JPH0251600B2

JPH0251600B2 -

Info

Publication number: JPH0251600B2
Application number: JP62253787A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Kobayashi; Takashi Okemoto; Keiji Kainuma; Hitoshi Hashimoto; Kozo Hara
Original assignee: Ensuiko Seito Kk; NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO
Current assignee: Ensuiko Seito Kk; NORINSUISANSHO SHOKUHIN SOGO KENKYUSHOCHO
Priority date: 1987-10-09
Filing date: 1987-10-09
Publication date: 1990-11-07
Also published as: JPS63301795A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明はマルトペンタオース合成酵素を用いて
マルトペンタオースを製造する方法に関し、詳し
くは特定の微生物が生産するマルトペンタオース
合成酵素を用いて効率よくマルトペンタオースを
製造する方法に関する。〔従来の技術および発明が解決しようとする問題
点〕近年、マルトオリゴ糖に関する研究がすすめら
れているが、現在工業的に大量生産されているも
のはマルトースのみである。マルトース以外には
マルトトリオースが試薬用として、またマルトペ
ンタオースがアミラーゼ括性測定用としてそれぞ
れ少量生産されているにすぎない。しかし、最近マルトトリオース〜マルトヘキサ
オースのマルトオリゴ糖を特異的に生産する微生
物起源のアミラーゼが次々に発見され、澱粉から
各種オリゴ糖の生産が容易に行なえるようになつ
てきた。たとえばマルトペンタオースに関しては
Arch.Biochem.Biophys.、155、290（1973）およ
び日本農芸化学会昭和57年度大会要旨集178頁に
記載の酵素が知られている。ところが、これらの
酵素は反応初期からマルトペンタオース以外の各
種糖を生成するものであり、マルトペンタオース
のみを生成するアミラーゼは未だ知られておら
ず、マルトペンタオースの効率的な製造方法も確
立されていない。〔問題点を解決するための手段〕そこで本発明知者らは、マルトペンタオースを
効率よく製造する方法を検索すべく研究を重ね
た。その結果、アルカリゲネス属に属する微生物
を培養することにより目的とするマルトペンタオ
ース合成酵素が得られ、該酵素を用いれば効率的
にマルトペンタオースを製造できることを見出
し、本発明を完成するに至つた。すなわち本発明は、澱粉、澱粉の組成画分およ
び澱粉の分解反応生成物のうちの少なくとも１種
の物質に下記の性質を有するマルトペンタオース
合成酵素を作用させることを特徴とするマルトペ
ンタオースの製造方法を提供するものである。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
5.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.0において至適温度は45℃であ
り、55℃以上の温度で15分間放置すると失活す
る。 (4) 本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀
およびモノヨードアセトアミド溶液中で阻害を
受けるが、阻害率は10〜20％である。 (5) 本酵素の分子量は約82000（デイスクゲル電気
泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH5.2（アンフオライン電気
泳動法による）である。本発明で用いるマルトペンタオース合成酵素は
微生物を用いて生産され、その生産菌としてはア
ルカリゲネス属に属し、上記性質を有する酵素を
生産する能力を有するものであればよく、たとえ
ばアルカリゲネス・フエカリスIAM−1015など
がある。これらは生産能に強弱の差異はあるが、
いずれも目的とするマルトペンタオース合成酵素
を産生する。なお、アクロモバクター属やモラキ
シダ属の微生物は運動性、カタラーゼ・テストな
どにアルカリゲネス属の微生物と差異が認められ
るのみであり、アルカリゲネス属に類縁の微生物
であると考えられるので、これらに属する菌株の
中にも本発明の酵素の生産能を有するものが存在
するものと推測される。上記の如く、本発明に用いる微生物はアルカリ
ゲネス属に属し、上記性質を有する酵素の生産能
力を有するものであればよく、前記した菌株とそ
の変種、変異株に制限されるものではない。ここ
で変異手段としては常法のものでよく、たとえば
ラジオアイソトープ（RI）、紫外線（UV）、ニト
ロソグアニジンなどを用いて行なえばよい。次に、本発明に用いるマルトペンタオース合成
酵素を生産するための微生物の培養条件について
検討した。まず、基本培地として肉エキス、ポリ
ペプトン、食塩および炭素源を含むものを用い、
炭素源については第１表に示した各種物質を１％
使用した。この培地に後記する実施例２に示した
菌株を植菌し、40℃で３日間振とう培養を行なつ
た。このときの活性比率（マルトースを100とし
たときの値）を第１表に示す。表から明らかなよ
うに、炭素源としてはマルトースが最良であり、
澱粉の中では米澱粉、甘藷澱粉を用いたときにか
なり高い活性が得られた、また、各種粉アメを用
いたときの活性比率はDEが高くなると共に高く
なり、ハイマルトースシロツプではマルトースと
同程度の活性が得られた。

【表】次に、窒素源について検討するため、肉エキス
0.7％、マルトース１％、食塩0.3％を含む培地に
各種物質１％を添加し、40℃で３日間振とう培養
を行なつた。このとき活性比率（硫酸アンモニウ
ムを100としたときの値）を第２表に示す。表か
ら明らかなように、硫酸アンモニウムまたは硝酸
アンモニウムを用いたときに著しく高い活性が得
られた。

【表】さらに、マルトース、硫酸アンモニウムおよび
肉エキスのそれぞれの濃度について検討した結
果、最適の培地組成はマルトース0.8％、硫酸ア
ンモニウム１％および肉エキス0.8％を含むもの
であることが判明した。したがつて、培養に用い
る培地としては、上記知見を参考にして、供試菌
株が良好な活性にて目的とする酵素を生産し得る
組成のものを選定すべきである。次に、培養日数による活性変化について検討し
たところ、培養１日で70％以上の活性が得られ、
３日目まで徐々に活性は上昇する。しかし、その
後は活性が減少する。したがつて、酵素の生産に
は１〜３日間の培養が適当であり、通常は３日間
培養した後、培養液中の不溶分等を遠沈除去して
得た上澄を粗酵素として用いればよい。なお、培
養条件については使用する菌株などによつて異な
るが、目的とする酵素の生産量が最大となるよう
に選定すべきである。また、培養液から酵素を採
取・精製するには、既知の方法を適当に組合せて
行なえばよい。酵素の精製は各種の方法により行なうとが出来
るが、その１例を示すと、次の通りである。酵素の精製方法としては湿熱処理澱粉を用いた
澱粉吸着法が効果的である。すなわち、粗酵素液
に湿熱処理澱粉を加えて４℃以下の低温で１夜撹
拌するのみで約80％の活性が吸着する。次に、該
酵素吸着澱粉を集めて氷水にて洗浄することによ
り容易に部分精製酵素が得られる。吸着酵素はこ
のままでも液化澱粉に作用させることができ、実
用的には本酵素剤をマルトペンタオースの生産用
とすることが有利である。吸着酵素は45℃の温水中で15分間撹拌すること
によつて脱着するので、この脱着酵素をさらに
DEAE−セルロースカラムクロマトグラフイー、
ゲル濾過クロマトグラフイーなどにより精製して
デイスクゲル電気泳動的に単一バンドを示す標品
を得ることができる。このようにして得た精製酵素を用いて本酵素の
性質を検討した。結果を以下に示す。 (1) 作用本酵素を可溶性澱粉に作用させたときの反応
経過は第１図および第２図に示したとおりであ
る。図から明らかなように、本酵素は反応初期
にマルトペンタオースを生成し、その後時間の
経過と共にマルトースとマルトトリオースに水
解される。したがつて、マルトペンタオースを効率的に
生産するには本酵素を、たとえばメンブランリ
アクターのような容器中で液化澱粉に作用さ
せ、生成糖を限外濾過膜を用いて反応系外に取
り出す方法を採用することが望ましい。本酵素の作用形式は、マルトオクタオース以
下のオリゴ糖を基質にした場合、次の通りであ
る。なお、略号はG₁：グルコース、G₂：マル
トース、G₃：マルトトリオース、…G₅：マル
トペンタオース、…G₈：マルトオクタオース
を示す。 G₈：〇−〇−〇−〇−〇−〇−〇−○／ →G₅＋G₃ G₇：〇−〇−〇−〇−〇−〇−○／ →G₅＋G₂ G₆：〇−〇−〇−〇−〇−○／ →G₅＋G₁ G₅：〇−〇−〇−〇−○／ →G₃＋G₂ G₄：〇−〇−〇−○／ →G₂＋G₂ G₃、G₂：作用しないこの作用形式から、G₂とG₃の混合物を生産
し、酵母によりG₂を消化させてG₃を製品とし
たり、またG₂とG₃の混合物を製品とすること
もできる。このように、重合度が小さい基質を用いた場
合、本酵素はいわゆるExo型のアミラーゼとし
ての作用を示すが、重合度の大きいデキストリ
ンにはEndo型のアミラーゼとして作用する。
したがつて、澱粉は本酵素の作用によつて切り
残しはなく大部分がG₅またはG₂とG₃に変換す
る。この際、プルラナーゼ等の枝初り酵素を共
存させれば、G₅の収率を向上させることがで
きる。 (2) 作用至適PHおよびPH安定性反応液組成を基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 各種のPHの緩衝液（100ｍＭ） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml とし、45℃で30分間反応させて還元力を測定
し、最高値を100として表わしたときの結果を
第３図に示す。図から明らかなように、本酵素
の至適PHは６〜７である。また、PH安定性については、本酵素液１mlに
各種PHの100ｍＭ緩衝液（PH４〜６：酢酸緩衝
液、PH６〜８：リン酸緩衝液、PH８〜９：トリ
ス−塩酸緩衝液、PH９〜10：炭酸ソーダ緩衝
液）0.1mlを加え、45℃で60分間静置した後、
各0.1mlずつを採り100ｍＭ酢酸緩衝液（PH6.0）
0.4mlおよび２％基質液0.5mlを加えて45℃にて
30分間反応させ、残存酵素活性を測定した。結
果を第４図に示す。第４図に示したように、本
酵素はPH5.5〜9.0の範囲で安定である。 (3) 酵素力価の測定法酵素の活性は、可溶性澱粉（メルク社製、分
析用）を還元して基質として用い、ソモジー・
ネルソン法により還元力を測定し、45℃で１分
間に１マイクロモル等量のグルコシド結合を切
断する酵素量を1IU（国際単位）とした。 (4) 作用至適温度と温度安定性反応液組成を基質（２％の還元した可溶性澱粉液） 0.5ml 100ｍＭ酢酸緩衝液（PH6.0） 0.4ml 酵素液（8IU／ml） 0.1ml とし、各種の温度で30分間反応させて還元力を
測定し、最高値を100として表わしたときの結
果を第５図に示す。図から明らかなように、本
酵素の作用至適温度は45℃である。またPH6.0で各種温度に15分間静置した後、
45℃で反応を行ない、残存活性を測定した。結
果を第６図に示す。第６図から明らかなよう
に、55℃以上では急激に失活する。 (5) 阻害、活性化および安定化本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀
およびモノヨードアセトアミド溶液中では阻害
を受けるが、阻害率は10〜20％であり高くはな
い。次に、各種金属イオン（１ｍＭ濃度）の影響
は水銀および銀による阻害率が80％以上という
高い値を示すが、マンガン、コバルト、亜鉛、
アルミニウムは50％以下、バリウム、マグネシ
ウム、鉄、リチウム、銅は20〜30％である。ま
た、カルシウムイオンは本酵素の耐熱性を２〜
３℃高める。 (6) 分子量デイスクゲル電気泳動法によつて得られた本
酵素の分子量は約82000である。 (7) 等電点アンフオライン電気泳動法によつて求められ
た等電点はPH5.2である。 (8) 結晶構造および元素分析本酵素については未だ結晶標品が得られてい
ないが、電気泳動で単一バンドを示す精製標品
についてアミノ酸分析を行なつた。アミノ酸分析は常法により試料に６規定の塩酸
を加えて減圧、封かんし、110℃で22時間分解し
た後、アミノ酸自動分析計（日立835型）を用い
て行なつた。なお、トリプトフアンはSpies氏の
比色定量法、システインは過ギ酸酸化法により定
量した。結果を第３表に示す。

〔実施例〕

次に、実施例により本発明を説明する。製造例１アルカリゲネス・フエカリスIAM−1015株を
肉エキス0.8％、硫酸アンモニウム１％、マルト
ース0.8％の斜面寒天培地に接種し、40℃で２日
間培養した後、その１白金耳をとり、同じ組成の
液体培地（100ml培地／500ml三角フラスコ）に移
し、45℃で３日間通気振とう培養を行なつた。培養終了後、低温で培養物中の菌体および不溶
物を遠沈除去して上澄を得、これを粗酵素とし
た。この粗酵素液の活性は0.01IU／mlであつた。製造例２アルカリゲネス・フエカリスIAM−1015株の
培養液を少量とり、常法により、RI、UV、ニト
ロソグアニジンで処理した後、平板培養を行ない
アミラーゼ活性の高いコロニーをとつた。これを
肉エキス0.8％、硫酸アンモニウム１％、マルト
ース0.8％の培地で45℃にて３日間培養し、その
後の操作は製造例１と同様にした。本粗酵素液の
活性は0.64IU／mlであつた。実施例１馬鈴薯澱粉を細菌液化型酵素（BLA）により
液化し、ヨウ素−澱粉反応が青色で失活処理し、
基質濃度10％、マルトペンタオース合成酵素（製
造例２の粗酵素液）1IU／ｇ基質、PH6.0、45℃で
６時間撹拌しながら反応せしめマルトペンタオー
スを30％含む反応液を得た。実施例２実施例１のようにして液化馬鈴薯澱粉液を作
り、基質濃度20％、マルトペンタオース合成酵素
（製造例２の粗酵素液）1IU／ｇ基質、PH6.0、45
℃で限外濾過器〔東洋濾紙(株)製、UHP−76（膜は
UK−10）〕中で窒素ガスで圧力をかけながら反
応させてマルトペンタオースを80％以上含む糖液
を得た。収率は12時間反応で出発基質の60％であ
り、得られた糖液は逆浸透膜で20％にまで濃縮す
ることができた。実施例３プルラナーゼを1IU／５ｇ基質に加えたこと以
外は実施例２と同様に操作し、12時間の反応でマ
ルトペンタオースを80％以上含む糖液を収率65％
で得た。〔発明の効果〕マルトペンタオースは現在、α−アミラーゼ活
性測定用基質として診断薬、試薬などへの用途が
あり、本酵素が本発明によつて安価で効率よく生
産されれば、食品をはじめ各種用途も拓けるもの
と期待される。マルトペンタオースは溶解性に優
れ、甘味がなく、ボデイー感があるので製菓用材
料として有用であり、また消化・吸収性が良いの
で幼児、老人、患者用の滋養食としての利用も可
能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はマルトペンタオース合成酵素の反応経
過（1IU／ｇ基質）を示すグラフ、第２図は本酵
素の反応経過（1IU／10mg基質）を示すグラフ、
第３図は本酵素の至適PHを示すグラフ、第４図は
本酵素のPH安定性を示すグラフ、第５図は本酵素
の至適温度を示すグラフ、第６図は本酵素の温度
安定性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１澱粉、澱粉の組成画分および澱粉の分解反応
生成物のうちの少なくとも１種の物質に下記の性
質を有するマルトペンタオース合成酵素を作用さ
せることを特徴とするマルトペンタオースの製造
方法。 (1) 本酵素はアミロース、可溶性澱粉、馬鈴薯澱
粉、甘藷澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、トウモ
ロコシ澱粉、モチトウモロコシ澱粉、サゴ澱粉
などに作用してマルトペンタオースを生成す
る。 (2) 本酵素は45℃にてPH６〜７が至適であり、PH
5.5〜９で安定である。 (3) 本酵素はPH6.0において至適温度は45℃であ
り、55℃以上の温度で15分間放置すると失活す
る。 (4) 本酵素は１ｍＭパラクロロ安息香酸第二水銀
およびモノヨードアセトアミド溶液中で阻害を
受けるが、阻害率は10〜20％である。 (5) 本酵素の分子量は約82000（デイスクゲル電気
泳動法による）である。 (6) 本酵素の等電点はPH5.2（アンフオライン電気
泳動法による）である。２澱粉の組成画分がアミロースまたはアミロペ
クチンである特許請求の範囲第１項記載の製造方
法。３澱粉の分解反応生成物が化工澱粉である特許
請求の範囲第１項記載の製造方法。