JPH0446190A - 新規なステビオール配糖体、その製造方法及びこれを用いた甘味料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、新規なステビオール配糖体、その製造方法
及びこれを用いた甘味料に関する。

（往来の技術） 近年、人工甘味料であるサッカリン、ズルヂン、チク口
等が安全性の点から一般食品への利用が禁止、又は規制
される傾向にある。

一方では、近年砂糖の採り過ぎによる健康上の影響が問
題にされはしめたことから、それらの間顕がより少ない
天然甘味料の開発が熱望されている。

これに対して、南米パラグアイ原産のキク科植物である
ステビアから得られるステビオール配糖体は、ステビオ
サイドＣ，Ｄ、Ｅ及びズルコザイドＡ、ステビオールビ
オサイドＨ等７種印の混合物である。

現在、市販されているステビア甘味料は、これらの混合
物として販売されている。これらのステビオール配糖体
のうち、代表的なステビ才サイドの構造式を（■）［第
１図（ａ）］に示す。

ステビオサイドは砂糖と異なり低カロリーの甘味料であ
り、しかも甘味は約１．４５倍と高く、砂糖に替わる甘
味料として注目されている。

ところが、上記ステビア甘味料は、苦味、嫌味があり、
更には残株が長く尾を引くという欠点がある。これらを
改善するため、ステビオサイドの甘味度・甘味質の改良
法について、数多くの研究報告並びに特許出願がなされ
ている。具体的には、ステビオサイドにバシラス・メガ
テリウムｆＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）
が生産するシクロデキストリングルカノトランスフェラ
ーゼ（以下、　ＣＧＴａｓｅと記す）を用い、澱粉を糖
供与体として、酵素転移を行なうことにより、甘味質を
改善する方法も提案されている。このように、ステビオ
ール配糖体の欠点を改善した製品が生産されているが、
未だ十分な成果を収めるには至っていない。

この原因については、上述の反応においてはステビオサ
イドの１３位または１９位のグルコシル基にグルコース
が１〜３分子それぞれ一方に転移するもの、また両方に
転移するもの等の混合物が生成するが、このうち１３位
のグルコシル基にグルコースが１〜３分子転移したもの
は甘味度、味質共に改良されるが、１３位のグルコシル
基より、１９位のグルコシル基により多くのグルコース
が転移した生成物は、甘味度、味質が低下する等の報告
がある。

そこで、本発明者らは、先にステビオサイドの１９位の
ＣＯＯＨにエステル結合するグルコシル基（以下、１９
位のグルコシル基と記す）をガラクトースで封鎖した後
、１３位のＯＨにエーテル結合したグルコシル基（以下
、１３位のグルコシル基と記す）にグルコースを選択的
に転移させる方法を提案した（特願昭６３−２４７３７
１号）。

（発明が解決しようとする問題点） この方法においては１９位のグルコシル基がガラクトー
スで封鎖されたものの他に、１３位のグルコシル基がガ
ラクトースで封鎖されたものも分画されずにかなり含ま
れており、したがってこれにＣＧＴａｓｅを用い澱粉を
糖供与体として酵素転移を行なうと、１９位のグルコシ
ル基がガラクトースで封鎖されたものについては、所期
の目的通りに１３位のグルコシル基に１〜３分子のグル
コースが転移し、甘味度・甘味質共にかなり改善される
が、１３位のグルコシル基がガラクトースで封鎖された
ものについては、１９位のグルコシル基に１〜３分子の
グルコースが転移し、この比率は１０〜１５％にも達し
、十分に甘味質が改善されない原因となっている。

これに対して、本発明者らは先にルプソサイド又はステ
ビオサイドの１９位のグルコシル基にβ−Ｄ−フラクト
フラノースを結合させることにより、甘味質の改良が図
られることを提案した（特願平１−２３４６７５号）。

一方、レバウディオサイドＡの構造式は（ＩＩ）［第１
図（ｂ）］に示す如くであるが、このレバウディオサイ
ドＡの含量はステビア中に含まれるステビオール配糖体
のうち、通常栽培されているもので１５％程度となって
いる。レバウディオサイドＡは甘味度が２４５倍とステ
ビオサイドの約２倍近くあり、甘味質もステビオサイド
よりかなりよいことから、以前から栽培法の改良研究が
行なわれ、レバウディオサイドＡ含量の高い品質に改良
され、数年前より５０％含量のものも栽培されている。

しかし、このようなレバウディサイドＡ高含量のものも
α−グルコシルステビオサイドと同様に甘味度、甘味質
ともに完全なものではなく、またレバウディオサイドＡ
自体についてはステビオサイドより甘味質が良好である
ため、今日に至るまでその甘味質改良に関する報告は皆
無である。

本発明者らは、先の特願平１．−２３４６７５号に鑑み
、レバウディオサイドＡについてもβ−Ｄ−フラクトフ
ラノースを作用させることにより、味質が改良されるだ
ろうことを予測し、これに使用する酵素等について鋭意
研究を重ねた結果、先にミクロバクテリウム・エスピー
、Ｈ−１（微工研寄託菌寄第１１４２８号）から特殊な
β−フラクトフラノシル転移酵素（に、ｉ下、転移酵素
と記す）が生産されることを確認した。また、この酵素
を使用することによってレバウディオサイドＡにβ−Ｄ
−フラクトフラノースが転移し、味質が改良されること
を見出したものである。

（問題点を解決するための手段） この発明は、上記知見に基づいて完成したものであり、
この発明に係る物質は、レバウディオサイドＡの１９位
のグルコシル基の６位に、β−Ｄ−フラクトフラノース
が２位の位置で結合した構造のステビオール配糖体、即
ちβ−フラクトフラノシルレバウディオサイドＡである
。

具体的には、この発明に係る物質はレバウディオサイド
Ａと糖供与体とを含有する水溶液又は懸濁液に、ミクロ
バクテリウム・エスピーＨ−１（微工研寄託　菌寄第１
１４２８号）の生産する転移酵素を作用させることによ
って得られる６その構造式は（ｎｌ）［第２図］で表わ
される。この反応に用いるレバウディオサイドＡは精製
分離されたレバウディオサイドＡを使用するがそれに限
定されるものではない。

この反応に用いる糖供与体は、蔗糖、ラフィノス、ステ
ビオール等が使用される。

この反応系で、レバウディオサイドＡと糖供与体を含有
する水溶液又は懸濁液の濃度は、レバウディオサイドＡ
が１〜４０％ｆＷ／Ｗ）、糖供与体が約１〜５０％（Ｗ
／Ｗ）とし、且つレバウディオサイドＡに対する糖供与
体の比率は使用する糖供与体によって異なるが、０．１
〜５０倍の範囲とし、好ましくは１〜５倍の範囲とする
。

反応条件は、通常ｐＦ（４〜８．温度は２０〜７０℃が
適当である。使用酵素活性量は反応時間と密接な関係が
あり、通常５〜１２０時間、好ましくは５〜２０時間で
反応が終了する酵素活性量にすれば良いが、これらに限
定されるものではない。

（発明の効果） 前述のようにして得られた反応生成物の甘味度は、原体
のレバウディサイドＡと比較し、モル比で１．２倍とな
り、特に甘味質については、苦味が殆どなくなり、甘味
の切れも良く、まろやかさが加わり、我々が今まで開発
し、特許出願したものも含め、従来の糖転移物に比べ、
更に改善されていることを確認した。したがって、この
ようにして得られた転移生成物の反応液は、そのまま甘
味料として使用することができるが必要に応して酵素を
失活させて濾過後、その溶液をイオン交換樹脂、例えば
Ｈ型強酸性カチオン交換樹脂及びＯＨ型塩基性アニオン
交換樹脂を用いて脱塩し、濃縮してシラツブ状の甘味料
とするか、またはこの濃縮液を乾燥して粉末状の甘味料
とすることもてきる。更に、脱塩した反応溶液をカラム
クロマト法にて精製し、転移生成物を分離、採取してこ
れを甘味料とすることもできる。この際の濃縮、乾燥、
粉末化は公知の方法によれば良い。

この発明により得られたβ−フラクトフラノシルレバウ
ディオサイドＡは甘味度が高く、甘味質が非常に良好で
あることから、低カロリーの飲食物、嗜好物等いわゆる
美容食、健康食、ダイエツト食の甘味付けに好適である
。また、うがい薬、練り歯磨き等、虫歯予防用の経口用
医薬部外品への添加にも好適であり、その他国薬品も含
めて甘味を必要とする分野に自由に使用することがてき
る。

（実施例） 以下、実施例によりこの発明を具体的に説明する。

実施例１ （１）酵素の調整 蔗糖０．５％、硝酸ナトリウム０３％、第ニリン酸カリ
ウム０．１％、硫酸マグネシウム００５％、塩化マグネ
シウム０．０２％を含む寒天斜面培地にミクロバクテリ
ウム・エスピー、Ｈ−１（微工研寄託　菌寄第１１４２
８号）を接種し、３０℃で３日間培養後、その１白金耳
を取り蔗糖１％、酵母エキス０．０５％、ポリペプトン
０．５％、硝酸ナトリウム０．３％、第ニリン酸カリウ
ム０．１％、硫酸マグネシウム００２％、（ｐＨ７，２
）の組成からなる液体培地（６０ｍｌ培地７５００ｍ１
肩付きフラスコ）に植菌し、３０℃で２日間振盪培養し
た。これを種菌とし、同組成からなる液体培地に分注し
、３０℃で２日間振盪培養した。培養終了後、培養液を
遠心分離し、上清（粗酵素液）を得た。水液にはｍ１当
たりｌＯ単位の転移酵素を含有していを二。

なお、活性測定法は次の通りである。５％蔗糖溶液（５
０ｍＭリン＃緩衝液ｐＨ６，５）２００　ｕ　ｌに適宜
希釈した酵素液２００μｌを加え、４０℃、１０分間作
用させた後、反応液を沸騰水に入れ、酵素を熱失活させ
た後、ソモギーネルソン法により生成したグルコース、
フラクトースをグルコースとして求め算出する。酵素活
性は、１分間に１μｍｏｌの蔗糖を分解する酵素量を１
単位とした。

（２）転移反応 ９７％レバウディオサイドＡ（試料Ｎｏ、ｌ：９田化学
社製）　２．８ｇ、蔗糖２０ｇを２０ｍＭクエン酸緩衝
液（ｐＨ５，７）に溶解し、２００ｍ１として後（１）
にて調製した転移酵素を５０単位添加し、４０℃にて１
６時間反応させた。この時の転移率は８２％であった。

その後、酵素を加熱失活させた反応液を吸着樹脂（商品
名：ダイヤイオンＨＰ−２０：三菱化成社製）に吸着後
、８０％メタノールで溶出し、未反応レバデイオサイド
Ａと転移反応生成物の混合物を分取した。このうちｌ／
２量をＭｅＯＨ留去、凍結乾燥して１．３４ｇの混合物
（試料Ｎ０２）を得た。次に上記１／２量を更に分取カ
ラムにてクロマト分画し、ＭｅＯＨ留去、凍結乾燥して
０．９２ｇの高純度の転移反応生成物（試料Ｎｏ、３１
　を得た。

（３）構造解析 上述の方法で分画・単離した試料Ｎ０９３をヨウ化リチ
ウム、２．６ルチジン、メタノール試薬を用いて、１９
位のエステル結合を選択的に分解する方法により、β−
Ｄ−フラクトフラノースが１９位のグルコシル基に転移
していることを確認した。次に’　Ｈ，＋３Ｃ−ＮＭＲ
解析によりβ−Ｄ−フラクトフラノースが２位の位置で
１分子結合していることを確認し、更にメチル化分析（
完全メチル化−酸加水分解−還元−アセチル化−ガスク
ロマトグラフ）から、そのβ−Ｄ−フラクトフラノ−又
はグルコシル基の６位に結合していることが確認された
。

以上の結果から構造式（ＩＩＩ）［第２図コに示すよう
に、レバウディオサイドＡの工９位のＣ００）ｌにエス
テル結合するグルコシル基の６位にβ−Ｄ−フラクトフ
ラノースが２位の位置で結合したβ−フラク１−フラノ
シルレバウディオサイドＡと構造決定した。

このときの”Ｃ−ＮＭＲのチャートを第３図にホす。

試験例 実施例１にて得られた試料Ｎｏ、　２．　Ｎｏ、　３に
ついて現在市販されているグルコース転移ステビオサイ
ド（東洋精糖社製）（試料Ｎｏ、４１　、現在市販され
ている合成品のうち最高の甘味度、甘味質を有するとさ
れているア又パルチーム（商品名６味の素社製）、ステ
ビオサイド、レバウディオサイドＡ（試料Ｎｏ、１）を
標準品として官能検査を行なった。

（１）甘味度試験 ■供試品の水溶液調製 既に報告されている文献値を基準として、各甘味度が概
略蔗糖換算３〜６％に入るように第１表に示す水溶液を
調製した。

第１表 供試品の水溶液濃度 ■蔗糖水溶液 下記の６種のＩｖ糖水溶液を調製した。

：１．５．４．０．４．５．５．０．５．５．６．Ｏ１
％）■試験方法 ＃：１！！水溶液を低濃度がら順に並べ、供試水溜液と
同等の甘味を有するものを１０名のパネル員に選ばせた
。試験に基づく甘味度を第２表に示す６第２表 試品の甘味度 ［於（財）日本食品分析セタンタ 以上のごとく、β−フラクトフラノシルレバウディサイ
ドＡ（高純度品）は標準品に比べてモル比換算では約１
．２倍となった、 （２）甘味質試験 （１）の甘味度試験の結果から、各供試品について５％
ＦｆＦ糖水溶ンルと同等甘味水溶液を調製し３それらの
甘味質（■苦味、■残株、■まろやかさ）の検査を行な
った。

まず、標準品３　、ｅ！５．について■苦味、■残株、
■まろやかさの３項目を２０名のパネルを用いて評１点
法（第３表）で採点し、次にこの評点を参考とし、供試
品（Ｎｏ、　２．　Ｎｏ、　：ｌ）　２点について１２
名のバネルを用い、 同様に採点した。

その結果を第４表に 小ず。

第３表 ５段階評ｆ曲の評、占尺度 第４表 供試品のｌ味質 ［於（財） 日本食品分析セタンター〕 以上のごとく、β−フラクトフラノシルレバウディオサ
イドＡは、苦味、残株、まろやがさ全ての項目について
、アスパルテームにやや劣るものの、甘味質が非常に良
好といわれているレバウディオサイドＡ、グルコース転
移ステビオサイドより良質なものに改善された。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、（ｂ）はステビオサイド及びこの発明の
原料物質であるレバウディオサイドＡの構造式、第２図
は、この発明に係る物質であるβ−フラクトフラノシル
レバウディオサイドＡの構造式、第３図は試料Ｎｏ３の
１３Ｃ−ＮＭＲのチャト、測定’ｊｋ　件ハｌ’ｌａ　
Ｈ：　、ＩＥＯＬ　ＪＥＮ　ＧＸ−４００（１００ＭＨ
ｚ）溶媒：Ｐｙｒｉｄｊｎ−ｄ５．内部槽４：Ｔｅｔｒ
ａｍｅｔｙｌｓｉｌａｎ　［ＴＭＳである。 特許出願人　北海道糖業株式会社 同　代理人　弁理士　日中　開維 第 図 第 図 エエ （式中、 β 区１ｕＣ β−グルコンル幕）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）レバウディオサイドＡの１９位のＣＯＯＨにエス
   テル結合するβ−グルコシル基の６位に、β−Ｄ−フラ
   クトフラノースが２位の位置で結合した構造のステビオ
   ール配糖体。
2. （２）レバウディオサイドＡとβ−フラクトシル糖化合
   物とを含有する水溶液又は懸濁液に、ミクロバクテリウ
   ム・エスピー．Ｈ−１（微工研寄託菌寄第１１４２８号
   ）の生産するβ−フラクトフラノシル転移酵素を作用さ
   せることを特徴とするステビオール配糖体の製造方法。
3. （３）レバウディオサイドＡとβ−フラクトシル糖化合
   物とを含有する水溶液又は懸濁液にミクロバクテリウム
   ・エスピー．Ｈ−１（微工研寄託菌寄第１１４２８号）
   の生産するβ−フラクトフラノシル転移酵素を作用させ
   て得られた甘味料。