JPS602185A - アミラーゼ酵素およびその製法 - Google Patents

アミラーゼ酵素およびその製法

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JPS602185A
JPS602185A JP59056379A JP5637984A JPS602185A JP S602185 A JPS602185 A JP S602185A JP 59056379 A JP59056379 A JP 59056379A JP 5637984 A JP5637984 A JP 5637984A JP S602185 A JPS602185 A JP S602185A
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    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なマルトース産生アミラーゼおよびその
製造方法に関する。
発明の背景 β−アミラーゼは、マルトース産生エキソ−アミラーゼ
でアシ、アミロース、アミロ被りチン又はグリコーゲン
の非還元性末端からα−１，４−グルコシド結合を加水
分解し、マルトースのβ形ヲ与える。マルトースのβ形
は、水溶液でα−形およびβ−形の混合物に自然的に異
性化するであろう。
β−アミラーゼは、製糖産業、製・母ン産業、および醸
造産業において用いるマルトース含有シロップを得るた
めに用いられる０ β−アミラーゼは、種々の植物および微生物から単離さ
れてきている（　Ｗ、Ｍ、ＦｏｇａｒｔｙおよびＣ８Ｔ
、Ｋｅｌｌｙ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ）’　、　１５巻、１
１２−１１５頁、　１９７３年）。植物（大麦、甘しよ
および大豆）および・々ｍｙｃａｌｄｏｓ　）、Ｂ、メ
ガテリウム（Ｂ　、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、−アミラ
ーゼは、サルフィディリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）試
薬、例えば活性部位がＳＨ基を含むことが示されるより
なＰＣＭＢ　（，４ラクロロ安息香酸水銀）によって活
性が阻害される全酵素である。
これまでＰＣＭＨによって阻害されないとして説明され
てきた唯一のβ−アミラーゼは、バシラスサーキュラン
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　）である
（米国特許４，００１，１３６）。Ｂ、サーキュランス
（Ｂ、ｃｉｒｃｕｌａｎｓ　）β−アミラーゼは、上述
のβ−アミラーゼよシもよシ熱的に安定である。しかし
、６５℃およびそれ以上で急速に失活する。
水性媒体中デンプンをβ−アミラーゼにょシ加水分解さ
れる、マルトースの製造方法ニおいて、レトログラデー
’／　、　７　（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ　）を
阻害しかつ微生物感染を避けるため約６５〜７０℃のプ
ロセス温度を用いることが好都合である。
従って、上述のバシラス　サーキュランスその急速な失
活の故に約６５〜７０℃での商業的用途に対しては十分
適合したものではない。
米国特許３，８０４，７１５においては、熱抵抗性β−
アミラーゼが開示されており、これは英国特許１．１３
０，３９８において記載されている如く小麦のもみがら
から抽出される。しかるに、β−アミラーゼは、商業的
プロセスにおいて細菌源由来の酵素と比較して興味が少
ない。と言うのは、後者は植物源のβ−アミラーゼのコ
ストと比較して相当に低コストで大規模で製造できるか
らである。
かくして、デンプンの加水分解を経済的方法で可能なら
しめるために長期間６５〜７０℃で用いることのできる
十分に熱安定性である、微生物のマルトース産生アミラ
ーゼの有効は製法が要求される。
本発明の目的は、ＰＣＭＨの如きスルフィディリル試剤
によって失活されるものとは異なシ新規な微生物マルト
ース産生アミラーゼを提供することにアシ、このアミラ
ーゼは公知の微生物のβ−アミラーゼよシもよシ高い温
度安定性を有する・本発明はかかる性質を有する、新規
な抽出細胞ツヤドース産生酵素（Ｃ５９９アミラーゼ）
が、バシラス　ステアロサーモフィラス　コンプレック
ス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕａｃｏｍｐｌｅｘ）に帰属する、新規に単離され
た微生物から産生されるという知見に基づいている。
本発明のよシ良き理解のため、以下の説明並びに添付図
面に注意されるべきである： 第１図は温度に対するマルトース産生酵素の相対活性を
プロットしたグラフであシ、 第２図は−に対し相対活性をプロットしたグラフであシ
、さらに 第３図は本発明の新規プラスミドｐＤＮ４５２に対する
制限エンドヌクレアーゼ制限地図である。
発明の要約 本発明の第一の面によれば、本発明はマル）　−ス産生
アミラーゼ酵素與品を提供するものであシ、この製品は
以下の特徴を有する新規な熱安定性マルトース産生アミ
ラーゼを含んでなる：ａ）パシラス菌株Ｃ５９９（受託
番号ＮＣＩ　Ｂ１１８３７）を適当な栄養培地中で培養
することによって得られ、 ｂ）バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）菌株Ｃ５９９から
由来したマルトース産生アミラーゼの酵素化学的および
免疫学的性質を示し、 ｃ）ｐＨ５，５で酢酸塩緩衝液（０，１Ｍ）中３０分の
反応時間で測定したその最適活性は約６０℃であシ、 ｄ）約６０℃のＭＣイルパイン（ｌ１ｖａｉｎｅ）緩衝
液中で測定した場合、３０分の反応時間でその最適、Ｉ
−１が４．５〜６の範囲内にあシ１さらにりｐＨ５，５
ノ酢酸塩緩衝液（０，１Ｍ）中７０℃で６０分後で少な
くとも７５ｑ／ｙの残留活性を有する。
マルトース産生アミラーゼ製品は固体又は液体の形態に
ある。固体形態物は１９尚たシ５００〜２５０００Ｕ（
後に定義）の活性夏を一般に有する。
第二の面によれば、本発明は上記マルトース産生の熱安
定性アミラーゼ酵素製品の製造方法を提供するものでア
シ、この方法はパシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株Ｃ５
９９又はそのアミラーゼ産生変異株又は突然変異株を）
、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄
養培地中で培養し、引き続き所望によシマルトース産生
アミラーゼ酵素製品を回収することを含んでなる。
更に、ＤＮＡ組換え技術を用いることによシ、形質転換
した新規熱安定性マルトース産生アミラーゼについてコ
ードする遺伝子を、他の微生物に形質転換するが、該微
生物は適当な培養条件のもとで、供与体微生物（Ｃ５９
９）によって産生されるよシも、実質的によシ多量のマ
ルトース産生アミラーゼを産生ずる◎ 第三の面によれば、本発明は適当な宿主微生物を、マル
トース産生の熱安定性アミラーゼについてコードする遺
伝子を含有する組換え型シラスミドを用いて変質転換し
、次いで炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適
当な栄養培地中で変質転換した微生物を培養し、更に引
き続き所望により該マルトース産生アミラーゼ酵素製品
を回収することによυマルトース産生アミラーゼ酵素の
製造方法を提供する。
別の面によれば、本発明は熱安定性マルトース産生アミ
ラーゼについてコードする遺伝子を含有する組換え型プ
ラスミドの調製方法を提供するものであシ、この方法は
アミラーゼを生産する供与体微生物由来の染色体ＤＮＡ
を、適当彦制限酵素を用いて切断してアミラーゼコード
遺伝子を含有する線状ＤＮＡ−鎖を得、適当なベクター
を適当な制限酵素を用いて切断し第二の線状ＤＮＡ−配
列を得、次いで線状ＤＮＡ−配列を結合しアミラーゼ遺
伝子を含有する組換えプラスミドを得ることを含んでな
る。
好ましくはＥ、コリー（ｃａｌｆ）７°ラスミドを、適
当な制限酵素を用いて切断するが、この酵素は供与体Ｄ
ＮＡの断片の両端に結合軒端は両端を有する線状ＤＮＡ
を与えるであろう。
ＤＮＡ−配列の二種の線状源の結合は、当業者に周知の
技術を用い、リガーゼを使用することにょシ達成される
◎ 本発明の好ましい態様によれば、宿主微生物はハシラス
群、好オしくは、Ｂ、サブチリス（ｇｕｂｔｌｌ　ｉｓ
　）　カＣ：ｒ選ハｈル。
宿主微生物の形質転換は又、組換えプラスミドをＥ、コ
リー（ｃｏｌｔ　）細胞に形質転換し、デンプン崩壊形
質転換体を同定し次いでそのようなＡｍｙ　形質転換体
由来の組換えプラスミドを選択された宿主微生物にサブ
クローニングすることを含む周知方法によっても達成さ
れる。
宿主微生物（好ましくはアミラーゼ活性を示さない）は
、適当な培地で培養した場合、該組換えグラスミドを獲
得すると、新規なマルトース産生アミラーゼを産生ずる
。アミラーゼは増殖培地に分泌し、かくして簡単な酵素
回収工程を得る。
本発明は又、前記アミラーゼについてコードする遺伝子
を含有する、新規な組換えグラスミド、ｐＤＮ４５２を
提供するものであシ、このプラスミドは、ハシラス（Ｂ
ａ６１１１ｕｓ　）　Ｃ５９９由来の染色体ＤＮＡを制
限酵素Ｍｂ　ｏ　１−を用いて切断し、４〜１２ｋｂ（
キロベース対）範囲のＤＮＡ−配列°′を単離し、Ｅ、
コリー（ｃｏｌｉ）７’ラスミドｐＡＣＹＣ１８４（す
でに制限酵素ＢａｍＨＬで切断されている）と結合させ
、Ｅ、コリー（シ±（）細胞に形質転換し、７　ミラー
−１４”遺伝子を含有するプラスミドを担持する１澱粉
崩壊形質転換体を同定し、該プラスミドを制限酵素Ｓ　
ａ　ｕ　３Ａｔを用Ｃて切断し、すでに制限酵素Ｂａｍ
ＨＬを用いて切断されたプラスミドｐＢＤ６４とアミラ
ーゼ活性を表わすＤＮＡ断片とを結合させ次いで新規な
組換えシラスミドをＢ、サブチリス（５ｕｂｔｉｌｉａ
　）に形質転換することにょシ調製される。
第３図は九本発明の新規プラスミドｐＤＮ４５２に対す
る制限エンド−ヌクレアーゼ制限地図を示す。新規シラ
スミドは７．６ｋｂ雑種シラスミドであシ、これはｐＢ
Ｄ６４のヌクレオシド配列を含んでなシ更に該プラスミ
ドのＢ　ａｍＨ１部位で、前記アミラーゼについてコー
ドするハシラス（Ｂａｅｉｌｌｕａ　）Ｃ５９９由来の
ＤＮＡ配列が挿入されている。
別の面から、本発明は高純度マルトースシロップの製造
方法を提供するものであシ、この方法においてはデンプ
ンを、水性媒体中新規マルトース産生アミラーゼ酵素製
品で処理する。ノ試験結果よシ、新規マルトース産生ア
ミラーゼ酵素製品は、マルトースおよびハイマルトース
シロップの製造に適していることが判明した・このよう
な製品は、低吸湿性、低粘度、良好な熱安定性およびま
ろやかで、マルトースの甘すぎない味覚の故に、幾つか
の製・果工場による製品として特に興味がある。
マルトースシロップを製造する工業的方法は、デンプン
を液化し、次いでマルトース産生酵素、並びに所望によ
シアミロペクチンの１，６−分岐点を分解する酵素、例
えばα−１，６−アミログルコシダーゼを用いて糖化す
ることを含んでなる。
本発明の新規酵素は〜公知のβ−アミラーゼを同様に多
くの点において同様に反応するけれども、以下の詳細な
説明からも明らかなように幾つかの本質的な点において
異っている。従って、新規酵素はβ−アミラーゼよシも
むしろマルトース産生アミラーゼとして特徴づけられる
。
新規酵素は、５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ダル電気泳
動において、約７０，０００ダルトンの分子量を示す単
一バンドとして移動する。薄層ダルエレクトロフォカス
シングによりて決定した等電点は８．５である。
Ｃ５９９アミラーゼは、アミロペクチン、グリコーゲン
およびアミロース、反応生成物の実質的部分を構成する
マルトースを加水分解する。グルコースは、形成したマ
ルトースト１０ｇ６に対応して小量産生される。
分枝多糖類、例えばアミロペクチンおよびグリコ−ダン
から０５９９アミラーゼはりミツトデキストリンを形成
し、これはグリコアミラーゼによシ加水分解できる。
スルヒドリル試剤、例えばｐ　−７００安息香酸水銀並
びにキレート化剤、例えばＥＤＴＡは酵素活性に何ら影
響を与えない。
Ｃ５９９マルトース産生アミラーゼは次の点において公
知のβ−アミラーゼと異なる：１、　シュレーディンガ
ーシクロデキストリンを定量的に加水分解する０シュレ
ーディンガーβ−シクロデキストリンは３：１０モル比
でマルトースおよびグルコースに加水分解され、一方、
α−シクロデキストリンは１０：１のモル比でマルトー
スおよびグルコースに加水分解される。マルトース産生
アミラーゼでインキュベートしたα−シクロデキストリ
ンの’　ＨＮＭＦスペクトル分析は、第一の主要生成物
としてα−マルトースの初期形成を示す。
２、マルトトリオースハ、等モル量のマル）　−スおよ
びグルコースに定量的に分解する。マルトース産生アミ
ラーゼでインキニーベートシタマルトトリオースの１Ｈ
ＮＭＲスペクトル分析は、加水分解生成物がα−マルト
ースおよびグルコ−ステすることを示す。
３、７０℃の緩衝液中で安定であシ１更に１４．０５９
９マルトース産生アミラーゼのリミ、ドア”４〜ストリ
ンはｌ２−ＫＩ−試剤との着色複合体を与えない。
従って為本発明に係るマルトース産生アミラーゼは、α
−１，４−グルコシド結合を攻撃する外酵素でアシ、主
加水分解生成物はα−マルトースであるヶ 公知（Ｄ　マルトースシロップ中に存在するマルトトリ
オースを、マルトースおよびグルコースに定量的に分解
しこれによりマルトース収率を増加する、本発明のマル
トース産生アミラーゼの能力は注目すべきでおる。と言
うのは、最近、マルトース８０チ以上を含有する）−イ
マルトースシロッゾに興味が高まっているからである。
本発明の詳細 な説明にかかるマルトース産生アミラーゼを産生じ得る
微生物は、以下の如く調製した寒天基質上で増殖するそ
の能力によって選択した。
トリジトン（１０，Ｆ）、アミロペクチン（ＣＰＣ雪片
１（１）、パクト（ＢａＣｔｏ　）寒天（４ＯＮ）およ
び脱イオン水（ｘｏｏｏｍＪ）を以下の組成を有する、
当量の塩の溶液と共に無菌的に５５℃で混合した： （ＮＨ４）２Ｓｏ４：　０．０４重量係Ｍｇ５Ｏ４ｊ７
Ｈ２０：　０．１　１ ＣａＣｌ２：　０−０４重量％ ＫＨ２Ｐｏ４：０．６　。
塩の溶液の−を、１ＯＮ硫酸で３．　ＯＫ調整した〇ク
ルスビク（Ｋｒ１ａｕｖ１１ｃ）　（アイスランドの温
泉地）で採取した土壌サンプルを上記寒天基質上に散布
し次いで６５℃で培養した。
４８時間後１寒天表面をヨウ素蒸気で発色させ次いで未
発色アミロペクチンの帯域によって囲まれたコロニー、
Ｃ５９９を単離した。下方に寒天を有するＣ５９９の単
離したコロニーを、ｐＨ４，５のデンプンと共に６０℃
および７０℃で一夜インキュベートした。薄層クロマト
グラフイン試験線、加水分解主産物としてマルトースを
示した。
単離した微生物Ｃ５９９をナショナル　コレツクジョン
　オブ　インダステリアル　バクテリア（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ
ａｌＢａａｔｅｒｌｇ　）　（トリーリサーチ・ステジ
ョン、アバディーン、スコツトランド）に１９８３年３
月１５日に）受託番号ＮＣ１１８３７をもって寄託し九
〇 分類 近時において見出された本発明に係る微生物は、好気性
で、杆状でかつ有芽細菌である。従って、該微生物はバ
シラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属に属する。
胞子形成が乏しい寒天基質上では、培養株が急速に自己
融解し次いで死滅する。従って、パシラス（、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　）種の分類に対し通常用いられている分類学
上のプログラムを行うことは不可能であった。
しかし、形態並では５０℃〜７０℃の範囲にある増殖に
対する温度は、新規微生物がパシラス・ステアロサーモ
フィラス・コンプレックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｃｏｍｐｌｅｘ）に
帰属することを示している。
形態 胞子は卵形で、約ＩＸ１．６μであシ更に末端又は末端
の近くに位置している。
胞子嚢は強く膨潤しておルラッヶット又は太鼓のばち様
である。　以下余白 酵素活性の決定 １　マルトース産生アミラーゼ単位（Ｕ）は、標準条件
（温度６０℃、ｐＨ５，５および反応温度３０分）下で
毎分１〃モルのマルトースに相当する還元糖を形感する
酵素の量と定義する。
０．１Ｍ酢酸塩緩衝液又は０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ５）中の０．５％可溶性デンプン（メルク（Ｍｅｒｃ
ｋ片ヱによって供給される）を、１ｍＪ当たシ０．１〜
０．２Ｕを含有する脱イオン水に溶解した酵素ＩＮでイ
ンキュベートする。０．０５　Ｎ　ＮａＯＨを４ｄ添加
するこ凄択よシ３０分後に反応を停止する。
次いで、還元糖の含量をソモギイ−（８ｏｍｏｇｙｉ）
法によシ測定する（　Ｓｏｍｏｇｙｉ　：　Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ　、Ｃｈｅｍ、　。
１９３、ｐ２６５（１９５１）。
酵素活性を測定する別の方法は、マルトトリオースヲ当
モル量のマルトースおよヒクルコ−スに定量的に分解で
きる能力に基づく◎ ＩＬマルトース産生アミラーゼＮ０ＶＯ単位（ＭＡＮＵ
）は１標準条件下で毎分１μモルのマルトトリオースを
分解する酵素の量として定義する。
−を約１１にシフトさせることによシ酵素反応を停止す
る。得られたグルコースは、脱水素酵素（メルク扛、Ｇ
ｌｕｃＤＨ）により、ＮＡＤＨの形成のもとグルコノラ
クトンに変換される。形成したＮＡＤＨの量を゛、３４
０　ｎｍでの比色定量により測定した。
標準条件：温度３７℃±０．０５℃ ｐＨ５，０ インキューペーション時間３０分 試薬： １、　０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５，０）５．２
５５．９のクエン酸（Ｃ６Ｈ８０７）Ｈ２０）を、約２
００属の脱イオン水に溶解し次いで４．　Ｏ／　１．　
ＯＮ　ＮａＯＨを用いｐ）Ｉを５．０に調整する。脱イ
オン水を添加し２５０ｔＩＬｌとし次いで−をコントロ
ールする＠緩衝液を冷蔵庫内で１週間保存する（ｐＨは
使用前に検査する必要がある）。しかし好ましくは試験
日毎に調製する〇 ５００（１０００）■のマルトトリオース（シダーｒ　
（Ｓｉｇｍａ　Ｍ　８３７８）に、クエン酸塩緩衝液（
試薬１）を２５（５０）７ｄまで添加する。試験日毎に
調製する。
３、ＧｌｕｃＤＨ試薬 酵素混合物（メルク（ｍｅｒｃｋ　）Ａｌ　４０５５フ
ラスコ「１」および「２」）、を緩衝液メルク屋１４０
５１を用いて満たす。１５分放置後、フラスコ内容物を
約２０９ｍｊ！緩衝液（メルク４１４０５１）を有する
５００ｒＩＬｌ測定フラスコに移し更に別の緩衝液を添
加して５００−とする。冷蔵庫内で１４日間安定である
。
４、停止剤 ０、０．６　Ｎ　ＮａＯＨ グルコース標準的′ａ： １．６ｇのグルコースを１０００−の脱イオン水に溶解
し次いで１．０　、２．０　、４．０　、６．０および
１０．０−量を、脱イオン水で希釈してｉ　ｏ　Ｏｍｌ
にする。得られた５種の標準液は、各々８８．８゜ｉ７
７．６．３５５．２．５３２．９および８８８．１μモ
ル／ｌのグルコース濃度を有する。
上記グルコース標準液２．ＯｄをＧｌｕｃＤＨ試薬３、
Ｏｄと混合し次いで室温で３０分インキュベートシ、シ
かる後０Ｄ３４０を測定することによりグルコース標準
曲線を作成する。ブランクとして、グルコースの代わシ
に脱イオン水を含むサンプルを用いる。
酵素試験サンプル： 最終希釈度が標準曲線によシカバーされる範囲内にある
ように試験サンプルを脱イオン水で希釈する。
分析： ５００μｔのマルトトリオース基質（３７℃に予熱）を
、５００μを酵素（３７℃に予熱）に添加し注意深く混
合後混合物を水浴（３７℃）にとシつけた０３０分反応
後、試験管を水浴からとシ出し、１０００μｔの停止剤
を添加した・次いで、３．ＯｄのＧｌｕｅＤＨ試薬を添
加し室温で３０分放置後０Ｄ３４ｏを測定した＠ ブランクとして、酵素含有サンプル、停止剤おょびマル
トトリオース基質を用いた。停止剤添加直後に、マルト
トリオース基質を添加した。
酵素の製造 本発明のマルトース産生アミラーゼを産生しうル／（チ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、）株を通常、適当な発酵培地
中で好気性条件下で培養する前に固体基質上で増殖させ
る。両方の培地は、酵母エキスのような生長促進栄養素
と一緒に、同化しうる炭素源及び窒素源並びに所望によ
シ無機塩を含む。発酵を、５０〜５５℃の範囲で、６，
５の−で実施するのが典型的で６Ｄ、自動装置によシは
ぼ一定に保持するのが好ましい０酵素は培地中に分泌さ
れる。
生じる、発酵液から細菌細胞、崩壊物を他の固形分と一
緒に例えば遠心分離によシ除去することができる・酵素
を含む上澄液を更に例えば濾過または遠心分離によシ清
澄にし、次に必要に応じ例えば限外濾過によるか、また
は減圧下に蒸発器中で濃縮し・得られた濃縮液を必要に
応じて、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥す
ることができる。生ずる粗製酵素製品は、約５００〜２
５．０００　Ｅ／１１の範囲の活性を示すのが代表的で
ある。
酵素の精製 本発明のマルトース産生アミラーゼハ、ノクツチの発酵
培養ブロスから次の如くして精製できる：４Ｅ／／ｗＬ
ｌの酵素活性を有する培養ブロス２５０Ｌを濾過し次い
でν液を遠心分離し、無菌濾過し次いで凍結乾燥する。
もとの活性の４７係に相当する、１．ｇ当だｆｉ２４０
０ｇの活性を有する凍結乾燥粉末１９３Ｉを得る。
粉末を１５ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解し
次いで電導率が約１ｍＳになるまで１５ｍＭの酢酸塩緩
衝液（ｐＨ５，０）に対し透析する。次いで・同緩衝液
ですでに平衡化した陽イオン交換体ＣＭ　−セファロー
スＣ１−６Ｂに、透析物を適用した。アミラーゼをカラ
ム内に通過せしめ、一方残存タンノククの６０ｑ６をイ
オン交換体によシ吸着されたＯこのカラムからの溶出液
の−を酢酸でｐＨ４，０に調整し次いで引き続き溶出液
を％１５ｍＭ酢酸塩緩衝液（Ｆｌ（４，０）で平衡化し
たＣＭ−セファロースＣ１−５Ｂに適用した。これらの
条件のもとで、アミラーゼはイオン交換体にょ９吸着さ
れる。次いで、イオン強度を増加した、ｐＨ４，０の酢
酸塩緩衝液で酵素を溶離する。溶出液中の酵素活性は対
称ピーク中のタン・ぐり含量に従う。ピーク部分は、５
Ｄｓ−，１９リアクリルアミドダル電気泳動による単一
な鋭いタンノ４クパンドを有す。席は約７０，０００ダ
ルトンである。イソーエレクトロフォヵッシングによシ
測定したｐＩは８．５である。結晶化し、再溶解し更に
凍結乾燥した製品について比活性はタン・千り１ｒｎｇ
当たｆｉ　３２５　ＭＡＮＵテ＄ル。
免疫学的性質 アクセルセｙ　（Ｎ　、　Ｈ、Ａｘｅｌｓｅｎ　）らに
よシア。
マニュアル・オブ・クオンティタティブ・イムノエレク
トロフォレシス（Ａ　Ｍａｎｏａｌ　ｏｆＱｕａｎｔｉ
ｔａｔｉｖｅ　Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ　）（オス１：ｌ、１９７３）２３章に記載され
た方法によシ・精製マルトース産生アミラーゼでうさぎ
を免疫にすることによって単因子抗血清を生じさせた。
この血清に対しての粗Ｃ５９９アミラーゼに−１）いて
の、前記著者による交差イミムエレク）０７オレシスに
より、抗血清の単一特異性を確認する免疫沈降体の単一
ピークを得た。
酵素化学的性質 本発明のマルトース産生アミラーゼの活性の温度および
［■に対する依存性を、ＰＩＩ及び温度を所定の数値に
調節した反応混合物を使用して、前記の方法によって測
定した。
添付図面を参照されたい。
第１図は、温度に対しプロットした相対活性を示すグラ
フであシ（基質４チ可溶性デンプン、ＰＩＩ５．５（０
，１Ｍ酢酸塩）、反応時間３０分）更に第２図はＸＰｌ
［に対しプロットした相対活性を示す（温度６０℃、基
質２俤可溶性デンゾン、反応時間３０分、Ｍｃイリバイ
ン（ＩＩ　１ｖａｉｎｅ　）　９１４液）。
添付図面から以下の内容が明らかである。すなわち、Ｃ
５９９マルトース産生アミラーゼは約６０℃のＰＨ５，
５で最適活性を有し更にその最適ＰＨは４．５〜６．０
の範囲内にある。最適活性の５０係以上が８０℃でも未
だ見出されている。
マルトース産生酵素の熱安定性を測定するため・酵素製
剤（１５００Ｅ／、！ｉ＋）を、それぞれ５０℃、６０
℃オヨび７０℃ｏｉ度”ｔ’ＰＩ（５，５（Ｄ　０．　
Ｉ　Ｍ酢酸塩緩衝液（１５ｏｍｇｙｍｌ）と混合した。
残留アミラーゼ活性を上記方法で測定した。次表に結果
を示す： 第１表 ０　１００ １５　１００ ０ ３０　’　１００ ０　１００ １５　１００ ０ ３０　１００ ０　１’００ ７０℃で６０分後、酵素活性の７５係が保持される。公
知のβ−アミラーゼは、このような良好な熱安定性を示
さない。
本発明のマルトース産生アミラーゼの活性に対する、多
種の試薬の影響を次の第２表に示す。
第２表 ＰＣＭＢ、１ｍＭ　９２ ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　１０４ シユレゾインがｍ−α− シュレディンガーーβ− ０７ シクロデキストリン、１係 ＣａＣｔ２１　ｍＭ　８５ １０　ｍＭ　７３ ＫＣＬ　１　ｍＭ　９５ １０　ｍＭ　９４ ＭｇＣ１２１ｍＭ　９５ １０　ｍＭ　９３ ＣｏＣ１２１ｍＭ　９１ １０ｍＭ　４４ ＦｅＣＬｓ　１　ｎ１Ｍ９６ １０　ｍＭ　７４ Ｍｎｅｔ２１ｍＭ　７８ １０　ｍＭ　５２ ＮａＣ１１ｍＭ　９８ １０　ｍＭ　９６ ＣｕＣ１２１ｒｎＭ、　１０ １０　ｍＭ　Ｉ ＺｎＣｔｚ　１　ｒｎＭＬ　５１ １０　ｍＭ　１５ ＢａＣｔｚ　１　ｍＭ、　９８ １０　ｍＭ　９２ ＡｔＣ１−ｓ　１　ｒｎｈｌ　９８ １０　ｍＭ　Ｂ　４ Ｈｇｅｔ２０．１　ｍＭ　３ １ｍＭ　０ Ｈｇ　＋４およびＣａ”＋の如き重金属イオンは、Ｃ５
９９アミラーゼ活性を阻害し、一方、ＰＣＭＢ　、　Ｅ
ＤＴＡ又はシュレディンガーーシクロデキストリンは活
性に何ら影響を与えない。
以下に詳しく述べるように、マルトース産生アミラーゼ
遺伝子は次の方法によりクローン化でき更にＢ、サブチ
リス（ｓｕｂｔｉｌｉｇ　）内で発現できる： Ｃ５９９由来の染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｍｂ　ｏ　Ｉ
（Ｂｉｏｌａｂｓ　ｃａｔ、Ａ１４７　）を用いて部分
分解する。４〜１２ｋｂの範囲内の断片を単離し次いで
、すでに制限酵素ＢａｍＨＩ　（Ｂｉｏｌａｂａ　ｃ、
ａｔ、Ａ１３６）で切断された、Ｅ、コリー（ｃｏｌｉ
）プラスミドＰＡＣＹＬ　１８４　（チャーン（Ｃｈａ
ｎ　）等、Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、　１３４　：　１１４１〜５６
．１９７８）と結合させる（　ＤＡＮリガーゼ（’Ｂｉ
ｏｌａｂｓ　Ｃａｔ、Ａ２０２）を用いる）。
グラスミドｐＡＣＹＣ１８４はテトラサイクリンおょび
クロラムフェニコールの双方に対し耐性を付与し更に制
限酵素１３ａｍＨＩに対し１個の制限部位を有する。Ｄ
ＮＡをＢａｍＨＩ部位に挿入すると、テトラサイクリン
に対する耐性を付与する能力が破壊されるが、クロラム
フェニコールに対しては破壊されない。
結合混合物を、コンピテントＥ、コリー（ｃｏｌｉ）細
胞内に形質転換する。形質転換した細胞を、可溶性デン
プンおよびクロラムフェニコールを含有する適当な選択
培地上にプレートする。ＢａｍＭＩ部位内でクローン化
した断片を担持する、クロラムフェニコール抵抗性形質
転換体はテトラサイクリン感受性あシとして同定される
。これらの内、アミラーゼ活性を示す形質変換体は、寒
天を含有するデンプンをヨウ素の蒸気にさらした場合コ
ロニーの周囲に現われる青いハローによって同定される
。このような形質変換体は、新規のマルトース産生アミ
ラーゼについてコードする遺伝子を含む、第一０組換え
プラスミドを担持する。
ングするため、シラスミドｐＢＤ６４（＝タフィロコッ
カスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｇ　ａｕ
ｒｅｕｓ）シラスミドｐＵＢ１１０　（Ｇｒｙｃｚａｎ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。
Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、１４１　：２４６−５３．１９８
０）の誘導体である）が用いられる。ｐＢＤ６４は、Ｂ
、サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｇ　）内で複製すること
ができ更にカナマイシンおよびクロラムフェニコールに
対し耐性を付与する。
ｐＢＤ６４は、Ｂ　ａｍＨＩで分解され次いで５ａｕ３
ＡＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｃａｔ、Ａ１６９　）で一部分
解した先の調製の第一組換えプラスミドと結合させる。
このサブクローニングは、プラスミドｐＵＢＩ　１０　
（Ｂ−サブチリス（ｇｕｂｔｉｌｉｓ　）に形質転換で
きるスタフィロコッカス　アウレウス（５ｔａｐｈｙｌ
ｏｅｏｃｃｕａａｕｒｅｕａ　）由来のシラスミドであ
る）を担持するアミラーゼーネガテブＢ、サブチリス（
ａｕｂｔｉｌｉｓ）株を用い、いわゆるレスキュ手法（
Ｇｒｙｅｚａｎ　ｅｔａｌ、　、Ｍｏ１．、Ｇｅｎ、　
Ｇｅｎｅｔ、１７７　：　４５９〜６７．１９８０）に
よシ好ましく行う◎ 持するｐＵＢｌｌｏの形質転換細胞を、可溶性デンプン
およびクロラムフェニコールを含有する適当な選択培地
上にプレートする。第二の組換えグラスミドを担持する
Ａｍｙ＋形質転換体を上述の如く同定し更にこの形質転
換体由来のシラスミドを単離し次いでｐＵＢ　ｌ　１０
を担持しないアミラーゼーネガテブパシラスサブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｇ　）に形質転換す
る。次いで、これらの形質転換細胞を適当な選択培地に
プレートし更に上記第二の組換えシラスミドを担持する
Ａｍｙ＋形質変換体を同定する。
以下に本発明の実施例を非制限的に説明する。
ｊリュ Ｃ５９９培養株を次の寒天上で１〜２日間６０℃で増殖
した。
パクトテキストロース　２９ パクト寒天　２５．９ 以下余白 水　１０ＱＱｍｌ 接種材料 上記の増殖培地由来の凍結乾燥した培養株を、５００ｍ
Ａ！＋７）バッフル付振とりフラスコ内中次ノ基質１０
０Ｖ！内で増殖させた： バクト　トリプトン　１０ｇ グルコース　ｌｏｇ 燐酸水素カリウム　３Ｉｉ 水　ｔｏｏｏｍＪ 培養は１〜２日間５０〜５５℃で行りた。
ａ）回分発酵 ５００−の振とりフラスコに、次の組成を有する基質１
０００１ｒＬｌを装入した： ＮＺ−ケース（シェフイールド）　１０ｇ酵母エキス（
バクト）５Ｉ リン酸水素カリウム　３Ｉ マルトデキストリン　１０９ 水　１０１００Ｏ 上記接種材料１〜５ｒｒＬｌを、振とりフラスコに接種
した。培養は５０℃で２日間行った。
得られた発酵ブロスは１罰当たり約１０〜２０Ｕを有し
ていた。
振トウフラスコから５５０ｔのスチール製ファーメンタ
−までのスケールアップは、培地の量を各工程において
３゛〜５倍増加させないことによシ段階的に行うことが
できる。
５５０ｔのスケールでは、収率は１−当たシ約５Ｕであ
った口 ｂ）連続発酵 以下の組成を有するＴＭＰおよびＳＭＰ基質を用いて連
続発酵を行った： ＴＭＰ−基質：　トリプトン（Ｂａｃｔｏ）　３０１１
マルトデキストリン（ＭＣＯ３Ｌ）　２０　＃燐酸水素
カリウム　３ｇ プルロニック　０．５．９ 水　１０００ＷＬｌ 以下余白 ＳＭＰ−基質：　ソイトーン（ディフコ）　２０９マル
トデキストリン　１０９ 燐酸水素カリウム　３９ グルロニツク　０．５．ｌｉ’ 水　１０００プ 発酵は、ＩＬの実容量を有するエスシェパイラ−（Ｅｇ
ｃｈｗａｉｌｅｒ　）ファーメンタ−（タイプ５１０）
を用いて行なった、。
発酵は上記接糧材料１００Ｍを用いて開始し、更に基質
の補充は２４時間後５５℃で開始した。
３チ硫酸で−を６．３に調節し、温度を５５℃に保った
。
通気　：１ｔ／基質１１７分 攪拌　：１１０００ｐｐ 希釈率：　Ｄ＝０．０５　ｈｒ 上記条件のもとで、活性収率はＴＭＰに対し１４当だ多
５０〜７５ＵであシＳＭＰに対し１プ当たシ４０〜５０
Ｕであった。
Ａ（ Ｂ、サブチリス０５９９由来のマルトース産生アミラー
ゼ遺　子のクローニング 全てのパシラス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｌｊ　）株は、Ｂ、サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）１６８　（５ｐｉｚｌｚｅｎ　、　Ｐｒｏｅ　Ｎａ
ｔｌ　、　Ａｃａ’ｄ、　Ｓｃｉ。
４４：１０７２−７８．１９５８）の誘導体であった。
ＤＮ３０４　：　ａｒｏ　Ｉ　９０６　ｇａｅＡ　３２
１　ａｍｙはＱＢ　１１３３　（Ｓｔｅｌｎｍｅｔｚ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ　１４８：２８１−８５．１９７６）のＭｅ
　ｔ＋形質変換体であシ更に１９８４年３月７日にナシ
ョナル−コレクション　オフ　インダストリアル　バク
テリー（Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔ１ｏｎ　ｏ
ｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂ＆（ｊｊｅｒｌａｓ　）リ
ーリサーチステーＤＮ　３０４　ｐＵＢ　１１０であシ
更にＤＮ３１１はＤＮ３０４　ｐＢＤ　６４である。プ
ラスミドｐＵＢ　１１０およびｐＢＤ　６４　（Ｇｒｙ
ｃｚａｎ　ａｔ　ａｌ　＊　、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ　。
１３４：３１８−３２９　１９７８、およびＧｒｙｃｚ
ａｎａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｓｒｌｏｌ、　１４１
　：　２４６−５３．１９８０）はＢ、サブチリス（５
ｕｂｔｉｌｉｓ）株ＢＤ　３６６およびＢＤ−６２４か
らそれぞれ単離した０ｐＵＢ　１１０およびｐＢＤ６４
は双方とも、カナマイシンに対し耐性を付与し更にｐＢ
Ｄ　６４又はクロラムフェニコールに耐性を付与した。
Ｂ、サブチリス（５ｕｂｔｉｌｉａ　）株１６８、ＱＢ
１１３３．ＢＤ３６６およびＢＤ　６２４は、バシラス
　ジェネティク　ストック　センター、コロンブス、オ
ハイオ、ＵＳＡから得ることができる（それぞれ菌株フ
ァイル番号ＢＧＳＣＩ　ＡＩ、ｌＡ２８９、ＩＦ５およ
びＩＦ２２　）。
全てのニジエリ゛キア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ
　ｃｏｌｌ）株は、Ｅ、コリー（ｃｏｌｌ）Ｋ　１２の
誘導体であった。
μ、コリー（ｃｏｉｌ）Ａ８０２ｍｅｔ　ｒ−ｍ”匹ｌ
ａｃ　（Ｗｏｏｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ’ｏ１．１
６　：１１８−３３１９６６）およびプラスミド１）Ａ
ＣＹｏ　１８４　（チャーン等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、１３４：１１４１−５６．１９７８）を担持する見
−シリｌ　ＭＣ１００Ｏニア１（盟１ｅｕ）７６９７　
ａｒａ　Ｄ　１３９Ｊａｅ　ｘ　７４　ｇａｌ　Ｋｇａ
ｌＵ−１ｓｔｒ　Ａ　（Ｃａｓａｄａｂａｎ　ａｔ　ａ
ｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。
３０　１３８：１７９−２０７．１９８０）は、１９８
４年３月７日に寄託された（ＮＣＩＢ１１９５８および
ＮＣＩ　Ｂ　１１９５６　）。
Ｂ、Ｅ、コリーの形質転換 ＬＢ　（１０，９のバクトトリノトン、５ＩＩのバクト
酵母抽屯物および水１を当たり１０　Ｊ９　ＮａＣｔ、
　ｐＨ７，０）中でＥ、コリー（ｃａｌｌ）Ｋ　−１２
株Ａ３０２の一夜培養物を５ｏｏｒｎｌＬＢ中１００倍
に希釈し次いで０Ｄ４５ｏが０．４になるまで３７℃で
増殖した。
培養物を冷却し、３０００ｒｐｍ（シーパル（５ｏｒｖ
ａｌｌ）　ＧＳ　３　Ｃ１−ターで）で１５分間回転し
た氷上で１５分放置し、２００−の冷０．１ＭＣａ　Ｃ
Ｌ２で再懸濁させ、３０００　ｒｐｍで１０分間回転し
た氷上に２０分間放置し、５罰の冷０．１ＭＣａ　ＣＬ
　２に再懸濁させ次いで氷上で２０分間放置する。次い
で冷グリセロールを１０俤になるまで添加し次いで一部
を液体窒素中で凍結し次いで一７０℃で保存した。凍結
細胞を氷上で融解し、ＤＮＡを添加し、混合物を氷上で
４５分〜３７℃で２分間インキュベートし次いで適当な
選択培地上にシレーｔした・ Ｃ，パシラス　サブチリスの形質転換 コンピテント　パシラス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　）細胞を、ヤシビｙ　（Ｙａｓｂ
ｉｎ　）等（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、　１２１　：
　２９６〜３−０４．１９７５）に従って調製した。次
いで、遠心分離（７０００ｒｐｍ、　３分）によシ細胞
を得、２０チグリセロールを含有する上澄液１０容量中
に再沈殿させ、液体窒素中で凍結乾燥し次いで一７０℃
で保存した。
形質転換に対し、凍結細胞を４２℃で融解し次いで一容
量の緩衝液（（０，４％グルコース、０，０４Ｍ　Ｍｇ
Ｃｌ２および０．００２Ｍ　ＥＧＴＡを含む５ｐｉｚｉ
ｚｅｎの微少培地（５ｐｉｚｉｚａｎ、　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ。
Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　４４　：　１０７２〜
７８．１９５８））と混合した。ＤＮＡを添加し次いで
３７℃で２０分間振とうしながら混合物をインキュベー
トした。
次いで１細胞を適当な選択培地上にプレートした。
プラスミドｐＡＣＹ０１８４を担持するＥ、コリーに−
１２株１１７ＩＣ１０００を、２５０−のＬＢ　、　０
．４係グルコース、２０μｍ７７ｍ１のクロラムフェニ
コール中で一夜増殖した。細胞は、遠心分離によシ得、
次イテ４ｍＪノ緩衝ｆ　１　（’　０．０２５　Ｍ））
　９　スＨＣ１゜ｐＨ＝８．０．０．０１ＭのＥＤＴＡ
、　０．０５　Ｍのグルコース、２４ゲのりゾチーム、
）中で再懸濁した。懸濁液を０℃で１５分間インキュベ
ートし次いで８−の緩衝液２（０，２ＭのＮａＯＨ、１
％　ＳＤＳ　）と混合した。次いで、６威の緩衝液３（
３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ＝４．８）を添加し、混合
物を０℃で６０分間保持し、次いでｊ９０００　ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した（ゾパール８８３４０−ラで約
４５００（［’）。上澄液を０．６容量の冷インプロパ
ツールで沈殿させ、次いで１．２属の５ＴＥ（０，０５
ＭトリスＨＣ４ｓ　ｐＨ＝　８．０．０．００５Ｍ　Ｅ
ＤＴＡ）および２０　ｆｉｔＩ）煮沸ＲＮａａｅＡ（ベ
ーリンガー）（２ｍ９７ｍｌ　）中で再沈殿させた。３
０分後、ＶＴｉ　６５管内の４．０１の緩衝液４　（８
０１ＣａＣｔおよび５６ｄの５ＴＥ）および０．１−の
ＥｔＢｒ　（エチジウムプロミド）の頂部上に加層した
０混合物をＳ４５０００ｒｐｍで２０時間遠心分離した
。次いで、グラスミドを管から取シ出し、透析し次いで
セクシ目ンＧ。
で述べた如く抽出した〇 の調製 以下の修正を行う他は、Ｅ、コ！Ｊ　（ｃｏｉｌ　）株
（セクションＤ参照）について述べた如くプラスミドを
調製した。増殖は、０．ＯＩＭの燐酸カリウム、ｐＨ＝
７．０および６μｉ／ｍｌのクロラムフェニコールを含
むＬＢ中で行った。〜 採取後、細胞を３７℃でリゾチームとインキュベートし
た。緩衝液２は、１容量の緩衝液２および３容量の緩衝
液５（０，２Ｍのグリシン、０．２ＭのＮａｃｔ、およ
び１％のｓｎｓ　）の混合物と取シ換えた。以下の工程
はＤに述べた工程と同じである。
Ｆ、Ｂ、サブチリス由来のグラスミドの小スチール調製 ＬＢ（ρ、ｏ／ｙｒの燐酸塩、−７，０および適当な抗
生物質を含む）中、５１１１１のＢ、サブチリス（ａｕ
ｂｔｉｌｉｇ　）由来のプラスミドを、以下を除く他セ
クションＥと同様に調製した： １：緩衝液の容量を１／４にした。
２：０．５ｍｌのフェノールおよび０．５１ｎｌのクロ
ラムフェニコールを緩衝液３の後に添加する。
３：１９０００ｒｐｍ　で遠心分離後、上澄液をエタノ
ールで沈殿させ、４００μｔの緩衝液（０，０５Ｍのト
リスＨＣ１，ｐＨ＝　８．０．０．１Ｍの酢酸ナトリウ
、ム）中で再沈殿させ、再たびプラスミドを沈殿させ、
４００μｔの緩衝液中で再懸濁させ、洗浄し次いで１μ
ｔΔａの煮沸ＲＮａａｅＡ　（ペーリンガー）を有する
１００μｔのＴＥ中で再懸濁させたＯＧ、パンラスＣ５
９９由来のクロラムフェニコールＤＮＡの調製 約５０ｄの培養物から凍結した細胞のベレットを、１．
１ｄの緩衝液（０，０５ＭのトリスＨＣ１，ｐＨ＝７．
４、’０．１ＭのＮａＣＡ　％　２５　％の蔗糖）中で
再懸濁させた。１００μｔのリゾチーム（２５〃ゲ）お
よび１５０μｔのＥＤＴＡ　（０，５Ｍ、、　ｐＨ＝　
８．０　）を添加した。混合物を３７℃で３０分間イン
キュベートした。２１の０．２チＳＤＳを、３７℃で３
０分。
間のインキュベーション後添加した。０．９５−の混合
胸当シ、１９のＣａＣＬおよび０．０５−のＥｔＢｒ（
１０”＆／ｄ）を、添加し次いで混合物を４５０００ｒ
ｐｍで、１５℃で２０時間、ＶＴｉ　６５０−ター（ペ
ックマン）中で遠心分離した。
長波長ＵＶランゾのもとで、ＤＮＡを位置決定し次いで
注射器をチューブに入れＤＮＡを取シ出した。
ＥｔＢｒをインプロＡノールで抽出し次いで溶液をＴＥ
Ｅ（０，０１Ｍ　）リスＨＣ４，声＝８．０．０．ＯＩ
ＭのＥＤＴＡ　）に対し２時間透析した。次いで溶液を
ＴＥＥで８ｍｌに調節し、フェノールで２回更μロロホ
ルムで１回抽出した。ＤＮＡを０．１ＭのＮａ　ＣＬお
よび冷エタノールで沈殿させ、次いで１ｍＡ！のＴＥ（
０，０１Ｍ）リス基Ｃｔ、　ｐｉ（＝　８．０、Ｏ，Ｏ
ＯＩＭ　のＥＤＴＡ　）中に溶解した。染色体ＤＮＡ　
（ｃｈｒ　ＤＮＡ）の溶液を４℃で保存した。
Ｃ５９９（セフシロンＧ参照）由来のＣｈｒＩｌｌＮＡ
６０μｇを、９００μｔの緩衝液（０，ＯＩＭ）リスＨ
Ｃｔ、　ｐＨ＝　７．４．０．０７５ＭのＮａＣｔ、　
０．０１　ＭのＭｇＣｌ２．０．００６Ｍのメルカプト
エタノール、１００μｉ／１１Ｌｌのゼラチン）中、１
０単位のＭｂｏＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｃａｔ、　Ａｌ　
４７　）を用い３７℃で切断した。１０分後、更に４０
分後、４５０μｔのサンプルとフェノールを用いて抽出
し、０．１ＭのＮａＣ２および冷エタノールで沈殿した
。各サンプルを１００μｔのＴＥＥ中に溶解した。１２
ゴの蔗糖勾配（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ等、Ｃｅ１ｌ　１
５　：６８７−７０１．１９７８）当たり、１００μｔ
のＤＮＡを付加し次いで５Ｗ４ｉローター（ペックマン
）中２７００Ｏｒｐｍで２０℃で２２時間、遠心分離し
た。
管の底部を穿孔した後、０６５−のフラクションを抜き
取）次いで冷エタノールで沈殿させた。
ＤＮＡを５０μｔのＴＥに溶解し次いで各フラクション
中のＤＮＡの大きさを０．５μ、ｌｉＩ／ゴのＥｔＢｒ
で染色した０、７チアガロースダル上で評価した。約４
〜１２ｂｂのＤＮＡを含む断片を集め、フェノールで抽
出し、エタノールで沈殿させ灰いてＴＥ中に溶解した。
Ｊユアミラーゼ遺伝子を含有する組換遺伝子の亨馴［ ４１ｔｉ（Ｄ　ｐＡＣＹ　１８４　（セクションＤ参照
）　ヲ、５０μｔの緩衝液（０，００６Ｍ）リスＨＣ１
，ｐＨ＝８．０．０．１５ＭのＮａ０２％　０．００６
　ＭのＭｇＣｌ２．０．００６Ｍのメルカプトエタノー
ル、１００１１１１／ｆｎｌのゼラチン）中８ＵのＢａ
ｍＨＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｃａｔ。
Ａ１３６）を用いて：３７℃で１時間切断した。線状Ｄ
ＮＡを、子牛の小腸アルカリ性ホスファターゼ（シグマ
Ｐ　４５０２）で処理した（グツドマン等、Ｍｅｔｈｕ
ｄａ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ７．６８　：　７５〜
９０．１９７９）０次いで、０．４　ｆｉｌｌ　Ｂａｍ
ＨＩおよびホスファターゼ処理ｐＡｃＹｃ　ｉ　８４を
、約１００　Ｕ　ＤＮＡリガーセ（Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｃ
ａｔ、　Ａ２０２　）を用い蔗糖勾配由来の約１μ９の
Ｃ５９９ｃｈｒ　ＤＮＡと、１００μｔの緩衝液（０，
６６Ｍ）リスＨＣ１，ｐＨ＝　７．５．０．０１ＭのＭ
ｇＣｌ２．２５μｂ旬のゼラチン０．００１ＭのＡＴＰ
、、Ｑ、０．１　ＭのＤＴＴ　）中、１６℃で４時間結
合させた。結合ＤＮＡを、セクシ目ンＢで述べた知く、
コンピテントＥ、コリー株Ａ３０２に形質転換した。
二層から成る新たに性別した寒天プレート上に細胞をプ
レートした：低部には、０．５係の可溶性デンプンおよ
び６０μ９７ｍ１のクロラムフェニコールを有する１０
ｍ１のＬＢ寒天。頂部には、クロラムフェニコールを含
まない同じ寒天２５ｍｆｆ１．３７℃で一夜インキュペ
ーション後、約ｉ　２．Ｏｏ個のクロラムフェニコール
耐性形質変換体を得た。これらの内６００個は、これら
の形質変換体のプラスミドがＢ　ａｍＨＩ部位内のクロ
ーン化断片を担持していることを示す感受性テトラサイ
クリンであった。とれらの６００個のコロニー（Ｃ５９
９の遺伝子バンクを表わす）の内、一種の株（ＤＮ４０
０と命名）は、寒天を含むデンプンをヨウ素蒸気にさら
すと、該コロニーの周囲に青いハローが出現することに
よって指示される如くアミラーゼ活性を示した。株ＤＮ
　４００は、アミラーゼコードづけ遺伝子を含む、約１
４０００の塩基対のプラスミド（ｐＤＮ４００と命名）
゛を担持することが判明した。
約１μＪｉｌｏｐＤＮ　４００　（セクション１で述べ
た如く構成されかつセクションＤにおいてｐＡＣＹ１８
４について説明した如（Ｅ、コリー株ＤＮ４００から調
製した）を、１００μｔの緩衝液中３７℃で０．０６Ｕ
の５ａｕ３Ａｔ（Ｂｉｏｌａｂａ　Ｃａｔ、　Ａｌ　６
９　）を用いて切断した。２５μｔアリコートを、フェ
ノール抽出し次いで０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ２および冷エ
タノールで沈殿させた＠ＤＮＡの捧を、すてにＢａｍＨ
Ｉで切断した（セクション！でｐＡｃＹｃｌ　８４につ
いて説明した如く）、０．４μｇプラスミドｐＢＤ　６
４　（セクションＥ参照）と結合させた（セクションＨ
参照）。
該株由来のプラスミドを単離しくセクションＦで説明し
た如く）次いでバシラス　サブチリス株（ＤＮ３０４と
命名）に形質転換した（セクションＣで説明した如く）
。
プラスミドｐＤＮ４５２を担持する、一種のＡｍｙ＋形
質転換体株（ＤＮ４６３と命名）を単離した。以下の例
３で説明するように、ＤＮ４６３を培養した場合、本発
明の新規熱安定性アミラーゼ製品の収率が向上すること
が説明した。
例３ 上記クローン化微生物ＤＮ　４６３の培養物を５００ｄ
振とりフラスコ中の次の基質１００プ上に接種した： 液化デンプン　１２．５チｖ／ｖ　（水道水）大豆ミル
　７．５チ Ｎａ２ＨＰ０４１　％ 接程前に、５μ９７ｄｌのクロラムフェニコールを上記
基質に添加した０ ３０℃で３〜４日間インキュベーションを行ったＯ 培養プロスを、６０００．９で２０分間遠心分離した。
約２００　ＵＡＩＬｌを有する、遠心分離濃厚物を＊ｏ
＊’ｍｎ″ｅｉｉｍ＋、−＊°　以下余白を皿二 糖化用基質を、イオン水に７ＤＥのスプレー乾燥したマ
ルトテキストリンを再溶解し次いで約３０４　Ｄ、Ｓ、
に仕上げることによって調製した・糖化実験は、標準５
０００Ｆ１Ｌ７！の実験室用パッチ反応器内で行った。
この基質の一部を６０℃に加熱し次いで−を５．５に調
整し次いで５０アミラ一ゼ単位／、ＦＤ、Ｓ、　を添加
した。６０℃で７２時間後、シロップ中のグルコース、
マルトースおよびマルトトリオースの含量は次の如くで
あった。
グルコース　＝　５チ マルトース　：６７−喝 マルトトリオース：　０チ 同条件のもと、２５β−アミラーゼ単位／１１Ｄ、Ｓの
パイオデイム（Ｂｉｏｚｙｍ　）　ＭＩＩ　（大豆β−
アミラーゼ、２０．０００β−アミラーゼ／、９）を用
いて糖化すると、グルコース０．３％、マルトース６１
チおよびマルトトリオース７％を含有するジ・′を得る
・　以下余白
【図面の簡単な説明】
第１図は温度に対するマルトース産生酵素の相対活性を
プロットしたグラフであシ、 第２図はｐ）（に対し相対活性をプロットしたグラフで
あシ、さらに 第３図は本発明の新規プラスミドｐＤＮ４５２に対する
制限エンドヌクレアーゼ制限地図である。 特許出願人 ノボ　インダストリ　アクテイーゼルスカブ特許出願代
理人 弁理士青水　朗 弁理士西舘和之 弁理士　内　１）幸　男 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 第１図 第２図 ４　’）　６　７　８　ｐＨ 第３図 Ｃ１２Ｒ１：１２５） ０発　明　者　ベルブ・クラーク・ディーデリヒセン デンマーク国ディーケー−２９００ ヘレルプ・エスタースベイ３２ ０発　明　者　ラルスークリスチャンセンデンマーク国
ディーケー−２８００ リングビー・テイオルネバエン ゲト１５

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、パシラス（ハ１１バリー）菌株Ｃ５９９（受託番号
    ＮＣｌＢ１１８３７）の適当な栄養培地中で培養するこ
    とによって得ることのできるマルトース産生アミラーゼ
    酵素。 ２、固体の形態テＩ！！当だ、！１１５００〜２５，０
    ００Ｕの範囲内のアミラーゼ活性を示す、特許請求の範
    囲第１項記載のマルトース産生アミラーゼ酵素製品。 ３、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、）菌株Ｃ５９９（受
    託番号ＮＣｌＢ１１８３７）又はこの変異株又は突然変
    異株を、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適
    当な栄養培地中で培養する、特許請求の範囲第１項記載
    のマルトース産生アミラーゼ酵素の製造方法。 ４、前記マルトース産生アミラーゼ酵素が培養プロスか
    ら回収される、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、バシラス菌株Ｃ５５９（受託番号ＮＣｌＢ１１８３
    ７）によって産生されたマルトース産生アミラーゼにつ
    いてコードする遺伝子を含有する形質転換宿主微生物を
    、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄
    養培地中で培養することを含んでなる、特許請求の範囲
    第１項記載のマルトース産生アミラーゼ酵素製品の製造
    方法。 ６、前記マルトース産生アミラーゼ酵素を培養ブロスか
    ら回収する、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記宿主微生物がバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）
    群に属する、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８、前記宿主微生物がバシラス　サブチリス（Ｂａｃｉ
    ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）である、特許請求の範
    囲第７項記載の方法。 ９、前記宿主生物がバシラス　サブチリス（Ｂａｃｉｌ
    ｌＵｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）菌株１６８又はその突然
    変異株又は変異株である、特許請求の範囲第７項記載の
    方法。 ブチリスＣ５９９（受託番号ＮＣｌＢ１１８３７）であ
    る、特許請求の範囲第５項記載の方法。 １１、特許請求の範囲第１項記載のマルトース産生アミ
    ラーゼについてコードする遺伝子を含有する組換プラス
    ミドの調製方法であって、前記アミラーゼを産生ずる供
    与体微生物由来の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素を用い
    て切断しアミラーゼコード遺伝子を含有する線状ＤＮＡ
    −鎖を得、適当なベクターを、適当な制限酵素を用いて
    切断し第二の線状ＤＮＡ−配列を得、次いで線状ＤＮＡ
    −配列を結合しアミラーゼ遺伝子を含有する組換えプラ
    スミドを得ることを含んでなる、前記方法。 １２、前記供与体微生物がバシラス（Ｂａｃｉ　１１ｕ
    ｓ）Ｃ５９９である、特許請求の範囲第１１項記載の方
    法。 １３、前記ベクターが、Ｅ、コリー（ｃｏｌｔ　）プラ
    スミドである、特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、前記Ｅ、コリー（ｃｏｌｔ）グラスミドがｐＡＣ
    ＹＣ１８４である、特許請求の範囲第１３項記載の方法
    。 １５、前記組換えプラスミド由来のマルトース産生アミ
    ラーゼ遺伝子と、複製可能なプラスミドとをバシラス　
    サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｇ　ｓｕｂｔｉｌｕｇ）宿
    主中で結合することを更に含んでなる、特許請求の範囲
    第１１項記載の方法。 １６、パシラス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
    ｔｉｌｉｓ　）中で複製可能プラスミドがプラスミドｐ
    ＢＤ６４もしくはｐＵＢ　１１０又は該プラスミドの一
    種の誘導体である、％粁にの範囲第１５項記載の方法。 １７、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　Ｃ５９９（受
    託番号ＮＣｌＢ１１８３７）由来の染色体ＤＮＡを制限
    酵素Ｍｂｏｌを用いて切断し、４〜１２ｋｂ範囲のＤＮ
    Ａ−配列を単離し、Ｅ、コリー（ｃｏｌｉ）７’ラスミ
    ドｐＡＣＹＣ１８４と結合させ、Ｅ、コリー（ｃｏｌｔ
    ）細胞に形質転換し、アミラーゼ遺伝子を含有しプラス
    ミドを担持する、澱粉崩壊形質転換体を同定し、該プラ
    スミドを制限酵素Ｓ　ａ　ｕ　３ＡＬを用いて切断し次
    いで制限酵素ＢａｍＨＣを用いて切断されたプラスミド
    ｐＢ０６４と結合させることを含んでなる、特許請求の
    範囲第１１項記載の方法。 １８、特許請求の範囲第１項記載のマルトース産生アミ
    ラーゼについてコードする遺伝子を含有する組換えグラ
    スミド。 １９、少なくともプラスミドｐＢ０６４もしくはｐｔｙ
    ｎ　１１０又はその誘導体の部分ヌクレオチド配列並び
    に前記マルトース産生アミラーゼに対しコードするＤＮ
    Ａ配列を更に含んでなる、特許請求の範囲第１８項記載
    の２組Ｊ具え７°ンヌミド′・２０、第３図に示される
    プラスミドを更に含んでなる、特許請求の範囲第１９項
    記載の、岨談えフ１ラス？ド。 ２１、任意のα−１，６−グルコシダーゼの存在中、特
    許請求の範囲第１項記載のマルトース産生アミラーゼ酵
    素を用いて水性媒体中デンプンを処理することを含んで
    なる、高純度マルトースシロップの製造方法０　以下余
    白
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