JPS6253148B2

JPS6253148B2 -

Info

Publication number: JPS6253148B2
Application number: JP1734081A
Authority: JP
Inventors: Shigetaka Okada; Sumio Kitahata; Shigeatsu Yoshikawa; Toshuki Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1981-02-07
Filing date: 1981-02-07
Publication date: 1987-11-09
Also published as: JPS57138387A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、枝つくり酵素の製造方法に関する。

アミロースのような直鎖状グルカンのα−１・
４結合に作用してアミロペクチンまたはグリコー
ゲンのようなα−１・６結合の枝分れ構造を生成
する酵素は、枝つくり酵素（Ｑ−酵素、あるいは
ブランチングエンザイム、EC2.4.1.18）と呼ば
れ古くから知られている。

この枝つくり酵素は、澱粉やグリコーゲンの合
成に関与する場合が多く、馬鈴薯、イネ種実、ト
ウモロコシ種実などの澱粉合成の活発な組織、グ
リコーゲンを含む動物の組織、大腸菌などの微生
物に存在することが知られている。このうち、馬
鈴薯と大腸菌の酵素は、高純度に精製され、その
作用特異性についてもくわしく検討されている
〔例えば、G.S.Drumond et al.、Eur.J.Biochem.
、Vol.26、168−176（1972年）、C.Boyer et al.
、Biochemistry、Vol.16、3693−3699（1977年）
参照〕。しかしながら、これらの研究は、何れも
生体中での澱粉またはグリコーゲンの生合成、代
謝を明らかにするために行なわれたものである。

本発明者らは、長年、食品製造への酵素利用の
研究を行つてきた。加工食品、なかでも澱粉質を
含有する食品の場合、澱粉の老化は、保存性の低
下、消化率の低下などをもたらしている。そし
て、澱粉の老化を防止するため食品製造に際して
糖類を添加する方法が経験的に採用されている。
しかしながら、これらの方法では、澱粉の持つ接
着性、粘性などの物性が変化し、賦形力が低下
し、甘味が増大するなどの欠点が生じる。

本発明者らは、澱粉の持つ長所を失うことな
く、澱粉の老化を防止するために枝つくり酵素を
利用することに着目し、その酵素の大量生産を目
ざして微生物を広く検索した。その結果、バチル
ス属に属する細菌バチルス・メガテリウム10−５
株が、多量の枝つくり酵素を産生することを見い
だし、本発明を完成した。

本発明の酵素は、バチルス属に属する細菌によ
つて多量に産生されること、クエン酸またはグル
コース−１−リン酸によつて活性化作用を受けな
い点で、これまでに報告されている枝つくり酵素
とは全く異なつている。

次に、本発明における枝つくり酵素の諸性質に
ついて述べる。

(1) 作用本酵素をアミロース（グルコース重合度約
500）に作用させると、還元力はほとんど生成
しないにもかかわらず、ヨウ素呈色はその作用
が進むにつれて漸次減少し、660nｍにおける
吸光度が作用前の約10％以下に低下する。

(イ) アミロースからの生成物に、細菌類化型α
−アミラーゼまたは豚膵臓α−アミラーゼを
作用させて、その作用物をペーパークロマト
グラフイーで分析すると、イソマルトシルマ
ルトースおよびさらに高重合度の分枝デキス
トリンを生じる。この結果からα−１・４結
合のアミロースからα−１・６結合を含む生
成物が生じているものと考えられる。

(ロ) アミロースからの生成物に、イソアミラー
ゼを作用させ、次いで、細菌糖化型α−アミ
ラーゼを作用させて得られる作用物をペーパ
ークロマトグラフイーで分析したが、イソマ
ルトシルマルトースは検出されなかつた。こ
れは、アミロースからの生成物に存在するα
−１・６結合がイソアミラーゼの作用により
分解されるものと考えられる。

(ハ) アミロースからの生成物に、イソアミラー
ゼを作用させると、ヨウ素呈色はその作用の
進行とともに漸次増大し、660nｍにおける
吸光度が作用前の約1.1〜10倍に増加する。
これは、イソアミラーゼによりα−１・６結
合が切断され、直鎖状デキストリンが生じる
ためと考えられる。

(ニ) アミロースからの生成物に、β−アミラー
ゼを作用させ、その分解率を測定すると、原
料アミロースの場合の約50％に低下した。こ
れは、生成したα−１・６結合によりβ−ア
ミラーゼの分解限度が低下するためと考えら
れる。

(ホ) アミロースからの生成物を、イソアミラー
ゼで分解させ、次いで、その分解物のグルコ
ース平均重合度を末端基定量法（還元力と全
糖量の割合により算出する。）で求めると約
14となり、アミロペクチンのイソアミラーゼ
分解物の場合における約21よりも、グリコー
ゲンのイソアミラーゼ分解物の場合における
約12に近かつた。また、アミロースからの生
成物を、完全メチル化した後、酸分解し、次
いでガスクロマトグラフイーを行うと、生成
物中の分枝鎖長は、グルコース平均重合度約
14と算出される。

(2) 基質特異性アミロースのほか、アミロペクチン、澱粉に
も作用する。

また、グルコース平均重合度18の低分子アミ
ロースにも作用する。

(3) 活性測定法部分的に精製し、α−アミラーゼを除去した
後の酵素液100μを、0.1％アミロース（PH
7.5、0.05Mリン酸塩緩衝液）100μに加え、
25℃で10分間作用させた後、これにＮ／300ヨ
ウ素溶液（0.004MKI、0.005N HClを含む）３
mlを加え、660nｍにおける吸光度を測定す
る。この条件で１分間に吸光度の１％を減少す
る酵素活性を１単位とする。

また、アミラーゼが存在する場合でも、例え
ば放線菌の産生するアミラーゼ阻害剤〔S.
Ueda et al.、Agr.Biol.Chem.、Vol.37(9)、
2025〜2030（1973年）〕を用いれば、本酵素は
阻害を受けないので、前記方法により容易に活
性を測定できる。

(4) 至適PHと安定PH PH４〜６は酢酸緩衝液、PH６〜８はリン酸塩
緩衝液、PH８〜10はグリシン−NaOH緩衝液を
用いる。

至適PHは、前項に述べる活性測定法のうち、
アミロース溶液のPHを変えて行なう。また、安
定PHは、酵素液を各PH緩衝液で25℃、２時間保
つた後、PH7.5に戻し、残存活性を測定する。

結果は、第１図に示す如く、本酵素の至適PH
は7.6付近であり、安定PHは6.5〜8.5である。

(5) 至適温度と温度安定性至適温度は、前述の活性測定方法のうち、温
度のみを変えて行なう。また、温度安定性は、
酵素溶液をPH7.5で各温度に10分間保つた後、
25℃で残存活性を測定する。

結果は、第２図に示す如く、本酵素の至適温
度は25℃付近であり、温度安定性は45℃付近ま
でである。

(6) 阻害、活性化および安定化亜鉛、水銀またはカドミウムの2.5×10^-3M
の存在で阻害される。

システイン残基に特異的に作用するｐ−クロ
ロマーキユリ安息香酸の10^-5Mの存在で阻害さ
れる。本酵素を活性化する物質については不明
であるが、多くの報告に見られるようなクエン
酸、グルコース−１−リン酸による活性化は見
られない。

SH還元試薬は、本酵素の安定化に効果があ
り、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタ
ノール、還元型グルタチオン、システインの順
に有効である。

また、20％グリセロールの存在下では、耐熱
性が増加する。0.1％牛血清アルブミンも若干
の効果が見られるが、カルシウム、マグネシウ
ムには耐熱性を高める効果は見られない。

(7) 精製方法通常の酵素の精製方法と同様に行うことがで
きる。

(8) 分子量シユクロース密度勾配超遠心法およびゲル
過法により測定したところ、本酵素の分子量は
70000±20000である。

(9) 結晶構造および元素分析明らかでない。

(10) 等電点焦点電気泳動法により測定すると、本酵素の
等電点はPH4.5付近である。

(11) デイスク電気泳動 7.5％ポリアクリルアミドゲル（PH9.4）を用
い、実施例１の精製酵素標品を４℃、ゲル１本
当り2.5ｍＡで２時間泳動させると、酵素活性
区分は単一であつて、ブロムフエノールブルー
に対する移動度は約0.19である。

本発明の枝つくり酵素の製造方法に用いられる
細菌は、バチルス属に属し枝つくり酵素産生能を
有す細菌であり、次に述べるバチルス・メガテリ
ウム10−５株は、本発明の目的に有効に使用する
ことができる。

バチルス・メガテリウム10−５株は、大阪市北
区の土壌から発見、分離したものであり、昭和56
年１月28日に工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託申請され、FERM−Ｐ No.5859号で受託さ
れた。

次に、バチルス・メガテリウム10−５株の菌学
的性質を記載する。

形態学的性質ａ細胞形態 (i) 肉汁寒天斜面培養（28℃、24時間）の場
合平均の大きさは（1.25〜1.5）×（２〜
４）μｍであり、両端に丸味を帯びた桿菌
で、多形性は有しない。細胞内に顆粒を有
し、異染顆粒染色法では染まらないが、脂
肪球染法により染まる。ときには、２連も
しくはそれ以上に連らなり、また非常に長
い細胞もみられる。

shadow formの形成もみられる。

(ii) グルコース肉汁寒天斜面培養（28℃、24
時間）の場合平均の大きさは（1.5〜2.0）×（2.0〜
2.5）μｍであり、両端に丸味を帯びた桿
菌で、多形性を有しない。細胞内の顆粒
は、脂肪球染色、フクシン染色により染ま
りやすくなる。普通の細胞は少し短かくな
るが、鎖状細胞は非常に長い細胞が多くな
る。

ｂ運動性、鞭毛肉汁寒天斜面培地にて、28℃で６時間培養
した場合、第３図の電子顕微鏡写真（×
10000）に示すように、よく運動する。

ｃ胞子 (i) 肉汁寒天培地、土壌浸出液寒天培地にお
いて、培養１〜２日の早い時期に形成され
る。

(ii) sporangia sporangiaに、ふくらみはほとんど見ら
れず、胞子は端よりの位置に形成される。

(iii) 胞子型、大きさ平均の大きさは（1.0〜1.5）×（1.25〜
2.5）μｍの楕円または膵臓体をしてい
る。

ｄグラム染色肉汁寒天培地にて、28℃で６時間および24
時間培養した菌は、何れも陽性である。

ｅ抗酸性肉汁寒天培地にて、28℃で24時間培養した
菌は、陰性である。

ｆカプセル（夾膜）肉汁寒天培地にて、28℃で18時間培養し、
リン−タングステン酸法にて染色し、電子顕
微鏡観察を行なつた結果、菌体の周りに影を
生じたことにより、カプセルが存在するもの
と判定する。

ｇ異染顆粒肉汁寒天培地にて、28℃で24時間培養した
菌は、陰性である。

ｈ脂肪球染色肉汁寒天培地およびグルコース肉汁寒天培
地にて、28℃で24時間培養した菌は、何れも
陽性である。

培養的性質ａ肉汁寒天平板培養（28℃、５日）菌の生育は非常に早く、５日後には４〜５
mmのコロニーとなる。コロニーは、不透明な
鈍光を帯びた黄白色の円形で、表面は平滑で
あり台状の隆起をしている。周縁は全縁で内
容は均質である。色素は形成しない。

ｂ肉汁寒天斜面培養（28℃、５日）菌の生育は非常に早く、良好である。コロ
ニーは、半透明であり、脂肪様の湿光をもつ
た平滑な表面で、黄白色をしており、外周は
少しもり上つた偏平状をなし、糸状の生育を
する。

ｃ肉汁液体培養（28℃、２日）菌の生育が早く、１日で液体はよく濁り、
粒状の生育もみられる。２日で濁りはほとん
どなくなり、大きな薄片状の沈澱を生じる。
表面にリングを形成しない。色素、ガスを生
成しない。

ｄ肉汁穿刺培養（28℃、５日）穿刺部を中心とした寒天表面に、コロニー
の形成が見られ、寒天上層部にはせん毛状の
菌の生育が見られる。

ｅ肉汁ゼラチン穿刺培養 (i) 20℃、10日、袋状に液化 (ii) 28℃、10日、液化し、冷却しても凝固し
にくくなる。

(iii) 肉汁ゼラチン寒天平面培養（28℃、５
日）で、広い分解ハローを示す。

ｆリトマスミルク（28℃、14日） (i) リトマスは青色から赤紫に、ブロムクレ
ゾールパープルは青色からうすい青黄色と
なり、酸の生成はほとんど見られない。凝
固も起きない。

(ii) ミルク寒天平面培養（28℃）で、短期間
に広い分解ハローを示す。

ｇ proteose−peptone acid agarでの生育菌はよく生育し、黄白色で表面にしわが形
成される。

ｈグルコース肉汁寒天斜面での生育肉汁寒天斜面と同様の生育がみられる。

ｉチロシン寒天での生育菌はよく生育し、表面にしわが形成される。

ｊクエン酸塩寒天での生育肉汁寒天と同様の生育が見られ、培地はピ
ンク色となり、アルカリ性を示した。

ｋ馬鈴薯楔子での生育菌はよく生育し、やわらく粘液性を示し、
水溶液中にも落下する。菌は黄色をしてお
り、表面はしわ状となる。ポテトは腐敗し、
灰白色に変色する。

ｌ大豆寒天での生育菌の生育は早く、良好である。コロニーは
不透明で、湿光をもつたしわ状の表面で、黄
白色をしており、台状で糸状の生育が見られ
る。

ｍグルコース・アスパラギン寒天での生育肉汁寒天と同様の生育が見られ、コロニー
は白色をしている。

ｎ tomato−yeast milkでの生育可溶化（peptonize）する。

生理的性質ａ硝酸塩の還元陽性ｂ脱窒反応ガス生成なく生育する。

ｃ MR試験陰性ｄ VP反応陰性ｅインドールの生成陰性ｆ硫化水素の生成陽性ｇデンプンの分解陽性ｈクエン酸の利用陽性ｉ無機窒素源の利用アンモニウム塩、硝酸塩ともに利用できる。

ｊ色素の生成ミルク寒天培地、馬鈴薯楔子での生育で、
黄色色素を生成する。

土壌抽出液を含む胞子形成培地での生育
で、灰白色色素を生成する。

ｋウレアーゼ陽性ｌカタラーゼ陽性ｍ生育の範囲 PH5.5〜9.3で生育し、生育最適PHは７附近
である。また、10〜40℃で生育し、生育最適
温度は30℃附近である。45℃では生育しな
い。

ｎ酸素に対する態度好気性ｏＯ−Ｆテスト（Hugh−Leifson）試験陰
性ｐ糖類からの酸およびガスの生成（28℃、14
日）ソルビトール、ラムノースからは酸を生成
しないが、アラビノース、キシロース、グル
コース、シユクロース、ラクトース、マンニ
トール、グリセロールから酸を生成する。

また、前記の何れの糖類からもガスの生成
は認められない。

ｑセルロースの分解陰性本菌株は、上述の菌学的性質からバージーズ・
マニユアル・オブ・デタミネイテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey´s Mannual of Determinative
Bacteriology）第７版および第８版に基づき、バ
チルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
であると同定した。

本発明の枝つくり酵素を製造するための培養
は、細菌の通常の培養方法に準じて液体培養、固
体培養などが行なわれる。液体培養の場合には、
静置培養でもよいが、振とう培養または通気撹拌
培養の方が好ましい。培養に用いられる培地とし
ては、バチルス属に属する細菌が必要とする栄養
源を含有するものであれば、合成培地、半合成培
地、または天然培地を自由に用いることができ
る。特に、本発明の酵素の生産量を増大させるた
めには、シユクロース、アミロース、澱粉、澱粉
部分分解物などの糖を含有する培地を用いること
が好ましい。一般には、PHを中性ないし微アルカ
リ性にした培地に、バチルス属に属する細菌を植
菌し、20〜35℃で、１〜５日間培養する。

以上のようにして得た培養物は、そのまま用い
るか、または菌体もしくは上清から粗酵素液さら
には精製酵素液とし、必要に応じて、例えば凍結
乾燥法などによつて粉末酵素を製造して使用す
る。

このようにして調整した枝つくり酵素は、食品
製造に使用される澱粉質に作用させ、得られる加
工食品の保存性の向上、消化率の向上のみなら
ず、品質の改善に大きく寄与することができる。

次に、実施例について述べる。

実施例１シユクロース2.0w／ｖ％、ポリペプトン
1.0w／ｖ％、肉エキス0.5w／ｖ％、リン酸２カ
リウム0.1w／ｖ％、塩化ナトリウム0.1w／ｖ
％、硫酸マグネシウム0.03w／ｖ％、炭酸カルシ
ウム（別滅菌）0.5w／ｖ％および水からなる培
養液（PH7.0）の15にバチルス・メガテリウム
10−５株FERM−Ｐ No.5859を植菌し、28℃で
48時間、通気撹拌培養した。培養物を遠心分離
（3000×ｇ）し、得られた菌体を超音波処理によ
り破砕した後、遠心分離（10000×ｇ）し、上清
（粗酵素液）約1.7を得た。本液には、ml当り約
9.6単位の枝つくり酵素を含有していた。

本酵素の精製は、硫酸アンモニウムを加え、飽
和度0.3〜0.65の沈澱画分を集め、５ｍM2−メル
カプトエタノールを含む10ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH7.5）に溶解し、同緩衝液で透析した後、
DEAE−セフアデツクスＡ−50カラムに吸着さ
せ、塩化ナトリウム濃度を高めた同緩衝液で溶出
させて活性画分を集め、同緩衝液で透析した後、
４−アミノ・ブチル−セフアロース4Bカラムク
ロマトグラフイーで活性画分を集めて行なつた。

得られた精製酵素は、粗酵素液に対して約2000
倍の比活性を有し、活性収率は約30％であつた。
本精製酵素を、アミロース（平均グルコース重合
度500）に作用させた時のヨウ素呈色の低下およ
びアミロースからの生成物にイソアミラーゼを作
用させた時のヨウ素呈色の増加の様子を第４図に
示す。

第４図から明らかなように、枝つくり酵素の作
用により、660nｍにおける吸光度は、作用前の
約10％以下に低下し、またアミロースからの生成
物にイソアミラーゼを作用させることにより、
660nｍにおける吸光度は、作用前の約1.1〜10倍
に増加する。

実施例２液化澱粉（D.E.2.0）2.5w／ｖ％、コーンステ
イープリカー0.5w／ｖ％、脱脂大豆0.2w／ｖ
％、酵母エキス0.1w／ｖ％、塩化アンモニウム
0.3w／ｖ％、リン酸２カリウム0.1w／ｖ％、硫
酸マグネシウム・７水塩0.04w／ｖ％、水および
炭酸カルシウム0.5w／ｖ％、（別滅菌）からなる
培養液（PH7.0）の18にバチルス・メガテリウ
ム10−５株FERM−Ｐ No.5859を植菌し、35℃
で40時間、通気撹拌培養した。培養物を25℃の嫌
気化に３日間保つて自己消化させた後、この液の
枝つくり酵素活性を、アミラーゼ阻害剤の存在下
で測定したところ、ml当り約18.6単位であつた。

【図面の簡単な説明】

図において、第１図は、PHと相対活性の関係を
示す線図であり、実線が枝つくり酵素の至適PH、
破線がそのPH安定性を示す。第２図は、温度と相
対活性の関係を示す線図であり、実線が枝つくり
酵素の至適温度、破線がその温度安定性を示す。
第３図は、バチルス・メガテリウム10−５株の細
胞を電子顕微鏡で10000倍に拡大した写真であ
る。第４図は、反応時間と相対吸光度の関係を示
す線図であり、実線がアミロースへの枝つくり酵
素の作用、破線が枝つくり酵素による生成物への
イソアミラーゼの作用を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１バチルス属に属し枝つくり酵素産生能を有す
る細菌を、栄養培地で培養して枝つくり酵素を生
成せしめ、これを採取することを特徴とする枝つ
くり酵素の製造方法。