JPS5971662A - 甘味料の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の概要と背景〕 本発明は新しい修飾天然甘味料、さらに詳しくはステビ
オサイドから生化学的に誘導されたα−１，４−グルコ
ピラノシルステビオサイド頻を含有し、α−１，４−グ
ルコピラノシルレバウディオサイド類を含有しない甘味
料及びその製造法番こ関する。

天然月味料を食品に利用しようとする動きは、。

近年、とみに活発化している。例えば、既に実用段階に
ある甘草甘味料、ステビア甘味料はもちろん、甘茶から
得られるフィロズルチン、アフリカ産ベリー類に含まれ
るミラクリ／、同じくアフリカ産果実に含まれるモネリ
ンやソーマチン、中国産羅漢果から得られる甘味物質等
、種々の天然甘味料が世界中で盛んに研究されている。

中でも、ステビア甘味料は、甘味質が比較的砂糖に近く
、甘味倍数も砂糖の約３００倍と高いし、熱に安定で食
品加工に適している等の理由から、それに対する一層の
需要の増大が嘱望されているものである。

ところで、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ　Ｒｅｂａｕｄｉａ
ｎａ　Ｂｅ　−ｒｔｏｎｉ）は南米パラグアイ原産のキ
ク科に属する多年生草木であって、その葉中にはステビ
オサイド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）を主とするジテルペ
ン系甘味配糖体類°が含まれているから、これを抽出、
精製し、ステビア抽出物又はステビア抽出精製物として
甘味料に供する。

辻ステビア葉中の配糖体甘味物質としては、ステビオサ
イドの他、レバウディオサイド−Ａ、Ｃ，Ｄ、Ｅおよび
ズルコサイドーＡの各成分が知られている。

一般　に、ステビオサイドはステビア葉中の配糖体甘味
成分のうち含量的に最も多く、ステビア抽出物、ステビ
ア抽出精製物中の甘味成分の主体をなしている成分であ
る。氷晶は前述の如く強い甘味を持ち、かつその甘味の
質も比較的砂糖のそれに近いという利点があるが、反面
強い苦味や渋味をも有するため、これらの不快味が日中
に残るという欠点かある。

ず、残株を感じさせない良質の甘味成分であるうレバウ
ディオサイド−ＣとズルコサイドーＡとは、ともにラム
ノースを有する成分であるか、甘味度は、それぞれレバ
ウディオサイド−Ａ及びステビオサイドの約１／１０程
度に過ぎない。かつ、含量的にも少く、甘味料の対象と
はなり難い。

レバウディオサイド−Ｄ、Ｅは、ともに甘味度、甘味質
ともステビオサイドより優れているという評価がなされ
ているが、微量成分であるため。

これまた甘味料の対象となり婦い。以下、参考までにこ
れまでに確認された６種のステビア甘味配糖体の化学構
造を示す。

ステビア葉中に含有されることが認められている上記６
種の配糖体のうち、とくにし／Ｎｌ＋ウディオサイドー
Ａは、甘味の強さ、質ともにステビオサイドより優れて
おり、含量的にもステビア抽出物・ステビア抽出精製物
の甘味に重要な役割をもつ成分である。したがって、ス
テビア系配糖体甘味成分のうち、旧味料として最も注目
されている成分である。

このレバウディオサイド−Ａをステビア葉から抽出し、
精製・単離して甘味料に供することも可能であるが、 ■　精製コストが高くなる。

■　含量的に最も高いステビオサイド画分が副産物とし
て多量に得られ、しかも苦味・渋味が分離前のものより
、より強くなるための甘味料として利用しにくくなる。

等のデメリットが生じるので、これを工業的に実施する
のは困難である。

そこで、本発明者は、甘味料として優れているレバウデ
ィオサイド−Ａをそのままにして右き、ステビオサイド
の苦味・渋味や不快な残株をなくす手段について鋭意研
究の結果、ステビア甘味料に、澱粉及び／又は澱粉部分
加水分解物を基質としてステビオサイドに対し選択的番
こ糖転位反応を触媒する酵素、例えばバチルス・マセラ
ンスＩＦＯ３４９０の産生ずるサイクロデキストリン・
グルコシルトランスフェラーゼを作用せしめることによ
りステビオサイドのみをα−１，４−グルコピラノシル
誘導体に変化させうることを見出した。

即ち、本発明は、ステビア甘味料の最も重要な旧株成分
であるステビオサイド及びレバウディオサイド−Ａのう
ち、甘味質の劣るステビオサイドのみを酵素化学反応の
利用によって選択的にα−１，４−グルコピラノシルス
テビオサイドに変換し、ステビオサイドの欠点である苦
味・渋味をなりシ、シかも不快な残株を感じさせない良
質甘味に改善することを本質とする。

本発明者は、本発明に係る酵素反応によってステビオサ
イドの実質的部分ないし殆んど大部タカα−１，４−モ
ノグルコピラノシルステビオサイド、α−１，４−７グ
ルコピラノシルステビオサイド、α−１，４−）リグル
コピラノシルステビオサイド等に変化していることを確
認し、レバウディオサイド−Ａには本発明による反応が
進行しないことを確認した。

因みに、ステビオサイド番こ、α−グルコシル糖化合物
を基質としてα−グルコンル糖転位酵素を作用させるこ
とにより、これをα−グリコジルステビオサイドに変換
させる甘味料の製法は本願出願前公知である（特開昭５
４−５０７６号公報参照）。しかるに、本公知方法はそ
の明細書の記載によると、精製ステビオシトとマルトデ
キストリンとをバチルス・ステアロサーモフィラスＦＥ
ＲＭ−ｐ　Ａ２２２２の培養物から得られた粗シクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼを用いて糖転位
反応を行わせた生成物中にはα−モノ、ジ及びトリグル
コシルステビオサイド以外に原料中のレバウディオサイ
ド−Ａに由来するα−モノ及びジグルコシルレバウディ
オサイドーＡを夾雑している旨記載されており（同明細
書４３３〜４３４頁「実験４」参照）、この結論に反す
る事実は記載されていない。即ち、水先Ｉｆ文献（こ記
載されている方法は、実質的に、オ 少なくともステビオサイドとレバウデン海イド−Ａとを
含むステビア配糖体混合物に酵素転位反応を施すことに
よりステビオサイドとレバウディオサイド−Ａの両者を
α−グリコジル詞導体に変換させる方法であると解され
る。しかるに、本発明の手段は原料中のステビオサイド
のみをα−１，４−グルコピラノシル誘導体に変換する
方法であって、原料中のレバウディオサイド−Ａは全く
変化を受けない。従って、先テテ発明の目的物がα−１
，４−グルコピラノシル化合物であると否とを問わず、
本発明は前者とは趣を異にするのはもちろん、前者から
容易に推考し得ないものである。

本発明における酵素反応は、レバウディオサイド−Ａを
殆んど含有しない高度に精製されたステビオサイドだけ
に限るものではなく、レバウディオサイド−Ａを含有す
る混合物であっても、さＣにその他のステビア系配糖体
甘味成分をも含有するステビア抽出物又はステビア抽出
精製物であってもよい。要は原料物質が実質的にステビ
オサイドを含有する限り、原料中のステビオサイドは酵
素の作用によって選択的にα−１，４−グルコピラノシ
ルステビオサイドに変換され、本発明による甘味料が製
造できる。

本発明に用いる澱粉もしくは澱粉部分加水分解物は、例
えばバチルス−マセランスＩＦＯ−３４９０の産出する
サイクロデキストリン・グルコシルトランスフェラーゼ
によってステビオサイドからα−１，４−グルコピラノ
シルステビオサイドを生成するものであればよく、好ま
しくは、Ｄ。

Ｅ、１′以下の澱粉からり、Ｅ、約３０までの澱粉部分
加水分解物が適している。

また、本発明の実施に好適に用いられるバチルス・マセ
ランスＩＦＯ３４９０の産生するサイクロデキストリン
・グルコシルトランスフェラーゼは、必ずしも精製され
ている必要はなく、精製途中段階の酵素であっても、さ
らには培養炉液てあっても充分に目的を達することかで
きる。

本発明の反応は、少なくともステビオサイドと澱粉もし
くは澱粉部分加水分解物とを含有する水溶液に、例えば
バチルス・マセランスＩＦＯ３４９０の産生ずるサイク
ロデキストリ／・グルコシルトランスフェラーゼを作用
させることにより行われるが、より好ましくは酵素の最
適反応条件又はそれに近い条件か選はれる。即ち、温度
３０〜６５　”ＣＸｐＨ４，５〜７．０番こて反応時間
２〜１００時間とするのがよい。

また、反応に用いられるステビオサイドと澱粉もしくは
澱粉部分加水分解物との割合は、特に制限されるもので
はないか、好ましくはステビオサイドの型理に対する澱
粉もしくは澱粉部分加水分解物の重量比率を０２５〜１
００の範囲とするのがよい。さらに、反応液中のステビ
オサイドと澱粉もしくは澱粉部分加水分解物との固形分
製度についても特に制限はないか、溶解性の点から好ま
しくは１〜８０％とするのかよい。

本発明原料であるステビア甘味料の甘味の強さは本発明
反応の実施前後とも殆んど同しである。しかし甘味の質
は反応の前後により著しく異なり、反応後では反応前の
原料に見られる苦味や渋味が消失し、しかも不快な残株
を呈しない爽やかでまろやかな良質甘味となる。

このように、本発明の反応によって生成されたα−１，
４−グルコピラノンルステビオサイドを含有する反応溶
液は、そのままでも甘味料として使用できるが、必要に
応じてイオン交換樹脂を用いて脱塩し、濃縮して液状製
品とすることもてきるし、さらに乾燥・粉末化して粉末
製品とし、または造粒し、顆粒製品とすることもてきる
。

イた、場合によっては、反応溶液から合成吸着樹脂を用
いて配糖体成分を吸着せしめ、未反応の澱粉もしくは澱
粉部分加水分解物や塩額を除去した後、メタノール、エ
タノール、アセトンもしくはこれら溶剤と水との混合溶
液にて吸着した配糖体成分を溶出せしめ、濃縮・乾燥・
粉末化し、より甘味度の高い甘味料とすることもてきる
。

このようにして得られる本発明の甘味料は、ステビオサ
イドに特有な呈味の欠点か改善され、爽やかでまろやか
な良質甘味となるため、食品及び医薬品の甘味料として
特に好ましいものである。

本発明に係る旧味料は、原料として用いたステビア甘味
料中のステビオサイドのみがα−１゜４−グルコピラノ
シル誘導体に変換されたものであって、レバウディオサ
イド−Ａがそのまま残存している。故に原料の甘味の質
が飛躍約６こ向上した、食品及び医薬品工業上極めて有
用なものである。しかもその製造面において、原料中の
レバウティオザイドーＡが酵素の作用を受けないため、
先行発明に比へて少い酵素量で充分な改質効果が得られ
るという利点がある。

以下、実験によって本発明を説明するが、本発明の技術
的範囲は、これらによって何ら限定されるものではない
。

〔本発明甘味料の製造〕

実験ｌ　甘味料の製造 １−１　酵素の調製 コーンステイープリカー１％、溶性澱粉１％、硫酸アン
モニウム０．５％、炭酸カルシウム０．５％からなる種
培養用液体培地１００ｍ１を５０〇−容の振とうフラス
コに入れ、１２１”Ｃ，３０分間殺菌した後、バチルス
・マセランスＩＦＯ３４９０ヲｔ　白金耳植菌し、４０
°Ｃにて１５時時間表う培養した。

次いてこの種培養液３０ｍ１をとり、上記と同一組成か
らなる本培養用液体培地３，０００ｍｌを５，０００　
ｉ容ンヤーフアーメンターをこ入れ、上記と同一条件に
て殺菌した培地に加えて、４０℃、４８時間通気撹拌培
養した。培養後、培養液を１３，０００　Ｘ　Ｇ、５分
′間遠心分離し、４０単位／　ｍｌのサイクロデキスト
リン・グルコシルトランスフェラーゼの活性を含む透明
な培養ろ液２，６００ｍｌを得た。

ここに、サイクロデキストリン・グルコシルトランスフ
ェラーゼの活性１単位とは、０．００２＋１１の塩化カ
ルシウムを含む０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
５，５の１％溶性澱粉溶液０．５　ｒｎｌに適当に稀釈
した酵素液０．５　ｍ７を加え、４０’Ｃ，１０分間正
確に反応させ、反応後、ＩＭのグリシン塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ３，０，１ｍｌを加えて反応を停止せしめ、さらにこ
の液にＯ，ＯＩＭのヨウ素−０，２５Ｍのヨウ化カリウ
ム溶液１ｍ！、を加えて発色させ、水５ｍｌを加えて稀
釈した後、６６０ｎｍの吸光度を測定し、６６０　ｎｍ
の吸光度を１分間（こ１０％減少させる酵素量をいう。

この培養炉液を５°Ｃ以下に冷却し、湿熱処理澱粉ｓｏ
ｙを加えて、１夜撹拌し、酵素を吸着せしめた。酵素の
吸着した澱粉を３，０００　Ｘ　６２分間遠心分離して
集め、５°Ｃ以下に冷却した蒸留水２００　ｍｌを用い
て３回洗浄し、同様に遠心分離し゛Ｃ澱粉を集めた。酵
素の吸着前後の活性測定結果から、ここに得られた酵素
吸着澱粉は、９１，０００単位の酵素量を吸着していた
。（酵素１）次に、この酵素吸着澱粉を０．０５Ｍのグ
リシノ−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，０、１２０
ｍＡ’を用いて５０°Ｃにて１０分間処理して酵素を溶
出せしめ、４９０単位／ｒｎｌの酵素液１３０　ｎ＝ｌ
を得た。（酵素２）この酵素液に硫酸アンモニウムを加
え、６５％飽和とし、冷蔵庫に１夜放置、酵素を塩析さ
せた。塩析物を１３，０ＯＯＸＧ　、　１０分間遠心分
離して集め、蒸留水５ｍｌに懸濁し、予め５°Ｃ以下に
冷却した０、０１Ｍのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液、ｐ　Ｈ９，０，３，０００ｍ７中で１昼夜透析し、
酵素を溶解させ、不溶物を１３，０ＯＯＸＧ、　１０分
間遠心分離して除去し、８，４５０単位／ｄの酵素液７
ｍ１．を得た。

（酵素３） さらに、この酵素液を予め冷温室中て、０．０１　Ｍの
クリノン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，０、にて
平衡にしたセファデックス、Ｇ　−１，５０カラム（φ
２．２　Ｘ　９４ｃｍ　）にチャージし、ケルｐ過した
。

溶出液はフラクションコレクタにて１フラク／ヨン当り
７．７　ｍｌずつ分取したところ、酵素は２６〜３３フ
ラクンヨンの間に溶出した。活性の強いフラクションを
集めて、１，２００単位／　ｍｌの酵素液３８ｄを得た
。（酵素４） ■−２酵素の純度検定と最適反応条件 実験１−１で得られた酵素４の吸収スペクトルを測定し
たところ、２８０ｎｍに極大吸収ピークを有し、２５０
ｎｍに極小吸収を有する典型的なタンパク質の吸収スペ
クトルを示した。また、０Ｄ２８０　／　０Ｄ２６０　
＝　１．８９であり、核酸のコンタミネーションは考え
られなかった。

また、電気泳動にて酵素４の純度を検定したところ、わ
ずかなコンタミ不一ンヨンが見られたが、はぼ単一なタ
ンパク質にまで精製されていた。

一方、本酵素の最適反応条件を下記に示すか最適反応条
件は酵素の精製前後で差か認められなかった。

最適温度　　　　５５〜６０℃ 最適ｐＨｐＨ５，０〜６，０ 温度安定性　　　５５〜６０°Ｃ ｐＨ安定性　　ｐＨ８，０〜１０．０ １−３　甘味料の製造 薄層クロマトグラムと高速液体クロマトグラムによって
ステビオサイド以外のステビア系配糖体甘味成分のスポ
ットやピークが検出されなくなるまぜ一度に精製された
純ステヒオサイド１０Ｆ？とり、Ｅ、８〜１０の市販澱
粉部分加水分解物８゜２とを水２２０−に加熱溶解し、
冷却後００２Ｍの塩化カルシウムを含むＩＭの酢酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ５，５，１０ｍＡ’を加えてｐＨ５
，５に調整し、温度５５°Ｃに調節してから、実験１−
１で得た酵素４を８００単位（１，５ｍｌり加えて２４
時間撹拌反応させた。反応後、反応溶液を沸騰水中に１
０分間保って酵素を加熱失活させ、液状甘味料を得た。

（試料１） 対照量は、酵素液の代りに水を加えた溶液及び酵素液を
沸騰水中に１０分間保って酵素を加熱失活させて加えた
溶液を上記同様に処理して得た。（対照量ｌ及び２） 実験２　高速液体クロマトグラフによる分析実験１−３
で得た試料ｌと対照量１及び２とを高速液体クロマトグ
ラフを用いて分析した。

高速液体クロマトグラフは、東洋ソータ製のＨＬＣ−８
０２ＵＲを用い、カラムはＬＳ−４５０ＮＨ２テ溶媒組
成はアセトニトリル：水＝＝８：２、流速は１ｍｌ　／
ｍ　ｉ　ｎにて分析し、検出方法は糖質の検出を防ぎ、
しかもステビオサイドを感度よく検出するため、２００
ｎｍ　ｌこおける吸光度を測定する方法によった。

試料１１対照品１及び２の溶液をそれぞれ１−別々に分
取し、水４ｄを加えて稀釈し、この稀釈溶液のｌＯμｌ
を高速液体クロマトグラフに注入して分析した。その結
果を第１図に示す。

第１図に示した高速液体クロマトクラムから、対照品１
及び２ではステビオサイドのみしか検出されておらず、
しかも含有量の変化も認められなかったことがわかる。

一方、試料１の高速液体クロマトグラムでは、ステビオ
サイドのピーク（ピークｌ）の他に複数の新規なピーク
（ステビオサイドのピークから順番にピーク２．３．４
．５とする）か検出されており、しかもステビオサイド
の含有量か非常に減少していることが認められる。

これらの分析結果から、本発明による反応によって、ス
テビオサイドから新規反応生成物が得られていることは
明白である。

実験３　反応生成物の精製 実験１−３で得た試料１の液状甘味料の半量を分取し、
合成吸着樹脂（三菱化成製　商品名ＨＰ−５０）　５０
０ｍ１をつめたカラムにｓｖｉで通じ、未反応のステビ
オサイド及び反応生成物を吸着せしめた後、カラムを水
で充分に洗浄して未反応の糖質と塩類を除去した。次に
、メタノール：水＝１：１の混合溶媒１０００−を用い
て吸着物を溶出させ、溶出液を濃縮−乾固して約５２の
粉末状１」味料を得た。（試料２） 試料２の３ｙをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（
ワコーケルＣ−２００カラム、φ２８×５２礪、展開溶
媒はクロロホルム：メタノール：水＝３０：２０：４）
にて分画し、未反応のステビオサイドの他、試料３４０
０ｍｇ、試料４３００ｍｇ、試料ｓｚｏｏｍｙの３分画
を得た。この３分画以外これ以上の分離はできなかった
。

試料３．４．５をそれぞれ１．５■鷹　の濃度になるよ
うに水に溶解して各溶液１０μｅを高速液体クロマトグ
ラフに注入し、分析した０ 分析条件は、実験２て述べた高速液体クロマトグラフに
よる分析条件にて行った。

その結果、試料３のピークは、第１図の試料１の高速液
体クロマトグラムのピーク２に一致し、このピーク以外
のピークは検出されなかった。試料４．５についても同
様に分析したところ、それぞれについておのおの１本の
ピークのみが検出され、試料４のピークは第１図に示し
た試料１の高速液体クロマトグラムのピーク３に一致シ
、試料５のピークは同様にピーク４に一致した。

実Ｍ４　　（１！　　１−４−グルコピラノ・／ルステ
ビオサイドの確認。

４−１　グルコアミラーゼによる加水分解物の高速液体
クロマトグラフによる分析 ステビオサイドおよび実験３て得た試料３．４５をそれ
ぞれ下記に示す重量とし、水３．６　ｍｌを加えて溶解
した溶液をサンプル溶液として実験に供した。

ステビオサイド　：４ｍｙ 試　　料　　３　　　　：　　　　４．８試　　料　　
４　　　：　　　５６ 試　　料　　５　　　：　　　　６４ このサンプル溶液をおのおの０．９　ｍｌすつとり、そ
れぞれ別々の試験管に入れ、それぞれの試験管をこＩＭ
の酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４，８，５０μｅを加え
、さらに市販結晶グルコアミラーゼ゛を１０ｍｙ／ｍｌ
の濃度に調整した水溶液を５０μｌ加えて、５０°Ｃに
て１夜反応させた。反応後、この溶液のそれぞれ２０μ
ｇを実験２に示した高速液体クロマトグラフの分析条件
下にて注入し、分析した。

その結果、ステビオサイド、試料３．４．５のすへての
反応溶液ともステビオサイドのみしか検出されず１．か
も検出されたステビオサイドの含有量は、はとんど同一
の量であった。

４−２　グルコアミラーゼによる加水分解物中のＤ−グ
ルコースの定量 実験４−１で調整したサンプル溶液を、おのおのの試料
について０．９ｄずつ２本の試験管に取り、それぞれの
試験管にＩＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４，８，５
０μｌを加え、さらに各々の２本の試験管のうち１木目
の試験管には、市販グルコアミラーセを１０　ｍｙ／ｍ
ｌの濃度に調整した水溶液を５０μｅ加え（試験液）、
各々の残る１本の試験管には、上記と同濃度の市販クル
コアミラーゼ応させた。

反応後、加水分解によって生成されたＤ−グルコースを
ＤＮＳ法にて測定した。すなわち、反応後の反応溶液に
ＤＮＳ試薬１ｒｎｌを加え、沸騰水中に５分間保った後
、冷水にて冷却し、水５ｍｌを加えて稀釈した溶液の５
１０ｎｍにおける吸光度を測定した。この結果を表１に
示す。

表Ｉ　　　ＤＮＳ法による分析結果 ステビオサイド　　　　０．００３　　　　　　　　０
．００９　μＭ試料３　　０．４０１　　　　１．１４
Ｈ４０，８１３２，３１ ／／　　　５　　　　　　１．２５７　　　　　　　　
３．５７をもって、あらかじめ市販特級Ｄ−グルコース
を用いて作製した検量線（Ｄ−グルコース爪μＭ＝　２
．８４　Ｘ△０Ｄ５１０　α二０．９９９９ただし、０
．５μＭ〜８０１１Ｍの範囲）から、Ｄ−グルコースの
分析値をＩＭで表わした。

ここで、ステビオサイドの分子量を８０５とし、試料３
はステビオサイド１モルにＤ−クルコースが１モルα−
１，４−結合したものであると仮定し分子量９６７、同
様に試料４はＤ−グルコース２モルが結合したものであ
るとして分子量１．１２９、同じく試料５はＤ−グルコ
ース３モルが結合したものとして分子Ｊｉ　１．２９１
　　の各分子量を仮定してＤＮＳ法による分析結果を解
析してみた。

その結果を表２に示す。

表２　　　ＤＮＳ法による分析結果の解析ステビオサイ
ド　　１．０ｍｇ８０５　　１．２４μＭ　　　Ｏ，０
０９Ａ（０，００７３試料３　１．２　９６７　１．２
４　　１，１４　０．９２Ｌ／　　　４　　１．４　　
１，１２９　　１．２４　　　２，３１　　１．８６ｕ
　　　５　　１．６　　１，２９１　　１．２４　　　
３．５７　　２．８８表２に示した結果から、試料３の
生成物は、ステビオサイド１モルにＤ−”ルコースカ０
．９２モルニ：−１モルα−１，４−結合したものであ
ることが判　る。

同様に試料４は２モル、試料５は３モルのＤ−クルコー
スがα−１，４−結合したものであることが判る。

４−３　機器による分析結果 第２図、第３図、第４図に試料３．４．５のそれぞれの
ＫＢｒ錠剤法による赤外吸収スペクトルを示す。赤外吸
収スペクトロメーターは、高滓製ＩＲ−２４Ｇ　　を用
い、スキャンスピード５分て測定した。

また、第５図には、試料３．４．５のそれぞれの炭素１
３−核磁気共鳴スペクトルを示す。炭素１３−核磁気共
鳴スペクトロメーターとしては、日本分光製ＪＮＭ−Ｆ
Ｘ−６０Ｑを用い、パルスＦＴ−ＮＭＲスペクトルを測
定した。試料は、ピリジンｄ５中、１５０ｍｇ、ｚＷの
濃度で室温にて測定した。化学シフトは、ピリジンｄ５
の３組のトリプレットシグナルの中央のシグナルを各々
１２３．６　１３５．７　１４９．８゜ｐｐｍとしてδ
ｐｐｍで示した。その結果、ステビオサイドのＣ−２０
の化学シフトは、１５．４ｐｐｍ（文献値１５．４　ｐ
ｐｍ）　、ｃ　−１９では１７７、ｌｐｐｍ　（文献値
１７７．０　）が得られたので化学ソフトの求め方は正
しいものであると考えられた。

この炭素−１３核磁気共鳴スペクトルから、試料３．４
．５ともに、９７．９ｐｐｍにＣ−１３−（）Ｈに結合
したβ−Ｄ−グルコースのアノマー炭素、１０６．４ｐ
ｐｍにβ−ソホロース部のアノマー炭素、１０２．９ｐ
ｐｍに本発明による反応にて転移したα−Ｄ−グルコー
スのアノマー炭素（試料３は１個分、試料４は２個分、
試料５は３個分）の各シグナルが検出されていることが
判る。

この実験４のすへての結果を総合して考えると、試料３
はステビオサイド１モルにＤ−グルコース１モルがα−
１，４−結合したものであり、同様に試料４は２モル、
試料５は３モルのＤ−グルコースがα−１，４−結合し
たものであると結論される。

即ち、試料３はα−１，４−モノグルコピラノシルステ
ビオサイド、試料４はα−１，４−シクルコピラノンル
ステビオサイド、試°料５はα−１，４−トリグルコピ
ラノシルステビオサイドであることが判る。この他にも
、本発明の反応による反応生成物が、第１図に示した高
速液体クワマドグラムから確認されているが、上記結果
からα−１，４−グルコピラノシルステビオサイドの一
連の化合物であると推定される。

よって、本発明【こよる反応生成物は、ステビオサイド
に等モル以上のＤ−グルコースかα−１，４−結合した
一連の化合物、即ち、ａ７−１．４−グルコピラノシル
ステビオサイトであるということができる。

実験５　官能検査 ５−１　甘味度の比較 実験１−３で得た本発明品の液状甘味料（試料１）と対
照量１及び２について甘味度の比較をしてみた。

試験液としてそれぞれの溶液５２を分取し、それぞれに
水を加えて１，０００　ｙｄとして検査に供した。官能
検査パネルは、甘味にすぐれた検査員１５名によって行
った。

ます、対シ陛と２について検査してみたとこ７）Ｓ 対照量１の甘味が強い　　　　１名 １／、　　Ｚ　　　ｕ　　　　　　　Ｏ名画者の甘味度
に差が認められない１４名となり、対照量１と２とは甘
味度が同等であると見なされた。

次に対照量１と試料１とについ云比較検査した。その結
果は、 対照量ｌの甘味が強い　　　　４名 試料　１　　　　　　　　３名 両者の甘味度に差が認められない　８名となり、甘味度
は対照量１と試料１とて差が認められず、同等であると
見なされた。

また、対照量をステビオサイドとし、実験３て得た粉末
状甘味料（試料２）と甘味度の比較検査を行った。試験
液は、対照量、試料２ともにｏ、ｏ　ｉ　ｓ％の水溶液
として検査に供した。その結果は、 対照量の甘味か強い　　　　　１２名 試料２　　ｌｌ　　　　　　　　ｏ名 画者の甘味度に差が認められない　３名となり、試料２
はステビオサイドに比し、弱い甘味度であると見なされ
“た。これは、本発明の反応によってステビオサイドに
等モル以上のＤ−グルコースがα−１，４＝結合し、反
応生成物の分子量がステビオサイドより大きくなったた
めであると考えられた。

そこで、甘味度を捉えるため、試料２の濃度をすべて０
．０１５％とし、対照量ステビオサイドの０．０１％、
０．０１２５％、０．０１５％の各溶液を調製し、甘味
度の比較をしてみた。その結果を表３に示す。

表３　甘味度の比較 ０．０１％　　　　　０１２３ ０．０１２５％　　　　４　　　３　　８０．０１５％
　　　　１３０２ 表３に示した結果から、試１Ｆ１２の００１５％溶液の
甘味度は、ステビオサイドの０．０１２５％溶液の月味
度に等しいことがわかる。

５−２　旧株質の比較 まず、試料１および対照量１．２について実験５−１で
調製した甘味度の比較試験溶液をそのまま用いて甘味質
の比較をしてみた。結果は、対照量１の甘味が最も良い
　　０名 （１２ｕ　　　　　　　Ｏ名 試料１の甘味が最も良い　　１５名 となり、全員一致して試料ｌが最も良好な甘味質である
との結果を得た。

甘味質が良好である理由は、対照品１と２とはともにス
テビオサイドに特有の強い苦味を有し、かつ、渋味と相
いまって不快な残株を呈するのに対し、試料１には、こ
のような苦味・渋味が感じられず、さらに不快な残株を
も呈さない爽やかでまろやかな甘味であるとされた。

次に、対照品をステビオサイドとし、試料２との甘味の
質について比較検査してみた。試験溶液の濃度は、甘味
度をそろえるため、ステビオサイドを０．０１２５％、
試料２を０．０１５％として検査に供した。その結果は
、 対照品の甘味が最も良い　　０名 試料２　　　η　　　　　　１５名 となった。甘味質が良好である理由は、試料ｌと同様に
試料２の甘味には苦味・渋味か伴わず、不快な残株を呈
さない爽やかでまろやかな甘味であるとされた。

これらの実験結果から、本発明による甘味料は、苦味−
渋味を伴わず、しかも不快な残株を呈しないまろやかな
良質の甘味料であることが判る。これらは原料中のステ
ビオサイドがα−１，４−グルコピラノシルステビオサ
イドに修飾された結果に因るものと結論される。

〔本発明の実施例〕

次に本発明に関する１〜２の実施例について述へる。

実施例１ 高速液体クロマトグラフ分析によって第６図の■に示し
たクロマトグラムのパターンが得られる市販ステビア抽
出精製物（商品名：ステビア５Ｔ−ＡＢ　、池田糖化工
業株式会社製）３ｏ−ｙと、ＤＥ８〜１０の市販澱粉部
分加水分解物５０ｙとを水１１０ｍ１に加熱溶解し、冷
却後、００２Ｍの塩化カルシウムを含むＩＭの酢酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ５，５，５ｍｌを加え、さらに酢酸
的０．１ｍｌを加えてｐＨ５，５に調整し、温度を５５
℃に調節してから実験１−１で述べた方法にて調製した
酵素１を加え（酵素の活性５００単位に相当する澱粉量
を加えた）、４０時間撹拌反応させた。

反応後の溶液１−を取り、沸騰水中に１０分間保って酵
素を加熱失活させた後、水９ｍｌを加えて稀釈した。こ
の稀釈溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、その
１０μｒを高速液体クロマトグラフに注入し、実験２−
１で述べた条件下に分析した。この結果を第６図の■の
クロマトグラムで示す。

第６図の■と■とを比較すると、本発明による反応後の
溶液では、ステビオサイドの含有量が非常に減少し、し
かも反応前のステビア抽出精製物には見られないα−１
，４−グルコピラノシルステビオサイドの一連のピーク
が検出されていることがわかる。

また、レバウディオサイド−Ａ、Ｃについては、本発明
による反応前後で含有量の変化が認められないことも同
時にわかる。

一方、反応の前後の溶液について官能検査してみたとこ
ろ、甘味度は反応前後で差が認められなかったが、甘味
質は、反応前に強い苦味及び渋味があり、不快な残株を
呈したの番こ対し、反応後ではこのような苦味・渋味及
び不快な残株が感じられず、爽やかでまろやかな甘味と
なっていた。

このことから、本発′明による方法では、ステビオサイ
ドを含有するステビア抽出物もしくはステビア抽出物を
用いて、含有量の高いステビオサイドに選択的に本発明
による反応を起こさせることによって、苦味・渋味及び
不快な残株をなくし、爽やかでまろやかな甘味に変換し
うることがわかる。

このようなステビア抽出物もしくはステビア抽出精製物
は、高度に精製されたレバウディオサイド−Ａよりも安
価で製造できるため、本発明による反応を起こさせても
コスト的に安価で供給できる。

また、甘味質の向上も著しいので、食品や医薬品の旧味
料として特に好ましいものであり、有用に利用されるも
のであると信する。

実施例２ 実施例１て用いたステビア抽出精製物３００２とり、Ｅ
、８〜１０の市販澱粉部分加水分解物５００２とを水１
，１００ｍＡ！に加熱溶解し、冷却後、酢酸を加えてｐ
Ｈ５，５に調整し、温度５５°Ｃに調節してから実験１
−１で述へた方法にて調製した酵素２を加え（酵素の活
性５，０００単位に相当する液量を加えた）、４０時間
撹拌反応させた。反応後、反応溶液を沸騰水中に１０分
間保って酵素を加熱失活させた後、スプレードライヤー
を用いて噴霧乾燥させ、７５０ｙの粉末状甘味料を得た
。

本甘味料は、反応前のステビア抽出精製物の甘味質に見
られた苦味・渋味や不快な残株を呈しない爽やかでまろ
やかな良質甘味であった。

〔参考例〕

薄層クロマトグラムと高速液体クロマトグラムによって
、レバウディオサイド−Ａ以外のステビア系配糖体甘味
成分のスポントやピークか見られなくなるまで番こ高度
に精製された純レバウディオサイド−Ａ１ｙと、ＤＥ、
８〜１０の市販澱粉部分加水′）解物８２とを水２２．
ｎｌに加熱溶解し、冷却後、０．０２Ｍの塩化カルシウ
ムを含む１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，５、ｌ
ｙｄを加えてｐＨ５，５に調整し、温度５５°Ｃに調節
してから実験１−１で得た酵素５の８０単位（０，１５
ｙ＋＋１）を加えて２４時間撹拌反応させた。対照は、
酵素の添加直後の反応溶液から５−を分取し、沸騰水中
に１０分間保って酵素を加熱失活させた溶液とした。

反応後、反応溶液を沸騰水中に１０分間保って酵素を加
熱失活させた溶液の１Ｔｎｌを分取し、水４ｒｎｌを加
えて稀釈した。この稀釈溶液のｌＯμｌを高速液体クロ
マトグラフに注入し、実験２−１に述べた条件下に分析
してみた。対照にらいても同様に稀釈して分析に供した
。その結果、反応溶液、対照溶液ともにレバウディオサ
イド−Ａ以外のピークは検出されず、しかも両者の溶液
について含有量の差も認められなかった。

また、反応溶液と対照溶液との甘味度及びＩｔ味の質を
比較官能検査してみたか、両者に差は認められなかった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は純ステビオサイド（こ澱粉部分加水分解物の存
在てＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ　ＩＦＯ３４
９０の酵素を作用させたもの（試料１）と同酵素を作用
させない対照品（１，２）の高速液体クロマトグラム、
第２図〜第４図は、それぞれ第１図ピーク２〜４の試料
（試料３〜５）の赤外部吸収スペクトル、第５図は、そ
れぞれ第１図、ピーク２〜４の試料（試料３〜５）の核
磁気共鳴スペクトル、第６図は、レバウディオサイド−
Ａを含む市販ステビア抽出精製物（こ第１図と同様の酵
素反応を行った場合における反応前のもの■）と反応後
のもの■の高速液体クロマトグラムである。 特許出願人　池田糖化工業株式会社 、パ− 代　　理　　人　　弁理士　　門　　脇　　　清・：手
続補正書（自発） 昭和５７年１′１′月１８日 特許庁長官若杉　和夫　殿 １８事件の表示 昭和５７年　特　許　願第１００２７１号２、発明の名
称　　甘味料及びその製法３、　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ６、　補正により増加する発明の数　　　１８　補正の
内容　続集紙のとおり。 （１）出願の種類に「特許願」とあるのを「特許願　（
特許法第６８条ただし書の規定による特許出願）」に改
める。 （２）願書の「１、発明の名称」の欄の次に、「特許請
求の範囲に記載された発明の数　２」の欄を加入する。 ９　添付書類の目録 （１）訂正願書　　　１通 手続補正書（自発） 昭和５８年１０月２１日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特　許願第１００２７１号 ２、発明の名称 １Ｊ味料及びその製法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　所　広島県福山市桜馬場町２番２８号名　　称　
池田糖化工業株式会社 代表者　水　ノ　上　禎　男 ４、代理人 住　　所　大阪市淀用区東三国１−３２−１２５、補正
命令の日付　　　　な　　し く１）　　明細書の「特許請求の範囲」を別紙の通りに
改める。 〔２〕　　明細書の第３頁、９行目：「多年生草木であ
って、」とあるのを「多年生草木であって、」と改める
。 １３］　　明細書の第４頁、６〜７行目：［含量的にス
テビオサイドより高く、」とあるのを［Ｃにステビオサ
イドに次いで多い成分であるが、甘味度はステビオサイ
ドｍ工」と改める。 １４１　　明細書の同頁、下から８行目：　「含量的に
も少く、」とあるのを「含量拍メ上沙な及ユ」と改める
。 ＋５’ｌ　　明細書の第６頁、下から６行目：［分離前
のものより、より強く」とあるのを「分離前のものよ、
史強く」と改める。 １６１　　明細書の同頁、下から５〜６行目：「ための
甘味料として」とあるのを「た汝■味料として」と改め
る。 １７」　　明細書の第７頁、５行目：　「糖転位反応を
」とあるのを「肺転移反応を」と改める。 １８１　　明細書の同頁、６〜７行目＝「サイクロデキ
ストリン・グルコシルトランスフェラーゼ」とあるのを
［サイクロデキストリン争グ１コシルトランスフェラー
ゼ」と改める。 １９１　　明細書の第８頁、８〜９行目：「α−グルコ
シル糖転位酵素」とあるのを「α−グｙコシル糖転移酵
素」と改める。 ］１０１　　明細書の同頁、下から４〜５行目：「糖転
位反応を」とあるのを「糖転釜反応を」と改める。 １１１１　　明細書の第９頁、５〜６行目＝　「酵素転
位反応」とあるのを「酵素転移反応」と改める。 Ｕカ　明細書の第１０頁、１０〜１１行目＝「サイクロ
デキストリン・グルコシルトランスフェラーゼ」とある
のを「サイクロデキストリン・グリコジルトランスフェ
ラーゼ」と改める。 咽１　明細書の同頁、下から３〜４行目＝「サイクロデ
キストリン−グルコシトランスフェラーゼ」とあるのを
「サイクロデキストリン・グルコシトランスフェラーゼ
」と改める。 帥　明細書の第１３頁、下から６行目＝　「比べて少い
酵素量」とあるのを「ル≦工沙な胡酵素量」と改める。 自　明細書の第１８頁、７行目：ｒ８００単位（１，５
ｍ１）　Ｊとあるのを「８００単位（立旦ヱ１）」と改
める。 ９、添付書類の目録 （＋１　別　紙　　　　　　　　１通 ［別　　紙］ 「２、特許請求の範囲 （１］　　α−１，４−グルコピラノシルステビオサイ
トｌｔＤを含有し、α−１，４−グルコピラノシルレバ
ウディオサイド類を含有しないことを特徴とする甘味料
。 （２］　　ステビオサイド及び／又はし／くウデイオサ
イド類を含有する特許請求の範囲第（１）項記載の甘味
料。 （３］　　ステビア甘味料に、澱粉及び／又は澱粉部分
加水分解物を基質としてステビオサイドに対し選択的に
糖転移反応を起こさせるサイクロデキストリン争グ旦コ
シルトランスフエラーゼを作用させることを特徴とする
α−１，４−グルコピラノシルステビオサイド類を含有
し、α−１゜４−グルコピラノシルレバウディオサイド
類を含有しないことを特徴とする甘味料の製造法。 １４１　　サイクロデキストリン・グリコジルトランス
フェラーゼが、バチルス・マセランス（Ｂａ−ｃｉｌｌ
ｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ３４９０の産生
する酵素である特許請求の範囲第１３）項記載の甘味料
の製造法。」 手続補正書（１鋤 １、事件の表示 昭和５７年　特　　許　願第１００２７１号２、発明の
名称 甘味料及びその製法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　所　広島県福山市桜馬場町２番２８号名　　称　
池田糖化工業株式会社 代表者　水　）　上　禎　男 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和５８年１０月２５日（発送日） ６、補正により増加する発明の数　　０７、補正の対象 図面の「第２図」、「第３図」、「第４図」及び「第５
図Ｊ ８、補正の内容

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　α−１，４−グルコピラノシルステビオサイ
   ド頻を含有し、ａ＋−１，４−グルコピラノシル　　３
   ゜レバウディオサイド類を含有しないことを特徴とする
   甘味料。
2. （２）　　ステビオサイド及び／又はレバウディオサイ
   ド類を含有する特許請求の範囲第（１）項記載の甘味料
   。
3. （３）　　ステビア甘味料（こ、澱粉及び／又は澱粉部
   分加水分解物を基質としてステビオサイトニ対し選択的
   に糖転位反応を起こさせるサイクロデキストリンーグル
   コシルトラノスフェラーゼを作用させることを特徴とす
   るα−１，４−グルコピラノシルステビオサイド類を含
   有し、α−１，４−’／”ルコピラノシルレバウディオ
   サイド類を含有しないことを特徴とする甘味料の製造法
   。
4. （４）　　サイクロデキストリン・グルコシルトランス
   フェラーゼが、バチルス・マセランス（Ｂａ−ｃｉｌｌ
   ｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）　ＩＦＯ３４９０の産生ずる
   酵素である特許請求の範囲第（３）項記載の甘味料の製
   造法。