JPH07505286A - 新規酵素及びｄｎａ配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規酵素及びＤＮＡ配列 本発明はラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ（以降、その略語ＲＧＡＥ を一般に用いる）である新規酵素、対応のＤＮＡ配列、ベクター、形質転換宿主 、ＲＧＡＥの製造方法、酵素調製品、及びＲＧＡＥの利用を含んで成る。 本発明は新規の＄１ＧＡｌｌ、この酵素の部分アミノ酸配列、部分ＤＮＡ配列、 並びに全アミノ酸配列及び全ＤＮＡ配列の特性化、検出及び詳細を提供する。　 。 ＲＧＡＥは分類酵素名うムノガラクツロナン酢酸−エステルアセチルヒドロラー ゼを有するヒドロラーゼであり、これは酢酸エステルの対応のアルコール及び酢 酸塩への加水分解を触媒するアセチルエステラーゼ（ＥＣｎｏ、３．１．１．６ ）の群に属する。 発明の背景 植物由来の多ＩＩＩ（例えばペクチン）はアセチル基でよく置換されている（Ｒ ｏｓｂｏｕｔｓ＋　Ｆ、Ｍ、、　Ｊ、Ｐ、Ｔｈ１ｂａｕｌｔ、　Ｃ，Ｍｅｒｃｉ ｅｒ、　ｒｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｃｒｏｓｓ ｌｉｎｋｉｎｇ　ｏｆ　ｂｅｅｔ　ｐｅｃｔｉｎｓ　Ｊ米国特許第４．６７２． ０３４号）、多Ｉ！類の用途において、これらの置換はゲル化特性に影響を及ぼ す（Ｗｉｌｌｉａｓ＋ｓｏｎ　ｃ、Ｉ　Ｃ，Ｂ、　Ｆａｕｌｄｓ、　Ｊ、＾、　 Ｍａｔｔｈｅ＠。 Ｄ、Ｂ、　Ａｒｃｈｅｒ＋　Ｖ、Ｊ、Ｍｏｒｒｊｓ、　Ｇ、Ｊ、Ｂｒｏｎｎｓｅ ｙ＊　Ｍ−Ｊ、Ｒ３ｄｏｕｔ＋　ｒＧｅｌａｔｉｏｎｏｆ　ｓｕｇａｒｂｅｅｔ 　ａｎｄ　ｃｉｔｒｕｓ　ｐｅｃｔｉｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｅｎｚｙｗｇｅｓ　ｅ ｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍｏｒａｎｇｅ　ｐｅｅｌ　Ｊ　、　Ｃａｒｂｏｈｙ ｄｒａｔｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　１３＋　３８７−３９’Ｌ　１９９０）＊植物 材料、例えば果物及び野菜の加工において、内因性酵素が最終産物の収率及び品 質を高めるために加工助剖として用いられている（Ｐｉｌｎｉｋ、Ｗ、＋　Ａ、 Ｇ、Ｊ、νＯｒａｇ（Ｉｎ、＋　ｒＥｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅＯＸｙｍ＠　１ｒｅ ａｊ＠ｊａｆｌＬ　０ｎｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　 ｆｒｕｉｔｓ　ａｎｄ　ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ」、：　Ｊｅｎ　Ｊｊ−ｔｒＱｕ ａｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｆｒｕｉｔｓ　ａｎｄ　ｖａｇｅｔａｂｌ ｅｓ＋　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ　Ｉ　ＡＣ３Ｓｙ ｍｐ、Ｓｅｒ、４０５＋　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔ ｙ＋Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ，２５０−２６９＋　１９８９）　、　５ｃｈ ｏｌｓらは、リンゴの細胞壁から酸性ポリマーペクチンフラグメントを、ペクト 分解、ヘミセルロース分解及びセルロース分解酵素を含む技術的酵素調製品の利 用によって単離及び特性化している。この酵素耐性多ｍ＋＊、通称「改良多毛領 域（ａｏｄｉｄｉｅｄ　ｈａｉｒｙ　ｒｅｇｉｏｎ）」（ＭＩＩＲ）は分枝度の 高いラムノガラクツロナン骨格より成り、ガラクツロン酸残基の上にアセチル基 を有している（Ｓｃｈｏｌｓ、　Ｉｌ、Ａ、、　Ｍ、Ａ、Ｐｏｓｔｈｕｍｕｓ＋ ＾、Ｇ、Ｊ、　Ｖｏｒａｇｅｎ＋ｒｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　 ｏｆ　ｈａｉｒｙ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｅｃｔｉｎｓ　１ｓｏｌａｔｅｄ ｔｒｏｌＩ　ａｐｐｌｅ　ｊｕｉｃｅ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　１ｉ ｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　」　＋Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ、　２０１＋　１１７−１２９＋１９９０）　＊商業酵素調製品 の多大なスクリーニングはアスペルギルス　アキエレアタス（＾ｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕａａｃｕｌｅａｔｕｓ）１ｍ製品に到り、これはＭ）ＩＲを分解することが できる。ラムノガラクツロナーゼ（ＲＧ）と呼ばれる新規酵素がこの調製品から 同定及び精製されている。　ＲＧの精製の際、この酵素はサポニン化ＭＨＲにの み働くことが明らかとなり、従ってエステラーゼ、特にアセチルエステラーゼが ＭＢＲの分解にとって重要な役割を果たしているにちがいない（Ｓｃｈｏｌｓ、 　ｔｌ、＾、、　Ｃ，Ｃ，Ｍ、　Ｃ＠ｒａ＠ｄｓ、　Ｍ、Ｊ、Ｆ、　５ｅａｒｌ ｅ−ｖａｎ　Ｌｅｕｗｅｎ＋　Ｐ、Ｊ、Ｍ、Ｋｏｒｍｅｌｉｎｋ、＾、Ｇ、Ｊ、 Ｖｏｒａｇｅｎ、’Ｒｈａｍｎｏｇａｌａｃｔ−ｕｒｏｎａｓｓ：　ａ　ｎａｖ ａｌ　ｅｎｚｙｍｅ　ｔｈａｔ　ｄｅｇｒａｄｅｓ　ｔｈｅ　ｈａｉｒｙ　ｒｅ ｇｉｏｎｓ　ｏｆｐｅｃｔｉｎｓ　Ｊ　Ｉ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｒｅｓ ｅａｒｃｈ　２０６＋　１０５−１１５＋　１９９０）　＊　ＨＭＲのような分 枝ラムノガラクツロランを脱アセチレートできる酵素が従って必要であり、なぜ なら分枝ラムノガラクツロラン上の高い度合いのアセチル化は、ラムノガラクツ ロナンの脱アセチル化に及ぼす高い活性を有する酵素の作用を防ぐからである。 いくつかの多Ｉ’ｌｌ（キシラン、マンナン及びペクチン）番よアセチル化され ることで知られ、そしてアセチルエステラーゼ番よその特異的な多糖類基質に対 して非常に特異的であること力（知られてに％る力く、しかしその一部は非多１ １１１１基質、例えば）　ＩＪアセチン及びナフトールアセテートに対する活性 を示す、トリアセチン及びビー゛ンペクチンに対して活性であるアスペルギルス 　ニガー（＾ｓｐｅｒｇｌｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）アセチルエステラーゼはＭａ ｔｈｅ−ら（Ｍａｔｈｅｗ、　Ｊ、Ａ、、　Ｓ、Ｊ、　Ｈｏｗｓｏｎ＋Ｍ、Ｈｊ 、Ｋｅｅｎａｎ、Ｐ、Ｓ、Ｄａｌｔｏｎ、　ｒｌｍｐｒｏｖｅｓｅｎｔ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ｇｅｌａｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｂｅｅｔ　 ｐｅｃｔｉｎ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａｎｅｎ ｚｙｍｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏ−＾ｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ−Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈ　ａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ 　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｒＢ　、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｐｏｌｙｍｅ ｒｓ　１２＋２９５−３０６．１９９０）により述べられている。トリアセチン に対して活性の高いペクチンアセチルエステラーゼｌよシトラスの外皮力１ら精 製されてしする（Ｗｉｌｌａｍｓｏｎ、　Ｇｅｌ　’Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆ　ｐｅｃｔｉｎ　ａｃｅｔｙ ｌ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｏｒａｎｇｅ　Ｐｅｅｌ　Ｊ　Ｐｈｙｔｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ３０、４４５−４４９．１９９１）　ＨＭＲに対する活性番よ ごれら従来技術の多ａｍアセチルエステラーゼのいづれについても実証されてし １なＩｌｌ。 従って、ＩＩＭＨのアセチル基を加水分解するアセチルエステラーゼの能力は従 来技術のアセチルエステラーゼのし１づれにつし１ても実証されておらず、そし て本発明の目的はＨＭＨに対して高１１特異性を有するＲＧＡＥを提供すること にある。 本発明にかかわるＲＧＡＥは、それがアスペルギルススＣＲ３　１０１．４３由 来の精製ＲＧＡＨに対して発生させた抗体と免疫反応性である事実を特徴とする 。 本明細書における「由来」なる語は、株ＣＢ３　１０１．４３により産生された ＲＧＡＥを示すのみならず、株ＣＢ５　１０１．４３から単離したｎＮＡ＆！Ｊ ｌによりエンコードされ、且つそのＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物におい て産生されたＲＧＡＥも意味する。 本発明にかかわるＲＧＡＥの好適なＳ欅の下記の部分アミノ酸配列（ＳＥＱより 　Ｎｏ．　１） 又はそれに相同生な部分アミノ酸配列を示し、この部分アミノ酸配列のＲＧＥＡ 活性を有するポリペプチドの一部である。 本明細書において、「同族体」とは、特定の条件のもとに（例えば５×のｓｃｃ の中で事前浸漬し、次いで５×のｓｃｃ，ｓｘのＤｅｎｈａｒｔｄｔ溶液、５Ｑ ＋＠ｌ’ｌのリン酸ナトリウム、９１１６．８及び５０ｕｇの変性音波処理中胸 腺ＤＮＡの溶液中で４０°Ｃで１時間プレハイブリダイズし、続し）て５０μＣ ｉの３２−　Ｐ−ｄＣＴＤラベルプローブの補完された同一の溶液の中で４０℃ で１８時間ハイブリダイゼーションし、次いで２×のＳＣＣ　。 ０、２％のＳＤＳの中で４０℃で３０分３回洗う）　ＲＧＡＥ酵素をコードする ＤＮＡと同じプローブとハイブリダイズするｔｌＮＡによりエンコードされるポ リペプチドを意味するつもりである．より詳しくは、この語は本発明のＲＧＡＩ ！をエンコードする上記の配列に対して少なくとも７０％相同性である［ｌＮＡ 配列を称することを意図してに％る．この語番よ上記のＤＮＡ配列の改変、例え ばヌクレオチド置換であってＲｒ；ＡＥの５５１１のアミノ酸配列はもたらさな いが、その［ｌＮＡ構築体を導入する宿主生物のコドン用法に対応する置換、又 はヌクレオチド置換であって５５１１のアミノ酸配列はもたらし、それ故可能と しては、天然酵素と番よ異なる性質を有するＲＧＡＥ突然変異体をもたらしうる 異なるタンＸり質構造を事実上もたらす置換を含むことを意図している．可能な 改変のその他の例は、配列へのーもしくは数個のヌクレオチドの挿入、配列のい づれかの末端での１もしくは数個のヌクレオチドの付加、又は配列のいづれかの 末端もくしは配列内での１もしくは数個のヌクレオチドの欠失である。 従って、驚くべきことに、本発明にかかわるＲＧＡＩ！はＭＩＩＲの脱アシル化 に関して特異性が高いが、しかしそれはトリアセチン及びビーンペクチンに対し て何ら活性を示さず、そして更に従来技術のアセチルエステラーゼより高い特異 性を示すことが発見された。 上記の部分アミノ酸配列は、かかる酵素を発現する生物に関するゲノムライブラ リー又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするのに用いることのできるＤＮＡ プローブの構築のために利用することができ、これにより、ＤＮＡ配列であって 、その親ＤＮＡ分子が由来する微生物種の中に挿入したときのＲＧＡＨの大量生 産、又は非形質転換条件ではＲＧＡＥに近縁する酵素を全（産生しない宿主微生 物の中に挿入したときの付随の近縁酵素なしのＲＧＡＩＩ！の産生のいづれかに 利用できうる配列を獲得できる。このＤＮＡ配列は樹立でき、それは以下で明ら かとなる。 従って、本発明の目的は、新規のＲＧＡＥ、並びに今まで可能であったよりも高 い収量及び高い純度でのＲＧＡＥの製造のための手段及び方法、並びに今まで可 能であったよりも効率的な植物細胞壁組織の分解のためのＲＧＡＥ単独での、又 はその他の有意義な量の酵素との組合せでの利用の提供にある。また、本発明の 目的は、ＲＧＡＥの比率が本来の産物における比率に対して高い又は低い新規な 産物の提供にある。 本発明により得られる組換ＤＮＡ配列はＲＧＡＥ活性を有するポリペプチドをコ ードする［ｌＮＡ配列、又はかかるＲＧＡＥコード配列に対して実質的な配列相 同性を有するＤＮＡ配列を含んで成る。 下記において、本発明にかかわる組換ＤＮＡ配列をどのようにして製造するかを 詳しく説明する。 ＲＧＡＨの精製のためのアスペルギルス　アキュレアタスから産生された粗酵素 調製品は下記のようにして作ることができる０便宜上、この粗アスペルギルス　 アキュレアタス調製品を以下でＡ、ａ、ｅ。 ｐと呼ぶ。 遺伝子ドナーとしての株アスペルギルス　アキエレアタスＣＢ５１０１．４３を 下記のようにしてパイロットプラントスクールで発酵させた。 下記の組成を有するアガー基質をＰｅｒｎｂａｃｈフラスコの中で調製した： ＰｅｐｔＯｎｅ　ロ１ｆｃｏ　６ｇ アミノリン　オルタナ　４ｇ グルコース　１ｇ 酵母抽出物Ｄｉｒｃｏ　３　ｇ 内袖出物Ｄｉｒｃｏ　１．５　ｇ ＫＨｍＰＯｎ　Ｍ、ｅｒｃｋ　２０ｇ モルツ抽出物Ｅｖｅｒｓ　２０　ｇ イオン交換ＨｚＯ１０００ｄまで ｐＨを５．３０〜５．３５に合わせた０次に４０ｇのアガーＤｉｒｃｏを加え、 そしてその混合物を１２０℃で２０輪ｉｎオートクレーブにかけた（この基質を Ｅ−アガーと呼ぶ）。 株ＣＢ５１０１．４３をＥ−アガースラント上で培養した（３７℃）、このスラ ントからの胞子を滅菌スキムミルクの中に懸濁し、そしてその懸濁物をバイアル の中で凍結乾燥した。１本の凍結乾燥バイマルの中身をＦｅｒｎｂａｃｈフラス コに移した。そのフラスコを次に３０°Ｃで１３日インキュベートした。 下記の組成を有する基質を５００リツトルのシード発酵槽の中に調製した： Ｒｏｆｅｃ（コーンスチープ　３．６ｋｇリカードライ物質） ソイビーンオイル　１．２ｋｇ 水道水を約２４０リツトルの総容量となるまで加えた。　ＣａＣＯ５の添加前に ｐＨを約５．５にした。この基質をシード発酵槽の中で１２１″Ｃで１時間滅菌 した。接種前の最終容量は約３００リツトルとした。 Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ胞子懸濁物をこのシード発酵槽に移した。シー型発酵 槽。 攪拌：　３００ｒｐｍ　（２枚のタービン羽）１気：　３００ノーマルリツトル のエアー／分温度＝３０〜３１℃ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　（商標）発泡防止剤　１５０ｊｄ＝８．０（ＮａｚＣＯｓの 添加）で、通気なしで１００ｒｐ−の攪拌で保った。その後、残りの基質成分を 加え、ｐｉをリン酸で約６．０に合わせた。この基質をメイン発酵槽の中で１２ ３°Ｃで１／２時間滅菌した。接種前の最終容量は約１０８０リツトルであった 。 次に１５０リツトルのシード培養物を加えた。 発酵条件は： 発酵槽タイプ：約２．７の高さ／直径の比を有する慣用の通気攪拌型発酵槽。 攪拌：　２５００ｒｐｍ　（２枚のタービン羽）通気７１２００ノーマルリツト ルのエアー／分温度：３０°Ｃ 時間：約１５１時間 ２４発酵時間から約１１６発酵時間に至るまで、ペクチン溶液を約８リツトル／ 時間の一定速度でメイン発酵槽に無菌的に加えた。以下の組成を有するペクチン 溶液を５００リツトルの投与タンクの中で調製した： Ｐｅｃｔｉｎ　ｇｅｎｕ　”　２２ｋｇ濃リン酸　６ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　（商標）発泡防止剤　５０Ｉｄ”　Ｇｅｎｕペクチン（Ｃｏ ｐｅｎｈａｇｅｎ　ｐｅｃｔｉｎ　ｆａｃｔｏｒｙ　Ｌｔｄ、からのシトラスタ イプＮＦ） 約３２５リツトルの全容量となるまで水道水を加えた。この基質をこの投与タン クの中に１２１°Ｃで１時間滅菌した。投与前の最終容量は約３６０リツトルで あった。この部からなくなったら、別の１ｇ位の部を作った。一台の発酵槽にと ってのペクチン溶液の全容量は約７２５であった。 約１５１時間の発酵の後、発酵工程を止めた。約１８５０リツトルの培地を約５ °Ｃに冷し、そしてその酵素を下記の方法に従って回収した。 培地を、Ｈｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土（フィルター助剤でプレコー トした真空ドラムフィルター（Ｄｏｒｒ　０１ｉｖｅｒ）でドラム濾過した。そ の濾液をエバーポレーシッンにより、培地容量の約１５％まで濃縮した。 その濃縮物を、フィルター助剤として０．２５％のＨｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃ ｅｌｌを有する５ｅｉｔｚフイルターシート（タイプスープラ１００）で濾過し た（以下の表では濾過Ｉと呼ぶ）、その濾液を５６１ｇの（ＮＨ４）ｌｓＯ４／ ２でｐｕｓ、ｓで沈澱させ、そして４％のＨｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪 藻土をフィルター助剤として加えた。この沈殿物及びフィルター助剤をフレーム フィルターでの濾過により分けた。そのフィルターケーキを水に溶かし、そして 不溶性部分をフレームフィルターでの濾過により分けた。その濾液を５ｅｉＬｚ フイルターシート（タイプスーブラ１００）上でフィルター助剤として０．２５ ％のＨｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌを保ってチェック濾過した（下記の表に おいては濾過■と呼ぶ）、その濾液を限通濾過装置でダイアフィルターに付した 。ダイアフィルター後、その液体を１２．７％乾燥物質含有量となるまで濃縮し た（下記の表においては濃縮物中の乾燥物質含有量として称する）。 プロテアーゼ活性の部分除のための任意の塩基処理をこの段階で実施できうる。 塩基処理を用いる場合、それは９．２のｐＨで１時間実施し、その後ｐＨ値を５ ．０に合わせる。 ここでその液体をチェック濾過し、そして胚種の削減のために濾過し、そしてそ の濾液を５ｔｏｋｅｓ由来の凍結乾燥装置で凍結乾燥した。 純粋なＲＧＡＥが表１に示す通りにＡ、ａ、ｅ、ｐ、から獲得できる。 表土　−五ノガークッロナンーアセチルエスーー−ゼのアスペルギルス　アキュ レアタス酵素液追加１： 工程２の準備のためのバッファー交換、小粒子及び約５０％の色調の除去、最大 １５−ｇのタンパク質／ｄへの希釈（これをしなければサンプルは工程２におけ るカラムに結合しない）。 追加２： ＴＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。アセチルエステラーゼ画分は０ ．０４〜０．０８Ｍのｌ１ａＣ１よりプールした。 追加３： 工程４の準備のための濃縮及びバッファー交換。 追加４： アフィニティークロマトグラフィー−非保持画分をプールした。 架橋化アルギネートの調製はＲｏｍｂｏｕｔｓ　ｐ、ＬＩ　Ｃ，Ｃ，Ｊ、Ｍ、　 Ｇｅｒａｅｄｓ。 Ｊ、　Ｖｉｓｓｅｒ、　Ｈ，Ｐｉｌｎｉｋ、ｒＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐｅｃｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓｏｎ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅ ｄ　Ｐｏ１ｙｕｒｏｎｉｄｅｓ　Ｊ　：　Ｇｒｉｂｎａｕ、Ｔ、Ｃ，Ｊ、＋　Ｊ 、Ｖｉｓｓｅｒ＋Ｒｊ、Ｐ、　Ｎ１ｖａｒｄ　（［）　、　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　 Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｓ＋ ｐａｎｙ、Ａｍ５ｔｅｒｄａ＋ｉ。 ２５５−２６０．１９８２に従って行った。 追加５： 工程６の準備のためのバッファーの適合。 追加６： 旧Ｃは疎水性相互作用クロマトグラフィーである。アセチルエステラーゼ画分を １．０Ｍ〜０．９Ｍの（ＮＨａ）　ｚｓＯａからプールした。 追加７： 工程８の準備のための濃縮及びバッファー交換。 追加８： ＩＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。アセチルエステラーゼ画分を６ ５−Ｍ〜７０ｍＭのＮａＣ１よりプールした。 追加９： 工程１０の準備のためのバッファー適合。 追加１０： ＩＥＣはイオン交換クロマトグラフィーである。アセチルエステラーゼ画分を６ ５ｍＭ〜７０ｍＭのＮａＣ１よりプールした。 このようにして精製したＲＧＡＩ！は抗体の製造のために動物の免疫に利用でき うる。より詳しくは、本発明のＲＧＡＥに対する抗血清はＮ。 Ａｘｅｌｓｅｎ　らのＡ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｉ ＊ｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏ　ｈｏｒｅｓｉｓＢｌａｃｋｉ＜ｅｌｌ　５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　１９７３＋第２３章、又はＡ。 Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ　とＲ１丁ｈｏｒｐｅのＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　ｉ ｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ＋　１９８２　（より詳しくはＰＰ、　２７−３１）に記載の手 順に従ってウサギ（又はその他のげっ歯動物）を免疫することにより発生させる ことができうる。精製イムノグロブリンはその抗血清から、例えば塩析（（ＮＨ ４）＊５Ｏａ）、続いて透析及び例えばＤＨＡＩ！−３ｅｐｈａｄｅｘでのイオ ン交換クロマトグラフィーにより得られうる。タンパク質の免疫化学特性化はオ フタロニー二重拡散分析（０，０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙのＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏ ｆ　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ１ｍ＋ｍｕｎｏｌｏ　（Ｄ、Ｍ、　Ｈｅ１ｒ、ｄ ｉ）、　ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、　１９６７＋　ｐｐ、　６５５−７０６）　、交差免疫電気泳動□１．１ｌｘ ｅｌｓｅｎらの前揚、第３及び４章）、又はロケット免疫電気泳動（Ｎ、　Ａｘ ｅｌｓｅｎら第２章）によって行われうる。 ヱ３　／菫星列 先に表示した部分アミノ酸配列は精製ＲＧＡ［！より、自動配列決定（Ａｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　４７３　Ａタンパク質シーケンサ−）を用いて 決定した。配列に基づき、サンプルの純度は９０％より大と推定された。 ＲＧＡＥを下記の通りに更に特性化した。 このＲＧＡＥはｐＨ５，５及び４０℃の温度でその最適活性を有する。５０℃及 びＰＨ５，０で２０時間以内では活性損失は認められなかった。３０℃ではｐＨ 安定性はｐＨ６〜７で最高であった。 ＲＧＡＩ！はＭＩＩＲに対して特異的な活性を有し、そしてＭＨＲの中に存在し ている全てのアセチル基の約７０％を最大で放出させる。 ＲＧＡＥと、シトラス及び菌類の両者の起源の純粋なペクチンメチルエステラー ゼ、アスペルギルス種（アスペルギルスニガー、アスペルギルス　アキ工しアタ ス）由来の純粋なエフソー及びコンドーアラビナーゼとの組合せは、ビーツペク チン又はリンゴＭＨＲのいづれからのアセチル放出の上昇を何ら示さなかった。 アラビノース側鎖を除去するためのこれらの基質の予備処理も何ら刺激効果を発 揮しなかった。これらの結果より、新規のＲＧＡＥが同定されたことが明らかと なり、これは分枝ペクチン領域のアセチルエステルに対して特異性が高い。 分子量：約３１．０００〜３５．０００ダルトン等電点：　ｐ）１４．２ 本発明にかかわるＲＧＡＥの好適な態様は、ＲＧＡ［！が４．０〜７．０好まし くは、４．５〜６．０の最適ｐＨ，３，７〜６．７、好ましくは４．０〜４．５ の等電点、３０，０００〜ｓｏ、ｏｏｏの分子量、及び１０〜５０°Ｃ１好まし くは２５〜４５゛Ｃの最適温度を示すことを特徴とする。 また、本発明は、本発明にかかわるＲＧＡＩｉをエンコードすることを特徴とす る組換ＤＮＡ配列を含んで成る。 本発明にかかわる組換ＤＮＡ配列の好適な態様は、それが、ａ）アスペルギルス 　アキュレアタスＲＧＡＥ　ＤＮＡインサート、ｂ）ａ）のＤＮＡインサートを 含んで成る成熟ＲＧＡＥ　［ｌＮ＾についてのコード領域にハイブリダイズし、 且つＲＧＡＥ活性を有するポリペプチドについての構造遺伝子並びに任意的にプ ロモーター、シグナルもしくはリーダーペプチドについてのコード領域及び／又 は転写ターミネータ−を含んで成るＤＮＡ配列、ｃ）ａ）又はｂ）において定義 したＤＮＡ配列の誘導体、あるいは、ｄ）成ＰＲＧＡＥ又はそのシグナルペプチ ドもしくはリーダーペプチドをコードし、且つａ）又はｂ）のＤＮＡ配列につい て遺伝コードの意義の範囲内で縮重しているＤＮＡ配列、より選ばれるＤＮＡ配 列を含んで成ることを特徴とする。 本発明にかかわる組換ＤＮＡ配列の好適な態様は、それが下記の部、分ＤＮ＾配 列を含んで成ることを特徴とする。 ａ）　ＡＴＧＡＡＧＡＣＣＧ　ＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧ　ＣＡＣＣＧＣＴＣＴＴ　 ＣＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＧＣＣＡＣＧＡＣＮＮＧ　（ＳＥＱ　 より　Ｎｏ、２）ｂ）　ＧＴＣＴＡＴＣＴＣＧ　ＣＧＧＧＴＧＡＣＴＣＧＡＣＣ ＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧ　ＧＣＧＧＧＴＣＧＧＧＭＣＴＭＣＧＧＣ（ ＳＥＱ　よりＮｏ、コ）ｃ）　ＴＧＧＧＧＣＧＡＧＴ　ＡＣＣＴＧＣＧＡＧＴ　 ＴＡＣＣＴＣＴＣＣＧ　ＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴ　ＴＡＡＣＧＡＣＧＣＧＧＴＣＧ ＣＧ　（ＳＥＱ　よりＮｏ、４）ｄ）　ＧＡＣＧＣＡＡＣＣＴ　ＡＴＧＡＡＧＡ ＣＣＴ　ＴＧＧＭＴＧＣＣＡ　ＣＣＧＴＣＡＡＣＴＣＧＴＡＴｒＣＣＣＣ入ＴＣ ＧＡＴＣＡＣＡＣ（ＳＥＱよりＮｏ、５）ｅ）　ＣＣＡＣＡＣＣＡＧＴ　ＣＣＴ ＧＣＧＧＣＧＣＧＡＧＧＴＣＧＴＧＧ　ＣＴＧＡＧＣＧＴＴＣＴｒＧＡＡＧＧＣ ＧＧＴＧＧＴＡＴＧＣＡＣ（ＳＥＱ　よりＮｏ、６）ｆ）　ＧＧＧＴＡＣＧＴＣ Ｇ　ＴＴＧＡＡＧＡＧＴＧ　ＴＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＴＴ　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ、７）本発明にかかわる組換［ＩＮＡ配列の好適な態様は、それ が下記のＤＮＡ配列を含んで成ることを特徴とする。 ＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴ　ＴＡＡＣＧＡＣＧＣＧ　ＧＴＣＧＣＧ　（ＳＥＱ　より 　Ｎｏ、８）ＧＡＣＧＡＧＣ’Ｍ’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、９）本発明にかか わる組換ＤＮＡ配列の好適な態様は、それがＡＧＴＣＴＡＴＭＧ　ＡＡＧＡ’Ｍ ’ＧＡＣＡ　ＧＣＣＡＡＧ入入ＣＡ　ＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡ　ＴＧＡＡＧＡＣＣ ＧＣ又は本発明にかかわるＲＧＡＥをエンコードするそれに相同性の配列を含ん で成ることを特徴とする。 また、本発明は、本発明にかかわる組換ＤＮＡ配列を含んで成ることを特徴とす るベクターを含んで成る。 本発明にかかわるベクターの好適な態様は、そのプロモーターがアスペルギルス 　オリザ（Ａｓｐｏｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｉｚａｅ）タカアミラーゼプロモータ ーであることを特徴とする。 また、本発明は、本発明にかかわるベクターを含むことを特徴とする形質転換宿 主を含んで成る。 本発明にかかわる形質転換宿主の好適な態様は、その形質転換宿主がアスペルギ ルス株であることを特徴とする。これにより、良好なＲＧＡＥ生産能力が得られ る。 本発明にかかわる形質転換宿主の好適な態様は、その形質転換宿主が、アスペル ギルス　アキュレアタス、アスペルギルス　ニガー、アスペルギルス　オリザ又 はアスペルギルス　アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓａｗａ曽ｏｒｉ）の株に 属することを特徴とする。これにより、良好なＲＧＡＥ生産能力が得られる。 本発明にかかわる形質転換宿主の好適な態様は、その形質転換宿主が微生物であ ることを特徴とし、それは非形質転換条件においてはＲＧＡＩＩ！を産生しない か、又は有意でない量でのみＲＧＡＥを産生し、好ましくはバチルス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ）種、Ｅ、コリ（１！、ｃｏｌｉ）又はＳ、セレピジア（Ｓ、ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）である、これにより、高いＲＧＡＥ活性及びその他の要望されて いる特異的な酵素活性のスペクトルを有する「テーラ−メート」酵素調製品が得 られる。 また、本発明は、本発明にかかわる形質転換宿主の利用による、　ＲＧＡＥの製 造方法を含んで成る。この方法により、ＲＧＥＡは高収量で得られうる。 また、本発明は、本発明にかかわる方法により製造したＲＧＡＥを含んで成る。 　ＲＧＥＡは高収量で得られうる。 また、本発明は酵素調製品を含んで成り、これはそれが本発明にかかわるＲＧＥ Ａで冨む植物細胞壁の分解又は改変にとって有用なペクチナーゼ調製品を含むこ とを特徴とする。これにより、ペクチナーゼ調製品の細胞壁分解能力の増強が得 られうる。 本発明にかかわる酵素調製品の好適な態様は、このペクチナーゼの調製品が、ア スルギルス属に属する衛生物、好ましくはアスペルギルス　ニガー、アスペルギ ルス　アキレアタス、アスペルギルスアワモリ又はアスペルギルスニガーにより 産生されうることを特徴とする。かかる調製品は非常に良好な植物細胞壁分解を 供することができる。 本発明にかかわる酵素調製品の好適なｉｌ欅は、そのＲＧＥＡが本発明にかかわ る方法によって製造されたＲＧＡＥであることを特徴とする。 この調製品の構造費はかなり安い。 また、本発明は、本発明にかかわるＲＧＡＥの、アセチル化うムノガラクッロナ ンの分解又は改変のための製剤としての利用を含んで成る。 本発明にかかわるＲＧＡＩ！の利用の好適な態様は、植物細胞壁の分解又は改変 のための製剤としての利用である。現状、植物細胞壁の分解が本発明にかかわる ＲＧＡＥの最も好適な用途であり、その理由はその高い植物細胞壁分解活性にあ る。 本発明にかか、わるＲＧＡＨの利用の好適な態様は、ｌ’１ｉｌＲを脱アシル化 又は部分脱アシル化するのに特異的な酵素と共にＲＧＡＥを利用する利用である 。このような更なる酵素は、アセチル化うムノガラクッロナンを攻撃するよりも 高い特異性で脱アシル化及び部分脱アシル化分枝うムノガラクッロナンを攻撃す る全ての酵素が含まれ、ラムノガラクッロナン骨格をエンドもしくはエクソ攻撃 により攻撃する酵素、又は側鎖を攻撃する酵素が含まれる。 また、本発明は、本発明にかかわる酵素調製品のアセチル化うムノガラクツロナ ンの分解又は改変のための製剤としての利用を含んで成る。 本発明にかかわる酵素調製品の好適な態様は植物細胞壁の分解又は改変のための 製剤としての利用である。現状、植物細胞壁の分解が本発明にかかわる酵素調製 品の最も好適な用途であり、その理由はその高い植物細胞壁分解活性にある。 本発明にかかわる酵素調製品の利用の好適な態様は、ＭＨＲを脱アシル化又は部 分脱アシル化するのに特異的な酵素と共にこの酵素調製品を利用する利用である 。このような更なる酵素は、アセチル化うムノガラクツロナンを攻撃するよりも 高い特異性で脱アシル化及び部分脱アシル化分技うムノガラクツロナンを攻撃す る全ての酵素が含まれ、ラムノガラクツロナン骨格をエンドもしくはエクソ攻撃 により攻撃する酵素、又は側鎖を攻撃する酵素が含まれる。 図６はプラスミドｐＹＨＤ１７の地図であり、ここでｒＴＰ１プロモーター」は Ｓ、セレビジア　トリオースホスフェト　イソメラーゼプロモーターを、「ター ミネータ−」は転写ターミネータ−を、「＾■ｐ」はアンピシリン耐性を媒介す る遺伝子を、「２μＯｒＩ」は酵素プラスミドの２μ複製起点を、そしてｒｔｌ ＲＡ３Ｊは宿主株におけるウラシル欠陥を補完する選択マーカーをエンコードす る遺伝子を示す。 実施例 林且反版方正 ドナー生物：　ｍＲＮＡを、十分なる通気性を保証する攪拌を伴ってダイズ含有 発酵壇地の中で増殖されたアスペルギルス　アキエレアタスＣＢ３１０１．４３ から単離した。３〜５日間の増殖の後菌糸体を回収し、液体窒素の中で急凍結し 、そして−８０℃で保存した。 鼠母抹工 使用したサツカロマイセス　セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ）株はｙＮＧ２３１　（ＭＡＴ　ａｌｐｈａ＋　１ｅｕ２．　ｕ ｒａ３−５２＋　ｈｉｓ４−５３９．　ｐｅｐ４−ｄｅｌｔａ　１１ｃｉｒ　＋ ）又はＪＧ１６９　（ＭＡＴｃｒ　；　ｕｒａ３−５２；　１ｅｕ２−３＋　１ １２　ｉ　ｈｉｓ　３−［１２００；ｐｅｐ　４−１１３；　ｐｒｃｌ：：８１ ３３；　ｐｒｂｌ：：ＬＥＩＩ２；　ｃｉｒ＋）とした。 −スミドの 市販のプラスミドｐＹＥｓ　Ｉ［（ｌｎｖｉ　ｔｒｏｇｅｎ）を５ｅｐｌでセロ リ、フレノウ［ＩＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰで補完し、そしてＣ１ａ　Ｉで切 った。そのＤＮＡをアガロースゲルでサイズ分画し、そして約２０００ｂｐのフ ラグメントを電気溶離により精製した。同じプラスミドをＣ１ａ　Ｉ／Ｐｖｕ　 ＩＩで切り、そして約３４００ｂｐのフラグメントを電気溶離により精製した。 この２本のフラグメントを、酵母ＴＰＩプロモーターを含むプラント末端化Ｓｐ ｈ　Ｉ　／ＥｃｏＲＩフラグメントをリゲートさせた。このフラグメントは、Ｓ 、セレビジア由来のＴＰＩプロモーター（Ｔ、＾１ｂｅｒｓとＧ。 ＫａｗａｓａｋｉのＪ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　１　、１９８ ２．　ｐｌ）、４１９−４３４）が若干改変（内部ｓｐｈ　１部位が、その部位 の中心を構成する４つのｂｐを欠失させることにより除かれている）されたプラ スミドから単離した。 更に、そのプロモーターの上流の冗長配列を、Ｂａｌ　１エクソヌクレアーゼ処 理により除去し、続いてＳｐｈ　Ｔリンカ−を付加した。最後に、ＥｃｏＲＩリ ンカ−を位置−１０に付加した。これらの改変を経て、そのプロモーターはＳｐ ｈ　Ｉ　−ＢｃｏＲＩフラグメントを含んだ、もとのプロモーターに比してのそ の効率はその改変により影響されなかつＲＮ＾単離に用いた全てのガラスウェア ーを＋２２０’Ｃで少なくとも１２ｈベークした。エッペンドルフチューブ、ピ ペットチューブ及びプラスチックカラムをＥ＋ＯＲの中の０．１％のジエチルビ ロカーボネ−）　（ＤＥＰＣ）において１２時間処理し、そしてオートクレーブ にかけた。全てのバッファー及び水（トリス含有バッファーを除く）を０．１％ のＤＨＰＣで３７°Ｃで１２時間処理し、そしてオートクレーブに力Ａ＆すた。 全ｌ恍コ列１阻 全ＲＮＡを、グアニジニウムチオシアネートによる抽出、それに続＜　５．７Ｍ のＣｓＣｌクッションを（Ｃｈｒｉｇｗｉｎら、１９７９）を介する下記の改良 を伴う超遠心によって調製した。線菌糸体を液体Ｎ８の中で乳鉢で細かい粉末に 砕き、続いて予備冷却したコーヒーミルの中に粉砕し、そして直ちに５ｖｏｌの ＲＮＡ抽出バ・ンファ−（９ＭのＧｕＳＣＮ。 ０．５％のＮａ−ラウリルサルコシン、２５＋ｓＭのＨａ−クエン酸、ｐＨ７， ０゜０．１Ｍのβ−メルカプトエタノール）の中に懸濁した。その混合物をＲＴ で３０分攪拌し、そして遠心（３０分、５０００ｒｐｍ、　ＲＴ、　Ｈｅｒａｅ ｕｓＭｅｇａｆｕｇｅ　１．ＯＲ）　シて細胞塊をベレット化した。その上清液 を集め、５．７ＭのＣｓＣｌクッシッン（５，７ＭのＣｓＣ１，０，１ＭのＥＤ ＴＡ、　ｐＨ７，５，０，１％のＤＨＰＣ、使用前にオートクレーブ処理）の上 に、１２．０ｄのＣｓＣ１クッション当り２６．５ｍの上清液を用いて慎重に重 ね、そして遠心して全ＲＮＡを得た（Ｂｅｃｋｍａｎ、　ＳＷ　２８０−ター、 　２５．ＯＯＯｒｐｍ、　ＲＴ、　２４ｈ）　−遠心後、その上清液を慎重に除 き、そしてＲＮＡペレットを含むチューブの底を取出し、そして７０％のＥ＋Ｏ Ｈですすいだ、全ＲＮＡペレットをエッペンドルフチュープの中に移し、５００ μ２のＴ＋！、　ｐＨ１，６の中に懸濁しくそれが困難なら、通常６５°Ｃで５ 分熱する）、フェノール抽出し、そしてエタノールで−２０“Ｃで１２時間かけ て沈殿させる（２．５　ｖｏｌのＥ＋ＯＨ，０，１ｖｏｌの３ＭのＮａＡｃ＋　 ｐＨ５，２）ｓ　このＲＮＡを遠心により集め、７０％のＥ十〇Ｈで洗い、そし て最小量のＤＨＰＣ−［１１−の中に再懸濁させた。　ＲＮ＾濃度を０Ｄｔｉ。 ７□。を測定することにより決定した。 ボＩＡ”ＲＮＡの ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースアフィニティークロマト グラフィー　（Ａｖｉｖ　＆　Ｌｅｄｅｒ＋　１９７２）により単離した。典型 的には、０．２ｇのオリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ）を、１０ｍの１×カラム装填バツフアー（２０■−のトリス−ＨＣ ｌ、　ｐＨ７，６，０，５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％の５Ｏ５ ）の中で予備膨潤させ、［１ＥＰＣ処理したプラグ付きプラスチックカラム（Ｄ ｏｌｙ　Ｐｒｅｐ　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＣｏｌｕｍｓ＋、　Ｂｉｏ　 Ｒａｄ）に載せ、そして２０ｍの１×装填バツフアーで平衡にした。全ＲＮＡを ６５°Ｃで８分熱し、氷上で５分急冷し、そしてこのＲＮＡサンプルに１ｖｏｌ の２Ｘカラム装填バツフアーを加えた後、このカラムの上に載せた。その溶離液 を集め、そして２〜３回再装填した。各装填の前にサンプルを上記の通りに加熱 及び氷上で急冷した。このオリゴ（ｄＴ）カラムをＩｏｖｄの１×装填バツフア ー、次いで３ｖｏｌ　のメディウス塩バッフｙ−（２０ｍＭのトリス−ＣＩ、　 ｐ）＋７．６．０．１ＭのＮａＣ１，１ｍＨのＥＤＴＡ、０．１％のＳ［ｌＳ） で洗い、続いて６５℃に予備加熱した３ｖｏｌ　の溶離バッフｙ　（１０ｍＭの トリス−ＣＩ、ｐＨ７，６＋　１　ｍＭのＥＤＴＡ、　Ｏ，ＯＳ％のＳ［］Ｓ） での５００ｍの画分を集めるポリ（Ａ）　”　ＲＮＡの溶離を行った。その００ □。を各回収画分について測定し、そして■ＲＮＡ含有画分をプールし、そして −２０゛ｃで１２ｈがけて沈殿させた。 このポリ（Ａ）　”　ＲＮＡを遠心により集め、ＩＩＥＰＣ−ＤＩ−の中に再懸 濁し、そして５〜１０μｇのアリコートとして８０℃で保存した。 ノーザンブロ・・ト 様々な菌糸体由来のポリ（Ａ）ＲＮＡ　（５μｇ／サンプル）を１．２アガロー ス−２，２Ｍホルムアルデヒドゲル（Ｓａｓ＋ｂｒｏｏｋら、１９８９）で電気 泳動し、そしてナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ　−Ｎ　、＾細ｅｒｓｈａ鵬）にトラ ンス７ｙ−バッファーとして１０　Ｘ　ＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９ ）を用いてプロットした。３つのランダムプライム（ＦｅｉｎｂｅｒｇをＶｏｇ ｅｌｓｔｅｉｎ＋１９８３）　”ｔＰ−ラベルｃｌｌＮＡプローブを個々のパイ プリダイゼーシッンにおいて用いた４１）Ａ、アキュレアタス由来のポリガラク ッロナーゼｒについての１．３ｋｂのＮｏｔ　Ｉ　−５ｐｅ　ｌフラグメント、 ２）Ａ。 アキュレアタス由来のエンドゲルカナーゼｒをエンコードする１、３ｋｂのＮｏ ｔ　ｒ　−５ｐｅ　ｌフラグメント及び３）Ａ、アキュレアタス由来のガラクタ ナーゼについての１．２ｋｂのＥａｇ　ｌフラグメント、ノーザンハイブリダイ ゼーシロンは５　ＸＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、５×デンハーツ 溶液（ＳａｍｂｒＯｏｋら、１９８９）、０．５％のＳＯ３（ｗ／ｖ）及び１０ ０μｇ／ａｔの変性サク精子ＤＮＡの中で、約２ｎｇ／ｍのプローブ濃度テロ５ °Ｃ’ｔ’１６時間、続イテ６５°Ｃテ５　Ｘ５ＳＣ（２Ｘ１５分”）　、２Ｘ ＳＳＣ１０，５％の５Ｏ５（ＩＸ３０分）、０．２ｘｓｓＣ、０，５％の５Ｏ３ （Ｉ　Ｘ３０分）及び５　ｘｓＳｃ（２ｘｌＳ分）で洗った。−８０″Ｃで１２ 時間のオートラジオグラフィーの後、プローブ＃１をフィルターからその製造者 の仕様書に従って除き、そしてプローブ＃２、そして最後にプローブ＃３と再ハ イブリダイズさせた。サイズマーカーとしてＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ由来のＲＮＡラダーを用いた。 ｃＩＩＩＮ八合成： 差合成■金虞 二本ｔＸｃＤＮＡを５μｇのＡ、アキュレアタスボリ（Ａ）　’　［ｌＮＡより 、ヘアーピン改良を利用するＲＮａｓｅＨ法（ＧｕｂｌｅとＨｏｆｆｍａｎ、　 １９８３゜５ａｓｂｒｏｏｋら、　１９８９）により合成した。このポリ（Ａ） ′″ＲＮＡ（５ｕ　ｌのＤＥＰＣ処理水中で５μｇ）を７０″Ｃで８分熱し、氷 上で急冷し、そして最終容量５０ｕｌで、１ｍＭづつのｄＮＴＤ　（Ｐｈｏｒｍ ａｃｉａ）、４０単位のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（ＲＮａｓｉｎ 、　Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｐｇのオリゴ（ｄＴ）＋ｚ−＋ｓプライマー（Ｐｈ ｏｒｍａｃｉａ）及び１００単位の５ｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）を含む逆転写酵素バッファー（５０謡Ｈのトリス−ＣＩ、　ｐＨ８，３， ７５■ｈのＭＣＩ、　３　ｍＭのＭｇＣ１ｔ、　ｌｏｍＭのＤＴＴ、　Ｂｅｔｈ ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と組合せた。第−鎖 ｃＤＮＡはこの反応混合物を４５°Ｃで１時間インキュベートすることにより合 成した。 ２二■■金成 合成後、３０ｔｔｌ！の１０１のトリス−Ｃ１，ｐＨ７，５，１ｍＭのＨＤＴＡ を加え、そしてａ＋ＲＮＡ　：　ｃＤＮＡバイブリドを、４０μｇのグリコーゲ ンキャリアー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＊）　、０．２ｖｏ１の ＩＯＭのＮＨａＡｃ及び２．５ｖｏｌの９６％のエタノールの添加により一２０ ℃で１２時間かけてエタノール沈殿させた。このバイブリドを遠心により回収し 、７０％のＥ＋ＯＩｌで洗い、風乾し、そして１１００ｕづつのｄＮＴＰ、　４ ４単位のＥ、コリＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　、６．２５単 位のＲＮａｓｅＨ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）と１０．５単位のＥ、コリＤＮＡ　リガーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ ｉｏｌａｂｓ）を含む２５０ｔｔｌの第二鎖バッフｙ−（２０ｍＭのトリス−Ｃ Ｉ。 ｐＨ７，４，９０＋ｓＭのＭＣＩ、　４．６ｍＭのＭｇＣｈ、　１０ｗＭの（Ｎ ＩＩ４）　ｔｓＯａ、　１６μＭのβＮＡＤ　”　）の中に再懸濁させた。第二 鎖ｃＤＮＡ合成は、その反応チューブを１６°Ｃで３時間インキュベートし、次 いでその反応をＥＤＴＡを２０−Ｈの最終濃度となるまで添加して停止させ、続 いてフェノール抽出することによって行った。 マン　ビーン　−ｕｎｂｅａｎヌクレアーゼル二本鎖（ｄｓ）　ｃＤＮＡを、２ ＶＯ１の９６％のＥ＋Ｏｔｌ、　０．１ｖｏｌの３ＭのＮａＡｃ、　ｐＨ５，２ の添加により一２０’Ｃで１２時間かけてエタノール沈殿させ、遠心により回収 し、７０％のＥ＋ＯＨで洗い、乾かしく５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ）、そして３６単位 のマングビーンヌクレアーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）を含む３０ＩＩｆｆｉのマングビーンヌクレアーゼバッファー 　（３０ａＭのＮａＡｃ、　ｐＨ４，６，３００ｍＭのＮａＣ１，ｔａｎのＺｎ ５Ｏａ＋　０．３５ｍＭのＤＴＴ、　２％のグリセロール）の中に再懸濁させた 。−末鎖ヘアーピンＤＮ＾をその反応物を３０°Ｃで３０分インキュベートする ことによりクリップし、続いて７０μｉの１０−Ｍのトリス−ＣＩ、　ｐＨ７， ５＋　１蒙りのＥＤＴＡを加え、フェノール抽出し、そして２　ｖｏｌの９６％ のＥ＋ＯＲ及び０，１ｖｏｌの３ＭのＮａＡｃ、　ｐＨ５，２により一２０′Ｃ で１２時間かけてエタノール沈殿させた。 Ｔ４ＤＮＡボ１メー−ゼによるプーン ｄｓ　ｃＣＤＡを、０．５μＭづつのｄＮＴＤ及び７．５単位の７４ＤＮＡポリ メラーゼ（ｌｎｖｊ　ｔｒｏｇａｎ）を含む５０ｕｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ バッファ”−（２０ｍＭのトリス−アセテート、　ｐ）１７．９．１Ｏａ＋Ｍの ＭｇＡｃ、　５抛−のＫＡＣ。 １ｍＭの［１ＴＴ）の中で、この反応混合物を＋３７℃で１５分インキュベート することによってＴ４１）ＮＡポリメラーゼでプラント末端化すた。その反応を ＥＤＴＡの２０−Ｍの最終濃度となる添加により停止させ、続いてフェノール抽 出及びエタノール沈殿を行った。 ア°ブ　−１　゛−ジョン　びサイズ１補完（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応の後、ｃＤ ＮＡを、６００μｍｏｌのＢｓｔＸＩアダプター及び５単位のＴ４リガーゼ（Ｉ ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む３０ｔｌｌのリゲーションバッファ−（５０ｓ＋Ｈ のトリス−ＣＩ、　ｐＨ７゜８．１０ｍＭのＭｇＣ１ｇ、１０■ｈのＤＴＴ、１ ＋ｓＭのＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌの牛血清アルブミン）の中で、その反応混合物 を１６°Ｃで１２２時間インキュベートることにより非パリンドロームＢｓｔＸ Ｉアダプター（１７７ｇ　／　ｉａＬ　ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にリゲートさせ た。この反応を＋７０’Ｃで５分熱することにより停止させ、そして適合ｃＤＮ Ａをアガロニスゲル電気泳動（０，８％）ＩＳＢ−アガロース、ＦＭＣ）により サイズ分画し、ポリゲートのアダプター及び小さいｃＤＮＡを分けた。このｃＤ ＮＡを０．７ｋｂのカットオフでサイズ選別し、そしてそのｃＤＮＡを１０＋＊ Ｍのトリス−ＣＩ、　ｐＨ７，５，１ｍＭのＥＤＴＡの中で１００ボルトで１時 間アガロースゲルから電気溶離させ、フェノール抽出し、そして上記の通りに一 ２０″Ｃで１２時間かけてエタノール沈殿させた。 ｃＤＮＡ−イブ−１−の 適合したｄｓ　ｃＤＮ’Ａを遠心により回収し、７０％のＥ＋ＯＨで洗い、そし て２５ｄのＤＩＭの中に再懸濁させた。大スケールライブラリーリゲーションの 前に、４つの試験リゲーションを、それぞれ１μ２のｄｓｃＤＮＡ　（反応チュ ーブ＃１〜＃３）、２単位のＴ４リガーゼ（ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５０ｎ ｇ　（チューブ＃　１　）　、１０１００ｎチユーブ＃２）及び２００ｎｇ（チ ューブ＃３及び＃４）のＢｓｔＸｌ切断済酵母発現ベクター（ｐＹＥ５２．０ベ クタ一１ｎｖｔｔｒｏｇｅｎ又はｙＨｆｌ１３のいづれか）を含む１ｏａｎのリ ゲーシッンバッファー（上記と同）の中で実施した。ラダーシラン反応は、＋１ ６℃での１２時間のインキュベーションにより行い、７０℃で５分間加熱し、そ して１μｌの各リゲーションを４０〃２のコンビテントＥ、コＩ月０６１細胞（ ＯＤａｓ。−ｌリットルのＬＢ培地の中でｏ、９；冷０■−で２回、２０ｊｄの １０％のグリセロール１回洗浄；２ｙｉの１０％のグリセロールに再懸濁）にエ レクトロボレートした。ＩＷｌのｓｏｃを各形質転換細胞に加えた後、それらの 細胞を３７°Ｃで１時間増殖させ、５０μ２をＬＢ＋ロンピシリンプレート（ｌ ｏｏｕｇ／ｄ）上でプレートし、そして３７°Ｃで１２時間増殖させた。 最適条件を利用し、大スケールリゲーシタンを９単位の７４リガーゼを含む４０ μｌのリゲーシヨンバツフア−の中で設定し、そして反応物を１６°Ｃで１２時 間インキュベートした。そのリゲーシゴン反応を７０℃で５分熱することにより 停止させ、−２０”Ｃで１２時間エタノール沈殿させ、遠心により回収し、そし て１０ｔｌｆｉのＤＩＭの中で再懸濁させた。１μｌのアリコートをエレクトロ コンピテントＥ、コリ１０６１の中に、上記と同じエレクトロポレーション条件 を利用して形質転換させ、そして形質転換細胞を０価検定し、そしてそのライブ ラリーを５０００〜７０００ｃ、ｆ、ｕ、　／プレートでＬＢ＋アンピシリンプ レート上にプレートした。各プレートに３ｄの培地を加えた。この細菌をかき取 り、１４のグリセロールを加え、そしてプールとして一８０’Ｃで保存した。残 りの２ｄをＤＮＡ単離のために用いた。ＤＮＡの量が必要な数の酵母形質転換体 を供するのに十分でないとき、大スクールＤＮ＾を、−夜増殖させた５０ｕｌの 一８０’Ｃの細菌ストックで接種した５００ｉの培地（ＴＢ）から調製した。 ボ１メー−ゼ゛　・によるｃＤＮＡプローブの　１Ａ、アキュレアタスＲＥ４由 来のラムノガラクッロナンアセチルエステラーゼのためのｃＤＮＡプローブを得 るため、精製酵素のＮＨ，−末端配列の中の領域に相当する縮重オリゴヌクレオ チド（ＲＧＥＡ／Ｓｘ図７）を、デオキシイノシンを４つのあいまいな位置に合 わせることによって合成した０図７は、ＰＣＨに用いた推定のデオキシイノシン 含有プライマー配列を示し、アスペルギルス　アキュレアタス由来の精製ラムノ ガラクッロナンアセチルエステラーゼ■より得た対応のアミノ酸を並べている。 このプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応技術（Ｏｈａｒａ　ら、１９８９）を 利用する、７０００クローンを含む増幅ｃＤＮＡライブラリープールから標的Ｒ ＧＡ［！ｉｅ　ｃＤＮ＾を増幅するために、直接（ブライ７−Ｒ２２，５’　− ＣＴＧＴＡＡ↑ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ−３’　）及び逆（プライ７−＃４３． 　５　’　−ＡＴＴＡＣＡＴＧＡＴＧＣＧＧＣＣＣＴ　−３’　）　ｐＹＥｓ　 ２．０プライマーと組んで用いた。　ＰＣＲ反応は、５５０μｗｏｌのセンスプ ライマー　（ＲＧＡＥ／む）及び８００μｍｏｌづつのアンチセンスプライマー （上述）、ｌｌＩｇの鋳型１１ＮＡ　（ｃＤＮＡライブラリーブール＃３３がら のＯｉａｇｅｎ精製プラスミドＤＮＡ）及び２００ｍＭづツ（７）ｄＴＰを含む １００　ｔｔ　ｌ　（７）ＰＣＲハｙ　７ｙ　（１０＋ｍＭ（７）　ト’Ｊ　ス −ＨＣｌ、　ｐ）１Ｂ、３．５０ｍＭノＫＣＩ、　１．５ｍＭ（７）ＭｇＣｈ、 ｏ、。 ％のＰｅｒｋｉｎ−ＥＩａ＋ｅｒ＋　（ｅｔｕｓ）の中で、ＤＮＡ熱サイクラ− 及び２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ＋　（ｅｔｕ ｓ）を用いて実施した。　３０サイクルのＰＣＲを、９４°Ｃで１分の変性、５ ５°Ｃで２分のアニール及び７２°Ｃで３分の伸長のサイクルプロフィールを利 用して実施した。 ２０μｌのアリコートの増幅生成物を０．７％のアガロースゲルでの電気泳動に より分析し、−のプライマーペアーを有する０、９ｋｂの主要産物を示した（セ ンス、ＲＧＡＥ／Ｓ！；アンチセンス、ｐＹＥｓ　２．０逆プライマー４４３） 　、課題の［ｌＮ＾フラグメントをゲルから単離し、タイプＤ−０４０５ふちな し透析チューブ（Ｓｉｇｍａ）を用いて電気溶離させ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ら） 、続いてフェノール抽出及び−２０”Ｃで１２時間のエタノール沈殿を行った。 そのＰＣＲ産物を５０１μＭづつのｄＮＴＰ、及び３単位の７４ＤＮＡポリメラ ーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む２０ｕｌのハラ７ｙ　 −（２０ｍＭ（７））’Ｊスー７セｆ　）、ｐ！（７，９，１０ｍＭ　（ＤＭｇ Ａｃ、　５０１のＫＡｃ、　１　ｍＭのＤＴＴ）の中で３７℃で１０分プラント 末端化した。その反応を７０°Ｃで５分のインキュベーションにより停止させ、 氷上で５分冷し、そして５０ｐ！のキナーゼバッファー（７０ｍＭのトリス−Ｈ Ｃｌ　、　ｐＨ７，６，１０ｍＭのＭｇＣ１，、５ｓ＋ＭのＤＴＴ）の中で希釈 し、続いて３７℃で３０分でのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＯＵ、　Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）及び１ｍＭのＡＴＰ　ｐＨ７，ｏ　（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）によるリン酸化、７エ／　／Ｌ／抽出、エタノール沈殿及び ５ｌｌａ　Ｉ−切断膜リン酸化ｐＵｃ１８ベクター（リ−ディングり５０ｎｇ、 　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　ヘの１６°Ｃで１２時間かけてのリゲーシタンを行っ た。 Ｅ、コリＤＨ５αを、５μｉのリゲーション混合物を用いてアンピシリン耐性に 形質転換させ（Ｈａｎａｈａｎ　１９８５）　、そして１３のクローンをプラス ミドミニプレプの単離によって分析した。　ＤＮＡ　（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１ ９８９）　、及びプラスミドサブクローンのＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　Ｉ［Ｉ 消化、それに続くユニバーサルｐＵＣプライマーによるーのサブクローン由来の ０．９ｓ＋ｂのインサートの末端の配列決定（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）を行 った。　ｐＲＧＡ１９サブクローンのヌクレオチド配列分析は、固有のオープン リーディングフレームを示し、それは、プライマーエンコードアミノ酸に加えて 、精製酵素由来の有用なＮＨ８末端配列と一致する１０個の追加の残基を含み、 それ故そのＰＣｌｌがラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼＩｃＤＮＡ（ 図８）の所望の領域を特異的に増幅させたことを確証せしめた０図８はｒｇａｌ 　ｃＤＮＡの５′−末端のヌクレオチド配列及びＡ、アキュレアタス由来のＲＧ ＡＥａｓｅ　Ｉの推定−次構造を示す。成熟タンパク質を先行するＮ１ｈ−末端 シグナルペプチドに下線を付した。 サザンプロ・ト ８個の個別のｃＤＮＡライブラリープール（Ｒ３３，９０，１００，１３０゜１ ３６、１４０．１４２．１４８）由来のＱｉａｇｅｎ精製ＤＮＡ（３Ｍｇ）をＥ ａｇｌ（３Ｕ／μｇのＤＮＡ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で完 全に消化し、０．７％のアガロースゲルで分画し、変性させ、そして１０　Ｘ　 ＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）をトランスファーバッフｙ　（Ｓｏｕ ｔｈｅｒｎ　１９７５）として用いてナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、 　Ａｒｎｅｒｓｈａｍ）にプロットした。精製した０、９ｋｂのＲＧＡＥｓｅ　 Ｉ　ＰＣＲフラグメントをランダム−ブライミング（ＦｅｉｎｂｅｒｇとＶｏｇ ｅｌｓｔｅｉｎ　１９８３）により３１ｐ−ラベルしく＞　Ｉ　ＸＩＯ雫Ｃｐｓ 　７８ｇ）、そしてサザン分析におけるプローブとして用いた。 ハイブリダイゼーシヨンを２　Ｘ５ＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）　、 ５　ｘデンハーツ溶液（Ｓａｓｂｒｏｏｋら、１９８９）　、１％（ｗ　／　ｖ 　）のＳＤＳ及び１００μｇ／−の変性サク精子ＤＮＡの中で、２．５ｎｇ　７ ｙｉのプローブ濃度で、６５°Ｃで１６時間行い、続いて２　Ｘ５ＳＣ（２Ｘ１ ５ｍ１ｎ）、２ＸＳＳＣ。 １％（１）ＳＤＳ　７！６５℃テ３０ｍ１ｎ　、次イテ０．２ＸＳＳＣ、１％ノ ｓＤｓテロ５°Ｃで３０分、そして最終に２　Ｘ５ＳＣ（２Ｘ１５■ｉｎ）で洗 った。このフィルターを一８０°Ｃで１２時間オートラジオグラフィーにがけ、 各ｃＤＮＡブールにおいて一本の強くハイブリダイズする１、０ｋｂの７ラグメ ントが示された。このことは、各分析プールがＡ、アキュレアタス由来のＲＧＡ Ｅｓｅ　Ｉをエンコードする全長ｃＤＮＡコピーを含むことを示唆する。 従って、ブール＃３３を更なる実験のために用いた。 ノーザンプロット Ｒ５３培地の中での増殖の際のＡ、アキュレアタスＲＧＡＥｓｅ　Ｉ　ｍＲＮＡ の定常期レベルを評価するため、ポリ（Ａ）”ＲＮＡを上記の培地の中に１〜５ 日間増殖させた後に毎日回収した菌糸体がら単離し、そしてノーザン分析にかけ た。このポリ（Ａ）　”　ＲＮＡ（５ｙｇ／サンプル）を１．２アガロース−２ ，２Ｍホルムアルデヒドゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）で電気泳動、そ してＩＯＸＳＳＣ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）をトランスファーバッファ ーとして用いたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、　Ａｍｅｒｓｈａ鋤）にプロッ トした。サイズマーカーとしてＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ由来のＲＮＡラダーを用い、そしてランダムプライムした（Ｆｅ ｉｎｂｅｒｇとＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ＋　１９８３）　”　Ｐラベルの０．９ｋ ｂ　ＲＧＡＥｓｅ　Ｉ　ＰＣＲ産物（前記の段落も参照のこと）をプローブとし てノーザン分析に用いた。ハイブリダイゼーションは５　Ｘ５ＳＣ（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、１９８９）、５×デンハー′ノ溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９ ）　、０．５％の５０５（ｗ　／　ｖ　）及び１００μｇ／ｄの変性サク精子Ｄ ＮＡの中で、約２．５ｍｇ／ｄのプローブ濃度で、６５°Ｃで１６時間行い、続 いて５×ＳＳＣで６５℃（２Ｘ１５分）、２　ｘｓｓｃ　、０．５％の５Ｏ５（ Ｉ　Ｘ３０分）、０．２ＸＳＳＣ、０，５％の５Ｏ３（１×３０分）、そして５ 　Ｘ５ＳＣ（２Ｘ１５分）洗った。そのフィルターを一８０’Ｃで４日間オート ラジオグラフィーにかけた。 ＲＧＡＥｓｅ　Ｉ　ｃＤＮＡプローブは、５日目の菌糸体及び若干４日目の菌糸 体において１．Ｏｋｂの−ＲＮＡ種を放出したが、３日目の菌糸体では検出せず １日後の増殖培地の中でのグルコースの低下レベルと一致し、３日後の上清液中 ではグルコースは検出できなかった。 Ａ　アキュレア　ス　の−ムノガークツロ　ンアセチルエスー−ＲＧＡＥｓｅ　 Ｉについての全長ｃＤＮＡクローンを単離するため、ｃＤＮＡライブラリーブー ル＃３３由来の３０，０００のコロニーを、アンピシリン（１００μｇ／−）を 含むＬＢ〜アガー（２４Ｘ　２４ｃ鵬のプレート、Ｎｕｎｃ）の上にプレートし 、そしてナイロンフィルター（Ｎｙｂｏｎｄ　−Ａ　、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）で カバーしたＬＢ＋ａｍｐ−プレート上にレプリケートした。精製した０、９ｋｂ のＲＧＡＥｓｅ　Ｉ　ＰＣＲフラグメントを上記の通りにランダムプライムする ことによって３ｆｆｉｐ−ラベルし、そしてコロニーハイブリダイゼーシッン（ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９１１１９）によるライブラリープールのスクリーニン グにおけるプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは２ＸＳＳＳ、５Ｘ デンハーツ溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）　１％（Ｗ／Ｖ）のＳＯ３及 び１００μｇ／ｄの変性サク精子［ＩＮＡの中で、２．５ｍｇＺｄのプローブ濃 度で６５°Ｃで１６時間行い、次いで２　Ｘ５ＳＧ（２Ｘ１５分）、０．２　Ｘ ５ＳＣ、０，１％の５ＯＳ（２Ｘ３０分）、そして２　Ｘ５ＳＣ（２Ｘ１５分） で洗い、続いて一８０℃で１２時間かけてオートラジオグラフィーにかけた。ブ ール＃３３由来の３０，０００コロニーのスクリーニングは、２ラウンド以上の ハイブリダイゼーションによりコロニー精製された５つの推定ＲＧＡＥｓｅ　Ｉ 　ｃＤＮＡクローンをもたらした。これらのクローンの一つ（ｐＲＧＡ　１と命 名）を、そのプラスミドをＨｉｎｄｌｌ！及びＸｂａ　Ｉで消化し、そしてその １．０ｋｂのｃＤＮＡインサートの末端の前進及び後進ｐＹＥ３２．０ポリリン カープライマーを用いる配列決定により特性化した。 ｐＲＧＡ　１の中の１．０ｋｂのインサートは、ヌクレオチド位置４０でＡＴＧ コドンより開始し、そしてＴＧＡ停止コドンで終結する０、８５ｋｂのオープン リーディングフレーム（０肝）を含む（図８と９）０図９は、ｒｇａ　１　ｃＤ ＮＡの３′末端のヌクレオチド配列及びＡ、アキエレアタス由来のＲＧＡＩ！ａ ｓｅ　Ｉの推定−次構造を示す、このＯＲＦには３９ｂｐの５′非コード領域が 先行し、そして１３２ｂｐの３′非コード領域とポリ（Ａ）テールが続く、推定 タンパク質配列と精製成熟ＲＧＡＥｓｅ　１のＮＨｚ−末端配列との比較は、１ ８残基のシグナルペプチドを含む前駆体タンパク質をそのｃＤＮＡがエンコード することを示す（図８）。 アスペルギルス　ベク　−の ベクターｐ！（１１４１４（図１０）はプラスミドｐ？７５（ＨＤ２３８．０２ ３号に記載）の誘導体である。このプラスミドとは異なり、ｐＨ０４１４はプロ モーターとターミネータ−との間に固有制限部位の鎖を有する。このプラスミド は、ターミネータ−の３′末端での約２ｏｏｂｐの長さのフラグメント（所望で ないＲＥ部位を含む）の除去、それに続くプロモーターの５′末端での約２５０ ｂ、の長さのフラグメント（これも所望でない部位を含む）の除去により構築さ れる。その２００ｂｐの領域はＮａｒ　Ｉ　（ｐＵｃベクターの中にある）及び Ｘｂａ　Ｉ　（ターミネータ−のすぐ３′）により切断し、続いてそれで作り上 げられた末端をクレノウＤＮ＾ポリメラーゼ＋ｄＮＴＤで補完し、そのベクター フラグメントをゲルで精製し、そしてベクターフラグメントに再すゲートするこ とによっそ除去する。このプラスミドをｐＨ０４１３と呼ぶ、　ｐＨ０４１３を ５ｔｕＩ　（プロモーターの５′末端にある）及びＲｖｕ　Ｉ［（ｐｔｌｃベク ターの中にある）で切り、ゲルで分画し、そして再すゲートし、ｐＨ０４１４が 得られる０図１０はプラスミドｐＨ０４１４の地図であり、ここで「へＭＧター ミネータ−」はＡ、ニガーグルコアミラーゼターミネータ−を示し、そしてｒ　 ＴＡＫＡプロモーター」はＡ、オリガＴＡＫ＾アミラーゼプロモーターを示す、 　ｐ＋１Ｄ４６４はｐＨ［１４１４の誘導体であり、その５′非翻訳領域はアス ペルギルスＴＰｉ遺伝子由来の５′非翻訳領域に置き換えられている。 ＲＧＡＥｓｅ　Ｉ　カセ・・　の ｐＲＧＡ＋　由来のブラスミドミ＝レプＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｂｏ　Ｉで消 化し、０．７％のアガロースゲルで電気泳動し、続いて１．０ｋｂのｃＤＮＡイ ンサートをＧｅｎｅｃｌｅａｎ　ＩＩキットを用い、その製造者の仕様書に従っ て精製しくＢｉｏ　１０１　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）＋そしてＢａｍＨ Ｉ　／Ｘｈｏ　Ｉ−切断ｐＨＤ４１４ベクターにリゲートした。１μ２のリゲー シッン混合物をＥ。 コ１月０６１にエレクトロボレートし、そして２つの形質転換体をプラスミドミ ニブレブＩ）ＮＡのＢａａ＋ＨＩ　／Ｘｈｏ　Ｉ消化によって分析した１両クロ ーン（ｐＲＧＡ１とｐＲＧＡｔと呼ぶ）とも適正なサイズのインサートを含むた め、ｐＲＧＡ、を更なる実験のために選んだ、　ｐＲＧＡ、発現プラスミドの一 ４ｄｉｉｌ製品（Ｑｉａｇｅｎ　Ｔｉｐ　１００％段落４参照のこと）を、この 構築体の５′末端の配列決定によりチェックし、アスペルギルスオリザ形質転換 に用いた。 アスペルギルス第１ザのノ　−　びそのノ　−　の１００　ｍｌのアスペルギル ス最少培地（ＬＭのスクロース、１０−Ｍの尿素、０．５２ｍｇ／ｄのＭＣＩ、 ０．５２ｍｇ／ｄのＭｇＳＯ４，１，５２ｍｇ／ｄのＫＨｘＰＯａ。 ０．０４μｇ／−のＮＡＪ４０？、０．４ｕ　ｇ　／’のＣｕＳＯ４，０，８＃ 　ｇ　／　’ｄのＦｅＰＯａ＋０．８μｇ／ａｄ！のＭｎ５Ｏａ、０．８１１　 ｇ　／　ｊ’のＮａＪｏＯｓ、　８　ｔｌ　ｇ　／　ＭｌのＺｎ５ＯＪに、Ａ、 オリザ株１５６０もしくは１５６０−７１０、又はＡ、ニガー由来の胞子懸濁物 を接種し、３０°Ｃで２４時間増殖させた後にその菌糸体を滅菌Ｍｉｒａｃ１ｏ ｔｈを介する濾過により集め、２００Ｊｄの０．６ＭのＭｇ５Ｏ，で洗い、２５ 威の低温の２Ｂ７／ｄのＮｏｖｏｚｙｍ（商標）（Ｎｏｖａ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　 Ａ　／　Ｓ）を含む１．２ＭのＭｇＳＯ４，１０ｍＭのＮａＨｚＰＯ４，ｐＨ５ ，８の中に懸濁し、そして氷上で５分インキュベートした。ＩＷｌのＢＳＡ（１ ２ｎｇ／ＩＩ！、滅菌濾過）をこの菌糸体に加え、そしてその懸濁物を３７°Ｃ で１．５時間ゆるやかに振盪させるからインキュベートした。プロトプラストを Ｍｉｒａｃｌｏｔｈを通じる濾過によって未消化菌糸体現から分け、５Ｉｄの０ ．６Ｍのソルビトール、１００＋＋＋Ｈのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，０の上に 載せ、そして２５００ｒｐｍで１５分遠心した。プロトプラストを中間相から集 め、３ｍの１．２Ｍのソルビトール、１０ａｎＨのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５ ，１０ｍＭのＣａＣ１ｚで４回洗い、同じバッファーの中で５Ｘ１０’〜５Ｘ１ ０”／ｄの濃度で再懸濁し、そして直ちに用いた。 Ａ、オリザ又はＡ、ニガーの形質転換を本質的に以下の通りに実施した。８μｇ のＱｉａｇｅｎ精製ｐＲＧ＾１プラスミドＤＩＩＡ（１ｕ　ｇ／ｕ　ｌ）をｌμ ｇのＱｉａｇｅｎ精製ＴｏＣ９Ｑ（１ｐ　ｇ　／　ｕ　ｊ！　）共プラスミドＤ ＮＡ　ＳＡ。 ニドゥランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　Ａｍｄｓ遺伝子保有プラスミド及び １００ｄのプロトプラスト懸濁物と混合し、そしてＲＴで２０分インキュベート した。　２５０Ｊ！ｌ！の６０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ　、　１０＋＊Ｐのトリス −ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，１０ｍＭのＣａＣ１１を加え、そしてこの混合物をＲ Ｔで２０分インキュベートした。３ｄの１．２Ｍのソルビトールを加えた後、そ の形質転換混合物を２５０Ｏｒｐｍで１０分遠心し、ＩＯＭの１．２Ｍのソルビ トールの中に再懸濁し、＾■ｄＳ選別プレートの上にまき、そして３０℃３〜５ 日間インキュベートした。 ２ＯａＭのアリコートのＹＰ＋マルトデキストリン（２％）培地に、Ｔｏｃプラ スミド（Ａ、オリザ１５６０−７１０の中で４つ、株１５６０の中で２つ）で共 形質転換したＡｍｄＳ”形質転換体由来の胞子懸濁物を接種し、続いて３０°Ｃ で２〜３日増殖させた。その形質転換体をＲＧＡＥｓｅ　Ｉ活性について、この 培養培地をラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ及びアセチルエステラー ゼ活性についてアッセイすることによりスクリーンした。様々の形質転換体にお ける培養培地に分泌したタンパク質の量及び純度を、４μ！のアリコートの上清 液画分を１０％の５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（Ｆｅｙら、１９８４）にかけ、続いてク マジー又は銀深色し、Ａ、アキュレアタス由来の精製ＲＧＡＥｓｅ　Ｉ酵素調製 品をコントロールとして用いることにより分析した。 Ｍ蓄ヱユ土工 ＡｍｄＳ”形質転換体の培養培地中のアセチルエステラーゼ活性を、２０ｄのサ ンプルを４０°Ｃで３０分、５００ａｌｔの２ｍＭのＰ−ニトロフェニル−アセ テート／２０ｍＭのＮａ−クエン酸塩バッファー、ｐｕｓ、ｏの中でインキュベ ートした液の０口、。、での吸光度の上昇として測定し、陰性コントロールとし てＡ、オリザ１５６０−７１０由来の培養培地、そして陽性コントロールとして 精製ＲＧＡＥｓｅ　Ｉ　Ｕ４製品（０，１８ｔａｇ／　ｄ　）を用いた。 測定の前に、そのｐｉｔをＩＩｉのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，０をサンプルに 加えることによって上げた。コントロール株の中の高アセチルエステラーゼ活性 に基づき、全てのサンプルはＰ−ニトロフェニル−アセテートに対して同等の活 性を示しくデーターは示さない）　、ＡｍｄＳ”形質転換体においては検出可能 な上昇はなかった。 培養培地中のラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ活性（前述）を、リン ゴペクチン（Ｓｃｈｏｌｓら、１９９０）から単離した改変多毛領域（？ＩＨＲ ）からのアセテートの遊離として測定した。サンプル（５０ｄづつの上清液）を ＩＯＭの１％（ｗ　／　ｖ　、　ＨＪ中）の改変多毛領域と、ａ）２時間及びｂ ）２４時間、上記と同じコントロールサンプルを用いて、インキュベートした。 酢酸の決定はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ＋ｓ由来の酢酸キットを用い 、その製造者の仕様書に従って実施した。６つのＡｍｄＳ”形質転換体のうちの ５つが１％のＭＨＲに対して明確な活性を示し、一方６つの形質転換体はＡ、オ リザコントロール株１５６０−７１０に比して活性を示さなかった（図１１）０ 図１１は、Ａ。 アキュレアタス由来のラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼＩを発現する 組換Ａ、オリザ株により産生された１％の改変の多毛領域（ＭＨＲ）に対する活 性を示す、酵素活性はリンゴペクチンＭＨＲからの酢酸塩の遊離として測定した 。最高の活性は形質転換体ＲＧＡＩ！７１０−１及びＲＧＡＥ　７１０−４にお いて観察され、培養培地に分泌した約３５ｋＤａのタンパク質と一致した。この タンパク質は５ＯＳ−ＤＡＧＨによる判定に従い、Ａ、アキュレアタス由来の精 製ＲＧＡＥｓｅ　Ｉに比して若干過剰グリコジル化されていた。 里廼 ｙｐｏ：ｔｏｇの酵母抽出物、２０ｇのペプトン、Ｉ（１０を８１０　ｄまで。 オートクレーブにかけ、９０ｄの２０％のグルコース（滅菌濾過）を加えた。 ＹＰＧ−アガー：２５ｇ／ｌのＢａｃｔｏａｇａｒ　％　１５　ｇ　／　ｌのグ ルコース、５　ｇ／／！のＫｇＰＯ４，０，５ｇ　／　ｊ！のＭｇ５Ｏａ−７Ｈ ｔＯ，ｐＨを５．０に調整、オートクレーブにかける。 １０ＸＢａｓａｌ塩：６６．８ｇの酵母窒素ベース、１００　ｇのコハク酸、６ ０ｇのＭａｉｌ（、Ｈ，Ｏを１０００ｄまで、滅菌濾過。 ５Ｃ−ＵＲＡ　：　９０＋ｊ！の１ＱＸＢａｓａｌ塩、２２．５ｄの２０％のカ スアミノ酸、９威の１％のトリプトファン、８１０を８０６まで、オートクレー ブに付＜、３．６ｍの５％のスレオニン及び９０ｍの２０％のグルコースを添加 。 ５Ｃ−Ｈアガー：アミノ酸抜きの７．５　ｇ　／　ｊ！の酵母窒素ベース、１１ ．３　ｇ　／　ｌのコハク酸、６．８ｇ／ｌのＮａＯＨ，ビタミン抜きの５．６ ｇ／ｌのカスアミノ酸、０．１ｇ／ｌのトリプトファン及び２０　ｇ　／　Ｉｉ のアガー（ＢａｃＬｏ）、１２１°Ｃで２０分のオートクレーブ。オートクレー フ゛後、５５ｄの２２％のガラクトース溶液及び１．８ｙｄの５％のスレオニン 溶液を４５０ｄのアガー当りに加える。 ＹＮＢ−１アガー：３．３ｇ／ｊ！のＫｌ！ＰＯ４，１６，７ｇ　／　ｌのアガ ー、ｐｎを７に調整、１２１”Ｃで２０分オートクレーブ、オートクレーフ゛後 、２５ｄのアミノ酸抜きの１３．６％の酵母窒素ベース、２５ｊｌｌ！の４０％ （１）りＢｔコース溶液、１．鑞の１％のし一ロイシン溶液及び１．５ｍの１％ のヒスチジン溶液を４５０１ｄのアガー当り加える。 ＹＮＢ−１培地：　ＹＨＢ−１アガーと同じ組成だが、アガー抜き。 ＭＨＲ上層ゲル：１％のアガロース、０．０５ＭのＮａ−酢酸／ｓ１７フアー中 の０．５％のＭＨＲ，ｐＨ４，５，ゲルを煮沸し、次いでアガープレートの上に この上層を注ぐ前に５５°Ｃまで冷却。 ＦＧ−４−アガー：３５ｇ／ｌのアガー、３０ｇ／ｌのソイビーンミール、１５ ｇ／ｌのマルトデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ６　）　、５　ｇ　／　ｊ！の Ｂａｃｔ。 ペプトン、ｐＨ７，１２１°Ｃで４０分オートクレーブ。 ＦＧ−４培地：３０ｇ／ｌのソイビーンミール、１５．ｇ／ｊ！のマルトデキス トリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ　６　）　、５　ｇ　／　ｌのＢａｃｔｏペプトン、 １２１°Ｃでｇ／ｌのＮａＣ１，２ｇ　／　Ｉ！、のＫｔｓｏａ、１２　ｇ　／ 　’のＫ）１．ＰＯ４，０，１ｄ／　ｆｆｉのＰｌｕｒｏｎｉｃ　６１　Ｌ、０ ．５ｒａ／ｌの微量金属溶液、ｐｏｓ、ｏ、１２１°Ｃで２０分オートクレーブ 、ｌ５ｄｌｌの５０％の滅菌濾過尿素をオートクレーブ後に加える。 微量金属溶液：１３．９ｇ／／！のＦｅ５Ｏａ−７Ｈｚｏ、８．４５　ｇ　／　 ｌのＭｎＳＯ４−ＨｔＯ，６，８ｇ／　ｌのＺｎＣ１ｇ、２．５　ｇ　／　ｌの ＣｕＳＯ４−５Ｍｇ０，０．２４　ｇ　／　ＮのＮｉＣ１ｇ−６ＨＪ、　３　ｇ 　／　ｌのクエン酸。 本発明のよりよい理解のために下記の参考文献を参照されたシ為。 Ａｖｉｖ＋　Ｉｔ、　ｌ　Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、　１９７２．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。 ６９　：　１４０８−１４１２　。 Ｂｅｃｋｅｒ、　Ｄ、Ｍ、　＆　Ｇｕａｒａｎｔｅ、　Ｌ、　１９９１．　Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ＋ｇｏ１．１９４　：１８２−１８７　。 Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、Ｍ、＋　Ｐｒｚｙｂｙｌａ、　Ａ、！、、　ＭａｃＤ ｏｎａｌｄ、　Ｒ，Ｊ、　＆　Ｒｕｔｔｅｒ。 Ｗｊ、１９７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８　：　５２９４−５２９９ ゜Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、＾、Ｐ、　＆　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ＋　Ｂ、　１９８３ ．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３２　：６−１３　。 Ｆｅｙ＋　Ｓ、、Ｍｏ５ｅ　Ｌａｒｓｅｎ、Ｐ、＆　Ｂ１５ｋｊａｅｒ＋　Ｎ、 Ｌ、１９８４．　Ｐｈ、Ｄ。 ｔｈｅｓｉｓ、　Ｆａｃｕｌｔｙ　ｏｆ　Ｎａｔｕｒａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、 　Ａａｒｈｕｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。 Ｄｅｎｍａｒｋ　。 Ｇｕｂｌｅｒ、１１．　＆　Ｈｏｆｆ５ａｎ、Ｂ、Ｊ、１９８３．　Ｇｅｎｅ　 ２５　：　２６３−２６９゜Ｈａｎｓｈａｎ＋　Ｄ、　１９８５＋　のＤＮＡ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　（［；１ｏｖｅｒ＋　Ｄ、Ｍ−Ｉ　Ｗ）ＩＲＬ＋０ｘｆｏｒ ｄ、　Ｖｏｌ、　１．、　ｐｐ、　１０９−１３５゜０ｈａｒａ、　Ｏ，、Ｄｏ ｒｉｔ、　Ｒ，Ｌ、　＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　ｗ、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌ、ｓ、Ａ、　８６　：　５６７３−５６７７　。 Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｐｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｐ、　＆　Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、　Ｔ、　１９８９．’ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂ、＋　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ　。 Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、　＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ＋　Ａ、　 Ｒ，１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　７４　：　５４６３−５４６７゜５ｃ ｈｏｌｓ、　Ｈ，Ａ、＋　Ｇｅｒａｅｄｓ、　Ｃ，ＣＪ、Ｍ、、　５ｅａｒｌｅ −ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎ、Ｍ、、Ｊ、Ｆ、。 Ｋｏｒｍｅｌｉｎｋ、　Ｆｊ、Ｍ、　＆　Ｖｏｒａｇｅｎ、　Ａ、Ｇ、Ｊ、　１ ９９０゜Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ、　２０６　：　１０５−１１５　 。 ５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、Ｍ、　１９７５．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９ ８　；　５０３−５１７　。 配列表 （１）一般情報 （１）　出願人： （Ａ）名称：　Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／５（Ｂ）通り：　Ｎｏｖｏ　Ａ １１ｅ （Ｃ）市：　Ｂａｇｓｖａｓｒｄ （Ｅ）　国　：　Ｄｅｎｍａｒｋ （Ｆ）郵便番号５ＤＫ−２８８０ （Ｇ）電話：　＋４５４４４４８８８８（）（）テレファックス：　＋４５４４ ４９３２５６（１）テレックス：　３７３０４ （ｉｉ）発明の名称：新規酵素及びＤＮＡ配列（ｍ）配列の数：１０ （ｉｖ）コンピューター読取フオーム：（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータＦ　ＩＢＮ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）作動シス−ｒム：　Ｐ Ｃ−００３／ＭＳ−００５（Ｄ）ソフトウェアー：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ ｅａｓｅ　Ｉｌ、Ｏ＋Ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２５（ＥＰＯ）（２）ＳＥΩＩＤ Ｎ０：１についての情報：（：）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）Ｈの数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ　）分子のタイプ：ペプチド （ｖｉ）起源 （Ａ）生物：アスペルギルス　アキエレアタス（Ｂ）株：　ＣＢＳ　１０１．４ ３ （ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　１　：Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ 　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　 Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ （２）　ＳＨＯＩＤ　Ｎｏ：　２についての情報：（ｉ）配列の特＠： （Ａ）長さ：６０塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本領 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子のタイプ：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　Ｉ ［ｌ　Ｎｏ：　２　：ＡＴＧＭＧＡＣＣＧ　ＣＣＧＣＣＴＣＴＴＧ　ＣＡＣＣＧ ＣＴＣＴＴ　ＣＴｒＣＣＴＣＣＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＧ　ＣＣＡＣＧＡＣＮＮ Ｇ@６０ （２）　Ｓ［！０１０　ＮＯｉ　３についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：６０塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　１０ 　Ｎｏ：　３　：ＧＴＣＴＡＴＣＴＣＧ　ＣＧＧＧＴＧＡＣＴＣＧＡＣＣＡＴＧ ＧＣＣＭＧＡＡＴＧＧＡＧ　ＧＣＧＧＧＴＣＧＧＧ　ＡＡＣＴＭＣＧＧＣ６０（ ２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　４についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）　゛（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　 １０　ＮＯ：　４　：ＴＧＧＧＧＣＧＡＧＴ　ＡＣＣＴＧＣＧＡＧＴ　ＴＡＣＣ ＴＣＴＣＣＧ　ＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴ　ＴＡＡＣＧＡＣＧＣＧ　ＧＴＣＧＣＧ　 ５U （２）　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　５　ニラいての情報：い）配列の特＠： （Ａ）長さ＝６０塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥ［１１０ Ｎｏ：　５　：ＧＡＣＧＣＭＣＣＴ　ＡＴＧＭＧＡＣＣＴ　ＴＧＧＡＡＴＧＣＣ Ａ　ＣＣＧＴＣＡＡＣＴＣＧＴＡＴｒＣＣＣＣＡ　ＴＣＧＡＴＣＡＣＡＣ（２） 　ＳＢＱ　ＩＤ　ＮＯ：　６ニツいての情報：（１）配列の特＠； （Ａ）長さ：６０塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （−鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列の詳細：　ＳＥＱ　Ｉｌ ｌ　Ｎｏ：　６　：ＣＣＡＣＡＣＣＡＧＴ　ＣＣＴＧＣＧＧｃｃｃ　ＧＡＧＧＴ ｃＧＴＧＧ　ＣＴＧＡＧＣＧＴｒＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＧ　ＴＧＧＴＡＴＧＣＡ b６０ （２）　ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎａ：　７についての情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列０）ｔＪｔＭ　：　Ｓ ＥＱ　１０　Ｎｏ：　７　：ＧＧＧＴＡＣＧＴＣＧ　ＴＴＧＡＡＧＡＧＴＧ　Ｔ ＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＴＴ　３９（２）　５１！０１０　Ｎｏ　： 　８　ニツィＴの情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列（７）詳細：　ＳＥｏ 　１０　Ｎｏ：　８　：（２）　ＳＥＱ　ＴＯＮｏ：　９についての情報：（ｉ ）配列の特ＩＬ （Ａ）長さ：１５９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎮 （１１）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列ノ詳細：　ＳＥＱ　Ｉｎ 　Ｎｏ：　９　：ＧＡＣＧＣＡＡＣＣＴ　ＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴ　ＴＧＧＭＴＧ ＣＣＡ　ＣＣＧＴＣＡＡＣＴＣＧＴＡｎＣＣＣＣＡ　ＴＣＧＡＴＣＡＣＡＣ６O ＣＣＡＣＡＣＣＡＧＴ　ＣＣＴＧＣＧＧＣＧＣＧＡＧＧＴＣＧＴＣＧ　ＣＴＧＡ ＧＣＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＧ　ＴＧＧＴＡＴＧＣＡＣP２０ ＧＧＧＴＡＣＧＴＣＧ　ＴｒＧＡＡＧＡＧＴＧ　ＴＧＴＴＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧ ＡＧＣＴＴ　１５９（２）　ＳＥＱ　Ｉｔ）　Ｎｏ　：　１０１．：ツぃての情 報：（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：９３５塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ　）分子のタイプ：ＤＮＡ（ゲノム）（×ｉ）配列ノ詳細：　ＳＥＱ　１ ０　ＮＯ：１０　：ＡＴＣＧＡＣＡＡＡＡ　Ｗμ胱川用航航ｕＭＡＡＡＡＡ　９ ３５ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　７ ＡＣｅｔｉＣａｃｉｄ　（／ＪＣｌ／ｍ＋）ＦＩＧ、１１ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，リ　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：６６） （７２）発明者　シュネル、イベツテ スイス国、ツェーハー−４２４４口シエンツ、オペルドルフシュトラーセ　１０ （７２）発明者　ミシュラー、マルツェルスイス国、ツェーハー−４２０４ヒン メルリート、パルデック　９５ Ｉ （７２）発明者　ダルベーゲ、ヘンリクデンマーク国、デーコー−２８３０ビル ム。 バルクバイ　２８ （７２）発明者　ヘルトーハンセン、ハンス　ペテルデンマーク国、デーコー− ２８３０ビルム。 パンゲレデト　５３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アスペルギルスアキュレアタスＣＢＳ１０１．４３由来の精製ラムノガラク ツロナンアセチルエステラーゼに対して発生せしめた抗体に免疫学的に反応性で あるラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ。 ２．下記の部分アミノ酸配列 【配列があります】 又はそれに対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好まし くは少なくとも９０％の相同性を有する部分アミノ酸配列を有する請求項１記載 のＲＧＡＥ。 ３．前記ＲＧＡＥが４．０〜７．０、好ましくは４．５〜６．０の最適ｐＨ、３ ．７〜４．７、好ましくは４．０〜４．５の等電点、３０，０００〜５０，００ ０の分子量、及び１０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の最適温度を示す、請 求項１〜２記載のＲＧＡＥ。 ４．請求項１〜３に記載のＲＧＡＥをエンコードすることを特徴とする組換ＤＮ Ａ配列。 ５．ａ）アスベルギルスアキュレアタスＲＧＡＥＤＮＡインサート、ｂ）ａ）の ＤＮＡインサートを含んで成る成熟ＲＧＡＥＤＮＡについてのコード領域とハイ プリダイズし、且つＲＧＡＥ活性を有するポリペプチドについての構造遺伝子、 並びに任意的にプロモーター、シグナルもしくはリーダーペプチドについてのコ ード領域及び／又は転写ターミネーターを含んで成るＤＨＡ配列、ｃ）ａ）又は ｂ）において定義するＤＮＡ配列の誘導体、あるいは、ｅ）成熟ＲＧＡＥ又はそ のシグナルペプチドもしくはリーダ−配列についてコードし、且つａ）又はｂ） のＤＮＡ配列に関する遺伝コードの意義の範囲内において縮重するＤＮＡ配列、 より選ばれるＤＨＡ配列を含んで成る、請求項４記載の組換ＤＮＡ配列。 ６．下記の部分ＤＨＡ配列を含んで成る請求項４又は５記載の組換ＤＮＡ配列 ａ）【配列があります】 ｂ）【配列があります】 ｃ）【配列があります】 ｄ）【配列があります】 ｅ）【配列があります】 ｆ）【配列があります】 ７下記のＤＮＡ配列を含んで成る、請求項６記載の組換ＤＮＡ配列ａ）【配列が あります】 ｂ）【配列があります】 ８．【配列があります】 又はＲＧＡＥをエンコードするそれに相同性な配列を含んで成る、請求項４〜７ に記載の組換ＤＮＡ配列。 ９．請求項４〜８記載の組換ＤＮＡ配列を含んで成るベクター。 １０．前記プロモーターがアスペルギルスオリガタカアミラーゼプロモーターで ある、請求項９に記載のベクター。 １１．請求項９又は１０記載のベクターを含む形質転換宿主。 １２．前記形質転換宿主がアスペルギルス株である、請求項１１記載の形質転換 宿主。 １３．前記形質転換宿主が、種アスペルギルスアキュレアタス、アスペルギルス ニガー、アスペルギルスオリガ又はアスペルギルスアワモリに属する株である、 請求項１１記載の形質転換宿主。 １４．前記形質転換宿主が、その非形質転換状態ではＲＧＡＥを産生しないか、 又は有意義でない量でしかＲＧＡＥを産生せず、好ましくはバチルス種、Ｅ．コ リ又はＳ．セレビジアである微生物である、請求項１３記載の形質転換宿主。 １５．請求項１１〜１４に記載の形質転換宿主の利用によるＲＧＡＥの製造方法 。 １６．請求項１５記載の方法により製造したＲＧＡＥ。 １７．請求項１〜３に記載のＲＧＡＥに富む、植物細胞壁の分解又は改変にとっ て有用なペクチナーゼ調製品を含むことを特徴とする酵素調製品。 １８．前記ペクチナーゼ調製品が、アスペルギルス属に属する微生物、好ましく はアスペルギルスニガー、アスペルギルスアキュレアタス、アスペルギルスアワ モリ又はアスペルギルスオリガにより産生されることのできる請求項１７記載の 酵素調製品。 １９．前記ＲＧＡＥが請求項１６記載のＲＧＡＥである、請求項１７又は１８記 載の酵素調製品。 ２０．アセチル化ＭＨＲの分解又は改変のための製剤としての、請求項１〜３又 は１６記載のＲＧＡＥの利用。 ２１．植物細胞壁の分解又は改変のための製剤としての請求項２０記載の利用。 ２２．ＲＧＥＡを脱アセチル化又は部分脱アセチル化ＭＨＲに特異的な酵素を一 緒に用いる、請求項２０〜２１記載の利用。 ２３．アセチル化ＭＨＲの分解又は改変のための製剤としての請求項１７〜１９ 記載の酵素調製品の利用。 ２４．植物細胞壁の分解又は改変のための製剤としての、請求項２３記載の利用 。 ２５．前記酵素調製品を、脱アシル化又は部分脱アシル化ＭＨＲに特異的な酵素 と一緒に用いる、請求項２３〜２４記載の利用。