JPH0789924B2 - 新規α−１，６グルコシダ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なα−1,6グルコシダーゼ及びその製造法
に関する。更に詳しくは、新菌種バチルス・セクトラマ
ス（Bacillus sectorramus）に属するα−1,6グルコシ
ダーゼの生産菌を培養し、培養物中より得られ、至適pH
が5.0〜5.5付近で至適温度が55℃付近である新規なα−
1,6グルコシダーゼ及び該菌株の培養物よりα−1,6グル
コシダーゼを採取することを特徴とする新規なα−1,6
グルコシダーゼの製造法に関する。

α−1,6グルコシダーゼは澱粉等のα−1,6グルコシド結
合を切断し、直鎖アミロースを生成する酵素であり、マ
ルトース、グルコース及び異性化糖等を製造する糖化業
界において広く用いられている。

〔従来技術〕

α−1,6グルコシダーゼは古くから高等植物或いは微生
物の酵母に見い出されていたが、近年各種の細菌におい
てその生産が報告されるようになった。例えばアエロバ
クター・アエロゲネス（Aerobactor aerogenes）、エシ
エリシア・インターメデイア（Escherichia intermedi
a）、シユードモナス・アミロデラモサ（Pseudomonas a
myloderamosa）、ストレプトコツカス・ミテス（Strept
ococcus mites）、サイトフアーガ（Cytophaga）属、ス
トレプトミセス（Streptomyces）属及びフラボクロモゲ
ネス（Flavochromogenes）属等である。

一方、バチルス（Bacillus）属の生産するα−1,6グル
コシダーゼとしてはバチルス・セレウス（Bacillus cer
eus）IFO 3001及びバチルス・フエルムス（Bacillus fe
rmus）IFO 3330及びバチルス・アシドプルリチカス（Ba
cillus acidopullulyticus）等が知られている。

〔解決すべき問題点〕

従来知られているα−1,6グルコシダーゼのほとんど
は、至適pHが中性ないし弱アルカリ性であり、酸性側で
糖化を行う糖化業界においてこれらのα−1,6グルコシ
ダーゼを使用することは不利であった。

一方酸性側に至適pHを有するα−1,6グルコシダーゼと
してシユードモナス・アミロデラモサ（Pseudomonas am
yloderamosa）及びバチルス・アシドプルリチカス（Bac
illus acidopullulyticus）等があるが、前者は温度耐
性がなく実用に不向きであり、後者は培養時間が60〜73
時間とバクテリアにしては長く経済面で問題があった。

〔問題点を解決するための方法〕

そこで本発明者らは、温度耐性があり、酸性側に至適pH
を有しかつよりα−1,6グルコシダーゼ生産性の高い微
生物を求め鋭意検討を試みた。

そして土壌中より新たに分離したバチルス（Bacillus）
属に属する新菌種が10〜15時間ぐらいのごく短時間培養
で培養物中に多量にα−1,6グルコシダーゼを生産する
ことを見い出し、これを採取することにより本発明を完
成した。

本発明において使用するα−1,6グルコシダーゼ生産菌
は新菌種に属し、本発明者らはこれをバチルス・セクト
ラマス（Bacillus sectorramus）と命名した。その工業
技術院微生物工業技術研究所微生物保管受託番号はFERM
−P No.8973であり、以下本菌株という。

次に本菌株の菌学的性質を記載する。

A.形態 （１）細胞の形 桿菌 （２）細胞の大きさ 1.0〜1.3×1.5〜5.2μ （３）運動性の有無 無 （４）胞子の有無 有 （５）グラム染色 陽性 （６）抗酸性染色 陰性 B.各培地における生育状態 （１）標準寒天平板培養 コロニーは円形、周辺は全縁、表面は平滑で半透灰白
色。

（２）標準寒天斜面培養 直状で表面は平滑、バター質、光沢あり、生育中程度。

（３）標準液体培養 薄く濁り粉状沈澱を有す。色素の発生なし。

（４）標準ゼラチン穿刺培養 直状、液化せず。

（５）リトマスミルク 何の変化もなし。

C.生理学的性質 （１）硝酸塩の還元性 陽性 （２）脱室反応 陽性 （３）メチルレツド試験 陽性 （４）アセチルメチルカルビノールの生成 陰性 （５）インドールの生成 陰性 （６）硫化水素の生成 陰性 （７）澱粉の加水分解 陽性 （８）クエン酸の利用 陽性 （９）無機窒素源 （硝酸塩及びアンモニウム塩）の利用 陽性 （10）色素の生成 陰性 （11）ウレアーゼ活性 陰性 （12）オキシダーゼ活性 陰性 （13）カタラーゼ活性 陽性 （14）生育の範囲pH 4.0〜7.1 温度 45.5℃〜15.0℃ （15）酸素に体する態度 通性嫌気性 （16）ジオキシアセトンの生成 陰性 （17）馬尿酸の分解 陰性 （18）アルギニンの分解 陰性 （19）フエニルアラニンの脱アミノ 陰性 （20）温度抵抗性（85℃、10分の耐性） 陽性 （21）塩化ナトリウムの耐性 ７％ 陰性 3.5％ 陽性 （22）サブロウ寒天培地の生育 陽性 （23）0.001％リゾチーム培地の生育 陽性 （24）チロシンの分解 陽性 （25）クエン酸・アンモニウム寒天での アルカリ産生 陽性 （26）カゼインの分解性 陰性 （27）ゼラチンの分解性 陰性 （28）嫌気性培地における発育性 陽性 （29）マツコンキー培地生育性 陰性 （30）レシチナーゼ反応 陰性 （31）VP培地におけるアルカリ産生能 陰性 （32）糖類の利用と生酸性 （ａ）Ｌ−アラビノース 陽性 （ｂ）Ｄ−キシロース 陽性 （ｃ）Ｄ−グルコース 陽性 （ｄ）Ｄ−マンノース 陽性 （ｅ）Ｄ−フラクトース 陽性 （ｆ）Ｄ−ガラクトース 陽性 （ｇ）麦芽糖 陽性 （ｈ）シヨ糖 陽性 （ｉ）乳 糖 陰性 （ｊ）トレハロース 陽性 （ｋ）Ｄ−ソルビツト 陰性 （ｌ）Ｄ−マンニット 陰性 （ｍ）イノシツト 陰性 （ｎ）グリセリン 陽性 （ｏ）デンプン 陽性 （ｐ）メリビオース 陽性 （ｑ）サリシン 陰性 （ｒ）エタノール 陽性 以上の菌学的性質をバージーのマニユアル・オブ・デイ
ターミネイテイブ・バクテリオロジー（Bergey's Manua
l of Determinative Bacteriology）第８版及びインタ
ーナシヨナル・ジヤーナル・オブ・システイマテツク・
バクテリオロジー（International Journal of Systema
tic Bacteriology）1974〜1986の記載に従って菌株を同
定した。

すなわち本菌株はグラム染色陽性、胞子を着生するこ
と、好気的に生育すること等からバチルス属に属する菌
株であることは明らかである。

次に本感株は、バチルス（Bacillus）属の内でどの公知
の菌種とも類似していなかったが、しいてあげれば、栄
養細胞の太さが1.0〜1.3μと比較的大きいことから類似
菌種としてバチルス・セレウス（Bacillus cereus）や
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）があ
げられる。

しかしこれらの菌株と本発明に使用した菌株とは以下の
諸点において区別することができる。

即ち、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）は７％
食塩で生育し、卵黄反応、カゼイン分解反応、ゼラチン
分解反応がいずれも陽性であるが、本菌株は７％食塩で
は生育できないしかつ卵黄反応、カゼイン分解反応及び
ゼラチン分解反応の凡てが陰性である。

又、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
は７％食塩でも生育し、カゼイン分解反応、ゼラチン分
解反応のいずれもが陽性であるのに対して本菌株は７％
食塩で生存できず、かつカゼイン分解反応、ゼラチン分
解反応が凡て陰性である。

更に又、同じくバチルス属の新菌種である特開昭61−43
994号記載のバチルス・アシドプルリチカス（Bacillus
acidopullulyticus）と本菌株を比較すると表−１に示
すとおり区別することができる。

以上により本菌株はバチルス（Bacillus）属の既知の菌
種とは異なり新菌種であることを認め、前記のとおり命
名した。

次に本菌株を培養してα−1,6グルコシダーゼを生成蓄
積せしめるための条件について述べる。

まず、培地成分として適当な無機塩類の他に、炭素源と
しては可溶性デンプン、ワキシースターチ、ポテトスタ
ーチのようなデンプン類、マルトース、デキストリン等
のデンプンの加水分解物等、窒素源としてはポリペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、リ
ン酸二アンモン、カゼインや大豆蛋白のような蛋白質加
水分解物等をそれぞれ適当に組合せたものが高力価なプ
ルラナーゼ活性を産生する。

培養の条件としては、前記のごとき培地のpHを4.0〜7.0
に調整したものに本菌を接種し、20〜45℃の温度で静
置、振盪又は通気撹拌などの条件で１〜２日間（最良は
10〜20時間）培養する。

培養終了後、その培養液から菌体を除去し、得られた上
澄液を濃縮する事によって高単位のプルラナーゼ標品が
得られた。さらに、この酵素標品は硫安分画後、γ−サ
イクロデキストリン−セフアロース6B（フアルマシア
製）にてアフイニテイークロマトグラフイーを行いSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドにまで
精製した。以下にその精製したα−1,6グルコシダーゼ
の酵素化学的性質を詳述する。

１ 作用：本酵素はα−1,6グルコシド結合に作用して
直鎖アミロースを生成する。

２ 基質に体するKm値及びVmax:本酵素のプルラン、ポ
テト由来アミロペクチン及びコーン由来アミロペクチン
に対してのKm値及びVmaxは表−２に示すとおりである。
尚、Km値の単位は（mg/ml）であり、Vmaxの単位は（μm
ol/min/mg蛋白）である。

３ 多糖に体する相対活性：本酵素のプルラン活性に体
するトウモロコシの溶性アミロペクチン、溶性デンプ
ン、カキのグリコーゲン、ウサギのグリコーゲン、トウ
モロコシのアミロペクチン及びポテトのアミロペクチン
の相対活性は表−３に示す通りである。

４ 至適pH:25mMクエン酸−50mM燐酸二ナトリウム緩衝
液を使用し、pH5.0〜5.5付近に至適pHを示す（図１に示
される）。

５ pH安定性:25mMクエン酸−50mM燐酸二ナトリウム緩
衝液を使用し、40℃、30分処理においてpH4.5〜6.5まで
安定であり、50℃、30分処理においてはpH5.0〜6.0まで
安定である（図２に示される）。

６ 至適温度:50mM酢酸緩衝液pH4.5を使用し、55℃付近
に至適温度を示す（図３に示される）。

７ 温度安定性:50mM酢酸緩衝液pH4.5を使用し、40℃、
30分処理において80％安定であり、60℃、30分処理にお
いて90％失活する（図４に示される）。

８ 活性測定性:0.5％プルラン溶液（pH4.5）4mlに酵素
液1mlを加え40℃、30分間反応させた後、ソモギー溶液2
mlを加え20分間加熱し、冷却する。冷後ヒ素モリブデン
酸アンモニウム溶液1mlを加え、次いで水を加えて25ml
とする。この液について層長1cmで500nmにおける吸光度
を測定する。本条件下において１分間に１μモルのグル
コースに相当する還元糖を生成するときを１単位とし
た。

９ 阻害剤の影響:p−メルクリ安息香酸（以下ｐ−CMB
と略する）及びドデシル硫酸ナトリウム（以下SDSと略
する）で70％以上阻害されオルトフエナントロリン及び
フエリシアン化カリウムでは阻害されない。各種阻害剤
による影響は、該阻害剤の終濃度が1mMで50mM酢酸緩衝
液pH4.5、40℃、30分処理後の残存活性で表−４に示
す。

９ 金属塩の影響:Ni²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺及びMn²⁺に
はほとんど影響されず、Fe³⁺で阻害され、Hg²⁺及びAg²⁺
で失活する。各種金属塩による影響は該金属塩の終濃度
が5mMで50mM酢酸緩衝液pH4.5、40℃、30分処理後の残存
活性で表−５に示す。

10 分子量：約95,500（SDS電気泳動法による） 本発明によつて得られた酵素について、特開昭57−1740
89号記載の枝切り酵素（以後、甲とする）の性質と比較
すると、下記のとおり明確に区別される。

１ 生産菌株に関しては、本発明はバチルス属の新菌株
であるバチルス・セクトラマスであり、甲はバチルス・
アシドプルリテイクスである。

２ 至適温度に関しては、本発明は55℃であるが甲は60
℃である。

３ 各pH及び温度における酵素活性に関しては、本酵素
は図５に示すように温度差に対する酵素活性の差が非常
に大きい。また酵素活性のpHに対するパターンも活性の
ピークはpH5.0であるが該pHより高くとも又低くとも急
激に活性は低下する。甲はこれらのパターンが全く異な
る。

４ 至適pHに関しては、本発明はpH5.0〜5.5と狭く、甲
の酵素のpH3.5〜5.5と比較して特異性が非常に高い。

本発明によって得られるα−1,6グルコシダーゼは甲と
は異なった新規の酵素であると言える。

本発明によって得られた新規なα−1,6グルコシダーゼ
は例えばグルコアミラーゼを用いてデンプンよりブドウ
糖を製造する際に収率アツプの目的で添加したり、β−
アミラーゼと組み合わせてデンプンから高収率のマルト
ースを製造する目的などに使用する事ができる。

以下本発明を実施例にて具体的に説明する。尚、α−1,
6−グルコシダーゼとプルラナーゼは同義語であり、本
実施例中ではプルラナーゼなる語句を用いている。

実施例１ 可溶性デンプン 1.5％ 肉エキス 0.5％ （NH₄）₂HPO₄ 0.3％ K₂HPO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ 初発pH 5.5 上記組成の培地にバチルス・セクトラマス（Bacillus s
ectorramus）FERM−P No.8973を接種し、37℃で20時間
坂口フラスコで振盪培養した結果、8.1u/mlのプルラナ
ーゼ活性を培養液から得ることができた。この培養液を
遠心分離して菌体を除去し、得られた上澄液を限外ろ過
膜で濃縮し、冷アルコールを80％濃度まで加えて酵素を
沈澱させ、これを遠心分離し、得られた沈澱物を凍結乾
燥する事によってプルラナーゼの粉末を得る事ができ
た。

実施例２ マルトース ２ ％ 酵母エキス 0.5％ K₂HPO₄ 0.2％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ 初発pH 4.5 30容ジヤーフアーメンターに上記組成の培地を仕込
み、バチルス・セクトラマス（Bacillus sectorramus）
FERM−P No.8973を接種し、37℃で16時間通気撹拌培養
した。培養液から13.6u/mlのプルラナーゼ活性を得た。
この培養液を遠心分離して菌体を除き得られた上澄液を
限外ろ過膜で約20倍に濃縮し、200u/ml（pH4.5）のプル
ラナーゼの粗酵素液状標品を得た。これを硫安分画した
後、γ−サイクロデキストリン−セフアロース6R（フア
ルマシア製）でアフイニテイークロマトグラフイーを行
い76.7u/mg蛋白の精製酵素標品を得た。

実施例３ ワキシースターチ ２ ％ ポリペプトン １ ％ K₂HPO₄ 0.2％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ 初発pH 5.0 1000容タンクに上記組成の培地を仕込み、バチルス・
セクトラマス（Bacillus sectorramus）FERM−P No.897
3を接種し、37℃で15時間通気撹拌培養した。培養液か
ら18.2u/mlのプルラナーゼ活性を得た。この培養液を実
施例２に示した同様の操作を行い約300u/mlの液状プル
ラナーゼ粗酵素標品を約26得た。

実施例１ 糖化用基質：コーンスターチ（33g/dl・DE8.0） 糖化酵素：グルクザイムNL−３（天野製薬（株）製）
（2.5u/g D.S.） 本酵素：実施例３で得られた液状プルラナーゼ（0.1u/g
D.S.） 糖化温度:62℃ 上記の条件で糖化を行い各時間での単糖類（G1）、２糖
類（G2）、３糖類（G3）及び多糖類（Gn）の含有率をHP
LCで測定した。対照として本酵素を添加しない糖化条件
でも測定し、その結果を表−６に示す。

〔発明の効果〕 本発明は新菌種バチルス・セクトラマス（Bacillus sec
torramus）を短時間培養することによって新規のα−1,
6グルコシダーゼを生産せしめ、且つ多量の耐熱性α−
1,6グルコシダーゼを経済的に生産することを可能に
し、澱粉糖化業界に貢献するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第５図は本発明のα−1,6グルコシダーゼの酵
素化学的性質を示すものであり、そのうち第１図は至適
pH曲線を、第２図では−○−は40℃におけるpH安定曲線
を、−●−は50℃におけるpH安定曲線を示し、第３図は
温度安定曲線を、第４図は至適温度曲線をそして第５図
では−○−は55℃における各pHでの酵素活性曲線を、−
□−は60℃における各pHでの酵素活性曲線を、−●−は
65℃における各pHでの酵素活性曲線をそれぞれ示すもの
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横井 信正 愛知県西春日井郡西春町大字野崎字乾出11 番地 (72)発明者 大矢 隆一 愛知県西春日井郡西春町大字野崎字乾出15 番地 審査官 村上 騎見高

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の酵素化学的性質を有する新規α−1,
   6グルコシダーゼ。 作用：α−1,6グルコシド結合を切断し、直鎖アミロ
   ースを生成する。 基質特異性：多糖に対する相対活性が下記のとおりで
   ある。 至適pH:5.0〜5.5付近である。 pH安定性:40℃、30分処理においてpH4.5〜6.5まで安
   定であり、50℃、30分処理においてはpH5.0〜6.0まで安
   定である。 至適温度:55℃付近である。 温度安定性:pH4.5、40℃、30分処理において80％安定
   であり、60℃、30分処理において90％安定である。 分子量：約95,000（SDS電気泳動法による）
2. 【請求項２】バチルス・セクトラマスに属するα−1,6
   グルコシダーゼ生産菌を培養し、培養物中にα1,6−グ
   ルコシダーゼを産生せしめ、これを採取することを特徴
   とするα−1,6グルコシダーゼの製造法。