CN110656150A - 一种莱鲍迪苷e的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种莱鲍迪苷E的制备方法及其产品和应用，所述制备方法包括以甜菊苷为原料，以乙酸乙酯和β‑环糊精为糖基供体，在复合酶的催化下发生转化反应，生成莱鲍迪苷E。本发明采用廉价易得的乙酸乙酯和β‑环糊精作为糖基供体，替换成本高昂的UDP‑葡萄糖，在复合酶的催化作用下生成莱鲍迪苷E，该反应为制备莱鲍迪苷E开辟了新的途径，反应的产物得率高，制备工艺简单，适用于工业化生产，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物催化转化领域，涉及一种莱鲍迪苷E的制备方法及其应用，尤其涉及一种以乙酸乙酯和β-环糊精为糖基供体的莱鲍迪苷E的制备方法及其应用。
背景技术
甜菊糖作为目前已知的最甜的甜味剂，其甜度是蔗糖的250-450倍，而热量只有蔗糖的1/300，略带有轻微涩味。除此之外，甜菊糖还具备对高血压、肥胖症、糖尿病等辅助药理作用，因此，越来越受到人们的关注。甜菊糖是甜菊糖甙的总称，目前已从甜叶菊中分离鉴定出超过35种甜菊糖甙，包括甜菊甙和莱鲍迪苷A、B、C、D、E、M等。甜菊糖甙结构围绕一个双萜甜菊醇为骨架，在C13位羟基和C19位羧基分别连接了不等的葡萄糖基团，其中，骨架上C16-C17之间的碳碳双键是提供甜菊糖甙甜味及功能的药理性基团。
不同甜菊糖甙的甜度有所差异，莱鲍迪苷E的口感无后苦味，甜度与蔗糖相似，其结构上较甜菊甙在骨架上的C19位侧链上多了一个葡萄糖基团，在甜叶菊的干叶片中含量甚微，直接通过常规物理手段从甜菊糖甙中分离莱鲍迪苷E，难度大且收率极低。另外富集莱鲍迪苷E的工艺繁琐，提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶，并在生产过程中产生大量的废水，其生产成本较高，不适合工业化大生产。
CN106795547A公开了一种由莱鲍迪苷KA或甜茶苷合成莱鲍迪苷E的方法，底物选自蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)，UDP-糖基转移酶选自HV1、EUGT11和UDP-糖基转移酶融合酶，温育反应混合物足够时间以生产莱鲍迪苷E。但该方法仍依赖UDP-葡萄糖为糖基供体，合成成本高，经济性较差。
CN109750072A公开了一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法，该方法利用番茄来源UDP-糖基转移酶和马铃薯来源蔗糖合成酶，以甜菊甙为原料一步糖基化反应生产莱鲍迪苷E，同时采用定点突变技术，改造UDP-糖基转移酶，进一步提高莱鲍迪苷E的产率。本发明的方法无需添加UDP-葡萄糖和UDP，利用粗提液中UDP及额外添加的蔗糖在蔗糖合成酶分解作用下获得UDP-葡萄糖作为糖基化反应的原材料，建立双酶循环反应体系，有效催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E。
目前生物酶法合成莱鲍迪苷E的方法通常需要外加昂贵的UDP-葡萄糖为底物，通过UDP-葡萄糖基转移酶的作用，以甜菊苷或莱鲍迪苷A为底物，催化生成莱鲍迪苷E，由于UDP-葡萄糖极高的售价，几乎完全限制了工业化制备莱鲍迪苷E的可行性，经济性较差、缺乏市场竞争力。或者工艺步骤繁琐，成本高，也缺乏市场竞争力。因此，开发出一种成本较低的工艺简单的制备莱鲍迪苷E的方法是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种莱鲍迪苷E的制备方法及其产品和应用，本发明采用廉价易得的乙酸乙酯和β-环糊精作为糖基供体，替换成本高昂的UDP-葡萄糖，在酰基转移酶和糖基转移酶的催化作用下生成莱鲍迪苷E，该反应为制备莱鲍迪苷E开辟了新的途径，反应的产物得率高，制备工艺简单，适用于工业化生产，具有广阔的应用前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种莱鲍迪苷E的制备方法，所述制备方法包括以甜菊苷为原料，以乙酸乙酯和β-环糊精为糖基供体，在酰基转移酶和糖基转移酶的催化下发生转化反应，生成莱鲍迪苷E。
本发明中，发明人意外发现可采用廉价易得的乙酸乙酯和β-环糊精作为糖基供体，以甜菊苷为底物原料，在酰基转移酶和糖基转移酶的催化下反应生产莱鲍迪苷E，替换现有技术中成本高昂的UDP-葡萄糖，乙酸乙酯通常用作萃取剂或有机溶剂，但其与β-环糊精共同使用可作为甜菊苷的糖基供体，使整个制备工艺更加简单高效，提高莱鲍迪苷E的产率，为工业化生产奠定基础。需要特别说明的是，在甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的过程中会先转化成莱鲍迪苷A，进而转化为莱鲍迪苷E，因此，此处也可以用莱鲍迪苷A作为底物原料，采用上述相同的技术手段进行制备莱鲍迪苷E。
优选地，所述甜菊苷的初始反应浓度为1-300g/L，例如可以是1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L、210g/L、220g/L、230g/L、240g/L、250g/L、260g/L、270g/L、280g/L、290g/L或300g/L。
优选地，所述乙酸乙酯和甜菊苷的质量比为(0.4-10):1，例如可以是0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。
本发明中，通过调整乙酸乙酯与甜菊苷的用量比例，发现在乙酸乙酯和甜菊苷比例低于40:1或者高于200:1时，都会使莱鲍迪苷E的转化率降低，这可能与低浓度乙酸乙酯无法满足酶促反应要求，而高浓度乙酸乙酯影响了体系中的酶活有关。
优选地，所述β-环糊精和甜菊苷的质量比为(3-10):1，例如可以是3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1。
本发明中，通过调整β-环糊精和甜菊苷的质量比，发现在β-环糊精和甜菊苷比例低于30:1或者高于100:1时，都会使莱鲍迪苷E的转化率降低，这可能与低浓度β-环糊精无法满足酶促反应要求，而高浓度β-环糊精的包埋作用影响了体系中的酶促反应有关。
优选地，所述酰基转移酶包括棕榈酰转移酶。
优选地，所述糖基转移酶包括环糊精糖基转移酶。
本发明中，通过酰基转移酶和糖基转移酶的组合作为复合酶，并调整两种酶的用量，可进一步提高甜菊苷转化为莱鲍迪苷E的产率，使得甜菊苷主要转化为莱鲍迪苷E，超出本发明所述复合酶配比范围，均降低莱鲍迪苷E的得率。
优选地，所述糖基转移酶在反应体系中的添加量为25000-50000U/L，例如可以是25000U/L、30000U/L、35000U/L、40000U/L、45000U/L或50000U/L等。
本发明中，糖基转移酶添加量低于25000U/L时，会使莱鲍迪苷E的转化率降低，添加量高于50000U/L时，生成大量副产物，也会使莱鲍迪苷E的转化率降低。
优选地，所述酰基转移酶在反应体系中的添加量为50000-100000U/L，例如50000U/L、60000U/L、70000U/L、80000U/L、90000U/L或100000U/L等。
本发明中，酰基转移酶添加量低于50000U/L时，会使莱鲍迪苷E的转化率降低，添加量高于100000U/L时，生成大量副产物，也会使莱鲍迪苷E的转化率降低。
优选地，所述转化反应采用水相体系，在pH＝6-8(例如pH＝6、pH＝7或pH＝8等)的缓冲液中进行生物转化。
优选地，所述转化反应的温度为20-50℃，例如可以是20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃或50℃等。优选为35-40℃。
优选地，所述转化反应的时间为1-24h，例如可以是1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h，优选为16-20h。
作为本发明优选方案，所述制备方法具体包括如下步骤：
以甜菊苷为原料，以乙酸乙酯和环糊精为糖基供体，以棕榈酰转移酶和环糊精糖基转移酶组成的复合酶为催化酶，在pH＝6-8的缓冲液水相体系中进行生物转化，反应温度20-50℃，反应时间1-24h，得主产物为莱鲍迪苷E的水溶液；任选地，所述水溶液分离纯化后得高纯度的莱鲍迪苷E；
其中，所述甜菊苷的初始浓度为1-300g/L，所述乙酸乙酯和甜菊苷的质量比为(0.4-10):1，所述β-环糊精和甜菊苷的质量比为(3-10):1，所述复合酶中环糊精糖基转移酶的添加量为25000-50000U/L；所述棕榈酰转移酶的添加量为50000-100000U/L。
本发明中，通过本发明的方法制备得到主产物为莱鲍迪苷E的水溶液，可选择地进行分离纯化，得到高纯度的莱鲍迪苷E，分离纯化方式典型但非限定的如结晶、膜浓缩、树脂分离等。
以甜菊苷为底物的酶催化法通常只能得到多种糖苷的混合物，通过调控反应条件使得某种特定糖苷为主要产物，本发明通过调控原料、糖基供体、复合酶的种类和比例关系，使得反应主要生成莱鲍迪苷E，显著提高莱鲍迪苷E的产率。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的制备方法得到的莱鲍迪苷E组合物或莱鲍迪苷E纯化产物。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的莱鲍迪苷E组合物或莱鲍迪苷E纯化产物在制备甜味剂、食品、饮料、口腔卫生产品或药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的莱鲍迪苷E制备方法开创性地采用廉价易得的乙酸乙酯和β-环糊精为复合糖基供体，替换昂贵的UDP-葡萄糖，实现莱鲍迪苷E的制备；
(2)本发明使用酰基转移酶和糖基转移酶作为复合酶，在本发明所述酶的配比条件下，以及本发明所述比例的乙酸乙酯存在的条件下，能够将β-环糊精上的葡萄糖基添加到甜菊苷相应位点，从而将其转变为莱鲍迪苷E；
(3)本发明提供的制备方法简单高效，适用于工业规模生产，提高莱鲍迪苷E的产率。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述各实施例中涉及的莱鲍迪苷E转化率为制得的莱鲍迪苷E质量与甜菊苷质量之比值。
实施例1
配制水相反应体系，甜菊苷的初始反应浓度为20g/L，乙酰乙酯的初始反应浓度为20g/L，β-环糊精的初始反应浓度为60g/L，棕榈酰转移酶初始反应浓度为58000U/L，β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为27000U/L，利用磷酸盐缓冲液调节反应体系在pH＝7。
将水相反应体系置于恒温摇床中，反应温度为30℃，反应时间为24h。即可制得含有莱鲍迪苷E的水溶液，利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为14.7g/L，转化率为73.5％。
实施例2
配制水相反应体系，甜菊苷的初始反应浓度为100g/L，乙酰乙酯的初始反应浓度为50g/L，β-环糊精的初始反应浓度为300g/L，棕榈酰转移酶初始反应浓度为80000U/L，β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为45000U/L，利用磷酸盐缓冲液调节反应体系在pH＝6。
将水相反应体系置于恒温摇床中，反应温度为40℃，反应时间为16h。即可制得含有莱鲍迪苷E的水溶液，利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为61.7g/L，转化率为61.7％。
实施例3
与实施例1相比的区别仅在于“乙酰乙酯的初始反应浓度为6g/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为2.6g/L，转化率为13％。
实施例4
与实施例1相比的区别仅在于“乙酰乙酯的初始反应浓度为250g/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为0.2g/L，转化率为1％。
实施例5
与实施例1相比的区别仅在于“β-环糊精的初始反应浓度为50g/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为4.5g/L，转化率为22.5％。
实施例6
与实施例1相比的区别仅在于“β-环糊精的初始反应浓度为250g/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为6.5g/L，转化率为32.5％。
实施例7
与实施例1相比的区别仅在于“棕榈酰转移酶初始反应浓度为50000U/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为7.7g/L，转化率为38.5％。
实施例8
与实施例1相比的区别仅在于“棕榈酰转移酶初始反应浓度为100000U/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为7.4g/L，转化率为37％。
实施例9
与实施例1相比的区别仅在于“β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为25000U/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为6.9g/L，转化率为34.5％。
实施例10
与实施例1相比的区别仅在于“β-环糊精糖基转移酶初始反应浓度为50000U/L”，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为6.7g/L，转化率为33.5％。
实施例11
与实施例1相比，除了不添加棕榈酰转移酶之外，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为4.2g/L，转化率为20％。
实施例12
与实施例1相比，除了不添加β-环糊精糖基转移酶之外，其他条件同实施例1。利用高效液相色谱方法，测定其中莱鲍迪苷E的浓度为3.3g/L，转化率为16.5％。
由上述实施例的数据结果可知：本发明以乙酸乙酯和β-环糊精作为糖基供体，以甜菊苷为底物原料，在糖基转移酶和酰基转移酶的催化下反应可以生产莱鲍迪苷E，且转化率较高。其中，乙酸乙酯和β-环糊精的添加浓度、糖基转移酶和酰基转移酶的添加浓度均是影响其转化率的关键因素，且单一添加糖基转移酶和酰基转移酶时莱鲍迪苷E的转化率很低。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种莱鲍迪苷E的制备方法及其产品和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种莱鲍迪苷E的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以甜菊苷为原料，以乙酸乙酯和β-环糊精为糖基供体，在酰基转移酶和糖基转移酶的催化下发生转化反应，生成莱鲍迪苷E。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述甜菊苷的初始反应浓度为1-300g/L。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸乙酯和甜菊苷的质量比为(0.4-10):1；
优选地，所述β-环糊精和甜菊苷的质量比为(3-10):1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酰基转移酶包括棕榈酰转移酶；
优选地，所述糖基转移酶包括环糊精糖基转移酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述糖基转移酶在反应体系中的添加量为25000-50000U/L；
优选地，所述酰基转移酶在反应体系中的添加量为50000-100000U/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述转化反应采用水相体系，在pH＝6-8的缓冲液中进行生物转化。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述转化反应的温度为25-40℃；优选为35-40℃；
优选地，所述转化反应的时间为1-24h，优选为16-20h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：以甜菊苷为原料，以乙酸乙酯和环糊精为糖基供体，以棕榈酰转移酶和环糊精糖基转移酶组成的复合酶为工具酶，在pH＝6-8的缓冲液水相体系中进行生物转化，反应温度20-50℃，反应时间1-24h，得到含有莱鲍迪苷E的水溶液；任选地，所述水溶液分离纯化后得高纯度的莱鲍迪苷E；
其中，所述甜菊苷的初始浓度为1-300g/L，所述乙酸乙酯和甜菊苷的质量比为(0.4-10):1，所述β-环糊精和甜菊苷的质量比为(3-10):1，所述复合酶中，环糊精糖基转移酶的添加量为25000-50000U/L；所述棕榈酰转移酶的添加量为50000-100000U/L。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法得到的莱鲍迪苷E组合物或莱鲍迪苷E纯化产物。
10.一种如权利要求9所述的莱鲍迪苷E组合物或莱鲍迪苷E纯化产物在制备甜味剂、食品、饮料、口腔卫生产品或药物中的应用。
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