ES2199942T3 - Ramnogalacturonano acetilesterasa (rgae) de aspergillus aculeatus. - Google Patents
Ramnogalacturonano acetilesterasa (rgae) de aspergillus aculeatus.Info
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Abstract
UNA SECUENCIA AMINO ACIDA PARCIAL DE UN RGAE OBTENIBLE POR MEDIO DE ASPERGILLUS ACULEATUS SE DESCRIBE, Y TAMBIEN SECUENCIAS DE DNA RECOMBINADAS CORRESPONDIENTES, VECTORES Y ANFITRIONES TRANSFORMADOS. USO DEL RGAE PARA DEGRADACION DE REGION PELUDA ACETILADA MODIFICADA SE DESCRIBE.
Description
Ramnogalacturonano acetilestearasa (RGAE) de
Aspergillus aculeatus.
La invención comprende un nuevo enzima, que es
una ramnogalacturonano acetilesterasa (a partir de ahora se
empleará normalmente la abreviatura RGAE), una secuencia de ADN
correspondiente, un vector, un huésped transformado, un método para
la producción de una RGAE, una preparación enzimática y un uso de
la RGAE.
La invención proporciona la caracterización,
detección y descripción de una nueva RGAE, una secuencia parcial de
aminoácidos de este enzima, secuencias parciales del ADN, una
secuencia completa de aminoácidos y una secuencia completa del
ADN.
La RGAE es una hidrolasa cuyo nombre enzimático
sistemático es éster acético ramnogalacturonano acetilhidrolasa,
que pertenece al grupo de las acetil esterasas (EC no. 3.1.1.6) y
que cataliza la hidrólisis de los ésteres acéticos en los alcoholes
y el acetato correspondientes.
Los polisacáridos (p. ej. pectinas) vegetales son
frecuentemente sustituidos por grupos acetilo (Rombouts, F.M., J.F.
Thibault, C. Mercier, "Oxidative enzyme-catalyzed
crosslinking of beet pectins", patente US Nº. 4,672,034). En las
aplicaciones de los polisacáridos, estas sustituciones influyen en
las propiedades de gelificación (Williamson G., C.B. Faulds, J.A.
Matthew, D.B. Archer, V.J. Morris, G.J. Brownsey, M.J. Ridout,
"Gelation of sugarbeet and citrus pectins using enzymes extracted
from orange peel", Carbohydrate Polymers 13,
387-397, 1990). En el tratamiento del material
vegetal, p. ej. frutas y verduras, se utilizan enzimas endógenos
como ayudantes del procesamiento para mejorar la producción y la
calidad del producto final (Pilnik, W., A.G.J. Voragen., "Effect
of enzyme treatment on the quality of processed fruits and
vegetables", en: Jen J.J., "Quality factors of fruits and
vegetables, chemistry and technology", ACS Symp. Ser. 405,
American Chemical Society, Washington DC, 250-269,
1989). Schols et al. aislaron y caracterizaron un fragmento de
pectina polimérica ácida a partir de membranas celulares de manzana
utilizando una preparación enzimática técnica que contenía enzimas
pectolíticos, hemicelulolíticos y celulolíticos. Este polisacárido
resistente a los enzimas, denominado "región vellosa
modificada" (MHR), consiste en un esqueleto de
ramnogalacturonano muy ramificado, con grupos acetilo en los
residuos de ácido galacturónico (Schols, H.A., M.A. Posthumus,
A.G.J. Voragen, "Structural features of hairy regions of pectins
isolated from apple juice produced by the liquefaction process",
Carbohydrate Research, 206, 117-129, 1990). La
detección extensiva de preparaciones enzimáticas comerciales ha
dado como resultado una preparación de Aspergillus aculeatus
capaz de degradar la MHR. A partir esta preparación se identificó y
se purificó un nuevo enzima llamado ramnogalacturonasa (RG).
Durante la purificación de la RG se observó que el enzima trabaja
sólo en la MHR saponificada y que en consecuencia las esterasas,
particularmente las acetilesterasas, ejercen un papel importante en
la degradación de la MHR (Schols, H.A., C.C.J.M. Geraeds, M.J.F.
Searle-van Leuwen, F.J.M. Kormelink, A.G.J. Voragen,
"Rhamnogalacturonase: a novel enzyme that degrades the hairy
regions of pectins", Carbohydrate research 206,
105-115, 1990). Por lo tanto, los enzimas que
pueden desacetilar los ramnogalacturonanos ramificados, como por
ejemplo la HMR, son necesarios en la medida en que la elevada
cantidad de acetilación en los ramnogalacturonanos ramificados
obstaculiza la acción de los enzimas con mayor actividad en los
ramnogalacturonanos desacetilados.
Se sabe que varios polisacáridos (xilano, manano
y pectina) son acetilados y se sabe que las acetilesterasas son muy
específicas contra su sustrato polisacárido específico, aunque
algunas de ellas muestran actividad en sustratos
no-polisacáridos, como en los acetatos triacetina y
naftol. Una acetilesterasa de Aspergillus Niger, activa
frente a la triacetina y a la pectina de la remolacha, ha sido
descrita por Mathew et al. (Mathew, J.A., S.J. Howson, M.H.J.
Keenan, P.S. Belton, "Improvement of the gelation properties of
sugarbeet pectin following treatment with an enzyme preparation
derived from Aspergillus Niger - Comparison with a chemical
modification", Carbohydrate Polymers 12,
295-306, 1990). La pectina acetilesterasa, altamente
activa frente a la triacetina, ha sido purificada a partir de
cáscara de cítricos (Wiliamson, G., "Purification and
characterisation of pectin acetyl esterase from orange peel",
Phytochemistry 30, 445-449, 1991). La actividad en
la HMR no ha sido demostrada en ninguna acetilesterasa de
polisacáridos de la técnica precedente.
De esta manera, la capacidad de las
acetilesterasas para hidrolizar los grupos acetilo de la HMR no ha
sido demostrada para ninguna acetilesterasa de la técnica
precedente, por lo tanto el objetivo de la invención es proporcionar
una RGAE con alta especificidad hacia la HMR.
La RGAE según la invención está caracterizada por
el hecho de ser inmunológicamente reactiva con un anticuerpo creado
contra una RGAE purificada derivada de Aspergillus
aculeatus, CBS 101.43.
En este contexto, la expresión "derivado de"
no sólo pretende indicar una RGAE producida por la cepa CBS 101.43,
sino que también se refiere a una RGAE codificada por una secuencia
de ADN aislada de la cepa de CBS 101.43 y producida en un organismo
huésped transformado con dicha secuencia de ADN.
Una forma de realización preferida de la RGAE
según la invención muestra la siguiente secuencia parcial de
aminoácidos
( SEQ ID No.1)
o una secuencia parcial de aminoácidos homóloga a
esta que forme parte de un polipéptido con actividad RGAE.
En este contexto, el término "homólogo"
indica un polipéptido codificado por el ADN que se hibrida con la
misma sonda que el ADN que codifica el enzima de la RGAE bajo unas
condiciones específicas determinadas (como pueden ser: remojo en 5x
SSC y prehibridación durante 1 hora a \sim40ºC en una solución de
5x SSC, 5x solución Denhardt, fosfato sódico 50 mM, pH 6.8, y 50
\mug de ADN de timo de ternero ultrasónico desnaturalizado, e
hibridación en la misma solución completada con 50 \muCi de una
sonda marcada con 32-P-dCTP durante
18 horas a \sim40ºC seguido de tres lavados en 2x SSC, SDS al 0.2%
a 40ºC durante 30 minutos). Más específicamente, el término hace
referencia a una secuencia de ADN con al menos el 70% de homología
con la secuencia mostrada anteriormente codificadora de la RGAE de
la invención. El término incluye modificaciones de la secuencia de
ADN arriba indicada, como es el caso de sustituciones de un
nucleótido que no den lugar a otra secuencia de aminoácidos de la
RGAE pero que corresponda al uso del codón del organismo huésped en
el cual se introduce la construcción del ADN, o sustituciones de un
nucleótido que den lugar a una secuencia de aminoácidos diferente y
en consecuencia, posiblemente, a una estructura distinta de las
proteínas, lo que podría dar lugar a una RGAE mutante con
propiedades distintas a las del enzima nativo. Otros ejemplos de
posibles modificaciones son la inserción de uno o más nucleótidos
en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cada
extremo de la secuencia o la eliminación de uno o más nucleótidos en
cada extremo o en el interior de la secuencia.
Así, sorprendentemente, se ha descubierto que la
RGAE según la invención es altamente específica para la
desacetilacián de la MHR, pero que no muestra acitividad con
triacetina y pectina de la remolacha, y también muestra una
especificidad más elevada que la de las esterasas de la técnica
precedente.
La secuencia parcial de aminoácidos arriba
indicada puede ser utilizada para elaborar sondas de ADN útiles
para realizar la selección de una biblioteca genómica para
organismos que expresen este enzima, o una biblioteca de ADNc,
obteniendo así o bien secuencias de ADN útiles para obtener una
sobreproducción de RGAE, en el caso de que se inserte en la especie
del microorganismo a partir del cual se originó la molécula de ADN
inicial, o bien la producción de la RGAE sin el acompañamiento de
enzimas relacionados, en el caso de que se inserte en un
microorganismo huésped que, en su estado no- transformado, no
produce enzimas relacionados con la RGAE. Las secuencias de ADN
pueden ser establecidas de otra manera, tal y como se explica a
continuación.
Por lo tanto, el objetivo de la invención es
proporcionar una nueva RGAE y medios y métodos para la producción
de la RGAE con un mejor rendimiento y con una pureza más elevada
que la que hasta ahora era posible, y también proporcionar un uso
de la RGAE, sola o en combinación con otras cantidades
significativas de enzimas, para la degradación del tejido de la
pared celular vegetal lo más eficaz posible hasta el momento.
También es un objetivo de la invención el hecho de proporcionar
nuevos productos, en los que aumenta o disminuye la proporción de
la RGAE con respecto a la proporción del producto original.
La secuencia de ADN recombinante que se puede
obtener según la invención comprende una secuencia de ADN
codificadora de un polipéptido con actividad RGAE, o bien, una
secuencia de ADN con homología secuencial sustancial con esta
secuencia codificadora de la RGAE.
A continuación se explicará con detalle cómo se
puede producir la secuencia de ADN recombinante según la
invención.
Las preparaciones enzimáticas brutas producidas a
partir de Aspergillus aculeatus para la purificación de la
RGAE pueden producirse de la manera siguiente. Para una mayor
brevedad, a partir de ahora se hará referencia a estas
preparaciones en bruto de Aspergillus aculeatus como
A.a.e.p.
La cepa de Aspergillus aculeatus CBS
101.43 como donante de genes fue fermentada a una escala de planta
piloto de la siguiente manera.
Se preparó un sustrato de agar con la siguiente
composición en un matraz Fernbach:
| Peptona Difco | \hskip5pt 6 g |
| Aminolin Ortana | \hskip5pt 4 g |
| Glucosa | \hskip5pt 1 g |
| Extracto de levadura Difco | \hskip5pt 3 g |
| Extracto de carne Difco | \hskip5pt 1.5 g |
| KH_{2}PO_{4} Merck | 20 g |
| Extracto de malta Evers | 20 g |
| H_{2}O por intercambio iónico | hasta 1000 ml |
Se ajustó el pH entre 5.30 y 5.35. A
continuación, se añadieron 40 g de Agar Difco y la mezcla fue
sometida a autoclave durante 20 minutos a 120ºC (el sustrato se
denomina E-agar).
La cepa CBS 101.43 fue cultivada en
E-agar inclinado (37ºC). Las esporas del agar
inclinado fueron suspendidas en leche desnatada esterilizada y la
suspensión fue liofilizada en frascos. El contenido de un frasco
liofilizado fue transferido al matraz Fernbach. El matraz fue luego
incubado durante 13 días a 30ºC.
Se preparó un sustrato con la siguiente
composición en un fermentador semilla de 500 litros:
| CaCO_{3} | 1.2 kg |
| Glucosa | 7.2 kg |
| Rofec (materia seca con agua de maíz) | 3.6 kg |
| Aceite de soja | 1.2 kg |
Se añadió agua corriente hasta un volumen total
de unos 240 litros. Se ajustó el pH hasta casi 5.5 antes añadir
CaCO_{3}. El sustrato fue esterilizado en el fermentador semilla
durante 1 hora a 121ºC. El volumen final antes de la inoculación
era de unos 300 litros.
La suspensión de esporas del matraz Fernbach fue
transferida al fermentador semilla. Las condiciones de la
fermentación semilla fueron:
Tipo de fermentador: fermentador convencional
ventilado y agitado con una proporción altura/diámetro de alrededor
de 2.3.
| Agitación: | 300 rpm (dos turbinas propulsoras) |
| Ventilación: | 300 litros normales de aire por minuto |
| Temperatura: | de 30 a 31ºC |
| Duración: | Alrededor de 28 horas |
Alrededor de 28 horas después de la inoculación,
se transfirieron 150 litros del fermentador semilla al fermentador
principal.
Un sustrato con la siguiente composición fue
preparado en un fermentador principal de 2500 litros:
| Harina de soja tostada | 90 kg |
| KH_{2}PO_{4} | 20 kg |
| Antiespumante Pluronic® | 150 ml |
Se añadió agua corriente hasta un volumen total
de unos 900 litros. La harina de soja tostada fue suspendida en el
agua. El pH fue ajustado a 8.0 con NaOH, y la temperatura fue
aumentada a 50ºC. A continuación, se añadieron alrededor de 925
unidades Anson de Alcalase® 0.6 L a la suspensión. La mezcla fue
mantenida durante 4 horas a 50ºC y con un pH = 8.0 (añadiendo
Na_{2}CO_{3}) sin ventilación y se agitó a 100 rpm. Luego se
añadieron los componentes restantes del sustrato y se ajustó el pH
hasta más o menos 6.0 con ácido fosfórico. El sustrato fue
esterilizado en el fermentador principal durante 1^{1/2} horas a
123ºC. El volumen final antes de la inoculación fue de unos 1080
litros.
Después se añadieron 150 litros de un cultivo
semilla.
Las condiciones de la fermentación fueron las
siguientes:
\newpage
Tipo de fermentador: fermentador ventilado y
agitado de forma convencional con una proporción altura/diámetro de
alrededor de 2.7.
| Agitación: | 250 rpm (dos turbinas) |
| Aireación: | 1200 litros de aire por minuto |
| Temperatura: | 30ºC |
| Duración: | Alrededor de 151 horas |
A partir de la hora 24 de fermentación hasta
alrededor de la hora 116 de fermentación, se añadió asépticamente
una solución de pectina al fermentador principal a un ritmo
constante de unos 8 litros por hora. La solución de pectina con la
siguiente composición fue preparada en un tanque dosificador de 500
litros:
| Genu Pectina * | 22 kg |
| Ácido fosfórico, conc. | 6 kg |
| Antiespumante Pluronic® | 50 ml |
| * Pectina Genu (NF de tipo cítrico de Copenhagen pectin factory Ltd.) |
Se añadió agua corriente hasta un volumen total
de unos 325 litros. El sustrato fue esterilizado en el tanque
dosificador durante 1 hora a 121ºC. El volumen final antes del
comienzo de la dosificación era de unos 360 litros. Una vez
terminada esta cantidad, se realizó otra similar. El volumen total
de la solución de pectina para la fermentación fue de unos 725
litros.
Transcurridas alrededor de 151 horas de
fermentación, se detuvo el proceso de fermentación. Se enfriaron
casi 1850 litros de caldo de cultivo a unos 5ºC y los enzimas
fueron recuperados según el método siguiente.
El caldo de cultivo fue filtrado en un tambor con
un filtro de tambor al vacío (Dorr Oliver) que fue pretratado con
tierra de diatomeas de Hyflo Supercell (materia filtrante). El
filtrado fue concentrado por evaporación hasta casi el 15% del
volumen del caldo de cultivo. El concentrado fue filtrado en un
filtro Seitz (tipo supra 100) con Hyflo Supercell al 0.25% como
materia filtrante (en la tabla siguiente denominada Filtración I).
La materia filtrada fue precipitada con 561 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4}/l a un pH de 5.5, y se añadió tierra de
diatomeas de Hyflo Supercell al 4% como materia filtrante. Se
separaron el filtrado y la materia filtrante mediante la filtración
en un filtro de tela. Se disolvió la torta de filtro en agua y se
separaron las partes insolubles mediante la filtración en un filtro
de tela. Se comprobó la filtración de la materia filtrada en un
filtro Seitz (tipo supra 100) con Hyflo Supercell al 0.25% como
materia filtrante (en la tabla siguiente denominada Filtración II).
La materia filtrada fue diafiltrada en un aparato de
ultrafiltración. Después de la diafiltración, el líquido fue
concentrado hasta alcanzar un contenido de materia seca de un 12.7%
(en la tabla siguiente denominada como Contenido de materia seca
concentrada).
En esta fase puede realizarse un tratamiento de
base facultativo para la extracción parcial de la actividad
proteasa. En el caso de que se utilice el tratamiento de base, se
llevará a cabo con un pH 9.2 durante 1 hora, después el valor del
pH se ajustará a 5.0.
En este punto, se comprueba la filtración del
líquido y se filtra para reducir los gérmenes y se liofiliza la
materia filtrada en un equipamiento de liofilización de Stokes.
La RGAE pura se puede obtener a partir del
A.a.e.p. tal y como se muestra en la Tabla 1.
(Tabla pasa a la página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Caldo de cultivo enzimático de Aspergillus aculeatus \cr 1:
ULTRAFILTRACIÓN - DIÁLISIS\cr Filtron Minisette, superficie de
filtración 3500 cm ^{2} , membrana NMWL 10,000\cr TRIS 20mM, pH
5.0; 5 x volumen\cr \downarrow \cr 2: IEC: AGUA ACCELL
QMA-PLUS, Fig. 1\cr (columna: 5.0 x 23.0 cm, flujo
60 ml/minuto)\cr Eluyente = TRIS 20 mM, pH 5.0, gradiente de NaCl
en aumento:\cr
0.0M-lineal-0.0125M-lineal-0.25M-lineal-0.5M\cr
\downarrow \cr 3: ULTRAFILTRACIÓN - DIÁLISIS\cr Filtron
Minisette, superficie de filtración 3500 cm ^{2} , membrana NMWL
10,000\cr TRIS 20 mM, pH 4.2; 5 x volumen\cr \downarrow \cr 4:
ALGINATO RETICULADO, Fig. 2\cr (columna: 4.9 x 17.5 cm, flujo 10
ml/minuto)\cr Eluyente 1 = TRIS 20mM, pH 4.2; eluyente 2 = TRIS 20
mM, pH 6.0\cr \downarrow \cr 5: PREPARACIÓN DE LA MUESTRA\cr
Agrupación del alignato reticulado, adición de
(NH _{4})_{2} SO _{4} sólido a\cr la concentración 2 M y ajuste
del pH a 5.0\cr \downarrow \cr 6: HIC: FENIL TOYOPEARL 650 (M),
Fig. 3\cr (columna: 5.0 x 25.0 cm, flujo 60 ml/minuto)\cr
Eluyente: agua, gradiente de (NH _{4})_{2} SO _{4} decreciente:\cr
Decrecimiento cóncavo de 2M (= decrecimiento lineal de la
conductividad)-\cr
0.5M-fase-0.0M\cr \downarrow \cr
7: ULTRAFILTRACIÓN - DIÁLISIS\cr Filtron Minisette, superficie de
filtración 3500 cm ^{2} , membrana NMWL 10,000\cr TRIS 20mM, pH
5.0; 5 x volumen\cr \downarrow \cr 8: IEC: PROTEINA PAC DEAE
-8HR, Fig. 4\cr (columna. 2.0 x 10.0 cm, flujo 4.5 mL/minuto)\cr
Eluyente: TRIS 20 mM, pH 5.0; gradiente de NaCl en aumento:\cr
0.0M-fase-0.05M-lineal-0.1M-lineal-0.15M\cr
\downarrow \cr 9: PREPARACIÓN DE LA MUESTRA\cr Agrupación de la
proteína PAC DEAE-8HR, dilución con TRIS 20mM con 2
x\cr volumen\cr (decrecimiento de la molaridad del NaCl para la
siguiente fase)\cr \downarrow \cr 10: IEC: PROTEÍNA PAC
DEAE-8HR, Fig. 5\cr (columna: 2.0 x 10.0 cm, flujo
4.5 mL/minuto)\cr Eluyente: TRIS 20mM, pH 5.0; gradiente de NaCl en
aumento:\cr 20 mM-fase-60
mM-lineal-100
mM-lineal-150 mM\cr \downarrow \cr
RAMNOGALACTURONANO-ACETILESTERASA\cr}
\newpage
ad
1:
Cambio del tampón como preparación para la fase
2, extracción de pequeñas partículas y de aproximadamente el 50%
del color, dilución hasta un máximo de 15 mg proteínas/ml (de lo
contrario la muestra no se uniría a la columna en la fase 2).
ad
2:
IEC es cromatografía de intercambio iónico. La
fracción de acetilestereasa fue agrupada entre 0.04 - 0.08 M de
NaCl.
ad
3:
Concentración y cambio del tampón como
preparación para la fase 4.
ad
4:
Cromatografía de afinidad - la fracción no
retenida fue agrupada. La preparación del alginato reticulado fue
realizada según Rombouts F.M., C.C.J.M. Geraeds, J. Visser, W.
Pilnik, "Purification of various pectic enzymes on crosslinked
polyuronides", en: Gribnau, T.C.J., J. Visser, R.J.F. Nivard
(Editors), Affinity Chromatography and Related Techniques, Elsevier
Scientific Publishing Company, Amsterdam, 255-260,
1982.
ad
5:
Adaptación del tampón como preparación para la
fase 6.
ad
6:
HIC es cromatografía de interacción hidrofóbica.
La fracción de la acetilesterasa fue agrupada entre 1.OM - 0.9M de
(NH_{4})_{2}SO_{4}.
ad
7:
Concentración y cambio del tampón como
preparación para la fase 8.
ad
8:
IEC es cromatografía de intercambio iónico. La
fracción de la acetilesterasa fue agrupada entre 65 mM y 70 mM de
NaCl.
ad
9:
Adaptación del tampón como preparación para la
fase 10.
ad
10:
IEC es cromatografía de intercambio iónico. La
fracción de la acetilesterasa fue agrupada entre 65 mM y 70 mM de
NaCl.
La RGAE así purificada puede ser utilizada para
inmunizar animales para la producción de anticuerpos. Más
específicamente, el antisuero contra la RGAE de la invención puede
ser creado mediante la inmunización de conejos (u otros roedores)
según el procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: A
Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific
Publications, 1973, capitulo 23, o A. Johnstone y R. Thorpe,
Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific
Publications, (más específicamente en las págs.
27-31). Las inmunoglobulinas purificadas pueden ser
obtenidas a partir de los antisueros, por ejemplo mediante la
precipitación de sal ((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguido de la
diálisis y de la cromatografía de intercambio iónico, p. ej. en un
DEAE-Sephadex. La caracterización inmunoquímica de
las proteínas puede realizarse mediante el análisis de doble fusión
de Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental
Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications,
1967, págs. 655-706), por inmunoelectroforesis
cruzada (N. Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4) o por
inmunoelectroforesis de Rocket (N. Axelsen et al., Capítulo
2,).
La secuencia de aminoácidos parcial previamente
indicada fue determinada a partir de la RGAE purificada mediante
una secuenciación automatizada (secuenciador de proteínas Applied
Biosystems 473A). Basándose en la secuencia, se estima que la
pureza de la muestra es superior al 90%.
La RGAE es posteriormente caracterizada, tal y
como se indica a continuación.
La RGAE tiene su actividad óptima con un pH 5.5 y
a una temperatura de 40ºC. A 50ºC y con un pH 5.0 no se pudo
observar pérdida alguna de actividad en un período de 20 horas. A
30ºC la estabilidad del pH fue máxima con un pH
6-7.
La RGAE tiene una actividad específica hacia a la
MHR y liberó aproximadamente un máximo del 70% de todos los grupos
acetilo presentes en la MHR.
Las combinaciones de esta RGAE con pectina
metilesterasa pura de origen tanto cítrico como micótico, y con
exo- y endo-arabinasas puras provenientes de
especies de Aspergillus (Aspergillus Niger, Aspergillus
aculeatus) no produjeron ningún aumento en la liberación de
acetilo de la MHR de la pectina de remolacha o de manzana.
El pre-tratamiento de estos
substratos, para eliminar las cadenas secundarias de arabinosa,
tampoco mostró ningún efecto estimulante. A partir de estos
resultados se constata la identificación de una nueva RGAE, la cual
es altamente específica para los ésteres acetilicos de las regiones
pécticas ramificadas.
Peso molecular: aprox. de 31,000 a 35,000
Daltons
Punto isoeléctrico: pH 4.2
Una forma de realización preferida de la RGAE
según la invención se caracteriza por el hecho de que la RGAE
muestra un pH óptimo entre 4.0 -7.0, preferiblemente entre
4.5-6.0, un punto isoeléctrico de
3.7-6.7, preferiblemente de
4.0-4.5, un peso molecular de entre 30,000 a 50,000
Daltons, y una temperatura óptima entre 10 y 50ºC, preferiblemente
entre 25 y 45ºC.
También consta la invención de una secuencia de
ADN recombinante, caracterizada por codificar la RGAE según la
invención.
Una forma de realización preferida de la
secuencia de ADN recombinante según la invención se caracteriza por
el hecho de que comprende de una secuencia de ADN seleccionada a
partir de
a) el inserto de ADN de la RGAE de Aspergillus
aculeatus
b) una secuencia de ADN que se hibrida con la
región de codificación del ADN de la RGAE madura comprendida en el
inserto de ADN de a) y que comprende un gen estructural para un
polipéptido con actividad RGAE y opcionalmente un promotor, una
región de codificación de un péptido señal o líder y/o un
terminador transcripcional.
c) un derivado de la secuencia de ADN definida en
a) o b), o
d) una secuencia de ADN codificadora de una RGAE
madura o un péptido señal o un péptido líder de la misma, y que
está degenerada respecto del significado del código genético con
respecto a una secuencia de ADN de a) o b).
Una forma de realización preferida de la
secuencia de ADN recombinante según la invención se caracteriza por
el hecho de que consta de las siguientes secuencias de ADN
parciales
Una forma de realización preferida de la
secuencia de ADN recombinante según la invención se caracteriza por
el hecho de que consta de las siguientes secuencias de ADN
Una forma de realización preferida de la
secuencia de ADN recombinante según la invención está caracterizada
por el hecho de que comprende
o una secuencia homóloga a la misma codificadora
de una RGAE según la
invención.
También, la invención consta de un vector
caracterizado por el hecho de que comprende la secuencia de ADN
recombinante según la invención.
Una forma de realización preferida del vector
según la invención se caracteriza por el hecho de que el promotor
es el promotor takaamilasa de Aspergillus oryzae.
La invención también comprende un huésped
transformado caracterizado por el hecho de que contiene el vector
según la invención.
Una forma de realización preferida del huésped
transformado según la invención se caracteriza por el hecho de que
el huésped transformado es una cepa de Aspergillus. De esta
manera se obtiene un buen rendimiento en la producción de la
RGAE.
Una forma de realización preferida del huésped
transformado según la invención se caracteriza por el hecho de que
el huésped transformado es una cepa que pertenece a las especies de
Aspergillus aculeatus, Aspergillus Niger, Aspergillus oryzae
o Aspergillus awamori. De esta manera se obtiene un buen
rendimiento en la producción de la RGAE.
Una forma de realización preferida del huésped
transformado según la invención se caracteriza por el hecho de que
el huésped transformado es un microorganismo, el cual en su estado
no-transformado no produce RGAE o sólo produce RGAE
en cantidades insignificantes, preferiblemente Bacillus sp.,
E. coli o S. cerevisiae. De esta manera, se puede
obtener una preparación enzimática "a medida" con una
actividad RGAE elevada y un espectro de otras actividades
enzimáticas específicas deseadas.
También, la invención consta de un método para la
producción de una RGAE usando un huésped transformado según la
invención. Mediante este método se puede obtener RGAE con un
rendimiento elevado.
También, la invención incluye la RGAE, producida
según el método de la invención. Se puede obtener RGAE con un
rendimiento elevado.
También, la invención consta de una preparación
enzimática caracterizada por el hecho de que contiene una
preparación de pectinasa que puede ser utilizada para la
degradación o modificación de las paredes celulares vegetales
enriquecidas con la RGAE según la invención. De esta forma, se
puede obtener una intensificación de la capacidad de degradación de
la membrana celular de la preparación de pectinasa.
Una forma de realización preferida de la
preparación enzimática según la invención se caracteriza por el
hecho de que la preparación de pectinasa puede producirse mediante
un microorganismo perteneciente al género del Aspergillus,
preferiblemente Aspergillus Niger, Aspergillus aculeatus,
Aspergillus awamori o Aspergillus oryzae. Esta
preparación es capaz de proporcionar una descomposición de las
membranas celulares vegetales extraordinariamente buena.
Una forma de realización preferida de la
preparación enzimática según la invención se caracteriza por el
hecho de que la RGAE es la RGAE producida según el método de la
invención. Los costes de producción de esta preparación son
relativamente bajos.
La invención también incluye una utilización de
la RGAE según la invención como agente degradante o modificador del
ramnogalacturonano acetilado.
Una forma de realización preferida de la
utilización de la RGAE según la invención es su utilización a modo
de agente degradante o modificador de la pared celular vegetal.
Actualmente, la forma de utilización más preferida de la RGAE según
la invención es para la degradación de las paredes celulares
vegetales, debido a su gran actividad de degradación de las paredes
celulares vegetales.
Una forma de realización preferida de la
utilización de la RGAE según la invención es una utilización en la
que la RGAE se utiliza junto con enzimas específicos para la MHR
desacetilada o parcialmente desacetilada. Estos enzimas adicionales
incluyen todos los enzimas que atacan a los ramnogalacturanos
desacetilados y parcialmente desacetilados ramificados con mayor
especificidad que los que atacan a los ramnogalacturonanos
acetilados, incluyendo enzimas que atacan al esqueleto del
ramnogalacturonano mediante un ataque endo o exo-, o los enzimas
que atacan a las ramificaciones laterales.
La invención consta también de una forma de
utilización de la preparación enzimática según la invención como
agente degradante o modificador de los ramnogalacturonanos
acetilados.
Una forma de realización preferida de la
utilización de la preparación enzimática según la invención es una
utilización a modo de agente degradante o modificador de las paredes
celulares vegetales. Actualmente, la forma de utilización más
preferida de la preparación enzimática según la invención es la
degradación de las paredes celulares vegetales, debido a su gran
actividad de degradación de las paredes celulares vegetales.
\newpage
Una forma de realización preferida de la
utilización de la preparación enzimática según la invención es una
utilización en la que la preparación enzimática se utiliza junto
con enzimas específicos para la MHR desacetilada o parcialmente
desacetilada. Estos enzimas adicionales comprenden todos los
enzimas que atacan los ramnogalacturonanos desacetilados y
parcialmente desacetilados ramificados con mayor especificidad que
los que atacan a los ramnogalacturonanos acetilados, incluyendo los
enzimas que atacan al esqueleto del ramnogalacturonano mediante un
endo- o exo- ataque, o los enzimas que atacan a las ramificaciones
laterales.
La Fig. 6 es un mapa del plásmido pYHD17, donde
el "promotor TPI" se refiere al promotor de triosa fosfato
isomerasa de la S. cerevisiae, el "terminador" se
refiere al terminador de la transcripción, "Amp" se refiere al
gen que media la resistencia a la ampicilina, "2\mu ori" se
refiere al origen de replicación del plásmido de levadura 2\mu, y
"URA3" se refiere a un gen que codifica un marcador de
selección que complementa una deficiencia de uracilo en la cepa
huésped.
Organismo donante: se aisló el ARNm de
Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, desarrollado en un medio de
fermentación con contenido de soja con agitación para asegurar una
ventilación suficiente. Tras 3-5 días de crecimiento
se recogieron los micelios y se congelaron inmediatamente en
nitrógeno líquido y se almacenaron a 80ºC.
Cepas de levadura: la cepa de Sacaromices
cerevisiae que se utilizó fue yNG231 (MAT alfa, leu2,
ura3-52, his4-539,
pep4-delta 1, cir+) o JG169 (MAT\alpha; ura
3-52; leu 2-3, 112; his
3-D200; pep 4-113; prc1::HIS3;
prb1:: LEU2; cir+).
El plásmido pYES II, que es comercialmente
disponible (Invitrogen), fue cortado con SpeI, rellenado con Klenow
de ADN polimerasa +dNTP y cortado con ClaI. Se destiló el ADN en un
gel de agarosa y se purificó un fragmento de aproximadamente 2000
pares de bases (bp) por electroelución. Se cortó el mismo plásmido
con ClaI/PvuII y se purificó un fragmento de aproximadamente 3400
bp por electroelución. Se ligaron ambos fragmentos a un fragmento
con un extremo romo de SphI/EcoRI que contenía el promotor TPI de
la levadura. Este fragmento fue aislado de un plásmido en el que el
promotor TPI proveniente de S. Cerevisiae (ver T. Albers y
G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, págs.
419-434) estaba ligeramente modificado: se eliminó
un sitio de SphI interno eliminando los cuatro bp que constituyen
el núcleo de este sitio. Además, las secuencias redundantes
localizadas corriente arriba del promotor fueron eliminadas
mediante el tratamiento de la exonucleasa Bal1 seguido de la
adición de un enlace de SphI. Finalmente, se añadió un enlace EcoRI
en la posición -10. Después de estas modificaciones, se incluyó el
promotor en un fragmento de SphI-EcoRI. Su
eficiencia comparada con el promotor original parece no estar
alterada por las modificaciones. En la Fig. 6 se muestra el
plásmido pYHD17 resultante.
Todo los instrumentos de cristal utilizados para
los aislamientos de ARN fueron calentados en un horno a + 220ºC
durante al menos 12h. Tubos Eppendorf, puntas de pipetas y columnas
de plástico fueron tratados en dietilpirocarbonato (DEPC) al 0.1%
en EtOH durante 12 horas, y se sometieron a autoclave. Todos los
tampones y el agua (excepto los tampones con contenido en Tris)
fueron tratados con DEPC al 0.1% durante 12 horas a 37ºC y
sometidos a autoclave.
El ARN total fue preparado por extracción con
guanidino tiocianato seguido de un ultracentrifugado a través de un
amortiguador de CsCl 5.7 M (Chirgwin et al, 1979) usando las
siguientes modificaciones. Los micelios congelados en N_{2}
líquido fueron triturados con un mortero y un mazo hasta
convertirlos en un polvo fino, seguido de la trituración en un
molinillo de café preenfriado y fueron suspendidos inmediatamente
en 5 vols de un tampón de extracción del ARN (GuSCN 4 M,
Na-laurilsarcosina al 0.5%,
Na-citrato 25 mM, pH 7.
\beta-mercaptoetanol 0,0.1 M). La mezcla fue
agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugada
(30 minutos, a 5000 rpm, a temperatura ambiente, Heraeus Megafuge
1.0 R) para aglomerar los fragmentos de célula. El sobrenadante fue
recogido, estratificado cuidadosamente sobre un amortiguador de
CsCl 5.7 M (CsCl 5.7 M, EDTA 0.1 M, pH 7.5, DEPC al 0.1%; sometido
a autoclave antes de su utilización), utilizando 26.5 ml de
sobrenadante por 12.0 ml de amortiguador de CsCl, y centrifugado
para obtener el ARN total (en un rotor SW 28 de Beckman, 25,000
rpm, temperatura ambiente, 24h). Después del centrifugado, el
sobrenadante fue cuidadosamente eliminado y el fondo del tubo que
contenía el ARN granulado fue cortado y enjuagado con EtOH al 70%.
El Granulado de ARN total fue transferido a un tubo de Eppendorf,
suspendido en 500 \mul de TE, pH 7.6 (en caso de dificultad,
calentar ocasionalmente durante 5 minutos a 65ºC), extraído con
fenol y precipitado con etanol durante 12 horas a –20ºC (2.5 vols
de EtOH, 0.1 Vol 3M de NaAc, pH 5.2). El ARN fue recogido por
centrifugado, lavado en EtOH al 70% y resuspendido en un volumen
mínimo de DEPC-DIW. La concentración de ARN se
determinó midiendo OD_{260/280}.
Se aislaron los ARNs poli(A)^{+}
por cromatografía de afinidad de la
oligo(dT)-celulosa (Aviv & Leder, 1972).
Como es habitual, se hincharon previamente 0.2 g de
oligo(dT)-celulosa (Boehringer Mannheim) en
10 ml de un tampón de carga de 1 x columna (Tris-Cl
20 mM, pH 7.6, NaCl 0.5 M, EDTA 1 mM, SDS al 0.1%), se depositaron
en una columna de plástico tratada con DEPC, tapada (Poly Prep
Chromatography Column, Bio Rad) y equilibrada con 20 ml de 1 x
tampón de carga,. El ARN total fue calentado a 65ºC durante 8
minutos, enfriado en hielo durante 5 minutos y, después de añadir 1
Vol de tampón de carga de 2 x columna a la muestra de ARN, se
depositó en la columna. El eluato fue recogido y vuelto a depositar
unas 2-3 veces, calentando la muestra según se ha
descrito anteriormente y enfriándola rápidamente en hielo antes de
proceder a cada carga. La columna de oligo(dT) se lavó con
10 vols de 1 x tampón de carga, luego con 3 vols de un tampón de un
medio salino (Tris-Cl 20 mM, pH 7.6, NaCl 0.1 M,
EDTA 1 mM, SDS al 0.1%), seguido de la elución del ARN
poli(A)^{+} con 3 vols de un tampón de elución
(Tris-Cl 10 mM, pH 7.6, EDTA 1 mM, SDS al 0.05%)
precalentado a +65ºC, recogiendo fracciones de 500 \mul. Se leyó
el OD_{260} de cada fracción recogida, se agruparon las
fracciones que contenían ARNm, se precipitó el etanol a 20ºC
durante 12 h. Se recogió el ARN poli(A)^{+} por
centrifugado, se volvió a suspender en DEPC-DIW y
se almacenó en partes alícuotas de 5-10 \mug a
80ºC.
Los ARNs poli(A)^{+} (5
\mug/muestra) de varios micelios fueron sometidos a
electroforesis en geles de agarosa 1.2 / formaldehído 2.2 M
(Sambrook et al., 1989) y transferidos a membranas de nilón
(Hybond-N, Amersham) con 10 x SSC (Sambrook et al.,
1989) como tampón de transferencia. Se utilizaron tres sondas de
ADNc cebadas aleatoriamente (Feinberg & Vogelstein, 1983) y
marcadas con ^{32}P en hibridaciones individuales: 1) un fragmento
de Not I-Spe I de 1.3 kb para poligalacturonasa I
proveniente de A. aculeatus, 2) un fragmento de Not
I-Spe I de 1.3 kb que codifica la endoglucanasa I
proveniente de A. aculeatus y 3) un fragmento de Eag I de
1.2 kb para galactanasa I proveniente de A. aculeatus. Las
hibridaciones de Northern fueron realizadas en 5 x SSC (Sambrook et
al., 1989), 5 x solución de Denhardt (Sambrook et al., 1989), SDS
(p/v) al 0.5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado con una concentración de la sonda de aprox. 2 ng/ml
durante 16 horas a 65ºC seguido de varios lavados en 5 x SSC a 65ºC
(2 x 15 minutos), 2 x SSC, SDS al 0.5% (1 x 30 minutos), 0.2 x SSC,
SDS al 0.5% (1 X 30 minutos), y 5 x SSC (2 x 15 minutos). Después
de realizar una autorradiografia a 80ºC durante 12 horas, la sonda
#1 fue eliminada del filtro según las instrucciones del fabricante
y rehibridizada con una sonda #2, y eventualmente con una sonda #3.
Se utilizó el ARN escalonado "Ladder" de Bethesda Research
Laboratories como marcador del tamaño molecular.
Se sintetizó ADNc bicatenario a partir de 5
\mug de ARN poli (A)^{+} de A. aculeatus mediante
el método de la ribonucleasa H (Gubler & Hoffman 1983, Sambrook
et al., 1989) usando la modificación de la horquilla. El ARN
poli(A)^{+} (5 \mug en 5 \mul de agua tratada
con DEPC) fue calentado a 70ºC durante 8 minutos, enfriado en hielo
y combinado en un volumen final de 50 pl con un tampón de
transcriptasa inversa (Tris-Cl 50 mM, pH 8.3, Kcl 75
mM, MgCl_{2} 3 mM, DTT 10 mM, Bethesda Research Laboratories) con
un contenido de 1 mM por cada dNTP (Pharmacia), 40 unidades de un
inhibidor de la ribonucleasa de placenta humana (RNasin, Promega),
10 \mug de un cebador
oligo(dT)_{12-18} (Pharmacia) y
1000 unidades de la transcriptasa inversa ribonucleasa H
SuperScript II (Bethesda Research Laboratories). El ADNc de la
primera cadena fue sintetizado incubando la mezcla reactiva durante
1 hora a 45ºC.
Después de sintetizar 30 \mul de
Tris-Cl 10 mM, pH 7.5, se añadió EDTA 1 mM, y los
híbridos de ARNm:ADNc fueron precipitados con etanol durante 12
horas a 20ºC añadiendo 40 g de un portador de glicógeno (Boehringer
Mannheim), 0.2 vols de NH_{4}Ac 10 M y 2.5 vols de EtOH al 96%.
Los híbridos fueron recuperados por centrifugado, lavados en EtOH
al 70%, secados al aire y vueltos a suspender en 250 \mul de un
tampón de la segunda cadena (Tris-Cl 20 mM, pH 7.4,
Kcl 90 mM, MgCl_{2} 4.6 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM,
\betaNAD^{+} 16 \muM) con un contenido de 100 pM por cada
dNTP, 44 unidades de ADN polimerasa I de E. Coli (Amersham),
6.25 unidades de ribonucleasa H (Bethesda Research Laboratories) y
10.5 unidades de ADN ligasa de E. coli (New England Biolabs).
La síntesis del ADNc de la segunda cadena fue realizada incubando
el tubo de reacción a 16ºC durante 3 horas y la reacción fue
detenida mediante la adición de EDTA a 20 mM de la concentración
final, seguido de la extracción de fenol.
El ADNc bicatenario (ds) fue precipitado con
etanol a 20ºC durante 12 horas mediante la adición de 2 vols de
EtOH al 96%, 0.1 Vol de NaAc 3 M, pH 5.2, recuperado por
centrifugado, lavado en EtOH al 70%, secado (SpeedVac) y
resuspendido en 30 \mul de un tampón de nucleasa de la judía Mung
(NaAc 30 mM, pH 4.6, NaCl 300 mM, ZnSO_{4} 1 mM, DTT 0.35 mM,
glicerol al 2%) con un contenido de 36 unidades de nucleasa de la
judía Mung (Bethesda Research Laboratories). El ADN monocatenario
en horquilla fue recortado mediante la incubación de la reacción a
30ºC durante 30 minutos, seguido de la adición de 70 \mul de
Tris-Cl 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, extracción de
fenol y precipitación de etanol con 2 vols de EtOH al 96% y 0.1 Vol
de NaAc 3M, pH 5.2 a 20ºC durante 12 horas.
El ADNc bicatenario fue terminado en extremo romo
con T4 ADN polimerasa en 50 l de un tampón de T4 ADN polimerasa
(Tris-acetato 20 mM, pH 7.9, MgAc 10 mM, Kac 50 mM,
DTT 1 mM) con un contenido de 0.5 mM por cada dNTP y 7.5 unidades
de T4 ADN polimerasa (Invitrogen) mediante la incubación de la
mezcla reactiva a +37ºC durante 15 minutos. La reacción fue
detenida mediante la adición de EDTA a 20 mM de la concentración
final, seguido de la extracción de fenol y de la precipitación con
etanol.
Después de la reacción de llenado, se unió el
ADNc a adaptadores no-palindrómicos de BstX I (1
\mug/\mul, Invitrogen) en 30 \mul de un tampón de unión
(Tris-Cl 50 mM, pH 7.8, MgCl2 mM, DTT 10 mM, ATP 1
mM, 25 \mug/ml de albúmina de suero bovino) con un contenido de
600 pmol de los adaptadores BstX I y de 5 unidades de T4 ligasa
(Invitrogen) mediante la incubación de la mezcla de reacción a
+16ºC durante 12 horas. La reacción fue detenida mediante el
calentamiento a +70ºC durante 5 minutos y el ADNc adaptado fue
dividido por tamaños por electroforesis en gel de agarosa
(HSB-agarosa al 0.8%, FMC) para separar los
adaptadores no unidos y los ADNc pequeños. El ADNc fue seleccionado
por tamaños con el punto de corte en 0.7 kb y el ADNc fue
electropurificado del gel de agarosa en Tris-Cl 10
mM, pH 7.5, EDTA 1 mM durante 1 hora a 100 voltios, extraído el
fenol y precipitado con etanol a 20ºC durante 12 horas, tal y como
se ha descrito anteriormente.
El ADNc bicatenario adaptado fue recuperado por
centrifugado, lavado en EtOH al 70% y vuelto a suspender en 25 ml
de DIW. Previamente a la unión de la biblioteca a gran escala, se
realizaron cuatro pruebas de unión en 10 \mul de un tampón de
unión (similar al anterior) cada una con un contenido de 1 \mul
de ADNc bicatenario (tubos de reacción #1 - #3), 2 unidades de T4
ligasa (Invitrogen) y 50 ng (tubo #1), 100 ng (tubo #2) y 200 ng
(tubos #3 y #4) del vector de expresión de levadura desprendido de
BstX I, sea del vector pYES 2.0 Invitrogen o yHD13. Las reacciones
de unión se realizaron mediante una incubación a +16ºC durante 12
horas, se calentaron a 70ºC durante 5 minutos y 1 \mul de cada
unión se electroporó (200\Omega, 2.5 kV, 25 \muF) a 40 \mul de
células 1061 competentes de E. Coli (OD_{600} = 0.9 en 1
litro de caldo de cultivo LB, lavado dos veces en DIW frío, una vez
en 20 ml de glicerol al 10%, resuspendido en 2 ml de glicerol al
10%). Tras la adición de 1 ml de SOC a cada mezcla de
transformación, las células fueron cultivadas a +37ºC durante 1
hora, 50 \mul fueron cultivadas en placas LB + de ampicilina (100
pg/ml) y cultivadas a +37ºC durante 12 horas.
Con las condiciones óptimas, se preparó una unión
a gran escala en 40 \mul de un tampón de unión con un contenido de
9 unidades de T4 ligasa, y la reacción fue incubada a +16ºC durante
12 horas. La reacción de unión fue detenida por calentamiento a
70ºC durante 5 minutos, se precipitó el etanol a 20ºC durante 12
horas, se recuperó por centrifugado y se volvió a suspender en 10
\mul de DIW. Un \mul de alícuotas fue transformado en células
1061 de E. Coli electrocompetentes con las mismas
condiciones de electroporación anteriormente descritas, las células
transformadas fueron concentradas y la biblioteca cultivada en
placas de LB + de ampicilina con 5000-7000
c.f.u./placa. Se añadió a cada placa 3 ml del medio. Las bacterias
fueron eliminadas por rascado, se añadió 1 ml de glicerol y se
almacenó a 80ºC en agrupaciones. Los 2 ml restantes fueron
utilizados para el aislamiento del ADN. En el caso de que la
cantidad de ADN haya sido insuficiente para proporcionar el número
requerido de transformantes de levadura, se preparará más ADN a
partir 500 ml de medio (TB) inoculado con 50 I del material
bacteriano a 80ºC propagado durante la noche.
Para obtener una sonda de ADNc para la
ramnogalacturonano acetilesterasa I de A. aculeatus RE4, se
sintetizó un oligonucleótido degenerado (RGAE/s_{2}, figura 7)
correspondiente a una región en la secuencia terminal NH_{2} del
enzima purificado mediante la incorporación de desoxiinosinas en
cuatro de las posiciones ambiguas. La Fig. 7 muestra la secuencia
deducida del cebador con un contenido en desoxiinosina, utilizada
en la PCR alineada con la secuencia de aminoácidos correspondiente
obtenida a partir de la ramnogalacturonano acetilesteresa I
purificada proveniente de Aspergillus aculeatus. El cebador
fue usado conjuntamente con los cebadores pYES 2.0 directos
(cebador #22,
5'-CTGTAATACGACTCACTA-3') e inversos
(cebador #43,
5'-ATTACATGATGCGGCCCT-3') para
aumentar el ADNc de la RGAE objetivo a partir de un grupo de una
biblioteca de ADNc amplificada que contiene 7000 clones utilizando
la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (Ohara et al.
1989). Las reacciones de la PCR fueron realizadas en 100 \mul de
un tampón de PCR (Tris-Hcl 10 mM, pH 8.3, Kcl 50 mM,
MgCl_{2} 1.5 mM, 0.01%, Perkin-Elmer, Cetus) con
un contenido de 550 pmol de un cebador sentido (RGAE/s_{2}) y 800
pmol de cada iniciador antisentido (ver más arriba), 1 \mug de un
molde de ADN (ADN del plásmido purificado con Qiagen del grupo #33
de la biblioteca de ADNc) y 200 pM por cada dNTP usando un variador
de ciclos térmico de ADN y 2.5 unidades de Taq polimerasa (Perkin-
Elmer, Cetus). Se realizaron treinta ciclos de PCR usando un perfil
cíclico de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, hibridación a
55ºC durante 2 minutos y extensión a 72ºC durante 3 minutos.
Se analizaron veinte \mul de partes alícuotas
de los productos de amplificación por electroforesis en geles de
agarosa al 0.7% que revelaron un producto principal de 0.9 kb con
un par cebador (sentido, RGAE/s_{2}; antisentido pYES 2.0,
cebador inverso #43). El fragmento de ADN en cuestión fue cortado
del gel y recuperado por electroelución (Sambrook et al. 1989)
utilizando un tubo sin juntas de diálisis de tipo
D-0405 (Sigma), seguido de la extracción del fenol
y de la precipitación del etanol a -20ºC durante 12 horas. El
producto de la PCR fue terminado en extremo romo a 37ºC durante 10
minutos en 20 \mul de un tampón (Tris-acetato 20
mM, pH 7.9, MgAc 10 mM, Kac 50 mM, DTT 1 mM) con un contenido de 50
\muM por cada dNTP y 3 unidades de T4 ADN polimerasa (New England
Biolabs). La reacción se detuvo por incubación a 70ºC durante 5
minutos, se enfrió en hielo durante otros 5 minutos y se diluyó en
50 pl de un tampón de quinasa (Tris-Hcl 70 mM, pH
7.6, MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM) seguido de fosforilación a 37ºC
durante 30 minutos con la T4 polinucleótido quinasa (10 U, New
England Biolabs) y 1 mM de ATP, pH 7.0 (Pharmacia), extracción del
fenol, precipitación del etanol y unión a 16ºC durante 12 horas en
el vector pUC18, defosforilado y cortado con Sma I (50 ng por
unión, Pharmacia).
Se transformó DH5_{\alpha} de E. Coli en
una resistencia a la ampicilina (Hanahan 1985) utilizando 5
{\mu}l de la mezcla de unión, y se analizaron 13 clones mediante
el aislamiento del ADN del plásmido miniprep. (Sambrook et al.
1989) y la digestión de EcoRI/HindIII de los subclones del plásmido,
seguido de secuenciación de los extremos de los insertos de 0.9 kb
de un subclón (pRGA19) con cebadores pUC universales (Sanger et al.
1977). El análisis de la secuencia de nucleótidos del subclón
pRGA19 reveló un único marco de lectura abierto que, además de los
aminoácidos codificados por el cebador, contenía 10 residuos
adicionales que concurrían con la secuencia disponible del terminal
NH_{2} del enzima purificado, lo cual confirma que la PCR
amplifica específicamente la región deseada del ADNc de la
ramnogalacturonano acetilesterasa I (fig. 8). La Fig. 8 muestra la
secuencia de nucleótidos del extremo 5' del ADNc de rgal y la
estructura primaria deducida de la RGAE I proveniente de A.
aculeatus. El péptido señal del terminal NH_{2} que precede a
la proteína madura está subrayado.
El ADN purificado con Qiagen (3 \mug) de ocho
grupos individuales de la biblioteca de ADNc (#33, 90, 100, 130,
136, 140, 142, 148) fue digerido hasta la terminación con Eag I (3
U/\mug ADN, New England Biolabs), destilado en gel de agarosa al
0.7%, desnaturalizado y transferido a un filtro de nilón
(Hybond-N, Amersham) utilizando 10 x SSC (Sambrook
et al. 1989) como tampón de transferencia (Southern 1975). El
fragmento de RGAE I de 0.9Kb de la PCR purificado fue marcado con
^{32}P (> 1 x 10^{9} cpm/\mug) por cebado aleatorio
(Feinberg & Vogelstein 1983) y se utilizó como sonda en el
análisis de Southern. La hibridación se efectuó en 2 x SSC
(Sambrook et al. 1989), 5 x solución de Denhardt (Sambrook et al.
1989), SDS (p/v) al 1% y 100 lag/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado en una concentración de sonda de 2.5 ng/ml durante
16 horas a 65ºC seguido de varios lavados en 2 x SSC (2 x 15
minutos), 2 x SSC, SDS al 1% a 65ºC durante 30 minutos, luego en 0.2
x SSC, SDS al 1% a 65ºC durante 30 minutos, y finalmente en 2 x SSC
(2 x 15 minutos). El filtro fue autorradiografiado a -80ºC durante
12 horas y reveló un único fragmento fuerte de hibridación de 1.0
kb en cada grupo de ADNc. Esto indicó que cada grupo analizado
contenía una copia entera del ADNc que codifica la RGAE I de A.
aculeatus. En consecuencia, se escogió el grupo #33 para
experimentos sucesivos.
Para realizar una estimación de los niveles
estables del ARNm de la RGAE I de A. aculeatus durante su
desarrollo en el medio RS3, se aisló ARN
poli(A)^{+} de los micelios recogidos diariamente
tras 1-5 días de cultivo en el medio arriba
indicado, y fue sometido al análisis de Northern. Los ARN
poli(A)^{+} (5 \mug/muestra) fueron sometidos a
electroforesis en geles de agarosa 1.2 / formaldehído 2.2 M
(Sambrook et al., 1989) y transferidos a una membrana de nilón
(Hybond-N, Amersham) con 10 x SSC (Sambrook et al.,
1989) como tampón de transferencia. El ARN escalonado "Ladder"
de Bethesda Research Laboratories fue empleado como marcador del
tamaño y se utilizó un producto de la PCR (ver sección anterior) de
0.9 kb de RGAE I marcado con ^{32}P y cebado aleatoriamente
(Feinberg & Vogelstein, 1983) como sonda para el análisis de
Northern. La hibridación se efectuó en 5 x SSC (Sambrook et al,
1989), 5 x solución de Denhardt (Sambrook et al., 1989), SDS (p/v)
al 0.5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado
con una concentración de sonda de aprox. 2.5 ng/ml durante 16 horas
a 65ºC seguido de varios lavados en 5 x SSC a 65ºC (2 x 15
minutos), 2 x SSC, SDS al 0.5% (1 x 30 minutos), 0.2 x SSC, SDS al
0.5% (1 x 30 minutos), y 5 x SSC (2 x 15 minutos). El filtro fue
autorradiografiado a 80ºC durante 4 días.
La sonda de ADNc de la RGAE I detecta especies de
1.0 kb de ARNm fácilmente en micelios de 5 días y débilmente en
micelios de 4 días, pero no las detecta en micelios de 3 días, lo
que coincide con unos niveles decrecientes de glucosa en el medio
de crecimiento a partir del día 1, sin glucosa detectable en el
sobrenadante después del día 3.
Para aislar un clon de ADNc completo para la RGAE
I, se cultivaron 30000 colonias provenientes del grupo de la
biblioteca de ADNc #33 en placas de LB-agar (placas
de 24 x 24 cm, Nunc) que contienen ampicilina (100 \mug/ml) y se
replicaron en una placa de LB-agar + amp cubierta
con un filtro de nilón (Hybond-N, Amersham). El
fragmento purificado de 0.9 kb de la PCR de RGAE I fue marcado con
^{32}P por cebado aleatorio al igual que antes y utilizado como
sonda para seleccionar el grupo de la biblioteca mediante
hibridación de las colonias (Sambrook et al., 1989). La hibridación
se efectuó en 2 x SSC (Sambrook et al.,1989), 5 x solución de
Denhardt (Sambrook et al. 1989), SDS (p/v) al 1% y 100 \mug/ml de
ADN de esperma de salmón desnaturalizado con una concentración de
sonda de 2.5 ng/ml durante 16 horas a 65ºC, luego en 2 x SSC (2 x
15 minutos), 0.2 x SSC, SDS al 1% (2 x 30 minutos), y en 2 x SSC (2
x 15 minutos) y a continuación fue autorradiografiado a 80ºC durante
12 horas. La selección de 30000 colonias del grupo 33 produjo 5
clones putativos del ADNc de la RGAE I que fueron purificados de la
colonia en otros dos ciclos de hibridación. Uno de estos clones
(denominado pRGA1) se caracteriza por la digestión del plásmido con
HindIII y XbaI y por la secuenciación de los extremos de 1.0 kb del
inserto de ADNc con cebadores polienlace pYES 2.0 directos e
inversos.
El inserto de 1.0 kb en el pRGA1 contiene un
marco de lectura abierto (ORF) de 0.85 kb que empieza con un codón
ATG en la posición 40 de los nucleótidos y que termina con un codón
de finalización TGA (figs. 8 y 9). La Fig. 9 muestra la secuencia
de nucleótidos del extremo 3' del ADNc del rgal y la estructura
primaria deducida de la RGAE I proveniente de A. aculeatus.
El ORF está precedido por una región 5' no codificadora de 39 bp,
seguida de una región 3' no codificadora de 132 bp y de un terminal
poli(A)^{+}. La secuencia de proteínas deducida
comparada con la secuencia del terminal NH_{2} de la RGAE I
madura purificada revela que el ADNc codifica una proteína
precursora que contiene un péptido señal de 18 residuos (figura.
8).
El vector pHD414 (fig. 10) es un derivado del
plásmido p775 (descrito en la patente EP 238 023). A diferencia de
este plásmido, el pHD 414 tiene una secuencia de sitios de
restricción únicos entre el promotor y el terminador. El plásmido
se construyó mediante la extracción de un fragmento de
aproximadamente 200 bp de largo (que contenía sitios RE no
deseables) en el extremo 3' del terminador, y mediante la
extracción posterior de un fragmento de aproximadamente 250 bp de
largo en el extremo 5' del promotor, que también contenía sitios no
deseables. La región de 200 bp fue eliminada mediante disociación
con NarI (situado en el vector pUC) y XbaI (justo a 3' del
terminador), posteriormente fue rellenada en los extremos generados
con Klenow de la ADN polimerasa +dNTP, y luego se purificó el
fragmento del vector en gel y se volvió a ligar el fragmento del
vector. Este plásmido se denominó pHD413. Se cortó el pHD413 con
StuI (situado en el extremo 5' del promotor) y Pvull (en el vector
pUC), se destiló en gel y se ligó de nuevo, dando como resultado el
pHD414. La Fig. 10 es un mapa del plásmido pHD414, donde
"terminador AMG" se refiere al terminador de la glucoamilasa
de A. Niger y "Promotor TAKA" se refiere al promotor de
la TAKA amilasa de A. oryzae. El pHD464 es un derivado del
pHD414, en el que la región 5' no traducida es sustituida por la
región 5' no traducida del gen Tpi de Aspergillus.
El ADN del plásmido miniprep. del pRGA1 fue
codificado con BamHI y XhoI, sometido a electroforesis en gel de
agarosa al 0.7%, seguido de la purificación de un inserto de ADNc
de 1.0 kb usando el kit Geneclean II según las instrucciones del
fabricante (Bio 101 Inc., La Jolla) y la unión en el vector pKD414
cortado con BamHI/XhoI. Un \mul de la mezcla de unión fue sometido
a electroporación en E. Coli 1061 y dos transformantes
fueron analizados mediante la codificación con BamHI/XhoI del ADN
del plásmido miniprep. Puesto que ambos clones (denominados pRGA1 y
pRGA2) contenían un inserto del tamaño correcto, se escogió el
pRGA1 para experimentos sucesivos. Una preparación media del
plásmido de expresión de pRGA1 (Qiagen Tip 100, ver sección 4) fue
controlada mediante la secuenciación de la construcción del extremo
5' y se utilizó para la transformación de Aspergillus
oryzae.
Se inocularon 100 ml del medio mínimo de
Aspergillus (1M de sacarosa, 10 mM de úrea, 0.52 mg/ml de
KCI, 0.52 mg/ml de MgSO_{4}, 1.52 mg/ml de KH_{2}PO_{4}, 0.04
\mug/ml de Na_{2}B_{4}O_{7}, 0.4 \mug/ml de CuSO_{4},
0.8 \mug/ml de FePO_{4}, 0.8 \mug/ml de MnSO_{4}, 0.8
\mug/ml de Na_{2}MoO_{4}, 8 \mug/ml de ZnSO_{4}) con
suspensiones de esporas provenientes de cepas de A. oryzae
1560 o 1560-710 o A. Niger, se recogió el
micelio por filtración a través de un Miracloth esterilizado tras 24
horas de cultivo a 30ºC, se lavó con 200 ml de MgSO_{4} 0.6 M, se
suspendió en 25 ml de MgSO_{4} 1.2 M frío, NaH_{2}PO_{4} 10
mM, pH 5.8, con un contenido de 2 mg/ml de Novozym® (Novo Nordisk
NS) y se incubó en hielo durante 5 minutos. Se añadió 1 ml de BSA
(12 mg/ml, filtrado esterilizado) a los micelios y la suspensión
fue incubada a 37ºC durante 1.5 horas con una agitación suave. Los
protoplastos fueron separados de los fragmentos de los micelios no
asimilados mediante filtración a través de un Miracloth, cubiertos
con 5 ml de sorbitol 0.6 M, Tris-Hcl 100 mM, pH
7.0, y centrifugados a 2500 rpm durante 15 minutos. Los
protoplastos fueron recogidos de la interfase, lavados cuatro veces
en 3 ml de sorbito) 1.2 M, Tris-Hcl 10 mM, pH 7.5,
CaCl_{2} 10 mM, resuspendidos en el mismo tampón con una
concentración de entre 5 x 107 y 5 x 108/ml y utilizados
inmediatamente.
La transformación de A. oryzae o A.
Niger se efectuó esencialmente de la manera siguiente. Se
mezclaron 8 \mug de ADN del plásmido pRGA1 purificado con Qiagen
(1 \mug/\mul), con 1 \mug de ADN del
co-plásmido ToC 90 purificado con Qiagen (1
\mug/\mul), un plásmido que transporta un gen AmdS de A.
nidulans, y 100 \mul de una suspensión de protoplastos, y
se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se
añadieron 250 \mul de PEG al 60% (p/v), Tris-Hcl
10 mM, pH 7.5, CaCl_{2} 10 mM, y se incubó la mezcla a
temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de añadir 3 ml de
sorbitol 1.2 M, la mezcla de transformación fue centrifugada a 2500
rpm durante 10 minutos, resuspendida en 100 \mul de sorbitol 1.2
M, extendida sobre placas de selección de AmdS e incubada a 30ºC
durante 3-5 días.
Se inocularon 20 ml de alícuotas de un medio de
YP + maltodextrina (2%) con suspensiones de esporas de
transformantes de AmdS^{+} cotransformados con el plásmido ToC (4
en A. oryzae 1560-710, 2 en la cepa 1560),
seguido de un cultivo a 30ºC durante 2-3 días. Los
transformantes fueron seleccionados por su actividad RGAE I
evaluando el medio de cultivo según las actividades
ramnogalacturonano acetilesterasa y acetilesterasa. La cantidad y
la pureza de las proteínas segregadas en el medio de cultivo en
varios transformantes fueron valoradas mediante el análisis de 4
\mul de partes alícuotas de las fracciones sobrenadantes en
SDS-PAGE al 10% (Fey et al. 1984) seguido por tinte
en Coomassie o en plata, usando una preparación enzimática de RGAE
I purificada de A. aculeatus como muestra de control.
La actividad acetilesterasa en el medio de
cultivo de los transformantes de AmdS^{+} fue determinada como el
aumento de la absorbancia de OD_{405} tras la incubación de
muestras de 20 \mul a 40ºC durante 30 minutos en 500 \mul de
p-nitrofenil-acetato 2 mM/tampón de
Na-citrato 20 mM, pH 5.0, utilizando un medio de
cultivo de A. oryzae 1560-710 como control
negativo y la preparación de RGAE I purificada (0.78 mg/ml) como
control positivo. Antes a la medición, se aumentó el pH añadiendo 1
ml de Tris-HCl, pH 7.0, a las muestras. Debido a la
elevada actividad acetilesterasa de la cepa de control, todas las
muestras indicaron una actividad comparable hacia el
p-nitrofenil-acetato (datos no
mostrados) sin un aumento detectable en los transformantes de
AmdS^{+}.
La actividad ramnogalacturonano acetilesterasa en
el medio de cultivo (ver arriba) fue determinada por una liberación
de acetato en las regiones vellosas modificadas (MHR) aisladas de
la pectina de manzana (Schols et al. 1990). Las muestras (50 \mul
de cada sobrenadante) fueron incubadas con 100 \mul de regiones
vellosas modificadas al 1% (p/v, en H_{2}O) durante a) 2 horas y
b) 24 horas, usando las mismas muestras de control que antes. La
determinación del ácido acético se efectuó usando el kit de ácido
acético de Boehringer Mannheim según las instrucciones del
fabricante. Entre cinco y seis transformantes de AmdS^{+}
muestran una actividad evidente hacia la MHR al 1%, mientras que el
sexto transformante no muestra ninguna actividad en comparación con
la cepa de control de A. oryzae 1560-710
(fig.11). La Fig. 11 indica la actividad hacia las regiones
vellosas modificadas (MHR) al 1%, producidas por cepas de A.
oryzae recombinantes que expresan ramnogalacturonano
acetilesterasa I de A. aculeatus. Las actividades
enzimáticas fueron determinadas como una liberación de acetato de la
MHR de la pectina de manzana. Las actividades más elevadas
observadas en los transformantes de la RGAE 710-1 y
la RGAE 710-4 coinciden con una proteína de aprox.
35 kDa segregada en el medio de cultivo. La proteína está
ligeramente glicosidada en exceso en comparación con la RGAE I
purificada de A. aculeatus, tal y como se ha deducido
mediante SDS-PAGE.
YPD: 10 g de extracto de levadura, 20 g de
peptona, H_{2}O hasta 810 ml. Sometido a autoclave, se añadieron
90 ml de glucosa al 20% (filtrada y estéril).
YPG-agar: 25 g/l de Bactoagar, 15
g/I de glucosa, 5 g/l de K_{2}PO_{4}, 0.5 g/l de
MgSO_{4^{-}}7H_{2}O, pH ajustado a 5.0. Sometido a
autoclave.
10 x sal basal: 66.8 g de una base nitrogenada de
levadura, 100 g de ácido succínico, 60 g de NaOH, H_{2}O hasta
1000 ml, filtrado y estéril.
SC-URA: 90 ml de 10 x sal basal,
22.5 ml de ácidos de casamino al 20%, 9 ml de triptófano al 1%,
H_{2}O hasta 806 ml, sometido a autoclave, se añadieron 3.6 ml de
treonina al 5% y 90 ml de glucosa al 20%.
SC-H agar: 7.5 g/l de base
nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11.3 g/l de ácido
succínico, 6.8 g/l de NaOH, 5.6 g/l de ácidos de casamino sin
vitaminas, 0.1 g/l de triptófano y 20 g/l de agar (bacto). Sometido
a autoclave durante 20 minutos a 121ºC. Después de la autoclave, se
añadieron 55 ml de una solución de galactosa al 22% y 1.8 ml de una
solución de treonina al 5% por 450 ml de agar.
YNB-1 agar: 3.3 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 16.7 g/l de agar, pH ajustado a 7. Sometido a
autoclave durante 20 minutos a 121ºC. Después de la autoclave, se
añadieron 25 ml de una base nitrogenada de levadura sin aminoácidos
al 13.6%, 25 ml de una solución de glucosa al 40%, 1.5 ml de una
solución de L-leucina al 1% y 1.5 ml de una solución
de histidina al 1% por 450 ml agar.
Caldo YNB-1 : composición similar
a la de YNB-1 agar, pero sin agar.
Gel de revestimiento de MHR: agarosa al 1%, MHR
al 0,5% en de un tampón de Na-acetato 0,05 M, pH
4.5. El gel fue hervido y luego enfriado a 55ºC antes de verter el
revestimiento sobre placas de agar.
FG-4-agar: 35 g/l
de agar, 30 g/l de harina de soja, 15 g/l de maltodextrina
(Glucidex 6), 5 g/l de Bacto pepton, pH 7. Sometido a autoclave
durante 40 minutos a 121ºC
Medio FG-4 : 30 g/l de harina de
soja, 15 g/l de maltodextrina (Glucidex 6), 5 g/l de Bacto pepton.
Sometido a autoclave durante 40 minutos a 121ºC.
Medio MDU-2 : 45 g/l de maltosa,
1 g/l de MgSO_{4^{-}}7H_{2}O, 1 g/l de NaCl, 2g/l de
K_{2}SO_{4}, 12 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0.1 ml/L de Plurónico
61 L, 0.5 ml/L de una solución de metal traza, pH 5.0. Sometido a
autoclave durante 20 minutos a 121ºC. Se añaden 15 ml/L de úrea
estéril filtrada al 50% tras la acción del autoclave.
Solución de metal traza: 13.9 g/l de
FeSO_{4^{-}}7H_{2}O, 8.45 g/l de MnSO_{4^{-}}H_{2}O, 6.8 g/l
de ZnCl_{2}, 2.5 g/l de CuSO_{4^{-}}5H_{2}O, 0.24 g/l de
NiCl_{2}-6H_{2}O, 3 g/l de ácido cítrico.
Para una mejor comprensión de la invención se
hace referencia a las siguientes referencias:
Aviv, H. & Leder, P.
1972. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69:
1408-1412.
Becker, D. M. & Guarante, L.
1991. Methods Enzymol. 194:
182-187.
Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E.,
MacDonald, R. J. & Rutter, W. J. 1979.
Biochemistry 18: 5294-5299.
Feinberg, A. P. & Vogelstein,
B. 1983. Anal. Biochem. 132: 6-13.
Fey, S., Mose Larsen, P. &
Biskj
\aer, N. L. 1984. Ph.D. thesis, Faculty of Natural Sciences, Aarhus University, Denmark.
Gubler, U. & Hoffman, B. J.
1983. Gene 25: 263-269.
Hanahan, D. 1985. in DNA Cloning,
(Glover, D. M., ed.) IRL, Oxford, Vol. 1., pp.
109-135.
Ohara, O., Dorit, R. L. &
Gilbert, W. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
86:5673-5677.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. &
Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY.
Sanger, F., Nicklen, S. &
Coulson, A. R. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 74: 5463-5467.
Schols, H. A., Geraeds, C. C. J.
M., Searle-van Leeuwen, M. J. F.,
Kormelink, F. J. M. & Voragen, A. G. J.
1990. Carbohydrate Res. 206:
105-115.
Southern, E. M. 1975. J. Mol.
Biol. 98: 503-517.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novo Nordisk A/S
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: DK-2880
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 4444 8888
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 4449 3256
\vskip0.333000\baselineskip
- (I)
- FAX: 37304
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo enzima y secuencia de ADN
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM Compatible***
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS-MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus aculeatus
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CBS 101.43
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATGAAGACCG CCGCCTCTTG CACCGCTCTT CTTCCTCCCC TCTGCCCTCG CCACGACNNG
\hfill60
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGTCTATCTCG CGGGTGACTC CACCATGGCC AAGAATGGAG GCGGGTCGGG AACTAACGGC
\hfill60
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGGGGCGAGT ACCTGCGAGT TACCTCTCCG CGACAGTGGT TAACGACGCG GTCGCG
\hfill56
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGACGCAACCT ATGAAGACCT TGGAATGCCA CCGTCAACTC GTATTCCCCA TCGATCACAC
\hfill60
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: secuencia ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCACACCAGT CCTGCGGCGC GAGGTCGTGG CTGAGCGTTC TTGAAGGCGG TGGTATGCAC
\hfill60
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGGTACGTCG TTGAAGAGTG TGTTGACGAC GACGAGCTT
\hfill39
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE IA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 176 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 159 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 935 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
Claims (13)
1. Polipéptido purificado que tiene actividad
ramnogalacturonano acetilesterasa (RGAE), el cual comprende la
secuencia de aminoácidos parcial de la SEC ID Nº. 1, o una
secuencia de aminoácidos parcial con una homología con la SEC ID
Nº. 1 de al menos el 70%.
2. Polipéptido según la reivindicación 1 que
comprende la secuencia de aminoácidos parcial de la SEC ID Nº.
1.
3. Polipéptido según la reivindicación 1 ó 2 que
es capaz de liberar acetato de las regiones vellosas modificadas
(MHR) de la pectina de manzana.
4. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que se mide la
actividad de la RGAE usando el ensayo descrito en la pág. 28 de la
descripción ("Actividad ramnogalacturonano acetilesterasa- - -
instrucciones del fabricante").
5. Polipéptido según la reivindicación 4, en el
que la actividad de la RGAE se corresponde con la liberación de al
menos alrededor de 12.5 \mug de ácido acético/ml.
6. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 que comprende al menos una de
las siguientes:
a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Fig. 7;
b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Fig. 8, o la secuencia de aminoácidos 19-59 de la
misma;
c) la secuencia de aminoácidos mostrada en la
Fig. 9;
d) la secuencia de aminoácidos codificada por la
secuencia de ADN de la SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 3, SEC ID Nº. 4,
SEC ID Nº. 5, SEC ID Nº. 6, SEC ID Nº. 7; o SEC ID Nº. 8, SEC ID
Nº. 9; o SEC ID Nº. 10;
e) una secuencia de aminoácidos codificada por
una secuencia de ADN que
- i)
- se hibrida a la secuencia de ADN de la SEC ID Nº. 10 bajo las siguientes condiciones: remojo en 5xSSC y prehibridación durante 1 hora a \sim40ºC en una solución de 5xSSC, 5xsolución de Denhardt, fosfato sódico 50 mM, pH 6.8, y 50 \mug de ADN de timo de ternero ultrasónico desnaturalizado, seguido de hibridación en la misma solución completada con una sonda marcada con 32-P-dCTP 50 mCi durante 18 horas a \mu40ºC seguido de tres lavados en 2xSSC, SDS al 0.2% a 40ºC durante 30 minutos;
- ii)
- se hibrida a la secuencia de ADN de la SEC ID Nº. 10 bajo cualquiera de las condiciones descritas en las págs.24-25 de la descripción ("Análisis de Southern blot - - - y cebadores polienlace pYES 2.0 inversos");
- iii)
- tiene al menos una homología del 70% con la SEC ID Nº. 10.
7. Polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, que es immunológicamente
reactivo con un anticuerpo desarrollado contra una RGAE purificada
derivada de Aspergillus aculeatus, CBS 101.43.
8. Secuencia de ADN recombinante que comprende
una secuencia de ADN que codifica el polipéptido según cualquiera
de las reivindicaciones 1-7.
9. Secuencia de ADN recombinante según la
reivindicación 8, donde la secuencia de ADN consta de al menos una
de las siguientes:
a) las secuencias de ADN mostradas en la Fig.
7;
b) la secuencia de ADN mostrada en la Fig. 8, o
los nucleótidos 40-215 de la misma;
c) la secuencia de ADN mostrada en la Fig. 9; o
los nucleótidos 1-159 de la misma;
d) las siguientes secuencias de ADN: SEC ID Nº.
2, SEC ID Nº. 3, SEC ID Nº. 4, SEC ID Nº. 5, SEC ID Nº. 6, SEC ID
Nº. 7; o SEC ID Nº. 8, SEC ID No.9; o SEC ID Nº. 10;
e) una secuencia de ADN que
- i)
- se hibrida a la secuencia de ADN de la SEC ID Nº. 10 bajo las siguientes condiciones: remojo en 5xSSC y prehibridación durante 1 hora a \sim40ºC en una solución de 5xSSC, 5xsolución de Denhardt, fosfato sódico 50 mM, pH 6.8, y 50 \mug de ADN de timo de ternero ultrasónico desnaturalizado, seguido de hibridación en la misma solución completada con una sonda marcada con 32-P-dCTP 50 mCi durante 18 horas a \sim40ºC seguido de tres lavados en 2xSSC, SDS al 0.2% a 40ºC durante 30 minutos;
- ii)
- se hibrida a la secuencia de ADN de la SEC ID Nº. 10 bajo cualquiera de las condiciones descritas en las págs. 24-25 de la descripción ("Análisis de Southern blot - - - y cebadores multienlace pYES 2.0 inversos");
- iii)
- tiene al menos una homología del 70% con la SEC ID Nº. 10.
10. Vector que comprende la secuencia de ADN
recombinante según cualquiera de las reivindicaciones
8-9.
11. Célula huésped transformada que contiene el
vector de la reivindicación 10.
12. Método para la producción de un polipéptido
con actividad RGAE utilizando una célula huésped transformada según
la reivindicación 11.
13. Utilización del polipéptido con actividad
RGAE según cualquiera de las reivindicaciones 1-7
en al menos uno de los siguientes objetivos:
a) como agente para la degradación o modificación
de la MHR o del ramnogalacturonano acetilado;
b) como agente para la degradación o modificación
de las paredes celulares vegetales;
c) en combinación con otros enzimas que degradan
la pared celular vegetal;
d) en combinación con otros enzimas que degradan
la pared celular vegetal, para preparar un producto con una
proporción aumentada de actividad RGAE;
e) en combinación con una preparación de
pectinasa que puede ser utilizada para degradar o modificar paredes
celulares vegetales;
f) en combinación con una preparación de
pectinasa que puede ser utilizar para degradar o modificar paredes
celulares vegetales, para preparar un producto con una proporción
aumentada de actividad RGAE;
g) en conjunto con enzimas específicos de la MHR
desacetilada o parcialmente desacetilada;
h) en conjunto con enzimas específicos de la MHR
desacetilada o parcialmente desacetilada, para preparar un producto
con una proporción aumentada de actividad RGAE.
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