter.
Nach ungefähr 151 Fermentationsstunden wurde der Fermentationsprozess gestoppt. Die ungefähr 1850 Liter Kulturbrühe wurden auf ungefähr 5°C gekühlt, und die Enzyme wurden gemäß dem folgenden Verfahren zurückgewonnen.
Die Kulturbrühe wurde in einem Vakuumtrommelfilter trommelgefiltert (Dorr Oliver), der mit Hyflo Super-Cell Kieselgur (Filterhilfe) vorbeschichtet war. Das Filtrat wurde durch Verdampfen auf ungefähr 15% des Volumens der Kulturbrühe konzentriert. Das Konzentrat wurde auf einem Seitz Filterblatt (Typ Supra 100) mit 0,25% Hyflo Super-Cell als einer Filterhilfe (in der folgenden Tabelle als Filtration I bezeichnet) gefiltert. Das Filtrat wurde mit 561 g (NH₄)₂SO₄/l bei einem pH von 5,5 präzipitiert, und 4% Hyflo Super-Cell Kieselgur wurde als Filterhilfe hinzugefügt. Das Präzipitat und die Filterhilfe werden getrennt durch Filtration auf einem Rahmenfilter. Der Filterkuchen wird in Wasser gelöst, und die unlöslichen Teile werden durch Filtration auf einem Rahmenfilter abgetrennt. Das Filtrat wird probegefiltert auf einem Seitz Filterblatt (Typ Supra 100) mit 0,25% Hyflo Super-Cell als Filterhilfe (in der folgenden Tabelle als Filtration II bezeichnet). Das Filtrat wird diafiltriert auf einer Ultrafiltrationsvorrichtung. Nach der Diafilt ration wird die Flüssigkeit auf einen Trockensubstanzgehalt von 12,7% konzentriert (in der folgenden Tabelle als Trockensubstanzgehalt im Konzentrat bezeichnet).
Eine fakultative Basenbehandlung für die teilweise Entfernung der Proteaseaktivität kann auf dieser Stufe durchgeführt werden. Falls die Basenbehandlung verwendet wird, wird sie bei einem pH von 9,2 für 1 Stunde durchgeführt, wonach der pH-Wert auf 5,0 eingestellt wird.
Jetzt wird die Flüssigkeit probefiltriert und zum Zweck der Keimreduktion filtriert, und das Filtrat wird auf einer Gefriertrockenanlage von Stokes gefriergetrocknet.
Die reine RGAE ist erhältlich aus dem A. a. e. p., wie in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 RHAMNOGALACTURONAN-ACETYLESTERASE-REINIGUNG Aspergillus aculeatus Enzymbrühe
Zu 1:
Pufferaustausch für die Vorbereitung von Schritt 2, Entfernen von kleinen Teilchen und ungefähr 50% der Farbe, Verdünnung auf max. 15 mg Protein/ml (sonst bindet die Probe nicht an die Säule in Schritt 2).
Zu 2:
IEC steht für Ionenaustauschchromatographie (engl.: ion exchange chromatography). Die Acetylesterasefraktion wurde von 0,04–0,08 M NaCl vereinigt.
Zu 3:
Konzentration und Pufferaustausch, um Schritt 4 vorzubereiten.
Zu 4:
Affinitätschromatographie – die nicht zurückgehaltene Fraktion wurde vereinigt. Die Präparation der kreuzvernetzten Alginate wurde durchgeführt nach Rombouts F. M., C. C. J. M Geraeds, J. Visser, W. Pilnik, „Purification of various pectic enzymes on crosslinked polyuronides", in: Gribnau, T. C. J., J. Visser, R. J. F Nivard (Herausgeber), Affinity Chromatography and Related Techniques, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, 255–260, 1982.
Zu 5:
Puffereinstellung, um Schritt 6 vorzubereiten.
Zu 6:
HIC steht für hydrophobe Interaktionschromatographie. Die Acetylesterasefraktion wurde von 1,0 M–0,9 M (NH₄)₂SO₄ vereinigt.
Zu 7:
Konzentration und Pufferaustausch, um Schritt 8 vorzubereiten.
Zu 8:
IEC bedeutet Ionenaustauschchromatographie (engl.: ion exchange chromatography). Die Acetylesterasefraktion wurde von 65 mM–70 mM NaCl vereinigt.
Zu 9:
Puffereinstellung, um Schritt 10 vorzubereiten.
Zu 10:
IEC bedeutet Ionenaustauschchromatographie (engl.: ion exchange chromatography). Die Acetylesterasefraktion wurde von 65 mM–70 mM NaCl vereinigt.
Die so gereinigte RGAE kann für die Immunisierung von Tieren für die Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Genauer kann Antiserum gegen die erfindungsgemäße RGAE gewonnen werden durch Immunisierung von Kaninchen (oder anderen Nagern) nach dem Verfahren, das beschrieben ist bei N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (insbesondere Seiten 27–31). Gereinigte Immunglobuline können aus den Antiseren erhalten werden, beispielsweise durch Salzpräzipitation ((NH₄)₂SO₄), gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z. B. auf DEAE-Sephadex. Immunchemische Charakterisierung von Proteinen kann durchgeführt werden entweder durch Ouchterlony-Doppeldiffusionsanalyse (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, Seiten 655–706), durch Kreuzimmunelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4) oder durch Rocketimmunelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2).
Aminosäuresequenz
Die zuvor beschriebene teilweise Aminosäuresequenz wurde aus der gereinigten RGAE mittels automatischer Sequenzierung (Applied Biosystems 473A Proteinsequenzierer) bestimmt. Auf der Basis der Sequenz wurde die Reinheit der Probe auf mehr als 90% geschätzt.
Die RGAE wurde weiter charakterisiert, wie unten angegeben.
Die RGAE hat ihre optimale Aktivität bei pH 5,5 und bei einer Temperatur von 40°C. Bei 50°C und pH 5,0 konnte über 20 Stunden kein Aktivitätsverlust beobachtet werden. Bei 30°C war die pH-Stabilität am höchsten bei pH 6–7.
Die RGAE hat eine spezifische Aktivität gegenüber MHR und setzte ein Maximum von ungefähr 70% aller Acetylgruppen, die in MHR vorliegen, frei.
Kombinationen dieser RGAE mit reiner Pektinmethylesterase sowohl Zitrus- als auch Pilzursprungs, reine Exo- und Endo-Arabinasen von Aspergillus-Spezies (Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus) lieferten keine Steigerung in der Acetylfreisetzung von entweder Rübenpektin oder Apfel-MHR.
Vorbehandlung dieser Substrate, um Arabinoseseitenketten zu entfernen, lieferte ebenfalls keinen stimulierenden Effekt. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, dass eine neue RGAE identifiziert wurde, die hochspezifisch für Acetylester von verzweigten Pektinregionen ist.

Molekulargewicht: ungefähr 31.000 bis 35.000

Isoelektrischer Punkt: pH 4,2
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen RGAE ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die RGAE ein pH-Optimum von 4,0–7,0 zeigt, vorzugsweise 4,5–6,0, einen isoelektrischen Punkt von 3,7–6,7, vorzugsweise 4,0–4,5, ein Molekulargewicht von zwischen 30.000 und 50.000 Dalton und ein Temperaturoptimum zwischen 10 und 50°C, vorzugsweise zwischen 25 und 45°C.
Die Erfindung umfasst ebenfalls eine rekombinante DNA-Sequenz, die gekennzeichnet ist durch Kodieren einer erfindungsgemäßen RGAE.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Sequenz ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie eine DNA-Sequenz umfasst, ausgewählt aus

a) dem Aspergillus aculeatus RGAE-DNA-Insert
b) einer DNA-Sequenz, die mit der kodierenden Region für die reife RGAE-DNA hybridisiert, umfasst von dem DNA-Insert nach a) und die ein strukturelles Gen für ein Polypeptid mit RGAE-Aktivität umfasst, und wahlweise einen Promotor, eine kodierende Region für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder transkriptionellen Terminator
c) einem Derivat einer DNA-Sequenz definiert in a) oder b), oder
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife RGAE oder ein Signalpeptid oder ein Leaderpeptid davon kodiert, und die degeneriert ist innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes bezüglich einer DNA-Sequenz von a) oder b).

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Sequenz ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie die folgenden teilweisen DNA-Sequenzen umfasst
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Sequenz ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie die folgenden DNA-Sequenzen umfasst
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Sequenz ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie umfasst

oder eine Sequenz homolog hierzu kodierend für eine erfindungsgemäße RGAE.
Außerdem umfasst die Erfindung einen Vektor, der gekennzeichnet durch die Tatsache, dass er die erfindungsgemäße rekombinante DNA-Sequenz umfasst.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Vektors ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass der Promotor der Aspergillus oryzae Takaamylase-Promotor ist.
Die Erfindung umfasst außerdem einen transformierten Wirt, der gekennzeichnet ist durch die Tatsache, dass er den erfindungsgemäßen Vektor enthält.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen transformierten Wirtes ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass der transformierte Wirt ein Aspergillus-Stamm ist. Hierdurch wird eine gute Herstellungskapazität der RGAE erhalten.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen transformierten Wirtes ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass der transformierte Wirt ein Stamm ist, der zu den Spezies Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus awamori gehört. Hierdurch wird eine gute Herstellungskapazität der RGAE erhalten.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen transformierten Wirtes ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass der transformierte Wirt ein Mikroorganismus ist, der in seinem nicht transformierten Zustand keine RGAE bildet oder RGAE nur in unsignifikanten Mengen bildet, vorzugsweise Bacillus sp., E. coli oder S. cerevisiae. Hierdurch kann eine „maßgeschneiderte" Enzympräparation mit hoher RGAE-Aktivität und einem Spektrum anderer gewünschter spezifischer Enzymaktivitäten erhalten werden.
Die Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer RGAE unter Verwendung eines erfindungsgemäßen transformierten Wirtes. Mittels dieses Verfahrens kann die RGAE in hoher Ausbeute erhalten werden.
Die Erfindung umfasst außerdem die RGAE, wenn sie gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt ist. Die RGAE kann in hoher Ausbeute erhalten werden.
Die Erfindung umfasst ebenfalls eine Enzympräparation, die gekennzeichnet ist durch die Tatsache, dass sie eine Pektinasepräparation enthält, die für die Degradation oder Modifikation von Pflanzenzellwänden, die mit erfindungsgemäßer RGAE angereichert sind, verwendbar ist. Auf diese Weise kann eine Verstärkung der Zellwanddegradationsfähigkeit der Pektinasepräparation erreicht werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Enzympräparation ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die Pektinasepräparation herstellbar ist mittels eines Mikroorganismus, der zu dem Genus Aspergillus, vorzugsweise Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori oder Aspergillus oryzae gehört. Eine solche Präparation besitzt die Fähigkeit, eine außerordentlich gute Zersetzung von pflanzlichen Zellwänden zu liefern.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Enzympräparation ist gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die RGAE die RGAE ist, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt ist. Die Herstellungskosten dieser Präparation sind relativ gering.
Die Erfindung umfasst außerdem eine Verwendung der erfindungsgemäßen RGAE als ein Mittel für Degradation oder Modifikation von acetyliertem Rhamnogalacturonan.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Verwendung der erfindungsgemäßen RGAE ist die Verwendung als ein Mittel für Degradation oder Modifikation von Pflanzenzellwänden. Gegenwärtig ist die Degradation von Pflanzenzellwänden aufgrund der hohen Pflanzenzellwanddegradationsaktivität die am meisten bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen RGAE.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Verwendung der erfindungsgemäßen RGAE ist eine Verwendung, bei der die RGAE zusammen mit Enzymen verwendet wird, die spezifisch sind für deacetylierte oder teilweise deacetylierte MHR. Diese weiteren Enzyme schließen alle Enzyme ein, die deacetylierte und teilweise deacetylierte verzweigte Rhamnogalacturonane mit einer höheren Spezifizität angreifen als sie acetylierte Rhamnogalacturonane angreifen, einschließlich Enzymen, die das Rhamnogalacturonanrückgrat durch Endo- oder Exoangriff angreifen, oder Enzyme, welche die Seitenketten angreifen.
Die Erfindung umfasst außerdem eine Verwendung der erfindungsgemäßen Enzympräparation als ein Mittel für Degradation oder Modifikation von acetylierten Rhamnogalacturonanen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Verwendung der erfindungsgemäßen Enzympräparation ist eine Verwendung als ein Mittel für Degradation oder Modifikation von Pflanzenzellwänden. Gegenwärtig ist die Degradation von Pflanzenzellwänden aufgrund der hohen Pflanzenzellwanddegradationsaktivität die am meisten bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Enzympräparation.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Verwendung der erfindungsgemäßen Enzympräparation ist eine Verwendung, bei der die Enzympräparation zusammen verwendet wird mit Enzymen, die spezifisch sind für deacetylierte oder teilweise deacetylierte MHR. Diese weiteren Enzyme schließen alle Enzyme ein, die deacetylierte oder teilweise deacetylierte verzweigte Rhamnogalacturonane mit einer höheren Spezifität angreifen, als sie acetylierte Rhamnogalacturonane angreifen, einschließlich Enzymen, die das Rhamnogalacturonanrückgrat durch Endo- oder Exoangriff angreifen, oder Enzyme, welche die Seitenketten angreifen.
6 ist eine Karte des Plasmids pYHD17, wobei „TPI-Promotor" den S. cerevisiae-Triosephosphat-Isomerasepromotor bezeichnet, „Terminator" den Transkriptionsterminator bezeichnet, „Amp" das Gen, welches die Ampicillinresistenz verleiht, bezeichnet, „ 2μ ori" den Hefeplasmid 2μ Replikationsursprung bezeichnet und „URA3" ein Gen bezeichnet, das einen Selektionsmarker kodiert, der eine Uracildefizienz in dem Wirtsstamm komplementiert.
BEISPIELE
Material und Methoden
Donororganismus: mRNA wurde isoliert aus Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, angezogen in einem Soja-enthaltenden Fermentationsmedium mit Bewegung, um eine ausreichende Belüftung sicherzustellen. Mycelien wurden nach 3–5 Tagen Wachstum geerntet, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert.
Hefestämme: Der verwendete Saccharomyces cerevisiae-Stamm war yNG231 (MAT alpha, leu2, ura3-52, his4-539, pep4-delta 1, cir+) oder JG169 (MATα ura 3-52; leu2-3, 112; his3-D200; pep4-113; prc1::HIS3; prb1:: LEU2; cir+).
Konstruktion eines Expressionsplasmids
Das kommerziell erhältliche Plasmid pYES II (Invitrogen) wurde mit SpeI gespalten, mit Klenow DNA-Polymerase + dNTPs aufgefüllt und mit ClaI geschnitten. Die DNA wurde in einem Agarose-Gel nach ihrer Größe aufgetrennt, und ein Fragment von ungefähr 2000 bp wurde durch Elektroelution gereinigt. Das gleiche Plasmid wurde mit ClaI/PvuII geschnitten, und ein Fragment mit ungefähr 3400 by wurde durch Elektroelution gereinigt. Die beiden Fragmente wurden zu einem SphI/EcoRI-Fragment mit stumpfen Enden enthaltend den Hefe-TPI-Promotor ligiert. Das Fragment wurde aus einem Plasmid isoliert, in dem der TPI-Promotor von S. cerevisiae (s. T. Albers und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, Seiten 419–434) leicht modifiziert war: Eine interne SphI-Stelle wurde entfernt durch Deletieren der vier bp, die den Kern dieser Stelle bilden. Außerdem wurden redundante Sequenzen oberhalb des Promotors durch BalI-Exonukleasebehandlung entfernt, gefolgt von dem Hinzufügen eines SphI-Linkers. Abschließend wurde ein EcoRI-Linker an Position -10 hinzugefügt. Nach diesen Modifikationen ist der Promotor in ein SphI-EcoRI-Fragment einge schlossen. Seine Wirksamkeit im Vergleich zu dem Originalpromotor scheint durch diese Modifikationen unbeeinflusst zu sein. Das resultierende Plasmid pYHD17 ist in 6 gezeigt.
Herstellung von RNase-freien Glaswaren, Spitzen und Lösungen
Alle Glaswaren, die in RNA-Isolationen verwendet wurden, wurden bei +220°C für wenigstens 12 h gebacken. Eppendorf-Röhrchen, Pipettenspitzen und Plastiksäulen wurden in 0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) in EtOH für 12 Stunden behandelt und autoklaviert. Alle Puffer und Wasser (außer Tris-enthaltenden Puffern) wurden mit 0,1% DEPC für 12 Stunden bei 37°C behandelt und autoklaviert.
Extraktion von Gesamt-RNA
Die Gesamt-RNA wurde durch Extraktion mit Guanidinthiocyanat gefolgt von Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen (Chirgwin et al., 1979) unter Verwendung der folgenden Modifikationen hergestellt. Die gefrorenen Mycelien wurden in flüssigem N₂ zu feinem Pulver mit einem Mörser und einem PistiII gemahlen, gefolgt von Mahlen in einer vorgekühlten Kaffeemühle, und sofort in 5-fachem Volumen an RNA-Extraktionspuffer (4 M GuSCN, 0,5% Na-Laurylsarcosin, 25 mM Na-Citrat, pH 7,0, 0,1 M β-Mercaptoethanol) suspendiert. Die Mischung wurde für 30 Minuten bei RT gerührt und zentrifugiert (30 Minuten, 5000 rpm, RT, Heraeus Megafuge 1,0 R), um die Zelltrümmer zu pelletieren. Der Überstand wurde gesammelt, vorsichtig auf ein 5,7 M CsCl-Kissen (5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA, pH 7,5, 0,1% DEPC; vor der Verwendung autoklaviert) geschichtet unter Verwendung von 26,5 ml Überstand pro 12,0 ml CsCl-Kissen, und zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu erhalten (Beckman, SW 28 Rotor, 25.000 rpm, RT, 24h). Nach der Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig entfernt, und der Boden des Röhrchens enthaltend das RNA-Pellet wurde abgeschnitten und mit 70% EtOH gespült. Das Gesamt-RNA-Pellet wurde in ein Eppendorf-Röhrchen transferiert, mit 500 μl TE, pH 7,6 suspendiert (wenn schwierig, gelegentlich für 5 Minuten bei 65°C erhitzen), Phenol extrahiert und mit Ethanol für 12 Stunden bei -20°C (2,5-faches Volumen EtOH, 0,1-faches Volumen 3 M NaAc, pH 5,2) präzi pitiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, in 70% EtOH gewaschen und in einem minimalen Volumen an DEPC-DIW resuspendiert. Die RNA-Konzentration wurde durch Messen der OD_260/280 bestimmt.
Isolation von poly(A)⁺-RNA
Die poly(A)⁺-RNAs wurden durch Oligo(dT)-Zelluloseaffinitätschromatographie (Aviv & Leder, 1972) isoliert. Typischerweise wurde 0,2 g an Oligo(dT)-Zellulose (Boehringer Mannheim) in 10 ml 1 × Säulen-Ladepuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) vorgequollen, auf eine DEPCbehandelte, gestopfte Plastiksäule (Poly Prep Chromatography Column, Bio Rad) geladen und mit 20 ml 1 × Ladepuffer equilibriert. Die Gesamt-RNA wurde bei 65°C fiir 8 Minuten erhitzt, auf Eis für 5 Minuten abgeschreckt und, nach dem Hinzufügen des 1-fachen Volumens 2 × Säulen-Ladepuffer zu der RNA-Probe, auf die Säule geladen. Das Eluat wurde gesammelt und erneut 2–3 Mal geladen durch Erhitzen der Probe wie oben beschrieben und Abkühlen auf Eis vor jedem Laden. Die Oligo(dT)-Säule wurde mit dem 10-fachen Volumen an 1 × Ladepuffer gewaschen, dann mit dem 3-fachen Volumen an Mittelsalzpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,6, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), gefolgt von Elution der poly(A)⁺-RNA mit dem 3-fachen Volumen an Elutionspuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,05% SDS) vorher erhitzt auf +65°C, durch Sammeln von 500 μl-Fraktionen. Die OD₂₆₀ wurde für jede gesammelte Fraktion gelesen, und die mRNA enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und Ethanol-präzipitiert bei – 20°C für 12 h. Die poly(A)+-RNA wurde durch Zentrifugation gesammelt, in DEPC-DIW resuspendiert und in 5–10 μg Aliquots bei –80°C gelagert.
Northern-Blot-Analyse
Die poly(A)⁺-RNAs (5 μg/Probe) von verschiedenen Mycelien wurden elektrophoretisiert in 1,2 Agarose-2,2 M Formaldehydgelen (Sambrook et al., 1989) und auf Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham), mit 10 × SSC (Sambrook et al., 1989) als Transferpuffer geblottet. Drei random-primed (Feinberg & Vogelstein, 1983) ³²P-markierte cDNA-Sonden wurden in individuellen Hybridisierungen verwendet: 1) ein 1,3 kb Not I-Spe I-Fragment für Polygalacturonase I von A. aculeatus, 2) ein 1,3 kb Not I-Spe I-Fragment kodierend Endoglucanase I von A. aculeatus und 3) ein 1,2 kb Eag I-Fragment für Galactanase I von A. aculeatus. Northern-Hybridisierungen wurden in 5 × SSC (Sambrook et al., 1989), 5 × Denhardt's-Lösung (Sambrook et al., 1989), 0,5% SDS (w/v) und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA mit einer Sondenkonzentration von ca. 2 ng/ml für 16 Stunden bei 65°C durchgeführt, gefolgt von Waschschritten in 5 × SSC bei 65°C (2 × 15 Minuten), 2 × SSC, 0,5% SDS (1 × 30 Minuten), 0,2 × SSC, 0,5% SDS (1 × 30 Minuten) und 5 × SSC (2 × 15 Minuten). Nach Autoradiographie bei –80°C für 12 Stunden wurde die Sonde #1 von dem Filter nach den Angaben des Herstellers entfernt und mit Sonde #2 rehybridisiert, und schließlich mit Sonde #3. Die RNA-Leiter von Bethesda Research Laboratories wurde als Größenmarker verwendet.
cDNA-Synthese:
Synthese des ersten Strangs
Doppelsträngige cDNA wurde aus 5 μg von A. aculeatus poly(A)⁺-RNA mittels des RNase-H-Verfahrens (Gubler & Hoffman 1983, Sambrook et al., 1989) unter Verwendung der Haarnadel-Modifikation synthetisiert. Die poly(A)⁺-RNA (5 μg in 5 μl DEPC-behandeltem Wasser) wurde bei 70°C für 8 Minuten erhitzt, auf Eis abgeschreckt und in einem Endvolumen von 50 μl mit reverse Transkriptasepuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories) kombiniert, enthaltend 1 mM jedes dNTPs (Pharmacia), 40 Einheiten humanem Placenta-Ribonukleaseinhibitor (RNasin, Promega), 10 μg oligo(dT)_12-18-Primer (Pharmacia) und 1000 Einheiten Superscript II RNase Hreverse Transkriptase (Bethesda Research Laboratories). Der erste cDNA-Strang wurde synthetisiert durch Inkubieren der Reaktionsmischung bei 45°C für 1 Stunde.
Synthese des zweiten Stranges
Nach der Synthese wurden 30 μl an 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA hinzugefügt, und die mRNA : cDNA-Hybride wurden Ethanol-präzipitiert für 12 Stunden bei –20°C durch Hinzufügen von 40 μg Glycogenträger (Boehringer Mannheim), 0,2-fachem Volumen 10 M NH₄Ac und dem 2,5-fachem Volumen 96% EtOH. Die Hybride wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen, luftgetrocknet und resuspendiert in 250 μl zweiter Strangpuffer (20 mM Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl₂, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 16 μM βNAD⁺) enthaltend 100 μM jedes dNTPs, 44 Einheiten an E. coli-DNA-Polymerase I (Amersham), 6,25 Einheiten an RNase H (Bethesda Research Laboratories) und 10,5 Einheiten an E. coli-DNA-Ligase (New England Biolabs). Die Synthese des zweiten DNA-Strangs wurde durchgeführt durch Inkubieren des Reaktionsgefäßes bei 16°C für 3 Stunden, und die Reaktion wurde durch Hinzufügen von EDTA auf 20 mM Endkonzentration, gefolgt von Phenolextraktion, abgestoppt.
Mungbohnen-Nukleasebehandlung
Die doppelsträngige (ds) cDNA wurde Ethanol-präzipitiert bei –20°C für 12 Stunden durch Hinzufügen des 2-fachen Volumens an 96% EtOH, 0,1-fachem Volumen 3 M NaAc, pH 5,2, durch Zentrifugation gewonnen, mit 70% EtOH gewaschen, getrocknet (SpeedVac) und in 30 μl Mungbohnen-Nukleasepuffer (30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO₄, 0,35 mM DTT, 2% Glycerol) enthaltend 36 Einheiten Mungbohnen-Nuklease (Bethesda Research Laboratories) resuspendiert. Die einzelsträngige Haarnadel-DNA wurde abgeschnitten durch Inkubieren der Reaktion bei 30°C für 30 Minuten, gefolgt von Hinzufügen von 70 μl 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation mit dem 2-fachen Volumen an 96% EtOH und dem 0,1-fachen Volumen 3 M NaAc, pH 5,2 bei –20°C für 12 Stunden.
Herstellen von stumpfen Enden mit T4-DNA-Polymerase
Die ds cDNA wurde mit stumpfen Enden versehen mit T4 DNA-Polymerase in 50 μl T4 DNA-Polymerasepuffer (20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT) enthaltend 0,5 mM jedes dNTPs und 7,5 Einheiten an T4 DNA-Polymerase (Invitrogen) durch Inkubieren der Reaktionsmischung bei +37°C für 15 Minuten. Die Reaktion wurde gestoppt durch Hinzufügen von EDTA auf 20 mM Endkonzentration, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation.
Adapterligation und Größenselektion
Nach der Auffüllreaktion wurde die cDNA an nicht-palindromische BstX I-Adapter (1 μg/μl, Invitrogen) ligiert in 30 μl Ligationspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml Rinderserumalbumin) enthaltend 600 pmol BstX I-Adapter und 5 Einheiten T4-Ligase (Invitrogen) durch Inkubieren des Reaktionsgemischs bei +16°C für 12 Stunden. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf +70°C für 5 Minuten abgestoppt, und die mit Adaptern versehene cDNA wurde durch Agarosegel-Elektrophorese (0,8% HSB-Agarose, FMC) größenfraktioniert, um unligierte Adapter und kleine cDNAs abzutrennen. Die cDNA wurde größenselektiert mit einem Cut-off von 0,7 kb, und die cDNA wurde elektroeluiert aus dem Agarose-Gel in 10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA für 1 Stunde bei 100 Volt, Phenol-extrahiert und Ethanol-präzipitiert bei – 20°C für 12 Stunden, wie oben beschrieben.
Herstellung der cDNA-Bibliotheken:
Die mit Adaptern versehene ds cDNA wurde durch Zentrifugation gewonnen, in 70% EtOH gewaschen und in 25 ml DIW resuspendiert. Vor der Bibliotheksligation im großen Maßstab wurden vier Testligationen in 10 μl Ligationspuffer (der gleiche wie oben) durchgeführt, jede enthaltend 1 μl ds cDNA (Reaktionsröhrchen #1–#3), 2 Einheiten T4-Ligase (Invitrogen) und 50 ng (Röhrchen #1), 100 ng (Röhrchen #2) und 200 ng (Röhrchen #3 und #4) BstX I geschnittenen Hefeexpressionsvektor entweder pYES 2,0 Vektor Invitrogen oder yHDl3. Die Ligationsreaktionen wurden durchgeführt durch Inkubation bei +16°C für 12 Stunden, erhitzt bei 70°C für 5 Minuten, und 1 μl jeder Ligation wurde in 40 μl kompetente E. coli 1061-Zellen (OD600 = 0,9 in 1 Liter LB-Brühe, zweimal gewaschen in kaltem DIW, einmal in 20 ml 10% Glycerol, resuspendiert in 2 ml 10% Glycerol) elektroporiert (200 Ω, 2,5 kV, 25 μF). Nach dem Hinzufügen von 1 ml SOC zu jedem Transformationsmix wurden die Zellen bei +37°C für 1 Stunde angezogen, 50 μl wurden auf LB + Ampicillin-Platten (100 μg/ml) ausplattiert und bei +37°C für 12 Stunden angezogen.
Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wurde eine Ligation im großen Maßstab in 40 μl Ligationspuffer enthaltend 9 Einheiten T4-Ligase durchgeführt, und die Reaktion wurde bei +16°C für 12 Stunden inkubiert. Die Ligationsreaktion wurde gestoppt durch Erhitzen bei 70°C für 5 Minuten, Ethanolpräzipitiert bei –20°C für 12 Stunden, durch Zentrifugation gewonnen und resuspendiert in 10 μl DIW. Ein-μl-Aliquots wurden in elektrokompetente E. coli 1061-Zellen, unter Verwendung derselben Elektroporationsbedingungen wie oben transformiert, und die transformierten Zellen wurden titriert und die Bibliothek wurde auf LB + Ampicillin-Platten mit 5000–7000 c. f. u./Platte ausplattiert. Zu jeder Platte wurden 3 ml Medium hinzugefügt. Die Bakterien wurden abgekratzt, 1 ml Glycerol wurde hinzugefügt und bei –80°C als Pools gelagert. Die verbleibenden 2 ml wurden zur DNA-Isolation verwendet. Wenn die Menge an DNA unzureichend war, um die benötigte Zahl an Hefetransformanten zu ergeben, wurde DNA in großem Maßstab hergestellt aus 500 ml Medium (TB), angeimpft mit 50 μl des –80°C Bakterienstocks, über Nacht angezogen.
Herstellung einer cDNA-Sonde durch Polymerasekettenreaktion
Um eine cDNA-Sonde für Rhamnogalacturonan-Acetylesterase I aus A. aculeatus RE4 zu erhalten, wurde ein degeneriertes Oligonukleotid (RGAE/s₂, 7), das einer Region in der NH₂-terminalen Sequenz des gereinigten Enzyms entspricht, durch Einbauen von Desoxyinosinen an vier der mehrdeutigen Positionen synthetisiert. 7 zeigt die abgeleitete, Desoxyinosin-enthaltende Primersequenz, die in der PCR verwendet wurde, angeordnet mit der korrespondierenden Aminosäuresequenz, die erhalten wurde aus gereinigter Rhamnogalacturonan-Acetylesterase I aus Aspergillus aculeatus. Der Primer wurde paarweise mit dem direkten (Primer #22, 5'-CTGTAATACGACTCACTA-3') und dem reversen (Primer #43, 5'- ATTACATGATGCGGCCCT-3') pYES 2,0-Primer verwendet, um die Ziel-RGAE-cDNA von einem amplifizierten cDNA-Bibliothekspool enthaltend 7000 Klone zu amplifizieren unter Verwendung der Polymerasekettenreaktionstechnik (Ohara et al. 1989). Die PCR-Reaktionen wurden durchgeführt in 100 μl PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01%, Perkin-Elmer, Cetus) enthaltend 550 pmol Sense-Primer (RGAE/s₂) und 800 pmol jedes Antisense-Primers (siehe oben), 1 μg Template-DNA (Qiagen-gereinigte Plasmid-DNA von dem cDNA-Bibliothekspool #33) und 200 μM jedes dNTPs unter Verwendung eines DNA-Thermocyclers und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer, Cetus). Dreißig PCR-Zyklen wurden durchgeführt unter Verwendung eines Zyklusprofils von Denaturieren bei 94°C für 1 Minute, Anlagern bei 55°C für 2 Minuten und Verlängern bei 72°C für 3 Minuten.
Zwanzig μl Aliquots der Amplifikationsprodukte wurden durch Elektrophorese auf 0,7% Agarose-Gelen analysiert, wobei sich ein 0,9 kb Hauptprodukt mit einem Primerpaar (Sense, RGAE/s₂; Antisense, pYES 2,0 Reverse Primer #43) zeigte. Das interessierende DNA-Fragment wurde durch Elektroelution (Sambrook et al. 1989) aus dem Gel ausgeschnitten, unter Verwendung von Typ D-0405 nahtlosen Dialyseschläuchen (Sigma) gewonnen, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation bei –20°C für 12 Stunden. Das PCR-Produkt wurde mit stumpfen Enden versehen bei 37°C für 10 Minuten in 20 μl Puffer (20 mM Trisacetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT) enthaltend 50 uM jedes dNTPs und 3 Einheiten T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs). Die Reaktion wurde abgestoppt durch Inkubation bei 70°C für 5 Minuten, auf Eis für 5 Minuten gekühlt und in 50 μl Kinasepuffer (70 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT) verdünnt, gefolgt von Phosphorylierung bei 37°C für 30 Minuten mit T4-Polynukleotidkinase (10 U, New England Biolabs) und 1 mM ATP pH 7,0 (Pharmacia), Phenolextraktion, Ethanolpräzipitation und Ligation bei 16°C für 12 Stunden in einen Sma I-geschnittenen, dephosphorylierten pUC 18-Vektor (50 ng pro Ligation, Pharmacia).
E. coli DHSα wurde zu Ampicillinresistenz (Hanahan 1985) unter Verwendung von 5 μl der Ligationsmischung transformiert, und 13 Klone wurden durch Isolation von Plasmid Miniprep. DNA (Sambrook et al. 1989) und EcoRI/HindIII-Spaltung der Plasmidsubklone, gefolgt durch Sequenzierung der Enden des 0,9 kb Inserts aus einem Subklon (pRGA19) mit Universal-pUC-Primern (Sanger et al. 1977) analysiert. Die Nukleotidsequenzanalyse des pRGA19-Subklons zeigte einen einzigen offenen Leserahmen, der zusätzlich zu den Primer-kodierten Aminosäuren 10 zusätzliche Reste enthielt, die mit der verfügbaren NH₂-terminalen Sequenz aus dem gereinigten Enzym zusammentreffen, wodurch bestätigt wurde, dass die PCR spezifisch die gewünschte Region der Rhamnogalacturonan-Acetylesterase I cDNA (8) amplifiziert hatte. 8 zeigt die Nukleotidsequenz des 5'-Endes der rga1 cDNA und die abgeleitete Primärstruktur der RGAE I von A. aculeatus. Das NH₂-terminale Signalpeptid, das dem reifen Protein vorangeht, ist unterstrichen.
Southern-Blot-Analyse
Qiagen-gereinigte DNA (3 μg) aus acht individuellen cDNA-Bibliothekpools (#33, 90, 100, 130, 136, 140, 142, 148) wurde vollständig gespalten mit EagI (3 U/μg DNA, New England Biolabs), auf einem 0,7% Agarose-Gel aufgetrennt, denaturiert und auf einem Nylonfilter (Hybond-N, Amersham) unter Verwendung von 10 × SSC (Sambrook et al. 1989) als Transferpuffer (Southern 1975) geblottet. Das gereinigte 0,9 kb RGAE I PCR-Fragment wurde ³²P-markiert (> 1 × 10⁹ cpm/μg) durch Random-Priming (Feinberg & Vogelstein 1983) und als Sonde in der Southern-Analyse verwendet. Die Hybridisierung wurde in 2 × SSC (Sambrook et al. 1989), 5 × Denhardt's-Lösung (Sambrook et al. 1989), 1% (w/v) SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA mit einer Sondenkonzentration von 2,5 ng/ml für 16 Stunden bei 65°C durchgeführt, gefolgt von Waschen in 2 × SSC (2 × 15 Minuten), 2 × SSC, 1% SDS bei 65°C für 30 Minuten, dann in 0,2 × SSC, 1% SDS bei 65°C für 30 Minuten und schließlich in 2 × SSC (2 × 15 Minuten). Der Filter wurde bei –80°C für 12 Stunden autoradiographiert und zeigte ein einzelnes stark hybridisierendes 1,0 kb Fragment in jedem cDNA-Pool.
Dies zeigte, dass jeder analysierte Pool eine Gesamtlängen-cDNA-Kopie kodierend RGAE I von A. aculeatus enthielt. Deshalb wurde Pool #33 für weitere Experimente ausgewählt.
Northern-Blot-Analyse
Um die Fließgleichgewichts-Spiegel der A. aculeatus RGAE I mRNA während des Wachstums in RS3-Medium abzuschätzen, wurde poly(A)⁺-RNA von Mycelien isoliert, die täglich geerntet wurden nach 1–5 Tagen des Wachstums in dem oben genannten Medium, und sie wurden der Northern-Analyse unterworfen. Die poly(A)⁺-RNAs (5 μg/Probe) wurden in 1,2 Agarose-2,2 M Formaldehyd-Gelen (Sambrook et al., 1989) elektrophoretisiert und auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham) mit 10 × SSC (Sambrook et al., 1989) als Transferpuffer geblottet. Die RNA-Leiter von Bethesda Research Laboratories wurde als Größenmarker verwendet, und ein Random-geprimtes (Feinberg & Vogelstein, 1983) ³²Pmarkiertes 0,9 kb RGAE I PCR-Produkt (siehe den vorherigen Abschnitt) wurde als eine Sonde in der Northern-Analyse verwendet. Die Hybridisierung wurde in 5 × SSC (Sambrook et al., 1989), 5 × Denhardt's-Lösung (Sambrook et al., 1989), 0,5% SDS (w/v) und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA mit einer Sondenkonzentration von ca. 2,5 ng/ml für 16 Stunden bei 65°C durchgeführt, gefolgt von Waschen in 5 × SSC bei 65°C (2 × 15 Minuten), 2 × SSC, 0,5% SDS (1 × 30 Minuten), 0,2 × SSC, 0,5% SDS (1 × 30 Minuten) und 5 × SSC (2 × 15 Minuten). Der Filter wurde bei –80°C für 4 Tage autoradiographiert.
Die RGAE I cDNA-Sonde detektiert eine 1,0 kb mRNA-Spezies leicht in 5 Tage alten Mycelien und schwach in 4 Tage alten Mycelien, aber nicht in 1 bis 3 Tage alten Mycelien, was zusammenfällt mit den abnehmenden Mengen an Glucose in dem Wachstumsmedium nach Tag 1, mit nicht nachweisbarer Glucose im Überstand nach Tag 3.
Isolierung und Charakterisierung einer Gesamtlängen-cDNA kodierende Rhamnogalacturonan-Acetylesterase I (RGAE I) aus A. aculeatus
Um einen Gesamtlängen-cDNA-Klon für RGAE I zu isolieren, wurden 30.000 Kolonien aus dem cDNA-Bibliothekspool #33 auf LB-Agar (24 × 24 cm Platte, Nunc) enthaltend Ampicillin (100 μg/ml) ausplattiert und auf einer LB + Amp-Platte bedeckt mit einem Nylonfilter (Hybond-N, Amersham) repliziert. Das gereinigte 0,9 kb RGAE I PCR-Fragment wurde durch Random-Priming wie oben beschrieben ³²P-markiert und als Sonde für das Screenen des Bibliothekpooos durch Koloniehybridisierung (Sambrook et al., 1989) verwendet. Die Hybridisierung wurde durchgeführt in 2 × SSC (Sambrook et al., 1989), 5 × Denhardt's-Lösung (Sambrook et al. 1989), 1% (w/v) SDS und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA mit einer Sondenkonzentration von 2,5 ng/ml für 16 Stunden bei 65°C, anschließend in 2 × SSC (2 × 15 Minuten), 0,2 × SSC, 1% SDS (2 × 30 Minuten) und in 2 × SSC (2 × 15 Minuten), gefolgt von Autoradiographie bei – 80°C für 12 Stunden. Das Screenen von 30.000 Kolonien aus Pool 33 führte zu 5 möglichen RGAE I cDNA-Klonen, die Kolonie-gereinigt wurden durch zwei weitere Hybridisierungsrunden. Einer dieser Klone (als pRGA1 bezeichnet) wurde durch Spalten des Plasmids mit HindIII und XbaI und Sequenzieren der Enden des 1,0 kb cDNA-Inserts mit den vorwärts gerichteten und reversen pYES 2,0 Polylinker-Primern, charakterisiert.
Das 1,0 kb Insert in pRGA1 enthält einen 0,85 kb offenen Leserahmen (ORF), beginnend mit einem ATG-Kodon bei Nukleotidposition 40 und endend mit einem TGA-Stoppkodon (8 und 9). 9 zeigt die Nukleotidsequenz des 3'-Endes der rga1 cDNA und die abgeleitete Primärstruktur von RGAE I von A. aculeatus. Dem ORF geht eine 39 bp 5' nicht-kodierende Region voran und ihm folgt eine 132 bp 3' nicht-kodierende Region und ein poly(A)-Schwanz. Der Vergleich der abgeleiteten Proteinsequenz mit der NH₂-terminalen Sequenz der gereinigten reifen RGAE I zeigt, dass die cDNA ein Vorläuferprotein enthaltend ein 18 Reste langes Signalpeptid (8) kodiert.
Konstruktion eines Aspergillus-Expressionsvektors
Der Vektor pHD414 (10) ist abgeleitet von dem Plasmid p775 (beschrieben in EP 238 023 ). Im Gegensatz zu diesem Plasmid hat pHD414 eine Abfolge von einmaligen Restriktionsstellen zwischen dem Promotor und dem Terminator. Das Plasmid wurde konstruiert durch Entfernen eines ungefähr 200 bp langen Fragments (enthaltend ungewünschte RE-Stellen) an dem 3'-Ende des Terminators, und das anschließende Entfernen eines ungefähr 250 by langen Fragments an dem 5'-Ende des Promotors, das ebenfalls ungewünschte Stellen enthielt. Die 200 bp Region wurde entfernt durch Spaltung mit NarI (liegt in dem pUC-Vektor) und XbaI (unmittelbar 3' zu dem Terminator), anschließendes Auffüllen der gebildeten Enden mit Klenow DNA-Polymerase + dNTPs, Reinigung des Vektorfragments auf dem Gel und Religation des Vektorfragments. Das Plasmid wurde als pHD413 bezeichnet. pHD413 wurde mit StuI (liegt in dem 5'-Ende des Promotors) und PvuII (in dem pUC-Vektor) geschnitten, im Gel aufgetrennt und religiert, was zu pHD414 führte. 10 ist eine Karte des Plasmids pHD414, wobei „AMG Terminator" den A. niger-Glucoamylaseterminator bezeichnet und „TAKA Promotor" den A. oryzae-TAKA-Amylasepromotor bezeichnet. pHD464 ist abgeleitet von pHD414, in dem die 5' nicht-translatierte Region durch die 5' nichttranslatierte Region des Aspergillus-TPI-Gens ersetzt wurde.
Herstellung einer RGAE I-Expressionskassette
Plasmid-Minipräp-DNA aus pRGAI wurde mit BamHI und XhoI gespalten, in einem 0,7% Agarose-Gel elektrophoretisiert, gefolgt von Reinigen des 1,0 kb cDNA-Inserts unter Verwendung des Geneclean II-Kits nach den Angaben des Herstellers (Bio 101 Inc., La Jolla) und Ligation in einen BamHUXhoIgespaltenen pHD414-Vektor. Ein μl der Ligationsmischung wurde in E. coli 1061 elektroporiert, und zwei Transformanten wurden durch BamHUXhoI-Spaltung von Plasmid-Minipräp-DNA analysiert. Da beide Klone (als pRGAI und pRGA2 bezeichnet) das Insert korrekter Größe enthielten, wurde pRGAI für weitere Experimente ausgewählt. Eine Midi-Präparation des pRGAI-Expressionsplasmids (Qiagen Tip 100, siehe Abschnitt 4) wurde durch Sequenzieren des 5'-Endes des Konstrukts überprüft und in einer Aspergillus oryzae-Transformation verwendet.
Transformation von Aspergillus oryzae und Analyse der Transformanten
100 ml des Aspergillus-Minimalmediums (1 M Saccharose, 10 mM Harnstoff, 0,52 mg/ml KCl, 0,52 mg/ml MgSO₄, 1,52 mg/ml KHP₂O₄, 0,04 μg/ml Na₂B₄O₇, 0,4 μg/ml CuSO₄, 0,8 μg/ml FePO₄, 0,8 μg/ml MnSO₄, 0,8 μg/ml Na₂MoO₄, 8 μg/ml ZnSO₄) wurden mit Sporensuspensionen von A. oryzae-Stämmen 1560 oder 1560-710 oder A. niger angeimpft, das Mycelium wurde durch Filtration durch steriles Miracloth nach 24 Stunden Wachstum bei 30°C gesammelt, mit 200 ml 0,6 M MgSO₄ gewaschen, in 25 ml kalter 1,2 M MgSO₄, 10 mM NaH₂PO₄, pH 5,8 enthaltend 2 mg/ml Novozym^® (Novo Nordisk A/S) suspendiert und auf Eis für 5 Minuten inkubiert. Ein ml BSA (12 mg/ml, sterilfiltriert) wurde zu den Mycelien hinzugefügt, und die Suspension wurde bei 37°C für 1,5 Stunden unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Protoplasten wurden von unverdauten Mycelien-Trümmern durch Filtern durch Miracloth entfernt, mit 5 ml 0,6 M Sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH 7,0 überschichtet und bei 2500 rpm für 15 Minuten zentrifugiert. Die Protoplasten wurden aus der Interphase gesammelt, vier Mal in 3 ml 1,2 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂ gewaschen, in dem gleichen Puffer bei einer Konzentration von zwischen 5 × 10⁷ – 5 × 10⁸/ml resuspendiert und sofort verwendet.
Die Transformation von A. oryzae oder A. niger wurde im Wesentlichen wie folgt ausgeführt. Acht μg Qiagen-gereinigte pRGAI-Plasmid-DNA (1 μg/μl) wurde mit 1 μg Qiagen-gereinigter ToC 90 (1 μg/μl) Co-Plasmid-DNA, einem A. nidulans-AmdS-Gen-tragenden Plasmid und 100 μl Protoplastensuspension gemischt und bei RT für 20 Minuten inkubiert. 250 μl 60% (w/v) PEG, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl₂ wurden zugefügt, und die Mischung wurde bei RT für 20 Minuten inkubiert. Nach dem Hinzufügen von 3 ml 1,2 M Sorbitol wurde die Transformationsmischung bei 2500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, in 100 μl 1,2 M Sorbitol resuspendiert, auf AmdS-Selektionsplatten ausgebracht und bei 30°C für 3 bis 5 Tage inkubiert.
Zwanzig ml Aliquots von YP + Maltodextrin-(2%)-Medium wurden mit Sporensuspensionen von AmdS⁺-Transformanten, die mit dem ToC-Plasmid (4 in A. oryzae 1560-710, 2 in dem Stamm 1560) kotransformiert wurden, angeimpft, gefolgt von Wachstum bei 30°C für 2 bis 3 Tage. Die Transformanten wurden auf RGAE I-Aktivität gescreent durch Testen des Kulturmediums auf Rhamnogalacturonan-Acetylesterase und Acetylesteraseaktivitäten. Die Menge und die Reinheit der Proteine, die von verschiedenen Transformanten in das Kulturmedium abgegeben wurden, wurde gemessen durch Analysieren von 4 μl Aliquots der Überstand-Fraktionen auf 10% SDS-PAGE (Fey et al. 1984), gefolgt von entweder Coomassie- oder Silberfärbung, unter Verwendung der gereinigten RGAE I-Enzympräparation von A. aculeatus als Kontrolle.
Enzymatische Assays
Die Acetylesteraseaktivität in dem Kulturmedium der AmdS⁺-Transformanten wurde gemessen als Anstieg der Absorption bei ODaos nach Inkubation von 20 μl Proben bei 40°C für 30 Minuten in 500 μl 2 mM p-Nitrophenyl-Acetat/20 mM Na-Citratpuffer; pH 5,0, wobei Kulturmedium von A. oryzae 1560-710 als eine Negativkontrolle und die gereinigte RGAE I-Präparation (0,78 mg/ml) als eine Positivkontrolle verwendet wurden. Vor der Messung wurde der pH durch Hinzufügen von 1 ml Tris-HCl, pH 7,0, zu den Proben angehoben. Aufgrund einer hohen Acetylesteraseaktivität in dem Kontrollstamm zeigten alle Proben eine vergleichbare Aktivität gegenüber p-Nitrophenyl-Acetat (Daten nicht gezeigt) mit keinem nachweisbaren Anstieg in den AmdS⁺-Transformanten.
Die Rhamnogalacturonan-Acetylesteraseaktivität in dem Kulturmedium (siehe oben) wurde gemessen als eine Freisetzung von Acetat aus modifizierten haarigen Regionen (MHR), isoliert aus Apfelpektin (Schols et al. 1990). Die Proben (50 μl jedes Überstandes) wurden mit 100 μl 1% (w/v, in H₂O) modifizierten haarigen Regionen für a) 2 Stunden und b) 24 Stunden inkubiert, wobei die gleichen Kontrollproben wie oben verwendet wurden. Die Bestimmung von Essigsäure wurde durchgeführt unter Verwendung des Essigsäure-Kits von Boehringer Mannheim nach den Angaben des Herstellers. Fünf von sechs AmdS+-Transformanten zeigten eine klare Aktivität gegenüber 1% MHR, während die sechste Transformante keine Aktivität verglichen mit dem A. oryzae-Kontrollstamm 1560-710 (11) zeigte. 11 zeigt die Aktivität gegenüber 1% modifizierten haarigen Regionen (MHR), gebildet durch rekombinante A. oryzae-Stämme, die Rhamnogalacturonan-Acetylesterase I aus A. aculeatus exprimieren. Die enzymatischen Aktivitäten wurden bestimmt als eine Freisetzung von Acetat aus Apfelpektin MHR. Die höchsten Aktivitäten, die in den Transformanten RGAE 710-1 und RGAE 710-4 beobachtet wurden, werden begleitet von einem ca. 35 kDa Protein, das in das Kulturmedium abgegeben wurde. Das Protein ist leicht überglycosyliert verglichen mit der gereinigten RGAE I aus A. aculeatus, wie durch SDS-PAGE beurteilt.
Medien
YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H₂O auf 810 ml. Autoklaviert, 90 ml 20% Glucose (sterilfiltriert) hinzugefügt.
YPG-Agar: 25 g/l Bactoagar, 15 g/l Glucose, 5 g/l KP₂O₄, 0,5 g/l MgSO₄-7H₂O, pH eingestellt auf 5,0. Autoklaviert.
10 × Basalsalz: 66,8 g Hefestickstoffbase, 100 g Bernsteinstäure, 60 g NaOH, H₂O auf 1000 ml, sterilfiltriert.
SC-URA: 90 ml 10 × Basalsalz, 22,5 ml 20% Casaminosäuren, 9 ml 1% Tryptophan, H₂O auf 806 ml, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 90 ml 20% Glucose hinzugefügt.
SC-H-Agar: 7,5 g/l Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosäuren ohne Vitamine, 0,1 g/l Tryptophan und 20 g/l Agar (Bacto). Autoklaviert für 20 Minuten bei 121°C. Nach dem Autokla vieren wurden 55 ml einer 22% Galactoselösung und 1,8 ml einer 5% Threoninlösung pro 450 ml Agar hinzugefügt.
YNB-1-Agar: 3,3 g/l KH₂PO₄, 16,7 g/l Agar, pH eingestellt auf 7. Autoklaviert für 20 Minuten bei 121°C. Nach dem Autoklavieren wurden 25 ml einer 13,6% Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 25 ml einer 40% Glucoselösung, 1,5 ml einer 1% L-Leucinlösung und 1,5 ml einer 1% Histidinlösung pro 450 ml Agar hinzugefügt.
YNB-1-Brühe: Zusammensetzung als YNB-1-Agar, aber ohne den Agar.
MHR-Überschichtungsgel: 1% Agarose, 0,5% MHR in 0,05 M Na-Acetatpuffer, pH 4,5. Das Gel wurde gekocht und anschließend auf 55°C abgekühlt, bevor die Überschicht auf Agarplatten gegossen wurde.
FG-4-Agar: 35 g/l Agar, 30 g/l Sojabohnenmehl, 15 g/l Maltodextrin (Glucidex 6), 5 g/l Bacto-Pepton, pH 7. Autoklaviert 40 Minuten bei 121°C.
FG-4-Medium: 30 g/l Sojabohnenmehl, 15 g/l Maltodextrin (Glucidex 6), 5 g/l Bacto-Pepton. Autoklaviert 40 Minuten bei 121°C.
MDU-2-Medium: 45 g/l Maltose, 1 g/l MgSO₄-7H₂O, 1 g/l NaCl, 2 g/l K₂SO₄, 12 g/l KH₂PO₄, 0,1 ml/l Pluronic 61 L, 0,5 ml/l Spurenmetalllösung. pH 5,0. Autoklaviert 20 Minuten bei 121°C. 15 ml/l 50% sterilfiltrierter Harnstoff wurde nach dem Autoklavieren hinzugefügt.
Spurenmetalllösung: 13,9 g/l FeSO₄-7H₂O, 8,45 g/l MnSO₄-H₂O, 6,8 g/l ZnCl₂, 2,5 g/l CuSO₄-5H₂O, 0,24 g/l NiCl₂-6H₂O, 3 g/l Zitronensäure.
Für das bessere Verständnis der Erfindung wird auf die folgenden Literaturstellen Bezug genommen.
Aviv, H. & Leder, P. 1972. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69: 1408–1412.
Becker, D. M. & Guarante, L. 1991. Methods Enzymol. 194: 182–187.
Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J. & Rutter, W. J. 1979. Biochemistry 18: 5294–5299.
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Fey, S., Mose Larsen, P. & Biskjæer, N. L. 1984. Doktorarbeit, Faculty of Natural Sciences, Aarhus University, Dänemark.
Gubler, U. & Hoffinan, B. J. 1983. Gene 25: 263–269.
Hanahan, D. 1985 in DNA Cloning, (Glover, D. M., Hrsg.) IRL, Oxford, Band 1, Seiten 109–135.
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Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463–5467.
Schols, H. A., Geraeds, C. C. J. M., Searle-van Leeuwen, M. J. F., Kormelink, F. J. M. & Voragen, A. G. J. 1990. Carbohydrate Res. 206: 105–115.
Southern, E. M. 1975. J. Mol. Biol. 98: 503–517.
SEQUENZLISTE

Claims

Gereinigtes Polypeptid mit Rhamnogalacturonanacetylesterase-(RGAE)-Aktivität, das die teilweise Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder eine teilweise Aminosäuresequenz mit einer Homologie von wenigstens 70% zu SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1, das die teilweise Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das die Fähigkeit besitzt, Acetat aus Apfelpektin-modifizierten haarigen („hairy") Regionen (MHR) freizusetzen.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die RGAE-Aktivität gemessen wird unter Verwendung des Assays, der auf S. 28 der Beschreibung („Die Rhamnogalacturonanacetylesterase-Aktivität -- Anweisungen des Herstellers") beschrieben ist.
Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die RGAE-Aktivität der Freisetzung von wenigstens ca. 12,5 μg Essigsäure/ml entspricht.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–5, das umfasst wenigstens eine von a) die Aminosäuresequenz, die in 7 gezeigt ist; b) die Aminosäuresequenz, die in 8 gezeigt ist, oder die Sequenz von Aminosäuren 19–59 darin; c) die Aminosäuresequenz, die in 9 gezeigt ist; d) die Aminosäuresequenz, die kodiert wird von der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7; oder SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9; oder SEQ ID Nr. 10; e) eine Aminosäuresequenz, die von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die i) mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 10 unter den folgenden Bedingungen hybridisiert: Prä-Tränken in 5 × SSC und Prähybridisieren für 1 Stunde bei ∼40°C in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und 50 μg denaturierter sonifizierter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisieren in derselben Lösung, die ergänzt ist mit 50 mCi 32-P-dCTP-markierter Sonde für 18 Stunden bei ∼40°C gefolgt von drei Waschzeiten in 2 × SSC, 0,2% SDS bei 40°C für 30 Minuten; ii) mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 10 unter irgendeiner der Bedingungen hybridisiert, die auf S. 24–25 der Beschreibung („Southern-Blot-Analyse -- und reverse pYES 2,0 Polylinker-Primer.") beschrieben sind; iii) wenigstens 70% homolog zu SEQ ID Nr. 10 ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–6, das immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper, der gegen eine gereinigte RGAE abgeleitet von Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, gerichtet ist.
Rekombinante DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz umfasst, die das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–7 kodiert.
Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 8, wobei die DNA-Sequenz umfasst wenigstens eine von a) die DNA-Sequenzen, die in 7 gezeigt sind; b) die DNA-Sequenz, die in 8 gezeigt ist; oder Nukleotide 40–215 davon; c) die DNA-Sequenz, die in 9 gezeigt ist; oder Nukleotide 1–159 davon; d) die folgenden DNA-Sequenzen SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7; oder SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9; oder SEQ ID Nr. 10; e) eine DNA-Sequenz, die i) mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 10 unter den folgenden Bedingungen hybridisiert: Prä-Tränken in 5 × SSC und Prähybridisieren für 1 Stunde bei ∼40°C in einer Lösung aus 5 × SSC, 5 × Denhardt's Lösung, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, und 50 μg denaturierter sonifizierter Kalbsthymus-DNA, gefolgt von Hybridisieren in derselben Lösung, die ergänzt ist mit 50 mCi 32-P-dCTP-markierter Sonde für 18 Stunden bei ∼40°C gefolgt von drei Waschzeiten in 2 × SSC, 0,2% SDS bei 40°C für 30 Minuten; ii) mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 10 unter irgendeiner der Bedingungen hybridisiert, die auf S. 24–25 der Beschreibung („Southern-Blot-Analyse -- und reverse pYES 2,0 Polylinker-Primer.") beschrieben sind; iii) wenigstens 70% homolog zu SEQ ID Nr. 10 ist.
Vektor umfassend die rekombinante DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 8–9.
Transformierte Wirtszelle enthaltend den Vektor gemäß Anspruch 10.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit RGAE-Aktivität unter Verwendung einer transformierten Wirtszelle nach Anspruch 11.
Verwendung des Polypeptids mit RGAE-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1–7 für wenigstens einen der folgenden Zwecke a) als ein Mittel zur Degradation oder Modifikation von MHR oder acetyliertem Rhamnogalacturonan; b) als ein Mittel zur Degradation oder Modifikation von Pflanzenzellwänden; c) in Kombination mit anderen Pflanzenzellwand-degradierenden Enzymen; d) in Kombination mit anderen Pflanzenzellwand-degradierenden Enzymen, um ein Produkt mit einem gesteigerten Anteil an RGAE-Aktivität zuzubereiten; e) in Kombination mit einer Pektinase-Zubereitung verwendbar zur Degradation oder Modifikation von Pflanzenzellwänden; f) in Kombination mit einer Pektinase-Zubereitung verwendbar zur Degradation oder Modifikation von Pflanzenzellwänden, um ein Produkt mit einem gesteigerten Anteil an RGAE-Aktivität zuzubereiten; g) zusammen mit Enzymen, die spezifisch für deacetylierte oder teilweise deacetylierte MHR sind; h) zusammen mit Enzymen, die spezifisch sind für deacetylierte oder teilweise deacetylierte MHR, um ein Produkt mit einem gesteigerten Anteil an RGAE-Aktivität zuzubereiten.