CN107849081A - 甜菊醇糖苷组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物，所述组合物包含不超过150ppm的量的贝壳杉烯酸。本发明还涉及制备甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括：提供甜菊醇糖苷组合物；将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；以及从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物，其中在pH7.0或以下进行所述结晶。本发明还涉及降低甜菊醇糖苷组合物的贝壳杉烯酸含量的方法，所述方法包括：提供包含贝壳杉烯酸的甜菊醇糖苷组合物；将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；以及从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物，其中在pH7.0进行所述结晶，从而减少所述甜菊醇糖苷组合物中贝壳杉烯酸的量。

Description

甜菊醇糖苷组合物
发明领域
本发明涉及包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物。本发明还涉及制备甜菊醇糖苷组合物的方法。
发明背景
多年生草本植物甜叶菊(Stevia rebaudiana Bert.)的叶子积聚大量被称为甜菊醇糖苷的具有强烈甜味的化合物。虽然这些化合物的生物功能尚不清楚，但它们作为替代性高效甜味剂具有商业意义。
这些甜的甜菊醇糖苷的功能和感官特性表现为优于许多高效甜味剂的功能和感官特性。此外，研究表明甜菊苷能够降低II型糖尿病患者的血糖水平，并且能够降低轻度高血压患者的血压。
甜菊醇糖苷积聚在甜叶菊叶中，其中它们可占叶干重的10％至20％。甜菊苷和莱鲍迪甙A均是热和pH稳定的，并且适用于碳酸饮料和许多其他食物。甜菊苷比蔗糖甜110与270倍之间，莱鲍迪甙A比蔗糖甜150与320倍之间。此外，莱鲍迪甙D也是在甜叶菊叶中积聚的高效二萜糖苷甜味剂。它可比蔗糖甜约200倍。莱鲍迪甙M是另一种高效二萜糖苷甜味剂。它在某些甜叶菊品种叶中以痕量存在，但已表明其具有优异的味道特征。
传统上已从甜叶菊植物中提取了甜菊醇糖苷。在甜叶菊中，(-)-贝壳杉烯酸(赤霉酸(GA)生物合成中的中间体)被转化成四环二萜甜菊醇，其然后通过多步糖基化途径进行以形成各种甜菊醇糖苷。然而，产率可以是可变的，并且受到农业和环境条件的影响。此外，甜叶菊种植需要大量的土地面积、在收获前的很长时间、密集劳动以及用于提取和纯化糖苷的额外成本。
因此，最近，使用发酵工艺生产甜菊醇糖苷的兴趣日益增长。WO2013/110673和WO2015/007748中描述了可用于产生至少甜菊醇糖苷莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D和莱鲍迪甙M的微生物。
需要从这种发酵工艺中分离甜菊醇糖苷的方法，例如考虑到可能不存在于甜菊醇糖苷的植物来源组合物中的发酵液中化合物的积累。
发明概述
本发明基于鉴定从例如发酵液中回收甜菊醇糖苷的方法，其中得到的甜菊醇糖苷组合物包含少量贝壳杉烯酸或不含贝壳杉烯酸。
因此，本发明涉及包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物，所述组合物包含贝壳杉烯酸。然而，贝壳杉烯酸的存在量不超过约150ppm，例如不超过约100ppm，优选量不超过约10ppm。也就是说，本发明涉及包含一种或多种甜菊醇糖苷和贝壳杉烯酸的组合物，其中贝壳杉烯酸的量不超过约150ppm，例如不超过约100ppm，优选量不超过约10ppm。
通常，组合物包含大量(例如至少约95干重％)的一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
本发明还涉及：
-一种用于制备(例如纯化)甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括从包含甜菊醇糖苷的溶液中结晶甜菊醇糖苷，其中所述结晶在约pH7.0或以下进行；
-一种用于降低甜菊醇糖苷组合物的贝壳杉烯酸含量的方法，所述方法包括从包含甜菊醇糖苷和贝壳杉烯酸的溶液中结晶甜菊醇糖苷，其中所述结晶在pH7.0或以下进行；
-一种用于制备(例如纯化)甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括：
提供甜菊醇糖苷组合物；
将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；和
从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物，其中所述结晶在pH7.0或以下进行；以及
-一种用于降低甜菊醇糖苷组合物的贝壳杉烯酸含量的方法，所述方法包括：
提供包含贝壳杉烯酸的甜菊醇糖苷组合物；
将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；和
从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物，
其中所述结晶在pH7.0下进行，从而降低甜菊醇糖苷组合物中贝壳
杉烯酸的量。
此外，本发明涉及通过本发明的方法能够获得的甜菊醇糖苷组合物。
发明详述
在本说明书和所附权利要求书中，词语“包含”、“包括”和“具有”以及变化形式应被解释为包含性的。也就是说，这些词语意图表达在上下文允许的情况下可包含未具体叙述的其他要素或整数。
不使用数量词修饰时在本文中用于指代一个或一个以上(即一个或至少一个)的语法对象。举例来说，“要素”可意指一个要素或多于一个要素。
在本文中，甜菊醇糖苷组合物是指包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物，而甜菊醇糖苷溶液是包含一种或多种甜菊醇糖苷的溶液。
本发明涉及纯化甜菊醇糖苷的方法，例如从包含由微生物产生的一种或多种甜菊醇糖苷的发酵液中纯化甜菊醇糖苷的方法。所述微生物通常可以是重组微生物，其经修饰使得其能够产生一种或多种甜菊醇糖苷。本发明还涉及通过这种方法产生的组合物。
本发明的组合物包含一种或多种甜菊醇糖苷。另外，本发明的组合物包含贝壳杉烯酸。然而，所述组合物包含不超过约150ppm，例如不超过约100ppm的量的贝壳杉烯酸。也就是说，本发明的组合物包含最高至多约150ppm，例如不超过约100ppm的非零量的贝壳杉烯酸。
本发明的组合物可以包含至多约90ppm，至多约80ppm，至多约70ppm，至多约60ppm，至多约50ppm，至多约40ppm，至多约30ppm，至多约20ppm，至多约10ppm，至多约5ppm或更少的贝壳杉烯酸。
本发明组合物中贝壳杉烯酸的最少量可以为至少0.1ppm，至少0.5ppm或至少1ppm。
因此，本发明的组合物可包含0.1ppm至150ppm的贝壳杉烯酸，0.1ppm至100ppm的贝壳杉烯酸，0.1ppm至50ppm的贝壳杉烯酸，0.1ppm至10ppm的贝壳杉烯酸，0.5ppm至150ppm的贝壳杉烯酸，0.5ppm至100ppm的贝壳杉烯酸，0.5ppm至50ppm的贝壳杉烯酸，0.5ppm至10ppm的贝壳杉烯酸，1ppm至150ppm的贝壳杉烯酸，1ppm至100ppm的贝壳杉烯酸，1ppm至50ppm的贝壳杉烯酸或1ppm至10ppm的贝壳杉烯酸。
贝壳杉烯酸可以以糖基化的贝壳杉烯酸化合物的形式存在于本发明的组合物中。贝壳杉烯酸的量可以用贝壳杉烯酸本身以及以任何糖基化的贝壳杉烯酸化合物的形式存在的贝壳杉烯酸的总量来表示。
或者，以ppm表示的量可以表示为mg/kg，其中1ppm相当于1mg/kg。
本发明的组合物可包含莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙M、甜菊苷、杜克苷A、甜茶苷或甜菊双糖苷中的一种或多种。
本发明的组合物可以包含基于干重至少80％的一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。本发明的组合物可以包含基于干重至少85％的一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。本发明的组合物可以包含基于干重至少90％的一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。本发明的组合物可以包含基于干重至少95％的一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。本发明的组合物可以包含基于干重至少97％的一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。本发明的组合物可以包含基于干重至少98％的一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙莱鲍迪M。本发明的组合物可以包含基于干重至少99％的一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
基于干重，在本发明组合物中的存在量为至少80％的一种甜菊醇糖苷可以是莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙M、甜菊苷、杜克苷A、甜茶苷或甜菊双糖苷中的任何一种。优选地，甜菊醇糖苷是莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
因此，本发明的组合物可以包含莱鲍迪甙A，其量基于干重计至少80％，基于干重计至少85％，基于干重计至少90％，基于干重计至少95％，基于干重计至少97％，基于干重计至少98％或基于干重计至少99％的至少一种甜菊醇糖苷，以及另外非零量的最高至多约150ppm的量，例如至多约100ppm，例如至多约10ppm的贝壳杉烯酸。
因此，本发明的组合物可以包含莱鲍迪甙D，其量基于干重计至少80％，基于干重计至少85％，基于干重计至少90％，基于干重计至少95％，基于干重计至少97％，基于干重计至少98％或基于干重计至少99％的至少一种甜菊醇糖苷，以及另外非零量的最高至多约150ppm的量，例如至多约100ppm，例如至多约10ppm的贝壳杉烯酸。
因此，本发明的组合物可以包含莱鲍迪甙M，其量基于干重计至少80％，基于干重计至少85％，基于干重计至少90％，基于干重计至少95％，基于干重计至少97％，基于干重计至少98％或基于干重计至少99％的至少一种甜菊醇糖苷，以及另外非零量的最高至多约150ppm的量，例如至多约100ppm，例如至多约10ppm的贝壳杉烯酸。
制备(例如纯化)本发明所提供的甜菊醇糖苷组合物的方法包括从包含甜菊醇糖苷的溶液中结晶甜菊醇糖苷。该方法通常旨在纯化现有甜菊醇糖苷组合物，特别地至少降低贝壳杉烯酸含量。
该方法包括在pH7.0或以下进行结晶的步骤。该步骤允许贝壳杉烯酸的量显著减少。在更高pH下结晶不能使贝壳杉烯酸的量有这样的减少。
因此，本发明的方法可以包括：
提供甜菊醇糖苷组合物(第一甜菊醇糖苷组合物)；
将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；
以及从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物(第二甜菊醇糖苷组合物)，其中在pH7.0或以下进行结晶。
这种方法中产生的甜菊醇糖苷组合物(第二甜菊醇糖苷组合物)包含比起始(第一)甜菊醇糖苷组合物更少的贝壳杉烯酸。
因此，本发明提供了一种降低甜菊醇糖苷组合物中贝壳杉烯酸的量的方法，所述方法通过在pH7.0或以下从包含甜菊醇糖苷的溶液中结晶甜菊醇糖苷进行。
所述方法可以包括：
提供包含贝壳杉烯酸的甜菊醇糖苷组合物(第一甜菊醇糖苷组合物)；
将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；和
从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物(第二甜菊醇糖苷组合物)，其中在pH7.0进行结晶，从而减少甜菊醇糖苷组合物(第一甜菊醇糖苷组合物)中贝壳杉烯酸的量。
这种方法中产生的甜菊醇糖苷组合物(第二甜菊醇糖苷组合物)包含比起始(第一)甜菊醇糖苷组合物更少的贝壳杉烯酸。
这种方法中的结晶步骤可以在pH6.0或更低，pH5.0或更低，pH4.0或pH约3.8下进行。
本发明的方法可以包括结晶低纯度甜菊醇糖苷组合物。低纯度甜菊醇糖苷组合物可包含基于干重至多约60％、至多约70％或至多约80％的给定甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。这种甜菊醇糖苷组合物的其余部分通常包含其他甜菊醇糖苷和杂质(包括贝壳杉烯酸)。通常，低纯度甜菊醇糖苷组合物可以含有从约80重量％或从约90重量％的甜菊醇糖苷。
通常，在本发明的方法中，将甜菊醇糖苷组合物(例如低纯度甜菊醇糖苷组合物)与有机溶剂组合以形成低纯度甜菊醇糖苷溶液。有机溶剂任选地可以进一步包含至多为约25重量％的水。例如，在一些具体的实施方式中，有机溶剂可以进一步包含约3重量％至约20重量％的量的水。有机溶剂的非限制性实例包括醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯。本文所用的醇是指任何直链、支链或环状的；取代或未取代的与至少一个羟基部分连接的烷基、烯基或炔基。醇的非限制性实例包括乙醇、甲醇、异丙醇、1-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇和异丁醇。
特别地，有机溶剂可以包含水和至少一种有机溶剂的混合物。在另一个示例性实施方式中，所述至少一种有机溶剂包含醇，所述醇包含乙醇、甲醇或其混合物。
甜菊醇糖苷溶液可以以约15份至约4份溶剂：约1份甜菊醇糖苷的重量比包含溶剂和甜菊醇糖苷组合物。
根据本发明的结晶可以在任何合适的温度下进行。结晶可以进一步包括冷却甜菊醇糖苷溶液。通常，可以将甜菊醇糖苷溶液冷却至适于从甜菊醇糖苷溶液中沉淀甜菊醇糖苷的温度。
甜菊醇糖苷溶液的结晶可以进行足够长的时间以从甜菊醇糖苷溶液获得甜菊醇糖苷组合物的期望产率。例如，甜菊醇糖苷溶液的结晶可以进行约0.5小时至约120小时(5天)，约12小时至约96小时(4天)，约24小时(1天)至约72小时(3天)或者介于之间的任何时间长度。
在结晶低纯度甜菊醇糖苷溶液之后，可以获得包含例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M的较高纯度的甜菊醇糖苷组合物，例如基本上纯的甜菊醇糖苷组合物。“基本上纯的甜菊醇糖苷组合物”在本文中用于指包含约95重量％或更多(以干基计)甜菊醇糖苷的组合物。
甜菊醇糖苷组合物的总产率可以为例如约25％或更高。产率在本文中通常用于指相对于起始质量获得的质量。
本发明方法可以进一步包括在开始结晶甜菊醇糖苷溶液之后接种(seeding)低纯度甜菊醇糖苷溶液。通常可以在与允许进行结晶的温度相同的温度下进行接种。
接种低纯度甜菊醇糖苷溶液通常可以如下进行：例如，通过向甜菊醇糖苷溶液中加入莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M的基本上纯的晶体，其量足以促进莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M和其他甜菊醇糖苷的沉淀。足以促进沉淀的量通常可包含量为低纯度甜菊醇糖苷溶液的约0.0001重量％至约1重量％、约0.01重量％至约1重量％或其间的任何量的基本上纯的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M组合物。
本发明方法可以进一步包括在结晶之后分离和洗涤甜菊醇糖苷组合物。可通过利用离心力的各种固液分离技术将甜菊醇糖苷组合物与其上清液分离，所述固液分离技术包括但不限于垂直和水平的多孔篮式离心机、无孔转鼓离心机、沉降式离心机、刮刀式离心机、推料式离心机、海因克尔型离心机、碟片式离心机和漩涡分离。另外，可通过任何压力、真空或重力过滤方法来增强分离，所述方法包括但不限于使用带、鼓、Nutsche式、叶片、板、罗森蒙德式、Sparkler式和袋式过滤器以及压滤机。固液分离装置的操作可以是连续模式、半连续模式或分批模式。也可使用多种有机溶剂及其混合物在分离装置上洗涤甜菊醇糖苷组合物，并可使用任何数量的气体(包括但不限于氮气或氩气)在分离装置上部分或完全干燥以蒸发残余的液体溶剂。可以使用液体、气体或机械方法，通过溶解固体或保持固体形式，从分离装置中自动或手动移除甜菊醇糖苷组合物。
本发明方法可以进一步包括干燥甜菊醇糖苷组合物。用于干燥这种组合物的合适方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于使用旋转式真空干燥器、流化床干燥器、旋转式隧道式干燥器、板式干燥器、盘架干燥器、Nauta式干燥器、喷雾干燥器、闪蒸干燥机、微米干燥机、盘式干燥机、高低速桨式干燥机和微波干燥机。在一个示例性实施方式中，在约40℃至约60℃的温度范围内，使用氮气或氩气吹扫干燥甜菊醇糖苷组合物持续约5小时至约5天、约1天至约4天、约2天至约3天或其间的任何时间长度，以除去残余溶剂。
本发明的方法允许获得这样的甜菊醇糖苷组合物(上述第二甜菊醇糖苷组合物)，其包含不超过约150ppm，不超过约100ppm，不超过90ppm，不超过约80ppm，不超过约70ppm，不超过约60ppm，不超过约50ppm，不超过约40ppm，不超过约30ppm，不超过约20ppm，不超过约10ppm或更少的量的贝壳杉烯酸。
组合物可以包含非零量的贝壳杉烯酸，例如至少0.1ppm、至少0.5ppm或至少1ppm的贝壳杉烯酸。
在本发明的方法中，可以发酵产生一种或多种甜菊醇糖苷(在起始或第一甜菊醇糖苷组合物中)。也就是说，待纯化的甜菊醇糖苷组合物可以是来自发酵培养液的甜菊醇糖苷组合物。可以使发酵液在根据本发明的方法结晶之前经受固/液分离、细胞破坏步骤、色谱步骤、浓缩步骤和干燥步骤中的一个或多个。
由本发明方法得到的甜菊醇糖苷组合物可包含一种或多种莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙M、甜菊苷、杜克苷A、甜茶苷或甜菊双糖苷中的任何一种。
由本发明方法得到的甜菊醇糖苷组合物可包含基于干重至少80％的至少一种甜菊醇糖苷，例如基于干重至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的至少一种甜菊醇糖苷，例如莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
本发明中使用的甜菊醇糖苷可以发酵产生，例如从能够生产甜菊醇糖苷的重组宿主获得。例如，合适的重组宿主可以能够产生例如甜菊醇-13-单糖苷、甜菊醇-19-单糖苷、13-[(β-D-吡喃葡萄糖基)氧基)贝壳杉-16-烯-18-酸2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基酯、甜茶苷、甜菊苷、杜克苷A、甜菊醇-19-双糖苷、甜菊双糖苷、rebA、rebB、rebC、rebE、rebD、rebF或rebM中的一种或更多种。
合适的重组宿主可包含编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)活性的一种或多种多肽的一种或多种重组核酸序列。
出于本发明的目的，具有UGT活性的多肽是具有糖基转移酶活性(EC 2.4)的多肽，即可以充当催化剂以将单糖单元从活化的核苷酸糖(又称“糖基供体”)转移到糖基受体分子(通常是醇)的多肽。UGT的糖基供体典型地是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖(尿嘧啶-二磷酸葡萄糖，UDP-葡萄糖)。
可以选择这种另外的UGT以产生期望的甜菊醇糖苷。Humphrey等人,PlantMolecular Biology(2006)61:47-62和Mohamed等人,J.Plant Physiology 168(2011)1136-1141中示出了甜菊醇糖苷形成的示意图。另外，图1示出了甜菊醇糖苷形成的示意图。
因此，重组宿主可包含一个或多个编码以下项中的一种或多种的重组核酸序列：
(i)具有UGT74G1活性的多肽；
(ii)具有UGT2活性的多肽；
(ii)具有UGT85C2活性的多肽；和
(iii)具有UGT76G1活性的多肽。
重组宿主可包含编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列。也就是说，适用于本发明方法的重组酵母可包含能够催化将甜菊醇转化为甜菊醇单糖苷的反应的UGT。
这种重组宿主可包含编码具有由UDP-糖基转移酶(UGT)UGT85C2所示活性的多肽的核苷酸序列，其中酵母转化后核苷酸序列赋予所述酵母将甜菊醇转化为甜菊醇单糖苷的能力。
UGT85C2活性是将葡萄糖单元转移至甜菊醇的13-OH。因此，合适的UGT85C2可充当尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-OH转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-O-糖苷13-OH转移酶。功能性UGT85C2多肽还可催化葡糖基转移酶反应，所述反应利用除甜菊醇和甜菊醇-19-O-糖苷以外的甜菊醇糖苷底物。此类序列在本文中可被称为UGT1序列。
重组宿主可以包含编码具有UGT2活性的多肽的核苷酸序列.
具有UGT2活性的多肽是充当尿苷5'-二磷酸葡萄糖基:甜菊醇-13-O-糖苷转移酶(又称甜菊醇-13-单葡萄糖苷1,2-转葡萄糖基酶)的多肽，其将葡萄糖部分转移到受体分子甜菊醇-13-O-糖苷的13-O-葡萄糖的C-2'。通常，合适的UGT2多肽还充当将葡萄糖部分转移到受体分子甜茶苷的13-O-葡萄糖的C-2'的尿苷5'-二磷酸葡萄糖基:甜茶苷转移酶。
具有UGT2活性的多肽也可以催化利用除甜菊醇-13-O-糖苷和甜茶苷以外的甜菊醇糖苷底物的反应，例如，功能性UGT2多肽可利用甜菊苷作为底物，从而将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱鲍迪甙E。功能性UGT2多肽也可以利用莱鲍迪甙A作为底物，从而将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱鲍迪甙D。然而，功能性UGT2多肽通常不将葡萄糖部分转移至在C-13位具有1,3-结合的葡萄糖的甜菊醇化合物，即将葡萄糖部分转移至甜菊醇1,3-双糖苷和1,3-甜菊苷通常不会发生。
具有UGT2活性的多肽也可以从除尿苷二磷酸葡萄糖以外的供体转移糖部分。例如，具有UGT2活性的多肽充当尿苷5'-二磷酸D-木糖基:甜菊醇-13-O-糖苷转移酶，其将木糖部分转移至受体分子甜菊醇-13-O-糖苷的13-O-葡萄糖的C-2'。作为另一个实例，具有UGT2活性的多肽可充当尿苷5'-二磷酸L-鼠李糖基:甜菊醇-13-O-糖苷转移酶，其将鼠李糖部分转移至受体分子甜菊醇的13-O-葡萄糖的C-2'。
重组宿主可以包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列，可以包含编码能够催化将C-19-葡萄糖添加到甜菊双糖苷的多肽的核苷酸序列。也就是说，重组宿主可以包含能够催化将甜菊双糖苷转化为甜菊苷的反应的UGT。因此，这种重组宿主可能够将甜菊双糖苷转化为甜菊苷。这种核苷酸序列的表达可以赋予重组酵母产生至少甜菊苷的能力。
因此，重组宿主可以还包含编码具有由UDP-糖基转移酶(UGT)UGT74G1所示活性的多肽的核苷酸序列，其中转化酵母后所述核苷酸序列赋予细胞将甜菊双糖苷转化为甜菊苷的能力。
合适的UGT74G1多肽可以能够将葡萄糖单元分别转移至甜菊醇的13-OH或19-COOH。合适的UGT74G1多肽可充当尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇19-COOH转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-O-糖苷19-COOH转移酶。功能性UGT74G1多肽还可催化使用除甜菊醇和甜菊醇-13-O-糖苷以外的甜菊醇糖苷底物或者从除尿苷二磷酸葡萄糖以外的供体转移糖部分的糖基转移酶反应。此类序列在本文中可被称为UGT3序列。
重组宿主可包含编码能够催化甜菊苷的C-13位置处的葡萄糖的C-3'的葡糖基化的多肽的核苷酸序列。也就是说，适用于本发明方法的重组酵母可包含UGT，所述UGT能够催化甜菊苷转化至莱鲍迪甙A的反应。因此，这种重组酵母可以能够将甜菊苷转化为莱鲍迪甙A。这种核苷酸序列的表达可赋予酵母产生至少莱鲍迪甙A的能力。
因此，重组宿主可以还包含编码具有由UDP-糖基转移酶(UGT)UGT76G1所示活性的多肽的核苷酸序列，其中转化后所述核苷酸序列赋予酵母将甜菊苷转化为莱鲍迪甙A的能力。
合适的UGT76G1向受体分子甜菊醇1,2糖苷的C-13-O-葡萄糖的C-3'添加葡萄糖部分。因此，UGT76G1例如充当尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-O-1,2葡糖苷C-3'葡糖基转移酶和尿苷5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-O-葡萄糖、13-O-1,2双糖苷C-3'葡糖基转移酶。功能性UGT76G1多肽还可催化葡糖基转移酶反应，所述反应使用含有除葡萄糖以外的糖的甜菊醇糖苷底物，例如甜菊醇鼠李糖苷和甜菊醇木糖苷。此类序列在本文中可被称为UGT4序列。UGT4可以替代地或者另外地能够将RebD转化为RebM。
重组宿主通常包含编码至少一种具有UGT1活性的多肽、至少一种具有UGT2活性的多肽、至少一种具有UGT3活性的多肽和至少一种具有UGT4活性的多肽的核苷酸序列。这些核酸序列中的一种或多种可以是重组的。给定的核酸可以编码具有一种或多种上述活性的多肽。例如，核酸编码具有两种、三种或四种上述活性的多肽。优选地，用于本发明方法的重组酵母包含UGT1、UGT2和UGT3以及UGT4活性。合适的UGT1、UGT2、UGT3和UGT4序列在WO2015/007748的表1中进行了描述。
重组宿主可包含两种或更多种编码具有任何一种UGT活性(例如UGT1、UGT2、UGT3或UGT4活性)的多肽的核酸序列。当重组宿主包含两种或更多种编码具有任何一种UGT活性的多肽的核酸序列时，这些核酸序列可以相同或不同，和/或可以编码相同或不同的多肽。特别地，重组宿主可包含编码两种不同UGT2多肽的核酸序列。
重组宿主可以包含一个或多个编码以下项中的一种或多种的重组核苷酸序列：
具有对映-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；
具有对映-贝壳杉烯合酶活性的多肽；
具有对映-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；以及
具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽。
出于本发明的目的，具有对映-柯巴基焦磷酸合酶(EC 5.5.1.13)的多肽能够催化化学反应：
所述酶具有一种底物，香叶基香叶基焦磷酸；以及一种产物，对映-柯巴基焦磷酸。所述酶参与赤霉素生物的合成。所述酶属于异构酶家族，特别是分子内裂解酶的类别。所述酶类别的系统名称是对映-柯巴基-二磷酸裂解酶(脱环)。通常使用的其他名称包括具有对映-柯巴基焦磷酸合酶、对映-贝壳杉烯合酶A和对映-贝壳杉烯合成酶A。
编码对映-柯巴基焦磷酸合酶的合适核酸序列可例如包含在WO2015/007748的SEQID.NO:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184中列出的序列。
出于本发明的目的，具有对映-贝壳杉烯合酶活性(EC 4.2.3.19)的多肽是能够催化以下化学反应的多肽：
因此，所述酶具有一种底物，对映-柯巴基二磷酸；以及两种产物，对映-贝壳杉烯和二磷酸。
所述酶属于裂解酶家族，特别是作用于磷酸盐/酯的碳-氧裂解酶。所述酶类别的系统名称是对映-柯巴基二磷酸二磷酸-裂解酶(环化，对映-贝壳杉烯形成)。常用的其它名称包括对映-贝壳杉烯合酶B、对映-贝壳杉烯合成酶B、对映-柯巴基-二磷酸二磷酸-裂解酶和(环化)。所述酶参与双萜类生物合成。
编码对映-贝壳杉烯合酶的合适核酸序列可例如包含在WO2015/007748的SEQID.NO:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184中列出的序列。
对映-柯巴基二磷酸合酶还可具有与相同蛋白质分子相关联的不同对映-贝壳杉烯合酶活性。由对映-贝壳杉烯合酶催化的反应是赤霉素的生物合成途径中的下一步骤。两种类型的酶活性是不同的，并且定点诱变以抑制蛋白质的对映-贝壳杉烯合酶活性导致对映-柯巴基焦磷酸的积累。
因此，本发明的重组宿主中使用的单个核苷酸序列可编码具有对映-柯巴基焦磷酸合酶活性和对映-贝壳杉烯合酶活性的多肽。或者，两种活性可被两个不同的分离的核苷酸序列编码。
出于本发明的目的，具有对映-贝壳杉烯氧化酶活性(EC 1.14.13.78)的多肽是能够催化对映-贝壳杉烯的4-甲基的三次连续氧化以产生贝壳杉烯酸的多肽。这种活性通常需要细胞色素P450的存在。
编码对映-贝壳杉烯氧化酶的合适核酸序列可例如包含在WO2015/007748的SEQID.NO:21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186中列出的序列。
出于本发明的目的，具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性(EC 1.14.13)的多肽是能够催化使用NADPH和O2形成甜菊醇(对映-贝壳杉-16-烯-13-醇-19-酸)的多肽。这种活性也可称为对映-贝壳杉烯酸13-羟化酶活性。
编码贝壳杉烯酸13-羟化酶的合适核酸序列可例如包含在WO2015/007748的SEQID.NO:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185中列出的序列。
重组宿主可包含编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的重组核酸序列。也就是说，本发明的重组宿主可能够表达编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列。出于本发明的目的，具有NADPH-细胞色素P450还原酶活性(EC1.6.2.4；也称为NADPH:高铁血红蛋白氧化还原酶、NADPH:血红素蛋白氧化还原酶、NADPH:P450氧化还原酶、P450还原酶、POR、CPR、CYPOR)的多肽通常是一种这样的多肽，其为膜结合酶，从而允许电子从含有FAD和FMN的酶NADPH:细胞色素P450还原酶(POR；EC 1.6.2.4)转移至真核细胞的微粒体中的细胞色素P450。
在重组宿主中，可上调宿主产生香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的能力。在本发明的上下文中上调意味着重组宿主比等同的非重组宿主产生更多的GGPP。
因此，重组宿主可包含编码羟甲基戊二酰基-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合成酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的一个或多个核苷酸序列，由此宿主转化后所述核苷酸序列赋予宿主产生提高水平的GGPP的能力。因此，根据本发明的重组宿主可包含编码羟甲基戊二酰基-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合成酶和香叶基香叶基二磷酸合酶中的一种或多种的一个或多个重组核酸序列。
因此，重组宿主可包含编码以下中的一种或多种的核酸序列：
具有羟甲基戊二酰基-辅酶A还原酶活性的多肽；
具有法尼基-焦磷酸合成酶活性的多肽；和
重组宿主可以是例如多细胞生物或其细胞或单细胞生物。宿主可以是原核、古细菌或真核宿主细胞。
原核宿主细胞可以是但不限于细菌宿主细胞。真核宿主细胞可以是但不限于酵母、真菌、变形虫、藻类、动物、昆虫宿主细胞。
真核宿主细胞可以是真菌宿主细胞。“真菌”包括真菌(Eumycotina)亚门的所有物种(Alexopoulos,C.J.,1962,在Introductory Mycology,John Wiley&Sons,Inc.(约翰威立出版有限公司),纽约)。因此，术语真菌包括丝状真菌和酵母等等。
“丝状真菌”在本文中定义为真核微生物，其包括真菌和卵菌亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人，1995，同上所定义)。丝状真菌是以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖以及其它复合多糖构成的菌丝壁为特征。营养体生长是通过菌丝延长，并且碳代谢是专性需氧的。丝状真菌菌株包括但不限于以下各项的菌株：枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、伞菌属(Agaricus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、棒囊壳属(Corynascus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、网孢菌属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、红曲霉属(Monascus)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、被孢霉属(Mortierella)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、平革菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、密孔菌属(Pycnoporus)、根霉菌属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、粪壳菌属(Sordaria)、踝节菌属(Talaromyces)、篮状菌属(Rasmsonia)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)以及木霉属(Trichoderma)。可充当宿主细胞的优选丝状真菌菌株属于以下物种：黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、桔青霉(Penicillium citrinum)、枝顶孢霉(Acremonium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、埃默森篮状菌(Rasamsonia emersonii)(先前称为埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii))、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophtora thermophyla)。用于比较转化和未转化细胞的发酵特征的参考宿主细胞包括例如黑曲霉CBS120.49、CBS 513.88；米曲霉ATCC16868、ATCC 20423、IF0 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC11601、ATCC12892；烟曲霉AF293(CBS101355)；产黄青霉CBS 455.95；桔青霉ATCC 38065；产黄青霉P2；枝顶孢霉ATCC 36225、ATCC 48272；里氏木霉ATCC 26921、ATCC 56765、ATCC26921；酱油曲霉ATCC11906；鲁克文金孢子菌ATCC44006以及所有这些菌株的衍生株。作为丝状真菌宿主细胞特别优选的是黑曲霉CBS 513.88及其衍生株。
真核宿主细胞可以是酵母细胞。优选的酵母宿主细胞可选自以下属：酵母属(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、巴斯德酵母(S.pastorianus)、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis))、酒香酵母属(Brettanomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)(例如，克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、拉考夫假丝酵母(C.revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis))、伊萨酵母属(Issatchenkia)(例如，东方伊萨酵母(I.orientalis))、毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、管囊酵母属(Pachysolen)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毛孢子菌属(Trichosporon)、耶氏酵母属(例如，解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)(先前分类为解脂假丝酵母(Candidalipolytica)))、Yamadazyma。
原核宿主细胞可以是细菌宿主细胞。细菌宿主细胞可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。细菌的实例包括但不限于，属于以下属的细菌：芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、潘蒂芽孢杆菌(B.puntis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus))、不动杆菌(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、黄杆菌属(Xanthobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(例如，菌株DH 1 OB、Stbl2、DH5-α、DB3、DB3.1)、DB4、DB5、JDP682和ccdA-over(例如，美国申请号09/518,188)))、链霉菌属(Streptomyces)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)(粘质沙雷氏菌(S.marcessans))、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、伤寒沙门氏菌(S.typhi))。细菌还包括但不限于光合细菌(例如，绿色非硫细菌(例如，绿弯菌属(Choroflexus)细菌(例如橙黄绿弯菌(C.aurantiacus))、绿丝菌属(Chloronema)(例如，巨大绿丝菌(C.gigateum)))、绿色硫细菌(例如，绿菌属(Chlorobium)细菌(例如，泥生绿菌(C.limicola))、暗网菌属(Pelodictyon)(例如，微黄暗网菌(P.luteolum))、紫色硫细菌(例如，着色菌属(Chromatium)(例如，奥氏着色菌(C.okenii)))以及紫色非硫细菌(例如，红螺菌属(Rhodospirillum)(例如，深红红螺菌(R.rubrum))、红细菌属(Rhodobacter)(例如类球红细菌(R.sphaeroides)、荚膜红细菌(R.capsulatus))和红微菌属(Rhodomicrobium)细菌(例如万尼氏红微菌(R.vanellii)))。
宿主细胞可以是来自非微生物生物体的宿主细胞。此类细胞的实例包括但不限于昆虫细胞(例如，果蝇属(Drosophila)(例如，黑腹果蝇(D.melanogaster))、夜蛾属(Spodoptera)(例如，草地贪夜蛾(S.frugiperda)Sf9或Sf21细胞)和粉纹夜蛾属(Trichoplusa)(例如，High-Five细胞))；线虫细胞(例如，秀丽线虫(C.elegans)细胞)；禽类细胞；两栖动物细胞(例如，非洲爪蟾(Xenopus laevis)细胞)；爬行动物细胞；以及哺乳动物细胞(例如NIH3T3、293、CHO、COS、VERO、C127、BHK、Per-C6、Bowes黑色素瘤和HeLa细胞)。
重组宿主可能够在本领域中已知的任何合适的碳源上生长，并且将其转化为甜菊醇糖苷。重组宿主可能够直接转化植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，优选的宿主表达酶如用于将纤维素转化成葡萄糖单体和将半纤维素转化成木糖和阿拉伯糖单体所需的纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素酶)和半纤维素酶(例如内切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化成葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶或将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。优选地，宿主能够转化选自由以下各项组成的组的碳源：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和甘油。宿主细胞可例如是WO03/062430、WO06/009434、EP1499708B1、WO2006096130或WO04/099381中所描述的真核宿主细胞。
用于构建这种重组宿主的标准遗传技术(例如在宿主细胞中过表达酶、宿主细胞的遗传修饰或杂交技术)是本领域已知的方法，例如在Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press，或F.Ausubel等人编辑,"Current protocols inmolecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)中所描述的。用于真菌宿主细胞的转化和遗传修饰的方法从例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186中获知。
制备甜菊醇糖苷的方法可以包括发酵如本文所述的重组宿主，所述重组宿主能够在合适的发酵培养基中产生至少一种甜菊醇糖苷；以及任选地回收所述甜菊醇糖苷。
在用于产生甜菊醇糖苷的方法中使用的发酵培养基可以是允许特定真核宿主细胞生长的任何合适的发酵培养基。发酵培养基的基本要素是本领域的技术人员已知的，并且可适用于所选择的宿主细胞。
优选地，发酵培养基包含选自由以下各项组成的组的碳源：植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油。优选地，发酵培养基还包含氮源，如尿素；或铵盐，如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵。
根据本发明的发酵方法可以分批、分批补料或连续模式进行。也可应用单独的水解和发酵(SHF)方法或同时糖化和发酵(SSF)方法。这些发酵方法模式的组合对于最佳生产率来说也可以是可行的。如果在发酵方法中使用淀粉、纤维素、半纤维素或果胶作为碳源，则SSF方法可以是特别有吸引力的，其中可需要添加水解酶如纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶以水解底物。
在用于制备甜菊醇糖苷的方法中使用的重组宿主可以是如上文所定义的任何合适的重组宿主。在所述方法中使用根据本发明的重组真核重组宿主可以是有利的，因为大多数真核细胞不需要用于繁殖的无菌条件并且对噬菌体感染不敏感。此外，真核宿主细胞可在低pH下生长以防止细菌污染。
重组宿主可以是兼性厌氧微生物。兼性厌氧重组宿主可以需氧方式繁殖至高细胞浓度。然后可在高细胞密度下进行这种厌氧阶段，这显著地降低了所需的发酵体积并且可使需氧微生物污染的风险最小化。
用于产生根据本发明的甜菊醇糖苷的发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。
厌氧发酵方法可在本文中定义为在不存在氧的情况下运行或者基本上不消耗氧(优选小于5、2.5或1mmol/L/h)，并且其中有机分子充当电子供体和电子受体两者的发酵方法。根据本发明的发酵方法也可首先在需氧条件下运行，且随后在厌氧条件下运行。
发酵方法也可在限氧或微需氧条件下进行。或者，发酵方法可首先在需氧条件下运行，且随后在限氧条件下运行。限氧发酵方法是其中氧消耗受到从气体到液体的氧传递的限制的过程。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/传质特性决定。
在方法中产生甜菊醇糖苷可在宿主细胞的生长阶段期间、固定(稳定状态)阶段期间或在两个阶段期间发生。在不同的温度下运行发酵方法可以是可行的。
用于产生甜菊醇糖苷的方法可在对于重组宿主来说最佳的温度下进行。对于每种转化的重组宿主而言，最佳生长温度可不同并且是本领域的技术人员已知的。最佳温度可高于野生型生物的最适温度以在非无菌条件下在最低感染敏感性和最低冷却成本的条件下有效生长生物体。或者，所述方法可在对于重组宿主的生长来说不是最佳的温度下进行。
用于产生根据本发明的甜菊醇糖苷的方法可在任何合适的pH值下进行。如果重组宿主是酵母，则发酵培养基中的pH优选具有低于6、优选低于5.5、优选低于5、优选低于4.5、优选低于4、优选低于pH 3.5或低于pH 3.0或低于pH 2.5、优选高于pH 2的值。在这些低pH值下进行发酵的优点是可防止发酵培养基中污染细菌的生长。
这种方法可在工业规模上进行。这种方法的产物是包含一种或多种甜菊醇糖苷的发酵液。可以使这种发酵液经受固/液分离、细胞破坏步骤、色谱步骤、浓缩步骤和干燥步骤中的一个或多个，然后进行根据本发明方法的结晶。
根据本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可用于对于此类化合物来说已知的任何应用中。特别地，这种组合物可例如用作甜味剂，例如用于食品或饮料中。因此，根据本发明，提供了包含本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物的食品、饲料或饮料。
例如，本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可被配制成软饮料、配制为桌面甜味剂、口香糖、乳制品如酸奶(例如原味酸奶)、蛋糕、谷物或基于谷类的食物、营养食品、药物、食用凝胶、糖果产品、化妆品、牙膏或其它口腔组合物等。此外，本发明的甜菊醇糖苷或组合物可用作甜味剂，不仅用于饮料、食品和其它专门用于人消费的产品，而且用于具有改进的特性的动物饲料和草料中。
因此，本发明尤其提供了一种包含本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物的食品、饲料或饮料。
在食品、饮料、药物、化妆品、桌面产品、口香糖的制造过程中，可使用诸如混合、捏合、溶解、酸浸、渗透、渗滤、喷洒、雾化、灌注和其它方法的常规方法。
本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可以干或液体的形式使用。它可在食品热处理之前或之后加入。甜味剂的量取决于使用目的。它可单独添加或与其它化合物组合添加。
本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可与一种或多种其它非热量或热量甜味剂掺混。这种掺混可用于改进风味或时间特征或稳定性。广泛范围的非热量和热量甜味剂二者可适用于与本发明的甜菊醇糖苷或组合物掺混。例如，非热量甜味剂如罗汉果苷、莫纳甜、阿斯巴甜、安赛蜜盐、环磺酸盐、三氯蔗糖、糖精盐或赤藓糖醇。适用于与本发明的甜菊醇糖苷或组合物掺混的热量甜味剂包括糖醇和碳水化合物如蔗糖、葡萄糖、果糖和HFCS。还可使用甜味氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可与甜味剂抑制剂如天然甜味剂抑制剂组合使用。它可与鲜味增强剂如氨基酸或其盐组合。
本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可与多元醇或糖醇、碳水化合物、生理活性物质或功能成分(例如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养食品、类黄酮、异硫氰酸酯、苯酚、植物甾醇或甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)、多元醇、益生元、益生菌、植物雌激素、大豆蛋白、硫化物/硫醇、氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质和/或基于健康益处如心血管、降胆固醇或抗炎分类的物质组合。
本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可包括调味剂、芳香组分、核苷酸、有机酸、有机酸盐、无机酸、苦味化合物、蛋白质或蛋白质水解产物、表面活性剂、类黄酮、收敛剂化合物、维生素、膳食纤维、抗氧化剂、脂肪酸和/或盐。
本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可作为高强度甜味剂应用，以产生具有改进的味道特征的零卡路里、低卡路里或糖尿病人用饮料和食品。它也可用于不能使用糖的饮料、食品、药物和其他产品中。
此外，本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可用作甜味剂，不仅用于饮料、食品和其它专门用于人消费的产品，而且用于具有改进的特性的动物饲料和草料中。
本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可用作甜味化合物的产品的实例可以是酒精饮料，如伏特加酒、葡萄酒、啤酒、烈酒、清酒等；天然果汁、提神饮料、碳酸软饮料、减肥饮料、零卡路里饮料、低卡路里饮料和食物、酸奶饮料、速溶果汁、速溶咖啡、粉末型速溶饮料、罐装产品、糖浆、发酵大豆酱、酱油、醋、调味品、蛋黄酱、番茄酱、咖喱、汤、速食肉汤、酱油粉、醋粉、多种类型的饼干、香米饼、咸饼干、面包、巧克力、焦糖、糖果、口香糖、果冻、布丁、蜜饯和腌菜、鲜奶油、果酱、橘子酱、糖花膏、奶粉、冰淇淋、冰糕、包装在瓶中的蔬菜和水果、罐装和煮熟的豆类、在甜味酱中煮熟的肉和食物、农业蔬菜食品、海鲜、火腿、香肠、鱼火腿、鱼香肠、鱼酱、油炸鱼制品、干制海产品、冷冻食品、腌渍海带、腊肉、烟草、医药产品等。原则上它可具有无限应用。
甜味组合物包含饮料，其非限制性实例包括非碳酸化和碳酸饮料，如可乐、姜汁汽水、根汁汽水、苹果汁、水果味软饮料(例如柑橘味软饮料，如柠檬莱姆或橙汁)、软饮料粉等；来自水果或蔬菜的果汁、包括榨汁等的果汁、含有果粒的果汁、水果饮料、果汁饮料、含果汁的饮料、具有水果调味料的饮料、蔬菜汁、含蔬菜的汁以及含水果和蔬菜的混合果汁；运动饮料、能量饮料、接近水的饮料等(例如具有天然或合成调味剂的水)；茶类或喜欢型饮料如咖啡、可可、红茶、绿茶、乌龙茶等；含乳成分饮料如乳饮料、含乳成分咖啡、牛奶咖啡、奶茶、果奶饮料、饮用酸奶、乳酸菌饮料等；以及乳制品。
通常，甜味组合物中存在的甜味剂的量取决于甜味组合物的具体类型及其所需的甜度而广泛变化。本领域的普通技术人员可容易确定加入到甜味组合物中的甜味剂的适当量。
在食品、饮料、药物、化妆品、桌面产品、口香糖的制造过程中，可使用诸如混合、捏合、溶解、酸浸、渗透、渗滤、喷洒、雾化、灌注和其它方法的常规方法。
因此，掺入了本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物的组合物可通过本领域的技术人员已知的提供成分的均匀或均质混合物的任何方法来制备。这些方法包括干混、喷雾干燥、团聚、湿法制粒、压实、共结晶等。
呈固体形式时，本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可以适于递送到待甜化的食物中的任何形式提供给消费者，所述形式包括小袋、小包、散装袋或盒、方块、片剂、喷雾或可溶解的条。所述组合物可以单位剂量或散装形式递送。
对于液体甜味剂体系和组合物而言，应开发方便范围的流体、半流体、糊状和膏状形式、使用任何形状或形式的适当包装材料的适当包装，其便于携带或分配或储存或运输含有任何上述甜味剂产品或上述产生的产品的组合的任何组合。
本发明的组合物或通过根据本发明的方法产生的组合物可包含多种填充剂、功能成分、着色剂、调味剂。
本发明的一些实施方式：
1.一种包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物，所述组合物包含不超过约150ppm的量的贝壳杉烯酸。
2.一种包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物，所述组合物包含不超过约100ppm、例如不超过约10ppm的量的贝壳杉烯酸。
3.根据实施方式1或2所述的组合物，其中所述甜菊醇糖苷是发酵产生的。
4.根据前述实施方式之任一所述的组合物，其包含一种或多种莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙M、甜菊苷、杜克苷A、甜茶苷或甜菊双糖苷中的任一种。
5.根据前述实施方式之任一所述的组合物，其包含基于干重至少80％的至少一种甜菊醇糖苷。
6.根据前述实施方式之任一所述的组合物，其包含基于干重至少95％的至少一种甜菊醇糖苷。
7.一种制备甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括：
提供甜菊醇糖苷组合物；
将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；和
从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物，其中在pH7.0或以下进行结晶。
8.一种降低甜菊醇糖苷组合物的贝壳杉烯酸含量的方法，所述方法包括：
提供包含贝壳杉烯酸的甜菊醇糖苷组合物；
将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；和
从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物，其中在pH7.0进行所述结晶，从而降低所述甜菊醇糖苷组合物中贝壳杉烯酸的量。
9.根据实施方式7或8所述的方法，其中在pH6.0或以下进行所述结晶。
10.根据实施方式7至9之任一所述的方法，其中在pH5.0或以下进行所述结晶。
11.根据实施方式7至10之任一所述的方法，其中在pH4.0或以下进行所述结晶。
12.根据实施方式7至11之任一所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含不超过约150ppm，例如不超过约100ppm的量的贝壳杉烯酸。
13.根据实施方式12所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含不超过约10ppm的量的贝壳杉烯酸。
14.根据实施方式7至13之任一所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷是发酵产生的。
15.根据实施方式7至14之任一所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含一种或多种莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙M、甜菊苷、杜克苷A、甜茶苷或甜菊双糖苷中的任一种。
16.根据实施方式7至15之任一所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含基于干重至少80％的至少一种甜菊醇糖苷。
17.根据实施方式16所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含基于干重至少95％的至少一种甜菊醇糖苷。
18.通过根据实施方式7至17之任一所述的方法能够获得的甜菊醇糖苷组合物。
在本文对专利文件或作为现有技术给出的其他材料的引用不应被认为承认该文件或材料是已知的或它包含的信息是任何这些权利要求的优先权日时公知常识的一部分。
在本文所述的每个参考文献的披露均通过引用以其全部内容并入本文。
本发明通过以下实施例来进一步说明：
实施例
实施例1：通过结晶来减少甜菊醇糖苷组合物中的贝壳杉烯酸
如共同待决专利申请no.PCT/EP2016/055734中所述，通过发酵基于ML14869的Yarrowia lipolitica菌株来生产发酵产生的含莱鲍迪甙A的甜菊醇糖苷组合物。如PCT/EP2016/055734的实施例15中所述，将UGT2变体UGT2_5b加入ML14869中(UGT2_5b具有序列如PCT/EP2016/055734的SEQ ID NO:11所示的开放阅读框)以获得所用的最终菌株。
利用WO2013/110673和WO2015/007748中所述的程序发酵该菌株。
然后使发酵液经受以下步骤：离心、热休克、精炼过滤、在HP20柱上层析、浓缩/蒸发、阳离子交换、阴离子交换，然后喷雾干燥最终材料。
将包含莱鲍迪甙A的所产生的干燥的发酵获得的含甜菊醇糖苷的物质以每升溶剂(92:8的乙醇:水)70g Reb A在70-75℃下溶解15分钟。在75℃的温度和最大1bar的压力下，使用具有6克硅藻土(Dicalite)(0.012m2)主体进料(body feed)的Pall HS 200滤器过滤得到的溶液。
然后在pH 10.5或pH 3.8(用4M HCl调节pH)下结晶得到的溶液。随后是经5小时将75℃的开始温度冷却至5℃的冷却曲线。然后将温度保持在5℃。
然后使用设置有20μm滤布的带式滤器(Larox PB 1180 B型)进行过滤和洗涤。洗涤液是溶剂混合物(即92:8的乙醇:水)并冷却到5℃。用150-200ml洗涤液(等于沉淀物体积)洗涤1.5-2升的浆料份3次。
然后在55-60℃、100mbar下，在真空烘箱中进行干燥，直至乙醇低于0.5％。
通过LC-MS来确定贝壳杉烯酸。
结果显示在下表1中，结果表明：pH对KA去除有显著影响，并且使用较低pH结晶可使甜菊醇糖苷组合物的KA量大大减少。
表1：通过在不同pH下乙醇结晶的KA值

Claims (18)

1.一种包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物，所述组合物包含不超过150ppm的量的贝壳杉烯酸。
2.一种包含一种或多种甜菊醇糖苷的组合物，所述组合物包含不超过100ppm，例如不超过10ppm的量的贝壳杉烯酸。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述甜菊醇糖苷是发酵产生的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含一种或多种莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙M、甜菊苷、杜克苷A、甜茶苷或甜菊双糖苷中的任一种。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含基于干重至少80％的至少一种甜菊醇糖苷。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含基于干重至少95％的至少一种甜菊醇糖苷。
7.一种制备甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括：
提供甜菊醇糖苷组合物；
将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；和
从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物，其中在pH7.0或以下进行所述结晶。
8.一种降低甜菊醇糖苷组合物的贝壳杉烯酸含量的方法，所述方法包括：
提供包含贝壳杉烯酸的甜菊醇糖苷组合物；
将所述甜菊醇糖苷组合物与溶剂组合以形成甜菊醇糖苷溶液；和
从所述甜菊醇糖苷溶液中结晶甜菊醇糖苷组合物，其中在pH7.0进行所述结晶，从而降低所述甜菊醇糖苷组合物中贝壳杉烯酸的量。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中在pH6.0或以下进行所述结晶。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中在pH5.0或以下进行所述结晶。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中在pH4.0或以下进行所述结晶。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含不超过150ppm，例如不超过10ppm的量的贝壳杉烯酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含不超过约10ppm的量的贝壳杉烯酸。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述甜菊醇糖苷是发酵产生的。
15.根据权利要求7至14中任一项所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含一种或多种莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、莱鲍迪甙M、甜菊苷、杜克苷A、甜茶苷或甜菊双糖苷中的任一种。
16.根据权利要求7至15中任一项所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含基于干重至少80％的至少一种甜菊醇糖苷。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所得甜菊醇糖苷组合物包含基于干重至少95％的至少一种甜菊醇糖苷。
18.通过根据权利要求7至17中任一项所述的方法能够获得的甜菊醇糖苷组合物。
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